KR101636542B1 - 인간 ｎｌｂｐ 유래의 ｎｐ12 폴리펩티드 또는 ｎｐ21 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 NLBP 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것으로, (1)인간 NLBP 유래의 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드; 및 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인, 및 (2)상기 세포막 투과 도메인과 융합된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다. 본 발명의 세포막 투과 도메인은 종래의 세포 투과 펩티드에 비하여 높은 효율로 카고 단백질을 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩티드 서열로서, 면역 반응 문제를 유발시킬 염려가 없는 바, 다양한 고분자 물질을 인체의 세포 내로 전달하는 신호서열로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인간 ＮＬＢＰ 유래의 ＮＰ12 폴리펩티드 또는 ＮＰ21 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템{Cell penetrating peptide comprising NP12 polypeptide or NP21 polypeptide derived from human NLBP and cargo delivery system using the same}

본 발명은 세포 투과 펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 NLBP 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것이다.

일반적으로, 살아있는 세포는 단백질 및 핵산과 같은 거대 분자에 대해서 불투과성이다. 일부 작은 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있는 반면에, 거대분자는 세포 내부로 들어갈 수 없다는 사실은, 단백질 또는 핵산을 포함하는 거대분자를 이용한 치료, 예방 및 진단에 대한 제한 요인이 되고 있다. 한편, 대부분의 치료, 예방 및 진단의 목적으로 제조되는 물질들은, 이것의 진단, 예방 및 치료학적 유효량이 세포내로 전달되어야 하므로 이들을 세포 외부나 표적 세포의 표면에서 작용시켜 세포내로 전달시키기 위한 여러 가지 방법들이 개발되었다. 이와 같이, 생체 외(in vitro)에서 세포 내로 거대 분자를 전달하는 방법에는 전기충격(electroporatio), 리포좀을 이용한 막 융합, 표면에 DNA가 코팅된 미세 투사체를 이용한 고농도 투사법, 칼슘-인-DNA 침전체를 이용한 배양법, DEAE-덱스트란을 이용한 트랜스펙션(trasnfection), 변형된 바이러스 핵산을 이용한 감염, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 전형적으로 거대 분자를 주입시키고자 하는 전체 세포 수 중에서 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 영향을 주는 경향이 있다. 또한, 생체 내에서 세포 내로 거대 분자를 실험적으로 이동시키는 방법으로서, 칼슘-인 침전, 라이포좀 등을 이용하는 방법이 있으나, 이러한 기술들은 생체 내에서 세포 내로 물질을 전달함에 있어 그 사용이 극히 제한적이라는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 연구의 결과로서 제시된 것으로 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)(단백질 전달 도메인(protein transduction domain, PTD) 또는 막 전달 서열(membrane translocating sequence, MTS)라고도 칭하나, 본 발명에서는 세포 투과 펩티드(CPP)로 통일하여 지칭하도록 한다.)가 있다. 이러한 CPP는 양전하를 띄는 짧은 길이의 펩티드로서, 세포막을 통과할 수 있다고 알려져 있으며, 단백질뿐 아니라 DNA, RNA, 지방, 탄수화물, 화합물 또는 바이러스까지도 효율적으로 세포 내로 전달할 수 있는 것으로 알려져 있다. CPP가 세포막을 투과하는 원리는 아직 밝혀지지 않았으나, 수용체 비의존적이고, 엔도사이토시스(endocytosis)나 파고사이토시스(phagocytosis)에 비의존적이라고 생각되고 있다.

종래 가장 널리 알려진 CPP로는 HIV-1 TAT, HSV-1 VP22, 초파리의 Antp, 쥐의 전사인자의 Mph-1(대한민국 특허공개번호 제2004-0083429호), 그리고 최근에 밝혀진 HP4(PCT특허 출원번호 PCT/KR2006/000759, PCT/KR2006/000790) 등이 있다. 그 중 HIV-1(Human immunodeficiency virus-1) Tat 단백질은 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질이다(Mann, D. A. et al., Embo J 10 : 1733-1739, 1991). 상기 Tat 단백질이 세포막을 투과하는데 결정적인 역할을 하는 11개의 아미노산 서열인 'YGRKKRRQRRR'이 CPP이고, 이를 TAT이라 칭한다. 상기 TAT을 이용해 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, PE 도메인(domain of Pseudomonas exotoxin A(PE)) 등을 세포 내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 위치(localization)에 대한 연구가 진행된 바 있다(Fawell, S. et al., PNAS 91 : 664-668, 1994). 또 다른 CPP로 알려져 있는 것 중 HSV-1(Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포막 투과 펩티드가 있다. 상기 BVP22는 'DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE'인 34개의 아미노산 서열로 이루어졌다. 상기 VP22 CPP 역시 단백질의 세포 내 전달 기작 연구 등을 위하여 Viral nucleoprotein, Bovine IFN-γ, Viral F protein 등을 세포내로 전달하는 실험에 이용된 바 있다(Dilber, M. S. et al., Gene Ther 6 : 12-21, 1999). 또한, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin(Antp)이라는 CPP, 그리고 인공적으로 조합/합성해낸 세포막 투과 펩티드인 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan이 있다(Barany-wallje, E. et al., Biophysical Journal 89 : 2513-2521, 2005, Pooga, M. et al., FASEB J 12 : 67-77, 1998). 뿐만 아니라, 인간과 가장 유사한 종인 쥐의 단백질로부터 유래된 세포막 투과 펩티드인 Mph-1(Hph-1)을 이용해서 면역 세포의 전사인자를 세포내로 전달해 면역 질환이 유도된 쥐의 질병 모델이 질병의 완화 및 치료 효과를 보인 연구결과도 있다(Choi, J. M. et al., Nat. Med. 12 : 574-579, 2006). CPP가 생체 내에서도 효과적으로 작용하며, 이를 이용한 단백질의 전달이 생체 내의 세포에서 효과적으로 그 기능을 수행함을 보인 연구라 할 수 있다.

상기와 같은 종래의 CPP들은 모두 세포 에너지를 이용하여 특정 수용체나 채널 분자의 도움 없이 외부로부터 세포 내로 단백질을 전달할 수 있게 해 준다(Kelly, M. S. et al., Org. Biomol. Chem. 6 : 2242-2255, 2008). 또한, 단백질 뿐만 아니라 핵산이나 지방 등의 다른 고분자들을 세포내로 전달하는 것도 가능하다고 알려져 있어, 이를 이용한 유전자의 세포내 도입 혹은 치료 약물의 세포내 전달 등에 의한 연구가 진행되고 있는 상황이다(Lim, S. J. et al., BioWave 8 : No 14, 2006).

상기와 같이, 세포 내로 단백질과 같은 고분자 물질을 세포내로 전달하기 위해 종래 수많은 연구를 통해 다양한 세포막 투과 펩티드들이 발견되거나 개발되어 왔다. 하지만 상기와 같이 종래의 세포막 투과 펩티드들은 HIV-1 또는 초파리 등과 같이 다른 종이 발현하는 단백질에서 유래한 것이거나, 세포막 투과 펩티드를 구성하는 아미노산 서열을 통해 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이었다. 이와 같이 CPP로서 역할을 하는 펩티드들이 인간에서 유래하지 않았다는 점으로 인하여, 인체에 적용해서 사용할 때에 원하지 않는 면역반응이 일어나는 등 부작용이 발생할 여지가 있다. 또한 종래의 세포막 투과 펩티드들은 10개 이상(VP22의 경우 34개의 아미노산으로 구성됨)의 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있기 때문에 상기와 같은 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 커지게 된다. 뿐만 아니라, 이렇게 긴 아미노산 서열의 CPP와 카고 물질이 융합된 재조합 물질의 상산에 비효율적인 영향을 나타낼 여지가 있다.

이에, 종래의 비인간 유래의 단백질에서 유래한 CPP들을 대체하면서도 높은 효율로 카고 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 인간 유래 CPP의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 높은 효율로 카고 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 인간 유래 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드; 및 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 카고 단백질을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다.

본 발명의 인간 NLBP 단백질 유래 세포막 투과 도메인은 종래의 세포 투과 펩티드에 비하여 높은 효율로 카고 단백질을 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩티드 서열로서, 면역 반응 문제를 유발시킬 염려가 없는 바, 다양한 고분자 물질을 인체의 세포 내로 전달하는 신호서열로서 유용하게 이용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제작한 인간 NLBP 유래의 세포막 투과 도메인(NP12 및 NP21)과 EGFP의 융합 단백질(재조합 EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 PCR 산물인 807bp의 두 이중사슬 DNA 절편을 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 젤 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 제작한 재조합 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 pRSET-b 벡터)를 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 절단하고 1% 아가로스 젤 전기영동하여, 상기 재조합 pRSET-b 벡터에 실시예 1에서 제작한 807bp의 두 재조합 EGFP 융합 단백질의 유전자가 제대로 삽입되었음을 확인한 젤 사진이다.
도 3은 재조합 pRSET-b 벡터의 맵을 나타내는 것으로서, (A)는 재조합 NP1-EGFP 융합 단백질이 삽입된 벡터의 벡터 맵을 나내는 것이고; (B)는 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질이 삽입된 벡터의 벡터 맵을 나타내는 것이고; (C)는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질이 삽입된 벡터의 벡터 맵을 나타낸 것이며; (D)는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질이 삽입된 벡터의 벡터 맵을 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 EGFP 융합 단백질과 야생형(wild type) EGFP 단백질을 12% SDS 젤로 전기영동한 젤 사진으로서, NP12는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; NP21은 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 5는 재조합 EGFP 융합 단백질이 농도 의존적으로 Jurkat 세포 내로 도입되었음을 나타내는 세포 내 형광 강도 분석 그래프로서, (A) 및 (B)는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질과 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 농도에 따른 세포 내 도입 효율을 측정한 결과이고, (C)는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질과 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 농도에 따른 세포내 도입 효율을 재조합 TAT-EGFP 융합 단배질과 비교한 결과을 나타내는 것이다. 상기 도 5의 (A) 내지 (C)에서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP12-EGFP는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; NP21-EGFP는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이며, TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 6은 재조합 EGFP 융합 단백질이 시간 의존적으로 Jurkat 세포 내로 도입되었음을 나타내는 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다. 상기 도 6에서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP12-EGFP는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; NP21-EGFP는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이며, TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 세포막 투과 도메인과 종래의 CPP들의 세포 내 도입 효율을 비교한 결과로서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP12-EGFP는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; NP21-EGFP는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; Hph1-EGFP는 Hph-1과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이고; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이며; R9-EGFP는 R9과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 8은 온도의 변화(A) 및 배지 내 혈청 농도의 변화(B)에 따른 본 발명의 세포막 투과 도메인의 세포 내 카고 전달 효율의 변화를 종래의 세포막 투과 펩티드들과 비교한 그래프로서, Negative는 아무 것도 처리하지 않은 세포를 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; NP12-EGFP는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; NP21-EGFP는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이며; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 9는 헤파린의 선처리 농도에 따른 본 발명의 세포막 투과 도메인의 세포 내 카고 전달 효율의 변화를 종래의 세포막 투과 펩티드 TAT과 비교한 그래프로서, NP12-EGFP는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; NP21-EGFP는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이며; TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 10은 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질(A), 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질(B) 및 재조합 NP12-EGPF 융합 단백질(C)이 HeLa 세포 내로 전달되었음을 확인한 현미경 사진이다.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.

본 발명에서 일컫는 '펩티드(peptide)'는 펩티드 결합에 의해 4개 내지 1000개의 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 사슬 형태의 고분자를 의미하며, '폴리펩티드'와 상호 혼용가능한 의미이다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)'는 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오티드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물을 의미한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '세포막 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)'는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력을 가진 펩티드를 의미하며, '세포막 투과 도메인'과 상호 혼용가능한 의미이다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '카고(cargo)'는 상기 세포막 투과 도메인에 결합되어 세포 내로 전달됨으로써 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능조절 물질로서, 본래 세포 내로 도입될 수 없거나, 본래 유용한 속도로 세포 내로 도입될 수 없는 벡터, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 지방, 탄수화물, 및 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 동물의 성장, 발달 또는 분화인자 등과 같이 세포의 기능을 조절할 수 있는 화합물 등과 같은 화학 물질을 의미한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '재조합 카고'란 세포막 투과 도메인 및 한 개 이상의 카고가 유전적 융합이나 화학 결합에 의해 재조합되어 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '접촉'이란 카고 또는 재조합 카고가 진핵 또는 원핵세포와 접하는 것을 의미하며, 이러한 접촉에 의하여 상기 카고 또는 재조합 카고가 상기 진핵 또는 원핵세포의 내로 전달된다.

아울러, 본 발명에서 단백질, 펩티드, 유기화합물 등을 세포 내로 '도입'시키는 것에 대하여 '운반', '침투', '수송', '전달', '투과' 또는 '통과'한다는 표현들과 상호 혼용한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고

본 발명의 일 측면은 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드; 및 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인; 및 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고를 제공한다.

본 발명의 세포막 투과 도메인은 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드, 및 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 포함한다.

상기 NP1 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서, 794개의 아미노산으로 구성되는 서열번호 22의 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 서열 중 414번째 내지 424번째 아미노산 서열에 해당하는, 11개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다. 상기 인간 NLBP 유래의 NP1 폴리펩티드는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력이 있어 본 발명의 세포막 투과 도메인 자체 또는 그 일부로서 이용될 수 있다. 상기 NP1 폴리펩티드는 상기 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 특별히 제한되지 아니하나, 특히 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.

상기 NP1 폴리펩티드의 변이체는 상기 NP1 폴리펩티드의 일부 아미노산 잔기가 유사한 물리적 성질을 가지는 다른 종류의 아미노산으로 치환된 다양한 종류의 아미노산 서열들로서, 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체들은 하기 화학식 1의 아미노산 서열로 구성된다.

[화학식 1]

X ₁₁ -X ₁₂ -Asp-X ₁₃ -X ₁₄ -Asp-Glu-X ₁₅ -X ₁₆ -X ₁₇ -X ₁₈

상기 화학식 1에서, X₁₁ 내지 X₁₈은 서로 독립적으로 아르기닌(Arg), 리신(Lys) 및 히스티딘(His)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 일 수 있다(단, X₁₁ 내지 X₁₄ 및 X₁₈이 리신(Lys)이고, X₁₅ 내지 X₁₇이 아르기닌(Arg)인 경우는 상기 NP1 폴리펩티드와 서열이 동일해 지므로 제외한다.). 특히, 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체들은 상기 화학식 1에서 상기 X₁₁ 내지 X₁₈이 서로 독립적으로 아르기닌(Arg) 및 리신(Lys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다. 일 예로, 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체는 상기 화학식 1에서 상기 X₁₁ 내지 X₁₈이 모두 리신(Lys) 또는 모두 아르기닌(Agr)인 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체는 상기 NP1 폴리펩티드와 유사한 물리적·화학적 성질을 가지기 때문에, 상기 NP1 폴리펩티드와 같이 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력이 있어 본 발명의 세포막 투과 도메인 자체 또는 그 일부로서 이용될 수 있다.

상기 NP2 폴리펩티드는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서, 794개의 아미노산으로 구성되는 서열번호 22의 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 서열 중 444번째 내지 454번째 아미노산 서열에 해당하는, 11개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다. 상기 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력이 있어 본 발명의 세포막 투과 도메인 자체 또는 그 일부로서 이용될 수 있다. 상기 NP2 폴리펩티드는 상기 서열번호 6으로 기재되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 특별히 제한되지 아니하나, 특히 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.

상기 NP2 폴리펩티드의 변이체는 상기 NP2 폴리펩티드의 일부 아미노산 잔기가 유사한 물리적 성질을 가지는 다른 종류의 아미노산으로 치환된 다양한 종류의 아미노산 서열들로서, 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들은 하기 화학식 2의 아미노산 서열로 구성된다.

[화학식 2]

X ₂₁ -Ile-X ₂₂ -X ₂₃ -Val-X ₂₄ -X ₂₅ -X ₂₆ -Gly-X ₂₇ -X ₂₈

상기 화학식 2에서, X₂₁ 내지 X₂₈은 서로 독립적으로 아르기닌(Arg), 리신(Lys) 및 히스티딘(His)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 일 수 있다(단, X₂₁ 내지 X₂₆ 및 X₂₈이 리신(Lys)이고, X₂₇이 아르기닌(Arg)인 경우는 상기 NP2 폴리펩티드와 서열이 동일해 지므로 제외한다.). 특히, 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들은 상기 화학식 2에서 상기 X₂₁ 내지 X₂₈이 서로 독립적으로 아르기닌(Arg) 및 리신(Lys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다. 일 예로, 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체는 상기 화학식 2에서 상기 X₂₁ 내지 X₂₈이 모두 리신(Lys) 또는 모두 아르기닌(Agr)인 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체는 상기 NP2 폴리펩티드와 유사한 물리적·화학적 성질을 가지기 때문에, 상기 NP2 폴리펩티드와 같이 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력이 있어 본 발명의 세포막 투과 도메인 자체 또는 그 일부로서 이용될 수 있다.

상기 세포막 투과 도메인은 상기 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체들로 구성되는 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드, 및 상기 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들로 구성되는 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 순차적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드가 순차적으로 포함되는 경우 상기 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드는 서열번호 16으로 기재되는 폴리펩티드의 형태로 포함될 수 있고, 상기 서열번호 16의 폴리펩티드는 특별히 제한되지 아니하나, 특히 서열번호 17로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.

또한, 반대로, 상기 세포막 투과 도메인은 상기 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체들로 구성되는 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드, 및 상기 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체들로 구성되는 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드를 순차적으로 포함할 수도 있다.

특히, 상기 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 및 상기 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드가 순차적으로 포함되는 경우 상기 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 및 상기 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드는 서열번호 18로 기재되는 폴리펩티드의 형태로 포함될 수 있고, 상기 서열번호 18의 폴리펩티드는 특별히 제한되지 아니하나, 특히 서열번호 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.

상기 세포막 투과 도메인은 카고를 세포 내로 도입시키는 효율이 유지되는 범위 내에서 상기 세포막 투과 도메인을 구성하는 아미노산의 개수에는 특별한 제한이 없으나, 11개 내지 100개의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하고, 상기 세포막 투과 도메인은 11개 내지 70개의 아미노산으로 구성되는 것이 더욱 바람직하며, 상기 세포막 투과 도메인은 11개 내지 50개의 아미노산으로 구성되는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 상기 세포막 투과 도메인이 상기 서열번호 16의 폴리펩티드를 포함하여 구성되는 경우, 상기 세포막 투과 도메인은 상기 서열번호 16의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 0개 내지 76개의 아미노산이 추가적으로 결합되어 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 세포막 투과 도메인은 상기 서열번호 16의 폴리펩티드 자체만으로 구성될 수 있다.

본 발명의 상기 세포막 투과 도메인은 종래 잘 알려진 CPP인 TAT 서열 또는 Mph-1(Hph-1) 서열 등에 비하여 카고를 세포 내로 도입시키는 효율이 우수하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 24개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 16의 NP12 폴리펩티드로 구성된 세포막 투과 도메인 또는 24개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 18의 NP21 폴리펩티드로 구성된 세포막 투과 도메인을 EGFP 단백질에 융합하여 Jurkat 세포와 HeLa 세포에 처리한 결과, EGFP의 세포 도입 효율이 현저히 향상됨을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 또한, 종래의 TAT 서열 또는 Mph-1(Hph-1) 서열에 비하여 EGFP의 세포 도입 효율이 더욱 향상됨을 확인하였다(도 7의 (A) 및 (B) 참조).

본 발명의 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에는 카고가 결합될 수 있다. 상기 카고는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 지방, 탄수화물, 및 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 동물의 성장, 발달 또는 분화인자 등과 같이 세포의 기능을 조절할 수 있는 화합물 등과 같은 화학 물질일 수 있다. 상기 카고는 상기 세포막 투과 도메인과 융합하거나, 화학적 또는 물리적 방법에 의해 결합됨으로써 진핵 또는 원핵세포 내로의 도입 효율이 향상된다. 특히, 상기 카고가 단백질(카고 폴리펩티드)인 경우, 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고 단백질(카고 폴리펩티드)이 융합된 재조합 카고 단백질(재조합 카고 폴리펩티드)이 되고, 야생형(wild type)의 카고 단백질에 비하여 세포 내 도입 효율이 향상된다.

상기 카고의 물리적 또는 화학적 성질은 카고의 세포 내 도입 효율에 큰 영향을 미치지 아니한다. 비록, 상기 카고는 크기에 따라 세포 내 도입 효율에 미차가 발생할 수 있으나, 이는 도입 효율의 차이일 뿐, 상기 카고는 크기에 관계없이 상기 세포막 투과 도메인에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포막 투과 도메인에 결합되어 세포 내로 도입될 수 있는 카고의 종류에는 원칙적으로 제한이 없다. 특히, 상기 카고가 단백질(또는 폴리펩티드)인 경우, 상기 카고는 약물로 활용 가능성이 높은 인간 유래의 단백질 일 수 있고, 상기 인간 유래의 단백질은 그 크기가 약 150 kDa 이하인 것이 바람직하며 상기 세포막 투과 도메인에 의하여 효율적으로 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 16으로 기재되는 세포막 투과 도메인에 EGFP 단백질이 융합된 서열번호 10의 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질, 서열번호 18로 기재되는 세포막 투과 도메인에 EGFP 단백질이 융합된 서열번호 15의 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질 및 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 각각 Jurkat 세포와 HeLa 세포에 처리하여 세포 내 도입 효율을 비교한 결과, 서열번호 10 또는 서열번호 15의 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율이 야생형의 EGFP 단백질에 비해 현저히 우수함을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 상기와 같은 결과로부터, 서열번호 16으로 기재되는 NP12 폴리펩티드 또는 서열번호 18로 기재되는 NP21 폴리펩티드를 세포막 투과 도메인으로 이용하는 경우, 카고 물질인 EGFP 단백질의 세포 내 도입 효율이 현저히 향상됨을 알 수 있다.

2. 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

본 발명의 다른 측면은 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명된 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 상기 유전자 컨스트럭트는 인간 NLBP 유래의 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제1 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체로 구성되는 제2 폴리펩티드군에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기 인간 NLBP 유래의 NP1 폴리펩티드, NP2 폴리펩티드, 및 상기 NP1 폴리펩티드와 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체에 관해서는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 유전자 컨스트럭트에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 NLBP의 NP1 폴리펩티드 또는 화학식 1의 폴리펩티드 서열을 갖는 상기 NP1 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이면 특별히 제한되지 않는다. 특히, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 1의 NP1 폴리펩티드를 코딩하는 것인 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

또한, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 NLBP의 NP2 폴리펩티드 또는 화학식 2의 폴리펩티드 서열을 갖는 상기 NP2 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이면 특별히 제한되지 않는다. 특히, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 6의 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 것인 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

상기 유전자 컨스트럭트는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 벡터를 이용하여 세포막 투과 도메인을 반복적으로 양산해 낼 수 있다. 뿐만 아니라, 세포 내로 도입되어야 하는 카고가 특히 단백질인 경우, 상기 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site, MCS)에 상기 카고 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킴으로써, 세포막 투과 도메인과 상기 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질을 양산할 수 있다. 즉, 상기의 발현 벡터를 이용하여 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명된 재조합 카고 단백질 용이하게 반복적으로 양산할 수 있는 것이다. 상기 벡터에 의하여 양산된 재조합 카고 단백질은 야생형(wild type)의 카고 단백질에 비하여 보다 높은 효율로 세포 내 도입될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 NP1 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 및 상기 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 포함하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 및 상기 NP1 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 포함하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 21의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 이를 pRSET-b 벡터에 삽입함으로써 각각 도 3의 (C) 및 (D)와 같은 맵의 재조합 발현 벡터를 제조하였다(도 3 참조). 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 형질전환하여 상기 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 또는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 반복적으로 양산하였고, 이를 분리 및 정제하여 Jurkat 세포 및 HeLa 세포에 처리한 결과, EGFP의 세포 내 도입 효율이 야생형(wild type)에 비하여 향상됨을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).

3. 세포막 투과 도메인을 이용한 세포 내로의 카고 전달 방법

본 발명의 또 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고가 융합된 재조합 카고를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 내로의 카고 전달 방법은 1) 재조합 카고를 제조하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 제조된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.

상기 단계 1)의 재조합 카고는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명한 인간 NLBP 유래의 세포막 투과 도메인과 카고가 유전적 융합 또는 화학적 결합에 의하여 재조합됨으로써 형성된 복합체를 의미하는 것으로서, 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고를 물리적 또는 화학적으로 결합하여 제조할 수 있다. 이러한 재조합 카고의 제조는 카고의 물리적 또는 화학적 성질에 따라 당업자가 적절한 방법을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 카고가 단백질인 경우에는 상기 세포막 투과 도메인과 카고를 인위적인 펩티드 결합으로 화학 결합시킬 수도 있지만, 상기 "2. 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 " 항목에서 설명한 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터를 이용함으로써 반복적으로 양산할 수 도 있다. 그러나, 이는 재조합 카고를 제조하는 한 예시일 뿐, 그 방법이 이에 한정되지 아니하고, 당업자가 적절한 방법을 선택하여 적절히 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 NP1 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 및 상기 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 포함하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 NP2 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 및 상기 NP1 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 포함하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 21의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 이를 pRSET-b 벡터에 삽입함으로써 각각 도 3의 (C) 및 (D)와 같은 맵의 재조합 발현 벡터를 제조하였다(도 3 참조). 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 형질전환하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질을 반복적으로 양산하였고, 이를 분리 및 정제하여 재조합 카고인 재조합 NP12-EFGP 단백질 또는 재조합 NP21-EGFP 단백질을 제조하였다.

상기 단계 2)의 재조합 카고와 세포의 접촉은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 수행될 수 있다. 상기 접촉이 인 비트로(in vitro) 상에서 진행될 경우, 시험관 내의 세포에 재조합 카고가 포함된 배지를 처리하여 세포를 배양시키는 과정에 의해 상기 접촉이 이루어진다. 상기 접촉이 인 비보(in vivo) 상에서 진행될 경우, 상기 재조합 카고는 근육내(intramuscular), 복막내(intraperitoneal), 정맥내(intravein), 경구(oral), 비내(nasal), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 점막(mucosal) 또는 흡입(inhale) 등의 경로를 통해 생체 내로 주입(injection)되고, 생체 내에서 세포와 재조합 카고의 접촉이 이루어지게 된다.

상기 단계 2)의 재조합 카고와 세포의 접촉에 의하여 상기 재조합 카고가 세포 내로 도입되게 된다. 상기 재조합 카고의 도입은 ⅰ) 처리되는 재조합 카고의 농도가 높으면 높을수록 재조합 카고의 도입 양이 증가하고, ⅱ) 재조합 카고가 처리되는 시간이 길면 길수록 재조합 카고의 도입 양이 증가한다. 본 발명의 인간 NLBP 단백질 유래 세포막 투과 도메인은 에너지-의존적이면서도, 다른 물질들과 상호 경쟁적인 작용 기작에 의하여 카고를 세포 내로 도입한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 재조합 EGFP 융합 단백질을 처리하고 온도를 달리하여 배양한 결과, 온도가 낮아질수록 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였다(도 8의 (A) 참조). 또한, 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 0%, 5% 및 10%로 달리하여 5μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 제조하여 Jurkat 세포에 처리하여 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포막 투과 효율을 측정하고, 헤파린을 0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 선처리한 Jurkat 세포에 10 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질의 세폼가 투과 효율을 측정한 결과, 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 상기 NP12 폴리펩티드 또는 NP21 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인의 카고 전달 효율이 영향을 받는 다는 점을 간접적으로 확인하였다(도 8의 (B) 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 NP12-EGFP_pRSET-b 벡터)의 제조

<1-1> NP1 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작

인간 NLBP 유래의 NP1 폴리펩티드와 EGFP의 융합단백질(재조합 NP1-EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 염기 서열을 제작하기 위하여, ①NheI 제한효소 인식 부위, ②NP1 폴리펩티드(서열번호 1)를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, ③BamHI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 3의 정방향 프라이머를 제작하였고(바이오닉스), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 4의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머에서 ①NheI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③BamHI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 4의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.

EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 NLBP 유래의 NP1 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 35주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.

<1-2> 재조합 NP1-EGFP 융합 단백질이 삽입된 재조합 벡터(재조합 NP1-EGFP_pRSET-b 벡터) 제작

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 절편을 제한효소 및 연결효소를 이용하여 단백질 발현 벡터인 pRSET-b에 삽입하여 도 3의 (A)와 같은 구조의 벡터를 제조하였다. 보다 구체적으로는 하기와 같이 제조된다.

상기 실시예 <1-1>에서 제조된 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 절편을 NheI과 HindIII(NEB)로 DNA의 5' 및 3' 말단이 접착성 말단(sticky end)이 되도록 효소 반응시키는 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSET-b 벡터를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSET-b 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다. 상기와 같이 분리된 재조합 NP1-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편과 pRSET-b 벡터를 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase(NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켰다. 상기와 같이 재조합 NP1-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 원형의 pRSET-b 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양하였으며, 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다.

<1-3> NP2 폴리펩티드와 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작

인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합단백질(재조합 NP2-EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 염기 서열을 제작하기 위하여, ①BamHI 제한효소 인식 부위, ②NP2 폴리펩티드(서열번호 6)를 코딩하는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열, ③EcoRI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 8의 정방향 프라이머를 제작하였고(바이오닉스), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 4의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 8의 정방향 프라이머에서 ①BamHI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③EcoRI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 4의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.

EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 8 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.

<1-4> 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질이 삽입된 재조합 벡터(재조합 NP12-EGFP_pRSET-b 벡터) 제작

서열번호 10의 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질을 발현시키기 위해, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 재조합 NP1-EGFP_pRSET-b 벡터를 BamHI 및 HindIII 제한효소로 절단하여 EFGP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분이 제거시키고, BamHI 및 HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 NP1-EGFP_pRSET-b 벡터를 만들었다. 상기와 같이 절단된 선형의 NP1-EGFP_pRSET-b 벡터와 상기 실시예 <1-3>에서 제작한 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열을 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase(NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켜, 도 3의 (C)와 같은 구조를 갖는 원형의 재조합 NP12-EGFP_pRSET-b 벡터를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 원형의 재조합 NP12-EGFP_pRSET-b 벡터를 제조하였다.

상기와 같이 제작된 재조합 NP12-EGFP_pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 NP12 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하였고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다.

그 결과, 807bp의 폴리뉴클레오티드 절편이 제작되었음을 확인하였다(도 1).

또한, 상기와 같은 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 NP12-EGFP_pRSET-b 벡터)인지 여부를 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동시켜 확인하였고, 잘려진 단편의 염기 서열을 분석하였다.

그 결과, 807bp에 해당하는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 2.9kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였고(도 2), 807bp에 해당하는 밴드를 일루션(elusion)하여 염기서열을 분석한 결과, 상기 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 서열번호 9의 염기서열을 가짐을 확인하였다.

재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 NP21-EGFP_pRSET-b 벡터)의 제조

<2-1> NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작

인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합단백질(재조합 NP2-EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 염기 서열을 제작하기 위하여, ①NheI 제한효소 인식 부위, ②NP2 폴리펩티드(서열번호 6)를 코딩하는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열, ③BamHI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 11의 정방향 프라이머를 제작하였고(바이오닉스), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 4의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 11의 정방향 프라이머에서 ①NheI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③BamHI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 4의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.

EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 11 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 35주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.

<2-2> 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질이 삽입된 재조합 벡터(재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터) 제작

상기 실시예 <2-1>에서 제조한 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 절편을 제한효소 및 연결효소를 이용하여 단백질 발현 벡터인 pRSET-b에 삽입하여 도 3의 (B)와 같은 구조의 벡터를 제조하였다. 보다 구체적으로는 하기와 같이 제조된다.

상기 실시예 <2-1>에서 제조된 폴리뉴클레오티드 절편을 NheI과 HindIII(NEB)로 DNA의 5' 및 3' 말단이 접착성 말단(sticky end)이 되도록 효소 반응시키는 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSET-b 벡터를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSET-b 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다. 상기와 같이 분리된 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편과 pRSET-b 벡터를 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase(NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켰다. 상기와 같이 재조합 NP2-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 원형의 pRSET-b 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양하였으며, 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 분리하였다.

<2-3> NP1 폴리펩티드와 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작

인간 NLBP 유래의 NP1 폴리펩티드와 EGFP의 융합단백질(재조합 NP1-EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 염기 서열을 제작하기 위하여, ①BamHI 제한효소 인식 부위, ②NP1 폴리펩티드(서열번호 1)를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, ③EcoRI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 13의 정방향 프라이머를 제작하였고(바이오닉스), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 4의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 13의 정방향 프라이머에서 ①BamHI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③EcoRI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 4의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.

EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 13 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.

<2-4> 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질이 삽입된 재조합 벡터(재조합 NP21-EGFP_pRSET-b 벡터) 제작

서열번호 15의 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 발현시키기 위해, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 재조합 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 BamHI 및 HindIII 제한효소로 절단하여 EFGP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분이 제거시키고, BamHI 및 HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터를 만들었다. 상기와 같이 절단된 선형의 NP2-EGFP_pRSET-b 벡터와 상기 실시예 <2-3>에서 제작한 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase(NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켜, 도 3의 (D)와 같은 구조를 갖는 원형의 재조합 NP21-EGFP_pRSET-b 벡터를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 원형의 재조합 NP21-EGFP_pRSET-b 벡터를 제조하였다.

상기와 같이 제작된 재조합 NP21-EGFP_pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 11 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 NP21 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하였고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다.

그 결과, 807bp의 폴리뉴클레오티드 절편이 제작되었음을 확인하였다(도 1).

또한, 상기와 같은 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 NP21-EGFP_pRSET-b 벡터)인지 여부를 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동시켜 확인하였고, 잘려진 단편의 염기 서열을 분석하였다.

그 결과, 807bp에 해당하는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 2.9kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였고(도 2), 807bp에 해당하는 밴드를 일루션(elusion)하여 염기서열을 분석한 결과, 상기 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 서열번호 14의 염기서열을 가짐을 확인하였다.

대장균을 이용한 재조합 EGFP 융합 단백질의 발현 및 정제

재조합 EGFP 융합 단백질(재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질)을 발현 및 정제하기 위하여, 상기 실시예 <1-4> 및 <2-4>에서 제조된 재조합 pRSET-b 벡터를 액체 LB 배지 상태(100 ㎕)의 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 첨가해 준 뒤, 42℃로 가열한 항온 수조에서 45 초간 열 활성(Heat Shock)기법으로 형질전환 시킨 후 항생제인 34 ㎍/㎖의 클로람페니콜(chloramphenicol)과 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50 ㎖에 접종하여 37 ℃에서 14시간 배양한 다음, 이를 새로운 액체 LB 배지 500 ㎖에 접종하였다. 동일한 온도에서 O.D 값이 0.5가 될 때까지 대장균을 배양한 후, IPTG를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 온도를 20℃로 낮추고, 150 rpm으로 회전하는 진탕 배양기에서 14 시간 동안 더 배양하여 대장균 내에서 pRSET-b 벡터에 삽입된 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질이 발현되도록 하였다. 상기와 같이 대장균주에서 발현된 단백질은 pRSET-b 벡터에 의하여 자체적으로 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 N-말단 부분에 발현되도록 코딩된 6X-His tag을 포함하고 있다. 상기 6X-His tag을 이용해 하기와 같은 방법으로 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 정제하였다.

배양액을 원심분리로 모은 후 원 조건(native condition)의 용해용액(0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 재부유시켰다. 대장균의 세포벽과 세포막을 깨뜨리기 위해 용해용액에 부유해 있는 상태로 10분간 놓아둔 다음, 초음파 세포 파쇄기(VCX-130(Sonics & Materials))를 이용하여 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45㎛ 필터(Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤, Ni-NTA 아가로스(agarose)(Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합시키고, 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA 아가로스(agarose)와 결합된 단백질 산물만이 컬럼(column)에 결합될 수 있도록 하였다. 20mM의 이미다졸(imidazole) 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 이미다졸(imidazole) 용액을 이용해 최종적으로 용출(elution)해 내었다. 상기와 같이 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Bioscience)에 적용하여 분리함으로써, 서열번호 10으로 기재되는 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 서열번호 15로 기재되는 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 정제하였다(도 4).

Jurkat 세포 내로의 재조합 EGFP 융합 단백질의 도입

상기 실시예 3에서 정제된 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 암화된 인간 T 세포의 세포주인 Jurkat 세포주 내로 도입하면서 그 효율을 확인하였다. Jurkat 세포를 RPMI 배지(HyClone)로 배양하고, 350 ㎕의 RPMI 배지를 분주해 놓은 24-웰(24-well) 플레이트(SPL lifescience)의 각 웰에 세포수가 1ㅧ10⁶ 개만큼 들어있는 100㎕의 RPMI 배지를 첨가하여 세포를 분주했다. 처리할 재조합 EGFP 융합 단백질은 제조할 농도에 따른 적절한 양을 50 ㎕의 D-PBS(WelGen)와 혼합하여, 총 부피가 500㎕가 되도록 제조하여 상기 Jurkat 세포주에 처리하였다.

<4-1> 처리 농도에 따른 도입 효율 분석

재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 농도에 따른 도입 효율을 분석하기 위하여, 각각 1 μM 및 5 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 5% CO₂ 세포 배양기에서 37℃로 2시간 동안 처리하였다. 대조군으로 NP2 또는 dNP2 폴리펩티드가 연결되어 있지 않은 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 처리하였다. 2시간 경과 후, 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거하였다. 또한, 세포 표면에 묻어있거나 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복하였다. 상기와 같은 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 최종적으로 500 ㎕의 D-PBS로 재부유시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

그 결과, 상기 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질이 처리된 재조합 EGFP 융합 단백질의 농도에 의존적으로 Jurkat 세포 내로 전달되었음을 확인하였다(도 5의 (A) 및 (B)). 특히, 상기 NP12 및 NP21이 모두 종래의 널리 알려진 세포막 투과 도메인인 TAT 보다도 더욱 효율적으로 카고를 상기 Jurkat 세포 내로 전달할 수 있음을 확인하였다(도 5의 (C)).

<4-2> 처리 시간에 따른 도입 효율 분석

5 μM 농도의 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 Jurkat 세포가 분주되어 있는 플레이트의 각 well에 처리하고 5% CO₂ 세포 배양기에서 37℃로 30분 내지 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로 NP2 또는 dNP2 폴리펩티드가 연결되어 있지 않은 야생형(wild type)의 EGFP 단백질과 재조합 TAT-EGF 융합 단백질을 처리하였다. 상기 각각의 시간 동안 단백질을 도입시킨 다음, 상기 실시예 <4-1>과 같은 방법으로 세포를 회수하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

그 결과, 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질은 처리 시간에 의존적으로 상기 Jurkat 세포 내로 전달되었음을 확인하였다. 시간이 지남에 따라 세포 내로 도입된 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질의 양이 점점 많아 졌고, 6시간이 경과한 후에도 세포 내로 도입된 EGFP의 양이 꾸준히 증가하였다(도 6). 특히, 종래 널리 알려진 세포막 투과 도메인인 TAT은 2시간이 경과한 후부터 세포 내로 도입되는 EGFP의 양이 줄어드는 양상을 나타내어, 본 발명의 상기 두 재조합 융합 단백질이 TAT 보다도 더욱 효율적으로 상기 Jurkat 세포 내로 전달됨을 확인하였다(도 6).

<4-3> 다른 종류의 세포막 투과 도메인과의 도입 효율 비교

NP12 폴리펩티드, NP21 폴리펩티드와 종래의 세포막 투과 도메인들의 도입 효율을 비교하기 위하여, 동일한 조건에서 다른 세포막 투과 도메인들을 이용하여 EGFP를 Jurkat 세포 내로 도입하였고, 그 도입 효율을 측정하였다. 보다 구체적으로, 하기 표 1의 재조합 단백질들을 5 μM의 농도로 Jurkat 세포에 처리하여 30분, 1시간, 2시간, 3시간 및 6시간 동안 5% CO₂ 세포 배양기에서 37℃로 배양한 다음, 상기 실시예 <4-1>과 같은 방법으로 세포를 회수하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정함으로써 각 재조합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

실시예 <4-3>에서 이용된 재조합 EGFP 단백질
음성 대조군	야생형 EGFP
실험군	실시예 3에서 정제한 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질
	실시예 3에서 정제한 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질
양성 대조군	TAT-EGFP
	Mph-1(Hph-1)-EGFP

그 결과, 본 발명의 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드 모두 종래 널리 알려진 Mph-1(Hph-1) 보다 높고, TAT과 비슷하거나 그 이상의 전달 효율을 나타내었다(도 7).

<4-4> 인간 NLBP 단백질 유래 세포막 투과 도메인의 작용 기작 규명

NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드가 어떠한 기작으로 세포막을 투과하여 단백질을 전달하는 것인지 확인하기 위하여, 상기 표 1에 기재된 재조합 단백질을 이용하여 온도 및 배지 내의 혈청 농도에 따른 EGFP 단백질의 도입 효율을 측정하였다.

먼저, 표 1의 재조합 단백질들(Mph-1(Hph-1)-EGFP 제외)을 5 μM의 농도로 Jurkat 세포에 2시간 동안 처리하되, 세포 배양 온도를 각각 독립적으로 4℃ 및 37℃로 달리 하였다.

그 결과, 온도가 낮아질수록 상기 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였고, 모든 온도 조건에서 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드는 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT보과 비슷하거나 그 이상의 카고 도입 효율을 나타내었다(도 8의 (A)). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 인간 NLBP 단백질 유래 세포막 투과 도메인이 에너지에 의존하여 단백질을 세포내로 전달하는 것임을 간접적으로 알 수 있다.

다음으로, RPMI 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 0%, 5% 및 10%로 달리하여 5μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 제조하여 처리하고, 표 1에 기재된 각 재조합 단백질들(Mph-1(Hph-1)-EGFP 제외)의 도입 효율을 분석하였다.

그 결과, 배지의 혈청 농도가 증가할수록 실시예 3에서 정제한 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였고, 모든 혈청 농도 조건에서 NP21 폴리펩티드는 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT보다 월등히 높은 도입 효율을 나타내었고, NP12 폴리펩티드는 TAT보다 약간 낮은 정도의 도입 효율을 나타냄을 확인하였다(도 8의 (B)). 상기와 같은 결과로부터, 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 본 발명의 세포막 투과 도메인이 카고 전달 효율에 영향을 받는 다는 점을 간접적으로 알 수 있다.

마지막으로, NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드가 세포 표면에 존재하는 헤파란 황산염(heparan sulfate)과 직·간접적으로 상호작용함으로써 세포막 투과 활성을 나타낼 것으로 예상되어, 상기 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드와 상기 헤파란 황산염의 결합을 억제한 뒤 단백질이 세포내 도입 효율을 확인하였다. 상기 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드가 상기 헤파란 황산염과 결합하는 것을 방해할 수 있는 헤파린(Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, Sigma)을 0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 Jurkat 세포에 30분 동안 선처리한 다음, 10 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 D-PBS와 섞어 부피가 100 ㎕로 되게 하여 상기 Jurkat 세포에 처리하고, 1시간 동안 37℃의 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다. 1시간 경과 후, 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거하였다. 또한, 세포 표면에 묻어있거나 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1 ㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복하였다. 상기와 같은 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 최종적으로 500 ㎕의 D-PBS로 재부유시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

그 결과, 헤파린의 선처리 농도가 높아질수록 상기 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드의 카고 전달 효율이 현저하게 낮아짐을 확인하였다(도 9). 상기와 같은 결과로부터, 상기 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드가 다른 단백질(헤파란 황산염 등)들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 본 발명의 세포막 투과 도메인이 카고 전달 효율에 영향을 받는 다는 점을 간접적으로 알 수 있다.

HeLa 세포 내로의 재조합 EGFP 융합 단백질의 도입

상기 실시예 4에서 확인한 인간 NLBP 유래의 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드의 세포막 투과 기능을 다시 한번 확인하면서, 상기 인간 NLBP 유래의 NP12 폴리펩티드 및 NP21 폴리펩티드에 의하여 도입된 재조합 단백질의 세포 내 위치를 확인하고, 실제로 세포 안으로 도입된 것인지 여부를 직접 확인하기 위하여, 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 내로 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질을 도입하고 형광현미경을 이용하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 6-웰 플레이트(6-well plate)(SPL lifescience)의 각 웰에 미리 현미경용 원형 커버글라스(Marin field)를 깔아두고 5ㅧ10⁵ 개의 HeLa 세포를 분주한 후, 18시간 동안 DMEM 배지(HyClone)에서 배양하여 HeLa 세포가 커버글라스에 부착될 수 있도록 하였다. 배지를 모두 흡입(suction)하여 버린 후 새로운 DMEM 900 ㎕를 넣어주고, 실시예 3에서 정제한 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질을 D-PBS와 각각 섞어 20 μM의 농도가 되도록 혼합하여 100 ㎕를 처리한 다음, 2시간 동안 37℃의 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 세포외부의 단백질을 제거하기 위해 배지를 모두 흡입하여 버린 후, 1 ㎖의 D-PBS로 3회 반복 세척하고 4% 포름알데히드 완충용액(4% formaldehyde buffer solution, formalin, SIGMA) 1㎖로 세포를 고정하였다. 고정 후에도 1 ㎖의 D-PBS로 3회 반복 세척하고, 세포 내 핵의 위치를 확인하기 위하여 1:10000으로 희석한 2 ㎖의 Hoechst(Hoechst AG)를 이용해 핵이 형광을 띄도록 10분 동안 염색하고, 1 ㎖의 D-PBS로 3회 반복 세척하였다. 이렇게 준비된 커버 글라스는 Mounting medium (SIGMA)을 이용해 슬라이드 글라스 위에 마운팅하고 공초점 형광현미경(AX-10 (Confocal fluorescence microscope, Carl zeiss))으로 EGFP가 세포 내로 도입되었는지 여부 및 세포 내에서의 위치를 확인하였다.

그 결과, 실시예 3의 재조합 NP12-EGFP 융합 단백질 및 재조합 NP21-EGFP 융합 단백질은 세포막을 투과하여 HeLa 세포 내로 도입되었고, 상기 HeLa 세포 내에서 세포질(cytoplasm)에 위치해 있음을 확인하였다(도 10).

동물 개체를 이용한 NP12 및 NP21의 in vivo 상에서 갖는 카고 단백질 전달 기능 확인

본 발명에서 개발된 NP12 및 NP21 폴리펩티드가 생체 내에서도 카고 단백질 전달 기능을 갖는 것을 확인하기 위하여 상기에서 밝힌 방법으로 정제해낸 NP12-EGFP 및 NP21-EGFP 단백질을 5 mg/800 μl 로 마우스에 복강주사로 주입하여 각 장기에 녹색형광단백질이 전달되는지 여부를 확인하였다. 주입 후 두 시간이 지났을 때 경추탈골 기법으로 마우스를 안락사 시키고, 간, 뇌, 신장, 소장에 해당하는 장기를 적출하였다. 적출된 장기는 O.C.T. 컴파운드를 이용하여 -80℃에서 동결시켰으며 이것을 6 μm의 두께로 동결절편을 만들어 슬라이드글라스에 부착시키고 PBS 세척하였다. 그리고 델타-비전 이미징 시스템(Delta-vision imaging system)을 이용하여 조직 내의 형광 단백질 전달 여부를 확인하였다.

그 결과 대조군인 EGFP 주입 마우스의 장기에 비하여 NP12-EGFP 및 NP21-EGFP가 주입된 마우스의 장기는 매우 진한 녹색형광을 나타내고 있었고, 이를 통하여 NP12 및 NP21 폴리펩티드가 생체 내에서도 매우 높은 효율로 카고 단백질을 전달할 수 있음을 확인하였다(도 11).

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Cell penetrating peptide comprising NP12 polypeptide or NP21 polypeptide derived from human NLBP and cargo delivery system using the same <130> PN130477P <150> 12/0112120 <151> 2012-10-09 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Lys Asp Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aagaaagata agaaagatga gagaagaaga aag 33 <210> 3 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant NP1-EGFP fusion protein without EcoRI restriction site <400> 3 cggctagcaa gaaagataag aaagatgaga gaagaagaaa gggatccgtg agcaagggcg 60 aggagctgtt cac 73 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for recombinant NP1-EGFP fusion protein <400> 4 caagctttta cttgtacagc tcgtc 25 <210> 5 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant NP1-EGFP fusion protein without EcoRI restriction site <400> 5 gctagcaaga aagataagaa agatgagaga agaagaaagg gatccgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcac 696 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aag 33 <210> 8 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant NP2-EGFP fusion protein with EcoRI restriction site <400> 8 cgggatccaa gattaagaaa gtcaagaaga aaggaagaaa ggaattcgtg agcaagggcg 60 aggagctg 68 <210> 9 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant BamHI-dNP2-EcoRI-EGFP fusion protein <400> 9 ggatccaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg aattcgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 720 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctatacaagt aa 762 <210> 10 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acide sequence for recombinant NP12-EGFP fusion protein <400> 10 Ala Ser Lys Lys Asp Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Glu Phe Val Ser Lys Gly 20 25 30 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 35 40 45 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 50 55 60 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 65 70 75 80 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val 85 90 95 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 100 105 110 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 115 120 125 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 130 135 140 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 145 150 155 160 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 165 170 175 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 180 185 190 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 195 200 205 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 210 215 220 Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 225 230 235 240 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly 245 250 255 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 260 265 <210> 11 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant NP2-EGFP fusion protein without EcoRI restriction site <400> 11 cggctagcaa gattaagaaa gtcaagaaga aaggaagaaa gggatccgtg agcaagggcg 60 aggagctgtt cac 73 <210> 12 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant NP2-EGFP fusion protein without EcoRI restriction site <400> 12 gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 720 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctatacaagt aa 762 <210> 13 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant NP1-EGFP fusion protein with EcoRI restriction site <400> 13 cgggatccaa gaaagataag aaagatgaga gaagaagaaa ggaattcgtg agcaagggcg 60 aggagctg 68 <210> 14 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant BamHI-NP1-EcoRI-EGFP fusion protein <400> 14 ggatccaaga aagataagaa agatgagaga agaagaaagg aattcgtgag caagggcgag 60 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 120 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 180 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 240 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 300 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 360 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 420 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 480 aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 540 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 600 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 660 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 720 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctatacaagt aa 762 <210> 15 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for recombinant NP21-EGFP fusion protein <400> 15 Ala Ser Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Lys Asp Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys Glu Phe Val Ser Lys Gly 20 25 30 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 35 40 45 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 50 55 60 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys 65 70 75 80 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val 85 90 95 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe 100 105 110 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 115 120 125 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 130 135 140 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 145 150 155 160 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His 165 170 175 Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 180 185 190 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 195 200 205 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 210 215 220 Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 225 230 235 240 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly 245 250 255 Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 260 265 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for NP12 polypeptide <400> 16 Lys Lys Asp Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys Gly Ser Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys 20 <210> 17 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for NP12 polypeptide <400> 17 aagaaagata agaaagatga gagaagaaga aagggatcca agattaagaa agtcaagaag 60 aaaggaagaa ag 72 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for NP21 polypeptide <400> 18 Lys Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Arg Lys Gly Ser Lys Lys Asp 1 5 10 15 Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys 20 <210> 19 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for NP21 polypeptide <400> 19 aagattaaga aagtcaagaa gaaaggaaga aagggatcca agaaagataa gaaagatgag 60 agaagaagaa ag 72 <210> 20 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant NP12-EGFP fusion protein <400> 20 gctagcaaga aagataagaa agatgagaga agaagaaagg gatccaagat taagaaagtc 60 aagaagaaag gaagaaagga attcgtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 120 cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 180 ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 240 ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 300 cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 360 gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 420 aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 480 gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 540 atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 600 gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 660 gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 720 gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 780 atggacgagc tatacaagta a 801 <210> 21 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence coding for recombinant NP21-EGFP fusion protein <400> 21 gctagcaaga ttaagaaagt caagaagaaa ggaagaaagg gatccaagaa agataagaaa 60 gatgagagaa gaagaaagga attcgtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 120 cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 180 ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 240 ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 300 cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 360 gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 420 aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 480 gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 540 atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 600 gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 660 gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 720 gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 780 atggacgagc tatacaagta a 801 <210> 22 <211> 794 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Ala Asp Ala Trp Glu Glu Ile Arg Arg Leu Ala Ala Asp Phe Gln 1 5 10 15 Arg Ala Gln Phe Ala Glu Ala Thr Gln Arg Leu Ser Glu Arg Asn Cys 20 25 30 Ile Glu Ile Val Asn Lys Leu Ile Ala Gln Lys Gln Leu Glu Val Val 35 40 45 His Thr Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Ile Thr Pro Ala Gln Ile Ser Lys 50 55 60 Glu Met Arg Asp Glu Leu His Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Ile Val 65 70 75 80 Asp Leu Gln Gln Val Ile Asn Val Asp Leu Ile His Ile Glu Asn Arg 85 90 95 Ile Gly Asp Ile Ile Lys Ser Glu Lys His Val Gln Leu Val Leu Gly 100 105 110 Gln Leu Ile Asp Glu Asn Tyr Leu Asp Arg Leu Ala Glu Glu Val Asn 115 120 125 Asp Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gln Val Thr Ile Ser Glu Leu Cys Lys 130 135 140 Thr Tyr Asp Leu Pro Gly Asn Phe Leu Thr Gln Ala Leu Thr Gln Arg 145 150 155 160 Leu Gly Arg Ile Ile Ser Gly His Ile Asp Leu Asp Asn Arg Gly Val 165 170 175 Ile Phe Thr Glu Ala Phe Val Ala Arg His Lys Ala Arg Ile Arg Gly 180 185 190 Leu Phe Ser Ala Ile Thr Arg Pro Thr Ala Val Asn Ser Leu Ile Ser 195 200 205 Lys Tyr Gly Phe Gln Glu Gln Leu Leu Tyr Ser Val Leu Glu Glu Leu 210 215 220 Val Asn Ser Gly Arg Leu Arg Gly Thr Val Val Gly Gly Arg Gln Asp 225 230 235 240 Lys Ala Val Phe Val Pro Asp Ile Tyr Ser Arg Thr Gln Ser Thr Trp 245 250 255 Val Asp Ser Phe Phe Arg Gln Asn Gly Tyr Leu Glu Phe Asp Ala Leu 260 265 270 Ser Arg Leu Gly Ile Pro Asp Ala Val Ser Tyr Ile Lys Lys Arg Tyr 275 280 285 Lys Thr Thr Gln Leu Leu Phe Leu Lys Ala Ala Cys Val Gly Gln Gly 290 295 300 Leu Val Asp Gln Val Glu Ala Ser Val Glu Glu Ala Ile Ser Ser Gly 305 310 315 320 Thr Trp Val Asp Ile Ala Pro Leu Leu Pro Thr Ser Leu Ser Val Glu 325 330 335 Asp Ala Ala Ile Leu Leu Gln Gln Val Met Arg Ala Phe Ser Lys Gln 340 345 350 Ala Ser Thr Val Val Phe Ser Asp Thr Val Val Val Ser Glu Lys Phe 355 360 365 Ile Asn Asp Cys Thr Glu Leu Phe Arg Glu Leu Met His Gln Lys Ala 370 375 380 Glu Lys Glu Met Lys Asn Asn Pro Val His Leu Ile Thr Glu Glu Asp 385 390 395 400 Leu Lys Gln Ile Ser Thr Leu Glu Ser Val Ser Thr Ser Lys Lys Asp 405 410 415 Lys Lys Asp Glu Arg Arg Arg Lys Ala Thr Glu Gly Ser Gly Ser Met 420 425 430 Arg Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ala Arg Glu Tyr Lys Ile Lys Lys Val 435 440 445 Lys Lys Lys Gly Arg Lys Asp Asp Asp Ser Asp Asp Glu Ser Gln Ser 450 455 460 Ser His Thr Gly Lys Lys Lys Pro Glu Ile Ser Phe Met Phe Gln Asp 465 470 475 480 Glu Ile Glu Asp Phe Leu Arg Lys His Ile Gln Asp Ala Pro Glu Glu 485 490 495 Phe Ile Ser Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Lys Pro Leu Asn Lys Thr 500 505 510 Tyr Leu Glu Val Val Arg Ser Val Phe Met Ser Ser Thr Thr Ser Ala 515 520 525 Ser Gly Thr Gly Arg Lys Arg Thr Ile Lys Asp Leu Gln Glu Glu Val 530 535 540 Ser Asn Leu Tyr Asn Asn Ile Arg Leu Phe Glu Lys Gly Met Lys Phe 545 550 555 560 Phe Ala Asp Asp Thr Gln Ala Ala Leu Thr Lys His Leu Leu Lys Ser 565 570 575 Val Cys Thr Asp Ile Thr Asn Leu Ile Phe Asn Phe Leu Ala Ser Asp 580 585 590 Leu Met Met Ala Val Asp Asp Pro Ala Ala Ile Thr Ser Glu Ile Arg 595 600 605 Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Glu Glu Thr Lys Val Ala Leu Thr 610 615 620 Lys Leu His Asn Ser Leu Asn Glu Lys Ser Ile Glu Asp Phe Ile Ser 625 630 635 640 Cys Leu Asp Ser Ala Ala Glu Ala Cys Asp Ile Met Val Lys Arg Gly 645 650 655 Asp Lys Lys Arg Glu Arg Gln Ile Leu Phe Gln His Arg Gln Ala Leu 660 665 670 Ala Glu Gln Leu Lys Val Thr Glu Asp Pro Ala Leu Ile Leu His Leu 675 680 685 Thr Ser Val Leu Leu Phe Gln Phe Ser Thr His Ser Met Leu His Ala 690 695 700 Pro Gly Arg Cys Val Pro Gln Ile Ile Ala Phe Leu Asn Ser Lys Ile 705 710 715 720 Pro Glu Asp Gln His Ala Leu Leu Val Lys Tyr Gln Gly Leu Val Val 725 730 735 Lys Gln Leu Val Ser Gln Ser Lys Lys Thr Gly Gln Gly Asp Tyr Pro 740 745 750 Leu Asn Asn Glu Leu Asp Lys Glu Gln Glu Asp Val Ala Ser Thr Thr 755 760 765 Arg Lys Glu Leu Gln Glu Leu Ser Ser Ser Ile Lys Asp Leu Val Leu 770 775 780 Lys Ser Arg Lys Ser Ser Val Thr Glu Glu 785 790

Claims (17)

1. 인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP1 폴리펩티드; 및
   인간 NLBP(Novel LZAP Binding Protein) 유래의 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 NP2 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인.
2. 제1항에 있어서, 상기 NP1 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
3. 제1항에 있어서, 상기 NP2 폴리펩티드는 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
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8. 제1항에 있어서, 상기 NP1 폴리펩티드 및 상기 NP2 폴리펩티드가 순차적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
9. 제 8항에 있어서, 상기 세포막 투과 도메인은 서열번호 16으로 기재되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
10. 제 1항에 있어서, 상기 NP2 폴리펩티드 및 상기 NP1 폴리펩티드가 순차적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
11. 제 10항에 있어서, 상기 세포막 투과 도메인은 서열번호 18로 기재되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
12. 제1항의 세포막 투과 도메인; 및 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고.
13. 제12항에 있어서, 상기 카고는 단백질인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고.
14. 제1항의 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
15. 제14항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터.
16. 제15항에 있어서, 상기 벡터는 제1항의 세포막 투과 도메인과 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질이 발현될 수 있도록, 카고 단백질을 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터.
17. 제1항의 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고가 융합된 재조합 카고를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 재조합 카고를 분리된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 분리된 세포 내로의 카고 전달 방법.
    

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