JP4188909B2 - 細胞質残留性細胞膜透過ペプチド及びこれの用途{CytoplasmicTransductionPeptidesandUsesthereof} - Google Patents
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Description
例えば、腹腔または静脈投与を実施することができる。
下記の実施例に記載のように、本発明の細胞質残留細胞膜透過システムを個体に投与した場合、特定生体内器官(肝またはリンパ節)に選好的に移動する特性を示す(下記実施例参照)。
従って、本発明の方法は、生物学的活性分子を肝またはリンパ節に運搬しようとする場合に特に適合している。また、本発明の細胞質残留細胞膜透過システムは、生体内器官で特定部位にのみ局所的に移動する特性を示す。
現在まで知られた細胞膜透過システムの中で、本発明の細胞膜透過システムのように、個体に適用され特定分子、特に巨大分子(例えば、β−ガラクトシダーゼ)を運搬するものはない。
従って、本発明の方法は、薬物(化学医薬及びバイオ医薬を含む)送達システムとしての価値が非常に高い。用語“個体”は、好ましくは動物、より好ましくはヒトを除いた哺乳動物である。
膜透過性機能ペプチドからNLSの機能を除去することが本発明のCTP開発デザインの目的であるため、NLSの機能的要件を理解することが一次的作業である。NLSの構造的特性を理解するために、マウスのインポーチン-αタンパク質と核タンパク質であるヌクレオプラスミン(nucleoplasmin)のNLS部位と結合した状態の構造を参照した((Fontes et al., 2000)。インポーチン-αには、陰電荷が多く分布された結合クレフト(binding cleft)が存在するが、その中に陽電荷を帯びるNLSのLys残基が伸長・ツイストされた(extended and twisted)形態で結合している。
実施例2-1:CTP候補群に対するプライマーリスト
本実施例に利用されるpTAT−HA LacZベクターは、ワシントン大学のS.Dowdey博士から提供してもらったものであって、前記ベクターは、pTAT−HAベクターのXhoI部分にLacZタンパク質がクローニングされているものである。pTAT−HAベクターは、目的タンパク質の発現及び精製のためのT7プロモーター、6x His-タグ、TATドメインがタギングされており、クローニングのためのマルチプルクローニング位置が存在する。本発明のCTP候補群をクローニングするために、pTAT−HA LacZベクターのTATドメインとHA−タグ部位をBamHI及びNcoI制限酵素により除去した後、本発明のCTP候補群をコーディングするオリゴヌクレオチドをクローニングした。β-ガラクトシダーゼタンパク質をコーディングする遺伝子であるLacZは、pTAT−HAベクターのXhoI部分にクローニングされている。
pTAT−HA LacZベクターを制限酵素BamHI及びNcoIで切断し、TatドメインとHA-タグドメインを除去した。CTP候補群に対する相補的な前方向プライマー及び逆方向プライマーを95℃で5分間加熱した後、温度を1℃/分の速度で常温まで落とした。このようなプライマーアニーリング方法により作られた挿入序列と前記ベクターとを16℃で18時間連結(T4 DNA ligase, Roche)して、再組合プラスミドを製作した。再組合プラスミドでE. coli JM109 (Stratagene)を形質転換しLB-Amp (50μg/ml)培地で18時間培養した後、形成されたコロニーの一部をLB-Amp培地で増殖させて、再組合プラスミドDNAを得た。CTP候補群が正常的に導入されたのか否かは、クローンを制限酵素で切断して確認した。最終的にCTP候補群に対する再組合プラスミド導入部位の塩基序列分析は、SolGent社に依頼し分析した。その結果、最初製作されたプライマーのDNA塩基序列との類似性は、100%一致した。
前記実施例2-2で構築されたPTDまたはCTP候補群が導入されたPTDまたはCTP-LacZ再組合プラスミドでE. coli BL21 (DE3) (Novagen)を形質転換して、これをPTD及びCTP-β-ガラクトシダーゼタンパク質の発現と精製に使用した。形質転換されたE. coli BL21(DE3)/PTD-LacZまたはBL21(DE3)/CTP-LacZを250mlのLB-Amp培地で18時間培養した。本発明において、pTAT−HA LacZ発現プラスミドは、LB培地に存在する微量の乳糖(lactose)により目的遺伝子が大量発現される特徴がある。従って、本発明のE. coli BL21(DE3)/PTD-LacZまたはBL21(DE3)/CTP-LacZは、IPTG誘導無しに、一晩中培養した。
PTDとCTP候補群の細胞内導入活性を、HeLa細胞を対象に実験した。24-ウェルプレート(Nunc)を利用して高ブドウ糖DMEM(10%FBS含有)培地にHeLa細胞5×104を分株した後、36時間培養した。細胞をPBSで洗浄した後、PTD及びCTP-β-ガラクトシダーゼタンパク質をopti-MEMI培地に100μg/mlの濃度で希釈して添加した。1時間培養した後、固定液(2%ホルムアルデヒド、0.2%グルタルアルデヒドin PBS)で常温で10分間細胞を固定した。PBSで2回洗浄した後、細胞内導入活性を観察するために、染色液(0.1% X-gal、5mMフェリシアン化カリウム、5mMフェロシアン化カリウム、2 mM MgCl2 in PBS)で2時間染色した(参照:図3)。2時間染色した時染色程度が低い試料に対しては、一晩中染色した後染色された程度を比較し、相対的に細胞内に入る程度を測定した。PTDとCTP候補群のHeLa細胞導入活性を比較分析した結果、次のような順位で細胞内に融合タンパク質を導入させるということが分かった。
PTD5 < CTP502 << CTP501 = CTP506 < CTP507 < CTP505 < CTP503 = CTP504 <CTP508 = CTP510 = MTS < CTP509 << PTD = CTP511 << CTP 512
細胞質残留性細胞膜透過ペプチド(CTP)の選別のための、共焦点走査顕微鏡分析は、HeLa細胞を利用し、蛍光染色は、FITC(Fluorescence-iso-thio-cyanate)を利用した単一染色(single staining)とPE (phycoerythrin)を利用したDNA染色試薬(green fluorescence SYTO-16 DNA staining dye, Molecular Probe)との二重染色(double staining)を通じて行われた。まず、HeLa細胞(5 x 105 cells/ml)を滅菌されたカバー−スリップが入っている6−ウェルプレートに広げて、37℃培養器で一晩中培養した。翌日、PBS(pH7.4)を利用して1回洗浄し、OPTI−MEM I培地を利用して1ml程度満たした後、候補CTPタンパク質(100μg/ml)を入れた。陽性対照群としてPTD-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質を利用し、陰性対照群としてはβ-ガラクトシダーゼタンパク質のみを利用した。候補CTPタンパク質をパルスして入れた後、37℃培養器で1時間反応させた。PBSを利用して3回洗浄した後、2%パラホルムアルデヒドを利用して4℃で20分間固定させた。固定されたHeLa細胞を洗浄用緩衝液(0.2%BSA及び0.02%アジ化ナトリウムを含有するPBS)を利用して3回洗浄した。抗体の透過性を高めるために、細胞を0.5% Triton X-100 (in PBS, Sigma)を利用して4℃で20分間反応させた。反応後、洗浄用緩衝液を利用して3回洗浄して、抗体を利用した染色を実施した。まず、単一染色の場合は、1次抗体であるマウス由来抗β-ガラクトシダーゼ単一クローン抗体(mouse anti-β-galactosidase monoclonal antibodies、1:2,000, Sigma)を利用して4℃で1時間反応させた。細胞を洗浄用緩衝液で3回洗浄した。2次抗体としては、FITCが接合されている山羊由来抗マウスIgG抗体(Goat anti-mouse IgG FITC、1:2,000, Jackson Laboratory)を利用して4℃で20分間反応させた。細胞を、洗浄用緩衝液を利用して3回洗浄して、スライドガラス上に蛍光固定培地(Fluorescence mounting medium、DAKO)1滴を利用し固定させて、凝固接合剤(nail vanish)を利用してカバースリップの縁を密封した。
最近細胞膜透過ペプチドの中でHIV-1 Tatタンパク質から由来のPTDの膜透過機能が、PTDペプチド自体の膜透過性質であるというよりは、PTDに含まれた多量の陽電荷アミノ酸により陰電荷を帯びる細胞膜に静電気的に付着された状態で細胞固定過程中細胞内に流入されて現れる人為的な現象である可能性が提示されている(43-45)。さらに、上述の事実が、PTDペプチドを処理した細胞を一定時間後再びトリプシンを処理し細胞膜に付着されたペプチドを除去すると、細胞内に導入されたペプチドの量に顕著な差が発生して、また膜透過機伝は、既存報告とは違って、エンドサイトーシスにのみよるという事実が報告され(46)、既存知られている数種の膜透過ペプチドは、機能上の再点検が求められている。
CTPを始めとしたPTDとMTSなど、細胞透過ペプチドの(Cell permeable peptide, CPP)細胞膜透過効率を比較するために、各CPPにβ-galが融合されたタンパク質を50μg/mlの濃度でHeLa細胞に処理して細胞内導入されたβ-gal酵素活性を測定した。β-gal酵素活性は、実施例3と同様に実施して、最終的に染色された細胞を顕微鏡で写真撮影した(参照:図6a)。図6aから分かるように、CTP512で処理した細胞で、PTDとMTSで処理した細胞に比べ、著しく強力なβ-gal活性を示して、CTP513及びCTP514の場合、CTP513は、CTP512と同等な程度に、CTP514は、PTDと同等な程度に、処理された細胞でβ-gal活性を示した。しかし、このような実験結果からは、観察されたβ-gal活性が、細胞膜透過を通じて細胞内に導入された量であるか、あるいは単純に細胞膜に付着されたものが固定過程で細胞内に流入されたのであるかは、判別できない。
本発明のCTPが実際的に細胞膜を透過するのか、それとも単純に細胞膜と静電気的引力により結合されて、固定過程で細胞膜を透過して細胞内に入るのかを確認した。HeLa細胞を48-ウェルプレートに2 x 105/mlで培養した後、37℃で一日間DMEM(high glucose)培地を利用して培養した後、1×PBSで1回洗浄した。PTD-β-gal、MTS-β-gal、CTP501〜514-β-galを50μg/mlの濃度でOPTI-MEMに添加し、細胞に添加して20時間培養した。次いで、細胞をトリプシン-EDTA(10×)で37℃で3分間処理して、細胞表面に残存するCPP-β-galタンパク質を全て除去した後、細胞を1×PBSで2回洗浄して、固定溶液により室温で10分間固定した。細胞を1×PBSで2回洗浄した後、染色溶液で37℃で2時間染色した後、顕微鏡上で細胞を撮影した(参照:図6b)。
上述の実験で実際的な細胞膜透過性質を示すPTD、MTS及びCTP508、509、511、512、513及び514の細胞膜透過程度を定量的に比較するために、CPP-β-gal融合タンパク質を上記のような方法により、HeLa細胞に20時間処理後トリプシンを処理して、実際的に細胞内に流入された融合タンパク質の量を定量的に比較した。トリプシン処理された細胞に10%FBSが含有されたDMEM((high glucose)を添加して、残余トリプシンの活性を抑制した後、遠心分離を通じて細胞を収得した後、1×PBSを利用して細胞を1回洗浄した。細胞pelletに0.9% Triton-X 100を添加した後、室温で10分間反応し細胞を分解させて、分解された細胞内容物を12000rpmで2分間遠心分離し、上澄液のみを収得した。各試料のβ-gal活性をenhanced β-gal assay kit(GTS Inc, USA)を利用して室温で反応させた後、ELISA readerを利用して570nmで測定した。
CTP-β-gal及びPTD-β-gal融合タンパク質の細胞内に透過される程度を速度論的に分析した。融合タンパク質を処理した後、トリプシン処理をしなかったまま細胞を0.9% Triton X-100で分解させた後、細胞に存在する全体β-galタンパク質の活性を測定した。また、細胞表面に結合した融合タンパク質を除去して細胞内に流入されたβ-galのみを定量するために、融合タンパク質で処理された細胞を再びトリプシンで処理した後、同じ条件でβ-galタンパク質の活性を調べることにより、実質的に細胞内に透過された融合タンパク質の量を比較、分析した(参照:図8)。
既存報告によると、PTDの細胞膜透過能及び細胞内の残留位置は、細胞固定過程で流入されるPTD融合タンパク質の種類により違うように現れることがある(46)。このような問題を解決するために、本発明のCTP-β-gal 100μg/mlを20時間処理したHeLa cellにトリプシンを10秒間3回処理し表面に付着されたCTP-β-galを除去して、細胞を固定し共焦点顕微鏡で細胞内に導入されたβ-galに対してのみ細胞内の位置を調査した。サンプル準備過程及び共焦点顕微鏡観察方法は、実施例4と同様である。
既存ペプチドの膜透過性は、細胞表面に結合されたものまで含まれ歪曲されて知られたものであるという事実が、トリプシン処理過程の導入により糾明された(46)。従って、本発明がCTP-β-galの膜透過性の真正性を確認するために、上述したように、トリプシン処理過程を導入して実験を行った。しかし、この場合、融合されたβ-galタンパク質により、CTP自体の活性が違うように現れる可能性があるため、β-gal融合タンパク質の代りにCTPを蛍光物質で標識して細胞に一定時間処理した後、トリプシン処理後、処理時間別及び処理濃度別に細胞内に導入されたペプチドの量を、FACSCalibur(Becton Dickison、USA)を利用して、 FACS (Fluorescence-activated cell sorter)分析した。
β-galが融合されたペプチドの場合は、膜透過程度を確認するために抗体を使用しなければならないため、細胞固定過程が必須的であり、このような固定過程で表面に付着されたペプチド融合タンパク質が細胞内に導入され、導入活性や細胞質内での移動位置に影響を及ぼすとして報告された。しかし、FITCで標識された膜透過ペプチドを使用すると、細胞固定過程を省いても共焦点顕微鏡でペプチドの細胞内位置を観察することができる。CTP、PTD及びMTSにFITCが付着されたペプチドを、単層培養されたHeLa細胞に25μg/ml濃度で1時間処理して、HBSSで3回洗浄後、細胞固定過程無しに細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
上述の実施例では、膜透過ペプチドによる細胞内への導入程度をHeLa細胞でのみ調査した。CTPの膜透過特性が他の細胞でも同様に維持されるのかを確認するために、マウス細胞株(マウス繊維細胞株L929、マウス腎臓癌細胞株RENCA)、Tリンパ腫瘍細胞であるJurkat細胞及びマウス脾臓から抽出した1次脾臓細胞を使用して細胞内への蛍光導入程度を調査した。
実施例10-1:CTP-β-galの肝またはリンパ節への移動分析
本発明のCTPが細胞水準でのみならず、生体内でも効率的に融合タンパク質を細胞内に導入させるのかを確認するために、BALB/cマウスに25μg/(g of mouse)濃度のCTP-β-gal、PTD-β-gal、MTS-β-gal融合タンパク質及びβ-galタンパク質を腹腔に注射するか、100μg/mouse濃度で尾静脈に注入した。注入4時間後マウスを安楽死させて、皮膚と皮を除去して腹腔を解剖し、PBS緩衝溶液で3回洗浄した。次いで、固定溶液で固定させた後、X-gal染色溶液で染色した後、各臓器を抽出して、β-gal活性を調査した。
前記のように、CTP-β-galをマウス腹腔及び静脈に投与して4時間後、胸腺、心臓、脾臓、肝、腎臓などの臓器を摘出して急冷した後、ミクロトーム(microtome)で冷凍切片を作って、X-gal反応溶液で一晩中反応させた後、顕微鏡でβ-gal活性を観察した。CTP-β-galを投与したマウスの場合、胸腺を除いた大部分の臓器切片全般でβ-gal活性が相当量観察された。反面、PTD-β-gal及びMTS-β-galやβ-galタンパク質を投与したマウス臓器切片では、β-gal活性がほとんど観察されないか、臓器の表面でのみ制限的に活性が観察された(図15a及び15b)。CTP-β-gal投与時、臓器別切片で現れたβ-gal活性は、腹腔(図15a)や静脈(図15b)のどの経路に投与してもあまり差がなく、同様に現れた。一方、PTD-β-gal及びMTS-β-galを腹腔に投与した時は、肝と腎臓組織表面にβ-gal活性が染色されたが、これはたぶん、腹腔に投与した融合タンパク質のPTDやMTSの細胞表面付着性により現れた現象として考えられる。しかし、CTPを除いたいずれのものも臓器内部まで浸透してβ-gal活性を示した臓器切片はなかった。このような事実は、CTPを薬物伝達システムに使用する場合、臓器内に効果的に浸透して薬効を奏することができるということを示唆する。
図16は、CTP-β-galを腹腔及び尾静脈に投与したマウスの臓器をX-galで染色した後、染色部位を拡大して見た写真である。Hematoxylene eosin染色(HE staining)から分かるように、各臓器内部は、それなりに独特な組織からなっており、このような組織において、CTPにより運搬されたβ-galは、投与経路に関わらず、特定部位にのみ現れた。従って、投与された融合タンパク質が自由に血液や体液を通じて移動し特定臓器に浸透したというよりは、特定細胞によりこのような臓器内部に運搬されたと推定される。特に、脾臓の場合は、腹腔や静脈投与の両方とも同様なβ-gal染色様相を示して、このような形態は、B cell領域のgerminal centerやT cell領域周辺で現れて、CTPを移動させる細胞が樹枝状細胞または大食細胞である可能性を表す。
XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)は、アポトーシスを開示するに重要な役割をするCaspase-9タンパク質と結合し、その機能を阻害することにより、アポトーシスを抑制する。XIAPタンパク質にあるzinc-binding BIRドメインは、procaspase-9タンパク質がプロセシングされて生成されたcaspase-9 smallサブユニットのN-末端と結合することにより、活性形のcaspase-9生成を抑制する。反面、Smac/DIABLOタンパク質のN-末端の7個アミノ酸序列は、XIAPタンパク質と結合することにより、XIAPのアポトーシス抑制機能を阻止する役割をする。即ち、Smac/DIABLOタンパク質は、アポトーシスを促進させる役割を担当するが、この過程にはN-末端の7個アミノ酸序列のみを以ってXIAP機能を抑制するに十分であるということが明かされた(47-50)。
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Claims (9)
- 細胞膜透過能を有して、細胞に処理して一定時間後、前記処理された細胞にタンパク質分解酵素を処理した場合でも細胞膜透過現象を示し、細胞膜を透過した以後には、細胞質に残留する特性を有するペプチドであって、前記ペプチドは、配列番号1から構成されたペプチドであることを特徴とする細胞質残留性細胞膜透過ペプチド。
- 細胞膜透過能を有して、細胞に処理して一定時間後、前記処理された細胞にタンパク質分解酵素を処理した場合でも細胞膜透過現象を示し、細胞膜を透過した以後には、細胞質に残留する特性を有するペプチドであって、前記ペプチドは、配列番号2から構成されたペプチドであることを特徴とする細胞質残留性細胞膜透過ペプチド。
- 細胞膜透過能を有して、細胞に処理して一定時間後、前記処理された細胞にタンパク質分解酵素を処理した場合でも細胞膜透過現象を示し、細胞膜を透過した以後には、細胞質に残留する特性を有するペプチドであって、前記ペプチドは、配列番号13から構成されたペプチドであることを特徴とする細胞質残留性細胞膜透過ペプチド。
- 前記ペプチドは、配列番号1、2及び13から構成された群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか一つの項に記載の細胞質残留性細胞膜透過ペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか一つの項に記載の細胞質残留性細胞膜透過ペプチドをエンコードする核酸分子。
- 請求項1〜4のいずれか一つの項に記載の細胞質残留性細胞膜透過ペプチドに共有結合された生物学的活性分子を含む細胞質残留細胞膜透過システム。
- 請求項6の細胞質残留細胞膜透過システムをヒト細胞を除いた細胞に接触する段階を含む、生物学的活性分子を前記細胞の細胞質に運搬する方法。
- 請求項6の細胞質残留細胞膜透過システムをヒトを除いた個体に投与する段階を含む、生物学的活性分子を前記個体の細胞の細胞質に運搬する方法。
- 前記細胞は、肝細胞またはリンパ節細胞であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
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