KR20050025143A - 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포막 투과능은 있으면서도 세포질에 잔류하는 펩타이드 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 (cytoplasmic transduction peptide, CTP) 및 이의 다양한 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 CTP는 종래의 단백질 투과 도메인인 PTD 와 비교하여 세포막 투과능이 개선 또는 거의 동일하면서도 세포질 내에 잔류하는 신규한 특성을 보유하고 있기 때문에, 세포 독성 T 림프구 (CTL)-반응을 유도하는 데 적합하며, 세포질 내로의 효과적인 약물송달시스템 (DDS)을 제공한다.

Description

세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 및 이의 용도 {Cytoplasmic Transduction Peptides and Uses thereof}

본 발명은 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 (cytoplasmic transduction peptide, CTP)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포막 투과능은 있으면서도 세포질에 잔류하는 펩타이드 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.

1988년 처음으로 HIV-1의 Tat 단백질을 세포 배양액에 첨가시켜 주었을 때 능동적으로 세포 내로 수송되는 현상이 밝혀진 이후 (Green and Loewenstein, 1988; 및 Frankel and Pabo, 1988), 세포 내로 단백질이 투과(transduction) 되는 기전에 대한 연구가 집중되었다. 그 결과 Tat 단백질에 존재하는 단백질 투과 도메인 (Protein Transduction Domain: PTD)의 9개의 염기성 아미노산 (RKKRRQRRR)으로 이루어진 부분이 세포막을 통과하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Vives et. al., 1997; Futaki et. al., 2001; Suzuki et. al., 2002; Hakansson et. al., 2001; Tyagi et. al., 2001; Rusnati et. al., 1997).

Tat PTD (RKKRRQRRR)는 양전하를 갖는 아미노산이 높은 빈도로 존재하기 때문에, 다양한 방법으로 PTD 아미노산 서열을 바꾸어서 투과효율을 비교, 분석하였고, 그 결과 Arg 폴리양이온성 호모폴리머(RRRRRRRRR)의 경우 Tat PTD 보다 20배 정도 투과 효율이 증가하는 것이 관찰되었다 (Wender et. al., 2000). Arg 이외에 Lys, Orn 및 His의 경우는 Tat PTD 보다 별로 효과가 높지 않았고, Arg의 구아니딘기의 양전하를 제거한 시트룰린 폴리머의 경우는 투과 효과가 전혀 나타나지 않은 결과를 나타내었다 (Michelle et. al., 2000). 상술한 내용은 PTD의 염기성 아미노산이 중요한 역할을 하며, 그 중에서도 Arg의 구아니딘기가 투과 과정에 필수적임을 나타낸다.

PTD를 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결시켰을 경우에도 융합단백질을 효율적으로 세포 내로 수송하는 것이 밝혀진 이후 PTD를 이용한 다양한 응용이 시도되었다 (Schwarze et. al., 1999; Kim et. al., 1997; Schwarze et. al., 2000; Gius et. al., 1999; Nagahara et. al., 1998; Mai et. al., 2001; Xia et. al., 2001; Embury et. al., 2001; Rothbard et. al., 2000; Lewin et. al., 2000 및 Vocero-Akbani et. al., 1999). 대부분이 Tat 단백질의 PTD를 이용하여 원하는 단백질, 핵산, 약물 등을 원하는 세포내로 수송하는 데 초점이 모아지고 있다.

Tat 단백질 이외에도 초파리의 Antp 단백질과 HSV의 VP22 단백질에도 투과 도메인이 존재하는데 (Derossi et. al., 1994; Derossi et. al., 1996; Derossi et. al., 1998; Joliot et. al., 1991; 및 Elliott et. al., 1997), 이들 PTD의 구조 및 세포막 통과 기전에 대해서는 밝혀진 것이 거의 없다.

Tat, Antp 및 VP22의 PTD 서열간에는 염기성 아미노산이 풍부한 공통성 이외에 아미노산 서열상의 상동성은 발견할 수가 없다. HIV-1 Tat의 경우는 NMR 구조상이나 CD 스펙트럼 상에서 랜덤 코일의 구조를 나타내지만, 단백질 구조 예측 프로그램을 사용하면 α-나선 구조에 대한 경향성이 매우 강하게 나타난다 (Loret et. al., 1991; Gregoire et. al., 1996; Mujeeb et. al., 1994; 및 Ho et. al., 2001). 한편, 현재까지 알려진 막 투과성을 보유한 기능성 펩타이드들 간의 주된 차이점은 외부 단백질을 융합시킬 수 있는 크기에 대한 제한성을 들 수 있다. Antp의 경우는 아미노산 100개 미만 길이의 단백질만 융합 가능한 반면, Tat 및 VP22 경우는 1,000개 이상의 단백질까지도 융합이 가능하다 (Schwarze et. al., 2000; Fawell et. al., 1994; 및 Schwarze et. al., 1999).

PTD와는 성격이 다르지만 FGF (Fibroblast Growth Factor)에 존재하는 시그널 서열 (막투과 서열 (membrane transduction sequence: MTS) 또는 세포질 침투 서열 (cytoplasmic penetration peptide: CPP)이라고 명명됨)은 세포막을 투과하는 성질을 갖고 있는 것이 보고되었다 (Hawiger J. 1999; Hawiger J. 1997; Lin et. al., 1995 및 Liu et. al., 1996; Rojas et. al., 1998; 및 Wang et. al., 2002), 상기 시그널 서열은 세포막을 쉽게 투과하는 성질을 갖지만 NLS가 없어서 핵 내로는 들어가지 않는 특징을 보인다.

하지만 원래가 시그널 서열이기 때문에 대부분이 소포체 내로 들어가는 문제점을 갖고 있고, 또한 거대 분자인 β-갈락토시다아제를 운반하는 효율성 실험에서 MTS의 막투과 능력은 PTD와 비교했을 때 PTD의 30% 정도로서 낮은 효율을 보여준다.

도 1은 종래의 PTD 및 PTD-5의 사슬 휠 플롯.

도 2는 PTD-β-갈락토시다아제 (β-gal) 융합 단백질 및 CTP-β-길락토시다아제 융합 단백질의 정제도를 보여주는 사진. M은 프리스테인 마커 (NEB)이고, 1번 내지 16번 레인은 각각 PTD-β-갈락토시다아제 (β-gal), β-gal, CTP50-β-gal, CTP501-β-gal, CTP502-β-gal, CTP503-β-gal, CTP504-β-gal, CTP505-β-gal, CTP506-β-gal, CTP507-β-gal, CTP508-β-gal, CTP509-β-gal, CTP510-β-gal, CTP511-β-gal , CTP512-β-gal 및 MTS-β-gal에 대한 것이다.

도 3은 PTD 및 본 발명의 CTP (cytoplasmic transduction peptide)의 세포막 투과성을 비교할 수 있는 사진. 1-16 웰은 각각 PTD-β-gal, β-gal, CTP50-β-gal , CTP501-β-gal , CTP502-β-gal , CTP503-β-gal, CTP504-β-gal, CTP505-β-gal, CTP506-β-gal, CTP507-β-gal, CTP508-β-gal, CTP509-β-gal, CTP510-β-gal, CTP511-β-gal, CTP512-β-gal 및 MTS-β-gal에 대한 것이다.

도 4a는 PTD 및 본 발명의 CTP512의 세포 내 위치를 비교할 수 있는 사진.

도 4b는 도 4a의 결과를 도시한 모식도.

도 5a는 PTD 및 본 발명의 CTP 후보군의 세포 내 위치를 비교할 수 있는 사진.

도 5b는 PTD 및 본 발명의 CTP 후보군의 세포 내 위치를 비교할 수 있는 사진.

도 6a는 PTD-β-gal, MTS-β-gal 및 CTP-β-gal의 세포막 투과도를 나타내는 사진.

도 6b는 세포고정 전 트립신 전처리를 한 PTD-β-gal, MTS-β-gal 및 CTP-β-gal의 세포막 투과도를 나타내는 사진. 도 6a-6b에서, 패널 1-16은 각각 PTD-β-gal, MTS-β-gal, CTP501-β-gal, CTP502-β-gal , CTP503-β-gal , CTP504-β-gal, CTP505-β-gal, CTP506-β-gal, CTP507-β-gal, CTP508-β-gal, CTP509-β-gal, CTP510-β-gal, CTP511-β-gal, CTP512-β-gal, CTP513-β-gal 및 CTP514-β-gal에 대한 것이다.

도 7은 세포고정 전 트립신 전처리를 한 PTD-β-gal, MTS-β-gal 및 CTP-β-gal의 세포막 투과의 정량적 분석을 나타내는 그래프.

도 8은 PTD-β-gal 및 CTP-β-gal의 세포막 투과의 속도론적 분석을 나타내는 그래프.

도 9는 PTD-β-gal 및 CTP-β-gal의 세포내 위치를 보여주는 공초점현미경 사진.

도 10은 PTD-FITC(Fluorescence-iso-thio-cyanate), MTS-FITC 및 CTP-FITC의 세포막 투과도를 보여주는 FACS (Fluorescence-activated cell sorter) 분석 결과 그래프.

도 11은 PTD-FITC, MTS-FITC 및 CTP-FITC의 세포 내 위치를 보여주는 공초점 현미경 사진 (세포 고정 과정 없음).

도 12는 HeLa, L929, RENCA, Jurkat 세포주 및 비장세포에서 PTD-FITC, MTS-FITC 및 CTP-FITC의 투과도를 나타내는 그래프. 그래프 아래의 숫자 1-6은 각각 대조군, CTP503-FITC, CTP508-FITC, CTP512-FITC, PTD-FITC 및 MTS-FITC에 대한 것이다.

도 13은 마우스에 투여된 CTP-β-gal이 간에 선호적으로 이동함을 보여주는 사진.

도 14는 마우스에 투여된 CTP-β-gal이 임파절에 선호적으로 이동함을 보여주는 사진.

도 15a는 마우스에 복강 투여된 CTP-β-gal이 생체내 기관의 조직으로 침투함을 보여주는 사진.

도 15b는 마우스에 정맥 투여된 CTP-β-gal이 생체내 기관의 조직으로 침투함을 보여주는 사진.

도 16은 마우스에 정맥 투여된 CTP-β-gal이 생체내 기관의 특정부위에 집중적으로 이동함을 보여주는 사진.

도 17은 세포질 위치 단백질, XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)의 기능이 CTP-융합 단백질에 의해 억제됨을 보여 주는 그래프.

본 발명자들은 세포막 투과능이 우수하면서도 세포질에 잔류하고 핵 내로는 도입되지 않는 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 특정의 아미노산 조성을 갖는 펩타이드가 상술한 목적에 적합한 특성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 또한 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드-생물학적 활성 분자의 컨쥬게이트를 포함하는 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 완성하였다. 상술한 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 통해 단백질과 같은 생물학적 활성 분자를 생체 내로 도입함으로써 특정 장기와 조직 내부로까지 운반하는 방법을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생물학적 활성 분자를 세포질에 운반하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세포막 투과능을 갖으며, 세포에 처리하고 일정 시간 후 상기 처리된 세포에 단백질 분해효소를 처리한 경우에도 세포막 투과현상을 나타내고, 세포막을 투과한 이후에는 세포질에 잔류하는 특성을 갖는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 (cytoplasmic transduction peptide)를 제공한다.

현재까지 알려진 PTD 내에는 단백질을 세포핵 내로 운반시켜주는 핵 국부화 서열 (Nuclear Localization Sequence: NLS)이 핵심적으로 존재한다. 현재까지 91개의 NLS가 실험을 통해서 밝혀졌으며 (Cokol et. al., 2000), 아미노산 서열상의 상동성은 존재하지 않고 다만 염기성 아미노산의 빈도가 높은 특징을 나타낸다. 그러나, 염기성 아미노산은 거의 나타나지 않고 글라이신의 빈도수가 높은 NLS도 밝혀졌으며 (Bonifaci et. al., 1997), 다음의 2가지 기준에 의해서 NLS로 분류한다. 첫째는 NLS 모티프를 제거했을 때 핵 내로의 운반이 일어나지 않으며, 둘째로 비-핵 단백질과 융합시켰을 때 핵 내로 수송이 일어나면 이러한 모티프를 NLS로 명명한다 (Tinland et. al., 1992; 및 Moede et. al., 1999). PTD 융합 단백질이 핵 내로 수송되는 것을 방지하기 위해서는 간단히 PTD로부터 NLS를 제거하면 되지만, NLS 자체가 PTD 기능의 필수 요소로서 작용하고 있기 때문에 현실적으로 세포질 내로만 융합 단백질을 수송하고 핵 내로는 수송을 일으키지 않는 세포막 투과 펩타이드를 디자인하는 것은 매우 어려운 실정이다.

NLS는 핵 단백질들이 핵 내로 들어가기 위해서 임포틴-α 단백질과 결합하는 부위이며, 비 핵단백질에 융합시켰을 경우 핵 내로 들어가게 된다. HIV-1 Tat 단백질의 경우, PTD와 NLS 사이에는 정확한 구분이 있는 것은 아니고, 일부분은 HIV-1 RNA 전사체의 TAR 결합 부위와 중복되기도 한다.

HIV-1 Tat 단백질의 PTD (YGRKKRRQRRR) 내에는 핵 국부화 시그널로서 알려진 부위 (GRKKRR)가 존재하는 데, PTD가 핵 내로 들어가는 것은 NLS가 임포틴-α 로 알려진 핵 운반 인자 (nuclear transport factor)와 상호 작용하여 핵 내로 PTD 융합 단백질을 도입시키기 때문이다.

PTD 펩타이드의 실용화 용도로서 항원 전달체로 사용될 때를 예를들면, 세포질 내로 유입된 펩타이드 항원이 프로티오좀 (proteasome)을 거쳐 프로세싱 되면서 MHC 클래스 I에 실려 세포 표면으로 제시되어야 하므로, PTD의 NLS 때문에 도입한 항원의 대부분이 핵 속으로 유입된다면 오히려 MHC 클래스 I에 의한 항원 제시에는 큰 도움을 주지 못할 것이다.

또한, 세포질에서 진행되는 세포 죽음과 세포 성장을 조절하는 여러 신호 전달 과정을 대상으로 하여 개발된 특정 기능의 단백질을 위시한 치료용 물질 전달에 있어서도 PTD 의 핵 내로의 이동성은 큰 도움을 주지 못할 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 기존의 PTD 부위 중에서 NLS의 기능을 제거하여 핵 내로의 유입은 방지하면서도 세포막 투과 효율이 높은 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드, CTP를 개발하는 것이 필수적이다.

본 발명자들은 이러한 CTP를 개발하기 위하여, 분자 모델링 방법에 의존해서 PTD의 기능과 구조 사이의 상호 연관성을 면밀히 조사하였고, PTD의 기능 중에서 임포틴-α(Importin-α) 단백질과 결합하는 NLS 기능을 제거한 상태의 변이 PTD, 즉 CTP를 제작하게 되었다.

본 명세서에서, 최초로 도입된 용어, " 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드(CTP)" 는, 세포막 투과능을 보유하면서도 세포질에 잔류하는 특성, 즉 핵내로 이동하지 않는 특성을 갖는 펩타이드를 의미하는 것이다.

이러한 CTP는 본 발명자들에 의해 세계 최초로 개발된 것이다. 한편, 종래의 PTD들은 그 세포막 투과 능력에 대하여 도전을 받고 있는데 (43-46), 본 발명의 CTP는 현재 당업계에서 제기하고 있는 펩타이드의 세포막 투과 능력에 대한 의문을 모두 제거할 수 있는 진정한 세포막 투과 펩타이드이다.

본 발명의 CTP에 있어서, 펩타이드의 길이는 당업계에서 수용되는 일반적인 길이에 해당하는 것이며, 바람직하게는 9-20 아미노산, 보다 바람직하게는 9-15 아미노산, 가장 바람직하게는 약 11 아미노산이다.

본 발명의 CTP는 진정한 세포막 투과 펩타이드이기 때문에, CTP를 세포에 적용하고, 세포막 투과에 필요한 적합한 시간이 경과한 다음, 단백질 분해효소 (예: 트립신, 키모트립신 및 서브틸리신)으로 처리한 이후에도 세포막 투과현상을 나타낸다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 종래의 PTD, 특히 Tat 단백질로부터 유래된 PTD는 세포에 적용된 이후에 단백질 분해 효소를 처리하게 되면, 세포막 투과현상을 나타내지 않는다.

이는 종래의 PTD는 진정한 세포막 투과 기전에 의해 세포내로 들어가는 것이 아니라, 세포막에 정전기적 인력에 의해 결합한 상태에서, 후속의 과정인 세포고정 단계에서 세포내로 들어가기 때문이다. 그러나, 본 발명의 CTP는 진정한 세포막 투과능을 보유하고 있어, 단백질 분해효소 처리에 영향을 받지 않고 세포막을 투과한다.

본 발명의 기본적인 전략은 α-사슬을 안정화 또는 잘 형성시키는 아미노산이면서도 동시에 양전하를 띠는 R-기를 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드를 디자인하여, 임포틴-α에 대한 결합력은 최소화하면서도 세포막 투과성은 향상 또는 적어도 유지한다는 것이다.

본 명세서에서, 용어 "α-사슬 형성-강화 아미노산"은 알파-사슬구조를 형성하거나 또는 안정화시키는 경향이 있는 아미노산을 의미하며, 이러한 경향은 W.H. Freeman, Prteins:Structure and Molecular Properties, p. 235(1983)에 개시되어 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드에서 필수적으로 포함되는, α-사슬 형성-강화 아미노산은 알라닌, 아르기닌 또는 라이신이며, 보다 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이며, 가장 바람직하게는 아르기닌이다.

본 명세서에서 용어 " 양전하를 띠는 R-기를 갖는 아미노산 잔기" 는 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘과 같은 염기성 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이고, 가장 바람직하게는 아르기닌이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 CTP는 α-사슬 형성-강화 아미노산이면서 양전하를 띠는 R-기를 갖는 아미노산을 필수적인 아미노산 잔기로 포함한다. 용어, " 필수적인 아미노산 잔기" 는 α-사슬 형성-강화 아미노산이면서 양전하를 띠는 R-기를 갖는 아미노산이 본 발명의 펩타이드에서 적어도 3, 바람직하게는 적어도 5, 보다 바람직하게는 적어도 7 가장 바람직하게는 적어도 8개가 포함된 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 α-사슬을 형성하게 되는 데, 형성된 α-사슬의 N-말단 쪽에는 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 결합되어 있다.

상기 회전각 중 "φ"는 Cα-N 단일결합의 회전을 나타내며, "ψ" Cα-C 단일결합의 회전을 나타낸다. 상기 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신 또는 알라닌이며, 가장 바람직하게는, 글라이신이다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 본 발명의 CTP는 A-X₁-X₂-B-X₃-X ₄-X₅-X₆-X₇-X₈으로 나타내는 아미노산 서열을 최소의 단위로서 포함하며, 상기 서열에서 A는 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이고, X₁, X₂, B, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, 및 X₈ 중 적어도 3 잔기는 아르기닌 또는 라이신이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드에서 A는 글라이신 또는 알라닌이며, 보다 바람직하게는 A는 글라이신이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, X₁, X₂, B, X₃, X₄, X₅ , X₆, X₇, 및 X₈ 중 적어도 4 잔기, 보다 바람직하게는 5 잔기, 특히 바람직하게는 6 잔기, 가장 바람직하게는 7 잔기는 아르기닌 또는 라이신이고, 보다 바람직하게는 아르기닌이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 CTP는 서열번호 1-14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1-6, 8-10 및 13-14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고, 특히 바람직하게는, 서열번호 1-2 및 13-14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 CTP는 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.

본 발명의 펩타이드는 천연 (natural-occurring) 펩타이드로부터 선택될 수 있고, 상술한 서열 특성을 갖는 펩타이드를 인공적으로 합성할 수도 있으며 (예를 들어, 펩타이드 합성기, Applied Biosystems Model 433을 이용하여 합성), 또한 천연적으로 존재하는 단백질 투과 도메인 (PTD)에 변이를 발생시켜 얻을 수도 있다.

따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Tat 단백질의 단백질 투과 도메인 (PTD)의 서열의 일부가 α-사슬 형성-강화 아미노산으로 치환된 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드를 제공한다.

상기 PTD는 그 유래가 다양하며, 예컨대, HIV-1의 Tat 단백질이 전형적인 오리진이다. 상기 PTD의 아미노산 서열의 구체적인 예는 서열번호 15에 나타나 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 α-사슬 형성-강화 아미노산은 아르기닌 또는 알라닌이며, 보다 바람직하게는 아르기닌이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드는 서열번호 1-2 및 13-14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고, 보다 바람직하게는 서열번호 1 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다.

본 발명의 CTP는 하기의 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 세포고정에 의해 세포내로 들어가는 종래의 PTD와는 다른, 진정한 세포막 투과 펩타이드이며, 종래의 PTD와 비교하여 개선된 세포막 투과도를 나타낼 뿐만 아니라, 세포질에 잔류하는 특성을 갖고 있다. 따라서, 그 응용성이 매우 크다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 CTP를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 단사슬 또는 이중사슬의 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 자연의 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 벡터에 포함되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 CTP에 공유결합된 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 제공한다.

본 발명의 CTP에 결합될 수 있는 생물학적 활성 분자는 세포내로 유입되어 세포질에 존재하는 특정의 생체 분자에 작용하여 일정한 생물학적 효과를 나타내는 물질로서, 예컨대, 조절 인자, 효소 및 항체와 같은 단백질 또는 펩타이드, 의약 과 같은 화학 물질, 탄수화물, 지질, 당지질 그리고 DNA (cDNA 또는 gDNA) 또는 RNA (mRNA 또는 안티센스 RNA)와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

세포질 잔류 세포막 투과 시스템에 있어서, CTP에 공유결합되는 분자는 CTP의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다. 공유결합 방법은 생물학적 활성 분자의 종류에 따라 당업계에 공지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 단백질이 생물학적 활성 분자로 이용되는 경우에는, 유전자의 재조합 기술을 이용하여 융합 유전자 (CTP-단백질을 인코딩하는 유전자)를 클로닝 및 세포 내 발현을 통해 CTP-단백질을 얻을 수 있다. 본 명세서에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 Joseph Sambrook, et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시된 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

또한, 다양한 교호 결합제를 이용하여 CTP-생물학적 활성 분자 컨쥬게이트를 얻을 수 있다. 이용 가능한 교호 결합제는 CTP의 운반능력 및 세포질 잔류성 그리고 생물학적 활성 분자의 활성을 방해하지 않는 것이 이용된다. 예를 들어, N-숙시니미딜 요오도아세테이드, N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 디스디아조벤지딘, 3,3 -디티오-비스-(설포숙시니미딜-프로피오네이트), 에틸렌 글리콜비스(설포숙시니미딜숙시네이트), 디시클로헥실 카보디이미드 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 생물학적 활성 물질이 CTP로부터 해리되었을 때에만 활성을 나타내는 경우에는, 사이 교호 결합제는 생체내에서 절단가능한 것이 이용된다. 예를 들어, 카복실산 에스테르 및/또는 디설파이드 결합이 있는 결합제가 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 CTP를 종래에 개발된 바이러스 백신 벡터 (예: 폴리오바이러스 벡터)에 결합시키는 경우에는 세포 내로 도입된 유전자에서 발현된 단백질이 유전자가 도입되지 않은 주변의 다른 세포 내로 침투하여 세포질에 잔류하게 됨으로써 세포 독성 T 림프구 (CTL) 유도능이 향상된 우수한 백신 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 세포질 잔류 세포막 투과 시스템 (즉, CTP-생물학적 활성 분자의 컨쥬게이트)을 세포 또는 개체 (individual)에 투여하는 단계를 포함하는 생물학적 활성 분자를 세포질에 운반하는 방법을 제공한다.

본 발명의 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 세포에 직접 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 특정 분자를 다양한 세포에 세포질 잔류성 운반을 한다 (하기 실시예 참조). 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 다양하며, 예컨대, T 세포, B 세포, 대식세포, 수지상세포, 내피세포, 상피세포, 각질세포, 근육 세포, 섬유아세포, 종양세포, 비장세포, 간세포, 신장세포, 심장조직세포, 비장세포, 임파절세포, 신경세포에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 조건은 CTP의 종류, 운반되는 분자 및 대상의 세포에 따라 다양하다. 예를 들어, 운반되는 분자의 분자량이 큰 경우에는 CTP-컨쥬게이트의 처리 시간이 길어진다. 일반적으로, 처리온도는 대략 22℃-37℃가 바람직하며, 처리 시간은 10분-30시간이 바람직하다. 한편, 본 발명의 CTP에 항원 단백질을 결합시키고 이를 이용하여 수지상 세포를 펄싱하는 경우에는 보다 강력한 수지상 세포 백신을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 특히, CTL-반응을 유도하는 데 적합하다. 현재까지 알려진 세포막 투과 시스템 중, 본 발명의 세포막 투과 시스템과 같이 세포에 적용되어 핵내가 아닌 세포질로 특정 분자를 운반하는 것은 없다.

투여 대상이 개체인 경우에는, 다양한 경로를 통해 본 발명의 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 투여할 수 있다. 예를 들어, 복강 또는 정맥 투여를 실시할 수 있다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 개체에 투여한 경우, 특정 생체내 기관(간 또는 임파절)에 선호적으로 이동하는 특성을 나타낸다(하기 실시예 참조). 따라서, 본 발명의 방법은 생물학적 활성 분자를 간 또는 임파절로 운반하고자 하는 경우에 특히 적합하다. 또한, 본 발명의 세포질 잔류 세포막 투과 시스템은 생체내 기관에서 특정 부위에만 국소적으로 이동하는 특성을 나타낸다. 현재까지 알려진 세포막 투과 시스템 중, 본 발명의 세포막 투과 시스템과 같이 개체에 적용되어 특정 분자, 특히 거대 분자(예: β-갈락토시다아제)를 운반하는 것은 없다. 따라서, 본 발명의 방법은 약물 (화학의약 및 바이오의약 포함) 송달시스템으로서의 가치가 매우 높다. 용어 " 개체" 는 바람직하게는, 동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 방법에 따르면, 운반되는 생물학적 활성 물질은 세포질에 잔류하기 때문에, 종래의 PTD들이 핵내로 운반되어 나타나는 부작용을 완벽하게 제거할 수 있다.

현재까지 다수의 세포막 투과 시스템이 개발되었다. 그러나, 대부분의 세포막 투과 시스템은 세포막을 통과한 이후, 핵내로 물질을 운반하기 때문에, 세포질에 특정 물질을 타깃팅하는 것은 현재까지 불가능하다. 본 발명은 이러한 당업계에서 오래 동안 해결하지 못했던 기술적 문제를 완벽하게 해결하고 있다. 본 발명의 CTP의 특성, 즉, 특정 물질을 세포질에 운반 및 잔류시키는 특성은 상술한 바와 같이, 다양한 용도로 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: CTP 디자인 개요

막 투과성 기능 펩타이드로부터 NLS의 기능을 제거하는 것이 본 발명의 CTP 개발 디자인의 목적이므로 NLS의 기능적 요건을 이해하는 것이 일차적 작업이다. NLS의 구조적 특성을 이해하기 위해서 마우스의 임포틴-α단백질과 핵 단백질인 뉴클레오플라즈민 (nucleoplasmin)의 NLS 부위와 결합한 상태의 구조를 참조하였다 (Fontes et al., 2000). 임포틴-α 에는 음전하가 많이 분포된 결합 클레프트 (binding cleft)가 존재하는 데, 그 안에 양전하를 띈 NLS의 Lys 잔기가 신장·트위스된 (extended ＆ twisted) 형태로 결합하고 있다.

뉴클레오플라즈민 NLS에는 C-말단 부위에 4개의 연속된 Lys 잔기가 나타나는 데, 이들은 임포틴-α의 결합 클레프트 내에서 신장된 형태로 존재하며, 음전하를 띈 결합 클레프트와 최대한의 염 다리를 형성하고 있는 양상을 하고 있다.

따라서 임포틴-α 단백질과 Tat PTD 간의 결합 구조는 밝혀지지 않았지만, PTD의 NLS 부위가 임포틴-α 와 결합하기 위해서는 α-사슬 구조의 견고성이 오히려 장애 요인이 될 가능성이 크다고 볼 수 있다. HIV-1 Tat 단백질 구조는 NMR에 의해서 밝혀졌는 데, PTD 부위는 α-사슬을 형성하는 대신에 신장된 코일 구조를 하고 있어서, 임포틴-α 단백질과의 결합에 적합한 구조를 갖고 있다. 본 발명의 전략에 따라 개발된 CTP 후보 물질들은 분자 모델링 방법에 의한 구조 분석을 수행했을 때, α-사슬을 형성하는 경향성이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에서는 PTD를 개량한 CTP개발의 기본 개념으로 임포틴-α 단백질과 결합할 것으로 예상되는 PTD의 NLS 부위를 변형하여 PTD 보다 안정한 α-사슬을 형성하게 함으로써 신장된 코일로 전형되는 성질을 최소화하여 임포틴-α 에 대한 결합력은 최소화하면서도, 세포막 투과능력은 PTD와 거의 비슷하거나 오히려 뛰어난 효율을 보이는 것을 바람직한 목표로 설정하였다.

NLS와 결합하는 임포틴-α의 결합 클레프트 구조는 신장·트위스된 형태이기 때문에, CTP 부위가 PTD 보다 α-사슬을 안정적으로 형성하게 되면 α-사슬의 견고성 때문에 CTP와 임포틴-α 사이에 결합은 비효율적이 되고, 그 결과 CTP 또는 CTP 융합 단백질은 핵 내로 운반되기 보다는 세포질 내에 다량으로 존재하게 될 것이다.

본 발명에서는 워싱턴 의과대학의 Dowdy 연구실에서 개발한 PTD와 그의 변이형을 (Ho et al., 2001) 기초로 분자 모델링 방법으로 아미노산 서열을 조정하면서 CTP를 개발하였지만, 개념적으로는 완전히 다른 기능의 펩타이드를 개발하였다. Dowdy 그룹의 연구는 형광 물질을 결합시킨 15개 길이의 펩타이드가 세포 내로 들어가는 정도를 수행한 결과로서 대부분의 펩타이드가 핵 내로 들어가는 반면에, 본 발명에서 개발된 CTP 유도체들은 분자량 120만인 β-갈락토시다아제를 융합시킨 상태에서 고분자량의 단백질을 세포질 내로만 운반할 수 있는 CTP 후보군을 선별하였다.

우선, Dowdy 그룹에서 발표한 7 종류의 개량 PTD에 대한 분자 모델링을 수행한 결과, 이들은 모두 양친매성의 (amphipathic) α-사슬을 안정적으로 형성하는 것을 분석하였다. 이들 α-사슬이 어떤 기전에 의해서 세포막을 통과하는 지에 대해서는 알려진 바가 없지만, 분자 모델링 결과 α-사슬의 다이폴 모먼트 (dipole moment) 및 정전기적 포텐셜에 의한 생체막과의 상호 작용이 PTD 펩타이드가 막을 통과하는 데 중요하게 작용할 것으로 예측되었다. 이들 중에서 PTD와 염기성 아미노산의 분포가 거의 비슷한 개량 PTD 들을 대상으로 β-갈락토시다아제와 융합하여 생체막 통과 정도를 테스트하였다. 그 결과 보고된 것과는 전혀 다른 결과를 얻게 되었는데, Dowdy 그룹의 연구 결과에 의하면 PTD5의 경우 PTD (TAT) 보다 8배나 높은 효율로 펩타이드를 세포 내로 운반시켜 주지만, β-갈락토시다아제를 융합시켰을 경우는 오히려 50배 이상으로 막을 투과하는 효율이 감소되는 것을 관찰하였다. 이와 같은 결과는 펩타이드만을 갖고 수행한 막 투과 효율을 일반적인 융합 단백질의 막투과 능력으로 일반화시키는 것은 적절치 않음을 의미한다.

한편, PTD5와 융합된 β-갈락토시다아제의 경우, 막 투과 효율은 야생형인 PTD 융합단백질에 비해서 50배 정도 감소하지만, 상대적으로 PTD에 비해서 융합된 단백질을 세포질 내에 머무르게 하는 정도가 증가한 현상을 발견하고, 이것을 주형으로 해서 개량된 CTP를 개발하였다.

도 1에서 보여주는 바와 같이, PTD5의 경우 α-사슬을 형성할 때 한쪽 방향으로만 염기성 아미노산인 5개의 아르기닌 (Arg5: 3번, 6번, 7번, 10번 및 11번 Arg)이 분포하는 특성을 갖고 있다.

본 발명에서 CTP 개발의 기본 개념은 다음과 같다. PTD5에서 5개의 아르기닌 (Arg5)을 그대로 유지한 채 α-사슬의 6번 Arg 및 11번 Arg 주위의 아미노산인 2번과 4번 Ala 위치를 양전하를 갖는 Arg으로 치환하거나 (CTP503, 507, 508 및 509) 음전하인 Glu로의 치환하거나 (CTP505 및 506), 크기가 작아서 자유로운 구조를 갖는 Gly으로 치환하거나 (CTP 504), 또는 구조적으로 제한된 Pro으로 치환하여(CTP 501, 502) CTP 후보 펩타이드 서열을 결정하였다 (참조: 표 1).

보다 다양한 아미노산 서열로의 치환이 가능하겠지만, 기본적인 PTD 펩타이드의 기능을 유지하기 위해서는 Arg에 의한 양전하의 도입 및 α-사슬을 안정화시키는 아미노산으로의 치환이라는 기본 전제가 필수적이기 때문에, 양전하는 Arg, 음전하는 Glu으로 한정하였다. CTP 후보 펩타이드에 β-갈락토시다아제 단백질을 융합시킨 다음, 대장균에서 융합단백질을 분리 및 정제하고 (참조: 도 2), HeLa 세포에 처리하여 세포막 투과 능력 및 세포질 잔류정도를 비교, 분석하였다.

실험 결과, 2번 위치에는 크기가 작고 유연성이 높은 Gly이 치환되었을 때 CTP로서 기능이 증가하였다. 4번 Ala 의 경우 음전하인 Glu으로 치환되었을 경우는 CTP로서의 기능이 떨어지는 반면, 4번 및 8번 Ala를 양전하인 Arg으로 치환하여 전체적인 양전하 분포가 증가할수록 CTP 기능이 증가하는 것을 관찰하였다. 또한, 본 발명의 CTP와 유사한 개념이지만 대부분이 세포질에 남아 있는 것이 아니고 소포체 내로 들어가는 MTS와 세포막을 투과하는 정도 및 핵 내로 들어가지 않은 성질을 비교하기 위해서 MTS-β-갈락토시다아제 융합단백질을 정제하여 비교 실험을 수행하였다.

이상의 결과를 바탕으로 해서 새로운 CTP 510, 511 및 512를 제조하여 세포막 투과 능력 및 세포질 잔류 성질을 비교, 분석한 결과, CTP511은 PTD와 거의 비슷한 정도의 막투과 능력과 우수한 세포질 잔류 성질을 보여주고, CTP512의 경우는 야생형인 PTD 융합단백질보다 융합단백질의 세포막 투과능력은 오히려 증가된 반면 세포질 잔류 성질이 PTD 융합단백질과 비교했을 때 우수하여 세포 내로 들어간 단백질의 대부분이 세포질에 남아 있는 성질을 보여 주었다.

비교 실험으로 실시한 MTS 융합단백질 경우는 세포막을 투과하는 효율이 CTP508과 유사한 정도로서 야생형인 PTD 융합단백질과 비교했을 때 20%도 되지 않은 세포막 투과 효율을 나타내었다 (참조: 도 3). 본 발명에서는 CTP 512를 비롯하여 세포막 투과 효율은 CTP 512보다 떨어지지만 세포질 잔류성이 우수한 CTP511, CTP509, CTP508 등의 세포막 투과 후 세포질 잔류성을 보이는 새로운 막투과 펩타이드 (CTP)를 개발하게 되었다.

[표 1]

실시예 2: CTP 후보군의 pTAT-HA LacZ 벡터 클로닝 및 단백질 정제

실시예 2-1: CTP 후보군에 대한 프라이머 리스트

본 실시예에서 이용되는 pTAT-HA LacZ 벡터는 Washington 대학의 S. Dowdey 박사로부터 분양 받았으며, 상기 벡터는 pTAT-HA 벡터의 XhoI 부분에 LacZ 단백질이 클로닝 되어 있는 것이다. pTAT-HA 벡터는 목적 단백질의 발현 및 정제를 위한 T7 프로모터, 6x His-태그, TAT 도메인이 태깅되어 있고, 클로닝을 위한 멀티플 클로닝 위치가 존재한다. 본 발명의 CTP 후보군을 클로닝하기 위해서, pTAT-HA LacZ 벡터의 TAT 도메인과 HA-태그 부위를 BamHI 및 NcoI 제한효소로 제거한 뒤에, 본 발명의 CTP 후보군을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 클로닝하였다. β-갈락토시다아제 단백질를 코딩하는 유전자인 LacZ 는 pTAT-HA 벡터의 XhoI 부분에 클로닝 되어 있다.

CTP 후보군의 아미노산 서열은 상기 표 1과 같다. MTS (12개의 펩타이드)를 제외한 PTD 및 본 발명의 CTP 후보군은 11개의 펩타이드로 구성되어 있으며, 치환된 아미노산은 볼드체로 표시하였다. CTP 개발을 위한 프라이머는 (주)제노텍에서 합성하였으며, 각각을 PAGE로 정제하여 사용하였다. 프라이머는 전방향 (f)및 역방향 (r) 각각을 합성하였고, 프라이머 어닐링 방법으로 TAT 도메인 및 HA 도메인이 제거된 pTAT-HA LacZ 벡터에 클로닝 하였다. 합성된 프라이머의 DNA 염기 서열은 다음 표 2와 같다:

[표 2]

실시예 2-2: pTAT-HA LacZ 벡터 내로의 CTP 후보군의 클로닝

pTAT-HA LacZ 벡터를 제한효소 BamHI 및 NcoI으로 절단하여 Tat 도메인과 HA-태그 도메인을 제거하였다. CTP 후보군에 대한 상보적인 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 95℃에서 5분간 가열한 다음 온도를 1℃/분의 속도로 상온까지 떨어뜨렸다. 이러한 프라이머 어닐링 방법으로 만들어진 삽입 서열과 상기 벡터를 16℃에서 18시간 동안 연결 (T4 DNA ligase, Roche)하여 재조합 플라스미드를 제작하였다. 재조합 플라스미드로 E. coli JM109 (Stratagene)를 형질전환하여 LB-Amp (50 ㎍/㎖)배지에서 18시간 배양한 뒤 형성된 콜로니 중 일부를 LB-Amp 배지에서 증식시키고 재조합 플라스미드 DNA를 얻었다. CTP 후보군이 정상적으로 도입되었는지 여부는 클론을 제한효소로 절단하여 확인하였다. 최종적으로 CTP 후보군에 대한 재조합 플라스미드 도입 부위의 염기서열분석은 SolGent사에 의뢰하여 분석하였다. 그 결과 최초 제작된 프라이머의 DNA 염기서열과의 유사성은 100% 일치하였다.

실시예 2-3: PTD 및 CTP β-gal의 발현 및 정제

상기 실시예 2-2에서 구축된 PTD 또는 CTP 후보군이 도입된 PTD 또는 CTP-LacZ 재조합 플라스미드로 E. coli BL21 (DE3) (Novagen)를 형질전환하여 이를 PTD 및 CTP-β-갈락토시다아제 단백질의 발현과 정제에 사용하였다.

형질전환된 E. coli BL21 (DE3) /PTD-LacZ 또는 BL21(DE3)/CTP-LacZ를 250 ㎖의 LB-Amp 배지에서 18시간 동안 배양하였다. 본 발명에서 pTAT-HA LacZ 발현 플라스미드는 LB 배지에 존재하는 미량의 유당 (lactose)에 의해 목적 유전자가 대량 발현되는 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 E. coli BL21(DE3)/PTD-LacZ 또는 BL21(DE3)/CTP-LacZ는 IPTG 유도 없이 밤새 배양하였다.

LB 배지에서 배양된 형질전환체를 수확하여 25 ㎖의 파쇄 완충용액(50 mM Na.Pi (pH 7.4), 300 mM NaCl)에 현탁한 후, 라이소자임 (1 mg/㎖)으로 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 5분간씩 음파 파쇄를 (40% duty, 6 output) 3번 수행하여 세포를 파쇄한 뒤, 15,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 수용성 분획을 Ni-NTA 레진 (Qiagen)에 결합시켰다.

수용성 분획을 파쇄 완충용액으로 평형화시킨 5 ㎖의 Ni-NTA 레진에 3번 반복하여 결합시킨 다음 20 mM 이미다졸이 첨가된 파쇄 완충액 25 ㎖로 세척하였다. 250 mM 이미다졸이 첨가된 파쇄 완충액12 ㎖로 용출하여 SDS-PAGE로 분석하였다 (참조: 도 2).

SDS-PAGE 분석을 통해서, 약 120 kDa의 PTD 및 CTP β-gal 단백질이 정제됨을 알 수 있었다. 정제된 단백질을 PBS로 투석한 뒤에 Pierce 사의 CommassieTM Plus-200 Protein Assay Reagent를 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 단백질의 활성을 알아보기 위하여 ONPG (0-nitrophenyl β-D-galactopyranoside)를 15 mM의 농도가 되도록 0.1 M Na.Pi (pH 7.4)완충용액에 녹인 40 ㎕의 기질 용액에 동일한 양이 되도록 희석시킨 단백질 80 ㎕를 첨가하여 상온에서 5분간 반응시켰다. 80 ㎕의 0.5 M Na2CO3로 반응을 중지시킨 후, ELISA 마이크로플레이트 리더 (Bio-Rad) 405 nm에서 흡광도를 측정하여 정제된 단백질의 활성이 동일함을 확인하였다.

실시예 3: PTD 및 CTP-β-갈락토시다아제의 HeLa 세포 내로의 도입

PTD와 CTP 후보군의 세포 내 도입 활성을 HeLa 세포를 대상으로 하여 실험하였다. 24-웰 플레이트 (Nunc)를 이용하여 고 포도당 DMEM (10% FBS 함유) 배지에 HeLa 세포 5 x 104 를 분주한 후 36시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 PTD 및 CTP- β-갈락토시다아제 단백질을 opti-MEM I 배지에 100 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 첨가하였다. 1시간 동안 배양한 후, 고정액 (2％ 포름알데히드, 0.2% 글루타르알데히드 in PBS)으로 상온에서 10분 동안 세포를 고정하였다. PBS로 두 번 세척한 다음, 세포 내 도입 활성을 관찰하기 위해서 염색액 (0.1% X-gal, 5 mM 포타슘 페리시아나이드, 5 mM 포타슘 페로시아나이드, 2 mM HgCl2 in PBS)으로 2시간 동안 염색하였다(참조: 도 3). 2시간 염색했을 때 염색 정도가 낮은 시료에 대해서는 하룻밤 동안 염색한 뒤에 염색된 정도를 비교하여 상대적으로 세포 내로 들어가는 정도를 측정하였다. PTD와 CTP 후보군의 HeLa 세포 도입 활성을 비교 분석한 결과 다음과 같은 순위로 세포 내로 융합 단백질을 도입시키는 것을 알 수 있었다.

PTD5 ＜ CTD502＜＜ CTP501 = CTP506 ＜ CTP507 ＜ CTP505 ＜ CTP503 = CTP504＜CTP508 = CTP510 = MTS ＜ CTP509 ＜＜ PTD = CTP511 ＜ CTP 512

활성이 낮은 CTP501, CTP502, CTP506 및 CTP507 에 대한 특성을 비교해 보면, 이들은 α-사슬이 시작되는 1, 2번 부위에 구조적으로 제한된 Pro가 존재하거나 (501, 502), 2번 위치에 음전하를 띄거나 (506), 크기가 비교적 큰 양전하 (507)를 갖는 특징을 보여준다. 2번 위치에 크기가 작아서 자유로운 구조를 갖기에 적합한 Gly이 치환된 CTP505의 경우는 PTD5와의 차이가 2번 위치의 Ala 가 Gly 으로 바뀐 것 밖에 없다. 그러나, PTD5에 비해서 20배 정도 세포 내로 들어가는 정도가 증가할 뿐만 아니라 세포질에 남아 있는 양이 증가되는 것을 알 수 있었다. 하지만 막을 통과하는 정도만 비교했을 때는 CTP505의 경우는 야생형인 PTD에 비해서 10%도 되지 않을 정도로 상당히 낮은 것을 알 수 있다. 이상의 결과는 2번 위치에는 크기가 작고 유연성이 높은 Gly 이 치환되었을 때 CTP로서의 기능이 증가됨을 알 수 있다.

전체적으로 세포 내로 융합 단백질을 운반하는 능력이 뛰어난 CTP503, CTP504, CTP505, CTP507, CTP508 및 CTP509 에 대한 특성을 비교하면, 비록 2번 위치에 크기가 큰 곁사슬을 갖는 경우에도 전체적인 양전하의 양이 증가하는 양상을 보여주고 있다. CTP508 (2A 4K)과 CTP509 (2K 4K)를 비교하면, CTP509는 2번 위치에 Lys를 가져서 불리하지만, 전체적인 양전하의 양이 증가함으로써 CTP508 보다 뛰어난 세포막 투과 성질을 갖고 CTP508 및 CTP509는 모두 세포질 잔류 성질이 PTD에 비해서 탁월한 것을 알 수 있다.

이상의 결과를 바탕으로 해서 2번 위치는 Gly으로 치환하고 5번, 8번 및 9번 위치에 단계적으로 Ala를 Arg으로 치환하여 전체적인 양전하의 양을 증가시킨 새로운 CTP 510, 511 및 512를 제조하여 세포막 투과 능력 및 세포질 잔류 성질을 비교 분석하였다. CTP 511은 PTD와 거의 비슷한 정도의 막 투과 능력과 우수한 세포질 잔류 성질을 보여 주었고, CTP 512의 경우는 야생형인 PTD 융합단백질보다 융합단백질의 세포막 투과 능력은 오히려 증가된 반면 세포질 잔류 성질이 PTD 융합단백질과 비교했을 때 탁월하여 세포 내로 들어간 단백질의 거의 대부분이 세포질에 남아 있는 성질을 보임으로써 본 발명이 목적했던 바, 세포질 잔류성 막투과 펩타이드(CTP)로서의 성질을 갖는 새로운 펩타이드를 개발하게 되었다.

실시예 4: 공초점 주사 현미경을 통한 CTP-β-gal의 세포 내 위치 관찰

세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 (CTP)의 선별을 위한, 공초점 주사현미경 분석은 HeLa 세포를 이용하였으며, 형광 염색은 FITC(Fluorescence-iso-thio-cyanate)를 이용한 단일 염색 (single staining)과 PE (phycoerythrin)을 이용한 DNA 염색 시약 (green fluorescence SYTO-16 DNA staining dye, Molecular Probe)과의 이중 염색 (double staining)을 통해 수행되었다. 먼저, HeLa 세포 (5 x 10⁵ cells/㎖)를 멸균된 커버-슬립이 담겨 있는 6-웰 플레이트에 깔아주고, 37℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. 다음날, PBS (pH 7.4)를 이용하여 1회 세척하고 OPTI-MEM I 배지를 이용하여 1 ㎖ 정도 채운 후에, 후보 CTP 단백질 (100 ㎍/㎖)을 넣어 주었다. 양성 대조군으로서 PTD-β-갈락토시다아제 융합단백질을 이용하였으며, 음성대조군으로는 β-갈락토시다아제 단백질만을 이용하였다. 후보 CTP 단백질을 펄싱하여 넣어준 후 37℃ 배양기에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS를 이용하여 3회 세척한 후, 2% 파라포름알데히드를 이용하여 4℃에서 20분간 고정시켰다. 고정된 HeLa 세포를 세척용 완충액 (0.2% BSA 및 0.02% 소듐 아지드를 함유하는 PBS)를 이용하여 3회 세척하였다. 항체의 투과성을 높이기 위하여, 세포를 0.5% Triton X-100 (in PBS, Sigma)를 이용하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후, 세척용 완충액을 이용하여 3회 세척하고, 항체를 이용한 염색을 실시하였다. 먼저, 단일 염색의 경우는 1차 항체인 마우스 유래 항 β-갈락토시다아제 단일 클론 항체(Mouse anti-β galactosidase monoclonal antibodies, 1:2,000, Sigma)를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세포를 세척용 완충액으로 3회 세척하였다. 이차 항체로는 FITC가 접합되어있는 염소유래 항 마우스 IgG 항체 (Goat anti-mouse IgG FITC, 1:2,000, Jackson Laboratory)를 이용하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 세포를 세척용 완충액을 이용하여 3회 세척하고. 슬라이드 글라스 위에 형광 고정 배지 (Fluorescence mounting medium, DAKO) 1 방울을 이용하여 고정시키고 응고 접합제 (nail vanish)를 이용하여 커버 슬립의 테두리를 밀봉하였다.

SYTO-16 DNA 염색 시약을 이용한 이중 염색의 경우는 다음과 같다. 먼저, 1차 항체를 동일한 조건에서 반응시키고 3회 세척하였다. 2차 항체로는 PE가 접합되어 있는 염소유래 항 마우스 IgG 항체 (Goat anti-mouse IgG PE, 1:2,000, Jackson Laboratory)를 이용하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 세척용 완충액을 이용하여 3회 세척하고, SYTO-16 DNA 염색시약 (1:2,000, DAKO)을 이용하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 세척용 완충액을 이용하여 3회 세척한 후에 세포를 슬라이드 글라스 위에 고정하고 밀봉하여 공초점 주사 현미경 (confocal laser scanning microscope) 분석에 이용하였다.

공초점 레이저 주사 현미경을 이용한 분석은 아르곤 (Ar), 크립톤(Kr) 레이저 발생, 주사 장치를 가지며, FITC (510-550 nm)와 PE (600-660)를 각각 독립적인 채널에서 검출할 수 있는 필터 (filter)가 내장된 LEICA TCS NT SP (LEICA Lasertech GmbH, Heidelverg, Germany)를 이용하였다. 사진촬영은 PL-APO X100 대물렌즈 (objective)를 이용하여, 단일염색의 경우는 한 세포에 대하여 4단 분할영역 (section)을 수행하여 FITC와 투과(transmission) 사진을 촬영하였으며, 이중 염색의 경우는 각각 필터를 달리 하여 FITC, PE, 그리고 투과 사진을 촬영하였다.

NLS을 갖는 단백질은 핵 내로 들어가지만 대부분은 핵막 주변부위(Perinuclear area)에 분포하는 것으로 알려져 있다 (Lin et al., 1995). PTD/CTP-β-gal 융합단백질의 세포 내 분포를 살펴보기 위해서 β-gal에 대한 항체를 이용하여 공초점 현미경을 통해서 관찰하였다. PTD 융합단백질은 자체 내에 NLS 부위를 갖고 있기 때문에 대부분이 핵 내로 들어가는 반면, 본 발명에서 개발된 CTP의 경우는 대부분이 핵 안으로 들어가지 않고 세포질 내에 존재하였다 (참조: 도 5a 및 5b).

공초점 현미경에서는 세포를 3차원적으로 다분할 하여 촬영이 가능하기 때문에 각 분할 면에서의 단백질 뿐만 아니라 다분할 영역으로 촬영한 사진을 오버랩시킬 경우에는 3차원적인 분포를 살펴볼 수 있는 장점이 있다. 이때 특정 세포 내에서 핵의 위치는 위상차 현미경을 통해서 촬영한 이미지를 비교하여 알 수 있다. 도 4a 및 도 4b에서는 PTD 융합단백질의 거의 대부분이 핵 내 - 정확하게는 핵막 주변 부위 -에 분포하는 것을 볼 수 있다. 반면 CTP512 융합단백질의 경우는 세포막 투과 능력은 오히려 야생형인 PTD 융합단백질보다 높지만, 세포 내에서는 거의 대부분이 세포질 내에 분포하는 것을 관찰할 수 있었다.

본 발명에서 개발한 CTP 후보군 전체에 대해서 공초점 현미경으로 촬영한 4단 분할 영상을 오버랩해서 합성한 것과 각 샘플에 대한 위상차 현미경 사진을 도 5에서 관찰할 수 있다. 도 3에서 세포막을 투과하는 정도를 X-Gal 염색을 통해서 관찰하고, 이들의 세포 내의 분포를 공초점 현미경을 이용하여 관찰한 결과 (참조: 도5a 및 5b)를 바탕으로 하여, 본 발명에서는 세포막 투과성이 야생형인 PTD 보다 우수하면서도 세포질 잔류성이 뛰어난 CTP512를 개발하였다. 또한 CTP511의 경우는 세포막 투과성은 야생형과 유사하지만, 세포질 잔류성에서는 CTP512와 유사한 효율을 보여주었다. CTP508 및 CTP509는 비록 세포막 투과성은 야생형에 비해서 떨어지지만, 세포질 잔류성 측면에서는 야생형 PTD 보다 우수한 막 투과 펩타이드 (CTP) 임이 입증되었다.

실시예 5: CTP의 세포막 투과 능력 진정성 (authenticity) 여부 분석

최근 세포막 투과 펩타이드 중 HIV-1 Tat 단백질에서 유래된 PTD의 막투과 기능이 PTD 펩타이드 자체의 막투과 성질보다는 PTD에 포함된 다량의 양전하 아미노산들에 의해 음전하를 띠는 세포막에 정전기적으로 부착된 상태에서 세포고정 과정 중 세포 내로 유입되어 나타나는 인위적인 현상일 가능성이 제시되고 있다 (43-45). 더불어, 상술한 사실이 PTD 펩타이드를 처리한 세포를 일정 시간 후 다시 트립신을 처리하여 세포막에 부착된 펩타이드를 제거하면, 세포 내로 도입된 펩타이드의 양에 현저한 차이가 발생하고 또한 막투과 기전은 기존 보고와는 달리 엔도사이토시스에만 기인한다는 사실이 보고되면서 (46), 기존에 알려진 여러 종류의 막투과 펩타이드 들은 기능상의 재점검을 요구받고 있다.

따라서, 본 발명자들은 본 발명의 CTP도 상술한 종래의 PTD와 같이 세포막 투과 기전에 대한 챌린징을 받을 문제점은 없는 지 여부를 확인하였다.

실시예 5-1: 트립신 처리과정 없이 CTP-β-gal 융합 단백질의 세포막 투과 효능 확인

CTP를 비롯한 PTD와 MTS 등 세포 투과 펩타이드의 (Cell permeable peptide, CPP) 세포막 투과 효율을 비교하기 위하여, 각 CPP에 β-gal이 융합된 단백질을 50 ㎍/㎖의 농도로 HeLa 세포에 처리하여 세포 내 도입된 β-gal 효소 활성을 측정하였다. β-gal 효소 활성은 실시예 3과 동일하게 실시하였고, 최종적으로 염색된 세포를 현미경에서 사진으로 촬영하였다 (참조: 도 6a). 도 6a에서 볼 수 있듯이, CTP512로 처리한 세포에서 PTD와 MTS로 처리한 세포에 비해 월등히 강력한 β-gal 활성을 보였으며, CTP513 및 CTP514의 경우 CTP513은 CTP512와 비슷한 정도로 CTP514는 PTD와 비슷한 정도로 처리된 세포에서 β-gal 활성을 보였다. 그러나, 이러한 실험 결과는 관찰된 β-gal 활성이 세포막 투과를 통해 세포 내로 도입된 양인지 또는 단순하게 세포막에 부착된 것이 고정과정에서 세포 내로 유입된 것인지를 나타내지는 못한다.

실시예 5-2: 트립신 처리에 의한 CTP-β-gal의 세포막 투과 정도 확인

본 발명의 CTP가 실제적으로 세포막을 투과하는지, 아니면 단순히 세포막과 정전기적 인력에 의해서 결합되었다가 고정과정에서 세포막을 투과하여 세포 내로 들어가는지 여부를 확인하였다. HeLa 세포를 48-웰 플레이트에 2x10⁵/㎖로 배양한 뒤 37℃에서 1일 동안 DMEM (high glucose)배지를 이용하여 배양 후 1x PBS로 1회 세척하였다. PTD-β-gal, MTS-β-gal, CTP501 - 514-β-gal을 50 ㎍/㎖의 농도로 OPTI-MEM에 첨가하여 세포에 첨가하여 20 시간동안 배양하였다. 이어, 세포를 트립신-EDTA(10x)로 37℃ 에서 3 분간 처리하여 세포 표면에 잔존하는 CPP-β-gal 단백질들을 모두 제거한 뒤, 세포를 1x PBS로 2회 세척하고 고정용액으로 실온에서 10분간 고정하였다. 세포를 1x PBS로 2회 세척 후 염색용액으로 37℃에서 2시간동안 염색한 뒤 현미경 상에서 세포를 촬영하였다 (참조: 도 6b).

도 6b에서 볼 수 있듯이, CTP512와 CTP513이 PTD와 MTS에 비교하여 β-gal를 매우 효과적으로 세포 내로 도입함을 확인하였으며, CTP511과 CTP514에 의해 도입된 β-gal 활성은 PTD와 비슷한 정도였다. 따라서, 본 발명의 CTP 중 적어도 CTP512와 CTP513은 트립신 처리로 표면에 잔존하는 단백질을 제거한 후에도 여전히 가장 강력한 세포도입 활성을 보임을 확인하였다.

실시예 5-3: CTP-β-gal의 세포막 투과의 정량적 분석

상술한 실험에서 실제적인 세포막 투과 성질을 보이는 PTD, MTS 및 CTP508, 509, 511, 512, 513 및 514의 세포막 투과 정도를 정량적으로 비교하기 위해, CPP-β-gal 융합 단백질을 상기와 같은 방법으로 HeLa 세포에 20시간 처리 후 트립신을 처리하고 실제적으로 세포 내로 유입된 융합단백질을 양을 정량적으로 비교하였다. 트립신 처리된 세포에 10% FBS가 함유된 DMEM (high glucose)을 첨가하여 잔여 트립신의 활성을 억제한 후 원심분리를 통해 세포를 수거한 뒤 1x PBS를 이용하여 세포를 1회 세척하였다. 세포 pellet에 0.9% Triton-X 100를 첨가한 후 실온에서 10분간 반응시켜 세포를 분해시키고, 분해된 세포 내용물을 12000 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액만 수거하였다. 각 시료의 β-gal 활성을 enhanced β-gal assay kit (GTS Inc, USA)를 이용하여 실온에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 측정하였다.

도 7에서 확인할 수 있듯이, CTP512-β-gal이 CTP513 (Arg₉)-β-gal 보다 약 1.5배 정도 높은 세포 도입 활성을 보였으며, CTP512-β-gal는 PTD-β-gal에 비해 약 4 배 높게 나타났고, MTS-β-gal에 비해서는 약 7배 높은 세포도입 활성을 보였다. 이상의 결과는 CTP512와 결합된 재조합단백질의 세포 내로의 도입능력이 PTD나 MTS에 결합된 재조합 단백질보다 매우 우수함을 정량적으로 보여준다. 특히, PTD-β-gal 융합단백질의 경우는 HeLa 세포에 20시간을 처리한 뒤에도 실질적으로 세포 내로 유입된 양은 극히 제한적임을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 최근에 보고된 PTD-펩타이드를 이용한 실험결과와 매우 잘 일치하였다 (46). 반면 CTP-β-gal 융합단백질의 경우는 1시간에는 세포막 투과 능력이 거의 관찰되지 않았지만 20시간 처리한 뒤에는 상당 양이 세포 내로 투과되는 것을 관찰할 수 있었다. 한편, 본 결과를 기초로 CTP 중 CTP512를 본 발명의 대표적인 세포막 투과 펩타이드로 선정하고 나머지 실험을 CTP512를 사용하여 진행하였다.

실시예 5-4: CTP-β-gal 및 PTD-β-gal의 세포 투과의 kinetics

CTP-β-gal과 PTD-β-gal 융합단백질의 세포 내로 투과되는 정도를 속도론적으로 분석하였다. 융합단백질을 처리한 뒤 트립신 처리를 하지 않은 채로 세포를 0.9% Triton X-100으로 분해시킨 뒤 세포에 존재하는 전체 β-gal 단백질의 활성을 측정하였다. 또한, 세포 표면에 결합한 융합단백질을 제거하고 세포 내로 유입된 β-gal 만을 정량하기 위해 융합단백질로 처리된 세포를 다시 트립신으로 처리한 뒤 같은 조건에서 β-gal 단백질의 활성을 조사함으로써 실질적으로 세포 내로 투과된 융합단백질의 양을 비교, 분석하였다 (참조: 도 8).

CTP-β-gal 및 PTD-β-gal을 처리하고 일정 시간 후 트립신을 처리하지 않고 세포를 수획한 경우, 1시간 안에 수확한 세포에서도 강력한 β-gal 활성을 보였으며 β-gal 활성은 16시간까지 계속 증가하였다 (참조: 도 8A). 그러나, 이 경우에도 전 기간에서 CTP-β-gal이 PTD-β-gal보다 현저히 높은 β-gal 활성을 보였다. 한편, CTP-β-gal 및 PTD-β-gal을 처리하고 세포를 수획하기 전에 트립신을 처리한 경우에는, 1시간 이내와 같은 짧은 시간에는 도입된 β-gal 활성을 전혀 측정할 수 없었으며 융합 단백질이 세포 내로 도입되는데 비교적 긴 시간이 요구되었다 (참조: 도 8B). 도 8B에서 보듯이, 융합 단백질은 시간이 지나면서 서서히 세포내로 도입되어 약 20 시간 이후에 β-gal 활성이 최대로 높게 관찰되었으며, 이 경우 역시 전 기간동안 CTP-β-gal이 PTD-β-gal 보다 세포막 투과력이 현저히 우수함을 다시 한번 확인하였다.

트립신 처리과정 없이 CTP나 PTD에 의해 세포에 유입된 것으로 측정된 β-gal 활성은 트립신 처리과정이 추가된 경우에 비해 약 2 배정도 높은 것으로 볼 때, 도 8A에서 나타난 β-gal 활성 중 약 1/2은 CTP 또는 PTD가 세포표면에 부착되어 고정과정에서 세포 내로 유입된 것임을 알 수 있었다. 따라서, 막투과 펩타이드를 처리한 세포를 수확 직전 트립신으로 처리하지 않으면 세포 내로 투과된 재조합 β-gal 단백질을 정확하게 측정할 수 없음을 확인하였다. 반면, 대조군으로 사용된 β-gal 단백질은 시간이 지나도 전혀 세포내로 투과되지 않음이 관찰되었다.

이상의 결과로 CTP는 PTD보다 세포표면에 결합하는 정도도 많을 뿐 아니라 세포투과성도 PTD보다 현저히 뛰어나 진정한 세포막투과 펩타이드임을 알 수 있다.

실시예 6: 공초점 현미경을 이용한 CTP-β-gal의 세포 내 위치 분석

기존 보고에 따르면, PTD의 세포막 투과능 및 세포내의 잔류 위치는 세포고정과정에서 유입되는 PTD 융합단백질의 종류에 따라 달리 나타날 수 있다 (46). 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 CTP-β-gal 100 ㎍/㎖을 29시간 처리한 HeLa cell에 트립신을 10 초간 3회 처리하여 표면에 부착된 CTP-β-gal을 제거하고 세포를 고정하여 공초점 현미경으로 세포내 도입된 β-gal에 대해서만 세포내의 위치를 조사하였다. 샘플 준비과정 및 공초점 현미경 관찰 방법은 실시예 4와 동일하다.

도 9에서 보는바와 같이, CTP-β-gal을 처리한 HeLa cell을 트립신을 처리하지 않은 상태로 고정한 경우에도 CTP-β-gal은 세포질에만 머물며 핵 속으로는 거의 들어가지 않는 것으로 관찰되었다. 트립신을 처리한 경우도 β-gal의 양이 약간 줄어든 것과 세포의 단층 배양형태가 조금 달라지긴 하였으나 고정과정에서 핵 속으로 이동하는 현상은 관찰되지 않았고 CTP에 의해 도입된 β-gal은 세포질에서만 관찰되었다. 한편, PTD-β-gal의 경우는 우선 도입된 양이 CTP-β-gal에 비해 현저히 낮았으며 트립신을 처리하지 않고 고정한 경우 세포표면에 상당량의 β-gal이 부착된 형태로 나타났으나 트립신을 처리한 경우는 세포 표면의 β-gal 신호는 거의 사라지고 대부분 핵 속에 β-gal 신호가 미약하게 나타남을 관찰하였다. 이러한 결과는 CTP가 PTD보다 세포막 투과성이 높을 뿐 아니라 PTD와는 달리 도입된 융합 단백질을 세포질에만 잔류하게 하는 특성을 가지고 있음을 명백하게 보여준다.

실시예 7: 펩타이드 CTP512-FITC의 세포막 투과성

기존 펩타이드들의 막 투과성이 세포표면에 결합된 것까지 포함되어 왜곡되어 나타난 것이라는 사실이 트립신 처리과정을 도입하면서 규명되었다 (46). 따라서, 본 발명이 CTP-β-gal의 막 투과성의 진정성 여부를 확인하기 위하여, 상술한 바와 같이, 트립신 처리과정을 도입하여 실험을 하였다. 그러나, 이 경우 융합된 β-gal 단백질 때문에 CTP 자체의 활성이 달리 나타날 수 있으므로 β-gal 융합단백질 대신 CTP를 형광물질로 표지하고 세포에 일정시간 처리한 다음 트립신 처리 후 처리 시간별 및 처리 농도별로 세포 내로 도입된 펩타이드의 양을 FACSCalibur (Becton Dickison, USA)를 이용하여 FACS (Fluorescence-activated cell sorter)분석하였다.

HeLa 세포를 12-well plate에 2x10⁵/ml의 농도로 접종한 후, 1일간 37℃에서 배양하였다. 세포 표면에 부착된 CTP, PTD 및 MTS를 트립신 처리로 제거 할 수 있는지 확인하기 위해, 5 ㎍의 CTP-FITC, PTD-FITC 및 MTS-FITC 펩타이드 (HHMI/Keck Biotechnology Resource Laboratory, Yale University, USA)를 37℃에서 트립신으로 3 분간 처리한 뒤, 2.5 ㎍/㎖의 농도로 2시간동안 세포에 처리하고 세포의 형광표지 정도를 FACS로 조사하였다.

도 10A에서 확인할 수 있듯이, 사전에 trypsin으로 처리한 CTP 및 PTD는 막부착 활성이 완전히 사라짐으로 보아, 막표면에 부착되어 아직 세포내로 유입되지 않고 남아있는 잔여 CTP나 PTD 펩타이드는 트립신 처리에 의해 쉽게 제거될 수 있음을 확인하였다. 그러나, MTS의 경우는 트립신에 의해 활성이 사라지지 않았으며 이는 MTS는 Arg나 Lys 잔기를 가지고 있지 않아 트립신에 의해 분해되지 않기 때문인 것으로 추측된다. 또한, 펩타이드의 경우는 융합단백질과는 달리 세포막 투과 정도가 2시간에 최대 값을 나타내며 시간이 경과할수록 감소하였다. 또한 이 경우에도 CTP는 PTD보다 전 과정에서 높은 세포막투과 활성을 보였다. 한편 MTS의 경우는 8 시간까지 세포도입 활성이 계속 증가되는 것으로 관찰되었으나 그 정도는 CTP나 PTD 보다는 낮게 나타났다.

농도에 따른 펩타이드의 세포막 투과 정도를 조사하기 위해 펩타이드의 농도를 증가시키면서 세포에 처리하고 2시간 후 수확하여 트립신 처리 후 세포 내로 도입된 형광 강도를 조사한 바 처리농도에 비례하여 세포 내로 유입되는 펩타이드의 양이 10 ㎍/㎖까지 계속 증가하는 양상을 보였다(참조: 도 10B) 또한 동일한 양에서는 항상 CTP가 PTD나 MTS에 비해 현저히 높은 세포도입 활성을 보였다.

실시예 8: 공초점 현미경을 이용한 CTP-FITC의 세포 내 위치 분석 (세포 고정 과정 없음)

β-gal이 융합된 펩타이드의 경우는 막투과 정도를 확인하기 위해 항체를 사용하여야 하므로 세포 고정과정이 필수적이며, 이러한 고정과정에서 표면에 부착된 펩타이드 융합단백질이 세포 내로 도입되면서 도입활성이나 세포질 내에서의 이동 위치에 영향을 미치는 것으로 보고 되었다. 그러나, FITC로 표지된 막투과 펩타이드를 사용하면 세포 고정과정 없이도 공초점현미경으로 펩타이드의 세포 내 위치를 관찰할 수 있다. CTP, PTD 및 MTS에 FITC가 부착된 펩타이드를 단층 배양된 HeLa 세포에 25 ㎍/㎖ 농도로 1시간동안 처리하고 HBSS로 3회 세척 후 세포 고정과정 없이 세포를 공초점현미경으로 관찰하였다.

도 11에서 보듯이, CTP 508, 512, 513 및 514 모두 도입된 펩타이드가 세포질에만 위치하고 핵 속에는 거의 관찰되지 않음을 확인하였으며 세포 내로의 도입정도는 CTP512＞513＞＞514＞＞＞508 순으로 나타났다. 이러한 결과는 CTP-β-gal 융합단백질의 결과와 비슷한 것으로 결과적으로 CTP에 의한 막투과 정도 및 세포 내 이동 위치는 막투과 펩타이드의 특성에 따라 결정됨을 알 수 있다.

또한 본 실험결과 PTD를 처리한 세포에서는 FITC가 핵에서만 뚜렷이 관찰되고 세포질에는 거의 관찰되지 않는 것으로 보아 PTD는 세포내 도입되면 핵이동 경향을 갖는 것이 분명하다. PTD-FITC를 처리한 세포의 골격을 따라 형광이 보이는 것은 아마도 도 9에서와 같이 세포막에 부착된 펩타이드 때문인 것으로 추측되며 이 것은 트립신을 처리하면 사라질 것으로 기대되나 세포의 형태를 유지하며 관찰하기 위해 따로 트립신 처리과정을 도입하지 않았다.

실시예 9: 여러 다른 세포에서 CTP의 세포막 투과정도 조사

상술한 실시예에서는 막투과 펩타이드에 의한 세포 내로의 도입정도를 HeLa 세포에서만 조사하였다. CTP의 막투과 특성이 다른 세포에서도 동일하게 유지되는지를 확인하기 위해 마우스 세포주 (마우스 섬유세포주 L929, 마우스 신장암세포주 RENCA), T 임파종양세포인 Jurkat 세포 및 마우스 비장에서 추출한 1차 비장세포 들을 사용하여 세포 내로 형광도입 정도를 조사하였다.

도 12에서 볼 수 있듯이, 동일한 조건에서 CTP의 막투과 정도는 세포마다 조금씩 차이가 있으나 펩타이드 간의 도입 비율은 거의 비슷하게 유지되었으며, 조사한 세포들 모두에서 CTP512의 세포 내로의 도입정도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과로 미루어 보아 CTP512를 세포질로의 약물전달의 운반체로 응용할 경우, 세포의 종류에 상관없이 기존의 어떠한 세포도입 펩타이드 보다 특정목적의 치료제 개발에 좋은 효과를 볼 수 있을 것으로 판단된다. 특히 CTP는 핵이동 성질을 제거하여 핵속의 유전물질에 손상을 줄 가능성이 거의 없으므로 부작용 가능성도 다른 막투과 펩타이드에 비해 현저히 미약하거나 없을 것으로 예상되어 응용성은 그만큼 클 것으로 판단된다.

실시예 10: 생체 내에서 CTP의 특정 위치로의 이동 능력 분석

실시예 10-1: CTP-β-gal의 간 또는 임파절로의 이동 분석

본 발명의 CTP가 세포 수준에서 뿐만 아니라 생체내에서도 효율적으로 융합단백질을 세포 내로 도입시키는지 여부를 확인하기 위하여, BALB/c 마우스에 25 ㎍/(g of mouse) 농도의 CTP-β-gal, PTD-β-gal, MTS-β-gal 융합 단백질 및 β-gal 단백질을 복강으로 주사하거나 100 ㎍/mouse 농도로 꼬리 정맥에 주입하였다. 주입 4시간 후 마우스를 안락사시켜 피부와 가죽을 제거하고 복강을 해부하여 PBS 완충용액으로 3번 세척을 하였다. 이어, 고정용액으로 고정시킨 뒤 X-gal 염색용액로 염색한 후, 각 장기를 추출하여, β-gal 활성을 조사하였다.

도 13에서 보는 바와 같이, CTP-β-gal을 투여한 마우스의 경우, 다른 어느 장기보다 간에서 β-gal 활성이 강력하게 나타남을 관찰하였으며, 복강 투여 시에 정맥투여 시 보다 더욱 강력한 β-gal 활성을 보였다. 그러나 이러한 간에서의 β-gal 활성은 β-gal 만을 투여한 대조군 뿐 아니라 PTD-β-gal 및 MTS-β-gal을 투여한 어느 군의 마우스에서도 관찰되지 않았다.

또한, CTP-β-gal을 정맥으로 투여한 마우스의 경우, 간 뿐 아니라 보조임파절, 대퇴부 임파절 및 정강이 임파절에서 강력한 β-gal 활성을 보였으나, PTD-β-gal, MTS-β-gal 및 β-gal 단백질을 투여한 대조군 마우스에서는 이러한 현상이 거의 관찰되지 않았다 (참조: 도 14).

이러한 결과들은 CTP가 생체내의 특정 기관 또는 조직 (간 또는 임파절)으로 선호적으로 이동함을 나타내며, CTP를 간이나 임파절을 표적으로 하는 약물이동 수단으로 활용할 때 매우 효과적일 수 있음을 강력히 시사해 준다.

실시예 10-2: 장기별 조직절편에서 CTP에 의해 침투된 β-gal 활성 조사

상기와 같이 CTP-β-gal을 마우스 복강 및 정맥으로 투여하고 4시간 후에 흉선, 심장, 지라, 간, 신장 등의 장기를 적출하여 급냉한 후 microtome으로 냉동절편을 만들고 X-gal 반응용액에서 밤 동안 반응시킨 다음 현미경으로 β-gal 활성을 관찰하였다. CTP-β-gal을 투여한 마우스의 경우 흉선을 제외한 대부분의 장기 절편 전반에 β-gal 활성이 상당량 관찰되었다. 반면 PTD-β-gal 및 MTS-β-gal 이나 β-gal 단백질을 투여한 마우스 장기절편에서는 β-gal 활성이 거의 관찰되지 않거나 장기의 표면에만 제한적으로 활성이 관찰되었다 (도 15a 및 15b). CTP-β-gal 투여시 장기별 절편에서 나타난 β-gal 활성은 복강 (도 15a) 이나 정맥(도 15b) 어느 경로로 투여하여도 별 차이가 없이 비슷하게 나타났다. 한편 PTD-β-gal 및 MTS-β-gal를 복강으로 투여 시는 간과 신장조직 표면에 β-gal 활성이 염색되었는데 이는 아마도 복강으로 투여한 융합단백질이 PTD 나 MTS의 세포표면 부착성 때문에 나타난 현상으로 보인다. 그러나 CTP를 제외한 어느 것도 장기 내부에까지 침투하여 β-gal 활성을 보이는 장기 절편은 없었다. 이러한 사실은 CTP를 약물전달 시스템에 사용할 경우 장기 내에 효과적으로 침투하여 약효를 발휘할 수 있음을 시사해 준다.

실시예 10-3: CTP의 장기 내 특정 부위로의 이동 분석

도 16은 CTP-β-gal을 복강 및 꼬리 정맥으로 투여한 마우스의 장기를 X-gal로 염색 후 염색 부위를 확대하여 본 사진이다. 헤마토자일렌에오신 염색 (HE staining)에서 보는 바와 같이 각 장기 내부는 나름대로 독특한 조직으로 되어 있으며 이러한 조직에서 CTP에 의해 운반된 β-gal은 투여 경로와 상관없이 특정 부위에만 나타나는 것으로 관찰되었다. 따라서, 투여된 융합단백질이 자유로이 혈액이나 체액을 통해 이동하여 특정 장기에 침투되었다기보다는 특정 세포에 의해 이러한 장기 내부로 운반되어 진 것으로 추정된다. 특히 비장의 경우는 복강이나 정맥투여 둘 다 비슷한 β-gal 염색 양상을 보이며 이러한 형태는 B cell 영역의 germinal center나 T cell 영역 주변으로 보여지며 아마도 CTP를 옮기는 세포가 수지상세포 또는 대식세포일 가능성을 나타낸다.

실시예 11: CTP를 이용한 세포질 위치 단백질의 기능억제 가능성 확인.

XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)는 아폽토시스를 개시하는데 중요한 역할을 하는 Caspase-9 단백질과 결합하여 그 기능을 저해함으로써 아폽토시스를 억제한다. XIAP 단백질에 있는 zinc-binding BIR 도메인은 procaspase-9 단백질이 프로세싱 되면서 생성된 caspase-9 small 서브유니트의 N-말단과 결합함으로써 활성형의 caspase-9 생성을 억제한다. 반면 Smac/DIABLO 단백질의 N-말단의 7개의 아미노산 서열은 XIAP 단백질과 결합함으로써 XIAP의 아폽토시스 억제 기능을 풀어주는 역할을 한다. 즉 Smac/DIABLO 단백질은 아폽토시스를 촉진시키는 역할을 담당하는데 이 과정에는 N-말단의 7개 아미노산 서열만 갖고도 XIAP 기능을 억제하는데 충분하다는 사실이 밝혀졌다 (47-50).

본 실시예에서는, 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드인 CTP의 세포질 잔류특성과 이에 기반하여 도입된 Smac/DIABLO 단백질의 N-말단 7개 아미노산 서열이 XIAP에 의해 억제된 아폽토시스를 촉진시키는지 여부를 확인하였다. 보고된 바에 의하면 Smac/DIABLO 단백질의 N-말단 7개 아미노산 서열 중 첫 번째 아미노산인 알라닌이 XIAP와의 결합에 필수적이기 때문에, 세포 내 도입을 위한 CTP 부위는 Smac/DIABLO C-말단 부위에 연결하여 Smac/Diablo-CTP-FITC 펩타이드를 합성하였고 검출을 위해서 펩타이드의 C-말단에 FITC labeling을 첨가하였다.

Smac/Diablo-CTP-FITC (AVPIAQKSEGGRRARRRRRRK-FITC)

pcDNA3-XIAP 10 ㎍을 transfection reagent인 GenePORTER 2를 사용하여 1 ㎍ DNA 당 1 ㎕를 사용하여 Jurkat E6 (2x10⁵ cell/ml)에 transfection한 뒤 RPMI에 10% FBS를 첨가한 media상에서 2일 동안 37℃에서 배양하였다. 2일후 1X PBS로 2회 세척하고, serum free media에 Smac/Diablo-CTP-FITC 펩타이드 (HHMI, KECK BIOTECHNOLOGY RESOURCE CENTER에서 합성) 각각 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 농도로 37℃ 에서 2시간 처리한 후 세포의 사멸 정도를 측정하기 위하여 culture hood내에서 UV light(40W)에 50sec 노출시켰다. 6시간 후 1X PBS로 2회 세척한 뒤 Annexin V-FITC apoptosis detection kit (BD Biosciences pharmingen, Cot : 556547)를 사용하여 FACS로 세포의 사멸정도를 분석하였다.

도 17에서 보는 것과 같이, 세포에 XIAP 유전자를 도입하게 되면 첨가해준 DNA의 농도에 따라서 UV에 의한 세포 사멸정도가 현저히 감소하여 세포의 생존율이 증가하는 것을 볼 수 있다. 한편, 10 ㎍ pcDNA-XIAP DNA를 transfection 시킨 상태에서 Smac/Diablo-CTP-FITC 펩타이드를 농도별로 세포에 처리했을 때 세포가 사멸되는 속도가 크게 증가됨을 확인할 수 있었 있었으며 낮은 농도인 0.1 ㎍/㎖에서도 그 효과가 매우 크게 나타났다. 따라서, 본 발명의 CTP는 세포막 투과성이 매우 우수할 뿐만 아니라 세포질 잔류성도 매우 우수하여 세포질 단백질을 표적으로 하는 연구개발에 매우 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

본 발명의 CTP의 경우는 세포질에 잔류하고 핵이동 특성이 거의 없어 유전적 부작용 없이 세포질의 특정 단백질을 targeting 할 수 있으므로 세포질에 잔류할 필요성이 높은 약물전달 시스템에 활용성이 매우 높을 것으로 생각된다.

본 발명은 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 (CTP)를 제공한다. 본 발명의 CTP는 세포 투과율이 종전의 단백질 투과 도메인과 비교하여 거의 유사하거나 또는 향상되어 있으면서도, 핵 내로 도입되지 않고 세포질내에 잔류하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 CTP는 다양한 물질을 세포질 내로 운반하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 요지가 보다 명확하게 설명된다.

상기에서 본 발명의 바람직한 구현예를 상설하였고, 본 발명의 요지에서 이탈하지 않는 범위에서 당업자는 본 발명의 변형 및 변화를 할 수 있다는 것은 자명하며, 본 발명의 범위는 하기의 청구항 및 그의 균등물에 의해 결정된다.

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Claims (22)

1. 세포막 투과능을 갖으며, 세포에 처리하고 일정 시간 후 상기 처리된 세포에 단백질 분해효소를 처리한 경우에도 세포막 투과현상을 나타내고, 세포막을 투과한 이후에는 세포질에 잔류하는 특성을 갖는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드는 α-사슬 형성-강화 아미노산이면서 양전하를 띠는 R-기를 갖는 아미노산을 필수적인 아미노산 잔기로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 펩타이드는 형성된 α-사슬의 N-말단이 시작되는 쪽에는 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌 또는 라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
6. 제 3 항에 있어서, 상기 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
7. 제 3 항에 있어서, 상기 펩타이드는 A-X₁-X₂-B-X₃-X₄-X₅ -X₆-X₇-X₈으로 나타내는 아미노산 서열을 최소의 단위로서 포함하며, 상기 서열에서 A는 펩타이드 분자에서 φ와 Ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이고, X₁, X₂, B, X₃, X₄ , X₅, X₆, X₇, 및 X₈ 중 적어도 3 잔기는 아르기닌 또는 라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드에서 A는 글라이신 또는 알라닌인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 펩타이드에서 A는 글라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
10. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드에서 X₁, X₂, B, X₃, X₄, X ₅, X₆, X₇, 및 X₈ 중 적어도 4 잔기는 아르기닌 또는 라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 펩타이드에서 X₁, X₂, B, X₃, X₄, X ₅, X₆, X₇, 및 X₈ 중 적어도 5 잔기는 아르기닌 또는 라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 펩타이드에서 X₁, X₂, B, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, 및 X₈ 중 적어도 6 잔기는 아르기닌 또는 라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 펩타이드에서 X₁, X₂, B, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, 및 X₈ 중 적어도 7 잔기는 아르기닌 또는 라이신인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1-14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1-6, 8-10 및 13-14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1-2 및 13-14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드.
18. 상기 제 1 항 내지 제 17 항의 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자.
19. 상기 제 1 항 내지 제 16 항의 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드에 공유결합된 생물학적 활성 분자를 포함하는 세포질 잔류 세포막 투과 시스템.
20. 상기 제 19 항의 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 세포에 접촉하는 단계를 포함하는 생물학적 활성 분자를 상기 세포의 세포질에 운반하는 방법.
21. 상기 제 19 항의 세포질 잔류 세포막 투과 시스템을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 생물학적 활성 분자를 상기 개체의 세포의 세포질에 운반하는 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 세포는 간세포 또는 임파절 세포인 것을 징으로 하는 방법.