CN104583240B - 结合有细胞质转导肽及聚乙二醇的干扰素α融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在IFNα蛋白质结合有细胞质转导肽(CTP)和聚乙二醇(PEG)的IFN‑α融合蛋白。本发明的IFN‑α融合蛋白的干扰素的固有活性得到较高的维持，当向生物体给药时，半衰期得到延长，且肝的移动能力得到提高。本发明的IFN‑α融合蛋白能够使用于对包括各种病毒性感染等的肝脏疾病的预防或治疗有效的蛋白质医药品的开发。

Description

结合有细胞质转导肽及聚乙二醇的干扰素α融合蛋白
【技术领域】
本发明涉及细胞质转导肽(Cytoplasmic Transduction Peptide，CTP)和聚乙二醇一同结合于干扰素-α(interferon-α，IFNα)蛋白质的干扰素-α融合蛋白。
【背景技术】
干扰素用作肝炎治疗剂，并以干扰素-α制剂(Intron-A：Schering，Roferon-A：Roche)以及给药次数少于干扰素-α制剂的加入聚乙二醇的(PEGylated)IFN制剂(PEG-Intron：Schering，Pegasys：Roche)等方式销售。
作为干扰素-α治疗的初期副作用，具有发热、恶寒、全身无力、食欲不振、恶心及肌肉痛等，且这种症状在几乎所有患者中以与给药容量成正比的方式出现，而这种症状在治疗初期最为严重，只要中断治疗就会消失。并且，已知在肝炎患者中，PEG-干扰素-α治疗中的副作用的频率和严重程度与干扰素-α治疗相似(Kwan Sik Lee,Dong Joon Kim etal.Management of Chronic Hepatitis B,The Korean Journal of Hepatology.13:447-488,(2007))。
如上所述，随着基于干扰素的给药容量的副作用的传播，在使用干扰素作为治疗剂的过程中，为将副作用最小化需要减少给药量。
以往，为了解决如上所述的问题而提出过将细胞质转导肽(cytoplasmictransduction peptide，CTP)融合于干扰素，来改善干扰素的肝移动性，从而解决干扰素α的治疗副作用的方法。但将上述融合蛋白向小鼠模型给药时，由于初期活性急剧减少，使得活性在约6小时之后减少一半以上，因而改善融合蛋白的肝移动及残留特性的必要性随之出现。
本说明书全文中，参照了多篇专利文献，并表示了其引用。所引用的专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。
【发明内容】
【技术问题】
本发明人致力于通过研发外源肽和聚乙二醇的结合之类的蛋白质变形，从而提高现有的干扰素的药剂学功效的干扰素-α融合蛋白。结果，通过实验证明了若通过接头在干扰素-α蛋白质的N末端结合细胞质转导肽，并通过接头在C末端结合聚乙二醇，则干扰素的固有活性得到较高的维持，生物体内的半衰期得到延长，且肝的移动能力得到提高，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供干扰素-α融合蛋白，上述干扰素-α融合蛋白通过改善以往的干扰素融合蛋白的肝移动及停留特性，最终能够期待干扰素给药量的减少。
本发明的再一目的在于，提供对上述干扰素-α融合蛋白进行编码的核酸分子。
本发明的另一目的在于，提供包含上述核酸分子的载体。
本发明的还一目的在于，提供包含上述载体的转化子。
本发明的又一目的在于，提供干扰素-α融合蛋白的制备方法。
本发明的又一目的在于，提供肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合物。
本发明的目的及优点借助以下的发明内容、发明要求保护范围及附图来更加明确。
【技术方案】
根据本发明的一实施方式，本发明提供干扰素-α融合蛋白，由CTP-X-IFNα-Y-PEG表示，上述干扰素-α融合蛋白的特征在于，上述CTP为细胞质转导肽(cytoplasmictransduction peptide)；上述X为由1-10个甘氨酸(glycine)组成的肽键；上述Y为1-100个半胱氨酸、甘氨酸或由甘氨酸及半胱氨酸组成的肽键；上述IFNα为干扰素-α2a或干扰素-α2b；上述PEG为聚乙二醇(polyethylene glycol)。
本发明人致力于通过研发外源肽和聚乙二醇的结合之类的蛋白质变形，从而提高现有的干扰素的药剂学功效的干扰素-α融合蛋白。通过本发明的一实施例，在向干扰素-α蛋白质和CTP之间导入接头之后，选择不改变干扰素-α蛋白质的结构的接头，并在上述融合蛋白的C-末端融合聚乙二醇之后，对此进行了活性分析。
结果，通过实验确认了若通过接头在干扰素-α蛋白质的N-末端结合细胞质转导肽，并通过接头在C-末端结合聚乙二醇，则干扰素的固有活性得到较高的维持，生物体内的半衰期得到延长，且肝的移动能力得到提高。即，上述结果最初证明了通过接头将CTP及PEG分别与干扰素α融合蛋白的N末端及C末端相连接，从而改善融合蛋白的生物体内的移动及残留效果，并改善现有的PEG或连接PEG及CTP的融合蛋白的治疗效果。具体地，这种效果通过以下方式实现：1)通过接头连接干扰素α蛋白质和CTP，从而使CTP的功能最优化；2)通过聚乙二醇与干扰素α蛋白质的C末端相融合，从而延长生物体内的半衰期；3)使线性(linearform)聚乙二醇与干扰素-α蛋白质的C末端相连接。
在本说明书中所使用的上述术语“干扰素-α(IFNα)融合蛋白”意味着在干扰素-α蛋白质仅结合CTP的蛋白质或同时结合CTP和PEG的蛋白质。在本说明书中，意味着在干扰素-α蛋白质仅结合CTP的融合蛋白的情况下，还记载为“CTP-X-IFNα-Y”。
在本说明书中所使用的术语“细胞质转导肽(CTP)”作为由本发明人最初导入的术语，意味着既保留细胞膜渗透能力，又具有残留于细胞质的特性，即，意味着抑制向核内移动的特性的肽。
本发明的IFNα融合蛋白所包含的CTP作为由本发明人为了解决蛋白转导结构域(PTD)的问题而世界上最初开发的递送肽(delivery peptide)，对此进行了申请并得到了专利注册(韩国特许第0608558号、美国专利第7101844及日本专利第4188909号)，上述专利文献所公开的与CTP相关的内容插入为本发明的内容。
在本发明的IFNα融合蛋白所包含的CTP中，肽的长度相当于所属领域中接受的一般长度，优选为9-20氨基酸，更优选为9-15氨基酸，最优选为11氨基酸。
根据本发明的优选实施例，本发明的IFNα融合蛋白所包含的CTP包含选自由序列表中序列1至序列表中序列14所公开的序列组成的组中的氨基酸序列。优选地，本发明的CTP包含序列表中序列1的序列。
CTP具有优秀的细胞膜渗透能力，且具有在向细胞内导入之后，也抑制向核的移动的特性，因而在生物体内，与其他递送体(尤其，蛋白转导结构域(PTD，proteintransduction domain)或聚精氨酸(polyarginine))相比，细胞毒性低，且具有使融合的蛋白质向肝移动的独特性质，因此是将肝作为靶的用于疾病治疗的有效的药物递送肽。
在本说明书中所使用的术语“干扰素-α(IFNα)”意味着用于抑制病毒的复制及细胞增殖，并调节免疫反应的同质性佳、种特异性的蛋白质组。
本发明的IFNα融合蛋白所包含的干扰素-α(IFNα)为重组IFNα2b、重组IFNα2a、重组IFNα2c、作为天然α-干扰素的被纯化的混合物的IFNα-n1、复合α-干扰素(参照美国专利第4897471号及第4695623号)或作为天然α-干扰素的混合物的IFNα-n3，更优选为IFNα2a或IFNα2b，最优选为IFNα2b。IFNα2b的制备方法已详细记载于美国专利第4,530,901号。
根据本发明的优选实施例，本发明的IFNα融合蛋白所包含的IFNα包含序列表中序列21所公开的氨基酸序列。
在本发明的IFNα融合蛋白中，上述X为由1-10个甘氨酸(glycine)残基组成的肽键。CTP通过上述肽键与IFNα的N-末端相结合。
利用肽键X来连接CTP与IFNα之间，从而向CTP肽赋予柔韧性(flexibility)和自由旋转(free rotation)能力，从而使CTP顺畅地执行原有的功能。
并且，通过将结合有CTP的融合蛋白表达及纯化时因具有疏水性的CTP而发生的融合蛋白的沉淀最小化，能够增大纯化收率。
根据本发明的具体一实施例，在对CFN1蛋白质(CTP-IFNα)实施纯化的情况下，发生了沉淀，但在与肽键相结合的CFN8蛋白质(CTP-GGGG-IFNα)的情况下，并未发生沉淀。
优选地，上述肽键X可以为1-10个甘氨酸残基，可优选为1-8个甘氨酸残基，更优选为1-7个甘氨酸残基，尤其优选为1-5个甘氨酸残基，进而优选为3-5个甘氨酸残基，可以为4个甘氨酸残基。
在本发明的IFNα融合蛋白中，上述Y为1-100个半胱氨酸残基、甘氨酸残基或由甘氨酸及半胱氨酸残基组成的肽键。通过上述肽键，聚乙二醇(PEG)与IFNα的C-末端相结合。上述肽键Y能够由0-10个甘氨酸残基及1-80个半胱氨酸残基组成，更优选地，能够由0-10个甘氨酸残基及1-60个半胱氨酸残基组成，尤其优选地，能够由1-10个甘氨酸残基及1-10个半胱氨酸残基组成，进而优选地，能够由1-5个甘氨酸残基及1-5个半胱氨酸残基组成。并且，上述肽键Y能够由0-10个甘氨酸残基或1-80个半胱氨酸残基组成，更优选地，能够由1-10个甘氨酸残基或1-60个半胱氨酸残基组成，尤其优选地，能够由1-10个甘氨酸残基及1-10个半胱氨酸残基组成，进而优选地，能够由1-5个甘氨酸残基及1-5个半胱氨酸残基组成，最优选地，能够由3-5个甘氨酸残基或3-5个半胱氨酸残基组成。
根据本发明的优选实施例，由本发明的干扰素-α(IFNα)融合蛋白内的“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽部分(peptide moiety)由选自由序列表中序列15至序列表中序列20所公开的序列组成的组中的氨基酸序列组成的肽，更优选地，是由序列表中序列18的氨基酸序列组成的肽。
在本发明中，由“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽部分的氨基酸序列被解释为还包含相对于上述序列表中序列15至序列表中序列20中的一个氨基酸序列呈现出实质性的同一性的氨基酸序列。上述实质性的同一性意味着使上述本发明的氨基酸序列与任意的其他序列最大限度地相对应的方式排比，并利用所属领域普遍使用的算法来对所排比的序列进行分析的情况下，呈现出最少80％的同一性，更优选地，呈现出最少90％的同一性，最优选地，呈现出最少95％的同一性的氨基酸序列。
在本发明的IFNα融合蛋白的C-末端结合有聚乙二醇(PEG)。
在本发明中，PEG与IFNα融合蛋白的N-末端相结合的情况下，会使CTP的细胞膜渗透性和肝移动性降低，因而并不优选。即，如以下本发明的具体一实施例所证明，若PEG与IFNα融合蛋白的N-末端相结合，则虽然试管内(in vitro)抗病毒活性及血液内的稳定性优秀，但肝移动性显著降低。
PEG具有减少肾清除机制来延长血液内的半衰期，从而减少本发明的融合蛋白的给药量的效果。
根据本发明的优选实施例，上述聚乙二醇(PEG)的分子量可以为20-60kDa，优选为20-50kDa，更优选为30-45kDa，尤其优选为35-45kDa，最优选为40-45kDa。在使用40-45kDa的PEG的情况下，肝移动性的增大效果最大。
根据本发明的另一优选实施例，上述聚乙二醇(PEG)可以为线性PEG(linear PEG)或分枝型PEG(branched PEG)。
在本说明书中，上述术语“线性PEG”意味着PEG以没有分枝的方式由单一的链(chain)组成的PEG形态，术语“分枝型PEG”意味着2-10个PEG链从中心核心组(centralcore group)分支出来的形态。
本发明的PEG作为线性PEG，特异性地与干扰素α蛋白质的特定氨基酸残基相结合，因而使最终生成的PEG-干扰素α融合蛋白的分离及纯化变得容易，且在蛋白质的质量管理方面也有优点。
在本发明的IFNα融合蛋白结合上述PEG的聚乙二醇化反应可通过所属领域公知的方法执行(M.J.Roberts,M.D.Bentley et al.,Chemistry for peptide and proteinPEGylation,Advanced Drug Delivery Reviews 54:459476(2002)；Francesco M.,Peptide and protein PEGylation:a review of problems and solutions,VeroneseBiomaterials 22:405-417(2001))。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供核酸分子，上述核酸分子对由上述本发明的干扰素-α(IFNα)融合蛋白内的“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽部分(peptide moiety)进行编码。
在本说明书中，术语“核酸分子”具有包含DNA(gDNA及cDNA)及RNA分子的意义，在核酸分子中作为基本结构单位的核苷酸不仅包含自然的核苷酸，还包含糖或碱基部位发生变形的类似物(analogue)(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
根据本发明的优选实施例，对由上述本发明的IFN-α融合蛋白内的“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽部分进行编码的核酸分子为对由序列表中序列15至序列表中序列20中的一个氨基酸序列组成的肽进行编码的核酸分子，更优选为对由序列表中序列18的氨基酸序列组成的肽进行编码的核酸分子，最优选为具有序列表中序列22的DNA碱基序列的核酸分子。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供载体，上述载体包含对由IFN-α融合蛋白内的“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽部分进行编码的核酸分子。
本发明的载体系统可通过所属领域公知的多种方法构建，与此相关的具体方法已公开于Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)，上述文献插入于本说明书作为参照。
典型地，本发明的载体能够作为用于克隆的载体或用于表达的载体构建。并且，本发明的载体能够将原核细胞或真核细胞作为宿主构建。本发明的核苷酸序列来源于原核细胞，且考虑到培养的便利性等，优选地，将原核细胞作为宿主。
在本发明的载体为表达载体，且将原核细胞作为宿主的情况下，通常包含能够进行转录的强有力的启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子及T7启动子等)、用于开始解读的核糖体结合位置及转录/解读终止序列。在使用E.coli作为宿主细胞的情况下，E.coli色氨酸生物合成途径的启动子、操纵基因部位(Yanofsky,C.,J.Bacteriol.,158:1018-1024(1984))及噬菌体λ的左向启动子(pLλ启动子，Herskowitz,I.and Hagen,D.,Ann.Rev.Genet.,14:399-445(1980))可利用为调节部位。
另一方面，能够利用于本发明的载体可通过对所属领域中常常使用的质粒(例：pSC101、ColE1、pBR322、pUC8/9、pHC79、pUC19、pET等)、噬菌体(例：λgt4λB、λ-Charon、λΔz1及M13等)或病毒(例：SV40等)进行操作来制备。
另一方面，在本发明的载体为表达载体，且将真核细胞作为宿主的情况下，可以利用来源于哺乳动物细胞的基因组(genome)的启动子(例：金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例：腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子及HSV的tk启动子)，并且作为转录终止序列，通常具有聚腺苷酸化序列。
在本发明的载体中，为了使从载体中表达的由本发明的IFN-α融合蛋白的“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽的纯化变得容易，可根据需要与其他序列相融合，而作为相融合的序列，例如可利用谷胱甘肽S-转移酶(美国法玛西亚(Pharmacia)公司)、麦芽糖结合蛋白(美国纽英伦(NEB)公司)、FLAG(美国IBI公司)及6x His(六组氨酸(hexahistidine)，美国凯杰(Quiagen)公司)等，但并不局限于此。
根据本发明的优选实施例，由借助本发明的载体表达的“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽可通过阳离子交换色谱法及凝胶过滤色谱法来实现纯化。
另一方面，本发明的表达载体可包含所属领域通常使用的抗生素抗性基因作为选择标记，例如，具有对氨苄西林、艮他霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素及四环素的抗性基因。
根据本发明的还一实施方式，本发明提供包含上述本发明的载体的转化子。
既能使本发明的载体得到稳定，又能连续地进行克隆及表达的宿主细胞也可利用所属领域公知的任何宿主细胞，例如，可利用E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、E.coliRR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X 1776、E.coli W3110、枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌之类的芽孢杆菌属菌株以及鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及多种假单胞菌属之类的肠杆菌科菌株等。
并且，在使本发明的载体转化于真核细胞的情况下，可利用酵母(Saccharomycecerevisiae)、昆虫细胞及人体细胞(例如，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese hamster ovary)细胞株、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株)等作为宿主细胞。
将本发明的载体向宿主细胞内运输的方法在宿主细胞为原核细胞的情况下，可利用CaCl2方法(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973))、单程方法(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973)及Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))及电穿孔法(Dower,W.J.et al.,Nucleic.Acids Res.,16:6127-6145(1988))等来实施。并且，在宿主细胞为真核细胞的情况下，可通过微注入法(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980))、磷酸钙沉淀法(Graham,F.L.et al.,Virology,52:456(1973))、电穿孔法(Neumann,E.et al.,EMBO J.,1:841(1982))、脂质体介导的转染法(Wong,T.K.et al.,Gene,10:87(1980))、DEAE-右旋糖酐治疗法(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985))及基因轰击法(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572(1990))等来向宿主细胞内注入载体。
向宿主细胞内注入的载体可在宿主细胞内进行表达，而在这种情况下，取得大量的“CTP-X-IFNα-Y”。例如，在上述表达载体包含lac启动子的情况下，利用IPTG对宿主细胞进行处理，从而能够诱导基因的表达。
以下，由于本发明的IFN-α融合蛋白的制备方法中包括了制备上述的本发明的由“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽的方法，因而两者之间的共同的内容为了避免因反复记载引起的说明书的过度复杂性而省略记载。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包括以下步骤的IFNα融合蛋白的制备方法：步骤(a)，培养由表达载体转化而成的转化子，上述表达载体包含对由以操作性的方式与启动子相连接的“CTP-X-IFNα-Y”表示的肽部分进行编码的核酸分子的步骤(b)，从上述步骤(a)的转化子培养液中获得融合蛋白；以及步骤(c)，在从上述步骤(b)中获得的融合蛋白的C-末端结合聚乙二醇(PEG)。
本发明中的术语“启动子”意味着用于调节编码序列或功能性RNA的表达的DNA碱基序列。
在本说明书中，术语“以操作性的方式相连接”意味着核酸表达调节序列(例：启动子、信号序列或转录调节因子结合位置的陈列)和其他核酸序列之间的功能性的结合，由此，上述调节序列调节上述其他核酸序列的转录和/或转化。
在本发明中，转化子的培养通过所属领域公知的通常的原核细胞或真核细胞的培养方法来执行。例如，只要用于培养转化子的培养基包含能够使原核细胞或真核细胞有效利用的碳源、氮源及无机盐等，就能均使用天然培养基或合成培养基。
转化子的培养通常在振荡培养或基于旋转器的旋转的培养之类的有氧性条件下执行。培养温度优选为15至50℃，培养时间通常为5小时至7天。优选地，培养基的pH在培养过程中维持在3.0至9.0的范围内。培养基的pH可利用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来调节。若有需要，可在培养过程中添加氨苄西林、四环素之类的抗生素。
从本发明中所培养的转化子的细胞中分离所表达的外源重组蛋白质的方法可使用所属领域通常利用的蛋白质的分离及纯化方法来执行。例如，可使用基于利用硫酸铵或PEG等的溶解度的分离(solubility fractionation)、基于分子量的超过滤分离、基于多种色谱法(为了基于大小、电荷、疏水性或亲和性的分离而制备的)的分离等多种方法，通常利用上述方法的组合来进行分离及纯化。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其包含：(a)上述本发明的IFNα融合蛋白的药剂学有效率；以及(b)药剂学上接受的载体。
借助本发明的组合物来预防或治疗的肝脏疾病包括肝癌、肝炎、肝硬化及其他肝脏疾病，优选地，包括肝癌及肝炎，例如，上述肝炎可以为急性病毒性肝炎、慢性肝炎及暴发性肝功能衰竭等，更优选地，可以为B型肝炎或C型肝炎，最优选地，可以为基于丙型肝炎病毒(HCV，Hepatitis C virus)性肝炎的C型肝炎。
根据本发明的优选实施例，优选地，本发明的肝脏疾病治疗用药剂学组合物能够以非口服方式进行给药，更优选地，能够向皮下进行给药。
在本说明书中，术语“药剂学有效量”意味着实现上述本发明的融合蛋白的功效或活性的足够量。
本发明的药剂学组合物作为根据需要含有药剂学上接受的通常的无毒性载体、辅助剂及赋形剂的容量单位制剂，能够以口服或非口服方式通过吸入喷雾向直肠内给药或者局部给药，优选地，能够以非口服方式进行给药。局部给药还可包括透皮贴片之类的经皮给药或利用离子泳动装置的给药。
在本说明书中，“非口服给药”包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、胸骨内注射或注入技术。例如药物制剂公布于文献(Hoover,John E.,Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,1975)中。与药物制剂相关的内容也可以在文献(Liberman,H.A.及Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980)中确认。
包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体，作为制剂时通常所利用的物质，虽包含乳糖、葡萄糖，蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂及防腐剂等。适合的药剂学上接受的载体及制剂详细记载于Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)。
本发明的药剂学组合物的适合的给药量可通过制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素来实施多种处方。优选地，以成人为基准，本发明的药剂学组合物的给药量可以为0.001-100μg/kg(体重)。
本发明的药剂学组合物可根据所属领域普通技术人员能够容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或者利用赋形剂来实现制剂化，从而可制备成单位容量形态或者导入于多容量容器内来制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳化液形态或浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，且还可更多的包含分散剂或稳定剂。
【有益效果】
对本发明的优点及效果进行归纳如下：
(i)本发明涉及在IFNα蛋白质结合细胞质转导肽(CTP)和聚乙二醇(PEG)的IFNα融合蛋白。
(ii)本发明的IFNα融合蛋白的干扰素的固有活性得到较高的维持。
(iii)本发明的IFNα融合蛋白在向生物体给药时，使半衰期延长，肝移动能力提高。
(iv)本发明的IFNα融合蛋白能够使用于对包括各种病毒性感染等的肝脏疾病的预防或治疗有效的蛋白质医药品的研发。
【附图说明】
图1示出了CTP通过接头结合的本发明的IFNα融合蛋白的结构。表示了CFN7(CTP-GGGGGG-IFNα，序列表中序列32)、CFN8(CTP-GGGG-IFNα、序列表中序列33)、插入有HepsinCleavage接头的CFN11(序列表中序列34)、CFN12(序列表中序列35)、CFN13(序列表中序列36)的结构。
图2为利用CD分光光度计(Jasco-815)来对通过结合接头来制备的本发明的IFNα融合蛋白的二次结构进行分析的结果。
图3示出了PEG以多种形态与CTP-IFNα融合蛋白相结合的CTP-IFNα-PEG融合蛋白。
图4以比较方式示出了本发明中IFNα融合蛋白401C及PEGASYS(罗氏公司(HoffmanLaRoche Ltd.))的应用于猴子上的临床前药物动力学测定结果。实验所使用的试样分别以300μg/kg体重的容量将PEGASYS和IFNα融合蛋白401C进行了给药。第一次将试样进行给药之后经6天的时间测定了活性。确认了本发明的IFNα融合蛋白401C的IFNα活性高，且到第六天为止，维持比PEGASYS优秀或同等的活性。
图5a及图5b示出了对本发明的融合蛋白和对照组药物的肝移动能力进行比较的结果。示出了向小鼠将本发明的干扰素-α融合蛋白和对照组药物PEGASYS(罗氏公司(Hoffman LaRoche Ltd.))进行给药之后，根据时间的推移分别测定血液(图5a)及肝(图5b)中的抗-病毒活性的结果。
【具体实施方式】
以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例只用于更加具体地说明本发明，对于所属领域普通技术人员来说，根据本发明的要旨，本发明的范围不会因这些实施例而受到限制是显而易见的。
【实施例】
【实施例1：CTP融合IFNα基因的聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)合成】
向来源于人类的干扰素-α(Interferon-α，IFNα)的N-末端插入CTP肽，并向CTP和IFNα之间插入了由4个或6个甘氨酸(glycine)组成的甘氨酸接头(linker)。通过甘氨酸接头连接CTP和IFNα之间，向CTP肽提供柔韧性，从而不仅使其功能变得顺畅，而且当实施纯化时，将起到由疏水性的CTP引起的沉淀最小化的作用。并且，通过聚合酶链反应法向IFNα基因的C-末端插入半胱氨酸(cysteine)，与马来酰亚胺PEG(Maleimide PEG)的反应使PEG能够附着于C-末端。通过在C-末端附着线性PEG，能够大大提高体内半衰期。
首先，为了在附着于IFNα的N-末端的CTP肽和IFNα之间插入甘氨酸接头，使用了以下表1所记载的引物来实施了聚合酶链反应。
将IFNα作为模板，使用PR2引物和PR3引物来实施了第一次聚合酶链反应。将所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PR1引物和PR2引物来实施了第二次聚合酶链反应。由此，取得了由6个对肽CTP-GGGGGG-IFNα进行编码的核酸分子作为最终产物，上述肽CTP-GGGGGG-IFNα与由6个甘氨酸组成的接头相连接。将最终产物CTP-GGGGGG-IFNα蛋白质命名为CFN7(序列表中序列32)。
将IFNα作为模板，使用PR2引物和PR4引物来实施了第一次聚合酶链反应。将所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PR1引物和PR2引物来实施了第二次聚合酶链反应。由此，取得了对CTP-GGGG-IFNα进行编码的核酸分子作为最终产物，上述CTP-GGGG-IFNα与由6个甘氨酸组成的接头相连接。将上述最终产物CTP-GGGG-IFNα蛋白质命名为CFN8(序列表中序列33)。
为了将丝氨酸蛋白酶分裂(hepsin cleavage)序列插入于附着在IFNα的N-末端的CTP肽和IFNα之间，使用了以下表1所记载的引物来实施了聚合酶链反应。将IFNα作为模板，使用PR2引物和PR5引物来实施了第一次聚合酶链反应。将所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PR1引物和PR2引物来实施了第二次聚合酶链反应。由此，取得了对肽CTP-KQLRVVNG-IFNα进行编码的核酸分子作为最终产物，上述肽CTP-KQLRVVNG-IFNα与由丝氨酸蛋白酶分裂组成的接头相连接。将最终产物CTP-KQLRVVNG-IFNα蛋白质命名为CFN11(序列表中序列34)。
为了将甘氨酸和丝氨酸蛋白酶分裂序列一同插入于附着在IFNα的N-末端的CTP肽和IFNα之间，使用了以下表1所记载的引物来实施了聚合酶链反应。将IFNα作为模板，使用PR2引物和PR7引物来实施了第一次聚合酶链反应。将所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PR1引物和PR2引物来实施了第二次聚合酶链反应。由此，取得了对肽CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFNα进行编码的核酸分子作为最终产物，上述肽CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFNα与由丝氨酸蛋白酶分裂和在上述丝氨酸蛋白酶分裂的左右分别具有4个甘氨酸和3个甘氨酸的接头相连接。将最终产物CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFNα蛋白质命名为CFN12(序列表中序列35)。
为了将甘氨酸和肝细胞生长因子激活剂(hepacyte growth factor activator)一同插入于附着在IFNα的N-末端的CTP肽和IFNα之间，使用了以下表1所记载的引物来实施了聚合酶链反应。将IFNα作为模板，使用PR2引物和PR8引物来实施了第一次聚合酶链反应。将所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PR1引物和PR2引物来实施了第二次聚合酶链反应。由此，取得了对肽CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFNα进行编码的核酸分子作为最终产物，上述肽CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFNα与由肝细胞生长因子激活剂和3个甘氨酸组成的接头相连接。将最终产物CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFNα蛋白质命名为CFN13(序列表中序列36)。
将制备的上述CFN7、CFN8、CFN11、CFN12及CFN13的结构呈现于图1中。
【表1】
然后，为了向C-末端插入半胱氨酸而实施了聚合酶链反应。将连接有4个甘氨酸接头的CTP-GGGG-IFNα作为模板，使用PR8引物和PR9引物来取得了对CTP-GGGG-IFNα-C进行编码的核酸分子作为最终产物，上述CTP-GGGG-IFNα-C由半胱氨酸插入于CTP-GGGG-IFNα基因的C-末端。将上述最终产物CTP-GGGG-IFNα-C蛋白质命名为CFN8C(序列表中序列18)。
【表2】
【实施例2：干扰素-α融合蛋白的大肠杆菌表达载体的制备】
为了在大肠杆菌中表达对通过聚合酶链反应确保的CFN7(CTP-GGGGGG-IFNα)、CFN8(CTP-GGGG-IFNα)、CFN8C(CTP-GGGG-IFNα-C)、CFN11(CTP-KQLRVVNG-IFNα)、CFN12(CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFNα)及CFN13(CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFNα)进行编码的各个基因，在作为大肠杆菌表达载体的pCFM536克隆各个基因，来制备了pCFM536-CFN7、pCFM536-CFN8、pCFM536-CFN8C、pCFM536-CFN11、pCFM536-CFN12及pCFM536-CFN13表达载体。
首先，将CFN7(CTP-GGGGGG-IFNα)、CFN8(CTP-GGGG-IFNα)、CFN8C(CTP-GGGG-IFNα-C)、CFN11(CTP-KQLRVVNG-IFNα)、CFN12(CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFNα)及CFN13(CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFNα)聚合酶链反应产物分别克隆于pGEM-T载体，并通过分析碱基序列取得了氨基酸序列以无变形的方式合成的pGEM-CFN7、pGEM-CFN8、pGEM-CFN8C、pGEM-CFN11、pGEM-CFN12及pGEM-CFN13重组载体。当从这种重组pGEM-CFN7、pGEM-CFN8和pGEM-CFN8C载体中实施聚合酶链反应时，利用包含于引物的XbaI和BamHI限制酶来取得嵌入物(insert)，并将上述嵌入物导入于pCFM536载体，从而分别完成了表达载体pCFM536-CFN7、pCFM536-CFN8、pCFM536-CFN8C、pCFM536-CFN11、pCFM536-CFN12及pCFM536-CFN13。
【实施例3：大肠杆菌中的干扰素-α融合蛋白的表达及确认】
将在上述实施例2中制备的克隆有CFN7、CFN8、CFN8C、CFN11、CFN12及CFN13基因的pCFM536载体转化于POP2136感应细胞(competent cell)，并涂抹于添加了氨苄西林(ampicillin)的固体培养基。取得在固体培养基中生长的菌落(colony)，并接种于LB培养基(broth)之后，在30℃温度下培养了18小时。当在600nm波长中的吸光度为0.4至0.6时，将温度提高至42℃，来诱导(induction)了表达。在继续培养4小时之后，在培养的细胞中通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析确认了蛋白质的表达。
【实施例4：干扰素-α融合蛋白的大量生产】
为了大量确保IFNα融合蛋白，使用5L发酵罐来实施了大量培养及纯化。
【1.利用5L发酵罐的大量培养】
为了通过培养生产菌株来大量确保IFNα融合蛋白，利用5L发酵罐(Biostat B，贝朗生物系统公司(B.Braun Biotech International))来实施了大量培养。首先，分别利用主细胞库(MCB，Master cell bank)和工作细胞库(WCB，Working cell bank)来制备了确认到IFNα融合蛋白的表达的菌株，并在-80℃条件下进行了保管。在进行本培养的前一天，在100ml的2xYT培养基(胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)添加以使氨苄西林的浓度成为50μg/ml并接种被保管的工作细胞库，并在30℃温度下培养了16小时。为了本培养，在3L的2xYT培养基(胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)中以氨苄西林的浓度成为50μg/ml的方式进行添加，来准备了培养基。本培养开始时的条件不会下降到温度30℃、pH6.8、vvm1及溶解氧(DO)50％以下。以1小时为间隔测定了OD值，当OD值成为10时，继续添加培养基，并将培养温度提高至42℃，从而诱导了表达。在诱导表达之后，也以1小时为间隔测定了OD值，并在OD值不再继续增加的区间中结束了培养。
【2.凝聚体(inclusion body)的分离及复性(refolding)】
在上述过程中，从细胞培养液回收细胞，并利用磷酸盐缓冲液(PBS)对所回收的细胞进行了清洗。悬浮于凝聚体清洗液1(50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH8.0)、1％TritonX-100)之后，使用细胞破碎机实施破碎，之后进行离心分离来回收了不溶性的凝聚体分馏。依次使用凝聚体清洗液1-4(清洗液1:50mM三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)、1％Triton X-100、清洗液2:50mM三羟甲基氨基甲烷、1％Triton X-100、0.1M NaCl(pH8.0)、清洗液3:50mM三羟甲基氨基甲烷、1％Triton X-100、0.2M NaCl(pH8.0)、清洗液4:50mM三羟甲基氨基甲烷、1％Triton X-100、0.3M NaCl(pH8.0))来按细胞悬浮、搅拌、清洗及离心分离的顺序进行清洗过程，并回收了不溶性的凝聚体分离。
为了取得在结构方面具有活性的IFNα融合蛋白，将所分离的凝聚体按不同种类分别溶解于实现最优化的增溶(solubilization)缓冲液，并在各个复性缓冲液中对此重新进行搅拌，从而实施了复性。将使用于各IFN的凝聚体的增溶及复性的缓冲液及条件呈现于以下表3中。
【表3】
在回收蛋白质的过程中，在放入0.5ml的三次蒸馏水并使细胞悬浮之后，添加1ml的增溶缓冲液(6M胍(Guanidine)、50mM三羟甲基氨基甲烷、2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pH9.5))，并使最终浓度成为6M胍的方式溶解了凝聚体。在搅拌4小时以上，使得凝聚体完全被溶解之后，实施离心分离(12000rpm、4℃、30分钟)，并利用0.2μm过滤器对上清液实施了过滤。
通过稀释方法对完全溶解的凝聚体进行了复性。在复性缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷、1mM谷胱甘肽(GSH)、0.2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、1mM乙二胺四乙酸、5％蔗糖(Sucrose)、pH8.0)中，以最终胍浓度成为1.5M的方式在4℃温度下慢慢混合24小时，并发生了反应。在结束反应之后，在上述试样中添加乙酸(acetic acid)，从而使pH成为4.0。在实施2小时以上的追加反应之后，利用0.2μm过滤器实施了过滤。利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)来确认了是否为复性。
【3.通过色谱法的高纯度纯化】
在通过上述方法来实施复性之后，为了将在结构上得到正常复性的CTP-X-IFNα-Y蛋白质纯化为高纯度，执行了脱盐(desalting)和阳离子交换色谱法。
将结束复性的CTP-X-IFNα-Y蛋白质在柱结合缓冲液(50mM柠檬酸钠-柠檬酸(Sodium Citrate-Citric acid)、1mM乙二胺四乙酸、pH4.0)中透析(dialysis)16小时，从而去除了1.5M胍。将10ml的琼脂糖凝胶(Sepharose)阳离子色谱树脂填充于柱，并安装于快速蛋白液相色谱(FPLC)中。在利用柱结合缓冲液(50mM柠檬酸钠-柠檬酸、1mM乙二胺四乙酸、pH4.0)使柱平衡化(equilibration)之后，使样品与柱相结合。使用浓度梯度缓冲液(50mM柠檬酸钠-柠檬酸、1mM乙二胺四乙酸、1M NaCl、pH4.0)来分离了与柱相结合的样品。使用高效液相色谱(HPLC)分析法确认了分离、纯化的蛋白质。被分离的试样使用了考马斯亮蓝法(Bradford)和紫外线(UV)吸光光度计在595nm条件下测定了浓度。
【实施例5：干扰素-α融合蛋白的结构分析】
根据上述实施例所说明的内容对结合接头来制备的IFNα融合蛋白的二级结构进行了分析。作为对照组，将插入有IFNα(interferon-α)、CFN1(CTP-IFNα)、CFN7(CTP-GGGGGG-IFNα)、CFN8(CTP-GGGG-IFNα)、丝氨酸蛋白酶分裂接头的CFN11、CFN12、CFN13作为对象实施了二级结构的分析。使用CD分光光度计(Jasco-815)来实施了蛋白质的二级结构分析。使所要分析的蛋白质的最终浓度在50mM柠檬酸钠-柠檬酸、1mM乙二胺四乙酸(pH4.0)内成为1mg/ml，具有25℃、0.2nm的分解能力(resolution)、1.0nm的带宽及50nm/min的扫描速度，并使用路径长度为0.1cm的石英单体，在190nm至250nm的范围内取得了频谱。
根据图2所示的频谱的分析结果，维持与干扰素α最相似的二级结构的侯选物为插入有甘氨酸接头的CFN7、CFN8，在插入有丝氨酸蛋白酶分裂接头的CFN11、CFN12、CFN13的情况下，呈现出α-螺旋(α-helix)得到减少的变形二级结构。因此，预测出CFN7及CFN8中的IFNα融合蛋白具有与IFNα类似的活性。
【实施例6：干扰素-α融合蛋白的聚乙二醇化】
将分子量30kDa或40kDa的线性PEG(linear PEG)或分枝型PEG(branched PEG)在N-末端、C-末端或内部实现了聚乙二醇化。N-末端聚乙二醇化在IFNα融合蛋白的CTP的前方附着有PEG的形态，内部聚乙二醇化(随机聚乙二醇化)在IFNα融合蛋白内部的赖氨酸(lysine)残基以随机方式附着PEG的形态。并且，C-末端聚乙二醇化在线性PEG或分枝型PEG附着于IFNα融合蛋白的C-末端的形态(参照图3)。
为了N-末端聚乙二醇化，将50mM磷酸钠(sodium phosphate，pH4.5)缓冲液代替了IFNα融合蛋白CFN8(CTP-GGGG-IFNα，序列表中序列33)。以1:10的比例混合了IFNα融合蛋白CFN8和醛-PEG(Aldehyde-PEG)。将1M的NaBH3CN作为还原剂添加于上述混合液，使最终浓度成为20mM之后，在常温条件下反应了2小时。通过SDS-PAGE确认了聚乙二醇化程度，并对聚乙二醇化的蛋白质实施阳离子交换色谱法及凝胶过滤色谱法实现了最终分离。聚乙二醇化收率为约40％。
为了内部聚乙二醇化，将50mM磷酸钠(sodium phosphate，pH7.5)缓冲液代替了IFNα融合蛋白CFN8(CTP-GGGG-IFNα，序列表中序列33)。以1:10的比例混合了PEG-NHS酯。将1M的NaBH3CN作为还原剂添加于上述混合液，从而使最终浓度成为20mM之后，在常温条件下反应了2小时。通过添加2M的甘氨酸来终止反应之后，利用SDS-PAGE来确认了聚乙二醇化程度。对实现聚乙二醇化的蛋白质实施阳离子交换色谱法及凝胶过滤色谱法来实现了最终分离。聚乙二醇化收率为约17％。
在IFNα融合蛋白中，对在IFNα的C-末端添加半胱氨酸的CFN8C(CTP-GGGG-IFNα-C，序列表中序列18)蛋白质进行了C-末端聚乙二醇化。与生成在CFN8C(CTP-GGGG-IFNα-C)的C-末端的半胱氨酸相结合的方式使马来酰亚胺-PEG附着在PEG。此时，以1:10的比例混合蛋白质和PEG，并添加1M的磷酸钠(Sodium phosphate，pH8.0)缓冲液使最终浓度成为100mM后反应了2小时。通过SDS-PAGE确认了聚乙二醇化程度，并对聚乙二醇化的蛋白质实施阳离子交换色谱法及凝胶过滤色谱法实现了最终分离。聚乙二醇化收率为约25％。
以下，在表4中显示了基于聚乙二醇化方法的各个制备收率。
【表4】
【实施例7：干扰素-α融合蛋白的抗-病毒活性的测定】
【1.抗-病毒活性的测定方法】
通过试管内实验(in vitro)测定了所制备的干扰素-α融合蛋白的抗病毒活性。抗病毒活性通过确认干扰素-α融合蛋白能够缓解多少马-达氏牛肾(MDBK，Madin-DarbyBovine Kidney)细胞(韩国细胞株银行)被水疱性口炎病毒(VSV，Vesicular stomatitisvirus)(韩国细胞株银行)感染时所发生的细胞病变效应(cytopathic effect)来测定。
首先，将马-达氏牛肾细胞在DMEM培养基中以成为1.0×105细胞/ml的方式进行稀释之后，在每个96孔板分别分注200μl，从而在37℃、5％CO2培养基中培养约18小时。在蛋白质的情况下，准备5000pg/ml浓度的干扰素-α融合蛋白、稀释为1/50的血液、稀释为1/10的肝样品之后，按1/2连续稀释，并按每100μl处理于细胞中。在37℃、5％CO2条件下诱导4小时的反应之后，将水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)以成为0.01MOI(感染复数，Multiplicity of Infection)的方式稀释于所有孔中，并以每孔100μl的方式分别放入于96孔板的各个孔。感染水疱性口炎病毒，并继续培养了18小时，从而引发了细胞病变效应。利用磷酸盐缓冲液对结束培养的细胞清洗两次之后，将4％甲醛以每孔放入200μl的方式放入各个孔，并在30分钟内固定了细胞。在利用磷酸盐缓冲液来清洗两次之后，将结晶紫(crystal violet)以每孔放入100μl的方式放入各个孔，并进行了30分钟的染色。在利用磷酸盐缓冲液来清洗两次之后，干燥了约30分钟。将80％乙醇以每孔放入100μl的方式放入各个孔，来溶解染色剂，并在570nm条件下测定了吸光度。以与未实施感染的对照组相比，呈现出50％的细胞病变效应的孔为基准，测定了活性度。
【2.基于干扰素-α融合蛋白形态的抗-病毒活性测定结果】
根据上述测定方法来测定了干扰素-α融合蛋白CFN7、CFN8、CFN11、CFN12、CFN13的活性，并将其结果呈现于以下表5中。
【表5】
融合蛋白 相对于IFN的相对活性(％)
IFN 100
CFN7 57.6
CFN8 90.7
CFN8C 95.0
CFN11 40.8
CFN12 43.6
CFN13 34.2
【3.基于干扰素-α融合蛋白的聚乙二醇化的抗-病毒活性测定结果】
根据上述测定方法来测定了基于PEG尺寸及聚乙二醇化方法的差异的干扰素-α融合蛋白的抗-病毒活性。
测定了作为未附着有CTP及PEG的干扰素α蛋白质的标准制剂IFNα、在N-末端附着有CTP而未附着有PEG的IFNα融合蛋白(CTP-X-IFNα-Y蛋白质)、作为PEG以多种形态附着于CTP-X-IFNα-Y蛋白质的N-末端或C-末端的IFNα融合蛋白的Di-PEG、202K、[2+4]K、401C、202C的抗-病毒活性。
上述Di-PEG融合蛋白为2个线性PEG(30kDa)分别与CFN8蛋白质N-末端氨基酸的氨基(NH2)和蛋白质的内部赖氨酸残基的氨基(NH2)相结合的形态的IFNα融合蛋白，上述202K融合蛋白为2个线性PEG(20kDa)同时与CFN8蛋白质的内部赖氨酸的氨基(NH2)相结合的形态的IFNα融合蛋白，上述[2+4]K融合蛋白为2个线性PEG(5kDa)和4个线性PEG(7.5kDa)同时与CFN8蛋白质的内部赖氨酸残基的氨基(NH2)相结合的形态的IFNα融合蛋白，上述401C融合蛋白为1个线性PEG(40kDa)与CFN8C蛋白质的C-末端半胱氨酸残基的巯基(SH)相结合的形态的IFNα融合蛋白，上述202C融合蛋白为2个线性PEG(20kDa)同时与CFN8C蛋白质的C-末端半胱氨酸的巯基(SH)相结合的形态的IFNα融合蛋白(参照图3)。
如以下表6所记载的结果，与标准制剂IFNα相比较，在未结合PEG的干扰素-α融合蛋白的情况下，抗-病毒活性几乎与标准制剂IFNα的活性等同。相反，结合有PEG的IFNα融合蛋白的活性值因PEG的形态和结合方法而多样，但与未附着有PEG的标准制剂相比，活性全部减少。
并且，通过对本发明的IFNα融合蛋白401C和当前市场上销售的PEG附着IFNα药物，即PEGASYS(罗氏公司(Hoffman LaRoche Ltd.))的抗-病毒活性进行比较来实施了测定。PEGASYS为20kDa的分枝型PEG以随机方式与IFNα蛋白质相结合的IFNα融合蛋白。实验结果如表6所示，本发明的401C融合蛋白的抗-病毒活性高出PEGASYS(罗氏公司(HoffmanLaRoche Ltd.))3倍。
【表6】
【实施例8：干扰素-α融合蛋白的药物动力学特性的测定】
【1.小鼠药物动力学数据】
将3只小鼠作为一个实验组或对照组，按不同的时间(4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天)，以每只30μg的方式向小鼠的颈后皮下注射了各干扰素-α融合蛋白。实验所使用的试样使用了202K、202C及401C的融合蛋白作为实验组，并使用了附着有PEG的IFNα药物，即PEGASYS(罗氏公司(Hoffman LaRoche Ltd.))作为对照组。PEGASYS为20kDa的分枝形态的PEG以随机方式与IFNα蛋白质相结合的IFNα融合蛋白。在注射试样之后，根据各个时间段从小鼠的眼睛中采集约1ml的血液，插入于冰中1小时之后，实施离心分离(13000rpm、4℃、0.5小时)，且只回收血清，并将所回收的血清稀释为1/50，从而测定了抗-病毒活性。所测定的结果记载于以下表7中。如表7的结果所示，可以确认相比401C的形态与202K或PEGASYS，血液内活性、肝内活性、及血液内活性对比肝内活性的比率更高。
【2.猴子药物动力学数据】
将2只猴子作为一个组，按不同的时间(4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天)，以每只300μg的方式向猴子的颈后皮下注射了各个样品。试样使用了附着有PEG的干扰素-α融合蛋白(401C)作为实验组，并使用了附着有PEG的市场上销售的IFN-α药物PEGASYS作为对照组。在注射前和注射后，根据各个时间段从猴子的后腿静脉中采集约2.5ml的血液，插入于冰中1小时之后，实施离心分离(13000rpm、4℃、0.5小时)，且只回收了血清。并将血清稀释为1/50，从而测定了抗病毒活性。测定结果呈现于图4中。
根据使用猴子的本发明中干扰素-α融合蛋白401C药物动力学，将本发明的干扰素α融合蛋白401C给药于猴子之后的3天以内的药物给药前期中，呈现出与PEGINTRON(肝炎治疗剂，默克公司(Merck&Co.,Inc))类似程度的药物给药后初期活性增加的效果，在给药后的4-7天内的药物给药后期中，呈现出与PEGASYS(肝炎治疗剂，罗氏公司(Hoffman LaRocheLtd.))类似程度的稳定性(参照图4)。这种结果意味着在本发明中制备的干扰素α融合蛋白401C在药物给药之后，初期活性不会减少，并到7天为止，维持高的活性。这种持久力证明了组成本发明一实施例的融合蛋白的接头、聚乙二醇的种类、位置及方法得到了最优化。
【实施例9：干扰素α融合蛋白的肝移动性的测定】
将3只小鼠作为一个组，按不同的时间(4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天)，以每只30μg的方式向小鼠的颈后皮下注射了各个样品。实验所使用的试样使用了202K、202C及401C的融合蛋白作为实验组，并使用了作为附着有PEG的IFNα药物的PEGASYS(罗氏公司(Hoffman LaRoche Ltd.))作为对照组。在注射之后的各个时间段切开小鼠的腹部，并向肝的血管注射冷藏保管的磷酸盐缓冲液，从而实施了肝灌注(perfusion)。若从肝中去除血液，则切断整个肝，来放入10％蔗糖缓冲液，之后利用磷酸盐缓冲液将肝清洗了两次。将肝放入装有蛋白质分解酶抑制剂(protease inhibitor)的磷酸盐缓冲液中，并利用粉碎机进行了粉碎。放入400μl的10xRIPA缓冲液，从而使该缓冲液成为1xRIPA缓冲液的方式进行混合。利用3个1.5ml管分注每个约1.2ml的样品，并在4℃温度下保管了12小时。在进行离心分离(13000rpm、4℃、0.5小时)之后，各管只回收700μl的上清液，从而每个样品分别收集了约2ml。通过快速蛋白液相色谱(使用预装脱盐柱(Hi-trap desalting column)，瘤(flow)固定为3)对1ml的样品进行了纯化。为了测定所回收的蛋白质分馏的量，对药时曲线下面积(AUC，Area under concentration)进行计算，从而计算出稀释倍数。[ELISA测定值(ng/ml)×2×2×粉碎的总体积(ml)]/[肝的重量(g)×(通过快速蛋白液相色谱纯化取得的蛋白质的量)/(快速蛋白液相色谱纯化的蛋白质的总量)]＝ng/g肝。在不同时间段，使用肝提取物来测定干扰素-α的活性度，从而对附着有PEG的IFN-α融合蛋白和作为市场上销售的药物的PEGASYS之间的肝移动性进行了比较评价。
如图5a及图5b的结果所示，根据使用小鼠的肝移动性测定实验结果，本发明的干扰素-α融合蛋白的肝移动性与PEGASYS相比，401C高出约13倍，202K高出约6倍。若考虑到PEGASYS因自身的PEG而具有高的肝移动特性，则可知本发明的干扰素-α融合蛋白的肝移动性显著高。并且，可知在202N的情况下，肝移动性几乎没有呈现。
这是因为在202N的形态中，PEG在C-末端的CTP实现聚乙二醇化，从而妨碍了CTP的肝移动能力。
以下的表7为在血液和肝中作为药动力学方面最优秀的实验组的401C和202K的活性值与作为对照组的PEGASYS的活性值相比较的结果。根据结果，401C不仅与实验组，与对照组相比，在血液和肝中也呈现出最卓越的药动力学活性。
【表7】
综上所述，本发明涉及改善肝移动及残留特性的干扰素α融合蛋白，以连接融合蛋白的接头的种类及长度的干扰素α融合蛋白的结构为基准，选择不会引起结构变化的接头，并通过这种融合蛋白的试管内(in vitro)及生物体内(in vivo)特性，证明干扰素α蛋白质的活性、肝移动及残留特性得到改善，从而完成了本发明。并且，本发明一实施例的融合蛋白与以往的融合蛋白相比，不仅在活性及半衰期方面得到改善，而且便于维持质量及制备，因此，能够有用地利用于肝脏疾病治疗用组合物。
以上，对本发明的特定部分进行了详细记述，对于所属领域的普通技术人员来说，这种具体的记述仅为优选实施例，本发明的范围并不局限于此，这是显而易见的。因此，本发明的实质范围应根据所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。

Claims (8)

1.一种干扰素-α融合蛋白，其由CTP-X-IFNα-Y-PEG表示，其中
所述CTP-X-IFNα-Y的序列是SEQ ID NO:18；且
所述PEG为分子量30～45kDa的聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的干扰素-α融合蛋白，其中所述聚乙二醇为线性聚乙二醇。
3.一种核酸分子，其对SEQ ID NO:18表示的肽进行编码。
4.一种载体，其包含上述权利要求3所述的核酸分子。
5.一种转化体，其由上述权利要求4所述的载体转化而成。
6.一种肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合物，所述组合物包含：
(a)药剂学有效量的权利要求1或2所述的干扰素-α融合蛋白；以及
(b)药剂学上允许的载体。
7.根据权利要求6所述的药剂学组合物，其中所述肝脏疾病为肝癌或肝炎。
8.根据权利要求7所述的药剂学组合物，其中所述肝炎为丙型肝炎病毒导致的丙型肝炎。
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