KR20230099956A

KR20230099956A - 면역세포에 항원을 전달하기 위한 폴리펩타이드

Info

Publication number: KR20230099956A
Application number: KR1020210189421A
Authority: KR
Inventors: 홍승호; 김영훈; 전윤재
Original assignee: 제이더블유크레아젠 주식회사
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-07-05
Also published as: WO2023128594A1

Abstract

본 발명은 면역세포에 항원을 전달하기 위한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 구체적으로 세포막 투과 펩타이드 및 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드를 포함하는 신규 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드에 항원이 결합되어 있는 융합 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 융합 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산에 의해 감작된 면역세포, 면역세포를 포함하는 면역치료제, 항-종양 또는 항암 백신 및 종양 또는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

면역세포에 항원을 전달하기 위한 폴리펩타이드 {Polypeptide for Delivering Antigen to Immune Cells}

FGF (Fibroblast Growth Factor)에 존재하는 시그널 서열 (막투과 서열: membrane transduction sequence: MTS) 또는 세포질 침투 펩타이드 (cytoplasmic penetration peptide: CPP)는 세포막을 투과하는 성질을 가지는 것으로 알려졌다. 상기 시그널 서열은 세포막을 쉽게 투과하는 성질을 가지나, NLS (nuclear localization sequence)가 없어서 핵 내로는 들어가지 않는 특징을 보인다.

MTS 또는 CPP는 항원 전달체로 사용될 수 있다. 세포질 내로 유입된 펩타이드 항원이 프로테아좀 (proteasome)을 거쳐 프로세싱 되면서 MHC 클래스 I에 실려 세포 표면으로 제시될 수 있다. 또한, 세포질에서 진행되는 세포 죽음과 세포 성장을 조절하는 여러 신호 전달 과정을 대상으로 하여 개발된 특정 기능의 단백질을 전달하기 위한 치료용 물질 전달에 사용될 수 있다.

이와 관련하여, 본 출원의 발명자들은 세포막 투과능은 있으면서도 세포질에 잔류하는, 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 (cytoplasmic transduction peptide, CTP)를 개발하고, CTP가 우수한 세포막 투과능을 보이면서도 세포질 내에 잔류하는 신규한 특성을 보유하고 있기 때문에, 세포 독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte; CTL)-반응을 유도하는 데 적합하며, 세포질 내로의 효과적인 약물송달시스템 (drug delivery system; DDS)으로 사용될 수 있음을 확인한 바 있다 (한국등록특허 제0608558호).

한편, 황색포도알균 (Staphylococcus aureus)은 자연환경에 대한 저항성이 강하기 때문에 자연계에 광범위하게 분포하고 있으며, 사람이나 동물의 화농성 변소에 존재할 뿐만 아니라 건강한 사람과 동물의 피부 등에도 상재하고 있어 식품과 인체에 오염될 가능성이 매우 높다. 황색포도알균 (Staphylococcus aureus)이 생성하는 병원성 인자는 외독소 (exotoxin), 장독소 (enterotoxin), 세포 용해성 독소 (hemolysin toxin), 백혈구 사멸독소 (leucodicin), 피부용해 독소 (epidermolytic toxin) 이외에 독소성 쇼크 증후군 독소 (toxin shock syndrome toxin, TSST) 등의 세포외 산물을 생성함으로써, 인간에게 식중독 등의 중요한 각종 질병을 유발한다.

황색포도알균 장독소 B형 (Staphylococcal Enterotoxin B 또는 이하 'SEB'라고도 함)는 황색포도알균 (Staphylococcus aureus) 독소형 식중독균에 의해 생산되는 독소로서, 전 세계적으로 분포되어 있고 주로 식중독을 일으키고 비정상적인 면역반응을 유도하여 심각한 면역질환을 일으키는 원인이 된다.

SEB는 약 26 내지 29 kDa 크기의 단백질로써 분자량은 작으나 SEB는 물에 잘 녹고 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), 폐폐인(papain) 등과 같은 프로테아제(Protease) 효소에 대한 저항성도 강하며 극한 온도나 pH에도 잘 견디는 매우 안정한 독소이다.

SEB의 기능적 측면에서, SEB는 슈퍼항원(Superantigen, SAg)으로 명명되며 활성화된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 존재하는 T-세포 수용체(T-cell receptor, TCR)와 항원표출세포(Antigen Presenting Cell, APC)에 존재하는 MHC 클래스 Ⅱ(Major Histocompatibility Complex class II) 사이를 연결하는 역할을 하는 항원(antigen)이다. SEB는 대식세포의 MHC 클래스 Ⅱ에 결합한 후, T 세포의 수용체 Vb8 부위와도 결합함으로써, T세포를 비정상적으로 활성화시켜, IL-6, IL-1β, MIP-1 (Macrophage Inflammatory Protein-1) 등과 같은 다량의 염증성 사이토카인을 대량으로 분비되도록 함으로써, 비정상적인 면역반응을 유도하게 된다. 호흡기계가 SEB에 노출되었을 때, SEB로 사망하는 사람은 적지만, 노출된 사람의 80% 이상은 임상적 증상을 나타내고, 1~2주 동안은 일상생활이 불가능할 정도로 심한 증상을 나타내는 것으로 알려졌다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 세포막 투과 펩타이드 및 SEB의 구조적 연구를 통해, MHC 클래스 Ⅱ에 결합하는 펩타이드를 선별하였으며, 세포막 투과 펩타이드 및 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드를 포함하는 신규 폴리펩타이드가 면역세포로의 항원 전달 수율을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 면역세포에 항원을 전달하기 위한 신규 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 폴리펩타이드에 항원이 결합되어 있는 융합 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 융합 폴리펩타이드 또는 상기 핵산을 포함하는 면역세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 면역세포를 포함하는 면역치료제를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 면역세포를 포함하는 항-종양 또는 항암 백신을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 면역세포를 포함하는 종양 또는 암 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포막 투과 펩타이드 (cytoplasmic transduction peptide, CTP) 및 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드를 포함하는, 면역세포에 항원을 전달하기 위한 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드에 항원이 결합되어 있는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 면역세포를 제공한다.

본 발명은 상기 면역세포를 포함하는 면역치료제를 제공한다.

본 발명은 상기 면역세포를 포함하는 항-종양 또는 항암 백신을 제공한다.

본 발명은 상기 면역세포를 포함하는 종양 또는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 우수한 면역세포의 세포막 투과 능력을 가지며, 면역세포에 직접적인 타켓팅을 통해 우수한 효율로 항원이 전달되도록 함으로써, T 세포 증식에 효과적일 수 있다.

도 1은 CTP/CTP-SEB 그룹의 MoDC 세포막 투과성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 CTP/CTP-SEB 그룹의 MoDC 투과성 차이를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 융합단백질 생산을 위한 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 융합단백질 생산에서 Ni-NTA 레진을 이용한 정제 결과 및 QC분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 융합단백질의 세포투과성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 융합단백질의 직접적인 결합력 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 배양액 내 단백질 잔존량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 PTD 계열 펩타이드의 DC 표현형 및 세포막 투과성 비교 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 항원 특이적 T cell 증식 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 CTP-OVA 또는 SCTP-OVA 항원으로 감작된 수지상세포를 접종시킨 마우스에서 항종양 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 면역세포 종류에 따른 투과성 분석 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서 본 발명은 세포막 투과 펩타이드 (cytoplasmic transduction peptide, CTP) 및 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드를 포함하는, 면역세포에 항원을 전달하기 위한 폴리펩타이드에 관한 것이다.

상기 세포막 투과 펩타이드는 예를 들어, 단백질 운반 도메인 예를 들어, CTP(cytoplasmic transduction peptide, 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드), HP4, Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(Antennapedia), Pep-1(peptide), PTD-5, R9(arginine) 및 7R 도메인을 포함하는 펩타이드로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 세포막 투과 펩타이드는 세포막 투과능을 갖으며, 세포에 처리하고 일정 시간 후 상기 처리된 세포에 단백질 분해효소를 처리한 경우에도 세포막 투과현상을 나타내고, 세포막을 투과한 이후에는 세포질에 잔류하는 특성을 갖는 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드일 수 있다. 상기 세포막 투과 펩타이드가 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드와 융합시, 엔도사이토시스 (endocytosis)를 억제함과 동시에 유비퀴틴 (ubiquitin)을 억제하는 경우 폴리펩타이드가 분해되지 않고 세포 내 존재하는 것을 확인하였다.

상기 세포막 투과 펩타이드는 예를 들어, 9-20 aa, 보다 바람직하게는 9-15 aa, 가장 바람직하게는 약 11 aa 길이를 가질 수 있다.

상기 세포막 투과 펩타이드는 예를 들어, 상기 세포막 투과 펩타이드는 서열번호 5 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 발명자들은 서열번호 5 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 세포막 투과 펩타이드를 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드와 융합하는 경우, 세포막 투과 펩타이드 단독에 비해 우수한 세포막 투과능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.

상기 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드는 예를 들어, MHC (major histocompatibility complex) 분자에 결합하는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 면역세포의 표면 분자로 발현하는 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 II (MHC class II)에 결합하는 펩타이드를 포함할 수 있다.

하나의 구체예에서, 상기 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.

상기 항원은 암 또는 종양에 대한 면역반응 활성화를 위한 암 또는 종양 항원일 수 있다. 상기 항원은 암 또는 종양 항원으로 세포치료에 있어 암 또는 종양 특이적 면역세포 예를 들어, 세포독성 T 세포를 유도할 수 있다. 상기 암 또는 종양 항원은 예를 들어, 자가(self) 또는 비자가(non-self) 유래 항원일 수 있다. 예를 들면 환자 자신의 유전자에서 유래된 자가 암 또는 종양 항원은 hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1) 등과 암 특이적 돌연변이 항원 예를 들면 neoantigens, mutated P53, RAS 등의 종양 억제 또는 유발 유전자를 포함할 수 있으며, 외래 암 또는 종양 항원으로 암 또는 종양 유발 바이러스 항원 예를 들면 CMV, EBV, HPV 등을 포함할 수 있다.

자가 암 또는 종양 항원인 hTERT는 염색체 말단에서 텔로미어 DNA(telomeric DNA)를 합성하는 효소로서 암세포는 이 효소를 과도하게 활성화시켜 텔로미어 의존적 세포사멸을 회피할 수 있도록 기능하고 폐암, 위암, 췌장암을 포함하는 다양한 고형암의 타겟 항원으로 알려져 있고 (Kim NW, et al. Science. 1994;266:2011-2015), WT1은 Wilms tumor와 관련된 유전자로서 징크 핑거 전사인자를 암호화하여 세포의 증식과 분화, 자멸사, 기관의 발생에 관여를 하는 단백질로서 뇌척수암, 폐암 등의 타겟 항원으로 알려져 있다 (Call KM, et al., Cell. 1990. 60:509-520; Nakahara Y, et al.,Brain Tumor Pathol. 2004. 21:113-6). 또한 NY-ESO1은 CTA (cancer testis antigen)에 속하는 단백질 중 하나로 주로 생식세포(germ cell)와 육종(sarcoma), 유방암을 포함한 다양한 암세포에 발현하는 것으로 잘 알려져 있다 (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res. 2006;95:1-30). MAGE-A3은 멜라노마 연관 항원 패밀리 (melanoma-associated antigen family)에 속하는 단백질로 폐암, 육종 및 흑색종을 포함한 다양한 암세포에 과발현하는 것으로 알려져 있어 암의 면역치료에 적합한 표적 항원으로 평가되고 있다 (Decoster L, et al.,Ann Oncol. 2012 Jun;23(6):1387-93).

경우에 따라서, 상기 항원은 예를 들어, A33, ALK, 알파페토단백질(AFP), 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3), alpha-folate receptor, AD034, AKT1, BCMA, 베타-인간 융모막 고나도트로핀, B7H3(CD276), BST2, BRAP, CD5, CD13, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44v6, CD52, CD72, CD79a, CD79b, CD89, CD97, CD123, CD138, CD160, CD171, CD179a, 탄산무수화효소 IX(CAIX), CA-125, 발암배아성 항원(CEA), CCR4, C-유형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1), 클라우딘 6(CLDN6), CXORF61, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, ERBB2, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), 상피 세포 부착 분자(EPCAM), 신장 인자 2 돌연변이된(ELF2M), 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2), EMR2, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3), FCRL5, Fibulin-1, G250, GD2, 당단백질 36(gp36), 당단백질 100(gp100), 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR), GPRC5D, GloboH, G 단백질-결합된 수용체 20(GPR20), GPC3, hsp70-2, 고분자량-흑색종-관련 항원(HMWMAA), A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1), HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/Galectin9, HOM-MEEL- 40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB 1, 인슐린 성장 인자(IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2), 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra), IGLL1, KIT(CD117), KM-HN-3, KM-KN- 1, KOC1, KOC2, KOC3, LAGA-1a, LAGE-1, LAIR1, LILRA2, LY75, Lewis Y antigen, MUC1, MN-CA IX, M-CSF, MAGE-1, MAGE-4a, 메소텔린, MAGE-A1, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MART1, MPPl 1, MSLN, 신경세포 부착 분자(NCAM), NY-ESO-1, NY-ESO-5, Nkp30, NKG2D, 유선 분화 항원(NY-BR-1), NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NNP-1, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK1 1, NY-REN-21, NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY-REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2), OGFr, PSMA, 전립선 산성 포스파타제(PAP), p53, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 프로테아제세린 21(테스티신 또는 PRSS21), 혈소판-유래된 성장인자 수용체 베타(PDGFR-beta), PLAC1, 파넥신 3(PANX3), PLU-1, ROR-1, RAGE-1, RU1, RU2, Rab38, RBPJkappa, RHAMM, 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4), SCP1, SSX3, SSX4, SSX5, Tyrp-1, TAG72, 티로글로불린, 5T4, 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제(Tyrosinase), 트랜스글루타미나제 5(TGS5), TEM1, TEM7R, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), Tie 2, TRP-2, TOP2A, TOP2B, 유로플라킨 2(UPK2), 비멘틴(Vimentin), 또는 혈관 내피성장 인자 수용체 2(VEGFR2)일 수 있다.

또한, 상기 항원은 병원균 (박테리아, 바이러스 등), 화합물질, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이며, 더욱 바람직하게는 암 항원 펩타이드이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 항원은 바람직하게는 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 유전자, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 폴리뉴클레오티드, 세포, 세포 용해물(lysate), 박테리아, 바이러스 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 암 항원 펩타이드일 수 있다. 상기 당백질은 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 조절 단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소의 단편, 수송 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도 물질, 저장 단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질 등일 수 있다. 그러나 생체에서 항원으로 작용하여 면역 반응을 유도할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 항원은 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항원으로, 불활성화 종양세포, 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 종양세포 관련 유전자, 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 유전자 재조합 방법에 의해 상기 항원을 수득하고자 하는 경우, 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지일 수 있으며, 공지된 서열의 전장을 이용할 수 있으나, 전장의 일부를 이용할 수도 있다. 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터에 클로닝하여 목적하는 항원이 발현되도록 할 수 있다.

상기 항원은 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다. 공유결합 방법은 항원의 종류에 따라 당업계에 공지된 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 클로닝 및 세포 내 발현시켜 수득할 수 있다.

경우에 따라서, 폴리펩타이드의 활성을 방해하지 않는 링커, 예를 들어 N-숙시니미딜 요오도아세테이드, N-말레이미도부티릴 옥시숙신아미드 에스테르, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 디스디아조벤지딘, 3,3-디티오-비스-(설포숙시니미딜-프로피오네이트), 에틸렌 글리콜비스(설포숙시니미딜숙시네이트), 디시클로헥실 카보디이미드 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 한편, 항원이 폴리펩타이드로부터 분해되었을 때에만 활성을 나타내는 경우에는, 링커는 생체 내에서 절단 가능한 것을 사용한다. 예를 들어, 카복실산 에스테르 및/또는 디설파이드 결합이 있는 결합제가 이용될 수 있다.

하나의 구체예에서, 상기 면역세포는 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 의해 전달된 항원을 표면에 제시하는 항원제시세포(antigen-presenting cells, APC)일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역세포는 수지상세포, 단핵구세포 (monocyte), 랑게르한스(Wrangel Hans) 세포, 마크로파지(macrophage), T세포 또는 B세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드는 예를 들어, 세포막 투과 펩타이드의 일 말단에 융합될 수 있다. 상기 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드는 세포막 투과 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다.

경우에 따라서, 상기 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드는 세포막 투과 펩타이드와 링커로 연결될 수 있다. 상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 5-25 aa 길이, 구체적으로 약 5-10 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 링커는 구조적 유연성을 부여하기 위하여 예를 들어, 글리신 링커 (G, Gly)p (p는 1 내지 10), GS 링커 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 GGGGS 또는 (GGGGS)2를 포함하거나, (G, Gly)p에서 p가 5-10인 5-10 aa의 글리신을 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명에 따른 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

상기 DNA를 통해 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 결합 단백질의 제1암 및/또는 제2암 코딩 DNA를 용이하게 분리 또는 합성한다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

동물세포의 예로 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 폴리펩타이드에 항원이 결합되어 있는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다.

상기 폴리펩타이드와 항원은 공유적 또는 비공유적 결합을 통해 연결되어, 복합체를 형성하고, 면역세포에 포함되도록 함으로써 항원으로 면역세포를 감작시킬 수 있다.

본 발명에 따른 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드에 항원이 결합되어 있는 융합 폴리펩타이드는 벡터를 통해 전달될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 융합 폴리펩타이드 및 상기 핵산을 포함하는 면역세포에 관한 것이다. 상기 융합 폴리펩타이드의 항원을 통해 면역세포가 감작되도록 할 수 있다.

상기 감작은 항원이 면역세포에 전달되어 세포 표면상에 로딩되도록 하는 것을 의미한다. 상기 항원은 폴리펩타이드와 재조합 항원 형태로 제조되어, 면역세포에 감작될 수 있다. 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드에 결합된 항원을 면역세포에 24시간 이하 동안 처리함으로써, 면역세포를 감작시킬 수 있다. 감작시간은 항원의 종류 및 면역세포의 종류에 따라 조절될 수 있다.

상기 항원은 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항원으로, 불활성화 종양세포, 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 종양세포 관련 유전자, 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 유전자 재조합 방법에 의해 상기 항원을 수득하고자 하는 경우, 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지일 수 있으며, 공지된 서열의 전장을 이용할 수 있으나, 전장의 일부를 이용할 수도 있다. 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터에 클로닝하여 목적하는 항원이 발현되도록 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 면역세포를 포함하는 면역치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 면역치료제는 면역 반응을 증가시키거나, 특정 질병, 감염 또는 질환의 치료 또는 예방에 바람직한 면역 반응의 일부를 선택적으로 상승시킬 수 있다.

이에 기반하여, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 면역세포를 포함하는 항-종양 또는 항암 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따른 백신을 통해 객체의 면역원성을 증가시킬 수 있으므로, 이를 통해 객체 내 종양의 증식 및/또는 전이를 예방 또는 억제할 수 있다.

상기 백신은 일회 투여함으로써 수행되는 면역화 방법과 연속 투여함으로써 수행되는 면역화 방법을 모두 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 종양 또는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 기관지, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 투여 시간 및 투여 경로와 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있으나 투여량에 따른 심각한 독성(Grade 3 이상)은 보고되지 않았기 때문에 제조의 방법 및 수율에 따라서 많은 부분이 결정된다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 피내 또는 피하 투여량은 바람직하게는 1회당 0.1X10⁷~10X10⁷ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조된다. 이때 제형은 세포 동결용 용액에 현탁 또는 완충용액에 현탁하는 형태일 수도 있으며, 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 면역세포는 항원 감작 이후 동결시키고, 필요시 해동하여 사용할 수 있다.

활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 상기 조성물은 종양 또는 암 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 펩타이드를 이용한 결합력 시험 연구

1.1 펩타이드 합성

MHC 클래스 Ⅱ와 결합하는 슈퍼 항원 펩타이드 (superantigen peptide) 중 5종을 선별하여 펩타이드 제작 업체인 애니잰㈜에 합성 의뢰를 진행하여 펩타이드 5종을 합성하였다.

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1.1.1 ELISA 활용 시험

합성된 펩타이드의 결합력을 확인하기 위해 96 웰 플레이트에 MHC 클래스 Ⅱ 단백질을 코팅 한 후 펩타이드를 50nM로 처리 한 다음 24시간 인큐베이션을 진행하였다. 이후 3회 PBS 워싱 후 HRP-항체(1:500)를 2시간 인큐베이션 진행한 뒤 5회 PBS 워싱 이후 TMB 용액을 넣은 후 10~30min 인큐베이션 후 정지 용액 (stopping solution: 2M H₂SO₄)활용 발색을 정지시킨 후 흡광도 450nm에서 확인하여 결합력이 좋은 펩타이드를 선별하였다. 그 결과 합성한 펩타이드 5가지중 SEB2에 해당하는 펩타이드 서열이 가장 높은 결합력을 보였으며 그 다음으로 SEB4, SEB1, SEB3 순서로 결합력을 보였다.

1.1.2 PBMC를 이용 단핵구 유래 수지상세포 (monocyte-derived dendritic cell) 분화

PBMC 바이얼을 꺼내서 해동 시킨 후 1%AB RPMI 배지를 활용하여 T150 플레이트에 30분동안 단핵구를 부착시켰다. 이후 부착되지 않은 세포들은 제거 한 후 성숙화 배지인 hGM-CSF 30ng/ml, hIL-4 20ng/ml로 3일간 배양 진행하였다.

1.1.3 펩타이드 세포투과성 측정

MoDC 세포는 30-40 % 컨플루언트(confluent) 상태로 커버슬립(cover slip)에 분주한 뒤, 1 x 10⁴ cells/well의 세포 밀도로 6 웰 플레이트에 보관되었다. 펩타이드를 각각 농도에 따라 처리 후 배양한 뒤 PBS로 세척하고 상온에서 15분 동안 4%파라포름알테하이드로 고정하였다. 이후 3% BSA를 이용하여 차단 (blocking) 진행 후 세포 내에 투과된 펩타이드를 표시하기 위해 FITC, DAPI를 이용하여 염색을 진행, 이후 형광현미경을 이용 분석 진행하였다. 그 결과 기존 원천특허로써 가지고 있는 CTP 서열 펩타이드 대비 APC의 결합력이 높은 SEB2를 결합한 CTP-SEB2 서열 펩타이드가 moDC세포에서 월등히 많이 투과되는 것을 관찰 할 수 있었으며, 그해 반에 SEB2 서열 펩타이드만 처리한 군에서는 투과되는 현상을 관찰할 수 없었다. 위 결과를 도 1에 나타내었다.

1.1.4 유동세포분석기를 이용한 세포투과성 측정

MoDC는 인간말초혈액에서 단핵구를 분리 후 배양하여 수지상 세포를 수득하였다. 분화된 수지상세포를 이용하여 각 그룹별로 펩타이드 농도에 따라 처리 후 10분간 배양하였으며, 이후 PBS를 이용 각각의 그룹을 세척하였다. 수지상세포의 표현형을 분석하기 위해 항-마우스 CD80, 항-마우스 CD86, 항-마우스 CD11c, 펩타이드-FITC를 각각 염색한 후 FACS CantoⅡ를 이용하여 측정하였다. 먼저 제조한 MoDC의 표현형을 확인 후 제조한 DC가 DC로써의 기능을 하는지 확인하는 분석을 진행 하였으며 그 결과 모든 DC 에서 90%이상의 표현형을 나타내었음을 확인하였다. 그 후 DC안에서의 펩타이드 투과성을 분석하기 위해 CD11c+와 CD80+의 이중 집단 (double population)을 수득한 후 그 안에서의 펩타이드-FITC를 분석하였다. 분석 결과 현미경 결과와 동일하게 CTP-SEB2 펩타이드 그룹에서 기존 CTP 펩타이드 그룹대비 많은 양의 펩타이드가 투과된 것을 확인할 수 있었으며, SEB2 단독 펩타이드의 경우는 투과성이 거의 없는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 2. CTP가 융합된 펩타이드 융합단백질 제작

2.1 융합단백질 벡터 제작.

투과성 결과에서 결합력이 가장 우수한 SEB2 서열 펩타이드를 선정하여 유전자재조합 단백질 벡터를 도 3과 같이 제작 의뢰(genscript, Piscataway, NJ)하였다.

2.2 재조합 융합단백질 생산.

재조합된 유전자를 E.coli를 이용하여 배양을 진행 한 뒤 IB상태로 제작한 이후 가용화 단계를 거쳐 Ni-NTA 레진 (resin)을 이용하여 분리 정제를 진행하였다. 구체적으로는 먼저 37℃에서 하룻밤 동안 종균 배양한 후, LB Broth Miller 배지 (Novagen, Yeast extract 5g,peptone from casein 10g, sodium chloride 10g)에 앰피실린(Ampicillin) 50μg/ml 을 첨가한 배양액 속에서 37℃로 키웠다. OD600 nm의 흡광도에서 그 값이 0.8~1.0 정도에 도달했을 때, 최종 0.5mM의 농도가 되도록 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도시킨 후 180rpm에서 8시간 동안 진탕 배양하였다. OD600nm의 흡광도에서 그 값이 1.5~2.0 정도로 자란 박테리아 세포들은 10,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 침전시킨 후, 침전된 세포2g (1L culture volume)당 50ml의 붕해 완충액(300mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% Triton X-100)으로 세포가 완전히 현탁될 때까지 교반시켰다. PMSF를 최종 농도 1mM이 되게 넣은 후, 초음파 분쇄기로 세포를 융해하였다. 융해된 세포는 12000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 하여 현탁액과 총 융해물을 분리한 후, 현탁액만을 모아 0.45μm의 기공 크기의 셀룰로오스 여과 막에 여과하여 미리 평형 완충액으로 평형화시킨 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 정제된 단백질을 버퍼 교환을 통해 안정화 상태로 만든 뒤 QC를 진행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

2.3 융합단백질 세포투과성 측정

MoDC 세포는 30-40 % 컨플루언트(confluent) 상태로 커버슬립(cover slip)에 분주한 뒤, 1 x 10⁴ cells/well의 세포 밀도로 6 well plate에 보관되었다. 펩타이드를 각각 농도에 따라 처리 후 배양한 뒤 PBS로 세척하고 상온에서 15분 동안 4%파라포름알테하이드로 고정하였다. 이후 3% BSA를 이용하여 blocking진행 후 세포 내에 투과된 단백질을 표시하기 위해 Cy5.5, DAPI를 이용하여 염색을 진행, 이후 형광현미경을 이용 분석 진행. 재조합 단백질 미처리군 대비 처리군인 CTP-SEB2-OVA 그룹에서 많은 양의 단백질이 투과된 것을 확인 할 수 있었으며, 기존 CTP 서열로 재조된 CTP-OVA 단백질 처리 그룹보다도 투과량이 많은 것을 확인 할 수 있었다. 그에 반해 CTP가 포함되지 않은 OVA, SEB-OVA 그룹의 경우 단백질 투과가 안 되는 것을 확인 할 수 있었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

2.4 웨스턴 블롯 활용 융합단백질 세포투과성 측정

세포를 차가운 PBS로 세척한 후, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 mM NaF, 10 mM Na3VO4,0.5% NP40 및 Pierce (protease inhibitor cocktail)를 포함하는 용배버퍼 (lysis buffer)에 의해 용해시켰다. 세포 전체 용해물 (Whole cell lysates)은 Bradford 제제 (Bio-Rad)를 이용하여 동일한 농도로 조절하였으며, 40-120 μg의 용해물을 사용하여 8-12% 아크릴아마이드 겔 (acrylamide gel)에 SDS-PAGE를 진행하였으며 PVDF 멤브레인 (Milipore)로 이동하였다. 면역블롯팅 (immunoblotting)을 진행하기 위해, 멤브레인을 0.5% Tween20이 포함된 TBS (TBST)로 제조된 5% non-fat dry milk로 상온에서 한 시간 동안 차단 (blocking) 하였다. 멤브레인을 TBST로 4회 세척하고 4% non-fat dry milk 로 희석한 1차 항체를 최적의 농도로 처리한 후 4℃에서 오버나이트 (overnight)하여 배양하였다. TBST로 4회 세척 후, HRP가 결합된 2차 항체와 함께 45분 동안 배양하였다. 결합된 항체는 chemiluminescent HRP substrate (Millipore, USA) 및 Chemi DOC (Bio-RAD, USA)를 이용하여 검출하였다

2.5 융합단백질의 직접적인 결합력 분석

선별된 펩타이드를 활용 HIS-tag이 발현되는 유전자를 제작하여 단백질을 제조하여 MHC 클래스 Ⅱ와 직접적인 상호작용을 하는지의 여부를 알아보기 위하여, His에 대한 면역침강법(immunoprecipitation)을 실시하여 분석하였다.

구체적으로, 4X10^7개의 세포를 수거하여 PBS로 2회 세척한 후, 단백질 분해효소 억제제 칵테일[2 mM AEBSF, 1mM EDTA, 130 μM 베스타틴(Bestatin), 1 μM 레우펩틴(leupeptin), 14 μM E-64, 0.3 μM 아프로티닌(Aprotinin)]과 탈인산가수분해효소 억제제(Roche)를 포함한 NP-40 용해 완충용액(lysis buffer)(20 mM Tris,pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 10% 글리세롤)로 부유한 세포를, 4℃ 챔버에서 회전자(rotator)에 끼워 30분간 돌려주었다(C1, 25 rpm). 13000 rpm, 4℃에 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거한 다음, 다시 12000rpm, 4℃에 10분 동안 원심분리하여 깨끗한 상층액만을 수거하였다. 단백질을 정량한 뒤, 세포파쇄물 데이타(cell lysate data)로 사용할 단백질은 따로 샘플링(sampling)하여 -80℃에 보관 해놓고, 면역침강에 사용할 단백질은 500 ㎍ 이상/700 ~ 1000 ㎕으로 덜고 총 1 ml이 되도록 나머지는 용해 완충용액으로 채웠다. 여기에 면역침강용 항체를 단백질 100 ~ 500 ㎍ 당 1 ~ 2 ㎍씩 넣고 4℃ 챔버에서 회전자에 끼워 2시간 이상 또는 밤새 돌려주었다(C1, 10 rpm). 그런 다음 단백질 A/G 비드(Protein A/G beads)(Pierce)를 약 30 ~ 50 ㎕ 넣고 1 ~ 2시간 4℃ 챔버에서 회전자로 돌려주었다. NP-40 용해 완충용액으로 1200 rpm, 3min, 4℃씩 3회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후에는 잔여 완충액을 완전히 제거하고 5X샘플 완충용액(sample buffer)을 20 ㎕ 넣고 끓였다. 얼음에서 식힌 후 원심분리기로 2분간 돌린 후, 상층액만 따서 7.5 ~ 12% SDSPAGE 법으로 분리하였다. 겔(gel)은 다시 PVDF 멤브레인으로 블럿하고, 단백질이 옮겨진 멤브레인에 1차 항체를 붙인 후 2차 항체 IgG에 대한 항체를 붙인 후 ECL 탐색 키트(detection kit)로 관찰하였다.

분석결과를 도 6에 나타내었다. 그 결과, protein A/G 비드 (bead)와 융합단백질을 결합시켜 타켓 단백질로 웨스턴 블랏 (western blot)을 진행 하였을 경우 펩타이드가 융합된 단백질에서 타겟 단백질과 함께 검출되는 것을 확인할 수 있으며, 펩타이드가 없는 단백질에서는 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

2.6 마우스 수지상 세포 분리

수지상 세포(DC)는 골수줄기세포 (bone marrow stem cells)를 수지상세포로 분화시켜 배양하였다. 보다 구체적으로, 골수 유래 수지상 세포 (Bone marrow-derived DC, BMDC)는 6-8주령 female C57BL/6 마우스의 대퇴골과 경골로부터 골수 세포를 분리한 후, 적혈구를 제거하기 위해 ACK lysis buffer (Lonza)를 처리하였다. 세포를 세척하고 10 ng/ml mGM-CSF (Creagene Inc.)를 포함하는 세포 배양배지 (10% FBS와 penicillin/streptomycin이 포함된 RPMI 1640)로 배양하였다. 2일 후, 배양된 세포의 상층액을 제거한 후 mGM-CSF가 포함된 새로운 배양배지 2 ml로 교체하였다. 배양 4일째, mGM-CSF가 포함된 새로운 배양배지 1 ml을 첨가하였다. 배양 6일째, 비접착성 세포들을 수거하여 미성숙 수지상세포 (immature DCs, imDC)로 사용하였다. 성숙 수지상 세포(mature DC, mDC)는 미성숙 수지상 세포(immature DC)를 LPS (100~200ng/ml) 존재 하에 24 시간동안 배양하여 준비하였다

2.7 유세포분석기를 이용한 세포투과성 측정

BMDC는 마우스 뼈에서 단핵구를 분리 후 배양하여 수지상 세포를 수득하였다. 분화된 수지상세포를 이용하여 각 그룹별로 펩타이드 농도에 따라 처리 후 1시간 배양하였으며, 이후 PBS를 이용 각각의 그룹을 세척하였다. 수지상세포의 표현형을 분석하기 위해 항-마우스 CD80, anti-mouse CD86, 항-마우스 CD11c를 각각 염색한 후 FACS CantoⅡ를 이용하여 측정하였으며, CD11c+중 펩타이드 투과성을 확인하기위해 펩타이드-FITC로 분석을 진행하였다.

2.8 TCA침전법을 이용한 배양액내 단백질 잔존량 분석

배양액 시료에 100% TCA용액을 1/10볼륨으로 첨가한 후 강하게 볼텍싱(vortexing) 후 얼음속에서 30분간 방치 후 4℃, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이후 상등액을 버리고 침전물에 콜드 아세톤 (cold acetone) 500ul 첨가하여 4℃, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 TCA를 제거하였다. 이후 침전물을 말린 후 완충용액을 사용하여 재현탁 후 웨스턴 블롯 진행하였다. 도 7에서와 같이, 배지상에 존재하는 단백질 잔존량을 확인 한결과 펩타이드가 결합된 CTP-SEB2-OVA 단백질의 경우 대부분 세포내로 침투하여 배지에 존재하는 단백질 양이 많지 않은 반면, CTP-OVA 기존 서열 단백질의 경우 투과량이 조금 낮은 것을 확인 할 수 있었다. 그러나, CTP가 결합되지 않은 단백질들의 경우 모두 배지상에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

2.9 PTD계열 펩타이드 세포막 투과성 비교 실험

기존에 알려진 PTD계열의 투과성 펩타이드 서열에 현재 자사가 개발하고자 하는 펩타이드 서열을 접목하였을 때의 투과성 비교를 통해 자사가 개발하는 서열이 좀더 투과성이 우월하다는 것을 확인하고자 하였다. BMDC 세포를 12-웰 플레이트에 2x10⁵/ml의 갯수로 시딩 (seeding)한 후, 1일간 37℃에서 배양하였다. 세포 표면에 부착된 1uM의 농도로 CTP-FITC, TAT-SEB2-FITC 및 CTP-SEB2-FITC 펩타이드 (애니젠㈜)를 4시간동안 세포에 처리하고 세포의 형광표지 정도를 FACS로 조사하였다. 우선 마우스 BMDC에서의 DC 표현형들을 분석한 결과 모두 90% 이상의 수율로써 BMDC가 잘 제조가 된 것을 확인할 수 있으며, 해당 DC에 펩타이드를 처리한 결과 기존에 알려진 PTD 계열 펩타이드에 SEB2 서열을 접목하여 투과된 양보다 자사가 보유하고 있는 CTP서열에 SEB2를 접목하였을 때 그 효과가 더 크다는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 융합단백질 결과에서도 동일하게 확인되었다 (도 8).

2.10 항원 특이적 T cell 증식 분석

OVA (ovalbumin) 항원에 특이적인 TCR(OT-I) 트랜스제닉 마우스 (transgenic mice)로써 해당 마우스 비장을 이용하여 DC와 공배양을 통한 T 세포 증식 반응 분석하였다. 배양 세포의 기능 확인을 위한 MLR 측정은 96-웰 플랫 밑바닥에 마이크로타이터 장착된 플레이트 (96-well flat-bottomed microtiter plate)에 비장세포(R, OT-1 specific T cell,: 1X10⁵ cells/well)와 OVA 항원으로 처리된 DCs (S, stimulator)의 비율(R：S ratio)을 1：10∼1：100로 하여 96시간 함께 배양한 후 반응기 (responder) 세포의 증식 정도를 측정하였다. 도 9에서와 같이, 펩타이드가 융합된 항원로 감작된 DC가 들어간 그룹에서 OVA 특이적 T 세포 반응이 가장 높았으며 CTP 항원 감작 DC의 경우는 특이적 T 세포 반응이 증가하기는 하였지만 펩타이드 융합 항원보다는 반응성이 낮은 것을 확인하였다.

실시예 3. 수지상세포 백신에 의한 마우스 흑색종 예방효과

수지상세포 백신에 의한 마우스 흑색종 예방효과(Prevention model) 수지상세포 백신에 의한 흑색종 예방 가능성을 조사하기 위하여, CTP-융합 흑색종 재조합 항원을 감작시킨 수지상세 포를 마우스에 2차례 면역시키고 그 후에 흑색종 특이 항원을 발현하는 암세포주로 도전시험을 실시하여 고형암 형성 여부를 조사하였다. 마우스 수지상세포는 대퇴골과 경골의 골수세포를 수지상세포로 분화시켜 사용하였다. 대퇴골과 경골의 양끝을 절단하고 골수세포를 추출하여 50 ㎖ 튜브에 세포를 수거하였다. 수거된 골수세포를 0.83% 염화암모늄 용액으로 현탁시켜 적혈구를 제거하고 골수세포를 수지상세포 생산배지(RPMI-1640,10% FBS, 10 ng/㎖의 마우스 재조합 IL-4와 10 ng/㎖의 마우스 GM-CSF)에서 2일간 배양하며 비흡착성 세포를 제거하고 용기 바닥에 부착된 세포만을 취하였다. 2-3일 간격으로 신 선한 배지로 교체하여 사이토카인의 고갈을 방지하였다. 배양 6일째 미성숙 수지상세포를 수거하고 여기에 재조합 항원인 CTP-OVA와 SCTP-OVA를 각각 처리하였다. 각 항원 단백질을 10 ㎍/㎖ 한국등록특허 제10-0647847호)씩 20시간 처리하여 미성숙 수지상세포를 감작하였으며 24시간부터 수지상세포 성숙화에 필요한 사이토카인(100 ㎍/㎖ IFN-γ와 100 ㎍/㎖ TNF-α)을 첨가하여 수지상세포의 성숙화를 유도하였다. 항원으로 감작된 수지상세포 1x 10⁶ 세포를 마우스 피하로 주사하여 항암면역을 유도하였다. 수지상세포 면역은 1주 간격으로 2회 접종하였으며, 2차 수지상세포 접종 1주 후에 B16-OVA melanoma cell를 각 1x 10⁶세포/마우스로 SC (subcutaneous) 주사하였다. 암의 크기(가로 x 세로)는 매 2일마다 측정하였다. 측정결과, CTP-OVA 또는 SCTP-OVA 항원으로 감작된 수지상세포를 접종시킨 실험군에서는 도 10에서와 같이 항종양 효과를 확인할 수 있었다.

실시예 4. PBMC를 이용 면역세포 투과성 분석

PBMC상에 존재하는 여러 면역세포(monocyte, T cell, B cell, Dendritic cell, NK cell등)들에서 개발하고자 하는 융합펩타이드의 투과성을 관찰하고자 하였다. 그러기 위해 동결된 PBMC를 해동 후 기존 CTP 펩타이드와 융합된 펩타이드 CTP-SEB펩타이드를 각각 1uM 농도로 처리 후 FACS로 분석을 진행하였다. 각각의 면역세포들의 경우 면역세포들의 대표적인 마커인 CD14(monocyte), CD3(T cell), CD19(B cell), HLA-DR(Dendritic cell)등으로 확인 후 투과된 펩타이드 양을 분석하였다. 면역세포별 펩타이드 투과성을 확인한 결과, 도 11에서와 같이 HLA-DR을 발현한다고 알려진 단핵구세포 (monocyte), B 세포 (B cell), 수지상세포 (dendritic cell)에서 기존 CTP 펩타이드 대비 융합 펩타이드가 투과성이 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 추가적으로 T세포 (T cell)에서도 투과량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 전반적으로 융합 펩타이드가 면역세포에서 투과량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> JW CreaGene Inc. <120> Polypeptide for Delivering Antigen to Immune Cells <130> P21-B290 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB1 <400> 1 Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe Asp Leu Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB2 <400> 2 Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB3 <400> 3 Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His 1 5 10 15 Gln Thr Asp Lys Arg Lys Thr Cys Met 20 25 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEB4 <400> 4 Tyr Asn Lys Lys Lys Ala Thr Val Gln Glu Leu Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP512 <400> 5 Tyr Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP509 <400> 6 Tyr Lys Arg Lys Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP513 <400> 7 Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10

Claims

세포막 투과 펩타이드 (cytoplasmic transduction peptide, CTP) 및 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드를 포함하는, 면역세포에 항원을 전달하기 위한 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 면역세포의 표면 분자는 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 II (MHC class II)인 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 면역세포는 수지상세포, 단핵구세포 (monocyte), 랑게르한스(Wrangel Hans) 세포, 마크로파지(macrophage), T세포 또는 B세포인 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 세포막 투과 펩타이드는 서열번호 5 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 세포막 투과 펩타이드의 말단에 면역세포의 표면 분자에 결합하는 펩타이드가 융합된, 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 항원은 암 또는 종양에 대한 면역반응 활성화를 위한 암 또는 종양 항원인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드에 항원이 결합되어 있는 융합 폴리펩타이드.
제9항에 있어서, 상기 항원은 암 또는 종양에 대한 면역반응 활성화를 위한 암 또는 종양 항원인 융합 폴리펩타이드.
제9항의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.
제9항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 면역세포.
제12항에 있어서, 수지상세포, 단핵구세포 (monocyte), 랑게르한스(Wrangel Hans) 세포, 마크로파지(macrophage), T세포 또는 B세포인 면역세포.
제12항의 면역세포를 포함하는 면역치료제.
제12항의 면역세포를 포함하는 항-종양 또는 항암 백신.
제12항의 면역세포를 포함하는 종양 또는 암 치료용 조성물.
제11항의 핵산을 포함하는 면역세포.
제17항에 있어서, 수지상세포, 단핵구세포 (monocyte), 랑게르한스(Wrangel Hans) 세포, 마크로파지(macrophage), T세포 또는 B세포인 면역세포.
제17항의 면역세포를 포함하는 면역치료제.
제17항의 면역세포를 포함하는 항-종양 또는 항암 백신.
제17항의 면역세포를 포함하는 종양 또는 암 치료용 조성물.