KR100490308B1 - 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법 - Google Patents

면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 치료용 수지상 세포 백신의 제조에 이용되는 융합 항원 및 이를 이용한 수지상 세포 백신의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 항원능 (antigenicity)을 갖는 단백질 또는 펩타이드; 및 (b) 상기 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 결합되어 있고 세포막 투과 펩타이드를 포함하는 면역 치료용 수지상 세포 백신의 제조에 이용되는 융합 항원 및 이를 이용한 수지상 세포 백신의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 수지상 세포 백신의 제조방법은 항원을 수지상 세포의 표면에 향상된 효율로 제시하게 하며, 이렇게 하여 제조된 수지상 세포 백신은 면역 치료에 보다 효과적인 면역 유도능을 가지고 있어 면역 치료 백신으로서의 유용 가치가 매우 크다.

Description

면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법{Method of Preparing Mature Dendritic Cell-Vaccine for Immunotherapy}
본 발명은 수지상 세포 백신의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 수지상 세포 백신의 제조에 이용되는 융합 항원 및 이를 이용한 수지상 세포 백신의 제조방법에 관한 것이다.
수지상 세포 (dendritic cell)는 가장 강력한 항원 전달 세포 (Antigen presenting cells)로서, 생체 내 극히 적은 수로 존재하지만 T 세포 면역을 조절하는 기능이 매우 뛰어나기 때문에 암 또는 병원균의 특이 항원에 대한 면역을 유도하기 위한 임상 연구에서 세포 백신으로서 그 응용 가치가 매우 크다.
현재 이러한 기능성 수지상 세포 백신 제작은 말초 혈액 유래 단핵구 (monocytes) 또는 조혈 모세포로부터 고가의 사이토카인을 사용하는 체외 세포 배양 (ex vivo culture)를 통해 통상적으로 이루어지고 있다. 최근에는 사이토카인 대신에 칼슘 이오노포어 (Calcium Ionophore) 또는 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)와 같은 포볼 에스테르 (Phorbol ester) 등의 세포 신호 물질를 이용하여 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있음이 발표되어 앞으로 수지상 세포 백신 제작에 응용될 전망이다.
이러한 수지상 세포 분화 유도 방법의 다양성에 상관 없이 수지상 세포 백신 제작 과정은 크게 두 단계로 나누어진다. 제 1 단계 배양은 여러 혈액 유래의 세포로부터 미성숙 수지상 세포로 분화를 유도하는 배양으로서 분화 유도 물질 (사이토카인 또는 다른 세포-분화 촉진제)을 처리하여 배양 최종일에 미성숙 수지상 세포로서 수확하는 것이다. 제 2 단계 배양은 이러한 미성숙 수지상 세포에 암 또는 병원균- 특이 항원 처리를 하는 배양으로서 항원과 함께 수지상 세포 성숙화 인자를 배양액에 첨가함으로써 항원 특이 면역 유도성을 취득한 백신으로서 성숙된 수지상 세포를 수확하는 것이다.
상기 수지상 세포 성숙화 인자는 일반적으로 임상 연구자의 선택에 따라 다르지만 대체로 특정 조성의 사이토카인 칵테일 (cytokine cocktail) 또는 비특정 조성의 활성 단핵구 배양액 (MCM: monocyte-conditioned medium; Armin Bender et al., Journal of Immunological Methods 196:121-135(1996)) 등이 많이 사용되고 있다.
항원의 형태는 펩타이드, 정제된 단백질, 특정 세포 분쇄물 또는 세포 사멸물질 등이 있다. 항원의 수지상 세포내 유입은 일반적으로 세포 흡수 작용 (pinocytosis), 식세포 작용 (phagocytosis) 및 수용체-매개 세포내 취입 작용 (endocytosis) 기작에 의존한다.
한편, 미국의 Dendreon 사는 전립선암 치료를 위해 전립선암 환자의 혈액에 소량 존재하는 수지상 세포를 원심분리하여 농축한 혼합 세포에, PAP (Prostate Acid Phosphatase) 항원을 GM-CSF 사이토카인에 연결된 형태 (PAP-GM-CSF 융합 단백질)로 발현하여 정제한 단백질을 처리한 것을 ProvengeTM 으로 명명하고, 이를 면역 치료 제품화 하여 전립선암 환자를 대상으로 임상시험 중에 있다. 이 백신의 제작에 있어서는 항원 전달 능력을 높이기 위해 GM-CSF 사이토카인 연결 단백질 형태로 PAP 항원을 발현/정제한 것을 사용하고 있으며, GM-CSF 사이토카인 연결 단백질이 아닌 일반 항원 형태인 PAP을 사용하였을 경우보다 효과적으로 세포성 면역 (cellular immunity)을 유도할 수 있음을 보고하고 있다(Eric J. Small et al., J. Clin. Oncol. 18:3894-3903(2000)). 그러나, 상기 방법은 사이토카인 비용이 들지 않는다는 측면에서 백신 제작 과정이 경제적인 측면이 있으나, 백신 주입 시마다 환자의 백혈구를 백혈구 분반 시술 (leukapheresis)을 통해 분리해야 한다는 점, 그리고 환자 혈액 내 존재하는 소수의 수지상 세포 활성에 의존하여야 한다는 점에 있어, 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신과 동일한 백신의 효율성을 갖게 될 지는 의문이다. 더욱이 전이성 암 환자의 혈액 내에 존재하는 수지상 세포는 정상인에 비해 그 수가 감소되어 있을 뿐 아니라 정상인 보다 많이 존재하는 혈액 내 면역 저하 물질 (예: IL-10, TGF-beta, VEGF 등)에 의해 이미 그 기능이 변질되어 있을 가능성이 높아 새로 유도하지 않고 그대로 활용한다는 것은 그 자체가 백신 역가 측면에서 갖는 모험성이 크다 (Almand B. et al., Clin. Cancer. Res. 6:1755-1766(2000); Lissoni P. et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 15:140-144(2001); 및 Ohm J.E. and Carbone D.P., Immunol. Res. 23:263-272(2001)). 또한 이러한 ProvengeM 이라 칭하는 면역 치료 제품으로 면역유도 시에 자가 항원인 GM-CSF 에 대한 T 세포 면역이 항진되는 것으로 나타나 문제점으로 제시되고 있다. 따라서, 전립선 암의 면역 치료를 위해 PAP 항원에 대한 면역을 보다 효과적으로 유도할 수 있는 방법에 대한 요구가 당업계에 있다. 또한, 전립선 암 이외에 수지상 세포-관련 면역 반응과 연관된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 수지상 세포 백신의 제조에 있어서도, 효과적으로 항원을 수지상 세포 내로 전달할 수 있는 방법에 대한 요구가 해결되지 않은 상황이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 요지가 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 면역 치료에 이용될 수 있는 수지상 세포 백신의 역가 (vaccine potency)를 향상시키기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 항원에 세포 투과 능력이 있는 펩타이드를 결합시킨 형태의 융합 항원을 이용하는 경우에 수지상 세포 백신의 역가가 크게 개선됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역 치료용 수지상 세포 백신의 제조에 유용한 융합 항원을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 항원능 (antigenicity)을 갖는 단백질 또는 펩타이드; 및 (b) 상기 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 결합되어 있고 서열번호 1의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 세포막 투과 펩타이드를 포함하는 면역 치료용 수지상 세포 백신의 제조에 이용되는 융합 항원을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 미성숙 수지상 세포를 세포막 투과 펩타이드가 융합된 상기의 융합 항원과 함께 배양하여 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 융합 항원에 포함되는 항원능을 갖는 단백질 또는 펩타이드는 생체 내에서 면역 반응 (체액성 면역 및 세포성 면역)을 유도할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용이 가능하다. 일반적으로, 항원능을 갖는 단백질 또는 펩타이드는 항원 결정 부위 (antigenic determinant region)을 갖는다. 이러한 단백질 또는 펩타이드는 전립선 산 포스파타아제 (prostate acid phosphatase), HER-2/neu (Herstatin), CEA (Carcinoembryonic antigen), MUC-1, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, gp100, 티로시나아제, 인간 파밀로마 바이러스 (Human papilloma virus)의 E7, p53 단백질, Ras 등의 암 관련 단백질, 이러한 단백질의 일부분 또는 이러한 단백질-유래 펩타이드 (Bocchia M. et al., Hematologia. 85:1172-1206(2000); 및 Hart D.N.J, Blood. 90:3245-3287(1997)) 등을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 본 발명의 융합 항원에 포함되는 전립선 산 포스파타아제 (이하, "PAP"라 한다)는 전립선 암 관련 항원 중 전립선 외 다른 조직에서는 발현이 안 되는 것으로 알려져 있어서 (J.T. Isaacs et al., Prog. Clin. Biol. Res., 243A:21(1987)) 전립선 암 특이 항원으로 유용하고 (Lawrence Fong et al., J. Immunol., 159: 3113-3117(1997)), 근래에는 전립선 암의 면역 치료용 수지상 세포의 성숙화 과정에 이용되고 있다 (Eric J. Small et al., J.Clin.Oncol.18:3894-3903 (2000), Patrick A.Burch et al., Clin. Cancer Res.6:2175-2182 (2000)). 본 발명의 융합 항원에 포함되는 PAP는 전장 (full length), 즉 단백질 항원 형태일 수도 있으나, 항원능 (antigenicity)을 갖는 펩타이드 형태도 가능하다.
본 발명의 융합 항원에 이용되는 세포막 투과 펩타이드 (membrane transduction peptide: 이하, "MTP"라 한다)는 PAP의 수지상 세포 내로의 유입을 보다 효과적으로 하기 위하여 추가적으로 부가된 것이다. 상기 세포막 투과 펩타이드에 의하여, 본 발명의 융합 항원은 수지상 세포에 세포막 투과 (membrane transduction) 기작을 통하여 세포 내로 유입된다. 즉, 항원의 수지상 세포 내 유입에 대한 통상적인 기작인 세포 흡수 작용 (pinocytosis), 식세포 작용 (phagocytosis) 및 수용체-매개 세포내 취입 작용 (endocytosis)이 아닌 세포막 투과 기작을 통해 유입된다. 따라서, 항원의 수지상 세포 내로의 유입이 다른 기전과 비교하여 보다 효율적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 항원에 상술한 특성을 부여하는 세포막 투과 펩타이드는 첨부한 서열 목록의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는다. 즉, 상기 세포막 투과 펩타이드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 동일하거나 세포막 투과성을 상실하지 않는 범위 내의 유사체 (derivatives)를 포함한다. 예를 들어, 상기 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 추가적으로 몇 개의 아미노산이 결합된 형태의 유사체, 아미노산이 치환된 유사체, 아미노산이 결실된 유사체 등이 있을 수 있으며, 이러한 유사체들이 세포막 투과성을 상실하지 않는다면, 본 발명의 융합 항원에 포함되는 세포막 투과 펩타이드에 속한다고 할 수 있다.
본 발명의 융합 항원은 미성숙 수지상 세포의 성숙화 과정에 첨가되어, 세포막 투과 펩타이드에 의해 항원이 세포 내로의 유입이 보다 효과적으로 이루어지게 하며, 이는 수지상 세포 백신의 항원 표지 능력을 증가시키게 하며, 결국 역가가 향상된 수지상 세포 백신을 제조하게 한다.
본 발명의 바람직한 수지상 세포 백신의 제조방법에 따르면, 상기 미성숙 수지상 세포는 단핵구 또는 조혈 모세포로부터 유래된 것이고, 보다 바람직하게는 단핵구로부터 유래된 것이다. 단핵구로부터 수지상 세포를 유도하는 방법이 보다 바람직한 이유는 다기능성 조혈 모세포 (pluripotent hematopoietic stem/progenitor cells)를 사용하는 방법 보다 비교적 짧은 시간에 균일한 성질의 수지상 세포를 얻을 수 있기 때문이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단핵구는 말초 혈액으로부터 수득한 것이다. 말초 혈액 내의 선조 세포 (progenitor cell, 예: 단핵구 또는 조혈 모세포)로부터 미성숙 수지상 세포를 얻는 방법은 말초 혈액 내 기타 다른 세포들로부터 상기 선조 세포를 분리하여 수지상 세포로 분화 유도시키는 과정으로 실시될 수 있고, 또한 말초 혈액 내 다른 세포들로부터 분리되지 않은 형태로서 상기 선조 세포를 수지상 세포로 분화 유도 시키는 과정으로 실시될 수도 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따라 본 발명의 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다:
우선, 혈액으로부터 백혈구를 농축하고 (예: 백혈구 분반 시술 (Leukapheresis)을 이용), 이어 백혈구 농축액으로부터 플라즈마 (plasma) 층을 제거하여 단일핵 세포층을 얻는다. 그런 다음, 원심분리를 통하여 말초 혈액 단일핵 세포를 얻는다. 본 명세서에서 용어 "혈액 단일핵 세포 (mononuclear cell)"는 혈액에서 발견되며 1개의 핵을 갖는 모든 세포를 의미하는 것으로서, 예를 들어, 단핵구 (monocyte), T 세포, B 세포, NK 세포 및 순환중의 수지상 세포 등을 포함하는 것이다. 수득한 단일핵 세포를 적합한 배지 (예: RPMI 1640 또는 AIM-V)가 포함되어 있는 배양기에서 적당 시간 배양하고, 단핵구를 선택적으로 얻는다.
그런 다음, 단핵구를 수지상 세포로 분화 유도한다. 수지상 세포로 분화시키기 위하여 적합한 사이토카인이 포함되어 있는 배양기에서 단핵구를 배양한다. 이용되는 사이토카인은 GM-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor) 와 IL-4 (interleukin-4) 또는 GM-CSF 와 IL-13 또는 GM-CSF와 IL-7이다. 경우에 따라서는 TGF-β1 (Transforming growth factor-beta 1) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)와 같은 사이토카인을 추가할 수도 있다. 가장 보편적으로 이용되는 사이토카인은 GM-CSF 와 IL-4 의 혼합물이다. 첨가되는 사이토카인의 적합한 양은 수지상 세포로의 분화를 하는 데 충분한 양으로서 각 연구자의 실험실에서 경험적으로 선택하여 선호되고 있는 양이며, 이는 일반적으로 각기 100 U/㎖-1000 U/㎖ 농도로 다양하게 적용되고 있다.
단핵구로부터 수지상 세포의 분화를 목적으로하는 제 1 차 배양은 상기의 사이토카인 대신에 칼슘 이오노포어 또는 PMA와 같은 포볼 에스테르 (Phorbol ester) 등의 세포 신호 물질을 이용하여 진행될 수도 있으며, 기타 개발되는 다양한 수지상 세포 분화 유도 물질을 사용하여 진행되어 질 수 있다.
한편, 제 1 차 배양 기간은 사이토카인을 사용하여 진행할 경우 통상적으로 5일 이상이고, 바람직하게는 6-7일간이다. 제 1 배양 기간에서는 새로운 (fresh) 배양액을 약 2-3일 마다 공급하는 것이 일반적이다. 만일, 사이토카인 대신에 칼슘 이오노포어 또는 PMA와 같은 포볼 에스테르 등의 세포 신호 물질을 이용하여 진행하는 경우는 5 일 이내에도 가능하다.
상술한 분화 과정에서 수득한 미성숙 수지상 세포를 이용하여 최종적으로 성숙화 과정을 실시한다. 즉, 적합한 사이토카인을 포함하는 배지가 있는 배양기에서 배양하여 수지상 세포를 성숙화시킨다. 제 2 차 배양에서 이용되는 성숙화 인자는 특정 조성의 사이토카인 칵테일 또는 비특정 조성의 활성 단핵구 배양액 (MCM: monocyte-conditioned medium; Armin Bender et al., Journal of Immunological Methods 196:121-135(1996)) 등이다. 특정 조성의 사이토카인 칵테일에 함유되는 사이토카인은 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2 (Prostaglandin E2), IFN-γ 등의 다양한 혼합 형태이거나 한 종류일 수 있다. 이러한 사이토카인 또는 사이토카인 칵테일은 상기의 제 1 배양에서 사용하는 분화 인자에 추가되는 형태로 주어질 수도 있다. 경우에 따라서는 성숙화 인자로서의 사이토카인 칵테일 또는 비특정 조성의 활성 단핵구 배양액 뿐만 아니라, T 세포 인자인 CD40L 또는 TRANCE (TNF-related activation-induced cytokine) 등의 성숙화 인자 및 안정화 인자를 제 2 차 배양에 단독으로 사용하거나 추가할 수도 있다. 또한 CpG, SAC (inactivated Staphylococcus aureus), SEB (Staphylococcal enterotoxin B) 또는 LPS (lipopolysaccharide)와 같은 세균 유래 물질로 자극을 강화 할 수도 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제 2 차 배양에서 이용되는 사이토카인은 활성 단핵구 배양액 또는 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2 의 혼합액이다. 일반적으로, 활성 단핵구 배양액의 혼합 비율은 25% -100% 등으로 연구자의 실험실에 따라 다를 수 있다. 제 2 차 배양의 기간은 통상적으로 1일 이상이며, 보다 바람직하게는 1-3일이다.
한편, 본 발명자들에 의해 개발된 MTP-항원은 미성숙 수지상 세포의 어떠한 발달 (development) 단계에 첨가되어 수지상 세포 백신을 제조하게 한다. 수지상 세포 백신의 제조에 있어서, 항원이 첨가되는 시기는 통상적으로 성숙화 과정이지만, 다른 여러 발달 단계에서 첨가되어 수지상 세포 백신을 제조하기도 한다 (Andreas Hinkel et al., J. Immunol.23:83-93(2000)). 본 발명에 있어서, 상기 MTP-항원이 미성숙 수지상 세포의 배양액에 첨가되는 시기는 다양할 수 있으나, 가장 바람직하게는 성숙화 과정에서 첨가된다. MTP-항원은 수지상 세포 내로 세포막 투과 기작을 통해 유입되고 세포 내에서 프로세싱을 거쳐 수지상 세포의 표면에 제시된다. 항원이 표면에 제시된 수지상 세포는 휴지 상태의 CD4+ T 세포를 Th1 세포로 분화시키고, 또한 휴지 상태의 CD8+ T 세포를 활성화된 세포 독성 세포 (CTL)로 분화시킴으로써, 세포 면역 반응 (cellular immunity)을 유도할 수 있다.
본 발명의 수지상 세포 백신의 제조방법은 질병 또는 질환-특이 항원을 수지상 세포의 표면에 향상된 효율로 제시하게 하며, 이렇게 하여 제조된 수지상 세포 백신은 각종 질병 또는 질환의 면역 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 일반 항원 형태로 발현/정제한 항원을 사용하는 방법 보다 항원-특이 면역 유도성이 높은 수지상 세포 백신을 얻을 수 있도록 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 전립선암 관련 항원 전달 시험을 위한 항원 단백질의 정제
우선, 마우스 PAP (Prostate Acid Phosphatase)의 cDNA (ICR 마우스 전립선 조직으로부터 클로닝 함, GenBank accession number AAF23171.1의 아미노산 서열과 98% 상동성을 보유한 단백질을 인코딩, 서열 번호 2 참조)를 pTAT-HA 벡터 (워싱톤 의과 대학의 Dowdy, S. F. 박사로부터 제공받음, A. Vocero-Akbani et al., Methods Enzymol. 332:36-49(2001))에 클로닝 하였다. 서열 번호 2에서 ORF (open reading frame)는 서열 32-381이다. 재조합된 pTAT-HA 벡터는 MTP (Membrane Transduction Peptide)로서 HIV (human immuondeficiency virus) TAT 단백질의 아미노산 서열 47-57 (참조: SEQ NO:1)에 해당하는 펩타이드를 갖고 추가적으로 6x His 표지 (tag)가 마우스 PAP 단백질의 N-말단에 융합된 형태로 재조합 된다. pTAT-HA 벡터에는 발현된 단백질의 면역학적 확인을 위해 HA (hemagglutinin)-표지가 MTP 펩타이드 인코딩 서열 및 클로닝을 위한 폴리링커 서열 사이에 위치하고 있다. 본 발명에서는 마우스의 전립선으로부터 클로닝된 PAP cDNA 염기 서열 중 N-말단 시그날 펩타이드를 지시하는 서열을 제외시킨 염기 서열을 PCR 증폭하여 pTAT-HA 벡터의 폴리링커 서열 중 KpnI과 XhoI 위치에 삽입시켰다. 이어, MTP-PAP 단백질을 발현하도록 재조합한 pTAT 벡터를 Hanahan 방법을 이용하여 E. coli BL21(DE3) GoldTM (Stratagene 사)에 형질전환시키고, 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 형질전환체를 배양하였다. 상기 벡터에 의해 발현되는 재조합 단백질을 "MTP-PAP"이라 명명 하였다.
한편, 비교 항원으로서 동일한 pTAT-HA 벡터에서 MTP 기능성 부분의 염기 서열이 제거된 형태로 마우스 PAP 단백질을 발현시키고 이를 "PAP" 이라 명명하였다.
형질전환된 E. coli BL21의 분쇄물로부터 불용성 분획 형태로 MTP-PAP 또는 PAP 재조합 단백질을 분리하고 내독소를 제거하기 위해 1% Triton X-100 용액으로 3 번 충분히 세척한 다음, 8 M 우레아/100 mM NaCl/10 mM Tris-Cl(pH 8.0) 완충용액으로 용출하였다. 용출된 90% 이상 순도의 MTP-PAP 또는 PAP 단백질을 다시 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피 (Qiagen 사)로 더 정제하였다. 그런 다음, 50 mM NaCl/50 mM Tris-Cl(pH 8.0) 완충용액을 이용하여 서서히 최적화된 투석 과정을 실시하여 단백질을 재구성하고, 센트리콘 (Centricon, Amicon 사)을 통해 단백질을 농축하고, 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과한 다음, 적당량 분주하여 -70℃에 보관하였다. 내독소 분석 시험을 통해 내독소-부재 상태 (< 0.2 IEU per mg 단백질)를 확인하였고 SDS-PAGE 상에서 단백질의 순도를 확인하였다. 저장 상태에 따른 단백질의 안정성은 원심분리 (12,000 rpm, 15 분, 4℃)를 통해 수득한 상층액에 대한 전기영동과 단백질 정량 방법을 통해 사용 직전에 확인하였다. 정제된 두 종류의 항원 단백질은 도 1 에서와 같이 거의 유사한 순도로 얻을 수 있었다.
실시예 2: 말초 혈액 단일핵 세포 (PBMC, peripheral blood mononuclear cell)로 부터 단핵구 (monocytes)-유래 수지상 세포의 분화
사람의 말초 혈액으로부터 백혈구 분반 시술 (Leukapheresis)을 통해서 백혈구 농축액을 얻었다. 이어, 피콜-페이크 용액 (Pharmacia Biotech, New Jersey, USA)을 이용한 원심분리를 통해 혈액 단일핵 세포층 (PBMC)을 얻고, 냉동 보관 후 해동하여 사용하거나 바로 단핵구 (monocytes) 유래 수지상 세포의 분화에 사용하였다. 그 과정은 다음과 같다. PBMC를 RPMI 1640 배지에 현탁하여 6-웰 플레이트의 각 웰당 1 x 107 말초 혈액 단일핵 세포를 넣고 배지를 2 ㎖로 채워주었다. 이어, 1시간 동안 배양기에서 배양을 한 후 부유 세포들을 제거하고 RPMI 1640 배지를 사용하여 세척을 세 번 수행하였다. 그런 다음, 사이토카인 배지 (10% 사람 혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지 + 500 u/㎖ IL-4 + 500 u/㎖ GM-CSF) 2 ㎖을 각 웰에 첨가하고, 7일 동안 배양을 하였다. 배양 3, 5일째에 각 웰에서 배지 750 ㎕를 모아 원심분리한 후 새로운 사이토카인 배지로 현탁한 세포를 본래의 웰에 첨가하는 방식으로 배지를 교환하였다.
실시예 3: 본 발명의 방법과 기존 방법에 의한 수지상 세포 백신의 항원 처리 효율 비교
사이토카인 배지 (10% 사람 혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지 + 500 u/㎖ IL-4 + 500 u/㎖ GM-CSF)를 이용한 제 1 단계 배양 7 일째에 부유 세포를 원심분리를 통하여 수확한 후, 50% 활성 단핵구 배양액 배지 (MCM: monocyte conditioned medium; Armin Bender et al., Journal of Immunological Methods 196:121-135(1996)) 2 ㎖에 상기 실시예 1에서 준비한 항원 (MTP-PAP or PAP)을 첨가하고 이틀 동안 배양하여 최종일에 부유 세포를 성숙한 수지상 세포로 얻었다. 제 2 단계 배양에서 항원 처리만을 달리한 두 전립선암 항원 백신용 세포를 수거하여 트립판-블루 염색 방법을 사용하여 현미경 (ECLIPSE E200, Nikon) 하에서 관찰하였다. 전형적인 수지상 세포의 형태를 가진 것만을 세수하여 그 기능을 비교하였다.
실시예 3-1: 세포표면 형질 (Cell Surface Phenotype) 비교
MTP-PAP 항원 또는 PAP 항원 단백질 존재 하에서 성숙 배양을 한 수지상 세포의 세포 표면 형질을 비교하기 위해 FACS (Fluorescence-activated cell sorter) 분석을 수행하였다. 항원처리 이틀 후에 성숙한 수지상 세포를 수거하여 FITC (fluorescein isothiocyanate) 및 PE (R-phycoerythrin)로 접합된 항체 (PE-접합-CD14 Ab, FITC-접합-HLA-DR Ab, FITC-접합-Class I (HLA-A,B,C) Ab, FITC-접합-CD40 Ab, PE-접합-CD80 Ab, FITC-접합-CD86 Ab, 및 PE-접합-CD83 Ab; Pharmingen)를 수지상 세포에 처리하고 20분 동안 4℃에서 반응을 시켰다. 이어, FACS 완충액 (5% BSA, 1% 소듐 아지드 in PBS)으로 세척을 하고, FACSCalibur (Becton Dickison, USA)를 사용하여 세포 표면 형질을 분석하였다. 그 결과는 도 2 및 도 3에 나타나 있다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 세포막 투과 펩타이드 (MTP)가 결합된 PAP 단백질 항원을 농도별 (0, 25 또는 50 ㎍/㎖)로 수지상 세포에 처리하고 이틀 후에 수거하여 FACSCalibur로 분석을 한 경우, 수지상 세포는 항원 처리 시 포함된 MTP-PAP 항원 단백질의 농도와 관계없이 유사한 세포 표면 형질을 나타내었다.
또한, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 동일한 농도의 PAP 및 MTP-PAP 항원 단백질을 각각 수지상 세포에 처리한 이틀 후에 FACSCalibur로 분석을 한 경우, 수지상 세포는 항원의 종류에 관계 없이 유사한 세포 표면 형질을 나타내었다.
결과적으로 세포 표면 형질 분석을 통해 얻어진 수지상 세포의 성숙도는 항원의 양과 항원의 종류에 상관없이 크게 다르지 아니하며, CD83+/CD14-/DRbright 임을 알 수 있다.
실시예 3-2: 항원 전달 능력 (Potency of Antigen Presenting C Activity) 비교
자가 T 세포 (autologous T cells)를 분리하기 위하여, 우선 나일론 울 파이버(Cat# 18369, Polysciences, Warrington, PA)를 10% 우태아 혈청 (FBS)이 포함된 RPMI 1640 배지 (GibcoBRL)에 적시어 5 ㎖ 주사기에 패킹 하였다. 이어, 동결 상태로 보관된 말초 혈액 단핵구 세포를 해동하고, 1,500 rpm에서 원심분리를 수행한 후, 1 ㎖의 10% 우태아 혈정이 포함된 RPMI 1640 배지에 현탁한 다음, 나일론 울 파이버가 패킹된 상기 주사기에 적재 하였다. 그런 다음, 1시간 동안 CO2 배양기에서 말초 혈액 단핵구 세포가 적재된 상기 주사기를 보관한 후, 10% 우태아 혈정이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 T 세포만을 획득하였다. 이렇게 얻은 T 세포를 자기 혈청이 들어 있는 RPMI1640 배지로 재현탁을 하고 100 ㎕에 105 T 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하였다.
상술한 바와 같이 항원 처리를 달리하여 제작된 수지상 세포 백신을 104 , 2 x 103 또는 103 세포수로 양을 달리하여 105 T 세포가 들어있는 웰 플레이트에 첨가함으로써 DC 대 T 세포 비율이 1:10, 1:50 또는 1:100이 되도록 하였다. 그리고 자기 혈청이 들어 있는 RPMI1640 배지를 사용하여 동일하게 각 배양의 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 채워 주었다. 이어, 3일 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양을 한 후, 1 μCi [3H]티미딘 (NEN, Boston, MA)을 첨가하여 18시간 동안 배양을 계속하였다. 각 DC 대 T 세포 비율 당 세 개의 배양을 반복 실시하였다. 최종일에 세포 수확기 (SKATRON Inc, Norway)로 세포를 자동 수거한 후 방사선 동위원소 측정기 (Liquid Scintillation Counter, LS6000, Beckman)로 세포가 흡입한 [3H]티미딘의 cpm (counter per minute) 값을 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타나 있다.
도 4에서 볼 수 있듯이, 수지상 세포 백신 제조 시 항원 처리를 하지 않고 성숙화 처리만 한 경우 수지상 세포 백신의 양을 1:10 까지 넣어주어도 자가 T 세포의 증식을 효과적으로 유도하지 못하였으나, 항원 처리한 수지상 세포의 경우 넣어준 수지상 세포 백신의 수에 의존적으로 자가 T 세포의 증식이 효과적으로 유도됨을 알 수 있다. 이와 같은 결과는 T 세포 증식이 항원 의존적 반응임을 입증하는 것이다.
또한, 보다 중요하게는 도 5에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 방법에 따라 MTP 기능성 펩타이드를 포함하고 있는 항원 (MTP-PAP) 처리된 수지상 세포 백신이 MTP 기능성 펩타이드를 포함하고 있지 않은 항원 (PAP) 처리된 수지상 세포 백신 보다 항원전달에 의한 T 세포 증식 유도 능력이 월등히 높음을 알 수 있다.
실시예 3-3: 수지상 세포 백신에 의해 유도된 T 세포 면역 반응의 사이토카인 분석
수지상 세포 백신은 항원처리/성숙화 조건에 따라 유도되는 면역 반응의 크기와 반응 유형이 결정된다. 따라서 MTP-항원 단백질을 처리한 수지상 세포 백신에 의해 유도되는 반응을 알아보기 위해 유도된 T 세포 면역 반응의 사이토카인을 분석하였다.
실시예 3-3a: IL-4 사이토카인 분비 T 세포 유도성
자기 유래 T 세포와 수지상 세포 백신의 비율을 5:1의 비율 (105 T 세포와 2 x 104 수지상 세포 백신)로 96-웰 플레이트에서 배양을 하였다. 4일 동안 배양한 후, 배지 상등액에 분비된 IL-4 사이토카인의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 또한 자기 유래 T 세포와 수지상세포 백신의 반응에서 분화되어 가는 T 세포의 성질을 확인하기 위해, 4일 동안 배양 후, 5 x 104 세포만을 수거하여 96-웰 플레이트에 다시 배양을 시작하였다. T 세포의 분비능력을 활성화시키기 위해 25 ng/㎖ PMA와 1 ug/㎖ 이노마이신 (Ionomycin)을 처리하여 48시간 동안 반응을 수행한 후, 배지 상등액에 분비된 IL-4 사이토카인의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. IL-4 사이토카인의 ELISA 방법을 기술하면 다음과 같다.
우선, IL-4에 대한 농도 2 ㎍/㎖인 코팅 항체 (Cat.#.P-451-E, Endogen, Woburn, MA) 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 각각 분주하고 상온에서 반응을 시켰다. 18-24 시간 후, 코팅 용액을 제거하고 200 ㎕의 분석용 완충액 (PBS with 4% BSA, pH 7.2-7.4)를 첨가하고 블록킹을 1시간 동안 상온에서 수행하였다. 세척용액 (50 mM Tris, 0.2% Tween-20, pH 7.9-8.1)를 사용하여 3번 세척을 하고, 계획했던 순서로 IL- 4 표준물질 (Cat.#.R-IL-4-5, Endogen, Woburn, MA)과 T 세포 배양의 상등액을 50 ㎕씩 이중으로 처리하고 상온에서 반응을 수행하였다. 농도 500 ng/㎖인 바이오틴-표지 검출 항체 (Cat.#.M-450-B, Endogen, Woburn, MA)를 50 ㎕씩 각 웰에 첨가하고 상온에서 반응시켰다. 1시간 후, 세척 용액으로 세 번 세척을 하고 1:4000으로 희석을 시킨 HRP-접합 스트렙트아비딘 (Cat.#.N-100, Endogen, Woburn, MA)을 100 ㎕씩 분주하고 30분 동안 상온에서 반응을 수행하였다. 3번 세척을 하고 TMP 기질 용액 (Cat.#.N-300, Endogen, Woburn, MA)을 100 ㎕씩 30분 동안 처리하고 반응 종결 용액 (0.18M H2SO4)으로 반응을 중지시켰다. 발색 정도를 측정하기 위해서 405 nm 파장의 분광광도계 (spectrophotometer; Model 550, Bio-RAD, USA)를 사용하였다.
도 6a에서 나타난 바와 같이, 수지상 세포 백신과 자가 T 세포의 4 일간 배양에서 IL-4 사이토카인의 분비는 매우 미약하여 ELISA로 감지될 수 없는 정도였다. 그러나, 도 6b 에서와 같이 PMA/이오노마이신 자극을 추가하여 분비된 IL-4 사이토카인 측정을 통해 일반 PAP 항원 단백질을 처리한 수지상 세포 보다 MTP-PAP 항원 단백질을 처리한 수지상 세포가 보다 효과적으로 IL-4 사이토카인을 생성할 수 있는 T 세포를 유도하고 있는 것으로 나타난다.
실시예 3-3b: IFN-γ 사이토카인 분비 T 세포 유도성
자기 유래 T 세포와 수지상 세포 백신의 비율을 5:1의 비율 (105 T 세포와 2 x 104 수지상세포 백신)로 96-웰 플레이트에서 배양을 하였다. 4일 동안 배양한 후, 배지 상등액에 분비된 IFN-γ 사이토카인의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 또한, 자기 유래 T 세포와 수지상 세포 백신의 반응에서 분화 되어가는 T 세포의 성질을 확인하기 위해, 4일 동안 배양한 후, 5 x 104 세포만을 수거하여 96-웰 플레이트에 다시 배양을 시작하였다. T 세포의 분비 능력을 활성화시키기 위해, 25 ng/㎖ PMA와 1 ug/㎖ 이오노마이신을 처리하여 48시간 동안 반응을 수행한 후, 배지 상등액에 분비된 IFN-γ 사이토카인의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. IFN-γ 사이토카인의 ELISA 방법을 기술하면 다음과 같다.
IFN-γ에 대한 농도 1 ug/㎖인 코팅 항체 (Cat.#.M-700A-E, Endogen, Woburn, MA) 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 각각 분주하고 상온에서 반응을 시켰다. 18-24 시간 후, 코팅 용액을 제거하고 200 ㎕의 분석용 완충액 (PBS with 4% BSA, pH 7.2-7.4)을 첨가하고 블록킹을 1시간 동안 상온에서 수행하였다. 세척용액 (50 mM Tris, 0.2% Tween-20, pH 7.9-8.1)을 사용하여 3번 세척을 하고 계획했던 순서로 IFN-γ 표준물질 (Cat.#.S-IFNG, Endogen, Woburn, MA)과 T 세포 배양의 상등액을 50 ㎕씩 이중으로 처리하고 상온에서 반응을 수행하였다. 농도 500 ng/㎖인 바이오틴-표지 검출 항체(Cat.#.M-701-B, Endogen, Woburn, MA)를 50 ㎕씩 각 웰에 첨가하고 상온에서 반응시켰다. 1시간 후, 세척용액으로 세 번 세척을 하고 1:16000으로 희석을 시킨 HRP-접합 스트렙트아비딘 (Cat.#.N-100, Endogen, Woburn, MA)를 100 ㎕씩 분주하고 30분 동안 상온에서 반응을 수행하였다. 3번 세척을 하고 TMP 기질 용액 (Cat.#.N-300, Endogen, Woburn, MA)을 100 ㎕씩 30분간 처리하고 반응 정지 용액 (0.18 M H2SO4)으로 반응을 중지시켰다. 발색정도를 측정하기 위해서 405 nm 파장의 분광광도계 (spectrophotometer; Model 550, Bio-RAD, USA)를 사용하였다.
도 7a와 도 7b 에서 보듯이, 도 6a에서 나타난 IL-4 사이토카인 분비와는 대조적으로 MTP-PAP 항원 단백질을 처리한 수지상 세포 백신은 자가 T 세포와의 반응을 통해 상당량의 IFN-γ생성을 유도하는 것으로 나타났다. 이것은 수지상 세포 백신이 세포성 면역 (cellular immunity)을 유도하는 성질이 매우 뛰어남을 시사하는 것이다. 따라서, MTP-PAP 항원 단백질로 항원 처리 시에 도 5에서 나타난 것 같이 일반 PAP 항원 단백질을 처리했을 경우보다 강력한 T 세포 증식이 일어나고 있었으며 대체로 그러한 세포들이 항암 면역에서 중요한 변수로 작용하는 세포성 면역에 관여하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-4: 수지상 세포 백신에 의해 장기간 유도된 자가 T 세포군 분석
실시예 2에 기재된 방법과 같이 제 1 단계 배양 7 일째에 부유 세포를 원심분리를 통하여 수확한 후, 50% 활성 단핵구 배양액 배지 2 ㎖에 상기 실시예 1에서 준비한 항원 (MTP-PAP 또는 PAP)을 첨가하고 이틀 동안 배양하여 최종일에 부유 세포를 성숙한 수지상 세포로 얻었다. 제 2 단계 배양에서 항원 처리만을 달리한 두 전립선암 항원 백신용 세포를 수거하여 실시예 3-2에 기재된 것과 같이 분리한 자가 T 세포 (autologous T cells)와 1:10의 비율로 혼합하여 항원-특이적인 T 세포군 유도를 실시하였다. 전립선암 백신용 수지상 세포와 자가 T 세포를 혼합한 후 IL-7 사이토카인(Endogen)을 25 ng/㎖의 농도로 처리하고, 이틀 후 IL-2 사이토카인 (Endogen)을 1.5 ng/㎖의 농도가 되도록 첨가하였다. 이와 같은 방법을 통하여 1주일 간격으로 3 차례 전립선암 항원 백신용 세포로 반복 자극하여 항원-특이적인 T 세포군을 유도하였다.
106 개의 T 세포를 3 차례 백신 처리한 결과, 항원 처리되지 않은 자가 수지상 세포 백신에 의해 얻어진 T 세포군은 4 x 106 개, 일반 PAP 항원 처리된 자가 수지상 세포 백신에 의해 얻어진 T 세포군은 7.8 x 106 개, 본 발명의 MTP-PAP 항원 처리된 자가 수지상 세포 백신에 의해 얻어진 T 세포군은 9 x 106 개로서 백신의 항원 전달 능력에 따라 T 세포 증식이 차별적으로 유도되었음을 알 수 있었다.
실시예 3-4a: 각 백신을 통해 유도된 자가 T 세포군 내의 CD8 + T 세포 비율 분석
마지막 3번째 자극 6일 후 증식한 각각의 T 세포군 중 일부를 취하여 실시예 3-1에서 설명한 방법으로 CD8 항원을 인지하는 단일클론 항체 (FITC-접합 항체)를 이용하여 유도된 T 세포군의 표면 형질을 분석하였다.
도 8a 에서 나타난 바와 같이, 항원을 처리 하지 않은 수지상 세포 백신과 일반 항원 형태의 PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신의 경우 장기간 백신에 의해 유도된 T 세포군이 각기 19.8% 와 31.6% 에 해당하는 CD8+ T 세포만을 유지하고 있는 것과 대조적으로 본 발명의 MTP-PAP 항원 처리된 수지상 세포 백신의 경우 장기간 백신에 의해 유도된 T 세포군이 전체 T 세포군의 57.1% 에 해당하는 CD8+ T 세포를 유지하고 있었다. 이것은 MTP-PAP 항원으로 감작된 수지상 세포 백신에 의한 항원 전달 시 CD8+ T 세포에 대한 신호 전달이 훨씬 강력하게 일어나고 있음을 시사하는 것이다. 이것은 암세포에 대한 면역치료 기전에 있어 가장 중요한 작용을 하는 세포가 CD8+ T 세포임을 고려하면 MTP-PAP 항원 처리된 수지상 세포 백신의 유용성을 입증하는 것이라 할 수 있다.
실시예 3-4b: 각 백신을 통해 유도된 자가 T 세포군 내에서 PMA와 이오노마이신 자극 시 IFN-γ을 생성하는 CD8 + 세포 비율 분석
마지막 3번째 자극 5일 후 각각의 T 세포군 중 일부를 취하여 세척하고 2 x 105 세포를 취하여 96-웰 배양 디쉬에 재분배하였다. 분배 후 보편적 T 세포 자극 인자인 PMA와 이오노마이의 농도가 각각 25 ng/㎖과 1 ㎍/㎖이 되도록 처리하였으며, 이때 IFN-γ의 분비에 의한 IFN-γ유실을 방지하기 위해 10 ㎍/㎖의 농도로 Brefeldin A (Sigma 사)를 함께 처리하였다. 4 시간 배양 후 이들 세포를 수확하여 항원 특이적인 IFN-γ 생성 CD8+ T 세포를 확인하고자 다음과 같은 방법에 의해 세포내 염색을 실시하였다. 우선, FITC-접합-CD8 Ab로 세포 표면 염색을 실행한 후, 1x FACS 라이싱 용액 (Becton Dickison, USA)으로 15 분간 실온에서 반응 시켰다. 원심 분리 후 라이싱 용액을 제거하고 투과 용액 (Becton Dickison, USA)으로 10 분간 실온에서 반응시켰으며, 반응 후 FACS 완충액으로 한번 세척한 후 PE-접합-IFN-γ Ab로 염색하였다. 다시 한번 세척한 후 이를 FACSCalibur (Becton Dickison, USA)를 사용하여 IFN-γ생성 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 8b 에서 나타난 바와 같이, 항원을 처리 하지 않은 수지상 세포 백신과 일반 항원 형태의 PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신의 경우 장기간 백신에 의해 유도된 T 세포군이 각기 6.4% 와 5.9% 에 해당하는 IFN-γ생성 CD8+ T 세포만을 유지하고 있는 것과 대조적으로, 본 발명의 MTP-PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신의 경우 장기간 백신에 의해 유도된 T 세포군은 전체 T 세포군의 13.7% 에 해당하는 IFN-γ생성 CD8+ T 세포를 유지하고 있었다. 이것은 MTP-PAP 항원 처리된 수지상 세포 백신에 의한 항원 전달 시 앞의 실시예 3-4a에서 밝힌 바와 같이 CD8+ T 세포의 활성을 훨씬더 강력하게 유도하고 있어 상당한 CD8 T 세포의 증식이 이루어졌을 뿐 아니라, 실제로 항암 치료 효과와 상관성이 높다고 알려진 활성 T 세포아군인 IFN-γ생성 CD8+ T 세포가 보다 효과적으로 유도되었음을 시사하는 것이다 (Asai T. et al, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:145-154(2000); 및 Scheibenbogen C. et al., Clin. Cancer Res. 3:221-226(1997)).
실시예 3-4c: 각 백신을 통해 유도된 자가 T 세포군 내 동일 PAP 항원 자극시 IFN-γ을 생성하는 CD8 + 세포 수 비교
우선, 자가 PBMC를 50 ㎍/㎖의 항원 (MTP-PAP 또는 β-갈락토시다아제)으로 12 시간 감작시킨 후 이를 수확하여 세척한 다음, 각 백신에 의해 유도된 자가 T 세포군과 1:2.5의 비율로 혼합하여 하루동안 다시 배양하였다. 배양의 마지막 4시간 동안 IFN-γ의 분비를 방지하기 위해 10 ㎍/㎖의 농도로 Brefeldin A (Sigma 사)를 처리하였다. 배양 후 이들 세포를 수확하여 실시예 3-4b에서 설명한 바와 같이 염색한 후 이를 FACSCalibur (Becton Dickison, USA)를 사용하여 IFN-γ 생성 CD8+ T 세포를 분석하였다.
도 8c 에서 나타난 바와 같이, 비교적 적은 수의 세포가 IFN- γ를 생성하였고, 이와 같은 결과는 PBMC에 의한 항원 전달이 부족해서 나온 것으로 판단된다. 그러나, 동일한 PBMC의 항원 전달에 의한 자극에 대해 본 발명의 MTP-PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신에 의해 유도된 T 세포군만이 반응하여 전체 T 세포군의 1.8% 에 해당하는 IFN-γ생성 CD8+ T 세포를 감지할 수 있었다. 한편, 백신 제조에 사용되지 않은 단백질인 β-갈락토시다아제 단백질로 표지된 PBMC에 의한 자극에서는 IFN-γ생성이 단지 백그라운드 수준으로 감지되는 것으로 보아 이러한 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ생성은 항원 특이적 반응으로 유도된 것임을 알 수 있었다. 또한, CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ생성은 항원 특이적 반응으로 간주되며 그 근거는 백신 제조에 사용되지 않은 단백질인 β-갈락토시다아제 항원이 표지된 PBMC에 의한 자극에서는 IFN-γ생성이 단지 백그라운드 수준으로 감지되기 때문이다. 이것은 세포 독성 CD8+ T 세포 활성과 IFN-γ생성 CD8+ T 세포 비율이 상호 양성 상관성 (positive correlation)을 갖고 있음을 고려해 볼 때 (Ghaneker S.A. et al, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8:628-631(2001); 및 Maino V.C. and Picker L.J., Cytometry 34:207-215(1998)), MTP-PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신이 세포 독성 CD8+ T 세포를 가장 효과적으로 유도 할 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서, 암세포에 대한 면역치료 기전에 있어 가장 직접적 작용을 하는 세포가 세포 독성 CD8+ T 세포임을 참작하면, MTP-PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신의 유용성을 거듭 입증하는 것이라 할 수 있다.
본 발명은 면역 치료용 수지상 세포 백신의 이용되는 융합 항원을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 융합 항원을 이용한 수지상 세포 백신의 제조방법은 특정 질병 또는 질환-특이 항원을 수지상 세포의 표면에 보다 향상된 효율로 제시하게 하며, 이렇게 하여 제조된 수지상 세포 백신은 보다 강력하고 효과적으로 항원 특이 T 세포 면역을 유도한다.
도 1은 본 발명의 MTP-PAP 융합 항원의 정제를 나타내는 겔 사진;
도 2는 본 발명의 처리된 MTP-PAP 항원의 농도에 따른 수지상 세포 표면 형질을 보여주는 FACS (Fluorescence-activated cell sorter) 분석 결과 그래프;
도 3은 종래의 항원 PAP 및 본 발명의 MTP-PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신의 표면 형질을 보여주는 FACS 분석 결과 그래프;
도 4는 본 발명의 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신의 항원 전달 능력을 나타내는 그래프;
도 5는 종래의 항원 PAP 및 본 발명의 MTP-PAP 항원을 처리한 수지상 세포 백신의 항원 전달 능력을 나타내는 그래프;
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신의 IL-4 분비 T 세포 유도능을 나타내는 ELISA 분석 결과 그래프;
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신의 IFN-γ 분비 T 세포 유도능을 나타내는 ELISA 분석 결과 그래프;
도 8a는 종래의 항원 PAP 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 백신을 통해 유도된 자가 T 세포군 내의 CD8+ T 세포 비율 분석을 나타내는 그래프; 및
도 8b는 종래의 항원 PAP 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 백신을 통해 유도된 자가 T 세포군 내에서 PMA와 이오노마이신 자극시 IFN-γ을 생성하는 CD8+ T 세포 비율 분석을 나타내는 그래프; 및
도 8c 는 종래의 항원 PAP 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 백신을 통해 유도된 자가 T 세포군 내 동일 PAP 항원 자극 시 IFN-γ을 생성하는 CD8+ T 세포 수를 비교한 FACS 분석 결과 그래프.
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Claims (11)

  1. (a) 항원능 (antigenicity)을 갖는 전립선 산 포스파타아제 (prostate acid phosphatase) 단백질 또는 펩타이드; 및 (b) 상기 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 결합되고 서열번호 1로 기재되는 세포막 투과 펩타이드로 이루어지는, 면역 치료용 수지상 세포 백신의 제조에 이용되는 융합 항원.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 미성숙 수지상 세포를 세포막 투과 펩타이드가 융합된 상기 제 1 항의 융합 항원과 함께 배양하여 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신을 제조하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 단핵구 또는 조혈 모세포로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 단핵구로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 단핵구는 말초 혈액으로부터 수득한 것임을 특징으로 하는 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법.
  8. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 단핵구 또는 조혈 모세포를 (ⅰ) IL-4 (interleukin-4), GM-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor), IL-13, IL-7, TGF-β1(Transforming growth factor-beta 1), TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 사이토카인 또는 (ⅱ) 칼슘 이오노포어 및 포볼 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 신호 물질이 함유된 배지에서 분화하여 수득한 것임을 특징으로 하는 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF가 함유된 배지에서 분화하여 수득한 것임을 특징으로 하는 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법.
  10. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포의 성숙화는 미성숙 수지상 세포를 (ⅰ) TNF (tumor necrosis factor)-α, IL-1β, IL-6, PGE2 (Prostaglandin E2), IFN-γ 또는 그들의 조합; (ⅱ) 활성 단핵구 배양액 배지; (iii) CD40L 또는 TRANCE (TNF-related activation-induced cytokine); 및 (iv) CpG, SAC (inactivated Staphylococcus aureus), SEB (Staphylococcal enterotoxin B), LPS (lipopolysaccharide) 또는 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 성숙화 인자를 함유하는 배지에서 배양하여 이루짐을 특징으로 하는 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포의 성숙화는 미성숙 수지상 세포를 (ⅰ) 활성 단핵구 배양액 배지 또는 (ⅱ) TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2 의 혼합액을 함유하는 배지에서 배양하여 이루어짐을 특징으로 하는 면역 치료용 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조방법.
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