CN117659140A

CN117659140A - 新冠病毒hla-a2限制性表位肽及应用

Info

Publication number: CN117659140A
Application number: CN202311404966.7A
Authority: CN
Inventors: 虞淦军; 吴艳峰; 何晓波; 李楠; 徐蓉蓉; 徐佳
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2023-10-26
Filing date: 2023-10-26
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本文提供了新冠病毒HLA‑A2限制性表位肽及应用。具体而言，本文提供了一种分离的多肽，其氨基酸序列为FLWLLWPVT(SEQ ID NO:5)，其为新型冠状病毒SARS‑CoV‑2HLA‑A2限制性表位多肽。本文还提供了包含所述多肽的复合物、制品及其应用。本申请相关活性物质和产品可用于SARS‑CoV‑2相关疾病的检测、诊断、预防和/或治疗。

Description

新冠病毒HLA-A2限制性表位肽及应用

技术领域

本发明涉及免疫学和生物医药领域。更具体而言，本申请涉及SARS-CoV-2病毒HLA-A2限制性表位多肽(例如SEQ ID NO:5的多肽)，以及所述表位多肽及其复合物、产品及其应用，例如在制备用于SARS-CoV-2相关疾病的检测、诊断、预防和/或治疗的产品。

背景技术

感染SARS-CoV-2的新冠患者主要临床症状表现为发热、咳嗽和呼吸急促等，实验室检查多见肺部多发磨玻璃影。部分患者的病情可迅速恶化，出现严重并发症，包括急性呼吸窘迫综合征、急性肾损伤、继发性感染、炎症因子风暴等，部分患者最终因呼吸衰竭、多器官功能障碍或休克而死亡。

引发疾病的病原体SARS-CoV-2经实验室鉴定为一种新发现的β属冠状病毒，与2003年SARS疫情的病原体SARS-CoV属同一病毒属，具有79％的遗传相似性，其直径为60～140nm，具有包膜及单链、正义的RNA基因组。SARS-CoV-2基因组两侧存在5'和3'端非翻译区，5'端包括2个较长开放型阅读框(ORF)，编码16种非结构蛋白；剩余接近3'端的基因组主要编码结构蛋白和其他辅助蛋白。该病毒的结构蛋白主要包括刺突蛋白(spike protein，S蛋白)、膜糖蛋白(membrane protein，M蛋白)、小包膜蛋白(envelope glycoprotein，E蛋白)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)。

S蛋白能结合宿主细胞并介导病毒感染，是目前抗体、疫苗研发参考的主要抗原蛋白，但疫情长期持续之下，SARS-CoV-2在宿主中不断积累突变，尤其是结构蛋白的突变，导致若干具有适应性优势的SARS-CoV-2突变株产生，例如奥密克戎等。这些突变株通常具有更强的传染或致病潜能，且突变可能导致抗原特性的改变，从而影响预防性疫苗和治疗性抗体对突变株的防治效果，导致病毒在机体内发生免疫逃逸。根据基因序列分析，结构蛋白突变主要集中在S蛋白和N蛋白上，这对基于S蛋白抗原信息研发的疫苗或抗体带来巨大挑战。

M蛋白本质是一类跨膜蛋白，其结构特征为具有三个结构域，分别为N端胞外结构域、三跨膜结构域和内部C端结构域，在病毒的形态发生、维持中发挥重要作用，是病毒颗粒中最为丰富的糖蛋白。更为关键的是M基因相对保守，M蛋白发生突变的频率远低于S蛋白，基于M蛋白研发的疫苗或抗体不易因病毒突变而导致防治效果降低。因此，如果以M蛋白作为靶标，对机体进行免疫，一方面将会使机体产生针对病毒M蛋白的特异性免疫应答，从而使机体能有效地清除病毒，为SARS-CoV-2的预防及治疗提供措施，另一方面其相对保守的低突变特性也能进一步避免病毒因突变产生的免疫逃逸，具有更为广谱的效果。

合成肽疫苗是近年来随着分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，且其副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个热门方向，广泛应用与抗肿瘤及抗病毒免疫治疗。目前已经有多种基于表位多肽的疫苗进入临床研究或上市。

HLA-A*0201是一种在我国人群中具有较高分布的一种MHC I类分子，阳性率在40～60％之间，占MHC I类分子各个亚群的首位，是疫苗设计中首选的相关分子。目前，已有多种HLA-A*0201限制性CTL表位被鉴定，有的已在临床显示了较好疗效。然而，由于细胞表位的多样性和复杂性，仍需针对特定蛋白质进行深入的研究以开发出可供免疫或治疗应用的表位多肽。

T2细胞是用于测定表位与HLA-A*0201分子结合力的工具细胞之一，它是一株抗原递呈转运体缺陷的HLA-A*0201型细胞株，该细胞表面只表达不含内源性抗原分子的HLA-A*0201分子，从而可利用其与目的肽的结合程度来测定HLA-A*0201分子与目的表位间的亲和力。

本领域中仍然迫切需要开发出能够有效预防和治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2及其相关疾病的途径、产品和方法。

发明内容

本申请中正是提供了针对SARS-CoV-2病毒的主要结构蛋白之一M蛋白的HLA-A2限制性表位多肽分子，其能够以高亲和力结合HLA-A2且具有M蛋白特异性，可有效应用于下游产品的制备和开发。

在本文的一些方面中，提供了一种分离的多肽，其包含氨基酸序列：FLWLLWPVT(SEQ ID NO:5)。在一些实施方式中，本申请的分离的多肽的氨基酸序列为FLWLLWPVT(SEQID NO:5)。

在一些实施方式中，分离的多肽为新型冠状病毒SARS-CoV-2表位肽，且所述多肽为HLA-A2限制性表位肽。

在一些实施方式中，分离的多肽为SARS-CoV-2的M蛋白表位肽，且所述多肽为HLA-A*0201限制性表位肽。

在一些实施方式中，分离的多肽与细胞表面HLA-A*0201分子的亲和力系数至少为2.0，例如，至少为2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0。

在本文的一些方面中，提供了一种复合物，其包含本申请中所述的表位多肽。

在一些实施方式中，复合物选自：包含本申请表位多肽的蛋白质或融合蛋白或重组蛋白、加载本申请表位多肽的抗原递呈细胞。

在一些实施方式中，抗原递呈细胞为选自下组中的一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞或前述任一者经人工修饰获得的细胞。

在本文的一些方面中，提供了一种分离的核酸分子，其编码本申请的表位多肽或包含本申请表位多肽的蛋白质或融合蛋白或重组蛋白。

在本文的一些方面中，提供了一种制品，其包含本文的表位多肽和/或复合物。

在一些实施方式中，所述制品还包含可接受的载体或赋形剂。

在一些实施方式中，制品为组合物或试剂盒。

在本文的一些方面中，提供了本申请多肽、复合物和/或制品的用途，其用于制备选自下组的一种或多种产品：用所述多肽致敏的树突状细胞、对所述多肽具有特异性的特异性免疫效应细胞、靶向所述多肽的靶向药物、靶向所述多肽的疫苗、靶向所述多肽的检测试剂或试剂盒。

在一些实施方式中，所述产品用于SARS-CoV-2相关疾病的检测、诊断、预防和/或治疗。

在本文的一些方面中，提供了一种制备选自下组的产品的方法，所述产品选自：用多肽致敏的树突状细胞、对多肽具有特异性的特异性免疫效应细胞、靶向多肽的靶向药物、靶向多肽的疫苗、靶向多肽的检测试剂或试剂盒，所述方法包括：

(a)提供本文所述的多肽、复合物和/或制品；

(b)将(a)中所述的多肽、复合物或制品用于所述树突状细胞的致敏、所述免疫效应细胞的刺激、或所述药物、疫苗、检测试剂或试剂盒的制备。

在一些实施方式中，制得的产品用于SARS-CoV-2相关疾病的检测、诊断、预防和/或治疗。

在本文的一些方面中，提供了用所述方法制得的致敏的树突状细胞、特异性免疫效应细胞、靶向药物、靶向疫苗、靶向检测试剂或试剂盒。

在一些实施方式中，所述致敏的树突状细胞、特异性免疫效应细胞、靶向药物、靶向疫苗、靶向检测试剂或试剂盒用于SARS-CoV-2相关疾病的检测、诊断、预防和/或治疗。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：SMp-11表位多肽与HLA-A*0201分子具有高亲和力。表1为预测表位肽与HLA-A*0201分子结合力的流式检测结果，荧光系数越高代表表位肽与HLA-A*0201的亲和力越高(一般荧光系数大于1代表该表位肽与HLA-A*0201具有高亲和力)。

图2：表位肽致敏的鼠源DC免疫转基因小鼠后诱导的针对表位特异性免疫应答反应。该图为Elispot结果分析(“****”，P<0.0001，“ns”＝无显著性差异)。

图3：体外成功诱导培养成熟的SMp-11表位多肽致敏的人源树突状细胞(DC)。该图为流式检测SMp-11诱导培养后DC细胞表面成熟标志分子的表达强弱。

图4：SMp-11致敏的人源DC诱导的效应T淋巴细胞具有SMp-11表位特异性杀伤作用。该图为CFSE/7-AAD流式检测法分析诱导SMp-11特异性CTL的杀伤作用(“***”，P<0.001；“****”，P<0.0001，“ns”＝无显著性差异)。

图5：SMp-11特异性人源CTL在致敏树突状细胞(DC)诱导的效应T细胞中具有较高比例。该图为Tetramer法流式检测结果(负载OVA的Tetramer作为流式对照组)。

图6：SMp-11特异性人源CTL在靶细胞刺激下可以特异性分泌杀伤性细胞因子IFN-γ。该图为Elispot结果分析(“****”，P<0.0001，“ns”＝无显著性差异)(负载无关肽OVA的靶细胞作为对照组)。

具体实施方式

本申请中针对SARS-CoV-2病毒的主要结构蛋白之一M蛋白发现并研制了能够以高亲和力结合HLA-A2分子，其能够有效应用于下游产品的制备和开发。

我们在对SARS-CoV-2新型冠状病毒M蛋白进行深度解析的基础上，选择性地合成了多条有可能与HLA-A*0201结合并诱导机体产生CTL的SARS-CoV-2候选抗原肽，通过T2肽结合实验，筛选出与HLA-A*0201具有强亲合力的表位肽，并对其免疫原性进行评价，发现其可以在HLA-A*0201健康人外周血中诱导出特异性的、HLA-A*0201限制性的细胞毒T淋巴细胞，而且是一个被细胞自然加工、递呈的免疫原性多肽。SARS-CoV-2新型冠状病毒M蛋白来源的、HLA-A2限制性的细胞毒T淋巴细胞表位肽的鉴定，不仅对SARS-CoV-2发病机制的研究，而且对其疫苗以及治疗制剂的研制均有重要的意义。

可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。例如，1～3包括端点1和3、其中的具体整数数值点2和非整数数值点(例如但不限于：1.2、1.5、1.8、2.1、2.3、2.4、2.8等，以及其子范围(例如但不限于：1～2、2～3、1～1.2、1.5～1.8等)。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“本发明多肽”、“特异性(多)肽”、“HLA-A2限制性表位(多)肽”和“SARS-CoV-2HLA-A2限制性表位(多)肽”可互换使用，是指基于SARS-CoV-2的M蛋白衍生的表位肽，其与HLA-A2具有高亲和力。

本申请的功能性表位多肽可包括或为SEQ ID NO:5的多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

如本文所用，术语“表位多肽编码序列”或“表位多肽编码分子”是指编码本文表位多肽或其活性片段的序列。在获得了本发明表位多肽的氨基酸序列后，本领域普通技术人员可采用本领域中已知的方法获得其编码序列，并可对其序列进行优化。例如，可根据SARS-CoV-2M蛋白所对应的全长编码序列或CDS序列获得其中的表位多肽编码序列。本申请的编码序列还可包括在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明多肽也可根据需要以多种形式存在。本发明的表位多肽可单独存在，或可与其他蛋白质或多肽偶联或融合形成多肽复合物，或可加载于抗原递呈细胞，或以上述形式存在于组合物或试剂盒等制品中。

在一些实施方式中，本文的表位多肽可包含在融合肽中，例如与之融合的部分包括：病毒或宿主来源的蛋白，转铁蛋白(Fn)、HIV p24、囊膜病毒的茎部，如流感HA2、艾滋病毒的gp41、抗体Fc段、GM-CSF、IL-21、CD40L或CD40抗体。

在一些实施方式中，融合肽可进一步包括：信号肽、连接肽、标签等元件。例如，信号肽可选自：蛋白自身、CD33、CD8、CD16、小鼠IgG1抗体、流感HA。连接肽可选自：(G4S)₃、(G4S)_n、GSAGSAAGSGEF、(Gly)₆、EFPKPSTPPGSSGGAP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、(Gly)₈、EGKSSGSGSESKST。标签可选自：His-tag、AviTag、Calmodulin tag、polyglutamate tag、E-tag、FLAG tag、HA-tag、Myc-tag、S-tag、SBP-tag、Sof-tag 1、Sof-tag3、Strep-tag、TCtag、V5 tag、T7 tag、VSV tag、Xpress tag、3X FLAG tag、Isopep tag、Spytag、Snoop tag和PNE tag。

在一些实施方式中，本发明的表位多肽可与BSA等分子量的蛋白偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的交联剂优选戊二醛、EDAC。又例如，本发明的表位多肽可加载本申请表位多肽的抗原递呈细胞。在一些实施方式中，抗原递呈细胞为选自下组中的一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞或前述任一者经人工修饰获得的细胞。

本申请多肽、复合物和/或制品可用于制备多种产品。产品可包括但不限于选自下组的一种或多种：用所述多肽致敏的树突状细胞、对所述多肽具有特异性的特异性免疫效应细胞、靶向所述多肽的靶向药物、靶向所述多肽的疫苗、靶向所述多肽的检测试剂或试剂盒，例如用所述多肽直接作为免疫原制备免疫组合物或药物组合物。

本发明还提供了一种药物、药物组合物或试剂盒，其中含有有效量的本发明的表位多肽、复合物或制品，或者采用表位多肽、复合物或制品制得的产品，以及药学上或免疫学上可接受的载体。

在较佳的实施方案中，所述药物组合物可用于检测、诊断、预防和/或治疗与SARS-CoV-2相关的疾病、其所导致的慢性疾病、和/或其病症。例如，本发明的药物组合物可用于预防或治疗因新型冠状病毒引起的感染性疾病或症状，例如其引起的肺部或其他组织损伤、并发症、多器官功能衰竭等。

在一些实施方式中，本文的产品可用于预防、消除或减轻对象中的新型冠状病毒感染或其至少一种症状，例如呼吸道症状(如鼻塞、咽喉痛、声嘶)、头痛、咳嗽、痰、发热、啰音、喘息、呼吸困难、因感染引起的肺炎、严重急性呼吸综合症、肾衰竭等。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“可接受的”成分是适用于人和/或动物和/或其他对象(如细胞)而无过度不良反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物和/或其他对象(如细胞)产生功能或活性的且可被对象所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，可包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的组合物中的活性物质占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型。在本发明的另一个优选例中，每天施用1～6剂本发明的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。

应理解，所用活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸蛋白注射法；(2)将活性物质与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)将活性物质与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)脂质体包裹给药；(5)与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)体外转染；(8)电打孔(electroporation)导入靶细胞。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：表位肽与HLA-A*0201分子的亲和力鉴定

应用肽结合实验筛选与HLA-A*0201高亲和力的表位肽。首先收集T2细胞(富衡生物科技，FH0150)，用无血清1640培养基洗三次后，调整细胞浓度至2×10⁶个/ml，铺于24孔板中，1ml/孔。再与50μM的候选多肽、3μg/ml的β2微球蛋白于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育18h。孵育好的细胞用冰PBS洗三遍，加入PE标记的HLA-A2特异性流式抗体(BiolegendInc)，4℃孵育30min，PBS洗后用流式细胞仪检测平均荧光强度。以HLA-A2限制性流感病毒表位多肽GILGFVFTL作为阳性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞作为背景对照。

结果判定：流式细胞术检测肽与HLA-A*0201分子的结合情况，是基于外源性多肽与T2细胞表面MHC I类分子的结合可使其表面的MHC-I类分子的表达量增加，两者结合越稳固，则可检测到的MHC I类分子的表达量越多，以平均荧光强度为检测指标。结果以荧光系数(FI)作为衡量指标。多肽的FI>1被认为是高亲和力的表位。

荧光系数(FI)的计算公式如下：

按照此方法，从SARS-CoV-2冠状病毒的膜糖蛋白M蛋白(SEQ ID NO:10)、刺突糖蛋白S蛋白(SEQ ID NO:11)、包膜蛋白E蛋白(SEQ ID NO:12)中筛选出HLA-A2高亲和力的表位多肽。参与筛选的示例性表位肽的平均荧光强度和荧光系数可参见表1和图1：

表1.流式检测不同表位肽与T2细胞表面HLA-A*0201分子结合后的荧光系数FI

结果：示例性候选表位多肽与HLA-A*0201分子的亲和力结果如表1所示，结果显示第1、3、5、7、8号多肽表位(分别命名为表位肽1、表位肽3、表位肽5(也称SMp-11)、表位肽7和表位肽8)排名前列，其平均荧光强度均大于10000，荧光系数FI均大于1，甚至均达2.0以上；其中，表位肽5(也称SMp-11)FLWLLWPVT的FI高达到2.73。

结论：通过筛选获得了与HLA-A*0201分子具有高亲和力的多肽表位，选择排名前五的多肽表位(1、3、5、7、8)进一步筛选鉴定。

实施例2：表位肽致敏DC免疫HLA-A2转基因小鼠脾细胞的IFN-γ分泌检测

根据实施例1筛选所得5个潜在多肽表位(表位肽1、3、5、7、8)，进一步在HLA-A2转基因小鼠中检测其免疫原性。按常规方法制备HLA-A2.1/K^b转基因小鼠(JacksonLaboratory，003475)骨髓来源的树突状细胞(DC)。将小鼠脱颈处死后取出股骨和胫骨，用1ml注射器抽取PBS并将针头插入骨髓腔冲出骨髓，然后使用Tris-NH₄Cl溶液裂解骨髓红细胞，离心弃去上清并用含10％ FBS、1ng/ml小鼠IL-4(PeproTech，214-14-5UG)、10ng/ml小鼠GM-CSF(PeproTech，315-03-50UG)的1640培养基中诱导培养DC。收集培养至第5天的DC，调细胞浓度至1×10⁶个/ml，加入表位肽(终浓度20μg/ml)，37℃，5％CO₂孵箱中继续培养至第6天，加入TNF-α(30ng/ml)刺激成熟，继续培养至第八天即获得表位肽致敏的DC细胞。

收集肽致敏的DC，用PBS洗三遍，调整细胞浓度至1×10⁷个/ml。每只雄性转基因小鼠腹部皮下注射0.1ml，共免疫三次，间隔一周。将未加表位肽孵育DC或PBS同时间皮下注射的小鼠作为阴性对照小鼠。末次免疫后7天，无菌操作摘取各组小鼠脾脏(致敏DC组、空载DC组、PBS组)，溶解红细胞，制成单细胞悬液。将脾细胞悬液(1×10⁶个/ml)加入ELISPOT预包被板(MabTech Inc)，每孔200μl，加入对应表位肽(终浓度20μg/ml)刺激培养24h。使用PMA(达优，2030421)刺激的脾细胞作为阳性刺激对照孔。培养结束排空细胞，用PBS清洗5遍后，加入显色液显色，充分干燥后用读板仪计数统计分析。

结果：Elispot检测结果如图2所示。结果表明，SMp-11(表位肽5)致敏DC免疫小鼠相比于阴性对照组(非致敏DC或PBS免疫小鼠)，其脾细胞在SMp-11表位肽的刺激下，可以分泌极显著提高数量的IFN-γ斑点。而其他四种表位肽(表位肽1、3、7、8)相比对照，分泌情况没有明显差异。

并且，虽然表位肽8与表位肽5包含7个相同的连续氨基酸，在序列上具有高相似性，但其诱导特异性免疫应答的作用却截然相反：结果显示表位肽8无法诱导特异性免疫应答，并不是特异性表位；而表位肽5不仅可高效诱导免疫应答，且该免疫应答具有优异的特异性。

结论：鉴于生物体体内机能的复杂性，与HLA-A*0201分子具有高亲和力的多肽表位是否能够有效致敏DC并进而在体内有效诱导免疫应答的能力具有不可预见性，需通过体内测试来验证其DC致敏以及特异性免疫诱导效果。通过本实施例的体内测试验证了本发明的SMp-11表位多肽能够有效致敏DC，并能够在小鼠体内极显著地诱导出针对该SMp-11表位的特异性IFN-γ免疫应答反应。

实施例3：SMp-11表位肽致敏DC细胞的表征

分离健康人外周血单个核细胞，用RPMI1640无血清培养基重悬PBMC，取样计数，调整细胞密度为5×10⁶个/ml，在6孔培养板中每孔铺2ml，于37℃、5％CO₂浓度下孵育过夜。次日晃动、吹下未贴壁的细胞(主要为淋巴细胞)收集冻存；贴壁细胞即为单核细胞，向六孔板中每孔加入2ml含人重组GM-CSF(50ng/ml)和人重组IL-4(10ng/ml)的完全培养基，隔天补入2ml相同培养基。至第五天收集由单核细胞诱导分化的未成熟树突状细胞(Dendriticcells，DC)，加入SMp-11表位肽至20μg/ml，第六天加入人TNF-α至10ng/ml刺激成熟，培养至第八天即获得SMp-11表位肽致敏的成熟DC细胞。

取成熟DC细胞，用PBS重悬至1×10⁶个/100μl，加入FITC-CD80、PE-CD83、APC-CD86流式抗体(Biolegend Inc.)各1μl，混匀后4℃避光孵育30分钟，PBS洗一遍后用流式细胞仪检测成熟DC特征性表面分子CD80、CD83、CD86分子的表达情况(图3)。

结果：SMp-11表位肽致敏DC细胞特征性表面分子的表达如图3所示，结果显示刺激成熟后的SMp-11表位肽致敏DC表面CD80、CD83、CD86特征性分子均高表达。

结论：采用SMp-11表位肽可在体外成功诱导成熟的SMp-11肽致敏DC细胞。

实施例4：SMp-11特异性人源CTL的诱导培养及特异性杀伤作用检测

从购得的人PBMC细胞(赛笠生物，s2001002)中采用常规方法分离获得自体T细胞和树突状细胞，将培养的T细胞每周用成熟的SMp-11致敏的自体树突状细胞刺激一次，共刺激三次。培养扩增三周后收集效应细胞，用CFSE/7-AAD法检测其特异性杀伤效应。

分别用负载SMp-11的T2细胞、负载OVA多肽(SEQ ID NO：13，SIINFEKL，即OVA_257-264)的T2细胞及未加载多肽的空载T2细胞作为靶细胞，用CFSE工作液在37℃下孵育标记15分钟(200μl CFSE/2×10⁶个细胞)，完全培养基洗一遍，用完全培养基调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，加入96孔圆底板，每孔100μl。

按10∶1、5∶1、2.5∶1三个不同效靶比加入效应细胞，不加效应细胞的负载SMp-11、OVA_257-264或空载T2细胞作为本底对照组，37℃孵育4小时，离心收集细胞，用7-AAD工作液在4℃下孵育标记15分钟，PBS洗两遍后重悬，用流式细胞仪检测CFSE与7-AAD荧光信号。

杀伤率的计算公式如下：

杀伤率(％)＝实验组CFSE-7AAD双阳性细胞(％)-本底组CFSE-7AAD双阳性细胞(％)

结果：CFSE/7-AAD杀伤检测法结果如图4所示，结果表明SMp-11致敏DC能够有效诱导T淋巴细胞，使其对负载SMp-11表位肽的靶细胞显示出比对照组(单纯T2细胞或负载无关肽的T2细胞)极显著提高的杀伤效率。

结论：表位肽SMp-11能够有效致敏DC并诱导产生具有优异的SMp-11表位特异性杀伤作用的效应T淋巴细胞。

实施例5：SMp-11特异性人源CTL在体外诱导的效应T细胞中的比例检测

取20μl肽FLEX-T^TMTetramer单体(Biolegend Inc；280003)与20μl SMp-11表位肽(400μM)混匀后，置于冰上用紫外光(366nm)照射30分钟，随后在37℃下避光孵育30分钟，再加入3.3μl PE-链霉亲和素(Biolegend Inc)混匀后置于冰上避光孵育30min，最后加入2.4μl封闭液混匀(封闭液：1.6μl 50mM D-生物素+6μl 10％(w/v)NaN₃+192.4μl PBS)，同法制备的负载OVA多肽(SIINFEKL，OVA_257-264，SEQ ID NO:13)的Tetramer作为无关肽对照。

取同实施例4方法体外诱导的效应T细胞用PBS重悬为2×10⁶个/200μl，加入2μl制备的SMp-11-Tetramer或OVA-Tetramer，混匀后4℃避光孵育30分钟，PBS洗一遍后用流式细胞仪检测结合SMp-11-Tetramer的SMp-11特异性CTL比例。

结果：SMp-11特异性CTL的Tetramer检测结果如图5所示，结果显示SMp-11致敏DC诱导培养的效应T细胞中，SMp-11特异性CTL比例达到2.02％，而无关肽对照组仅为0.37％。

结论：表位肽SMp-11能够有效致敏DC并进一步诱导效应T细胞中SMp-11特异性人源CTL比例的显著提高，从而诱导出针对该SMp-11表位的特异性T细胞免疫应答反应。

实施例6：SMp-11特异性人源CTL的IFN-γ细胞因子分泌检测

取同前方法体外诱导的效应T细胞用完全培养基重悬为2×10⁶个/ml以每孔100μl加入ELISPOT预包被板。分别用负载SMp-11的T2细胞、负载OVA多肽(SIINFEKL，OVA_257-264)的T2细胞及未加载多肽的空载T2细胞作为刺激细胞，用完全培养基调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，按不同的效靶比(1:0.1、1:0.25、1:0.5)加入ELISPOT预包被板(MabTech Inc)。不加效应细胞的负载SMp-11、OVA_257-264或空载T2细胞作为本底对照组，37℃孵育24小时，排空细胞后用PBS清洗5遍后加入显色液显色，充分干燥后用读板仪计数显示的IFN-γ斑点数并统计分析。根据效应T细胞中CD8阳性T细胞比例和IFN-γ斑点数，计算分泌IFN-γ的CTL细胞比例。

分泌IFN-γ的CTL细胞比例计算公式如下：

结果：Elispot检测结果如图6所示。结果表明，诱导的SMp-11特异性CTL在负载SMp-11表位肽的靶细胞刺激下具有比对照组(单纯T2细胞或负载无关肽的T2细胞)极显著提高的IFN-γ分泌，且分泌IFN-γ的CTL在最低比例刺激细胞的刺激下占比高达0.87％。

结论：表位肽SMp-11能够有效致敏DC并进一步诱导SMp-11特异性CTL在靶细胞刺激下特异性高效分泌IFN-γ，从而诱导出针对该SMp-11表位的特异性IFN-γ免疫应答反应。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

附表.序列信息

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Claims

1.一种分离的多肽，其氨基酸序列为FLWLLWPVT(SEQ ID NO:5)。

2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽为新型冠状病毒SARS-CoV-2表位肽，且所述多肽为HLA-A2限制性表位肽。

3.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽为SARS-CoV-2M蛋白表位肽，且所述多肽为HLA-A*0201限制性表位肽。

4.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽与细胞表面HLA-A*0201分子的亲和力系数至少为2.0，例如，至少为2.2，至少为2.5，至少为2.9。

5.一种复合物，其包含如权利要求1～4中任一项所述的多肽，

例如所述复合物选自：包含权利要求1～4中任一项所述多肽的蛋白质或融合蛋白或蛋白偶联物；加载权利要求1～4中任一项所述多肽的抗原递呈细胞。

6.如权利要求5所述的复合物，其中，所述抗原递呈细胞为选自下组中的一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞或前述任一者经人工修饰获得的细胞。

7.一种制品，其包含如权利要求1～4中任一项所述的多肽和/或如权利要求5～6中任一项所述的复合物，

例如，所述制品为组合物或试剂盒。

8.如权利要求1～4中任一项所述的多肽、如权利要求5～6中任一项所述的复合物或如权利要求7所述的制品的用途，其用于制备选自下组的一种或多种产品：用所述多肽致敏的树突状细胞、对所述多肽具有特异性的特异性免疫效应细胞、靶向所述多肽的靶向药物、靶向所述多肽的疫苗、靶向所述多肽的检测试剂或试剂盒，

例如，所述产品用于SARS-CoV-2相关疾病的检测、诊断、预防和/或治疗。

9.一种制备选自下组的产品的方法，所述产品选自：用如权利要求1～4中任一项所述的多肽致敏的树突状细胞、对所述多肽具有特异性的特异性免疫效应细胞、靶向所述多肽的靶向药物、靶向所述多肽的疫苗、靶向所述多肽的检测试剂或试剂盒，所述方法包括：

(a)提供如权利要求1～4中任一项所述的多肽、如权利要求5～6中任一项所述的复合物或如权利要求7所述的制品；

(b)将(a)中所述的多肽、复合物或制品用于所述树突状细胞的致敏、所述免疫效应细胞的刺激、或所述药物、疫苗、检测试剂或试剂盒的制备，

10.用权利要求9所述方法制得的致敏的树突状细胞、特异性免疫效应细胞、靶向药物、靶向疫苗、靶向检测试剂或试剂盒，其用于SARS-CoV-2相关疾病的检测、诊断、预防和/或治疗。