CN110195042B - 一种树突状细胞的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种树突状细胞的制备方法，属于肿瘤治疗技术领域；所述制备方法包括以下步骤：1)将人类白细胞抗原(HLA)和KRAS突变的融合基因连接到pCDH或哺乳动物表达载体，得到重组质粒；2)利用重组质粒电击转化外周血来源的树突状细胞(DC)，得到重组细胞(i‑DC)；3)诱导重组细胞成熟，得到成熟的树突状细胞。现有技术一般通过突变多肽负载抗原提呈细胞，或者将突变抗原转入抗原提呈细胞，但两者提呈的效率均较低，本发明通过构建KRAS抗原和HLA的融合基因，共同转入抗原提呈细胞，过表达两种基因，增加HLA与KRAS突变抗原的结合率，提高提呈效率，更容易得到特异性杀伤效果明显的CTL。

Description

一种树突状细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种树突状细胞的制备方法及应用。
背景技术
ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种：HRAS、KRAS突变和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。KRAS突变因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS突变对人类癌症影响最大，当KRAS突变正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS突变基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。
在实体瘤患者中，KRAS突变，是对靶向药抗药的原因之一。因此，KRAS突变患者很难从靶向药中获益，生存期短，因此，迫切需要开发针对KRAS突变的免疫细胞治疗手段；传统的靶向KRAS突变的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备，一方面受患者树突状细胞(DC)提呈能力弱的影响，另一方面，受患者人类白细胞抗原(HLA)缺失的影响，导致制备的CTL对KRAS突变的肿瘤细胞没有杀伤能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种树突状细胞的制备方法及应用，该方法制备得到的树突状细胞能够提高提呈KRAS突变抗原的效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将人类白细胞抗原和KRAS突变的融合基因连接到pCDH或哺乳动物表达载体，得到重组质粒；
2)利用步骤1)所述重组质粒电击转化外周血来源的DC，得到重组细胞；
3)诱导步骤2)所述重组细胞成熟，得到成熟的树突状细胞。
优选的，步骤1)所述人类白细胞抗原为HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:07、HLA-A*02:10、HLA-A*02:12、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*11:02、HLA-A*11:10、HLA-A*11:12、HLA-A*23:01、HLA-A*24:02、HLA-A*24:04、HLA-A*24:23、HLA-A*26:01、HLA-A*29:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*30:09、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:01、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-B*07:02、HLA-B*07:05、HLA-B*08:01、HLA-B*13:01、HLA-B*13:02、HLA-B*15:01、HLA-B*15:02、HLA-B*15:07、HLA-B*15:08、HLA-B*15:11、HLA-B*15:18、HLA-B*15:25、HLA-B*18:01、HLA-B*27:04、HLA-B*27:05、HLA-B*27:07、HLA-B*35:01、HLA-B*35:03、HLA-B*37:01、HLA-B*38:01、HLA-B*38:02、HLA-B*39:01、HLA-B*39:07、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*40:06、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HLA-B*46:01、HLA-B*48:01、HLA-B*50:01、HLA-B*51:01、HLA-B*51:02、HLA-B*52:01、HLA-B*54:01、HLA-B*55:01、HLA-B*55:02、HLA-B*57:01、HLA-B*58:01、HLA-B*67:01、HLA-C*01:02、HLA-C*01:03、HLA-C*02:02、HLA-C*03:02、HLA-C*03:03、HLA-C*03:04、HLA-C*04:01、HLA-C*04:03、HLA-C*06:02、HLA-C*07:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:04、HLA-C*07:06、HLA-C*08:01、HLA-C*08:03、HLA-C*12:02、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02、HLA-C*14:03、HLA-C*15:02或HLA-C*15:05。
优选的，步骤1)所述KRAS突变为KRAS-G12D、KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12R、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D或KRAS-Q61H。
优选的，步骤1)所述KRAS突变为KRAS-G12D；所述人类白细胞抗原为HLA-A*02:01。
优选的，步骤2)所述重组质粒的浓度为5～20μg/mL。
优选的，步骤2)所述电击转化采用的电极的间距为2～3mm。
优选的，步骤2)所述电击转化的电压为100～350V。
本发明还提供了上述方案所述树突状细胞在提高KRAS突变抗原的提呈效率和制备靶向KRAS突变的细胞毒性T淋巴细胞中的应用。
本发明还提供了上述方案所述树突状细胞在制备杀伤KRAS突变的实体肿瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种外周血来源的树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：1)将人类白细胞抗原和KRAS突变的融合基因连接到pCDH或哺乳动物表达载体，得到重组质粒；2)利用步骤1)所述重组质粒电击转化外周血来源的树突状细胞(DC)，得到重组细胞(i-DC)；3)诱导步骤2)所述重组细胞成熟，得到成熟的树突状细胞。现有技术一般通过突变多肽负载抗原提呈细胞，或者将突变抗原转入抗原提呈细胞，但两者提呈的效率均较低，本发明通过构建KRAS抗原和HLA的融合基因，共同转入抗原提呈细胞，过表达两种基因，增加HLA与KRAS突变抗原的结合率、提高提呈效率；更容易得到特异性杀伤效果明显的CTL。
附图说明：
图1表示i-DC-CTL细胞的分型结果中T细胞和NK细胞比例；
图2表示i-DC-CTL细胞的分型结果中T细胞中CD8和CD4的比例；
图3表示传统DC诱导CTL细胞的分型结果中T细胞和NK细胞比例；
图4表示传统DC诱导CTL细胞的分型结果中T细胞中CD8和CD4的比例；
图5表示正常DC诱导的CTL细胞和高效提呈的i-DC诱导的CTL细胞对KRAS突变的肿瘤细胞的杀伤效果。
具体实施方式
本发明提供了一种树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将人类白细胞抗原和KRAS突变的融合基因连接到pCDH或哺乳动物表达载体，得到重组质粒；
2)利用步骤1)所述重组质粒电击转化树突状细胞，得到重组细胞；
3)诱导步骤2)所述重组细胞成熟，得到成熟的树突状细胞。
本发明首先将人类白细胞抗原(HLA)和KRAS突变进行连接，得到的融合基因连接到pCDH或哺乳动物表达载体，得到重组质粒。
本发明中，所述HLA和KRAS突变优选为高亲和力的KRAS突变与HLA组合；本发明具体实施过程中根据患者的HLA分型和实体瘤的KRAS突变序列，通过在线软件，进行亲和力的预测，根据亲和力高低进行排序，选择高亲和力的KRAS突变与HLA组合；所述在线预测软件优选为NetMHCpan4.0Server。
本发明中，所述HLA优选为HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:07、HLA-A*02:10、HLA-A*02:12、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*11:02、HLA-A*11:10、HLA-A*11:12、HLA-A*23:01、HLA-A*24:02、HLA-A*24:04、HLA-A*24:23、HLA-A*26:01、HLA-A*29:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*30:09、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:01、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-B*07:02、HLA-B*07:05、HLA-B*08:01、HLA-B*13:01、HLA-B*13:02、HLA-B*15:01、HLA-B*15:02、HLA-B*15:07、HLA-B*15:08、HLA-B*15:11、HLA-B*15:18、HLA-B*15:25、HLA-B*18:01、HLA-B*27:04、HLA-B*27:05、HLA-B*27:07、HLA-B*35:01、HLA-B*35:03、HLA-B*37:01、HLA-B*38:01、HLA-B*38:02、HLA-B*39:01、HLA-B*39:07、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*40:06、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HLA-B*46:01、HLA-B*48:01、HLA-B*50:01、HLA-B*51:01、HLA-B*51:02、HLA-B*52:01、HLA-B*54:01、HLA-B*55:01、HLA-B*55:02、HLA-B*57:01、HLA-B*58:01、HLA-B*67:01、HLA-C*01:02、HLA-C*01:03、HLA-C*02:02、HLA-C*03:02、HLA-C*03:03、HLA-C*03:04、HLA-C*04:01、HLA-C*04:03、HLA-C*06:02、HLA-C*07:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:04、HLA-C*07:06、HLA-C*08:01、HLA-C*08:03、HLA-C*12:02、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02、HLA-C*14:03、HLA-C*15:02或HLA-C*15:05。
本发明中，所述KRAS突变优选为KRAS-G12D、KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12R、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D或KRAS-Q61H。
本发明具体实施过程中，所述KRAS突变为KRAS-G12D；所述人类白细胞抗原为HLA-A*02:01。
本发明中，所述融合基因优选的依次串联有HLA、剪切序列和KRAS突变；所述剪切序列对应的剪切肽优选为P2A、T2A或E2A；所述P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为ATNFSLLKQA GDVEENPGP；所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为EGRGSLLTCGDVEENPGP；所述E2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为QCTNYALLKL AGDVESNPGP；本发明具体实施过程中，所述融合基因优选的由金维智生物科技有限公司合成。
本发明中，所述连接体系包括目的基因4μL、载体1μL和连接混合液5μL；所述连接程序为16℃连接4h。
得到重组质粒后，本发明利用步骤1)所述重组质粒电击转化树突状细胞，得到重组细胞；本发明对所述树突状细胞的来源没有特殊限制；
本发明在利用重组质粒电击转化树突状细胞前，优选的还包括对重组质粒进行鉴定、扩增和提取。
本发明中，所述重组质粒的浓度优选为5～20μg/mL，更优选为10μg/mL；所述电击转化采用的电极的间距为2mm；所述电击转化的电压优选为100～350V，更优选为250V。
得到重组细胞后，本发明诱导重组细胞成熟，得到成熟的树突状细胞。具体过程为：将重组细胞加入培养液中，调整重组细胞为1×106细胞/mL，进行培养，培养24～72h后，加入IL-4和GM-CSF，再进行培养3d后，得到成熟的树突状细胞。
本发明中，所述培养液为X-VIVO+1％人血白蛋白；所述培养的温度优选为35～40℃，更优选为37℃；所述培养的设备优选为5％CO2培养箱。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的树突状细胞在提高KRAS突变抗原的提呈效率中的应用。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的树突状细胞在制备靶向KRAS突变的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中的应用。
本发明具体实施过程中，利用所述树突状细胞刺激能够识别KRAS突变抗原的T细胞增殖，得到CTL。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的树突状细胞在制备杀伤KRAS突变的实体肿瘤的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1一种树突状细胞的制备方法及应用
1.分析KRAS突变抗原与HLA的亲和力
根据患者的HLA分型结果，和KRAS突变序列，以NetMHCpan 4.0Server在线软件分析所有HLA与KRAS组合的亲和力，根据亲和力高低进行排序，确定选择HLA-A0201和KRAS-G12D。
2.构建HLA与KRAS融合蛋白表达载体
1)利用HLA-A0201和KRAS-G12D合成融合基因(HLA-A0201和KRAS-G12D中间以P2A剪切序列相连，基因合成由金维智生物科技有限公司完成)，并克隆到pCDH表达载体上，得到重组质粒；其中融合基因对应的融合蛋白序列如SEQ ID NO：4所示，具体为GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWATNFSLLKQAGDVEENPGPTEYKLVVVGADGVGKSALTIQ；所述P2A对应的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示，具体为ATNFSLLKQA GDVEENPGP；
2)上述得到的重组质粒转化感受态细胞，挑取单克隆，进行测序，选择测序结果正确的克隆，进行后续实验；
3.以天根质粒大提试剂盒(购自于天根生化科技(北京)有限公司)进行质粒的提取，方法按照厂家说明书操作。
4.贴壁发分离外周血来源的树突状细胞(DC)
1)单采血，分离PBMC；
2)将PBMC以培养基1640+10％FBS调整至1×106细胞/mL，至于培养皿中，于37℃5％CO2培养箱，静止过夜；收集悬浮细胞，标记为T+B，备用；
3)以培养基1640+10％FBS对贴在培养皿底部的细胞进行吹打，收集贴壁的单核细胞，即为外周血来源的DC，备用。
5.质粒电击转化DC
1)将步骤2中得到的重组质粒，电击转入步骤4)中得到的外周血来源的DC，即得到i-DC；电击转化条件如下：
质粒浓度调整至10μg/mL，2mm电极，电压为250V。
6.诱导i-DC成熟
1)将i-DC加入新鲜的培养液X-VIVO+1％人血白蛋白，计数，调整至1×106细胞/mL，置于平皿中，于37℃5％CO2培养箱培养；
2)培养过夜48h后，加入1000IU/mL IL-4和800IU/mL GM-CSF，培养3d后，收集成熟的i-DC，备用。
7.分离T细胞
1)离心收集步骤4中得到的T+B细胞，以PBS重悬，细胞过30μm细胞筛，计数；
2)离心，300g，10min，完全去除上清；
3)以分离缓冲液(PBS，pH 7.2，0.5％BSA2mM EDTA)重悬细胞，每107细胞以80μL分离缓冲液重悬；
4)每107细胞，加入20μL CD8/CD3beads；
5)混匀后，孵育15min(4℃)
6)每107细胞，加入2mL分离buffer重悬细胞，300g，10min，完全去除上清；
7)将108以内的细胞以500μL分离buffer重悬；
8)以分离buffer润洗分离柱；MS：500μL，LS：3mL；
9)将细胞转移至分离柱；
10)收集未结合的细胞，并以分离buffer冲洗3次，液体完全流出时，再加入分离buffer；MS：3×500μL；
11)从分离器上卸下柱子，放到适合的分离管上；
12)加入适量的分离缓冲液，立即将细胞推出，收集细胞备用。
8.I-DC诱导靶向KRAS突变的CTL细胞
1)将CD3+T细胞或CD8+T细胞以X-VIVO培养基调整至1×106细胞/mL，2mL接种于6孔板中，将i-DC按1：200的比例加入孔中，标记为Day0；
2)共培养48h，Day 3按培养基体积，每天加入IL-2，终浓度为50IU/mL；
4)Day 5后，培养基变黄时进行半量换液(X-VIVO+50IU/mL IL 2)；根据细胞生长情况补充培养基，细胞密度维持在1×106细胞/mL；
5)Day 21收获细胞，既为CTL。
9.流式检测细胞分型
1)收集CTL细胞，1000pm离心5min；
2)1×106cells/管，加入CD3、CD4、CD8和CD56的抗体，室温避光30min；
3)PBS洗两次，1000rpm离心5min；
PBS重悬，上机检测；
10.杀伤实验——LDH法
1)收集靶细胞，1000rpm离心5min；
2)以PBS洗一遍，1000rpm离心5min；
3)以1640+2％FBS重悬后，计数调整至8×104cells/mL，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，备用；
4)收集效应细胞，1000rpm离心5min；
5)以PBS洗一遍，1000rpm离心5min；
6)以1640+2％FBS重悬细胞计数后，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，设置效靶比为10：1、5：1、2.5：1和1.25：1；
7)37℃5％CO2共孵育3.5h后，进行LDH检测；
对照例1
1.以传统CTL细胞(即DC没有经过改造加强，直接诱导制备的CTL细胞)为对照，进行比较。(参见实施例1的方法)
结果发现，正常DC诱导的CTL和i-DC诱导的CTL，在细胞分型上，没有本质区别，两者均以CD8+T细胞为主；少量的NK细胞和NKT细胞；i-DC-CTL细胞的分型结果参见图1和图2，其中图1表示i-DC诱导的CTL中76.9％为T细胞；图2表示T细胞中70％的细胞为CD8+T细胞；传统DC诱导CTL细胞的分型结果参见图3和图4，其中图3表示传统DC诱导的CTL中76.9％为T细胞；图4表示T细胞中77％的细胞为CD8+T细胞。
2.i-DC-CTL细胞对KRAS突变的肿瘤细胞的杀伤效果
正常DC诱导的CTL细胞和高效提呈的i-DC诱导的CTL细胞，对KRAR突变的肿瘤细胞在杀伤效率有有显著差异，在效靶比为1.25：1和2.5：1时，i-DC-CTL的特异性杀伤效率显著高于DC-CTL，在效靶比为10：1至40：1时，i-DC-CTL的特异性杀伤效率更明显，两者的差异极显著；参见图5。由图5可以看出将HLA基因融合KRAS突变基因，转入DC后，i-DC可以诱导出对KRAS突变的肿瘤细胞，具备更强杀伤效率的CTL细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 焦顺昌
北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> 一种树突状细胞的制备方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 4
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270
Arg Trp Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
275 280 285
Glu Asn Pro Gly Pro Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp
290 295 300
Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln
305 310

Claims (6)

1.一种树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将人类白细胞抗原和KRAS突变的融合基因连接到哺乳动物表达载体，得到重组质粒；
2)利用步骤1)所述重组质粒电击转化外周血来源的DC，得到重组细胞；
3)诱导步骤2)所述重组细胞成熟，得到成熟的树突状细胞；
步骤1)所述KRAS突变为KRAS-G12D；所述人类白细胞抗原为HLA-A*02:01；
步骤1)中所述融合基因对应的融合蛋白序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWATNFSLLKQAGDVEENPGPTEYKLVVVGADGVGKSALTIQ。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述重组质粒的浓度为5～20μg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述电击转化采用的电极的间距为2～3mm。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述电击转化的电压为100～350V。
5.权利要求1～4任意一项所述制备方法制备得到的树突状细胞。
6.权利要求5所述树突状细胞在制备提高KRAS突变抗原的提呈效率的药物和制备靶向KRAS突变的细胞毒性T淋巴细胞中的应用。
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