CN110857319B

CN110857319B - 一种分离的t细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸及其应用

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Publication number: CN110857319B
Application number: CN201810972150.7A
Authority: CN
Inventors: 侯亚非; 侯大炜
Original assignee: Hangzhou Converd Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Converd Co Ltd
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2023-12-08
Anticipated expiration: 2038-08-24
Also published as: CN110857319A; WO2020038491A1; TW202009240A

Abstract

本发明提供了一种分离的T细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸及其应用。所述分离的T细胞受体(TCR)包括α链和β链中的至少一者，所述α链和β链均包含可变区和恒定区，其特征在于，所述T细胞受体能够特异性识别肿瘤细胞所表达的抗原Her2/neu，并且所述α链的所述可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少98％的一致性，所述β链的所述可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少98％的一致性。所述TCR可特异性识别肿瘤抗原，同时可避免可能的脱靶毒副反应。用此TCR修饰的免疫细胞具有显著的抗肿瘤效果。

Description

一种分离的T细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及分离的T细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸、表达载体、制备方法、药物组合物和应用。

背景技术

Her2/neu(ERBB2)是属于EGFR家族的一个跨膜蛋白，和家族其它蛋白形成二聚体并通过一系列细胞内信号传导途径来调控细胞增值，分化以及癌变等过程(参见文献“Growth Factors,2008；26:263”、“Oncol Biol.Phys,2004；58:903”)。Her2/neu蛋白在多种上皮来源的癌细胞中过度表达，如乳腺癌，胃癌，大肠癌，卵巢癌，胰腺癌，肺癌，食管癌，膀胱癌，肾癌等(参见文献“Trends in Molecular Med,2013；19:677”)，并且在原发灶和转移灶癌细胞中的表达相对均一(参见文献“J Clin Oncol,1998；8:103”)，因此，Her2/neu成为靶向治疗的适当靶点。

靶向Her2/neu的人源化单抗药物Herceptin可以显著延长Her2/neu阳性的乳腺癌患者生存期(参见文献“N Engl J Med,2001,344:783”)，然而单独使用Herceptin治疗Her2阳性的转移乳腺癌的临床反应率只有11％到26％(参见文献“J Clin Oncol,2002；20:7169”)，表明单用Heceptin对大部分Her2高表达的转移乳腺癌的疗效并不理想。尽管Heceptin联合化疗可提高临床应答率，但大多数Her2/neu过度表达的乳腺癌病人在一年后会对Heceptin产生抗性(参见文献“J Clin Oncol,2001；19:2587”)。

Her2/neu阳性肿瘤患者体内会产生针对Her2/neu抗原的内源性抗体和T细胞反应(参见文献“Cancer Res,2005；65:650”)，因而，靶向Her2/neu抗原的特异性免疫治疗成为一种颇有前景的治疗手段。特异性识别Her2/neu抗原表位多肽(epitope peptide)369-377的T细胞可以从Her2/neu高表达的卵巢癌腹水中成功分离(参见文献“J.Exp.Med.1995；181:2109–2117”)。靶向Her2/neu 369-377多肽抗原的肿瘤疫苗进入临床试验，尽管临床1/2期显示此疫苗可以诱导出针对Her2/neu 369-377多肽抗原的特异性T杀伤细胞(参见文献“Breast Care,2016；11:116”)，但临床三期却没达到延长病人生存期的预定目标(http://www.onclive.com/web-exclusives/phase-iii-nelipepimuts-study-in-breast-cancer-halted-after-futility-review)。过继传输经体外培养的，基于嵌合抗原受体(chimericantigen receptors，CARs)的肿瘤特异性T细胞疗法被开发后，作为第一个针对实体瘤的，靶向Her2/neu抗原的CAR-T细胞疗法进入临床试验，但由于产生强烈的细胞因子风暴(cytokine release syndrome，CRS)导致病人死亡而被终止(参见文献“Nature Med,2016；22:26”)。严重的细胞因子风暴以及神经毒性是CAR-T治疗中常见的毒性反应(参见文献“Blood,2016；127:3321”)，部分原因可能和CAR这种非天然的T细胞受体不受限制的细胞活化有关(参见文献“Nat Ned,2015；21:581”)，或者与不需抗原刺激的细胞因子的自分泌有关(参见文献“Cancer Immunol Res,2015；3:356”)。

过继转输经过特异性T细胞受体(即TCR)基因修饰的T细胞的TCR-T疗法被认为是针对实体瘤最具前景的免疫细胞基因疗法(参见文献“Adv Immunol.2016；130:279-94”)。其中，靶向NY-ESO-1抗原的TCR-T疗法的临床研究显示出令人鼓舞的临床治疗效果(参见文献“Nat Med.2015Aug；21(8):914-921”)。然而，目前已知的靶向肿瘤抗原、并有效识别肿瘤细胞的特异性TCR的数量十分有限，因此限制了TCR-T疗法的广泛应用。另外，尽管TCR-T疗法没有出现CAR-T疗法中所表现出的严重的细胞因子风暴毒性，但如果靶抗原来源于自身蛋白，针对正常组织细胞中低表达的靶抗原有可能会导致严重的自身免疫反应，即转接脱靶(或称中靶脱瘤)(on target off tumor)毒性反应(Blood 2009；114:535-546)。另外，为了获得有效识别肿瘤细胞的高亲和性TCR，一般的策略是体外通过对TCR上的互补性决定区(complementarity determing regions,CDRs)进行基因点突变，或者通过从未经过中枢耐受机制筛选的人源化小鼠T细胞库中进行诱导(参见文献“Front Immunol.2013；4:363”)。然而，这种高亲和性TCR可能会对正常自身蛋白产生交叉反应而导致对正常组织细胞的杀伤作用，即严重甚至致命的脱靶(off-target)毒性(参见文献“Curr Opin Immunol 2015；33:16–22”、参见文献“Sci Transl Med.2013；5(197):197ra103”)。因此，获得特异性靶向肿瘤抗原并有效识别肿瘤细胞，同时避免可能出现的脱靶毒副反应的新型TCR基因，是成功开发TCR-T免疫细胞基因疗法面临的主要挑战。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了分离的T细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸、表达载体、制备方法、药物组合物和应用。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种分离的T细胞受体，包括α链和β链中的至少一者，所述α链和β链均包含可变区和恒定区，其特征在于，所述T细胞受体能够特异性识别肿瘤细胞所表达的抗原Her2/neu，并且所述α链的所述可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少98％的一致性，所述β链的所述可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少98％的一致性。

(2)根据(1)所述的T细胞受体，其中所述的T细胞受体能够特异性识别被HLA-A2分子所提呈的所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽；优选的是，所述抗原表位多肽包括如SEQID NO:3所示的Her2/neu 369-377。

(3)根据(1)所述的T细胞受体，其中所述α链的所述恒定区和/或所述β链的所述恒定区来源于人；优选地，所述α链的所述恒定区全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换，并且/或者所述β链的所述恒定区全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换；更优选地，所述其它物种为小鼠。

(4)根据(1)所述的T细胞受体，其中所述α链的所述恒定区修饰有一个或多个二硫键，并且/或者所述β链的所述恒定区修饰有一个或多个二硫键。

(5)根据(1)所述的T细胞受体，其中所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NOs:4、5或6所示，所述β链的氨基酸序列如SEQ ID NOs:7、8或9所示。

(6)一种分离的、编码T细胞受体的核酸，包含所述T细胞受体的α链和β链中的至少一者的编码序列，所述α链编码序列和β链编码序列均包含可变区编码序列和恒定区编码序列，其特征在于，所述T细胞受体能够特异性识别肿瘤细胞表达的抗原Her2/neu，并且所述α链可变区编码序列编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少98％的一致性，所述β链可变区编码序列编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少98％的一致性。

(7)根据(6)所述的核酸，其中所述核酸为DNA或RNA。

(8)根据(6)所述的核酸，其中所述α链可变区编码序列如SEQ ID NO:10所示，所述β链可变区编码序列如SEQ ID NO:11所示。

(9)根据(6)所述的核酸，其中被所述核酸编码的所述T细胞受体能够特异性识别被HLA-A2分子所提呈的所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽；优选的是，所述抗原表位多肽包括如SEQ ID NO:3所示的Her2/neu 369-377。

(10)根据(6)所述的核酸，其中所述α链恒定区编码序列和/或所述β链恒定区编码序列来源于人；优选地，所述α链恒定区编码序列全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换，并且/或者所述β链恒定区编码序列全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换；更优选地，所述其它物种为小鼠。

(11)根据(6)所述的核酸，其中所述α链恒定区编码序列包含一个或多个二硫键编码序列，并且/或者所述β链恒定区编码序列包含一个或多个二硫键编码序列。

(12)根据(6)所述的核酸，其中所述α链编码序列如SEQ ID NOs:12、13或14所示，所述β链编码序列如SEQ ID NOs:15、16或17所示。

(13)根据(6)-(11)中任一项所述的核酸，其中所述α链编码序列和所述β链编码序列之间由可切割性连接多肽的编码序列连接。

(14)根据(13)所述的核酸，其序列如SEQ ID NOs:18、19、或20所示。

(15)一种重组表达载体，其含有与启动子有效连接的、根据(6)-(14)中任一项所述的核酸，和/或其互补序列。所述启动子可以是真核细胞启动子，包括持续表达启动子和可诱导表达启动子，包括(例如)：PGK1启动子、EF-1α启动子、CMV启动子、SV40启动子、Ubc启动子、CAG启动子、TRE启动子、CaMKIIa启动子、人β肌动蛋白(human beta actin)启动子。

(16)一种T细胞受体修饰的细胞，该细胞的表面被(1)-(5)中任一项所述的T细胞受体修饰，其中所述细胞包括原始T细胞或其前体细胞，NKT细胞，或T细胞株。

(17)一种制备根据(16)所述的T细胞受体修饰的细胞的方法，包括以下步骤：

1)提供细胞；

2)提供编码根据(1)-(5)中任一项所述的T细胞受体的核酸；

3)将所述核酸转染入所述细胞中。

(18)根据(17)所述的方法，其中步骤1)所述的细胞来自自体或异体。

(19)根据(17)所述的方法，其中所述转染的方式包括：采用病毒载体转染的方式，优选的是，所述病毒载体包括γ逆转录病毒载体或慢病毒载体；化学方式，优选的是，所述化学方式包括采用脂质体转染的方式；物理方式，优选的是，所述物理方式包括电转染方式。

(20)根据(17)所述的方法，其中步骤2)所述的核酸为根据(6)-(14)中任一项所述的核酸。

(21)根据(16)所述的T细胞受体修饰的细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

(22)根据(21)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症是抗原Her2/neu阳性的，并且是HLA-A2阳性的。

(23)根据(16)所述的T细胞受体修饰的细胞在制备用于检测宿主的肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

(24)一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据(16)所述的T细胞受体修饰的细胞，及可药用辅料。

(25)根据(24)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含每个患者每个疗程总剂量范围为1×10³-1×10⁹个细胞/Kg体重的所述T细胞受体修饰的细胞。

(26)根据(24)所述的药物组合物，其中所述药物组合物适于经动脉、静脉、皮下、皮内、瘤内、淋巴管内、淋巴结内、蛛网膜下腔内、骨髓内、肌肉内和腹膜内给药。

(27)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据(16)所述的T细胞受体修饰的细胞。

(28)根据(27)所述的方法，其中所述T细胞受体修饰的细胞的施用剂量为每个患者每个疗程总剂量范围为1×10³-1×10⁹个细胞/Kg体重。

(29)根据(27)所述的方法，其中所述T细胞受体修饰的细胞通过动脉、静脉、皮下、皮内、瘤内、淋巴管内、淋巴结内、蛛网膜下腔内、骨髓内、肌肉内和腹膜内给药。

(30)根据(27)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症是抗原Her2/neu阳性的，并且是HLA-A2阳性的。

(31)根据(27)所述的方法，还包括对所述肿瘤和/或癌症患者施用其它用于治疗肿瘤的药物，和/或用于调节患者免疫系统的药物。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明从HLA-A2阳性的健康供体外周血中成功诱导出对HLA-A2提呈的Her2/neu抗原表位多肽(如Her2/neu 369-377多肽)有特异性的T细胞克隆，并从中筛选出携带有特异性识别Her2/neu抗原表位多肽(如Her2/neu 369-377多肽)的天然TCR的T细胞克隆，进而获得了该TCR全序列。此TCR属于非CD8分子依赖性，对Her2/neu抗原表位多肽(如Her2/neu369-377多肽)具有中等到高亲和性，可特异性识别HLA-A2阳性并表达Her2/neu抗原的肿瘤细胞。另外，携带此TCR的T细胞克隆经过中枢免疫耐受机制筛选后进入外周T细胞库。携带此TCR的杀伤T细胞曾存在于正常人外周血，并未对微量表达Her2/neu蛋白的正常组织细胞产生交叉反应。另外，为了避免所述TCR对正常蛋白产生脱靶交叉反应而导致自身免疫毒性，首先获得Her2/neu 369-377多肽上与所述TCR识别功能相关的关键氨基酸位点的信息，据此，从人正常蛋白数据库中搜索出包含所述TCR识别的关键氨基酸位点的所有人正常蛋白，并进一步筛选出可能结合HLA-A2分子的抗原表位多肽。实验显示，所述TCR不识别这些来自正常蛋白，具有潜在交叉反应的表位多肽。因此，本发明获得了能够特异性识别肿瘤抗原，同时能够避免可能出现的脱靶毒副反应的新型TCR。

在进一步的发明中还对TCR的恒定区进行了改造(例如进行二硫键修饰或鼠源化改造)，以使得此TCR在免疫细胞上表达时能够进一步减少或避免与内源TCR错配的发生。

用此TCR修饰的免疫细胞(例如原始T细胞、其前体细胞、NKT细胞、T细胞株)可特异性识别多种HLA-A2⁺且Her2/neu⁺的肿瘤细胞株，具有显著的抗肿瘤效果。因此，基于此TCR的TCR-T疗法可望治疗多种实体瘤。

用本发明的TCR修饰的免疫细胞治疗肿瘤时，可有效避免采用CAR-T治疗时所引起的细胞因子风暴和免疫排斥反应。

本发明的TCR修饰的免疫细胞为治疗HLA-A2⁺且Her2/neu⁺肿瘤患者提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。

附图说明

图1示出本发明实施例1中从HLA-A2⁺正常供体PBMC(具体为#1PBMC)中诱导出的Her2/neu 369-377多肽(Her2-E75)特异性杀伤性T细胞的表型和功能检测结果。图1A为经过两轮Her2-E75抗原多肽体外刺激后，PBMC细胞经CD8-APC抗体和Her2-E75五聚体-PE染色后进行流式细胞分析结果，右图是经多肽刺激的细胞，对CD8⁺五聚体⁺杀伤T细胞群进行FACS分选，以获得T细胞克隆。左图为没有多肽刺激的对照组细胞。横坐标表示CD8分子表达的荧光强度，纵坐标表示结合的Her2-E75五聚体的荧光强度。图1B为CD8⁺E75-四聚体⁺杀伤T细胞克隆经CD8-APC和Her2-E75四聚体-PE染色后流式细胞的表型分析，右图显示CD8⁺Her2四聚体⁺T细胞克隆Her2CTL 6A5为纯化的Her2-E75多肽特异性CTL细胞克隆。左图为没有多肽刺激的对照组CTL细胞。横坐标表示CD8分子表达的荧光强度，纵坐标表示结合的Her2-E75四聚体的荧光强度。图1C示出所构建的携带Her2 TCR-6A5-mC基因的慢病毒载体(即“pCDH-EF1α-Her2 TCR载体”)的主要功能片段。示出的片段表达EF-1α启动子所驱动的TCR基因，各TCR的β链和α链的不变区片段均为鼠源不变区片段，TCR的β链和α链被可切割性连接多肽的编码序列(furin-F2A)所链接。

图2示出经Her2 TCR-6A5-mC TCR基因转染的外周血单个核细胞(PBMC)的表型和功能检测结果。图2A为编码Her2 TCR-6A5-mC的慢病毒载体转染来自两个不同供体的PBMC，经Her2-E75四聚体-PE和抗CD8-APC抗体染色后进行流式细胞分析的结果。首先根据细胞形态和大小分出淋巴细胞群，Her2-E75四聚体⁺细胞群为表达Her2 TCR-6A5-mC TCR的细胞。横坐标表示CD8分子表达的荧光强度，纵坐标表示结合的Her2-E75四聚体的荧光强度。所示百分率为各阳性细胞群占分出的淋巴细胞数的比率。左图涉及一个供体所提供的外周血单个核细胞(#1PBMC)，右图涉及另一个不同供体提供的PBMC(#2PBMC)。CD8⁺Her2-E75四聚体⁺细胞为表达Her2TCR-6A5-mC的杀伤性T细胞。CD8^-Her2-E75四聚体⁺细胞可能为表达Her2TCR-6A5-mC的CD4⁺辅助T细胞。图2B示出表达Her2TCR-6A5-mC的T细胞可以识别被T2细胞所提呈的Her2-E75多肽。经编码Her2 TCR-6A5-mC的慢病毒载体转染的两个不同供体PBMC分别与提呈不同浓度梯度Her2-E75多肽的T2细胞混合培养16小时，取细胞上清进行IFN-γ的ELISA分析。对照组中靶细胞为提呈可以结合HLA-A2分子的EBV病毒抗原多肽LMP2 426-434的T2细胞(图中未显示)。图中“0.1μg/ml”表示提呈0.1μg/ml的Her2-E75多肽的T2细胞组，“0.01μg/ml”表示提呈0.01μg/ml的Her2-E75多肽的T2细胞组，“0.001μg/ml”表示提呈0.001μg/ml的Her2-E75多肽的T2细胞组，“0.0001μg/ml”表示提呈0.0001μg/ml的Her2-E75多肽的T2细胞组。纵坐标表示T细胞分泌的IFN-γ的浓度。图2C示出T细胞功能的CD8抗体阻断试验结果。其中，经编码Her2 TCR-6A5-mC的慢病毒载体转染的#2PBMC与T2细胞提呈的Her2-E75抗原多肽共培养时加入抗人CD8抗体，检测T细胞分泌IFN-γ的功能是否被抑制。图中“T2+Her2-E75”表示未加入抗人CD8抗体的、提呈0.1μg/ml的Her2-E75多肽的T2细胞组，“T2+Her2-E75+抗-CD8”表示加入抗人CD8抗体的、提呈0.1μg/ml的Her2-E75多肽的T2细胞组。横坐标表示不同实验组别，纵坐标表示T细胞分泌的IFN-γ的浓度。“ns”表示两实验组无显著性差异。图2B和2C中各试验组和对照组均为复孔，结果显示为平均值±SEM。

图3示出经Her2 TCR-6A5-mC TCR基因转染的外周血单个核细胞(PBMC)识别肿瘤细胞株的功能检测结果。图3A示出不同肿瘤细胞株细胞表达HLA-A2和Her2/neu的情况。横坐标表示不同的人肿瘤细胞株。“Colo205”和“HCT116”为结肠癌细胞；“MDA-MB-231”和“MCF-7”为乳腺癌细胞；“PANC-1”为胰腺癌细胞；“U87MG”为神经胶质瘤细胞；“NCI-H446”为肺癌细胞。纵坐标“MFI”表示细胞经抗HLA-A2荧光抗体或抗Her2/neu荧光抗体染色后的荧光强度均值。白色条柱为Her2/neu在细胞表面的表达量，黑色条柱为HLA-A2在细胞表面的表达量。图3B示出编码Her2 TCR-6A5-mC TCR基因的慢病毒载体转染#2PBMC，与不同肿瘤细胞株细胞混合培养24小时后，取细胞上清进行IFN-γ的ELISA分析结果。各试验组和对照组均为三孔，结果显示为平均值±SME。横坐标示出不同靶细胞，纵坐标示出T细胞分泌的IFN-γ的浓度。效靶比E:T为5:1。白色条柱示出效应细胞为未经Her2 TCR-6A5-mC TCR基因转染的对照外周血单个核细胞，黑色条柱示出效应细胞为经Her2 TCR-6A5-mC TCR基因转染的外周血单个核细胞。图3C、D、E、F、G、H、I、J、和K示出#2PBMC经编码Her2 TCR-6A5-mC TCR基因的慢病毒载体转染后，对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。图3C-3G的杀伤活性是通过对活细胞计数获得的，图3H-3K的杀伤活性是MTT方法测定的，反应时间为24小时。(其中，图3C和3H示出针对肿瘤细胞株MCF-7的结果、图3D示出针对肿瘤细胞株HCT116的结果、图3E示出针对肿瘤细胞株U87MG的结果、图3F示出针对肿瘤细胞株NCI-H446的结果、图3G示出针对肿瘤细胞株SKOV3的结果、图3I示出针对肿瘤细胞株PANC-1的结果、图3J示出针对肿瘤细胞株HEPG2的结果、图3K示出针对肿瘤细胞株HT-29的结果。各试验组和对照组均为三孔，结果显示为平均值±SME。横坐标示出不同的效靶比E:T。纵坐标示出T细胞对靶细胞的杀伤率百分比数值。圆点形图注示出效应细胞为未经Her2 TCR-6A5-mC TCR基因转染的对照外周血单个核细胞，上三角图注示出效应细胞为经Her2 TCR-6A5-mC TCR基因转染的外周血单个核细胞。MTT杀伤实验中，另外一组为加紫杉醇10μM作为阳性对照(图3H-3K中示出为单独的下三角点)。

图4示出Her2 TCR-6A5-mC TCR所识别的Her2-E75多肽上的氨基酸关键位点，以及对来自人正常蛋白并具有潜在交叉反应的的表位多肽的识别功能检测的结果。图4A示出实施例5中所形成的9个新表位多肽分别与T2细胞以及转染有编码Her2 TCR-6A5-mC TCR基因的慢病毒载体的#2PBMC混合培养24小时后，取细胞上清进行IFN-γ检测的ELISA分析结果。各试验组和对照组均为复孔，结果显示为平均值±SME。横坐标示出T2细胞提呈不同的表位多肽(T2+多肽)，“E75”为Her2/neu 369-377多肽，“E75-K1A”、“E75I2A”、“E75F32A”、“E75G4A”、“E75S5A”、“E75L6A”、“E75F8A”、“E75L9A”分别为Her2/neu 369-377多肽相应位点的氨基酸被丙氨酸所替换，“E75-A7G”为Her2/neu 369-377多肽的第七个丙氨酸被甘氨酸替代。纵坐标示出T细胞分泌的IFN-γ的浓度。效靶比E:T为5:1。图4B示出Her2 TCR-6A5-mC TCR识别来自人正常蛋白且具有潜在交叉反应的表位多肽的识别功能。“E75”为Her2/neu 369-377多肽，多肽“B”是NSMA3 93-101多肽，“C”是O11A1 103-111多肽，“D”是SV2C687-695多肽。转染有编码Her2 TCR-6A5-mC TCR基因的慢病毒载体的#2PBMC与提呈不同浓度梯度所述多肽的T2细胞混合培养24小时，取细胞上清进行IFN-γ的ELISA分析。各试验组和对照组均为三孔，结果显示为平均值±SME。横坐标示出T2细胞提呈不同浓度的表位多肽。纵坐标表示T细胞分泌的IFN-γ的浓度。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”、“T细胞”、“T细胞受体”、“T细胞受体修饰”、“TCR可变区”、“TCR恒定区”、“抗原”、“抗原表位多肽”、“同源序列”、“编码”、“抗原提呈”、“重组DNA表达载体”、“启动子”、“互补序列”、“转染”、“自体”、“异体”、“特异性识别”、“TCR-T疗法”涵盖本领域通常认为的含义。

Her2/neu抗原属于肿瘤相关抗原，识别Her2/neu抗原的高亲和性T细胞多数被中枢耐受机制所清除，以避免导致可能的自身免疫反应(参见文献“Immunol Rev.2016；271(1):127-40”)。因此，从外周血T细胞库中诱导出具有特异性识别肿瘤细胞所表达的Her2/neu抗原的T细胞克隆变得十分困难。利用树突状细胞(Dendritic cell)提呈Her2/neu369-377多肽抗原，进而从Her2/neu 369-377多肽疫苗免疫过的患者外周血中诱导出的高亲和性TCR尽管可以识别极低量外源所负载的(exogenously loaded)Her2/neu 369-377多肽，但不能识别肿瘤细胞内源提呈的(endogenously presented)抗原多肽(参见文献“Cancer Res.1998；58:4902–4908”)。这可能是由于外源负载的多肽/HLA复合物在构型(conformation)上与细胞内部自然提呈的HLA/多肽复合物有所不同而导致，或者由于Her2/neu 369-377多肽位于Her2蛋白高度糖化区，细胞内部自然提成的Her2/neu 369-377多肽可能被糖基化而导致TCR识别构型的差异(参见文献“Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003；100:15029–15034”)。体外通过Her2/neu 369-377抗原多肽诱导T细胞的过程中，仅能识别外源负载抗原多肽的高亲和性T细胞克隆往往获得优势生长(dominant expansion)，而能特异性识别被细胞提成的内源性Her2/neu抗原多肽的T细胞克隆生长受到抑制(参见文献“J Exp Med.2016 Nov 14；213(12):2811-2829”)，因而增加了获得可识别肿瘤细胞的功能性TCR的难度。有研究小组从HLA-A2阴性的外周血中诱导出异体T细胞(Allo–T cells)，可以特异性识别HLA-A2限制的Her2/neu 369-377抗原多肽，用获得的TCR基因转染T细胞后，不仅可以识别肿瘤细胞提成的Her2/neu 369-377抗原多肽，也可交叉识别同家族的Her3以及Her4抗原表位(参见文献“Journal of Immunology,2008,180:8135–8145”)。然而，基于异体allo-TCR的TCR-T疗法存在产生针对其它正常自身蛋白抗原表位的异体反应(allo-reaction)的风险(参见文献“Int.J.Cancer 2009；125,649–655。Nat Immunol 2007；8:388–97”)。另外一个研究小组从Her2/neu 369-377多肽疫苗免疫过的肿瘤患者外周血中诱导出Her2/neu 369-377多肽特异性T细胞，并把来源于不同T细胞的alpha和beta链进行配对并筛选出一个高亲和性TCR，转染此高亲和性TCR的T细胞可识别HLA-A2⁺Her2/neu⁺的多种肿瘤细胞(参见文献“HUMAN GENE THERAPY 2014；25:730–739”)。这个TCR不是从单克隆T细胞获得，因此不能确定此TCR是否为存在于经过中枢耐受筛选过的T细胞库的天然TCR。为了提高TCR对HLA I类分子提呈的表位多肽的亲和性，可以通过对TCR识别表位多肽的功能性区域进行点突变，并筛选出高亲和性TCR。由于Her2/neu蛋白也在心肌、肺、食道、肾、膀胱这些重要脏器有微量表达(参见文献“Oncogene.1990Jul；5(7):953-62”)，因此经上述方法获得非天然的高亲和性Her2/neu抗原特异性TCR存在对正常组织产生脱靶毒性反应的风险。

肿瘤细胞高表达Her2/neu蛋白，因此细胞表面被HLA提呈的抗原多肽的数量也会相应增加，在肿瘤细胞和正常细胞上HLA/抗原多肽复合物数量的差异可成为特异性T细胞区分正常和肿瘤组织的窗口。本发明提出从自体T细胞库(auto-T cell repertoire)中获得天然TCR的序列，进而在体外使TCR表达在T细胞上，以使所得到的表达TCR的T细胞可识别肿瘤细胞增加表达的Her2/neu抗原，是成功开发有效低毒的TCR-T疗法的关键。

为了获得能够特异性识别肿瘤抗原，同时能够避免可能出现的脱靶毒副反应的TCR，本发明从HLA-A2阳性的健康供体外周血中诱导对HLA-A2提呈的Her2/neu 369-377多肽有特异性的T细胞克隆，并从中筛选出携带有对Her2/neu 369-377多肽具有中等亲和性的天然TCR的T细胞克隆。这不同于其他研究小组从经过Her2/neu 369-377多肽疫苗免疫过的肿瘤患者外周血诱导Her2/neu 369-377多肽特异性T细胞的策略(参见文献“HUMAN GENETHERAPY 2014，25:730–739”)，本发明认为经过Her2/neu 369-377抗原多肽免疫后，针对Her2/neu 369-377多肽的特定T细胞克隆会优势增殖，因而不能代表体内T细胞库(repertoire)中自然存在的可识别靶细胞所提呈的Her2/neu 369-377多肽抗原的特异性T细胞群。本发明也没有采取其他研究小组从HLA-A2阴性外周血中诱导多肽特异性T细胞的方式(参见文献“The Journal of Immunology,2010,184:1617–1629”)，尽管从异体PBMC中更容易获得高亲和性的识别Her2/neu 369-377多肽抗原的allo-T细胞，但这也同时增加了T细胞交叉识别被HLA-A2分子提呈的其它多肽而导致的异体反应。

基于上述构思，本发明提供了一种分离的T细胞受体，包括α链和β链中的至少一者，所述α链和β链均包含可变区和恒定区，其特征在于，所述T细胞受体能够特异性识别肿瘤细胞所表达的抗原Her2/neu，并且所述α链的所述可变区的氨基酸序列具有与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列至少98％、优选至少98.5％、更优选至少99％的一致性，所述β链的所述可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少98％、优选至少98.5％、更优选至少99％的一致性，只要不显著影响本发明的效果即可。还优选的是，所述α链的所述可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述β链的所述可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

TCRα链和β链的可变区用于结合抗原多肽/主要组织相容性复合体(MHC I)，分别包括三个超变区或称为互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)，即，CDR1、CDR2、CDR3。其中CDR3区域对特异性识别被MHC分子提呈的抗原多肽至关重要。TCRα链是不同的V和J基因片段重组而成，β链则是不同的V、D和J基因片段重组而成。特定基因片段重组结合所形成的相应CDR3区域，以及结合区域回文以及随机插入的核苷酸(palindromicand random nucleotide additions)形成了TCR对抗原多肽识别的特异性(参见文献“Immunobiology:The immune system in health and disese.5^th editin,Chapter 4,Thegeneration of Lymphocyte antigen receptors”)。所述MHC I类分子包括人HLA。所述HLA包括：HLA-A、B、C。

进一步具体地，所述的T细胞受体能够特异性识别被HLA-A2分子所提呈的所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽。抗原Her2/neu的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。优选的是，所述抗原表位多肽包括如SEQ ID NO:3所示的Her2/neu 369-377。HLA-A2阳性细胞表达的HLA-A2等位基因包括HLA-A*0201、0202、0203、0204、0205、0206和0207。优选的是，所述HLA-A2分子优选为HLA-A*0201。

在一个实施方案中，所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽为Her2/neu 369-377多肽(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽为与Her2/neu369-377多肽具有4-9个连续的相同氨基酸(例如，4、5、6、7、8或9个连续的相同氨基酸)的抗原表位多肽，并且这些多肽的长度为8-11个氨基酸。例如，在一个实施方案中，所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽为Her2/neu 373-382多肽(SEQ ID NO:22)。

优选地，所述T细胞受体识别Her2/neu 369-377多肽的最大半反应多肽浓度在1.0-10ng/ml之间。在本发明的一个实施方案中，所述最大半反应多肽浓度约为1.6ng/ml-2.9ng/ml。术语“最大半反应多肽浓度”是指诱导T细胞反应达到最大值的50％所需多肽的浓度。据报道，针对巨细胞病毒(CMV)抗原CMV pp65(495-503)多肽的特异性T细胞的最大半反应多肽浓度在0.1-1ng/ml之间，而此TCR对CMV抗原多肽被认为具有高亲和性(参见文献“Journal of Immunogical Methds 2007；320:119-131”)。在本发明中，所述T细胞受体对Her2/neu抗原具有中等到高亲和性，从而可避免高亲和性(最大半反应多肽浓度小于0.1ng/ml)可能带来的脱靶毒性。另外，所述T细胞受体识别Her2/neu 369-377多肽不依赖CD8分子的辅助作用，CD8阴性CD4阳性T细胞表达所述T细胞受体也可特异性识别被HLA-A2提呈的Her2/neu 369-377多肽而分泌细胞因子，从而增强表达所述T细胞受体的杀伤性T细胞的功能。

T细胞表达的外源TCRα链和β链有可能和T细胞本身TCR的α链和β链发生错配，不仅会稀释正确配对的外源TCR的表达量，错配TCR的抗原特异性也不明确，因而有识别自身抗原的潜在危险，因此优选将TCRα链和β链的恒定区修饰以减少或避免错配。

在一个实施方案中，所述α链的所述恒定区和/或所述β链的所述恒定区来源于人；优选地，本发明发现所述α链的所述恒定区可以全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换，并且/或者所述β链的所述恒定区可以全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换。更优选地，所述其它物种为小鼠。所述替换可以增加细胞中TCR的表达量，并且可以进一步提高被该TCR修饰的细胞对Her2/neu抗原的特异性。

所述α链的所述恒定区可以修饰有一个或多个二硫键，并且/或者所述β链的所述恒定区可以修饰有一个或多个二硫键，例如1个或2个。

在具体的实施方式中，制备了两种不同方式修饰的TCR，一种方式是通过点突变在TCR恒定区增加一个二硫键，方法在文献“Cancer Res.2007 Apr 15；67(8):3898-903.”中描述，其全文通过引用方式并入本文。Her2 TCR-1B5-mC是用小鼠TCR恒定区序列置换相应的人TCR恒定区序列，方法在文献“Eur.J.Immunol.2006 36:3052–3059”中描述，其全文通过引用方式并入本文。

在具体的实施方案中，所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NOs:4、5或6所示，所述β链的氨基酸序列如SEQ ID NOs:7、8或9所示。

其中，对于氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的α链，其序列为原始的人源序列；对于氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的α链，其在恒定区修饰有1个二硫键；对于氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的α链，其恒定区替换为鼠源恒定区。

其中，对于氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的β链，其序列为原始的人源序列；对于氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的β链，其在恒定区修饰有1个二硫键；对于氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的β链，其恒定区替换为鼠源恒定区。

在一个具体实施方案中，所述TCR的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。在另一个具体实施方案中，所述TCR的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。在又一个具体实施方案中，所述TCR的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在本发明其它具体的实施方案中，所述TCR的α链具有在SEQ ID NOs:4、5或6所示氨基酸序列中替换、删除、和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；例如，所述α链具有与SEQ ID NOs:4、5或6所示氨基酸序列至少90％、优选至少95％、更优选至少99％的一致性。

在本发明其它具体的实施方案中，所述TCR的β链具有在SEQ ID NOs:7、8或9所示氨基酸序列中替换、删除、和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；例如，所述β链具有与SEQ ID NOs:7、8或9所示氨基酸序列至少90％、优选至少95％、更优选至少99％的一致性。

本发明的TCR的α链和/或β链还可以在末端(例如C末端)结合其它功能性序列，例如共刺激信号CD28、4-1BB和/或CD3zeta的功能区序列。

本发明还提供了一种分离的、编码T细胞受体的核酸，包含所述T细胞受体的α链和β链中的至少一者的编码序列，所述α链编码序列和β链编码序列均包含可变区编码序列和恒定区编码序列，其特征在于，所述T细胞受体能够特异性识别肿瘤细胞表达的抗原Her2/neu，并且所述α链可变区编码序列编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少98％、优选至少98.5％、更优选至少99％的一致性，所述β链可变区编码序列编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少98％、优选至少98.5％、更优选至少99％的一致性，只要不显著影响本发明的效果即可。还优选的是，所述α链可变区编码序列编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述β链可变区编码序列编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

所述核酸可以为DNA或RNA。

优选地，所述α链可变区编码序列如SEQ ID NO:10所示，所述β链可变区编码序列如SEQ ID NO:11所示。

进一步具体地，被所述核酸编码的所述T细胞受体能够特异性识别被HLA-A2分子所提呈的所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽。

在一个实施方案中，所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽为Her2/neu 369-377多肽(SEQ ID NO:3)。在其它实施方案中，所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽为与Her2/neu369-377多肽具有4-9个连续的相同氨基酸(例如，4、5、6、7、8或9个连续的相同氨基酸)的抗原表位多肽，并且这些多肽的长度为8-10个氨基酸。例如，在一个实施方案中，所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽为Her2/neu 373-382多肽(SEQ ID NO:22)。

优选地，被所述核酸编码的所述T细胞受体识别Her2/neu 369-377多肽的最大半反应多肽浓度在1.0-10ng/ml之间(例如，在3.0-8.0ng/ml、5.0-7.0ng/ml之间)。在本发明的一个实施方案中，所述最大半反应多肽浓度约为1.6-2.9ng/ml。在此情况下，所述T细胞受体对Her2/neu抗原具有中高等亲和性，可避免高亲和性(最大半反应多肽浓度小于0.1ng/ml)可能带来的脱靶毒性。

在一个实施方案中，所述α链的所述恒定区和/或所述β链的所述恒定区来源于人；优选地，所述α链恒定区编码序列全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换，并且/或者所述β链恒定区编码序列全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换。更优选地，所述其它物种为小鼠。所述替换可以增加细胞中TCR的表达量，并且可以进一步提高被该TCR修饰的细胞对Her2/neu抗原的特异性。

所述α链恒定区编码序列可以包含一个或多个二硫键的编码序列，并且/或者所述β链恒定区编码序列可以包含一个或多个二硫键的编码序列。

在具体的实施方案中，所述α链编码序列如SEQ ID NOs:12、13或14所示，所述β链编码序列如SEQ ID NOs:15、16或17所示。

其中，对于编码序列如SEQ ID NO:12所示的α链，其序列为原始的人源序列；对于编码序列如SEQ ID NO:13所示的α链，其在恒定区修饰有1个二硫键；对于编码序列如SEQID NO:14所示的α链，其恒定区替换为鼠源恒定区。

其中，对于编码序列如SEQ ID NO:15所示的β链，其序列为原始的人源序列；对于编码序列如SEQ ID NO:16所示的β链，其在恒定区修饰有1个二硫键；对于编码序列如SEQID NO:17所示的β链，其恒定区替换为鼠源恒定区。

在一个具体实施方案中，所述TCR的α链的编码序列如SEQ ID NO:12所示，β链的编码序列如SEQ ID NO:15所示。在另一个具体实施方案中，所述TCR的α链的编码序列如SEQID NO:13所示，β链的编码序列如SEQ ID NO:16所示。在又一个具体实施方案中，所述TCR的α链的编码序列如SEQ ID NO:14所示，β链的编码序列如SEQ ID NO:17所示。

在另外的实施方案中，所述α链编码序列和所述β链编码序列之间由可切割性连接多肽的编码序列连接，这样可以增加TCR在细胞内的表达。术语“可切割性连接多肽”是指该多肽起到连接作用，并且可以被特定的酶切割，或者编码此多肽的核酸序列通过核糖体跳跃方式(ribosome skipping)进行翻译，从而使被其连接的多肽彼此分离。可切割性连接多肽的例子是本领域已知的，例如F2A多肽，F2A多肽序列包括但不限于来自微小核糖核酸病毒的F2A多肽、以及来自其它病毒相似的2A类序列。另外，可切割性连接多肽也包括可被Furin酶切割的标准的四氨基酸基序(canonical four amino acid motif)，即R-X-[KR]-R氨基酸序列。该实施方案所编码的TCR为单链嵌合T细胞受体，该单链嵌合T细胞受体表达完成后，连接α链和β链的可切割性连接多肽会被细胞中的特定酶切割，从而形成等量游离的α链和β链。

组成单链嵌合TCR的α链和β链也可如上文所述，恒定区(及其相应的编码序列)全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换，并且/或者修饰有(编码)一个或多个二硫键。

在具体的实施方案中，所述核酸的序列如SEQ ID NOs:18、19、或20所示。

优选地，对所述核酸的核苷酸序列进行编码子优化以增加基因表达、蛋白翻译效率以及蛋白表达，从而增强TCR识别抗原的能力。编码子优化包括但不限于翻译启动区域的修饰、改变mRNA结构片段、以及使用编码同一氨基酸的不同密码子。

在其它的实施方案中，可以对上述TCR编码核酸的序列进行突变，包括去除、插入和/或置换一个或多个氨基酸密码子，使得所表达的TCR识别Her2/neu抗原的功能不变或者增强。例如，在一个实施方案中，进行保守氨基酸置换，包括对上述TCRα链和/或β链的可变区中的一个氨基酸用结构和/或化学属性相似的另一个氨基酸进行置换。术语“相似的氨基酸”是指具有相似的极性、电负荷、可溶性、疏水性、亲水性等属性的氨基酸残基。突变后的TCR仍具有识别上述被靶细胞提呈的Her2/neu抗原多肽的生物活性。在另一个实施方案中，进行TCR成熟性(TCR maturation)修饰，即，包括对上述TCRα链和/或β链的可变区中的互补决定区2(CDR2)和/或CDR3区域的氨基酸进行去除、插入和/或置换，从而改变TCR结合Her2/neu抗原的亲和性。

本发明还提供了一种分离的、由根据本发明所述的DNA转录的mRNA。

本发明还提供了一种重组表达载体，其含有与启动子有效连接的根据本发明所述的核酸(例如DNA)，和/或其互补序列。

优选地，在所述重组表达载体中，本发明所述的DNA合适地与启动子、增强子、终止子和/或polyA信号序列有效连接。

本发明的重组表达载体的上述作用元件的组合能够促进DNA的转录和翻译，并增强mRNA的稳定性。

重组表达载体的基本骨架可以是任何已知的表达载体，包括质粒或病毒，病毒载体包括但不限于(例如)逆转录病毒载体(病毒原型为莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV))和慢病毒载体(病毒原型为人类免疫缺陷I型病毒(HIV))。表达本发明所述TCR的重组载体可以通过本领域常规的重组DNA技术来获得。

在一个实施方案中，重组表达载体上的α链和β链基因的表达可以由两个不同的启动子所驱动，启动子包括各种已知的类型，例如强表达的、弱表达的、持续表达的、可诱导的、组织特异性的、和分化特异性的启动子。启动子可以是病毒来源的或者非病毒来源的(例如真核细胞启动子)，例如CMV启动子、MSCV的LTR上的启动子、EF1-α启动子、和PGK-1启动子、SV40启动子、Ubc启动子、CAG启动子、TRE启动子、CaMKIIa启动子、人β肌动蛋白启动子。两个启动子的驱动方向可以是同向也可以是反向的。

在另一个实施方案中，重组表达载体上的α链和β链基因的表达可以由同一个启动子所驱动，例如编码单链嵌合T细胞受体的情况，α链的核苷酸序列和β链的核苷酸序列由Furin-F2A多肽编码序列相连接。

在另一些实施方案中，重组表达载体除了包含α链和β链基因外，还可以包含其它功能分子的编码序列。一个实施方案包括表达自发荧光蛋白(如GFP或其它荧光蛋白)以用于体内追踪成像。另一个实施方案包括表达可诱导的自杀基因系统，例如诱导表达单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)蛋白，或者诱导表达Caspase 9(iCasp9)蛋白。表达这些“安全转换分子”(safety-switch)可以增加经本发明所述TCR基因修饰的细胞在体内使用的安全性(参见文献“Front.Pharmacol.,2014；5：1-8)。另一个实施方案包括表达人趋化因子受体基因，例如CCR2，这些趋化因子受体可结合肿瘤组织中高表达的相应趋化因子配体，从而可以增加经本发明所述TCR基因修饰的细胞在肿瘤组织中的归巢。

本发明还提供了一种T细胞受体修饰的细胞，该细胞的表面被本发明所述的T细胞受体修饰，其中所述细胞包括原始T细胞或其前体细胞，NKT细胞，或T细胞株。

所述“T细胞受体修饰”中的“修饰”是指，通过基因转染使细胞表达有本发明所述的T细胞受体，即，所述T细胞受体通过跨膜区锚定在所修饰的细胞的细胞膜上，并具有识别抗原多肽/MHC复合物的功能。

本发明还提供了一种制备根据本发明所述的T细胞受体修饰的细胞的方法，包括以下步骤：

1)提供细胞；

2)提供编码本发明T细胞受体的核酸；

3)将所述核酸转染入所述细胞中。

步骤1)所述的细胞可以来源于哺乳动物，包括人、犬、小鼠、大鼠及其转基因动物。所述细胞可以来自自体或异体。异体细胞包括来自同卵双胞胎的细胞、异体干细胞、经基因改造的异体T细胞。

步骤1)所述的细胞包括原始T细胞或其前体细胞、NKT细胞、或T细胞株。术语“原始T细胞(naive T cell)”是指外周血中尚未被相应抗原活化的成熟T细胞。这些细胞可以通过本领域已知的方法分离得到。例如，T细胞可以从不同组织器官获得，包括外周血、骨髓、淋巴组织、脾脏、脐带血、肿瘤组织。一个实施方案中，T细胞可以来自造血干细胞(HSCs)，包括来自骨髓、外周血或者脐带血，通过干细胞标记分子例如CD34而分离获得。一个实施方案中，T细胞可以来自诱导性多功能干细胞(iPS cells)，包括把特定基因或特定基因产物导入体细胞，使该体细胞转化为干细胞后，体外诱导分化成T细胞或其前体细胞。T细胞可以通过常用方法如密度梯度离心法而获得，密度梯度离心法的例子包括Ficoll或者Percoll密度离心。一个实施方案是利用血浆分离置换法(apheresis)或白细胞去除法(leukapheresis)从外周血获得富集的T细胞的产物。一个实施方案是用抗体标记特定细胞群后，通过磁珠分离的方式(如系统(Miltenyi Biotec))、或流式细胞分离的方式获得富集的CD8⁺或CD4⁺T细胞。

优选地，所述T细胞前体细胞为造血干细胞。可以将本发明所述TCR的编码基因直接引入造血干细胞，然后转输到体内，进一步分化成为成熟T细胞；也可以将编码基因引入在体外特定条件下由造血干细胞分化成熟的T细胞中。

所述细胞可以被重悬于冻存溶液里置于液氮中保存。常用冻存溶液包括但不限包含20％DMSO和80％人血清白蛋白的PBS溶液。细胞以每分钟降低温度1℃的条件冻存于-80℃，然后保存于液氮罐的气相部分。其它冻存方法是把置于冻存液的细胞直接放入-80℃或液氮中进行冻存。

步骤2)所述的核酸为根据本发明所述的核酸，包括所述DNA和RNA。

所述转染包括物理方式、生物方式和化学方式。物理方式是通过磷酸钙沉淀、脂质体、微注射、电穿孔、基因枪等途径把TCR基因以DNA或RNA的形式导入细胞内。目前已有商业化的仪器，包括电转移仪(例如Amaxa Nucleofector-II(德国Amaxa Biosystems公司)、ECM830(BTX)(美国Harvard Instruments)、Gene Pulser II(美国BioRad公司)、Multiporator(德国Eppendort公司)。生物方式是通过DNA或RNA载体把TCR基因引入细胞内，逆转录病毒载体(例如γ逆转录病毒载体)是转染并插入外源基因片段到动物细胞(包括人细胞)的常用工具，其它病毒载体来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒以及腺病毒相关病毒等。化学方式是把多核苷酸引入细胞内，包括胶态分散系统，比如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、微珠、微团和脂质体。无论以什么方式把TCR基因引入细胞，要用各种检测方法分析目的基因是否引入靶细胞内，所述检测方法包括常见的分子生物学方法(例如Southern印迹和Northern印迹、RT-PCR和PCR等)，或者常见的生物化学方法(例如ELISA和Western印迹)，以及本发明所提及的方法。

优选地，所述转染通过逆转录病毒载体或慢病毒载体进行。

转染后所述细胞的培养可以根据实际应用通过其各自的常规方法和条件进行。例如，T细胞通过表面的TCR/CD3复合体，以及辅助刺激分子(如CD28)共同激活后，可获得体外扩增。激活TCR、CD3和CD28的刺激物(如抗TCR、CD3或CD28的抗体)可以吸附在培养容器表面，或者共培养物(比如磁珠)表面，也可以直接加入细胞培养液中共同培养。另一个实施方案是将T细胞与滋养细胞共同培养，所述滋养细胞表达辅助刺激分子或者相应的配体，包括但不限于HLA-A2、β2-微球蛋白、CD40、CD83、CD86、CD127、4-1BB。

依照通常的哺乳动物细胞体外培养的方法，T细胞培在适当培养条件下进行培养和扩增。例如，细胞达到70％以上融合状态(confluence)时可进行传代，一般2到3天换新鲜培养液。当细胞达到一定数目时直接使用，或按上述描述进行冻存。体外培养的时间可以是24小时之内，也可以长达14天或更长。冻存细胞解冻后可进行下一步应用。

在一个实施方案中，细胞可以在体外培养数小时到14天，或者之间任何小时数。T细胞培养条件包括使用基础培养液，包括但不限于RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo。其它细胞生存和增殖所需要的条件包括但不限于使用血清(人或胎牛血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TGF-β和TNF-a，其它培养添加物(包括氨基酸、丙酮酸钠、维生素C、2-巯基乙醇、生长激素、生长因子)。细胞可置于适当的培养条件，例如，温度可处于37℃、32℃、30℃或者室温，并且空气条件可为(例如)含5％CO₂的空气。

本发明还提供了根据本发明所述的T细胞受体修饰的细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

所述肿瘤和/或癌症是抗原Her2/neu阳性的，并且是HLA-A2阳性的，包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、肠癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、皮肤癌、肺癌、骨癌以及脑癌。

本发明还提供了根据本发明所述的T细胞受体修饰的细胞在制备用于检测宿主的肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

在本发明的一个实施方案中，可将从宿主取出的肿瘤和/或癌症细胞的样本与本发明所述的T细胞受体修饰的细胞以一定浓度进行接触，根据二者的反应程度可以判断所述肿瘤和/或癌症是HLA-A2阳性的还是HLA-A2阴性的，以及是否表达抗原Her2/neu。

本发明还提供了一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据本发明所述的T细胞受体修饰的细胞，及可药用辅料。

所述药物组合物优选包含每个患者每个疗程总剂量范围为1×10³-1×10⁹个细胞/Kg体重的所述T细胞受体修饰的细胞，包括两个端点之间的任何数量的细胞。优选的是，每个疗程1-3天，每天施用1-3次。可以根据实际情况和需要对患者进行一个或多个疗程的治疗。

所述可药用辅料包括药用或生理载体、赋形剂、稀释剂(包括生理盐水、PBS溶液)、以及各种添加剂，包括糖类、脂类、多肽、氨基酸、抗氧化剂、佐剂、保鲜剂等。

所述药物组合物可通过合适的给药途径给药，其适于经动脉、静脉、皮下、皮内、瘤内、淋巴管内、淋巴结内、蛛网膜下腔内、骨髓内、肌肉内和腹膜内给药。

本发明还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的T细胞受体修饰的细胞。

所述T细胞受体修饰的细胞的施用剂量优选为每个患者每个疗程总剂量范围为1×10³-1×10⁹个细胞/Kg体重。优选的是，每个疗程1-3天，每天施用1-3次。可以根据实际情况和需要对患者进行一个或多个疗程的治疗。

所述T细胞受体修饰的细胞可通过合适的给药途径给药，其适于经动脉、静脉、皮下、皮内、瘤内、淋巴管内、淋巴结内、蛛网膜下腔内、骨髓内、肌肉内和腹膜内给药。

所述T细胞受体修饰的细胞进入治疗对象体内后可以消除表达Her2/neu抗原的肿瘤细胞，和/或改变肿瘤组织的微环境而诱发其它抗肿瘤免疫反应。

所述治疗肿瘤和/或癌症的方法还包括对肿瘤和/或癌症患者施用其它用于治疗肿瘤的药物，和/或用于调节患者免疫系统的药物，以增强所述T细胞受体修饰的细胞在体内的数量和功能。

所述其它用于治疗肿瘤的药物包括但不限于，化疗药物，例如环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)；放疗；免疫抑制剂，例如环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯(mycophenolate)、FK50；抗体，例如抗CD3、IL-2、IL-6、IL-17、TNFα的抗体。

本发明还提供了所述分离的T细胞受体用于检测接受该TCR修饰的T细胞(即TCR-T细胞)治疗的患者体内的该TCR-T细胞的增殖或生存情况的应用，从而进行药物代谢研究，和了解该TCR-T细胞的疗效和毒性。具体而言，TCR序列可作为引物，通过PCR方法检测体内携带此TCR的TCR-T细胞的数量。与荧光标记的HLA/多肽复合物多聚体染色后用流式细胞法进行分析的方法相比，所述应用所需要的细胞量少，也更敏感。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

例子

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。

材料和方法

细胞株：用于制备慢病毒颗粒的细胞株为293T细胞(ATCC CRL-3216)。用于提呈抗原多肽的提呈细胞株为T2细胞(174xCEM.T2，ATCC CRL-1992)。用于检测功能的肿瘤细胞株为人结直肠癌colo205细胞(ATCC CCL-222)、HT-29细胞(HTB-38)和HCT116细胞(ATCC CCL-247)、人乳腺癌MDA-MB-231细胞(ATCC HTB-26)和MCF7细胞(ATCCHTB-22)、人卵巢癌SKOV3细胞(ATCC HTB-77)、人胰腺癌PANC-1细胞(ATCCCRL-1469)、人神经胶质细胞瘤U87MG细胞(ATCC HTB-14)、人肝细胞癌HepG2细胞(ATCC HB-8065)、人非小细胞肺癌NCI-H460细胞(ATCC HTB177)和小细胞肺癌NCI-H446细胞(ATCC HTB-171)。细胞株用RPMI-1640完全培养基(Lonza，cat#12-115F)维持培养，RPMI-1640完全培养基中加入10％小牛血清FBS(ATCC30-2020)，2mmol/L L-谷氨酸，100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

外周血：试验所用健康供者的人外周血制品均来自位于旧金山的Pacific血液中心(#1PBMC和#2PBMC分别为来自Apheresis法收集试剂盒的Trima残留细胞组分#R32334和#R33941)。

台盼蓝染色法计数：将细胞用PBS洗后，用胰蛋白酶消化，细胞悬浮在PBS中，加入终浓度为0.04％(w/v)的台盼蓝染液，显微镜下计数，死细胞会染成浅蓝色，活细胞拒染。取活细胞数为最终数据。

体外诱导Her2/neu 369-377特异性杀伤T细胞(CTL)：外周血经Ficoll-PaquePremium(Sigma-Alorich公司，cat#GE-17-5442-02)密度梯度离心(×400g)30分钟后获得单个核细胞(PBMC)。首先用荧光素FITC标记的抗HLA-A2抗体(Biolegend公司，cat#343303)染色检测细胞的HLA-A2表型，流式细胞分析(流式细胞仪为MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec公司)，用Flowjo软件(Flowjo公司)进行结果分析)后提取阳性细胞的RNA，逆转录为cDNA并克隆到载体上，之后进行HLA基因测序分析，确定细胞配型为HLA-A*0201。HLA-A2阳性的PBMC细胞培养在24-孔培养板的培养孔，培养液为上述RPMI-1640完全培养基。每孔2×10e6/ml PBMC，加入Her2/neu 369-377多肽(Her2-E75，用Peptide2.0合成，10μg/ml溶于DMSO)，终浓度为1μg/ml。置于5％CO₂、37℃条件下的培养箱培养16-24小时后加入以下终浓度的细胞因子：人IL-2(Peprtech公司，cat#200-02)100IU/ml，人IL-7(Peprotech公司，cat#200-07)5ng/ml，人IL-15(Peprotech公司，cat#200-15)5ng/ml。培养10到14天，对培养的T细胞进行抗原再刺激：在24-孔板中每孔加入10e6个上述所得的培养细胞，同时加入2×10e6个经25μg/ml丝裂霉素C(Santa Cruz Biotechnology公司，cat#SC-3514)处理2小时的HLA-A2阳性的PBMC细胞作为滋养细胞，每孔加入终浓度为1μg/ml的Her2/neu 369-377多肽，培养过夜后加入IL-2 100IU/ml，IL-7 5ng/ml，IL-15 5ng/ml(终浓度)。经两轮上述抗原刺激和再刺激后，收集扩增的T细胞进行表型分析以及T细胞克隆。

流式细胞分析及单细胞分离：表达Her2/neu 369-377特异性TCR的T细胞表型是通过流式细胞来分析的。收集被检测的细胞置于1.5ml管(细胞数目约为10e5个)，用1ml DPBS溶液(2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，136.9mM NaCl,8.9mM Na₂HPO₄·7H₂O，pH 7.4)洗一遍，并重置于100μl含有1％小牛血清的DPBS中，加入5μl荧光素APC标记的抗人CD8抗体(Biolegend公司，cat#300912)，以及10μl荧光素PE标记的Her2-E75/HLA-A2四聚体(Her2-E75四聚体，MBL International Co公司，cat#T01014)或者Her2-E75/HLA-A2五聚体(Her2-E75五聚体，Proimmune公司，cat#F214-2A-D)，冰上孵育30分钟后用DPBS溶液洗两遍，重悬于100μl PBS溶液(8mM Na₂HPO₄、136mM NaCl、2mM KH₂PO₄、2.6mM KCl，pH7.2-7.4)进行流式细胞分析。流式细胞仪为MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec公司)，用Flowjo软件(Flowjo公司)进行结果分析。T细胞克隆是利用流式细胞分离仪(FACS sorter)进行单细胞分离后培养获得。对Her2/neu369-377多肽抗原刺激过的PBMC用APC标记的抗人CD8抗体和PE标记的Her2-E75/HLA-A2五聚体染色，然后进行流式细胞分离(型号：Sony cell sorter SH800)。单个CD8⁺Her2-E75/HLA-A2五聚体⁺细胞被分选到96-孔培养板的单个培养孔后，加入经25μg/ml丝裂霉素C处理2小时的HLA-A2阳性的PBMC细胞，每孔10e5个细胞，加入1μg/ml Her2/neu369-377多肽培养过夜后，加入含有IL-2 100IU/ml、IL-7 5ng/ml、IL-15 5ng/ml的RPMI-1640完全培养液。每3-4天换新鲜含有所述细胞因子的培养液，显微镜下观察是否有T细胞克隆生长。收集增殖的T细胞，按上述方法进行抗原再刺激以获得足够数量的细胞，进行表型或功能检测，以及提取RNA进行TCR基因的克隆。

T细胞功能检测：为了检测转染TCR基因的T细胞识别抗原表位多肽的能力，在96-孔板的每孔中加入10e5个转染TCR基因的T细胞以及10e5个T2细胞，在100μl/每孔RPMI-1640完全培养基中进行混合培养，各试验组为复孔。再加入不同终浓度(分别为1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml、0.001μg/ml和0.0001μg/ml)的Her2/neu 369-377多肽后置于5％CO₂、37℃条件下的孵育箱过夜培养。为了确定所述TCR识别表位抗原的关键氨基酸位点，在96-孔板的每孔中加入10e5个转染TCR基因的T细胞以及10e5个T2细胞，再加入终浓度为0.1μg/ml的待测表位多肽后置于5％CO₂、37℃条件下的孵育箱过夜培养。24小时后收集收集上清，用人IFN-γELISA Read-set-Go试剂盒(eBioscience公司，cat#88-7316)或人IFN-γDuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems cat#DY285B)，按照厂家说明书，对上清中的IFN-γ进行检测。

为了检测转染TCR基因的T细胞识别肿瘤细胞株的能力，根据不同效靶比在96-孔板的每孔中加入一定数量的转染TCR基因的PBMC细胞和肿瘤细胞作为靶细胞，培养24小时后，收集上清检测上清中分泌的γ干扰素。各试验组为复孔或三孔。抗体功能阻断试验中，细胞培养孔中同时加入10μg/ml终浓度的抗人CD8抗体(Biolegend公司，cat#300912)，细胞置于5％CO₂、37℃条件下的孵育箱过夜培养。18-24小时收集细胞上清，并用人IFN-γELISARead-set-Go试剂盒(eBioscience公司，cat#88-7316)或人IFN-γDuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems cat#DY285B)，按照厂家说明书，对上清中的IFN-γ进行检测。

为了检测转染TCR基因的T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，在24-孔培养板中每孔加入靶细胞1×10e4培养24小时使靶细胞完全贴壁,去除悬浮细胞，根据设定的效靶比加入一定数量的转染TCR基因的T细胞。培养24小时后，去除悬浮细胞，并用胰酶消化收集贴壁细胞进行台盼蓝染色计数活细胞。杀伤率(Cytotoxicity)％＝(初始靶细胞的活细胞数-培养终止时的靶细胞的活细胞数)/初始靶细胞的活细胞数×100。各实验组为复孔或三孔，差异显著性用学生t-检验分析。或者用MTT方法检测杀伤活性。

MTT方法说明：

胰酶消化对数生长期细胞，终止后离心收集，吹散均匀，制备单细胞悬液；用细胞培养液将细胞浓度调整至0.1～10×104/ml(根据不同细胞生长状况调整接种细胞数)，接种于96孔细胞培养板，培养体系为100μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱培养过夜，使细胞完全贴壁，第二天达到70～80％；计数方式用计数板计数，同时用countstar计数仪来验证计数的正确性。取出96孔板，加入100μl预先配制的T细胞和TCR-T细胞悬液，加样前轻微涡旋，空白对照孔加100μl的相应细胞培养的无血清培养基；置于37℃，5％CO₂培养箱分别培养24小时；于24h后取细胞，离心400g，10min后吸取180μl培养基放入新的96孔板中，留样用于后面ELISA检测上清IFN-γ水平，检测步骤可参照检测说明书。注：上清可冻存-80℃用于后续检测。每孔加入新的100μl完全培养基，每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4～6h；设立效应细胞对照组，在加入MTT 4小时后，300g离心5分钟，将染上MTT的效应细胞离心至板底以后，再弃去上清，再加入DMSO检测。每孔加入150μl DMSO，置摇床上低速震荡10分钟，使结晶物充分溶解，在酶标仪上检测其在490nm处的吸光值。

获得单克隆TCR基因：利用Zymo Quick-RNA Microprep试剂盒(Zymo Research公司，cat#R1050)从T细胞克隆提纯总RNA，以此为模板利用Smarter RACE 5’/3’试剂盒获得cDNA(美国Takara Bio公司，cat#634858)。用5’-CDS引物和TCRβ链3’引物5’-GCCTCTGGAATCCTTTCTCTTG-3’(SEQ ID NO:24)以及α链3’引物5’-TCAGCTGGACCACAGCCGCAG-3’(SEQ ID NO:25)进行PCR，扩增出TCRα和β全序列基因片段，并分别克隆到pRACE载体(美国Takara Bio，cat#634858)上。转化感受态细菌Stellar(美国Takara Bio公司，cat#636763)并获得质粒后进行测序。

重组TCR慢病毒表达载体的制备：用于表达TCR的病毒载体为复制缺陷型慢病毒载体，包括：表达GFP的慢病毒载体pCDH-EF1α-MCS-(PGK-GFP)，可购自System Biosciences公司(Cat#CD811A-1)；以及不表达GFP的载体pCDH-EF1α-MCS，通过采用本领域常规技术去除pCDH-EF1α-MCS-(PGK-GFP)载体上的PGK启动子及GFP基因而得到。根据所获得的TCR基因序列，合成TCRβ链和α链以及之间可切割的F2A序列和Furin酶切片段的全基因序列，并链接到所述载体的EF-1α启动子下游的多克隆位点，插入TCR的转录顺序依次为TCRβ链(无终止密码子)，Furin酶切片段，F2A片段，TCRα链(方法参见文献“Gene Ther.2008Nov；15(21):1411–1423”)。表达GFP的载体是被反向的PGK启动子驱动的。不表达GFP的载体则是去除了PGK启动子以及GFP片段。

重组TCR慢病毒颗粒的制备：TCR慢病毒颗粒是通过Lipofectaine 2000转染试剂(invitrogen，#11668019)转染293T/293FT细胞而获得的。依照厂家说明书准备293T/293FT细胞以及转染流程。转染在6孔培养板进行，首先用Opti-MEM 1培养液(Thermo Fisher公司，cat#51985091)制备转染质粒的脂质体混合溶液，依照厂家说明在250μl培养液中加入lipofectaine2000试剂6μl、以及TCR慢病毒载体质粒0.8μg和pCDH系统的病毒包装质粒1.8μg(SBI公司，cat#LV500A-1)，混合孵育25分钟后加入293T/293FT细胞培养孔。5％CO₂、37℃条件下培养16小时，换不含FBS的DMEM培养液(Thermo Fisher公司，cat#11965092)，继续培养24小时和48小时后分别收集细胞上清，2000g离心10min后，用0.4μm过滤膜过滤后得到的病毒上清使用慢病毒浓缩液(GeneCopoeiaTM#LPR-LCS-01)按厂家说明书浓缩后用于感染细胞。

重组TCR慢病毒转染人T细胞：冻存的原代PBMC细胞解冻后在RPMI-1640完全培养液中培养24小时，经Ficoll-Paque Premium密度梯度离心(×400g)30分钟去除死细胞，置于用2μg/ml抗人CD3抗体(Biolegend公司，OKT3克隆cat#317303)和2μg/ml抗人CD28抗体(Biolegend公司，cat#302914)处理(其中每孔加入100μl含有上述CD3抗体和CD28抗体的DPBS溶液)24小时的24孔板培养孔中，细胞浓度为2×10e6/ml，也可以用Dynabead人T-CD3/CD8磁珠(Thermo Fisher公司，cat#11131D)，按照厂家说明书对PBMC细胞进行刺激活化。培养24小时后收集细胞，加入100μl浓缩后TCR慢病毒颗粒(3×10^8Tu/ml)中置于24孔板的孔中，用含有IL-2100IU/ml、IL-7 5ng/ml、IL-15 5ng/ml的RPMI-1640完全培养液或X-VIVO15(Lonza#04-418Q)继续培养，每3天换新鲜含有上述细胞因子的培养液。也可以使用RestroNectin预处理的培养板(Takara公司，cat#T110A)，按照厂家说明书用病毒感染活化的PBMC细胞。一般72小时后可进行表型和功能检测。转染T细胞株也依照上述步骤进行，如果病毒载体上带有GFP标记，一般转染后48小时即可在荧光显微镜下观察到GFP阳性细胞。

实施例1：从HLA-A2阳性的正常供体外周血诱导Her2/neu 369-377多肽(Her2-E75表位多肽)特异性杀伤T细胞

本实施例用1μg/ml的低浓度Her2/neu 369-377多肽经过两轮体外刺激从HLA-A2阳性的正常PBMC(#2)中诱导出多肽特异性杀伤T细胞，并进行流式细胞分析及单细胞分离。具体方法如上文所述。结果如下：

图1A右图显示，0.024％的淋巴细胞为可结合Her2/neu 369-377/HLA-A2五聚体(即Her2-E75五聚体)的CD8阳性杀伤性T细胞，左图中没有经Her2多肽刺激的对照细胞没有出现CD8阳性五聚体阳性细胞。结果说明在自然T细胞库中，识别Her2/neu 369-377抗原多肽的特异性T细胞数量很少。尽管数量少，这群可识别Her2/neu 369-377多肽的T细胞仍可被清晰地区分出来。另外根据结合Her2-E75五聚体的荧光强度，阳性细胞中又包含高亲和性T细胞和低亲和性T细胞。通过流式细胞分离出300个CD8阳性五聚体阳性细胞后进行单克隆培养，经过两轮抗原多肽再刺激以及细胞因子扩增，从这300个分离出的单个T细胞中获得一个增殖的T细胞克隆Her2CTL克隆6A5(称为Her2CTL 6A5)。图1B右图显示97.9％的CD8⁺CTL细胞可结合Her2/neu 369-377/HLA-A2四聚体(即Her2-E75四聚体)，显示此纯化的T细胞克隆没有混杂其他无关细胞。左图为不能结合Her2-E75四聚体的对照T细胞。

实施例2：Her2/neu 369-377多肽特异性TCR全序列的获得

本实施例直接从由实施例1得到的一定数量的Her2 CTL 6A5细胞提纯总RNA，通过5’-RACE RT-PCR的方法获得配对的TCRα链和β链基因序列(即，两条链可共同组成识别抗原多肽的功能性TCR)，其编码的TCR称为“Her2 TCR-6A5”。该TCR的α链的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示，编码序列如SEQ ID NO:12所示，并且该TCR的β链的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码序列如SEQ ID NO:15所示。此TCR存在于HLA-A2阳性正常人的外周T细胞库中，不会对微量表达Her2/neu蛋白的正常细胞产生交叉反应而导致自身免疫反应。为了检测所获TCR的抗原特异性及其功能，TCRα链和β链序列被克隆到复制缺陷型慢病毒表达载体中。图1C显示所构建的TCR慢病毒载体结构片段示意图。TCRα链和β链的恒定区由人源序列替换为鼠源序列，并由可切割性连接多肽连接。6A5 TCRα链和β链的表达由EF-1α启动子所驱动。此启动子属于真核细胞中高表达启动子，而且不会受到甲基化等因素的影响而导致功能丧失，适于外源基因在体内的长期表达。TCRα链和β链之间由F2A多肽序列所连接，TCRα链和β链基因可同时被转录，通过核糖体跳跃方式(ribosome skipping)进行翻译，从而使TCRα链和β链多肽彼此分离。这样保证了TCRα链和β链表达量的一致性，从而更有效率的组成TCR二聚体。TCRα链和β链之间还链有furin酶切位点，用于去除β链羧基端的多余肽段。

将由可切割性连接多肽链接的、恒定区由人源序列替换为鼠源序列的TCRβ链和α链的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)(对应的TCR为Her2 TCR-6A5-mC，氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示)连接至上述载体，以得到Her2 TCR-6A5-mC重组慢病毒载体。Her2TCR-6A5-mC基因片段通过PCR扩增后，克隆到上述慢病毒载体(即pCDH-EF1α-MCS)的EF1-启动子下游：携带鼠源恒定区序列的Her2TCR-6A5-mC的β片段是由5’引物5’-AGAGCTAGCGAATTCAACATGGGCTGCAGGCTGCTC-3’(SEQ ID NO:26)和3’引物5’-GGATCGCTTGGCACGTGAATTCTTTCTTTTGACCATAGCCAT-3’(SEQ ID NO:27)扩增而得；携带鼠源恒定区序列的Her2TCR-6A5-mC的α基因是由5’引物5’-TCCAACCCTGGGCCCATGCTCCTGTTGCTCATACCAGTG-3’(SEQ ID NO:28)和3’引物5’-GTTGATTGTCGACGCCCTCAACTGGACCACAGCCT-3’(SEQ ID NO:29)扩增而得。PCR使用Q5高保真PCR试剂盒(NEB,cat#M0543S)，反应条件为：98℃30秒后，进行25个循环：98℃10秒，65℃10秒，以及72℃3分钟。获得的TCR片段克隆到pCDH-EF1α-MCS载体的EF1α启动子下游的MCS区域。

将构建得到的重组TCR慢病毒表达载体按前述方法制备得到各自的重组TCR慢病毒颗粒。

实施例3：正常外周血T细胞经Her2 TCR-6A5-mC重组慢病毒转染后表达可识别Her2/neu 369-377多肽的特异性TCR。

为了进一步验证本发明所获得的TCR能否在原代T细胞表达并具有识别Her2/neu抗原多肽的功能，用携带Her2 TCR-6A5-mC基因的重组慢病毒颗粒(Her2 TCR-6A5-mC重组慢病毒载体)转染经CD3/CD28抗体活化的、来自两个不同正常供体的外周血T细胞，14天后收集细胞进行Her2-E75四聚体染色。具体方法如上文所述。结果如下：

图2A显示，两个供体外周血单个核细胞(分别为#1PBMC和#2PBMC)中均有淋巴细胞可以结合Her2-E75四聚体，说明这些细胞表达的Her2 TCR-6A5-mC可以特异性识别被HLA-A2提呈的Her2/neu抗原多肽。结果还显示，Her2-E75四聚体阳性细胞(即表达Her2 TCR-6A5-mC)中，CD8⁺T杀伤细胞的阳性率和CD8^-淋巴细胞的阳性率相近。CD8^-的淋巴细胞很可能是CD4⁺的T辅助细胞，如果慢病毒感染CD8⁺和CD4⁺T细胞的转染效率一样，说明CD4⁺细胞上的外源Her2/neu 369-377特异性TCR能有效结合Her2-E75四聚体。这也进一步说明转染的Her2 TCR-6A5-mC不需要CD8分子的辅助功能也能有效结合Her2/HLA-A2复合物，即Her2TCR-6A5-mC识别被HLA-A2提呈的Her2/neu 369-377表位多肽是CD8非依赖型。表达Her2TCR-6A5-mC TCR的CD4细胞识别Her2抗原后分泌细胞因子，不仅以可辅助杀伤T细胞的功能及在体内的存活时间，也可以通过调节肿瘤微环境来诱导针对内源性肿瘤抗原的特异性T细胞，从而增强抗肿瘤免疫。

在96-孔板的每孔中加入10e5个转染TCR的PBMC细胞，与不同浓度被T2细胞(每孔1×10e5个)提呈的Her2/neu 369-377抗原多肽(Her2/neu 369-377抗原多肽从0.1μg/ml开始进行10倍稀释，从而得到终浓度为0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml和0.0001μg/ml的不同组)混合培养后，检测上清中T细胞分泌的IFN-γ，用以确定此表达TCR的PBMC细胞特异性识别Her2/neu 369-377多肽的功能。图2B显示，表达Her2 TCR-6A5-mC的PBMC可以被T2细胞提呈的Her2/neu 369-377抗原多肽所激活而分泌IFN-γ，说明表达外源Her2TCR-6A5-mC的原代T细胞可以特异性识别被HLA-A2分子提呈的Her2/neu 369-377多肽。识别抗原多肽的能力与外源TCR在T细胞上的表达量相关。两个不同供体PBMC转染Her2 TCR-6A5-mC后识别抗原多肽的最大半反应(half-maximum reaction，EC50)多肽浓度经曲线拟合推算分别为约1.6ng/ml和2.9ng/ml(IC50Tool程序，http://www.ic50.tk/)。尽管此反应敏感度低于识别病毒抗原等外源抗原的高亲和性TCR的EC50(EC50约10e-10M)(参见文献“CANCERRESEARCH 1998,58.4902-4908”和“HUMAN GENE THERAPY 2014,25:730–739”)，但仍处于可识别常见肿瘤相关抗原的中高TCR亲和力范围之内(如文献“Eur J Immunol(2012)42:3174–9”所述)。

图2C显示T细胞与T2细胞提呈的抗原多肽(T2+Her2-E75，即Her2/neu 369-377多肽)共培养时加入抗人CD8抗体后，T细胞分泌IFN-γ的功能没有被显著抑制。这说明外源TCR识别Her2/neu369-377抗原多肽的功能不需要CD8分子的辅助作用，也显示本发明所述的Her2 TCR-6A5-mC TCR的识别功能是非CD8功能依赖型。

实施例4：正常外周血T细胞经Her2 TCR-6A5-mC重组慢病毒转染后表达的Her2/neu 369-377多肽特异性TCR可识别HLA-A2⁺Her2/neu⁺肿瘤细胞

首先检测所选肿瘤细胞株表达HLA-A2和Her2/neu的情况。肿瘤细胞株包括结直肠癌Colo205和HCT116、乳腺癌MDB-MB-231和MCF-7、胰腺癌PANC-1、神经胶质瘤U87MG以及小细胞肺癌NCI-H446。肿瘤细胞经抗HLA-A2抗体(BD Bioscences,cat#561341)以及抗人CD340(erbB2)抗体(Biolegend,cat#324406)染色后进行流式细胞分析。图3A结果显示，colo205,MDB-MB-231、MCF-7、HCT116、PANC-1均为HLA-A2⁺Her/neu⁺；U87MG为HLA-A2⁺，Her2/neu^-；NCI-H446的HLA-A2和Her2/neu均为阴性。这些肿瘤细胞株不仅来源于不同组织，所表达的HLA-A2和Her2/neu也各异，其中U87MG和NCI-H446细胞可作为Her2 TCR-6A5-mC T细胞功能检测的阴性对照。

在96-孔板的每孔中加入1×10e4个肿瘤细胞后，根据效靶比(5:1)在96-孔板的每孔中加入一定数量的转染Her2 TCR-6A5-mC TCR的PBMC细胞或没有转染Her2 TCR-6A5-mCTCR的PBMC细胞作为对照组。效靶比为5:1。T细胞与不同肿瘤细胞株混合培养，之后检测上清液中分泌的IFN-γ。具体方法如上文所述。结果如下：

图3B显示，表达Her2 TCR-6A5-mC的T细胞均可被HLA-A2⁺Her2/neu⁺的肿瘤细胞株所激活并分泌IFN-γ，肿瘤细胞株包括结肠癌Colo205和HCT116、乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7、胰腺癌PANC-1。而对照组HLA-A2⁺Her2/neu^-的神经胶质瘤U87MG、以及HLA-A2^-Her2/neu^-的肺癌NCI-H446却不能激活转染Her2 TCR-6A5-mC的T细胞，说明Her2 TCR-6A5-mC TCR可以特异性识别肿瘤细胞表面被HLA-A2提呈的Her2/neu抗原。来源同一供体PBMC、平行培养但没有转染Her2 TCR-6A5-mC的对照组T细胞不能被所列肿瘤细胞株所激活，说明对肿瘤细胞的反应不是非特异性的。结果也显示，Her2 TCR-6A5-mC T细胞识别HLA-A2提呈的Her2/neu抗原的能力与肿瘤细胞表面HLA-A2和Her2/neu分子的表达量不太相关。不同肿瘤细胞可能存在对T细胞不同的抑制作用，另一方面，细胞表面的表达量不一定反映出Her2/neu总的表达量，某些肿瘤细胞表达的Her2/neu主要存在于细胞胞浆内，这些抗原更容易被HLA-A2所提呈(参见文献“J Immunol 2006；177:5088-5097”)。

在培养板中每孔加入靶细胞1×10e4,根据设定的效靶比(1:1、5:1、10:1、20:1、40:1)加入一定数量的转染TCR基因的PBMC细胞，24小时后测定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。图3C-K显示，与没有转染TCR的对照T细胞相比，表达Her2 TCR-6A5-mC TCR的T细胞可以特异性识别和杀伤HLA-A2⁺Her2/neu⁺的肿瘤细胞株MCF-7，HCT116，PANC-1和HEPG-2。杀伤能力与Her2 TCR-6A5-mC T细胞的数量呈量效关系。而对照组HLA-A2⁺Her2/neu^-的神经胶质瘤U87MG、HLA-A2-Her2/neu+的SKOV3和HT-29以及HLA-A2^-Her2/neu^-的肺癌NCI-H446却不能被Her2 TCR-6A5-mC T细胞特异性杀伤。结果显也示，当Her2 TCR-6A5-mC T细胞增加到一定数量时，对HLA-A2⁺Her2/neu⁺的肿瘤细胞表现出显著的特异性识别和杀伤功能，当效靶比低于10：1时，特异性杀伤功能并不明显，可能与肿瘤细胞表面被HLA-A2所提呈的Her2/neu表位多肽的数量有关。为了进一步增强Her2 TCR-6A5-mC T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤敏感性，一个策略是增加肿瘤靶细胞表达HLA-A2和Her2/neu的数量。

实施例5：正常外周血T细胞经Her2 TCR-6A5-mC重组慢病毒转染后表达的Her2/neu 369-377多肽特异性TCR不识别可结合HLA-A2分子的来自人正常蛋白的具有潜在交叉反应的表位多肽。

所述Her2 TCR-6A5-mC TCR来源于健康供体外周血的T细胞，由于所述TCR存在于外周血的正常T细胞(T cell repertoire)，通常情况下不会识别正常组织的自身蛋白而产生脱靶毒性反应。为了进一步提高临床使用表达所述TCR的T细胞的安全性，本实施例首先通过抗原表位多肽的比对筛选(alanine scanning)来确定与Her2TCR-6A5-mC TCR识别功能相关的氨基酸关键位点(motif)。把Her2-E75多肽KIFGSLAFL上每一个氨基酸各自分别用丙氨酸替代，以进行单突变。由于Her2-E75多肽的第七个氨基酸本身是丙氨酸，因此单突变时用甘氨酸替代。合成所形成的新表位多肽，并检测这些多肽是否能激活表达Her2 TCR-6A5-mC TCR的T细胞。由于丙氨酸保持多肽链二级结构的基本骨架，又拥有较小的残基侧链，因此可以确定被其所置换的特定残基对多肽生物活性所起的作用，对于抗原表位多肽，可以确定与Her2 TCR-6A5-mC TCR识别功能相关的氨基酸关键位点。所形成的9个新表位多肽(终浓度为0.1μg/ml)分别与T2细胞以及转染有编码Her2 TCR-6A5-mC TCR基因的慢病毒载体的#2PBMC混合培养24小时后，取细胞上清进行IFN-γ检测的ELISA分析。效靶比E:T为5:1。图4A结果显示，Her2-E75多肽第1、2、3、4、5、6、8、9位的氨基酸残基各自被丙氨酸替换后或第7位的丙氨酸被甘氨酸替换后，分别形成的新表位多肽激活Her2 TCR-6A5-mC TCR分泌干扰素的能力各不同。与Her2-E75相比，第1位赖氨酸残基被替换后，抗原表位多肽激活Her2 TCR-6A5-mC TCR的能力有所增强，当第7位的丙氨酸被甘氨酸所替换，第8位的苯丙氨酸和第9位的亮氨酸被丙氨酸所替换后，表位多肽激活Her2 TCR-6A5-mC TCR的能力有所降低，然而当第2位的异亮氨酸，第3位的苯丙氨酸，第4位的甘氨酸，第5位的丝氨酸和第6位的亮氨酸被丙氨酸替换后，抗原表位多肽激活Her2 TCR-6A5-mC TCR的能力明显降低。结果说明第2、3、4、5、6位氨基酸残基对于Her2 TCR-6A5-mC TCR的识别功能至关重要，这些位点的氨基酸侧链可能形成表位多肽结合HLA-A2分子的锚定位点或者是TCR特异性识别的结合位点，改变这些位点的氨基酸残基将导致多肽失去被Her2 TCR-6A5-mC TCR所识别的抗原特异性，而其他位点的氨基酸残基对Her2 TCR-6A5-mC TCR识别功能的贡献相对较小。因此，包含第2位的异亮氨酸、第3位的苯丙氨酸、第4位的甘氨酸、第5位的丝氨酸和第6位的亮氨酸残基的正常人蛋白质，都有可能被Her2 TCR-6A5-mC TCR所识别而产生交叉反应。为了获得所有包含上述关键氨基酸残基位点的人正常蛋白，用“X-I-F-G-S-L-X-X-X”序列搜索人正常蛋白数据库(https://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/PSScan.cgi)，其中“X”可以是21个常见氨基酸中的任何一个。共13个不同的人正常蛋白序列中包含-2I-3F-4G-5S-6L-序列，表1示出蛋白名称、包含-2I-3F-4G-5S-6L-序列的抗原表位位置和抗原表位序列。这些多肽若要成为被Her2 TCR-6A5-mC TCR所识别的抗原表位多肽，首先要能够结合HLA-A2，通过HLA/多肽结合预测软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)可以预测多肽与HLA-A2的结合能力。表1还示出预测的多肽与HLA-A2的亲和性，以及多肽结合HLA-A2的亲和性在已知的与HLA-A2结合的天然表位多肽的亲和性中的排序。“亲和性(nM)“是指该表位多肽与HLA-A2的亲和性预测。“％排序”是指该表位多肽结合HLA-A2的亲和性在已知的和HLA-A2结合的天然表位多肽的亲和性排序，数目越小亲和性越高。“结合水平”是预测该表位多肽结合HLA-A2的能力。“SB”(强结合)是指所述多肽与HLA-A2具有高度亲和性，通常％排序<0.5设定为强亲和，0.5<％排序<2设定为弱亲和，％排序>2设定为不结合。通常亲和性<50nM，％排序<0.5被认为多肽与HLA-A2结合是高亲和性的。结果显示，和Her2/neu369-377多肽一样，NSMA3 93-101多肽、O11A1 103-111多肽和SV2C 687-695多肽均包含-2I-3F-4G-5S-6L-序列，并且可能为高亲和性结合HLA-A2的所预测的表位多肽。为了检测上述来源于人正常蛋白、包含-2I-3F-4G-5S-6L-序列并高亲和性结合HLA-A2分子的潜在表位多肽是否能被Her2 TCR-1B5-mC TCR所识别，检测表达Her2 TCR-1B5-mC的T细胞是否能被T2细胞所提呈的表位多肽激活并分泌γ干扰素。转染有编码Her2 TCR-6A5-mC TCR基因的慢病毒载体的#2PBMC与提呈不同浓度梯度所述多肽的T2细胞混合培养24小时，取细胞上清进行IFN-γ的ELISA分析。图4B示出经Her2 TCR-6A5-mC TCR基因转染的外周血单个核细胞(PBMC)与T2细胞提呈的不同浓度的表位多肽混合培养后检查上清中分泌IFN-γ的结果。结果示出，除了Her2/neu 369-377多肽外，其他3个所预测的抗原表位多肽均不能激活Her2TCR-1B5-mC T细胞，说明所预测的来源于人正常蛋白的表位多肽均不能被Her2 TCR-1B5-mC TCR所识别，从而降低了Her2 TCR-6A5-mC TCR识别正常蛋白而产生脱靶副反应的风险。

表1

讨论

不同肿瘤细胞株对特异性T细胞的反应敏感性差异可能与肿瘤细胞表达不同水平Her2/neu抗原多肽/HLA-A2复合体有关，也可能与肿瘤细胞本身对T细胞功能的不同抑制作用有关。尽管特异性识别Her2/neu 369-377多肽的高亲和性TCR可以通过Her2/neu 369-377多肽体外诱导而获得，但这些高亲和性TCR往往不能识别肿瘤细胞所提呈的Her2/neu抗原(Cancer Res.1998；58:4902–4908.Cancer Immunol.Immunother.2008；57:271–280)。一个原因可能是外源Her2/neu 369-377多肽结合HLA-A2分子的构型与细胞内所提呈的多肽/HLA复合物的构型有所不同(参见文献“Journal of Immunology,2008,180:8135–8145”)。另一个可能原因为，Her2/neu 369-377多肽作为模拟表位(mimotope)抗原，所诱导的特异性TCR既可识别Her2/neu 369-377多肽，也可识别被肿瘤细胞提呈的相似多肽，例如Her2/neu 373-382多肽(参见文献“J Immunol.2013 Jan 1；190(1):479–488”)，然而高亲和性TCR虽然对HLA-A2提呈的Her2/neu 369-377多肽具有高亲和力，却不能有效识别相应的被肿瘤细胞提呈的模拟表位多肽而杀伤肿瘤细胞。本发明所述的特异性识别Her2/neu 369-377多肽的TCR能够靶向肿瘤细胞所提呈的Her2/neu 369-377多肽而特异性识别和杀伤肿瘤细胞。

由于识别自身抗原的高亲和性T细胞大多被中枢耐受机制所清除，外周T细胞库中自然存在的可以识别Her2/neu抗原的TCR大多为中低亲和性。另外一个可以识别肿瘤细胞的CD8功能非依赖型的高亲和性TCR是来自经Her2/neu 373-382多肽特异性T细胞群的多个α链和β链进行配对后，通过功能检测筛选而出(参见文献“HUMAN GENE THERAPY 2024，25:730–739”；WO/2016/133779)。由于不是从特异性的单克隆T细胞直接获得，不能确定此TCR是否存在于外周自然T细胞库。一般认为，高亲和性T细胞的过继转输治疗的疗效要优于靶向同一抗原的低亲和性T细胞(参见文献“Clin Exp Immunol(2015)180:255–70”)。然而，高亲和性TCR本身容易产生识别自身抗原的自身免疫性反应(参见文献“Blood(2009)114:535–46”)，没有经过中枢耐受机制筛选的TCR也会识别抗原低表达的正常组织，或者针对其它类似的自身抗原表位产生交叉反应的脱靶毒性(参见文献“Sci Transl Med(2013)5:197ra103.Blood(2013)122:863–71”)。选择高亲和性TCR的另一个原因是这些TCR的功能不依赖CD8的辅助功能，因而可以通过转染CD4⁺T细胞而获得对CD8⁺杀伤T细胞功能的辅助作用。本发明所述的TCR识别Her2/neu 369-377多肽属于中到高亲和性，而且TCR的功能不依赖CD8的辅助功能，因而适合用于过继转输治疗中T细胞的修饰。本发明所述TCR不能识别通过比对筛选方法和计算机辅助预测软件所获得的来源于正常蛋白的所有潜在的表位多肽，从而进一步避免了针对正常蛋白的潜在的交叉反应风险。

总之，本发明提供了一种从HLA-A2⁺的自体外周T细胞库中诱导而来的Her2/neu369-377多肽特异性TCRα链和β链全序列，经转染后表达此TCR及恒定区被修饰的TCR的原代杀伤性T细胞可以识别多种HLA-A2⁺Her2/neu⁺的肿瘤细胞。为开发和临床应用过继转输经特异性TCR修饰的T细胞来治疗肿瘤提供了新的方法和途径。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州康万达医药科技有限公司

合成免疫股份有限公司（Synimmune, Inc.）

<120> 一种分离的T细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸及其应用

<130> FI-183580-59:52/C

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Leu Gly Met Ile Phe Ala Leu Arg

1 5 10 15

Asp Ala Arg Ala Gln Ser Val Ser Gln His Asn His His Val Ile Leu

20 25 30

Ser Glu Ala Ala Ser Leu Glu Leu Gly Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly

35 40 45

Thr Val Asn Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Gln His Leu Gln

50 55 60

Leu Leu Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val Lys Gly Ile Lys

65 70 75 80

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100 105 110

Asn Asp Asn Asp Tyr Lys Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr

115 120 125

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130

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met

20 25 30

Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Leu Gly His

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Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu

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Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu Asn Asn Ser Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser His Leu Phe Leu His

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Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

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<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

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1 5

<210> 4

<211> 272

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

Met Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Leu Gly Met Ile Phe Ala Leu Arg

1 5 10 15

Asp Ala Arg Ala Gln Ser Val Ser Gln His Asn His His Val Ile Leu

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Ser Glu Ala Ala Ser Leu Glu Leu Gly Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly

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Leu Leu Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val Lys Gly Ile Lys

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225 230 235 240

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<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

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<210> 7

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<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 7

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225 230 235 240

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln

260 265 270

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

275 280 285

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

290 295 300

Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 8

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met

20 25 30

Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Leu Gly His

35 40 45

Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu

50 55 60

Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu Asn Asn Ser Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser His Leu Phe Leu His

85 90 95

Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Gln Glu Ala Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

130 135 140

Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

145 150 155 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

165 170 175

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp

180 185 190

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

195 200 205

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

210 215 220

Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

225 230 235 240

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln

260 265 270

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

275 280 285

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

290 295 300

Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 9

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met

20 25 30

Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Leu Gly His

35 40 45

Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu

50 55 60

Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu Asn Asn Ser Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser His Leu Phe Leu His

85 90 95

Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Gln Glu Ala Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val

130 135 140

Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala

145 150 155 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu

165 170 175

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

180 185 190

Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg

195 200 205

Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg

210 215 220

Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu

225 230 235 240

Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly

245 250 255

Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu

260 265 270

Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr

275 280 285

Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys

290 295 300

Asn Ser

305

<210> 10

<211> 396

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 10

atgctcctgt tgctcatacc agtgctgggg atgatttttg ccctgagaga tgccagagcc 60

cagtctgtga gccagcataa ccaccacgta attctctctg aagcagcctc actggagttg 120

ggatgcaact attcctatgg tggaactgtt aatctcttct ggtatgtcca gtaccctggt 180

caacaccttc agcttctcct caagtacttt tcaggggatc cactggttaa aggcatcaag 240

ggctttgagg ctgaatttat aaagagtaaa ttctccttta atctgaggaa accctctgtg 300

cagtggagtg acacagctga gtacttctgt gccgtgaatg ataacgacta caagctcagc 360

tttggagccg gaaccacagt aactgtaaga gcaaac 396

<210> 11

<211> 399

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 11

atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcggt ccccatggaa 60

acgggagtta cgcagacacc aagacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120

aaatgtgaac aacatctggg tcataacgct atgtattggt acaagcaaag tgctaagaag 180

ccactggagc tcatgtttgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 240

agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat tccttcacct acacaccctg 300

cagccagaag actcggccct gtatctctgc gccagcagcc aagaagccgg ttcctacaat 360

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgcta 399

<210> 12

<211> 819

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 12

atgctcctgt tgctcatacc agtgctgggg atgatttttg ccctgagaga tgccagagcc 60

cagtctgtga gccagcataa ccaccacgta attctctctg aagcagcctc actggagttg 120

ggatgcaact attcctatgg tggaactgtt aatctcttct ggtatgtcca gtaccctggt 180

caacaccttc agcttctcct caagtacttt tcaggggatc cactggttaa aggcatcaag 240

ggctttgagg ctgaatttat aaagagtaaa ttctccttta atctgaggaa accctctgtg 300

cagtggagtg acacagctga gtacttctgt gccgtgaatg ataacgacta caagctcagc 360

tttggagccg gaaccacagt aactgtaaga gcaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480

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ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660

agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720

ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780

tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagctga 819

<210> 13

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

atgctcctgt tgctcatacc agtgctgggg atgatttttg ccctgagaga tgccagagcc 60

cagtctgtga gccagcataa ccaccacgta attctctctg aagcagcctc actggagttg 120

ggatgcaact attcctatgg tggaactgtt aatctcttct ggtatgtcca gtaccctggt 180

caacaccttc agcttctcct caagtacttt tcaggggatc cactggttaa aggcatcaag 240

ggctttgagg ctgaatttat aaagagtaaa ttctccttta atctgaggaa accctctgtg 300

cagtggagtg acacagctga gtacttctgt gccgtgaatg ataacgacta caagctcagc 360

tttggagccg gaaccacagt aactgtaaga gcaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480

tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaatgcgtg 540

ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660

agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720

ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780

tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagctga 819

<210> 14

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

atgctcctgt tgctcatacc agtgctgggg atgatttttg ccctgagaga tgccagagcc 60

cagtctgtga gccagcataa ccaccacgta attctctctg aagcagcctc actggagttg 120

ggatgcaact attcctatgg tggaactgtt aatctcttct ggtatgtcca gtaccctggt 180

caacaccttc agcttctcct caagtacttt tcaggggatc cactggttaa aggcatcaag 240

ggctttgagg ctgaatttat aaagagtaaa ttctccttta atctgaggaa accctctgtg 300

cagtggagtg acacagctga gtacttctgt gccgtgaatg ataacgacta caagctcagc 360

tttggagccg gaaccacagt aactgtaaga gcaaacatcc agaacccaga acctgctgtg 420

taccagttaa aagatcctcg gtctcaggac agcaccctct gcctgttcac cgactttgac 480

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ctggacatga aagctatgga ttccaagagc aatggggcca ttgcctggag caaccagaca 600

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ccctgtgatg ccacgttgac cgagaaaagc tttgaaacag atatgaacct aaactttcaa 720

aacctgtcag ttatgggact ccgaatcctc ctgctgaaag tagcgggatt taacctgctc 780

atgacgctga ggctgtggtc cagttga 807

<210> 15

<211> 939

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 15

atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcggt ccccatggaa 60

acgggagtta cgcagacacc aagacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120

aaatgtgaac aacatctggg tcataacgct atgtattggt acaagcaaag tgctaagaag 180

ccactggagc tcatgtttgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 240

agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat tccttcacct acacaccctg 300

cagccagaag actcggccct gtatctctgc gccagcagcc aagaagccgg ttcctacaat 360

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag aggacctgaa aaacgtgttc 420

ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480

acactggtat gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540

aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600

gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660

cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720

gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780

agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840

ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900

ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggctaa 939

<210> 16

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcggt ccccatggaa 60

acgggagtta cgcagacacc aagacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120

aaatgtgaac aacatctggg tcataacgct atgtattggt acaagcaaag tgctaagaag 180

ccactggagc tcatgtttgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 240

agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat tccttcacct acacaccctg 300

cagccagaag actcggccct gtatctctgc gccagcagcc aagaagccgg ttcctacaat 360

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag aggacctgaa aaacgtgttc 420

ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480

acactggtat gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540

aatgggaagg aggtgcacag tggggtctgc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600

gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660

cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720

gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780

agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840

ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900

ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggctaa 939

<210> 17

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcggt ccccatggaa 60

acgggagtta cgcagacacc aagacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120

aaatgtgaac aacatctggg tcataacgct atgtattggt acaagcaaag tgctaagaag 180

ccactggagc tcatgtttgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 240

agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat tccttcacct acacaccctg 300

cagccagaag actcggccct gtatctctgc gccagcagcc aagaagccgg ttcctacaat 360

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag aggatctgag aaatgtgact 420

ccacccaagg tctccttgtt tgagccatca aaagcagaga ttgcaaacaa acaaaaggct 480

accctcgtgt gcttggccag gggcttcttc cctgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540

aatggcaagg aggtccacag tggggtcagc acggaccctc aggcctacaa ggagagcaat 600

tatagctact gcctgagcag ccgcctgagg gtctctgcta ccttctggca caatcctcgc 660

aaccacttcc gctgccaagt gcagttccat gggctttcag aggaggacaa gtggccagag 720

ggctcaccca aacctgtcac acagaacatc agtgcagagg cctggggccg agcagactgt 780

gggattacct cagcatccta tcaacaaggg gtcttgtctg ccaccatcct ctatgagatc 840

ctgctaggga aagccaccct gtatgctgtg cttgtcagta cactggtggt gatggctatg 900

gtcaaaagaa agaattcata a 921

<210> 18

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcggt ccccatggaa 60

acgggagtta cgcagacacc aagacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120

aaatgtgaac aacatctggg tcataacgct atgtattggt acaagcaaag tgctaagaag 180

ccactggagc tcatgtttgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 240

agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat tccttcacct acacaccctg 300

cagccagaag actcggccct gtatctctgc gccagcagcc aagaagccgg ttcctacaat 360

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag aggacctgaa aaacgtgttc 420

ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480

acactggtat gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540

aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600

gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660

cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720

gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780

agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840

ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900

ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggccgtg ccaagcgatc cggaagcgga 960

gcccctgtaa agcagacttt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtcgagtcc 1020

aaccctgggc ccatgctcct gttgctcata ccagtgctgg ggatgatttt tgccctgaga 1080

gatgccagag cccagtctgt gagccagcat aaccaccacg taattctctc tgaagcagcc 1140

tcactggagt tgggatgcaa ctattcctat ggtggaactg ttaatctctt ctggtatgtc 1200

cagtaccctg gtcaacacct tcagcttctc ctcaagtact tttcagggga tccactggtt 1260

aaaggcatca agggctttga ggctgaattt ataaagagta aattctcctt taatctgagg 1320

aaaccctctg tgcagtggag tgacacagct gagtacttct gtgccgtgaa tgataacgac 1380

tacaagctca gctttggagc cggaaccaca gtaactgtaa gagcaaatat ccagaaccct 1440

gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 1500

accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 1560

gacaaaaccg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 1620

agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 1680

accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 1740

acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 1800

aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 1851

<210> 19

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 19

atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcggt ccccatggaa 60

acgggagtta cgcagacacc aagacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120

aaatgtgaac aacatctggg tcataacgct atgtattggt acaagcaaag tgctaagaag 180

ccactggagc tcatgtttgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 240

agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat tccttcacct acacaccctg 300

cagccagaag actcggccct gtatctctgc gccagcagcc aagaagccgg ttcctacaat 360

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag aggacctgaa aaacgtgttc 420

ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480

acactggtat gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540

aatgggaagg aggtgcacag tggggtctgc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600

gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660

cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720

gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780

agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840

ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900

ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggccgtg ccaagcgatc cggaagcgga 960

gcccctgtaa agcagacttt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtcgagtcc 1020

aaccctgggc ccatgctcct gttgctcata ccagtgctgg ggatgatttt tgccctgaga 1080

gatgccagag cccagtctgt gagccagcat aaccaccacg taattctctc tgaagcagcc 1140

tcactggagt tgggatgcaa ctattcctat ggtggaactg ttaatctctt ctggtatgtc 1200

cagtaccctg gtcaacacct tcagcttctc ctcaagtact tttcagggga tccactggtt 1260

aaaggcatca agggctttga ggctgaattt ataaagagta aattctcctt taatctgagg 1320

aaaccctctg tgcagtggag tgacacagct gagtacttct gtgccgtgaa tgataacgac 1380

tacaagctca gctttggagc cggaaccaca gtaactgtaa gagcaaatat ccagaaccct 1440

gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 1500

accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 1560

gacaaatgcg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 1620

agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 1680

accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 1740

acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 1800

aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 1851

<210> 20

<211> 1821

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 20

atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcggt ccccatggaa 60

acgggagtta cgcagacacc aagacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120

aaatgtgaac aacatctggg tcataacgct atgtattggt acaagcaaag tgctaagaag 180

ccactggagc tcatgtttgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 240

agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat tccttcacct acacaccctg 300

cagccagaag actcggccct gtatctctgc gccagcagcc aagaagccgg ttcctacaat 360

gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag aggatctgag aaatgtgact 420

ccacccaagg tctccttgtt tgagccatca aaagcagaga ttgcaaacaa acaaaaggct 480

accctcgtgt gcttggccag gggcttcttc cctgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540

aatggcaagg aggtccacag tggggtcagc acggaccctc aggcctacaa ggagagcaat 600

tatagctact gcctgagcag ccgcctgagg gtctctgcta ccttctggca caatcctcgc 660

aaccacttcc gctgccaagt gcagttccat gggctttcag aggaggacaa gtggccagag 720

ggctcaccca aacctgtcac acagaacatc agtgcagagg cctggggccg agcagactgt 780

gggattacct cagcatccta tcaacaaggg gtcttgtctg ccaccatcct ctatgagatc 840

ctgctaggga aagccaccct gtatgctgtg cttgtcagta cactggtggt gatggctatg 900

gtcaaaagaa agaattcacg tgccaagcga tccggaagcg gagcccctgt aaagcagact 960

ttgaattttg accttctcaa gttggcggga gacgtcgagt ccaaccctgg gcccatgctc 1020

ctgttgctca taccagtgct ggggatgatt tttgccctga gagatgccag agcccagtct 1080

gtgagccagc ataaccacca cgtaattctc tctgaagcag cctcactgga gttgggatgc 1140

aactattcct atggtggaac tgttaatctc ttctggtatg tccagtaccc tggtcaacac 1200

cttcagcttc tcctcaagta cttttcaggg gatccactgg ttaaaggcat caagggcttt 1260

gaggctgaat ttataaagag taaattctcc tttaatctga ggaaaccctc tgtgcagtgg 1320

agtgacacag ctgagtactt ctgtgccgtg aatgataacg actacaagct cagctttgga 1380

gccggaacca cagtaactgt aagagcaaac atccagaacc cagaacctgc tgtgtaccag 1440

ttaaaagatc ctcggtctca ggacagcacc ctctgcctgt tcaccgactt tgactcccaa 1500

atcaatgtgc cgaaaaccat ggaatctgga acgttcatca ctgacaaaac tgtgctggac 1560

atgaaagcta tggattccaa gagcaatggg gccattgcct ggagcaacca gacaagcttc 1620

acctgccaag atatcttcaa agagaccaac gccacctacc ccagttcaga cgttccctgt 1680

gatgccacgt tgaccgagaa aagctttgaa acagatatga acctaaactt tcaaaacctg 1740

tcagttatgg gactccgaat cctcctgctg aaagtagcgg gatttaacct gctcatgacg 1800

ctgaggctgt ggtccagttg a 1821

<210> 21

<211> 1255

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 21

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr

1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly

1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu

1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser

1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu

1085 1090 1095

Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser

1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val

1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu

1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala

1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 22

Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp

1 5 10

<210> 23

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 23

Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg His Leu Val Met

20 25 30

Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Leu Gly His

35 40 45

Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu

50 55 60

Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu Asn Asn Ser Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser His Leu Phe Leu His

85 90 95

Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Gln Glu Ala Gly Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val

130 135 140

Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala

145 150 155 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu

165 170 175

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

180 185 190

Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg

195 200 205

Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg

210 215 220

Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu

225 230 235 240

Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly

245 250 255

Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu

260 265 270

Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr

275 280 285

Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys

290 295 300

Asn Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr

305 310 315 320

Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

325 330 335

Gly Pro Met Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Leu Gly Met Ile Phe Ala

340 345 350

Leu Arg Asp Ala Arg Ala Gln Ser Val Ser Gln His Asn His His Val

355 360 365

Ile Leu Ser Glu Ala Ala Ser Leu Glu Leu Gly Cys Asn Tyr Ser Tyr

370 375 380

Gly Gly Thr Val Asn Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Gln His

385 390 395 400

Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val Lys Gly

405 410 415

Ile Lys Gly Phe Glu Ala Glu Phe Ile Lys Ser Lys Phe Ser Phe Asn

420 425 430

Leu Arg Lys Pro Ser Val Gln Trp Ser Asp Thr Ala Glu Tyr Phe Cys

435 440 445

Ala Val Asn Asp Asn Asp Tyr Lys Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr Thr

450 455 460

Val Thr Val Arg Ala Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln

465 470 475 480

Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp

485 490 495

Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe

500 505 510

Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser

515 520 525

Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp

530 535 540

Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys

545 550 555 560

Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn

565 570 575

Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val

580 585 590

Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

595 600 605

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 24

gcctctggaa tcctttctct tg 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 25

tcagctggac cacagccgca g 21

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 26

agagctagcg aattcaacat gggctgcagg ctgctc 36

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 27

ggatcgcttg gcacgtgaat tctttctttt gaccatagcc at 42

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 28

tccaaccctg ggcccatgct cctgttgctc ataccagtg 39

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 29

gttgattgtc gacgccctca actggaccac agcct 35

Claims

1.一种分离的T细胞受体，包括α链和β链，所述α链和β链均包含可变区和恒定区，其特征在于，所述T细胞受体能够特异性识别肿瘤细胞所表达的抗原Her2/neu，并且所述α链的所述可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述β链的所述可变区的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其中所述的T细胞受体能够特异性识别被HLA-A2分子所提呈的所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽。

3.根据权利要求2所述的T细胞受体，其中所述抗原表位多肽包括如SEQ ID NO:3所示的Her2/neu 369-377。

4.根据权利要求1所述的T细胞受体，其中所述α链的所述恒定区和/或所述β链的所述恒定区来源于人。

5.根据权利要求4所述的T细胞受体，其中所述α链的所述恒定区全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换，并且/或者所述β链的所述恒定区全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换。

6.根据权利要求5所述的T细胞受体，其中所述其它物种为小鼠。

7.根据权利要求1所述的T细胞受体，其中所述α链的所述恒定区修饰有一个或多个二硫键，并且/或者所述β链的所述恒定区修饰有一个或多个二硫键。

8.根据权利要求1所述的T细胞受体，其中所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NOs:4、5或6所示，所述β链的氨基酸序列如SEQ ID NOs:7、8或9所示。

9.一种分离的、编码T细胞受体的核酸，包含所述T细胞受体的α链和β链的编码序列，所述α链编码序列和β链编码序列均包含可变区编码序列和恒定区编码序列，其特征在于，所述T细胞受体能够特异性识别肿瘤细胞表达的抗原Her2/neu，并且所述α链可变区编码序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述β链可变区编码序列编码的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

10.根据权利要求9所述的核酸，其中所述核酸为DNA或RNA。

11.根据权利要求9所述的核酸，其中所述α链可变区编码序列如SEQ ID NO:10所示，所述β链可变区编码序列如SEQ ID NO:11所示。

12.根据权利要求9所述的核酸，其中被所述核酸编码的所述T细胞受体能够特异性识别被HLA-A2分子所提呈的所述抗原Her2/neu的抗原表位多肽。

13.根据权利要求12所述的核酸，其中所述抗原表位多肽包括如SEQ ID NO:3所示的Her2/neu 369-377。

14.根据权利要求9所述的核酸，其中所述α链恒定区编码序列和/或所述β链恒定区编码序列来源于人。

15.根据权利要求14所述的核酸，其中所述α链恒定区编码序列全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换，并且/或者所述β链恒定区编码序列全部或部分地被来源于其它物种的同源序列所替换。

16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述其它物种为小鼠。

17.根据权利要求9所述的核酸，其中所述α链恒定区编码序列包含一个或多个二硫键编码序列，并且/或者所述β链恒定区编码序列包含一个或多个二硫键编码序列。

18.根据权利要求9所述的核酸，其中所述α链编码序列如SEQ ID NOs:12、13或14所示，所述β链编码序列如SEQ ID NOs:15、16或17所示。

19.根据权利要求9-18中任一项所述的核酸，其中所述α链编码序列和所述β链编码序列之间由可切割性连接多肽的编码序列连接。

20.根据权利要求19所述的核酸，其序列如SEQ ID NOs:18、19、或20所示。

21.一种重组表达载体，其含有与启动子有效连接的、根据权利要求9-20中任一项所述的核酸，和/或其互补序列。

22.一种T细胞受体修饰的细胞，该细胞的表面被权利要求1-8中任一项所述的T细胞受体修饰，其中所述细胞包括原始T细胞或其前体细胞，NKT细胞，或T细胞株。

23.一种制备根据权利要求22所述的T细胞受体修饰的细胞的方法，包括以下步骤：

1)提供细胞；

2)提供编码根据权利要求1-8中任一项所述的T细胞受体的核酸；

3)将所述核酸转染入所述细胞中。

24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤1)所述的细胞来自自体或异体。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述转染的方式包括：采用病毒载体转染的方式、化学方式和物理方式。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病毒载体包括γ逆转录病毒载体或慢病毒载体。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述化学方式包括采用脂质体转染的方式。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述物理方式包括电转染方式。

29.根据权利要求23所述的方法，其中步骤2)所述的核酸为根据权利要求9-20中任一项所述的核酸。

30.根据权利要求22所述的T细胞受体修饰的细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途；其中所述肿瘤和/或癌症是抗原Her2/neu阳性的，并且是HLA-A2阳性的。

31.根据权利要求22所述的T细胞受体修饰的细胞在制备用于检测宿主的肿瘤和/或癌症是否为抗原Her2/neu阳性且HLA-A2阳性的药物中的用途。

32.一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求22所述的T细胞受体修饰的细胞，及可药用辅料。

33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含每个患者每个疗程总剂量范围为1×10³-1×10⁹个细胞/Kg体重的所述T细胞受体修饰的细胞。

34.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述药物组合物适于经动脉、静脉、皮下、皮内、瘤内、淋巴管内、淋巴结内、蛛网膜下腔内、骨髓内、肌肉内或腹膜内给药。