TW201927812A - 醫藥重組受體組成物及方法 - Google Patents

Abstract

本揭露主要為醫藥組成物以及用以治療一種疾病（例如：癌症）的醫藥組成物之製造方法。其中，醫藥組成物是指重組嵌合抗原受體。更明確地，醫藥組成物包含：一種對CD19高專一性的重組嵌合抗原受體蛋白、一種可誘導細胞產生所述重組嵌合抗原受體蛋白之載體以及一群改良哺乳動物細胞包含至少一個前述蛋白、載體或兩者。此外，重組嵌合抗原受體19包含：CD19抗原結合片段、跨膜區域以及訊息區域。而所述CD19抗原結合片段是一個具有特定胺基酸序列的單鏈變異區片段。在另一示例中，所述製造方法為生產用以治療疾病的一群改良哺乳細胞。此外，所述用以治療疾病的改良細胞之製造方法包含：純化一群自體衍生的細胞並且以重組嵌合抗原受體改良所述自體衍生的細胞。

Description

醫藥重組受體組成物及方法

本揭露涉及一種醫藥重組受體組成物。更具體地，是一種包含重組嵌合抗原受體19的醫藥組成物以及其製造方法。

癌症是指一種疾病用以形容細胞的生長以及擴散是不受控制的。而細胞的擴散不受控制時，其最終可能會導致宿主死亡。已有許多研究指出，癌症的成因可歸於外在因子（例如：吸菸、病原體感染、不當飲食等）或內在因子（例如：遺傳基因突變、賀爾蒙、免疫狀態等）。而上述這些因子可能是一起協同作用或獨自作用而導致癌症的發生。然而從一開始疾病的好發到症狀開始顯現，中間所經過的時間往往超過數十年。目前用來治療癌症的方法包含：手術、放射療法、化學療法、賀爾蒙療法、免疫療法以及標靶治療（用藥物干擾或抑制癌細胞的生長）。

白血病（又稱血癌）可以分成四種類別，分別為：急性骨髓性白血病（Acute Myeloblastic Leukemia; AML）、慢性骨髓性白血病（Chronic Myeloblastic Leukemia; CML）、急性淋巴性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia; ALL）、慢性淋巴性白血病（Chronic Lymphoblastic Leukemia; CLL）。而上述這四種不同型態的白血病其主要差異為好發病程速度與好發原位。根據中華民國兒童癌症基金會的報導指出，白血病占幼童罹患癌症中的31%。更進一步，其中所述白血病又有95%是急性白血病。

而依據所罹患白血病的種類不同（例如：AML、CML、ALL、CLL），其所採用的治療方法也不盡相同。而所述治療方法如同前述之化學療法、標靶治療，放射療法、造血幹細胞移植、支持療法等等。然而，往往在治療之後仍會有些許難以偵測的癌細胞殘存。而這些殘存之癌細胞往往又會導致癌症的復發。此外，癌細胞對於傳統化學療法也逐漸產生了抗性。

白血病的治療方法如同前述之化學療法、標靶治療，放射療法、造血幹細胞移植、支持療法等等。但是由於癌症的復發以及癌細胞逐漸產生抗性，因此近年來免疫療法逐漸普遍成為取代傳統化學療法的治療方式。其中一種免疫療法為利用基因改良T細胞來使所述T細胞上具有對癌症細胞抗原具有高度專一性之重組嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors; CARs）。重組嵌合抗原受體是一種以基因工程方式裝載於人類淋巴球細胞上，而用以精準辨識癌細胞之受體。於2011年，首度由美國賓州大學Carl June醫師成功地以帶有重組嵌合抗原受體之T細胞治癒白血病患者，並將其臨床研究成果刊載於「新英格蘭醫學期刊」。（Porter et al., N Engl J Med, 2011; 365:725-733）

近期的研究指出，大多數的癌症目前還未有專一且高度特異性的抗原被發現。但是在B淋巴性白血病中，CD19卻是一個目前被大家公認有效作為目標之抗原。而根據研究指出，CD19只在正常及惡性B淋巴球上表現。（Uckun, et al. Blood, 1988, 71:13-29）並且，某些研究又更進一步指出，可以CD19作為標靶而有效消除B淋巴性白血病。（例如：Salem et al., Indian J Hematol Blood Transfus, 2012, 28(2):89-96以及 Schewe et al., Blood, 2017-01-764316; and Seidel et al., Mol Ther., 2016, 24(9):1634-43）

因此，本揭露的主旨是設計一種有效的醫療重組嵌合抗原受體醫療組成物，並且其具有較小蛋白質和對於CD19抗原具有高度專一性。另外，同時間也提供一種製造方法用以生產上述之醫療重組嵌合抗原受體醫療組成物。

本揭露提供一種重組嵌合抗原受體（CAR）蛋白質，其包括三個部分，分別為CD19抗原結合片段、跨膜區域、訊息區域。其中，所述CD19抗原結合片段是單鏈變異區片段（single-chain variable fragment; scFv），並且其中還包括重鏈變異區片段和輕鏈變異區片段。更進一步地，所述重鏈變異區片段包括第一胺基酸序列，而所述序列選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或上述序列任意之組合；而所述輕鏈變異區片段包括第二胺基酸序列，其選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或上述序列任意之組合。而跨膜區域包括：CD28、IgG1、CD4、CD8α之跨模區域或上述任意之組合。而所述訊息區域則包括免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）、共同刺激分子（CM）或上述任意之組合。

在一些實施例中，其中所述重組嵌合抗原受體中的跨膜區域是CD8α的跨膜區域。

在一些實施例中，其中所述重組嵌合抗原受體中共同刺激分子的數目為至少兩個。

在一些實施例中，其中所述重組嵌合抗原受體中訊息區域上的免疫受體酪氨酸激活基序為CD3 zeta。

在一些實施例中，其中所述重組嵌合抗原受體中訊息區域上的共同刺激分子包括：CD27、CD28、CD30、4-1BB/CD137、OX40、herpesvirus entry mediator （HVEM）或上述任意之組合。

在一些實施例中，其中所述重組嵌合抗原受體中訊息區域上的共同刺激分子包括4-1BB/CD137。

本揭露還提供一種用以表現重組嵌合抗原受體（CAR）之載體（vector），其包括：重組哺乳動物細胞。此外，其中所述重組哺乳動物細胞包括至少一個如前面所述之重組嵌合抗原受體，其包括：CD19抗原結合片段、跨膜區域以及訊息區域。此外，所述CD19抗原結合片段是單鏈變異區片段，並且所述單鏈變異區片段包括重鏈變異區域以及輕鏈變異區域。其中，所述重鏈變異區域包括第一胺基酸序列選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或上述任意之組合，以及所述輕鏈變異區域包括第二胺基酸序列選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或上述任意之組合。跨膜區域包括：CD28、IgG1、CD4、CD8α或上述任意之組合。所述訊息區域包括免疫受體酪氨酸激活基序、共同刺激分子或上述任意之組合。

在一些實施例中，其中所述醫藥組成物中的重組哺乳動物細胞是淋巴球。

在一些實施例中，其中所述醫藥組成物中的淋巴球是T細胞或是NK細胞。

在一些實施例中，其中所述醫藥組成物中的重組哺乳動物細胞是自體衍生的。

本揭露還提供一種製造方法，其用以生產如前面所述之包括重組哺乳動物細胞之醫藥組成物，並且所述重組哺乳動物細胞還包括至少一個重組嵌合抗原受體。更進一步，所述製造方法包括以下步驟：（a）從哺乳動物中分離出週邊血液；（b）從所述週邊血液中分離出淋巴球；（c）以及在所述淋巴球上表現重組嵌合抗原受體。其中，所述淋巴球上的重組嵌合抗原受體包括：CD19抗原結合片段、跨膜區域以及訊息區域。更進一步，所述CD19抗原結合片段是單鏈變異區片段，並且所述單鏈變異區片段包括重鏈變異區域以及輕鏈變異區域。其中，所述重鏈變異區域包括第一胺基酸序列選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或上述任意之組合，以及所述輕鏈變異區域包括第二胺基酸序列選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或上述任意之組合。跨膜區域包括：CD28、IgG1、CD4、CD8α或上述任意之組合。所述訊息區域包括免疫受體酪氨酸激活基序、共同刺激分子或上述任意之組合。

在一些實施例中，在所述製造方法中在淋巴球上表現重組嵌合抗原受體之步驟還包括擴增表現嵌合抗原受體的淋巴球之步驟。

在一些實施例中，所述在所述淋巴球上表現重組嵌合抗原受體之方法包括：磷酸鈣處理法、基因槍注射法、病毒感染法、電穿孔法、顯微注射法和脂質體處理法。

下文詳細討論了本揭露說明中的實施例的製造和使用。然而，應當理解，以下實施例提供了許多可實施的概念，此類概念可能體現在各類具體情況中。以下所討論的具體實施例僅說明了製造和使用實施例的具體方式，且未限制本揭露說明的範圍。

本揭露內容主要有關於一種應用於治療疾病或症狀之醫療組成物及其製造方法，例如癌症但是不限於血液科惡性腫瘤（hematologic malignancies）或實質固體瘤（solid tumors）。更進一步地，本揭露主要關於一種組成物包含重組嵌合抗原受體蛋白、用以表現重組嵌合抗原受體之載體以及具有所述蛋白或載體或兩者的細胞。並且所述重組嵌合抗原受體分子具有如同抗體一樣可對特定抗原有專一性之特性，並且在與所述特並抗原結合後可進一步透過其T細胞受體活化之區域去活化抗腫瘤之細胞免疫反應（cellular immune activity）。

此外，本揭露內容之嵌合抗原受體蛋白主要為一種基因改造後的重組嵌合抗原受體蛋白。並且，所述重組嵌合抗原受體蛋白對於CD19抗原具有高度的專一性。因此，在本揭露內容中所述之重組嵌合抗原受體蛋白即為重組嵌合抗原受體19或抗CD19之重組嵌合抗原受體。

本揭露組成物中所述重組嵌合抗原受體19蛋白基本上包含三個主要區域，且分別位於細胞外區域（extracellular area）、細胞膜區域（cell membrane area）以及細胞內區域（intracellular area）。並且所述三個區域分別為：CD19抗原結合片段、跨膜區域以及訊息區域。一方面，所述CD19抗原結合片段是單鏈變異區片段，因此所述單鏈變異區片段具有一重鏈變異區域、輕鏈變異區域以及連接前述兩者區域之連接序列。此外，所述重鏈變異區域包含第一胺基酸序列，而所述第一胺基酸序列選自SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12。而所述輕鏈變異區域包含第二胺基酸序列，而所述第二胺基酸序列選自SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11。另一方面，所述跨模區域包含：CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模區域。又另一方面，所述訊息區域包含至少一個免疫受體酪氨酸激活基序或至少一個共同刺激分子。

在一些實施例中，本揭露中所述重組嵌合抗原受體19蛋白僅由CD19抗原結合片段、跨膜區域以及訊息區域三個部分所構成。換句話說，所述重組嵌合抗原受體19蛋白只具有上述三個區域而不包含其他任何區域。並且，所述單鏈變異區片段僅只具有一個重鏈變異區域、一個輕鏈變異區域以及一個用連接前述兩者區域之連接序列。同樣地，所述重鏈變異區域中的第一胺基酸序列為選自SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12三者其中一個；而所述輕鏈變異區域中的第二胺基酸序列為選自SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11三者其中一個。另一方面，所述跨模區域也僅只有包含CD28的、IgG1的、CD4的、CD8α的跨模區域中的其中一個。又另一方面，所述訊息區域也僅只包含免疫受體酪氨酸激活基序或共同刺激分子兩者其中一個。

在一些實施例中，所述CD19抗原結合片段上的單鏈變異區片段還包含一連接序列，而所述連接序列選自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16。在另一實施例中，本揭露之組成物中的所述重組嵌合抗原受體19蛋白還包含至少一個連接序列位於兩個蛋白區域之間，並且上兩個蛋白區域指的為單鏈變異區片段以外的其他蛋白區域。而所述連接序列包含一個序列選自SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16。

在一些實施例中，所述CD19抗原結合片段上單鏈變異區片段的數目為至少兩個。換句話說，所述CD19抗原結合片段上有至少兩個單鏈變異區片段。所述重鏈變異區片段上的第一胺基酸序列可為重複序列或任意組合之序列，且上述重複序列或任意組合序列可選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12。並且，所述輕鏈變異區片段上的第二胺基酸序列可為重複序列或任意組合之序列，且上述重複序列或任意組合序列可選自SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11。

在一實施例中，在本揭露組成物中所述重組嵌合抗原受體19上單鏈變異區片段包含一特定第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之組合：SEQ ID NO：8與SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：12 與SEQ ID NO：11。

在一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體19蛋白中所包含的重鏈變異區片段中的第一胺基酸序列是SEQ ID NO：8，而輕鏈變異區片段中的第二胺基酸序列是SEQ ID NO：7。

在一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體19蛋白中的跨膜區域是CD8α的跨膜區域。

在一實施例中，所述重組嵌合抗原受體19蛋白中的訊息區域包含免疫受體酪氨酸激活基序和共同刺激分子兩者。在另一實施例中，所述重組嵌合抗原受體19蛋白中的訊息區域之組合包含至少一個免疫受體酪氨酸激活基序和至少一個共同刺激分子。

在一實施例中，所述重組嵌合抗原受體19蛋白中至少一個免疫受體酪氨酸激活基序為CD3 zeta。

在一實施例中，所述重組嵌合抗原受體19蛋白中的訊息區域上的共同刺激分子包含CD27或CD28或CD30或4-1BB/CD137或OX40或HVEM的共同刺激分子。在一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體19蛋白中的訊息區域上的共同刺激分子是4-1BB/CD137或CD28的共同刺激分子。

本揭露還提供一個表現載體，其用以穩定表現上面所述重組嵌合抗原受體19蛋白。所述重組嵌合抗原受體19表現載體之骨架是選自專門應用於哺乳動物中之載體表現系統。較佳地，所述表現載體是慢病毒載體。並且，所述重組嵌合抗原受體19表現載體包含：CD19抗原結合片段序列、跨膜區域序列、訊息區域序列。一方面，所述CD19抗原結合片段序列還包含：重鏈變異區域、輕鏈變異區域、連接序列之三者核苷酸序列。進一步來說，所述重鏈變異區域之核苷酸序列包含：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6三者其中一個。而所述輕鏈變異區域之核苷酸序列包含：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5，三者其中一個。在另一方面，所述跨模區域序列包含：CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模區域序列。又另一方面，所述訊息區域包含：免疫受體酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列。

在一些實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體由一個骨架序列、一個CD19抗原結合片段序列、一個跨膜區域序列以及一個訊息區域序列。換句話說，所述重組嵌合抗原受體19表現載體僅只包含上述四個核苷酸序列而不包含其他任何核苷酸序列。此外，所述CD19抗原結合片段序列也僅只由三個核苷酸序列所構成。換句話說，所述CD19抗原結合片段序列只有重鏈變異區片段序列、輕鏈變異區片段序列以及連接序列。所述跨模區域序列也僅由一個序列所構成，即CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模區域序列，四者其中一個。所述訊息區域序列也同樣只由一個序列所構成，即免疫受體酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列，兩者其中一個。

在一些實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體包含超過一個（即至少兩個）重鏈變異區片段和輕鏈變異區片段核苷酸序列。換句話說，所述重鏈變異區片段核苷酸序列可為重複序列或任意組合之序列，且上述重複序列或任意組合序列可選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6。並且，所述輕鏈變異區片段核苷酸序列可為重複序列或任意組合之序列，且上述重複序列或任意組合序列可選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5。

在一些實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體包含特定的重鏈變異區片段和輕鏈變異區片段核苷酸序列組合，而所述組合為：SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：1為一組；SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：3為一組；以及SEQ ID NO：6與SEQ ID NO：5為一組。

在一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體中的重鏈變異區片段和輕鏈變異區片段核苷酸序列分別為SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：1。

在一些實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體包含至少兩個跨膜區域序列。因此，所述跨膜區域序列可為重複序列或任意組合之序列，且所述重複序列或任意組合之序列是選自CD28或IgG1或CD4或CD8α的跨模區域序列。

在一些實施例中，所述訊息區域序列可為重複序列或任意組合之免疫受體酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列。換句話說，所述免疫受體酪氨酸激活基序或共同刺激分子序列之數目為至少兩個。

在一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體的跨模區域序列為CD8α的跨模區域序列。

在一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體的訊息區域序列中的免疫受體酪氨酸激活基序是CD3 zeta。

在一些實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體中的共同刺激分子序列包含：CD27的或CD28的或CD30的或4-1BB/CD137的或OX40的或HVEM的共同刺激分子序列。在另一實施例中，所述訊息區域中的共同刺激分子之數目為至少兩個，因此，所述共同刺激分子序列可為重複序列或任意組合之CD27的或CD28的或CD30的或4-1BB/CD137的或OX40的或HVEM的共同刺激分子序列。在一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體19表現載體中的共同刺激分子序列僅只有一個，即4-1BB/CD137或CD28的共同刺激分子序列。

本揭露還提供一個醫藥組成物，包含一群基因改造的細胞，且所述基因改造細胞可以穩定表現至少一個如前面所述具有特定組成之重組嵌合抗原受體19蛋白或表現載體。在另一實施例中，所述醫藥組成物中之基因改造細胞同時具有至少一個如前面所述具有特定組成之重組嵌合抗原受體19蛋白或表現載體。

在另一實施例中，本揭露所提供的一個醫藥組成物，僅只由一群基因改造細胞所組成，而所述基因改造細胞可以穩定表現至少一個如前面所述具有特定組成之重組嵌合抗原受體19蛋白，或是具有至少一個如前面所述具有特定組成之重組嵌合抗原受體19表現載體。換句話說，此醫藥組成物中僅只有所述基因改造細胞而不包含其他醫藥成分（例如：抗癌藥）。更進一步，所述基因改造細胞身上僅只具有重組嵌合抗原受體19蛋白、重組嵌合抗原受體19表現載體或同時包含以上兩者。

在一些實施例中，所述醫藥組成物中之改造細胞為哺乳動物細胞。在另一實施例中，所述醫藥組成物中之改造細胞為淋巴球細胞。更進一步地，在一較佳實施例中，所述醫藥組成物中之改造細胞為帶有CD3之淋巴球細胞（例如：T細胞）。

本揭露更提供一種製造方法，其主要用以製造一種應用於治療疾病或症狀之醫療組成物，而所述疾病或症狀主要特徵為患者大量表現某特定抗原。一方面來說，所述疾病較佳是癌症，例如：慢性淋巴性白血病。在另一方面，所述大量表現之抗原為CD19。而所述之製造方法包括：（a）從至少一個哺乳動物捐贈者中分離出週邊血液；（b）從所述週邊血液中分離出淋巴球；以及（c）藉由所述淋巴球產生如請求項13所述之醫藥組成物。明確來說，所述醫療組成物為一群基因改造淋巴球細胞，並且其身上可表現至少一個如前述之重組嵌合抗原受體19蛋白，或是帶有至少一個如前述之重組嵌合抗原受體19重組載體。在另一實施例中，所述醫療組成物中之基因重組淋巴球上不僅只具有如前述之重組嵌合抗原受體19蛋白，還帶有如前所述之重組嵌合抗原受體19重組載體。

在另一實施例中，所述醫藥組成物之製造方法僅包含如前所述之步驟（a）至（c），換句話說，即所述製造方法僅只有3個步驟而不包含其他額外之步驟。

在一實施例中，所述醫療組成物製造方法中之步驟（c）還包含擴增表現嵌合抗原受體（CAR）的淋巴球之步驟。

在一較佳實施例中，所述醫療組成物製造方法中之所述淋巴球細胞為帶有CD3之淋巴球細胞（即T細胞）或是帶有CD56之淋巴球細胞（即NK細胞）。

定義說明

在各類圖示和說明性實施例中，類似的參考數位用於表示類似元件。接下來我們將詳細參考附圖中所示的典型實施例。附圖和描述中盡可能使用相同的參考數字來表示相同或相似部件。在附圖中，出於清晰和方便目的，形狀和厚度可能會放大。根據本揭露說明，本揭露說明的描述將特別針對構成裝置的一部分、或直接與裝置一同工作的元件。應當理解，對於未具體表示或描述的元件，其形式可能多種多樣。本揭露說明中，「一項實施例」或「某一實施例」的引用是指關於該實施例所描述的某一特定特徵、結構、或特性包括於至少一項實施例中。因此，本揭露說明中不同位置出現的短語「在一項實施例中」或「在某一實施例中」不一定均指同一實施例。此外，上述特定特徵、結構或特性可通過任何適宜方式在一項或多項實施例中進行組合。應當理解，以下附圖未按比例繪製；更準確地說，此類附圖僅可用於說明。

在附圖的各類視圖中，類似參考編號用於標示相同或相似的元件，同時表示和描述了本揭露說明的說明性實施例。附圖不一定按比例繪製，且在某些情況下，為達到說明目的，附圖已放大和/或簡化。本領域中的普通技術人員根據本揭露說明的以下說明性實施例來理解本揭露說明的多種可能的應用和變體。

除非另有定義，否則本文使用的所有術語（包括科技術語）的意義與本揭露說明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。應當進一步理解，常用詞典中定義的術語的含義應當與相關領域和本揭露說明的上下文中的含義一致，且不會解釋地過於理想化或過於正式，除非本文中明確定義。

當本文在敘述一個可測量的數值時（例如：數量或週期等等），本文所使用的「大約」是指數值±20%或是±10%，其較佳範圍為±5%，而更佳範圍為±1%。並且進一步更佳範圍為一個特定數值的±0.1%，因為所述數值範圍適合實施本揭露之內容。

本文中所使用的「活化」是用來形容一個T細胞的狀態，且所述狀態是指所述T細胞已接受充分的刺激而產生可被偵測的細胞增殖。並且，所述活化還可伴隨著誘導性細胞激素的產生，以及可被偵測的作用功能。除此之外，「活化T細胞」是指T細胞可以進行細胞分裂。

本文中所使用的「抗體」是指一個免疫球蛋白分子，且其可專一性的與一個特定抗原結合。所述抗體的來源可以自然產生的或是藉由重組方法所產生的完整分子或是具有免應反應能力的部分。典型的抗體為四聚體的免疫球蛋白。本揭露中的抗體可以以不同的形式存在，例如：多株抗體、單株抗體、變異區片段（Fv）、抗原結合區片段（Fab）、雙抗原結合區片段（Fab）2、單鏈抗體以及擬人化抗體。(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)

本文中所使用的「抗體片段」是指一個完整抗體的一部分，並且是指所述完整抗體的抗原決定變異區域。舉例來說（但不限定本揭露），抗體片段包括：抗原結合區片段（Fab）、雙抗原結合區片段（Fab）₂ 、變異區片段（Fv）、線型抗體、單鏈變異區片段抗體（scFv）以及由不同抗體片段所形成的多專一性抗體。

本文中所使用的抗體「重鏈」是指在所有抗體自然構型存在的狀況下，所述抗體中的兩種多胜肽中較大的多胜肽。

本文中所使用的抗體「輕鏈」是指在所有抗體自然構型存在的狀況下，所述抗體中的兩種多胜肽中較小的多胜肽。κ鏈和λ鏈則是抗體輕鏈主要存在的兩種構型。

本文中所使用的「合成抗體」是指一個藉由重組基因技術所產生出來的抗體，舉例來說：例如本文所揭示的利用噬菌體所表現的抗體。另外，「合成抗體」也可理解為一個抗體是藉由一段可以轉譯出所述抗體的基因序列而產生，或是由一段可以轉錄出所述抗體的胺基酸序列而產生。其中，所述基因序列或是胺基酸序列可藉由此領域之通常知識的基因或胺基酸序列合成技術而獲得。

本文中所使用的「抗原」是指一個可以引起免疫反應的分子。所述免疫反應可能包括：抗體的產生、特定免疫活性細胞或是同時包括上述兩者反應。此領域之通常知識者可以瞭解任何巨分子（包括幾乎所有的蛋白質或是胜肽）可做為抗原。此外，抗原可由重組基因或遺傳體基因（genomic DNA）衍生而來。此領域之通常知識者可以瞭解本文中所使用的「抗原」包括任何基因（包括一個完整的或是部分的核苷酸序列）所形成的一個可以引起免疫反的蛋白質。更進一步，此領域之通常知識者也可以瞭解抗原不限於需要將一個核苷酸序列全部編譯出。明顯地，本揭露包括（但不限於）使用一種基因以上的部分核苷酸序列，並且所述核苷酸序列以各種排列組合以引起所需的免疫反應。此外，此領域之通常知識者可以瞭解抗原可以完全不需要由「基因」產生。明顯地，抗原也可以是合成出來的或是由生物樣品中所衍生出來的。而所述生物樣品可包括（但不限於）組織樣品、腫瘤樣品、細胞或是生物液體。

本文中所使用的「抗腫瘤能力」是指一個生物能力包括：減小腫瘤體積、減少腫瘤細胞數目、減少轉移細胞數目、延長生命週期或是改善與腫瘤相關的各種生理學症狀。「抗腫瘤能力」也可指本揭露中所述胜肽、多核苷酸、細胞或是抗體在第一時間防止腫瘤發生的能力。

本文中所使用的「自體的（autologous）」是指來自於相同個體的任何物質，並且隨後其再次進入所述個體。

本文中所使用的「同種異體的（allogeneic）」是指接受由相同物種但不同動物所衍生的移植物。

本文中所使用的「癌症（cancer）」是用以定義一種疾病，其特徵在於細胞的生長是快速且不受控制的。癌症細胞可以在局部擴散或通過血液和淋巴系統擴散到身體的其他部位。癌症舉例來說（但不限制）包括：乳癌，前列腺癌，卵巢癌，子宮頸癌，皮膚癌，胰腺癌，結腸直腸癌，腎癌，肝癌，腦癌，淋巴癌，白血病，肺癌等等。

本文中所使用的「共刺激配體（co-stimulatory ligand）」是指抗原呈現細胞（APCs；例如：樹突細胞、B細胞等等）上的一種分子，而所述分子可以與T細胞上的一個同源共刺激分子專一性結合而產生一個訊息。並且，除了T細胞受體（TCR）/CD3與載有胜肽的一個主要組織相容性複合物（MHC）分子結合而產生的第一訊息之外，所述訊息也可調節T細胞的反應。所述反應包括（但不限於）細胞增生、活化、分化等等。共刺激配體可包括（但不限於）：CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、LT-βR、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、可與類鐸受體（TLRs）結合的活化劑或抗體、可與B7-H3專一性結合的配體。共刺激配體還包括可與T細胞上的共刺激分子專一性結合的抗體，例如（但不限於）： CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、可與CD83專一性結合的配體。

本文中所使用的「共刺激分子（co-stimulatory molecular）」是指T細胞上可與共刺激配體專一性結合的同源結合配偶體，且藉此調控所述T細胞的共刺激反應，例如（但不限於）：細胞增生。

本文中所使用的「共刺激訊息（co-stimulatory signal）」是指一個訊號，包括：一個引導T細胞增生的第一訊息（例如：T細胞受體與CD3的接合）和/或正向調節或負向調節的關鍵分子。

本文中所使用的「疾病」是用以形容動物的健康狀態呈現無法維持體內平衡（homeostasis），並且其中如果疾病沒有改善，則所述動物的健康將繼續惡化。相對地，「失調」是用以形容動物的健康狀態是呈現可維持體內平衡，但是所述動物現階段的健康狀態不如沒有失調（disorder）時的狀態。然而，若繼續不治療則不一定會進一步導致動物的健康狀況下降。

本文中所使用的「有效數量（effective amount）」是指一個數量可以提供一個具有治療或預防的效果。

本文中所使用的「編譯（encoding）」是指多核苷酸（例如：基因、互補去氧核糖核酸（cDNA）或訊息核糖核酸（mRNA））中特定核苷酸序列的固有特性，用以作為合成其它聚合物和大分子的模板於生物過程中。所述模板具有特定的核苷酸序列（例如：核糖體核糖核酸（rRNA），轉移核糖核酸（tRNA）和訊息核糖核酸）或是特定的氨基酸序列以及由此產生的生物學特性。如果相對應於所述基因的訊息核糖核酸被轉譯且轉錄出所述蛋白質在一個細胞或生物系統中，則一個基因編譯出一個蛋白質。

本文中所使用的「內源的（endogenous）」是指任何物質由一個生物體內、細胞內、組織內、系統內而來，或是產生出來。

本文中所使用的「外源的（exogenous）」是指任何物質由一個生物體外、細胞外、組織外、系統外而來，或是產生出來。

本文中所使用的「表現」是用以定義一個特定的核苷酸序列由其啟動子所驅動而發生轉錄和/或轉譯。

本文中所使用的「表現載體」是指一個載體包括一個重組的多核苷酸用（其包括與待表達的核苷酸序列有效連接的表達控制序列）。表現載體包括足夠用以表現的順式作用（cis-acting）元件；而其他用以表現的元件可以由宿主細胞或一個體外表現系統所提供。所述表現載體包括此領域所屬通常知識可思及的載體，例如：黏性質體（cosmid）、質體（plasmid）（例如：裸露的或包括在微脂體中）和包括重組多核苷酸的病毒（例如：慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒）。

本文中所使用的「免疫球蛋白（immunoglobulin）或（Ig）」是指一種類型的蛋白質，其具有抗體之功能。由B淋巴球所表現之抗體，在些許情況中是指B細胞受體（BCR）或抗原受體。而上述此種類型蛋白質可分為五種，其分別為：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）、免疫球蛋白E（IgE）。其中，免疫球蛋白A主要是存在於身體的分泌物中，例如：唾液、眼淚、乳液、消化系統中分泌物以及黏液。免疫球蛋白G則是最常見的循環抗體。免疫球蛋白M則是大多數動物體中初次免疫反應中主要的免疫球蛋白，並且也是在凝集反應（agglutination）、補體結合（complement fixation）或其他抗體反應中最有效率之免疫球蛋白。而且在對抗細菌或是病毒的免疫反應中，免疫球蛋白M也扮演最重要的腳色。免疫球蛋白D的功能雖尚未被透徹了解，但是已知的是其也可以作為一抗原受體。免疫球蛋白E則是在調控過敏反應（hypersensitivity）中扮演重要的腳色。其主要透過聚集肥大細胞（mast cells）以及嗜鹼性球（basophils）與過敏原（allergen）反應。

本文中所使用的「分離（Isolated）」是指變更（altered）或移出一個原本常態的狀態。舉例來說，核苷酸或胜肽自然存在一活體中並非一「分離」狀態，但是上述同樣的核苷酸或胜肽若是「部分地」或「完全地」從與其共同存在的常態物質中分離出，此一狀態即為「分離」狀態。一個分離的核苷酸或胜肽可存在於一實質的純化狀態，或存在一非自然狀態的環境，例如：宿主細胞中。

本揭示之以下內文中之縮寫為此領域之通常知識者用以代表特定核苷酸之縮寫，其中「A」指的是腺嘌呤核苷酸、「C」指的是胞嘧啶核苷酸、「G」指的是鳥嘌呤核苷酸、「T」指的是胸腺嘧啶核苷酸、「U」指的是尿嘧啶核苷酸。

除非有特別說明，本文中的「一個用以編譯胺基酸之核苷酸序列」是包含彼此簡併（degenerate）形式並編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。而所述之「一個用以編譯蛋白質（protein）或核糖核酸（RNA）之核苷酸序列」其中也可能包含內含子（introns）以延長所述之苷酸序列。因此，在某些狀態之下用以表現某些蛋白質或核糖核酸之核苷酸序列包含內含子序列。

本文中所使用的「慢病毒（lentivirus）」是指反轉錄病毒科家族（Retroviridae family）中的一類。反轉錄病毒是一種獨特的病毒可以感染非分裂中（non-dividing）之細胞。並且其可以將顯著數量的遺傳訊息插入宿主的去氧核醣核酸（DNA）中，因此其為一非常有效之工具用以作為基因載體。而常用的型態包含：HIV、SIV、FIV等等。而從慢病毒所衍伸出的基因載體提供了一個非常有效的工具將基因轉入活體（in vivo ）中。

本文中的「大量表現（hyperexpression）」癌症蛋白質主要是指在一病患中特定器官或是組織上的細胞所帶有之癌症抗原表現量明超高於或多於其相對存在一正常人中之表現水平。而病患是否患有硬質瘤或是惡性血液腫瘤可藉由標準測試偵測癌症抗原是否大量表現為該領域所屬通常知識者所熟知。

本文中的「注射（administration or administering）」免疫性的組成物包含：皮下注射（s.c. ）、靜脈注射（i.v. ）、肌肉注射（i.m. ）、腦池內注射（intrasternal injection）或點滴注射（infusion technique）。

本文中的「病人（patient）、受試者（subject）或個體（individual）」或其他類似之用詞為彼此涵義相同，因此可以互相替換。並且，也可以代表任何動物或是其身上之可藉由本文所提供之方法而修改之細胞（無論是試管中（in vitro ）或是原位（in suit ）之狀態），在某些實施例中但非限制，所述之病人或個體指的為人類。

本文中的「多核苷酸（polynucleotide）」指的為一個鏈狀之核苷酸。此外核酸（nucleic acids）為核苷酸之多聚體。因此，據上述本文中之多核苷酸與核酸為可互相替換之用詞。而此領域之通常知識者也可以理解所述核酸與所述多核苷酸為相等之用詞，且可以被水解成核苷酸。而本文所使用之多核苷酸（但非限定）指的是所屬領域藉由各種方式所獲得之核酸序列，其包含（但非限定）：重組之種類（recombinant means），舉例來說為從一個重組基因庫（recombinant library）或一個細胞之基因體（genome）利用習知之複製技術（cloning technology）或是聚合酶連鎖反應技術（PCR）複製出核酸序列，或是利用合成技術而合成出所述核酸序列。

本文中的「胜肽（peptide）、多胜肽（polypeptide）以及蛋白質（protein）」為互相可替換之用詞，其所指的為一種成分包含胺基酸殘基（residues）且彼此之間之胜肽鍵是以共價鍵連方式連結（covalently linked）。一個蛋白質或是胜肽必須包含至少兩個胺基酸，並且並不限制其最多含量之胺基酸數目於所述蛋白質序列或是所述胜肽序列中。所述多胜肽包含任何胜肽或是蛋白質其具有至少兩個或多個彼此以胜肽鍵連結之胺基酸。而本文中所指的是兩短鏈，舉例來說即習知之胜肽、單胜肽、寡胜肽（oligopeptides）以及單體（oligomers），並且較長鏈通常為指習知之蛋白質，而其也具有多種存在型式，例如：具有生物活性之片段、實質桐元之多胜肽、寡胜肽、同源二聚體（homodimers）、異源二聚體（heterodimers）、變種胜肽（variants of polypeptides）、重組胜肽（modified polypeptides）、衍伸物（derivatives）、類似物（analogs）、融合蛋白（fusion proteins）等等。所述多胜肽也包含自然之胜肽、重組之胜肽、合成之胜肽以及組合之胜肽。

本文中的「專一性結合（specifically binds）」為關於抗體。其主要用以形容一個抗體辨認一個特定的抗原，並且實質上也可與其他之相類似之抗原結合。舉例來說，一個抗體與一個物種中之一特定抗原專一性結合，則所述抗體也可以與其他物種中相同之抗原產生專一性結合。然而，所述之跨物種辨識結合反應性本身並不會改變抗體的分類。在另一個例子中，一個抗體可與一個抗原專一性結合也可以與不同對偶的（allelic）抗原結合。並且上述之跨物種辨識結合反應性本身也不會改變抗體的分類。而在一些示例中，「專一性結合」也可以用於形容抗體、蛋白質或胜肽與一個第二化學成分物質之間之作用，即所述「專一性結合」為指的為透過變上化學物質上的一種特定結構（例如：抗原決定區（antigenic determinant）或是（epitope））；因此抗體會辨認舉有特定結構之化學物質而非單傳世蛋白物質就會產生結合作用。若是某特定抗體會與抗原決定區域A而結合，而將所述抗體與三種分子（分別為：不具有A、具有未標記之A以及有標記之A）反應，則所述抗體與分子帶有標記之A的結合量會相較於帶有未標記之A來的少。

本文中的「刺激（stimulation）和擴增（amplification）」是指特定分子與刺激分子（例如：T細胞受體複合體（TCR/CD3 complex））結合後所誘導的初級反應（primary response），並且其伴隨著訊息傳遞例如（但不限制）：由T細胞受體複合體所誘導的訊息傳遞。此外，本文中的「刺激（stimulate）或擴增（amplify）」用來描述刺激配體（stimulatory ligand）啟動主要反應之過程。更進一步地，「刺激」與「擴增」可互相交替使用。而所述「刺激」也可以調控一個分子使其表現受到抑制，例如：抑制（down-regulation）轉化生長因子β（TGF-β）的表現，和/或重新排列細胞骨架的結構等等。

本文中的「產生（generating）和擴增（amplifying）」一個組成物是指增加所述組成物之數量（例如：細胞數目）。因此，「產生」和「擴增」可互相交替使用。

本文中的「刺激分子（stimulatory molecule）」是指T細胞身上之分子，且其可以與抗原呈現細胞（antigen presenting cell）上之刺激配體產生專一性結合。

本文中的「刺激配體（stimulatory ligand）」是指一個由抗原呈現細胞（APC）（例如：樹突細胞（dendritic cell）、B細胞（B cell）等等）所表現之配體（ligand），而所述刺激配體可以與T細胞上之刺激分子作專一性結合並且進一步誘導初級免疫反應，例如（但是不限制）：活化、啟動免疫反應、增生等等反應。所屬領域之通常之事者可以理解刺激配體特別是指：主要組織相容性複合體Ⅰ（MHCⅠ）上裝載著一個胜肽、一個可辨認CD3之抗體、一個超級激動劑（superagonist）可辨認CD28之抗體以及一個超級激動劑可辨認CD2之抗體。

本文中的「受試者（subject）」是包含在免疫反應中可被誘導（elicited）之活體組織，例如：人。而受試者還可包含：人、狗、貓、小鼠、大鼠、基因轉殖物種等等。

本文中的「分離、純化（purified）」是指一種細胞從一群混合細胞組成中被分離出。此外，本文中之「分離、純化」也可指一種細胞從一群混合細胞所自然存在環境中被分離出。在一些示例中，一群被分離出的細胞為一均勻的細胞群。在其他示例中，「分離、純化」僅用以形容一個細胞被從其自然狀態的細胞群中被分離出來。在一些實施例中，所述細胞是被培養在試管中（in vitro ）環境。在其他實施例中，所述細胞並非被培養於試管中（in vitro ）環境。

本文中的「醫藥用（therapeutic）」是指包含治療（treatment）以及預防（prophylaxis）。而醫藥用效果是指可抑制（suppression）、減緩（remission）或消除（eradication）一個疾病之症狀。

本文中的「治療（treat）」疾病是指減輕受試者身上因為疾病號發所產生之至少一個病徵程度或是嚴重度。

本文中的「轉染（transfected）、轉型（transformed）或轉導（transduced）」是指一個程序用以將外源（exogenous）核酸傳送（transferred）或是導入（introduced）宿主細胞中。因此，以上所述三個詞在用以形容此程序時是可以相互替換使用的。一個「轉染的（transfected）、轉型的（transformed）或轉導的（transduced）」細胞是指一個已經將所述外援核酸導進細胞內之細胞。而所述細胞包含受試者之細胞及其後續所分裂出之細胞。

本文中的「載體（vector）」是指一種組成物包含：分離之核酸和可被用以作為傳輸體而將所述分離核酸送入目標細胞中之核酸。習知的數種載體包含（但不限制）：線型多核苷酸、多核苷酸與離子或是親水物質之混合物、質體以及病毒。因此，「載體」包含一個可自動複製的質體或是病毒。而「載體」也可被解釋為包含非質體或非病毒之物質而所述物質可以驅使核酸進入細胞中，例如：聚賴胺酸（polylysine）物質、微脂體（liposomes）等等。而病毒載體舉例來說包含（但不限制）：腺病毒載體（adenoviral vectors）、腺相關病毒載體（AAV）、反轉錄病毒載體（retroviral vectors）等等。

詳細說明

本揭露提供一種組成物用以治療一種疾病、失調或症狀以及所述組成物之製造方法。更明確地，所述疾病包含癌症（例如：惡性血液腫瘤、硬質瘤、原位腫瘤或是轉移腫瘤等）。較佳地，所述癌症為惡性血液腫瘤。更佳地，所述癌症為慢性淋巴性白血病。而其他疾病也可藉由注射本揭露之組成物，例如：病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染或是自體免疫疾病等等。

蛋白組成（Protein Composition）

本揭露中一個醫藥組成物是一種重組嵌合抗原受體蛋白，並且其主要包含三個部分：細胞外區域（extracellular domain）、跨模區域（transmembrane domain）、細胞內區域（intracellular domain）。其中，所述細胞外區域包含一個能與目標專一性結合的元件，若沒有特別說明則是指抗原結合區域（antigen binding moiety）。所述跨模區域是用以連結所述細胞外區域與所述細胞內區域，並且支持所述細胞外區域立於細胞表面。所述細胞內區域或細胞質區域（cytoplasmic domain）還包含一個訊息區域。而所述訊息區域還進一步包含：至少一個免疫受體酪氨酸激活基序部分、至少一個共同刺激分子部分或是者兩者任意之組合。所述共同刺激分子分子是一個非抗原受體的細胞蛋白，並且其在淋巴球與抗原的有效反應中扮演不可或缺之腳色。

而在重組嵌合抗原受體蛋白的細胞內區域或細胞質區域，或是所述細胞外區與所述跨模區域之間，或是所述細胞質區域與跨模區域之間均可包含至少一個連結序列（linker），或是換句話說至少一個間隙子區域（spacer domain）。本文中之「連結序列」基本上是指任何可以在任何蛋白質區域間以胜肽鍵作為連接功用之寡胜肽（oligopeptide）或是多胜肽（polypeptide）。因此，連接序列包含約300個胺基酸，較佳為約10〜100個胺基酸，更佳為約10〜50個胺基酸，最佳為約25〜50個胺基酸。

抗原結合區域（Antigen Binding Moiety）

在一實施例中，本揭露中的重組嵌合抗原受體包含一個與目標專一性結合的元件，若本文中無特別說明即指可被合成抗體所辨認之抗原結合區域。而所述抗原結合區域的選擇主要是依據目標細胞表面上的配體數目及種類。舉例來說，所述抗體結合區域之選擇是為了要辨認目標細胞之表面標記（surface marker），而所述細胞與某特定疾病狀態有關連。因此，上述例子中的細胞表面標記為一個配體用以作為本揭露中重組嵌合抗原受體可辨識之抗原結合區域，其包含：病毒、細菌、寄生蟲感染、自體免疫疾病以及癌症細胞。

在一實施例中，本揭露中的重組嵌合抗原受體可被修改（engineered）而進一步標記一個欲了解之腫瘤抗原，其中主要方式為修改欲了解抗原之抗原結合區域，以使所述重組嵌合抗原受體可與腫瘤細胞上的抗原產生專一性地結合。而在本文中，「腫瘤抗原」或「大量表現失調之抗原」或「與大量表現失調症有關之抗原」指的是特定抗原與大量表顯失調之疾病有關，例如：癌症。而本文中所討論之抗原僅是眾多中一示例，而並不侷限本揭露僅用於本文所揭露之範圍。該領域所屬通常知識者所依據本揭露之揭露而可易於思即之範圍，本揭露也涵蓋所述之範圍。

腫瘤抗原為腫瘤細胞所分泌出來並用以抑制免疫反應（例如：T細胞所調控之免疫反應）之蛋白質。而本揭露中所選擇的抗原結合區域是依據所欲治療之癌症作為選擇基礎。在一實施例中，所述腫瘤抗原包含一個或多個與哺乳動物癌症有關之抗原結合區域（epitope）。通常，腫瘤會表現數種蛋白質且可用來作為免疫攻擊之抗原。而這些分子包含（但是並不侷限）：具組織專一性之抗原，舉例來說，在黑色素瘤（melanoma）中為MART-1、tyrosinase、GP 100；在攝護腺癌（prostate cancer）中為PAP、PSP。而其他目標分子則屬於一群轉型有關之分子（transformation-related molecules）例如：致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一群之目標抗原屬於癌胚抗原（onco-fetal antigens）例如：CEA。在B淋巴瘤中，腫瘤專一性之個體遺傳型（idiotype）免疫球蛋白包含：一個真正的腫瘤專一性免疫球蛋白抗原，且其在不同腫瘤中為不相同的。B細胞分化抗原，例如：流感病毒之血球凝集素、hen egg lysozyme、白蛋白、CD19、CD20、CD37等其他可以用來標定B淋巴癌之抗原。而上述之抗原中（CEA、HER-2、CD19、CD20、idiotype）已經些許被用以作為標的來生產單株抗體已引起被動免疫治療（passive immunotherapy），但是只有少部份成功的例子。

本揭露中所述腫瘤抗原之種類也可以指腫瘤特異抗原（TSA）或腫瘤相關抗原（TAA）。所述腫瘤特異抗原僅只表現在腫瘤細胞中，而不表現在身體其他細胞中。而腫瘤相關抗原並非僅只表現在腫瘤細胞，而在正常細胞上也會表現。並且所述腫瘤相關抗原會表現於正常細胞上是因為當正常細胞無法引起免疫耐受性（immunologic tolerance）時。前述抗原僅在當免疫系統與所述抗原有反應時於腫瘤細胞上表現。腫瘤相關抗原僅在胎兒發育時（fetal development）表現於正常細胞上，並且所述時期之免疫系統並未發展健全以及無法反應，或是所述抗原是以非常低的表現量存在於細胞表面。然而，所述腫瘤相關抗原在腫瘤細胞上的表現量則是非常高的。

本揭露中之重組嵌合抗原受體可以依據感興趣且欲標記之抗原而包含一合適的抗原結合區域，其可專一性的辨認所述抗原結合區域。舉例來說，若感興趣的抗原為CD19（即CD19為標的抗原），則一個可以辨認CD19的抗體即可作為抗原結合區域而被包含進本揭露所述之重組嵌合抗原受體。

跨膜區域（Transmembrane Domain）

關於跨膜區域，所述重組嵌合抗原受體可被設計成包含一個跨膜區域，且該跨膜區域是與所述細胞外區域（抗原結合區域）融合在在一起。在一些示例中，可以通過氨基酸取代選擇或修飾跨膜結構域，以避免這些結構域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結構域結合，以最小化與受體複合物的其他部分產生相互作用。在另一實施例中，所述跨膜區域並不直接與抗原結合區域之任一區域直接連接。因此據上述，所述跨膜區域與所述抗原結合區域之間存在只少一個短胜肽（例如連接序列）。

所述跨膜區域的來源可以是自然存在的或是以合成方式產生出來的。其中，若是選擇自然存在的，則所述跨膜區域可以是由任何與膜結合的蛋白或是膜蛋白。本揭露中使用之跨膜區域可由或至少包含下述之T細胞α、β、ζ鏈、CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、IgG1、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154任一或任意組合之跨膜區域。或是，所述跨膜區域可藉由合成方式，且所述合成跨模區域主要是疏水性殘基（hydrophobic residues）例如：白胺酸、纈草胺酸。較佳的為在每個跨膜區域尾端帶有由苯丙氨酸、色氨酸以及纈草胺酸三個連續胺基酸序列。可選擇地，一個短寡胜肽連接序列或多胜肽連接序列（較佳地為2〜10個胺基酸長度）在重組嵌合抗原受體的所述跨膜區域以及細胞質之訊息區域間做為連接序列。另外，甘胺酸與絲胺酸組成之連續胺基酸序列為一較合適之連接序列。

在一實施例中，本揭露中重組嵌合抗原受體的跨膜區域為CD28、IgG1、CD4、CD8α其中一個，或是這四個任意之組合。在另一較佳實施例中，所述重組嵌合抗原受體的跨膜區域較佳為CD8α的跨膜區域。

訊息區域（Signaling domain）

本揭露中重組嵌合抗原受體的訊息區域或是細胞質區域，若本文無特別限定則是指負責活化免疫細胞中至少一個正常功能之區域。本文中「有效功能」是指某一特定免疫細胞之免疫功能。淋巴球的有效功能（特別是指CD3淋巴球）舉例來說為毒殺作用（cytolytic activity）或是輔助作用（helper activity），其中輔助作用包含：分泌細胞激素（cytokines）。因此「訊息區域」代表的是蛋白質的一特定部分，其用以傳遞所述有效功能之訊息並且引導細胞展現所述之功能。通常來說，整個細胞內訊息區域會完整使用，然而在一些示例中使用完整的細胞內訊息區域是不必要的。針對作為訊息區域之傳遞部分的區域，所述傳遞部分的區域可以用來代替整個蛋白質。因此，所述訊息區域代表包含任何訊息傳遞部分的區域可以被來傳遞所述有效功能之訊息。

本揭露之一較佳之示例，所述重組嵌合抗原受體包含T細胞受體之細胞膜部分序列，以及其共同受體（co-receptor）。此兩個區域均作為在抗原受體與配體接觸後啟動後續訊息傳遞之作用。另外只要是相似的序列或是藉由合成相似的序列均可達成相同的訊息傳遞之作用。

目前已知為僅只靠T細胞受體（TCR）是無法達成T細胞完整的活化，所以第二訊息（secondary signal）或是共同刺激訊息（co-stimulatory signal）也是必要的。因此，T細胞的活化是透過兩個不同的訊息訊列：一個為透過T細胞受體（即主要訊息序列）而啟動抗原依賴主要活化（antigen-dependent primary activation），以及透過非抗原依賴方式（antigen-independent manner）而提供第二訊息或共同訊息。

主要訊息區域調控T細胞受體複合體之主要活化，不論於受到刺激的過程或是受到抑制的過程。主要訊息區域在受到刺激的過程中還可以包含訊息區域（即為已知之免疫受體酪氨酸激活基序）。此外，所述第二訊息區域或共同訊息區域在上述刺激過程中還可包含一個訊息區域（即為已知之共同刺激分子）。

而本揭露中示例之所述免疫受體酪氨酸激活基序所包含的主要訊息區域則可選自TCR zeta、FcR gamma、FcR beta、CD3 gamma、CD3 delta、CD3 epsilon、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。此外，本揭露中較佳的訊息區域中之免疫受體酪氨酸激活基序是CD3 zeta。

在一較佳實施例中，在重組嵌合抗原受體中所述訊息區域中的免疫受體酪氨酸激活基序可設計成為CD3 zeta的訊息區域本身或是包含如本文所述其他細胞質區域之部分。舉例來說，重組嵌合抗原受體的細胞質區域除了包含CD3 zeta之部分外，還包含共同刺激訊息區域。而所述共同刺激區域則是指所述重組嵌合抗原受體具有共同刺激分子的細胞內區域。所述共同刺激分子是一個細胞表面分子，但所述細胞表面分子不包含抗原受體或其相對應之配體，並且所述受體是指淋巴球與抗原反應時所必須之受體。而上述分子舉例來說可包含：CD27、CD28、4-1BB/CD137、OX40、CD30、 CD40、PD-1、ICOS、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、可與CD83專一性結合之配體等等。因此，當本專利說明以4-1BB/CD137作為共同刺激訊息分子時，其他如上所示或是本領域之通常知識者藉由本揭露而能得知之分子均在本揭露範圍之內。

本揭露所述重組嵌合抗原受體其細胞質訊息區域之免疫受體酪氨酸激活基序與共同刺激分子的排列順序可以為任意方式或是有特定序列。可選擇地，短胜肽連接序列或是多胜肽序列（較佳為約2〜10胺基酸長度）可作為上述兩者之間之連接序列。而甘胺酸與絲氨酸雙體則為較合適之連接序列。

在一實施例中，所述訊息區域並不只有免疫受體酪氨酸激活基序，還具有共同刺激分子（例如：CD27、CD28、CD30、4-1BB/CD137、OX40、HVEM或上述任一之組合。在另一實施例中，所述重組嵌合抗原受體細胞內區域的所述共同刺激分子包含4-1BB/CD137。而在一較佳實施例中，所述訊息區域包含免疫受體酪氨酸激活基序和共同刺激分子。其中所述免疫受體酪氨酸激活基序為CD3 zeta，而所述共同刺激分子則為4-1BB/CD137的共同刺激分子部分。

載體（Vectors）

本揭露中還提供一個基因載體，其包含重組嵌合抗原受體的核酸序列。更進一步，所述核酸序列包含抗原結合片段核酸序列可操作地與跨膜區域之核酸序列以及訊息區域之核酸序列連結。而上述用以產生所預期分子之核酸序列可藉由目前習知重組技術來達成，舉例來說，藉由篩選一個細胞的表達基因庫、或是表達一個基因在體且其帶有如上所述之基因、或直接由細胞或組織中直接分離出來等等。此外，所述基因也可以藉由合成方式直接合成或選殖（clone）出。

因此本揭露所提供之載體可以帶有本揭露所述分子知DNA。而所述載體是由反轉錄病毒（例如：慢病毒（lentivirus））所產生，因為其為一較佳工具用以將基因長時間表現於一特定細胞。主要原因為藉由反轉錄病毒送至細胞之基因可長時間並且穩定的表現於目標細胞及其子代細胞中。而從慢病毒衍生出之載體相較於由原致癌反轉錄病毒（onco-retroviruses，例如：MLV）所衍生出之載體還具有一優勢，即可將目標基因送入一個不分裂（non-dividing）之細胞，例如：肝細胞（hepatocytes）。並且，它們還具有低致免疫性（low immunogenicity）。

簡而言之，本揭露所述之表現一個自然或是合成的核酸，且所述核酸可以編譯出重組嵌合抗原受體，其核酸主要結構為一個表現載體藉由核酸連接序列連結所述欲表現之核酸，且表現載體之表現由載體上之啟動子所驅動。所述表現載體適合進行複製於真核細胞（eukaryote）中或被包含於真核細胞中。典型的選殖表現載體包含：轉錄（transcription）或轉譯終止子（translation terminator）、啟動序列（initiation sequences）以及用以調節欲表現核酸序列之啟動子（promoter）。

本揭露中所揭露之表現載體也可用於核酸疫苗（nucleic acid immunization）或是基因療法（gene therapy）並搭配標準基因轉殖方法。因此在一實施例中，本揭露提供了一個基因治療表現載體。

而上述之核酸可被選殖進一些不同型態的表現載體。舉例來說，所述核酸可被選殖至（但不限制）：plasmid、phagemid、phage derivative、animal virus、cosmid。而表現載體又可以依據不同用途分為：表現載體（expression vectors）、複製載體（ replication vector）、探針製備載體（probe generation vector）、定序載體（sequencing vector）。

更進一步，本文中所述表現載體備用以感染細胞時是以病毒載體的形式。而所述病毒載體的技術是所屬技術領域之通常知識者所習知之技術。所述病毒被用於攜帶所述表現載體包含（但並不限制）：反轉錄病毒（retrovirus）、腺病毒（adenovirus）、腺微小病毒（AAV）、皰疹病毒（herpes viruses）、慢病毒（lentivirus）。通常來說，一個和是表現載體包含一個原位複製起始子適於至少一個特定物種、一個啟動子序列、通用的限制內切酶切位以及一個或多個篩選基因。

一些病毒為基礎的方則是因應要將核酸轉殖入哺乳動物細胞中而產生的。舉例來說，反轉錄病毒提供了一個通用的平台用以轉殖基因。一個選擇的基因可被插入表現載體中並且進一步包裹成病毒顆粒已為一習知技術。上述重組病毒可被分離出並送至特定個體的細胞中於活體外（ex vivo ）或活體中。部分反轉錄病毒方法為習知技術。在一實施例中，慢病毒方法被用於將表現載體送至細胞中。

由於為了偵測重組嵌合抗原受體的表現量，因此被轉殖入細胞的表現載體也同時具有一個篩選記號基因（selectable marker gene）、報導基因（reporter gene）或同時具有以上兩者。且上述兩者可進一步用於從一大群混合的細胞中辨識和篩選出帶有表現載體之細胞。在另一方面，所述篩選記號基因還可帶有用於共同轉殖過程步驟的DNA。篩選記號基因與報導基因均與些許調控基因連接著，因此使其可以於宿主細胞中被表現。有用的篩選記號基因包含（並不限制）：抗藥性基因（antibiotic-resistance genes），例如：neo或其他類似功能之基因等等。

報導基因被使用於鑑別有被轉殖入基因之細胞以及評估特定基因上之調節功能。大體來說，報導基因是一段不會被宿主器官或組織所表現的基因，並且其會編譯出一段具有可被輕易偵測出特性（例如：酵素活性）之多胜肽。而偵測所述報導基因的時間為在將所述基因轉殖入所述宿主細胞後之一特定時間。適合的報導基因可包含基因可編譯出luciferase、beta-galactosidase、chloramphenicol acetyl transferase、secreted alkaline phosphatase、the green fluorescent protein (GFP) gene。而其合適的表現系統為習知之知識，並且可使用目前習知技術來製備或是可直接藉由市售獲得。大體上來說，所述載體之結構包含一段一定的5’ flanking region，且5’ flanking region具有高度表現報導基因的能力，因此所述結構基因可視為啟動子。所述啟動子區域可與一個報導基因相連接，並且可被一種藥劑所誘導而表現（即啟動子驅動之轉錄）。在一實施例中，報導基因是使用GFP。

用以將基因導入以及表現於細胞中之方法是屬於習知之知識。而在本文中所使用的表現載體可被輕易地藉由各種習知技術轉殖入宿主細胞（例如：哺乳動物、細菌、酵母菌或是昆蟲細胞）。舉例來說，所述表現載體可以轉殖入宿主細胞藉由物理性的、化學性的或生物性的方法。

將一段多核酸轉殖入一個宿主細胞之所述物理性的方法包含：calcium phosphate precipitation、lipofection、particle bombardment、microinjection、electroporation、gene gun等等。另外，用以製造細胞包含所述載體和/或所述多核酸之方法為所屬領域之通常知識。其中，用以將一段多核酸轉殖入宿主細胞的較佳方法為electroporation轉殖法。

將一段多核酸轉殖入一個宿主細胞之所述生物性的方法包含使用DNA載體或是RNA載體。病毒載體（更具體而言為反轉錄病毒載體）為目前最被廣泛使用之方法用以將基因插入哺乳動物中（例如人類細胞）。而其他種類病毒載體可以由慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒Ⅰ、腺病毒、腺相關病毒（AAV）等等病毒衍生出。

將一段多核酸轉殖入一個宿主細胞之所述化學性的方法包含：膠體分散系統（colloidal dispersion system）例如：macromolecule complexes、nanocapsules、microspheres、beads；以及脂質系統（lipid-based systems）例如：oil-in-water emulsions、micelles、mixed micelles、liposomes。其中，一個用以運送囊泡於試管中或活體中的膠體分散系統之示例為liposomes（例如：人工膜囊泡）。

不論使用哪種方法將外源核酸引入宿主細胞均可已使用多種檢測方法來確認宿主細胞中重組DNA序列的存在。而所述檢測方法包含：舉例來說，分子生物學檢測方法為所屬領域之習知技術（例如：Southern、Northern blotting、RT-PCR、PCR）；生化檢測方法為偵測一個特定胜肽的存在或是減少（例如：藉由免疫檢測方法，即ELISA以及Western blot）或是藉由本文中所述之藥劑來檢測之方法均視為落入本揭露之範圍。

醫藥組成物（Pharmaceutical Composition）

本揭露還提供一個醫藥組成物包含一群細胞（例如：淋巴球），且所述細胞表現至少一個重組嵌合抗原受體蛋白或是具有至少一個重組嵌合抗原受體之DNA載體。因此，所述細胞具有抗腫瘤之特性。

細胞之來源

在擴增和基因重組本揭露中具有CD3之淋巴球前，所述具有CD3之淋巴球是從一個受試者中所獲得。更進一步，具有CD3的淋巴球的來源為多種，包含：周邊血中單核球細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、受到感染之組織、腹水、胸膜滲出液、脾臟組織、腫瘤等等。在本揭露的某些實施例中，習知的具有CD3的淋巴球的數目均可被使用。在本揭露的某些實施例中，具有CD3的淋巴球是從受試者血液中藉由習知之方法（例如：Ficoll™分離法）所分離出來。在一較佳實施例中，所述從一個體循環血液中所分離出之所述淋巴球是從血液分離產物獲得。所述血液分離產物基本上為淋巴球，其包含：T細胞、單核球、顆粒性白血球、B細胞、其他種類白血球、紅血球、血小板。在一實施例中，所述從血液分離產物中獲得的血球可藉由沖洗而去除血漿部分，並且將剩餘所述細胞保存於合適之緩衝液或培養液中以進行後續步驟。在本揭露中一實施例，是利用PBS沖洗所述細胞並且將細胞保存於PBS中。在沖洗過後，所述細胞被重新均勻分散於數種生物相容緩衝液中，舉例來說，不含鈣離子和鎂離子的PBS，或其他生理食鹽水（其可包含或不包含緩衝溶液）。另外，血液分離產物中不需要的物質在被分離出後，所剩下的細胞可以直接重新均勻分散於培養液中。

在另一實施例中，T細胞可藉由將周邊血的淋巴球中紅血球溶解並去除單核球細胞後而被分離出，舉例來說，藉由使用PERCOLL™梯度並搭配離心。T細胞中特別的次族群（例如：帶有CD2和CD3）可以藉由更進一步的正選（positive selection）或負選（negative selection）技術而獲得。舉例來說，在一實施例中T細胞藉由與具有anti-CD14、anti-CD16、anti-CD19、anti-CD36、anti-CD56、anti-CD123、anti-Glycophorin A的磁珠（即MACS® Pan T Cell Isolation Kit II）反應一段時間，最後以負選技術而篩選出所要的T細胞。在一特定實施例中，較佳的分離出目標的T細胞是以「負選」的方式來篩選以進一步後續的活化（activation）和擴增程序。而且負選出的細胞也還可以進一步的再次進行篩選。

另外一種以負選技術來篩選出所要的目標細胞是藉由抗體，而所述抗體是辨認負選細胞上所沒有的細胞表面記號（cell surface marker）。而所述將細胞分離（sorting）和/或篩選出藉由負選磁珠系統或是流式細胞儀的技術是使用單株抗體雞尾酒（cocktail of monoclonal antibodies），且其可以直接與複選目標細胞上的細胞表面記號結合而作為標記。

而依據本揭露之內容，所述擴增的目標細胞來源可在任何必要的時間點收集，並且進一步分離和冷凍所述細胞，例如：T細胞，即本文中所述之用於隨後T細胞治療中的任何數量的T細胞。在一實施例中，血液樣本和血液分離產物是從一健康受試者上所分離出。在另一實施例中，血液樣本和血液分離產物是從一健康受試者上所分離出，但是其具有潛在風險號發一特定疾病卻尚未明顯產生病徵，並且所分離出的細胞先進行冷凍以供後續使用。在某些特定實施例中，所述T細胞首先進行擴增而隨後被冷凍保存以供後續進一步使用。在某些特定實施例中，前述血液樣本是從一病人身上所分離出來，且分離時間為於所述病人被診斷出患有本揭露中所述疾病但是在施行治療之前時。更進一步地，在一實施例中，所述目標細胞是從受試者的血液樣本或血液分離產物中所篩選出來，且所述受試者還未接受任何的治療，其包含但是不限定於natalizumab、efalizumab、antiviral agents、chemotherapy、radiation、immunosuppressive agents（包含：cyclosporin, azathioprine、methotrexate、mycophenolate、FK506、CAMPATH、anti-CD3 antibodies、cytoxan、fludarabine、cyclosporin、rapamycin、steroids、FR901228、irradiation）。更進一步地，在一實施例中所述細胞是從一病人身上所分離出來並且直接冷凍以供後續療程使用（在刺激之前或是接續），而所述療程是指骨髓移植、幹細胞移植、T細胞燒灼術（T cell ablative therapy）即使用化療藥劑例如：fludarabine、體外放射治療（XRT）、cyclophosphamide、抗體（例如：OKT3、CAMPATH）。在另一實施例中，所述細胞是事先被分離出來並冷凍保存而以利於之後治療彈性使用，而所述治療是指B細胞燒灼術（B cell ablative therapy），並且其所使用的藥劑為可與CD20反應的藥劑，例如：Rituxan。

活化和擴增T細胞

無論是在利用基因重組所述T細胞來表現目標重組受體組成物之前或之後，所述T細胞可藉由以下之方法來進一步活化以及擴增。

本揭露中所述T細胞之擴增是藉由一藥劑與其細胞表面接觸而刺激T細胞表面之CD3/TCR複合體與共同刺激分子。具體來說，本文所述T細胞族群可使用以下方法刺激，例如：與anti-CD3抗體接觸、anti-CD3的抗體結合片段、將anti-CD2抗體固定於T細胞表面、與protein kinase C activator（例如：bryostatin）結合calcium ionophore接觸。而針對T細胞表面上的共同刺激分子，則是使用可與共同刺激分子結合的配體。舉例來說，T細胞可與anti-CD3抗體與anti-CD28抗體接觸，因而提供T細胞一適合之條件促使其開始增生（proliferation）。無論是刺激具有CD4或是具有CD8的T細胞進行增生，均可以使用anti-CD3抗體與anti-CD28抗體來達成。目前習知可以用來刺激T細胞增生活化的anti-CD3抗體，包含：HIT3a、UCHT1、OKT3（BD Pharmingen™, USA）（Kemper et al., Nature 421.6921: 388-92. 2003; Li et al., J. Immunother. 35(2):189-95, 2012）。另外，目前習知可以用來刺激T細胞增生活化的anti-CD28抗體，包含：CD28.2、L293、clone 15E8（BD Pharmingen™, USA）。並且使用上述抗體來刺激所述T細胞之方法為所屬領域之通常知識者所習知之技術。

在另一實施例中，所述anti-CD3抗體與anti-CD28抗體被固定於磁珠上（可以於相同磁珠上即順式（cis）刺激；或不同磁珠上即順式（trans）刺激）。舉例來說，用來作為提供第一活化信號（primary activation signal）的藥劑為anti-CD3抗體或anti-CD3抗體結合片段，以及另外用來作為提供共同刺激活化信號（co-stimulatory signal）的藥劑為anti-CD28抗體或anti-CD28抗體結合片段。並且，所述兩個藥劑均被固定於相同一個磁珠上以相同比例的數量。

在本揭露中之進一步實施例中，所述細胞（例如：T細胞）包含如前述具有藥劑處理過的磁珠，而所述磁珠與所述細胞是彼此分散的，並且細胞進一步培養於所述細胞與磁珠混合液中。在另一實施例中，在培養之前，上述細胞與磁珠並不是彼此分開的而是混合在一起的。更進一步，在另一實施例中，所述細胞與磁珠被藉由一額外應力（例如：磁力）而濃縮聚集，而增加了細胞表面記號的連結（ligation），因此也誘導細胞的刺激。

在本揭露之一實施例中，前述磁珠與細胞混合液培養時間從幾小時（約3小時）至約14天，或是任何小時數之間的整數值。在另一實施例中，所述混合液之培養時間為21天。在另一實施例中，本揭露中之所述T細胞與磁珠共同培養了2至3天。依據不同需求也可能需要數個刺激週期，使得T細胞的培養時間可以為60天或更長。適合於T細胞培養的條件包括適當的培養基（例如：RPMI Media 1640或是LGM-3™ Lymphocyte Growth Medium（Lonza）或是AIM-V），其還可具有增加增生和活性所必需的要素，包括血清（例如；胎牛血清或人類血清）、白血球介素2 （IL-2）、胰島素、IFN-γ、白血球介素4（IL-4）、白血球介素7（IL-7）、顆粒單核球群落刺激生長因子（GM-CSF）、白血球介素10（IL-10）、白血球介素12（IL-12）、白血球介素15（IL-15）、轉化生長因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或是其他習知可以刺激細胞生長的物質。而所述其他習知用以刺激細胞生長物質包含但是不限定：surfactant、plasmanate、reducing agents（例如：N-acetyl-cysteine、2-mercaptoethanol）。而培養基可以包含：RPMI 1640、DMEM、MEM、α-MEM、F-12，另外可選擇性地，培養基還可以包含胺基酸、丙酮酸鈉、維他命、可包含血清或不含血清、賀爾蒙、細胞激素（cytokine）等可促使T細胞生長和擴增。抗生素（antibiotics）（例如：青黴素、鏈黴素）只用於實驗過程中，若是所述細胞會進一步輸入一受試者時，其所述細胞培養過程中並不會使用所述抗生素。而所述細胞均維持在支持其生長所需的條件下，例如：其合適溫度（37° C）和大氣環境（一般空氣含有5%二氧化碳）。

所述T細胞在接受不同刺激時間下可能會產生不同特性。舉例來說，典型血液或是周邊血分離出的單核球產物中具有較多的輔助型T細胞族群（T_H ；CD4⁺ ）相較於毒殺型或抑制型T細胞（T_C ；CD8⁺ ）。透過刺激CD3和CD28受體達成活體外（Ex vivo ）擴增T細胞所產生的T細胞族群，於刺激8至9天前主要是輔助型T細胞族群，而在8至9天後所產生的細胞族群則是毒殺型T細胞較多。因此，取決於治療的目的，而決定使用何種主要T細胞族輸入受試者是較有利的。類似地，如果已分離出抗原專一性之毒殺型T細胞，則較有利的是將所述細胞擴增至較大的程度。

治療應用（Therapeutic Application）

本揭露還包含一種轉殖了慢病毒載體（LV）的細胞（例如：T細胞）。舉例來說，所述慢病毒載體可編譯出重組嵌合抗原受體，其受體包含：單鏈變異區域的抗原辨識區域、CD8α的跨膜區域、CD3 zeta或4-1BB/CD137或CD28或以上兩者的訊息區域。因此，在一些條件下，所述轉殖後的T細胞具有重組嵌合抗原受體誘導的T細胞反應。

本揭露提供了一種利用重組嵌合抗原受體而使的原始的（primary）T細胞可以辨認特定腫瘤抗原。因此，本揭露也提供一種方法用以針對某特定細胞族群或是組織而刺激產生T細胞所誘導的免疫反應，而所述方法包含一個步驟將一種可表現重組嵌合抗原受體的T細胞注射至哺乳動物中。

在一實施例中，本揭露中包含一種製造方法，其主要用以生產治療哺乳動物患有大量表現CD19抗原之疾病、失調或症狀之醫藥組成物。其中所述製造方法包含：（a）如同前述之從至少一個哺乳動物的捐贈者（即捐贈人）中分離出週邊血液；（b）從所述捐贈者之週邊血液中分離出淋巴球；以及（c）藉由所分離出之淋巴球依照前述之方法產生所述之醫藥組成物。其中，所述之醫藥組成物為CD3+淋巴球且所述淋巴球包含如前述之重組嵌合抗原受體19蛋白或重組嵌合抗原受體19表現載體或是同時具有兩者。在另一實施例中，本揭露中所述之製造方法如同上述之步驟，但是其所產生之醫藥組成物中僅只有CD3+淋巴球，且所述CD3+淋巴球只具有重組嵌合抗原受體19蛋白或重組嵌合抗原受體19表現載體兩者中之一種。又在另一實施例中，本揭露中所述之製造方法如同上述之步驟，但是在步驟（c）中除了藉由所分離出之淋巴球依照前述之方法產生所述之醫藥組成物，還進一步包含擴增表現嵌合抗原受體（CAR）的淋巴球之步驟。並且，所述擴增方法包含：磷酸鈣處理法、基因槍注射法、病毒感染法、電穿孔法、顯微注射法和脂質體處理法。

在一實施例中，本揭露中包含一種細胞療法，其中T細胞藉由基因修飾以表現重組嵌合抗原受體，並且所述具有重組嵌合抗原受體的T細胞被注射至有需要的受試者。而上述被注射至受試者的細胞具有殺死受試者體內的腫瘤細胞的能力。與抗體療法不同，上述基因修飾之T細胞可以在體內（in vivo ）不斷複製而具有長期持續性，且可持續地控制腫瘤。

在一實施例中，本揭露中之具有重組嵌合抗原受體的T細胞具有穩定地活體內擴增，並且可以持續較長的時間。在另一實施例中，所述重組嵌合抗原受體的T細胞可以演變成可被再活化，以及抑制任何另外的腫瘤生成的特異性記憶性T細胞（memory T cells）。此外，由具有重組嵌合抗原受體的T細胞所引起的抗腫瘤免疫反應可以是主動（active）免疫反應或被動（passive）免疫反應。並且，所述重組嵌合抗原受體所調節的免疫反應可以是被動免疫療法（adoptive immunotherapy）中的一部分，而其主要透過重組嵌合抗原受體上的抗原結合區域，並且驅使所述具有重組嵌合抗原受體的T細胞產生免疫反應。舉例來說，一個具有重組嵌合抗原受體19的T細胞會對一個表現CD19（CD19陽性）的細胞產生免疫反應。

雖然本揭露揭露的慢病毒載體包含：衍生自單克隆抗體的CD19抗原結合片段、人類CD8α的跨膜區域、以及人類4-1BB/CD137和CD3 zeta信息區域，但應解釋為包括任何數目於本文中所述載體的每種組合和變化。也就是說，本揭露包含使用任何抗原結合區域以產生對抗原結合區域專一性的重組嵌合抗原受體誘導的T細胞反應。舉例來說，本揭露的重組嵌合抗原受體上的抗原結合區域可用於針對治療癌症的腫瘤抗原。

而本揭露所可以應用治療的腫瘤，包括未血管化（vascularized）或尚未實質上血管化的腫瘤以及血管化的腫瘤。並且，腫瘤還包含：非固態腫瘤（non-solid tumor）例如：血液腫瘤（例如：白血病、淋巴癌），或可以包括固態瘤（solid tumor）。

在一實施例中，本揭露中所述重組嵌合抗原受體之抗原結合區域是設計針對特定腫瘤。舉例來說，所述重組嵌合抗原受體是針對CD19，因此可以用來治療腫瘤或不適應症包含但是不限於pre-B ALL、adult ALL、mantle cell lymphoma、diffuse large B-cell lymphoma、salvage post allogenic bone marrow transplantation等。在另一實施例中，上述腫瘤或不適應症也可藉由可與CD19、CD20、CD22、ROR1專一性結合之重組嵌合抗原受體而進行如前述之免疫療法。

本揭露中的重組嵌合抗原受體T細胞還可以作為哺乳動物活體外免疫（ex vivo immunization）和/或活體內治療（in vivo therapy）的一種疫苗。 較佳地，所述哺乳動物為人。

所述活體外（ex vivo ）程序為習知之技術，並且在以下內容做更完整之揭露。簡而言之，首先將細胞從哺乳動物（較佳是人）中分離出，並且利用如前述所揭露之重組嵌合抗原受體的載體進行基因修飾（即在體外轉殖或轉染）。前述之具有重組嵌合抗原受體的細胞可以注射於哺乳動物受試者以提供其治療益處。其中，哺乳動物受試者可以是人，並且所述修飾的細胞可以是來自於受試者本身的細胞。或者，相對於受試者，所述修飾的可以是同種異體的（allogeneic）、同基因的（syngeneic）或異種異體的（xenogeneic）。

除了在體外免疫方面使用基於細胞型（cell-based）疫苗外，本揭露還提供用於體內免疫的組合物和方法，以誘導針對患者抗原的免疫反應。

通常來說，如本文中上述活化和擴增的細胞可用於治療和預防在免疫功能降低的個體中出現之疾病。特別地，本揭露中之重組嵌合抗原受體T細胞可用於治療慢性淋巴性白血病。在某些實施例中，本揭露中上述之細胞用於治療患有慢性淋巴性白血病風險的患者。因此，本揭露還提供了用於治療或預防慢性淋巴性白血病的方法，其包含向有需要的受試者注射有效治療量之重組嵌合抗原受體T細胞。

本揭露的重組嵌合抗原受體T細胞可以單獨施用，也可以作為與稀釋劑和/或其它成分（例如：白血球介素2、其它細胞因子、細胞群組合的藥物等）一起施用。簡而言之，本揭露的醫藥組成物包含本文中所述的細胞群、一種或多種醫藥上或生理上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合。而所述組成物還可以包含：緩衝液（例如：中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等）。

本揭露中的藥物組成物可以較合適之方式給藥以進行治療（或預防）疾病。而給藥的劑量和頻率則將由患者的狀況、類型和嚴重性等因素決定，儘管適當的劑量也可以通過臨床試驗來確定。特定類型患者的最佳劑量和治療方案可藉由醫學領域之技術人員透過監測患者的疾病跡象並相對應地調整治療來決定。

在特定實施例中，較佳地將活化的T細胞注射至受試者中，並且隨及重新取血（或進行血液分離術）即依據本揭露中前述之內容活化所述T細胞，並且再次注射這些活化和擴增的T細胞至受試者體內。而此一過程可以每幾週進行一次。

將本揭露中之醫藥組成物注射至受試者中之方式可藉由任何方便的方式進行，包括通過氣溶膠吸入（aerosol inhalation）、注射（injection）、攝取（ingestion）、輸血（transfusion）、植入（implantation）或移植（transplantation）。所述注射方式包含：通過靜脈內（i.v.）、腹膜內（i.p.）、皮下（subcutaneously）、皮內（intradermally）、腫瘤內（intratumorally）、肌肉（intramuscularly）等注射方式。在一實施例中，所述重組嵌合抗原受體T細胞組成物是透過皮內或皮下注射至受試者中。在另一實施例中，所述T細胞組成物也可以直接注射至腫瘤、淋巴結或感染部位中。

在更進一步的實施例中，本揭露中所述具有重組嵌合抗原受體T細胞可以與化學療法、放射療法、免疫抑製劑（例如：cyclosporin、azathioprine、methotrexate、mycophenolate、FK506），抗體或其它免疫去除劑（immunoablative agents）（例如：CAM PATH、anti-CD3抗體或其他抗體療法、細胞毒素（cytoxin）、fludaribine、rapamycin、mycophenolic acid、類固醇、FR901228、細胞激素（cytokines）等等）。在另一實施例中，所述細胞組成物與骨髓移植以及免疫去除療法聯合施行（例如：同時或之後）於患者中，其中並搭配使用化療藥物（例如：fludarabine、external-beam radiation therapy（XRT）、cyclophosphamide、抗體（例如：OKT3或CAMPATH））。在另一實施例中，本揭露中所述細胞組成物於B細胞去除治療（例如：藉由與CD20有反應的藥劑，即Rituxan）後才注射至受試者中。在另一實施方案中，所使用的化療方法可從以下程序中選擇出較佳的方式：（A）Flu/Cy-A：每日注射Fludarabine 30 mg/m² 持續3天，以及每日注射Cyclophosphamide 300 mg/m² 持續3天；（B）Flu/Cy-B：每日注射Fludarabine 30 mg/m² 持續4天，每日注射Cyclophosphamide 500 mg/m² 持續2天；或（C）Flu/Cy-C：每日注射Fludarabine 25 mg/m² 持續3天，每日注射Cyclophosphamide 60 mg/m² 持續1天。

另外，上述給予受試者的治療劑量將依據所治療疾病和受試者的的確切狀態而改變。並且給藥劑量的增減可以根據所屬領域之通常知識而進一步決定。

實驗示例（EXPERIMENTAL EXAMPLE）

本揭露進而透過以下實驗示例進一步詳細描述本揭露實驗過程。 因此，以下之示例僅為了說明的目的而提供，除非另有規定，否則並不限制本揭露之範圍。 因此，本揭露絕不應被解釋為僅限於以下之示例，而應理解為包括本揭露中所提供的教示，以及其他對所屬領域之通常知識者顯而易見之任何變化。

不透過進一步的揭露，相信所屬領域之通常知識者技術人員仍可以藉由本揭露中前述之內容和以下說明實施例進一步製備和利用本揭露之標的，並且實踐所要求保護的方法。 因此，以下實驗實施例具體指出了本揭露中較佳的實施方式，但是其不應被解釋為以任何方式限制本揭露之其餘部分。

以下揭露本揭露之實驗中所使用的材料和方法。

材料及方法（MATERIAL AND METHOD）

製備Anti-CD19 CAR 慢病毒載體

mouse anti-human CD19 scFvs的抗體株是由Uwell Biopharma所製造。其中所述anti-CD19 scFv的序列經過進一步選擇而增加其表現能力於人類細胞中。所述Anti-CD19 CAR基因載體（anti-CD19-scFv-CD8α-CD137-CD3ζ），則是依據NCBI GenBank中所提供的基因序列而設計出。而整個Anti-CD19 CAR基因載體則進一步藉由DNA定序（Genomics, Taiwan）確認所有基因編碼是正確的。

產生慢病毒並測量病毒含量（viral titer）

首先，將DNA載體轉殖至HEK 293T細胞中，其中搭配包裹殖體pCMVdeltaR8.91以及pMD.G（Academia Sinica, Taiwan）藉由X-tremeGENE 9（Roche, Basel, Switzerland）。而具有病毒顆粒之懸浮液則進一步被收集，且透過Lenti-X Concentrator（Clontech Laboratories, Mountain View, CA）濃縮。濃縮後的病毒在分裝後，隨即置於-80°C中保存以供後續使用。本實驗中所使用的所有慢病毒均是從上述冷凍保存原液中而來。慢病毒含量之檢測則是透過SUP-T1細胞，並且是以三倍稀釋為基礎來檢測。簡而言之，50 ul的三倍稀釋濃度之慢病毒從1：3連續稀釋至1：2,187／well的稀釋慢病毒且再與SUP-T1細胞（20,000 個／100ul／well）一起培養於96微孔盤中，並且培養至隔日。轉殖兩日後，SUP-T1細胞則藉由Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat anti-mouse IgG,F(ab’)2 fragment specific（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）抗體，並搭配PE-conjugated streptavidin（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）抗體進行染色。隨後，帶有CAR的細胞則是使用流式細胞儀（FACSCalibur cytometer, Becton Dickinson）進行檢測，並搭配軟體FlowJo進行分析。其中，僅需1〜20％的CAR陽性細胞的稀釋液進行含量計算。則所述計算方式為將CAR陽性細胞的百分比乘以每孔接種的細胞數（20,000個），然後除以加入的上清液的實際體積（ml），以確定上清液中轉殖的慢病毒含量（單位／ml）。病毒感染劑量（MOI）之定義為病毒顆粒的轉殖單位與目標T細胞數目的比率。

細胞株

HEK293T細胞和人類白血病細胞株（SUP-T1、Raji、RS4;11）均購自American Type Culture Collection（ATCC; Rockville, MD）。其中，SUP-T1用於測量病毒含量試驗中。另外，人類白血病細胞株K562購自Bioresource Collection and Research Center（BCRC; Hsinchu, Taiwan）。而Raji、RS4;11、SUP-T1、K562細胞均培養於RPMI-1640（Invitrogen, Carlsbad, CA）培養基中，而HEK 293T細胞則培養於DMEM（HyClone; GE Healthcare, South Logan, UT）培養基中；而上述兩種培養基均添加10%胎牛血清（FBS; Gibco, Carlsbad, CA）和100 mg/ml penicillin/streptomycin（Gibco, Carlsbad, CA）。

製備螢光腫瘤細胞

為了增加注射於免疫缺陷小鼠中的腫瘤細胞的視覺辨識率，因此進一步將Lentivirus-EF1alpha-MCS-IRES-Luciferase plasmid（Addgene，Cambridge，MA）轉殖入Raji細胞中，隨後具有較高Luc表現量的Raji-Luc細胞則藉由FACSAria流式細胞分選儀（BD Biosciences, San Jose, CA）分選出。

轉殖人類T細胞

周邊血是從健康成年捐贈者之血液樣本中獲得，而所述樣本為從高雄榮民總醫院機構審查委員會所准予（計畫編號：VGHKS13-CT6-11）。首先，利用Lymphoprep密度梯度離心法（Nycomed，Oslo，Norway）從樣品中分離出單核細胞，並且使用培養基洗滌兩次。人類T細胞則是進一步使用抗體（CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、CD235a）搭配磁珠套件（Pan T Cell Isolation Kit II; Miltenyi Biotec）並進行負選（negitive selection）而純化出。另外，T細胞上的CD3和CD56的表現百分比是藉由CD3-PerCP和CD56-FITC抗體進行染色（BD Biosciences，San Jose，CA）並且搭配流式細胞儀（FACSCalibur，Becton Dickinson）測定。純化的T細胞將培養於含有10％FBS、重組人類白血球介素2（rHuIL-2，50 IU/ml；Proleukin，Novartis Pharma）、anti-CD3和anti-CD28磁珠（Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA）的RPMI-1640培養基中，直到進行病毒轉殖。在24小時內，使用相同MOI的慢病毒轉殖上述之T細胞，以產生具有不同單鏈變異區片段所衍生的結合區域的重組嵌合抗原受體T細胞。每2天更換一次新的培養基且總共培養8天，第5天時將細胞轉移到G-Rex 24微孔盤（Wolson Wolf Manufacturing，Sanit Paul, MN ）中，至第8天細胞收成。最後，上述T細胞藉由Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat anti-mouse IgG, F(ab’)2 fragment specific 抗體（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）與PE-conjugated streptavidin 抗體（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）進行染色，以進一步檢測具有重組嵌合抗原受體的T細胞之百分比為多少。

試管中功能試驗（In vitro functional assays）

為了進一步檢測anti-CD19重組嵌合抗原受體T細胞對B細胞惡性腫瘤的專一性抗腫瘤能力，因此以CD19陽性的RS4;11細胞和Raji細胞作為目標細胞，而CD19陰性的K562細胞則是作為對照細胞。將anti-CD19重組嵌合抗原受體T細胞（以E代表）和目標細胞（以T代表）依指定的比例（E：T）共同培養於96微孔盤中。培養24小時後，收集所以細胞並洗滌，且以PE-conjugated mouse anti-human CD19抗體（BD Biosciences, San Jose, CA）進行染色。最後透過FACSCalibur流式細胞儀分析CD19陽性細胞的百分比，即代表剩餘的白血病細胞數量。

而前述培養細胞的上清液也被進一步收集，並且搭配使用酵素免疫分析法（ELISA）套件（R＆D Systems Inc, Minneapolis, MN）以檢測重組嵌合抗原受體在接觸白血病細胞後所產生干擾素γ（IFN-γ）的含量。更明確地，使用微孔盤偵測儀（Anthos 2010, Biochrom Ltd., Cambridge, UK）來測量每個孔中在波長450 nm的吸光度。細胞毒殺檢驗則是用以檢測重組嵌合抗原受體T細胞的抗白血病的能力（anti-leukemia ability）。目標細胞（代表符號為T）首先被均勻懸浮於培養基RPMI-1640（含10% FBS）中，並且進一步以Calcein AM（BD Biosciences, San Jose, CA）標記細胞，最後平均分散於96孔平底微孔盤（Costar, Corning, NY）中。而重組嵌合抗原受體T細胞（代表符號為E）一樣也是平均懸浮於培養基RPMI-1640（含10% FBS）中，並且以不同的細胞數量比例（E:T ratios）與目標細胞混合，並且共同培養4小時。之後，上述之混合細胞進一步以propidium iodide（PI）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）染色，而重組嵌合抗原受體T細胞的毒殺能力最後藉由流式細胞儀FACSCalibur（Becton Dickinson）進一步檢測，更明確地，是藉由目標細胞中有多少細胞為呈現Calcein AM陽性和propidium-iodide陰性之狀態，即呈現活細胞狀態。

流式細胞儀檢測

實驗中之細胞均可藉由流式細胞檢測方法檢測其細胞特性，無論所述細胞是藉由Ficoll-Paque分離法所剛分離出的，或是先前冷凍保存的。而細胞的多維免疫免疫表型分析（Multi-parametric immunophenotyping）是以每種條件下以4×10⁶ 個細胞去進行分析。另外，染色條件如以下內容所示，將細胞以每100 ul中含1×10⁶ 個細胞的濃度回溶於PBS中並至於冰上，之後使用抗體以製造商所推薦的試劑濃度在冰上進行染色30分鐘。染色完畢再使用PBS洗滌。最後以流式細胞儀LSRII（BD Immunocytometry systems）（其內置藍光雷射（488 nm）、紫光雷射（405 nm）、綠光雷射（532 nm）、紅光雷射（633 nm）以及相對應合適之濾鏡組合）以進一步分析經由上述染色過程處理後之細胞。其中，本實驗中每次染色至少需要100,000個CD3+細胞。而在功能試驗中，細胞同樣經由上述過程進行洗滌、表面染色；而在此實驗中每次染色至少需要50,000個CD3+細胞。螢光補償值（compensation values）則是使用單抗體染色劑建立，並且使用流式細胞儀自動計算和應用。而資料的分析則是使用軟體FlowJo（Version 8.8.4, Treestar）。

淋巴瘤動物實驗（Xenogeneic Lymphoma Models）

我們使用聯合免疫缺陷（SCID）－淋巴瘤人異種移植模式實驗來測試不同的重組嵌合抗原受體（UW022、UW026和FMC63）修飾的CD3+淋巴球細胞在活體內的持久性和抗腫瘤作用。因此，免疫缺陷小鼠（簡稱ASID小鼠；品系：NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl /YckNarl）則用於上述實驗中，並且相關實驗均依照高雄榮民總醫院機構動物護理和使用委員會之要求而進行。

而本實驗的第一步是將Raji/Luc+細胞植入小鼠中。 因此，在第0天（Day 0）時將Raji/Luc+細胞（每隻小鼠5×10⁵ 個細胞）藉由腹腔內注射（i.p.）注射ASID小鼠（8〜10週齡；台灣國家實驗動物中心）的腹膜內。而植入的Raji/Luc+細胞所形成之腫瘤則使用如下所述的體內成像系統進一步測量。 簡而言之，將D-luciferin potassium salt（劑量：3 mg／小鼠；Perkin Elmer, Waltham, MA）利用腹腔內注射（i.p.）注射至小鼠的腹膜內，之後在每次需要檢測時使用活體影像檢測儀IVIS Spectrum（Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA）進行分析。 從表現luciferase的細胞發出的光子（photon）則可以藉由Living Image 3.0軟體做進一步的定量。 當小鼠所發出的光子達到1×10¹⁰ 個光子／秒時，則小鼠將進行安樂死，或者如果它們生理數值提早顯示需要進一步提早安樂死的徵兆，則小鼠將提早進行安樂死。

為了進一步測試具有不同anti-CD19的重組嵌合抗原受體（UW022、UW026和FMC63）修飾的CD3+淋巴球細胞的抗腫瘤作用，因此將上述不同修飾的淋巴細胞先進行擴增置所需數量。 隨後，將上述不同的anti-CD19重組嵌合抗原受體（UW022，UW026和FMC63）轉殖的T細胞和模擬轉殖的T細胞懸浮於培養基RPMI-1640（含10％ FBS）中並擴增培養8天，之後，在Raji-Luc注射至小鼠後7天時（即Day 7）利用腹腔內注射（i.p.）注射（每隻小鼠1×10⁷ 個細胞）至小鼠腹膜內。在另一個實驗控制組中，注射至小鼠中的是培養基而不是T細胞。

統計分析

本實驗中之統計分析則是使用學生T檢驗（Student's t-test）來統計樣本之間差異的顯著性，並且當P ＜0.05則代表兩者間具有顯著差異。 在淋巴瘤動物實驗中的生物冷光影像結果，則是使用平均值±s.d來總結每組小鼠於不同時間點時期所發出的信號強度。

實驗（EXAMPLES）

以下實驗則是主要作為實例之提供，並不意圖以任何方式限制本揭露之範圍。

實驗一：不同重組嵌合抗原受體19之T細胞均呈現相似增生能力

三種具有不同的重組嵌合抗原受體表達載體（即UW022、UW024和UW026）藉由前述之方法而構建出。進一步地，由UW022、UW024和UW026所形成的重組嵌合抗原受體19均具有類似結構組合，包含CD19抗原結合片段中的單鏈變異區片段（scFv）、CD8α的跨膜結構區域、信號結構區域由CD3ζ鏈（即免疫受體酪氨酸激活基序）和4-1BB/CD137（即共同刺激分子）所構成的訊息區域。此外，UW022、UW024和UW026重組嵌合抗原受體19中單鏈變異片段的重鏈和輕鏈的氨基酸組合有三種，分別是：SEQ ID NO ：8與SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：12與SEQ ID NO：11。 UW022、UW024和UW026中重組嵌合抗原受體19中單鏈變異區片段的重鏈和輕鏈的核酸序列組合是：SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：6與SEQ ID NO：5。而在本實驗中，另一個重組嵌合抗原受體19（FMC63）則用以作為對照比較。而UW022、UW024和UW026載體的轉殖效率則可以藉由載體上的GFP以及anti-Fab抗體來檢測。根據圖2A和圖2B中GFP陽性的CD3+淋巴球細胞（即T細胞）的定量結果，轉殖UW022載體的T細胞比其他細胞呈現具有最多的GFP陽性細胞（約29.71％）（如圖所揭示UW024：9.67％；UW026：12.86％；FMC63：6.32％）。因此，有上述結果得知UW022表現載體相較於其他的重組嵌合抗原受體19表現載體（UW024、UW026和FMC63）具有最高的轉殖效率。另外，根據圖2A和2B中所揭示之初代（primary）人類CD3+淋巴球細胞上Fab表現的定量結果，其中轉殖UW022載體的細胞有21.6％表現Fab、轉殖UW024載體的細胞有9.77％表現Fab、轉殖UW026載體的細胞有10.1％表現Fab、轉殖FMC63載體的細胞有2.22％表現Fab，根據上述之定量結果均顯示UW022載體、UW024載體和UW026載體相較於FMC63載體有較高之轉染效率和高表達效率。更進一步地，其中值得注意的是在圖2B中顯示，UW022載體相較於FMC63載體呈現顯著性較高的效率可被轉殖進人類CD3+淋巴球細胞中並且進一步誘導CD3+淋巴球細胞表現重組嵌合抗原受體19蛋白。儘管UW024載體和UW026載體都顯示出較少的轉染和表達能力相較於UW022載體，但與FMC63相比，它們仍然表現出較高的能力。此外，UW024載體和UW026載體均呈現了相似的能力（即轉染效率和表達效率）。為了進一步確認具有UW022載體、UW024載體、UW026載體或FMC63載體之修飾T細胞（以下本文則分別以「UW022-T」細胞、「UW024-T」細胞、「UW026-T」細胞或「FMC63」細胞代替）的生物活性（即增殖能力／速率） 與上述結果相似或相關。換而言之，UW022-T細胞相較於UW026-T細胞或FMC63-T細胞是否具有最高的增殖能力？因此，首先將UW022-T細胞、UW024-T細胞、UW026-T細胞或FMC63-T細胞中GFP和Fab雙重陽性的細胞純化出，並且進一步培養。 培養至第2、5、8天時透過細胞計數以檢測各組細胞的增殖能力。根據圖2C所揭示，UW022-T細胞、UW024-T細胞、UW026-T細胞或FMC63-T細胞的細胞生長速度相似，因此其增殖能力均相似。

實驗二：UW022-T細胞對CD19陽性的腫瘤細胞具有高毒殺能力

為了進一步評估每個重組嵌合抗原受體19細胞（即：UW022-T細胞、UW024-T細胞、UW026-T細胞或FMC63-T細胞）對於CD19陽性的腫瘤細胞的毒殺能力，所述重組嵌合抗原受體19 T細胞與RS4;11細胞或Raji細胞共同培養於指定時間。隨後，藉由流式細胞儀分析於共培養實驗後所剩餘之CD19陽性細胞的數量。由圖3A和圖3B的結果顯示，儘管所述重組嵌合抗原受體19 T細胞均顯示可以殺死前述兩種CD19陽性的腫瘤細胞（即RS4;11細胞或Raji細胞），但是其中UW024-T細胞相較於其他細胞其顯示具有最高的腫瘤細胞毒殺能力（在RS4;11細胞組別中僅殘存4.01％的RS4;11細胞；在Raji細胞組別中僅殘存0.41％的Raji細胞）。由圖3A和圖3C的結果顯示，雖然UW024-T細胞（殘存41.7％的RS4;11細胞）、UW026-T細胞（殘存38.5％的RS4;11細胞）、FMC63-T細胞（殘存45.1％的RS4;11細胞）三者均顯示比UW022-T細胞僅具有較低的細胞毒殺能力，但是UW024-T細胞和UW026-T細胞仍然比FMC63-T細胞對RS4;11腫瘤細胞具有較高的毒殺能力。由圖3B和圖3D的結果顯示，所述重組嵌合抗原受體19 T細胞對Raji細胞均呈現顯著的細胞毒殺能力，然而，其中UW022-T細胞（殘存0.41％的Raji細胞）、UW024-T細胞（殘存2.60％的Raji細胞）、UW026-T細胞（殘存5.16％的Raji細胞）三者仍高於FMC63-T細胞（殘存7.42％的Raji細胞）。

為了進一步證實圖3A〜3D的細胞毒殺能力的結果，因此藉由酵素免疫分析法（ELISA）分析由所述重組嵌合抗原受體19 T細胞分泌至培養基中IFN-γ的含量而進一步驗證。根據圖3E和3F的結果顯示，UW022-T細胞相對於其他所述重組嵌合抗原受體19 T細胞無論對於RS4;11細胞或Raji細胞均可釋放出最高量的IFN-γ。 更進一步地，其中值得注意的是相比於MOCK組別，UW022-T細胞可以對RS4;11細胞或是Raji細胞分泌顯著性較多的IFN-γ。因此，所述重組嵌合抗原受體19 T細胞確實對CD19陽性的腫瘤細胞（例如：RS4;11細胞和Raji細胞）具有細胞毒殺能力。 此外，UW022-T細胞與其他細胞相比更呈現顯著的細胞毒殺能力。

為了進一步評估每種重組嵌合抗原受體19 T細胞的細胞毒殺能力的最大效用，我們以不同比例的腫瘤細胞與重組嵌合抗原受體19 T細胞共同培養（例如：CAR19T細胞相對於腫瘤細胞以1：1、2： 1、5：1或是10：1之比例）。 此外，本文所使用的腫瘤細胞包括兩個CD19陽性的腫瘤細胞（即：RS4;11細胞和Raji細胞）和一個CD19陰性的腫瘤細胞（即：K562細胞）。 在針對K562細胞毒殺能力實驗的結果中，而四種所述重組嵌合抗原受體19 T細胞（UW022-T細胞、UW024-T細胞、UW026-T細胞、FMC63-T細胞）均呈現類似的細胞毒殺能力，並且毒殺能力與細胞數量相關。 然而，增加細胞數量僅稍微增加了毒殺能力（即供體1：約7〜17％；供體2：約24〜40％）。

由RS4;11細胞和Raji細胞的實驗結果顯示，所有四種所述重組嵌合抗原受體19 T細胞（UW022-T細胞、UW024-T細胞、UW026-T細胞、FMC63-T細胞）顯示其細胞毒殺能力與細胞數量呈正相關。 根據表一和圖4A之揭露，UW022-T細胞是所有重組嵌合抗原受體19 T細胞中對RS4;11細胞或Raji細胞的細胞毒殺能力最高。 然而，增加UW022-T細胞的細胞數（從5：1變成10：1）僅略微增強對CD19陽性腫瘤細胞的毒殺作用。 另一方面，若增加其他重組嵌合抗原受體19 T細胞（UW024-T細胞或UW026-T細胞）數量可增強對腫瘤細胞的細胞毒殺。例如，將供體1組的UW026-T細胞倍增可將其毒殺能力從19.79％增加至53.30％。 然而，只有UW022-T細胞可以以不同的比例對不同的腫瘤細胞產生最高的細胞毒殺能力。

表一：不同比例的重組嵌合抗原受體19 T細胞對腫瘤細胞的細胞毒殺能力

同樣地，我們還使用流式細胞儀來確認先前的實驗結果。 首先，將細胞以PI和calcein-AM進行雙重染色，隨後再將染色的細胞通過流式細胞儀進行分析。 PI和calcein-AM分別用於以染色區別活細胞和死細胞。calcein-AM染料僅可染色於活細胞上，PI僅可染色於死細胞上（即壞死細胞（necrosis cells））。 根據圖4B的結果，UW022-T細胞比FMC63-T細胞更能促使大量的PI陽性且calcein-AM陰性的細胞。 也就是說，UW022-T細胞可以有效地誘導腫瘤細胞壞死，更具體地說是CD19陽性的腫瘤細胞。

實驗三：重組嵌合抗原受體19 T細胞可增強對CD19陽性腫瘤細胞的細胞毒殺於體內狀態下

為了進一步評估所述重組嵌合抗原受體19 T細胞於體內（in vivo）環境下的持續性，我們則藉由ASID小鼠淋巴瘤異種移植實驗和生物活體影像系統（即IVIS系統）來做進一步證實。 ASID小鼠淋巴瘤異種移植實驗設計如圖5A所揭示。首先，我們一開始以FFLuc標記Raji細胞，隨後將標記的Raji細胞在第0天時（即Day 0時）以腹腔內注射方式將腫瘤植入小鼠中。在將FFLuc標記的Raji細胞打入ASID小鼠中後，我們則利用IVIS系統監測ASID小鼠中FFLuc標記Raji細胞的生長於第6、14、21、28、34天（即在Day 6、14、21、28、34）。在植入之後， 我們發現Raji細胞（5×10⁵ 個）主要分布在淋巴結和腹腔內（如圖5B中控制組所揭示）。在設定腫瘤植入的時間和位置之後，我們進一步評估了T細胞對腫瘤於體內的持續性。將標記的Raji細胞移植至小鼠體內後，更進一步將對照T細胞和三種重組嵌合抗原受體19 T細胞（FMC63-T、UW022-T、UW026-T）（1×10⁷ 個細胞∕小鼠）注射入小鼠體內。更明確來說，本實驗首先將FFLuc標記Raji細胞於第0天時（即Day 0時）以腹腔內注射方式植入小鼠中以建立腫瘤模式。當Raji細胞注射至小鼠體內6天後（即於第6天時（Day 6）），則進一步以生物活體影像儀拍攝接種之小鼠以確定Raji細胞有成功於小鼠上形成預期大小之腫瘤。進一步地，於第七天時（即在Day 7時）再將對照T細胞和三種重組嵌合抗原受體19 T細胞（FMC63-T、UW022-T、UW026-T）分別注射至小鼠中，之後則每7天（即在Day 14、21、28、34時）利用生物活體影像儀觀察小鼠上腫瘤大小變化狀況。簡而言之，FFLuc標記Raji細胞與T細胞均分別均只被接種至小鼠身上一次。

圖5B和圖5C揭示了在注入各種重組嵌合抗原受體19 T細胞後，移植的Raji腫瘤細胞的發展和變化。一方面，Raji細胞在植入小鼠體內6天後（如圖5B中Day 6所示之影像）即可容易檢測到由Raji細胞所產生的生物冷光（bioluminescence）。另一方面，在所有注射T細胞的組別（包含對照T細胞和三種重組嵌合抗原受體19 T細胞（FMC63-T、UW022-T、UW026-T））均顯示其組別老鼠體內Raji細胞所產生的生物冷光信號低於無治療組。然而，在UW026-T細胞處理組中有兩個個體顯示出相反的結果（即有較多的Raji腫瘤細胞增生）。如圖5B和圖5C所示，與無治療組相比mock-T細胞也可以減少和延緩腫瘤發展。然而，FMC63-T細胞注射組和UW022-T細胞注射組都顯著抑制腫瘤細胞發育。更重要的是，UW022-T細胞注射組數據顯示出UW022-T細胞相較於FMC63-T細胞具有最佳的能力於抑制Raji細胞發育。並且，於UW022-T細胞注射至小鼠後，在後續各觀察時間點下Raji腫瘤細胞的生物冷光信號幾乎不增加且相對於其他治療組（Mock-T、FMC63-T、UW022-T、UW026-T）或非治瞭組（None）則其冷光強度是非常微弱。換句話說，注射UW022-T細胞的小鼠相對於其他組別中之小鼠，其身上的腫瘤大小並無明顯增加的趨勢，且有略微減小。更進一步地，UW022-T細胞在小鼠體內也比FMC63-T細胞呈現更高的細胞毒殺能力，如同前面試管中實驗之結果。

雖然以上內容已經詳細描述了本揭露及其優點，但是應當理解的是，在不脫離由本揭露範圍所要求限定之本揭露中所揭露之精神和範圍的情況下，可以在本文中進行各種改變、替換和更改。 例如：上述之討論中的許多過程可以以不同的方法實現，並被其他過程或其組合替代。

此外，本揭露的範圍不限於本揭露說明中描述的方法、製造、組合物、方法和步驟的特定實施例。如同本領域的普通技術人員將可通過本揭露說明的公開內容、目前存在或將來開發的方法、製造、組合物、方法和步驟而輕易理解到，根據本揭露說明的展示內容，可實質上執行或實現與本揭露說明所述的相應實施例實質相同的功能或結果。因此，隨附的權利要求範圍旨在將此類方法、製造、組合物、方法或步驟包含在其範圍內。

附圖圖片中通過示例而非局限性方法展示出了一個或多個實施例，其中具有相同參考數位識別碼的元件始終表示類似元件。附圖並非等比例圖，除非另有披露。

圖1A〜1B為一系列的示意圖揭示了基因轉殖用的載體圖譜與細胞（外週邊血單核細胞（PBMCs）與淋巴球）純化實驗的純度測試結果。圖1A揭示了一個慢病毒載體（ pLAS5w.PeGFP-I2-Puro）的基因圖譜用以將特定基因轉殖至T細胞。所述圖譜中也揭示了各遺傳因子的主要功能。簡而言之，所述慢病毒載體包含：一個可以直接用以表現辨認CD19抗原的單鏈變異區片段（由小鼠或人類單株抗體中產生）、一個人類CD8α之跨模區域、一個由人類4-1BB/CD137的共同刺激分子與CD3 zeta所組成的訊息區域。持續性表現此慢病毒載體主要是由延長因子1α（EF-1α）之啟動子所驅動，另外其他遺傳基因所代表意義如下：長末端重複序列（LTR）、Rev響應元件（RRE）、內部核糖體進入位點（IRES）、綠色螢光蛋白（eGFP）、土撥鼠肝炎病毒轉錄調控元件（WPRE）。圖1B揭示了純化後外週邊血單核細胞與T淋巴球上的CD3與CD56抗原的表面染色結果。並且，FACS染色圖中向上偏移（依Y軸方向）的細胞族群代表的是表現CD3的細胞群，而向右偏移（依X軸方向）的細胞族群則是代表表現CD56的細胞群。

圖2A〜2C為一系列的示意圖揭示了UW022-CAR、UW024-CAR、UW026-CAR轉殖至純化的CD3淋巴球並在其表面表現的能力，並且所述三種改良CD3淋巴球的增殖能力。圖2A與圖2B揭示了在轉殖後的改良CD3淋巴球上Fab與綠螢光蛋白（GFP）的表現狀況。並且如圖2A所示，FACS染色圖中向上偏移（依Y軸方向）的細胞族群代表的是表現Fab的細胞群（即代表CD19-CAR），而向右偏移（依X軸方向）的細胞族群代表的是表現綠螢光蛋白的細胞群（即帶有慢病毒載體的細胞）。圖2B則是一統計數據用以揭示圖2A中轉殖後的改良CD3淋巴球上Fab與綠螢光蛋白（GFP）的表現狀況。每筆資料代表三重複實驗並平均後之數值。圖2C是另一筆統計資料用以揭示轉殖後的各種改良CD3淋巴球在不同時間點細胞數量增值之倍數。如同上述，每筆資料代表三重複實驗並平均後之數值。

圖3A〜3F為一系列的示意圖揭示了各種重組嵌合抗原受體19（CAR19）改良CD3淋巴球對於兩種帶有CD19抗原之血癌細胞株RS4;11與淋巴癌細胞株Raji的毒殺能力。圖3A與圖3B為細胞表面染色圖用以揭示將上述不同重組嵌合抗原受體19改良CD3淋巴球與兩種帶有CD19抗原之癌細胞株一起培養24小時後，最後所殘存的癌細胞數量。明確來說，FACS染色圖中而向右偏移的細胞族群代表的是表現CD19陽性的細胞群（即RS4;11細胞或Raji細胞）。而圖3C與圖3D則統計資料用以揭示上述圖3A與圖3B所述之殘存細胞數量。而每筆資料代表三重複實驗並平均後之數值。圖3E與3F則為酵素免疫吸附實驗（ELISA）結果，其主要用以揭示將上述不同重組嵌合抗原受體19改良CD3淋巴球與兩種帶有CD19抗原之淋巴癌細胞一起培養24小時後，所述不同改良CD3淋巴球所分泌至培養液中的干擾素-γ（INF-γ）含量。其中，每筆資料代表三重複實驗並平均後之數值。

圖4A〜4B為一系列的示意圖揭示了各種重組嵌合抗原受體19改良CD3淋巴球對於帶有CD19抗原之淋巴癌細胞株（RS4;11與Raji）的毒殺能力是與改良CD3淋巴球數目呈正相關。進一步說明，圖4A揭示了以不同比例的各種重組嵌合抗原受體19改良CD3淋巴球與癌細胞株一起培養4小時，以測試所述改良CD3淋巴球之同種異體毒殺能力。其中所述淋巴癌細胞包含具有CD19抗原（RS4;11與Raji細胞）與不具CD19抗原（K562細胞）之癌細胞株。並且，每筆資料代表三重複實驗並平均後之數值。另外，圖4B主要揭示了UW022轉殖的改良CD3淋巴球與FMC63、UW024及UW026相比，具有能最佳的細胞毒殺能力，不論是針對RS4;11細胞或Raji細胞一起共同培養4小時後均有相同的結果。

圖5A〜5C為一系列的示意圖揭示了活體內（in vivo ）毒殺能力實驗之設計以及各種重組嵌合抗原受體19改良CD3淋巴球之活體內毒殺能力。其中，圖5A揭示了活體內（in vivo ）毒殺能力實驗之各時間點所應執行之特定步驟。更進一步說明，NOD/SCID小鼠於起始日（Day 0）時注射淋巴癌細胞（Raji/Luc⁺ 細胞）。另外，各種重組嵌合抗原受體19改良CD3淋巴球則於Day7注射至小鼠中，之後每周進行活體影像照射。而圖5B是活體影像系統照射結果，其用以揭示在不同時間點小鼠體內的淋巴癌（Raji/Luc⁺ 細胞）之生長情形。圖5C則是統計資料用以揭示以活體影像系統偵測腫瘤大小所呈現出的生物冷光強度（BLI），並用其結果來定量腫瘤之大小。並且每筆資料代表五重複實驗並平均後之數值。

附圖僅為示意圖，且無限制。在附圖中，為達到說明目的，一些元件的尺寸可能過大，且未按比例繪製。該尺寸和相對尺寸不一定對應於本揭露的實際實施方式。本揭露中的所有參考標記不得解釋為對本揭露中權利要求範圍的限制。

SEQUENCE LISTING<110> 宇越生醫科技股份有限公司 <120> 醫藥重組受體組成物及方法<130> UWBI-1TW<160> 16 <170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 322<212> DNA<213> 人工合成序列<223> Chemically Synthetic anti-CD19 Light Chain Variable Region - UW022L<400> 1gagatcgtgc tgacacagtc cccagccacc ctgtctctga gccctggaga gagggccacc 60ctgtcctgct ctgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggtatcagca gaagccagga 120caggcaccaa ggctgctgat ctacgacaca tctaagctgg ccagcggaat cccagcacgg 180ttcagcggat ccggatctgg aaccgacttc accctgacca tcagctccct ggagccagag 240gacgtggccg tgtactattg cttccagggc agcgtgtatc ccttcacatt tggccagggc 300accaagctgg agatcaagag at 322<210> 2<211> 360<212> DNA<213> 人工合成序列<223> Chemically Synthetic anti-CD19 Heavy Chain Variable Region - UW022H<400> 2caggtgcagc tgcaggagag cggaccagga ctggtgaagc cttcccagac actgtctctg 60acatgtaccg tgtccggcgg cagcatctcc acctctggca tgggagtggg atggatcagg 120cagcaccctg gcaagggcct ggagtggatc ggccacatct ggtgggacga tgacaagcgg 180tacaacccag ccctgaagtc ccgggtgaca atcagcgtgg atacctccaa gaatcagttc 240tctctgaagc tgtcctctgt gacagccgcc gacaccgccg tgtactattg cgcccgcatg 300gagctgtggt cctactattt tgattattgg ggccagggca cactggtgac cgtgagctcc 360<210> 3<211> 333<212> DNA<213> 人工合成序列<223> Chemically Synthetic anti-CD19 Light Chain Variable Region - 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Claims (20)

1. 一種重組嵌合抗原受體，其包含： CD19抗原結合片段， 其中，所述CD19抗原結合片段是單鏈變異區片段，並且所述單鏈變異區片段包含：重鏈和輕鏈和連接序列， 其中，所述重鏈包含：第一胺基酸序列，其選自：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或上述任意之組合，並且所述輕鏈包含：第二胺基酸序列，其選自：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或上述任意之組合； 跨膜區域，其包含：CD28、IgG1、CD4、CD8α的跨膜區域或上述任意之組合；以及 訊息區域，其包含：免疫受體酪氨酸激活基序、共同刺激分子或上述任意之組合。
2. 如請求項1所述之重組嵌合抗原受體，其中所述跨膜區域是CD8α的跨膜區域。
3. 如請求項1所述之重組嵌合抗原受體，其中所述共同刺激分子的數目為至少二個。
4. 如請求項1所述之重組嵌合抗原受體，其中所述免疫受體酪氨酸激活基序包含：CD3 zeta。
5. 如請求項1所述之重組嵌合抗原受體，其中所述共同刺激分子包含：CD27的、CD28的、CD30的、4-1BB/CD137的、OX40的或herpesvirus entry mediator （HVEM）的共同刺激分子或上述任意之組合。
6. 如請求項1所述之重組嵌合抗原受體，其中所述共同刺激分子包含：4-1BB/CD137的共同刺激分子。
7. 一個重組嵌合抗原受體（CAR）的表現載體，其包含： CD19抗原結合片段序列， 其中，所述CD19抗原結合片段序列包含：重鏈變異區域的核苷酸序列和輕鏈變異區域的核苷酸序列和連接序列的核甘酸序列， 其中，所述重鏈變異區域的核苷酸序列選自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或上述任意之組合，並且所述輕鏈輕鏈變異區域的核苷酸序列選自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或上述任意之組合； 跨膜區域序列，其包含：CD28的、IgG1的、CD4的或CD8α的跨膜區域序列或上述任意之組合；以及 訊息區域序列，其包含：免疫受體酪氨酸激活基序序列、共同刺激分子序列或上述之組合。
8. 如請求項7所述之表現載體，其中所述跨膜區域序列為CD8α的跨膜區域序列。
9. 如請求項7所述之表現載體，其中所述共同刺激分子的數目為至少兩個。
10. 如請求項7所述之表現載體，其中所述免疫受體酪氨酸激活基序序列包含：CD3 zeta。
11. 如請求項7所述之表現載體，其中所述共同刺激分子序列包含：CD27、CD28、CD30、4-1BB/CD137、OX40或herpesvirus entry mediator （HVEM）的共同刺激分子的序列或上述任意之組合。
12. 如請求項7所述之表現載體，其中所述共同刺激分子序列包含：4-1BB/CD137的共同刺激分子的序列。
13. 一種醫藥組成物，其包含：一群重組細胞，其包含：如請求項1所述之重組嵌合抗原受體（CAR）、如請求項7所述之表現載體或上述任意之組合。
14. 如請求項13所述之醫藥組成物，其中所述重組細胞是哺乳動物細胞。
15. 如請求項13所述之醫藥組成物，其中所述重組細胞是淋巴球。
16. 如請求項13所述之醫藥組成物，其中所述重組細胞是T細胞或NK細胞。
17. 一種製造方法，其用以生產治療哺乳動物患有大量表現CD19抗原之疾病、失調或症狀之醫藥組成物，其包含： （a）哺乳動物捐贈者中分離出週邊血液； （b）從所述週邊血液中分離出淋巴球；以及 （c）藉由所述淋巴球產生如請求項13所述之醫藥組成物。
18. 如請求項17所述之製造方法，其中步驟（c）還包含：（d）擴增表現嵌合抗原受體的淋巴球之步驟。
19. 如請求項18所述之製造方法，其中所述擴增表現之方法包含：磷酸鈣處理法、基因槍注射法、病毒感染法、電穿孔法、顯微注射法和脂質體處理法。
20. 如請求項17所述之製造方法，其中所述淋巴球是T細胞或NK細胞。