JP2022531814A

JP2022531814A - 改変細胞の増幅およびその応用

Info

Publication number: JP2022531814A
Application number: JP2021540137A
Authority: JP
Inventors: シャオ，レイ; プー，チェンフェイ; カオ，ジーユアン
Original assignee: Innovative Cellular Therapeutics Holdings Ltd Grand Cayman
Current assignee: Innovative Cellular Therapeutics Holdings Ltd Grand Cayman
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2022-07-12

Abstract

本開示は、インビボおよび／またはインビトロでのＴ細胞応答および／またはＣＡＲ細胞増幅および／または維持を増強する組成物および方法に関する。例えば、Ｔ細胞による療法を増強する方法は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変Ｔ細胞と、第２のＣＡＲを含む改変Ｔ細胞とを含む混合Ｔ細胞集団を投与することを含み、ここで、前記第１のＣＡＲの結合ドメインは第１の抗原に結合し、前記第２のＣＡＲの結合ドメインは第２の抗原に結合する。前記第１の抗原は、前記第２の抗原と異なる。実施形態では、前記第１のＣＡＲは、白血球の表面分子または抗原に結合する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月１９日に提出された米国特許出願第１６／４４５，９６５号、および２０１９年４月１７日に提出された米国特許出願第１６／３８７，１６６号の一部継続出願である。本出願はさらに、２０１９年１１月８日に提出された米国仮出願第６２／９３２，５８７号、２０１９年９月１９日に提出された米国仮出願第６２／９０２，７６６号、２０１９年８月２３日に提出された米国仮出願第６２／８９１，１３１号、２０１９年８月２１日に提出された米国仮出願第６２／８８９，９２６号、２０１９年５月１６日に提出された米国仮出願第６２／８４８，９６１号、２０１９年５月１０日に提出された米国仮出願第６２／８４６，５６３号、２０１９年３月１２日に提出された米国仮出願第６２／８１７，３２２号、２０１９年３月１１日に提出された米国仮出願第６２／８１６，４９７号、２０１９年１月３１日に提出された米国仮出願第６２／７９９，４６２号、および２０１９年１月１０日に提出された米国仮出願第６２／７９０，７８３の優先権の利益を主張し、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の情報
２０２０年１月６日頃に作成された、ファイルサイズが約１．２０ＭＢの「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するコンピューターで読み取り可能なテキストファイルには、本出願の配列表が含まれており、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、遺伝子改変細胞を含む改変細胞を増幅および維持するための組成物および方法、ならびに癌を含む疾患の治療におけるそれらの用途に関するものである。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）やリンパ腫などの癌に対して良好な臨床効果を示している。しかしながら、固形腫瘍に対する治療は比較的ゆっくりと進んでいる。ＣＡＲＴ細胞療法を効果にするために、ＣＡＲＴ細胞を患者に長期的に維持することは、腫瘍治療における患者の予後にとって重要である。例えば、ＣＡＲＴ細胞を長時間維持できれば、この技術は腫瘍の再発を効果的に減らすことができる。

癌は悪性腫瘍とも呼ばれ、細胞が異常に増殖し、体の他の部位に侵入または転移する可能性がある。人間には、１００種類を超える癌がある。一例は、乳房の上皮組織に存在する乳腺癌である。乳腺癌細胞が正常細胞の特性を失うため、乳腺癌細胞間のつながりが失われる。癌細胞が脱落すると、それらは血液および／またはリンパ系を介して全身に転移し、したがって、生命を脅かす可能性がある。現在、乳腺癌は、女性の心身の健康に対する一般的な脅威の１つになっている。免疫療法、例えば、ＣＡＲＴ細胞療法は、癌の治療に効果的であることが証明されているが、固形腫瘍を伴う癌などの特定の癌に対してより効果的にするため、その免疫療法を改善する必要がある。

患者はＢ細胞枯渇の状態でも生きられるため、第１の抗原結合ドメインを使用して患者のＢ細胞を患者におけるＣＡＲＴ細胞の増幅に使用され得る。したがって、患者のより多くのＣＡＲＴ細胞を適時に増幅し、ＣＡＲＴ細胞の効力を高めることができる。患者の適時に増幅したＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＲＴ細胞が腫瘍細胞、特に第２のＣＡＲと結合する抗原を有する固形腫瘍細胞と接触する可能性を高めることができる。

本開示は遺伝子改変細胞を記載し、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の異なる抗原結合ドメインを含む。遺伝子改変細胞は、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメイン、すなわち、遺伝子改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺すための第２の抗原結合ドメインを含むことができる。例えば、第１の抗原結合ドメインは、白血球（ＷＢＣ）の細胞表面分子などの表面マーカーに結合し、第２の抗原結合ドメインは腫瘍細胞の標的抗原に結合する。実施形態では、細胞表面分子はＷＢＣの表面抗原である。ＣＡＲは、第１または第２の抗原結合ドメインを含むことができる。改変細胞は、第１および第２の抗原結合ドメインを含む。実施形態では、改変細胞は、（１）第１の抗原結合ドメインを含む第１群の改変細胞、および（２）第２の抗原結合ドメインを含む第２群の改変細胞を含む。実施形態では、改変細胞は、２つの異なる群の改変細胞を含む混合群である。

ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲであり得る。例えば、２つの抗原結合ドメインは、同じＣＡＲ上（二重特異性ＣＡＲまたはタンデムＣＡＲ（ｔａｎＣＡＲ））、異なるＣＡＲ分子上、またはＣＡＲとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）上に存在する。単一のＣＡＲは少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを含んでもよいし、２つの異なる抗原結合ドメインがそれぞれ別のＣＡＲ上に存在してもよい。

本開示はさらに、第１のＣＡＲ分子および第２のＣＡＲ分子またはＴＣＲをコードする１つ以上の核酸を記載している。第１のＣＡＲは第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲまたはＴＣＲは第２の抗原結合ドメインを含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、個別のポリペプチドとして発現され、かつ少なくとも２つの個別の核酸によってコードされる。実施形態では、単一のＣＡＲは少なくとも、本明細書に記載される第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含み、かつ単一の核酸によってコードされる。実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインは、２つ以上の核酸によってコードされてもよい。さらに、本開示は、本明細書に記載される核酸を含むベクター、および本明細書に記載される核酸を含む細胞を記載している。実施形態では、細胞は、遺伝子改変細胞、例えばＣＡＲＴ細胞などの遺伝子によって改変されたＴ細胞を含む。

本開示はさらに、患者における遺伝子改変細胞の増幅および／または維持に有効な改変細胞集団（例えば、改変Ｔ細胞の混合集団）について記載している。実施形態では、遺伝子改変細胞混合集団は、少なくとも２つの異なる遺伝子改変細胞、すなわち、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを発現する第１の遺伝子改変細胞と、腫瘍細胞などの標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを発現する第２の遺伝子改変細胞とを含む。２つの抗原結合ドメインは、異なる分子であり、異なる抗原に結合する。実施形態では、遺伝子改変細胞混合集団はさらに、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを発現する第３の遺伝子改変細胞を含み、前記２つの異なる抗原結合ドメインは、遺伝子改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ細胞上で発現される）である。

実施形態では、改変細胞混合集団は、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを発現する遺伝子改変細胞を含み、前記２つの異なる抗原結合ドメインは、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ細胞上で発現される）である。

実施形態では、改変細胞混合集団は、標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを発現する改変細胞と、少なくとも２つの抗原結合ドメインを発現する改変細胞とを含み、前記２つの抗原結合ドメインは、改変Ｔ細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ改変細胞上で発現される）である。

実施形態では、改変細胞混合集団は、改変Ｔ細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを発現する改変細胞と、少なくとも２つの抗原結合ドメインを発現する改変細胞とを含み、前記２つの抗原結合ドメインは、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ改変細胞上で発現される）である。

本開示は、本明細書に記載される改変細胞混合集団からなる組成物を記載している。

実施形態では、改変細胞は、改変Ｔ細胞、改変ＮＫ細胞、改変マクロファージまたは改変樹状細胞である。実施形態では、改変Ｔ細胞はＣＡＲＴ細胞である。実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインを発現する改変細胞は、単一のＣＡＲＴ細胞であり得る。実施形態では、単一のＣＡＲＴ細胞は、二重特異性ＣＡＲＴ細胞であり得る。

実施形態では、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインは、ＷＢＣの表面抗原に結合し、標的細胞を殺すための抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。実施形態では、ＷＢＣはＢ細胞である。実施形態では、Ｂ細胞の表面抗原はＣＤ１９であり、腫瘍抗原は、ｔＭＵＣ１、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＡＣＰＰ、ＣＬＤＮ１８．２（１８．２）、ＰＳＭＡ、ＵＰＫ２または他の腫瘍抗原である。

さらに、本開示は、本明細書に記載される組成物または改変細胞混合集団を、それを必要とする患者におけるＣＡＲＴ細胞の増幅および／または維持を増強するために使用することを記載している。ＣＡＲＴ細胞の増幅および維持が増強されることで、ＣＡＲＴ細胞療法の治療効果を高めることができる。本開示は、本明細書に記載される改変細胞混合集団を使用して、腫瘍を有する患者を治療する方法を記載している。実施形態では、遺伝子改変細胞混合集団は、患者における改変細胞を増幅および／または維持し、かつ腫瘍成長を効果的に阻害することができる。実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。

さらに、本開示は、改変細胞混合集団の導入に応答してサイトカインが放出されることを記載している。

本発明の概要は、主張された主題の主な特徴または必要な特徴を特定することを意図しておらず、主張された主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。

図面と組み合わせて具体的な実施形態について説明する。異なる図面で使用される同じ参照番号は、類似または同一の項目を示す。

２つのＣＡＲ分子を含む改変細胞の細胞膜の例示的な部分を示す概略図である。異なるＣＡＲ分子を有する２つの改変細胞を含む、改変細胞混合集団を示す概略図である。ＣＡＲ分子およびＴＣＲ分子を含む細胞膜の例示的な部分を示す概略図である。ＣＡＲ分子を含む改変細胞と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変細胞とを含む、改変細胞混合集団を示す概略図である。二重特異性ＣＡＲ分子を含む細胞膜の例示的な部分を示す概略図である。マウスからの末梢血サンプルのサイトカインデータを示す。二重特異性ＣＡＲの設計と発現アッセイの結果を示す。二重特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞のサイトカイン放出を示す。二重特異性ＣＡＲを発現するＴ細胞と、対応する標的細胞との共培養アッセイの結果を示す。二重特異性ＣＡＲの別の設計と発現アッセイの結果を示す。図１０のアッセイで使用される二重特異性ＣＡＲの発現アッセイの結果を示す。ＣＡＲ分子の核酸構築物を示す概略図である。図１２に示されるＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＡＲＴ細胞を腫瘍細胞と共培養してＩＦＮγ（ＩＦＮｇ）を放出した結果を示す。ＣＡＲＴ細胞と腫瘍細胞を共培養したＣＤ１３７発現を示したフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。単一のＣＡＲ（ｔＭＵＣ１ＣＡＲまたはＴＳＨＲＣＡＲ）を発現するＴ細胞を注入した後の日数に対する、患者のＣＡＲコピー数の変化を示す。ｔＭＵＣ１ＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲを発現するＴ細胞を注入した後の日数に対する、患者のＣＡＲコピー数の変化を示す。ｔＭＵＣ１ＣＡＲを発現するＴ細胞を注入した後の日数に対する、患者のＣＡＲＴ細胞数の変化を示す。ｔＭＵＣ１ＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＡＲＴ細胞混合集団を注入した後の日数に対する、患者のＣＡＲＴ細胞数の変化を示す。ＭＵＣ１ＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲを発現する混合ＣＡＲＴ細胞を注入した後の日数に対する、数名の患者のＣＡＲＴ細胞数の変化を示す。ＭＵＣ１ＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲを発現する混合ＣＡＲＴ細胞を注入した後の日数に対する、数名の患者のＣＡＲＴ細胞数の変化を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入に応答した患者の様々なアッセイの結果を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入前と注入後の、患者のＣＴおよび／またはＰＥＴＣＴのスキャン画像を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入前と注入後の、患者のＣＴおよび／またはＰＥＴＣＴのスキャン画像を示す。混合ＣＡＲＴ細胞の注入前と注入後の、患者のＣＴおよび／またはＰＥＴＣＴのスキャン画像を示す。Ｋ１９細胞の存在下または非存在下でＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞とｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞とを共培養したフローサイトメトリー分析の結果を示す。図３６のアッセイで使用される細胞培養物におけるＰＢＭＣおよび単球の活性化を示す。ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によるＩＦＮγの放出を示す。ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によるＧＺＭＢの放出を示す。様々な実施形態におけるＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。様々な実施形態におけるＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。様々な実施形態におけるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。実施形態におけるサイトカインの放出を示す。様々な細胞培養物におけるＣＤ１３７の発現を示す。細胞活性化のフローサイトメトリー分析の結果を示す。図４４に記載の細胞培養物におけるＰＢＭＣおよび単球の活性化を示す。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化により、ＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞が細胞内ＩＦＮγを放出することを示す。細胞培養物で細胞を２４時間共培養した後のサイトカインの放出を示す。細胞培養物で細胞を２４時間共培養した後のサイトカインの放出を示す。様々な細胞培養物におけるＣＤ１３７の発現を示す。ＫＡＴＯ３＋細胞と４８時間共培養した各種ＣＡＲＴ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。図５０に記載のシステムにおけるＰＢＭＣおよび単球の活性化を示す。ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の活性化により、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が細胞内ＩＦＮγを放出することを示す。ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の活性化により、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が細胞内ＩＦＮγを放出することを示す。様々な細胞培養物の殺傷アッセイの結果を示す。ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲシステムにおけるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。様々な細胞培養物におけるサイトカインの放出を示す。様々な細胞培養物におけるサイトカインの放出を示す。様々な細胞培養物におけるサイトカインの放出を示す。免疫療法システムを示す概略図である。図６１の免疫療法システムの実施形態を示す概略図である。図６１の免疫療法システムの別の実施形態を示す概略図である。例示的な条件付き遺伝子発現系の概略図である。樹状細胞の活性化の例示的な実施形態の概略図である。フローサイトメトリー分析を用いた、ＣＡＲＴ細胞およびＴａｎＣＡＲＴ細胞におけるいくつかのマーカーの発現を示す。ＣＡＲＴ細胞およびＴａｎＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出を示す。対応する基質細胞で５日間刺激した後の、各群の細胞の増幅を示す。６９１７がＭＣＦ－７を阻害し、かつ６９２１がＰＣ３－ＡＣＰＰを阻害したことを示す殺傷アッセイの結果を示す。フローサイトメトリー分析を用いて測定した、ＣＡＲＴ細胞およびＴａｎＣＡＲＴ細胞におけるいくつかのマーカーの発現、ならびにＣＡＲＴ細胞およびＴａｎＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出を示す。基質細胞に応答した、様々なＣＡＲＴ細胞およびＴａｎＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出を示す。患者００９の単球のＰＤＬ１発現を示す。改変Ｔ細胞の注入に応答した、患者０１１のＣＡＲＴ細胞の増幅を示す。改変Ｔ細胞の注入に応答した、患者０１１のＣＡＲＴ細胞の増幅を示す。改変Ｔ細胞の注入に応答した、患者０１１のＣＡＲＴ細胞の増幅を示す。改変Ｔ細胞の注入に応答した、患者０１１のサイトカイン放出を示す。図７７Ａおよび図７７Ｂは、結合分子の例示的な構造を示す。フローサイトメトリーを用いて、目的遺伝子の表現型および発現を決定することを示す。フローサイトメトリーを用いて共培養された細胞を識別することを示す。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の活性化に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。矢印１１４および１１６、ならびにボックス１０２、１０４、１０６および１０８は、比較群を指す。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の増殖に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。矢印２０８、ならびにボックス２０２、２０４および２０６は、比較群を指す。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＡＦＰＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の活性化に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。矢印３１４および３１６、ならびにボックス３０２、３０４、３０６および３０８は、比較群を指す。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＡＦＰＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の増殖に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。矢印４０８、ならびにボックス４０２、４０４および４０６は、比較群を指す。様々な細胞培養物におけるＣＤ１３７発現の他のヒストグラムを示す。ＧＵＣＹ２ＣＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。細胞培養物において、細胞を２４時間共培養した後のサイトカイン放出を示す。図８７Ａ～Ｄは、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの例示的な構築物、および抗体の例示的な構造を示す。

以下、具体的な実施例と併せて、本発明をさらに説明する。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解しているものと同じ意味である。本開示の実施または試験において本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料も依然として記載されている。本開示の目的のために、以下の用語は次のように定義される。

冠詞「１つ（ａ／ａｎ）」は、１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の文法的対象を指すために本明細書で使用される。例として、「ある要素」は１つの要素または１つ以上の要素を意味する。

「約」とは、参照数、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対する数、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの変化が２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％に及ぶことを意味する。

本明細書で使用される「活性化」という用語は、検出可能な細胞の増殖を誘導するのに十分に刺激されている細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能と関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、特に、細胞分裂しているＴ細胞を指す。

「抗体」という用語は最も広く使用されており、望ましい生物学的活性または機能を有するモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを指す。本開示における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’とＦ（ａｂ’）２フラグメント、並びに一本鎖抗体とヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗら，１９９９，書名：ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら，１９８９，書名：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６）を含む様々な形態で存在し得る。

「抗体フラグメント」という用語は、全長抗体の一部、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域を指す。抗体フラグメントの他の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２とＦｖフラグメント、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。

「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントを指す。このフラグメントは、緊密で、非共有結合性会合による１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインを折り畳むことにより、６つの超可変ループ（Ｈ鎖からの３つのループとＬ鎖からの３つのループ）が生じ、抗原結合に使用されるアミノ酸残基を提供し、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むＦｖの半分）であっても、その親和性が結合部位全体（二量体）よりも低いが、抗原を認識して結合する能力がある。

本明細書で使用される「抗体重鎖」は、天然に存在するコンフォメーションですべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、天然に存在するコンフォメーションですべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。Κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

「合成抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージによって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。前記用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成、および抗体を得るためまたは抗体をコードするアミノ酸を得るためのＤＮＡ分子の発現によって生成された抗体を含む。合成ＤＮＡは、当技術分野で利用可能でよく知られている技術を使用して得られる。

「抗原」という用語は、抗体産生、または特異的免疫機能を持つ細胞の活性化、またはその両方を含み得る、免疫応答を誘発する分子を指す。抗原は、すべてのタンパク質やペプチドを含む任意の高分子、または組換えやゲノムＤＮＡに由来する分子を含む。例えば、ＤＮＡは、免疫応答を誘発するタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列または一部のヌクレオチド配列を含むため、本明細書で使用される用語「抗原」をコードする。抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はない。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体液を含む生体サンプルから生成、合成、または誘導することができる。

本明細書で使用される、「抗腫瘍作用」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存数の減少、腫瘍細胞を有する対象の平均余命の増加または癌性病態に関連する様々な生理学の症状の改善に関連する生物学の作用を指す。「抗腫瘍作用」は、そもそも腫瘍の発生を予防する際のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって明らかにすることができる。

「自己抗原」という用語は、免疫系によって外来であると誤認される内因性抗原を指す。自己抗原には、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が含まれる。

「自己」という用語は、後に同じ被検体に再導入される、被検体に由来する材料を説明するために使用される。

「同種異系」という用語は、同じ種の異なる被検体に由来する移植片を説明するために使用される。一例として、ドナー被検体は、レシピエント被験体に関連または非関連し得るが、ドナー被検体はレシピエント被験体と同様の免疫系マーカーを有する。

「異種の」という用語は、異なる種に由来する被検体の移植片を説明するために使用される。一例として、ドナー被検体はレシピエント被験体とは異なる種に由来し、ドナー被検体およびレシピエント被験体は遺伝的および免疫学的に不適合なものであり得る。

「癌」という用語は、異常な細胞の急速で制御されない成長を特徴とする疾患を指すために使用される。癌細胞は、局所的に転移し、または血流とリンパ系を介して体の他の部位に転移する可能性がある。様々な癌の例としては、乳腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが含まれる。

明細書全体において、文脈によって別段の解釈が必要でない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という言葉は、前記ステップや要素或いはステップや要素の群を含むことを示唆するが、他のステップや要素或いはステップや要素の群を除外しないものと理解される。

「・・・からなる」という語句は、「・・・からなる」という語句の後のあらゆるものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「・・・からなる」という語句は、リストされた要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。

「基本的には・・・からなる」という語句は、語句の後にリストされた任意の要素を含み、かつ本開示においてリストされた要素に対して指定された活動または動作を妨害しない、または寄与する他の要素を含み得ることを意味する。したがって、「基本的には・・・からなる」という語句は、リストされた要素が必要または必須であるが、他の要素は選択可能であり、リストされた要素の活動または動作に影響するかどうかに応じて、存在し得る場合と存在し得ない場合があることを示す。

「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対形成法則によって関連付けられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」と相補的である。相補性は、核酸の一部の塩基のみが塩基対形成法則に従って一致する「部分的な」相補性であってもよく、核酸間に存在する「完全な」または「全体的な」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に大きな影響を与える。

「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏ）」という用語は、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と実質的に同一または相補的であるか、ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または（ｂ）参照ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチド、を指す。

「共刺激リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を指し、それがＴ細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが担持されたＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナルのほかに、増殖、活性化、分化および他の細胞応答のうちの少なくとも１つを含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドは、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、ＣＤ７のリガンド、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含むことができる。共刺激リガンドは、特に、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなど、Ｔ細胞に存在する共刺激分子と特異的に結合するアゴニストまたは抗体、をさらに含む。

「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌ様受容体を含む。

「共刺激シグナル」という用語は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞の増殖および／または主要分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを引き起こすシグナルを指す。

「疾患」および「病状」という用語は、互換的に使用されることもあり、特定の疾患または病状の病原性物質が分からない（したがって、病因がまだ解明されていない）可能性があるため、疾患としてまだ周知されておらず、臨床医によって多かれ少なかれ特定の症状が特定されている望ましくない状態または症候群としてのみ認識されているという点で、異なることもある。「疾患」とは、被検体の健康状態が恒常性を維持できない状態であり、疾患が改善されなければ、被検体の健康が悪化し続ける状態である。対照的に、被検体の「病症」とは、動物が恒常性を維持できる健康状態であるが、その動物の健康状態が、病症がない場合よりも好ましくない状態である。無治療のまま放置しても、病症があるからといって、動物の健康状態がさらに低下するとは限らない。

「有効」という用語は、望ましい、期待された、または意図された結果を達成するのに十分であることを指す。例えば、治療設定における「有効量」は、治療上または予防上の有益性をもたらすのに十分な化合物の量であり得る。

「コード化」という用語は、決定されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）、または決定されたアミノ酸配列およびその結果として生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして機能するための、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおける特定ヌクレオチド配列の固有特性を指す。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合に、前記遺伝子は前記タンパク質をコードする。（「Ｕ」で「Ｔ」が置換されている場合を除き）ｍＲＮＡ配列と同一であり、そのヌクレオチド配列が通常は配列表に記載されているコード化鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡ転写のテンプレートとして使用される非コード化鎖は、いずれも、前記遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物コード化と称呼することができる。

「外因性」という用語は、野生型の細胞または生体に天然に存在しないが、通常は分子生物学的技術によって細胞内に導入される分子を指す。外因性ポリヌクレオチドの例には、所望のタンパク質をコードするベクター、プラスミドおよび／または人工核酸構築物が含まれる。ポリヌクレオチドおよびタンパク質に関して、「内因性」または「自然的」という用語は、所与の野生型の細胞または生体内に見られる天然に存在するポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。同様に、分子生物学的技術によって、第１の生体から単離して第２の生体に転移された特定のポリヌクレオチド配列は、通常は第２の生体に対して「外因性」のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列と見なされる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、分子生物学的技術によって、そのようなポリヌクレオチド配列をすでに含んでいる微生物に「導入」することができ、例えば、本来なら天然に存在するポリヌクレオチド配列の１つ以上の他のコピーを作成して、コードされたポリペプチドの過剰発現を促進する。

「発現または過剰発現」という用語は、例えばそのプロモーターによって駆動される、特定のヌクレオチド配列の前駆体または成熟タンパク質への転写および／または翻訳を指す。「過剰発現」は、形質転換された生体または細胞における遺伝子産物の産生量が、正常または形質転換されていない生体または細胞における産生量を超えることを意味する。本明細書で定義されるように、「発現」という用語は、発現または過剰発現を指す。

「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御（調節）配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって提供され、またはインビトロ発現系において提供され得る。発現ベクターは、当技術分野で知られている、組換えポリヌクレオチドを組み込んだすべてのもの、例えば、（例えば、裸の、またはリポソームに含まれている）コスミド、プラスミドおよびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。

ウイルスは、インビトロおよびインビボ（被検体内）で核酸を細胞内に送達するために使用することができる。核酸を細胞内に送達し得るウイルスの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれる。

また、核酸を細胞内に送達するための非ウイルス性の方法もあり、例えば、エレクトロポレーション、ジーンガン、ソノポレーション、マグネトフェクション、およびオリゴヌクレオチド、リポプレックス、デンドリマーや無機ナノ粒子の使用が挙げられる。

「相同」という用語は、２つの比較される配列の１つの位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、２つのポリペプチド間または２つのポリヌクレオチド間の配列類似性または配列同一性を意味し、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子は前記位置で相同である。２つの配列間の相同性の割合は、２つの配列が共有している一致する、または相同な位置の数を、比較された位置の数で割った値×１００の関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個の位置が一致し、または相同であれば、２つの配列は６０％の相同性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を有する。最大の相同性を与えるために、２つの配列が整列されたときに比較が行われる。

「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスを指す。このようなタンパク質に含まれるメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの５つである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、消化管分泌物、呼吸器や生殖器の粘液分泌物などの体内分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの被検体における一次免疫応答で産生される主な免疫グロブリンである。それは、凝集、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌やウイルスからの防御に重要な役割を果たしている。ＩｇＤは、既知の抗体機能を有しないが、抗原受容体として機能し得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの暴露時に、肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことにより、即時型の過敏症を媒介する免疫グロブリンである。

「単離」という用語は、基本的または実質的には、通常、その自然状態でそれに付随する成分を含まないコンポーネントを指す。前記コンポーネントは、細胞、またはタンパク質や核酸などの高分子であり得る。例えば、本明細書で使用される「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から除去されたＤＮＡフラグメントを指す。あるいは、本明細書で使用される「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、ペプチドまたはポリペプチド分子を、その自然な細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から、インビトロで単離および／または精製したペプチドを指す。

「実質的に精製された」という用語は、通常、その自然状態でそれに会合する成分を基本的に含まないコンポーネントを指す。例えば、実質的に精製された細胞は、その天然に存在する状態または自然状態で通常関連している他の細胞種類から単離された細胞を指す。いくつかの場合には、実質的に精製された細胞集団は均質な細胞集団を指す。他の場合には、この用語は単に、天然状態でそれと自然に会合している細胞から単離された細胞を指す。実施形態では、細胞はインビトロで培養される。実施形態では、細胞はインビトロで培養されない。

本開示の文脈では、一般的に存在する核酸塩基の以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを表す。

特に指定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮退バージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、さらに、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がある形態で１つ以上のイントロンを含んでもよい程度でイントロン（１つ以上）を含み得る。

「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の１属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも独特であり、非分裂細胞に感染することができ、また、大量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡに送り込むことができるため、遺伝子送達ベクターとしては最も効率的な方法の１つである。さらに、レンチウイルスを用いることで、遺伝情報を宿主染色体に組み込むことができ、安定して形質導入された遺伝情報が得られる。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、有意なレベルの遺伝子導入をインビボで達成する手段を提供する。

「調節」という用語は、治療をしない、または化合物を使用しない場合の被検体における応答レベルと比較して、および／またはそれ以外は同一であるが未治療の被検体における応答レベルと比較して、被検体における応答レベルの検出可能な増加または減少を媒介することを指す。前記用語は、天然のシグナルや応答を干渉し、および／または影響を与え、それによって被検体、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。

核酸は、別のポリヌクレオチドと機能的な関係に置かれたときに、「動作可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合には、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に動作可能に連結されており、または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合には、コード配列に動作可能に連結されている。

「転写制御下」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御（調節）するために、プロモーターがポリヌクレオチドに動作可能に連結され、且つポリヌクレオチドに対して正しい位置および配向にあることを指す。

「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、特定の組織または臓器からの正常な細胞における発現レベルに対する、患者の前記組織または臓器の固形腫瘍などの疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の異常な発現レベルを示すことを意図する。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって確定することができる。

固形腫瘍は、通常、嚢胞や液状の部分を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍には、良性のものと悪性のものがある。様々な種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類に応じて命名される（肉腫、癌腫やリンパ腫など）。肉腫や癌腫などの固形腫瘍の例として、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳腺癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫およびＣＮＳ（中枢神経系）腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫や混合神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫とも称される）、星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫や脳転移など）が含まれる。

固形腫瘍抗原は、固形腫瘍で発現される抗原である。実施形態では、固形腫瘍抗原はまた、健康な組織において低レベルで発現される。固形腫瘍抗原およびその関連する疾患腫瘍の例を表１に提供する。

組成物の「非経口投与」という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、胸骨内注射または注入技術を含む。

「患者」、「被検体」や「個体」などの用語は、本明細書で互換的に使用可能であり、かつ、本明細書に記載される方法に適合する任意のヒトまたは動物を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、被検体または個体は、ヒトまたは動物である。実施形態では、「被検体」という用語は、免疫応答が誘発され得る生体（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。被検体の例には、ヒト、およびイヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらの遺伝子組み換え種などの動物が含まれる。

治療を必要とする被検体または治療が必要な被検体には、治療を必要とする疾患、病状または病症を有する被検体が含まれる。治療が必要な被検体は、疾患、病状または病症の予防のために治療を必要とする被検体も含まれる。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指す。前記用語は、通常、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変された形態の、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体形態を指す。前記用語は、一本鎖や二本鎖形態を含む核酸のすべての形態を含む。

「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下に定義される厳密な条件で参照配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、さらに少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを含む。したがって、「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが付加または欠失されたか、異なるヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関して、当技術分野でよく理解されるように、参照ポリヌクレオチド対して、突然変異、付加、欠失および置換を含む特定の変異を生じさせることができ、それにより、変異されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持するか、参照ポリヌクレオチドに対して活性が増加する（すなわち、最適化される）。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、本明細書に記載された参照ポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％（少なくとも５１％～少なくとも９９％およびその間のすべての整数パーセンテージ、例えば、９０％、９５％または９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、天然に存在する対立遺伝子変異体およびオルソログをも含む。

「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異体および合成類似体を指す。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特定の態様において、ポリペプチドは、通常、様々な化学反応を触媒する（すなわち、その速度を上げる）酵素ポリペプチドまたは「酵素」を含み得る。

「ポリペプチド変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照ポリペプチド配列と区別されるポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は、保存的または非保存的であり得る１つ以上の置換によって参照ポリペプチドと区別される。特定の実施形態では、ポリペプチド変異体は保存的置換した変異体を含み、この点において、いくつかのアミノ酸は、ポリペプチド活性の性質を変えることなく、類似する特性を有する他のアミノ酸に変更され得ることは、当技術分野でよく理解されている。ポリペプチド変異体はまた、１つ以上のアミノ酸が付加または欠失されたか、異なるアミノ酸残基によって置換されたポリペプチドを含む。

「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構が認識され、または合成機構の導入によって、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を指す。「発現制御（調節）配列」という用語は、特定の宿主生物において動作可能に連結されたコード化配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的なオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。

「結合（ｂｉｎｄ）」、「結合（ｂｉｎｄｓ）」または「・・・と相互作用する」という用語は、サンプルまたは生体中の第２の分子を認識して付着するが、サンプル中の他の構造的に無関係な分子を基本的に認識または付着しない分子を指す。本明細書で抗体に関して使用される「特異的に結合する」という用語は、特異的な抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を基本的に認識または結合しない抗体を指す。例えば、１つの種からの抗原と特異的に結合する抗体は、１つ以上の種からのその抗原にも結合し得る。しかし、このような種間の反応性は、それ自体が抗体の特異的な分類を変えるものではない。別の例では、抗原と特異的に結合する抗体は、異なる対立遺伝子型の抗原に結合してもよい。しかしながら、このような交差反応性は、それ自体が抗体の特異的な分類を変えるものではない。特定の場合には、「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、抗体、タンパク質またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、その相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；例えば、抗体は、任意のタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」および抗体を含む反応において、エピトープＡ（または遊離の非標識Ａ）を含む分子が存在すると、抗体に結合する標識Ａの量が減少する。

「統計的に有意」とは、その結果が偶然に発生する可能性が低いことを意味する。統計的に有意性は、当技術分野で知られている任意の方法で決定することができる。一般的に使用される有意性の尺度は、帰無仮説が真であった場合に観測された事象が発生する頻度や確率を表すｐ値を含む。得られたｐ値が有意性レベルよりも小さい場合、帰無仮説は棄却される。単純な場合に、有意レベルは０．５以下のｐ値と定義される。「減少した」または「低下した」または「より少ない」量は、通常、「統計的に有意な」または生理学的に有意な量であり、本明細書に記載の量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０倍以上（例えば、１００、５００、１０００倍）（１以上のすべての整数および小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含む。

「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がその同族リガンドと結合することにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達イベントを媒介することで誘導される一次応答を指す。刺激は、特定の分子の発現の変化、例えば、ＴＧＦ－βのダウンレギュレーションおよび／または細胞骨格構造の再編成を媒介することができる。

「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。例えば、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体複合体に会合するζ鎖である。刺激分子には、シグナル伝達を担うドメインが含まれる。

「刺激リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞などの細胞上の同族結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称する）に特異的に結合でき、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖など、Ｔ細胞による一次応答を媒介するリガンドを指す。刺激リガンドは当技術分野で周知であり、特に、ペプチドを搭載したＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗－ＣＤ２８抗体、およびスーパーアゴニスト抗－ＣＤ２抗体を包含する。

「治療的」という用語は、治療および／または予防を指す。治療効果は、病状の抑制、寛解、根絶または病状の緩和によって得られる。

「治療上有効な量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めている組織、系または被検体の生物学的または医学的応答を誘発する本発明の化合物の量を指す。「治療上有効な量」という用語は、化合物を投与することにより、治療される病症または疾患の１つ以上の徴候または症状の進行を防止するか、またはある程度軽減するのに十分な量を含意する。治療上有効な量は、化合物、疾患とその重症度、ならびに治療される被検体の年齢、体重などの要因によって異なる。

「疾患を治療する」という用語は、被検体が経験する疾患または病症の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を減少させることを指す。

「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に転移または導入されたプロセスを指す。「トランスフェクトの」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。前記細胞は、一次被験細胞およびその子孫を含む。

「ベクター」という用語は、単離核酸を含み、かつ単離核酸を細胞内部に送達し得るポリヌクレオチドを指す。線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物と会合するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む、数多くのベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。前記用語はまた、細胞への核酸の転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含む。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、腺伴随ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。例えば、レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節機能または構成機能を持つ他の遺伝子をさらに含む。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって産生されており、例えば、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕやｎｅｆといった遺伝子を削除することで、生物学的に安全なベクターとなる。

範囲：本開示全体を通して、本開示の様々な態様を範囲形態で提示することができる。理解されるように、範囲形態の説明は、単に利便性と簡潔性のためのものであり、本開示の範囲を融通性なく制限するものとして解釈されるべきではない。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能なすべてのサブ範囲を具体的に開示しているものと考えるべきである。例えば、１から６までのような範囲の説明は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までのサブ範囲と、その範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、６が具体的に開示されていると考えるべきである。範囲の広さに関係なく適用される。

「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」分子とは、少なくとも細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインまたは細胞内ドメインを含む組換えポリペプチドのことである。実施形態では、ＣＡＲのドメインは同じポリペプチド鎖、例えば、キメラ融合タンパク質上にある。実施形態では、前記ドメインは異なるポリペプチド鎖上にあり、例えば、ドメインは連続していない。

ＣＡＲ分子の細胞外ドメインは抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、ＣＡＲＴ細胞などの改変細胞を増幅および／または維持するため、あるいは固形腫瘍などの腫瘍細胞を殺すために使用され得る。実施形態では、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインは、抗原、例えばＷＢＣの表面にある細胞表面分子またはマーカーと結合し得る。実施形態では、ＷＢＣは、ＧＭＰ（顆粒球マクロファージ前駆体）、ＭＤＰ（単球－マクロファージ／樹状細胞前駆体）、ｃＭｏＰ（共通単球前駆体）、好塩基球、好酸球、好中球、ＳａｔＭ（セゲレート核を含む非定型単球）、マクロファージ、単球、ＣＤＰ（共通樹状細胞前駆体）、ｃＤＣ（従来のＤＣ）、ｐＤＣ（形質細胞様ＤＣ）、ＣＬＰ（共通リンパ球前駆体）、Ｂ細胞、ＩＬＣ（自然リンパ球）、ＮＫ細胞、巨核球、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、バンド細胞、リンパ芽球、前リンパ球、単芽球、巨核球、前巨核球、巨核球、血小板またはＭＳＤＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）のうちの少なくとも１つである。実施形態では、ＷＢＣは、顆粒球、単球および／またはリンパ球である。実施形態では、ＷＢＣは、Ｂ細胞などのリンパ球である。実施形態では、ＷＢＣはＢ細胞である。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子はＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３を含む。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子はＣＤ１９である。

ＣＡＲ細胞や改変Ｔ細胞などの改変細胞を含む、本明細書に記載される細胞は、幹細胞に由来することができる。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髓幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。改変細胞はさらに、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であってもよい。実施形態では、改変細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増幅および遺伝子改変に先立って、細胞の供給源は、様々な非限定的な方法によって被検体から得ることができる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髓、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多くの非限定的な供給源から得ることができる。本発明の特定の実施形態では、利用可能で、かつ当業者に知られている任意の数のＴ細胞株を使用することができる。実施形態では、改変細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得る。実施形態では、改変細胞は、異なる表現型特性を示す細胞混合集団の一部である。

細胞集団とは、２つ以上の細胞が集まった群を指す。細胞集団における細胞は、同じであってよく、その場合、細胞集団は細胞の均質な集団となる。細胞集団における細胞は、異なってもよく、その場合、細胞集団は細胞混合集団または細胞の異種集団となる。例えば、細胞混合集団は、第１のＣＡＲを含む改変細胞、および第２のＣＡＲを含む細胞を含み得、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは異なる抗原に結合する。

「幹細胞」という用語は、自己複製能力と他の種類の細胞に分化する能力を持つ、特定の種類の細胞のいずれかを指す。例えば、幹細胞は、２つの娘幹細胞（インビトロで胚性幹細胞と培養した場合に発生）、または１つの幹細胞および分化した細胞（血液細胞を生成できる造血幹細胞で発生）を生成する。幹細胞は、その由来および／または他の種類の細胞に分化する能力の程度に応じて、異なるカテゴリーに分類され得る。例えば、幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞（すなわち、多能性幹細胞）、体性幹細胞、人工多能性幹細胞、およびその他の任意の種類の幹細胞を含み得る。

多能性胚性幹細胞は、胚盤胞の内部の細胞塊に存在し、生来の高い分化能力を有し得る。例えば、多能性胚性幹細胞は、体内であらゆる種類の細胞を形成する可能性がある。インビトロで長期間成長した場合、ＥＳ細胞は多能性を維持し、子孫細胞は多系統に分化する可能性がある。

体性幹細胞は、（胎児からの）胎児幹細胞および（骨髓などの様々な組織に存在する）成体幹細胞を含み得る。これらの細胞は、多能性ＥＳ細胞よりも分化能力が低いと見なされ、中で胎児幹細胞の能力が成体幹細胞の能力よりも高い。体性幹細胞は明らかに限られた種類の細胞にしか分化せず、多能性と見なされてきた。「組織特異的」な幹細胞は、通常、１種類の細胞しか生じない。例えば、胚性幹細胞は、血液幹細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ））に分化することができ、さらに様々な血液細胞（例えば、赤血球、血小板、白血球）に分化することもできる。

人工多能性幹細胞（すなわち、ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）は、特定の遺伝子の発現を誘導することにより、非多能性細胞（例えば、成人の体細胞）から人工的に誘導された多能性幹細胞の１種類を含み得る。人工多能性幹細胞は、特定の幹細胞遺伝子やタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、力価や分化能など、多くの点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの天然に存在する多能性幹細胞と類似している。人工多能性細胞は、成人の胃、肝臓、皮膚、および血液細胞から得ることができる。

実施形態では、腫瘍を殺すための抗原結合ドメインは、腫瘍の表面にある抗原、例えば腫瘍抗原または腫瘍マーカーと結合する。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞を介した免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。腫瘍抗原は、当技術分野ではよく知られており、例えば、腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＤ１９およびメソテリンを含む。例えば、腫瘍抗原がＣＤ１９の場合、そのＣＡＲをＣＤ１９ＣＡＲまたは１９ＣＡＲと称することができ、前記ＣＤ１９ＣＡＲまたは１９ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲ分子である。

実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも１つのｓｃＦｖまたは少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含む。一例として、１つのＣＡＲには２つのｓｃＦｖｓが存在し得る。ｓｃＦｖは、柔軟なリンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。一本鎖可変領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いて軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を連結することにより形成することができる（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６，１９８８）。連結ペプチドの例としては、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２７８）を有するＧＳリンカーがあり、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端の間を約３．５ｎｍ架橋している。他の配列のリンカーが設計して使用されている（Ｂｉｒｄら，１９８８，上記と同様）。一般的に、リンカーは、短くて柔軟性のあるポリペプチドであり得、約２０個以下のアミノ酸残基を含むことが好ましい。一本鎖変異体は、組換えまたは合成によって産生することができる。ｓｃＦｖの合成産生には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫、哺乳類細胞などの真核生物、または大腸菌などの原核生物のいずれかの適切な宿主細胞に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの慣習的な操作で作ることができる。得られたｓｃＦｖは、当技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を用いて単離することができる。

本明細書に記載されるＣＡＲ分子の細胞質ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインおよび１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインは、抗原結合に応答して、シグナルを伝達し、Ｔ細胞などの分子を活性化する機能を持つ。１つ以上の共刺激ドメインは、刺激分子および／または共刺激分子に由来し、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインなどの一次シグナル伝達ドメインに由来する。実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激分子に由来する１つ以上の機能的なシグナル伝達ドメインをさらに含む。実施形態では、共刺激分子は、抗原に対する細胞応答の活性化に必要な細胞表面分子（抗原受容体またはそのリガンド以外のもの）である。

実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドの細胞内ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体に由来するＣＤ３ζドメインを含む。

本明細書に記載されるＣＡＲ分子は、膜貫通ドメインをさらに含む。ＣＡＲ分子に膜貫通ドメインを組み込むことで、分子を安定させることができる。実施形態では、ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８または４－１ＢＢ分子の膜貫通ドメインである。

ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間には、スペーサードメインが組み込まれる場合がある。本明細書では、「スペーサードメイン」という用語は、一般的に、ポリペプチド鎖上の膜貫通ドメインと細胞外ドメインおよび／または細胞質ドメインを連結する機能を持つ任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含み得る。

本開示は、インビトロで細胞を調製するための方法を記載し、前記方法は、細胞を準備することと、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて改変細胞集団を得ることと、を含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なる。

本開示はさらに、癌を有する被検体における細胞増幅を増強するための方法を記載し、前記方法は、被検体または健康なドナーから細胞を得ることと、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の改変細胞を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なり、有効量の改変細胞を投与した被検体における細胞増幅のレベルは、第２のベクターではなく第１のベクターと接触する有効量の細胞を投与した被検体における細胞増幅のレベルよりも高い。

本開示はさらに、癌を有する被検体を治療するための方法を記載し、前記方法は、被検体または健康なドナーから細胞を得ることと、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の改変細胞を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なる。

本開示はさらに、癌を有する被検体の治療を増強するための方法を記載し、前記方法は、被検体または健康なドナーから細胞を得ることと、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の改変細胞を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なり、有効量の改変細胞による腫瘍成長の阻害レベルは、第１のベクターではなく第２のベクターと接触する有効量の細胞による腫瘍成長の阻害レベルよりも高い。

本開示はさらに、インビトロで細胞を調製するための方法を記載し、前記方法は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを第１の細胞集団に導入することと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを第２の細胞集団に導入することと、第１の細胞集団および第２の細胞集団を培養することと、を含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なる。

本開示はさらに、癌を有する被検体における細胞増幅を増強するための方法を記載し、前記方法は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを、第１の細胞集団に導入して第１の改変細胞集団を得ることと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを、第２の細胞集団に導入して第２の改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なり、第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における細胞増幅のレベルは、第１の改変細胞集団ではなく第２の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における細胞増幅のレベルよりも高い。

本開示はさらに、癌を有する被検体を治療するための方法を記載し、前記方法は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを、第１の細胞集団に導入して第１の改変細胞集団を得ることと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを、第２の細胞集団に導入して第２の改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なる。

本開示はさらに、癌を有する被検体の治療を増強するための方法を記載し、前記方法は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを、第１の細胞集団に導入して第１の改変細胞集団を得ることと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを、第２の細胞集団に導入して第２の改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を投与することと、含み、ここで、第１の抗原は第２の抗原と異なり、第１の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における腫瘍成長の阻害レベルは、第１の改変細胞集団ではなく第２の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における腫瘍成長の阻害レベルよりも高い。

本開示はさらに、Ｔ細胞応答を増強するための方法を記載し、前記方法は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを第１の細胞集団に導入することと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを第２の細胞集団に導入することと、第２の抗原を発現する細胞を第１の細胞集団および第２の細胞集団と接触させることと、Ｔ細胞応答のレベルを測定することと、を含み、ここで、第１の細胞集団および第２の細胞集団と接触した細胞に応答するＴ細胞応答のレベルは、第１の細胞集団ではなく第２の細胞集団と接触した細胞に応答するＴ細胞応答のレベルよりも高い。

本開示はさらに、Ｔ細胞応答を増強するための方法を記載し、前記方法は、細胞集団を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターと接触させて改変細胞集団を得ることと、第２の抗原を発現する細胞を改変細胞集団と接触させることと、Ｔ細胞応答のレベルを測定することと、を含み、ここで、第１のベクターおよび第２のベクターと接触させて得られた改変細胞集団と接触した細胞におけるＴ細胞応答のレベルは、第１のベクターではなく第２のベクターと接触した細胞集団と接触した細胞におけるＴ細胞応答のレベルよりも高い。

細胞は、マクロファージ、樹状細胞、またはＴ細胞やＮＫ細胞などのリンパ球を含む。実施形態では、細胞はＴ細胞である。実施形態では、第１の抗原結合分子は、ＷＢＣの細胞表面分子に結合する。実施形態では、ＷＢＣは、顆粒球、単球またはリンパ球である。実施形態では、ＷＢＣはＢ細胞である。実施形態では、ＷＢＣの細胞表面分子はＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である。実施形態では、ＷＢＣの細胞表面分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである。実施形態では、ＷＢＣの細胞表面分子は、ＣＤ１９である。

実施形態では、第２の抗原結合分子は、固形腫瘍抗原に結合する。実施形態では、固形腫瘍抗原は、腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＣＬＤＮ１８．２、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３－Ｒα２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ－α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲである。

実施形態では、第１の結合分子および第２の結合分子は、ＣＡＲである。実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは腫瘍抗原に結合する。実施形態では、細胞内ドメインは共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインはＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及それらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含んでいる。実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。

実施形態では、第１の結合分子はＣＡＲであり、第２の結合分子はＴＣＲである。実施形態では、Ｔ細胞は、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。実施形態では、ＴＣＲは、患者において自然に発生した腫瘍特異的Ｔ細胞に由来する。実施形態では、ＴＣＲは腫瘍抗原に結合する。実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、ｐ５３、ＭＡＧＥ－Ａ３またはＮＹ－ＥＳＯ－１を含む。実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲγとＴＣＲδ鎖、またはＴＣＲαとＴＣＲβ鎖、またはそれらの組み合わせを含む。

実施形態では、第２の細胞集団は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来する。実施形態では、標的抗原に対して高い親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞クローンは、単離され得る。ＴＩＬまたは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、定義されたＨＬＡ対立遺伝子の背景で提示された場合に優性Ｔ細胞応答を誘発可能なであることが知られているエピトープを表すペプチドでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養することができる。次に、ＭＨＣ－ペプチドテトラマー染色および／また低滴定濃度の同族ペプチド抗原でパルスされた標的細胞を認識および溶解する能力に基づいて、高親和性クローンを選択することができる。クローンが選択された後、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖、またはＴＣＲγ鎖とＴＣＲδ鎖は、分子クローニングによって同定および単離される。例えば、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の場合、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの遺伝子配列を使用して、ヒトＴ細胞における両ＴＣＲ鎖の安定した高レベルの発現を理想的に促進する発現構築物を生成する。次に、形質導入媒体、例えば、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスを生成して、その機能性（抗原特異性および機能親和性）について試験を行い、かつ臨床用ベクターを多く製造するために使用することができる。最終生成物のアリコートを使用して、被検体への注入前に増幅される標的Ｔ細胞集団（通常、患者のＰＢＭＣから精製）に形質導入することができる。

腫瘍反応性ＴＣＲをコードする遺伝子を得るために、様々な方法を実行し得る。詳細は、Ｋｅｒｓｈａｗら，ＣｌｉｎＴｒａｎｓｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４年５月；３（５）：ｅ１６に提供されている。実施形態では、特異的ＴＣＲは、患者において自然に発生した腫瘍特異的Ｔ細胞に由来することができる。このカテゴリーに含まれる抗原は、メラノサイト分化抗原ＭＡＲＴ－１およびｇｐ１００、さらにＭＡＧＥ抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１を含み、それらはより広範囲の癌で発現する。ウイルスタンパク質が形質転換細胞によって発現される限り、ウイルス関連悪性腫瘍に特異的なＴＣＲも単離することができる。このカテゴリーの悪性腫瘍は、肝炎と乳頭腫ウイルスに関連する肝臓癌と子宮頸癌、およびエプスタインバーウイルスに関連する悪性腫瘍を含む。実施形態では、ＴＣＲの標的抗原は、ＣＥＡ（例えば、結腸直腸癌を対象にする）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、ｐ５３（例えば、黒色腫を対象にする）、ＭＡＧＥ－Ａ３（例えば、黒色腫、食道肉腫および滑膜肉腫を対象にする）およびＮＹ－ＥＳＯ－１（例えば、黒色腫、肉腫および多発性骨髄腫を対象にする）を含む。

実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の調製および注入は、以下のように実施され得る。例えば、無菌状態で外科手術や生検標本からの腫瘍組織を採取し、且つ、アイスボックスの細胞培養室に輸送する。壊死組織や脂肪組織を取り除く。腫瘍組織を約１－３立方ミリメートルの小片に切り分ける。コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびＤＮＡ酵素を加えて、４℃で一晩で消化する。０．２ μｍフィルターでろ過し、リンパ球分離液を用いて１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞を分離および収集する。ＰＨＡ、２－メルカプトエタノールおよびＣＤ３モノクローナル抗体を含む培地で細胞を増幅し、活性化および増幅を誘導するために少量のＩＬ－２（１０－２０ＩＵ／ｍｌ）を添加し得る。３７℃、５％ＣＯ_２の条件で、細胞密度を注意深く測定し、それを０．５－２×１０６／ｍｌの範囲で７ー１４日間維持する。相同癌細胞を殺す能力を有するＴＩＬ陽性細胞は、共培養によって選別することができる。ＴＩＬ陽性細胞は、１×１０１１を超えるＴＩＬが得られるまで、高用量のＩＬ－２（５０００－６０００ＩＵ／ｍｌ）を含む無血清培地で増幅することができる。ＴＩＬを投与するために、まず連続遠心分離で生理食塩水に収集し、次に血小板投与装置で、５％のアルブミンおよび４５００００ＩＵのＩＬ－２を含む２００－３００ｍＬの体積になるまでろ過する。ＴＩＬは、中心静脈カテーテルを介して、３０－６０分かけて患者に注入してもよい。実施形態では、ＴＩＬは、２～４個の別々のバッグに分けて注入してもよく、注入は、数時間間隔で行ってもよい。

実施形態では、改変細胞集団は、第１の結合分子を含む細胞、および第２の結合分子を含む細胞を含む。実施形態では、改変細胞集団は、第１の結合分子を含む細胞、第２の結合分子を含む細胞、および第１の結合分子と第２の結合分子の両方を含む細胞を含む。

実施形態では、Ｔ細胞応答の増加は、ＣＡＲコピー数の増加、および／または放出されるサイトカイン（例えばＩＬ－６とＩＦＮ－γ）量の増加に基づく。実施形態では、Ｔ細胞応答は、サイトカイン放出、細胞増幅および／または活性化レベルを含む。実施形態では、第１のベクターはさらに、ＩＬ－６またはＩＦＮγまたはそれらの組み合わせをコードするポリヌクレオチドを含む。実施形態では、第１のベクターはさらに、ＩＬ－１２をコードするポリヌクレオチドを含む。実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＮＦＡＴおよび／またはＶＨＬをコードするポリヌクレオチドを含む。実施形態では、改変細胞集団は、第１の結合分子およびＩＬ－６またはＩＦＮγまたはそれらの組み合わせを発現する細胞、第２の結合分子を発現する細胞、第１の結合分子および第２の結合分子を発現する細胞、および／または第１の結合分子およびＩＬ－１２を発現する細胞を含む。実施形態では、改変細胞集団は、第２の結合分子およびＩＬ－６またはＩＦＮγまたはそれらの組み合わせを発現する細胞、第２の結合分子を発現する細胞、第１の結合分子および第２の結合分子を発現する細胞、および／または第１の結合分子およびＩＬ－１２を発現する細胞を含む。実施形態では、改変細胞集団は、第２の結合分子およびＩＬ－６またはＩＦＮγまたはそれらの組み合わせを発現する細胞、第２の結合分子を発現する細胞、第１の結合分子および第２の結合分子を発現する細胞、および／または第２の結合分子およびＩＬ－１２を発現する細胞を含む。実施形態では、改変細胞集団は、ＰＤ－１のドミナントネガティブ形態を発現する細胞を含む。

本開示は、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインをコードする核酸を記載する。実施形態では、ＷＢＣの表面上の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインが存在し、かつ、ＷＢＣの表面上の抗原と異なる腫瘍上の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインが存在する。第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインが導入された細胞を増幅するように機能するが、第２の抗原結合ドメインは、標的抗原に結合すると、標的腫瘍抗原を含む腫瘍細胞の成長を阻害するか、またはそれを殺すように機能する。実施形態では、本明細書に記載される核酸は、同じ核酸分子上の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの両方をコードする。実施形態では、２つの抗原結合ドメインは、２つの個別の核酸分子によってコードされる。例えば、第１の核酸は第１の抗原結合ドメインをコードし、第２の核酸は第２の抗原結合ドメインをコードする。

実施形態では、本開示は、結合分子の第１の抗原結合ドメインおよび結合分子の第２の抗原結合ドメインをコードする核酸を記載し、ここで、第１の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する。実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞の細胞表面抗原またはＢ細胞マーカーに結合する。実施形態では、第２の結合ドメインはＢ細胞マーカーに結合しない。実施形態では、第２の結合ドメインは、配列番号２６４または２６５のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。例えば、第２の抗原結合ドメインは、配列番号２７１－２７７のアミノ酸配列の１つを含むＣＡＲ上に存在する。

実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのような２つの異なる結合分子（第１の結合分子および第２の結合分子）上に存在する。一例として、第１のＣＡＲは、Ｂ細胞の表面上のマーカーに結合する細胞外結合ドメインを含み、第２のＣＡＲは、腫瘍細胞の標的抗原に結合する細胞外結合ドメインを含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、異なる核酸によってコードされる。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、２つの異なる結合分子であるが、単一の核酸によってコードされる。

実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインは、同じ結合分子、例えば二重特異性ＣＡＲ上に存在し、かつ単一の核酸によってコードすることができる。実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、リンカーによって連結された２つの異なるｓｃＦｖ分子を有してもよい。二重特異性ＣＡＲの例を表２に提供する。

二重特異性ＣＡＲの一例を図５に示す。図５に示すように、二重特異性ＣＡＲ（またはタンデムＣＡＲ（ｔａｎＣＡＲ））は、ｓｃＦｖ１およびｓｃＦｖ２の２つの結合ドメインを含み得る。実施形態では、ｓｃＦｖ１は、白血球抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合し、ｓｃＦｖ２は、固形腫瘍抗原（例えば、ｔＭＵＣ１）に結合する。実施形態では、ｓｃＦｖ１は固形腫瘍抗原に結合し、ｓｃＦｖ２は、別の固形腫瘍抗原（例えば、ｔＭＵＣ１およびＣＬＤＮ１８．２）に結合する。クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）は、クローディン－１８の胃特異的アイソフォームである。ＣＬＤＮ１８．２は、胃癌および膵臓癌で高度に発現している。実施形態では、ｓｃＦｖ１は、腫瘍細胞に発現するが正常組織に発現しない抗原（例えば、ｔＭＵＣ１）に結合し、ｓｃＦｖ２は、固形腫瘍に関連する非必須組織に発現する抗原に結合し、かつ組織の正常細胞を殺すことは、被検体（例えば、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ）に生命を脅かす事象（例えば、合併症）を引き起こさない。非必須組織の例には、前列腺や乳腺などの臓器、またはメラノサイトが含まれる。実施形態では、ｓｃＦｖ１およびｓｃＦｖ２は、同じ非必須組織に発現する異なる抗原（例えば、前立腺癌の場合のＡＣＰＰとＳＬＣ４５Ａ３、尿路上皮癌の場合のＳＩＧＬＥＣ１５とＵＰＫ２）に結合する。二重特異性ＣＡＲおよびその成分の配列は、表２に記載されている。

実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインは、ＣＡＲおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の上に存在し、個別の核酸によってコードすることができる。ＴＣＲの結合ドメインは、腫瘍細胞上の特異的な腫瘍抗原または腫瘍マーカーを標的とすることができる。実施形態では、ＴＣＲ結合ドメインは、特異的な腫瘍抗原を標的とするＴＣＲα結合ドメインまたはＴＣＲβ結合ドメインである。実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖またはＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を含む。

本開示はさらに、本明細書に記載される核酸を含むベクターを記載する。実施形態では、単一のベクターは、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲ（第２の抗原結合ドメインを含む）をコードする核酸を含む。実施形態では、第１のベクターは第１のＣＡＲをコードする第１の核酸を含み、第２のベクターは第２のＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸を含む。実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲをコードする核酸を含む。実施形態では、本明細書に記載される核酸を含むベクターは、レンチウイルスベクターである。

さらに、本開示は、本明細書に記載される核酸またはベクターを含む改変細胞を記載する。細胞には、本明細書に記載される核酸またはベクターが導入され、少なくとも１つ以上の異なる抗原結合ドメインを発現する。実施形態では、細胞は、１つの抗原結合ドメインを発現する。実施形態では、細胞は、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する。実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。実施形態では、細胞は、改変Ｔ細胞である。実施形態では、改変Ｔ細胞は、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインをコードする１つ以上の核酸を含むＣＡＲＴ細胞である。実施形態では、改変細胞は、第２の抗原結合ドメインを含むＴＣＲを含むＴ細胞を含む。

さらに、本開示は、本明細書に記載される改変細胞混合集団を含む組成物を記載する。実施形態では、改変細胞は、改変リンパ球、改変樹状細胞および改変マクロファージを含む。実施形態では、改変リンパ球は、改変Ｔ細胞または改変ＮＫ細胞である。実施形態では、改変Ｔ細胞はＣＡＲＴ細胞である。

本開示はさらに、患者において改変細胞を増幅および／または維持することに有効な改変細胞混合集団を記載する。実施形態では、改変細胞混合集団の例としては、以下が含まれる：（１）改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを発現する第１の改変細胞、および腫瘍細胞などの標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを発現する第２の改変細胞；（２）（１）の改変細胞、および少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを発現する他の改変細胞であって、前記２つの異なる抗原結合ドメインは、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ細胞で発現される）である；（３）少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを発現する改変細胞であって、前記２つの異なる抗原結合ドメインは、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ細胞で発現される）である；（４）標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを発現する改変細胞、および少なくとも２つの抗原結合ドメインを発現する改変細胞であって、前記２つの抗原結合ドメインは、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ細胞で発現される）である；または（５）改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを発現する改変細胞、および少なくとも２つの抗原結合ドメインを発現する改変細胞であって、前記２つの抗原結合ドメインは、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメイン（ここで、２つの異なる抗原結合ドメインが同じ細胞で発現される）である。実施形態では、２つの抗原結合ドメインは、異なる分子である。実施形態では、改変細胞を増幅するための抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）は、Ｂ細胞などのＷＢＣに結合する抗原結合ドメインであり、腫瘍細胞などの標的細胞を殺すための抗原結合ドメイン（第２の抗原結合ドメイン）は、腫瘍に結合する抗原結合ドメインである。実施形態では、Ｂ細胞に結合する抗原結合ドメインは、Ｂ細胞の表面抗原、例えばＣＤ１９に結合し、腫瘍に結合する抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、例えばｔＭＵＣ１に結合する。実施形態では、腫瘍細胞は固形腫瘍細胞である。

実施形態では、改変細胞混合集団は、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを発現する第１の改変細胞と、腫瘍細胞などの標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを発現する第２の改変細胞と、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメイン、および標的細胞を殺すための抗原結合ドメインの両方を発現する第３の改変細胞のうちの少なくとも１つを含み得る。例えば、改変細胞混合集団は、第１の改変細胞および第２の改変細胞、第１の改変細胞および第３の改変細胞、または第２の改変細胞および第３の改変細胞を含む。実施形態では、第１の改変細胞は、ＷＢＣ抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合するＣＡＲを発現し、第２の改変細胞は、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲを発現し、第３の改変細胞は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲ、および固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲ／ＴＣＲを発現する。持続的な抗原曝露は、Ｔ細胞の枯渇を引き起こす可能性があることが報告されている。したがって、第３の改変細胞を含む改変細胞集団の枯渇率は、改変細胞混合集団よりも高い。例えば、ＷＢＣ抗原の存在下では、第３の改変細胞のみを含む改変細胞集団の枯渇率は、第１の改変細胞および第２の改変細胞を含む改変細胞混合集団よりも高い。ＴＣＲの固形腫瘍抗原の例には、ＴＰＯ、ＴＧＭ３、ＴＤＧＦ１、ＴＲＯＰ２、ＬＹ６Ｋ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＨＥＧ１、ＬＹ７５、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＰＨＡ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＬＸＤＣ２、ＨＡＶＣＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＯＲ５１Ｅ２、ＣＤＨ１７、ＩＦＩＴＭ１、ＭＥＬＴＦ、ＤＲ５、ＳＬＣ６Ａ３、ＩＴＧＡＭ、ＳＬＣ４４Ａ１、ＲＨＯＣ、ＣＤ１０９、ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＡ１０、ＡＢＣＧ８、５ｔ４、ＨＨＬＡ２、ＰＲＡＭＥ、ＣＤＨ６、ＥＳＲ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＧＪＡ５、ＡＬＰＰ、ＦＧＤ２、ＰＭＥＬ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＭＬＡＮＡ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＳＸ２、ＰＬＡＣ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＰＡ２、ＴＴＮ、ＺＤＨＨＣ２３、ＡＲＰＰ２１、ＲＢＰＭＳ、ＰＡＸ５、ＭＩＡ、ＣＩＺ１、ＡＭＡＣＲ、ＢＡＰ３１、ＩＤＯ１、ＰＧＲ、ＲＡＤ５１、ＵＳＰ１７Ｌ２、ＯＬＡＨ、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＳＴＳ、ＩＧＦ２、ＡＣＴＡ１、またはＣＴＡＧ１が含まれる。

本明細書に記載される改変細胞混合集団は、第１の抗原結合ドメインを発現する約１％～１０％の改変細胞、第２の抗原結合ドメインを発現する５０％～６０％の改変細胞、および第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの両方を発現する約１０％の改変細胞（ここで、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは単一の細胞で発現される）を含む。

本開示はさらに、本明細書に記載される細胞を培養する方法を記載する。本明細書に記載される方法は、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインを含む細胞を得ることと、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、ＷＢＣの細胞表面分子、または第２の抗原結合ドメインが結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養することと、を含む。実施形態では、試薬は、ＷＢＣの細胞表面分子の細胞外ドメインである。

本開示はさらに、本明細書に記載される細胞混合集団を培養する方法を記載する。本明細書に記載される方法は、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインを含む細胞混合集団を得ることと、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、ＷＢＣの細胞表面分子、または第２の抗原結合ドメインが結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養することと、を含む。実施形態では、試薬は、ＷＢＣの細胞表面分子の細胞外ドメインである。

本開示は、インビトロで細胞を調製するための方法を記載し、ここで、前記方法は、細胞を提供することと、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインをコードする、本明細書に記載の１つ以上の核酸を細胞に導入することと、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合し、ＷＢＣの細胞表面分子、または第２の抗原結合ドメインが結合する抗原に由来する試薬の存在下で細胞を培養することと、を含む。方法は、第１の抗原結合ドメインを含む遺伝子改変細胞と、第２の抗原結合ドメインを含む細胞と、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの両方を含む細胞とを提供する。方法は、単一の抗原結合ドメインを含む細胞、および２つの抗原結合ドメインを発現する細胞を提供する。方法はさらに、単一の抗原結合ドメインを含む細胞と、２つの抗原結合ドメインを発現する細胞とを含む細胞混合集団を提供する。さらに、方法は、本明細書に記載される細胞混合集団を含む組成物を提供する。

本開示は、調製された細胞調製物、細胞混合集団、または細胞混合集団の組成物を使用して、被検体における腫瘍形成細胞を効果的に殺すために、癌を有する被検体におけるＴ細胞増幅を増強および維持することを記載する。実施形態では、方法は、本明細書に記載される複数の核酸をＴ細胞に導入して改変Ｔ細胞の混合集団を得ることと、ここで、前記複数の核酸は、固形腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲをコードし、および／またはＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲをコードし、被検体に有効量の改変細胞混合集団を投与することと、ここで、改変細胞混合集団の例には、以下が含まれる：（１）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞、およびＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲを含むＴ細胞；（２）（１）のＴ細胞、および（ｉ）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含む別のＴ細胞（（ｉ）と（ｉｉ）の両方が単一の改変Ｔ細胞にある）；（３）（ｉ）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含むＴ細胞（（ｉ）と（ｉｉ）の両方が単一の改変Ｔ細胞にある）；（４）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞、および（ｉ）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含むＴ細胞（（ｉ）と（ｉｉ）の両方が単一の改変Ｔ細胞にある）；または（５）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲを含むＴ細胞、および（ｉ）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含むＴ細胞（（ｉ）と（ｉｉ）の両方が単一の改変Ｔ細胞にある）。実施形態では、ＷＢＣはＢ細胞である。さらに、本開示は、被検体におけるリンパ球（Ｔ細胞）応答を導入および／または増強するための方法を記載し、ここで、応答は、治療薬（例えば、サイトカイン）または被検体を治療するための療法に対するものである。本明細書に記載される実施形態は、リンパ球を増幅および／または維持するメカニズムと、腫瘍細胞に対するＣＡＲの結合に関連するメカニズムとを含む。実施形態では、第１のメカニズムは、被検体におけるリンパ球の増幅および／または維持に関与する分子を含み、追加のメカニズムは、被検体における腫瘍細胞の成長を阻害するか、または被検体における腫瘍細胞を殺すことを目的とする分子を含む。実施形態では、これらのメカニズムは、シグナル伝達を含み、シグナル伝達を担う分子または分子のドメインは、本明細書に記載されるメカニズムに関与している。例えば、第１のメカニズムは、血球や血漿などの血液、または非必須組織に関連する抗原に結合するＣＡＲを含み、追加のメカニズムは、腫瘍細胞に関連する抗原を標的とするＣＡＲまたはＴＣＲを含む。非必須組織の例としては、乳腺、結腸、胃腺、卵巣、ＷＢＣなどの血液成分および甲状腺が含まれる。実施形態では、第１のメカニズムは、分子の第１の抗原結合ドメインを含み、追加のメカニズムは、分子の第２の抗原結合ドメインを含む。実施形態では、第１のメカニズムおよび追加のメカニズムは、改変細胞混合集団によって実行される。実施形態では、一つのメカニズムは、腫瘍細胞に関連する抗原を発現する細胞を含み、追加のメカニズムは、細胞表面抗原を発現するＢ細胞などのリンパ球を含む。実施形態では、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。実施形態では、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。

本明細書に記載される方法は、増幅分子および機能分子を発現するリンパ球を含む。実施形態では、増幅分子は、被検体におけるリンパ球を増幅および／または維持し、機能分子は、被検体における腫瘍細胞の成長を阻害するか、または被検体における腫瘍細胞を殺す。実施形態では、増幅分子および機能分子は、単一のＣＡＲ分子、例えば、二重特異性ＣＡＲ分子上にある。実施形態では、増幅分子および機能分子は、個別の分子、例えば、ＣＡＲおよびＴＣＲまたは２つの異なるＣＡＲ上に存在する。増幅分子は、血液（例えば、血球や血漿）または非必須組織に関連する抗原に結合するＣＡＲを含み得、機能分子は、腫瘍細胞に関連する抗原を標的とするＣＡＲまたはＴＣＲを含み得る。

被検体におけるリンパ球またはＴ細胞応答とは、ヘルパー、キラーや調節などのＴ細胞に関連する細胞媒介性の免疫を指す。例えば、Ｔ細胞応答は、免疫学的プロセスにおいて他のＷＢＣを補助すること、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を同定して破壊することなどの活動を含み得る。被検体におけるＴ細胞応答は、Ｔ細胞が殺すウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞の数、インビボでおよび／または、ウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞との共培養においてＴ細胞が放出するサイトカイン（例えば、ＩＬ－６およびＩＦＮ－γ）の量など、様々な指標を介して測定することができ、これは、被検体におけるＴ細胞の増殖レベル、Ｔ細胞の表現型の変化（例えば、記憶Ｔ細胞の変化）、および被検体におけるＴ細胞の寿命または寿命レベルを示す。

実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞応答を増強する方法は、それを必要とする被検体、例えば、腫瘍があると診断された被検体を効果的に治療することができる。腫瘍という用語は塊を指し、血液などの流体の集合体であってよく、固形塊であってもよい。腫瘍は、悪性（癌性）または良性のものであり得る。血液癌の例としては、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および多発性骨髄腫が含まれる。

固形腫瘍は、通常、嚢胞や液状の部分を含まない。悪性固形腫瘍の主な種類には、肉腫および癌腫がある。肉腫は、血管、骨骼、脂肪組織、靭帯リンパ管、神経、軟骨、筋肉、靭帯または腱に存在可能な間質細胞と呼ばれる軟部組織細胞に発生する腫瘍であり、癌腫は、皮膚や粘膜に存在する上皮細胞に発生する腫瘍である。最も一般的な肉腫には、軟部組織および骨細胞が関与する未分化多形肉腫、血管、消化管や子宮に行き渡る平滑筋細胞が関与する平滑筋肉腫、骨細胞が関与する骨肉腫、および脂肪細胞が関与する脂肪肉腫が含まれる。肉腫のいくつかの例としては、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、軟骨肉腫、中皮腫、線維肉腫および神経膠腫が含まれる。

代表的な５つの癌腫としては、乳房や前立腺など体液や粘液を生成する臓器が関与する副腎癌、皮膚癌など皮膚の最外層の細胞が関与する基底細胞癌、皮膚の基底細胞が関与する扁平上皮癌、および膀胱、腎臓、尿管などの尿路の移行細胞に影響を及ぼす移行細胞癌が含まれる。癌腫の例としては、甲状腺癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、腸癌、皮膚癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌および胆管癌が含まれる。

本明細書に記載の方法は、癌があると診断された被検体を治療するために使用することができる。癌は、血液癌であってもいし、肉腫や癌腫などの固形腫瘍であってもよい。治療方法は、本明細書に記載される混合Ｔ細胞集団の有効量を被検体に投与してＴ細胞応答を提供することを含み、前記混合Ｔ細胞集団は、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインはＷＢＣの細胞表面分子に結合し、第２の抗原結合ドメインは、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原に結合する。実施形態では、被検体におけるＴ細胞応答を増強することは、インビボで第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを発現するＴ細胞の増殖を選択的に増強することを含む。

被検体におけるＴ細胞応答を増強するための方法は、ＣＡＲ、または、２つの異なる抗原結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲを含むＴ細胞を被検体に投与することと、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含むＴ細胞を投与することを含み、ここで、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、それぞれ異なる抗原結合ドメインを含む。

実施形態では、本明細書に記載の被検体におけるＴ細胞応答を増強するための方法は、ＣＡＲ分子およびＴＣＲ分子を含むＴ細胞を被検体に投与することを含む。ＣＡＲ分子は、白血球の表面マーカーを標的とし、またはそれに結合し、ＴＣＲ分子は、腫瘍細胞の表面または内部に発現している腫瘍のマーカーまたは抗原に結合する。

実施形態では、それを必要とする被検体におけるＴ細胞応答を増強するための方法は、改変細胞混合集団、または改変細胞混合集団を含む組成物を被検体に投与することを含む。改変Ｔ細胞の混合集団の例には、以下が含まれる：（１）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲを含むＴ細胞、および腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞；（２）（１）のＴ細胞、および（ｉ）腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含む別のＴ細胞（（ｉ）と（ｉｉ）の両方が単一の改変Ｔ細胞にある）；（３）（ｉ）腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含むＴ細胞（（ｉ）と（ｉｉ）の両方が単一の改変Ｔ細胞にある）；（４）腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞、および（ｉ）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含むＴ細胞；または（５）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲを含むＴ細胞、および（ｉ）固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲまたはＴＣＲと（ｉｉ）ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲの両方を含むＴ細胞（（ｉ）と（ｉｉ）の両方が単一の改変Ｔ細胞にある）。実施形態では、被検体は、固形腫瘍があると診断されている。実施形態では、腫瘍抗原は、固形腫瘍抗原、例えばｔＭＵＣ１である。実施形態では、ＷＢＣはＢ細胞であり、抗原はＢ細胞抗原である。実施形態では、Ｂ細胞抗原はＣＤ１９である。実施形態では、腫瘍抗原はｔＭＵＣ１であり、ＷＢＣの抗原はＣＤ１９である。

本開示は、抗原結合ドメインを発現する細胞をインビボで増幅および／または維持する方法を記載する。方法は、本明細書に記載される改変細胞混合集団、または改変細胞混合集団を含む組成物の有効量を被検体に投与することを含む。本明細書に記載されるこれらの方法は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／または樹状細胞を増幅するために使用され得る。

本明細書に記載される改変Ｔ細胞の混合集団は、第１のＣＡＲおよび／または第２のＣＡＲまたはＴＣＲを含む。実施形態では、第１のＣＡＲは第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲまたはＴＣＲは第２の抗原結合ドメインを含む。例えば、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの細胞質ドメインは、細胞応答を活性化するためのシグナルを伝達するための共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、異なる改変Ｔ細胞上で発現される。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、同じ改変Ｔ細胞上で発現される。

実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の混合集団において、改変Ｔ細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを含む第１のＣＡＲの細胞質ドメインは、第１のＣＡＲの活性化または刺激が、ＷＢＣを標的とする改変Ｔ細胞の殺傷機能を導入および／または活性化することなく、リンパ球などのＷＢＣを増幅するように、ＣＤ３ζドメインの非存在下で、１つ以上の共刺激ドメインを含む。実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。実施形態では、第１のＣＡＲの細胞質ドメインがＣＤ３ζドメインの非存在下で１つ以上の共刺激ドメインを含む場合、第２のＣＡＲはＣＤ３ζドメインを含む。

実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、同じＣＡＲ（第１のＣＡＲ）、例えば、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの二重特異性ＣＡＲ上にある。細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも２つのｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖの少なくとも１つは、ＷＢＣの細胞表面分子に結合する第１の抗原結合ドメインとして機能する。実施形態では、二重特異性ＣＡＲは、改変Ｔ細胞上で発現される。

実施形態では、ＷＢＣの細胞表面分子と異なる抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１３、Ｂ７－Ｈ３、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１－ＣＡＭ、ＣＥＡ、クローディン１８．２、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢＴ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＦＳＨ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ－１Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ゼタカイン）、Ｋａｐｐａ、白血病関連抗原、ＬｅｗｉｓＹ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ－１、ＴＲＡＩＬ受容体１またはＶＥＧＦＲ２である。

実施形態では、ＭＵＣ１は、ヒトＭＵＣ１の腫瘍専用エピトープであり、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲは、個別のポリペプチドとして発現される。実施形態では、ＭＵＣ１は、ヒトＭＵＣ１の腫瘍形態（ｔＭＵＣ１）である。

実施形態では、本明細書に記載される改変細胞混合集団において、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを含む第１のＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインのシグナル伝達ドメインを含まずに共刺激ドメインを含んでもよく、ＣＡＲ（第２のＣＡＲ）は、ＭＵＣ１結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含んでもよい。

本明細書で使用されるように、「ＭＵＣ１」という用語は、以下のように定義される分子を指す。ＭＵＣ１は、上皮ムチンファミリー分子の１つである。ＭＵＣ１は、通常、主要な臓器のすべての腺上皮細胞で発現される膜貫通型ムチン糖タンパク質である。正常細胞では、ＭＵＣ１は、頂端表面にのみ発現し、かつ炭水化物によって隔離されたコアタンパク質で高度にグリコシル化される。細胞が悪性の表現型に変化することにつれ、ＭＵＣ１の発現は数倍増加し、かつその発現はもはや頂端表面に限定されるものではなく、細胞表面全体および細胞質内に見られるようになる。さらに、腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）のグリコシル化には異常があり、正常組織で発現しているＭＵＣ１に比べてペプチドコアの露出度が高い。

ＭＵＣ１は、多くの上皮癌で広く発現しており、かつ異常にグリコシル化されているため、非悪性細胞で発現するＭＵＣ１とは構造的および抗原的に異なる（例えば、Ｂａｒｒａｔｔ－Ｂｏｙｅｓ，１９９６；Ｐｒｉｃｅら，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，１９９１を参照）。ＭＵＣ１の主要な形態は、多数の２０個のアミノ酸タンデムリピートユニットを有する免疫原性の高い細胞外ムチン様ドメイン、膜貫通領域および細胞質尾部からなる高分子量分子である（Ｑｕｉｎら，２０００；ＭｃＧｕｃｋｅｎら，１９９５；Ｄｏｎｇら，１９９７）。

乳房や膵臓を含むほとんどの上皮腺癌では、ＭＵＣ１が過剰発現し、かつ異常にグリコシル化される。乳房や膵臓の腺癌は、ＭＵＣ１を過剰発現するだけでなく、ＭＵＣ１を循環させる。高いＭＵＣ１の血清レベルは、進行性疾患に関連している。ＭＵＣ１は、抗原内で発現するエピトープが複雑で非均一であるため、将来のバイオマーカーとして利用される。癌性組織で合成されたＭＵＣ１（例えば、腫瘍関連ＭＵＣ１）は通常、異常なオリゴ糖プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を示し、これにより、シアリル－Ｌｅａ（ＣＡ１９－９試験で測定）、シアリル－Ｌｅｘ、やシアリル－Ｔｎ（ＴＡＧ－７２）などのネオマーカー、およびＴｎなどの潜在的なエピトープの発現を引き起こす。

ＭＵＣ１に対する治療用の抗体がいくつか開発されている。ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（ＨＭＦＧ１としても知られる）は、放射性同位元素であるイットリウム－９０を卵巣癌の腫瘍内に送達するベクターとして、第ＩＩＩ相臨床試験が行われている（Ｓｃｏｔｔら，２０１２に掲載）。ＣＡ１５－３（ＨＭＦＧ１抗体でもある）、ＣＡ２７－２９、およびＣＡ１９－９は、いずれもＭＵＣ１に対する抗体で、癌患者の循環ＭＵＣ１レベルを評価するために用いられる。しかしながら、これらの抗体は、正常な上皮細胞と形質転換された腫瘍上皮細胞で発現するＭＵＣ１を効果的に区別できないため、治療薬またはバイオマーカーとしての有用性が限られている。言い換えれば、これらの抗体はいずれも腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）エピトープを標的とするように見えない。

腫瘍関連形態のＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）に対して高い特異性を持つ新しい抗体は、ＴＡＢ－００４と称され、米国特許出願第８，５１８，４０５号に記載されている（Ｃｕｒｒｙら，２０１３も参照）。ペムツモマブ（ＨＭＦＧ１）は、抗原としてヒトの乳脂肪球を使用して開発されたが（Ｐａｒｈａｍら，１９８８）、ＴＡＢ－００４は、ＭＵＣ１の変化した形態を発現している腫瘍を使用して開発された（Ｔｉｎｄｅｒら，２００８）。ＴＡＢ－００４は、ＭＵＣ１のタンデムリピート配列内の変化したグリコシル化エピトープを認識することができる。この領域は、ｔＭＵＣでの抗原検出に使用され得るが、グリコシル化の大きな分岐により、通常のＭＵＣ１では抗原の検出が妨害される（Ｇｅｎｄｌｅｒ，２００１；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，２００３ｂ；Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ＆Ｓｗａｎｓｏｎ，２００４；Ｋｕｆｅ，２００９）。重要なことに、ＴＡＢ－００４は、他のＭＵＣ１抗体が認識するエピトープとは異なり、重鎖および軽鎖の固有の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。その抗体は、３ｎｇ／ｍｌ（２０ｐＭ）の高い結合親和性で標的抗原に結合し、かつ無関係な抗原に結合しない（Ｃｕｒｒｙら，２０１３）。したがって、ＴＡＢ－００４は、ＭＵＣ１の正常形態と腫瘍形態を区別するが、ＨＭＦＧ１（ペムツモマブ）は区別することができない（米国特許出願第８，５１８，４０５号を参照）。

実施形態では、第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、および／または第２のＣＡＲは、第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。

実施形態では、抗原結合ドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖである。実施形態では、第１のＣＡＲは、配列番号５、６および５３－５８のうちの１つのアミノ酸配列を含み、第２のＣＡＲは、配列番号５－１７、２９、３３、３７、７１、および７２のうちの１つのアミノ酸配列、または配列番号４１、４５、６３、６７および６８のうちの１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。実施形態では、第１のＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号５９または６０の核酸配列を含み、第２のＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号６１の核酸配列を含む。実施形態では、核酸は、配列番号６２－６９の核酸配列のうちの１つを含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、個別のポリペプチドとして発現される。

実施形態では、第１の抗原結合ドメインはＣＡＲ上に存在し、第２の抗原結合ドメインはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）上に存在する。実施形態では、ＴＣＲは改変ＴＣＲである。実施形態では、ＴＣＲは、患者において自然に発生した腫瘍特異的Ｔ細胞に由来する。実施形態では、ＴＣＲは腫瘍抗原に結合する。実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ｔＭＵＣ１、ＭＡＲＴ－１、ｐ５３、ＭＡＧＥ－Ａ３またはＮＹ－ＥＳＯ－１を含む。

本明細書では、「甲状腺抗原」とは、甲状腺細胞上で発現される、または甲状腺細胞によって発現される抗原を指す。甲状腺細胞の例には、濾胞細胞と傍濾胞細胞が含まれる。ヒトＴＳＨＲは、甲状腺膜（配列番号２０）上に存在する甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の受容体である。下垂体から分泌されたＴＳＨは、甲状腺濾胞細胞膜上のＴＳＨＲに結合すると、甲状腺は代謝機能を持つＴ３およびＴ４を分泌する。ＴＳＨＲは、約９５，０００～１００，０００ダルトンの分子量を持つ７回膜貫通型の受容体である。ヒト甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）には、ロイシンリッチドメイン（ＬＲＤ；アミノ酸３６－２８１）、開裂ドメイン（ＣＤ；アミノ酸２８２－４０９）および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ；アミノ酸４１０-６９９）の３つのドメインが含まれることが報告されている。ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）α鎖は、ＬＲＤ表面およびＣＤ表面の多くのアミノ酸に結合することがわかった。本明細書では、「ＴＳＨＲ」は、ヒト甲状腺刺激ホルモン受容体を指す。この用語は、ヒト甲状腺刺激ホルモン受容体を含むだけでなく、本明細書に開示されているヒト甲状腺刺激ホルモン受容体の抗体またはリガンドに結合するヒト甲状腺刺激ホルモン受容体の能力を保持している程度の、その変異体、同族体、フラグメントおよびその一部も含むと解釈されるべきである。

特定の実施形態では、抗原は、胃または結腸の抗原である。例えば、結腸抗原は、配列番号２３を有するグアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）である。本明細書では、「結腸抗原」とは、結腸細胞上で発現される、または結腸細胞によって発現される抗原を指す。結腸細胞の例には、杯細胞および腸上皮細胞が含まれる。グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）は、主に小腸上皮細胞で発現される。ＧＵＣＹ２Ｃは、下痢原性細菌エンテロトキシン（ＳＴ）や、腸パラクリンホルモン、グアニリンおよびウログアニリンの受容体である。これらのリガンドは、小腸上皮細胞や腎上皮細胞における水や電解質の輸送を調節し、最終的には急性分泌性下痢の原因となる。本明細書では、「ＧＵＣＹ２Ｃ」は、ヒトグアニル酸シクラーゼ２Ｃを指す。この用語は、ヒトグアニル酸シクラーゼ２Ｃを含むだけでなく、本明細書に開示されているヒトグアニル酸シクラーゼ２Ｃの抗体またはリガンドに結合するグアニル酸シクラーゼ２Ｃの能力を保持している程度の、その変異体、同族体、フラグメントおよびその一部も含むと解釈されるべきであす。実施形態では、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも一部のアミノ酸配列は、配列番号２３を含む。クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）は、クローディン－１８の胃特異的アイソフォームであり、胃や膵臓腺癌で高度に発現している。

実施形態では、標的抗原に対して高い親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞クローンを単離し得る。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、定義されたＨＬＡ対立遺伝子の背景で提示された場合に優性Ｔ細胞応答を誘発することが知られているエピトープを表すペプチドでパルスされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養することができる。次に、ＭＨＣ－ペプチドテトラマー染色および／または低滴定濃度の同族ペプチド抗原でパルスされた標的細胞を認識および溶解する能力に基づいて、高親和性クローンを選択することができる。クローンが選択された後、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖、またはＴＣＲγ鎖とＴＣＲδ鎖は、分子クローニングによって同定および単離される。例えば、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の場合、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの遺伝子配列を使用して、ヒトＴ細胞における両ＴＣＲ鎖の安定した高レベルの発現を理想的に促進する発現構築物を生成する。次に、形質導入媒体、例えば、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスを生成して、その機能性（抗原特異性および機能親和性）について試験を行い、かつ臨床用ベクターを多く製造するために使用することができる。最終生成物のアリコートを使用して、被検体への注入前に増幅される標的Ｔ細胞集団（通常、患者のＰＢＭＣから精製）に形質導入することができる。

腫瘍反応性ＴＣＲをコードする遺伝子を得るために、様々な方法を実行し得る。詳細は、Ｋｅｒｓｈａｗら，ＣｌｉｎＴｒａｎｓｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４年５月；３（５）：ｅ１６に提供されている。実施形態では、特異的ＴＣＲは、患者において自然に発生した腫瘍特異的Ｔ細胞に由来することができる。このカテゴリーに含まれる抗原は、メラノサイト分化抗原ＭＡＲＴ－１およびｇｐ１００、さらにＭＡＧＥ抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１を含み、それらはより広範囲の癌で発現する。ウイルスタンパク質が形質転換細胞によって発現される限り、ウイルス関連悪性腫瘍に特異的なＴＣＲも単離することができる。このカテゴリーの悪性腫瘍は、肝炎と乳頭腫ウイルスに関連する肝臓癌と子宮頸癌、およびエプスタインバーウイルスに関連する悪性腫瘍を含む。実施形態では、ＴＣＲの標的抗原は、ＣＥＡ（例えば、結腸直腸癌を対象にする）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、ｐ５３（例えば、黒色腫を対象にする）、ＭＡＧＥ－Ａ３（例えば、黒色腫、食道および滑膜肉腫）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（例えば、黒色腫、肉腫および多発性骨髄腫を対象にする）を含み得る。

実施形態では、第１のＣＡＲの結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、第２のＣＡＲの結合ドメインは、腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）に結合する。実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、（ｉ）配列番号７６または８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、配列番号７７または８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、配列番号７８または８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）配列番号７３または８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１と、ＴＲＰ－ＡＬＡ－ＳＥＲ（ＷＡＳ）または配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、配列番号７５または８４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。

実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、（ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１と、ＴＲＰ－ＡＬＡ－ＳＥＲ（ＷＡＳ）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２と、配列番号７５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３を含む。

実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、（ｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域１と、配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域２と、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖相補的決定領域３と、および（ｉｉ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域１と、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補的決定領域２と、配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３を含む。実施形態では、第１のＣＡＲの結合ドメインは、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む。実施形態では、第２のＣＡＲの結合ドメインは、配列番号７０－７２および７９－８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む。

実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、個別のポリペプチドとして発現される。

実施形態では、第２のＣＡＲの細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインは、第２のＣＡＲが、ＣＤ１９を発現する細胞を損傷することなく、ＣＤ１９を発現する細胞を介して改変Ｔ細胞を活性化できるように改変される。

本明細書に記載の実施形態は、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、細胞質ドメイン、および膜貫通ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体に関し、ここで、第１の抗原結合ドメインが第１の抗原を認識し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原を認識し、第１の抗原が第２の抗原と異なる。

実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、同じ細胞で発現されない。実施形態では、第１の抗原は、血液成分の抗原であり、第２の抗原は、固形腫瘍の抗原である。

血球とは、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板または他の血球を指す。例えば、ＲＢＣは、循環系を流れる血流を介して体組織に酸素（Ｏ２）を送達する血球である。血小板は、血栓の形成につながる止血に関与する細胞である。ＷＢＣは、感染症および異物から体を守ることに関与する免疫系の細胞である。ＷＢＣには様々な種類と亜種があり、それぞれ異なる役割を担っている。例えば、顆粒球、単球およびリンパ球は、白血球の３つの主要な種類である。顆粒球には、好中球、好酸球、好塩基球の３つの異なる形態がある。

ＷＢＣの細胞表面分子は、ＷＢＣ表面に発現される分子を指す。例えば、リンパ球の細胞表面分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ３０を含み得る。Ｂ細胞の細胞表面分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡを含み得る。単球の細胞表面分子は、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９およびＣＤ１ｃを含み得る。顆粒球の細胞表面分子は、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８およびＣＤ１３を含み得る。

実施形態では、第１の抗原はＣＤ１９であり、第２の抗原は腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）である。実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５および６のアミノ酸配列のうちの１つを含む。実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号７０－７２および７９－８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む。

実施形態では、本開示は、それを必要とする被検体におけるＴ細胞応答を増強する方法、または被検体の腫瘍を治療する方法を記載しており、前記方法は、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の混合集団、または改変Ｔ細胞の混合集団を含む組成物の有効量を被検体に投与することにより、Ｔ細胞応答を提供し、ＣＤ１９を発現する細胞を介して被検体の血液にＣＡＲＴ細胞を増幅するようになることを含む。実施形態では、方法はさらに、ＣＡＲＴ細胞の活性化および／または増幅を継続するために、Ｂ細胞を被検体に注入することを含み得る。例えば、ＣＡＲＴ細胞を注入する前に、被検体のＢ細胞または健康なドナーからの遺伝子改変Ｂ細胞を入手して保存し得る。実施形態では、方法はさらに、ＣＤ１９を発現する細胞、または少なくともＣＤ１９の細胞外ドメインを含むポリペプチド、またはＣＡＲＴ細胞が認識する抗原を投与することを含み得る。例えば、ＣＤ１９を発現する細胞は、ＣＤ１９をコードする核酸配列で形質導入されるＫ５６２およびＮＫ９２などの細胞株を含み得る。実施形態では、方法はさらに、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの両方を発現するＣＡＲＴ細胞を認識することと、被検体に識別子のＣＡＲＴ細胞を投与することとを含み得る。例えば、ＭＵＣ１は、ＭＵＣ１を発現するＣＡＲＴ細胞をタイムリーに認識できるように、ソートマーカーと関連付けられてもよい。

実施形態では、腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）は、腫瘍細胞で発現されるが、対応する非悪性細胞で発現されない。実施形態では、腫瘍関連ＭＵＣ１に対するｓｃＦｖは、ｏ－グリコシル化されたＧＳＴＡモチーフ（配列番号８８）と直接相互作用する。

実施形態では、本開示は、インビボで細胞を増幅および維持する方法を記載する。実施形態では、方法は、Ｔ細胞応答を提供するために、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の混合集団の有効量を、それを必要とする被検体に投与することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する可溶化剤を発現する提示細胞（例えば、Ｔ細胞）の有効量を投与することと、を含み得る。実施形態では、方法は、それを必要とする被検体におけるＴ細胞応答を増強するために実施され得る。方法は、Ｔ細胞応答を提供するために、ＣＡＲを含む改変Ｔ細胞の混合集団の有効量を被検体に投与することと、被検体におけるＴ細胞応答を増強するために、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する可溶化剤を発現する提示細胞の有効量を投与することと、を含み得る。特定の実施形態では、提示細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞および／または抗原提示細胞である。特定の実施形態では、被検体におけるＴ細胞応答を増強することは、ＣＡＲを含むＴ細胞の増殖を選択的に増強することを含み得る。実施形態では、方法は、改変Ｔ細胞を用いて被検体の病状の治療を増強するために使用され得る。方法は、薬剤を発現するＴ細胞集団を投与すること、またはワクチンとして製剤化される薬剤を投与することを含み得る。これらの例では、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を含み、かつＣＡＲの細胞外ドメインが前記薬剤を認識する。実施形態では、方法は、疾患を有する被検体における改変Ｔ細胞の増殖を増強するために実施され得る。方法は、ＣＡＲを含む改変Ｔ細胞を調製することと、改変Ｔ細胞の有効量を被検体に投与することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する薬剤をコードする核酸を細胞に導入することと、（薬剤をコードする核酸が導入された）細胞の有効量を被検体に投与することと、を含み得る。実施形態では、Ｔ細胞増幅は、Ｔ細胞ゲノムＤＮＡにおけるＣＡＲ分子のコピー数の増加に基づいて測定され得る。実施形態では、Ｔ細胞増幅は、Ｔ細胞で発現された分子に関するフローサイトメトリー分析に基づいて測定され得る。

本明細書に記載される実施形態は、別々のＴ細胞および／または同じＴ細胞での第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲを含む改変Ｔ細胞の混合集団に関し、ここで、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４やＢＣＭＡなどの抗原に結合し、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、腫瘍関連ＭＵＣに結合する。実施形態では、腫瘍関連ＭＵＣは、ＭＵＣ１（例えばｔＭＵＣ１）またはＭＵＣ２である。本明細書に記載される実施形態は、改変Ｔ細胞の混合集団を含む組成物、およびそれを必要とする被検体におけるＴ細胞応答を増強する方法、または被検体における腫瘍を治療する方法に関し、前記方法は、改変Ｔ細胞の混合集団の有効量を投与することを含む。

実施形態では、第１のＣＡＲは、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み、第２のＣＡＲは、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。実施形態では、第１のＣＡＲは、配列番号２０３、２０７、２１６または２１９のアミノ酸配列を含み、第２のＣＡＲは、配列番号２０２または２０５のアミノ酸配列を含む。実施形態では、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。実施形態では、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む。実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２０１、２０４、２０６、２０８、２１５、２１７、２１８または２２０の核酸配列を含む。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのそれぞれは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ分子の細胞質ドメインは、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ分子は、ＣＤ３ζドメインに対応する成分を有さずに共刺激ドメインを含み得る。実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ分子は、共刺激ドメインを有さずにＣＤ３ζドメインを含み得る。

実施形態では、改変細胞は、プログラム死１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アッテネーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３（ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）またはＣＤ１６０のドミナントネガティブ変異体を含む。実施形態では、改変細胞は自殺遺伝子をコードする核酸配列をさらに含み、および／または自殺遺伝子はＨＳＶ－ＴＫ自殺遺伝子系を含む。実施形態では、単離Ｔ細胞は、対応する野生型Ｔ細胞と比較して、減少した量のＴＣＲを含む。

ドミナントネガティブ突然変異は、野生型対立遺伝子に対して拮抗する遺伝子産物が変化している。これらの突然変異は通常、分子機能の変化（通常は不活性）を引き起こし、優性または半優性表現型を特徴とする。実施形態では、本明細書に記載される改変細胞は、ドミナントネガティブ（ＤＮ）形態のＰＤ－１受容体を含む。実施形態では、本明細書に記載される改変細胞におけるＤＮＰＤ－１受容体の発現は、誘導性遺伝子発現系によって調節される。実施形態では、誘導性遺伝子発現系は、ｌａｃ系、テトラサイクリン系、またはガラクトース系である。

本開示は医薬組成物を記載している。医薬組成物は、本明細書に記載されるＣＡＲ分子、ＴＣＲ分子、改変ＣＡＲＴ細胞、ＣＡＲまたはＴＣＲを含む改変細胞、改変細胞混合集団、核酸およびベクターのうちの１つ以上を含む。医薬組成物は、治療（または予防）する疾患に適切な方法で投与される。適切な投与量は臨床試験により決定されるが、投与の数や頻度は、患者の病状、患者の疾患の種類や重症度などの要因によって決定される。

「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府、州政府、ＥＭＡ（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｅｄｉｃｉｎｅｓＡｇｅｎｃｙ）の規制機関によって承認されているか、米国薬局方（米国薬局方－３３／米国の処方箋－２８再発行、メリーランド州ロックビルの米国薬局方コンベンションコーポレーションが２０１０年４月に出版される）またはその他の一般に認められた薬局方に記載されていて動物、特にヒトへの使用を可能にすることを意味する。

「ベクター」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤または媒体である。薬学的に許容されるベクターは、水や油などの無菌液体であり得て、石油、動物、植物または合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合に好ましいベクターである。食塩水溶液、水性デキストロースやグリセリン溶液は液体ベクター、特に注射可能な溶液として使用することもできる。

本開示はさらに、本明細書に記載される第１の細胞集団および第２の細胞集団を含む医薬組成物を記載する。本明細書に記載される医薬組成物は、第１の抗原結合分子を含む第１の細胞集団と、第２の抗原結合分子を含む第２の細胞集団とを含み、且つ癌治療に適している。例えば、第１の抗原結合分子が抗原に結合することで、癌治療に適した細胞の増幅が促進される。

本開示はさらに、本明細書に記載される、癌治療に適した細胞を用いて癌治療を増強する方法を記載する。方法は、腫瘍抗原を発現する形態の癌を有する被検体に第１の組成物の有効量を投与することと、ここで、第１の組成物は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子（例えば、ＣＡＲ）を含む第１の細胞（例えば、Ｔ細胞）集団を含み、被検体に第２の組成物の有効量を投与することと、を含み、ここで、第２の組成物は第２の抗原結合分子を含む細胞集団を含む。第１の組成物および第２の組成物の投与は、同時にまたは別々に、例えば順次行うことができる。癌治療に適した細胞についての情報は、Ｅｙｉｌｅｔｅｎら，ＩｍｍｕｎｅＣｅｌｌｓｉｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，ＭｅｄｉａｔｏｒｓＩｎｆｌａｍｍ．２０１６；２０１６：５２３０２１９に記載されており、参照により本明細書に組み込まれている。

実施形態では、方法は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、を含む。実施形態では、方法は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、固形腫瘍抗原に結合するＴ細胞（ＴＣＲおよびＴＩＬ治療で使用されるＴ細胞）集団の有効量を投与することと、を含む。実施形態では、方法は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲを発現するＮＫ細胞集団またはＮＫ細胞の有効量を投与することと、を含む。実施形態では、方法は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲを発現するＤＣ細胞集団またはＤＣ細胞の有効量を投与することと、を含む。実施形態では、方法は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲを発現するマクロファージ集団またはマクロファージの有効量を投与することと、を含む。実施形態では、方法は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲを発現する好中球集団または好中球の有効量を投与することと、を含む。実施形態では、方法は、ＷＢＣ抗原に結合するＣＡＲＴ細胞集団の有効量を投与することと、固形腫瘍抗原を結合または標的とするリンパ球集団の有効量を投与することと、を含む。実施形態では、固形腫瘍抗原は、細胞表面（例えば、ＴＳＨＲ）、腫瘍微小環境の細胞外マトリックス（例えば、αｖβ５インテグリン）および／または腫瘍細胞内（例えば、ｇｐ１００）に位置することができる。

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療有効量」が示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、患者（被検体）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および病状の個体差を考慮して、医師が決定できる。本明細書に記載される改変細胞を含む医薬組成物は、１０４～１０９個の細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５～１０６個の細胞／ｋｇ体重（前記範囲のすべての整数値を含む）の投与量で投与することができるといえる。改変細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を使用して投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．ｏｆＭｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。当業者は、患者の疾患徴候をモニタリングし、それに応じて治療方法を調整することにより、特定の患者に対する最適な投与量および治療レジームを容易に決定することができる。特定の実施形態では、被検体に活性化のＴ細胞を投与してから、血液を採取し（またはアフェレーシスを実施する）、活性化および増幅されたＴ細胞を収集し、かつ、これらの活性化および増幅されたＴ細胞を患者に再注入することが望しい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施することができる。特定の実施形態では、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。特定の実施形態では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。理論に縛られることなく、このような複数回の採血／複数回の再注入の手段を採用すれば特定のＴ細胞集団を選択することができる。

実施形態では、治療上有効な量の改変細胞混合集団を、それを必要とする被検体に順次または同時に投与することができる。一例として、２つの異なる改変細胞の混合集団の場合、標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを含む改変細胞の治療上有効な量の投与の前、後または同時に、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを含む改変細胞の治療上有効な量を投与することができる。別の例として、２つの異なる改変細胞の混合集団の場合、改変細胞を増幅および／または維持する抗原結合ドメインと標的細胞を殺す抗原結合ドメインとを共に含む改変細胞（単一の改変細胞において）の治療上有効な量の投与の前、後または同時に、標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを含む改変細胞の治療上有効な量を投与することができる。一例として、（１）改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを含む改変細胞、（２）標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを含む改変細胞、および（３）改変細胞を増幅および／または維持する抗原結合ドメインと、標的細胞を殺す抗原結合ドメインの両方を含む改変細胞（単一の改変細胞において）という３つの異なる改変細胞を含む混合集団の場合、任意の順序（１、２、３；２、３、１；３、１、２；１、３、２；２、１、３；または３、２、１）で順次または同時（１＋２＋３同時）に、（１）、（２）および（３）の有効量を投与することができる。さらに、３つの改変細胞のうちの２つを組み合わせて、その前または後に３つ目の改変細胞を投与することもできる。例えば、（１）と（２）の組み合わせを（３）の前または後に投与することができ、または、（１）と（３）の組み合わせを（２）の前または後に投与することができ、または（２）と（３）の組み合わせを（１）の前または後に投与することができる。

本明細書に記載の医薬組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、インプラントまたは移植を含む、任意の便利な方法で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髓内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹腔内投与で患者に投与することができる。実施形態では、本明細書に記載される改変細胞組成物は、皮内または皮下注射によって被検体に投与される。実施形態では、本開示のＴ細胞組成物は、静脈内注射によって投与される。改変細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注入され得る。実施形態では、本明細書に記載の方法、またはＴ細胞を治療レベルまで増幅する当技術分野で知られている他の方法を用いて活性化および増幅された細胞は、任意の数の関連する治療方法、例えば併用療法と組み合わせて（例えば、治療の前に、同時に、または後に）患者に投与され、前記治療方法は、抗ウイルス剤、シドフォビル、インターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）による治療、またはＭＳ患者に対するナタリズマブ治療、または乾癬患者に対するエファリズマブ治療、またはＰＭＬ患者に対する他の治療などを含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、マイコフェノレートおよびＦＫ５０６）、抗体、または他の免疫消失薬（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ）、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用することができる。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または成長因子誘導シグナルの伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を阻害する。（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ６６：８０７－８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎ７３：３１６－３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ５：７６３－７７３，１９９３；Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（上記と同様））。実施形態では、本明細書に記載の細胞組成物は、骨髓移植、フルダラビンなどの化学治療薬を使用したＴ細胞焼灼療法、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３やＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。実施形態では、Ｂ細胞焼灼療法の後に、本明細書に記載の細胞組成物が投与される。例えば、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンを患者に投与し得る。実施形態では、被検体は、高用量化学療法による標準的な治療の後に、末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の実施形態では、移植の後に、被検体は、本開示の増幅された免疫細胞の注入を受ける。実施形態では、増幅された細胞は、手術の前または後に投与される。それを必要とする被検体に投与する上記治療薬の用量は、治療される病状の正確な性質や治療を受ける人によって異なる。ヒトへの投与量のスケーリングは、様々な要因に応じて、医師が当技術分野で周知される慣行に従って実行することができる。改変細胞を使用する癌治療の方法に関する追加の情報は、米国特許出願第ＵＳ８，９０６，６８２号に記載されており、その全体が参照により組み込まれている。

本明細書に記載される実施形態は、インビトロで改変細胞を調製するための方法に関する。この方法は、被検体から細胞サンプルを取得することを含み得る。例えば、サンプルは、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含み得る。方法は、少なくともＣＡＲをコードするＤＮＡで細胞のサンプルをトランスフェクトすることと、ＣＡＲを発現するＴ細胞の増殖を選択的に強化する培地で細胞のサンプルをエクスビボで培養することと、をさらに含み得る。細胞サンプルは、本明細書に記載される改変細胞混合集団であり得る。

実施形態では、サンプルは、凍結保存されたサンプルである。実施形態では、細胞サンプルは、臍帯血からのものであり、または被検体からの末梢血サンプルである。実施形態では、細胞サンプルは、アフェレシスまたは静脈穿刺によって得られる。実施形態では、細胞サンプルはＴ細胞亜集団である。

本開示の実施形態は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質を含むＤＮＡ結合ドメインと、開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメインを含むＤＮＡ開裂ドメインとを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に関する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、１、２、３、４、５、６またはそれ以上のジンクフィンガーを含んでもよく、各ジンクフィンガーは、いずれも標的遺伝子中の標的サブ部位に結合する認識スパイラルを有する。実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、３、４、５、６本のフィンガー（ここで、フィンガーはＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６と呼ばれ、Ｎ末端からＣ末端に向かってＦ１からＦ３、Ｆ４またはＦ５またはＦ６の順で並んでいる）を含み、かつフィンガーは表５に示す認識領域のアミノ酸配列を含む。開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメインの例としては、野生型または工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインが含まれる。実施形態では、ＤＮＡ開裂ドメインは、野生型開裂ドメインまたは開裂ハーフドメイン（例えば、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメイン）を含む。実施形態では、開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメインは、工学的に設計された（非天然に存在する）開裂ドメインまたは開裂ハーフドメイン、例えば、偏性ヘテロダイマーを形成する工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む。実施形態では、遺伝子はヒト遺伝子である。実施形態では、開裂ドメインは、野生型または工学的に設計されたＦｏｋＩ開裂ドメインを含む。実施形態は、本明細書に記載の単離ＺＦＮをコードするポリヌクレオチドに関する。実施形態は、ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。実施形態では、ベクターは、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクターである。実施形態は、本明細書に記載の単離ＺＦＮを含む単離細胞または細胞株に関する。実施形態では、単離細胞は、幹細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。実施形態では、細胞は、ヒトのドナーから単離された一次ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である。実施形態では、細胞は、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＦＯＸＰ３、ＳＩＶＡ１またはＬＧＡＬＳ９の内因性遺伝子の発現が低下している。実施形態では、様々な遺伝子編集技術または過剰発現技術（例えば、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮ）を使用して、１つ以上の遺伝子をノックアウト、ノックダウン、過剰発現、または挿入することにより、Ｔ／ＮＫ細胞の機能を調節することができる。例えば、改変細胞は、対応する野生型細胞と比較して、リスト１およびリスト２（第２６８段落を参照）のペプチドの生合成経路または輸送経路の１つ以上の遺伝子の発現が低下または増加する。実施形態では、標的遺伝子はＲｕｎｘ３である。例えば、改変Ｔ／ＮＫ細胞は、対応する野生型細胞と比較して、Ｒｕｎｘ３の発現が増加する。一例として、Ｒｕｎｘ３の発現が増加すると、Ｔ細胞の腫瘍細胞内での浸潤や長期滞在が促進されるため、Ｔ細胞の殺傷効果が高まる。実施形態では、改変細胞は、改変幹細胞、改変Ｔ細胞または改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。実施形態では、改変細胞は、ヒトのドナーから単離された一次ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である。実施形態では、細胞は、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＦＯＸＰ３、ＳＩＶＡ１和ＬＧＡＬＳ９の内因性遺伝子の発現が低下する。

ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞応答の主要な負の調節因子として作用する阻害性受容体である。Ｔリンパ球受容体であるＣＴＬＡ－４は、刺激性の共同受容体であるＣＤ２８よりも高い親和性で共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７－１）およびＣＤ８６（Ｂ７－２）に結合し、かつＴ細胞活性化に対して負の調節を行う。ＬＡＧ３は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞の表面に発現する。ＬＡＧ３は、Ｂ細胞、樹状細胞、ＴＩＬおよびＴｒｅｇの表面にも検出される。ＬＡＧ３を遮断すると、Ｔ細胞増殖および機能が有意に増加する。ＴＩＭ３は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）、ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性１細胞（Ｔｃ１）およびＴｈ１７細胞によって構成的に発現される免疫チェックポイント受容体である。ＴＩＭ３とそのリガンドであるガレクチン－９ＬＧＡＬＳ９との相互作用は、Ｔ細胞応答の阻害につながると考えられる。ＦＯＸＰ３は、転写調節因子であるフォークヘッド／ウイングドヘリックスファミリーのメンバーであり、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発生と阻害機能に重要な役割を果たしている。ＳＩＶＡ１は、ＣＤ２７媒介性アポトーシスを誘導し、ＢＣＬ２Ｌ１アイソフォームＢｃｌ－ｘ（Ｌ）の抗アポトーシス活性を阻害し、ＮＦ－κＢの活性化を阻害し、Ｔ細胞受容体媒介性アポトーシスを促進する。

実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含む改変細胞に関し、ここで、内因性遺伝子がＺＦＮを用いて不活性化される。

実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。

実施形態では、改変Ｔ細胞は、一次ヒトＴ細胞の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答と比較して、生体不適合ヒトレシピエントにおけるＧＶＨＤ応答が低下する。

実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ１７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する。

実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ７、ＢＣＭＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７１／Ｌ１－ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＣＳＰＧ４、Ｄｅｃｔｉｎ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ受容体、ＥｒｂＢＴ４、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、葉酸受容体１、ＦＩＴＣ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＡ－１Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２、ＨＥＲ２、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ１３受容体ａ２、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２（ゼタカイン）、Ｋａｐｐａ、ＬｅｗｉｓＹ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ－１、ＴＲＡＩＬ－受容体１またはＶＥＧＦＲ２のうちの少なくとも１つに結合する。

実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及それらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。

実施形態では、改変細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、またはＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含む。実施形態では、改変細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列およびＳＶ４０ＬＴをコードする核酸を含む。実施形態では、ｈＴＥＲＴの発現は、誘導性発現系によって調節される。実施形態では、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子の発現は、誘導性発現系によって調節される。実施形態では、誘導性発現系はｒＴＴＡ－ＴＲＥであり、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子またはｈＴＥＲＴ遺伝子、またはそれらの組み合わせの発現を増加または活性化する。実施形態では、改変細胞は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む。実施形態では、自殺遺伝子は、ＨＳＶ－ＴＫ自殺遺伝子系を含む。これらの例では、改変細胞のアポトーシスを誘導することができる。

本開示は、被検体における癌を治療する方法を記載しており、本方法は、本明細書に記載される改変細胞混合集団を被検体に投与することを含み、ここで、癌が、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、骨癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、卵巣癌、リンパ腫および脳癌からなる群から選択される。

本明細書に記載される方法は改変Ｔ細胞および／または改変ＮＫ細胞を含み、対応する野生型細胞と比較して、前記改変Ｔ細胞および／または改変ＮＫ細胞は量が減少した１つ以上のペプチドを含み、前記１つ以上のペプチドはＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、ＬＲＢＡ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＩＬＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、Ｆｏｘｐ３、ＣＣＲ４、ＰＶＲＩＧ、ＣＤ１６Ｂ、ＳＩＶＡ１、ＣＤ３３、ＬＡＧＬＳ９、ＣＤ１２２、ＩＤＯ１、ＣＤ４５、Ｃｖｐ１ｂ１、ＴＮＦＡＩＰ８Ｌ２、ＩＤ０２、ＴＤ０２、ＤＮＭＴ３Ａおよび／または癌胎児性抗原細胞接着分子－１（Ｃｅａｃａｍ－１）（リスト１）を含む。実施形態では、被検体における癌を治療する方法は、遺伝子改変Ｔ細胞の混合集団を被検体に投与して、これらのＴ細胞および／またはＮＫ細胞（減少した量の上記に記載した１つ以上のペプチドを有する）の改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞応答を増強することを含む。方法は改変Ｔ細胞および／または改変ＮＫ細胞を含み、対応する野生型細胞と比較して、前記改変Ｔ細胞および／または改変ＮＫ細胞は増加した量の１つ以上のペプチドを含み、前記１つ以上のペプチドはＲｕｎｘ３、ｌｅｘｍ、ＰＩＬＲＡ、Ｐｔｎｎｓ１Ｌ３、Ｆｃｇｒ３ａ、Ｎａｔ８、Ｃｃｌ９、Ｈｃｋ、Ｔｒｅｍ２、Ｃｃｌ６、Ｃｄ３６、Ｉｇｆ１、Ｃｔｓｓ、Ｇｚｍｃ、Ｂａｔｆ、Ｃｘｃｌ２、ＴＮＦＡＩＰ８Ｌ３、Ｉｌ１ｂ、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、Ｒｇｓ１、ＰＬＳＣＲ１、ＩＴＧＢ２、Ｃ３ＡＲ１、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＬ、ｂａｔｆ、ｂａｔｆ３、Ｃｘｃｌ２、ＣＡＲＤ１１および／またはＣＤ８３（リスト２）を含む。実施形態では、被検体における癌を治療する方法は、改変Ｔ細胞および／または改変ＮＫ細胞を被検体に投与して、これらのＴ細胞および／またはＮＫ細胞（増加した量の上記に記載した１つ以上のペプチドを有する）のＴ細胞および／またはＮＫ細胞応答を増強することを含む。実施形態では、リスト１または２に記載の１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の遺伝子をノックアウト／ノックダウン／過剰発現／挿入することにより、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の機能を調節することために、様々な遺伝子編集技術または過剰発現技術（例えば、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮ）を使用することができる。例えば、遺伝子改変Ｔ細胞は、対応する野生型細胞と比較して、リスト１およびリスト２（上記参照）に記載のペプチドの生合成経路または輸送経路の１つ以上の遺伝子の発現が低下または増加する。

実施形態では、標的遺伝子はＲｕｎｘ３である。例えば、改変Ｔ細胞は、対応する野生型細胞と比較して、Ｒｕｎｘ３の発現が増加する。これらの例では、Ｒｕｎｘ３発現の増加は、例えば、腫瘍細胞内での改変Ｔ細胞の浸潤または長期滞在に寄与することができ、よって、Ｔ細胞の殺傷効果が高められる。

例えば、被検体におけるＴ細胞応答とは、補助、殺傷、調節および他の種類のＴ細胞に関連する細胞媒介性免疫を指す。例えば、Ｔ細胞応答は、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助すること、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を同定して破壊することなどの活動を含み得る。被検体におけるＴ細胞応答は、Ｔ細胞が殺すウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞の数、ウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞との共培養においてＴ細胞が放出するサイトカインの量、被検体におけるＴ細胞の増殖レベル、Ｔ細胞の表現型の変化（例えば、記憶Ｔ細胞への変化）、被検体におけるＴ細胞の寿命または寿命のレベルなど、様々な指標を介して測定することができる。

Ｔ細胞応答はまた、サイトカイン放出を含む。サイトカインの放出は、通常、全身性炎症や疾患の合併症と関連しているが、サイトカインの放出は、ＣＡＲＴ細胞療法の治療効果にも関連しているように見える。サイトカインの放出は、ＣＡＲＴ細胞療法などで、養子移植された細胞の増幅および進行性免疫活性化と関連し得る。本開示では、ＩＦＮ－γなどのエフェクターサイトカイン、ＩＬ－６などの促炎性および抗炎性サイトカインの放出が記載されており、この放出は本明細書に記載される改変Ｔ細胞の混合集団に応答し、特に、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲの存在に応答し、前記第１のＣＡＲは細胞を増幅するための抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲまたはＴＣＲは標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを含む。実施形態では、本開示は、本明細書に記載される第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲまたはＴＣＲを導入した被検体におけるＩＬ－６およびＩＦＮ－γの放出を記載する。実施形態では、被検体は、癌治療を必要としており、癌治療は膵臓癌治療である。実施形態では、本開示は、サイトカイン放出のレベルを測定することによって、ＣＡＲＴ細胞療法の治療効果を決定するか、またはその治療効果をモニタリングすることを記載している。実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の混合集団を用いたＣＡＲＴ細胞療法に応答した被検体におけるサイトカイン（例えば、ＩＬ－６および／またはＩＦＮ－γ）の放出は、第１のＣＡＲを含まずに第２のＣＡＲを含むＴ細胞を用いた場合よりも多い。

実施形態では、本明細書に記載される改変細胞は、プログラム死１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アッテネーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３（ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）またはＣＤ１６０という受容体のドミナントネガティブ変異体をさらに含み得、これにより、改変細胞混合集団によって誘導されるＴ細胞応答を増強することができる。実施形態では、本明細書に記載される改変細胞は、改変細胞の運命が制御され得るように、自殺遺伝子をコードする核酸配列、および／またはＨＳＶ－ＴＫ自殺系を含む自殺遺伝子をさらに含み得る。例えば、治療が被検体にリスクを与える場合、および／または被検体が副作用に遭遇した場合、あるいは、治療が完了した場合、一定の必要条件が満たされた時、および／または所定の時間が経過した場合に、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することができる。

本開示は、本明細書に記載される改変細胞混合集団を含む組成物を記載する。実施形態では、第１の抗原に結合する第１のＣＡＲを含む第１の改変細胞集団と、第１の抗原と異なる第２の抗原に結合する第２のＣＡＲまたはＴＣＲを含む第２の改変細胞集団とが存在する。第１の抗原は、Ｂ細胞などのＷＢＣの抗原であってよく、第２の抗原は腫瘍抗原である。本開示は、腫瘍細胞を殺すための第２の改変細胞集団の増幅および維持を増強する方法を記載する。方法は、第２のＣＡＲが認識して結合する腫瘍抗原に関連する形態の癌形態を有する被検体に、改変細胞混合集団を含む組成物の有効量を投与することを含む。実施形態は、それを必要とする被検体におけるＴ細胞応答を増強する方法、または癌を有する被検体を治療する方法をさらに含む。方法は、第２のＣＡＲが認識して結合する腫瘍抗原に関連する形態の癌を有する被検体に、本明細書に記載される組成物の有効量を投与することを含む。別の実施形態は、被検体における改変細胞の増幅および／または維持を増強する方法を含み、この方法は、Ｔ細胞を、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターおよび第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターと接触させて、本明細書に記載される改変細胞混合集団の組成物を得ることと、第２のＣＡＲが認識して結合する腫瘍抗原に関連する形態の癌を有する被検体に、組成物の有効量を投与することと、を含む。別の実施形態は、それを必要とする被検体におけるＴ細胞応答を増強する方法、または癌を有する被検体を治療する方法を含み、この方法は、Ｔ細胞を、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターおよび第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターと接触させて、本明細書に記載される改変細胞混合集団の組成物を得ることと、第２のＣＡＲが認識して結合する腫瘍抗原に関連する形態の癌を有する被検体に、組成物の有効量を投与することと、を含む。実施形態は、被検体における改変細胞の増幅および維持を増強する方法を含み、この方法は、本明細書に記載される改変細胞混合集団の組成物の有効量を投与することを含む。

実施形態では、組成物は、少なくとも第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を含む。第１の改変細胞集団は、第１のＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２およびＢＣＭＡＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドと、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ１２およびＩＦＮγ）をコードするポリヌクレオチドとを含む。第２の改変細胞集団は、固形腫瘍抗原に結合する第２のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、組成物は、第１の改変細胞集団、第２の改変細胞集団、第３の改変細胞集団および第４の改変細胞集団を含む。第１の改変細胞集団は、ＷＢＣ抗原およびＩＬ－６に結合するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、図８７Ｂ）。第２の改変細胞集団は、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、図８７Ａ）。第３の改変細胞集団は、ＷＢＣ抗原およびＩＬ－１２に結合するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、図８７Ｂ）。第４の改変細胞集団は、ＷＢＣ抗原およびＩＦＮγに結合するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、図８７Ｂ）。これらのＷＢＣ抗原は、同じもの（例えば、ＣＤ１９）であっても、異なるもの（例えば、ＣＤ１９およびＢＣＭＡ）であってもよい。第１の所定比率に基づいて、第１の改変細胞集団、第３の改変細胞集団と第４の改変細胞集団を混合して、改変細胞群を得ることができ、次に、第２の所定比率に基づいて、前記改変細胞群と第２の改変細胞集団を混合して、改変細胞混合集団を含む組成物を得ることができる。所定比率は、被検体における１つ以上のサイトカインの発現量を制御するために使用され、被検体において制御可能で持続的かつ効率的なサイトカイン効果を達成すると同時に、細胞傷害性を低下させる。実施形態では、第１の改変細胞集団、第３の改変細胞集団および第４の改変細胞集団の第１の所定比率は、ＩＬ－１２またはＩＬ－６をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞よりもＩＦＮγをコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞の方が多くなるように設定されている。例えば、第１の所定比率は、１：１：１０である。実施形態では、第２の所定比率は、第１のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞（例えば、第１の改変細胞集団、第３の改変細胞集団および／または第４の改変細胞集団）よりも第２のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞（例えば、第２の改変細胞集団）の方が多くなるように決定されている。例えば、第１の改変細胞集団と第２の改変細胞集団の第２の所定比率は、１：１未満であるが、１：１０，０００を超える。実施形態では、第２の所定比率は、１：１、１：１０、１：１００、１：１０００および１：１０４、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１：１０、１：１００または１：１０００である。実施形態では、第２の所定比率は、１：１０～１：１０００である。実施形態では、第２の所定比率は、１：１０～１：１００である。実施形態では、第２の所定比率は、１：１～１：１００である。実施形態では、細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ミエロイド由来細胞など）は、被検体または健康なドナーから得られ、且つ少なくとも２群に分けられる。これらの細胞群は、それぞれ２つ以上のベクターで転移することができる。これらの細胞は、健康なドナーから得られた場合、さらに改変することができる。実施形態では、第２の改変細胞集団は、１つ以上のサイトカインを発現しない。

実施形態では、第１のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ構築物、ｍＲＮＡまたはウイルスベクターの形態で改変細胞に存在する。実施形態では、ポリヌクレオチドは改変細胞のゲノムに組み込まれていないｍＲＮＡであり、よって、改変細胞が有限期間において第１のＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ）を発現するようになる。

実施形態では、改変細胞混合集団は、第３のＣＡＲを発現する第３の改変細胞集団および／または第４のＣＡＲを発現する第４の改変細胞集団をさらに含み、これにより、異なる改変細胞集団によって引き起こされる免疫応答を結合してＣＡＲＴ治療を増強することができる。実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲまたはＣＡＲとＴＣＲの組み合わせで置き換えてもよい。

実施形態は、ＣＡＲＴ細胞の複数回の注入をタイムリーに実施することにより、ＣＡＲＴ療法を増強する方法に関する。方法は、被検体または健康なドナーからＰＢＭＣを得ることと、得られたＰＢＭＣを用いてＣＡＲＴ細胞を調製することと、ＣＡＲＴ細胞を、例えば所定の時間培養することと、培養したＣＡＲＴ細胞の一部を被検体に投与することと、被検体の血中のＣＡＲＴ細胞を観察および／または測定することと、血中のＣＡＲＴ細胞のレベルが所定値に達したとき、またはＣＡＲＴ細胞が臓器（例えば、リンパ節）に戻ったとき、第２の部分の培養ＣＡＲＴ細胞を投与することと、を含む。例えば、最初に注入されたＣＡＲＴ細胞は、臓器内で選択的に活性化および増幅され、被検体の免疫応答を引き起こすことができる。したがって、ＣＡＲＴ細胞の第２の部分の注入は、前記免疫応答と結合して第２のＣＡＲＴ細胞集団の活性化および／または増幅を増強し、ＣＡＲＴ療法を増強することができる。

本開示は改変細胞集団を含む組成物を記載しており、前記改変細胞集団は、第２のＣＡＲを含まずに第１のＣＡＲを含む第１の改変細胞集団、およびまたは第１のＣＡＲを含まずに第２のＣＡＲを含む第２の改変細胞集団を含む。本開示はさらに、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲ（単一の改変細胞内にある）を含む改変細胞集団を含む組成物を記載する。実施形態では、組成物は第１の改変細胞集団と、第２の改変細胞集団と、第３の改変細胞集団とを含み、これらの改変細胞集団は、同じ改変細胞における第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つ以上の核酸配列を含む。実施形態では、組成物は、第２の改変細胞集団と、同じ改変細胞における第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つ以上の核酸配列を含む第３の改変細胞集団とを含むが、第１の遺伝子改変細胞集団を含まない。

実施形態は、抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドおよび／または治療薬を用いて改変細胞の増幅を増強し、または被検体におけるＴ細胞応答を増強する方法に関し、または改変細胞の増幅の増強または被検体におけるＴ細胞応答の増強での抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドおよび／または治療薬の用途に関する。本方法または用途は、ポリヌクレオチドの転写を付与する発現制御要素に動作可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターゲノムを含むウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはそれらの変異体）を提供することと、ポリヌクレオチドを被検体で発現するように、一定量のウイルス粒子を被検体に投与することと、を含む。実施形態では、ＡＡＶ製剤は、ＡＡＶベクター粒子、空のキャプシドおよび宿主細胞の不純物を含んでもよく、それによって、ＡＡＶ空のキャプシドを実質的に含まないＡＡＶ製品が提供される。ウイルス粒子の投与および調製のより詳細な情報は、米国特許出願第９８４０７１９号およびＭｉｌａｎｉら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１，ｅａａｖ７３２５（２０１９）、２０１９年５月２２日、に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

実施形態では、ポリヌクレオチドは改変細胞のゲノムに組み込まれ、かつ改変細胞の子孫もポリヌクレオチドを発現し、その結果、安定的にトランスフェクトされた改変細胞が得られる。実施形態では、改変細胞はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを発現するが、ポリヌクレオチドは改変細胞のゲノムに組み込まれず、よって、改変細胞は限られた時間帯（例えば、数日間）に、一過性にトランスフェクトされたポリヌクレオチドを発現すると、ポリヌクレオチドが細胞分裂または他の要因によって失われる。例えば、ポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ構築物、ｍＲＮＡまたはウイルスベクターの形態で改変細胞に存在し、および／またはポリヌクレオチドは改変細胞のゲノムに組み込まれていないｍＲＮＡである。

実施形態では、第１の細胞集団は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み、第２の細胞集団は、第１のＣＡＲを含むが、第２のＣＡＲを含まない。実施形態では、第１の細胞集団は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み、第２の細胞集団は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む。実施形態では、第１の細胞集団は、第１のＣＡＲを含むが第２のＣＡＲを含まず、第２の細胞集団は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む。実施形態では、第１の細胞集団は、第１のＣＡＲを含むが第２のＣＡＲを含まず、第２の細胞集団は、第２のＣＡＲを含むが第１のＣＡＲを含まない。実施形態では、第１の細胞集団は、第２のＣＡＲを含むが第１のＣＡＲを含まず、第２の細胞集団は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む。実施形態では、第１の細胞集団は、第１のＣＡＲを含むが第２のＣＡＲを含まず、第２の細胞集団は、第２のＣＡＲを含むが第１のＣＡＲを含まず、第３の細胞集団は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む。ここに記載されるように、第１のＣＡＲは、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを含み、第２のＣＡＲは、腫瘍などの標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを含む。

実施形態では、抗原結合ドメインは一つの抗原に結合し、前記抗原は白血球（ＷＢＣ）の細胞表面分子、腫瘍抗原または固形腫瘍抗原であるか、またはそれらを含む。実施形態では、ＷＢＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である。

実施形態では、ＷＢＣは、顆粒球、単球またはリンパ球である。実施形態では、ＷＢＣはＢ細胞である。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子または抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子または抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである。実施形態では、Ｂ細胞の細胞表面分子または抗原は、ＣＤ１９である。

実施形態では、腫瘍抗原は、固形腫瘍抗原である。実施形態では、固形腫瘍抗原は、ｔＭＵＣ１、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３－Ｒα２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ－α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７－Ｈ３またはＥＧＦＲである。実施形態では、固形腫瘍抗原は、腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＡＣＰＰ、ＣＬＤＮ１８．２（１８．２）、ＰＳＭＡまたはＵＰＫ２であるか、またはそれらを含む。

実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む。実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドの細胞内ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む。実施形態では、第２のＣＡＲは、ｔＭＵＣ１に結合する結合ドメインと、ＣＤ２８の細胞内ドメインを含む共刺激ドメインとを含み、および／または、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する結合ドメインと、４－１ＢＢの細胞内ドメインを含む共刺激ドメインとを含む。

実施形態では、第１の細胞集団および／または第２の細胞集団は、Ｔ細胞上に存在するドミナントネガティブ形態のチェックポイントタンパク質またはチェックポイントタンパク質受容体（例えば、ＰＤ－１）をさらに含む。実施形態では、第１の細胞集団は、第１のＣＡＲおよびドミナントネガティブ形態のＰＤ－１をコードする核酸を含むベクターを含む。

実施形態では、第２のＣＡＲは、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、ＣＤ３ζドメインを含み、第２のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、ＣＤ３ζドメインを含む。実施形態では、第１のＣＡＲは、配列番号５のｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは、配列番号７０のｓｃＦｖを含む。対応する配列を表５に示す。

実施形態は、癌を有する患者に、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖを含む第２のＣＡＲを含む第２のＴ細胞集団の有効量を投与することを含む方法に関する。第２のＣＡＲはさらに、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、ＣＤ３ζドメインを含み得る。実施形態では、方法は、患者に、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを含む第１のＣＡＲを含む第１のＴ細胞集団の有効量を投与することをさらに含み、それによって、患者における第２のＴ細胞集団の増幅を増強する。前記ＣＡＲはさらに、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含み得る。

実施形態では、第２のＣＡＲは、ＣＤ２８の細胞内ドメインを含み、第１のＣＡＲは、４－１ＢＢの細胞内ドメインを含む。この場合、ＣＤ１９を含む第１のＴ細胞集団は、４－１ＢＢの細胞内ドメインを含む第２のＣＡＲおよび／またはＣＤ２８の細胞内ドメインを含む第１のＣＡＲと比較して、患者に対する悪影響（例えば、ＣＲＳ）が少なくなる可能性があり、および／またはｔＭＵＣ１を含む第２のＴ細胞集団は、増強したＴ細胞応答（例えば、殺傷効果）を引き起こす可能性がある。実施形態では、第２のＣＡＲは、ＣＤ２８の細胞内ドメインを含み、これにより、第２のＴ細胞集団が、４－１ＢＢの細胞内ドメインを含む第２のＣＡＲと比較して、増強したＴ細胞応答（例えば、殺傷効果）を引き起こすことができる。実施形態では、第１のＣＡＲは、４－１ＢＢの細胞内ドメインを含み、これにより、第１のＴ細胞集団が、ＣＤ２８の細胞内ドメインを含む第１のＣＡＲと比較して、患者に対する悪影響（例えば、ＣＲＳ）が少なくなる可能性がある。

実施形態では、第２の細胞集団は、固形腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖを含むが、Ｂ細胞抗原に結合するｓｃＦｖを含まず、第１の細胞集団は、固形腫瘍抗原と異なる抗原（例えば、ＷＢＣ抗原またはＢ細胞抗原）に結合するｓｃＦｖを含むが、腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖを含まない。これらの例では、第１のＴ細胞集団と抗原（例えば、ＣＤ１９）との間の結合によって誘導される患者Ｔ細胞応答は、第１のＴ細胞集団および第２のＴ細胞集団の両方を増幅させる可能性がある。したがって、患者に、本質的に第１の細胞集団と第２の細胞集団で構成される遺伝的に操作されたＴ細胞の混合集団を投与してもよい。実施形態では、遺伝的に操作されたＴ細胞の第２の集団および１つ以上の組換えタンパク質（例えば、サイトカインＩＬ６および／またはＩＮＦγ）または１つ以上の組換えタンパク質を発現および分泌する細胞を患者に投与することで、第１のＴ細胞集団によって引き起こされるＴ細胞応答と同様のまたは増強されたＴ細胞応答を誘導することができる。実施形態では、患者に第２のＴ細胞集団およびホルモン剤（例えば、フルベストラント）を投与して、第１のＴ細胞集団によって引き起こされるＴ細胞応答と同様の、または増強されたＴ細胞応答を誘導することができる。

実施形態では、第１の改変細胞集団はさらに、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含む第３のＣＡＲを含むことができる。実施形態では、第２の細胞集団は、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを含まない。実施形態では、第１の細胞集団は、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖを含まない。

実施形態では、被検体における細胞増幅および／または細胞応答を増強する本明細書に記載される方法は、被検体が１つのＣＡＲのみ（例えば、第１のＣＡＲのみまたは第２のＣＡＲのみ）で投与される方法、および／または被検体が本明細書に記載される細胞混合集団が投与されない方法と比較される。実施形態では、本明細書に記載される細胞混合集団は、細胞の増幅および／または細胞応答を増強することができる。

実施形態は、癌を有する患者を治療する、または被検体におけるＴ細胞応答を増強するための組成物および方法に関する。方法は、第１のＣＡＲを含む改変細胞集団の有効量を被検体に投与することを含む。第１のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激ドメイン、および／またはＣＤ３ζドメインを含む。方法は、改変細胞によって誘導されるＴ細胞応答の１つ以上のパラメータをモニタリングおよび／または測定することをさらに含むことができる。例えば、１つ以上のパラメータは、サイトカイン放出、リンパ球数、およびＣＡＲＴ細胞の増幅と枯渇レベルを含む。方法は、所定の時間（例えば、注入後１週間または２週間）および／または、測定されたパラメータ（例えば、ＣＡＲのコピー数およびＣＡＲＴ細胞数）に関連する状况に応じて、第２のＣＡＲを含む改変細胞集団の有効量を被検体に投与することを含むことができる。第２のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢの共刺激ドメイン、および／またはＣＤ３ζドメインを含む。ＣＤ２８ＣＡＲＴ細胞および４－１ＢＢＣＡＲＴ細胞は、実験室と臨床で異なる挙動を示すことが報告されている。したがって、前記方法は、強力な初期免疫応答と長く持続する免疫応答を結合することで、２つの共刺激ドメインの利点を組み合わせる。例えば、ＣＤ２８を含む第１のＣＡＲは、強力なＴ細胞の活性化を誘発し、エフェクター様分化と関連している。第１のＣＡＲはＴ細胞の枯渇を引き起こすことができるが、被検体の免疫系の強力な初始応答を誘導するように設計されている。４－１ＢＢを含む第２のＣＡＲは、Ｔ細胞の枯渇を抑え、持続性を増強し、かつ中央記憶の分化やミトコンドリアの生合成を増加させることは、持続的なＣＡＲＴ療法のために設計されている。実施形態では、第１のＣＡＲによって誘導される初始応答は、持続的なＣＡＲＴ療法を増強することができる。実施形態では、第１のＣＡＲを含む改変細胞集団と、第２のＣＡＲを含む改変細胞集団とを、同時に被検体に投与してもよい。例えば、組成物は、第１のＣＡＲを含む改変細胞集団と、第２のＣＡＲを含む改変細胞集団とを含み得る。実施形態では、第１のＣＡＲはＷＢＣの抗原に結合し、第２のＣＡＲは固形腫瘍抗原に結合する。実施形態では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、同じまたは異なる固形腫瘍抗原に結合する。例えば、固形腫瘍抗原（例えば、ＴＳＨＲ）に結合し、かつ４－１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＡＲ改変細胞集団と、固形腫瘍抗原（例えば、ＴＳＨＲ）または別の固形腫瘍抗原（例えば、ｔＭｕｃ１）に結合し、かつＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＡＲを含む別の改変細胞集団と混合して、混合改変細胞を得る。実施形態では、改変細胞は、さらに被検体に投与されてもよい。実施形態では、改変細胞は、ＷＢＣ抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合するＣＡＲを含む改変細胞集団とともに、被検体に投与されてもよい。

実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ分子は、目的の抗原に結合するための１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、特異的抗原に結合するための免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体の可変ドメインの一部である。各可変ドメインには、３つのＣＤＲがある。可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインがあるので、抗原に結合するためのＣＤＲは６個ある。さらに、抗体には２本の重鎖および２本の軽鎖があるので、抗原に結合するためのＣＤＲは全部で１２個ある。実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ分子は、抗原に結合するための１つ以上のＣＤＲを含む。実施形態では、１つ以上のＣＤＲは、Ｂ細胞などのＷＢＣの抗原に結合する。一例として、１つ以上のＣＤＲは、Ｂ細胞の細胞表面抗原であるＣＤ１９に結合する。実施形態では、１つ以上のＣＤＲは、腫瘍抗原、例えば、ｔＭＵＣ１、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＡＣＰＰ、ＣＬＤＮ１８．２（１８．２）、ＰＳＭＡまたはＵＰＫ２に結合する。

実施形態は、免疫療法システム、および被検体の癌の治療におけるその用途に関する。図６１に示すように、免疫療法システム１０２は、腫瘍細胞の成長を阻害するように構成された機能性成分１０４と、被検体の免疫応答と腫瘍細胞の成長阻害を結合するように構成された結合成分１０６と、阻害および／または結合を制御するように構成された制御成分１０８とを含む。実施形態では、免疫療法システム１０２は、癌の治療に適した１つ以上の医薬組成物（例えば、抗体および細胞）を含む組成物である。

機能性成分１０４の例には、ＣＡＲＴ、ＴＩＬ、ＴＣＲなどの細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、化学療法、腫瘍ワクチン療法、代謝標的療法および標的療法が含まれる。実施形態では、機能性成分１０４は、免疫代謝を調節する阻害剤（例えば、ＩＤＯ阻害剤およびアデノシン阻害剤）、免疫調節剤（例えば、ＩＭｉＤ）、単球または樹状細胞に対するアゴニスト（例えば、ＴＬＲ／ＳＴＩＮＧ）、腫瘍溶解性ウイルス療法、腫瘍ワクチン（例えば、ＤＣワクチン）、腫瘍浸潤Ｔ細胞（例えば、Ｔｉｌ）、マクロファージ再プログラミング剤（例えば、ＣＣＲ２－ＣＣＬ２阻害剤、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＰＰＡＲ－γアゴニスト／阻害剤およびＣＤ－４０アゴニスト）、化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、フルダラビンおよびイブルチニブ）、モノクローナル抗体の標的薬（例えば、抗ｈｅｒ２）、または非モノクローナル抗体の標的薬（例えば、ＡＬＫ阻害剤、ＥＧＦ／ＶＥＧＦ阻害剤）のうちの少なくとも１つを含む。ＴＣＲ療法の標的例を表６に示す。実施形態では、機能性成分１０４は、Ｂｉｔｅ分子（例えば、ＴＳＨＲ－ＣＤ３）によって実施され得る。実施形態では、図７７Ａに示すように、Ｂｉｔｅ分子は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインは、固形腫瘍抗原に結合し、第２の結合ドメインは、Ｔ細胞ＣＤ３受容体複合体またはＣＤ２８に結合する。第２の結合ドメインはさらに、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＴＴＲ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２０などの他のＴ細胞分子に結合することができる。

結合成分１０６の例には、ＣＡＲＴ／ＮＫ細胞によって引き起こされる免疫応答、ＤＣ刺激、Ｔ細胞刺激、および抗原／ワクチン刺激が含まれる。ＣＡＲＴ／ＮＫ細胞は、本開示に記載の改変細胞を含む。例えば、改変細胞は、ＷＢＣ抗原（例えば、ＣＤ１９）、ＥＢＶ抗原および／またはアルブミンに結合するＣＡＲを含む。Ｔ細胞刺激は、Ｂｉｔｅ分子（例えば、ＣＤ１９－ＣＤ３）によって実施され得る。ＤＣ細胞刺激は、ＣＡＲＴ／ＮＫ細胞を被検体に投与するか、低分子、小ペプチド、ワクチンまたは抗原を被検体のリンパ系臓器（例えばリンパ節）に投与することによって実施することができる。実施形態では、図７７Ａに示すように、Ｂｉｔｅ分子は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み得、ここで、第１の結合ドメインは抗原に結合し、第２の結合ドメインは、例えば、Ｔ細胞ＣＤ３受容体複合体またはＣＤ２８に結合する。第２の結合ドメインは、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２０などの他のＴ細胞分子に結合し得る。第１の結合ドメインは、ＷＢＣ抗原（例えば、ＣＤ１９およびＢＣＭＡ）に結合し得る。実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、Ｂｉｔｅ分子を発現し得る。実施形態では、ＣＡＲＴ細胞およびＢｉｔｅ分子は、同時にまたは別々に被検体に投与され得る。

実施形態では、免疫療法システム１０２は、癌を治療する様々なＢｉｔｅ抗体を含み得る。実施形態では、免疫療法システム１０２は、第１のＢｉｔｅ分子および第２のＢｉｔｅ分子を含む。第１のＢｉｔｅ分子は、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み得、ここで、第１の結合ドメインは、固形腫瘍抗原に結合し、第２の結合ドメインは、例えば、Ｔ細胞ＣＤ３受容体複合体またはＣＤ２８に結合する。第２のＢｉｔｅ分子は、第３の結合ドメインおよび第４の結合ドメインを含み得、ここで、第３の結合ドメインは、抗原に結合し、第４の結合ドメインは、例えば、Ｔ細胞ＣＤ３受容体複合体またはＣＤ２８に結合する。実施形態では、免疫療法システム１０２は、改変された二重特異性抗体または三重特異性抗体（例えば、図８７Ｃおよび８７Ｄ）、ならびに第１のＢｉｔｅ抗体および／または第２のＢｉｔｅ抗体を含む。これらの例では、腫瘍微小環境内またはその近くで、抗体技術を用いて、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７およびＩＦＮγ）を分泌するように細胞を刺激することができる。成分８７０２は、様々な細胞を刺激してサイトカインの放出を促進する刺激物として機能するように実装することができる。例えば、刺激装置は、被検体に１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＦＮγ）を直接または間接的に分泌させるアゴニストまたはリガンドを含み得る。実施形態では、第１のＢｉｔｅ分子および／または第２のＢｉｔｅ分子の使用は、１つ以上のヒト組換え形態のサイトカインの投与と組み合わせることができる。実施形態では、治療薬は単離されたヒトサイトカイン、合成されたヒトサイトカイン、天然のヒトサイトカイン、または組み換えられたヒトサイトカインであり得る。実施形態では、有効量のヒト組換えサイトカインを投与することは、体重１キログラム当たり約０．５－５０ｕｇ範囲の量のＩＬ－６を静脈内送達することを含む。実施形態では、ヒト組換えサイトカインは、ＩＬ－６またはＩＬ－７を含む。組換えＩＬ－１５は、所定の期間または日数をかけて、３ｍｃｇ／ｋｇ／日および１ｍｃｇ／ｋｇ／日で、毎日のボーラス注入として投与することができる。組換えＩＦＮγは、所定の期間にわたって、週に５日間、毎日２００万単位の用量で投与することができる。実施形態では、ヒト組換えサイトカインの有効量を投与することは、被検体の血液中のＩＬ－６および／またはＩＦＮ－γなどのサイトカインの濃度が５－１０００倍（例えば、５０倍）増加するように、ヒト組換えサイトカインの有効量を投与することを含む。ＩＬ－６、ＩＬ－１５および／またはＩＦＮγの投与方法は、米国特許出願第ＵＳ５１７８８５６Ａ号および癌治療におけるサイトカイン、第００巻、第００号、２０１８に記載されており、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、組換えＩＬ－１２は、開始用量として３０ｎｇ／ｋｇが投与され、そしてＣＡＲＴ細胞の注入後に週に２回、５００ｎｇ／ｋｇまで増加させることができる。ＩＬ－１２の投与方法は、ＬｅｕｋＲｅｓ．２００９Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；３３（１１）：１４８５-１４８９に記載されており、前記参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、ヒト組換えサイトカインは、細胞の投与後、０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、または３０日目から被検体に投与することができる。

実施形態では、結合成分１０６と機能性成分１０４は、被検体の免疫系の過剰な活性化をもたらす固形腫瘍抗原および超抗原に結合するＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて結合され、実施されてもよい。例えば、改変細胞集団は、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターと超抗原を含み、超抗原は、アラバンウイルス核タンパク質、オーストラリアコウモリリサウイルス核タンパク質、ドゥベンヘイジウイルス核タンパク質、ヨーロッパコウモリリサウイルス１核タンパク質、イルクットウイルス核タンパク質、クジャンドウイルス核タンパク質、トウモロコシモザイクウイルス核タンパク質、モコラウイルス核タンパク質、マウス乳腺腫瘍ウイルスタンパク質ＰＲ７３、狂犬病ウイルス核タンパク質、イネ黄化葉巻ウイルス核タンパク質、スタフィロコッカス・アウレウス・エンテロトキシン、タロイモ葉緑病ウイルス核タンパク質または西コーカサスコウモリウイルス核タンパク質である。細胞外シグナルペプチドを加えて、これらの核タンパク質を改変してもよい。実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、二重特異性または三重特異性抗体に結合して腫瘍を治療してもよい。ＣＡＲＴ細胞は、固形腫瘍抗原に結合し得る。実施形態では、ＣＡＲＴ細胞と抗体は、同時にまたは別々に被検体に投与してもよい。実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、抗体を発現し得る。二重特異性抗体は、包ＣＤ３、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０などを標的とする第１の抗体フラグメント、および固形腫瘍抗原またはＷＢＣ抗原を標的とする第２の抗体フラグメントを含む。図７７Ｂに示すように、三重特異性抗体は、例えばＣＤ３、ＴＬＲ、ＦｃＲまたはＮＫＧ２Ｄを標的とする第１の抗体フラグメント、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０を標的とする第２の抗体フラグメント、および例えばＷＢＣ抗原または固形腫瘍抗原を標的とする第３の抗体フラグメントを含み得る。

本開示はさらに、ＣＡＲ、上記二重特異性抗体または三重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む改変細胞集団を記載する。本開示はさらに、ＣＡＲおよび上記二重特異性抗体または三重特異性抗体を発現する改変細胞集団を記載する。

図６５に示すように、樹状細胞（ＤＣ）を活性化するには３つの方法がある。１つ目の方法は、抗原（例えば、ＣＥＡ、ＰＳＡまたはＴＥＲＴ）をＤＣに送達することである。例えば、抗原を含む癌ワクチンまたはナノ粒子は、ＤＣを活性化することができ、それによって免疫系を活性化することができる。２つ目の方法は、アゴニスト（例えば、サイトカイン）を送達してＤＣの成熟を促進し、関連するサイトカインを直接または間接的に放出することである。３つ目の方法は、ＤＣ活性化に寄与するサイトカインまたはタンパク質を送達することである。ＤＣを活性化するために、他の方法を実施することもできる。例えば、ＬＰＳ、各種ウイルス、マラリア原虫抗原、サイトカイン、ワクチンなどの方法でＤＣを刺激することができる。実施形態では、小分子（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモド、原型薬）はアルブミンと結合してリンパ節に送達されて、ＤＣを刺激することができ、これによって、その後、リンパ節にホーミングしたＣＡＲＴ細胞の増幅を選択的に引き起こすことができる。本開示の実施例では、Ｔ細胞上のＣＣＲ７やＣＤ６２Ｌなどの分子により、一部のＴ細胞（例えば、中央記憶Ｔ細胞）は、注入後に血液中に安定的に留まらず、リンパ節などのリンパ系臓器に入ることが示されている。したがって、ＤＣを直接および／または間接的に刺激することは、より多くの記憶様の表現型を示すＣＡＲＴ細胞を選択的に増幅および／または活性化することができ、その結果、Ｔ細胞療法の有効性を増強することができる。実施形態のより詳細な情報は、Ｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３６５，１６２－１６８（２０１９）に記載されており、前記参考文献は以参照により組み込まれる。

抗原／ワクチン刺激は、以下の実施形態によって実施することができる。一例として、方法は、腫瘍（例えば、固形腫瘍）を治療するために、Ｔ細胞（例えば、ＴＩＬ、ＣＡＲＴ、ＴＣＲ細胞）の有効量を、それを必要とする被検体に投与することと、Ｔ細胞を直接または間接的に活性化する薬剤の有効量を投与することと、を含む。実施形態では、薬剤は、Ｔ細胞が認識する抗原を含む。実施形態では、薬剤は、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する可溶性薬剤を発現する提示細胞を含む。実施形態では、薬剤は、抗原に由来するワクチンを含む。例えば、薬剤はアルブミンに結合する抗原を含み、これにより、前記薬剤は例えばリンパ節中のＴ細胞を活性化してから、ＤＣを活性化してＴ細胞の増幅を誘発することができる。

制御成分１０８の例には、自殺系（例えば、自殺遺伝子）、条件付き遺伝子発現系（例えば、ｌａｃ、テトラサイクリンまたはガラクトース系）、および遺伝子調節系（例えば、Ｈｉｆ１ａ、ＮＦＡＴ、ＦＯＸＰ３および／またはＮＦｋＢ）が含まれる。

図６２は、免疫療法システム、例えば免疫療法システム１０２を示す。実施形態では、改変細胞集団は、機能性成分細胞および結合成分細胞の２種類を含む。機能性成分細胞は、腫瘍細胞を阻害することができる。実施形態では、機能性成分細胞は、腫瘍抗原（例えば、固形腫瘍抗原）に結合する結合分子を含む。例えば、結合分子は、固形腫瘍に結合するＣＡＲまたはＴＣＲであるか、またはそれらを含む。実施形態では、結合成分細胞は、白血球抗原を標的とするＣＡＲを含む。実施形態では、結合成分細胞は、ＨＩＦＶＨＬ結合ドメインに連結されたＩＬ１２をコードする核酸配列を含む改変細胞、および／または２Ａペプチドで連結されたＩＬ６およびＩＦＮγをコードする核酸配列を含む別の改変細胞を含む。

図６２は、ＣＡＲＴ細胞と腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の組み合わせのための例示的なプロセスを示す概略図である。本開示に記載の様々な方法を用いて、被検体のＰＢＭＣを入手し、ＷＢＣの抗原（例えば、ＣＤ１９）を標的とするＣＡＲＴを調製することができる。実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、図６１に記載の結合成分細胞であってもよい。その後、被検体はリンパ球枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｅ）を実施する可能性がある。様々な方法を用いてＴＩＬを調製することができる。方法の一例として、ＴＩＬ１０２を調製する。例えば、切除後、腫瘍転移部を２４ウェルプレートで単細胞懸濁液に消化する。その後、これらの懸濁液／フラグメントをＩＬ－２の存在下で培養する。実施形態では、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡを用いて培地中に分泌されるＩＦＮγを測定することにより、自家メラノーマ細胞（例えば、メラノーマ細胞株または新鮮に凍結された腫瘍消化液、利用できない場合はＨＬＡにマッチした同種異系腫瘍細胞株のパネル）の認識について試験される。実施形態では、腫瘍反応性の選択ステップを省略することができる。その後、可溶性抗ＣＤ３モノクローナル抗体と高濃度のＩＬ－２、照射した同種異系フィーダー細胞で刺激し、ＴＩＬ培養物を治療レベルまで増幅する。ＴＩＬ培養物を精製して生成物細胞を得た後、被検体におけるＴＩＬの増幅を増強し得るＣＡＲＴ細胞を生成物細胞に注入する準備が整っている。ＴＩＬ調製に関する情報は、国際出願第ＷＯ２０１８／０８１４７３およびＷＯ２０１８／０９４１６７号、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｎｃｏｌｏｇｙ、第９巻、第１０期、２０１５年１２月、第１９１８－１９３５ページに記載されており、前記参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。

Ｔ細胞が固形腫瘍を克服するためには、３つの理論的課題を解決する必要がある。１つ目の課題は、腫瘍を認識するＴ細胞を決定することである。１つの標的を特定することの代わりに、できるだけ多くの異種癌細胞を特定する必要がある。この点では、ＴＩＬ（腫瘍浸潤性Ｔリンパ球）療法が有望であるように思われる。２つ目の課題は、腫瘍を認識するこれらの選別されたＴ細胞が、腫瘍微小環境への阻害を克服できるようにすることである。３つ目の課題は、腫瘍を認識し、微小環境への阻害を克服して十分に増幅した選別されたＴ細胞集団を進行した腫瘍と戦い、疾患の経過を逆転させることである。通常のＴＩＬ技術は、インビトロで大量に増幅されるが、コストが高く、サイクルが長い。コストが高すぎると、将来の薬価が高くなる可能性があり、サイクルが長すぎると、進行した癌患者が買えなくなる可能性があり、今後の治療への応用が課題となる。そこで、免疫療法システム１０２は、後者の２つの課題の解決に役立つ可能性がある。結合成分１０６は、被検体の免疫応答とＴＩＬ療法を結合でき、それにより、例えば、被検体のＴＩＬを増幅し、被検体中のＴＩＬ群を維持することでコストを削減し、ＴＩＬ療法に関連するサイクルを短縮し、および／または腫瘍微小環境への阻害を克服することができる。

本開示は、血液癌（例えば、白血病、黒色腫およびリンパ腫）を治療するための組成物を記載する。血液癌の例には、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）が含まれる。組成物は、血液癌抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＢＣＭＡ）に結合するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをそれぞれ有する、少なくとも２群の改変細胞からなる改変細胞混合集団を含む。改変細胞混合集団における１群の改変細胞は、１つ以上の組換えタンパク質（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＦＮγ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、改変細胞混合集団は、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド（例えば、図８７Ａ）を含む第１群の改変細胞、ＣＤ１９ＣＡＲおよびＩＬ－６をコードするポリヌクレオチドを含む第２群の改変細胞、ＣＤ１９ＣＡＲおよびＩＬ－１２をコードするポリヌクレオチドを含む第３群の改変細胞、およびＣＤ１９ＣＡＲおよびＩＦＮγをコードするポリヌクレオチド（例えば、図８７Ｂ）を含む第４群の改変細胞のうちの少なくとも１つを含む。これらの改変細胞群を混合して、改変細胞混合集団を得て、それを、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫を有する被検体に投与することができる。実施形態では、改変細胞混合集団は、改変細胞混合集団を得るために、所定比率に基づいて混合することができる。所定比率は、被検体における１つ以上のサイトカインの発現量を制御するために使用され、それにより、被検体において制御可能で持続的かつ効率的なサイトカインの効果を達成すると同時に、細胞傷害性の効果が少なくなる。実施形態では、第１群、第２群、第３群および第４群の改変細胞の所定比率は、改変細胞混合集団において、第１群の改変細胞が第２群、第３群または第４群の改変細胞よりも多くなるように設定される。例えば、第１群の改変細胞と第２群、第３群または第４群の改変細胞の所定比率は、１０：１である。実施形態では、所定比率は、１：１、１０：１、１００：１、１０００：１、および１０４：１、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１０：１、１００：１または１０００：１である。実施形態では、第２の所定比率は、１０：１～１０００：１である。実施形態では、第２の所定比率は、１０：１～１：１００である。実施形態では、第２の所定比率は、１：１～１００：１である。

本開示は、固形腫瘍を治療するための組成物を記載する。組成物は、２つの改変細胞集団を含む。第１の改変細胞集団は、２つ以上の群の改変細胞を含む。改変細胞の１群は、第１のＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＢＣＭＡＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含み、改変細胞の少なくとも１つの他の群は、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ１２およびＩＦＮ）をコードするポリヌクレオチドか、または１つ以上のサイトカインおよび第１のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。実施形態では、第１のＣＡＲは、ＷＢＣ抗原に結合する。例えば、第１の改変細胞集団は、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド（例えば、図８７Ａ）を含む第１群の改変細胞と、ＣＤ１９ＣＡＲおよびサイトカインをコードするポリヌクレオチド（例えば、図８７の実施例２）を含む第２群の改変細胞とを含む。第１群の改変細胞および第２群の改変細胞を混合して、第１の改変細胞集団を得る。実施形態では、第１群の改変細胞および第２群の改変細胞は、第１の改変細胞集団において、第１群の改変細胞が第２群の改変細胞よりも多くなるように、第３の所定比率に基づいて混合される。例えば、第１群の改変細胞と第２群の改変細胞の第３の所定比率は、１０：１である。実施形態では、第２の改変細胞集団は、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲを含む。実施形態では、第２の改変細胞集団は、１つ以上のサイトカインを発現しない。第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を混合して、改変細胞混合集団を得て、被検体に前記改変細胞混合集団を注入することができる。実施形態では、第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団は、第２の改変細胞集団が第１の改変細胞集団よりも多くなるように、第４の所定比率に基づいて混合され得る。例えば、第１の改変細胞集団と第２の改変細胞集団の第２の所定比率は、１：１未満であるが、１：１０，０００を超える。実施形態では、第４の所定比率は、１：１、１：１、１：１０、１：１００、１：１０００および１：１０４、並びにその範囲内の個々の数値であり、１：１０、１：１００または１：１０００が好ましい。実施形態では、第４の所定比率は、１：１０～１：１０００である。実施形態では、第２の所定比率は、１：１０～１：１００である。実施形態では、第２の所定比率は、１：１～１：１００である。所定比率は、被検体における１つ以上のサイトカインの発現量を制御するために使用され、被検体において制御可能で持続的かつ効率的なサイトカイン効果を達成すると同時に、細胞傷害性を低下させる。

以下の例示的な実施形態および実施例を参照して、本開示をさらに説明する。これらの例示的な実施形態および実施例は、例示のみを目的として提供され、特に指定されていない限り、本発明を限定することを意図しない。したがって、本開示は、以下の例示的な実施形態および実施例に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書に記載される示唆の結果として明らかになる一切の変形形態を包含するように解釈されるべきである。

例示的な実施形態
例示的な実施形態は以下のとおりである。

１、患者において改変細胞の増幅および／または維持に有効な改変細胞集団であって、少なくとも２つの異なる改変細胞、すなわち、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを含む第１の改変細胞と、腫瘍細胞などの標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを含む第２の改変細胞とを含む、改変細胞集団である。実施形態では、改変細胞は改変Ｔ細胞である。実施形態では、少なくとも２つの異なる改変細胞は、２つの異なる改変Ｔ細胞、２つの異なる改変免疫細胞、またはそれらの組み合わせを含む。実施形態では、改変免疫細胞は、改変Ｔ細胞、ＤＣ細胞および／またはマクロファージを含む。

２、抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、実施形態１に記載の改変細胞集団。

３、改変細胞集団が、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを発現する第３の改変細胞をさらに含み、前記２つの異なる抗原結合ドメインが、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン及び標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメインであり、かつ２つの異なる抗原結合ドメインが同じ細胞上で発現される、実施形態１に記載の改変細胞集団。

４、改変細胞集団が、標的細胞を殺すための抗原結合ドメインを発現する改変細胞と、少なくとも２つの抗原結合ドメインを発現する改変細胞とを含み、前記２つの抗原結合ドメインが、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン及び標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメインであり、かつ２つの異なる抗原結合ドメインが同じ改変細胞上で発現される、実施形態１に記載の改変細胞集団。

５、改変細胞集団が、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインを発現する改変細胞と、少なくとも２つの抗原結合ドメインを発現する改変細胞とを含み、前記２つの抗原結合ドメインが、改変細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメイン及び標的細胞を殺すための第２の抗原結合ドメインであり、かつ２つの異なる抗原結合ドメインが同じ改変細胞上で発現される、実施形態１に記載の改変細胞集団。

６、改変細胞が、改変Ｔ細胞、改変ＮＫ細胞、改変マクロファージまたは改変樹状細胞である、実施形態１－５のいずれか一項に記載の改変細胞集団。

７、改変細胞を増幅および／または維持するための抗原結合ドメインがＷＢＣの表面抗原に結合し、標的細胞を殺すための抗原結合ドメインが腫瘍抗原に結合する、実施形態１－６のいずれか一項に記載の改変細胞集団。

８、ＷＢＣがＢ細胞である、実施形態７に記載の改変細胞集団。

９、ＷＢＣの細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である、実施形態７に記載の改変細胞集団。

１０、固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ１、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３－Ｒα２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ－α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７－Ｈ３、ＥＧＦＲ、または表１にリストされているものの１つである、実施形態１－９のいずれか一項に記載の改変細胞集団。

１１、ＷＢＣの細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態７に記載の改変細胞集団。

１２、Ｂ細胞の細胞表面抗原がＣＤ１９であり、腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ１、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＡＣＰＰ、ＣＬＤＮ１８．２（１８．２）、ＰＳＭＡまたはＵＰＫ２である、実施形態７に記載の改変細胞集団。

１３、第１の抗原に結合する第１のＣＡＲを含む第１の細胞集団と、第２の抗原に結合する第２のＣＡＲを含む第２の細胞集団とを含む組成物であって、第２の抗原が腫瘍抗原であり、第１の抗原と第２の抗原が異なる抗原である、組成物。

１４、第１の細胞集団が第２のＣＡＲを含まず、および／または第２の細胞集団が第１のＣＡＲを含まない、実施形態１３に記載の組成物。

１５、組成物が、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含む第３の細胞集団をさらに含む、実施形態１４に記載の組成物。

１６、第２の細胞集団が第１のＣＡＲをさらに含み、第１の細胞集団が第２のＣＡＲを含まず、または第１の細胞集団が第２のＣＡＲをさらに含む、実施形態１３に記載の組成物。

１７、第２の細胞集団が第１のＣＡＲを含まず、第１の細胞集団が第２のＣＡＲを含む、実施形態１３に記載の組成物。

１８、固形腫瘍を標的とする細胞である第２の細胞集団の増幅を増強する方法であって、実施形態１３－１７のいずれか一項に記載の組成物の有効量を、腫瘍抗原に関連するかまたは腫瘍抗原を発現する形態の癌を有する被検体に投与することを含む、第２の細胞集団の増幅を増強する方法。

１９、実施形態１３－１７のいずれか一項に記載の組成物の有効量を、腫瘍抗原に関連するかまたは腫瘍抗原を発現する形態の癌を有する被検体に投与することを含む、被検体におけるＴ細胞応答を増強するまたは癌を有する被検体を治療する方法。

２０、細胞を、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターおよび第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターと接触させて、実施形態１３－１７のいずれか一項に記載の組成物を得ることと、組成物の有効量を、腫瘍抗原に関連するかまたは腫瘍抗原を発現する形態の癌を有する被検体に投与することと、を含む、被検体における細胞の増幅を増強する方法。

２１、細胞を、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターおよび第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターと接触させて、実施形態１３－１７のいずれか一項に記載の組成物を得ることと、組成物の有効量を、腫瘍抗原に関連するかまたは腫瘍抗原を発現する形態の癌を有する被検体に投与することと、を含む、それを必要とする被検体におけるＴ細胞応答を増強するまたは癌を有する被検体を治療する方法。

２２、実施形態１３－１７のいずれか一項に記載の組成物の第１の細胞集団の有効量を投与することと、第２の細胞集団の有効量を投与することと、を含む、被検体における細胞の増幅を増強する方法。

２３、第１のベクターおよび第２のベクターが、レンチウイルスベクターを含む、実施形態２０－２２のいずれか一項に記載の方法。

２４、第１の抗原または第２の抗原が、白血球（ＷＢＣ）の表面分子、腫瘍抗原、または固形腫瘍抗原であるか、またはそれらを含む、実施形態１３－２３のいずれか一項に記載の組成物または方法。

２５、細胞が、改変Ｔ細胞、改変ＮＫ細胞、改変マクロファージまたは改変樹状細胞である、実施形態１３－２４のいずれか一項に記載の組成物または方法。

２６、ＷＢＣが、顆粒球、単球またはリンパ球である、実施形態２４に記載の組成物または方法。

２７、ＷＢＣがＢ細胞である、実施形態２６に記載の組成物または方法。

２８、ＷＢＣの細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である、実施形態２７に記載の組成物または方法。

２９、ＷＢＣの細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態２６に記載の組成物または方法。

３０、ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９である、実施形態２６に記載の組成物または方法。

３１、腫瘍抗原が固形腫瘍抗原である、実施形態２６に記載の組成物または方法。

３２、固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ１、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３－Ｒα２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ－α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＬＤＮ１８．２またはＥＧＦＲである、実施形態２６に記載の組成物または方法。

３３、固形腫瘍抗原がｔＭＵＣ１であるか、またはｔＭＵＣ１を含む、実施形態２６に記載の組成物または方法。

３４、ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態１３－３３のいずれか一項に記載の組成物または方法。

３５、共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドの細胞内ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態３４に記載の組成物または方法。

３６、第２のＣＡＲの共刺激ドメインが、４－１ＢＢの細胞内ドメインを含むか、またはそれであり、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインがｔＭＵＣ１に結合し、および／または第１のＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ１９に結合し、第２のＣＡＲの共刺激ドメインが、ＣＤ２８の細胞内ドメインを含むか、またはそれである、実施形態３４に記載の組成物または方法。

３７、第１の細胞集団および／または第２の細胞集団が、ドミナントネガティブ形態のＰＤ－１をさらに含む、実施形態１３－３６のいずれか一項に記載の組成物または方法。

３８、第１の細胞集団が、第１のＣＡＲおよびドミナントネガティブ形態のＰＤ－１をコードするベクターを含む、実施形態３７に記載の組成物または方法。

３９、第１のＣＡＲが、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含み、第２のＣＡＲが、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態１３－３８のいずれか一項に記載の組成物または方法。

４０、第１のＣＡＲが配列番号５を含み、第２のＣＡＲが配列番号７０を含む、実施形態１３－３９のいずれか一項に記載の組成物または方法。

４１、第２の細胞集団が、第１のＣＡＲおよび治療薬をコードするレンチウイルスベクターを含み、第１の細胞集団が、第２のＣＡＲおよびドミナントネガティブ形態のＰＤ－１をコードするレンチウイルスベクターを含む、実施形態１３－４０のいずれか一項に記載の組成物または方法。

４２、第１の細胞集団が、第１のＣＡＲおよび治療薬を含み、第２の細胞集団が、第２のＣＡＲおよびドミナントネガティブ形態のＰＤ－１を含む、実施形態１３－４１のいずれか一項に記載の組成物または方法。

４３、治療薬が、サイトカインを含むか、またはそれである、実施形態４１または４２に記載の組成物または方法。

４４、サイトカインが、ＩＬ６および／またはＩＮＦγである、実施形態４３に記載の組成物または方法。

４５、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含むＣＡＲを一つ含む第１のＴ細胞集団の有効量を被検体に投与することにより、被検体における第１のＴ細胞集団の増幅を増強することと、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含むＣＡＲをもう一つ含む第２のＴ細胞集団の有効量を被検体に投与することと、を含む、方法。

４６、第１の細胞集団が別のＣＡＲをさらに含み、前記ＣＡＲがｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態４５に記載の方法。

４７、第２の細胞集団が、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを含まない、実施形態４５に記載の方法。

４８、第１の細胞集団が、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖを含まない、実施形態４５に記載の方法。

４９、ＷＢＣ抗原を標的とするＣＡＲＴ細胞を被検体に投与することと、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を被検体に投与することと、を含む、癌を有する被検体の治療を増強する方法。

５０、ＷＢＣ抗原を標的とするＣＡＲＴ細胞を被検体に投与することと、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を被検体に投与することと、を含む、癌を有する被検体の治療を増強する方法。

５１、ＴＩＬが、
（ｉ）被検体から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップと、
（ｉｉ）ＩＬ－２を含む細胞培地で第１のＴＩＬ集団を培養して第１の増幅を行い、第２のＴＩＬ集団を産生するステップと、
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培地に、追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の増幅を行い、第３のＴＩＬ集団を産生するステップと、ここで、第３のＴＩＬ集団の数が第２のＴＩＬ集団の数よりも少なくとも１００倍多くなり、かつ第３のＴＩＬ集団を得るために第２の増幅を少なくとも１４日間行い、第３のＴＩＬ集団が、第２のＴＩＬ集団と比較して増加したエフェクターＴ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞亜集団を含むＴＩＬの治療集団であり、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の治療上有効な投与量を被検体に投与するステップと、によって調製される、実施形態４９または５０に記載の方法。

５２、前記方法は、ステップ（ｉｖ）の前に、第３のＴＩＬ集団の細胞培地に追加のＩＬ－２、追加のＯＫＴ－３および追加のＡＰＣを補充することによって追加の第２の増幅を行うステップをさらに含み、ここで、追加の第２の増幅は、ステップ（ｉｉｉ）で得られたＴＩＬ治療集団よりも大きなものを得るために、少なくとも１４日間行われ、より大きなＴＩＬ治療集団は、第３のＴＩＬ集団に対して増加したエフェクターＴ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞亜集団をさらに含む、実施形態５１に記載の方法。

５３、ステップ（ｉｉ）の後、実施形態５１の第２の増幅の前に、細胞を細胞培地から取り出し、貯蔵媒体に凍結保存する、実施形態５１に記載の方法。

５４、実施形態５１の第２の増幅の前に細胞を解凍する、実施形態５３に記載の方法。

５５、ステップ（ｉｉｉ）が、ＴＩＬＴＩＬ治療集団において治療上有効な投与量のための十分なＴＩＬを得るために、１～４回繰り返される、実施形態５１に記載の方法。

５６、ＡＰＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態４９－５５のいずれか一項に記載の方法。

５７、エフェクターＴ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞が、第３の細胞集団におけるエフェクターＴ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞と比較して、ＣＤ２７の発現、ＣＤ２８の発現、より長いテロメア、ＣＤ５７の発現の増加およびＣＤ５６の発現の低下からなる群から選択される１つ以上の特性を示す、実施形態４９－５５のいずれか一項に記載の方法。

５８、エフェクターＴ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞が、第３の細胞集団におけるエフェクターＴ細胞および／または中央記憶Ｔ細胞と比較して、ＣＤ５７の発現の増加およびＣＤ５６の発現の低下を示す、実施形態４９－５５のいずれか一項に記載の方法。

５９、癌が、黒色腫、子宮頸癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌および非小細胞肺癌からなる群から選択される、実施形態４９－５５のいずれか一項に記載の方法。

６０、ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、またはＢＣＭＡに結合する、実施形態４９－５９のいずれか一項に記載の方法。

６１、ＣＡＲＴ細胞とＴＩＬの両方を注入した被検体におけるＴＩＬの数が、ＴＩＬを注入した被検体におけるＴＩＬの数よりも多い、実施形態４９－６０のいずれか一項に記載の方法。

６２、ＣＡＲＴ細胞が、図６３の改変細胞２および改変細胞１を含む、実施形態４９－６０のいずれか一項に記載の方法。

６３、腫瘍抗原を発現する形態の癌を有する被検体に組成物の有効量を投与することを含み、
前記組成物が、第１の抗原に結合する第１のＣＡＲを含む第１の細胞集団と、第２の抗原に結合する第２のＣＡＲを含む第２の細胞集団とを含み、ここで、第２の抗原が腫瘍抗原であり、かつ第１の抗原と異なる、それを必要とする被検体における細胞増幅を増強するまたは癌を有する被検体を治療する方法。

６４、細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、実施形態６３に記載の方法。

６５、第１の抗原が、白血球（ＷＢＣ）の細胞表面分子、腫瘍抗原、または固形腫瘍抗原を含む、実施形態６３に記載の方法。

６６、ＷＢＣが、顆粒球、単球またはリンパ球である、実施形態６５に記載の方法。

６７、リンパ球がＢ細胞である、実施形態６６に記載の方法。

６８、ＷＢＣの細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である、実施形態６５に記載の方法。

６９、ＷＢＣの細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態６５に記載の方法。

７０、ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９である、実施形態６５に記載の方法。

７１、腫瘍抗原が固形腫瘍抗原である、実施形態６３に記載の方法。

７２、固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ１、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３－Ｒα２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ－α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＬＤＮ１８．２またはＥＧＦＲである、実施形態７１に記載の方法。

７３、固形腫瘍抗原がｔＭＵＣ１を含む、実施形態７１に記載の方法。

７４、ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態６３に記載の方法。

７５、共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に結合するリガンドの細胞内ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態７４に記載の方法。

７６、第１のＣＡＲが、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含み、第２のＣＡＲが、ｔＭＵＣ１に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含む、実施形態６３に記載の方法。

７７、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号５を含み、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号７０を含む、実施形態６３に記載の方法。

７８、第２の細胞集団が、第２のＣＡＲおよびドミナントネガティブ形態のＰＤ－１をコードするレンチウイルスベクターを含む、実施形態６３に記載の方法。

７９、第１の細胞集団が、第１のＣＡＲおよび治療薬をコードするレンチウイルスベクターを含む、実施形態６３に記載の方法。

８０、治療薬がサイトカインを含む、実施形態７９に記載の方法。

８１、サイトカインが、ＩＬ６および／またはＩＮＦγである、実施形態８０に記載の方法。

８２、サイトカインが、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＴＮＦ－αまたはＩＦＮγのうちの少なくとも１つである、実施形態８０に記載の方法。

８３、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて改変細胞集団を得ることにより、改変細胞混合集団を得ることを含み、ここで、第１の抗原が第２の抗原と異なる、インビトロで細胞を調製するための方法。

８４、被検体または健康なドナーから細胞を得ることと、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて、改変細胞混合集団を得ることと、被検体に有効量の改変細胞混合集団を投与することと、を含み、ここで第１の抗原が第２の抗原と異なり、改変細胞混合集団の有効量を投与した被検体における細胞増幅のレベルが、第２のベクターではなく第１のベクターと接触する改変細胞集団の有効量を投与した被検体における細胞増幅のレベルよりも高い、癌を有する被検体における細胞増幅を増強するための方法。

８５、被検体または健康なドナーから細胞を得ることと、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて改変細胞混合集団を得ることと、被検体に有効量の改変細胞混合集団を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原が第２の抗原と異なる、癌を有する被検体を治療するための方法。

８６、被検体または健康なドナーから細胞を得ることと、細胞を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（１）第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む（２）第２のベクターと接触させて改変細胞混合集団を得ることと、被検体に有効量の改変細胞混合集団を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原が第２の抗原と異なり、かつ有効量の改変細胞混合集団を投与した被検体における腫瘍成長の阻害レベルが、第１のベクターではなく第２のベクターと接触する改変細胞集団の有効量を投与した被検体における腫瘍成長の阻害レベルよりも高い、癌を有する被検体の治療を増強するための方法。

８７、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを第１の細胞集団に導入することと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを第２の細胞集団に導入することと、第１の細胞集団および第２の細胞集団を別々に培養することと、を含み、ここで、第１の抗原が第２の抗原と異なる、インビトロで細胞を調製するための方法。

８８、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを、第１の細胞集団に導入して第１の改変細胞集団を得ることと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを、第２の細胞集団に導入して第２の改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原が第２の抗原と異なり、かつ第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における細胞増幅のレベルが、第１の改変細胞集団ではなく第２の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における細胞増幅のレベルよりも高い、癌を有する被検体における細胞増幅を増強するための方法。実施形態では、第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団は、同時または順に投与される。

８９、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを、第１の細胞集団に導入して第１の改変細胞集団を得ることと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを、第２の細胞集団に導入して第２の改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原が第２の抗原と異なる、癌を有する被検体を治療するための方法。実施形態では、第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団は、同時または順に投与される。

９０、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを、第１の細胞集団に導入して第１の改変細胞集団を得ることと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを、第２の細胞集団に導入して第２の改変細胞集団を得ることと、被検体に有効量の第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団を投与することと、を含み、ここで、第１の抗原が第２の抗原と異なり、かつ第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における腫瘍成長の阻害レベルが、第１の改変細胞集団ではなく第２の改変細胞集団の有効量を投与した被検体における腫瘍成長の阻害レベルよりも高い、癌を有する被検体の治療を増強するための方法。実施形態では、第１の改変細胞集団および第２の改変細胞集団は、同時または順に投与される。

９１、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを第１の細胞集団に導入することと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを第２の細胞集団に導入することと、第２の抗原を発現する細胞を、第１の細胞集団および第２の細胞集団と接触させることと、Ｔ細胞応答のレベルを測定することと、を含み、ここで、第１の細胞集団および第２の細胞集団と接触する細胞におけるＴ細胞応答のレベルが、第１の細胞集団ではなく第２の細胞集団と接触する細胞におけるＴ細胞応答のレベルよりも高い、Ｔ細胞応答を増強するための方法。

９２、細胞集団を、第１の抗原に結合する第１の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および第２の抗原に結合する第２の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターと接触させて改変細胞混合集団を得ることと、第２の抗原を発現する細胞を、改変細胞混合集団と接触させることと、Ｔ細胞応答のレベルを測定することと、を含み、ここで、改変細胞混合集団と接触した細胞におけるＴ細胞応答のレベルが、第１のベクターではなく第２のベクターと接触した細胞集団と接触した細胞におけるＴ細胞応答のレベルよりも高い、Ｔ細胞応答を増強するための方法。

９３、細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、実施形態８３－９２のいずれか一項に記載の方法。実施形態では、細胞はＴ細胞である。

９４、第１の抗原結合分子が、ＷＢＣの細胞表面分子に結合する、実施形態８３－９３のいずれか一項に記載の方法。

９５、ＷＢＣが、顆粒球、単球またはリンパ球である、実施形態９４に記載の方法。

９６、ＷＢＣがＢ細胞である、実施形態９４に記載の方法。

９７、ＷＢＣの細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である、実施形態９４に記載の方法。

９８、ＷＢＣの細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態９４に記載の方法。

９９、ＷＢＣの細胞表面分子がＣＤ１９である、実施形態９４に記載の方法。

１００、第２の抗原結合分子が、固形腫瘍抗原に結合する、実施形態８３－９９のいずれか一項に記載の方法。

１０１、固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ１、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３－Ｒα２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ－α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＬＤＮ１８．２またはＥＧＦＲである、実施形態１００に記載の方法。

１０２、第１の結合分子および第２の結合分子がＣＡＲである、実施形態８３－１０１のいずれか一項に記載の方法。

１０３、ＣＡＲが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、かつ細胞外ドメインが腫瘍抗原に結合する、実施形態１０２に記載の方法。

１０４、細胞内ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激ドメインを含む、実施形態１０３に記載の方法。

１０５、細胞内ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１０５に記載の方法。

１０６、第１の結合分子がＣＡＲであり、第２の結合分子がＴＣＲである、実施形態８３－１０１のいずれか一項に記載の方法。

１０７、Ｔ細胞が、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、実施形態１０６に記載の方法。

１０８、ＴＣＲが、患者において自発的に発生した腫瘍特異的Ｔ細胞に由来する、実施形態１０６に記載の方法。

１０９、ＴＣＲが腫瘍抗原に結合する、実施形態１０６に記載の方法。

１１０、腫瘍抗原が、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、ｐ５３、ＭＡＧＥ－Ａ３またはＮＹ－ＥＳＯ－１を含む、実施形態１０９に記載の方法。

１１１、ＴＣＲが、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１０６に記載の方法。

１１２、第２の細胞集団がＴＩＬに由来する、実施形態１０６に記載の方法。

１１３、改変細胞集団が、第１の結合分子を含む細胞と、第２の結合分子を含む細胞とを含む、実施形態８３－１１２のいずれか一項に記載の方法。

１１４、改変細胞集団が、第１の結合分子を含む細胞と、第２の結合分子を含む細胞と、第１の結合分子と第２の結合分子の両方を含む細胞とを含む、実施形態８３－１１２のいずれか一項に記載の方法。

１１５、Ｔ細胞応答が、ＣＡＲのコピー数および／または放出されるサイトカインの量によって測定される、実施形態８３－１１２のいずれか一項に記載の方法。実施形態では、放出されるサイトカインが、ＩＬ－６および／またはＩＦＮ－γである。

１１６、Ｔ細胞応答が、サイトカイン放出、細胞増幅および／または活性化レベルを含む、実施形態８３－１１２のいずれか一項に記載の方法。

１１７、第１のベクターが、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γまたはそれらの組み合わせをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態８３－１１２のいずれか一項に記載の方法。

１１８、第１のベクターが、ＩＬ－１２をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態８３－１１２のいずれか一項に記載の方法。

１１９、ポリヌクレオチドが、ＮＦＡＴおよび／またはＶＨＬをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１１６および１１７のいずれか一項に記載の方法。

１２０、改変細胞集団が、第１の結合分子およびＩＬ－６、ＩＦＮγまたはそれらの組み合わせを発現する細胞と、第２の結合分子を発現する細胞と、第１の結合分子および第２の結合分子を発現する細胞と、および／または第１の結合分子およびＩＬ－１２を発現する細胞と、を含む、実施形態８３－１１９のいずれか一項に記載の方法。

１２１、改変細胞集団が、第２の結合分子およびＩＬ－６、ＩＦＮγまたはそれらの組み合わせを発現する細胞と、第２の結合分子を発現する細胞と、第１の結合分子および第２の結合分子を発現する細胞と、および／または第１の結合分子およびＩＬ－１２を発現する細胞と、を含む、実施形態８３－１２０のいずれか一項に記載の方法。

１２２、改変細胞集団が、第２の結合分子およびＩＬ－６、ＩＦＮγまたはそれらの組み合わせを発現する細胞と、第２の結合分子を発現する細胞と、第１の結合分子および第２の結合分子を発現する細胞と、および／または第２の結合分子およびＩＬ－１２を発現する細胞と、を含む、実施形態８３－１２１のいずれか一項に記載の方法。

１２３、改変細胞集団が、ドミナントネガティブ形態のＰＤ－１を発現する細胞を含む、実施形態８３－１２２のいずれか一項に記載の方法。

１２４、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、ここで、第１の抗原結合ドメインが第１の抗原を認識し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原を認識し、第１の抗原が第２の抗原と異なる、二重特異性キメラ抗原受容体。

１２５、第１の抗原および第２の抗原が、同じ細胞上で発現しない、実施形態１２４に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１２６、第１の抗原が血液成分の抗原であり、第２の抗原が固形腫瘍の抗原である、実施形態１２４または１２５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１２７、第１の抗原がＣＤ１９であり、第２の抗原が腫瘍関連ＭＵＣ１である、実施形態１２４－１２６のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１２８、第１の抗原結合ドメインが、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、実施形態１２４－１２７のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１２９、第２の抗原結合ドメインが、配列番号７０、７１、７２、７９、８０または８１のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１２４－１２８のいずれか一項に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１３０、ＣＡＲが、表５に示すｔａｎＣＡＲのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１２４に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１３１、第１の結合ドメインが非必須組織抗原に結合し、第２の結合ドメインが腫瘍組織抗原に結合する、実施形態１２４に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。実施形態では、第１の結合ドメインが、ＴＳＨＲまたはＧＵＣＹ２Ｃに結合する。実施形態では、第２の結合ドメインが、ｔＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１、または上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）に結合する。

１３２、第１の結合ドメインが組織特異的抗原に結合し、第２の結合ドメインが、２つ以上の組織で発現される抗原に結合する、実施形態１２４に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。実施形態では、第１の結合ドメインが、ＴＳＨＲまたはＰＲＬＲに結合する。実施形態では、第２の結合ドメインが、ｔＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１またはＥＴＡに結合する。

１３３、第１の結合ドメインが正常組織抗原に結合し、第２の結合ドメインが、腫瘍組織で発現される抗原に結合する、実施形態１２４に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。実施形態では、第１の結合ドメインが、ＡＣＰＰ、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＵＰＫ２、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＳＭＡ、ＤＰＥＰ３、ＣＸＣＲ５、Ｂ７－Ｈ３、ＭＵＣ１６、ＳＩＧＬＥＣ－１５、ＣＬＤＮ６、Ｍｕｃ１７、ＰＲＬＲまたはＦＺＤ１０に結合する。実施形態では、第２の結合ドメインが、ｔＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１またはＥＴＡに結合する。

１３４、第１の結合ドメインが、非悪性細胞で発現される抗原に結合し、第２の結合ドメインが、対応する非悪性細胞で発現されずに腫瘍細胞で発現される抗原に結合する、実施形態１２３に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。

１３５、実施形態１２３－１３４のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲを含む、細胞。

１３６、実施形態１２３－１３４のいずれか一項に記載の二重特異性ＣＡＲをコードする、核酸。

１３７、実施形態１３５に記載の細胞の有効量を投与することを含む、Ｔ細胞応答を増強する、癌の治療を増強する、被検体における癌を治療する、腫瘍を有する被検体を治療する、または腫瘍の成長を阻害する方法。

１３８、それを必要とする被検体の治療における、実施形態１－１３５のいずれか一項に記載の細胞、二重特異性ＣＡＲ、改変細胞集団、組成物または方法の用途。

１３９、被検体が癌を有する、実施形態１３６に記載の細胞、二重特異性ＣＡＲ、改変細胞集団、組成物または方法の用途。

＜実施例１．二重特異性ＣＡＲ＞
各ＣＡＲ分子をコードするレンチウイルスベクターを産生し、かつＴ細胞でトランスフェクトし、その詳細は以下のとおりである。細胞培養、細胞傷害性Ｔリンパ球のアッセイの構築に関する技術は、「Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｕｍｏｒｘｅｎｏｇｒａｆｔｓｗｉｔｈｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｒｅｔａｒｇｅｔｅｄｈｕｍａｎＴｃｅｌｌｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＣＤ２８ａｎｄＣＤ１３７ｄｏｍａｉｎｓ」、ＰＮＡＳ、２００９年３月３日、第１０６巻第９期、第３３６０－３３６５ページ、および「ＣｈｉｍｅｒｉｃＲｅｃｅｐｔｏｒｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＣＤ１３７ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＤｏｍａｉｎｓＭｅｄｉａｔｅＥｎｈａｎｃｅｄＳｕｒｖｉｖａｌｏｆＴＣｅｌｌｓａｎｄＩｎｃｒｅａｓｅｄＡｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃＥｆｆｉｃａｃｙＩｎＶｉｖｏ，」ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ、２００９年、第１７巻第８期、第１４５３－１４６４ページに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

０日目に、健康なボランティアから末梢血を抽出し、選別してＣＤ３＋Ｔ細胞を収集した。１：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを収集したＣＤ３＋Ｔ細胞に加えた。１日目に、ＣＤ１９ＣＡＲ（ＭＯＩ＝１５；ＣＡＲの結合ドメインが配列番号５）を含むベクターと、ＴＳＨＲＣＡＲ（ＭＯＩ＝９２；ＣＡＲの結合ドメインが配列番号８）を含むベクターと、ＴＳＨＲ－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲ（ＭＯＩ＝９２、ＣＡＲの結合ドメインが配列番号４３５）を含むベクターを用いて活性化したＣＤ３＋Ｔ細胞をトランスフェクトした。より多くの構造および配列の情報を図７および表５に提供する。２日目に、培地を交換した。レンチウイルスを除去し、細胞を新鮮な培地に再懸濁した。５日目に、ＣＡＲ発現のフロー検出を行った。様々な発現率（ＣＤ１９ＣＡＲ１７．４５％、ＴＳＨＲＣＡＲ７６．８４％、ＴＳＨＲ－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲ２０．５９％）を観察した。さらに、０日目に、健康なボランティアから末梢血を抽出し、選別してＣＤ３＋Ｔ細胞を収集した。１：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを収集したＣＤ３＋Ｔ細胞に加えた。１日目に、ＣＤ１９ＣＡＲ（ＭＯＩ＝２；ＣＡＲの結合ドメインが配列番号５）を含むベクターと、ｔＭＵＣ１ＣＡＲ（ＭＯＩ＝３０；ＣＡＲの結合ドメインが配列番号７０）を含むベクターと、ｔＭＵＣ１－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲ（ＭＯＩ＝９５；ＣＡＲの結合ドメインが配列番号４３７）を含むベクターと、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１９（１８．２－ＣＤ１９）二重特異性ＣＡＲ（ＭＯＩ＝１８０、ＣＡＲの結合ドメインが配列番号４３９）を含むベクターを用いて活性化したＣＤ３＋Ｔ細胞をトランスフェクトした。より多くの配列情報を図１０、１２、１３および表５に提供する。２日目に、培地を交換した。レンチウイルスを除去し、細胞を新鮮な培地に再懸濁した。５日目に、ＣＡＲ発現のフロー検出を行った。様々な発現率（ＣＤ１９ＣＡＲ６８．２８％、ｔＭＵＣ１ＣＡＲ３１．５８％、ｔＭＵＣ１ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲ２８．１１％および３５．１１％）を観察した。

図８に示すように、０．２×１０^４または１×１０^４個のＣＡＲＴ細胞と１×１０^４個のＮａｌｍ６またはＢ－ＣＰＡＢ－Ｂ腫瘍細胞を２４時間共培養し、上澄み液を収集した。ＩＦＮγの放出を検出した。Ｎａｌｍ６はＣＤ１９陽性腫瘍細胞であり、Ｂ－ＣＰＡＢ－ＢはＴＳＨＲ陽性腫瘍細胞である。図８の左図に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞は、Ｂ－ＣＰＡＢ－Ｂに応答して放出されるＩＦＮγと比較して、Ｎａｌｍ６に応答してより多くのＩＦＮγを放出した。図８の中図に示すように、ＴＳＨＲＣＡＲＴ細胞は、Ｎａｌｍ６に応答して放出されるＩＦＮγと比較して、Ｂ－ＣＰＡＢ－Ｂに応答してより多くのＩＦＮγを放出した。右図に示すように、二重特異性ＣＡＲＴ細胞は、Ｎａｌｍ６とＢ－ＣＰＡＢ－Ｂのそれぞれに応答して、大量のＩＦＮγを放出した。これらの結果から、ＣＤ１９陽性細胞またはＴＳＨＲ陽性細胞の両方がいずれも二重特異性ＣＡＲＴ細胞を刺激し得ることがわかった。１０^５個のＣＡＲＴ細胞および１０^５個のＮａｌｍ６またはＢ－ＣＰＡＢ－Ｂ腫瘍細胞を２４時間共培養した後、フローサイトメトリーによってＣＡＲＴＣＤ８陽性細胞のＣＤ１３７発現を検出した。図９の左図は、腫瘍細胞と共培養していないＣＡＲＴ細胞のＣＤ１３７発現を示し、中図と右図は、Ｎａｌｍ６またはＢ－ＣＰＡＢ－Ｂと共培養したＣＡＲＴ細胞のＣＤ１３７発現を示した。結果から、Ｎａｌｍ６とＢ－ＣＰＡＢ－Ｂの両方はいずれも二重特異性ＣＡＲＴ（ＴＳＨＲ－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲ）を活性化し得ることがわかった。同様のサイトカイン放出アッセイを行うと、Ｎａｌｍ６とＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の両方がいずれも二重特異性ＣＡＲＴ（ＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲまたはＣＬＤＮ１８．２－１９ｔａｎＣＡＲ）細胞を活性化し得ることを示した（図１２－１５）。

図１２は、ＣＡＲ分子をコードするベクター構築物の概略構造を示す。図１３は図１２に示されるＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＤ１９ＣＡＲにはヒト化抗体が含まれるので、１８．２ＣＡＲはマウス抗体である。そのため、検出にはヒトＣＡＲ抗体とマウスＣＡＲ抗体を使用した。二重特異性ＣＡＲを用いて、この２つの抗体の発現率を検出し、前記発現率が１：１に近いので、二重特異性ＣＡＲの発現が期待通りであったことがわかった。図１４は、共培養したＣＡＲＴ細胞と腫瘍細胞のＩＦＮγ放出結果を示す。０．２×１０^４または１×１０^４個のＣＡＲＴ細胞と、１×１０^４個の２９３ＴまたはＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋またはＮａｌｍ－６細胞とを共培養して実験を行った。２４時間後、上澄み液を収集し、ＩＦＮ－γを検出した。Ｎａｌｍ－６はＣＤ１９Ｔ細胞であり、ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋は、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する細胞であり、２９３Ｔは、ＣＤ１９およびＣＬＤＮ１８．２を発現しないダブルネガティブ細胞である。図に示すように、ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋細胞と共培養した場合、１８．２ＣＡＲＴに明らかなＩＦＮ－γの放出が見られ、これにより、ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋が１８．２ＣＡＲＴ細胞によって認識され、かつＩＦＮ－γを放出して標的細胞を殺傷できることがわかり、Ｎａｌｍ－６も、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によって認識され、ＩＦＮ－γを放出して標的細胞を殺傷することができ、ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋およびＮａｌｍ－６を共培養すると、１８．２－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲ（１８．２－１９ｔａｎＣＡＲ）は、明らかなＩＦＮ－γの放出が見られた。さらに、Ｎａｌｍ－６は１８．２ＣＡＲＴ細胞からのＩＦＮ－γの放出を刺激することができず、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞はＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋によってＩＦＮ－γの放出を刺激することができなかったから、この２つのＣＡＲＴ細胞は特異的であることがわかった。要するに、１８．２－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲＴ細胞は、１８．２とＣＤ１９陽性の標的細胞を特異的に認識し、かつＩＦＮ－γを放出して標的細胞を殺傷することができる。

図１５はＣＡＲＴ細胞と腫瘍細胞を共培養したＣＤ１３７発現を示したフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。１×１０^４個のＣＡＲＴ細胞と１×１０^４個の２９３Ｔ－ＷＴまたはＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋またはＮａｌｍ－６細胞を共培養した。４８時間後、フローサイトメトリーによってＣＡＲＴＣＤ８＋細胞のＣＤ１３７発現を検出した。左列は、２９３Ｔと共培養したＣＡＲＴ細胞のＣＤ１３７発現を示す。ＣＤ１９ＣＡＲ群、１８．２ＣＡＲ群および１８．２－１９ｔａｎＣＡＲ群では、ＣＤ１９ＣＡＲの発現が存在しない。２９３Ｔは特異的抗原発現を有さず、ＣＡＲＴ細胞を活性化できないことがわかる。中列は、ＣＡＲＴ細胞を、１８．２タンパク質を高発現するＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋細胞と共培養したものである。１８．２ＣＡＲ群では、ＣＤ１３７の発現率は８．７７％であり、１８．２－１９二重特異性ＣＡＲ群では、ＣＤ１３７の発現率は６．３６％である。ＣＤ１９ＣＡＲ群では、ＣＤ１３７の発現が観察されなかった。１８．２－ＣＡＲＴと１８．２－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲＴは、ＫＡＴＯＩＩＩ－１８．２＋における１８．２タンパク質を認識して活性化したが、ＣＤ１９ＣＡＲＴはしなかった。右列は、ＣＡＲＴ細胞と、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によって特異的に認識して活性化されるＣＤ１９＋細胞であるＮａｌｍ－６細胞を共培養したものである。結果から、ＣＤ１９ＣＡＲ群でのＣＤ１３７の発現率は１１．１４％、１８．２－１９二重特異性ＣＡＲ群でのＣＤ１３７の発現率は１０．５５％、１８．２ＣＡＲ群での発現率は検出できなかったことがわかった。ＣＤ１９ＣＡＲと１８．２－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲは、Ｎａｌｍ－６によって活性化され得るが、１８．２ＣＡＲはＮａｌｍ－６を活性化できなかった。要するに、結果から、１８．２－ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲＴ細胞は、１８．２抗原およびＣＤ１９抗原を特異的に認識できることがわかった。ＣＤ１３７はＴ細胞の活性化のためのマーカータンパク質であるため、ＣＡＲＴ細胞と基質標的細胞を共培養した後、ＣＡＲＴ細胞のＣＤ１３７のアップレギュレーションレベルによって、ＣＡＲＴ細胞が活性化されているかどうかを決定することができる。

ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）のグリコシル化異常など、多くの腫瘍でグリコシル化異常が見られることが知られている。ｔＭＵＣ１に結合するＣＡＲは、５Ｅ５抗体に基づくｓｃＦｖを含み得る。多くの腫瘍は、特定の特徴的な標的を特異的に発現する。腫瘍マーカーの傷害およびその対応する癌種に関するより多くの情報を表３に示す。例としては、リンカーで連結された２つのｓｃＦｖが、２つのｓｃＦｖを含むタンデムＣＡＲ（ｔａｎＣＡＲ）を形成する。

０日目に、健康なボランティアから末梢血を抽出した。ＣＤ３＋Ｔ細胞をｐａｎＴキットで選別し、３：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを用いて活性化した。１日目に、活性化したＣＤ３＋Ｔ細胞を感染させた。表４に基づくベクターで複数の細胞群（各群１．００Ｅ＋０６個のＴ細胞）を感染させ、残りの細胞をＮＴ（トランスフェクトなし）とした。２日目に、レンチウイルスおよびダイナビーズを除去し、培地を交換した。６日目に、フローサイトメトリーアッセイにより、各群のＣＡＲＴ細胞のＣＡＲ比率と細胞表現型を測定した。抗ＡＣＰＰ抗体はヒト化抗体、抗ＭＵＣ１抗体はマウス抗体であるため、これら２つのｓｃＦｖの発現を検出するために、それぞれウサギ抗ヒトＣＡＲ抗体とウサギ抗マウスＣＡＲ抗体を用いた。７日目に、表４に基づいて実験を行った。２４時間完全に活性化した後、サンプルをフロー染色した。上澄み液を収集してサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）の検出に用い、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色を行い、増殖を観察した。細胞を蛍光基質細胞と共培養し、蛍光基質を持つ細胞の生存率を観察して殺傷効果を決定した。

図６６は、フローサイトメトリーアッセイを使用した、ＣＡＲＴ細胞およびｔａｎＣＡＲＴ細胞におけるいくつかのマーカーの発現を示すヒストグラムを提供する。ＮＴ、６９１７、６９２１、２５２９、２５３０、２５３３、２５３４と基質細胞（ＭＣＦ－７、ＰＣ３－ａｃｐｐ、２９３Ｔ細胞）を２４時間共培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。ＣＡＲＴ細胞を３つの基質細胞（２９３Ｔ、ＭＣＦ－７、ＰＣ３－ａｃｐｐ）と２４時間共培養した。ＣＡＲＴ細胞の活性化後、フローサイトメトリーアッセイを行った。図６６では、縦座標はそれぞれＣＡＲ＋ＣＤ１３７＋細胞（ＣＡＲ＋細胞の合計）およびＣＡＲ＋ＣＤ２５＋（ＣＡＲ＋細胞の合計）である。ＣＤ１３７とＣＤ２５の発現から、４種類のｔａｎＣＡＲ細胞が対応する基質細胞によって効果的に活性化され得ることがわかった。ＣＡＲＴ細胞を基質細胞（２９３Ｔ、ＭＣＦ－７およびＰＣ３－ａｃｐｐ）と２４時間共培養した後、フローサイトメトリーによってＣＤ４０Ｌの発現の統計分析を行った。４種類のｔａｎＣＡＲ細胞がＣＤ４０Ｌを発現し、これらはＣＤ４０＋細胞、およびＢ細胞、活性化単球やＤＣなどの免疫系細胞を活性化することができる。

図６７は、ＣＡＲＴ細胞およびｔａｎＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出を示すヒストグラムを提供する。ＮＴ、６９１７、６９２１、２５２９、２５３０、２５３３および２５３４を基質細胞（ＭＣＦ－７、ＰＣ３－ａｃｐｐ、２９３Ｔ細胞）と２４時間共培養２４し、８日目にサイトカイン放出を測定した。

図６８は、対応する基質細胞で５日間刺激した後の、各群の細胞の増幅を示す。対照群と比較して、ｔａｎＣＡＲ群は、これら二つの基質細胞に応答して顕著な増幅を示した。基質細胞（ＭＣＦ－７、ＰＣ３－ａｃｐｐ、２９３Ｔ細胞）と５日間共培養した後、１２日目に６９１７、６９２１、２５２９、２５３０、２５３３、２５３４およびＮＴの増殖を測定した。

図６９は、殺傷アッセイの結果を示す。その結果、６９１７がＭＣＦ－７を阻害し、６９２１がＰＣ３－ＡＣＰＰを阻害することがわかった。４群のｔａｎＣＡＲＴ細胞は、この２つの基質細胞を殺した。ＮＴの実験結果は陰性であった。対照は腫瘍細胞のみを含んでいた。基質細胞と５日間共培養した後、６９１７、６９２１、２５２９、２５３０、２５３３、２５３４およびＮＴ細胞の殺傷アッセイを行った。

図７０は、フローサイトメトリーアッセイを使用した、他のＣＡＲＴ細胞およびｔａｎＣＡＲＴ細胞におけるいくつかのマーカーの発現およびサイトカイン放出を示すヒストグラムを提供する。２４０７、１６３および２５１７をＭＣＦ－７、ＫＡＴＯ３＋および２９３Ｔ細胞と２４時間共培養し、８日目にサイトカイン放出アッセイを行った。ＴａｎＣＡＲ２５１７は、ＭＣＦ－７とＫＡＴＯ３＋基質細胞の両方で活性化され、その強度と割合が単一のＣＡＲに近いものであった。対応するＣＡＲＴ細胞を基質細胞（２９３Ｔ、ＭＣＦ－７およびＫＡＴＯ３＋）と２４時間共培養し、フローサイトメトリーによってＣＤ４０Ｌの発現を検出した。

図７１は、基質細胞に応答した、様々なＣＡＲＴ細胞およびｔａｎＣＡＲＴ細胞のサイトカイン放出を示す。実験方法および実験設計は、上記の実験と同様であった。

＜実施例２．患者におけるＣＡＲＴ細胞増幅および抗腫瘍活性＞
臨床研究は、いくつかの固形腫瘍マーカーの特異的ＣＡＲ／４－１ＢＢ／ＣＤ３－ζを発現するように改変された自己Ｔ細胞を患者に注入することの安全性と治療効果を評価するために設計された。本研究の第１群では、患者には、固形腫瘍マーカーの特異的ＣＡＲＴ細胞のみが投与された。固形腫瘍マーカーはＴＳＨＲおよびｔＭｕｃ１を含む。第２群では、患者には、ＣＤ１９および固形腫瘍抗原（例えば、ＴＳＨＲ、ｔＭＵＣ１またはＧＵＣＹ２Ｃ）に向けられたＣＡＲＴ細胞が投与された。患者からＴ細胞を得て、前記Ｔ細胞を改変して患者に注入した。第１群と第２群２からの患者のＴ細胞応答を測定し、試験が実施された病院によって承認された以下の手段を用いて比較した。すべての患者には、書面によるインフォームドコンセントが提供された。これらの患者の情報は、以下の表９中（ＳＤ：安定した疾患；ＰＤ：進行性疾患；ＰＲ：部分寛解；ＣＲ：完全寛解；ＮＲ：応答なし）に提供される。

患者からＰＢＭＣを得た。様々なレンチウイルスベクターを生成した後、それらをＴ細胞にトランスフェクトし、さらに前記Ｔ細胞を数日間培養した後、共培養してアッセイを行った。より詳細な情報は、以下の表７、９および１０に記載されている。細胞培養、細胞傷害性Ｔリンパ球のアッセイ構築に関連する技術は、「Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｕｍｏｒｘｅｎｏｇｒａｆｔｓｗｉｔｈｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｒｅｔａｒｇｅｔｅｄｈｕｍａｎＴｃｅｌｌｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＣＤ２８ａｎｄＣＤ１３７ｄｏｍａｉｎｓ」、ＰＮＡＳ、２００９年３月３日、第１０６巻第９号、３３６０－３３６５に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの方法を使用してＣＡＲＴ細胞を生成する。患者００１－００３の場合、ＰＢＭＣからＣＤ３＋細胞を得て、ＩＬ－２を含むＸ－ｖｉｖｏ１５培地を用いて培養した。例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａを含む抗体キットを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を収集し、望ましくない細胞を除去することができる。ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化した後、感染前にサンプリングしてカウントした。感染する細胞の数を得た。群１の細胞数は６ｘ１０７、群２の細胞数は７ｘ１０７であった。必要なベクターＭＯＩに応じて、対応するベクター数とベクター体積を算出した（表１０を参照）。患者００４－０１０の場合、ＩＬ－２を含むＴＥＸＭＡＣＳ培地を用いて、ＰＢＭＣを培養した。ＣＤ４とＣＤ８の磁気ビーズを用いて、ＰＢＭＣ中のＴ細胞を分類して選択した。適当な培養開始量を選択し、Ｔｒａｎｓａｃｔアクチベーターを用いてＴ細胞を性化した。ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰＴＣｅｌｌＴｒａｎｓＡｃｔ^ＴＭには、ヒトＣＤ３およびＣＤ２８に対するヒト化組換えアゴニストに共有結合したコロイド状高分子ナノマトリックスが含まれる。ナノマトリックスの使用により、ＧＭＰＴＣｅｌｌＴｒａｎｓＡｃｔを滅菌ろ過でき、かつ、余分な試薬は、遠心分離と従来の澄み液交換、または培地による簡単な洗浄によって除去することができる。この試薬は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔなどの自動培養システムでの使用に適している。必要なベクターＭＯＩに応じて、対応するベクター数とベクター体積を算出した（表１０を参照）。具体的には、患者００４－００８および０１０の場合、複数のベクターを含むレンチウイルスベクターをＴ細胞と２４時間混合した。Ｔ細胞をさらに洗浄し、８日間培養した後、病院に運んだ。患者００９の場合、Ｔ細胞を４つの群に分け、各群のＴ細胞を、１つ以上のベクター（表７を参照）を含むレンチウイルスベクターと２４時間混合し、これらのＴ細胞を洗浄して８日間培養した。この４つの群のトランスフェクトされたＴ細胞を混合した後、病院に運んだ。

新鮮な細胞の場合、磁気ビーズを除去した後、形質導入された細胞を遠心分離するか、９５％複合電解質と５％ヒトアルブミンの溶液で交換し、返送用バッグに入れ、密封後１５－２５℃で輸送した。新鮮な製剤は直接回収された。凍結保存された細胞の場合、３３．７５％の複合電解質溶液、３３．７５％のデキストラン４０グルコース溶液、２５％のヒト血液アルブミンおよび７．５％のジメチルスルホキシドを含む培地は凍結保存に使用された。細胞懸濁液を凍結保存用バッグに入れた後、バッグを－９０℃まで冷却し、気相液体窒素タンクに移して保管した。凍結製剤の蘇生後３０分以内に凍結製剤の再構成を完了した。ＣＡＲＴ細胞の調製のために、患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を白血球アフェレーシスにより入手し、ＣＡＲＴ注入の最初の日を試験の０日目とした。

数人の患者は、ＣＡＲＴ細胞注入のためのリンパ球枯渇のコンディショニング治療を受けた。フルダラビンとシクロホスファミドを用いたコンディショニング治療は、骨髓（ＢＭ）と末梢血（ＰＢ）中の腫瘍量に応じて変化した。患者には、感染の予防に重要な役割を果たす好中球を増やすために、長時間作用型のＧ－ＣＳＦを、コンディショニング治療後の１－３日間、それぞれ約６ｍｇまたは１００μｇ／ｋｇ体重の量で投与した。ＣＡＲＴ細胞を患者に注入した。毎日、ＣＡＲＴ細胞を病院に輸送し、洗浄、カウント、生存率のチェックを行い、その後、患者への投与準備の後、患者を少なくとも２時間綿密に観察した。サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、改訂された評価システムに従って評価された（ＬｅｅＤＷ．ら．，Ｂｌｏｏｄ２０１４；１２４：１８８－９５を参照）。治療中および治療後のその他の毒性は、治療中および治療後の他の毒性は、国立衛生研究所の有害事象共通用語基準バージョン４．０（ｈｔｔｐ：／／ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／）に従って評価された。治療応答は、フローサイトメトリーおよび形態学的分析により評価された。可能な場合、患者はキメラ遺伝子の発現レベルによって評価された。

ＣＡＲＴ細胞注入後の骨髓（ＢＭ）および末梢血（ＰＢ）サンプルをＫ２ＥＤＴＡＢＤバキュテナーチューブに採取した。患者のＰＢおよびＢＭにおけるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の持続性をＦＡＣＳで決定した。測定された絶対ＣＤ３＋Ｔリンパ球数に基づいて、マイクロリットルあたりの循環ＣＡＲＴ細胞数を計算した。同時に、ＣＡＲＤＮＡコピーは、ＣＡＲＴ細胞増幅および持続性を決定する別の方法として評価された。ＱＩＡａｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、凍結保存されたＰＢとＢＭからゲノムＤＮＡを抽出した。補足資料に記載されているように、ＣＡＲＤＮＡコピーは、定量的なリアルタイムＰＣＲによって評価された。血清およびＣＳＦ中のサイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７などのレベルを、製造者の指示に従ってマルチプレックス形態で測定した。

ＱＩＡａｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、凍結保存された末梢血と骨髓からゲノムＤＮＡを抽出した。定量的なＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で、ＡＢＩ２×ＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスとＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、３回ずつリアルタイムで実施した。１０２－１０８個のコピー数／マイクロリットルを含む精製ＣＡＲプラスミドの１０倍連続希釈液の標準曲線から、ゲノムＤＮＡのマイクログラムあたりのコピー数を算出した。ＤＮＡ量の正規化には、内部対照遺伝子の増幅を用いた。ＣＡＲ導入遺伝子および内部対照遺伝子に特異的なプライマー／プローブは、以前に記載されたとおりである（ＧｏｋｂｕｇｅｔＮ．ら，Ｂｌｏｏｄ２０１２；１２０：２０３２－４１およびＯ’ＢｒｉｅｎＳ．ら，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２０１３；３１：６７６－８３を参照）。

各ＣＡＲのＣＡＲコピー数に基づいてＣＡＲＴ細胞の増幅を観察し、図１６および１７に示した。これらの図に示すように、患者００４と００５におけるＣＡＲＴ細胞の増幅は、患者００２、００３および００１におけるＣＡＲＴ細胞の増幅に比べて明らかに高いため、ＣＤ１９ＣＡＲおよび／またはＣＤ１９ＣＡＲおよびｔＭＵＣ１ＣＡＲを発現するＴ細胞がＣＡＲＴ細胞増幅を増強したことを示している（表１０も参照）。ＣＤ１９ＣＡＲ、固形腫瘍ＣＡＲ（例えば、ｔＭＵＣ１、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２ＣＣＡＲ）およびダブルＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲと固形腫瘍ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を算出した。例えば、以下の式を用いて、ＣＤ１９ＣＡＲ、ｔＭＵＣ１ＣＡＲおよびブルＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲおよびｔＭＵＣ１ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を算出した：
ＷＢＣ×ＣＤ３％×（（ｔＭＵＣ１ＣＡＲ＋ＣＤ１９ＣＡＲ－）／ＣＤ３）；
ＷＢＣ×ＣＤ３％×（（ｔＭＵＣ１ＣＡＲ－ＣＤ１９ＣＡＲ＋）／ＣＤ３）；および
ＷＢＣ×ＣＤ３％×（（ｔＭＵＣ１ＣＡＲ＋ＣＤ１９ＣＡＲ＋）／ＣＤ３）；
ここで、ＷＢＣはＷＢＣの数であり、ＣＤ３％は、ＷＢＣにおけるＣＤ３陽性細胞のパーセンテージであり、（ｔＭＵＣ１ＣＡＲ＋ＣＤ１９ＣＡＲ－）／ＣＤ３は、ＣＤ３陽性細胞においてＣＤ１９ＣＡＲではなくｔＭＵＣ１ＣＡＲを発現するＴ細胞のパーセンテージであり、（ｔＭＵＣ１ＣＡＲ－ＣＤ１９ＣＡＲ＋）／ＣＤ３は、ＣＤ３陽性細胞においてｔＭＵＣ１ＣＡＲではなくＣＤ１９ＣＡＲを発現するＴ細胞のパーセンテージであり、および（ｔＭＵＣ１ＣＡＲ＋ＣＤ１９ＣＡＲ＋）／ＣＤ３は、ＣＤ３陽性細胞においてＣＤ１９ＣＡＲおよびｔＭＵＣ１ＣＡＲを発現するＴ細胞のパーセンテージである。結果を図１８および１９に示す。これらの図に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞は、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増幅を有意に増加させ、ＣＤ１９ＣＡＲの存在がｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増幅を増強することを示している。同様の結果は、患者００６－０１０でも観察された（図２０および２１を参照）。上記インビトロの結果と下記の実施例におけるインビボの結果を組み合わせると、ＷＢＣ抗原を標的とするＣＡＲＴ細胞を活性化することで、固形腫瘍抗原を標的とするＣＡＲＴ細胞の増幅を増強し得ることがわかる。

患者００８は、甲状腺切除術を受けていた。注入から２８日後、右の腫瘍は消失し、左の腫瘍のサイズは減少した。ＰＥＴＣＴスキャン画像の例を図３３に示す。注入から３ヶ月後、右の腫瘍は再発せず、左の腫瘍は消失した。ＰＥＴＣＴ画像（図示せず）では、腫瘍の再発、または手術領域の再発はなかった。走査信号を増強した後、上記の領域には異常な増強信号が観察されていない。ネックＩＩおよびＩＩＩのダブル領域には、最大短径が１０ｍｍ以下の小さなリンパ節が複数示された。両側の顎下腺の形態と信号には異常がなかった。同時に、頸髄の形態やＣＴ信号も正常であった。患者は、少なくとも部分寛解（ＰＲ）を達成したようであった。治療中、患者００８では重度のＣＲＳ（例えば、レベル２以下のＣＲＳ）が観察されなかった。患者はＰＲを達成したと評価された。

患者００９は、甲状腺の神経内分泌癌を伴う低分化濾胞性乳頭癌と診断された。患者００９は、甲状腺二葉切除術を受け、その後診察を受けたところ、複数の肺転移が確認された。縦隔には複数の肥大したリンパ節が見られた。ＣＡＲＴ細胞を注入してから３０日後のＣＴ走査では、小さな腫瘍は消失し、２つの大きな腫瘍のサイズは７０％以上縮小した（表８を参照）。図３４は、大きな腫瘍が縮小し、小さな腫瘍が消失したことを示す（図３４の線と丸を参照）。患者はＰＲを達成したと評価された。

患者０１０は結腸直腸癌と診断され、ＣＡＲＴ細胞を注入する前に、８サイクルの化学療法に加え、手術など他の治療も行った。注入してから１ヶ月後、ＰＥＴ－ＣＴ走査の結果、ほとんどの標的病巣が大幅に減少し（５０％以上）、腫瘍減少量を総合的に計算すると４４．７％であったことが分かった。患者は、ＰＲを達成したと評価された（図３５の矢印を参照）。

患者０１１は、甲状腺癌と診断された。患者のＰＢＭＣを収集し、Ｐｒｏｄｉｇｙを用いて選別してＣＤ３＋細胞を得た後、それを６つの群に分けた。表１９に示すように、６つの群の細胞のそれぞれを、対応するベクターを含む培地と混合した。この６つの群の細胞では、ＣＤ１９ＣＡＲおよびＴＳＨＲＣＡＲの両方を発現する細胞はなかった。その後、適切な条件で、この６つの群の細胞を、ベクターを含まない培地で７日目まで培養し、細胞数を算出した。その後、各群から一定数の細胞を得て、表１９に示すように混合して細胞混合集団を得て、前記細胞混合集団を病院に搬送して注入した。図７３は、注入に応答した、患者０１１のＣＡＲＴ細胞を含むリンパ球、自然キラー（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）および単球の増加を示す。図７４および図７５は、細胞注入に応答した、患者０１１の各ＣＡＲＴ細胞の数とＣＡＲＴ細胞の総数の増加を示す。各ＣＡＲＴ細胞のコピー数を測定し、患者０１１の血液中の各種類のＣＡＲＴ細胞数とＣＡＲＴ細胞の総数を算出した。コピー数とフローサイトメトリーデータを用いて、線形回帰分析を行い、各ＣＡＲＴ細胞の数を算出した。線形回帰分析と各ＣＡＲＴ細胞増幅を図７５に示す。これらのデータおよび以前の患者のデータから、（１）ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が固形腫瘍ＣＡＲＴ細胞（例えば、ＴＳＨＲＣＡＲ）の増幅を増強し、（２）ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が、非ＣＡＲＴ細胞の増幅を増強した（図７３の個々のリンパ球数の増加を参照）ことがわかった。さらに、これらのデータは、この増強作用がＣＤ１９ＣＡＲの活性化によって引き起こされ、患者のインビボの免疫細胞（例えばＤＣ）によって媒介されることを示している。したがって、ＷＢＣ抗原（例えば、ＣＤ１９およびＢＣＭＡ）に結合するＣＡＲＴ細胞は、他のＴ細胞に基づく療法（例えば、ＮＫ、ＴＣＲおよびＴＩＬ）を増強するためにも使用することができる。例えば、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を、操作されたＴＣＲまたはＴＩＬを発現するＮＫおよび／またはＴ細胞群と組み合わせて患者に投与することができ、かつＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化は、患者におけるこれらのリンパ球の増幅を増強することができる。図７６は、細胞注入に応答した、患者０１１のサイトカイン放出を示す。

上記のインビトロの結果と本実施例のインビボの結果と組み合わせると、ＷＢＣ抗原を標的とするＣＡＲＴ細胞を活性化することで、固形腫瘍抗原を標的とするＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性を増強できることがわかる。

図７２は、０日目、１日目および４日目の患者００９における単球のＰＤＬ１発現を示す。混合ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ＋ｔＭｕｃ１ＣＡＲ、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＧＵＣＹ２ＣＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲ＋ＴＳＨＲＣＡＲ）を患者に注入する前および注入した後、複数の患者から単球を得た。フローサイトメトリーを用いて単球を分析し、ＰＤＬ１などのマーカーの発現を測定した。フローサイトメトリーの結果、混合ＣＡＲＴ細胞を注入した後の患者の単球では、ＰＤＬ１の発現がアップレギュレートした。その一例を図７２に示す。単球におけるＰＤＬ１のアップレギュレーションは、単球の活性化を示し、患者の免疫系が活性化されたことをさらに証明する。

＜実施例３．結合／混合したＴ細胞の活性化＞
混合ＣＡＲＴ細胞（結合ＣＡＲＴ細胞）は、活性化についてのアッセイを行うために、ＣＤ１９ＣＡＲとｔＭＵＣ１ＣＡＲ（第１群）、抗ＣＤ１９ＣＡＲとＡＣＰＰＣＡＲ（第２群）、およびＣＤ１９とＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲ（第３群）の３つの群に分けられた。健康なボランティアから末梢血を採取した。ＰａｎＴキットを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を選別し、１：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを加えた。その後、レンチウイルスでＣＤ３＋Ｔ細胞をトランスフェクトした。レンチウイルスとダイナビーズを除去し、新鮮な培地を加えた。ＣＡＲの比率と細胞の表現型を決定した。これらの３群の細胞におけるＣＡＲの発現を測定した。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞および標的細胞を選択し、２４時間または４８時間混合した。対応する細胞における様々なマーカーの発現を測定した。２０×１０^４個のＣＡＲＴ細胞と２０×１０^４個の基質細胞を２４時間共培養した。フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞におけるｈＣＡＲ（ヒト化ｓｃＦｖ）、ｍＣＡＲ（マウスｓｃＦｖ）、ＣＤ２５やＣＤ１３７などの分子の発現を測定した。例えば、ＣＤ２５およびＣＤ１３７の陽性染色は、Ｔ細胞が活性化されたことを示した。抗原活性化に応答して様々なＴ細胞から放出されるサイトカインの量を測定し、対応するＴ細胞のバックグラウンドを差し引いた。

表１１、１２および１３はそれぞれ、第１群、第２群と第３群のＣＡＲＴ細胞、および対応する基質細胞の情報を示す。例えば、ＣＡＲ１２０４はヒト化ＣＡＲであり、ヒトＣＡＲ抗体およびＣＤ１３７抗体で標識することができる。ＣＡＲ２４０７（ｔＭＵＣ１ＣＡＲ）はマウスＣＡＲであり、マウスＣＡＲ抗体およびＣＤ１３７抗体で標識して活性化することができる。ＣＡＲ１２０４を発現する細胞（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞）は、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞によって活性化されることができ、よって、ＣＤ１３７の発現がアップレギュレートされる。ＣＡＲ１２０４細胞、ＣＡＲ２４０７細胞、およびＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞を共培養してＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化を誘導した。ＣＤ１９ＣＡＲおよびｔＭＵＣ１ＣＡＲの結合ドメインはそれぞれ、配列番号５および配列番号７０を含む。２４０７ＣＡＲＴ細胞の活性化は、ＣＤ１３７の発現に基づいて検出および測定され、これはＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の間接的な活性化を証明する。

図３６はＫ１９細胞の存在下または非存在下でＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞とｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞とを共培養したフローサイトメトリー分析の結果を示す。

０日目に、健康なボランティアの末梢血を収集した。ＰａｎＴキットを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を選別し、１：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを収集したＣＤ３＋Ｔ細胞に加えた。１日目に、活性化したＣＤ３＋Ｔ細胞を２つの亜群に分け、各亜群をそれぞれ単一のＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲまたはｔＭＵＣ１ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスでトランスフェクトした。よって、ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＣＡＲＴ細胞亜群と、ｔＭＵＣ１ＣＡＲを発現するＣＡＲＴ細胞亜群との２つのＣＡＲＴ細胞亜群を得た。ＣＤ１９ＣＡＲおよびｔＭＵＣ１ＣＡＲの結合ドメインはそれぞれ、配列番号５および配列番号７０を含む。２日目に、レンチウイルスおよびダイナビーズを除去し、新鮮な培地を加えた。７日目に、ＣＡＲＴ細胞および標的細胞を２４時間共培養し、８日目に様々なアッセイを行った。細胞亜群を混合し、対応する基質細胞と共培養することができる（図３６－６０を参照）。

図３６は、異なる細胞培養物におけるＣＤ１３７の発現を示すヒストグラムを提供する。各細胞培養物において、ＣＡＲＴ細胞を対応する基質細胞と培養し、フローサイトメトリーによりＣＤ１３７の発現を測定した（ＧａｔｅｍＣＡＲ＋：ｔＭＵＣ１ＣＡＲ）。細胞培養物は、（１）ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞およびＫ１９、（２）ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞、Ｋ１９およびＰＢＭＣ、（３）ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＫ１９、（４）ｔＭＵＣ１ＣＡＲＣＡＲＴ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、Ｋ１９およびＰＢＭＣを含む。さらにＣＤ８＋Ｔ細胞をカウントした。図３６に示すように、Ｋ１９の存在下では、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の活性化（すなわち、ＣＤ１３７発現）が観察され、かつＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の活性化レベルは、単一群の活性化レベルよりも高い。さらに、ＰＢＭＣを加えた後の活性化レベルがより高くなった（例えば、ＣＤ１３７のＭＦＩ）。これらの結果から、Ｋ１９によるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化は、ｔＭＵＣ１ＣＡＲが結合する抗原（ｔＭＵＣ１）の非存在下でｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞を活性化することができ、かつ、この活性化はＰＢＭＣの存在によって増強されることが示された。実験結果は、差の測定のための主な根拠とする発現率に基づく（左図）。割合の差が有意でない場合は、発現強度（ＭＦＩ）を差の測定基準としている（右図）。

図３７は、図３６に記載の細胞培養物におけるＰＢＭＣおよび単球の活性化を示す。単球（ＣＤ１４＋）および活性化単球（ＣＤ１４＋ＣＤ８０＋）のフローサイトメトリーアッセイをＰＢＭＣで実施し、図３７は、アッセイの統計分析ヒストグラムを示す。ｈ１９ＣＡＲはヒト化ＣＤ１９ＣＡＲであり、細胞培養物は、（１）単一のＰＢＭＣ、（２）ＰＢＭＣ＋Ｋ１９、（３）ＰＢＭＣおよびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、（４）ＰＢＭＣ、Ｋ１９及びＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を含む。図３７に示すように、最後の１群のＰＢＭＣは、活性化（ＣＤ８０の発現）を示した。これらの結果は、ＣＡＲＴ細胞の活性化が、単球を含むＰＢＭＣを活性化できることを示す。図３６および３７に示す結果を組み合わせると、Ｋ１９によるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化は、ｔＭＵＣ１ＣＡＲが結合する抗原の非存在下でｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞を活性化し、このような活性化は少なくとも部分的にＰＢＭＣを介して媒介され得ることが示される。

図３８は、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によるＩＦＮγ放出を示すヒストグラムを提供する。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。前記図は、対流グラフ（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅｇｒａｐｈ）を統計的に分析したものである。これらのアッセイでは、対照としてＮＴ（非トランスフェクトされたＴ細胞）を用いた。対照と比較して、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞を含む細胞培養物では、ＣＤ１９ＣＡＲＴおよびＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞における細胞内ＩＦＮγの増加が見られたことから、Ｋ１９で活性化されたＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞がＩＦＮγを放出し、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞を活性化してＩＦＮγを放出したことが示された。ＰＢＭＣ群は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞から放出されるＩＦＮγの比率をアップレギュレートした。単一のＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲまたはｔＭＵＣ１ＣＡＲ）を発現した細胞と比較して、結合ＣＡＲ群で蓄積されたＩＦＮγがより多く、かつＰＢＭＣを加えることでこの作用をアップした。ｍＣＡＲ群はすべてＣＤ１９ＣＡＲ陽性細胞ではなく、その統計値は相対的なものである。その結果、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化により、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞がより多くのＩＦＮγを発現し、それによって、ｔＭＵＣ１ＣＡＲが結合する抗原（ｔＭＵＣ１）の非存在下でＩＦＮγを放出することを示している。

図３９は、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によるＧＺＭＢ放出を示すヒストグラムを提供する。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。フローサイトメトリーアッセイでは、活性化したＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞によるＧＺＭＢ放出が示された。対流グラフの統計分析（ＭＦＩ割合比較）から、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化はＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞にＧＺＭＢを放出させることができ、そのような放出はＰＢＭＣの存在下で増強されることがわかる。ｍＣＡＲ群はすべてＣＤ１９ＣＡＲ陽性細胞ではなく、その統計値は相対的なものである。これらの結果は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化によって、ＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞が細胞内ＧＺＭＢを放出することを示す。

図４０および４１は、様々な実施形態におけるＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。ＣＦＳＥ反応を行い、細胞増殖のレベルを示すために使用した。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。図４０に示すように、１行目は２つの基質細胞と共培養した結合ＣＡＲＴ細胞の実験群であり、２行目は２つの基質細胞と共培養したＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の対照群である。１行目および２行目における３列目と４列目に示すように、Ｋ１９でＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を活性化することで、ＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増殖が誘導される。５列目および６列目は、ＭＣＦ－７がＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増殖を活性化して誘導することを示す。図４１は、図４０に示すフローサイトメトリーの結果を示す。体積較正を行い、ｔＭＵＣ１ＣＡＲ細胞集団をゲート制御し、各群のｔＭＵＣ１ＣＡＲの細胞数を統計分析した。図４１に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞を含む群の細胞数は対照群に比べてより多く、ＰＢＭＣの存在下でのＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞を含む群の増殖が最も高いことがわかった。この結果から、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化がＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増殖を増強することができ、この増強作用が、ＰＢＭＣを介して増強および／または媒介できることを示している。

図１２は様々な実施形態におけるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。ＣＦＳＥ反応を行い、細胞増殖のレベルを示すために使用した。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞、ＭＣＦ－７を含む細胞群は、ＰＢＭＣの存在または不存下で、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖が認められた。これらの結果から、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の活性化がＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖を増強することができ、この増強作用がＰＢＭＣを介して増強および／または媒介できることを示している。図４０－４２に示す結果を組み合わせると、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の混合物は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞またはｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の活性化がさらに互いに活性化して、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増殖および／またはＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞とｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞によるサイトカインの放出を増強するように、ＰＢＭＣを介してフォワード循環を形成している可能性があり、この増強作用はＰＢＭＣによって媒介および／または増強される可能性がある（図６２を参照）。これらの結果をもたらす理由として、単一種類のＣＡＲＴ細胞を含む細胞集団を注入した被検体よりも、結合ＣＡＲＴ細胞を含む細胞集団を注入した被検体（例えば、患者００１－００３）において、ｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞の増幅程度がより高いというように解釈することもできる。結合ＣＡＲＴ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびｔＭＵＣ１ＣＡＲＴ細胞）は、このような増強された細胞増幅に寄与することができる。

図４３は、実施形態におけるサイトカインの放出を示す。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。図４３に示すように、対照群のＩＦＮ－γ放出は限られている。結合ＣＡＲ群と単一のＣＡＲ群は、それぞれ実線と点線で表表されている。放出されたＩＦＮ－γのレベルは、ＰＢＭＣがない場合、類似する。ＰＢＭＣを加えると、放出されるＩＦＮ－γのレベルが増加した。ＩＬ６は主にＰＢＭＣによって分泌され、活性化したシステムではその放出量が増加した。ここで、ｔＭＵＣ１ＣＡＲのサイトカインの放出量は比較的少なかった。

図４４は様々な細胞培養物におけるＣＤ１３７発現の他のヒストグラムを示す。０日目に、健康なボランティアの末梢血を収集した。ＰａｎＴキットで選別してＣＤ３＋Ｔ細胞を収集し、１：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを収集したＣＤ３＋Ｔ細胞に加えた。１日目に、それぞれＣＤ１９ＣＡＲおよびＡＣＰＰＣＡＲをコードするレンチウイルスでＣＤ３＋Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＣＤ１９ＣＡＲおよびＡＣＰＰＣＡＲの結合ドメインはそれぞれ、配列番号５および配列番号４８９を含む。２日目に、レンチウイルスおよびダイナビーズを除去し、新鮮な培地を加えた。７日目に、ＣＡＲＴ細胞および標的細胞を２４時間共培養し、８日目に様々なアッセイを行った。フローサイトメトリーアッセイを行い、その結果、ＣＤ１９ＣＡＲおよびＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞の発現を示した。図４４に示すように、ＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞の活性化がより高く、ＰＢＭＣの存在下で活性化が増加した。これらの結果から、ｎａｌｍ６によるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化が、ＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞を活性化することができ、この作用がＰＢＭＣによって増強されることを示している。

図４５は、活性化分析のフローサイトメトリーアッセイを示す。ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを使用して、ＣＡＲＴ細胞を４つの状態に分けることができる。Ｎａｌｍ６は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞上のＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌの発現を活性化することができ、かつ、ＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞におけるエフェクター細胞の割合が増加した。これらの結果から、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化がＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞を機能的な状態にするように誘導し、それがＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞の事前活性化として作用したことを示している。

図４６は図４４に記載の細胞培養物におけるＰＢＭＣおよび単球の活性化を示す。フローサイトメトリーアッセイは、ＰＢＭＣにおける単球（ＣＤ１４＋）と活性化単球（ＣＤ１４＋およびＣＤ８０＋）を示した。ｈ１９ＣＡＲは、ヒト化ＣＤ１９ＣＡＲであり、これらの群は、（１）単一のＰＢＭＣ、（２）ＰＢＭＣ＋Ｋ１９、（３）ＰＢＭＣとＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、（４）ＰＢＭＣ、Ｋ１９とＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を含む。これらの結果は、ＣＡＲＴ細胞の活性化がＰＢＭＣの活性化につながることを示している。

図４７は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化により、ＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞が細胞内ＩＦＮγを放出することを示す。上記と同様に、７日目に様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。この２つのＣＡＲＴ細胞が存在し、かつシステムにＰＢＭＣが存在する場合、ＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞はさらに増強したＩＦＮγ放出を示した。

図４８および図４９は、細胞培養物で細胞を２４時間共培養した後のサイトカインの放出を示す。対照群では、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＧＺＭＢの放出量は限られている。結合ＣＡＲ群（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞とＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞）および単一のＣＡＲ群（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞またはＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞）は、それぞれ実線と点線で表されている。放出されるＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＧＺＭＢレベルは、ＰＢＭＣがない場合に、類似する。ＰＢＭＣを加えると、放出されるＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＧＺＭＢの量が増加した。ＩＬ６は主にＰＢＭＣによって分泌され、ＰＢＭＣの存在下で結合ＣＡＲ群におけるサイトカインの放出量が増強した。

図５０は、異なる細胞培養物におけるＣＤ１３７発現を示す他のヒストグラムを提供する。０日目に、健康なボランティアの末梢血を収集した。ＰａｎＴキットを用いてＣＤ３＋Ｔ細胞を選別し、１：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを加えた。１日目に、それぞれＣＤ１９ＣＡＲおよびＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲをコードするレンチウイルスでＣＤ３＋Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＣＤ１９ＣＡＲおよびＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲの結合ドメインはそれぞれ、配列番号５および配列番号３７を含む。２日目に、レンチウイルスおよびダイナビーズを除去し、新鮮な培地を加えた。７日目に、ＣＡＲＴ細胞および標的細胞を２４または４８時間共培養し、８日目に様々なアッセイを行った。図５０に示すように、ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の活性化がより高く、ＰＢＭＣの存在下で活性化が増加した。これらの結果は、Ｋ１９によるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化が、ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞を間接的に活性化することができ、この作用がＰＢＭＣによって増強されることを示している。

図５１ＫＡＴＯ３＋細胞と４８時間共培養した各種ＣＡＲＴ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ヒストグラムから、ＫＡＴＯ３＋細胞の存在下で、結合ＣＡＲＴ群（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲ）におけるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化レベルは、単一のＣＡＲＴ群（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲ）よりも高いことがわかる。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化レベルは、ＰＢＭＣの存在下で活性化された後の方が高かった（例えば、ＣＤ２５和ＣＤ１３７の比率）ことから、ＫＡＴＯ３＋細胞によるＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の活性化により、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を活性化し得、この作用はＰＢＭＣによって増強されたことが示された。ＣＤ４０Ｌは主にＣＤ４Ｔ細胞によって発現される（Ｂ細胞、活性化単球、ＤＣなどのＰＢＭＣにおけるＣＤ４０Ｌ＋細胞と相互作用する）。その結果、ＫＡＴＯ３＋細胞によるＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の活性化は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞によるＣＤ４０Ｌの発現をアップレギュレートし、Ｂ細胞および単球を活性化することができることがわかる。この作用はＰＢＭＣによって増強された。

図５２は図５０に記載のシステムにおけるＰＢＭＣおよび単球の活性化を示す。ｈ１９ＣＡＲはヒト化ＣＤ１９ＣＡＲであり、これらの群は、（１）単一のＰＢＭＣ、（２）ＰＢＭＣおよびＫ１９、（３）ＰＢＭＣおよびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞、（４）ＰＢＭＣ、Ｋ１９およびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を含む。図５２に示すように、最後列のＰＢＭＣが活性化を示しており、ＣＡＲＴ細胞の活性化がＰＢＭＣを活性化することができることを示している。

図５３および５４は、ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の活性化により、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が細胞内ＩＦＮγを放出することを示す。図３９に示すものと同様に、結合ＣＡＲＴ細胞群（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲ）から放出されるＩＦＮγ量は、単一種類のＣＡＲＴ細胞群（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲ）よりも多く、ＰＢＭＣの添加によりこの作用をアップレギュレートすることができる。

図５５は、様々な細胞培養物に対する殺傷アッセイを示す。２つの基質細胞の開始量は、２．０×１０^５／６００ｕｌまたは３．３３×１０^５／ｍｌである。図５５は、殺傷の３日後の基質細胞の細胞密度を示す。ＰＢＭＣは基質細胞の殺傷を助け、結合ＣＡＲＴ細胞群（ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲ）は、単一のＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞または単一のＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の殺傷効果を増強した。ＰＢＭＣの存在下で、結合ＣＡＲＴ細胞はより優れた殺傷効果を発揮したことから、活性化したＣＡＲＴ細胞がＰＢＭＣを活性化し、さらに結合ＣＡＲＴシステムにおける一種類のＣＡＲＴ細胞が活性化されると、結合ＣＡＲＴ細胞群における別の種類のＣＡＲＴ細胞をさらに活性化してサイトカインを放出し、有効性を増強することを示している。

図５６はＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。さらに、ＣＦＳＥ反応を測定し、増殖レベルを評価した。図５６に示すように、１行目は、２つの基質細胞と共培養した結合ＣＡＲを含む実験群であり、２行目は、２つの基質細胞と共培養したＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲを含む対照群である。図５６は、Ｋ１９によるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の活性化が、ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の増殖を誘導することを示す。ＫＡＴＯ３細胞は、ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞によって効果的に活性化されて増殖することができる。ＰＢＭＣの存在は、増殖をさらに増強することができる。結果から、ＣＤ１９ＣＡＲは、結合ＣＡＲ群のＫ１９によって効果的に活性化され、かつ活性化されたＣＤ１９ＣＡＲＴは、ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞を活性化してＣＬＤＮ１８．２細胞の増殖を促進することができ、これはＰＢＭＣによってさらに増強されることがわかった。

図５７は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。さらに、ＣＦＳＥ反応を測定し、増殖レベルを評価した。図５７に示すように、１行目は、２つの基質細胞と共培養した結合ＣＡＲＴ細胞を含む実験群であり、２行目は、２つの基質細胞と共培養したＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を含む対照群である。図５７は、ＫＡＴＯ３＋細胞によるＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞の活性化が、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖を誘導できることを示す。５列目および６列目は、ＰＢＭＣがＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖をさらに増強することができることを示す。結果から、ＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞は、結合ＣＡＲ群のＫＡＴＯ３＋細胞によって活性化され、かつ活性化されたＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を活性化してＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の増殖を促進することができ、これはＰＢＭＣによってさらに増強されることが分かった。

図５８－６０は、様々な細胞培養物におけるサイトカイン放出を示す。７日目に、様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。示すように、対照群ではＩＬ１２、ＩＦＮγおよびＧＺＭＢの放出量が限られている。結合ＣＡＲＴ細胞群および単一のＣＡＲＴ細胞群は、それぞれ実線と点線で表されている。放出されるＩＬ１２、ＩＦＮγおよびＧＺＭＢの量は、ＰＢＭＣがない場合に、類似する。ＰＢＭＣを加えると、放出されるＩＬ１２、ＩＦＮ－γおよびＧＺＭＢの量が増加した。

図８４は様々な細胞培養物におけるＣＤ１３７発現の他のヒストグラムを示す。０日目に、健康なボランティアの末梢血を収集した。ＰａｎＴキットで選別してＣＤ３＋Ｔ細胞を収集し、１：１の比率でＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを収集したＣＤ３＋Ｔ細胞に加えた。１日目に、それぞれＢＣＭＡＣＡＲおよびＧＵＣＹ２ＣＣＡＲのレンチウイルスでＣＤ３＋Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＣＤ１９ＣＡＲおよびＡＣＰＰＣＡＲの結合ドメインはそれぞれ、配列番号６０および配列番号４８８を含む。２日目に、レンチウイルスおよびダイナビーズを除去し、新鮮な培地を加えた。７日目に、ＣＡＲＴ細胞および標的細胞（例えば、８２２６）を２４時間共培養し、８日目に様々なアッセイを行った。フローサイトメトリーアッセイを行い、その結果、ＣＤ１９ＣＡＲおよびＡＣＰＰＣＡＲＴ細胞の発現を示した。図８４に示すように、ＧＵＣＹ２ＣＣＡＲＴ細胞の活性化がより高く、ＰＢＭＣの存在下で活性化が増加した。これらの結果から、８２２６によるＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞の活性化が、ＧＵＣＹ２ＣＣＡＲＴ細胞を活性化することができ、この作用がＰＢＭＣによって増強されることを示している。ＰＢＭＣにはＢＣＭＡを含むＢ細胞やプラズマ細胞が含まれているため、ＰＢＭＣはＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を活性化することができる。ＰＭＢＣによるＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞の活性化は、ＧＵＣＹ２ＣＣＡＲＴ細胞によって増強される。

図８５はＧＵＣＹ２ＣＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。７日目に様々な細胞を培養し、８日目にフローサイトメトリーアッセイを行った。さらに、ＣＦＳＥ反応を測定し、増殖レベルを評価した。ＰＭＢＣはＢ細胞およびプラズマ細胞を含み、前記Ｂ細胞およびプラズマ細胞はＢＣＭＡを含む。図８５に示すように、ＰＭＢＣによるＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞を活性化することで、ＧＵＣＹ２ＣＣＡＲＴ細胞の増殖を誘導することができる。

図８６は、細胞培養物において、細胞を２４時間共培養した後のサイトカイン放出を示す。対照群では、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＧＺＭＢの放出量が限られている。放出されるＩＬ－６およびＧＺＭＢレベルは、ＰＢＭＣがない場合に、類似する。ＰＢＭＣを加えると、放出されるＩＬ－６およびＧＺＭＢの量が増加した。ＰＢＭＣの存在下で、結合ＣＡＲ群におけるサイトカインの放出量が増強した。

ＮＹ－ＥＳＯ－１形質導入されたＴ細胞（ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳまたは８３０２）およびＡＦＰ形質導入されたＴ細胞（ＡＦＰＴＣＲＴＳまたはＤＷ１０５）を、それぞれＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（１２３４）と混合し、様々な対応する標的細胞（例えば、Ｋ１９：Ｋ５６２－ＣＤ１９）と共培養した。図７８は、フローサイトメトリーを用いて、目的遺伝子の表現型および発現を決定することを示す。混合細胞を７日間共培養した後、フローサイトメトリーを用いて、細胞の表現型と目的遺伝子の発現を検出した。例えば、（Ａ）生細胞のおおよその範囲を画定し、（Ｂ）接着細胞を除去し、（Ｃ）ＤＡＰＩ染色を行って生細胞集団を画定し、（Ｄ）ＣＤ３陽性細胞集団（すなわち、Ｔ細胞）を画定した。フローサイトメトリーを用いて、細胞表現型とＣＡＲ発現を決定した。ＮＴ（ＣＡＲを発現しないＴ細胞）群およびＣＤ１９ＣＡＲＴ群では、ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳおよびＡＦＰＴＣＲＴＳのＣＤ８の割合は、それぞれ７０．３２％、５６．４４％、７３．８５％および７２．７４％であった。ＣＤ１９ＣＡＲの発現率は６３．７１％、ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲの発現率は８８．８０％、ＡＦＰＴＣＲの発現率は７１．６１％であった。細胞の発現表現型は正常であり、ＣＤ１３７の発現率は低く、細胞は既に休眠状態にあり、その後の実験に使用することができる。

図７９は、フローサイトメトリーを用いて共培養された細胞を識別することを示す。共培養した後の２つのＴ細胞を区別するために、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞をＶＩＯＬＥＴで染色し、紫色の蛍光で標識した。細胞をフローサイトメトリーＶ４５０－ＰＢチャンネルで２つの群に分け、陽性群はＣＤ１９ＣＡＲ細胞、陰性群はＮＹＥＳＯ－１／ＡＦＰＴＣＲＴＳ（Ｃ）であった。ＣＤ３陽性群はＴ細胞であった。

図８０は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の活性化に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。異なる細胞群を２４時間共培養し、フローサイトメトリーを用いてこれらの細胞の活性化を測定した。対照群ＮＣでは、ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳの活性化は非常に低かった（１．４３％ＭＦＩ＝５５５９）。ＰＣ群では、ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳの活性化は正常であった（１５．０２％、ＭＦＩ＝２３３０１）。Ａ群のＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳの活性化（２．５６％，ＭＦＩ＝６０８７）は、ＮＣ群よりも高かった（１０２および１０４を参照）。Ｂ群のＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳの活性化（５．２８％，ＭＦＩ＝１２３５２）は、Ａ群（２．５６％，ＭＦＩ＝６０８７）よりも高かった（１０６および１０８を参照）。Ｃ群のＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳの活性化（６．８０％，ＭＦＩ＝１２３５２）は、Ｂ群（５．２８％，ＭＦＩ＝１２３５２）よりも高かった（１１０および１１２を参照）。Ｃ群のＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳの活性化は、Ａ群よりも高かった（１１４および１１６を参照）。

図８１はＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の増殖に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。異なる細胞群を９６時間共培養し、フローサイトメトリーを用いてこれらの細胞の増殖を測定した。細胞増殖の比較を行った。ＮＣ対照群では、ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳ細胞の増殖率は２．４６％であった。Ａ群では、ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳ細胞の増殖率は２８．１７％であり、ＮＣ群と比較して増加した（２０２を参照）。Ｂ群ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳ細胞の増殖率は４１．６０％であり、Ａ群よりも高かった（２０４を参照）。Ｃ群ＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳ細胞の増殖率は４７．７９％であり、Ｂ群の４１．６０％よりも高く（２０６を参照）、かつＡ群よりも高かった（２０８を参照）。

図８２はＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＡＦＰＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の活性化に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。異なる細胞群を２４時間共培養し、フローサイトメトリーを用いてこれらの細胞の活性化を測定した。対照群ＮＣのＡＦＰＴＣＲＴＳは、活性化されなかった（０．７０％ＭＦＩ＝４５６８）。ＰＣ群ＡＦＰＴＣＲＴＳの活性化は正常であった（３８．５８％、ＭＦＩ＝２３３２７）。Ａ群ＡＦＰＴＣＲＴＳの活性化（１．２４％，ＭＦＩ＝４８８４）は、ＮＣ群よりも高かった（３０２および３０４を参照）。Ｂ群ＡＦＰＴＣＲＴＳの活性化（４．１７％，ＭＦＩ＝１３１１２）は、Ａ群（１．２４％，ＭＦＩ＝４８８４）よりも高かった（３０６および３０８を参照）。Ｃ群ＡＦＰＴＣＲＴＳの活性化（６．４７％、ＭＦＩ＝１４２１８）は、Ｂ群（４．１７％，ＭＦＩ＝１３１１２）よりも高く（３１０および３１２を参照）、かつＡ群よりも高かった（３１４および３１６を参照）。さらに、ＴＣＲ陰性のＴ細胞も部分的に活性化された（ＮＣ＝０．５１％、Ａ＝１．４６％、Ｂ＝２．８４％、Ｃ＝５．１２％）。群間の関係は、陽性部分と同じであった。

図８３はＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＡＦＰＴＣＲＴＳを含む共培養細胞の増殖に関するフローサイトメトリー分析の結果を示す。異なる細胞群を９６時間共培養し、フローサイトメトリーを用いてこれらの細胞の活性化を測定した。細胞増殖の比較を行った。ＮＣ対照群ＡＦＰＴＣＲＴＳの増殖率は３．１１％であった。Ａ群ＡＦＰＴＣＲＴＳの増殖率は３６．４４％で、ＮＣ群に比べて増加した（４０２）。Ｂ群ＡＦＰＴＣＲＴＳの増殖率は３９．５９％で、Ａ群の３６．４４％よりも高かった（４０４）。Ｃ群ＡＦＰＴＣＲＴＳの増殖率は５１．９７％で、Ｂ群の３９．５９％よりも高く（４０６）、かつＡ群よりも高かった（４０８）。よって、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞は、その増殖率を高めることで、ＴＣＲＴ細胞の増幅が増強される。

これらのデータは、結合ＣＡＲＴ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞およびＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲＴ細胞）において、活性化した第１の種類のＣＡＲＴ細胞が、第２の種類のＣＡＲＴ細胞を活性化できることを示している。例えば、活性化された第１の種類のＣＡＲＴ細胞は、第２の種類ＣＡＲＴ細胞の活性化、サイトカイン放出、および細胞増殖を増強した。この作用は、ＰＢＭＣが存在する場合に増強された。ＰＢＭＣと単球が活性化された以上、第１の種類のＣＡＲＴ細胞は単球（例えばＤＣ）を活性化し、次に第２の種類のＣＡＲＴ細胞を活性化することができる。ここで提供されたデータおよび本開示のインビボの実施例で示されたデータを組み合わせると、被検体の樹状細胞（ＤＣ）は媒介として、第１の種類ＣＡＲＴ細胞の活性化を第２の種類ＣＡＲＴ細胞の活性化と関連付け、かつフォワード活性化の循環を形成し、免疫恒常性の増幅により、被検体（患者００４－０１１）に観察されたＣＡＲＴ細胞の増幅に寄与する可能性があることが示される。これらのデータおよび上記の臨床データは、結合または混合Ｔ細胞が、Ｔ細胞増幅および／またはサイトカイン放出を含むＴ細胞応答の増強を達成することを示している。結合または混合Ｔ細胞の例としては、ＢＣＭＡとＧＵＣＹ２ＣＣＡＲＴ細胞、およびＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞とＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳが含まれる。混合Ｔ細胞を患者に注入した後、第１群のＴ細胞（例えば、ＣＤ１９およびＢＣＭＡＣＡＲＴ細胞）は、Ｂ細胞抗原に結合し、活性化される。活性化後、第１群のＣＡＲＴ細胞は、特定の細胞膜分子（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ４０Ｌなど）をアップレギュレートし、かつ特定のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγおよびＧＭ－ＣＳＦ）を放出する。これらの表面分子やサイトカインは、単球（例えばＤＣ）や好中球などの細胞を活性化および／またはリクルートする。リクルートおよび／または活性化された細胞は、放出サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ１２）を放出し、炎症様環境を形成する。炎症様環境により、これらの活性化された免疫細胞は、いくつかのタンパク質（例えばＣＤ８０、ＣＤ８０およびＣＤ４０）をアップレギュレートし、前記タンパク質は、第２群のＴ細胞（例えばＮＴ、固形腫瘍を標的としたＣＡＲＴ細胞およびＮＹＥＳＯ－１ＴＣＲＴＳ）を活性化する。さらに、第１群のＴ細胞によって分泌されるサイトカイン（例えばＩＦＮγ）も、第２群のＴ細胞を活性化する。

＜実施例４．ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣａｓ９を用いた改変細胞＞
複数の遺伝子特異的ＺＦＮは、突然変異の部位特異的導入を可能にするために構築された。基本的にＭａｌａら（２００５）ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ３３５（２）：４４７－５７，Ｌｉｕら（２００２）ＪＢｉｏＣｈｅｍ２７７（６）：３８５０－６，Ｓａｎｄｅｒら（２０１１）ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．８（１）：６７－９，Ｕｒｎｏｖら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５（７０４２）：６４６－６５１および米国特許公開第２００８／０１３１９６２号に記載するように、様々なＺＦＮを設計してプラスミドベクターに組み込んでいる。ＺＦＮは、表１４および表１５に記載された、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ左結合ドメインおよびＺＦＮ右結合ドメイン）の様々な組み合わせを含んでいた。ＺＦＮの開裂ドメインは、操作されたＦｏｋＩ開裂ドメイン（配列番号２８０、２８１または２８２）を含む。

ＺＦＮ左腕プラスミドベクターおよびＺＦＮ右腕プラスミドベクターを、それぞれｆｕｇｅｎｅトランスフェクト試薬を用いてＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。２４時間トランスフェクトした後、Ｈｅｌａ細胞を１ μｇ／ｍｌのピューロマイシンで４８時間処理し、ＺＦＮに富んだ細胞を得た。その後、Ｈｅｌａ細胞を収集した。様々な遺伝子（すなわち、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＦＯＸＰ３、ＳＩＶＡ１またはＬＧＡＬＳ９）およびＨｅｌａ細胞ゲノムに特異的なプライマーをテンプレートとして用い、ＰＣＲによってＺＦＮを含む溶解したＤＮＡフラグメントを増幅した。フォワードプライマーを用いてＤＮＡフラグメントを配列決定した。ＤＮＡフラグメントをベクターにクローニングした。約３０個のモノクローナル細胞を有するＤＮＡフラグメントを配列決定し、そのＤＮＡフラグメントに突然変異が含まれているかどうかを決定した。配列決定の結果を表１５に示す。

複数の遺伝子特異的ＺＦＮは、突然変異の部位特異的導入を可能にするために構築された。基本的にＭａｌａら（２００５）ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ３３５（２）：４４７－５７；Ｌｉｕら（２００２）ＪＢｉｏＣｈｅｍ２７７（６）：３８５０－６；Ｓａｎｄｅｒら（２０１１）ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．８（１）：６７－９；Ｈａｎｄｅｌら（２００９）ＭｏｌＴｈｅｒ．Ｊａｎ；１７（１）：１０４－１１；Ｕｒｎｏｖら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５（７０４２）：６４６－６５１および米国特許公開第２００８／０１３１９６２号に記載するように、様々なＺＦＮを設計してプラスミドベクターに組み込み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＺＦＮは、表１６に記載された、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ左結合ドメインおよびＺＦＮ右結合ドメイン）の様々な組み合わせを含んでいた。ＺＦＮの開裂ドメインは、操作されたＦｏｋＩ開裂ドメイン（配列番号：９６、９７または９８）を含んでいた。

ＺＦＮ左腕プラスミドベクターおよびＺＦＮ右腕プラスミドベクターを、それぞれｆｕｇｅｎｅトランスフェクト試薬を用いてＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。２４時間トランスフェクトした後、Ｈｅｌａ細胞を１ μｇ／ｍｌのピューロマイシンで４８時間処理し、ＺＦＮに富んだ細胞を得た。その後、Ｈｅｌａ細胞を収集した。様々な遺伝子（すなわち、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ）およびＨｅｌａ細胞ゲノムに特異的なプライマーをテンプレートとして用い、ＰＣＲによってＺＦＮを含む溶解したＤＮＡフラグメントを増幅した。フォワードプライマーを用いてＤＮＡフラグメントを配列決定した。ＤＮＡフラグメントをベクターにクローニングした。約３０個のモノクローナル細胞を有するＤＮＡフラグメントを配列決定し、そのＤＮＡフラグメントに突然変異が含まれているかどうかを決定した。配列決定の結果を表１８に示す。Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子での部位特異的変異導入を可能にするように構築されたＴＲＡＣ特異的ＺＦＮで導入された。基本的にＵｒｎｏｖら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３５（７０４２）：６４６－６５１；Ｌｏｍｂａｒｄｏら（２００７）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２５（１１）：１２９８－３０６および米国特許公開第２００８／０１３１９６２に記載するように、様々なＺＦＮを設計してプラスミドベクターに組み込み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＺＦＮは、表１７に記載された、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ左結合ドメインおよびＺＦＮ右結合ドメイン）の様々な組み合わせを含んでいた。ＺＦＮの開裂ドメインは、ＦｏｋＩ開裂ドメイン（配列番号９６、９７または９８）を含む。１対のＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（表１７を参照）を形質導入細胞に導入し、ＴＣＲ鎖に関連する標的ゲノム遺伝子座を改変した。

ＣＩＩＴＡ用のＴＡＬＥＮは、エクソン２（２Ｌ１：ｇｃｔｇａｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔ（配列番号４２６）；２Ｌ２：ｇａｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｃｔ（配列番号４２７）；２Ｒ１：ｃｔｃｃａｇｃｃａｇｇｔｃｃａｔｃｔ（配列番号４１９）；２Ｒ２：ｔｃｔｃｃａｇｃｃａｇｇｔｃｃａｔ（配列番号４２０））およびエクソン３（３Ｌ１：ｔｃａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｇｔ（配列番号４２１）；３Ｌ２：ｔｃａｇｃａｇｇｃｔｇｔｔｇｔｇｔ（配列番号４２２）；３Ｒ１：ｃｃｃｔｇｇｔｃｔｃｔｔｃａｔ（配列番号４２３）；３Ｒ２：ａａｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇｔｃｔｔ（配列番号４２４）；３Ｒ３：ａａｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇｔｃｔ（配列番号４２５））を標的とするように設計された。前記のように、ＴＡＬＥＮはＦａｓｔＴＡＬＥＴＡＬＥＮ組立キット（Ｓｉｄａｎｓａｉ）を用いて構築し、２９３Ｔ細胞でその活性を確認した。構築したＴＡＬＥＮトランスフェクトを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で選択した。選択後、２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを採取した。その後、ＰＣＲと配列決定を行い、ＴＡＬＥＮの効率を検出した。ｆｕｇｅｎｅトランスフェクト薬剤を使用し、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現するプラスミドを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。７２時間後、２９３Ｔ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＢ２ｍとＨＬＡタンパク質の発現を検出した。

本明細書で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれたことが明確かつ個別的に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。上記のことを様々な実施形態で説明したが、当業者は、その精神から逸脱することなく、様々な修正、置換、省略および変更が可能であることを理解するべきである。

Claims

第１の抗原に結合する第１のＣＡＲを含む第１の細胞集団と、第２の抗原に結合する第２のＣＡＲを含む第２の細胞集団とを含み、ここで、前記第２の抗原が腫瘍抗原であり、かつ前記第１の抗原と異なる、組成物。
腫瘍抗原を発現する癌形態を有する被検体に、請求項１に記載の組成物の有効量を投与することを含む、請求項１に記載の組成物の用途、またはそれを必要とする被検体における細胞増幅を増強するまたは癌を有する被検体を治療する方法。
前記組成物を投与した前記被検体における前記第２の細胞集団の増幅が、前記第１の細胞集団ではなく前記第２の細胞集団を投与した被検体における前記第２の細胞集団の増幅よりも大きい、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記増幅が、第２の細胞集団の数または前記第２のＣＡＲをコードするＤＮＡのコピー数に基づいて測定される、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞である、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記第１の抗原が、白血球（ＷＢＣ）の細胞表面分子、腫瘍抗原または固形腫瘍抗原を含む、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記ＷＢＣが、顆粒球、単球またはリンパ球である、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記ＷＢＣがＢ細胞である、請求項６に記載の組成物または方法。
前記ＷＢＣの前記細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である、請求項６に記載の組成物または方法。
前記ＷＢＣの前記細胞表面分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、請求項６に記載の組成物または方法。
前記ＷＢＣの前記細胞表面分子が、ＣＤ１９またはＢＣＭＡである、請求項６に記載の組成物または方法。
前記腫瘍抗原が固形腫瘍抗原である、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記固形腫瘍抗原が、腫瘍関連ＭＵＣ１（ｔＭＵＣ１）、ＰＲＬＲ、ＣＬＣＡ１、ＭＵＣ１２、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＧＰＲ３５、ＣＲ１Ｌ、ＭＵＣ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＭＵＣ２１、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＣＤ２０７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＦＣ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＳＴＲ１、ＧＰＲ２７、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＣＬＤＮ１８．２、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＣＥＡ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＩＬ１３－Ｒα２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＧＤ２、ＦＲ－α、ＥｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７－Ｈ３またはＥＧＦＲである、請求項１２に記載の組成物または方法。
前記固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ１、ＡＣＰＰ、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＵＰＫ２、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＳＭＡ、ＤＰＥＰ３、ＣＸＣＲ５、Ｂ７－Ｈ３、ＭＵＣ１６、ＳＩＧＬＥＣ－１５、ＣＬＤＮ６、Ｍｕｃ１７、ＰＲＬＲまたはＦＺＤ１０を含む、請求項１２に記載の組成物または方法。
前記固形腫瘍抗原が、ｔＭＵＣ１、ＡＣＰＰ、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＵＰＫ２またはＣＬＤＮ１８．２を含む、請求項１２に記載の組成物または方法。
前記ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に結合するリガンドの細胞内ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物または方法。
前記第１のＣＡＲが、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含み、前記第２のＣＡＲが、ｔＭＵＣ１、ＡＣＰＰ、ＴＳＨＲ、ＧＵＣＹ２ＣまたはＣＬＤＮ１８．２に結合するｓｃＦｖ、４－１ＢＢまたはＣＤ２８の細胞内ドメインおよびＣＤ３ζドメインを含む、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号５の配列を含み、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号７０の配列を含む、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記第２の細胞集団が、前記第２のＣＡＲおよびドミナントネガティブ形態のＰＤ－１をコードするレンチウイルスベクターを含む、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記第１の細胞集団が、前記第１のＣＡＲおよび治療薬をコードするレンチウイルスベクターを含む、請求項１または２に記載の組成物または方法。
前記治療薬がサイトカインを含む、請求項２１に記載の組成物または方法。
前記サイトカインが、ＩＬ６および／またはＩＮＦγである、請求項２２に記載の組成物または方法。
前記サイトカインが、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＴＮＦ－αまたはＩＦＮ－γのうちの少なくとも１つである、請求項２２に記載の組成物または方法。