CN115704039A - 包含编码抗原结合分子的多核苷酸和靶向ecm试剂的多核苷酸的多核苷酸及修饰细胞 - Google Patents

Abstract

本公开涉及包含编码抗原结合分子的多核苷酸和编码靶向一种或多种细胞外基质(ECM)分子的试剂的多核苷酸的修饰细胞。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码组织蛋白酶K(CK)的多核苷酸和/或编码中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的多核苷酸。在实施方案中，编码NE的多核苷酸包含编码NE的多核苷酸和编码IL‑2信号结构域的多核苷酸。本发明方案能够使CAR‑T细胞在肿瘤病灶位置特异分泌可降解组成肿瘤外基质成分的酶，以打破屏障，有利于提高CAR‑T细胞针对实体瘤的疗效。

Description

包含编码抗原结合分子的多核苷酸和靶向ECM试剂的多核苷 酸的多核苷酸及修饰细胞

技术领域

本公开涉及用于扩增和维持修饰的细胞(包括基因修饰的细胞)的组合物和方法，以及其在疾病(包括癌症)治疗中的用途，具体涉及包含编码抗原结合分子的多核苷酸和靶向ECM试剂的多核苷酸的多核苷酸、载体、修饰细胞及组合物。

背景技术

癌症又称为恶性肿瘤，其涉及异常细胞生长，并有可能侵袭或扩散到身体的其他部位。人类中存在一百多种癌症。虽然已证明免疫疗法(例如，CAR T)对治疗某些癌症有效，但是仍需要对免疫疗法进行改进，以便有效治疗包括涉及实体瘤等的更多癌症。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在诸如B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和淋巴瘤等癌症中已取得良好的临床疗效。然而，对实体瘤的治疗进展相对缓慢。为了使CAR T细胞疗法有效，长期维持患者体内的CAR T细胞对于肿瘤治疗中患者的预后至关重要。例如，如果可以维持CAR T细胞长期存在，则该技术可以有效减少肿瘤复发。

发明内容

肿瘤外基质是包裹在实体瘤外由多种成分组成的基质，不属于任何细胞。鉴于其多样性，肿瘤外基质有多方面的功能。例如，为肿瘤细胞提供支持、固定和保护屏障、调节肿瘤细胞间的动态行为、为肿瘤细胞生长提供必要的信号等，在肿瘤疾病中起重要作用。

在之前的临床数据中，在部分缓解的病人中观察到了肿瘤的缩小，但是随着时间的推移仍然没能完全消失，达到完全缓解的评判标准。效果未达预期的原因是多因素的，可能是CAR-T细胞数量还不够，识别浸润杀伤功能还不够强，也可能是肿瘤微环境抑制了CAR-T的活性，还有可能是肿瘤部位最外圈的细胞外基质(ECM)保护了残留的肿瘤细胞以逃过识别和杀伤。因此，如果能在肿瘤部位降解ECM，很可能可以让残留的肿瘤细胞摆脱保护从而被识别杀伤。

再者，从肿瘤预后评判角度来看，对于血液瘤/淋巴瘤，病人可以快速达到部分缓解/完全缓解，而在治疗实体瘤的过程中，肿瘤的缩小常常耗时巨大，需要等待数月以上才能观察到疗效，对病人和医生都是一个挑战，因此，如果加了降解ECM可以快速使病人达到部分缓解/完全缓解，对于双方都是一大福音。

本发明是新一代CAR-T技术，使CAR-T细胞在肿瘤病灶位置特异分泌可降解组成肿瘤外基质成分的酶，如MMP1，MMP2，MMP3，MMP7，MMP8，MMP9，MMP13，Cathepsin L,CathepsinK，Neutrophil Elastase，Plasmin，Trypsin等，以打破屏障。通过这项新技术，可以使CAR-T细胞更易接触到每一个肿瘤细胞从而进行更有效、更彻底的杀伤。另外由于屏障被打破，缺少了必要信号的肿瘤细胞生长减缓，而CAR-T细胞更易浸润至实体肿瘤内部。因此这项新技术可以提高CAR-T细胞针对实体瘤的疗效，使肿瘤病灶缩小更迅速，让每一个肿瘤细胞失去了保护屏障，提升病人快速实现完全缓解的可能，同时由于消灭肿瘤细胞更彻底，病人复发风险也随之降低。

以肠癌为例，在肠癌组织中，表达最高的ECM成分有Collagen VI,硫酸乙酰肝素，Fibrillin，Fibronectin，Collagen I，Collagen IV和Collagen III。在ECM中，CollagenI，Collagen IV和Fibronectin是组成结构的主体，在ECM其中交联形成网状结构并提供了抗张强度，一般认为，降解了Collagen I，Collagen IV和Fibronectin能够破坏ECM的主体结构，从而彻底重塑ECM。本发明通过在肠癌CAR-T中使用NFAT-drove Ck和NE在肿瘤部位受激活后释放活性CK和NE，降解肿瘤部位ECM，从而增强CAR-T细胞快速浸润能力，达到更强的杀伤肿瘤效果。

实施方案涉及包含编码抗原结合分子的多核苷酸和编码靶向一种或多种细胞外基质(ECM)分子的试剂的多核苷酸的修饰细胞。

在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码组织蛋白酶K(CK)的多核苷酸和/或编码中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的多核苷酸。

在实施方案中，编码NE的多核苷酸包含编码NE的多核苷酸和编码IL-2信号结构域的多核苷酸。

在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码CK的多核苷酸、编码NE的多核苷酸和编码MMP7的多核苷酸。

具体实施方案涉及：

1.一种多核苷酸，其包含编码抗原结合分子的第一多核苷酸和编码靶向一种或多种细胞外基质(ECM)分子的试剂的第二多核苷酸，其中所述多核苷酸包含

(1)编码嵌合抗原受体(CAR)的第一多核苷酸，该第一多核苷酸包含抗原结合分子结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，和

(2)编码以下氨基酸序列的第二多核苷酸：

SEQ ID NO:7、10和16；或

SEQ ID NO:7；或

SEQ ID NO:10；或

SEQ ID NO:16；或

SEQ ID NO:7和10；或

SEQ ID NO:7、16；或

SEQ ID NO:10和16。

2.实施方案1的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9。

3.实施方案1的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：10和编码SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的多核苷酸。

4.实施方案2或3的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸还包含编码SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：16的多核苷酸。

5.实施方案1～4的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸还包含多核苷酸序列SEQ IDNO：5和6。

6.根据实施方案1～5的多核苷酸，其中结合肿瘤抗原的抗原结合分子的抗原结合域选自：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII,GD2,GD3,BCMA,Tn Ag,PSMA,ROR1,FLT3,FAP,TAG72,CD38,CD44v6,CEA,EPCAM,B7H3,KIT,IL-13Ra2,Mesothelin,IL-11Ra,PSCA,PRSS21,VEGFR2,LewisY,CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、聚乳酸、ALK,GloboH,NY-BR-1,UPK2,HAVCR1,ADRB3,PANX3,GPR20,LY6K,OR51E2,TARP,WT1,NY-ESO-1,LAGE-1a,MAGE-A1,legumain,HPV E6,E7,MAGE A1,ETV6-AML,精子蛋白17,XAGE1,Tie 2,MAD-CT-1,MAD-CT-2,Fos相关抗原1,p53,p53突变体,prostein,survivin和端粒酶,PCTA-1/Galectin 8,梅兰/MAR T1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1；和/或

其中所述细胞内信号结构域包括共刺激信号结构域，或初级信号结构域和共刺激信号结构域，其中所述共刺激信号结构域包括选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，一种与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R特异性结合的配体α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGAD、ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D的蛋白质的功能信号结构域。

7.包含实施方案1-6中任一项的多核苷酸和的载体。

8.包含实施方案7的载体的细胞。

9.一种包含实施方案8的细胞群的组合物。

10.根据实施方案9的组合物，其中所述细胞包含选自程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-的抑制性免疫检查点分子、淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIRl)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD 160；和/或

其中所述组合物包含包含结合第一抗原的第一CAR的第一细胞群和包含结合第二抗原的第二CAR的第二细胞群，其中所述第二抗原是肿瘤抗原并且与第一抗原不同，第一抗原包括白细胞(WBC)、肿瘤抗原或实体瘤抗原的细胞表面分子；和/或

其中所述细胞具有降低的内源TRAC基因表达，和/或所述细胞包括编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸序列，或其组合；和/或

其中所述细胞包括编码结合TGF-β1、TGF-β2、CTGF、αv/β3整联蛋白、α4/β7整联蛋白或α5/β1整联蛋白的scFv的多核苷酸，和/或包含IL-6、IFNγ、IL-10或IL-12；和/或

其中所述细胞包括编码靶向一种或多种ECM分子合成的细胞因子抑制剂或细胞因子的多核苷酸、靶向一种或多种ECM分子降解的肽和/或靶向一种或多种ECM分子的信号传导的肽。

11.实施方案9的组合物，其中所述细胞包含结合第一抗原的第一CAR和结合第二抗原的第二CAR，其中所述第一抗原包括WBC抗原，第二抗原包括实体瘤抗原。

12.实施方案1～11中任意一项的多核苷酸、载体、细胞或组合物在制备治疗实体瘤药物中的用途。

本发明内容既不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考号指示相似或相同的项目。

图1显示GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE的表达以及体外试验结果。

图2显示GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE进一步体外试验结果。

图3显示GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE的CK和NE转录水平与静息时无明显区别。

图4显示了过表达或由NFAT诱导表达CK的CAR正常表达。

图5显示了正常过表达wt的NE无法在上清中检测到NE的释放，更改了NE的信号肽，可以看到NE释放量明显上升。

图6显示了过表达或由NFAT诱导表达MMP7的CAR正常表达。

图7显示了GUCY2C-NFAT-IL2 SP NE+CK+MMP7正常表达。

图8显示了正常表达CAR-T过表达或NFAT表达MMP9后无法正常表达CAR+细胞，经mRNA检测也无MMP9表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施方案涉及包含编码抗原结合分子的多核苷酸和编码靶向一种或多种ECM分子的试剂的多核苷酸的修饰细胞。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码组织蛋白酶K(CK)的多核苷酸和编码中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的多核苷酸。在实施方案中，编码NE的多核苷酸包含编码NE的多核苷酸和编码IL-2信号结构域的多核苷酸。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码CK的多核苷酸、编码NE的多核苷酸和编码MMP7的多核苷酸。

肿瘤微环境(TME)包括肿瘤细胞、脉管系统、细胞外基质(ECM)、基质和免疫细胞。ECM包括许多分子(ECM分子)，传统上分为胶原蛋白、弹性蛋白和微纤维蛋白、蛋白聚糖(包括透明质酸)和非胶原蛋白糖蛋白。与TME的其他成分一样，肿瘤中的ECM与正常器官中的ECM显著不同。例如，肿瘤中的ECM影响肿瘤的恶性程度和生长，并帮助肿瘤细胞抵抗治疗。ECM的摘要可以在论文Extracellular Matrix Molecules:Potential Targets inPharmacotherapy.Pharmacological Reviews,2009,61(2),198–223.doi:10.1124/pr.109.001289(

H、Sainio A、Koulu M、Wight TN、Penttinen R)中找到，其全部内容并入本文。在实施例中，ECM分子的实例包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白VI、胶原蛋白IV和纤连蛋白。在实施方案中，靶向ECM的药剂是指降解和/或引起或增加一种或多种ECM分子的降解的药剂。在实施方案中，靶向ECM的药剂包括靶向ECM合成的药剂，包括细胞因子抑制剂和细胞因子。靶向ECM合成的药剂的实例包括TGF-β1抗体、TGF-β2抗体、TGF-β1信号抑制剂、TGF-β受体I激酶抑制剂、CTGF抗体、重组TGF-β3和/或重组白细胞介素10。在实施例中，靶向ECM的药剂包括靶向ECM降解的药剂。靶向ECM降解的药剂的实例包括MMP抑制剂、胶原酶和MMP-14抑制剂、广谱MMP抑制剂、选择性组织蛋白酶K抑制剂、乙酰肝素酶活性抑制剂和/或胶原酶刺激剂。在实施例中，以ECM为目标的试剂包括以ECM的信令为目标的试剂。靶向ECM信号传导的药剂的实例包括针对αv/β3整联蛋白的抗体、针对α4/β7整联蛋白的抗体和/或针对α5/β1整联蛋白的抗体。

在实施方案中，靶向ECM的药剂包括降解一种或多种ECM分子的药剂，例如胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白VI、胶原蛋白IV、纤连蛋白。在实施例中，靶向ECM的药剂包括一种或多种降解ECM分子的酶。降解一种或多种ECM分子的试剂的实例包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP13、组织蛋白酶L(CL)、组织蛋白酶K(CK)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、纤溶酶、胰蛋白酶。在实施方案中，CAR-T细胞可分泌可降解肿瘤部位的ECM分子以破坏TME的酶。因此，可以使更多的肿瘤细胞更容易接近CAR-T细胞。此外，屏障被打破，缺乏必要信号的肿瘤细胞生长减慢，因此CAR-T细胞更有可能浸润实体瘤。

在实施方案中，本文描述的组合物和/或方法可以与PCT公开号：WO2019140100A1,WO2020106843A1和WO2020146743A1中描述的与CoupledCAR相关的技术组合，其整体并入本文。

实施方案涉及包含编码抗原结合分子的多核苷酸和编码靶向一种或多种细胞外基质(ECM)分子的试剂的多核苷酸的修饰细胞。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码组织蛋白酶K(CK)的多核苷酸和编码中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的多核苷酸。在实施方案中，编码NE的多核苷酸包含编码NE的多核苷酸和编码IL-2信号结构域的多核苷酸。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码CK的多核苷酸、编码NE的多核苷酸和编码MMP7的多核苷酸。

实施方案涉及包含编码抗原结合分子的多核苷酸和编码靶向一种或多种细胞外基质(ECM)分子的药剂的多核苷酸的多核苷酸。

实施方案涉及包含编码抗原结合分子的多核苷酸和编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸的组合物。

在实施方案中，靶向一种或多种分子ECM的药剂的表达受NFAT启动子调节。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码CK的多核苷酸。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码CK的多核苷酸和/或编码NE的多核苷酸。在实施方案中，编码NE的多核苷酸包含编码NE的多核苷酸和编码IL-2信号结构域的多核苷酸(例如，SEQ ID NO：22或23)。在实施方案中，编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸包含编码CK的多核苷酸、编码NE的多核苷酸和编码MMP7的多核苷酸。在实施例中，多核苷酸包括：SEQ ID NOS：5-10和16；SEQ ID NO：5-10；SEQ ID NO：13和SEQ IDNO:11或12中的任何至少一个，或表2中列出的那些。

实施方案涉及包含上述多核苷酸和/或组合物的载体。实施方案涉及包含载体的细胞。实施方案涉及增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用包含病毒载体的药物组合物，所述病毒载体包含多核苷酸和/或上述组合物。

在实施方案中，病毒载体包括慢病毒。在实施方案中，病毒载体是包含AAV衣壳蛋白的rAAV颗粒和包含以有效感染细胞、器官或组织的方式插入一对AAV反向末端重复(ITR)之间的编码抗原结合分子的核酸的载体对象外周系统，使得细胞、器官或组织表达抗原结合分子。

实施方案涉及经改造以表达抗原结合分子的修饰细胞，其中靶向修饰细胞中一种或多种ECM分子的药剂的表达和/或功能已得到增强。

在实施方案中，修饰的细胞包含编码抗原结合分子的多核苷酸和编码靶向上述一种或多种ECM分子的试剂的多核苷酸。

实施方案涉及刺激T细胞应答和治疗患有某种形式的癌症或增强T细胞应答和/或治疗癌症的受试者的方法，该方法包括施用有效量的修饰细胞；并且施用有效量的靶向一种或多种ECM分子的药剂。

实施方案涉及增强T细胞应答(IL-6、TNF-α和/或IFNγ释放和/或细胞扩增)的方法，该方法包括施用有效量的包含编码抗原结合分子的多核苷酸的修饰细胞和编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸，并且与施用有效量的包含编码抗原结合分子的多核苷酸的修饰细胞而不包括编码靶向一种或多种ECM分子的药剂的多核苷酸相比，更多的靶向ECM分子的T细胞应答增强。

在实施方案中，一种或多种ECM分子包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白VI、胶原蛋白IV和/或纤连蛋白。在实施例中，靶向ECM的药剂包括降解一种或多种ECM分子的药剂。在实施方案中，靶向一种或多种ECM分子的药剂包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP13、组织蛋白酶L(CL)、组织蛋白酶K(CK)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、纤溶酶和/或胰蛋白酶。在实施方案中，靶向一种或多种ECM分子的药剂包括MMP7、NE和/或CK。在实施方案中，抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合域、跨膜域和细胞内信号域。在实施方案中，结合肿瘤抗原的抗原结合域选自：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA,Tn Ag,PSMA,ROR1,FLT3,FAP,TAG72,CD38,CD44v6,CEA,EPCAM,B7H3,KIT,IL-13Ra2,Mesothelin,IL-11Ra,PSCA,PRSS21,VEGFR2,LewisY,CD24,PDGFR-beta,SSEA-4,CD20,叶酸受体α,ERBB2(Her2/neu),MUC1,EGFR,NCAM,Prostase,PAP,ELF2M,Ephrin B2,IGF-I受体,CAIX,LMP2,gp100,bcr-abl,酪氨酸酶,EphA2,岩藻糖基GM1,sLe,GM3,TGS5,HMWMAA,o-乙酰基-GD2,叶酸受体β,TEM1/CD248,TEM7R,CLDN6,GPRC5D,CXORF61,CD97,CD179a,ALK,聚唾液酸,PLAC1,NY-GloboH-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活蛋白和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体,hTERT,sar昏迷易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY3、75、FCRL5和IGLL1。在实施方案中，细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域，或初级信号传导域和共刺激信号传导域，其中共刺激信号传导域包含选自由CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3,结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18 1,ITGB7,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100),(SEMA)CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BL AME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D组成的组的蛋白质的功能性信号传导域。

在实施方案中，抗原结合分子是修饰的TCR。在实施方案中，TCR源自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。在实施方案中，TCR包括TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链，或其组合。

在实施方案中，细胞是免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群)。在实施方案中，免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。在实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在实施方案中，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。在实施方案中，细胞是人类细胞。

在实施方案中，靶向一种或多种ECM分子的药剂的增强表达和/或功能是通过将一种或多种基因的核酸序列引入mRNA来实现的，该基因存在于重组DNA构建体中的修饰细胞中，或在病毒载体中。在实施方案中，核酸序列是未整合到修饰细胞的基因组中的mRNA。在实施方案中，核酸序列与氧敏感多肽结构域相关。在实施方案中，氧敏感多肽结构域包含HIF VHL结合结构域。在实施方案中，核酸序列由包含转录调节剂的结合位点的启动子调节，所述转录调节剂调节细胞中治疗剂的表达和/或分泌。在实施方案中，转录调节剂是或包括Hifla、NFAT、FOXP3和/或NFkB。实施方案涉及包含包含结合第一抗原的第一CAR的第一细胞群和包含结合第二抗原的第二CAR的第二细胞群的组合物，其中第二抗原是肿瘤抗原并且不同于第一抗原，并且第一细胞群和/或第二细胞群包含任何合适的前述实施方案的一个或多个多核苷酸。

实施方案涉及上述组合物的用途或在有需要的受试者中增强细胞扩增或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的组合物，受试者具有一种表达肿瘤抗原的癌症。

在实施方案中，受试者中第二细胞群的扩增大于与第二细胞群而非第一细胞群一起施用的受试者中第二细胞群的扩增。在实施方案中，基于第二细胞群的数目或编码第二CAR的DNA的拷贝数来测量扩增。在实施方案中，细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在实施方案中，第一抗原包括白细胞(WBC)、肿瘤抗原或实体瘤抗原的细胞表面分子。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。在实施例中，WBC是B细胞。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。

在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19或BCMA。在实施方案中，肿瘤抗原是实体瘤抗原。

实施方案涉及增强CAR细胞表达和/或释放NE的方法，该方法包括：将编码CAR的多核苷酸引入细胞以获得CAR细胞；以及引入编码IL-2的NE和SP的多核苷酸，其中与编码不具有IL-2的SP的试剂的多核苷酸的CAR细胞相比，NE释放得到增强。

在实施方案中，细胞是NK或T细胞。

在实施方案中，多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列SEQID NO：5、6、7、10和16的多核苷酸。

在实施方案中，多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列SEQID NO：5、6和7的多核苷酸。

在实施方案中，多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列SEQID NO：5、6和10的多核苷酸。

在实施方案中，多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列SEQID NO：5、6和16的多核苷酸。

在实施方案中，多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列SEQID NO：5、6、7和10的多核苷酸。

在实施方案中，多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列SEQID NO：5、6、7和16的多核苷酸。

在实施方案中，多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：9和编码氨基酸序列SEQID NO：5、6、10和16的多核苷酸。

在实施方案中，修饰的细胞包含编码结合分子和显性失活形式的抑制性免疫检查点分子或其受体的核酸序列。

在实施方案中，抑制性免疫检查点分子选自由程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞衰减剂(BTLA)、T细胞免疫球蛋白组成的组粘蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞激活蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD 160。在实施方案中，抑制性免疫检查点分子是经修饰的PD-1。在实施方案中，修饰的PD-1缺乏用于PD-1信号转导的功能性PD-1胞内结构域，干扰人细胞的人T细胞的PD-1和特定细胞的PD-L1之间的通路，包括或者是PD-1胞外域或PD-1跨膜域，或其组合，或与野生型PD-1胞内域相比包含取代或缺失的修饰的PD-1胞内域，或包含或是一种可溶性受体，包含与特定细胞的PD-L1结合的PD-1胞外域。

在实施方案中，经修饰的细胞具有降低的内源TRAC基因表达。

在实施方案中，修饰的细胞包括编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸，或其组合。在实施方案中，修饰的细胞包括编码hTERT的核酸序列和编码SV40LT的核酸序列。在实施方案中，hTERT的表达由诱导型表达系统调节。在实施方案中，SV40LT基因的表达由诱导型表达系统调节。在实施方案中，诱导型表达系统是rTTA-TRE，其增加或激活SV40LT基因或hTERT基因或其组合的表达。在实施方案中，修饰的细胞包括编码自杀基因的核酸序列。在实施方案中，自杀基因包括HSV-TK自杀基因系统，和/或可以诱导修饰的细胞经历细胞凋亡。

在实施方案中，其中所述细胞包括编码结合TGF-β1、TGF-β2、CTGF、αv/β3整联蛋白、α4/β7整联蛋白或α5/β1整联蛋白的scFv的多核苷酸，和/或包含IL-6、IFNγ、IL-10或IL-12。在实施方案中，其中所述细胞包括编码靶向一种或多种ECM分子合成的细胞因子抑制剂或细胞因子的多核苷酸、靶向一种或多种ECM分子降解的肽和/或靶向一种或多种ECM分子的信号传导的肽。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管可在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但还是描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一个/种(a/an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)物品的语法对象。举例来说，“一种要素”意指一种要素或多于一种要素。

“大约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所用，术语“激活”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞状态。激活也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”的使用范围最广，是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性或功能即可。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段；以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如，抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠，产生了六个高变环(3个环来自H链，3个环来自L链)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，诸如例如由噬菌体表达的抗体。所述术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而生成的抗体。使用本领域可用和众所周知的技术来获得合成DNA。

术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可涉及抗体产生或特异性免疫能力细胞的激活或两者。抗原包括任何大分子，所述大分子包括所有蛋白质或肽，或衍生自重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引发免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从生物样品中生成、合成或衍生自生物样品，所述生物样品包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减小、肿瘤细胞数减少、转移数减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加或与癌性病状相关的各种生理症状改善相关的生物作用。首先，也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤发生方面的能力来表现出“抗肿瘤作用”。

术语“自体抗原”是指被免疫系统误认为是外来的内源性抗原。自体抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体的”用于描述衍生自受试者的材料，其随后被重新引入同一受试者中。

术语“同种异体的”用于描述衍生自相同物种的不同受试者的移植物。作为实例，供体受试者可以与受体受试者相关或不相关，但是供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标志物。

术语“异种的”用于描述衍生自不同物种的受试者的移植物。作为实例，供体受试者与受体受试者来自不同的物种，并且供体受试者和受体受试者可以是遗传学和免疫学上不相容的。

术语“癌症”用于指特征在于异常细胞快速且不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”、“包括(includes)”和“包括(including)”将被理解为暗示包括所述步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。

短语“由......组成”意指包括并且限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”指示所列出的要素是必需或强制性的，并且可不存在其他要素。

短语“基本上由......组成”意指包括在短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或不影响本公开中针对所列要素所指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由......组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的，并且取决于它们是否影响所列要素的活动或动作，可以存在或可以不存在。

术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则关联在一起的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配，或在核酸之间可以存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有重要作用。

术语“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补，或者编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外的一种信号，所述信号介导T细胞应答，包括增殖、激活、分化和其他细胞应答的至少一种。共刺激配体可以包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，诸如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及特异性结合CD83的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指与主要信号(诸如TCR/CD3连接)结合，导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的信号。

术语“疾病”和“病状”可以互换使用，或可以不同，因为特定的疾病或病状可能没有已知的致病物(因此病因尚未得到解决)，因此它还不是公认的疾病，但仅是一种不良病状或综合症，其中临床医生已鉴定出或多或少的特定症状的集合。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状态要比没有病症的情况下不利。如果不及时治疗，病症不一定会导致动物健康状态进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或意图的结果。例如，在治疗背景下的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中的特定核苷酸序列在生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述生物过程具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了用“U”代替“T”以外)并且通常提供在序列表中的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链可被称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源的”是指并非天然存在于野生型细胞或生物体中，但通常通过分子生物学技术引入细胞中的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。同样，通过分子生物学技术从第一生物体分离并转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生原本天然存在的多核苷酸序列的一个或多个其他拷贝，从而促进编码多肽的过表达。

术语“表达或过表达”是指例如由其启动子驱动，将特定核苷酸序列转录和/或翻译成前体或成熟蛋白。“过表达”是指在转基因生物或细胞中的基因产物产量超过正常或未转化的生物或细胞中的产量水平。如本文所定义，术语“表达”是指表达或过表达。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作连接至待表达的核苷酸序列的表达控制(调节)序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用要素；用于表达的其他要素可以由宿主细胞提供或提供在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的并入重组多核苷酸的所有载体，诸如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

病毒可以用于将核酸体外和体内(在受试者体内)递送到细胞中。可用于将核酸递送到细胞中的病毒的实例包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺相关病毒。

还存在用于将核酸递送到细胞中的非病毒方法，例如电穿孔、基因枪、声波穿孔、磁转染，以及使用寡核苷酸、脂质体、树状聚合物和无机纳米颗粒。

术语“同源的”是指当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，例如，如果两个DNA分子中的每个中的一个位置被腺嘌呤占据，则分子在所述位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列享有的匹配或同源位置数除以所比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。当比对两个序列时进行比较，以得到最大同源性。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指用作抗体的一类蛋白质。包括在此类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物，诸如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物和呼吸道与泌尿生殖道的粘液分泌物中的一抗。IgG是最常见的循环抗体。在大多数受试者中，IgM是初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒很重要。IgD是不具有已知抗体功能但可以充当抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过暴露于过敏原时，引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。

术语“分离的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。所述材料可以是细胞或大分子，诸如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已从以天然存在状态的方式位于其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如已从通常与片段相邻的序列中去除的DNA片段。或者，如本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从其天然细胞环境以及从其与细胞的其他组分的缔合中体外分离和/或纯化肽或多肽分子。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含在其天然状态下通常与其缔合的组分的材料。例如，基本上纯化的细胞是指在其天然存在或天然状态下从通常与其缔合的其他细胞类型中分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语简单地是指在其天然状态下从与其天然缔合的细胞中分离的细胞。在实施方案中，细胞在体外培养。在实施方案中，细胞并非在体外培养。

在本公开的上下文中，使用了以下常见存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列也可以包括内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可以包含一个或多个内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。此外，使用慢病毒能够将遗传信息整合到宿主染色体中，从而产生稳定转导的遗传信息。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的情况下受试者中的反应水平相比，和/或与其他相同但未治疗的受试者中的反应水平相比，介导受试者中反应水平的可检测的增加或降低。所述术语涵盖干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者、优选地人中介导有益的治疗反应。

当核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，所述核酸是“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。

术语“在转录控制下”是指启动子可操作地连接至多核苷酸并相对于多核苷酸并处于正确的位置和方向，以控制由RNA聚合酶进行的转录开始和多核苷酸表达。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在指示相对于来自特定组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自患者的所述组织或器官中的疾病区域(例如实体瘤)的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定患有特征在于肿瘤抗原过表达的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤根据形成它们的细胞类型而命名(诸如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌瘤的实例包括纤维肉瘤、粘肉肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴性恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS(中枢神经系统)肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形胶质细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。

实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上低水平表达。实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例提供在表1中。

表1

术语组合物的“肠胃外施用”包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文可互换使用，并且是指适用于本文描述的方法的任何人或动物。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括在其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，诸如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

需要治疗或其有需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病状或病症的受试者。其有需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病状或病症的受试者。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。所述术语通常是指长度至少为10个碱基的聚合形式核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或修饰形式的任一类型核苷酸。所述术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区分开的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸代替的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和替换，从而使改变后的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物功能或活性或相对于参考多核苷酸具有增加的活性(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与本文描述的参考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％以及其间的所有整数百分比，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。

术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，诸如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括酶促多肽或“酶”，其通常催化各种化学反应(即，增加其速率)。

术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或替换至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个替换而与参考多肽区分开，所述一个或多个替换可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守替换，并且就这一点而言，在本领域中众所周知，可以将一些氨基酸改变为具有大致相似特性的其他氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基代替的多肽。

术语“启动子”是指由细胞的合成机制识别或引入合成机制，开始多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。术语“表达控制(调节)序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合(bind)”、“结合(binds)”或“与......相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中第二分子但基本上不识别或粘附于样品中其他结构无关分子的分子。如本文所用关于抗体的术语“特异性结合”，是指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种种间反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binding)”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，意味着相互作用取决于化学物种上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是结合任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在包含标记“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离、未标记的A)的分子将减少与抗体结合的标记A的量。

“统计学上显著的”意指结果不太可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性度量包括p值，所述p值是在虚假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝虚假设。在简单情况下，显著性水平被定义为0.05或更小的p值。“减少”或“降低”或“较少”的量通常是“统计学上显著的”或生理上显著的量，并且可包括与本文描述的量或水平相比约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括介于1和大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少量。

术语“刺激”是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合从而介导信号转导事件而诱导的初次应答，诸如经由TCR/CD3复合物进行的信号转导。刺激可以介导某些分子表达的改变，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织。

术语“刺激分子”是指T细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的分子。例如，来源于刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。刺激分子包括负责进行信号传导的结构域。

术语“刺激配体”是指以下配体，所述配体当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突状细胞、B细胞等)上时，可以与细胞例如T细胞上的同源结合伴侣(本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初次应答，包括激活、免疫应答的开始、增殖和相似过程。刺激配体在本领域中是众所周知的，并且尤其涵盖载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。

术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态的症状可获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指本发明的化合物的量，其将引发研究人员、兽医、医生或另外临床医生所寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应。术语“治疗有效量”包括当施用时足以防止所治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状的发展或在某种程度上对其减轻的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。在本领域中已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体是通过多重减毒HIV毒力基因生成的，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，从而使得载体具有生物安全性。

范围：在整个公开内容中，可以以范围形式来呈现本公开的各个方面。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不可改变的限制。因此，对范围的描述应被认为已明确公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围的描述诸如从1到6应被认为已明确公开了子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的各个数，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

“嵌合抗原受体(CAR)”分子是至少包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域的重组多肽。在实施方案中，CAR的结构域在同一多肽链上，例如嵌合融合蛋白。在实施方案中，所述结构域在不同多肽链上，例如结构域是不连续的。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。抗原结合结构域可用于扩增和/或维持修饰的细胞(诸如CAR T细胞)，或用于杀死肿瘤细胞(诸如实体瘤)。在实施方案中，用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域可结合抗原，例如WBC表面上的细胞表面分子或标志物。在实施方案中，WBC是以下各项中的至少一种：GMP(粒细胞巨噬细胞前体)、MDP(单核细胞-巨噬细胞/树突状细胞前体)、cMoP(常见单核细胞前体)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、SatM(含七叶形核的非典型单核细胞)、巨噬细胞、单核细胞、CDP(常见树突状细胞前体)、cDC(常规DC)、pDC(浆细胞样DC)、CLP(常见淋巴细胞前体)、B细胞、ILC(先天性淋巴细胞)、NK细胞、巨核细胞、成髓细胞、前髓细胞、髓细胞、后髓细胞、杆状核粒细胞、淋巴母细胞、前淋巴细胞、成单核细胞、成巨核细胞、前巨核细胞、巨核细胞、血小板或MSDC(髓源性抑制细胞)。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞和/或淋巴细胞。在实施方案中，WBC是淋巴细胞，例如B细胞。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。

本文描述的细胞，包括诸如CAR细胞和修饰T细胞等的修饰细胞，可以来源于干细胞。干细胞可以是成人干细胞、胚胎干细胞、更具体地非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导型多能干细胞、全能干细胞、或造血干细胞。修饰的细胞还可以是树突状细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，所述T细胞选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。在实施方案中，修饰的细胞可以来源于CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞。在对本发明的细胞进行扩增和基因修饰之前，可以通过各种非限制性方法从受试者中获得细胞来源。T细胞可获自多种非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员可获得和已知的任何数量的T细胞系。在实施方案中，修饰的细胞可来源于健康供体，来源于诊断患有癌症的患者或诊断为感染的患者。在实施方案中，修饰的细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

细胞群是指两个或更多个细胞的组。细胞群中的细胞可以是相同的，以使得细胞群是同质细胞群。细胞群中的细胞可以是不同的，以使得细胞群是混合细胞群或异质细胞群。例如，混合细胞群可以包括：含有第一CAR的修饰细胞；以及含有第二CAR的细胞，其中第一CAR和第二CAR结合不同抗原。

术语“干细胞”是指具有自我更新能力和分化成其他类型细胞能力的某些类型的细胞中的任何一种。例如，干细胞产生两个子干细胞(如在体外与胚胎干细胞培养时发生)或一个干细胞和经历分化的细胞(如在可产生血细胞的造血干细胞中发生)。不同类别的干细胞可以基于其来源和/或其分化成其他类型细胞的能力程度来加以区分。例如，干细胞可以包括胚胎干(ES)细胞(即多能干细胞)、体干细胞、诱导型多能干细胞以及任何其他类型干细胞。

多能胚胎干细胞可存在于胚泡内细胞团中，并且具有先天分化能力。例如，多能胚胎干细胞具有在体内形成任何类型细胞的潜力。当体外长时间生长时，ES细胞保持多能性，因为子代细胞保留了多向分化的潜力。

体干细胞可以包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成人干细胞(存在于各种组织中，诸如骨髓)。这些细胞被认为具有低于多能ES细胞的分化能力，其中胎儿干细胞的能力大于成人干细胞的能力。体干细胞显然仅分化成有限数量类型的细胞，并被描述为专能的(multipotent)。“组织特异性”干细胞通常仅产生一种类型的细胞。例如，胚胎干细胞可以分化成血液干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，其可以进一步分化成各种血细胞(例如，红细胞、血小板、白细胞等)。

诱导型多能干细胞(即iPS细胞或iPSC)可以包括通过诱导特定基因表达而人工衍生自非多能细胞(例如，成人体细胞)的一种多能干细胞。诱导型多能干细胞在许多方面类似于天然存在的多能干细胞(诸如胚胎干(ES)细胞)，所述方面诸如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、类胚体形成、畸胎瘤形成、可活嵌合体形成以及潜力和可分化性。诱导型多能细胞可获自成人胃、肝、皮肤和血液细胞。

在实施方案中，用于杀死肿瘤的抗原结合结构域可结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的引发免疫应答的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括例如肿瘤相关的MUC1(tMUC1)、神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺特异性蛋白(prostein)、PSMA、Her2/neu、存活素、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、CD19和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可被称为CD19 CAR或19CAR，所述CD19 CAR或19CAR是包括结合CD19的抗原结合结构域的CAR分子。

在实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括至少一个scFv或至少单域抗体。作为实例，在CAR上可以存在两个scFv。scFv包括通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。通过使用短连接肽连接轻链可变区和/或重链可变区可制备单链可变区片段(Bird等人,Science 242:423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)3的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已设计并使用了其他序列的接头(Bird等人,1988,同上)。通常，接头可以是短的柔性多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以重组或合成产生。针对scFv的合成产生，可以使用自动合成仪。针对scFv的重组产生，可以将合适的含有编码scFv的多核苷酸的质粒引入合适的宿主细胞中，所述宿主细胞可以是真核生物，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或者可以是原核生物，诸如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可以通过常规操作诸如多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号传导结构域。共刺激结构域和信号传导结构域的功能在于响应于抗原结合而传递信号并激活分子，诸如T细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，信号传导结构域衍生自初级信号传导结构域，诸如CD3ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括一个或多个衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是用于激活针对抗原的细胞应答所必需的细胞表面分子(除抗原受体或其配体以外)。

在实施方案中，共刺激结构域包括以下的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域包括衍生自T细胞受体的CD3ζ结构域。

本文描述的CAR分子还包括跨膜结构域。将跨膜结构域并入CAR分子可使分子稳定。在实施方案中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。

在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间，可以并入间隔域。如本文所用，术语“间隔域”通常意指在多肽链上起到将跨膜结构域连接至细胞外结构域和/或细胞质结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔域可以包含高达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸，并且最优选地25至50个氨基酸。

本公开描述了用于体外细胞制备的方法，该方法包括：准备细胞；将细胞与(1)第一载体和(2)第二载体接触以获得修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原，其中第一抗原与第二抗原不同。

本公开还描述了用于增强患有癌症的受试者中细胞扩增的方法，该方法包括：从受试者或健康供体中获得细胞；将细胞与(1)第一载体和(2)第二载体接触以获得修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；以及向受试者施用有效量的修饰细胞，其中：第一抗原与第二抗原不同；并且与施用有效量的与第一载体接触而没有与第二载体接触的细胞的受试者中细胞扩增水平相比，施用有效量的修饰细胞的受试者中细胞扩增水平更高。

本公开还描述了用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：从受试者或健康供体中获得细胞；将细胞与(1)第一载体和(2)第二载体接触以获得修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；以及向受试者施用有效量的修饰细胞，其中：第一抗原与第二抗原不同。

本公开还描述了用于增强患有癌症的受试者的治疗的方法，该方法包括：从受试者或健康供体中获得细胞；将细胞与(1)第一载体和(2)第二载体接触以获得修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；以及向受试者施用有效量的修饰细胞，其中：第一抗原与第二抗原不同；并且与有效量的与第二载体接触而没有与第一载体接触的细胞所引起的肿瘤生长抑制水平相比，有效量的修饰细胞所引起的肿瘤生长抑制水平更高。

本公开还描述了用于体外细胞制备的方法，该方法包括：将第一载体引入第一细胞群中，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原；将第二载体引入第二细胞群中，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；以及培养第一细胞群和第二细胞群，其中第一抗原与第二抗原不同。

本公开还描述了用于增强患有癌症的受试者中细胞扩增的方法，该方法包括：将第一载体引入第一细胞群中以获得第一修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原；将第二载体引入第二细胞群中以获得第二修饰细胞群，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；以及向受试者施用有效量的第一修饰细胞群和第二修饰细胞群，其中：第一抗原与第二抗原不同；并且与施用有效量的第二修饰细胞群而非第一修饰细胞群的受试者中细胞扩增水平相比，施用有效量的第一修饰细胞群和第二修饰细胞群的受试者中细胞扩增水平更高。

本公开还描述了用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：将第一载体引入第一细胞群中以获得第一修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原；将第二载体引入第二细胞群中以获得第二修饰细胞群，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；以及向受试者施用有效量的第一修饰细胞群和第二修饰细胞群，其中：第一抗原与第二抗原不同。

本公开还描述了用于增强患有癌症的受试者的治疗的方法，该方法包括：将第一载体引入第一细胞群中以获得第一修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原；将第二载体引入第二细胞群中以获得第二修饰细胞群，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；以及向受试者施用有效量的第一修饰细胞群和第二修饰细胞群，其中：第一抗原与第二抗原不同；并且与施用有效量的第二修饰细胞群而非第一修饰细胞群的受试者中肿瘤生长抑制水平相比，施用有效量的第一修饰细胞群的受试者中肿瘤生长抑制水平更高。

本公开还描述了用于增强T细胞应答的方法，该方法包括：将第一载体引入第一细胞群中，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原；将第二载体引入第二细胞群中，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；将表达第二抗原的细胞与第一细胞群和第二细胞群接触；以及测量T细胞应答水平，其中与响应于与第二细胞群接触而没有与第一细胞群接触的细胞的T细胞应答水平相比，响应于与第一细胞群和第二细胞群接触的细胞的T细胞应答水平更高。

本公开还描述了用于增强T细胞应答的方法，该方法包括：将细胞群与第一载体和第二载体接触以获得修饰细胞群，第一载体包含编码第一抗原结合分子的多核苷酸，所述第一抗原结合分子结合第一抗原，第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，所述第二抗原结合分子结合第二抗原；将表达第二抗原的细胞与修饰细胞群接触；以及测量T细胞应答水平，其中：与接触过第二载体而没有接触过第一载体的细胞群接触的细胞中T细胞应答水平相比，与通过第一载体和第二载体接触获得的修饰细胞群接触的细胞中T细胞应答水平更高。

细胞包括巨噬细胞、树突状细胞或淋巴细胞，诸如T细胞或NK细胞。在实施方案中，细胞是T细胞。在实施方案中，第一抗原结合分子可结合WBC的细胞表面分子。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19。

在实施方案中，第二抗原结合分子可结合实体瘤抗原。在实施方案中，实体瘤抗原是肿瘤相关MUC1(tMUC1)、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、CLDN 18.2、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII或EGFR。

在实施方案中，第一结合分子和第二结合分子是CAR。在实施方案中，CAR包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且细胞外结构域结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包括选自以下各项的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。在实施方案中，细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

在实施方案中，第一结合分子是CAR，第二结合分子是TCR。在实施方案中，T细胞包括修饰的T细胞受体(TCR)。在实施方案中，TCR来源于患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。在实施方案中，TCR包括TCRγ和TCRδ链、或TCRα和TCRβ链、或其组合。

在实施方案中，第二细胞群来源于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在实施方案中，可以分离T细胞克隆物，所述T细胞克隆物可表达对靶抗原具有高亲和力的TCR。可以在肽负载的抗原呈递细胞(APC)存在下培养TIL或外周血单核细胞(PBMC)，所述肽表示当存在于特定HLA等位基因背景下时已知可引起显性T细胞应答的表位。然后可以基于MHC-肽四聚体染色和/或识别和裂解靶细胞的能力来选择高亲和力克隆物，所述靶细胞用低滴定浓度的同源肽抗原负载。在选择克隆物后，通过分子克隆鉴定和分离TCRα和TCRβ链或TCRγ和TCRδ链。例如，对于TCRα和TCRβ链，然后使用TCRα和TCRβ基因序列来生成表达构建体，所述表达构建体可理想地促进人T细胞中两条TCR链的稳定、高水平表达。然后可生成转导媒介物(例如γ逆转录病毒或慢病毒)并测试其功能性(抗原特异性和功能亲合力)，将其用于产生大量的临床载体。等分试样的最终产品然后可用于转导靶T细胞群(通常从患者PBMC中纯化)，所述靶T细胞群在输注到患者之前进行扩增。

可实施各种方法来获得编码肿瘤反应性TCR的基因。更多信息提供在Kershaw等人,Clin Transl Immunology.2014年5月；3(5):e16中。在实施方案中，特异性TCR可来源于患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。此类别中包括的抗原包括黑色素细胞分化抗原MART-1和gp100，以及MAGE抗原和NY-ESO-1，它们在更广泛的癌症中表达。只要病毒蛋白由转化细胞表达，对病毒相关的恶性肿瘤具有特异性的TCR也可以被分离。此类别中的恶性肿瘤包括与肝炎和乳头瘤病毒相关的肝癌和宫颈癌，以及与爱泼斯坦-巴尔病毒相关的恶性肿瘤。在实施方案中，TCR的靶抗原包括CEA(例如，针对结肠直肠癌)、gp100、MART-1、p53(例如，针对黑色素瘤)、MAGE-A3(例如，黑色素瘤、食管肉瘤和滑膜肉瘤)和NY-ESO-1(例如，针对黑色素瘤和肉瘤以及多发性骨髓瘤)。

在实施方案中，可以按照下列方式实施肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的制备和输注。例如，在无菌条件下获得来自外科手术或活检样本的肿瘤组织，并将其运送到冰箱中的细胞培养室中。去除坏死组织和脂肪组织。将肿瘤组织切成约1-3立方毫米的小块。加入胶原酶、透明质酸酶和DNA酶，并在4℃下消化过夜。用0.2μm过滤器进行过滤，并通过淋巴细胞分离液在1500rpm下离心5min分离和收集细胞。在包含PHA、2-巯基乙醇和CD3单克隆抗体的培养基中扩增细胞，并且可以加入小剂量的IL-2(10-20IU/ml)来诱导激活和增殖。在37℃、5％CO₂下，仔细测量细胞密度并将其维持在0.5-2×10⁶/ml的范围内7-14天。可以通过共培养筛选出具有杀死同源癌细胞能力的TIL阳性细胞。可以在含有高剂量的IL-2(5000-6000IU/ml)的无血清培养基中扩增TIL阳性细胞，直到获得大于1×10¹¹的TIL。为了施用TIL，首先使用连续离心法将其收集在盐水中，然后通过血小板施用装置过滤至200-300mL的体积，其中含有5％的白蛋白和450000IU的IL-2。可以在30-60分钟内通过中心静脉导管将TIL输注到患者体内。在实施方案中，可以将TIL输注到2至4个单独的袋子中，并且每次输注可以间隔若干小时。

在实施方案中，修饰细胞群包括：包含第一结合分子的细胞；和包含第二结合分子的细胞。在实施方案中，修饰细胞群包括：包含第一结合分子的细胞、包含第二结合分子的细胞、以及包含第一结合分子和第二结合分子两者的细胞。

在实施方案中，T细胞应答的增加是基于CAR拷贝数的增加和/或释放的细胞因子(例如IL-6和IFN-γ)量的增加。在实施方案中，T细胞应答包括细胞因子释放、细胞扩增和/或激活水平。在实施方案中，第一载体还包含编码IL-6或IFNγ或其组合的多核苷酸。在实施方案中，第一载体还包含编码IL-12的多核苷酸。在实施方案中，多核苷酸包括编码NFAT和/或VHL的多核苷酸。在实施方案中，修饰细胞群包括：表达第一结合分子以及IL-6或IFNγ或其组合的细胞，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子和第二结合分子的细胞；和/或表达第一结合分子和IL-12的细胞。在实施方案中，修饰细胞群包括：表达第二结合分子以及IL-6或IFNγ或其组合的细胞；表达第二结合分子的细胞；表达第一结合分子和第二结合分子的细胞；和/或表达第一结合分子和IL-12的细胞。在实施方案中，修饰细胞群包括：表达第二结合分子以及IL-6或IFNγ或其组合的细胞；表达第二结合分子的细胞；表达第一结合分子和第二结合分子的细胞；和/或表达第二结合分子和IL-12的细胞。在实施方案中，修饰细胞群包括表达显性失活形式PD-1的细胞。

本公开描述了编码至少两个不同抗原结合结构域的核酸。在实施方案中，存在与WBC表面上的抗原结合的第一抗原结合结构域，并且存在与肿瘤上的抗原结合的第二抗原结合结构域，肿瘤上的抗原不同于WBC表面上的抗原。第一抗原结合结构域的功能在于使细胞扩增，所述细胞中引入了第一抗原结合结构域，而第二抗原结合结构域的功能在于与靶抗原结合后，抑制含有靶肿瘤抗原的肿瘤细胞生长或杀死所述肿瘤细胞。在实施方案中，本文描述的核酸编码同一核酸分子上的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。在实施方案中，两个抗原结合结构域由两个单独的核酸分子编码。例如，第一核酸编码第一抗原结合结构域，第二核酸编码第二抗原结合结构域。

在实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域在两个不同的结合分子(第一结合分子和第二结合分子)上，诸如第一CAR和第二CAR。作为实例，第一CAR包括与B细胞表面上的标志物结合的细胞外结合结构域，第二CAR包括与肿瘤细胞的靶抗原结合的细胞外结合结构域。在实施方案中，第一CAR和第二CAR由不同核酸编码。在实施方案中，第一CAR和第二CAR是两个不同的结合分子，但由单个核酸编码。

在实施方案中，两个不同的抗原结合结构域可在同一结合分子上，例如在双特异性CAR上，并由单个核酸编码。在实施方案中，双特异性CAR可具有由接头连接在一起的两个不同的scFv分子。

双特异性CAR(或串联CAR(tanCAR))可包括两个结合结构域：scFv1和scFv2。在实施方案中，scFv1结合白细胞抗原(例如，CD19)，scFv2结合实体瘤抗原(例如，tMUC1)。在实施方案中，scFv1结合一种实体瘤抗原，scFv2结合另一种实体瘤抗原(例如，tMUC1和CLDN18.2)。Claudin18.2(CLDN 18.2)是Claudin-18的胃特异性亚型。CLDN 18.2在胃癌和胰腺癌中高度表达。在实施方案中，scFv1结合在肿瘤细胞上而非正常组织上表达的抗原(例如，tMUC1)；scFv2结合在与实体瘤相关的非必需组织上表达的抗原，并且杀死组织的正常细胞不会对受试者造成危及生命的事件(例如，并发症)(例如，TSHR、GUCY2C)。非必需组织的实例包括诸如前列腺、乳腺这样的器官、或黑色素细胞。在实施方案中，scFv1和scFv2结合在相同非必需组织上表达的不同抗原(例如，针对前列腺癌的ACPP和SLC45A3，以及针对尿路上皮癌的SIGLEC15和UPK2)。

在实施方案中，两个不同的抗原结合结构域可在CAR和T细胞受体(TCR)上并由单独的核酸编码。TCR的结合结构域可靶向肿瘤细胞上的特异性肿瘤抗原或肿瘤标志物。在实施方案中，TCR结合结构域是靶向特异性肿瘤抗原的TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域。在实施方案中，TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链。

本公开还描述了包含本文所述的核酸的载体。在实施方案中，单个载体包含编码第一CAR和第二CAR或TCR(含有第二抗原结合结构域)的核酸。在实施方案中，第一载体包含编码第一CAR的第一核酸，第二载体包含编码第二CAR或TCR的核酸。在实施方案中，载体包含编码双特异性CAR的核酸，所述双特异性CAR至少包括两个不同的抗原结合结构域。在实施方案中，包括本文所述的核酸的载体是慢病毒载体。

此外，本公开描述了包含本文所述的核酸或载体的修饰细胞。将细胞与本文所述的核酸或载体一起引入，并表达至少一个或多个不同的抗原结合结构域。在实施方案中，细胞表达一个抗原结合结构域。在实施方案中，细胞包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合与WBC的细胞表面分子不同的抗原。在实施方案中，第二抗原结合结构域可结合肿瘤抗原。在实施方案中，细胞是修饰的T细胞。在实施方案中，修饰的T细胞是CAR T细胞，所述CAR T细胞包括编码第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的一种或多种核酸。在实施方案中，修饰的细胞包括含有TCR的T细胞，所述TCR包括第二抗原结合结构域。

此外，本公开描述了包含本文所述的混合修饰细胞群的组合物。在实施方案中，修饰的细胞包括修饰的淋巴细胞、修饰的树突状细胞和修饰的巨噬细胞。在实施方案中，修饰的淋巴细胞是修饰的T细胞或修饰的NK细胞。在实施方案中，修饰的T细胞是CAR T细胞。

本公开还描述了混合修饰细胞群，其有效用于在患者中扩增和/或维持修饰的细胞。在实施方案中，混合修饰细胞群的实例包括以下各项：(1)表达用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域的第一修饰细胞以及表达用于杀死靶细胞(诸如肿瘤细胞)的抗原结合结构域的第二修饰细胞；(2)(1)的修饰细胞以及表达至少两个不同抗原结合结构域的其他修饰细胞，所述两个不同抗原结合结构域为：用于扩增和/或维持修饰细胞的第一抗原结合结构域；和用于杀死靶细胞的第二抗原结合结构域(其中两个不同的抗原结合结构域在同一细胞上表达)；(3)表达至少两个不同抗原结合结构域的修饰细胞，所述两个不同抗原结合结构域为：用于扩增和/或维持修饰细胞的第一抗原结合结构域；和用于杀死靶细胞的第二抗原结合结构域(其中两个不同的抗原结合结构域在同一细胞上表达)；(4)表达用于杀死靶细胞的抗原结合结构域的修饰细胞以及表达至少两个抗原结合结构域的修饰细胞，所述两个抗原结合结构域为：用于扩增和/或维持修饰细胞的第一抗原结合结构域；和用于杀死靶细胞的第二抗原结合结构域(其中两个不同的抗原结合结构域在同一细胞上表达)；或(5)表达用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域的修饰细胞以及表达至少两个抗原结合结构域的修饰细胞，所述两个抗原结合结构域为：用于扩增和/或维持修饰细胞的第一抗原结合结构域；和用于杀死靶细胞的第二抗原结合结构域(其中两个不同的抗原结合结构域在同一细胞上表达)。在实施方案中，两个抗原结合结构域是不同的分子。在实施方案中，用于扩增修饰细胞的抗原结合结构域(第一抗原结合结构域)是结合WBC(诸如B细胞)的抗原结合结构域，用于杀死靶细胞(诸如肿瘤细胞)的抗原结合结构域(第二抗原结合结构域)是结合肿瘤的抗原结合结构域。在实施方案中，结合B细胞的抗原结合结构域结合B细胞的表面抗原，例如CD19，结合肿瘤的抗原结合结构域结合肿瘤抗原，例如tMUC1。在实施方案中，肿瘤细胞是实体瘤细胞。

在实施方案中，混合修饰细胞群可包括以下修饰细胞中的至少一种：第一修饰细胞，其表达用来扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域；第二修饰细胞，其表达用来杀死靶细胞(诸如肿瘤细胞)的抗原结合结构域；以及第三修饰细胞，其表达用来扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域和用来杀死靶细胞的抗原结合结构域两者。例如，混合修饰细胞群包括第一修饰细胞和第二修饰细胞，第一修饰细胞和第三修饰细胞，或第二修饰细胞和第三修饰细胞。在实施方案中，第一修饰细胞表达结合WBC抗原(例如，CD19)的CAR；第二修饰细胞表达结合实体瘤抗原的CAR或TCR；第三修饰细胞表达结合WBC抗原的CAR和结合实体瘤抗原的CAR/TCR。据报道，持续的抗原暴露可引起T细胞耗竭。因此，与混合修饰细胞群相比，包括第三修饰细胞的修饰细胞群的耗竭率更高。例如，在WBC抗原存在下，与包括第一修饰细胞和第二修饰细胞的混合修饰细胞群相比，包括单独第三修饰细胞的修饰细胞群的耗竭率更高。TCR的实体瘤抗原的实例包括TPO、TGM3、TDGF1、TROP2、LY6K、TNFSF13B、HEG1、LY75、HLA-G、CEACAM8、CEACAM6、EPHA2、GPRC5D、PLXDC2、HAVCR1、CLEC12A、CD79B、OR51E2、CDH17、IFITM1、MELTF、DR5、SLC6A3、ITGAM、SLC44A1、RHOC、CD109、ABCG2、ABCA10、ABCG8、5t4、HHLA2、PRAME、CDH6、ESR1、SLC2A1、GJA5、ALPP、FGD2、PMEL、CYP19A1、MLANA、STEAP1、SSX2、PLAC1、ANKRD30A、CPA2、TTN、ZDHHC23、ARPP21、RBPMS、PAX5、MIA、CIZ1、AMACR、BAP31、IDO1、PGR、RAD51、USP17L2、OLAH、IGF2BP3、STS、IGF2、ACTA1、或CTAG1。

本文所述的混合修饰细胞群包括约1％至10％的表达第一抗原结合结构域的修饰细胞；50％至60％的表达第二抗原结合结构域的修饰细胞；以及约10％的表达第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者的修饰细胞(其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域在单个细胞中表达)。

本公开还描述了培养本文所述的细胞的方法。本文所述的方法包括获得包含第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的细胞，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合与WBC的细胞表面分子不同的抗原；以及在一种试剂的存在下培养细胞，所述试剂衍生自WBC的细胞表面分子或衍生自第二抗原结合结构域所结合的抗原。在实施方案中，试剂是WBC的细胞表面分子的细胞外结构域。

本公开还描述了培养本文所述的混合细胞群的方法。本文所述的方法包括获得包含第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的混合细胞群，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合与WBC的细胞表面分子不同的抗原；以及在一种试剂的存在下培养细胞，所述试剂衍生自WBC的细胞表面分子或衍生自第二抗原结合结构域所结合的抗原。在实施方案中，试剂是WBC的细胞表面分子的细胞外结构域。

本公开描述了用于体外细胞制备的方法，其中方法包括提供细胞；将本文所述的编码第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的一种或多种核酸引入细胞中，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合与WBC的细胞表面分子不同的抗原；以及在一种试剂的存在下培养细胞，所述试剂衍生自WBC的细胞表面分子或衍生自第二抗原结合结构域所结合的抗原。方法提供了包括第一抗原结合结构域的基因修饰细胞，包括第二抗原结合结构域的细胞，以及包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者的细胞。方法提供了具有单个抗原结合结构域的细胞以及表达两个抗原结合结构域的细胞。方法还提供了混合细胞群，所述混合细胞群包括含有单个抗原结合结构域的细胞以及表达两个抗原结合结构域的细胞。此外，方法提供了包含本文所述的混合细胞群的组合物。

本公开描述了使用所制备的细胞制剂、混合细胞群、或混合细胞群的组合物来增强和维持患癌受试者中的T细胞扩增，以便有效杀死受试者中的致癌细胞。在实施方案中，方法包括将本文所述的多种核酸引入T细胞中，获得混合修饰T细胞群，所述多种核酸编码结合实体瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)或TCR和/或编码结合WBC抗原的CAR；以及向受试者施用有效量的混合修饰细胞群，其中混合修饰细胞群的实例包括以下各项：(1)含有结合实体瘤抗原的CAR或TCR的T细胞以及含有结合WBC抗原的CAR的T细胞；(2)(1)的T细胞以及另外的含有(i)结合实体瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞((i)和(ii)两者在单个修饰T细胞中)；(3)含有(i)结合实体瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞((i)和(ii)两者在单个修饰T细胞中)；(4)含有结合实体瘤抗原的CAR或TCR的T细胞以及含有(i)结合实体瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞((i)和(ii)两者在单个修饰T细胞中)；或(5)含有结合WBC抗原的CAR的T细胞以及含有(i)结合实体瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞((i)和(ii)两者在单个修饰T细胞中)。在实施方案中，WBC是B细胞。此外，本公开描述了用于在受试者中引入和/或增强淋巴细胞(T细胞)应答的方法，其中应答针对治疗剂(例如细胞因子)或针对治疗受试者的疗法。本文描述的实施方案涉及扩增和/或维持淋巴细胞的机制以及涉及CAR与肿瘤细胞结合的机制。在实施方案中，第一种机制涉及与扩增和/或维持受试者中淋巴细胞相关的分子，而另一种机制涉及与抑制受试者中肿瘤细胞生长或杀死受试者中肿瘤细胞的分子。在实施方案中，这些机制涉及信号转导，并且负责信号转导的分子或分子的结构域也涉及本文所述的机制。例如，第一种机制包括结合与血液(诸如血细胞和血浆)或非必需组织相关的抗原的CAR，另一种机制包括靶向与肿瘤细胞相关的抗原的CAR或TCR。非必需组织的实例包括乳腺、结肠、胃腺、卵巢、血液组分(诸如WBC)和甲状腺。在实施方案中，第一种机制涉及分子的第一抗原结合结构域，另一种机制涉及分子的第二抗原结合结构域。在实施方案中，第一种机制和另一种机制由混合修饰细胞群执行。在实施方案中，一种机制涉及表达与肿瘤细胞相关的抗原的细胞，而另一种机制涉及表达细胞表面抗原的淋巴细胞(诸如B细胞)。在实施方案中，结合实体瘤抗原的CAR是双特异性CAR。在实施方案中，结合WBC抗原的CAR是双特异性CAR。

本文所述的方法涉及表达扩增分子和功能分子的淋巴细胞。在实施方案中，扩增分子扩增和/或维持受试者中的淋巴细胞，功能分子抑制受试者中肿瘤细胞的生长或杀死受试者中的肿瘤细胞。在实施方案中，扩增分子和功能分子在单个CAR分子上，例如双特异性CAR分子。在实施方案中，扩增分子和功能分子在单独的分子上，例如，CAR和TCR或两个不同的CAR。扩增分子可以包括结合与血液(例如血细胞和血浆)或非必需组织相关的抗原的CAR，功能分子可以包括靶向与肿瘤细胞相关的抗原的CAR或TCR。

受试者中的淋巴细胞或T细胞应答是指与辅助细胞、杀伤细胞、调节细胞和其他类型的T细胞相关的细胞介导免疫。例如，T细胞应答可包括诸如在免疫过程中协助其他WBC以及鉴定和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞的活动。受试者中的T细胞应答可通过各种指标进行测量，诸如：T细胞杀死的病毒感染细胞和/或肿瘤细胞的数量；在体内和/或与病毒感染细胞和/或肿瘤细胞共同培养时T细胞释放的细胞因子(例如，IL-6和IFN-γ)的量，这表明受试者中的T细胞增殖水平，T细胞的表型改变(例如记忆T细胞的改变)以及受试者中T细胞的寿命或生命水平。

在实施方案中，本文所的增强T细胞应答的方法可有效地治疗有需要的受试者，例如，诊断有肿瘤的受试者。术语肿瘤是指肿块，其可以是诸如血液的流体聚集体，或者是实体肿块。肿瘤可以是恶性的(癌性的)或良性的。血液癌症的实例包括慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤。

实体瘤通常不包含囊肿或液体区域。恶性实体瘤的主要类型包括肉瘤和癌瘤。肉瘤是在称为间质细胞的软组织细胞中发展的肿瘤，其可以存在于血管、骨骼、脂肪组织、韧带淋巴管、神经、软骨、肌肉、韧带或肌腱中，而癌瘤是在上皮细胞中形成的肿瘤，其存在于皮肤和粘膜中。最常见的肉瘤类型包括涉及软组织和骨细胞的未分化多形性肉瘤；涉及遍布血管、胃肠道和子宫的平滑肌细胞的平滑肌肉瘤；涉及骨细胞的骨肉瘤以及涉及脂肪细胞的脂肪肉瘤。肉瘤的一些实例包括尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、软骨肉瘤、间皮瘤、纤维肉瘤、纤维肉瘤和神经胶质瘤。

五种最常见的癌瘤包括涉及产生流体或粘液的器官(诸如乳腺和前列腺)的腺癌；涉及皮肤最外层细胞的基底细胞癌，例如皮肤癌；涉及皮肤基底细胞的鳞状细胞癌；以及影响泌尿道中的移行细胞的移行细胞癌，所述泌尿道包括膀胱、肾脏和输尿管。癌瘤的实例包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、肾癌和膀胱癌以及胆管癌。

本文描述的方法可用于治疗诊断有癌症的受试者。癌症可以是血癌或可以是实体瘤，诸如肉瘤或癌瘤。治疗方法包括向受试者施用有效量的本文所述的混合T细胞群以提供T细胞应答，所述混合T细胞群包含第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合与WBC的细胞表面分子不同的抗原。在实施方案中，增强受试者中的T细胞应答包括在体内选择性增强T细胞的增殖，所述T细胞表达第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。

用于增强受试者中T细胞应答的方法包括向受试者施用包含CAR或双特异性CAR的T细胞，所述双特异性CAR包括两个不同的抗原结合结构域；以及施用包含第一CAR和第二CAR的T细胞，其中第一CAR和第二CAR各自包括不同的抗原结合结构域。

在实施方案中，本文所述的用于增强受试者中T细胞应答的方法包括向受试者施用包含CAR分子和TCR分子的T细胞。CAR分子靶向或结合白细胞的表面标志物，TCR分子结合在肿瘤细胞表面或内部表达的肿瘤标志物或抗原。

在实施方案中，用于增强有需要的受试者中T细胞应答的方法包括向受试者施用混合修饰细胞群或包含混合修饰细胞群的组合物。混合修饰T细胞群的实例包括以下各项：(1)含有结合WBC抗原的CAR的T细胞以及含有结合肿瘤抗原的CAR或TCR的T细胞；(2)(1)的T细胞以及另外的含有(i)结合肿瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞((i)和(ii)两者在单个修饰T细胞中)；(3)含有(i)结合肿瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞((i)和(ii)两者在单个修饰T细胞中)；(4)含有结合肿瘤抗原的CAR或TCR的T细胞以及含有(i)结合实体瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞；或(5)含有结合WBC抗原的CAR的T细胞以及含有(i)结合实体瘤抗原的CAR或TCR和(ii)结合WBC抗原的CAR两者的T细胞((i)和(ii)两者在单个修饰T细胞中)。在实施方案中，受试者被诊断具有实体瘤。在实施方案中，肿瘤抗原是实体瘤抗原，例如tMUC1。在实施方案中，WBC是B细胞，抗原是B细胞抗原。在实施方案中，B细胞抗原是CD19。在实施方案中，肿瘤抗原是tMUC1，WBC的抗原是CD19。

本公开描述了在体内扩增和/或维持表达抗原结合结构域的细胞的方法。方法包括向受试者施用有效量的本文所述的混合修饰细胞群或包含混合修饰细胞群的组合物。本文所述的这些方法可用于扩增T细胞、NK细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞。

本文所述的混合修饰T细胞群包括第一CAR和/或第二CAR或TCR。在实施方案中，第一CAR包含第一抗原结合结构域，第二CAR或TCR包含第二抗原结合结构域。例如，第一CAR和第二CAR或TCR包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。第一CAR和第二CAR的细胞质结构域包括用于传递信号以激活细胞应答的共刺激结构域和CD3ζ结构域。在实施方案中，第一CAR和第二CAR或TCR在不同修饰T细胞上表达。在实施方案中，第一CAR和第二CAR或TCR在同一修饰T细胞上表达。

在实施方案中，在本文所述的混合修饰T细胞群中，第一CAR的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域且不存在CD3ζ结构域，使得激活或刺激第一CAR扩增WBC(诸如淋巴细胞)，而不会引入和/或激活靶向WBC的修饰T细胞的杀伤功能，其中所述第一CAR包含用于扩增和/或维持修饰T细胞的抗原结合结构域。在实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在实施方案中，当第一CAR的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域且不存在CD3ζ结构域时，第二CAR包括CD3ζ结构域。

在实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域在同一CAR(第一CAR)上，例如具有细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质结构域的双特异性CAR。细胞外抗原结合结构域包括至少两个scFv，并且scFv中的至少一个用作结合WBC的细胞表面分子的第一抗原结合结构域。在实施方案中，双特异性CAR在修饰T细胞上表达。

在实施方案中，与WBC的细胞表面分子不同的抗原是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138、CD13、B7-H3、CAIX、CD123、CD133、CD171、CD171/L1-CAM、CEA、Claudin 18.2、cMet、CS1、CSPG4、Dectin1、EGFR、EGFR vIII、EphA2、ERBB受体、ErbB T4、ERBB2、FAP、叶酸受体1、FITC、叶酸受体1、FSH、GD2、GPC3、HA-1H/HLA-A2、HER2、IL-11Ra、IL13受体a2、IL13R、IL13Rα2(zetakine)、Kappa、白血病、LewisY、间皮素、MUC1、NKG2D、NY-ESO-1、PSMA、ROR-1、TRAIL受体1或VEGFR2。

在实施方案中，MUC1是人MUC1的肿瘤排他性表位，并且第一CAR和第二CAR或TCR被表达为单独的多肽。在实施方案中，MUC1是人MUC1的肿瘤形式(tMUC1)。

在实施方案中，在本文所述的混合修饰细胞群中，第一CAR可包括共刺激结构域且不具有CD3ζ结构域的信号传导结构域，所述第一CAR包括用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域，而CAR(第二CAR)可包括MUC1结合结构域、跨膜结构域、共刺激和CD3ζ结构域。

如本文所用，术语“MUC1”是指如下所定义的分子。MUC1是上皮粘蛋白家族分子之一。MUC1是通常在主要器官的所有腺上皮细胞上表达的跨膜粘蛋白糖蛋白。在正常细胞中，MUC1仅在腔面上表达，并被碳水化合物隔离的核心蛋白高度糖基化。随着细胞转化为恶性表型，MUC1的表达增加数倍，并且表达不再局限于腔面，而是遍布细胞表面和细胞质中。另外，肿瘤相关的MUC1(tMUC1)的糖基化异常，其中肽核的暴露量比正常组织中表达的MUC1中存在的量更大。

MUC1在许多上皮癌中广泛表达，并且异常糖基化使其在结构和抗原上相异于非恶性细胞表达的MUC1(参见，例如Barratt-Boyes,1996；Price等人,1998；Peterson等人,1991)。MUC1的主要形式是一种高分子量分子，其包含具有大量的二十个氨基酸串联重复单元的高度免疫原性细胞外粘蛋白样结构域、跨膜区和胞质尾区(Quin等人,2000；McGucken等人,1995；Dong等人,1997)。

在包括乳腺和胰腺在内的大多数上皮腺癌中，MUC1是过表达且异常糖基化的。乳腺和胰腺的腺癌不仅过表达MUC1，而且使MUC1进入循环。高MUC1血清水平与进行性疾病相关。由于抗原内表达的表位具有复杂性和异质性，因此MUC1被用作未来的生物标志物。由癌性组织合成的MUC1(例如，肿瘤相关的MUC1)通常表现出异常的低聚糖特性(profile)，这会引起新标志物(neomarker)诸如唾液酸化-Lea(在CA19-9测试中测定)、唾液酸化-Lex和唾液酸化-Tn(TAG-72)，以及隐性表位诸如Tn的表达。

几种针对MUC1的抗体正在开发用于治疗。培妥木单抗(Pemtumomab)(又称为HMFG1)作为将放射性同位素钇-90递送到卵巢癌肿瘤中的载体正处于III期临床试验中(Scott等人对其进行了综述,2012)。CA15-3(又称为HMFG1抗体)、CA27-29和CA19-9均是MUC1的抗体，其用于评定患有癌症的患者中循环MUC1的水平。然而，这些抗体作为治疗剂或作为生物标志物的作用有限，因为它们不能有效地区分正常的上皮细胞与转化的肿瘤上皮细胞上表达的MUC1。换句话说，这些抗体似乎都没有靶向肿瘤相关MUC1(tMUC1)表位。

对肿瘤相关形式的MUC1(tMUC1)具有高度特异性的新抗体称为TAB-004，其描述在美国专利号8,518,405中(还参见Curry等人,2013)。虽然使用人乳脂肪球作为抗原开发出培妥木单抗(HMFG1)(Parham等人,1988)，但使用表达MUC1的改变形式的肿瘤开发了TAB-004(Tinder等人,2008)。TAB-004可识别MUC1串联重复序列内改变的糖基化表位。该区域可用于tMUC中的抗原检测，但由于糖基化的大分支而无法在正常MUC1中进行抗原检测(Gendler,2001；Mukherjee等人,2003b；Hollingsworth&Swanson,2004；Kufe,2009)。重要地，TAB-004与其他MUC1抗体识别的表位不同，其具有独特的重链和轻链的互补决定区(CDR)。该抗体以3ng/ml(20pM)的高结合亲和力与靶抗原结合，并且不会与无关的抗原结合(Curry等人,2013)。因此，TAB-004可区分MUC1的正常形式与肿瘤形式，而HMFG1(培妥木单抗)不能(参见美国专利号8,518,405)。

在实施方案中，第一CAR包含第一抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ结构域，和/或第二CAR包含第二抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ结构域。

在实施方案中，抗原结合结构域是Fab或scFv。在实施方案中，第一CAR和第二CAR被表达为单独的多肽。

在实施方案中，第一抗原结合结构域在CAR上，第二抗原结合结构域在T细胞受体(TCR)上。在实施方案中，TCR是修饰的TCR。在实施方案中，TCR来源于患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括CEA、gp100、tMUC1、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。

如本文所使用，“甲状腺抗原”是指在甲状腺细胞上表达或由甲状腺细胞表达的抗原。甲状腺细胞的实例包括滤泡细胞和滤泡旁细胞。人TSHR是促甲状腺激素(TSH)的受体，其存在于甲状腺膜上。当垂体分泌的TSH与甲状腺滤泡细胞膜上的TSHR结合时，甲状腺分泌具有代谢功能的T3和T4。TSHR是具有约95,000至100,000道尔顿分子量的七次跨膜受体。据报道，人促甲状腺激素受体(TSHR)包括三个结构域：富含亮氨酸的结构域(LRD；氨基酸36–281)、切割结构域(CD；氨基酸282–409)和跨膜结构域(TMD；氨基酸410–699)。发现人促甲状腺激素(hTSH)α链可结合LRD表面和CD表面上的许多氨基酸。如本文所使用，“TSHR”是指人促甲状腺激素受体。该术语应解释为不仅包括人促甲状腺激素受体，而且还包括其变体、同源物、片段和部分，其程度是其变体、同源物、片段和部分保留了人促甲状腺激素受体与本文所公开的人促甲状腺激素受体的抗体或配体结合的能力。

在某些实施方案中，抗原是胃或结肠的抗原。如本文所使用，“结肠抗原”是指在结肠细胞上表达或由结肠细胞表达的抗原。结肠细胞的实例包括杯状细胞和肠上皮细胞。鸟苷酸环化酶2C(GUCY2C)主要在小肠上皮细胞中表达。GUCY2C是腹泻性细菌肠毒素(ST)和肠旁分泌激素鸟苷蛋白和尿鸟苷蛋白的受体。这些配体调节小肠上皮细胞和肾上皮细胞中的水和电解质运输，并最终导致急性分泌性腹泻。如本文所使用，“GUCY2C”是指人鸟苷酸环化酶2C。该术语应解释为不仅包括人鸟苷酸环化酶2C，而且还包括其变体、同源物、片段和部分，其程度是其变体、同源物、片段和部分保留了鸟苷酸环化酶2C与本文所公开的人鸟苷酸环化酶2C的抗体或配体结合的能力。Claudin18.2(CLDN 18.2)是Claudin-18的胃特异性亚型，并且在胃和胰腺腺癌中高度表达。

在实施方案中，可分离表达对靶抗原具有高亲和力的TCR的T细胞克隆物。可以在多肽负载的抗原呈递细胞(APC)存在下培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或外周血单核细胞(PBMC)，所述多肽代表已知的可用于引起显性T细胞应答的表位，所述显性T细胞应答为当存在于特定的HLA等位基因背景下时的应答；然后可以基于MHC-肽四聚体染色和/或识别和裂解靶细胞的能力来选择高亲和力克隆物，所述靶细胞用低滴定浓度的同源肽抗原负载。在选择克隆物后，通过分子克隆鉴定和分离TCRα和TCRβ链或TCRγ和TCRδ链。例如，对于TCRα和TCRβ链，然后使用TCRα和TCRβ基因序列来生成表达构建体，所述表达构建体可理想地促进人T细胞中两条TCR链的稳定、高水平表达。然后可生成转导媒介物(例如γ逆转录病毒或慢病毒)并测试其功能性(抗原特异性和功能亲合力)，将其用于产生大量的临床载体。等分试样的最终产品然后可用于转导靶T细胞群(通常从患者PBMC中纯化)，所述靶T细胞群在输注到患者之前进行扩增。

可实施各种方法来获得编码肿瘤反应性TCR的基因。更多信息提供在Kershaw等人,Clin Transl Immunology.2014年5月；3(5):e16中。在实施方案中，特异性TCR可来源于患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。此类别中包括的抗原包括黑色素细胞分化抗原MART-1和gp100，以及MAGE抗原和NY-ESO-1，它们在更广泛的癌症中表达。只要病毒蛋白由转化细胞表达，对病毒相关的恶性肿瘤具有特异性的TCR也可以被分离。此类别中的恶性肿瘤包括与肝炎和乳头瘤病毒相关的肝癌和宫颈癌，以及与爱泼斯坦-巴尔病毒相关的恶性肿瘤。在实施方案中，TCR的靶抗原可包括CEA(例如，针对结肠直肠癌)、gp100、MART-1、p53(例如，针对黑色素瘤)、MAGE-A3(例如，黑色素瘤、食管肉瘤和滑膜肉瘤)、NY-ESO-1(例如，针对黑色素瘤和肉瘤以及多发性骨髓瘤)。

在实施方案中，第一CAR包含第一抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ结构域，和/或第二CAR包含第二抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ结构域。

在实施方案中，第一CAR和第二CAR被表达为单独的多肽。

在实施方案中，第二CAR的细胞质结构域或跨膜结构域被修饰使得第二CAR能够通过表达CD19的细胞来激活修饰的T细胞，同时不会损害表达CD19的细胞。

本文所述的实施方案涉及双特异性嵌合抗原受体，其包含：第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、细胞质结构域和跨膜结构域，其中第一抗原结合结构域识别第一抗原，第二抗原结合结构域识别第二抗原，第一抗原与第二抗原不同。

在实施方案中，第一抗原和第二抗原不在同一细胞上表达。在实施方案中，第一抗原是血液组分的抗原，第二抗原是实体瘤的抗原。

血细胞是指红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板或其他血细胞。例如，RBC是通过血流流经循环系统而将氧气(O2)递送到身体组织的血细胞。血小板是参与止血的细胞，致使血块形成。WBC是涉及防御身体免受传染性疾病和异物侵害的免疫系统的细胞。存在许多不同类型和子类型的WBC，每种都有不同的作用。例如，粒细胞、单核细胞和淋巴细胞是白细胞的3种主要类型。存在三种不同形式的粒细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。

WBC的细胞表面分子是指在WBC表面上表达的分子。例如，淋巴细胞的细胞表面分子可包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56和CD30。B细胞的细胞表面分子可包括CD19、CD20、CD22、BCMA。单核细胞的细胞表面分子可包括CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169和CD1c。粒细胞的细胞表面分子可包括CD33、CD38、CD138和CD13。

在实施方案中，本公开描述了增强有需要的受试者中T细胞应答或治疗受试者肿瘤的方法，方法包括：向受试者施用有效量的本文所述的混合修饰T细胞群或包含混合修饰T细胞群的组合物，从而提供T细胞应答，使得通过表达CD19的细胞在受试者血液中扩增CART细胞。在实施方案中，方法还可以包括将B细胞输注到受试者中以继续激活和/或扩增CART细胞。例如，可在CAR T细胞输注之前获得并储存受试者的B细胞或来自健康供体的基因修饰B细胞。在实施方案中，方法还可以包括施用表达CD19的细胞或至少包含CD19的细胞外结构域的多肽或CAR T细胞识别的抗原。例如，表达CD19的细胞可包括用编码CD19的核酸序列转导的细胞系，诸如K562和NK92。在实施方案中，方法还可以包括识别表达第一CAR和第二CAR两者的CAR T细胞，以及向受试者施用标识物CAR T细胞。例如，MUC1可以与分选标志物相关，使得可及时识别表达MUC1的CAR T细胞。

在实施方案中，本公开描述了体内细胞扩增和维持的方法。在实施方案中，方法可包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的混合修饰T细胞群，从而提供T细胞应答；以及施用有效量的表达可溶性试剂的呈递细胞(例如，T细胞)，所述可溶性试剂为CAR的细胞外结构域可识别的。在实施方案中，方法可实施以增强有需要的受试者中的T细胞应答。方法可包括向受试者施用有效量的包含CAR的混合修饰T细胞群，从而提供T细胞应答；以及施用有效量的表达可溶性试剂的呈递细胞以增强受试者中的T细胞应答，所述可溶性试剂为CAR的细胞外结构域可识别的。在某些实施方案中，呈递细胞是T细胞、树突状细胞和/或抗原呈递细胞。在某些实施方案中，增强受试者中的T细胞应答可以包括选择性增强包含CAR的T细胞的增殖。在实施方案中，方法可用于使用修饰T细胞来增强对受试者病状的治疗。方法可包括施用表达试剂的细胞群或施用被配制成疫苗的试剂。在这些情况下，修饰T细胞包含编码CAR的核酸，并且CAR的细胞外结构域可识别所述试剂。在实施方案中，方法可实施以增强患有疾病的受试者中修饰T细胞的增殖。方法可包括制备包含CAR的修饰T细胞；向受试者施用有效量的修饰T细胞；将编码试剂的核酸引入细胞中，所述试剂是CAR的细胞外结构域可识别的；以及向受试者施用有效量的细胞(所述引入了所述编码试剂的核酸)。在实施方案中，可基于T细胞基因组DNA中CAR分子拷贝数的增加来测量T细胞扩增。在实施方案中，可基于对T细胞上表达的分子进行的流式细胞分析来测量T细胞扩增。

本文所述的实施方案涉及混合修饰T细胞群，所述混合修饰T细胞群包括在单独T细胞和/或在同一T细胞中的第一CAR和第二CAR或TCR，其中第一CAR的抗原结合结构域结合诸如CD19、CD33、CD14和BCMA等的抗原，第二CAR的抗原结合结构域结合肿瘤相关的MUC。在实施方案中，肿瘤相关的MUC是MUC1(例如tMUC1)或MUC2。本文所述的实施方案涉及包含混合修饰T细胞群的组合物，并且涉及增强有需要的受试者中T细胞应答或治疗受试者肿瘤的方法，方法包括：施用有效量的混合修饰T细胞群。

在实施方案中，本文所述的CAR分子的细胞质结构域包含共刺激结构域和CD3ζ结构域。在实施方案中，本文所述的CAR分子可包含共刺激结构域且不具有相应的CD3ζ结构域组分。在实施方案中，本文所述的CAR分子可包含CD3ζ结构域且不具有共刺激结构域。

在实施方案中，修饰的细胞包含以下受体的显性失活变体：程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B淋巴细胞和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞激活蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)或CD160。在实施方案中，修饰的细胞还包含编码自杀基因的核酸序列，和/或自杀基因包括HSV-TK自杀基因系统。在实施方案中，与相应的野生型T细胞相比，分离的T细胞包含减少量的TCR。

显性失活突变具有改变的基因产物，所述基因产物对野生型等位基因起拮抗作用。这些突变通常导致分子功能改变(通常是无活性的)，并且特征在于显性或半显性表型。在实施方案中，本文所述的修饰细胞包含显性失活(DN)形式的PD-1受体。在实施方案中，DNPD-1受体在本文所述的修饰细胞中的表达由诱导型基因表达系统调节。在实施方案中，诱导型基因表达系统是lac系统、四环素系统或半乳糖系统。

本公开描述了药物组合物。药物组合物包含以下各项中的一种或多种：本文所述的CAR分子、TCR分子、修饰的CAR T细胞、包含CAR或TCR的修饰细胞、混合修饰细胞群、核酸以及载体。药物组合物以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的数量和频率将由诸如患者的病状以及患者疾病的类型和严重程度等因素来确定。

术语“药学上可接受的”意指由美国联邦或州政府的监管机构或EMA(欧洲药品管理局)批准或在《美国药典》(美国药典-33/国家处方-28重新发行，由美国药典公约公司，马里兰州罗克维尔(Rockville)出版，出版日期：2010年4月)或其他公认的药典中列出可用于动物，尤其是人类。

术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全的和不完全的))、赋形剂或媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油，动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

本公开还描述了药物组合物，其包含本文所述的第一细胞群和第二细胞群。本文所述的药物组合物包含适用于癌症治疗的第一细胞群和第二细胞群，所述第一细胞群包含第一抗原结合分子，所述第二细胞群包含第二抗原结合结构域。例如，第一抗原结合分子与抗原的结合可增强适用于癌症治疗的细胞的扩增。

本公开还描述了使用本文所述的适用于癌症治疗的细胞来增强癌症治疗的方法。方法包括向患有表达肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的第一组合物，第一组合物包含第一细胞(例如，T细胞)群，所述第一细胞群包含结合第一抗原的第一抗原结合分子(例如，CAR)；以及向受试者施用有效量的第二组合物，第二组合物包含具有第二抗原结合分子的细胞群。可以同时地或分开地，例如依次地执行第一组合物和第二组合物的施用。关于适用于癌症治疗的细胞的更多信息，可以参见Eyileten等人，Immune Cells in CancerTherapy and Drug Delivery,Mediators Inflamm.2016；2016:5230219，所述参考文献以引用的方式并入本文。

在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的结合实体瘤抗原的CAR T细胞群。在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的结合实体瘤抗原的T细胞(用于TCR和TIL治疗的T细胞)群。在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的表达结合实体瘤抗原的CAR的NK细胞群或NK细胞。在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的表达结合实体瘤抗原的CAR的NK细胞群或NK细胞。在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的表达结合实体瘤抗原的CAR的DC细胞群或DC细胞。在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的表达结合实体瘤抗原的CAR的巨噬细胞群或巨噬细胞。在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的表达结合实体瘤抗原的CAR的中性粒细胞群或中性粒细胞。在实施方案中，方法包括施用有效量的结合WBC抗原的CAR T细胞群；以及施用有效量的结合或靶向实体瘤抗原的淋巴细胞群。在实施方案中，实体瘤抗原可位于细胞表面上(例如，TSHR)、肿瘤微环境的细胞外基质上(例如，αvβ5整联蛋白)和/或肿瘤细胞内(例如，gp100)。

当指示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗有效量”时，可以由医生考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及病状的个体差异来确定待施用的本公开的组合物的精确量。可以这样说，包含本文所述的修饰细胞的药物组合物可以在10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量下施用，优选地在10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量下施用，包括那些范围内的所有整数值。修饰细胞组合物还可以在这些剂量下施用多次。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病病征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。在某些实施方案中，可需要向受试者施用激活的T细胞，然后再抽血(或进行单采)，收集激活的和扩增的T细胞，并向患者再输注这些激活的和扩增的T细胞。此过程可以每几周进行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活T细胞。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注的方案可以选择出某些T细胞群。

在实施方案中，可向有需要的受试者依次或同时施用治疗有效量的混合修饰细胞群。作为两种不同修饰细胞的混合群的一个实例，可以在施用治疗有效量的含有用于杀死靶细胞的抗原结合结构域的修饰细胞之前、之后或同时，施用治疗有效量的含有用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域的修饰细胞。作为两种不同修饰细胞的混合群的另一个实例，可以在施用治疗有效量的同时含有扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域以及杀死靶细胞的抗原结合结构域的修饰细胞(在单个修饰细胞中)之前、之后或同时，施用治疗有效量的含有用于杀死靶细胞的抗原结合结构域的修饰细胞。作为三种不同修饰细胞的混合群的一个实例，所述混合群包括(1)含有用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域的修饰细胞，(2)含有用于杀死靶细胞的抗原结合结构域的修饰细胞，以及(3)同时含有扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域和杀死靶细胞的抗原结合结构域两者的修饰细胞(在单个修饰细胞中)，可以根据任何顺序依次(1、2、3；2、3、1；3、1、2；1、3、2；2、1、3；或3、2、1)或同时(1+2+3同时)施用有效量的(1)、(2)和(3)。此外，可以将三种修饰细胞中的两种进行组合，并与在组合之前或之后施用的第三种一起施用。例如，可以在(3)之前或之后施用(1)和(2)的组合；或可以在(2)之前或之后施用(1)和(3)的组合；或可以在(1)之前或之后施用(2)和(3)的组合。

本文所述的药物组合物的施用可以在任何方便的方式下进行，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或或腹膜内向患者施用。在实施方案中，本文所述的修饰细胞组合物通过皮内或皮下注射向受试者施用。在实施方案中，本公开的T细胞组合物通过静脉内注射来施用。修饰细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在实施方案中，可结合任何数量的相关治疗方法(例如，在之前、同时或之后)向患者施用细胞，例如作为联合疗法，所述细胞通过使用本文描述的方法或本领域已知的其他方法进行激活和扩增，其中T细胞被扩增至治疗水平；所述相关治疗方法包括但不限于：使用抗病毒疗法的试剂西多福韦和白介素-2、阿糖孢苷(也称为ARA-C)的治疗；或针对MS患者的那他珠单抗治疗；或针对牛皮癣患者的依法珠单抗治疗或针对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方案中，本文描述的T细胞可与以下各项组合使用：化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消除剂(诸如CAM PATH)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达立滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导至关重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun 73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun5:763-773,1993；Isoniemi(同上))。在实施方案中，将本文描述的细胞组合物与骨髓移植、T细胞消融疗法(使用诸如氟达拉滨的化学治疗剂)、外部束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)结合(例如在之前、同时或之后)向受试者施用。在实施方案中，在B细胞消融疗法之后施用本文描述的细胞组合物。例如，可向患者施用与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗(Rituxan)。在实施方案中，受试者可以经历高剂量化学疗法的标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植之后，受试者接受输注本公开的扩增的免疫细胞。在实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。待向有需要的受试者施用的上述治疗的剂量将随所治疗的病状的确切性质和治疗的接受者而变化。可以根据各种因素，由医师根据本领域公认的实践来进行用于人类施用的剂量缩放比例。关于使用修饰细胞进行癌症治疗的方法的其他信息可参见美国专利号US8,906,682，所述美国专利以引用的方式整体并入。

本文所述的实施方案涉及用于体外制备修饰细胞的方法。方法可以包括从受试者中获得细胞样品。例如，样品可以包括T细胞或T细胞祖细胞。方法还可以包括用至少编码CAR的DNA转染细胞样品，以及在培养基中离体培养细胞样品，所述培养基可选择性增强表达CAR的T细胞的增殖。细胞样品可以是本文所述的混合修饰细胞群。

在实施方案中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血，或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，细胞样品通过单采或静脉穿刺获得。在实施方案中，细胞样品是T细胞亚群。

本公开的实施方案涉及锌指核酸酶(ZFN)，其包含DNA结合结构域和DNA切割结构域，所述DNA结合结构域包含锌指DNA结合蛋白，所述DNA切割结构域包含切割结构域和/或切割半结构域。锌指DNA结合蛋白可包含1、2、3、4、5、6或更多个锌指，每个锌指均具有与靶基因中的靶亚位点结合的识别螺旋。在实施方案中，锌指蛋白包含3、4、5、6个指状物(其中指状物被命名为F1、F2、F3、F4、F5和F6，并且从N末端至C末端顺序排列为F1至F3、F4或F5或F6)，并且指状物包含表5所示的识别区的氨基酸序列。切割结构域和/或切割半结构域的实例包括野生型或工程化的FokI切割半结构域。在实施方案中，DNA切割结构域包括野生型切割结构域或切割半结构域(例如，FokI切割半结构域)。在实施方案中，切割结构域和/或切割半结构域包括工程化的(非天然存在的)切割结构域或切割半结构域，例如，形成专性异二聚体的工程化FokI切割半结构域。在实施方案中，基因是人类基因。在实施方案中，切割结构域包括野生型或工程化的FokI切割结构域。实施方案涉及多核苷酸，其编码本文所述的分离的ZFN。实施方案涉及包含多核苷酸的载体。在实施方案中，载体是腺病毒或慢病毒载体。实施方案涉及分离的细胞或细胞系，其包含本文所述的分离的ZFN。在实施方案中，分离的细胞是干细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在实施方案中，细胞是T细胞，所述T细胞衍生自从人类供体分离的原代人T细胞。在实施方案中，细胞对以下内源基因的表达降低：CTLA4、LAG3、BTLA、TIM3、FOXP3、SIVA1或LGALS9。在实施方案中，各种基因编辑技术或过表达技术(例如，Cas9、TALEN和ZFN)可用于通过敲除、敲低、过表达或插入一个或多个基因来调节T/NK细胞功能。在实施方案中，靶基因是Runx3。例如，与相应的野生型细胞相比，修饰的T/NK细胞增加了Runx3的表达。作为实例，增加Runx3的表达可有助于T细胞在肿瘤细胞内浸润或长期驻留，从而增加T细胞杀伤作用。在实施方案中，修饰的细胞是修饰的干细胞、修饰的T细胞或修饰的自然杀伤(NK)细胞。在实施方案中，修饰的细胞是T细胞，所述T细胞衍生自从人类供体分离的原代人T细胞。在实施方案中，细胞降低以下内源基因的表达：CTLA4、LAG3、BTLA、TIM3、FOXP3、SIVA1和LGALS9。

CTLA4是用作T细胞应答的主要负调节因子的抑制性受体。T淋巴细胞受体CTLA-4以比刺激性共受体CD28更高的亲合力与共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)结合，并且负调节T细胞激活。LAG3是免疫球蛋白超家族的成员，并且在激活的T细胞和NK细胞的表面上表达。也在B细胞、树突状细胞、TIL和Treg的表面上检测到LAG3。阻断LAG3可显著增加T细胞增殖和功能。TIM3是由CD4+T辅助细胞1(Th1)、CD8+T细胞毒性1细胞(Tc1)和Th17细胞组成性表达的免疫检查点受体。TIM3与其配体半乳凝集素-9LGALS9之间的相互作用被认为可导致T细胞应答的抑制。FOXP3是转录调节因子的叉头状/有翼状螺旋家族的成员，其对调节性T细胞(Treg)的发育和抑制功能至关重要。SIVA1诱导CD27介导的细胞凋亡，抑制BCL2L1亚型Bcl-x(L)抗凋亡活性，抑制NF-κB的激活，并且促进T细胞受体介导的细胞凋亡。

实施方案涉及修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中使用ZFN使内源基因失活。

在实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在实施方案中，与原代人T细胞的移植物抗宿主疾病(GVHD)应答相比，修饰的T细胞在生物不相容的人受体中的GVHD应答降低。

在实施方案中，CAR的抗原结合结构域与FZD10、TSHR、PRLR、Muc17、GUCY2C、CD207、CD19或CD20结合。

在实施方案中，CAR的抗原结合结构域与以下各项中的至少一种结合：B7、BCMA、CAIX、CD123、CD133、CD138、CD171、CD171/L1-CAM、CD19、CD2、CD22、CD30、CD33、CEA、cMet、CS1、CSPG4、Dectin1、EGFR、EGFR vIII、EphA2、ERBB受体、ErbB T4、ERBB2、FAP、叶酸受体1、FITC、叶酸受体1、GD2、GPC3、HA-1H/HLA-A2、HER2、IL-11Ra、IL13受体a2、IL13R、IL13Rα2(zetakine)、Kappa、LewisY、间皮素、MUC1、NKG2D、NY-ESO-1、PSMA、ROR-1、TRAIL-受体1或VEGFR2。

在实施方案中，CAR的共刺激结构域包括选自以下各项的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。

在实施方案中，修饰的细胞包含编码hTERT的核酸序列、或编码SV40LT的核酸或其组合。在实施方案中，修饰的细胞包含编码hTERT的核酸序列和编码SV40LT的核酸。在实施方案中，hTERT的表达由诱导型表达系统调节。在实施方案中，SV40LT基因的表达由诱导型表达系统调节。在实施方案中，诱导型表达系统是rTTA-TRE，其增加或激活SV40LT基因或hTERT基因或其组合的表达。在实施方案中，修饰的细胞包含编码自杀基因的核酸序列。在实施方案中，自杀基因包括HSV-TK自杀基因系统。在这些情况下，可诱导修饰的细胞发生凋亡。

本公开描述了治疗受试者中的癌症的方法，方法包括向受试者施用本文所述的混合修饰细胞群，其中癌症选自以下各项：肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、结肠直肠癌、白血病、卵巢癌、淋巴瘤和脑癌。

本文所述的方法包括修饰的T细胞和/或修饰的NK细胞，与相应的野生型细胞相比，所述修饰的T细胞和/或修饰的NK细胞包含减少的量的一种或多种肽，所述一种或多种肽包括PD1、PDL1、PDL2、CTLA4、LRBA、LAG3、Tim3、BILA、CD160、2B4、SOCS1、SOCS3、Foxp3、CCR4、PVRIG、CD16B、SIVA1、CD33、LAGLS9、CD122、IDO1、CD45、Cvp1b1、TNFAIP8L2、ID02、TD02、DNMT3A和/或癌胚抗原细胞粘附分子-1(Ceacam-1)(列表1)。在实施方案中，治疗受试者中的癌症的方法包括将混合基因修饰T细胞群施用到受试者中时，增强这些T细胞和/或NK细胞(具有减少的量的上面所列的一种或多种肽)的修饰T细胞和/或NK细胞应答。方法包括修饰的T细胞和/或修饰的NK细胞，与相应的野生型细胞相比，所述修饰的T细胞和/或修饰的NK细胞包含增加的量的一种或多种肽，所述一种或多种肽包括Runx3、lexm、PILRA、Ptnns1L3、Fcgr3a、Nat8、Ccl9、Hck、Trem2、Ccl6、Cd36、Igf1、Ctss、Gzmc、Batf、Cxcl2、TNFAIP8L3、Il1b、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、Rgs1、PLSCR1、ITGB2、C3AR1、ITGA3、ITGA5、ITGAL、batf、batf3、Cxcl2、CARD11和/或CD83。在实施方案中，治疗受试者中的癌症的方法包括将修饰的T细胞和/或修饰的NK细胞施用到受试者中时，增强这些T细胞和/或NK细胞(具有增加的量的上面所列的一种或多种肽)的T细胞和/或NK细胞应答。在实施方案中，各种基因编辑技术或过表达技术(例如，Cas9、TALEN和ZFN)可用于通过敲除/敲低/过表达/插入一个或多个基因来调节T细胞和/或NK细胞的功能，所述一个或多个基因可编码列表1或2中的一种或多种肽。

在实施方案中，靶基因是Runx3。例如，与相应的野生型细胞相比，修饰的T细胞增加了Runx3的表达。在这些情况下，增加Runx3的表达可有助于例如修饰T细胞在肿瘤细胞内浸润或长期驻留，因此增加了T细胞的杀伤作用。

例如，受试者中的T细胞应答是指与辅助、杀伤、调节和其他类型的T细胞相关的细胞介导免疫。例如，T细胞应答可以包括诸如在免疫过程中协助其他白细胞以及鉴定和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞的活动。受试者中的T细胞应答可通过各种指标进行测量，诸如：T细胞杀死的病毒感染细胞和/或肿瘤细胞的数量，与病毒感染细胞和/或肿瘤细胞共同培养时T细胞释放的细胞因子的量，受试者中T细胞的增殖水平，T细胞的表型改变(例如记忆T细胞的改变)以及受试者中T细胞的寿命或生命期限。

T细胞应答还包括细胞因子释放。虽然细胞因子释放通常与疾病的全身性炎症和并发症相关，但细胞因子释放似乎也与CAR T细胞疗法的疗效相关。诸如在CAR T细胞疗法中，细胞因子释放可与过继性转移细胞的扩增和进行性免疫激活相关。本公开描述了效应子细胞因子(诸如IFN-γ)以及促炎性和抗炎性细胞因子(诸如IL-6)的释放，所述释放响应于本文所述的混合修饰T细胞群，尤其响应于第一CAR和第二CAR或TCR的存在，所述第一CAR包含用于扩增细胞的抗原结合结构域，所述第二CAR或TCR包含用于杀死靶细胞的抗原结合结构域。在实施方案中，本公开描述了在受试者中释放IL-6和IFN-γ，所述受试者被引入了本文所述的第一CAR和第二CAR或TCR。在实施方案中，受试者是有癌症治疗需要的，并且癌症治疗是胰腺癌治疗。在实施方案中，本公开描述了通过测量细胞因子释放的水平来确定CAR T细胞疗法的疗效或监测其疗效。在实施方案中，与使用包含第二CAR而不包含第一CAR的T细胞的CAR T细胞疗法相比，响应于使用本文所述的混合修饰T细胞群的CAR T细胞疗法在受试者中进行的细胞因子(例如，IL-6和/或IFN-γ)释放更多。

在实施方案中，本文所述的修饰细胞还可以包含以下受体的显性失活变体：程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B淋巴细胞和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞激活蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)或CD 160，使得可以增强由混合修饰细胞群诱导的T细胞应答。在实施方案中，本文所述的修饰细胞还可以包含编码自杀基因的核酸序列，和/或包含HSV-TK自杀系统的自杀基因，使得可以控制修饰细胞的命运。例如，如果治疗对受试者有危险，和/或受试者遭受不良影响，或者如果治疗已经完成，满足一定的要求条件，和/或超过了预定时间，则可以诱导T细胞发生凋亡。

本公开描述了包含本文所述的混合修饰细胞群的组合物。在实施方案中，存在第一修饰细胞群和第二修饰细胞群，所述第一修饰细胞群包含结合第一抗原的第一CAR，所述第二修饰细胞群包含结合与第一抗原不同的第二抗原的第二CAR或TCR。第一抗原可以是WBC的抗原，诸如B细胞，而第二抗原是肿瘤抗原。本公开描述了增强第二修饰细胞群的扩增和维持的方法，所述第二修饰细胞群可用于杀死肿瘤细胞。方法包括向受试者施用有效量的包含混合修饰细胞群的组合物，所述受试者具有的癌症形式与第二CAR识别并结合的肿瘤抗原相关。实施方案还包括增强有需要的受试者中T细胞应答或治疗患癌受试者的方法。方法包括向受试者施用有效量的本文所述的组合物，所述受试者具有的癌症形式与第二CAR识别并结合的肿瘤抗原相关。其他实施方案包括增强受试者中修饰细胞的扩增和/或维持的方法，方法包括：使T细胞与第一载体和第二载体接触，从而获得本文所述的混合修饰细胞群的组合物，所述第一载体包含编码第一CAR的第一核酸序列，所述第二载体包含编码第二CAR的第二核酸序列；以及向受试者施用有效量的组合物，所述受试者具有的癌症形式与第二CAR识别并结合的肿瘤抗原相关。其他实施方案包括增强有需要的受试者中T细胞应答或治疗患癌受试者的方法，方法包括：使T细胞与第一载体和第二载体接触，从而获得本文所述的混合修饰细胞群的组合物，所述第一载体包含编码第一CAR的第一核酸序列，所述第二载体包含编码第二CAR的第二核酸序列；以及向受试者施用有效量的组合物，所述受试者具有的癌症形式与第二CAR识别并结合的肿瘤抗原相关。实施方案包括增强受试者中修饰细胞的扩增和维持的方法，方法包括：施用有效量的本文所述的混合修饰细胞群的组合物。

在实施方案中，组合物至少包含第一修饰细胞群和第二修饰细胞群。第一修饰细胞群包含编码第一CAR(例如，CD19、CD22和BCMA CAR)的多核苷酸和编码一种或多种细胞因子(例如，IL-6、IL12和IFNγ)的多核苷酸。第二修饰细胞群包含编码第二CAR的多核苷酸，所述第二CAR结合实体瘤抗原。例如，组合物包含第一修饰细胞群、第二修饰细胞群、第三修饰细胞群和第四修饰细胞群。第一修饰细胞群包含编码CAR的多核苷酸，所述CAR结合WBC抗原和IL-6。第二修饰细胞群包含编码CAR的多核苷酸，所述CAR结合实体瘤抗原。第三修饰细胞群包含编码CAR的多核苷酸，所述CAR结合WBC抗原和IL-12(例如，。第四修饰细胞群包含编码CAR的多核苷酸，所述CAR结合WBC抗原和IFNγ。这些WBC抗原可以是相同的(例如，CD19)或不同的(例如，CD19和BCMA)。基于第一预定比率，可以将第一修饰细胞群、第三修饰细胞群和第四修饰细胞群进行混合，得到修饰细胞组，然后可以基于第二预定比率将所述修饰细胞组与第二修饰细胞群进行混合，获得包含混合修饰细胞群的组合物。预定比率用来控制受试者中一种或多种细胞因子的表达量，从而在受试者中实现可控、持续且有效的细胞因子效用，同时细胞毒性降低。在实施方案中，设定第一修饰细胞群、第三修饰细胞群和第四修饰细胞群的第一预定比率，使得包含编码IFNγ的多核苷酸的修饰细胞多于包含编码IL-12或IL-6的多核苷酸的修饰细胞。例如，第一预定比率为1:1:10。在实施方案中，确定第二预定比率，使得包含编码第二CAR的修饰细胞(例如，第二修饰细胞群)多于包含编码第一CAR的多核苷酸的修饰细胞(例如，第一修饰细胞群、第二修饰细胞群和/或第三修饰细胞群)。例如，第一修饰细胞群和第二修饰细胞群的第二预定比率小于1:1，但大于1:10,000。在实施方案中，第二预定比率为1:1、1:10、1:100、1:1000和1:10⁴，以及所述范围内的各个数，例如1:10、1:100或1:1000。在实施方案中，第二预定比率在1:10与1:1000之间。在实施方案中，第二预定比率在1:10与1:100之间。在实施方案中，第二预定比率在1:1与1:100之间。在实施方案中，从受试者或健康供体中获得细胞(例如，NK细胞、T细胞、B细胞、髓源性细胞等)，并将其分成至少两组。这些细胞组可以分别用两个或更多个载体转移。如果从健康供体中获得，这些细胞还可以被进一步修饰。在实施方案中，第二修饰细胞群不表达一种或多种细胞因子。

在实施方案中，编码第一CAR的多核苷酸以重组DNA构建体、mRNA或病毒载体的形式存在于修饰细胞中。在实施方案中，多核苷酸是mRNA，其并未整合到修饰细胞的基因组中，从而使得修饰细胞在有限的时间段内表达第一CAR(例如，CD19 CAR)。

在实施方案中，混合修饰细胞群还包括表达第三CAR的第三修饰细胞群和/或表达第四CAR的第四修饰细胞群，从而使得由不同修饰细胞群引起的免疫应答可以耦合以增强CAR T治疗。在实施方案中，CAR可以被TCR或CAR和TCR的组合替代。

实施方案涉及通过及时实施多次CAR T细胞输注来增强CAR T疗法的方法。方法包括从受试者或健康供体中获得PBMC；使用所获得的PBMC制备CAR T细胞；培养CAR T细胞，例如培养预定的时间；向受试者施用一部分的培养CAR T细胞；观察和/或测量受试者血液中的CAR T细胞；当血液中的CAR T细胞水平达到预定值时或当CAR T细胞回到器官(例如，淋巴结)时，施用第二部分的培养CAR T细胞。例如，最先输注的CAR T细胞可以在器官中被选择性激活和扩增，并引起受试者的免疫应答。因此，输注第二部分的CAR T细胞可以与所述免疫应答耦合以增强第二CAR T细胞群的激活和/或扩增，从而增强CAR T疗法。

本公开描述了包含修饰细胞群的组合物，所述修饰细胞群包括第一修饰细胞群和/或第二修饰细胞群，所述第一修饰细胞群包含第一CAR而不具有第二CAR，所述第二修饰细胞群包含第二CAR而不具有第一CAR。本公开还描述了包含修饰细胞群的组合物，所述修饰细胞群包含第一CAR和第二CAR(在单个修饰细胞中)。在实施方案中，组合物包含第一修饰细胞群和第二修饰细胞群以及第三修饰细胞群，这些修饰细胞群包含编码同一修饰细胞中的第一CAR和第二CAR的一种或多种核酸序列。在实施方案中，组合物包含第二修饰细胞群和第三修饰细胞群，而不包含第一基因修饰细胞群，所述第三修饰细胞群包含编码同一修饰细胞中的第一CAR和第二CAR的一种或多种核酸序列。

实施方案涉及使用编码抗原结合分子的多核苷酸和/或治疗剂来增强修饰细胞扩增或增强受试者中T细胞应答的方法，或者涉及编码抗原结合分子的多核苷酸和/或治疗剂在增强修饰细胞扩增或增强受试者中T细胞应答的用途。方法或用途包括：提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或其变体)，所述载体基因组包含多核苷酸，其中多核苷酸与赋予多核苷酸转录的表达控制元件可操作地连接；以及向受试者施用一定量的病毒颗粒，使得多核苷酸在受试者中表达。在实施方案中，AAV制剂可以包含AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供了基本上不含AAV空衣壳的AAV产品。关于病毒颗粒施用和制备的更多信息可参见美国专利号9840719和Milani等人,Sci.Transl.Med.11,eaav7325(2019)，2019年5月22日，所述参考文件以引用的方式并入本文。

在实施方案中，多核苷酸可整合到修饰细胞的基因组中，并且修饰细胞的后代也将表达多核苷酸，从而产生稳定转染的修饰细胞。在实施方案中，修饰细胞表达编码CAR的多核苷酸，但多核苷酸并未整合到修饰细胞的基因组中，从而使得修饰细胞在有限的时间段内(例如，几天)表达瞬时转染的多核苷酸，其后多核苷酸会通过细胞分裂或其他因素而失去。例如，多核苷酸以重组DNA构建体、mRNA或病毒载体的形式存在于修饰细胞中，和/或多核苷酸是mRNA，所述多核苷酸并未整合到修饰细胞的基因组中。

在实施方案中，第一细胞群包含第一CAR和第二CAR，第二细胞群包含第一CAR但不包含第二CAR。在实施方案中，第一细胞群包含第一CAR和第二CAR，第二细胞群包含第一CAR和第二CAR。在实施方案中，第一细胞群包含第一CAR但不包含第二CAR，第二细胞群包含第一CAR和第二CAR。在实施方案中，第一细胞群包含第一CAR但不包含第二CAR，第二细胞群包含第二CAR但不包含第一CAR。在实施方案中，第一细胞群包含第二CAR但不包含第一CAR，第二细胞群包含第一CAR和第二CAR。在实施方案中，第一细胞群包含第一CAR但不包含第二CAR；第二细胞群包含第二CAR但不包含第一CAR；第三细胞群包含第一CAR和第二CAR。如本文所述，第一CAR包括用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合结构域，第二CAR用于杀死靶细胞诸如肿瘤的抗原结合结构域。

在实施方案中，抗原结合结构域结合一种抗原，所述抗原是或包括白细胞(WBC)的细胞表面分子、肿瘤抗原或实体瘤抗原。在实施方案中，WBC是T细胞、NK细胞或树突状细胞。

在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子或抗原是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子或抗原是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子或抗原是CD19。

在实施方案中，肿瘤抗原是实体瘤抗原。在实施方案中，实体瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。在实施方案中，实体瘤抗原是或包括肿瘤相关MUC1(tMUC1)、TSHR、GUCY2C、ACPP、CLDN18.2(18.2)、PSMA或UPK2。

在实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ结构域。在实施方案中，共刺激结构域包括以下的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、或其组合。在实施方案中，第二CAR包括结合tMUC1的结合结构域和包括CD28的细胞内结构域的共刺激结构域；和/或第一CAR包括结合CD19的结合结构域和包括4-1BB的细胞内结构域的共刺激结构域。

在实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群还包含存在于T细胞上的显性失活形式的检查点蛋白或检查点蛋白受体(例如，PD-1)。在实施方案中，第一细胞群包含载体，所述载体包含编码第一CAR和显性失活形式PD-1的核酸。

实施方案涉及包括向患癌患者施用有效量的第二T细胞群的方法，所述第二T细胞群包括含有结合tMUC1的scFv的第二CAR。第二CAR还可以包含4-1BB或CD28的细胞内结构域、CD3ζ结构域。在实施方案中，方法还包括向患者施用有效量的第一T细胞群，所述第一T细胞群包括含有结合CD19的scFv的第一CAR，从而增强患者中第二T细胞群的扩增。所述CAR还可以包含4-1BB或CD28的细胞内结构域、以及CD3ζ结构域。

在实施方案中，第二CAR包含CD28的细胞内结构域，第一CAR包含4-1BB的细胞内结构域。在这种情况下，与包含4-1BB的细胞内结构域的第二CAR和/或包含CD28的细胞内结构域的第一CAR相比，包含CD19的第一T细胞群可对患者产生较少的不良反应(例如，CRS)，和/或包含tMUC1的第二T细胞群可产生增强的T细胞应答(例如，杀伤作用)。在实施方案中，第二CAR包含CD28的细胞内结构域，使得与包含4-1BB的细胞内结构域的第二CAR相比，第二T细胞群可产生增强的T细胞应答(例如，杀伤作用)。在实施方案中，第一CAR包含4-1BB的细胞内结构域，使得与包含CD28的细胞内结构域的第一CAR相比，第一T细胞群可对患者产生较少的不良反应(例如，CRS)。

在实施方案中，第二细胞群包含结合实体瘤抗原的scFv，但不包含结合B细胞抗原的scFv；第一细胞群包含结合与实体瘤抗原不同的抗原(例如，WBC抗原或B细胞抗原)的scFv，但不包含结合肿瘤抗原的scFv。在这些情况下，由第一T细胞群与抗原(例如，CD19)之间的结合而诱导的患者T细胞应答可导致第一T细胞群和第二T细胞群扩增。因此，可以向患者施用混合的基因工程化T细胞群，所述混合基因修饰T细胞群主要由第一细胞群和第二细胞群组成。在实施方案中，可以向患者施用第二基因工程化T细胞群和一种或多种重组蛋白(例如，细胞因子IL6和/或INFγ)或表达和分泌一种或多种重组蛋白的细胞，这可诱导与第一T细胞群引起的T细胞应答相似或增强的T细胞应答。在实施方案中，可以向患者施用第二T细胞群和激素类药物(例如，氟维司群)，这可诱导与第一T细胞群引起的T细胞应答相似或增强的T细胞应答。

在实施方案中，第一修饰细胞群还可以包含第三CAR，所述第三CAR包含结合tMUC1的scFv、4-1BB或CD28的细胞内结构域、以及CD3ζ结构域。在实施方案中，第二细胞群不包含结合CD19的scFv。在实施方案中，第一细胞群不包含结合tMUC1的scFv。

在实施方案中，将本文所述的增强受试者中细胞扩增和/或细胞应答的方法与其中仅向受试者施用一种CAR(例如，仅第一CAR或仅第二CAR)和/或并未向受试者施用本文所述的混合细胞群的方法进行比较。在实施方案中，本文所述的混合细胞群可增强细胞的扩增和/或细胞应答。

实施方案涉及用于治疗患癌患者或增强受试者T细胞应答的组合物和方法。方法包括向受试者施用有效量的具有第一CAR的修饰细胞群。第一CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、CD28的共刺激结构域、和/或CD3ζ结构域。方法还可以包括监测和/或测量由修饰细胞诱导的T细胞应答的一个或多个参数。例如，一个或多个参数包括细胞因子释放、淋巴细胞数、以及CAR T细胞扩增和耗竭水平。方法还可以包括响应于预定时间(例如，输注后一周或两周)和/或与所测量的参数相关的状况(例如，CAR的拷贝数和CAR T细胞数)而向受试者施用有效量的包括第二CAR的修饰细胞群。第二CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、4-1BB的共刺激结构域、和/或CD3ζ结构域。据报道，CD28 CAR T细胞和4-1BB CAR T细胞在实验室和在临床上表现不同。因此，所述方法通过将强烈的初始免疫应答与长期而持久的免疫应答结合起来，实现结合两个共刺激结构域的优点。例如，包括CD28的第一CAR可引发强烈的T细胞激活，并与效应子样分化相关。虽然第一CAR可引起T细胞耗竭，但它旨在诱导受试者免疫系统的强烈初始应答。包括4-1BB的第二CAR可减少T细胞耗竭，增强持久性并增加中枢记忆分化和线粒体生物发生，这是专为持久性CAR T疗法而设计的。在实施方案中，由第一CAR诱导的初始应答可增强持久性CAR T疗法。在实施方案中，可同时向受试者施用包括第一CAR的修饰细胞群和包括第二CAR的修饰细胞群。例如，组合物可包含包括第一CAR的修饰细胞群和包括第二CAR的修饰细胞群。在实施方案中，第一CAR结合WBC的抗原，第二CAR结合实体瘤抗原。在实施方案中，第一CAR和第二CAR结合相同或不同的实体瘤抗原。例如，将一种修饰细胞群与另一种修饰细胞群混合在一起，获得混合修饰细胞，所述的一种修饰细胞群包括结合实体瘤抗原(例如，TSHR)并包含4-1BB共刺激结构域的CAR，所述的另一种修饰细胞群包括结合实体瘤抗原(例如，TSHR)或另一种实体瘤抗原(例如，tMuc1)并包含CD28共刺激结构域的CAR。在实施方案中，可以进一步向受试者施用修饰细胞。在实施方案中，可以连同包括结合WBC抗原(例如，CD19)的CAR的修饰细胞群一起，进一步向受试者施用修饰细胞。

在实施方案中，本文所述的CAR分子包含用于结合感兴趣抗原的一个或多个互补决定区(CDR)。CDR是用于结合特异性抗原的免疫球蛋白和T细胞受体中的可变结构域的一部分。每个可变结构域存在3个CDR。由于存在可变重结构域和可变轻结构域，因此存在6个用于结合抗原的CDR。此外，由于抗体具有两条重链和两条轻链，因此抗体总共具有12个用于结合抗原的CDR。在实施方案中，本文所述的CAR分子包含用于结合抗原的一个或多个CDR。在实施方案中，一个或多个CDR可结合WBC(诸如B细胞)的抗原。作为实例，一个或多个CDR可结合CD19(B细胞的细胞表面抗原)。在实施方案中，一个或多个CDR可结合肿瘤抗原，例如tMUC1、TSHR、GUCY2C、ACPP、CLDN18.2(18.2)、PSMA或UPK2。

通过参考以下示例性实施方案和实施例进一步描述本公开。提供这些示例性实施方案和实施例仅出于说明的目的，除非另有说明，否则它们不意图构成限制。因此，本公开决不应解释为限于以下示例性实施方案和实施例，而应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。

实施例

产生编码各个CAR分子的慢病毒载体，并用T细胞转染，详细说明如下。与细胞培养、细胞毒性T淋巴细胞测定构建相关的技术可参见“Control of large,establishedtumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137 domains”，PNAS，2009年3月3日，第106卷第9期，第3360–3365页以及“ChimericReceptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate EnhancedSurvival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy In Vivo,”MolecularTherapy，2009年，第17卷第8期，第1453–1464页，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。

图1：A，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE的平均CAR+％表达，CAR+MFI和CD8+比例均与GUCY2C-CAR无明显区别；B，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE的质粒结构示意图；C，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2SP)NE感染后至Day8的扩增与GUCY2C-CAR无明显区别。同时从mRNA水平上验证了GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE感染T细胞后，CAR，CK和NE的成功转录，证实了正确的质粒构建和成功的感染；D，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE在底物细胞刺激后增殖和释放因子中IL2和Granzyme B与GUCY2C-CAR无明显区别，IL6，IFN-g和TNF-α较GUCY2C-CAR释放更高。

图2：A，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE激活后(采用T84激活)较静息时显著提高了CK和NE的转录；B，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE静息时CK和NE释放水平极低，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE激活后较静息时显著提高了CK和NE的分泌量；C，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE激活后表现出了消化I型胶原蛋白，IV型胶原蛋白和纤连蛋白的能力，而静息状态下不具有消化能力。活性NE蛋白(图2中NE(Active)，为Native人Neutrophil Elastase蛋白(Active)(ab91099)，来自Abcam)作为阳性对照同样具有消化I型胶原蛋白，IV型胶原蛋白和纤连蛋白的能力，10ug/ml的浓度下的效果最佳，高于2ug/ml的浓度下的效果，又高于400ng/ml的浓度下的效果，说明NE的浓度越高，消化能力越强。

图3：A，在CoupledCAR(GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE，CD19-CAR，B细胞)系统下，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE的CK和NE转录水平与静息时无明显区别，远低于抗原依赖激活下的转录水平；B，在CoupledCAR系统下，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE的CK和NE释放与静息时无明显区别，远低于抗原依赖激活下的释放水平。

因此，GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE可以成功包装病毒，感染T细胞，感染的T细胞功能与GUCY2C-CAR无明显区别，在某些因子释放上达到了更高的水平。GUCY2C-NFAT-CK+(IL2 SP)NE感染的T细胞能够成功转录和表达NE和CK，在静息时和CoupledCAR系统下具有极低的本底表达泄漏和消化活性，在遇底物细胞激活后能够显著提高表达水平和消化能力。

图4，A：可以看到，过表达或由NFAT诱导表达CK的CAR正常表达，CD4/CD8分型正常。B：可以看到，ACPP-NFAT-CK具有极低的本底CK转录泄漏，在遇底物细胞PC3-ACPP激活后能够显著提高CK转录水平。

图5，用编码CAR和NE的慢病毒载体转导T细胞，包括NE的原始信号肽。实验发现正常过表达wt的NE无法在上清中检测到NE的释放，而在更改NE的信号肽之后，如图所示，更改了NE的信号肽前后的上清释放数据显示，以IL2 SP和IL2 SP2作为信号肽后NE释放量明显上升。未更改NE原始信号肽的情况(mCD19CAR-2A-NE)下，虽然CAR在这些T细胞上正常表达，但在培养基上清液中几乎没有检测到NE。NE的原始信号肽被慢病毒载体中的其他的信号肽结构域取代后，这些结构域被转导到T细胞中。进一步检测了这些T细胞的NE释放。在这些信号肽中，IL2的信号肽比其他信号肽导致更多的NE释放，并且IL-2的信号肽的短版本(SEQID NO:22)比其他信号肽导致更多的NE释放，包括整个长度IL-2的信号肽。例如，如图5所示，用编码NE和IL2信号肽的载体转导的T细胞比其他T细胞释放出更多的NE。

图6，上图显示过表达或由NFAT诱导表达MMP7的CAR正常表达，CD4/CD8分型正常；下图显示过表达或由NFAT诱导表达MMP7在静息和激活状态下CAR-T细胞上清MMP-7释放量和MMP7 mRNA水平。

图7，GUCY2C-NFAT-IL2 SP NE+CK+MMP7滴度为3.9×10⁸/mL，并成功感染T细胞，CD4/CD8分型正常，表明可以使用慢病毒载体包装体系成功包装同时包括GUCY2C CAR、NE、CK和MMP7四种元件的结构。

图8，上图显示CAR-T过表达MMP9后无法正常转录MMP9；下图显示CAR-T过表达MMP9后无法正常表达CAR+细胞。这些表明，并非所有降解ECM分子的酶(比如MMP9)都可以与CAR共表达。

表2

序列	组成	生物体类型	序列	组成	生物体类型
						1	Anti-GCC ScFv	人工序列	15	MMP9	智人
2	CD8 Hinge	智人	16	MMP7	智人
						3	4-1BB	智人	17	MMP8	智人
4	CD3z	智人	18	MMP3	智人
						5	IL-2 minimal promoter	智人	19	Plasmin	智人
6	NFAT enhancer	人工序列	20	PLAT(tPA)	智人
						7	Active Cathepsin K	智人	21	heparanase	智人
8	P2A	智人	22	IL2 SP	智人
						9	IL-2 signal peptide	智人	23	IL2 SP2	人工序列
10	Active Neutrophil Elastase	智人	24	TPA SP	智人
						11	NE+IL-2SP(1)	人工序列	25	TPA SP2	人工序列
12	NE+IL-2SP(2)	人工序列	26	WT SP	智人
						13	MMP13	智人	27	MMP9	智人
14	MMP2	智人

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指示以引用的方式并入。尽管已根据各种实施方案描述了前述内容，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离其精神的情况下进行各种修改、替换、省略和改变。

序列表

<110> 斯丹赛控股有限公司

美国斯丹赛生物技术公司

<120> 包含编码抗原结合分子的多核苷酸和靶向ECM试剂的多核苷酸的多核苷酸及修饰细胞

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> Anti-GCC ScFv(人工序列)

<400> 1

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln

115 120 125

Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg

165 170 175

Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr

210 215 220

Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 2

<211> 69

<212> PRT

<213> CD8 Hinge(homo sapiens )

<400> 2

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 4-1BB(homo sapiens )

<400> 3

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> CD3z(homo sapiens )

<400> 4

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 5

<211> 113

<212> DNA

<213> IL-2 minimal promoter(homo sapiens )

<400> 5

cattttgaca cccccataat atttttccag aattaacagt ataaattgca tctcttgttc 60

aagagttccc tatcactctc tttaatcact actcacagta acctcaactc ctg 113

<210> 6

<211> 277

<212> DNA

<213> NFAT enhancer(人工序列)

<400> 6

tcgaggtcga cggtatcgat aagcttgata tcgaattagg aggaaaaact gtttcataca 60

gaaggcgtca attaggagga aaaactgttt catacagaag gcgtcaatta ggaggaaaaa 120

ctgtttcata cagaaggcgt caattggtcc catcgaatta ggaggaaaaa ctgtttcata 180

cagaaggcgt caattaggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtcaat taggaggaaa 240

aactgtttca tacagaaggc gtcaattggt cccggga 277

<210> 7

<211> 231

<212> PRT

<213> Active Cathepsin K(homo sapiens )

<400> 7

Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Arg

1 5 10 15

Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val

20 25 30

Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser Val Gly

35 40 45

Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu Asn Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Asp Gly Cys Gly

65 70 75 80

Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Lys Asn Arg Gly

85 90 95

Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Glu Glu Ser Cys

100 105 110

Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr Arg Glu

115 120 125

Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala Arg Val

130 135 140

Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser Phe Gln Phe

145 150 155 160

Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn Ser Asp Asn Leu

165 170 175

Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile Gln Lys Gly Asn Lys

180 185 190

His Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu Asn Trp Gly Asn Lys Gly

195 200 205

Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile Ala Asn

210 215 220

Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met

225 230

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> P2A(homo sapiens )

<400> 8

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> IL-2 signal peptide(homo sapiens )

<400> 9

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

<210> 10

<211> 218

<212> PRT

<213> Active Neutrophil Elastase(homo sapiens )

<400> 10

Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Arg Pro His Ala Trp Pro Phe Met Val

1 5 10 15

Ser Leu Gln Leu Arg Gly Gly His Phe Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ala

20 25 30

Pro Asn Phe Val Met Ser Ala Ala His Cys Val Ala Asn Val Asn Val

35 40 45

Arg Ala Val Arg Val Val Leu Gly Ala His Asn Leu Ser Arg Arg Glu

50 55 60

Pro Thr Arg Gln Val Phe Ala Val Gln Arg Ile Phe Glu Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Pro Val Asn Leu Leu Asn Asp Ile Val Ile Leu Gln Leu Asn Gly

85 90 95

Ser Ala Thr Ile Asn Ala Asn Val Gln Val Ala Gln Leu Pro Ala Gln

100 105 110

Gly Arg Arg Leu Gly Asn Gly Val Gln Cys Leu Ala Met Gly Trp Gly

115 120 125

Leu Leu Gly Arg Asn Arg Gly Ile Ala Ser Val Leu Gln Glu Leu Asn

130 135 140

Val Thr Val Val Thr Ser Leu Cys Arg Arg Ser Asn Val Cys Thr Leu

145 150 155 160

Val Arg Gly Arg Gln Ala Gly Val Cys Phe Gly Asp Ser Gly Ser Pro

165 170 175

Leu Val Cys Asn Gly Leu Ile His Gly Ile Ala Ser Phe Val Arg Gly

180 185 190

Gly Cys Ala Ser Gly Leu Tyr Pro Asp Ala Phe Ala Pro Val Ala Gln

195 200 205

Phe Val Asn Trp Ile Asp Ser Ile Ile Gln

210 215

<210> 11

<211> 714

<212> DNA

<213> NE+IL-2SP (1)(人工序列)

<400> 11

atcgtgggcg gcaggagggc caggccccac gcctggccct tcatggtgag cctgcagctg 60

aggggcggcc acttctgcgg cgccaccctg atcgccccca acttcgtgat gagcgccgcc 120

cactgcgtgg ccaacgtgaa cgtgagggcc gtgagggtgg tgctgggcgc ccacaacctg 180

agcaggaggg agcccaccag gcaggtgttc gccgtgcaga ggatcttcga gaacggctac 240

gaccccgtga acctgctgaa cgacatcgtg atcctgcagc tgaacggcag cgccaccatc 300

aacgccaacg tgcaggtggc ccagctgccc gcccagggca ggaggctggg caacggcgtg 360

cagtgcctgg ccatgggctg gggcctgctg ggcaggaaca ggggcatcgc cagcgtgctg 420

caggagctga acgtgaccgt ggtgaccagc ctgtgcagga ggagcaacgt gtgcaccctg 480

gtgaggggca ggcaggccgg cgtgtgcttc ggcgacagcg gcagccccct ggtgtgcaac 540

ggcctgatcc acggcatcgc cagcttcgtg aggggcggct gcgccagcgg cctgtacccc 600

gacgccttcg cccccgtggc ccagttcgtg aactggatcg acagcatcat ccagatgtac 660

aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac ttgtcacgaa ttcg 714

<210> 12

<211> 714

<212> DNA

<213> NE+IL-2SP (2)(人工序列)

<400> 12

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

atcgtgggcg gcaggagggc caggccccac gcctggccct tcatggtgag cctgcagctg 120

aggggcggcc acttctgcgg cgccaccctg atcgccccca acttcgtgat gagcgccgcc 180

cactgcgtgg ccaacgtgaa cgtgagggcc gtgagggtgg tgctgggcgc ccacaacctg 240

agcaggaggg agcccaccag gcaggtgttc gccgtgcaga ggatcttcga gaacggctac 300

gaccccgtga acctgctgaa cgacatcgtg atcctgcagc tgaacggcag cgccaccatc 360

aacgccaacg tgcaggtggc ccagctgccc gcccagggca ggaggctggg caacggcgtg 420

cagtgcctgg ccatgggctg gggcctgctg ggcaggaaca ggggcatcgc cagcgtgctg 480

caggagctga acgtgaccgt ggtgaccagc ctgtgcagga ggagcaacgt gtgcaccctg 540

gtgaggggca ggcaggccgg cgtgtgcttc ggcgacagcg gcagccccct ggtgtgcaac 600

ggcctgatcc acggcatcgc cagcttcgtg aggggcggct gcgccagcgg cctgtacccc 660

gacgccttcg cccccgtggc ccagttcgtg aactggatcg acagcatcat ccag 714

<210> 13

<211> 387

<212> PRT

<213> MMP13(homo sapiens )

<400> 13

Met His Pro Gly Val Leu Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ser Trp Thr His

1 5 10 15

Cys Arg Ala Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Met

20 25 30

Asn Leu Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Met Thr His Ser

35 40 45

Glu Val Glu Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val Trp Ser Asp Val

50 55 60

Thr Pro Leu Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Ile Ala Asp Ile Met

65 70 75 80

Ile Ser Phe Gly Ile Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly

85 90 95

Pro Ser Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly Pro Asn Tyr Gly

100 105 110

Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr Ser Ser Ser Lys

115 120 125

Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Ser Leu

130 135 140

Gly Leu Asp His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met Phe Pro Ile Tyr

145 150 155 160

Thr Tyr Thr Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp Asp Asp Val Gln

165 170 175

Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp Pro Asn Pro Lys

180 185 190

His Pro Lys Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ala

195 200 205

Ile Thr Ser Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys Asp Arg Phe Phe

210 215 220

Trp Arg Leu His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu Phe Leu Thr Lys

225 230 235 240

Ser Phe Trp Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu His

245 250 255

Pro Ser His Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg Lys Phe Trp Ala

260 265 270

Leu Asn Gly Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys Lys Ile Ser Glu

275 280 285

Leu Gly Leu Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala Ala Val His Phe

290 295 300

Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn Gln Val Trp Arg

305 310 315 320

Tyr Asp Asp Thr Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr Pro Arg Leu Ile

325 330 335

Glu Glu Asp Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp Ala Val Tyr Glu

340 345 350

Lys Asn Gly Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile Gln Phe Glu Tyr

355 360 365

Ser Ile Trp Ser Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro Ala Asn Ser Ile

370 375 380

Leu Trp Cys

385

<210> 14

<211> 580

<212> PRT

<213> MMP2(homo sapiens )

<400> 14

Met Glu Ala Leu Met Ala Arg Gly Ala Leu Thr Gly Pro Leu Arg Ala

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Gly Cys Leu Leu Ser His Ala Ala Ala Tyr Asn Phe

20 25 30

Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp Lys Asn Gln Ile Thr Tyr Arg Ile

35 40 45

Ile Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe

50 55 60

Ala Arg Ala Phe Gln Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Arg Phe Ser

65 70 75 80

Arg Ile His Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp

85 90 95

Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala

100 105 110

His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Val Gly Gly Asp Ser His Phe Asp

115 120 125

Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gln Val Val Arg Val Lys

130 135 140

Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn

145 150 155 160

Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe

165 170 175

Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly

180 185 190

Phe Cys Pro His Glu Ala Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly

195 200 205

Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser

210 215 220

Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr

225 230 235 240

Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala

245 250 255

Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro

260 265 270

Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg

275 280 285

Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp

290 295 300

Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val

305 310 315 320

Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp

325 330 335

Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg

340 345 350

Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser

355 360 365

Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val

370 375 380

Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln

385 390 395 400

Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr

405 410 415

Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe

420 425 430

Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln

435 440 445

Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser

450 455 460

Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly

465 470 475 480

Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys

485 490 495

Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn

500 505 510

Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp

515 520 525

Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln

530 535 540

Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu

545 550 555 560

Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp

565 570 575

Trp Leu Gly Cys

580

<210> 15

<211> 620

<212> PRT

<213> MMP9(homo sapiens )

<400> 15

Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys

1 5 10 15

Cys Phe Ala Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp His His His

20 25 30

Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala

35 40 45

Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val

50 55 60

Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val

65 70 75 80

Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly

85 90 95

Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln

100 105 110

Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly

115 120 125

Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn Ala Asp Gly Ala Ala Cys His

130 135 140

Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp

145 150 155 160

Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp

165 170 175

Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln

180 185 190

Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln

195 200 205

Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr

210 215 220

Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly

225 230 235 240

Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr Val Met Gly Gly Asn Ser Ala

245 250 255

Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser

260 265 270

Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr

275 280 285

Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln

290 295 300

Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Leu

305 310 315 320

Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr

325 330 335

Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile

340 345 350

Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr

355 360 365

Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly

370 375 380

Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly

385 390 395 400

Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr

405 410 415

Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn

420 425 430

Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys

435 440 445

Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln

450 455 460

Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu

465 470 475 480

Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser

485 490 495

Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg

500 505 510

Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala Asp Val Ala Gln Val Thr Gly

515 520 525

Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg

530 535 540

Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln Met Val Asp Pro Arg Ser Ala

545 550 555 560

Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly Val Pro Leu Asp Thr His Asp

565 570 575

Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr

580 585 590

Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu Asn Gln Val Asp Gln Val Gly

595 600 605

Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys Pro Glu Asp

610 615 620

<210> 16

<211> 190

<212> PRT

<213> MMP7(homo sapiens )

<400> 16

Met Arg Leu Thr Val Leu Cys Ala Val Cys Leu Leu Pro Gly Ser Leu

1 5 10 15

Ala Tyr Ser Leu Phe Pro Asn Ser Pro Lys Trp Thr Ser Lys Val Val

20 25 30

Thr Tyr Arg Ile Val Ser Tyr Thr Arg Asp Leu Pro His Ile Thr Val

35 40 45

Asp Arg Leu Val Ser Lys Ala Leu Asn Met Trp Gly Lys Glu Ile Pro

50 55 60

Leu His Phe Arg Lys Val Val Trp Gly Thr Ala Asp Ile Met Ile Gly

65 70 75 80

Phe Ala Arg Gly Ala His Gly Asp Ser Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly

85 90 95

Asn Thr Leu Ala His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Leu Gly Gly Asp

100 105 110

Ala His Phe Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asp Gly Ser Ser Leu Gly

115 120 125

Ile Asn Phe Leu Tyr Ala Ala Thr His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly

130 135 140

Met Gly His Ser Ser Asp Pro Asn Ala Val Met Tyr Pro Thr Tyr Gly

145 150 155 160

Asn Gly Asp Pro Gln Asn Phe Lys Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly

165 170 175

Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser Asn Ser Arg Lys Lys

180 185 190

<210> 17

<211> 387

<212> PRT

<213> MMP8(homo sapiens )

<400> 17

Met Phe Ser Leu Lys Thr Leu Pro Phe Leu Leu Leu Leu His Val Gln

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ala Leu Thr Pro Gly Asn Pro Lys Trp Glu Arg Thr Asn

20 25 30

Leu Thr Tyr Arg Ile Arg Asn Tyr Thr Pro Gln Leu Ser Glu Ala Glu

35 40 45

Val Glu Arg Ala Ile Lys Asp Ala Phe Glu Leu Trp Ser Val Ala Ser

50 55 60

Pro Leu Ile Phe Thr Arg Ile Ser Gln Gly Glu Ala Asp Ile Asn Ile

65 70 75 80

Ala Phe Tyr Gln Arg Asp His Gly Asp Asn Ser Pro Phe Asp Gly Pro

85 90 95

Asn Gly Ile Leu Ala His Ala Phe Gln Pro Gly Gln Gly Ile Gly Gly

100 105 110

Asp Ala His Phe Asp Ala Glu Glu Thr Trp Thr Asn Thr Ser Ala Asn

115 120 125

Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Ser Leu Gly

130 135 140

Leu Ala His Ser Ser Asp Pro Gly Ala Leu Met Tyr Pro Asn Tyr Ala

145 150 155 160

Phe Arg Glu Thr Ser Asn Tyr Ser Leu Pro Gln Asp Asp Ile Asp Gly

165 170 175

Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Leu Ser Ser Asn Pro Ile Gln Pro Thr Gly

180 185 190

Pro Ser Thr Pro Lys Pro Cys Asp Pro Ser Leu Thr Phe Asp Ala Ile

195 200 205

Thr Thr Leu Arg Gly Glu Ile Leu Phe Phe Lys Asp Arg Tyr Phe Trp

210 215 220

Arg Arg His Pro Gln Leu Gln Arg Val Glu Met Asn Phe Ile Ser Leu

225 230 235 240

Phe Trp Pro Ser Leu Pro Thr Gly Ile Gln Ala Ala Tyr Glu Asp Phe

245 250 255

Asp Arg Asp Leu Ile Phe Leu Phe Lys Gly Asn Gln Tyr Trp Ala Leu

260 265 270

Ser Gly Tyr Asp Ile Leu Gln Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Ser Asn Tyr

275 280 285

Gly Phe Pro Ser Ser Val Gln Ala Ile Asp Ala Ala Val Phe Tyr Arg

290 295 300

Ser Lys Thr Tyr Phe Phe Val Asn Asp Gln Phe Trp Arg Tyr Asp Asn

305 310 315 320

Gln Arg Gln Phe Met Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ile Ser Gly Ala

325 330 335

Phe Pro Gly Ile Glu Ser Lys Val Asp Ala Val Phe Gln Gln Glu His

340 345 350

Phe Phe His Val Phe Ser Gly Pro Arg Tyr Tyr Ala Phe Asp Leu Ile

355 360 365

Ala Gln Arg Val Thr Arg Val Ala Arg Gly Asn Lys Trp Leu Asn Cys

370 375 380

Arg Tyr Gly

385

<210> 18

<211> 395

<212> PRT

<213> MMP3(homo sapiens )

<400> 18

Met Lys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Val Cys Ser

1 5 10 15

Ala Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu

20 25 30

Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ala Val

35 40 45

Asp Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro

50 55 60

Leu Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Ser

65 70 75 80

Phe Ala Val Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly

85 90 95

Asn Val Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly Ile Asn Gly Asp

100 105 110

Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr

115 120 125

Asn Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu

130 135 140

Phe His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr His Ser

145 150 155 160

Leu Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp Ile Asn Gly

165 170 175

Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro Leu

180 185 190

Val Pro Thr Glu Pro Val Pro Pro Glu Pro Gly Thr Pro Ala Asn Cys

195 200 205

Asp Pro Ala Leu Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Leu Arg Gly Glu Ile

210 215 220

Leu Ile Phe Lys Asp Arg His Phe Trp Arg Lys Ser Leu Arg Lys Leu

225 230 235 240

Glu Pro Glu Leu His Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro Ser Leu Pro Ser

245 250 255

Gly Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Thr Ser Lys Asp Leu Val Phe Ile

260 265 270

Phe Lys Gly Asn Gln Phe Trp Ala Ile Arg Gly Asn Glu Val Arg Ala

275 280 285

Gly Tyr Pro Arg Gly Ile His Thr Leu Gly Phe Pro Pro Thr Val Arg

290 295 300

Lys Ile Asp Ala Ala Ile Ser Asp Lys Glu Lys Asn Lys Thr Tyr Phe

305 310 315 320

Phe Val Glu Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Lys Arg Asn Ser Met

325 330 335

Glu Pro Gly Phe Pro Lys Gln Ile Ala Glu Asp Phe Pro Gly Ile Asp

340 345 350

Ser Lys Ile Asp Ala Val Phe Glu Glu Phe Gly Phe Phe Tyr Phe Phe

355 360 365

Thr Gly Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Pro Asn Ala Lys Lys Val Thr

370 375 380

His Thr Leu Lys Ser Asn Ser Trp Leu Asn Cys

385 390 395

<210> 19

<211> 249

<212> PRT

<213> Plasmin(homo sapiens )

<400> 19

Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser

1 5 10 15

Gly Gln Gly Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro

20 25 30

Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu

50 55 60

Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln

65 70 75 80

Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu

85 90 95

Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser

100 105 110

Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro

115 120 125

Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu

145 150 155 160

Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly

165 170 175

Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr

180 185 190

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys

195 200 205

Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala

210 215 220

Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr

225 230 235 240

Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245

<210> 20

<211> 562

<212> PRT

<213> PLAT(tPA)(homo sapiens )

<400> 20

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg

20 25 30

Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met

35 40 45

Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn

50 55 60

Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser

65 70 75 80

Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr

85 90 95

Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu

100 105 110

Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr

115 120 125

Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser

130 135 140

Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro

145 150 155 160

Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His

165 170 175

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val

180 185 190

Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys

195 200 205

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg

210 215 220

Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn

225 230 235 240

Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala

245 250 255

Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly

260 265 270

Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp

275 280 285

Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr

290 295 300

Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala

305 310 315 320

Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro

325 330 335

Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile

340 345 350

Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu

355 360 365

Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu

370 375 380

Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp

385 390 395 400

Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser

405 410 415

Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro

420 425 430

Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly

435 440 445

Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys

450 455 460

Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His

465 470 475 480

Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr

485 490 495

Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp

500 505 510

Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val

515 520 525

Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly

530 535 540

Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met

545 550 555 560

Arg Pro

<210> 21

<211> 543

<212> PRT

<213> heparanase(homo sapiens )

<400> 21

Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro

20 25 30

Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro

35 40 45

Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn

50 55 60

Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu

65 70 75 80

Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly

85 90 95

Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe

100 105 110

Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys

115 120 125

Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp

130 135 140

Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe

145 150 155 160

Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe

165 170 175

Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu

180 185 190

Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu

195 200 205

Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn

210 215 220

Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser

225 230 235 240

Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser

245 250 255

Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg

260 265 270

Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu

275 280 285

Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr

290 295 300

Ala Thr Lys Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile

305 310 315 320

Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly

325 330 335

Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala

340 345 350

Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys

355 360 365

Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val

370 375 380

Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro

385 390 395 400

Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr

405 410 415

Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg

420 425 430

Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu

450 455 460

Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu

465 470 475 480

Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn

485 490 495

Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met

500 505 510

Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser

515 520 525

Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile

530 535 540

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> IL2 SP(homo sapiens )

<400> 22

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 23

<211> 23

<212> PRT

<213> IL2 SP2(人工序列)

<400> 23

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Ala Ser

20

<210> 24

<211> 22

<212> PRT

<213> TPA SP(homo sapiens )

<400> 24

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Ala

20

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> TPA SP2(人工序列)

<400> 25

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Ala Ser

20

<210> 26

<211> 27

<212> PRT

<213> WT SP(homo sapiens )

<400> 26

Met Thr Leu Gly Arg Arg Leu Ala Cys Leu Phe Leu Ala Cys Val Leu

1 5 10 15

Pro Ala Leu Leu Leu Gly Gly Thr Ala Leu Ala

20 25

<210> 27

<211> 633

<212> PRT

<213> MMP9(homo sapiens )

<400> 27

Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys

1 5 10 15

Cys Phe Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr

35 40 45

Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp

50 55 60

Asp Ala Phe Ala Arg Ala Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu

65 70 75 80

Thr Phe Thr Arg Val Tyr Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe

85 90 95

Gly Val Ala Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly

100 105 110

Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala

115 120 125

His Phe Asp Asp Asp Glu Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val

130 135 140

Pro Thr Arg Phe Gly Asn Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe

145 150 155 160

Ile Phe Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser

165 170 175

Asp Gly Leu Pro Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp

180 185 190

Arg Phe Gly Phe Cys Pro Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Asn

195 200 205

Ala Asp Gly Lys Pro Cys Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser

210 215 220

Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys

225 230 235 240

Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro

245 250 255

Thr Arg Ala Asp Ser Thr Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu

260 265 270

Cys Val Phe Pro Phe Thr Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr

275 280 285

Ser Glu Gly Arg Gly Asp Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn

290 295 300

Phe Asp Ser Asp Lys Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser

305 310 315 320

Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp

325 330 335

His Ser Ser Val Pro Glu Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr

340 345 350

Glu Gly Pro Pro Leu His Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu

355 360 365

Tyr Gly Pro Arg Pro Glu Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr

370 375 380

Pro Gln Pro Thr Ala Pro Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr

385 390 395 400

Val His Pro Ser Glu Arg Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser

405 410 415

Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr

420 425 430

Val Pro Leu Ser Pro Val Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp

435 440 445

Ala Ile Ala Glu Ile Gly Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys

450 455 460

Tyr Trp Arg Phe Ser Glu Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe

465 470 475 480

Leu Ile Ala Asp Lys Trp Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val

485 490 495

Phe Glu Glu Arg Leu Ser Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln

500 505 510

Val Trp Val Tyr Thr Gly Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp

515 520 525

Lys Leu Gly Leu Gly Ala Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg

530 535 540

Ser Gly Arg Gly Lys Met Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg

545 550 555 560

Phe Asp Val Lys Ala Gln Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val

565 570 575

Asp Arg Met Phe Pro Gly Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln

580 585 590

Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val

595 600 605

Ser Ser Arg Ser Glu Leu Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr

610 615 620

Tyr Asp Ile Leu Gln Cys Pro Glu Asp

625 630

Claims (12)

1.一种多核苷酸，其包含编码抗原结合分子的第一多核苷酸和编码靶向一种或多种细胞外基质(ECM)分子的试剂的第二多核苷酸，其中所述多核苷酸包含

(1)编码嵌合抗原受体(CAR)的第一多核苷酸，该第一多核苷酸包含抗原结合分子结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，和

(2)编码以下氨基酸序列的第二多核苷酸：

SEQ ID NO:7、10和16；或

SEQ ID NO:7；或

SEQ ID NO:10；或

SEQ ID NO:16；或

SEQ ID NO:7和10；或

SEQ ID NO:7、16；或

SEQ ID NO:10和16。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9。

3.权利要求1的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ ID NO：10和编码SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的多核苷酸。

4.权利要求2或3的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸还包含编码SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：16的多核苷酸。

5.权利要求1～4的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸还包含多核苷酸序列SEQ ID NO：5和6。

6.权利要求1的多核苷酸，其中结合肿瘤抗原的抗原结合分子的抗原结合域选自：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII,GD2,GD3,BCMA,Tn Ag,PSMA,ROR1,FLT3,FAP,TAG72,CD38,CD44v6,CEA,EPCAM,B7H3,KIT,IL-13Ra2,Mesothelin,IL-11Ra,PSCA,PRSS21,VEGFR2,LewisY,CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、聚乳酸、ALK,GloboH,NY-BR-1,UPK2,HAVCR1,ADRB3,PANX3,GPR20,LY6K,OR51E2,TARP,WT1,NY-ESO-1,LAGE-1a,MAGE-A1,legumain,HPV E6,E7,MAGE A1,ETV6-AML,精子蛋白17,XAGE1,Tie 2,MAD-CT-1,MAD-CT-2,Fos相关抗原1,p53,p53突变体,prostein,survivin和端粒酶,PCTA-1/Galectin8,梅兰/MAR T1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1；和/或

其中所述细胞内信号结构域包括共刺激信号结构域，或初级信号结构域和共刺激信号结构域，其中所述共刺激信号结构域包括选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，一种与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R特异性结合的配体α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGAD、ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D的蛋白质的功能信号结构域。

7.包含权利要求1～6中任一项的多核苷酸的载体。

8.包含权利要求7的载体的细胞。

9.一种包含权利要求8的细胞群的组合物。

10.权利要求9的组合物，其中所述细胞包含选自程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-的抑制性免疫检查点分子、淋巴细胞衰减因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIRl)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160；和/或

其中所述组合物包含包含结合第一抗原的第一CAR的第一细胞群和包含结合第二抗原的第二CAR的第二细胞群，其中所述第二抗原是肿瘤抗原并且与第一抗原不同，第一抗原包括白细胞(WBC)、肿瘤抗原或实体瘤抗原的细胞表面分子；和/或

其中所述细胞具有降低的内源TRAC基因表达，和/或所述细胞包括编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸序列，或其组合；和/或

其中所述细胞包括编码结合TGF-β1、TGF-β2、CTGF、αv/β3整联蛋白、α4/β7整联蛋白或α5/β1整联蛋白的scFv的多核苷酸，和/或包含IL-6、IFNγ、IL-10或IL-12；和/或

其中所述细胞包括编码靶向一种或多种ECM分子合成的细胞因子抑制剂或细胞因子的多核苷酸、靶向一种或多种ECM分子降解的肽和/或靶向一种或多种ECM分子的信号传导的肽。

11.根据权利要求9的组合物，其中所述细胞包含结合第一抗原的第一CAR和结合第二抗原的第二CAR，其中所述第一抗原包括WBC抗原，第二抗原包括实体瘤抗原。

12.权利要求1～11中任意一项的多核苷酸、载体、细胞或组合物在制备治疗实体瘤药物中的用途。

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