CN112779223B - 偶联嵌合抗原受体细胞及其用途 - Google Patents

偶联嵌合抗原受体细胞及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及在体内和/或体外增强免疫细胞细胞反应和/或扩增和/或维持的组合物和方法。例如，施用混合的细胞群体，包括编码第一CAR的修饰的细胞和编码第二CAR的修饰的细胞，其中第一CAR的抗原结合域结合第一抗原，第二CAR的抗原结合域结合第二抗原，第一抗原区别于第二抗原。

Description

偶联嵌合抗原受体细胞及其用途
技术领域
本公开涉及与嵌合抗原受体细胞分泌治疗剂有关的组合物和方法，及其在治疗包括癌症在内的疾病中的用途。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和淋巴瘤等癌症中取得了良好的临床疗效。然而，实体瘤的治疗进展相对缓慢。为了使CAR T细胞疗法有效，患者体内CAR T细胞的长期维持对于肿瘤治疗中患者的良好预后很重要。例如，如果可以维持CAR T细胞的长期存在，那么该技术可以有效地减少肿瘤复发。
癌症被称为恶性肿瘤，涉及异常细胞生长，并有可能侵袭或扩散到身体的其他部位。人类有一百多种癌症。例如乳腺癌发生在乳房的上皮组织中。由于乳腺癌细胞失去了正常细胞的特性，因此失去了乳腺癌细胞之间的联系。癌细胞剥落后，它们会通过血液和/或淋巴系统扩散到整个身体，从而危及生命。当前，乳腺癌已经成为对女性身心健康的常见威胁之一。尽管已经证明免疫疗法(例如，CAR T)对于治疗某些癌症是有效的，但是仍然需要改善免疫疗法，以使其有效地治疗更多的癌症，包括涉及实体瘤的癌症。
发明内容
本发明所采用的技术方案如下：
由于患者可以在B细胞耗竭的情况下存活，因此可以使用CAR T细胞的第一抗原结合结构域结合B细胞来扩增该患者的CAR T细胞。因此，更多的CAR T细胞可以及时在患者体内扩增，从而增加了CAR T细胞的效力。患者中及时扩增的CAR T细胞可增加CAR T细胞与肿瘤细胞，特别是具有第二CAR结合的抗原的实体肿瘤细胞接触的机会。
本公开描述了包括一个或多个不同抗原结合结构域的基因修饰免疫细胞群。所述基因修饰的免疫细胞可以包括至少两个不同的抗原结合结构域：用于扩展和/或维持所述基因修饰的细胞的第一抗原结合结构域，以及用于杀死靶细胞例如肿瘤细胞的第二抗原结合结构域。例如，第一抗原结合结构域结合表面标志物，例如白细胞(WBC)的细胞表面分子，而第二抗原结合结构域结合肿瘤细胞的靶抗原。在实施方案中，细胞表面分子是WBC的表面抗原。CAR可以包含第一或第二抗原结合结构域。修饰的免疫细胞包含第一和第二抗原结合结构域。在实施方案中，修饰的细胞包括(1)包含第一抗原结合结构域的第一组修饰细胞和(2)包含第二结合结构域的第二组修饰细胞。在实施方案中，修饰的细胞是包含两个不同组的修饰的细胞的混合群体。CAR可以是双特异性CAR。例如，两个抗原结合结构域在相同的CAR(双特异性CAR或串联CAR(tanCAR))上，在不同的CAR分子上，或在CAR和T细胞受体(TCR)上。单个CAR可以包括至少两个不同的抗原结合结构域，或者两个不同的抗原结合结构域各自在单独的CAR上。
本公开还描述了一种或多种编码第一CAR分子和第二CAR分子或TCR的核酸。第一CAR包括第一抗原结合结构域，第二CAR或TCR包括第二抗原结合结构域。在实施方案中，第一CAR和第二CAR或TCR表达为分开的多肽，并由至少两个分开的核酸编码。在实施方案中，单个CAR至少包含本文所述的第一和第二抗原结合结构域，并由单个核酸编码。在实施方案中，两个不同的抗原结合结构域可以由一个以上的核酸编码。此外，本公开描述了包含本文所述核酸的载体和包含本文所述核酸的细胞。在实施方案中，细胞包括基因修饰的细胞，例如基因修饰的T细胞，例如CAR T细胞。
本公开还描述了有效用于在患者中扩增和/或维持基因修饰细胞的修饰细胞群体，例如修饰T细胞的混合群体。在实施方案中，基因修饰细胞的混合群体包括至少两种不同的基因修饰细胞，第一基因修饰细胞表达用于扩增和/或维持修饰细胞的抗原结合域，第二基因修饰细胞表达用于以下目的的抗原结合域：杀死靶细胞，例如肿瘤细胞。两种抗原结合结构域是不同的分子并结合不同的抗原。
在实施方案中，基因修饰细胞的混合群体还包括表达至少两个不同抗原结合结构域的第三基因修饰细胞，第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持基因修饰细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞。
在实施方案中，混合的修饰细胞群体还包括表达至少两个不同抗原结合结构域的基因修饰细胞，第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持修饰细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞(其中两个不同的抗原结合结构域在同一基因修饰细胞上表达)。
在实施方案中，混合的修饰细胞群体包括表达用于杀死靶细胞的抗原结合域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合域的修饰细胞(其中两个不同的抗原结合结构域在同一修饰细胞上表达)，第一抗原结合域用于扩增和/或维持修饰T细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞。
在实施方案中，修饰细胞的混合群体包括表达用于扩增和/或维持修饰T细胞的抗原结合域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合域的修饰细胞(其中两个不同的抗原结合结构域在同一修饰细胞上表达)，第一抗原结合域用于扩增和/或维持的，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞。
本公开还描述了以下情况，在两种类型的修饰细胞中，用于扩展和/或维持修饰细胞中不包含编码第二抗原结合结构域的核酸序列，和/或用于结合靶细胞的修饰细胞中不包含编码第一抗原结合结构域的核酸序列。
本公开描述了包含本文所述的修饰的细胞的混合群体的组合物。
在实施方案中，修饰的细胞是修饰的T细胞、修饰的NK细胞、修饰的巨噬细胞或修饰的树突状细胞。在实施方案中，修饰的T细胞是CAR T细胞。在实施方案中，表达两个不同抗原结合结构域的修饰细胞可以是单个CAR T细胞。在实施方案中，单个CAR T细胞可以是双特异性CAR T细胞。
在实施方案中，用于扩增和/或维持修饰的细胞的抗原结合结构域结合WBC的表面抗原，并且用于杀死靶细胞的抗原结合结构域结合肿瘤抗原。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，B细胞的表面抗原是CD19，并且肿瘤抗原是tMUC1、TSHR、GUCY2C、ACPP、CLDN18.2(18.2)、PSMA、UPK2或其他肿瘤抗原。此外，本公开描述了本文所述的修饰细胞的组合物或混合群体在有需要的患者中增强CAR T细胞的扩增和/或维持的用途。CAR T细胞的增强的扩增和维持提高了CAR T细胞疗法的功效。本公开描述了一种用本文所述的混合修饰细胞群体治疗患有肿瘤的患者的方法。在实施方案中，基因修饰的细胞的混合群体在患者中扩增和/或维持修饰的细胞并有效地抑制肿瘤的生长。在实施方案中，肿瘤是实体瘤。另外，本公开描述了响应于修饰细胞的混合群体的引入而释放细胞因子。
一些实施方案涉及包含分离的核酸序列的细胞，所述分离的核酸序列包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码包含治疗剂IL-12、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17、IFN-γ和IL-23中的至少一种。细胞表达并分泌治疗剂。
本发明内容并非旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也并非旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
附图说明
参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。
图1A-1C显示了CD19 CAR和GUCY2C CAR在相应的T细胞中的构建体和表达；
图2显示了GUCY2C CAR T细胞在各种培养系统中的扩增(CD19 CAR+：B细胞的比率是1:2/1:1/2:1)；
图3示出了关于GUCY2C CAR和CD19 CAR的共培养细胞的细胞因子释放分析；
图4A-4C显示了CD19 CAR和PAP CAR在相应的T细胞中的构建体和表达；
图5显示了PAP CAR T细胞在各种培养系统中的扩增；
图6示出了针对PAP CAR和CD19 CAR的共培养细胞的细胞因子释放分析；
图7显示在存在或不存在K19细胞的情况下与tMUC1 CAR T细胞共培养的CD19 CART细胞的流式细胞术分析结果；
图8显示了在图7的测定中使用的细胞培养物中PBMC和单核细胞的活化；
图9显示了tMUC1 CAR T细胞和CD19 CAR T细胞释放的IFNγ；
图10显示了tMUC1CAR T细胞和CD19 CAR T细胞释放GZMB；
图11和图12显示了在各种实施方案中MUC1CAR T细胞的增殖；
图13显示了各种实施方案中的CD19 CAR T细胞的增殖；
图14显示了实施方案中的细胞因子释放；
图15显示了CD137在各种细胞培养物中的表达；
图16显示了细胞活化的流式细胞术分析的结果；
图17显示了在图15中描述的细胞培养物中PBMC和单核细胞的活化；
图18显示CD19 CAR T细胞的活化引起ACPP CAR T细胞释放细胞内IFNγ；
图19和图20显示了在细胞培养物中将细胞共培养24小时后细胞因子的释放；
图21显示了CD137在各种细胞培养物中的表达；
图22显示了与KATO3+细胞共培养48小时的各种CAR T细胞的流式细胞术分析结果；
图23示出了在图21中描述的系统中PBMC和单核细胞的活化；
图24和图25显示CLDN18.2 CAR T细胞的活化导致CD19 CAR T细胞释放细胞内IFNγ；
图26显示了各种细胞培养物的杀伤试验的结果；
图27显示CLDN18.2 CAR T细胞的增殖；
图28显示在CLDN18.2 CAR和CD19 CAR系统中CD19 CAR T细胞的增殖；
图29、图30和图31显示了各种细胞培养物中细胞因子的释放；
图32显示了使用流式细胞术鉴定共培养细胞；
图33显示了对包括CD19 CAR T细胞和NYESO-1TCRTS的共培养细胞的活化的流式细胞术分析的结果，箭头114和116以及方框102、104、106和108指的是比较组；
图34显示了对包括CD19 CAR T细胞和NYESO-1TCRTS的共培养细胞的增殖进行流式细胞术分析的结果，箭头208以及框202、204和206指的是比较组；
图35显示了对包括CD19 CAR T细胞和AFP TCRTS的共培养细胞的活化进行流式细胞术分析的结果，箭头314和316以及框302、304、306和308指的是比较组；
图36显示了对包括CD19 CAR T细胞和AFP TCRTS的共培养细胞的增殖进行流式细胞术分析的结果，箭头408以及框402、404和406指的是比较组；
图37显示了在各种细胞培养物中CD137表达的其他直方图；
图38显示了GUCY2C CAR T细胞的增殖；
图39显示了在细胞培养物中将细胞共培养24小时后细胞因子的释放；
图40显示了NK细胞感染CD19CAR比例数据；
图41显示了T细胞感染CD19CAR比例数据；
图42-43显示了CD19细胞与NTNK、CD19NK以及CD19细胞与GUCY2C、CD19NK以及CD19细胞与CD19 T和NTNK共培养96h增殖数据。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。
本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。
所谓“约”是指数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，相差多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性或功能。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“Fv”是指含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(每个来自H和L链的3个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。
如本文所用，“抗体重链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较大的一种。如本文所用，“抗体轻链”是指存在于所有抗体分子中的天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。使用本领域可获得且众所周知的技术可获得合成DNA。
术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。抗原包括任何大分子，包括所有蛋白质或肽，或来源于重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引起免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。可以从包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体的生物样品产生，合成或衍生。
如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加，或与癌症相关的各种生理症状的改善有关的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤发生方面的能力来表现。
术语“自体抗原”指的是由免疫系统错误识别为外源的抗原。自体抗原包括细胞蛋白质、磷蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
术语“自体”用于描述源自受试者的材料，随后将其重新引入相同的受试者。
术语“同种异体”用于描述来源于相同物种的不同受试者的移植物。作为例子，供体受试者可以是与受体受试者相关或不相关的，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标记。
术语“异种”用于描述源自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。
术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所述步骤或元件或步骤或元件的组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的组。
短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。
短语“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何元素，并且可以包括不干扰或不影响本公开中针对所列元素指定的活动或动作的其他元素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的元素是必需的或强制性的，但是其他元素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活动或动作。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配，或者在核酸之间可以存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。
术语“对应”或“对应于”是指(a)具有与参考肽或蛋白质中的多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。
术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号之外的信号，其介导T细胞应答，包括增殖、活化、分化和其他中的至少一种细胞反应。共刺激配体可包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体尤其还包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。
术语“共刺激信号”是指信号，其与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。术语“疾病”和“病症”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特定的疾病或病症可能没有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认识到作为一种疾病，但仅作为不良状况或综合征，其中临床医生已经确定了或多或少特定的一组症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则受试者的健康继续恶化。相反，受试者中的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中动物的健康状态不如没有病症时的健康状态。如果不及时治疗，疾病并不一定会导致动物的健康状况进一步下降。
术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗中的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，具有任何定义的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了“T”被“U”代替)并且通常在序列表中提供，并且非编码链用作模板对于基因或cDNA的转录，可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
术语“外源性”是指在野生型细胞或生物中不天然存在但通常通过分子生物学技术引入细胞的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源性”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。而且，从第一生物体中分离并通过分子生物学技术转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如以产生另外天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，并且由此有助于过表达编码的多肽。
术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“同源的”是指两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个多肽中的每一个中的位置。DNA分子被腺嘌呤占据，然后分子在该位置同源。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以相比的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当两个序列比对以产生最大同源性时进行比较。
术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指一类起抗体作用的蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于体内分泌物中的一级抗体，例如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是没有已知的抗体功能但可以作为抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过在暴露于过敏原时从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质而介导即时超敏反应的免疫球蛋白。
术语“分离的”是指基本上或基本上不含通常伴随其天然状态的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已经从通常是正常序列中去除的DNA片段与片段相邻。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境的体外分离和/或纯化，以及与其他组分细胞。
术语“基本上纯化的”是指基本上不含通常与其天然状态相关的组分的物质。例如，基本上纯化的细胞是指已经与其通常以其天然存在或天然状态相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在某些实施方案中，细胞在体外培养。在某些实施方案中，细胞不在体外培养。
在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含(一个或多个)内含子。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将大量的遗传信息输送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。来自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。
术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比，调节受试者中反应水平的可检测增加或减少，和/或与在其他方面相同但未经处理的主题中的回应。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者，优选人的有益治疗反应。
当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，它是“可操作地连接”的。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。
术语“在转录控制下”是指与多核苷酸有效连接并处于正确位置和方向的启动子，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
术语“过度表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示肿瘤抗原在来自疾病区域的细胞中的异常表达水平，所述疾病区域例如患者相关的特定组织或器官内的实体肿瘤到来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有肿瘤抗原过表达的以实体瘤或血液恶性肿瘤为特征的患者。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌症、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤))、胶质母细胞瘤(也是称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上以低水平表达。表1中提供了实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例。
表1
组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)、静脉内(iv)、肌内(im)、胸骨内注射或输注技术。
术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述方法的任何人、动物或生物体。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。
需要治疗或有此需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病症或病状的受试者。有此需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病症或病状的受试者。
术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸置换的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性或具有与参考多核苷酸的关系(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％以及所有整数百分比之间，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸本文所述的术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直向同源物。
术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化(即增加各种化学反应的速率)的酶促多肽或“酶”。
术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分的多肽。在某些实施方案中，通过一个或多个取代将多肽变体与参考多肽区分开来，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就此而言，本领域中熟知可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基置换的多肽。
术语“启动子”是指由启动多核苷酸序列特异性转录所需的细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
术语“结合”，或“与...相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中的第二分子但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构上不相关的分子的分子。如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体，蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示相互作用取决于存在。特定结构(例如，抗原决定簇或表位)对化学物质的影响；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记A的量。
“统计上显著”意味着结果不可能偶然发生。统计显著性可通过本领域已知的任何方法确定。常用的重要度量包括p值，即如果零假设为真，观察事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.5或更小。“降低”或“减少”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括减少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括所有整数和介于1和大于1之间的小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的本文所述的数量或水平。
术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，由此介导信号转导事件，例如经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。
术语“刺激分子”是指特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体的T细胞上的分子。例如，源自刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的ζ链。
术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与细胞(例如T细胞)上的同源结合配偶体(在本文中称为作为“刺激分子”)特异性结合的配体，从而介导T细胞的主要反应，包括活化、启动免疫应答，增殖和类似过程。刺激性配体在本领域中是公知的，并且尤其包括装载有肽、抗CD3抗体、超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体的MHC I类分子。
术语“治疗剂”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态症状而获得。
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或另一临床医生正在寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种症状或症状的发展或在一定程度上减轻所述病症或疾病的一种或多种症状或症状的量的化合物。治疗有效量将取决于待治疗的受试者的化合物、疾病及其严重程度和年龄、体重等而变化。
术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染，转化或转导的细胞。细胞包括主要受试细胞及其后代。
术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过多次减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，使得载体在生物学上是安全的。
范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。
“嵌合抗原受体”(CAR)分子是重组多肽，其至少包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域。在实施方案中，CAR的结构域位于相同的多肽链上，例如嵌合融合蛋白。在实施方案中，结构域位于不同的多肽链上，例如结构域不是连续的。
CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域结合B细胞表面上的抗原，例如细胞表面分子或标记物。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138、或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在特定的实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。
在实施方案中，抗原结合结构域结合肿瘤表面上的抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域公知的，包括例如肿瘤相关MUC1、胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)，凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺素酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活蛋白、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可以称为CD19CAR。
在实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域包括至少一种scFv或至少一种单结构域抗体。例如，CAR上可以有两个scFv。scFv包括轻链可变区(VL)和通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的重链可变区(VH)。单链可变区片段可以通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备(Bird等，Science 242:423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO：20)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计并使用了其他序列的接头(Bird等，Science242:423-426,198)。通常，接头可以是短的、柔性的多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以重组或合成产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组产生，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞，真核细胞如酵母，植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核细胞如大肠杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可以通过常规操作制备，例如连接多核苷酸。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。
本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号传导结构域。共刺激和信号传导结构域用于响应抗原结合而传递信号并激活分子，例如T细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号传导结构域衍生自主要信号传导结构域，例如CD3-ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括衍生自共刺激分子的一个或多个功能信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是激活对抗原的细胞应答所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。
在实施方案中，共刺激结构域包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7的细胞内结构域、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、或其任何组合。在实施方案中，信号传导结构域包括衍生自T细胞受体的CD3-ζ结构域。
在实施方案中，CAR的细胞质结构域仅包括一个或多个刺激结构域而没有信号传导结构域。
CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。
在细胞外结构域和CAR的跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域或细胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。
受试者中的淋巴细胞或T细胞应答是指与辅助细胞、杀伤细胞、调节细胞和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞应答可以包括诸如在免疫过程中辅助其他WBC以及鉴定和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞的活动。受试者中的T细胞应答可以通过各种指标来测量，例如T细胞杀死的许多病毒感染的细胞和/或肿瘤细胞，T细胞在与病毒感染的细胞共培养时释放的细胞因子的量和/或或肿瘤细胞，受试者中T细胞的增殖水平，T细胞的表型变化，例如记忆T细胞的变化，以及受试者中T细胞的水平寿命或寿命。
在实施方案中，增强T细胞应答的方法治疗有此需要的受试者，例如，诊断患有肿瘤的受试者。术语肿瘤是指块状肿瘤，其可以是液体肿瘤的集合，例如血液或固体物质。肿瘤可以是恶性的(癌性的)或良性的。血癌的实例包括慢性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。
实体瘤通常不含囊肿或液体区域。恶性实体瘤的主要类型包括肉瘤和癌。肉瘤是在称为间充质细胞的软组织细胞中发展的肿瘤，其可以在血管、骨、脂肪组织、韧带淋巴管、神经、软骨、肌肉、韧带或肌腱中发现，而癌是在上皮细胞中形成的肿瘤，在皮肤和粘膜中发现。最常见的肉瘤类型包括未分化的多形性肉瘤，其涉及软组织和骨细胞；平滑肌肉瘤，包括排列血管，胃肠道和子宫的平滑肌细胞；涉及骨细胞的骨肉瘤和涉及脂肪细胞的脂肪肉瘤。肉瘤的一些实例包括尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、软骨肉瘤、间皮瘤、纤维肉瘤、纤维肉瘤和神经胶质瘤。
五种最常见的癌包括肾上腺癌，其涉及产生液体或粘液的器官，例如乳房和前列腺；基底细胞癌，包括皮肤最外层的细胞，例如皮肤癌；鳞状细胞癌，涉及皮肤基底细胞；和影响泌尿道过渡细胞的移行细胞癌，包括膀胱、肾和输尿管。癌的实例包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、肾癌和膀胱癌以及胆管癌。
本文描述的方法可用于治疗诊断患有癌症的受试者。癌症可以是血癌或可以是实体瘤，例如肉瘤或癌。治疗方法包括向受试者施用包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的有效量的T细胞以提供T细胞应答，其中第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合不同于WBC的细胞表面分子的抗原。在实施方案中，增强受试者中的T细胞应答包括选择性增强体内表达第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的T细胞的增殖。
本文描述的实施方案涉及用于制备修饰细胞的体外方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可包括T细胞或T细胞祖细胞。该方法可以进一步包括用编码至少CAR的DNA转染细胞样品，并在选择性增强CAR表达T细胞增殖的培养基中离体培养CAR细胞群。
在实施方案中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，通过单采血液成分术或静脉穿刺术获得细胞样品。在实施方案中，细胞样品是T细胞的亚群。
一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂，所述治疗剂是或包含至少一种IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23的组合物。在一些实施方案中，治疗剂是或包含Eome、TRAF6、IL12、IL2、IL18、IL23、AQP9、Runx3、AMPK或BCL-2。
一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂，所述治疗剂是或包含至少一种TNFRSF超家族成员受体活化抗体或其膜结合形式，TNFRSF超家族成员配体或其膜结合形式，不同的趋化因子或其膜结合形式，趋化因子抗体，或趋化因子或膜受体抗体-其结合形式可以和D28家族的配体对应于表7中的序列。TNFRSF超家族成员受体活化抗体或其膜结合形式，TNFRSF超家族成员配体或其膜结合形式，趋化因子或其膜结合形式，趋化因子抗体，或趋化因子受体抗体或膜结合其形式，或D28家族的配体。例如，TNFRSF超家族成员受体可包括肿瘤坏死因子受体1、肿瘤坏死因子受体2、淋巴毒素β受体、淋巴毒素β受体、CD40、Fas受体、诱饵受体3、CD27、CD30、4-1BB、死亡受体4、死亡受体5、诱饵受体1、诱饵受体2、RANK、骨保护素、TWEAK受体、TACI、BAFF受体、疱疹病毒进入介质、神经生长因子受体、B细胞成熟抗原、糖皮质激素诱导相关的TNFR、TROY、死亡受体6、死亡受体3、Ectodysplasin A2受体等。
在一些实施方案中，治疗剂是或包括抗体试剂(例如，单链抗体(例如，scFv)、单结构域抗体(例如，骆驼抗体)、或双特异性抗体试剂(例如，双特异性T细胞)。在其他实施方案中，治疗剂是或包括细胞因子。细胞因子的实例包括IL-1P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-γ、MIP-1n、MIP-IP、MCP-1、TNFα、GM-CSF、GCSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-P、CD40、CD40L、铁蛋白及其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子可包括促炎细胞因子，例如：IFN-γ、IL-15、IL-4、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。例如，IFN-γ已被FDA批准治疗患有恶性骨质疏松症的患者(例如，Journal of Pediatrics 121(1)：119-24·1992年8月)。
一些实施方案涉及包含核酸序列和另外的核酸序列的CAR细胞群，其中CAR细胞包含淋巴细胞、白细胞或PBMC。在一些实施方案中，CAR和治疗剂以多蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR和治疗剂分子。在一些实施方案中，多蛋白包含CAR和治疗剂之间的可切割部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A，和/或CAR和治疗剂各自组成型表达。在一些实施方案中，CAR细胞包含：第三核酸序列，其编码与不同于CAR的抗原结合的另外的CAR，或结合实体肿瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在实施方案中，治疗剂或其变体可以重组或合成产生。对于治疗剂的合成生产，可以使用自动合成仪。为了重组产生治疗剂，可以将含有编码治疗剂的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞、真核细胞如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞、或原核细胞如大肠杆菌。编码目标治疗剂的多核苷酸可以通过常规操作制备，例如连接多核苷酸。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得治疗剂。
一些实施方案涉及包含CAR细胞群的药物组合物。一些实施方案涉及在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的组合物。
一些实施方案涉及包含一种或多种CAR的修饰细胞，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌治疗剂，所述治疗剂是IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23中的至少一种或包含IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23中的至少一种。在一些实施方案中，将细胞工程化以表达治疗剂，所述治疗剂与修饰细胞的膜结合。
一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含一种或多种CAR的T细胞组合物，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌作为或包含IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23中的至少一种的治疗剂，并且与给予不表达或分泌治疗剂的T细胞。
一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物；施用有效量的治疗剂，所述治疗剂是或包含IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-17和IL-23中的至少一种，其中T细胞应答增强为与不施用治疗剂的CAR T细胞的施用相比。在一些实施方案中，施用有效量的治疗剂包括静脉内递送一定量的人IL-6，其范围为约0.5-50μg/千克体重。在一些实施方案中，治疗剂是IL-6或IL-7。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括监测受试者的组织或血液中治疗剂的浓度；如果受试者的浓度和/或其他参数不在期望的条件下，则施用治疗剂或治疗剂的受体拮抗剂(例如，抗体)。例如，参数可以包括体温水平，CRS水平和神经毒性水平等。
在一些实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌可以通过诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统，其增加或激活治疗剂或其组合的表达。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统。例如，四环素控制的转录激活是诱导型基因表达的方法，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如多西环素)的存在下可逆地打开或关闭转录。在一些实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌可以通过诱导型表达系统调节和/或修饰的细胞包含编码诱导型自杀系统的核酸序列。例如，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型caspase-9系统。
在一些实施方案中，T细胞包含结合实体瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在一些实施方案中，实体瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、PSCA或EGFR，B细胞抗原是CD19、CD20、MEGEA4、CD22或BCMA。
在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导域，所述共刺激信号传导域包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能-相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。
在一些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体(EGFRvIII)的变体III、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、二唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白细胞介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体-α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。
在一些实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含显性失活的PD-1突变体，使得细胞的PD-1/PD1-1信号传导途径受到干扰。
在一些实施方案中，治疗剂以重组DNA构建体、mRNA或病毒载体形式存在于修饰的细胞中。在一些实施方案中，修饰的细胞包含编码治疗剂的治疗剂mRNA，并且mRNA未整合到修饰的细胞的基因组中。在一些实施方案中，可以将治疗剂mRNA引入(例如，电穿孔)到修饰的细胞中，使得治疗剂的表达和/或分泌是短暂的。可以注射合成mRNA以实现瞬时基因表达。例如，由mRNA提供的治疗剂是短暂的，使得治疗剂的释放是可控的，尤其是对于促炎细胞因子，例如：IFN-γ、IL-4、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
在一些实施方案中，修饰的细胞包含核酸序列，其包含或分离的核酸序列包含启动子，所述启动子包含调节细胞中治疗剂表达的转录调节剂(例如转录因子)的结合位点。表7中提供了核酸序列或分离的核酸序列的实例，可以将这些构建体正向或反向置于载体(例如，慢病毒载体)中。在一些实施方案中，转录调节剂是或包括Hif1a、NFAT、FOXP3和/或NFkB。在一些实施方案中，启动子对转录调节剂有响应。在一些实施方案中，启动子与编码治疗剂的核酸序列可操作地连接，使得启动子驱动治疗剂在细胞中的表达。在一些实施方案中，将治疗剂连接至特定启动子，以诱导治疗剂在所需条件下表达。启动子分为两部分，一个含有转录因子结合位点的特定调节区，加上一个最小启动子。在一些实施方案中，启动子和结合位点对应于表7中列出的序列关于NFAT的更多信息可以在WO2018006882中找到，其在此引入作为参考。
一些实施方案涉及分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述另外的核酸序列编码治疗剂。例如，治疗剂包含IL-6或IFN-γ，或其组合。例如，治疗剂是IL-15或IL-12，或其组合。一些实施方案涉及包含核酸序列和另外的核酸序列的CAR细胞群，其中CAR细胞包含淋巴细胞、白细胞或PBMC。在实施方案中，一些实施方案的CAR细胞群，其中CAR和治疗剂以多蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR和治疗剂分子。在实施方案中，多蛋白包含CAR和治疗剂之间的可切割部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A，和/或CAR和治疗剂各自组成型表达。在实施方案中，CAR细胞包含：第三核酸序列，其编码与不同于CAR的抗原结合的另外的CAR，或结合实体肿瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。一些实施方案涉及包含CAR细胞群的药物组合物。一些实施方案涉及在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的一些实施方案的组合物。在实施方案中，CAR细胞、修饰的细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞、修饰的细胞是T细胞。
在实施方案中，另外的核酸序列包含编码IL6的第一核酸序列和编码IFN-γ的第二核酸序列，并且第一核酸序列和第二核酸序列通过IRES元件或编码2A肽的序列或第三核酸连接。编码2A肽的序列。在实施方案中，另外的核酸序列包含SEQ ID NO：21或22的核酸序列，或其组合。在实施方案中，通过条件表达系统调节另外的核酸序列的表达，使得治疗剂响应于靶抗原的结合而表达。在实施方案中，另外的核酸序列的表达受SynNotch多肽的调节。
一些实施方案涉及与如上所述的小蛋白质(例如细胞因子)相关的FC融合蛋白。在实施方案中，治疗剂可包含FC融合蛋白。例如，细胞因子如IL-15、IFN-γ或IL-6可以与一个或多个免疫球蛋白Fc结构域连接。在实施方案中，Fc结构域独立地折叠并且可以在体外和体内改善小蛋白质的溶解度和稳定性。在实施方案中，Fc区允许在制造期间通过蛋白-G/A亲和层析容易地进行成本有效的纯化。在实施方案中，可以修饰FC融合蛋白以聚合成含有多种小蛋白质的明确定义的复合物。在实施方案中，融合蛋白可以由修饰的细胞(例如，CART细胞)表达和分泌，其用于治疗患有癌症和/或其他疾病的受试者。在实施方案中，融合蛋白的施用可以与表达和分泌融合蛋白的CAR T细胞的处理组合。例如，用于增强T细胞应答和/或治疗患有癌症或其他疾病的受试者的方法可以包括向受试者施用与小蛋白质(例如，IFN-γ)相关的融合蛋白并施用有效量的组合物包含CAR并表达以及将与小蛋白质相关的融合蛋白分泌到受试者中的T细胞群体。在实施方案中，融合蛋白的施用可以在CAR T治疗的早期阶段(例如，在输注CAR T细胞后1、2、3、4、5或6天增强CAR T细胞的扩增)。例如，融合蛋白可以在输注CAR T细胞后1、2、3、4、5或6天施用于受试者。在实施方案中，该方法可以包括向受试者施用与小蛋白质(例如，IFN-γ)相关的融合蛋白，并施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物，而不表达或分泌融合蛋白。与受试者的小蛋白质相关。例如，融合蛋白可以在预定时间内施用于受试者。关于FC融合蛋白的更多信息可以在J Immunol 2004，172：2925-2934和EMBO Mol Med2012，4(10):1015-1028中找到。其通过引用并入。关于施用治疗剂(例如细胞因子)的更多信息可以在J Interferon Cytokine Res 2019,39(1):6-21，其通过引用并入。
一些实施方案涉及包含一种或多种CAR的修饰细胞，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌治疗剂。例如，治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ，或其组合。一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含一种或多种CAR的T细胞组合物，其中所述细胞经工程改造以表达和分泌治疗剂。例如，治疗剂是或包含IL-6或IFN-γ，或其组合。在实施方案中，治疗剂是与IL-6或IFN-γ相关的小蛋白质。例如，向受试者施用IL-15可以使患者血液中IL-6和IFN-γ的浓度增加至多50倍。一些实施方案涉及引起或增强T细胞应答，治疗癌症或增强癌症治疗的方法，该方法包括：施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物；并施用有效量的治疗剂。例如，治疗剂包含IL-6或IFN-γ，或其组合。在实施方案中，CAR细胞、修饰的细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞、修饰的细胞是T细胞。一些实施方案涉及增强T细胞应答和/或治疗患有癌症或其他疾病的受试者的方法，其可包括向受试者施用治疗剂(例如，重组或天然IFN-γ)并施用有效量的组合物包含CAR并表达以及将治疗剂分泌到受试者的T细胞群体中的一种。在实施方案中，治疗剂的施用可以在CAR T治疗的早期阶段(例如，在输注CAR T细胞后1、2、3、4、5或6天增强CAR T细胞的扩增)。例如，可以在输注CAR T细胞后1、2、3、4、5或6天将治疗剂施用于受试者。在实施方案中，该方法可以包括向受试者施用治疗剂和施用有效量的包含CAR的T细胞群的组合物，而不向受试者表达或分泌治疗剂。例如，可以将治疗剂施用到受试者中预定的时间。在实施方案中，可以修饰治疗剂，使得可以增强治疗剂的生物学和/或药理学性质。例如，可以将杂合FC融合技术实施为治疗剂的活性成分的溶解度和/或稳定性。
在实施方案中，治疗剂可以是分离的天然或重组人细胞因子。例如，重组人IL-15可以每天推注输注施用3mcg/kg/天和1mcg/kg/天的预定时间。重组人IFN-γ可以每天2百万单位的剂量在预定时间内每周给药5天。在实施方案中，施用有效量的治疗剂包括施用有效量的治疗剂，使得受试者的血液中IL-6和/或IFN-γ的浓度可以增加5-1000倍(例如，50倍)。例如，治疗剂包含IL-15。
在实施方案中，与施用不表达或分泌治疗剂的T细胞相比，T细胞应答增强，或者与施用不施用治疗剂的CAR T细胞相比，T细胞应答增强。
在实施方案中，治疗剂的表达和/或分泌由诱导型表达系统调节和/或修饰的细胞包含编码诱导型自杀系统的核酸序列。在实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统。在实施方案中，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型半胱天冬酶-9系统。
在实施方案中，受试者血液中IL-6的浓度值范围为60至5000pg/mL、200-5000pg/mL或2000-5000pg/mL。在实施方案中，受试者血液中IFN-γ的浓度范围为20至5000pg/mL、200至5000pg/mL、或500至5000pg/mL。在实施方案中，施用有效量的治疗剂包括静脉内递送一定量的人IL-6，其范围为约0.5-50μg/千克体重。在实施方案中，修饰的细胞可以表达治疗剂，使得受试者的血液中IL-6和/或IFN-γ的浓度可以增加5-1000倍(例如，50倍)。例如，治疗剂包含IL-15。有关IFN-γ临床用途的更多详细信息可在Cancer Med 2018,7：4509-4516中找到,其通过引用并入。
在实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含结合实体瘤抗原的另外的CAR，并且CAR结合白细胞的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、PSCA或EGFR，并且B细胞抗原是CD19、CD20、CD22或BCMA。
在实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含显性失活的PD-1。在实施方案中，修饰的细胞或T细胞包含缺乏功能性PD-1细胞内结构域的修饰的PD-1。
在实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。在实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导域，所述共刺激信号传导域包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其组合。在实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体(EGFRvIII)的变体III、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、二唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白细胞介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体-α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。
在实施方案中，治疗剂在重组DNA构建体，mRNA或病毒载体中存在于修饰的细胞中。在实施方案中，修饰的细胞包含编码治疗剂的治疗剂mRNA，并且mRNA未整合到修饰的细胞的基因组中。在实施方案中，修饰的细胞包含核酸序列，所述核酸序列包含或包含分离的核酸序列，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中治疗剂的表达和/或分泌。在实施方案中，转录调节剂是或包括Hif1a、NFAT、FOXP3和/或NFkB。在实施方案中，启动子对转录调节剂有响应。在实施方案中，启动子与编码治疗剂的核酸序列可操作地连接，使得启动子驱动治疗剂在细胞中的表达和/或分泌。在实施方案中，启动子包含SEQ ID NOs：23-26中的至少一个。
在实施方案中，CAR细胞、修饰的细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞、修饰的细胞是T细胞。
本文描述的实施方案还涉及修饰的T细胞包含CAR，其中所述T细胞包含一个核酸序列，该核酸序列包含串联的编码IL-6的核酸序列和编码IFN-γ的核酸序列，所述T细胞经工程化改造当T细胞被激活时以表达和分泌IL-6和INF-γ，其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域、细胞内结构域，细胞外结构域结合抗原。
在实施方案中，该修饰T细胞的抑制肿瘤的功能和不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的T细胞相比没有减弱。在此，选择某些细胞因子(例如IL-6和INF-γ)在T细胞中表达或过表达。这些细胞因子至少不会削弱抑制肿瘤细胞的杀伤功能和/或能力。因为并非所有细胞因子都可以由T细胞表达和分泌而不减少它们杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤生长的功能。报告显示某些细胞因子的肿瘤促进作用。例如，TAM产生的IL-10可以通过抑制APC的功能并随后阻断T细胞效应子功能如细胞毒性来减弱抗肿瘤反应(Mannino，MH，Zhu，Z.，Xiao，H.，Bai，Q.，Wakefield，MR,Fang，Y.,Cancer Lett.2015Oct 28；367(2):103-7)。小鼠肿瘤模型的研究表明IL-10可抑制肿瘤浸润性DC成熟及其产生IL-12以刺激Th1细胞，除非IL-10信号传导是同时阻断(Vicari AP,Chiodoni C,Vaure C,Ait-Yahia S,Dercamp C,Matsos F,Reynard O,Taverne C,Merle P,Colombo MP,O’Garra A,Trinchieri G,Caux C.J ExpMed.2002；196:541-549。通过CpG免疫刺激性寡核苷酸和抗白细胞介素10受体抗体逆转肿瘤诱导的树突细胞麻痹(J.Exp.Med.196,541-549)。再例如，研究表明，TGF-β可能是T细胞增殖的有效抑制剂(Kehrl JH,Wakefield LM,Roberts AB,Jakowlew S,Alvarez-Mon M,Derynck R,Sporn MB,Fauci AS.Production of transforming growth factor beta byhuman T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cellgrowth.J Exp Med.1986May 1；163(5):1037–1050)。几种机制驱动TGF-β介导的T细胞增殖抑制，包括抑制IL-2产生，下调c-myc和上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Li MO，WanYY，Sanjabi S，Robertson AK，Flavell,Transforming growth factor-beta regulationof immune responses,Annu Rev Immunol.2006；24:99-146)。在某些情况下，TGF-β在促进细胞死亡以限制激活后T细胞扩增中也起重要作用(Mark A.TravisandDean Sheppard，TGF-βActivation and Function in Immunity，Annu.Rev.Immunol.2014，32：51-82)。趋化因子是一大类细胞因子，可指导正常的白细胞迁移。它们还涉及白细胞发育和许多疾病的发病机理。此外，一些趋化因子浓度梯度在结内T细胞迁移中起重要作用。这些趋化因子的过度表达会破坏T细胞的迁移，从而削弱实体瘤的CAR T细胞治疗。如果没有适当的迁移，T细胞可能无法到达肿瘤细胞。例如，据报道趋化因子CCL21的过表达会破坏T细胞迁移(Christopherson KW and,Campbell JJ,Hromas RA.Transgenic overexpression of theCC chemokine CCL21disrupts T-cell migration.Blood.2001Dec 15；98(13):3562-8)。因此，在实施方案中，在修饰细胞中过表达或表达的细胞因子不包括CCL21,IL-10和/或TGF-β。在实施方案中，在修饰细胞中过表达或表达的细胞因子不包括IL-10和/或TGF-β。在实施方案中，在修饰细胞中过表达或表达的细胞因子不包括TGF-β。
在实施方案中，所述修饰T细胞的抑制肿瘤的功能和不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的T细胞相比没有减弱。
在实施方案中，所述修饰T细胞不表达和/或分泌IL-10和/或TGF-β。
在实施方案中，所述CAR结合实体瘤抗原。某些细胞因子可在T细胞中过表达或表达，以增强CAR T疗法治疗肿瘤。然而，一些细胞因子(例如IL-6)不能在T细胞中过表达或表达以治疗血肿瘤。IL-6是导致CAR T治疗血液肿瘤如ALL和NHL的严重CRS的主要因素。因此，IL-6可在T细胞中过表达或表达以治疗实体瘤，因为很少有报道显示CART治疗实体瘤的严重CRS。
在实施方案中，所述修饰T细胞包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列。
在实施方案中，所述CAR结合tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、PSCA或EGFR。在实施方案中，所述细胞内结构域包含共刺激信号传导域，所述共刺激信号传导域包含共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其组合。在实施方案中，所述抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1。、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、PSCA或EGFR。
在实施方案中，所述核酸序列包含启动子，所述启动子包含调节所述转录调节剂的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。在实施方案中，所述转录调节剂是或包含Hif1a、NFAT、FOXP3或NFkB。在实施方案中，所述启动子对转录调节剂有响应。在实施方案中，所述启动子与该核酸序列可连接，使得所述启动子驱动所述T细胞中IL-6和INF-γ的表达和/或分泌。在实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NOs：23-26中的至少一种。
在实施方案中，所述修饰的细胞群体包含编码SEQ ID NO：21和22，和SEQ ID NO：27的核酸序列，以使得当T细胞被激活时IL-6和INF-γ被表达和分泌。
在实施方案中，所述CAR、IL-6和INF-γ以多聚蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR、IL-6和INF-γ，并且在CAR、IL-6和INF-γ之间存在可切割的部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。
实施方案涉及用于治疗患有癌症或增强受试者的T细胞应答的受试者的组合物和方法。该方法包括向受试者施用有效量的具有第一CAR的修饰细胞群。第一CAR包括抗原结合结构域，跨膜结构域，CD28的共刺激结构域和/或CD3ζ结构域。该方法可以进一步包括监测和/或测量由修饰的细胞诱导的T细胞应答的一个或多个参数。例如，一个或多个参数包括细胞因子释放，淋巴细胞数目以及CAR T细胞扩增和衰竭水平。该方法可以进一步包括响应于预定时间(例如，输注后一或两周)和/或病状，向受试者施用有效量的包括第二CAR的修饰细胞群，所述第二种CAR与受试者相关。测量参数是例如，CAR的拷贝数和CAR T细胞的数目。第二CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、4-1BB的共刺激结构域和/或CD3ζ结构域。据报道，CD28 CAR T细胞和4-1BB CAR T细胞在实验室和临床上表现不同。因此，该方法通过将强的初始免疫应答与长而持久的免疫应答偶联而结合了两个共刺激域的优点。例如，包括CD28的第一个CAR引起强烈的T细胞活化，并与效应子样分化有关。虽然第一个CAR可能导致T细胞衰竭，但它被设计为引起受试者免疫系统的强烈初始反应。包括4-1BB在内的第二种CAR减少了T细胞衰竭，增强了持久性并增加了中枢记忆分化和线粒体生物发生，这是专为持久性CAR T治疗而设计的。在实施方案中，由第一CAR诱导的初始反应可以增强持续性CAR T疗法。在实施方式中，可以将包含第一CAR的修饰细胞群和包含第二CAR的修饰细胞群同时施用于受试者。例如，该组合物可以包括包含第一CAR的修饰细胞群和包含第二CAR的修饰细胞群。在实施方案中，第一CAR结合WBC的抗原，并且第二CAR结合实体瘤抗原。在实施方案中，第一CAR和第二CAR结合相同或不同的实体瘤抗原。例如，包括结合了实体肿瘤抗原(例如TSHR)并包含4-1BB共刺激域的CAR的修饰细胞群和包含结合了实体肿瘤抗原的CAR的修饰细胞群(例如TSHR)或另一种实体肿瘤抗原(例如tMuc1)和包含CD28共刺激域的细胞混合在一起，以获得混合的修饰细胞。在实施方案中，可以将修饰的细胞进一步施用于受试者。在实施方案中，修饰的细胞可以与包含结合WBC抗原(例如，CD19)的CAR的修饰的细胞群一起进一步施用于受试者。
在实施方案中，本文所述的CAR分子包含一个或多个用于结合目的抗原的互补决定区(CDR)。CDR是免疫球蛋白和T细胞受体中用于结合特定抗原的可变域的一部分。每个可变域有三个CDR。由于存在可变的重结构域和可变的轻结构域，因此存在六个用于结合抗原的CDR。此外，由于抗体具有两条重链和两条轻链，所以抗体总共具有十二个用于结合抗原的CDR。在实施方案中，本文所述的CAR分子包含一个或多个用于结合抗原的CDR。在实施方案中，一个或多个CDR结合WBC的抗原，例如B细胞。例如，一个或多个CDR结合B细胞的细胞表面抗原CD19。在实施方案中，一个或多个CDR结合肿瘤抗原，例如tMUC1。TSHR，GUCY2C，ACPP，CLDN18.2(18.2)，PSMA或UPK2。
本公开描述了用于治疗实体瘤的组合物。该组合物包含修饰的细胞的第一和第二群体。工程化的第一群体的细胞被工程化以表达第一CAR(例如，CD19，CD22，BCMA CAR)。第二组修饰的细胞被工程化以表达第二种CAR(例如GCC，TSHR，PAP和tMUC1)。在实施方案中，第一CAR结合WBC抗原。在实施方案中，第二CAR结合实体瘤抗原。在实施方案中，第一修饰细胞群不包含第二CAR，和/或第二修饰细胞群不包含第一CAR。可以混合第一群体和第二群体的修饰细胞以获得混合细胞群体，其被注入受试者中。在实施方案中，可以基于第五预定比率将修饰细胞的第一群体和第二群体混合，使得第一修饰细胞群体不比修饰细胞第二群体多。例如，修饰细胞的第一群体和第二群体的第五预定比例小于1：1但大于1：10,000。在实施方案中，在注入受试者后，第一群体的修饰细胞结合受试者的WBC(例如，B细胞)，杀死B细胞，并引起受试者的一个或多个免疫反应。在实施方案中，第一修饰细胞群可以引起第二修饰细胞群的扩增并且可以不直接结合和/或抑制实体瘤细胞，所述实体瘤细胞随后可以被扩增的第二修饰细胞群抑制。在实施方案中，鉴于第一修饰细胞群可能不直接结合和/或抑制实体瘤细胞，第五预定比率的值可以小于1：1以减少制造第一修饰细胞群的成本。同样，较少数量的第一修饰细胞群体将在治疗期间花费更长的时间使第一修饰细胞群体杀死WBC(例如，B细胞)并杀死更少的WBC。细胞杀死WBC的时间更长，可以更好地扩增第二批修饰细胞。在治疗期间杀死更少的白细胞可以对受试者的免疫系统造成更少的损害和/或使免疫系统更快地恢复。同时，应该有一定量的第一批修饰细胞在受试者中引发和/或引起第二批修饰细胞的扩增。例如，第五预定比率是1：1、1：10、1：100、1：1000和1：104，以及该范围内的单个数字，最好是1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：100或1：1000。在实施例中，第五预定比率以及该范围内的单个数字小于1：1且大于1：100。在实施例中，第五预定比率以及该范围内的单个数字小于1：1且大于1:20。在实施例中，第五预定比率以及该范围内的单个数字小于1：1且大于1:17。在实施方案中，注入受试者的混合细胞可以进一步包含经改造的细胞群体，其被改造以表达第一CAR和第二CAR。在实施方式中，由于与第五预定比例相似的原因，第三群体的修饰细胞具有第六预定比例，第二群体的修饰细胞为1：1、1：10、1：100、1：1000和1：104，以及该范围内的单个数字，最好是1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：100或1：1000。在实施例中，第六预定比率以及该范围内的单个数字小于1：1且大于1：100。在实施方案中，该组合物可以用于创新细胞疗法的CoupledCAR系统。可在创新细胞治疗学的PCT专利申请号PCT/CN2016/075061，PCT/CN2018/08891和PCT/US19/13068和PCT/US20/13099中找到关于CoupledCAR系统的更多信息。结合在此作为参考。
本公开描述了一种用于产生混合细胞群的方法，其可以用于治疗实体瘤。该方法包括使细胞群体与第一载体和第二载体接触，以将第一载体和/或第二载体引入细胞群体并获得修饰的细胞群体，然后将其施用于患有癌症的受试者。修饰细胞群至少包括第一和第二修饰细胞群。工程化的第一群体的细胞被工程化以表达第一CAR(例如，CD19，CD22，BCMA CAR)。第二组修饰的细胞被工程化以表达第二种CAR(例如GCC，TSHR，PAP和tMUC1)。在实施方案中，第一CAR结合WBC抗原。在实施方案中，第二CAR结合实体瘤抗原。在实施方案中，第一修饰细胞群不包含第二CAR，和/或第二修饰细胞群不包含第一CAR。可以混合第一群体和第二群体的修饰细胞以获得混合细胞群体，其被注入受试者中。在实施方案中，可以基于第五预定比率将修饰细胞的第一群体和第二群体混合，使得第一修饰细胞群体不比修饰细胞第二群体多。在实施方案中，修饰细胞群可进一步包含经工程改造以表达第一CAR和第二CAR的第三修饰细胞群。在实施方案中，感染复数(MOI)是指试剂/载体(例如噬菌体或更一般地病毒，细菌)与感染靶标(例如细胞)的比率。在实施方案中，细胞群在不同的MOI处与第一载体和第二载体接触。例如，以第一预定MOI接触细胞群，并以第二预定MOI接触第二载体。在实施方案中，第一和第二预定MOI被设计为产生比第一修饰细胞群更多或相同数量的第二修饰细胞群。例如，第一预定MOI与第二预定MOI之比为1：1、1：10、1：100、1：1000和1：104，以及该范围内的单个数字，优选为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：100或1：1000。在实施例中，第一预定MOI与第二预定MOI之比以及该范围内的单个数字小于1：1但大于1：100。在实施例中，第一预定MOI与第二预定MOI之比以及该范围内的单个数字小于1：1但大于1:20。在实施例中，第一预定MOI与第二预定MOI之比以及该范围内的单个数字小于1：1但大于1:17。
本公开描述了混合细胞群，其可以用于治疗实体瘤。该混合细胞群包括修饰的T细胞，该修饰的T细胞包含至少两个T细胞，其中所述第一T细胞包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码CAR结合血细胞抗原的核酸序列，所述第二T细胞包含第二核酸序列，该第二核酸序列包括编码CAR或TCR结合实体瘤抗原的核酸序列，其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域、细胞内结构域。
在实施方案中，其中第二T细胞的数量多于第一T细胞的数量，并且可以包括多约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括1和在1以上的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)这里描述的数量或水平。在实施方案中，其中第二T细胞的数量比第一T细胞的数量的多1-10倍。在实施方案中，其中第二T细胞的数量不少于第一T细胞的数量。由于患者可以在B细胞的消耗中存活，因此可以使用CAR细胞的第一抗原结合结构域，使用患者的B细胞在患者体内扩增CAR细胞。因此，更多的CAR细胞可在患者体内及时扩增，从而增加了CAR细胞的效力。患者中及时扩增的CAR T细胞可增加CART细胞与肿瘤细胞，特别是具有第二CAR结合的抗原的实体肿瘤细胞接触的机会。由于为了减少对患者的B细胞消耗和或增加B细胞的消耗的时间来扩大对第二CAR细胞的扩增，在实施方案中，第二T细胞的数量不少于第一T细胞的数量或第二T细胞的数量大于第一T细胞的数量。
在实施方案中，该第二核酸序列包括编码CAR的核酸序列，所述CAR包括SEQ IDNO：8、11、29、30、31、32、33、34或35。
在实施方案中，该第一核酸序列包括编码CAR的核酸序列，所述CAR包括SEQ IDNO：5或6。
在实施方案中，实体瘤抗原包括tMUC1、TSHR、GUCY2C、ACPP、CLDN18.2(18.2)、PSMA或UPK2。
在实施方案中，其中所述TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，所述TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，所述肿瘤抗原包含CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。在实施方案中，所述TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链，或其组合。
在实施方案中，所述其中所述第一T细胞和或第二T细胞包含第三核酸序列，该第三核酸序列包含(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列。在实施方案中，所述第一T细胞和或第二T细胞经工程化改造，当T细胞被激活时以表达和分泌IL-6和或INF-γ。在实施方案中，所述第一T细胞和或第二T细胞包含串联的(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列。在实施方案中，所述第一T细胞和或第二T细胞包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列。
在实施方案中，所述细胞内结构域包含共刺激信号传导域，所述共刺激信号传导域包含共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1，ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其组合和或，所述抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、，EGFRvIII、PSCA或EGFR。
在实施方案中，所述第三核酸序列包含启动子，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述结合位点调节转录调节剂的表达和/或分泌。在实施方案中，转录调节剂是或包含Hif1a、NFAT、FOXP3或NFkB。在实施方案中，启动子对转录调节剂有响应。在实施方案中，所述启动子与该核酸序列可连接，使得所述启动子驱动所述T细胞中IL6和INFγ的表达和/或分泌。在实施方案中，启动子包含SEQ ID NOs：23-26中的至少一种。
在实施方案中，该修饰的细胞群体包含编码SEQ ID NO：21和22，和SEQ ID NO：27的核酸序列，以使得当T细胞被激活时IL-6和INF-γ被表达和分泌。在实施方案中，CAR、IL-6和INF-γ以多聚蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR、IL-6和INF-γ，并且在CAR、IL-6和INF-γ之间存在可切割的部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。在实施方案中，该修饰T细胞的抑制肿瘤的功能和不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的T细胞相比没有减弱，该修饰T细胞不表达和/或分泌TGF-β。
本文描述的实施方案涉及组合物在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的用途，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物上面描述的修饰细胞。
进一步，本文描述的实施方案涉及组合物在有此需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的用途，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包含上述的修饰细胞。通过参考以下示例性实施例和示例来进一步描述本公开。提供这些示例性实施例和示例仅用于说明的目的，并非旨在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应被解释为包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
示例性实施方式
以下是示例性实施例：
1.一种有效用于在患者中扩增和/或维持修饰细胞的修饰细胞群，其中所述修饰细胞群包含至少两种不同的修饰细胞：第一修饰细胞，其包含用于扩增和/或维持的抗原结合域。第二修饰细胞，其包含用于杀死靶细胞例如肿瘤细胞的抗原结合结构域。在实施方案中，修饰的细胞是修饰的T细胞。在实施方案中，至少两个不同的修饰的细胞包括两个不同的修饰的T细胞，两个不同的修饰的免疫细胞或其组合。在实施方案中，修饰的免疫细胞包括修饰的T细胞，DC细胞和/或巨噬细胞。
2.实施方案1的修饰细胞群体，其中所述抗原结合结构域结合不同的抗原。
3.实施方案1的修饰细胞群，其中修饰细胞群还包含表达至少两个不同抗原结合结构域的第三修饰细胞，用于扩展和/或维持修饰细胞的第一抗原结合域和第二抗原结合域用于杀死靶细胞，其中两个不同的抗原结合域在同一细胞上表达。
4.实施方案1的修饰细胞群，其中所述修饰细胞群包括表达用于杀死靶细胞的抗原结合域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合域的修饰细胞，所述第一抗原结合域用于扩增和/或维持修饰的细胞和用于杀死靶细胞的第二抗原结合结构域，其中两个不同的抗原结合结构域在同一修饰的细胞上表达。
5.实施方案1的修饰细胞群，其中所述修饰细胞群包括表达用于扩展和/或维持修饰细胞的抗原结合域的修饰细胞和表达至少两个抗原结合域的修饰细胞，第一抗原用于扩展和/或维持修饰的细胞的结合结构域和用于杀死靶细胞的第二抗原结合结构域，其中两个不同的抗原结合结构域在相同的修饰细胞上表达。
6.实施方案1-5中任一项的修饰的细胞群，其中所述修饰的细胞是修饰的T细胞，修饰的NK细胞，修饰的巨噬细胞或修饰的树突状细胞。
7.实施方案1-6中任一项的修饰的细胞群，其中用于扩展/或维持修饰的细胞的抗原结合结构域结合WBC的表面抗原，并且用于杀死靶细胞的抗原结合结构域结合WBC的表面抗原。肿瘤抗原。
8.实施方案7的修饰的细胞群，其中所述WBC是B细胞。
9.实施方案7的修饰细胞群，其中WBC的细胞表面抗原是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
10.实施方案1-9中任一项的修饰的细胞群，其中所述实体肿瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、ILA13、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3、EGFR或表1中所列的一种。
11.实施方案7的修饰细胞群，其中所述WBC的细胞表面抗原是CD19、CD20、CD22或BCMA。
12.实施方案7的修饰细胞群体，其中B细胞的细胞表面抗原是CD19，并且肿瘤抗原是tMUC1、TSHR、GUCY2C、ACPP、CLDN18.2(18.2)、PSMA或UPK2。
13.一种组合物，其包含第一细胞群和第二细胞群，所述细胞群包含结合第一抗原的第一CAR，所述第二细胞包含结合第二抗原的第二CAR，其中所述第二抗原是肿瘤抗原，并且所述第一抗原和第二抗原是不同的抗原。
14.实施方案13的组合物，其中第一细胞群不包含第二CAR，和/或第二细胞群不包含第一CAR。
15.实施方案14的组合物，其中所述组合物还包含第三细胞群体，所述第三细胞群体包含第一CAR和第二CAR。
16.实施方案13的组合物，其中第二细胞群进一步包含第一CAR，并且第一细胞群不包含第二CAR；并且或第一细胞群进一步包含第二CAR。
17.实施方案13的组合物，其中第二细胞群不包含第一CAR，并且第一细胞群包含第二CAR。
18.一种增强第二细胞群的扩增的方法，其中所述第二细胞群是靶向实体瘤的细胞，所述方法包括将有效量的实施方案13-17中任一项的组合物施用于患有与该癌症相关或表达该癌症的肿瘤抗原的癌症形式的个体。
19.一种在受试者中增强T细胞应答或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向患有与该癌症相关或表达该癌症的肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的实施方案13-17中任一项的组合物。
20.一种增强受试者中细胞的扩增的方法，所述方法包括：使细胞与包含编码第一CAR的第一核酸序列的第一载体和包含编码第二CAR的第二核酸序列的第二载体接触以获得所述载体。实施方案13-17中任一项的组合物；将有效量的组合物施用于患有与肿瘤抗原有关或表达肿瘤抗原的癌症形式的受试者。
21.一种在有需要的受试者中增强T细胞应答或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：使细胞与包含编码第一CAR的第一核酸序列的第一载体和包含第二核酸的第二载体接触。编码第二CAR的核酸序列以获得实施方案13-17中任一项的组合物；向患有与该肿瘤抗原相关或表达该肿瘤抗原的癌症形式的受试者给予有效量的该组合物。
22.一种增强受试者中细胞的扩增的方法，所述方法包括：施用有效量的实施方案13-17中任一项的组合物的第一细胞群；和施用有效量的所述第一细胞群；和施用有效量的第二细胞群。
23.实施方案20-22中任一项的方法，其中所述第一载体和第二载体包括慢病毒载体。
24.实施方案13-23中任一项的组合物或方法，其中第一或第二抗原是或包含白细胞(WBC)，肿瘤抗原或实体瘤抗原的表面分子。
25.实施方案13-24中任一项的组合物或方法，其中所述细胞是修饰的T细胞，修饰的NK细胞，修饰的巨噬细胞或修饰的树突状细胞。
26.实施方案24的组合物或方法，其中所述WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。
27.实施方案26的组合物或方法，其中所述WBC是B细胞。
28.实施方案27的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
29.实施方案26的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。
30.实施方案26的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19。
31.实施方案26的组合物或方法，其中所述肿瘤抗原是实体肿瘤抗原。
32.实施方案26的组合物或方法，其中所述实体肿瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、Me ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3、CLDN18.2或EGFR。
33.实施方案26的组合物或方法，其中所述实体瘤抗原是或包含tMUC1。
34.实施方案13-33中任一项的组合物或方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和CD3ζ结构域。
35.实施方案34的组合物或方法，其中所述共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体或其组合。
36.实施方案34的组合物或方法，其中第二CAR的共刺激结构域包含或为4-1BB的细胞内结构域，并且第二CAR的抗原结合结构域结合tMUC1；和/或第一CAR的抗原结合结构域结合CD19，而第二CAR的共刺激结构域包含或为CD28的细胞内结构域。
37.实施方案13-36中任一项的组合物或方法，其中第一细胞群体和/或第二细胞群体进一步包含PD-1的显性失活形式。
38.实施方案37的组合物或方法，其中第一细胞群体包含编码第一CAR和PD-1的显性失活形式的载体。
39.实施方案13-38中任一项的组合物或方法，其中所述第一CAR包含scFv结合tMUC1、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ区域，并且所述第二CAR包含scFv结合CD19、4-1BB或CD28的胞内结构域和CD3 zeta结构域。
40.实施方案13-39中任一项的组合物或方法，其中第一CAR包含SEQ ID NO：5，并且第二CAR包含SEQ ID NO：31。
41.实施方案13-40中任一项的组合物或方法，其中所述第二细胞群体包含编码所述第一CAR和治疗剂的慢病毒载体，并且所述第一细胞群体包含编码所述第二CAR和IFN-γ的慢病毒载体。
42.实施方案13-41中任一项的组合物或方法，其中第一细胞群体包含第一CAR和治疗剂，第二细胞群体包含第二CAR和PD-1的显性失活形式。
43.实施方案41或42的组合物或方法，其中所述治疗剂包含细胞因子或为细胞因子。
44.实施方案43的组合物或方法，其中所述细胞因子是IL6和/或INFγ。
45.一种方法，其包括向对象施用有效量的第一T细胞群，所述第一T细胞群包括包含scFv结合CD19、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ区域的CAR，从而增强第一受试者中T细胞的数量；向患者施用有效量的第二T细胞群，所述第二T细胞群包含含有scFv结合tMUC1、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域的CAR。
46.实施方案45的方法，其中第一细胞群还包含另外的CAR，其包含scFv结合tMUC1、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ结构域。
47.实施方案45的方法，其中第二细胞群不包含scFv结合CD19。
48.实施方案45的方法，其中第一细胞群不包含scFv结合tMUC1。
49.一种增强对癌症受试者的治疗的方法，所述方法包括：
对受试者施用靶向WBC抗原的CAR T细胞；和
对受试者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
50.一种在患有癌症的受试者中扩增TIL的方法，该方法包括：
对受试者施用靶向WBC抗原的CAR T细胞；和
对受试者施用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
51.实施方案49或50的方法，其中所述TIL通过以下方法制备：
(i)从该受试者切除的肿瘤中获得第一TIL群体；
(ii)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，以产生第二TIL群体；
(iii)通过向第二TIL群体的细胞培养基补充额外的IL-2，OKT-3和抗原呈递细胞(APC)进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中第三群体为TIL的数量比第二TIL群体大至少100倍，并且其中第二次扩增至少进行14天以获得第三TIL群体，其中第三TIL群体是治疗性TIL群体。第三TIL群体，其相对于第二TIL群体包含增加的效应T细胞和/或中央记忆T细胞亚群；和
(iv)对受试者施用治疗有效剂量的第三TIL。
52.实施方案51的方法，其中该方法进一步包括在步骤(iv)之前，通过向第三TIL群体的细胞培养基中补充额外的IL-2，额外的OKT-3，进行额外的第二次扩增的步骤，以及另外的APC，其中，与步骤(iii)相比，进行额外的第二次扩增至少14天以获得更大的TIL治疗群体，其中，更大的TIL治疗群体包括效应T细胞和/或相对于第三类TIL的中央记忆T细胞。
53.实施方案51的方法，其中在步骤(ii)之后，在实施方案51的第二次扩增之前，将细胞从细胞培养基中移出并冷冻保存在存储介质中。
54.实施方案53的方法，其中在实施方案51的第二次扩增之前将细胞融化。
55.实施方案51的方法，其中将步骤(iii)重复1-4次，以便在治疗性TIL群体中获得对于治疗有效剂量的TIL而言足够的TIL。
56.实施方案49至55中任一项的方法，其中所述APC是外周血单核细胞(PBMC)。
57.实施方案49至55中任一项的方法，其中所述效应T细胞和/或中央记忆T细胞显示出一种或多种选自以下的特征：CD27的表达，CD28的表达，端粒更长，CD57的表达增加相对于第三细胞群体中的效应T细胞和/或中央记忆T细胞，CD56的表达降低。
58.实施方案49至55中任一项的方法，其中相对于第三群体中的效应T细胞和/或中央记忆T细胞，效应T细胞和/或中央记忆T细胞表现出增加的CD57表达和降低的CD56表达。细胞。
59.实施方案49至55中任一项的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、子宫颈癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三联癌阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。
60.实施方案49-59中任一项的方法，其中所述CAR结合CD19、CD20、CD22或BCMA。
61.如实施方式49-60中任一项所述的方法，其中，在输注了CAR T细胞和TIL的受试者中的TIL的数量大于在输注了TIL的受试者中的TIL的数量。
62.实施方案49-60中任一项的方法，其中所述CAR T细胞包含修饰的细胞2和修饰的细胞1。
63.一种在需要其的受试者中增强细胞扩增或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
向具有表达肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含第一细胞群和第二细胞群，所述细胞群包含结合第一抗原的第一CAR，第二细胞群包含结合第二抗原的第二CAR抗原，其中第二抗原是肿瘤抗原并且不同于第一抗原。
64.实施方案63的方法，其中所述细胞是T细胞，NK细胞或树突细胞。
65.实施方案63的方法，其中第一抗原包括白细胞(WBC)的细胞表面分子、肿瘤抗原或实体瘤抗原。
66.实施方案65的方法，其中所述WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。
67.实施方案66的方法，其中淋巴细胞是B细胞。
68.实施方案65的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
69.实施方案65的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。
70.实施方案65的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19。
71.实施方案63的方法，其中所述肿瘤抗原是实体肿瘤抗原。
72.实施方案71的方法，其中所述实体瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα1、间皮素、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3、CLDN18.2或EGFR。
73.实施方案71的方法，其中所述实体肿瘤抗原包含tMUC1。
74.实施方案63的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ结构域。
75.实施方案74的方法，其中所述共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的细胞内结构域)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、结合CD83的配体或其组合。
76.实施方案63的方法，其中第一CAR包含scFv结合CD19、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ域，并且第二CAR包含scFv结合tMUC1、4-细胞内结构域。1BB或CD28，以及CD3ζ域。
77.实施方案63的方法，其中所述第一CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：5，并且所述第二CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：31。
78.实施方案63的方法，其中第二细胞群包含编码第二CAR和PD-1的显性失活形式的慢病毒载体。
79.实施方案63的方法，其中第一细胞群体包含编码第一CAR和治疗剂的慢病毒载体。
80.实施方案79的方法，其中所述治疗剂包括细胞因子。
81.实施方案80的方法，其中所述细胞因子是IL6和/或INFγ。
82.实施方案80的方法，其中所述细胞因子是IL6、IL12、IL7、IL15、TNF-α或IFNγ中的至少一种。
83.一种用于体外细胞制备的方法，该方法包括：使细胞与(1)包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和(2)包含编码第二抗原的多核苷酸的第二载体接触抗原结合分子，其结合第二抗原以获得修饰的细胞群体，以获得修饰的细胞的混合群体，其中第一抗原不同于第二抗原。
84.一种用于增强患有癌症的受试者的细胞扩增的方法，该方法包括：从受试者或健康供体获得细胞；使细胞与(1)包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和(2)包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体以获得混合群体修饰细胞将有效量的修饰细胞混合群体施用于受试者；其中：第一抗原不同于第二抗原；并且受试者的细胞扩增水平高于给予有效量的已与第一载体而非第一载体接触的修饰细胞群的受试者中的细胞扩增水平。
85.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：从受试者或健康供体获得细胞；使细胞与(1)包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和(2)包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体以获得混合群体修饰细胞将有效量的修饰细胞混合群体施用于受试者；其中：第一抗原不同于第二抗原。
86.一种增强对患有癌症的受试者的治疗的方法，所述方法包括：从受试者或健康供体获得细胞；使细胞与(1)包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和(2)包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体以获得混合群体修饰细胞将有效量的修饰细胞混合群体施用于受试者；其中：第一抗原不同于第二抗原；并且该受试者中对肿瘤生长的抑制水平高于对受试者施用有效量的已与第二载体而非第一载体接触的修饰细胞群的肿瘤生长的抑制水平。
87.一种用于体外细胞制备的方法，所述方法包括：将包含编码与第一抗原结合的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群；引入第二载体，该第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，该第二抗原结合分子将第二抗原结合到第二细胞群中；分别培养第一和第二细胞群；其中第一抗原不同于第二抗原。
88.一种在患有癌症的受试者中增强细胞扩增的方法，所述方法包括：将包含编码与第一抗原结合的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群体，以获得第一修饰细胞群体。引入第二载体，该第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，该第二抗原结合分子将第二抗原结合到第二细胞群中以获得第二修饰细胞群；向受试者施用有效量的第一和第二修饰细胞群；其中：第一抗原不同于第二抗原；并且受试者中的细胞扩增水平高于给予有效量的第二组修饰细胞而不是第一组修饰细胞的受试者中细胞扩增的水平。在实施方案中，同时或顺序施用第一组修饰的细胞和第二组修饰的细胞。
89.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：将包含编码与第一抗原结合的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群体，以获得第一修饰细胞群体；和引入第二载体，该第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，该第二抗原结合分子将第二抗原结合到第二细胞群中以获得第二修饰细胞群；向受试者施用有效量的第一和第二修饰细胞群；其中第一抗原不同于第二抗原。在实施方案中，同时或顺序施用第一组修饰的细胞和第二组修饰的细胞。
90.一种增强对患有癌症的受试者的治疗的方法，所述方法包括：将包含编码与第一抗原结合的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群体，以获得第一修饰细胞群体；和引入第二载体，该第二载体包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸，该第二抗原结合分子将第二抗原结合到第二细胞群中以获得第二修饰细胞群；向受试者施用有效量的第一和第二修饰细胞群，其中：所述第一抗原不同于所述第二抗原；以及并且在不存在第一个修饰细胞群的情况下，给予有效量的第二个修饰细胞群的受试者的肿瘤生长抑制水平高于给予有效量的第二个修饰细胞群体的受试者的肿瘤生长抑制水平。在实施方案中，同时或顺序施用第一组修饰的细胞和第二组修饰的细胞。
91.一种增强T细胞应答的方法，所述方法包括：将包含编码与第一抗原结合的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体引入第一细胞群；引入第二载体，该第二载体包含编码结合第二抗原的第二抗原结合分子的多核苷酸到第二细胞群中；使表达第二抗原的细胞与第一细胞群和第二细胞群接触；以及测量T细胞应答的水平，其中接触的细胞中的T细胞应答的水平高于与没有第一细胞群的第二细胞群体接触的细胞中的T细胞应答的水平。
92.一种增强T细胞应答的方法，所述方法包括：使细胞群体与包含编码结合第一抗原的第一抗原结合分子的多核苷酸的第一载体和包含编码第二抗原结合分子的多核苷酸的第二载体接触结合第二种抗原以获得混合的修饰细胞群；使表达第二抗原的细胞与修饰细胞的混合群体接触；以及测量T细胞应答的水平，其中在接触的细胞中的T细胞应答的水平高于与在没有第一载体的情况下与第二载体接触的细胞群接触的细胞中的T细胞应答的水平。
93.实施方案83-92中任一项的方法，其中所述细胞是T细胞、NK细胞或树突细胞。在实施方案中，细胞是T细胞。
94.实施方案83-93中任一项的方法，其中第一抗原结合分子结合WBC的细胞表面分子。
95.实施方案94的方法，其中所述WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。
96.实施方案94的方法、其中该WBC是B细胞。
97.实施方案94的方法、其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
98.实施方案94的方法，其中该WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。
99.实施方案94的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19。
100.实施方案83-99中任一项的方法，其中第二抗原结合分子结合实体瘤抗原。
101.实施方案100的方法，其中所述实体瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα1、间皮素、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、CLDN18.2或EGFR。
102.实施方案83-101中任一项的方法，其中所述第一和第二结合分子是CAR。
103.实施方案102的方法，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，并且所述细胞外结构域结合肿瘤抗原。
104.实施方案103的方法，其中所述细胞内结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD的共刺激分子的细胞内结构域-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或其组合。
105.实施方案105的方法，其中所述细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
106.实施方案83-101中任一项的方法，其中所述第一结合分子是CAR，并且所述第二结合分子是TCR。
107.实施方案106的方法，其中所述T细胞包含修饰的T细胞受体(TCR)。
108.实施方案106的方法，其中所述TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。
109.实施方案106的方法，其中TCR结合肿瘤抗原。
110.实施方案109的方法，其中所述肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。
111.根据实施例106所述的方法，其中所述TCR包括TCRγ和TCRδ链，TCRα和TCRβ链或其组合。
112.实施方案106的方法，其中第二细胞群体衍生自TIL。
113.实施方案83-112中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括包含第一结合分子的细胞和包含第二结合分子的细胞。
114.实施方案83-112中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括包含第一结合分子的细胞，包含第二结合分子的细胞和同时包含第一结合分子和第二结合分子的细胞。
115.实施方案83-112中任一项的方法，其中所述T细胞应答通过CAR的拷贝数和/或释放的细胞因子的量来测量。在实施方案中，释放的细胞因子是IL-6和/或IFNγ。
116.实施方案83-112中任一项的方法，其中所述T细胞应答包括细胞因子释放，细胞扩增和/或活化水平。
117.实施方案83-112中任一项的方法，其中第一载体进一步包含编码IL-6，IFNγ或其组合的多核苷酸。
118.实施方案83-112中任一项的方法，其中所述第一载体还包含编码IL-12的多核苷酸。
119.实施方案116和117中任一项的方法，其中所述多核苷酸包含编码NFAT和/或VHL的多核苷酸。
120.实施方案83-119中任一项的方法，其中修饰的细胞群体包括表达第一结合分子和IL-6，IFNγ或其组合的细胞，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子和IL-6的细胞。第二分子和/或表达第一结合分子和IL-12的细胞。
121.实施方案83-120中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括表达第二结合分子和IL-6，IFNγ或其组合的细胞，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子和IL-6的细胞。第二分子，和/或表达第一结合分子和IL-12的细胞。
122.实施方案83-121中任一项的方法，其中修饰的细胞群包括表达第二结合分子和IL-6，IFNγ或其组合的细胞，表达第二结合分子的细胞，表达第一结合分子和IL-6的细胞。第二分子和/或表达第二结合分子和IL-12的细胞。
123.实施方案83-122中任一项的方法，其中所述修饰细胞群包含表达显性负型PD-1的细胞。
124.双特异性嵌合抗原受体，其包含：第一抗原结合结构域，第二抗原结合结构域，细胞质结构域和跨膜结构域，其中所述第一抗原结合结构域识别第一抗原，并且所述第二抗原结合结构域识别第二抗原。抗原，并且第一抗原不同于第二抗原。
125.实施方案124的双特异性嵌合抗原受体，其中第一抗原和第二抗原不在同一细胞上表达。
126.实施方案124或125的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一抗原是血液成分的抗原，并且所述第二抗原是实体瘤的抗原。
127.实施方案124-126中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一抗原是CD19，并且所述第二抗原是肿瘤相关的MUC1。
128.实施方案124-128中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一抗原结合结构域包含氨基酸序列SEQ ID：5或6。
129.实施方案124-128中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第二抗原结合结构域包含氨基酸序列SEQ ID：31。
130.实施方案124的双特异性嵌合抗原受体，其中所述CAR包含表2中列出的任何tanCAR的氨基酸序列。
131.实施方案124的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合非必需组织的抗原，并且所述第二结合结构域结合肿瘤组织的抗原。在实施方案中，第一结合结构域结合TSHR或GUCY2C。在实施方案中，第二结合结构域结合tMUC1，MAGE-E1或上皮肿瘤抗原(ETA)。
132.实施方案124的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合组织特异性抗原，并且所述第二结合结构域结合在一个以上组织上表达的抗原。在实施方案中，第一结合结构域结合TSHR或PRLR。在实施方案中，第二结合结构域结合tMUC1，MAG-E1或ETA。
133.实施方案124的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合正常组织的抗原，并且所述第二结合结构域结合在肿瘤组织上表达的抗原。在实施方案中，第一结合结构域结合ACPP，TSHR，GUCY2C，UPK2，CLDN18.2，PSMA，DPEP3，CXCR5，B7-H3，MUC16，SIGLEC-15，CLDN6，Muc17，PRLR或FZD10。在实施方案中，第二结合结构域结合tMUC1，MAG-E1或ETA。
134.实施方案123中任一项的双特异性嵌合抗原受体，其中所述第一结合结构域结合在非恶性细胞上表达的抗原，并且所述第二结合结构域结合在肿瘤细胞而非相应细胞上表达的抗原。非恶性细胞。
135.一种细胞，其包含实施方案123-134中任一项的双特异性CAR。
136.一种核酸，其编码实施方案123-134中任一项的双特异性CAR。
137.一种增强T细胞应答，增强癌症治疗，治疗受试者癌症，治疗患有肿瘤的受试者或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括：施用有效量的实施方案135的细胞。
136.实施方案1-135中任一项的细胞，双特异性CAR，修饰的细胞群，组合物或方法在治疗需要其的受试者中的用途。
137.实施方案136的细胞，双特异性CAR，修饰的细胞群体，组合物或方法的用途，其中所述受试者患有癌症。
138.一种增强靶向实体瘤的细胞群的扩增和/或由此增强对实体瘤上的细胞群的治疗的方法，该方法包括给予有效量的包含靶向该实体瘤的细胞群的组合物肿瘤和靶向WBC抗原的细胞群。
139.一种产生混合细胞群体的方法，该方法包括：
在第一感染复数(MOI)下使细胞群体与第一载体接触，而在第二MOI下使细胞群体与第二载体接触，以获得混合细胞群，其包括靶向实体瘤的细胞群和靶向WBC抗原的细胞群体。
140.实施方式139的方法，其中细胞群体同时或顺序地与第一载体和第二载体接触。
141.实施方案139的方法，其中确定第一MOI和第二MOI的比率，使得靶向实体瘤的细胞群体至少比靶向WBC抗原的细胞群体多或多。混合细胞。
142.根据实施例139所述的方法，其中所述第一MOI与所述第二MOI的比率是1：1、1：10、1：100、1：1000和1：104，以及该范围内的单个数字，最好排除1.1和1：104。
143.根据实施例139所述的方法，其中所述第一MOI与所述第二MOI的比例为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：100或1：1000，以及该范围内的单个数字。
144.根据实施例139所述的方法，其中所述第一MOI和所述第二MOI的比率以及在该范围内的单个数字小于1：1但大于1：100。
145.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群与所述第二细胞群的比率为1：1、1：10、1：100、1：1000和1：104，该范围内的数字。
146.实施方式145的方法，其中所述比率为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：100或1：1000，以及该范围内的单个数字。
147.实施方案145的方法，其中该比率小于1∶1且大于1∶100，以及该范围内的单个数字。
148.一种组合物，其包含使用实施方案139-147中任一项的方法产生的混合细胞。
149.修饰的细胞群体，其包含使用实施方案139-147中任一项的方法产生的混合细胞。
150.一种增强受试者的T细胞应答或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向患有与肿瘤抗原或表达该肿瘤抗原的癌症形式的受试者施用有效量的实施方案148或实施方案149的组合物。
151.前述任一项合适实施方案的方法，其中修饰细胞中的一个或多个分子和/或结合分子的核酸序列以mRNA或病毒载体导入修饰细胞。
152.实施方案151的方法，其中所述核酸序列是不整合到所述修饰细胞的基因组中的mRNA。
153.实施方案151的方法，其中所述核酸序列与氧敏感性多肽结构域相关。
154.实施方案151的方法，其中所述氧敏感性多肽结构域包含HIF VHL结合结构域。
155.实施方案151的方法，其中所述核酸序列由启动子调节，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中治疗剂的表达和/或分泌。
156.实施方案155的方法，其中所述转录调节剂是或包括Hif1a、NFAT、FOXP3和/或NFkB。
157.前述实施方案中任一项的方法，其中所述修饰的细胞包含一个或多个分子。
158.实施方案157的方法，其中所述一个或多个分子包含G-CSF或GM-CSF的受体中的至少一种，或其组合，或包含G-CSF或GM-CSF的至少一种，或它们的组合。
159.实施方案157的方法，其中一种或多种分子包含IL-33、IL-1β、TNFα、MALP-2、IL1和IL17中的至少一种。
160.前述实施方案中任一项的方法，其中靶向实体瘤的细胞群的数量与靶向WBC抗原的细胞群的数量至少相同或更多。
161.前述合适实施方案中任一项的方法，其中所述修饰的细胞包含抗原结合分子，所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导域。
162.实施方案161的方法，其中与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域选自：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、蛋白酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、与Fos相关的抗原1、p53、p53突变体、prostein、survivin和端粒酶、PCTA-1/Galectin8、黑色素/MA RT1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧化酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。
163.实施方案161和162中任一项的方法，其中所述细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域，或主要信号传导域和共刺激信号传导域，其中所述共刺激信号传导域包括选自以下各项的功能性信号传导域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、一种与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D。
164.前述合适实施方案中任一项的方法，其中所述修饰的细胞包含抗原结合分子，所述抗原结合分子是修饰的TCR。
165.实施方案164的方法，其中所述TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。
166.实施方案165的方法，其中所述TCR结合肿瘤抗原。
167.实施方案166的方法，其中所述肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART-1、p53、MAGE-A3或NY-ESO-1。
168.实施方案166的方法，其中所述TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链，或其组合，和/或前述任何合适实施方案的方法，其中所述细胞是免疫细胞(例如，免疫效应细胞群)，例如，免疫细胞是T细胞或NK细胞。
169.实施方案168的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
170.实施方案169的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞或其组合。
171.前述合适实施方案中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。
172.任何进行适当实施方案的方法，其中至少一部分修饰的细胞包含编码结合分子和抑制性免疫检查点分子或其受体的显性失活形式的核酸序列。
173.如实施方式172所述的方法，其中所述抑制性免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞减毒剂(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160。
174.方法实施方案172，其中抑制性免疫检查点分子是修饰的PD-1。
175.实施方案174的方法，其中所述修饰的PD-1缺乏用于PD-1信号转导的功能性PD-1胞内结构域，干扰了人细胞的人T细胞的PD-1与PD-L1之间的途径。某种细胞的结构域，其包含或为PD-1细胞外结构域或PD-1跨膜结构域，或其组合，或与野生型PD-1相比包含取代或缺失的修饰的PD-1细胞内结构域胞内结构域，或包含或为包含与特定细胞的PD-L1结合的PD-1细胞外结构域的可溶性受体。
176.任何进行适当实施方案的方法，其中所述修饰的细胞被工程化以表达和分泌治疗剂，例如细胞因子。
49.实施方案48的方法，其中所述治疗剂为IL-6或IFN-γ或包含IL-6或IFN-γ或其组合。
177.实施方案176的方法，其中所述治疗剂为或包含IL-15或IL-12，或其组合。
51.实施方案48-50中任一项的方法，其中所述修饰的细胞的至少一部分包含小蛋白，或者所述治疗剂是或包含重组或天然细胞因子。
52.实施方案48的方法，其中所述小蛋白是或包含IL-12、IL-6或IFN-γ。
178.任何进行适当实施方案的方法，其中所述修饰的细胞衍生自健康供体或患有癌症的受试者。
179.实施方案42的方法，其中所述修饰的细胞具有降低的内源TRAC基因表达。
180.任何进行适当的实施方案的方法，其中第一细胞群包含结合WBC抗原的第一CAR，第二细胞群包含结合实体瘤抗原的第二CAR。
181.任何进行适当实施方案的方法，其中第一载体包含编码结合WBC的第一CAR的多核苷酸，第二载体包含编码结合实体瘤抗原的第二CAR的多核苷酸。
182.实施方案180或181的方法，其中所述WBC抗原是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
183.实施方案180或181的方法，其中该WBC抗原是CD19、CD20、CD22或BCMA。
184.实施方案180-183中任一项的方法，其中所述实体肿瘤抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、ILA13、GPC Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。
185.实施方案180-183中任一项的方法，其中所述实体肿瘤抗原是肿瘤相关的MUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2、CLDN18.2、PSMA、DPEP3、CXCR5、B7-H3、MUC16、SIGLEC-15、CLDN6、Muc17、PRLR和FZD10。
186.前述任一合适实施方案的方法，其中所述细胞群，所述混合细胞或所述组合物还包含经工程改造以表达所述第一CAR和所述第二CAR的第三修饰细胞群体。
187.实施方案186的方法，其中第三修饰细胞群与第二修饰细胞群之比为1：1、1：10、1：100、1：1000和1：104，以及该范围内的单个数字，最好不包括1.1和1：104。
188.实施方案186的方法，其中第三细胞群体与第二修饰细胞群体的比例为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：100或1：1000，以及该范围内的单个数字。
189.实施方案186的方法，其中第三修饰细胞群与第二修饰细胞群的比率小于1：1且大于1：1：10、1：17、1：20或1：100，以及该范围内的单个数字。
190.前述任何合适的实施方案的方法，其中所述细胞群还包含编码hTERT、SV40LT或其组合的核酸序列。
191.实施方案190的方法，其中所述细胞群是比没有所述核酸的T细胞更可增殖的T细胞。
192.实施方案191的方法，其中所述可增殖T细胞保留正常T细胞/CAR T细胞的功能，例如细胞治疗功能。
193.实施方案192的方法，其中该T细胞包含CAR，并且在该CAR的胞外域识别的试剂的存在下培养，从而产生修饰的CAR细胞。
194.在前述任何合适的实施方案中的方法，其中编码hTERT的核酸序列，编码SV40LT的核酸或其组合的整合包括编码hTERT的核酸序列，编码SV40LT的核酸或其组合的基因组整合其与hTERT，SV40LT或其组合的组成型表达。
195.根据前述任何合适的实施方案的方法，其中hTERT，SV40LT或其组合的表达由诱导型表达系统例如rtTA-TRE系统调节。
196.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰的T细胞包含编码自杀基因例如HSV-TK系统的核酸序列。
197.根据前述任一项合适的实施方案所述的方法，其中与生物相容性人类受体相比，所述细胞与原代人T细胞的GVHD应答相比具有降低的移植物抗宿主病(GVHD)应答。
198.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞具有降低的内源TRAC基因表达。
199.药物组合物，其包含通过实施方案138-73中任一项的方法产生的修饰的细胞群和另外的修饰的细胞群，其中所述修饰的细胞结合第一抗原，并且所述另外的修饰的细胞结合第二抗原，不同于第一抗原。
200.一种引发或增强T细胞应答，治疗有此需要的受试者或增强其癌症治疗的方法，该方法包括给予有效量的实施方案199的药物组合物。
201.一种组合物，其包含第一细胞群和第二细胞群，所述细胞群包含结合第一抗原的第一CAR，所述第二细胞包含结合第二抗原的第二CAR，其中所述第二抗原是肿瘤抗原并且不同于所述第一抗原。
202.实施方案201的组合物的用途或在需要其的受试者中增强细胞扩增或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
对受试者施用有效量的实施方案1的组合物，所述受试者具有表达肿瘤抗原的癌症形式。
203.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中受试者中第二细胞群的扩增大于被施用第二细胞群但不施用第二细胞群的受试者中第二细胞群的扩增。首先是细胞群体。
204.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中基于第二细胞群的数目或编码第二CAR的DNA的拷贝数来测量扩增。
205.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中所述细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。
206.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中第一抗原包括白细胞(WBC)的细胞表面分子，肿瘤抗原或实体瘤抗原。
207.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中所述WBC是粒细胞，单核细胞或淋巴细胞。
208.实施方案206的组合物或方法，其中所述WBC是B细胞。
209.实施方案206的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
210.实施方案206的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。
211.实施方案206的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19或BCMA。
212.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中所述肿瘤抗原是实体肿瘤抗原。
213.实施方案212的组合物或方法，其中所述实体肿瘤抗原是肿瘤相关的MUC1(tMUC1)、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2 IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。
214.实施方案212的组合物或方法，其中所述实体肿瘤抗原包含tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2、CLDN18.2、PSMA、DPEP3、CXCR5、B7-H3、MUC16、SIGLEC-15、CLDN6、Muc17、PRLR或FZD10。
215.实施方案212的组合物或方法，其中所述实体肿瘤抗原包含tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2或CLDN18.2。
216.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和CD3ζ结构域。
217.实施方案213的组合物或方法，其中所述共刺激结构域包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT，NKG2C、B7-H3、结合CD83的配体或其组合，和/或其中第一个CAR包含与scFv结合的CD19、4-1BB或CD28的胞内结构域第二个CAR包含一个与scFv结合的tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C或CLDN18.2，一个4-1BB或CD28的细胞内结构域以及一个CD3ζ结构域。
218.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中所述第一CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：5，并且所述第二CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：31。
219.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中第二细胞群包含编码第二CAR和PD-1的显性失活形式的慢病毒载体。
220.实施方案201或实施方案202的组合物或方法，其中所述第一细胞群体包含编码所述第一CAR和治疗剂的慢病毒载体。
221.实施方案220的组合物或方法，其中所述治疗剂包括细胞因子。
222.实施方案221的组合物或方法，其中所述细胞因子是IL6和/或INFγ。
223.实施方案221的组合物或方法，其中所述细胞因子是IL6、IL12、IL-15、IL-7、TNF-α或IFN-γ中的至少一种。
224.一种在患有癌症的受试者中增强免疫疗法的抗肿瘤功效的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含抗原结合分子和一种或多种增强包含该抗原的淋巴细胞的扩张的试剂的淋巴细胞群受试者中的结合分子。
225.实施方案224的方法，其中淋巴细胞是T细胞、DC、巨噬细胞和/或NK细胞。
226.实施方案224的方法，其中所述抗原结合分子是靶向任何前述合适实施方案中所述的与癌症相关的抗原的CAR或TCR。
227.实施方案224的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞，并且所述抗原结合分子是靶向实体瘤抗原的CAR。
228.实施方案224-227中任一项的方法，其中淋巴细胞的扩增是淋巴细胞的抗原依赖性扩增，使得一种或多种试剂通过抗原和抗原结合分子的结合使淋巴细胞扩增。
229.实施方案228的方法，其中一种或多种试剂包括表达抗原结合分子结合的抗原的细胞。
230.根据实施例229所述的方法，其中所述细胞是T细胞或APC。
231.实施方案228的方法，其中一种或多种试剂包含抗原结合分子结合的抗原的细胞外结构域。
232.实施方案224-227中任一项的方法，其中所述淋巴细胞的扩增是淋巴细胞的抗原非依赖性扩增，使得：所述一种或多种试剂不通过抗原和抗原结合分子的结合来扩增淋巴细胞，或所述一种或多种试剂既不通过抗原与抗原结合分子的结合也不通过MYD88和CD40下游的淋巴细胞基因的修饰来扩增淋巴细胞，和/或其中一种或多种包含靶向WBC抗原的CAR的试剂(例如，CD19)和/或淋巴细胞群包括任何前述合适实施方案的修饰细胞的第一群和修饰细胞的第二群。
233.实施方案232的方法，其中一种或多种试剂是双特异性或三特异性抗体。有关双特异性抗体的更多信息，请参见用于消化道癌症的新型GUCY2C-CD3 T细胞接合双特异性构建体(PF-07062119)(DOI：10.1158/1078-0432.CCR-19-3275)。此处通过参考，和/或其中抗体结合CD3zeta和WBC抗原(例如，CD19)。
234.实施方案232的方法，其中一种或多种试剂包含与淋巴细胞的扩增相关的转录因子或调节剂。
235.实施方案224-234中任一项的方法，其中所述一种或多种试剂是可分泌的或膜蛋白。
236.实施方案224-235中任一项的方法，其中所述淋巴细胞的扩增是基于所述淋巴细胞的基因组DNA中的抗原结合分子的拷贝数和/或所述受试者的血液中的淋巴细胞数来测量的。
237.实施方案224-236中任一项的方法，其中基于肿瘤尺寸的减小来测量受试者中免疫疗法的抗肿瘤功效。
238.实施方案237的方法，其中使用CT或PET CT扫描确定肿瘤的大小。
239.实施方案224-238的方法，其中与给予有效量的包含抗原结合分子但缺乏一种或多种抗原的淋巴细胞群的受试者相比，免疫疗法在受试者中的抗肿瘤功效增强。在“创新细胞疗法”的PCT专利申请号：PCT/CN2016/075061，PCT/CN2018/08891和PCT/US19/13068中提供了更多的试剂，以及相关的序列，在此引入作为参考。
240.一种组合物，其包含第一细胞群和第二细胞群，所述细胞群包含结合第一抗原的第一CAR，所述第二细胞包含结合第二抗原的第二CAR，其中所述第二抗原是肿瘤抗原，并且不同于所述第一抗原。
241.实例240的组合物的用途或在有需要的受试者中增强细胞扩增或治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
对受试者施用有效量的实例240的组合物，所述受试者具有表达肿瘤抗原的癌症形式。
242.根据实例240或实例241所述的组合物或方法，其中所述受试者中第二细胞群的扩增大于与所述第二细胞群一起施用但不与所述第二细胞群一起给药的受试者中第二细胞群的扩增。
243.根据实例240或实例241所述的组合物或方法，其中，基于第二细胞群的数目或编码第二CAR的DNA的拷贝数来测量扩增。
244.根据实例240或241所述的组合物或方法，其中：
细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突状细胞；
第一细胞群和第二细胞群是NK细胞；
第一细胞群是NK细胞，第二细胞群是T细胞，或第一组细胞是T细胞，第二组细胞是NK细胞；和或
第一细胞群数量不大于第二细胞群数量。
245.实例240-244的组合物或方法，其中所述第一抗原包括白细胞(WBC)的细胞表面分子，肿瘤抗原或实体瘤抗原。
246.实例245的组合物或方法，其中所述WBC是粒细胞，单核细胞或淋巴细胞。
247.实例246的组合物或方法，其中所述WBC是B细胞。
248.实例245的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
249.实例245的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。
250.实例245的组合物或方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19或BCMA。
251.实例240-244的组合物或方法，其中所述肿瘤抗原是实体肿瘤抗原。
252.实例251的组合物或方法，其中所述实体肿瘤抗原是肿瘤相关的MUC1、tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC 17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。
253.实例251的组合物或方法，其中所述实体瘤抗原包括tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2、CLDN18.2、PSMA、DPEP3、CXCR5、B7-H3、MUC16、SIGLEC-15、CLDN6、Muc17、PRLR或FZD10。
254.实例251的组合物或方法，其中所述实体瘤抗原包括tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2或CLDN18.2。
255.实例240或实例241的组合物或方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和CD3ζ结构域。
256.实例252的组合物或方法，其中所述共刺激结构域包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、结合CD83的配体或其组合。
257.实例240或实例241的组合物或方法，其中所述第一CAR包含scFv结合CD19、4-1BB或CD28的细胞内结构域和CD3ζ区域，并且所述第二CAR包含scFv结合tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、或CLDN18.2、4-1BB或CD28、和CD3ζ电域的胞内域。
258.实例240或实例241的组合物或方法，其中所述第一CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：5或6，并且所述第二CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：7-12和29-33的其中之一。
259.根据实例240或实例241所述的组合物或方法，其中所述第二细胞群体包含编码所述第二CAR和PD-1的显性阴性形式的慢病毒载体。
260.根据实例240或实例241所述的组合物或方法，其中所述第一细胞群体包含编码所述第一CAR和治疗剂的慢病毒载体。
261.根据实例260所述的组合物或方法，其中所述治疗剂包括细胞因子。
262.根据实例261所述的组合物或方法，其中所述细胞因子是IL6和/或INFγ。
263.根据实例261所述的组合物或方法，其中所述细胞因子是IL6、IL12、IL-15、IL-7、TNF-α或IFN-γ中的至少一种。
264.一种药物组合物，其包含修饰的NK细胞，所述修饰的NK细胞包含抗原结合分子，其中所述修饰的NK细胞中一种或多种蛋白质的表达和/或功能已经增加或增强，并且所述一种或多种蛋白质包括IL-6、IFNγ或其组合。
265.根据实例264所述的药物组合物，其中所述修饰的NK细胞响应于所述修饰的NK细胞的活化，缺氧或其组合而表达和分泌所述一种或多种蛋白质。
266.实例264的药物组合物，其中IL-6是人IL-6，并且IFNγ是人IFNγ。
267.根据实例264所述的药物组合物，其中所述修饰的NK细胞包含编码所述一种或多种蛋白质的外源多核苷酸。
268.根据实例267所述的药物组合物，其中所述外源多核苷酸以重组DNA构建体，mRNA或病毒载体的形式存在于所述修饰的NK细胞中。
269.根据实例267所述的药物组合物，其中所述外源多核苷酸包含表10中列出的对应于IL-6和IFNγ的多核苷酸。
270.根据实例267所述的药物组合物，其中所述外源多核苷酸包含启动子，所述启动子包含用于转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节所述修饰细胞中IL-6、IFNγ或其组合的表达和/或分泌。
271.根据实例270所述的药物组合物，其中所述转录调节剂包括Hif1a、NFAT、FOXP3或NFkB。
272.根据实例264所述的药物组合物，其中所述抗原结合分子和所述一种或多种蛋白以多蛋白形式产生，所述多蛋白被切割以产生分离的所述抗原结合分子和所述一种或多种蛋白，并且存在抗原结合分子和一种或多种蛋白质之间的可切割部分。
273.根据实例264所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含经改造以表达IL-12的修饰的NK细胞。
274.根据实例273所述的药物组合物，其中所述修饰的NK细胞响应于所述修饰的NK细胞的活化，缺氧或其组合而表达和分泌IL-12。
275.根据实例273所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含经工程改造以表达结合实体瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)的修饰的NK细胞。
276.根据实例264所述的药物组合物，其中所述抗原结合分子是CAR，其包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域。
277.根据实例276所述的药物组合物，其中所述CAR结合TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、脯氨酸、存活蛋白和端粒酶、PCTA-1/Galectin 8、MelanA /MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5或IGLL1。
278.根据实例276所述的药物组合物，其中所述细胞内结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、一种与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、N Kp46和NKG2D的共刺激分子的细胞内结构域。
279.根据实例276所述的药物组合物，其中所述CAR结合选自以下的B细胞抗原：CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138和CD13。
280.药物组合物，其包含结合实体瘤抗原的第一CAR NK细胞群和结合B细胞抗原的第二CAR NK细胞群，其中已经增强了第二CAR细胞群中一种或多种细胞因子的表达。以及包含IL-6，IL-12或IFNγ中至少一种的一种或多种细胞因子。
281.任何进行适当的实例的NK，其中所述NK包括编码结合WBC抗原的CAR的多核苷酸。
282.一种NK，其包含编码结合WBC抗原的CAR的多核苷酸和编码治疗剂的多核苷酸(例如细胞因子，例如IL-6、IL-12、IL-7、IFNγ、GCSF等)。
283.一种多特异性抗体，其包含结合NK细胞抗原/标志物(例如CD56、CD16和/或NKp46)的结合域和结合WBC抗原(例如CD19)或实体瘤抗原(例如GCC)的结合域。
284.如实例283所述的多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体还包含结合T细胞抗原/标志物(例如CD3)的结合域。
285.一种增强受试者中NK细胞扩增的方法，该方法包括：
对患有癌症形式的受试者给予有效量的NK细胞；
施用有效量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体结合白细胞(WBC)的细胞表面分子；和
允许NK细胞和表达CAR的细胞扩增，其中与施用包含不表达CAR的细胞的NK细胞的组合物的受试者相比，受试者中NK细胞的扩增得到增强。
286.实例285的方法，其中表达CAR的细胞是T细胞或NK细胞。
287.根据实例285所述的方法，其中所述白细胞为粒细胞，单核细胞或淋巴细胞。
288.实例285的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138或CD13。
289.实例285的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。
290.实例285的方法，其中所述WBC的细胞表面分子是CD19或BCMA。
291.根据实例285所述的方法，其中所述NK细胞包含结合实体瘤抗原的CAR。
292.根据实例291所述的方法，其中所述实体瘤抗原是肿瘤相关的MUC1、tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、CLDN18.2、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC2、IL13-间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、B7-H3或EGFR。
293.如实例所述的方法291，其中所述实体瘤抗原包含tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2、CLDN18.2、PSMA、DPEP3、CXCR5、B7-H3、MUC16、SIGLEC-15、CLDN6、MUC17、PRLR、MAGE-A4或FZD10。
294.根据实例291所述的方法，其中所述实体瘤抗原包含tMUC1、ACPP、TSHR、GUCY2C、UPK2、MAGE-A4或CLDN18.2。
295.根据实例285所述的方法，其中所述CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和CD3ζ结构域。
296.根据实例295所述的方法，其中所述共刺激结构域包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83结合的配体或其组合的细胞内结构域。
297.实例285的方法，其中所述CAR的结合结构域包含SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列。
298.根据实例285所述的方法，其中所述NK细胞或所述细胞包含编码治疗剂的多核苷酸。
299.根据实例298所述的方法，其中所述治疗剂包括细胞因子。
300.根据实例299所述的方法，其中所述细胞因子是IL6或INFγ，或其组合。
301.根据实例299所述的方法，其中所述细胞因子是IL6、IL12、IL-15、IL-7、TNF-α或IFN-γ中的至少一种。
302.根据实例285所述的方法，其中所述NK细胞或所述细胞包含编码PD-1的显性负型的多核苷酸。
303.修饰的细胞群体，包含至少两种细胞，其中所述第一细胞包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码第一CAR的核酸序列，所述第二细胞包含第二核酸序列，该第二核酸序列包括编码第二CAR的核酸序列，第一CAR包括SEQ ID NO：36、5或6，第二CAR包括SEQID NO：8、11、或29-41之一的序列，其中所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域，细胞内结构域，其中第二T细胞的数量不少于第一T细胞的数量，其中第一T细胞不包含第二核酸序列以及第二T细胞不包含第一核酸序列。
304.权利要求1所述的修饰细胞，其中所述第一细胞包含或是T细胞，第二细胞包含或是NK细胞。
305.权利要求1所述的修饰细胞，其中所述第一细胞包含或是NK细胞，第二细胞包含或是T细胞。
306.权利要求1所述的修饰细胞，其中所述两种细胞包含NK细胞和T细胞。
307.权利要求303-306所述任一的修饰细胞，其中所述第一细胞和/或第二细胞包含第三核酸序列，所述第三核酸序列包含(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列。
308.权利要求307所述的修饰细胞，其中所述第一细胞和/或第二细胞经工程化改造，当细胞被激活时表达和分泌IL-6和/或INF-γ。
309.权利要求307或308所述的任一修饰的细胞，其中所述第一细胞和/或第二细胞包含串联的(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列。
310.权利要求307所述的修饰细胞，其中所述第一细胞和/或第二细胞包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列。
311.权利要求303-309所述任一的修饰的细胞，其中所述细胞内结构域包含共刺激信号传导域，所述共刺激信号传导域包含共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其组合、所述抗原是tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、MUC21、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、PSCA或EGFR。
312.权利要求307-311所述任一的修饰的细胞，其中所述第三核酸序列包含启动子，所述启动子包含调节转录调节剂的表达和/或分泌的转录调节剂的结合位点。
313.权利要求312所述的修饰的细胞，其中转录调节剂是或包含Hif1a、NFAT、FOXP3或NFkB。
314.权利要求3127所述的修饰的细胞，其中启动子对转录调节剂有响应。
315.权利要求312所述的修饰的细胞，其中所述启动子与该核酸序列可连接，使得所述启动子驱动所述细胞中IL6和INFγ的表达和/或分泌。
316.权利要求312所述的修饰的细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NOs：23-26中的至少一种。
317.权利要求303-316所述任一的修饰的细胞，其包含编码SEQ ID NO：21、22和27的核酸序列，使得当细胞被激活时IL-6和INF-γ可以被表达和分泌。
318.权利要求317所述的修饰细胞，其中CAR，IL-6和INF-γ以多聚蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR、IL-6和INF-γ，并且在CAR、IL-6和INF-γ之间存在可切割的部分，可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。
319.权利要求303-318所述任一的修饰细胞，其中该修饰细胞的抑制肿瘤的功能和不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的细胞相比没有减弱，该修饰细胞不表达和/或分泌TGF-β。
320.权利要求303-319所述任一的修饰细胞，其中当修饰细胞和血液细胞接触时，第二细胞的扩增大于不含第一细胞的修饰细胞的第二细胞的扩增。
321.权利要求303-320所述任一的修饰细胞，其中修饰的细胞群体包括第三细胞包含第一核酸序列和第二核酸序列。
322.组合物在受试者中引起细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的用途，该方法包括向受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包含权利要求303-320的修饰细胞。
实例
CAR T细胞的制作和用途
从患者或捐献者中获得原代T细胞。用慢病毒载体转导所获得的原代T细胞以获得修饰的T细胞。进行流式细胞术并分析以确定CAR在原代T细胞中的表达(参见图6)。与细胞培养、慢病毒载体构建和流式细胞术相关的技术可在“Control of large,establishedtumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137 domains”,PNAS 2009年3月3日，第106卷第9期，3360-3365中找到，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。同时，生成了编码CAR的慢病毒载体参见“ChimericReceptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate EnhancedSurvival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy In Vivo,”MolecularTherapy,2009年8月,第17卷第8期,1453–1464，所述参考文件以引用的方式整体并入本文”。
分别用编码CAR的慢病毒载体转染T细胞。共培养两种类型的T细胞和不同的单个类型或多个类型的基底细胞(substrate cell)，并观察细胞因子的释放。基底细胞包括阳性肿瘤细胞或靶抗原的细胞比如MUC1阳性肿瘤细胞(MCF-7)、MUC1阴性肿瘤细胞(231)以及CD19阳性肿瘤细胞(RK19)等等。将E:T(效应细胞:靶细胞)比率为例如1:1/3:1/10:1/30:1(即，CAR T细胞:靶肿瘤细胞)的CAR T细胞与靶肿瘤细胞共培养一段时间。随后，收集上清液，并测量细胞因子的释放。当共培养CAR T细胞和基底细胞时，观察到各种水平的细胞因子释放。与细胞培养、细胞毒性T淋巴细胞测定构建相关的技术可在“Control of large,established tumor xenografts with genetically retargeted human T cellscontaining CD28 and CD137 domains”,PNAS 2009年3月3日，第106卷第9期，3360-3365中找到，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
表达嵌合受体的细胞在复发/难治性急性淋巴细胞白血病患者中建立抗肿瘤作用
该临床试验设计用于评估改良用于表达CD19特异性CAR/4-1BB/CD3-ζ或CD19特异性CAR/4-1BB/CD3-ζ的自体T细胞的安全性和有效性。注入标准如下：1)年龄小于60岁；2)复发或难治CD19+ALL；3)复发性同种异体HSCT无移植物抗宿主病(GVHD)证据，无需免疫抑制治疗；和4)可测量的疾病和足够表现状态和器官功能。该方案由机构评估委员会医学院第一附属医院批准。所有患者均提供书面知情同意书。
CD19特异性的单链片段变量(scFv)序列衍生自Clone FMC63(参见Zola H.等人，Immunol Cell Biol 1991；69：411-22)。产生4-1BB共刺激结构域，CD3-ζ信号转导域和铰链和跨膜结构域。将携带抗CD19 scFv(SEQ ID：6)和人4-1BB和CD3-ζ信号转导域的CART19-4-1BB载体如前所述克隆入慢病毒骨架(参见Hu Y.Journal of Hematology&Oncology 2016；9：70)。抗CD19 scFv和人4-1BB和CD3-ζ信号转导域的PD-1/CART19-4-1BB载体克隆入慢病毒主链。
用CART19-4-1BB载体和病毒包装质粒转染293T细胞产生慢病毒，其在-80℃下冷冻并在转导前立即解冻。收获慢病毒上清液。如所述(参见Kalos M.等人，Sci Transl Med2011；3：95ra73)，分离和激活CD3+T细胞。然后将细胞在含有100U/mL白细胞介素-2(IL-2)的X-VIVO 15培养基(Lonza)中培养，并在24小时内以5:1至10:1的高感染复数(MOI)用慢病毒上清液转导-48小时。获得CAR转导的T细胞(CD19-CART细胞，之后为“CART19”)，培养11天。给药前3天，取代新鲜培养基。之后，不进行对细胞的操作，直到运输输液。通过流式细胞术(FACS)在慢病毒转导后第5-7天评估转导效率。使用以下抗人抗体：抗hCD45 APC(BDBioscience)，抗hCD3 FITC(BD Bioscience)，特异于F(ab')2片段的生物素标记的山羊抗小鼠IgG(Jackson免疫研究，Cat#115-065-072)和PE抗生蛋白链菌素(BD Bioscience)。使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)进行数据采集。在CART19s输注之前，对每个患者进行CART19s的转导效率和体外细胞毒性测定的FACS分析。另外，CART19培养物被检查两次可能的真菌，细菌，支原体，衣原体和内毒素的污染。
在第8天，为CART19s制备，外周血单核细胞(PBMC)用白细胞分离术从患者获得。第一天CART19s输注设定为第0天。给患者进行淋巴细胞清除的调理治疗。基于氟达拉滨和环磷酰胺的调理治疗根据骨髓(BM)和外周血(PB)中的肿瘤负荷而变化。CART19s在连续3天的时间内以不断增加的剂量，直接输入患者无需任何术前用药法。每天将CART19s运送到医院，洗涤，计数，检查活力，然后准备给予患者，然后密切观察至少2小时。CRS根据修订的分级系统分级(参见Lee DW等人，Blood 2014；124：188-95)。治疗期间和之后的其他毒性根据美国国家卫生研究院不良事件版本4.0常用术语标准(http://ctep.cancer.gov/)进行评估。通过流式细胞术和形态学分析评估治疗反应。如果可能，通过嵌合基因表达水平评估患者。响应类型定义为补充材料中描述的最小残留病(MRD)阴性，完全应答，完全反应，不完全计数恢复，疾病稳定和进行性疾病。
将CART19s输注后的系列BM和PB样品收集在K2EDTA BD真空管(BD)中。通过FACS确定来自新鲜PB和BM患者的CART19s的持续性。基于测量的绝对CD3+T淋巴细胞计数计算每μl循环CART19数。同时，CAR DNA拷贝被评估为确定CART19s扩增和持久性的另一种方法。使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)从冷冻保存的PB和BM中提取基因组DNA。通过定量实时PCR评估CAR DNA拷贝。
根据制造商的说明书，以多重格式测定血清和CSF中细胞因子IFN-γ，TNF-α，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17等的水平。使用Mann-Whitney U检验比较2组的可能影响3级或4级CRS发展变化的连续变量和危险因素。Fisher精确检验用于评估两组间分类变量对3级CRS的影响。使用基于秩的Spearman检验计算相关性。总体生存(OS)和无白血病生存(LFS)概率通过Kaplan-Meier方法使用所有入组患者来确定OS和具有MRD阴性反应的LFS。所有引用的P值均为双侧，P值小于0.05被认为具有统计学意义。
CD19+-RFP和RFP经慢病毒转导入K562，分别产生CD19-RFP-K562细胞和K562-RFP细胞。通过与靶细胞，CD19-RFP-K562细胞或K562-RFP细胞共同培养，以不同比例的效应细胞与靶细胞(E：T)在输注前测量CART19s的细胞毒活性。将靶细胞以每孔104个细胞接种在补充有10％FBS(Gibco)的50μLRPMI 1640培养基中的96孔微孔板(Nunc)中。除去CD3/CD28珠，并以指定的E：T比将效应T细胞与孔中的靶细胞混合。总体积为每孔200μL。孵育24小时后，用多通道移液器将细胞在96孔微孔板中上下移液，以将细胞分离成单细胞悬浮液。拍摄每个孔中存活的RFP靶细胞，计数存活的RFP靶细胞数，并与没有效应细胞的孔进行比较。细胞死亡率计算为(对照样品)/对照×100％。还使用人IFN-γValukine ELISA试剂盒(R&D系统)收集和定量上清液。
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)从冷冻保存的外周血和骨髓中提取基因组DNA。在7500个实时PCR系统(Applied Biosystems)中，使用具有AmpErase UNG(Applied Biosystems)的ABI 2×TaqMan Universal Master Mix一式三份进行定量实时PCR。从含有102-108拷贝/μL的纯化CAR质粒的10倍连续稀释度的标准曲线计算每微克基因组DNA的拷贝数。内部对照基因的扩增用于DNA量的标准化，如前所述(参见等人，Blood 2012；120：2032-41和O'Brien S.等人，J Clin Oncol 2013；31：676-83)。
通过流式细胞术和形态学来评估治疗反应。如果可能，在患者中评估嵌合基因表达水平。反应类型定义为MRD阴性，完全反应，完全反应包括不完全计数恢复，疾病稳定，和进行性疾病，如前所述。通过流式细胞术将MRD阴性定义为小于0.01％的骨髓母细胞。完全反应定义为少于5％的骨髓母细胞，无循环爆发，无绝经嗜中性粒细胞计数为1000/μL或更多，血小板100,000μL/μL以上的疾病的髓外部位。不完全计数恢复的完全反应被定义为具有血细胞减少的完全反应。稳定性疾病被定义为不符合完全反应，完全反应不完全计数恢复或进行性疾病的标准的疾病。进行性疾病被定义为M状态较差或M状态无变化，绝对外周血细胞计数增加超过50％。CART19治疗后，每周随访患者，每4周进行一次骨髓检查，包括形态学，MRD状态，嵌合基因表达和CART细胞计数。
将样品收集在凝胶管中并在4℃下储存，直到同一天晚些时候离心。然后将所有血液和CSF样品以5000rpm离心6分钟。转移上清液用于随后的分析。BD Cytometric BeadArray Human Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD Biosciences)，FCAP Array v3.0软件(BDBiosciences)和BD FACS CANTO II(BD Biosciences)用于测量和分析细胞因子例如IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17A，IFN-γ和TNF-α等等。
将红细胞裂解的全部BM样品用于骨髓抽吸当天的免疫分型。使用单克隆抗体(mAb)与异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE)，别藻蓝蛋白(APC)的四色组合，通过流式细胞术(FACSCalibur flow cytometer，BD Biosciences，San Jose，CA)系统地分析胚细胞的抗原表达)和藻红蛋白-花青素7(PE-Cy7)。Cell-Quest 软件(Becton DickinsonBiosciences)用于数据分析。单克隆抗体购自以下制造商：BD Biosciences，CD10-APC，CD19-FITC，CD22-PE，CD34-PE，CD45-PE-Cy7，cyCD79a-PE，表面免疫球蛋白(sIg)M-PE，细胞质免疫球蛋白cIg)M-APC；Beckman Coulter，CD20-APC，sIg-Lamda-FITC，sIg-Kappa-APC。
对于MRD的调查，mAb的组合是基于单独诊断的白血病母细胞的异常表型，至少获得了50万个结果。MRD结果表示为有核细胞中具有异常表型的细胞的百分比。在所有样品分析中均达到0.01％的敏感性。每天通过分析CalibriteTM珠和标准血液样品(来自BDBiosciences的BDTM多重检查控制或Streck，Inc.的CD-chexTMPlus)来校准仪器设置以进行质量控制。
偶联/混合T细胞的活化
图1A-1C显示了CD19 CAR和GUCY2C CAR在相应的T细胞中的构建和表达。图1中的免疫化学染色。图1A显示GUCY2C在正常胃粘膜和食道上皮中不表达，但是在结直肠癌组织中表达(正常食管鳞状上皮(i)；胃粘膜(ii)未显示膜染色；(iii)小肠显示根尖膜染色绒毛和隐窝细胞；以及(iv)大肠癌组织中的细胞膜染色(免疫组织化学，x150)，在大肠癌肿瘤中高表达)。图1B显示了编码GUCY2C CAR和编码CD19 CAR的载体构建体。图1C显示CD19 CAR表达的比例为59.65％，GUCY2C CAR表达的比例为55.23％。
图2显示了GUCY2C CAR T细胞在各种培养系统中的扩增(CD19 CAR+T细胞的比率：B细胞为2：1/1：1/2：1)。具有B细胞的组的扩增显着高于不含B细胞的组。有关CD4/CD8T细胞总数的统计数据证实，CD19 CAR T细胞可以显着促进GUCY2C CAR T细胞的扩增，并且随着CD19 CAR比例的增加，这种扩增的效果更强。当E：T的比例为2：1时，PAP-CAR在和B组中的扩增约为对照组的4倍。CD8 T细胞的扩增效果略高，在CD4/CD8 T细胞中结果一致。与Cell Trace(Far Red)和Gate GUCY2C CAR+CD4+/CD8+共同培养96小时。SingleCAR是指GUCY2C CAR T细胞；是指GUCY2C CAR+CD19CAR混合T细胞；“单独”是指在共培养系统中未添加底物的细胞作为阴性对照。Cell Trace(远红)用于标记在不同系统中培养的GUCY2C CAR T细胞。96小时后，测定GUCY2C CAR T细胞的扩增。纵轴是处于扩增中的CD4/CD8阳性GUCY2C CAR T细胞的绝对数量。
图3显示了关于GUCY2C CAR和CD19 CAR的共培养细胞的细胞因子释放分析。CD19CAR T细胞在B细胞存在下介导各种细胞因子的释放，并且CD19 CAR的比例越高，释放的细胞因子越多，这表明CD19 CAR促进了GUCY2C CAR T细胞的扩增。将细胞共培养48小时，并收集细胞上清液以确定细胞因子。
图4A-4C显示了CD19-CAR和PAP-CAR在相应的T细胞中的构建体和表达。图4A显示了肾脏，肝脏，前列腺和前列腺癌切片的PAP表达。免疫化学染色显示PAP在正常前列腺组织中表达，而在前列腺癌组织中高度表达。图4B显示了编码PAP-CAR的载体和编码CD19-CAR的载体的构建体。图4C显示了CD19-CAR和PAP-CAR的CAR表达。CAR表达显示CD19-CAR表达的比例为71.50％，PAP-CAR表达的比例为41.71％。
图5显示了在各种培养系统中PAP-CAR T细胞的扩增。使用Cell Trace和门PAP-CAR+CD4+/CD8+将相应的细胞共培养96小时。SingleCAR是指PAP-CART+NT组；是指PAP-CAR+CD19-CAR组；“单独”是指在共培养系统中未添加底物的细胞作为阴性对照。实验组包括具有不同CD19-CAR比的B细胞。用CFSE标记PAP-CAR T细胞，并置于不同的系统中进行培养。96小时后，确定PAP-CAR T细胞的扩增。纵轴是扩增后CD4/CD8阳性PAP-CAR T细胞的绝对数目。CD19 CAR+：B 细胞的比例为2：1/1/1：1/2：1。具有B细胞的偶联CAR组的扩增显着高于没有B细胞的组。有关CD4/CD8 T细胞总数的统计数据显示，CD19-CAR T细胞可以显着促进PAP-CAR T细胞的扩增，并且随着CD19-CAR比例的增加，扩展效果更强。当E：T＝2：1时，CAR和B偶联组中PAP-CAR的扩增约为对照组的5倍，并且在CD4/CD8 T细胞中结果一致。
图6显示了针对PAP-CAR和CD19-CAR的共培养细胞的细胞因子释放分析。将对应的细胞共培养48小时，并收集细胞上清液以确定细胞因子。CD19 CAR T细胞在B细胞的存在下介导各种细胞因子的释放，并且CD19 CAR的比例越高，释放的细胞因子越多，这表明CD19CAR促进了PAP-CAR T细胞的扩增。
将混合的CAR T细胞(偶联的CAR T细胞)分为与激活相关的三组：CD19 CAR和tMUC1 CAR(第1组)，抗CD19 CAR和ACPP CAR(第2组)以及CD19和CLDN18.2 CAR(第3组)。收集健康志愿者的外周血。使用Pan T试剂盒对CD3+T细胞进行分选，并以1：1的比例添加CD3/CD28 Dynabeads。然后用慢病毒转染CD3+T细胞。去除慢病毒和Dynabeads，并添加新鲜培养基。测定CAR比和细胞表型。测量了这三组细胞中CAR的表达。选择CD19 CAR T细胞，tMUC1CAR T细胞和靶细胞并混合24小时或48小时。测量各种标记在相应细胞中的表达。将20×104个CAR T细胞和20×104个底物细胞共培养24小时。通过流式细胞术测量诸如hCAR(人源化scFv)，mCAR(鼠源scFv)，CD25和CD137等分子在T细胞中的表达。例如，CD25和CD137阳性染色表明T细胞被激活。测量响应抗原激活而从各种T细胞释放的细胞因子的量，并减去相应T细胞的背景。
表11、12和13分别提供了第1、2、3组的CAR T细胞和相应底物细胞的信息。例如，CAR 1204是人类衍生的CAR，可以用人类CAR抗体和CD137抗体标记。CAR 2407(tMUC1 CAR)是一种鼠类CAR，可以用鼠类CAR抗体和CD137抗体标记激活。表达CAR 1204的细胞(CD19CAR T细胞)可以被表达CD19的K562细胞激活，从而导致CD137表达上调。共培养表达CD19的CAR 1204细胞，CAR 2407细胞和K562细胞，以诱导CD19 CAR T细胞活化。CD19CAR和tMUC1CAR的结合结构域分别包括SEQ ID NO：5和31。根据CD137的表达检测并测量了2407个CAR T细胞的激活，这证明了CD19 CAR T细胞的间接激活。
表11：第1组中使用的CAR T细胞和底物细胞
图7显示在存在或不存在K19细胞的情况下与tMUC1 CAR T细胞共培养的CD19 CART细胞的流式细胞术分析结果。
在第0天收集健康志愿者的外周血。使用Pan T试剂盒对CD3+T细胞进行分选，并将CD3/CD28 Dynabeads以1：1的比例添加到所收集的CD3+T细胞中。在第1天，活化的CD3+T细胞被分为两个亚组，每个亚组都用编码单个CAR(CD19 CAR或tMUC1 CAR)的慢病毒转染。因此，获得了CAR T细胞的两个亚组：表达CD19 CAR的CAR T细胞的一个亚组和表达tMUC1 CAR的CAR T细胞的另一个亚组。CD19CAR和tMUC1CAR的结合结构域分别包括SEQ ID NO：5和31。在第2天，去除了慢病毒和Dynabeads，并添加了新鲜培养基。在第7天，将CAR T细胞和靶细胞共培养24小时，并在第8天进行各种测定。可以将细胞亚组与相应的底物细胞混合并共培养(参见图7-31)。
图7提供显示在各种细胞培养物中CD137表达的直方在每种细胞培养物中，将CART细胞与相应的底物细胞一起培养，并使用流式细胞仪(Gate mCAR+：tMUC1CAR)测量CD137的表达。细胞培养物包括(1)tMUC1CAR T细胞和K19，(2)tMUC1CAR T细胞，K19和PBMC，(3)tMUC1CAR T细胞，CD19CAR T细胞和K19，(4)tMUC1CAR CAR T细胞，CD19 CAR T细胞，K19和PBMC。还计数了CD8+T细胞。在图7中，在K19存在下观察到tMUC1CAR T细胞的活化(即CD137的表达)，并且MUC1 CAR T细胞的活化水平高于单个组。此外，在添加PBMC(例如，CD137的MFI)之后，活化水平更高。这些结果表明，在不存在tMUC1 CAR结合的抗原(tMUC1)的情况下，K19对CD19 CAR T细胞的激活会激活tMUC1CAR T细胞，而PBMC的存在会增强这种激活。实验结果基于表达比作为测量差异的主要依据(左)。当比例差异不明显时，将表达强度(MFI)用作差异的度量(右)。
图8显示了图7中描述的细胞培养物中PBMC和单核细胞的活化.在PBMC中进行了单核细胞(CD14+)和活化的单核细胞(CD14+CD80+)的流式细胞术测定，并且图8示出了测定的统计分析的直方h19CAR是人源化的CD19CAR，细胞培养包括(1)单独的PBMC，(2)PBMC+K19，(3)PBMC和CD19CAR T细胞，(4)PBMC，K19和CD19CAR T细胞。如图1所示。在图37中，最后一组PBMC显示活化(CD80表达)。这些结果表明，CAR T细胞的活化能够活化包括单核细胞在内的PBMC。图2和3所示结果的组合。图7和8表明在缺乏tMUC1 CAR结合的抗原的情况下，由K19激活的CD19 CAR T细胞激活tMUC1CAR T细胞，并且该激活可以至少部分地通过PBMC介导。
图9提供显示tMUC1 CAR T细胞和CD19 CAR T细胞释放IFNγ的直方在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。该图是对流图的统计分析。在这些测定中，将NT(未转染的T细胞)用作对照。与对照相比，包括CD19 CAR T细胞和tMUC1 CAR T细胞的细胞培养物显示CD19 CAR T和MUC1 CAR T细胞中细胞内IFNγ的增加，表明被K19激活的CD19CAR T细胞释放IFNγ，而激活的tMUC1CAR T细胞释放。干扰素γ。PBMC组上调了CD19CAR T细胞和tMUC1CAR T细胞释放的IFNγ的比例。偶联CAR组中累积的IFNγ高于表达单个CAR(CD19 CAR或tMUC1 CAR)的细胞中的IFNγ，PBMC的添加上调了这种作用。mCAR组并非全部为CD19 CAR阳性细胞，其统计值是相对的。结果表明，在没有tMUC1 CAR结合的抗原(tMUC1)的情况下，CD19 CAR T细胞的激活诱导tMUC1 CAR T细胞表达更多的IFNγ，从而释放IFNγ。
图10提供显示tMUC1 CAR T细胞和CD19 CAR T细胞释放GZMB的直方在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。流式细胞术测定显示活化的CD19 CAR T细胞和MUC1 CAR T细胞释放GZMB。对流图的统计分析(比例比较MFI)表明CD19 CAR T细胞的激活可以引起MUC1 CAR T细胞释放GZMB，并且在PBMC存在下这种释放得到增强。mCAR组并非全部为CD19 CAR阳性细胞，其统计值是相对的。这些结果表明，CD19 CAR T细胞的活化诱导MUC1 CAR T细胞释放细胞内GZMB。
图11和12显示了在各种实施方案中MUC1 CAR T细胞的增殖。进行CFSE反应，并用于指示细胞增殖水平。在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。在图11中，第一行是与两个底物细胞共培养的偶联CAR T细胞的实验组，第二行是与两个底物细胞共培养的MUC1 CAR T细胞的对照组。如第一行和第二行的第三和第四列所示，用K19激活CD19CAR T细胞可诱导MUC1 CAR T细胞增殖。第五和第六列显示MCF-7激活并诱导MUC1CAR T细胞的增殖。图12示出了来自图11所示的流式细胞术的计数结果。进行体积校准，对tMUC1CAR细胞群进行门控，并对tMUC1 CAR各组的细胞数进行统计分析。图12中，包括CD19 CAR T细胞和tMUC1CAR T细胞的组中的细胞数高于对照组，并且在PBMC存在下包括CD19 CAR T细胞和tMUC1 CAR T细胞的组的增殖为：最高。结果表明，CD19 CAR T细胞的激活可以增强MUC1 CAR T细胞的增殖，可以通过PBMC增强CART的治疗。
图13显示了各种实施方案中的增殖CD19 CART细胞。进行CFSE反应，并用于指示细胞增殖水平。在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞仪分析。在存在或不存在PBMC的情况下，包含CD19 CAR T细胞，tMUC1 CAR T细胞，MCF-7的细胞组均显示CD19 CAR T的增殖细胞。这些结果表明，tMUC1 CAR T细胞的激活可以增强CD19 CAR T细胞的增殖，这可以通过PBMC增强和/或治疗。图11-13表示CD19 CAR T细胞和tMUC1 CAR T细胞的混合物可以通过PBMC形成正循环，因此CD19 CAR T细胞或tMUC1 CAR T细胞的激活可以进一步相互激活，从而增强CD19 CAR T的增殖细胞和tMUC1 CAR T细胞和/或CD19 CAR T细胞和tMUC1CAR T细胞释放的细胞因子可能由PBMC介导和/或增强。这些结果也可以解释以下原因：与包含单种类型的CAR T的细胞群相比，注入包含偶联CAR T细胞的细胞群(例如，患者001-003)的受试者中，tMUC1 CAR T细胞的扩增更强。偶联的CAR T细胞(例如CD19 CAR T细胞和tMUC1 CAR T细胞)可以促进这种细胞扩增。
图14显示了实施方案中的细胞因子释放。在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。对照组的IFN-γ释放受到限制。用实线和虚线分别标记了偶联的CAR组和单个CAR组。在没有PBMC的情况下释放的IFN-γ水平相似。当添加PBMC时，释放的IFN-γ水平增加。IL6主要由PBMC分泌，并且激活系统中的释放量增加。在此，释放的tMUC1CAR细胞因子的量相对较低。
表12：第2组中使用的CAR T细胞和底物细胞
图15显示了在各种细胞培养物中CD137表达的其他直方在第0天收集健康志愿者的外周血。使用Pan T试剂盒对CD3+T细胞进行分类和收集，并将CD3/CD28 Dynabeads以1：1的比例添加到所收集的CD3+T细胞中。第1天，分别用编码CD19 CAR和ACPP CAR的慢病毒转染CD3+T细胞。CD19 CAR和ACPP CAR的结合结构域分别包括SEQ ID NO：5和489。在第2天，去除了慢病毒和Dynabeads，并添加了新鲜培养基。在第7天，将CAR T细胞和靶细胞共培养24小时，并在第8天进行各种测定。进行流式细胞术测定，结果显示CD19 CAR和ACPP CAR T细胞的表达。如图1所示。如图15所示，ACPP CAR T细胞的活化较高，并且在PBMC存在下活化增加。这些结果表明，nalm6激活CD19 CAR T细胞可以激活ACPP CAR T细胞，而PBMC可以增强这种作用。
图16显示了活化分析的流式细胞术测定。CD45RO和CD62L可用于将CART细胞分为四个状态。Nalm6激活CD19 CAR T细胞上CD45RO和CD62L的表达，并且效应细胞在ACPP CART细胞中的比例增加。这些结果表明，CD19 CAR T细胞的激活诱导ACPP CAR T细胞达到功能状态，其充当ACPP CAR T细胞的预激活。
图17显示了在图16中描述的细胞培养物中PBMC和单核细胞的活化。流式细胞仪检测显示PBMC中有单核细胞(CD14+)和活化的单核细胞(CD14+&CD80+)。h19CAR是人源化的CD19CAR，其组包括(1)单独的PBMC，(2)PBMC和K19，(3)PBMC和CD19CAR T细胞，(4)PBMC和K19和CD19CAR T细胞。这些结果表明激活CAR T细胞能够激活PBMC。
图18显示CD19 CAR T细胞的活化诱导ACPP CAR T细胞释放细胞内IFNγ。与上述类似，在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术分析。当两个CAR T细胞均存在且系统中存在PBMC时，ACPP CAR T细胞也显示出增强的IFNγ释放。
图19和20显示了在细胞培养物中将细胞共培养24小时后细胞因子的释放。对照组中释放的TNF-α、IFN-γ、GZMB数量有限。偶联的CAR组(CD19 CAR T细胞和ACPP CAR T细胞)和单个CAR组(CD19 CAR T细胞或ACPP CAR T细胞)分别用实线和虚线标记。在没有PBMC的情况下，释放的TNF-α、IFN-γ、GZMB水平相似。当添加PBMC时，释放的TNF-α、IFN-γ、GZMB的量增加。IL6主要由PBMC分泌，在PBMC存在的情况下，偶联CAR组的细胞因子释放量增加。
表13：第3组中使用的CAR T细胞和底物细胞
图21提供显示在各种细胞培养物中CD137表达的另外的直方在第0天收集健康志愿者的外周血。使用Pan T试剂盒对CD3+T细胞进行分类，并以1：1的比例添加CD3/CD28Dynabeads。在第1天，分别用编码CD19 CAR和CLDN 18.2CAR的慢病毒转染CD3+T细胞。CD19CAR和CLDN 18.2CAR的结合结构域分别包括SEQ ID NO：5和437。在第2天，去除了慢病毒和Dynabeads，并添加了新鲜培养基。在第7天，将CAR T细胞和靶细胞共培养24或48小时，并在第8天进行各种测定。如图21所示，CLDN18.2 CAR T细胞的活化较高，并且在PBMC存在下活化增强。这些结果表明，K19激活CD19 CAR T细胞可以间接激活CLDN18.2 CAR T细胞，而PBMC可以增强这种作用。
图22显示了与KATO3+细胞共培养48小时的各种CAR T细胞的流式细胞术分析结果。从直方图可以看出CAR)在KATO3+细胞存在的情况下，偶联的CAR T组(CD19 CAR T细胞和CLDN 18.2CAR)中CD19 CAR T细胞的活化水平高于单个CAR T组(CD19 CAR T细胞或CLDN18.2)的活化水平。在PBMC存在下被激活后，CD19 CAR T细胞的激活水平更高(例如，CD25与CD137的比例)，表明CD19 CAR T细胞可以被KATO3+激活CLDN18.2 CAR T细胞激活。细胞，由PBMC增强。CD40L主要由CD4 T细胞表达(与PBMC中的CD40L+细胞相互作用，例如B细胞，活化的单核细胞，DC)。结果表明，KATO3+细胞激活CLDN18.2 CAR T细胞可以上调CD19 CAR T细胞CD40L的表达，从而激活B细胞和单核细胞。PBMC增强了这种效果。
图23示出了在图21中描述的系统中PBMC和单核细胞的激活。50.h19CAR是一种人源化的CD19 CAR，其组包括(1)单独的PBMC，(2)PBMC和K19，(3)PBMC和CD19 CAR T细胞，(4)PBMC，K19和CD19 CAR T细胞。在图23中，PBMC的最后一列显示了激活，表明CAR T细胞的激活能够激活PBMC。
图24和25显示CLDN18.2 CAR T细胞的活化诱导CD19 CAR T细胞释放细胞内IFNγ。在偶联的CAR T细胞组(CD19 CAR T细胞和CLDN 18.2CAR)中释放的IFNγ的量大于单一类型的CAR T细胞组(CD19 CAR T细胞或CLDN 18.2CAR)，和PBMC的添加可以上调这种效果。
图26显示了各种细胞培养物的杀伤测定。两个底物细胞的起始量为2.0×105/600ul或3.33×105/ml。图26显示了杀死三天后底物细胞的细胞密度。PBMC有助于杀死底物细胞，而偶联的CAR T细胞组(CD19 CAR T细胞和CLDN 18.2CAR)增强了单独的CD19 CAR T细胞或单独的CLDN18.2 CAR T细胞的杀伤作用。在PBMC存在下，偶联的CAR T细胞具有更好的杀伤作用，表明活化的CAR T细胞可以活化PBMC并进一步活化偶联的CAR T细胞组中另一种类型的CAR T细胞以释放细胞因子并增强疗效。偶联CAR T系统中的一种CAR T细胞被激活。
图27显示CLDN18.2 CAR T细胞的增殖。在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。此外，测量CFSE反应以评估增殖水平。在图27中，第一行是包含与两个底物细胞共培养的偶联CAR的实验组，第二行是包含与两个底物细胞共培养的CLDN18.2CAR的对照组。图27显示了用K19激活CD19 CAR T细胞可以诱导CLDN18.2CAR T细胞的增殖。KATO3细胞可以被CLDN18.2 CAR T细胞有效激活，然后被增殖。PBMC的存在可以进一步增强增殖。结果表明，在偶联的CAR组中，CD19 CAR被K19有效地激活，而激活的CD19 CART可以激活CLDN18.2 CAR T细胞以促进CLDN18.2细胞的增殖，PBMC可以进一步增强其增殖。
图28显示了CD19 CAR T细胞的增殖。在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。此外，测量CFSE反应以评估增殖水平。此外，测量CFSE反应以评估增殖水平。在图28中，第一行是实验组，其包括与两个底物细胞共培养的成对CAR T细胞，第二行是与两个底物细胞一起共培养的对照组CD19 CAR T细胞。图28显示了用KATO3+细胞激活CLDN18.2CAR T细胞可以诱导CD19 CAR T细胞的增殖。第五和第六列显示PBMC可以进一步增强CD19CAR T细胞的增殖。结果表明，偶联的CAR组中的KATO3+细胞激活了CLDN18.2 CAR T细胞，激活的CLDN18.2 CAR T细胞可以激活CD19 CAR T细胞，从而促进CD19 CAR T细胞的增殖，并可以进一步增强CD19 CAR T细胞的增殖。PBMC。
图29-31显示了在各种细胞培养物中的细胞因子释放。在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。如图所示，在对照组中释放了有限量的IL12，IFNγ和GZMB。偶联的CAR T细胞组和单个CAR T细胞组分别用实线和虚线标记。在没有PBMC的情况下，IL12，IFNγ和GZMB的释放量相似。当添加PBMC时，释放的IL12，IFNγ和GZMB的量增加。
表20：第4组中使用的CAR T细胞和底物细胞
图37显示了在各种细胞培养物中CD137表达的其他直方在第0天收集健康志愿者的外周血。使用Pan T试剂盒对CD3+T细胞进行分类和收集，并将CD3/CD28 Dynabeads以1：1的比例添加到所收集的CD3+T细胞中。在第1天，分别用编码BCMA CAR和GUCY2C CAR的慢病毒转染CD3+T细胞。CD19 CAR和ACPP CAR的结合结构域分别包括SEQ ID NO：60和488。在第2天，去除了慢病毒和Dynabeads，并添加了新鲜培养基。在第7天，将CAR T细胞和靶细胞(例如8226)共培养24小时，并在第8天进行各种测定。进行流式细胞术测定，结果显示CD19 CAR和ACPP CAR T细胞的表达。在图37中，GUCY2C CAR T细胞的活化更高，并且在PBMC存在下活化增加。这些结果表明，由8226激活的BCMA CAR T细胞可以激活GUCY2C CAR T细胞，并且PBMC增强了这种作用。由于PBMC包括B细胞和浆细胞，包括BCMA，所以PBMC可以激活BCMACAR T细胞。GUCY2C CAR T细胞增强了PMBC对BCMA CAR T细胞的激活。
图38显示了GUCY2C CAR T细胞的增殖。在第7天培养各种细胞，并在第8天进行流式细胞术测定。此外，测量CFSE反应以评估增殖水平。PMBC包括B细胞和浆细胞，其中包括BCMA。如图38所示，用PMBC激活BCMA CAR T细胞可以诱导GUCY2C CAR T细胞增殖。
图39显示了在细胞培养物中将细胞共培养24小时后细胞因子的释放。对照组中释放的IL-6，IFN-γ，GZMB数量有限。在没有PBMC的情况下，IL-6和GZMB的释放水平相似。当添加PBMC时，IL-6和GZMB的释放量增加。在PBMC存在下，偶联CAR组的细胞因子释放量增加。
将NY-ESO-1转导的T细胞(NYESO-1TCRTS或8302)和AFP转导的T细胞(AFP TCRTS或DW105)分别与CD19 CAR T细胞(1234)混合，并与各种相应的靶细胞共培养(例如，K19：K562-CD19)。图78示出了使用流式细胞术确定表型和目的基因的表达。混合细胞共培养7天后，使用流式细胞仪检测细胞的表型和目的基因的表达。例如，描绘出大致范围的活细胞(A)，去除粘附细胞(B)，进行DAPI染色描绘活细胞群(C)，以及CD3阳性细胞群(即T细胞))划出(D)。流式细胞仪用于确定细胞表型和CAR表达。对于NT(不表达CAR的T细胞)和CD19 CART组，NYESO-1TCRTS和AFP TCRTS的CD8百分比分别为70.32％，56.44％，73.85％和72.74％。CD19 CAR表达为63.71％，NYESO-1TCR的表达为88.80％，AFP TCR的表达为71.61％。细胞表达表型正常。CD137的表达低；细胞已经处于静止状态，可用于后续实验。
图32显示了使用流式细胞术鉴定共培养的细胞。为了区分共培养后的两种T细胞，将CD19 CAR细胞用VIOLET染色，用紫色荧光标记。通过流式细胞仪V450-PB通道将细胞分为两组：阳性组为CD19 CAR细胞，阴性组为NYESO-1/AFP TCRTS(C)。CD3阳性人群是T细胞。
图33显示了流式细胞仪分析对包括CD19 CAR T细胞和NYESO-1TCRTS的共培养细胞的活化的结果。将各组细胞共培养24小时，并使用流式细胞仪测量这些细胞的活化。在对照组NC中，NYESO-1TCRTS的激活非常低(1.43％MFI＝5559)。PC组中NYESO-1TCRTS的激活正常(15.02％，MFI＝23301)。A组的NYESO-1TCRTS活化(2.56％，MFI＝6087)高于NC组(见102和104)。B组(5.28％，MFI＝12352)中NYESO-1TCRTS的激活高于A组(2.56％，MFI＝6087)(参见106和108)。C组中NYESO-1TCRTS的活化(6.80％，MFI＝12352)高于B组中(5.28％，MFI＝12352)(参见110和112)。C组中NYESO-1 TCRTS的激活高于A组(参见114和116)。
图34示出了流式细胞术分析对包括CD19 CAR T细胞和NYESO-1TCRTS的共培养细胞的增殖的结果。将各组细胞共培养96小时，并使用流式细胞仪测量这些细胞的增殖。进行细胞增殖的比较。NC对照组中NYESO-1TCRTS细胞的增殖为2.46％。A组中NYESO-1TCRTS细胞的增殖率为28.17％，与NC组相比有所增加(见202)。B组的NYESO-1TCRTS细胞的增殖比A组高41.60％(参见204)。C组的NYESO-1 TCRTS细胞增殖率为47.79％，高于B组的41.60％(206)，高于A组(见208)。
图35显示了流式细胞仪分析对包括CD19 CAR T细胞和AFP TCRTS的共培养细胞的活化的结果。将各组细胞共培养24小时，并使用流式细胞仪测量这些细胞的活化。对照组NC的AFP TCRTS未激活(0.70％MFI＝4568)。PC组AFP TCRTS的激活正常(38.58％，MFI＝23327)。A组的AFP TCRTS活化(1.24％，MFI＝4884)高于NC组(参见302和304)。B组(4.17％，MFI＝13112)的AFP TCRTS激活高于A组(1.24％，MFI＝4884)(参见306和308)。C组的AFPTCRTS激活(6.47％，MFI＝14218)高于B组(4.17％，MFI＝13112)(参见310和312)，也高于A组(参见314和316)。此外，TCR阴性T细胞也被部分激活(NC＝0.51％；A＝1.46％；B＝2.84％；C＝5.12％)。组之间的关系与积极部分的关系相同。
图36示出了对包括CD19 CAR T细胞和AFP TCRTS的共培养细胞的增殖的流式细胞术分析的结果。将各组细胞共培养96小时，并使用流式细胞仪测量这些细胞的活化。进行细胞增殖的比较。NC对照组AFP TCRTS的增殖率为3.11％。A组AFP TCRTS的增殖率为36.44％，与NC组(402)相比有所增加。B组AFP TCRTS的增殖率为39.59％，高于A组的36.44％(404)。C组AFP TCRTS的增殖率为51.97％，高于B组的39.59％(406)和A组(408)。因此，CD19 CAR T细胞通过增加其增殖速率来增强TCRT细胞的扩增。
这些数据表明，活化的第一类CAR T细胞可以活化偶联的CAR T细胞中的第二种CAR T细胞(例如CD19 CAR T细胞和CLDN18.2 CAR T细胞)。例如，活化的第一类型的CAR T细胞增强了第二类型的CAR T细胞的活化，细胞因子释放和细胞增殖。存在PBMC时，这种效果会增强。考虑到PBMC和单核细胞被激活，第一种类型的CAR T细胞可以激活单核细胞(例如DC)，然后单核细胞可以激活第二种类型的CAR T细胞。此处提供的数据与体内显示的数据的组合本公开的实施例显示，受试者的树突状细胞(DC)充当将第一类CAR T细胞的激活与CDT激活相关的介质。第二种类型的CAR T细胞并形成一个正向激活圈，由于免疫稳态的增强，这可能有助于在受试者(患者004-011)中观察到CAR T细胞的扩增。以上这些数据和临床数据表明，偶联或混合的T细胞可实现增强的T细胞反应，包括T细胞扩增和/或细胞因子释放。偶联或混合的T细胞的实例包括BCMA和GUCY2C CAR T细胞以及CD19 CAR T细胞和NYESO-1 TCRTS。在向患者输注混合的T细胞后，第一组T细胞(例如CD19和BCMA CAR T细胞)结合B细胞的抗原并被激活。在其激活后，第一组CAR T细胞上调某些膜分子(例如CD28、OX40、4-1BB、CD40L等)并释放某些细胞因子(例如IFNγ和GM-CSF)。这些表面分子和细胞因子激活和/或募集细胞，例如单核细胞(例如DC)和嗜中性粒细胞。募集和/或激活的细胞释放细胞因子(例如TNFα、IL6、IL12)以形成炎症样环境。鉴于炎症样环境，这些激活的免疫细胞上调了一些蛋白质(例如CD80、CD80和CD40)，这些蛋白质激活了第二组T细胞(例如靶向实体瘤的NT，CAR T细胞和NYESO-1TCRTS)。同样，第一组T细胞分泌的细胞因子(例如IFNγ)也激活第二组T细胞。
图40显示了NK细胞感染CD19CAR比例数据。NK细胞(CD3-CD56+)通过CD56+CD16+NKCell Isolation Kit分选人外周血PBMC得到；Day0加入激活剂NK Cell Activation/Expansion Kit(CD2和CD335抗体)；Day1进行感染CD19CAR病毒，MOI为30，助转剂为DEAE-Dextran hydrochloride(8μg/mL)；Day7用CD19蛋白检测CAR比例，图40a为对照组NTNK(33.03％)，图40b为实验组CD19CAR NK(CAR比例51.09％)，CD19CAR感染NK的效率约为18％，CD19CAR病毒感染后，NK细胞纯度为94.07％(图40c)
图41显示了T细胞感染CD19CAR比例数据。T细胞(CD3+)通过Miltenyi Biotec公司的CD4/CD8 microbeads分选人外周血PBMC得到；Day0加入激活剂Transact(CD3和CD28抗体)；Day1进行感染CD19CAR病毒，MOI为3，助转剂为Protamine phosphate(10μg/mL)
；Day7用hCAR抗体检测CAR比例，图41a为对照组NT-T(1.65％)，图41b为实验组CD19CAR T(CAR比例57.68％)，CD19CAR感染T的效率约为56％，CD19CAR病毒感染后，T细胞纯度为93.56％(图41c)；
图42-43显示了CD19细胞与NTNK、CD19NK以及CD19细胞与GUCY2C、CD19NK以及CD19细胞与CD19 T和NTNK共培养96h增殖数据。图42a是CD19cell-NTNK共培养，NTNK增殖比例为53.34％；图42b是CD19NK-CD19细胞-NTNK共培养，NTNK增殖比例为89.71％；与对照组CD19cell-NTNK共培养相比较，CD19NK-CD19细胞-NTNK体系中NTNK增殖比例更高；图42c是CD19细胞-GUCY2C T共培养，GUCY2C T增殖比例为31.20％；图42d是CD19NK-CD19细胞-GUCY2C T共培养，GUCY2C T增殖比例为43.67％；与对照组CD19细胞-GUCY2CT共培养相比较，CD19NK-CD19 cell-GUCY2CT体系中GUCY2CT增殖比例更高；图42e是CD19 cell-NTNK共培养，NTNK增殖比例为59.15％；图42f和是CD19T-CD19 cell-NTNK共培养，NTNK增殖比例为74.89％；与对照组CD19 cell-NTNK共培养相比较，CD19T-CD19 cell-NTNK体系中NTNK增殖比例更高；
图42a，细胞比例CD19cell:NTNK为3:1；图42b细胞比例CD19NK:CD19cell:NTNK为1:3:1；图42c，细胞比例CD19cell:GUCY2C T为3:1；图42d细胞比例CD19NK:CD19cell:GUCY2C T为1:3:1；图42e，细胞比例CD19cell:NTNK为3:1；图42f细胞比例CD19 T:CD19cell:NTNK为1:3:1。
图43a，CD19cell-NTNK共培养为对照组，NTNK增殖比例为53.34％，CD19NK-CD19cell-NTNK共培养为实验组，NTNK增殖比例为89.71％；与对照组CD19cell-NTNK共培养相比较，实验组CD19NK-CD19cell-NTNK体系中NTNK增殖比例更高；图43b，CD19cell-GUCY2CT共培养为对照组，GUCY2C T增殖比例为31.20％，CD19NK-CD19 cell-GUCY2C T共培养为实验组，GUCY2C T增殖比例为43.67％；与对照组CD19 cell-GUCY2CT共培养相比较，实验组CD19NK-CD19 cell-GUCY2CT体系中GUCY2CT增殖比例更高；图43c，CD19 cell-NTNK共培养为对照组，NTNK增殖比例为59.15％，CD19T-CD19 cell-NTNK共培养为实验组，NTNK增殖比例为74.89％；与对照组CD19 cell-NTNK共培养相比较，实验组CD19T-CD19 cell-NTNK体系中NTNK增殖比例更高；
本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入此处，一个单独的出版物，专利或专利申请被特定和单独地指示为通过引用并入。虽然已经根据各种实施例描述了弥补内容，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离其精神的情况下可以进行各种修改，替换，省略和改变。
表7
序列表
<110> 上海斯丹赛生物技术有限公司
<120> 偶联嵌合抗原受体细胞及其用途
<150> US62/932,587
<151> 2019-11-08
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
<211> 69
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
50 55 60
Ser Leu Val Ile Thr
65
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 5
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 6
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 7
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Asn Ile Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro
145 150 155 160
Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn
165 170 175
Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp
180 185 190
Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe
210 215 220
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
225 230 235
<210> 8
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu
85 90 95
Gly Ile Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gln Ser Leu Lys
130 135 140
Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Asp Asn Trp Ile Gly
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile
165 170 175
Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln
180 185 190
Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp
195 200 205
Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Gly Leu
210 215 220
Asp Trp Asn Tyr Asn Pro Leu Arg Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 9
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Gly Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 10
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr
165 170 175
Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr
210 215 220
Gly Thr Asn Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 11
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg
165 170 175
Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr
210 215 220
Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 12
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Arg Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gln Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
130 135 140
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Tyr Asn Glu Asn
180 185 190
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala
195 200 205
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Thr Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ala
245
<210> 13
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu
20 25 30
Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg
35 40 45
Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala
50 55 60
Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe
65 70 75 80
Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr
85 90 95
His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile
100 105 110
Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu
115 120 125
Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn
130 135 140
Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp
145 150 155 160
Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg
165 170 175
Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg
180 185 190
Ile Ile His Asn Asn Asn Cys
195
<210> 14
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
145 150 155 160
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
210 215 220
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 15
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
Met Asn Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Gly Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Glu Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala
35 40 45
Ile Asp Ala Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser
85 90 95
Arg Pro Gln Val Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
130 135 140
Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Leu Ile Phe Pro Ser Cys Val
145 150 155 160
Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro
165 170 175
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Thr
180 185 190
Ser Asn Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Trp Met Gly Val Ile Trp Ser Asn Gly Asp Ala Asp Tyr Asn Ser Ala
210 215 220
Ile Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe
245 250 255
Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Phe Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
260 265 270
Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 16
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val
20 25 30
Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
Ser Ile Ser Ser His Asp Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Ser Lys Asp Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Leu Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile
145 150 155 160
Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
165 170 175
Val Gln Pro Gly Arg Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
180 185 190
Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys
195 200 205
Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Tyr
210 215 220
Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala
225 230 235 240
Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
245 250 255
Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe
260 265 270
Asp Phe Trp Gly Pro Gly Ile Met Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 17
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 17
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr Asn Ser Tyr Asn Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp
145 150 155 160
Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala His Ile Trp
165 170 175
Trp Asp Asp Asp Val Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Ile Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asp Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser
195 200 205
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Arg Ala
210 215 220
Thr Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 18
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 19
<211> 1689
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 19
cggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 60
gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 120
tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 180
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggatccgcc 240
accatggcct taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc 300
aggccggaca tccagctcac ccagtccccg agctcgctgt ccgcctccgt gggagatcgg 360
gtcaccatca cgtgccgcgc cagccagtcg atttcctcct acctgaactg gtaccaacag 420
aagcccggaa aagccccgaa gcttctcatc tacgccgcct cgagcctgca gtcaggagtg 480
ccctcacggt tctccggctc cggttccggt actgatttca ccctgaccat ttcctccctg 540
caaccggagg acttcgctac ttactactgc cagcagtcgt actccacccc ctacactttc 600
ggacaaggca ccaaggtcga aatcaagggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 660
ggcggcggat ctgaagtgca attggtggaa tcagggggag gacttgtgca gcctggagga 720
tcgctgagac tgtcatgtgc cgtgtccggc tttgccctgt ccaaccacgg gatgtcctgg 780
gtccgccgcg cgcctggaaa gggcctcgaa tgggtgtcgg gtattgtgta cagcggtagc 840
acctactatg ccgcatccgt gaaggggaga ttcaccatca gccgggacaa ctccaggaac 900
actctgtacc tccaaatgaa ttcgctgagg ccagaggaca ctgccatcta ctactgctcc 960
gcgcatggcg gagagtccga cgtctgggga caggggacca ccgtgaccgt gtctagcacc 1020
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 1080
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1140
ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1200
tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1260
caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1320
ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1380
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1440
gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1500
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1560
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1620
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1680
cctcgctaa 1689
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
20 25 30
Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile
50 55 60
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
100 105 110
Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
130 135 140
Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His
180 185 190
Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Leu Arg Gln Met
210
<210> 22
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp
50 55 60
Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
65 70 75 80
Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
85 90 95
Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg
100 105 110
Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val
115 120 125
Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser
130 135 140
Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
145 150 155 160
Gly Arg Arg Ala Ser Gln
165
<210> 23
<211> 1117
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
aatgctttgt cctggagagc tatcttaagg gacaaaatcg ttttcccagc gtcatctgtg 60
acacatcctg acagtagaga gctgcttcca agaagcaatt tgaagtgcca ttatcaggca 120
gggacggggg ctctagggga tttcggggtc agcagatatg aaatgaatga tttcataggg 180
ctgtcacaga gctgtggtgg gaatttccca tgagaccccg cccctggctg agtcaccgca 240
ctcctgtgtt tgacctgaag tcctctcgag ctgcagaagc ctgaagacca aggagtggaa 300
agttctccgg cagccctgag atctcaaggt ctgtccatct gggggagtgg gtgggggcac 360
tgagaagggg tgagattgga acttttgctc cctttgccca tttctagact ttttctccta 420
atatgtaata acttctcttc aatagccctt taaataaaca tcaataactt agcctgaaga 480
gtttttcact ccttagtttt gttaccatac aaacttcaca tctcaaaaca tgtctctgtt 540
taagaaaatg tgttagtgag ttgaacaggg aggtctttcc acatgttagt agttaggtgt 600
tcagctaaag ggggaagagt gattatgtga tagcttcttc ttgaactgaa ttgtctgatg 660
cccctgacag attctctttg taaggagttt atttcagggg caataagtaa ttggcattat 720
tgctggttgg tactgcaaag tacctatgaa agtccccaaa agttcttgct attgttattt 780
ctgcattttg gcagaacatg atggaaaatg caccctcaaa ctttggcaaa ccggcacaaa 840
gctgtgtgtt taatcacgcc tgccttgtcc tagtggtttc tatgaatctg ctacttttcc 900
gtaatattgc atcattaatt gttcctgaaa aaccctgagt tatcctctta tagaattgta 960
taagtaatga ttgcaatata gataattttg aaaggagaaa ccacctttcc ttggaaatgt 1020
ttatcttttg cagagtgaca tttgtgagac cagctaattt gattaaaatt ctcttggaat 1080
cagctttgct agtatcatac ctgtgccaga tttcatc 1117
<210> 24
<211> 590
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
agtgaggcgg tacccacaga gccgcgtggc actcctcaac ctgctagagc agccggcctc 60
ctgcaggatg gcttaaggac cacctggtcc ttggggtctg ggttctccgg gtcctgctgt 120
tccctgcagc cttccttcta cccccagagc agcttggggg catctttaga gaaagcggca 180
gtgtcgcacc tgccccagca gccacaaaac agaggaaatt ctgagcacct ccgggcgtga 240
gtcaccatac cacattcagg aattgccacc tctgcccaca gaatcaccca ctcttttctg 300
tttgggacca aaatagatac ctccttcaga agccgctgct ttctgtactc tcagcaataa 360
aaaaacaaag gctaggatag gtgtgtgcct ctgaggcgtg agggggggcg cgttttctcc 420
cctgggaagg ttttcagaga gaagttgttg ctacagcagt acaggcagct gatgggttga 480
gggtacagga ggaagaggga tggcctcggc ggccaagctt agacactaga gggtatataa 540
tggaagctcg acttccagct tggcaatccg gtactgttgg taaagccacc 590
<210> 25
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 25
tgagagagga tgatgtattc taaattgaag ttttgattca caagaagatt aaaagccatt 60
cagaaaccta attcacccac tgaaaggaaa aaaaaaaaag agagatgagc agtttgtctc 120
cggaaattgt cttaggtcgg aagtctgtgg tccctgttca catgtaccca aaagcatcct 180
gctgctgcag ctgtctgata agcacagagt accccacctt ctctgcacac tttgcatcta 240
gctcatatta cctcatcttt acttcctttc tgacgtctca ccctggattc tacatataag 300
gtcacacagg aaggaaagct gcattgagtt ttggtgtcct gaaagacttt tgccaacctt 360
gtccccgcac taatttctct aagcctcggc tatactattt tctcagctac acgatgaaat 420
gtgaatgata atttctgccc taaaaatatc acttaatttt ttaacatatc atttatgaaa 480
gaagacacat aaaatgtctc cctaaaatgg aaagttacat attattgcca tctgtgtttt 540
ataaagaggt tgaaaggggt ggtacctgag ctcgctagcc tcgaggatat caagatctgg 600
cctcggcggc caagcttaga cactagaggg tatataatgg aagctcgact tccagcttgg 660
caatccggta ctgttggtaa agccacc 687
<210> 26
<211> 688
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
tttctactgg gcagtgctga tctagagcaa tttgaaactt gtggtagata ttttactaac 60
caactctgat gaaggacttc ctcaccaaat tgttctttta accgcattct ttccttgctt 120
tctggtcatt tgcaagaaaa attttaaaag gctgcccctt tgtaaaggtt tgagaggccc 180
tagaatttcg tttttcactt gttcccaacc acaagcaaat gatcaatgtg ctttgtgaat 240
gaagagtcaa cattttacca gggcgaagtg gggaggtaca aaaaaatttc cagtccttga 300
atggtgtgaa gtaaaagtgc cttcaaagaa tcccaccaga atggcacagg tgggcataat 360
gggtctgtct catcgtcaaa ggacccaagg agtctaaagg aaactctaac tacaacaccc 420
aaatgccaca aaaccttagt tattaataca aactatcatc cctgcctatc tgtcaccatc 480
tcatcttaaa aaacttgtga aaatacgtaa tcctcaggag acttcaatta ggtataaata 540
ccagcagcca gaggaggtgc agcacattgt tctgatcatc tgaagatcag ctattagaag 600
agaaagatca gttaagtcct ttggacctga tcagcttgat acaagaacta ctgatttcaa 660
cttctttggc ttaattctct cggaaacg 688
<210> 27
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
tcgaggtcga cggtatcgat aagcttgata tcgaattagg aggaaaaact gtttcataca 60
gaaggcgtca attaggagga aaaactgttt catacagaag gcgtcaatta ggaggaaaaa 120
ctgtttcata cagaaggcgt caattggtcc catcgaatta ggaggaaaaa ctgtttcata 180
cagaaggcgt caattaggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtcaat taggaggaaa 240
aactgtttca tacagaaggc gtcaattggt cccgggacat tttgacaccc ccataatatt 300
tttccagaat taacagtata aattgcatct cttgttcaag agttccctat cactctcttt 360
aatcactact cacagtaacc tcaactcctg 390
<210> 28
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 28
gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggagacgtgg aagaaaaccc cggtcct 57
<210> 29
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser His Thr Ser Ser
85 90 95
Asn Thr Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys
130 135 140
Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile
165 170 175
Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln
180 185 190
Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp
195 200 205
Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Leu Glu Pro Thr His His Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 30
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
145 150 155 160
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 31
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
145 150 155 160
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Thr Asp Ile Lys Tyr Asn Asp Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
210 215 220
Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 32
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 32
Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln Glu
1 5 10 15
Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val
20 25 30
Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Val Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu
130 135 140
Val Leu Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
165 170 175
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser
180 185 190
Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp Ser
195 200 205
Thr Phe Tyr Ala Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu
210 215 220
Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Leu Phe Asn Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 33
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 33
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Leu Gly Gly Thr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro
130 135 140
Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp
145 150 155 160
Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu
165 170 175
Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asn Thr Met Glu
195 200 205
Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala His Thr Tyr Pro
210 215 220
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 34
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
130 135 140
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
165 170 175
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
210 215 220
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 35
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 35
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Ser Glu Phe Pro Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Pro Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr
130 135 140
Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val
210 215 220
Gln Thr Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Met Lys
<210> 36
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 36
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Val Tyr Ser
165 170 175
Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser Ala His Gly Gly Glu Ser
210 215 220
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
<210> 37
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 37
Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro
20 25 30
Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp
35 40 45
Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro
50 55 60
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr
85 90 95
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Tyr His Arg Cys Thr Leu Arg Ser
145 150 155 160
Gly Ile Asn Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Tyr
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser
180 185 190
Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser
210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala
225 230 235 240
Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Ala Ser
245 250
<210> 38
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 38
Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile
85 90 95
Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
His His Ser Tyr Pro Leu Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
130 135 140
Gly Ser Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
145 150 155 160
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
165 170 175
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp
195 200 205
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 39
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 39
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
35 40 45
Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu
100 105 110
Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser
165 170 175
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile
180 185 190
His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met
210 215 220
Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu
225 230 235 240
Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Lys Pro
260
<210> 40
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 40
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Leu Glu
275 280 285
Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
290 295 300
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
305 310
<210> 41
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 41
Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu
1 5 10 15
Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met
20 25 30
Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg
50 55 60
Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser
65 70 75 80
Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys
85 90 95
Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
100 105 110
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
115 120 125
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
130 135 140
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Lys
145 150 155 160
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Val Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
180 185 190
Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
210 215 220
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340

Claims (21)

1. 修饰的细胞群体，其特征在于：所述的细胞群体包含至少两种T细胞，其中第一T细胞包含第一核酸序列，该第一核酸序列包括编码第一CAR的核酸序列，第二T细胞包含第二核酸序列，该第二核酸序列包括编码第二CAR的核酸序列，所述第一CAR的序列为SEQ IDNO：5、6、或36，所述第二CAR的序列为SEQ ID NO：11、29、或31，并且其中所述第一CAR和所述第二CAR分别包含细胞外结构域、跨膜结构域、细胞内结构域，所述第一CAR结合表面标志物抗原，用于细胞群体的扩增和/或维持，所述第二CAR结合实体瘤或血液瘤抗原，用于使第二T细胞与靶细胞结合。
2.根据权利要求1所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第一T细胞不包含第二核酸序列，和/或第二T细胞不包含第一核酸序列，和/或修饰的细胞群体还包括表达至少两种不同抗原结合结构域的第三基因修饰细胞，第一抗原结合结构域用于扩增和/或维持基因修饰细胞，第二抗原结合结构域用于杀死靶细胞。
3.根据权利要求1所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述的细胞群体包括修饰的NK细胞群体、修饰的T细胞群体、修饰的巨噬细胞群体或修饰的树突状细胞群体。
4.根据权利要求1所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第二T细胞的数量不少于第一T细胞的数量。
5. 根据权利要求4所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第一T细胞和/或第二T细胞包含第三核酸序列，所述第三核酸序列包含编码以下各项中的一种或多种的核酸序列：IL-1P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-γ、MIP-1n、MIP-IP、MCP-1、TNFα、GM- CSF、GCSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-P、CD40、CD40L、铁蛋白。
6.根据权利要求5所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第一T细胞和/或第二T细胞包含第三核酸序列，所述第三核酸序列包含(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列。
7.根据权利要求1所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第一T细胞和/或第二T细胞经工程化改造，当T细胞被激活时表达和分泌IL-6和/或INF-γ。
8.根据权利要求6所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第一T细胞和/或第二T细胞包含串联的(1)编码IL-6的核酸序列和/或(2)编码IFN-γ的核酸序列。
9. 根据权利要求6所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第一T细胞和/或第二T细胞包含编码SEQ ID NO：21和22的核酸序列。
10.根据权利要求1所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述细胞内结构域包含共刺激信号传导域，所述共刺激信号传导域包含共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3的任意一种及其组合，所述抗原包括tMUC1、PRLR、CLCA1、MUC12、GUCY2C、GPR35、CR1L、MUC17、TMPRSS11B、TMPRSS11E、CD207、SLC30A8、CFC1、SLC12A3、SSTR1、GPR27、FZD10、TSHR、SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12、ALPP、CEA、EphA2、FAP、GPC3、IL13-Rα2、间皮素、PSMA、ROR1、VEGFR-II、GD2、FR-α、ErbB2、EpCAM、EGFRvIII、PSCA或EGFR的任意一种及其组合。
11.根据权利要求5-6任意一项所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第三核酸序列包含启动子，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述结合位点调节转录调节剂的表达和/或分泌。
12.根据权利要求11所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述转录调节剂包括Hif1a、NFAT、FOXP3或NFkB中的任意一种及其组合。
13.根据权利要求12所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述启动子对转录调节剂有响应。
14.根据权利要求11所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述启动子与第三核酸序列连接，以使得所述启动子驱动所述第一T细胞和/或所述第二T细胞中IL6和INFγ的表达和/或分泌。
15. 根据权利要求11所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述启动子的序列为SEQID NOs：23-26中的至少一种。
16. 根据权利要求1所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述修饰的细胞群体包含编码SEQ ID NO：21、22和27的核酸序列，以使得当所述第一T细胞和/或所述第二T细胞被激活时IL-6和INF-γ被表达和分泌。
17.根据权利要求16所述的修饰的细胞群体，其特征在于：CAR、IL-6和INF-γ以多聚蛋白的形式产生，其被切割以产生单独的CAR、IL-6和INF-γ，并且在CAR、IL-6和INF-γ之间存在可切割部分，所述可切割部分包含2A肽，2A肽包含P2A或T2A。
18.根据权利要求4-9任意一项所述的修饰的细胞群体，其特征在于：所述第一T细胞和/或所述第二T细胞的抑制肿瘤的功能与不表达和/或分泌IL-6和INF-γ的T细胞相比没有减弱，并且所述第一T细胞和/或所述第二T细胞不表达和/或分泌TGF-β。
19.根据权利要求18所述的修饰的细胞群体，其特征在于：当所述第一T细胞和所述第二T细胞与血液细胞接触时，第二T细胞的扩增大于不包含第一T细胞的单独第二T细胞的扩增。
20.一种组合物，其特征在于：所述组合物包含权利要求1-19任意一项所述的修饰的细胞群体。
21.权利要求1-19任意一项所述的修饰的细胞群体，或权利要求20所述的组合物在制备治疗受试者肿瘤药物中的用途。
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