CN110114371A

CN110114371A - 嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN110114371A
Application number: CN201780080784.5A
Authority: CN
Inventors: S.奥努奥哈; V.佩达雷迪加里; L.斯坦克祖克; M.费拉里; B.马
Original assignee: Otto Ruth Ltd
Current assignee: Otto Ruth Ltd; Autolus Ltd
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2019-08-09
Also published as: US20190352409A1; EP3538556A1; WO2018087557A1; JP2019535262A; AU2017357649A1; CA3042613A1

Abstract

本发明提供了包含与不同的抗原结合的第一和第二嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其中第一CAR结合跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物(TACI)。本发明还提供了包含tanCAR的细胞，所述tanCAR包含与不同抗原结合的第一和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域结合抗原跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物(TACI)。本发明进一步提供了相应的核酸序列和/或构建体、包含所述核酸序列和/或构建体的试剂盒和载体、分子和用于制备此类细胞的方法。细胞可以用于细胞免疫治疗方法，用于治疗诸如多发性骨髓瘤的疾病。

Description

嵌合抗原受体

发明领域

本发明涉及包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体结合抗原跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物(TACI)。此类细胞可用于治疗癌性疾病，例如多发性骨髓瘤。

发明背景

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合抗原受体是以其通常形式将单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应功能的蛋白质。它们通常的形式是I型跨膜结构域蛋白，其具有识别氨基末端的抗原、间隔区、跨膜结构域，所有这些都与传递T细胞存活和激活信号的复合胞内域连接(参见图1)。

这些分子的最常见形式使用衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)来识别靶抗原。scFv经由间隔区和跨膜结构域融合至信号传导胞内域。此类分子响应于scFv对其靶标的识别而导致T细胞的激活。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀伤表达靶抗原的靶细胞。

已经开发了几种针对肿瘤相关抗原的CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前正在临床试验中用于治疗各种癌症。例如，一些涉及使用CD19靶向的CAR T细胞治疗血液学恶性肿瘤的临床试验正在进行中(Park et al 2016,Blood 127(26):3312-3320)。

细胞因子释放综合征(CRS)

然而，与CAR T细胞输注相关的显著缺点是毒性的引发，其中最普遍的是细胞因子释放综合征(CRS)。在利用“第一代”构建体(没有共刺激信号传导元件)的早期CAR T细胞试验中，注意到T细胞增殖/细胞因子产生不足和缺少抗肿瘤反应。在第二代CAR设计(例如CD28或41BB)中添加共刺激信号传导转化为改善的T细胞激活/扩增、细胞因子产生，以及血液恶性肿瘤患者中最显著引人注目的抗肿瘤反应。然而，CAR T细胞的“双刃剑”在CAR T细胞施用后类似令人印象深刻且潜在危及生命的CRS中得到证实。

CRS的标志是导致炎性细胞因子升高的免疫激活。临床和实验室测量范围从轻度/中度CRS(全身症状和/或2级器官毒性)到严重CRS(sCRS；≥3级器官毒性，侵袭性临床干预和/或潜在危及生命)。临床特征包括：高烧、不适、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心功能障碍、肾损伤、肝衰竭和弥散性血管内凝血。在CAR T细胞输注后观察到细胞因子引人注目的升高，所述细胞因子包括干扰素-gamma、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10和IL-6。

CRS的存在通常与过继转移细胞的扩增和进行性免疫激活相关。引起CRS的细胞因子来自输注的T细胞和周围的基质细胞，包括单核细胞和巨噬细胞。涉及CRS的主要细胞因子是IL-6，其主要由髓样细胞(myeloid cell)(单核细胞和巨噬细胞)分泌。通过使用抗IL6受体抗体(例如toci)或抗IL6抗体(例如司妥昔单抗(siltuximab))，可以中和CRS的体征和症状。

已经证明，CRS严重程度由输注时的疾病负担决定，因为具有高肿瘤负担的患者经历更严重的sCRS。在用CD19特异性CAR T细胞治疗复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的患者的报告中，sCRS的发生率范围为19至43％，具有可能由于综合征的临床鉴定、嵌合受体设计和输注的细胞表型的差异引起的可变性。不能基于sCRS的发展断定临床结果，因为患者在不存在该毒性的情况下可以表现出抗肿瘤反应。然而，在血液恶性肿瘤的背景下，大多数响应的患者在CAR T细胞输注后表现出至少轻度CRS(发热)。

在诊断CRS之后，挑战在于选择适当的疗法来缓解不受控制的炎症的生理症状，而不抑制经工程化的细胞的抗肿瘤功效。已证明全身性皮质类固醇可以迅速逆转sCRS的症状，而不损害初始抗肿瘤反应。然而，长期使用(例如，>14天)的高剂量皮质类固醇也已导致过继转移的CAR T细胞群的消除，潜在地限制其长期抗白血病作用。作为食品和药物管理局批准的mAb的有效的备选IL-6受体(IL-6R)阻断，已经证明托珠单抗(tocilizumab)的CRS的几乎立即逆转。然而，IL-6R阻断可以对CAR T细胞增殖、持久性以及最重要的抗肿瘤作用具有负面影响。

因此，需要用于避免和控制与CAR-T细胞疗法相关的CRS的备选机制。

多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤(骨髓瘤)是浆细胞的骨髓恶性肿瘤。异常浆细胞的集合在骨髓中积累，在那里它们干扰正常血细胞的产生。骨髓瘤是美国第二常见的血液学恶性肿瘤(在非霍奇金淋巴瘤之后)，并且占血液学恶性肿瘤的13％和所有癌症的1％。该疾病在痛苦和医疗支出方面是繁重的，因为它导致病理性骨折、易感染、死亡前的肾衰竭以及随后骨髓衰竭。

与许多淋巴瘤不同，骨髓瘤目前无法治愈。淋巴瘤中使用的标准化疗剂对骨髓瘤基本无效。典型地，这些免疫治疗剂靶向单一抗原：例如，利妥昔单抗(Rituximab)靶向CD20；Myelotarg靶向CD33；以及阿仑珠单抗(Alemtuzumab)靶向CD52。然而，由于浆细胞中CD20表达缺失，利妥昔单抗不可以针对骨髓瘤使用。新药剂如Bortezamib和Lenolidomide部分有效，但未能导致长期缓解。

BCMA

BCMA是在成熟淋巴细胞(例如记忆B细胞、浆母细胞、骨髓浆细胞和骨髓瘤细胞)中表达的跨膜蛋白质。已证明经转导以表达抗BCMA CAR的T细胞能够从骨髓瘤患者的浆细胞瘤中特异性杀伤骨髓瘤细胞(Carpenter et al.,2013,Clin Cancer Res 19(8)2048-60)。

然而，靶向BCMA时的考虑因素是骨髓瘤细胞上BCMA的特别低的密度，与例如淋巴瘤细胞上的CD19相比(图2)。此外，初始临床数据表明，用表达抗BCMA CAR的T细胞治疗与骨髓瘤细胞BCMA表达随时间的丧失和BCMA阴性骨髓瘤的进展有关(Ali et al.,(2016,Blood128(13)1688-1700)。此外，所有接受BCMA-CAR的患者均检测为CRS(细胞因子释放综合征)阳性。

因此，需要解决了这些问题的治疗骨髓瘤的改善的治疗方法。

附图说明

图1–嵌合抗原受体的标准设计

显示了嵌合抗原受体的典型形式。这些是I型跨膜蛋白质。胞外域识别抗原。这由抗体衍生的单链可变片段(scFv)组成，所述scfv附接至间隔区结构域。这继而与用于将分子锚定在膜中的跨膜结构域连接。最后，这与用于将细胞内信号传输给细胞的胞内域连接。这由一个或多个信号传导结构域组成。

图2–BCMA在骨髓瘤上的表达数据

通过CD138+磁珠选择分离来自39个多发性骨髓瘤患者的骨髓样品的骨髓瘤细胞。用缀合有PE(GSK)的抗BCMA单克隆抗体J6MO对这些细胞染色。使用PE Quantibrite珠(Becton Dickenson)按照制造商的说明定量抗原拷贝数。呈现抗原拷贝数的框和须状图以及绘制的范围、四分位数和中值。我们发现每个细胞的范围是348.7-4268.4BCMA拷贝，平均值为1181且中位数为1084.9。

图3–APRIL和BAFF的配体特异性和功能分配

B细胞激活因子(BAFF，TNFSF13B)与BAFF受体(BAFF-R，TNFRSF13C)、B细胞膜抗原(BCMA，TNFRSF17)和跨膜激活物以及钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI，TNFRSF13B)相互作用，而A增殖诱导配体(APRIL，TNFSF13)仅与BCMA和TACI相互作用。BAFF-R激活影响外周B细胞存活，而BCMA可以影响浆细胞存活。

图4–生理B细胞发育期间的表面标志物

在发育期间，B细胞表达不同的表面标志物，其中一些被所示的治疗性单克隆抗体靶向。在骨髓中初始发育后，成熟B细胞经由血流迁移至次级淋巴器官，并可以经历生发中心反应和类别转换重组。它们形成记忆B细胞和抗体分泌细胞，其是短寿命浆母细胞或长寿浆细胞。褪色条表示关于表面标志物的表达的报告不均匀。缩写：BAFF-R，TNF家族受体的B细胞激活因子(TNFRSF13C)；BCMA，B细胞成熟抗原(TNFRSF17)；TACI，跨膜激活物和CAML相互作用物(TNFRSF13B)。

图5–阐明三种可能的TACI CAR设计的示意图

在第一CAR(A)中，人CD8茎部结构域用作间隔区结构域。在第二CAR(B)中，来自IgG1的铰链用作间隔区结构域。在第三CAR(C)中，用Hombach等人(2010Gene Ther.17:1206-1213)描述的用于减少Fc受体结合的用pva/a突变修饰的人IgG1的铰链、CH2和CH3结构域用作间隔区。在所有CAR中，这些间隔区与CD28跨膜结构域连接，然后与含有CD28、OX40和CD3-Zeta胞内域的融合物的三部分胞内域连接。

图6–TACI特异性结合剂的生产

a)ELISA筛选以鉴定分泌TACI阳性抗体的杂交瘤。筛选总共10个亲本杂交瘤细胞系的平板并测试TACI结合。

b)通过流式细胞术对TACI结合的验证分析。在TACI阳性和BCMA阳性SupT1细胞上筛选杂交瘤细胞系。选择对SupT1TACI细胞具有最高反应性的四种杂交瘤进行亚克隆和表征。

图7–TACI CAR

a)TACI嵌合抗原受体盒的示意图。将TACI CAR2H6克隆到整合胞内域OX40CD28CD3zeta的第三代CAR形式中。

b)TACI和BCMA表达细胞的24小时杀伤测定法，将具有TACI抗原结合结构域(2H6)的CAR与具有包含截短的APRIL的结合结构域的等同CAR进行比较。以4:1效应:靶标比例进行共培养。

c)将与TACI和BCMA表达SupT1细胞以4:1共培养后的IFNy释放进行比较的测定法。

图8–TACI结合结构域的Biacore亲和力测定

图9–阐明实施例4中描述的CAR的示意图

图10–APRIL CAR-T细胞与靶细胞的接合导致高水平的IFNg和GM-CSF的产生

来自APRIL CART细胞和MM1靶细胞的共培养物的培养基中的细胞因子浓度。将MM1s细胞以1:1的比例与APRIL CART细胞或未转导的(NT)对照T细胞接种。48小时温育后，收集培养基，并通过Luminex Multiplex测定法测量一组细胞因子。(A)APRIL CAR-T细胞；(B)未转导的T细胞。

图11–IFNg和GM-CSF的组合诱导单核细胞中IL-6的产生

INFg与GMC-SF组合诱导人原代单核细胞和单核细胞样THP1细胞中IL-6的产生。(A)将从3个健康供体(n＝3)分离的人原代单核细胞或THP1细胞(n＝1)单独地或在存在IFNg(50ng/ml)或GMC-SF(10ng/ml)或两者的情况下培养48小时。温育后，通过ELISA在培养基中测量IL-6水平。

(B)人原代单核细胞的代表性图像，其显示出48小时温育后响应于INFg和GMC-SF的组合独特的形态变化。

图12–APRIL细胞显示针对单核细胞的细胞毒活性

APRIL CART对THP1细胞的细胞毒作用。(A)细胞毒性测定法结果的总结。从两个匹配的供体(n＝2)获得APRIL CART、TRBC1CART和未转导的(NT)对照细胞。将THP1细胞与CART细胞或它们各自的NT对照以1:1的比例共培养72小时。通过流式细胞术分析THP1裂解。(B)具有THP1和CART细胞的细胞毒性测定法的代表性FACS图。

图13–在存在自体抑制细胞的情况下CAR介导的肿瘤细胞溶解

(a)与未刺激的单核细胞相比，M2单核细胞(M2)、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)和树突状细胞(DC)TACI表达。(b)未转导的(蓝色)或用APRIL-CAR转导的(橙色)或用具有基于抗BCMA单克隆抗体的scFv抗原结合结构域的抗BCMA CAR转导的(灰色)T细胞在存在衍生自自体单核细胞的抑制细胞的情况下以1:4的E:T比与MM.1s细胞共培养。相对于MM1s细胞，M2单核细胞、MDSC和DC以1:10的比例包括在内。

发明概述

本发明涉及基于CAR的系统，其靶向跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)以及另一种抗原。CAR系统可以是：

a)共表达两种或更多种不同的CAR的细胞，其中一种结合TACI；

b)具有两个或更多个抗原结合结构域的tanCAR系统，其中一个结合TACI；

c)包含两个或更多个细胞群的组合物，每个细胞群表达不同的CAR，其中一个结合TACI；或

d)用于治疗疾病的方法，其包括在分开的施用步骤中施用两个或更多个细胞群，每个细胞群表达不同的CAR，其中一个结合TACI。

因此，本发明第一方面的第一实施方案提供了细胞，其包含与不同的抗原结合的第一和第二嵌合抗原受体(CAR)，其中第一CAR结合跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。

第二CAR可以结合与多发性骨髓瘤相关的另一种抗原。例如，第二CAR可以结合BCMA或BAFF。

第一CAR可以包含免疫球蛋白样抗原结合结构域。例如，第一CAR可以包含结合TACI的scFv。第一CAR可以缺少来自增殖诱导配体(APRIL)的TACI结合结构域。

本发明的第一方面的第二实施方案提供了细胞，其包含tanCAR，所述tanCAR包含与不同的抗原结合的第一和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域结合抗原跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。

第二抗原结合结构域可以结合与多发性骨髓瘤相关的另一种抗原。例如，第二抗原结合结构域可以结合BCMA或BAFF。

第一抗体结合结构域可以是免疫球蛋白样抗原结合结构域。例如，第一抗体结合结构域可以包含结合TACI的scFv。第一抗体结合结构域可以缺少来自增殖诱导配体(APRIL)的TACI结合结构域。

在第二方面，本发明提供核酸序列，其编码如本发明的第一方面的第二实施方案中定义的tanCAR。

核酸序列可以具有以下结构：

AgB1-接头-AgB2-间隔区-TM-endo

其中

AgB1是编码tanCAR的第一抗原结合结构域的核酸序列；

接头是编码tanCAR的接头的核酸序列；

AgB2是编码tanCAR的第二抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区是编码tanCAR的间隔区的核酸序列；

TM是编码tanCAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo是编码tanCAR的胞内域的核酸序列；

所述核酸序列当在细胞中表达时编码在细胞表面处串联表达第一和第二抗原结合结构域的多肽。

接头可以是Gly-Ser柔性接头或者可以包含Gly-Ser柔性接头。

可以在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用备选密码子，以避免同源重组。

在第三方面，本发明提供核酸构建体，其编码如本发明的第一方面的第二实施方案中定义的第一CAR和第二CAR。

核酸构建体可以具有以下结构：

AgB1-间隔区1-TM1-endo1-coexpr-AgB2-间隔区2-TM2-endo2

其中

AgB1是编码第一CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；

TM1是编码第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo1是编码第一CAR的胞内域的核酸序列；

coexpr是使第一和第二CAR能够共表达的核酸序列；

AgB2是编码第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；

TM2是编码第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo2是编码第二CAR的胞内域的核酸序列；

所述核酸构建体当在细胞中表达时编码在切割位点处被切割的多肽，使得第一和第二CAR在细胞表面处共表达。

“coexpr”可以编码包含自切割肽的序列。

在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用备选密码子，以避免同源重组。

在第四方面提供载体，其包含根据本发明的第二方面的核酸序列，或根据本发明的第三方面的核酸构建体。

载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。

在本发明的第五方面的第一实施方案中，提供试剂盒，其包含

(i)第一核酸序列，其编码如本发明的第一方面的第一实施方案中定义的第一CAR，所述核酸序列具有以下结构：

AgB1-间隔区1-TM1-endo1

其中

AgB1是编码第一CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；

TM1是编码第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo1是编码第一CAR的胞内域的核酸序列；和

(ii)第二核酸序列，其编码如权利要求1或2中定义的第二CAR，所述核酸序列具有以下结构：

AgB2-间隔区2-TM2-endo2

其中

AgB2是编码第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；

TM2是编码第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo2是编码第二CAR的胞内域的核酸序列。

在本发明的第五方面的第二实施方案中，试剂盒包含：第一载体，其包含如权利要求15中定义的第一核酸序列；和第二载体，其包含如权利要求15中定义的第二核酸序列。

载体可以例如是整合病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或转座子。

在第六方面提供用于制备根据本发明的第一方面的细胞的方法，其包括将以下各项引入到细胞中的步骤：根据本发明的第二方面的核酸序列；根据本发明的第三方面的核酸构建体；根据本发明的第四方面的载体或根据本发明的第五方面的序列或载体的试剂盒。

细胞可以来自从受试者分离的样品。

在本发明的第七方面的第一实施方案中，提供药物组合物，其包含多个根据本发明的第一方面的细胞。

在本发明的第七方面的第二实施方案中，提供药物组合物，其包含：

(i)表达第一CAR的第一细胞群；和

(ii)表达第二CAR的第二细胞群

其中第一和第二CAR结合不同的抗原并且第一CAR结合跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。

在第八方面的第一实施方案中，本发明提供用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据本发明的第七方面的药物组合物的步骤。

在第八方面的第二实施方案中，本发明提供用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括以下步骤：

(i)施用表达第一CAR的第一细胞群

(ii)施用表达第二CAR的第二细胞群

方法可以包括以下步骤：

(i)从受试者分离含有细胞的样品；

(ii)用以下各项转导或转染细胞：根据本发明的第二方面的核酸序列；根据本发明的第三方面的核酸构建体；根据本发明的第四方面的载体或根据本发明的第五方面的序列或载体的试剂盒；和

(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。

在第九方面，提供用于根据本发明的第八方面的方法的试剂盒，其包含：

(i)表达第一CAR的第一细胞群

(ii)表达第二CAR的第二细胞群

在第十方面，提供根据本发明的第七方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。

在第十一方面，提供根据本发明的第一方面的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

关于本发明的第八、第十和第十一方面，疾病可以是癌症，例如成熟B细胞恶性肿瘤。疾病可以例如是多发性骨髓瘤。

在第十二方面，提供tanCAR，其包含与不同的抗原结合的第一和第二抗原结合结构域，其中第一抗原结合结构域结合抗原跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物(TACI)。

在第十三方面，提供用于避免和/或减少受试者中细胞因子释放综合征的方法，其包括向受试者施用抗TACI剂的步骤。

抗TACI剂可以是抗TACI抗体或者可以包含抗TACI抗体。药剂可以是例如抗体-药物缀合物(ADC)、双特异性抗体或双特异性T细胞接合子(BiTE)。

抗TACI剂可以是表达抗TACI嵌合抗原受体(CAR)的细胞或者可以包含表达抗TACI嵌合抗原受体(CAR)的细胞。

抗TACI CAR包含两种单独的组分：抗原结合组分，其包含抗原结合结构域和跨膜结构域；和细胞内信号传导组分，其包含胞内域。抗原结合组分和细胞内信号传导组分在细胞表面处缔合以形成功能性CAR复合物。

抗原结合组分和细胞内信号传导组分可以仅在存在或不存在某些分子的情况下缔合，分别如WO2015/150771和WO2016/030691中所述。分子，例如四环素，可以引起抗原结合组分和细胞内信号传导组分的解离，从而减少或停止CAR功能。

抗TACI CAR可以具有抗原结合结构域，其包含来自APRIL的BCMA结合结构域，如WO2015/052538中所述。抗原结合结构域可以包含上文如SEQ ID No.2所示的序列或其保留TACI结合能力的片段或变体。

抗TACI剂可以是根据本发明的第一方面的细胞或者可以包含根据本发明的第一方面的细胞。

抗TACI剂可以抑制受试者中髓样细胞分泌细胞因子。抗TACI剂可以杀伤受试者中的髓样细胞，例如通过凋亡。

还提供如上定义的抗TACI剂，其用于在受试者中避免和/或减少细胞因子释放综合征。

还提供如上定义的抗TACI剂在制备用于避免和/或减少受试者中细胞因子释放综合征的药物中的用途。

由于癌症中固有的高突变率，对单一抗原的唯一靶向可以通过调控抗原导致肿瘤逃逸。用CAR方法单独靶向BCMA已显示导致BCMA阴性骨髓瘤复发(Ali et al 2016)。另一种骨髓瘤相关抗原TACI的共靶向应当避免此类逃逸。

两种抗原的共靶向还解决了在多发性骨髓瘤细胞的表面处的低BCMA表达的问题：当除了另一种抗原之外还靶向TACI时，CAR系统可识别的靶细胞上的有效总抗原浓度增加。

BCMA由生发中心B细胞表达，而TACI主要由脾过渡性2型和边缘区B细胞以及激活的B细胞表达(参见图5)。用CAR T细胞方法单独靶向BCMA可能会遗留骨髓瘤前体细胞。此外，单独靶向BCMA可以导致基质细胞的APRIL和BAFF分泌增加，从而促进骨髓瘤前体细胞的存活和生长。由于这两个原因，单独靶向BCMA可能导致耐久性差，持续时间仅与CAR-T细胞持久性一样长。

另一方面，靶向TACI应当导致更好地清除浆母细胞和晚期前B细胞，导致更好的应答持久性。

TACI在分泌细胞因子如IL-6的单核细胞和巨噬细胞上表达，所述细胞可以引起CRS。

因此，可以使用抗TACI剂的预处理、共处理或后处理来避免和/或减少CAR T细胞免疫疗法中的CRS。这种方法比用抗IL6或抗IL6受体抗体治疗患者更好，因为它更持久并且不仅会降低IL6，还会降低单核细胞和巨噬细胞产生的其他CRS相关细胞因子。

发明详述

嵌合抗原受体(CAR)

图1中示意性显示的CAR是嵌合I型跨膜蛋白质，其将细胞外抗原识别结构域(结合剂)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。结合剂通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式。通常需要间隔区结构域以将结合剂从膜分离并使其具有合适的定向。使用的常见间隔区结构域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以满足，例如来自CD8α的茎部，以及甚至仅仅是IgG1铰链。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中并将间隔区连接至胞内域。

早期的CAR设计具有衍生自FcεR1或CD3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足够触发T细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全激活T细胞以增殖或存活。为了克服这一限制，构建了复合胞内域：将T细胞共刺激分子的细胞内部分融合至CD3ζ的细胞内部分，产生了第二代受体，其能够在抗原识别后同时传输激活和共刺激信号。最通常使用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发T细胞增殖。已经描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如紧密相关的OX40和41BB，其传输存活信号。现在已经描述甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输激活、增殖和存活信号的胞内域。

可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸转移至T细胞。可以采用慢病毒载体。以这种方式，可以生成大量癌症特异性T细胞用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致激活信号传输至上面有其表达的T细胞。因此CAR将特异性和T细胞的细胞毒性引导至表达靶定抗原的肿瘤细胞。

或门(OR门)

在第一实施方案中，本发明的第一方面涉及共表达第一CAR和第二CAR的细胞，其中一个CAR结合抗原TACI而另一个CAR结合不同的抗原，使得细胞可以识别表达TACI和/或其他抗原作为标志物的靶细胞。

第二CAR可以例如结合多发性骨髓瘤细胞的抗原特征，例如BCMA或BAFF。

因此，该细胞包括或门。在WO2015/075468中描述了用于识别抗原的模式的嵌合抗原受体系统的逻辑门。

第一和第二CAR可以作为包含两个CAR的多肽产生，其通过切割位点分开。切割处的切割使得两个CAR在细胞表面处能够表达为分开的实体。

串联CAR(TanCAR)

已经开发了称为串联CAR或TanCAR的双特异性CAR，以同时靶向两个或更多个癌症特异性标志物。在TanCAR中，细胞外结构域包含串联的两个抗原结合特异性，通过接头接合。因此，两个结合特异性(scFv)都与单个跨膜部分连接：一个scFv与膜并置，而另一个scFv在远端位置。当TanCAR结合任一个或两个靶抗原时，这导致激活信号传输至上面有其表达的细胞。

Grada等人(2013,Mol Ther Nucleic Acids 2:e105)描述了TanCAR，其包括CD19特异性scFv，接着是Gly-Ser接头，并且然后是HER2特异性scFv。HER2-scFv在近膜位置，而CD19-scFv在远端位置。显示TanCAR诱导针对两种肿瘤限制性抗原中的每一种的不同的T细胞反应性。选择这种布置因为HER2(632aa/)和CD19(280aa,)的各自的长度适合于该空间排列。还已知HER2scFv结合HER2的最远端的4个环。

本发明的第一方面的第二实施方案涉及包含TanCAR的细胞，所述TanCAR包含串联的两个抗原结合特异性，其中第一抗原结合结构域与抗原TACI结合，而第二抗原结合结构域与不同的抗原结合。

在本发明的TanCAR中，TACI结合抗原结合结构域可以与膜并置，而另一个抗原结合结构域可以在远端位置，或反之亦然。

第二抗原结合结构域可以结合在骨髓瘤细胞上表达的另一种抗原，例如BCMA或BAFF-R。

抗原结合结构域

抗原结合结构域是CAR或TanCAR识别抗原的部分。本领域已知许多抗原结合结构域，包括基于抗体、抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的那些。例如，抗原结合结构域可以包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；靶抗原的天然配体；对于靶标具有足够亲和力的肽；单结构域抗体；人工单结合剂，如Darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)；或来自T细胞受体的单链。

抗原结合结构域可以包含免疫球蛋白样抗原结合结构域，例如scFv。

TACI

跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物)TACI(UniProtKB:O14836)是免疫应答中的调节物，并且与BCMA一样，优先在成熟淋巴细胞中表达，所述成熟淋巴细胞如CD27+记忆B细胞，尤其是边缘区B细胞、骨髓浆细胞和骨髓瘤细胞。另外，TACI在巨噬细胞上表达并介导巨噬细胞存活。TACI是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的淋巴细胞特异性成员，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员13B(TNFRSF13B)，并且可以从细胞的表面脱落并以其可溶形式循环。与BCMA相反，生发中心B细胞中显著缺少TACI。已知TACI作为TNFSF13/APRIL和TNFSF13B/BAFF的受体起作用，并以高亲和力结合两种配体。TACI抑制B细胞扩增并促进浆细胞的分化和存活。

TACI是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，并且作为B细胞功能的关键调节物。TACI以高亲和力结合两种配体APRIL和BAFF，并在其细胞外区域含有两个富含半胱氨酸的结构域(CRD)。然而，存在另一种形式的TACI，其中通过可变剪接除去N-末端CRD。已经表明，该较短的形式能够配体诱导的细胞信号传导，并且单独的第二CRD(TACI_d2)含有对两种配体的完全亲和力(Hymowitz et al 2005Am Soc.Biochem.And Mol.Biol.Inc 280(8)7218-7227)。

已经解析了TACI_d2的晶体结构以及APRILTACI_d2和APRIL BCMA复合物的共晶结构(Hymowitz et al 2005，如上)。

TACI的CRD与其他TNFR的CRD一起具有共同的序列特征，即所谓的DXL基序，其由保守的6残基序列(Phe/Tyr/Trp)-Asp-Xaa-Leu-(Val/Thr)-(Arg/Gly)(SEQ ID No.50)组成。该基序是结合APRIL或BAFF所必需的。受体基序结合在疏水口袋中并与BAFF表面上的两个保守的精氨酸残基相互作用。

与TACI结合的CAR或tanCAR的抗原结合结构域可以是能够结合TACI的任何结构域。例如，抗原结合结构域可以包含可衍生自下表中列出的市售抗TACI抗体之一的TACI结合剂：

抗TACI Ab	公司
		1A1	BioLegend
ab5994	Abcam
		Ab79023	Abcam
11H3	Affymetrix eBioscience

抗原结合结构域可以包含实施例2中描述的TACI结合剂之一，即来自克隆2H6、2G2、1G6或4B11。

这些TACI结合剂具有以下序列：

2H6

ScFv:EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKASGYTFTNYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPSNDDTKYTEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTHGDYYALDYWGQGTSVTVSSGGGGAGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQSVTISCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQAPKLLIYGASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID No.36)

CDR H1:NYVMH(SEQ ID No.37)

CDR H2:YINPSNDDTKYTEKFKG(SEQ ID No.38)

CDR H3:GTHGDYYALDY(SEQ ID No.39)

CDR L1:RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID No.40)

CDR L2:GASNVES(SEQ ID No.41)

CDR L3:QQSRKVP(SEQ ID No.42)

2G2

ScFv:QVTLKESGPGMLQPSQTLSLTCSFSGFSLSTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDAQYSNPALRSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCSRIHSYYSYDEGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSYRTFGGGTKLEIKR(SEQ ID No.43)

CDR H1:TFGMGVG(SEQ ID No.44)

CDR H2:HIWWDDAQYSNPALRS(SEQ ID No.45)

CDR H3:RIHSYYSYDEGFAY(SEQ ID No.46)

CDR L1:KASQNVGTAVA (SEQ ID No.47)

CDR L2:SASNRYT(SEQ ID No.48)

CDR L3:QQYSSY(SEQ ID No.49)

1G6

VH:QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVDWVRQSPGKGLEWLGIIWGGGRTNYNSAFKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCASGDRAADYWGQGTSVTVSS(SEQ ID No.54)

CDR H1:SYGVD(SEQ ID No.55)

CDR H2:IIWGGGRTNYNSAFKS(SEQ ID No.56)

CDR H3:GDRAADY(SEQ ID No.57)

VL:DIVMTQSQKFMSTTVGDRVTITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPVRFTGSGSGTDFTLTINNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID No.58)

CDR L1:KASQNVGTAVA(SEQ ID No.59)

CDR L2:SASNRYT(SEQ ID No.60)

CDR L3:QQYSSYP(SEQ ID No.61)

4B11

VH:EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGKIDPANGNSEYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTTIYYCTSGYGAYWGQGTTLTVSS(SEQ ID No.62)

CDR H1:NTYIH(SEQ ID No.63)

CDR H2:KIDPANGNSEYAPKFQG(SEQ ID No.64)

CDR H3:GYGAY(SEQ ID No.65)

VL:DIVLSQSPSSLAVSIGEKVTLSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWFQQKPGQSLKLLIYWASTREFGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAVYYCQQYYTWTFGGGTKLEIK(SEQ ID No.66)

CDR L1:KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID No.67)

CDR L2:WASTREF(SEQ ID No.68)

CDR L3:QQYYTW(SEQ ID No.69)

本发明提供抗TACI剂，例如抗体、scFv、CAR或tanCAR，其包含基于克隆2H6、2G2、1G6或4B11之一的TCI结合结构域。抗TACI剂可以包含一个或多个CDR，其具有SEQ ID No37-42；44-49；55-57；59-61；63-65；67-69所示的序列。药剂可以包含以下六个CDR的组中的一个：

SEQ ID No 37-42；SEQ ID No 44-49；SEQ ID No 55-57和59-61；或SEQ ID No63-65和67-69。

抗TACI剂可以包含SEQ ID No.36或43中所示的VH和/或VL序列(VH在丝氨酸-甘氨酸接头之前，VL在丝氨酸-甘氨酸接头之后)。抗TACI剂可以包含SEQ ID No.54或62中所示的VH序列和/或SEQ ID No.58或66中所示的VL序列。抗TACI剂可以包含SEQ ID No 36或43中所示的scFv，或通过将SEQ ID No.54与SEQ ID No.58连接或者将SEQ ID No.62与SEQ IDNo.66连接而形成的scFv。

对于所有上述序列，抗TACI剂可以包含与给定序列具有80％、85％、90％、95％或98％一致性的序列，条件是变体序列保留结合TACI的能力。。

本发明的CAR或TanCAR中的TACI特异性抗原结合结构域可以缺少全部或部分增殖诱导配体(APRIL)。APRIL是BCMA和TACI的天然配体(参见图4)。

本发明的CAR的BCMA结合结构域可以缺少增殖诱导配体(APRIL)的任何部分。APRIL也称为TNFSF13。

APRIL的野生型序列可在UNIPROT/O75888获得并如下所示(SEQ ID No.1)。保留BCMA和TACI结合但失去蛋白聚糖结合的截短形式的APRIL如SEQ ID No.2所示。SEQ IDNo.2缺少如SEQ ID No.1所示的野生型APRIL分子的氨基末端116个氨基酸。

SEQ ID No.1

SEQ ID No.2

VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL

本发明的CAR或TanCAR中的TACI特异性抗原结合结构域可以缺少增殖诱导配体(APRIL)的任何部分。例如，它可以缺少来自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的任何10、20、30或40个氨基酸长的连续氨基酸的段。它可以缺少如SEQ ID No.2所示的完整序列。

CAR或TanCAR中的TACI特异性抗原结合结构域可以缺少APRIL的BCMA结合结构域。

BAFF-R

BAFF-R(UniProtKB：Q96RJ3)(也称为BF3)的主要作用是介导外周B细胞的存活和成熟。编码的蛋白质是BAFF的受体，并且是含有单细胞外富含苯丙氨酸的结构域的III型跨膜蛋白质。据认为该受体是BAFF介导的成熟B细胞存活所需的主要受体。

在BAFF-R缺陷小鼠中进行的研究指出BAFF-R作为转导BAFF介导的B淋巴细胞存活信号的主要受体。

结合BAFF-R的第一和/或第二CAR或TanCAR的抗原结合结构域可以包含衍生自下表中列出的市售抗BAFF-R抗体之一的序列：

抗BAFF-R抗体	公司
		11C1	BioLegend
ab16232	Abcam
		ab5965	Abcam
9B9	Adipogen
		PA1391	Boster Biological Technology
抗hBAFF-R	Axxora LLC

BAFF

TNF家族的B细胞激活因子(BAFF)，也称为BLyS、THANK、TAL1-1或zTNF4)是由髓样细胞表达的细胞因子，其被认为在B细胞应答中发挥促炎作用。Walters等人(2009,Journalof Immunology 182:793-801)显示，在特定条件下，BAFF也在T细胞应答中起抗炎作用。调节这些作用是通过调控细胞因子反应。BAFF主要由髓样细胞如单核细胞产生。

已经显示BAFF通过促进B淋巴细胞在成熟过程期间从T1阶段向T2阶段的转变对维持B淋巴细胞稳态至关重要。BAFF在B淋巴细胞存活和成熟中的关键作用已经在体内使用可溶性BCMA分子和不表达BAFF的基因工程化小鼠中证实，所属小鼠具有降低的成熟B细胞水平和严重受损的针对T依赖性和T非依赖性抗原的抗体反应。相反，表达高水平BAFF的转基因小鼠显示出具有增加数量的循环成熟B细胞。

BAFF显示与APRIL的结构相似性和重叠但不同的受体结合特异性。BAFF与BCMA和/或TACI的配位结合激活转录因子NF-κB并增加促存活Bcl-2家族成员(例如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1)的表达和促凋亡因子(例如Bid、Bad、Bik、Bim等)的下调，从而抑制凋亡并促进存活。该组合作用促进B细胞分化、增殖、存活和抗体产生(如Rickert RC et al.,Immunol Rev(2011)244(1):115-133中综述)。

本发明的TACI特异性CAR或tanCAR可以包含抗原结合结构域，其包含全部或部分BAFF。抗原结合结构域可以例如包含BAFF的TACI结合结构域。

已经获得了BAFF和TACI的3D晶体结构，显示由TACI鉴定的BAFF中的关键结构域是从Ile233从Glu238和从Asp 205至Leu 211的结构域(Wang et al.,JGenet Syndr GeneTher 2012,3:3)。

BAFF的氨基酸序列如下所示。

SEQ ID No.3

结合BAFF-R、BCMA和/或TACI的CAR或tanCAR的抗原结合结构域可以包含SEQ IDNo.3的全部或部分。例如，它可以包含保留BAFF-R、BCMA和/或TACI结合的SEQ ID No.3的截短形式。它可以包含BAFF的BAFF-R、BCMA和/或TACI结合位点。结合TACI的抗原结合结构域可以包含SEQ ID No.3的残基205-211和233-238。结合TACI的抗原结合结构域可以包含SEQID No.3的残基205-238。

BCMA

B细胞成熟靶标，也称为BCMA；TR17_HUMAN、TNFRSF17(UniProt Q02223)是在成熟淋巴细胞中表达的跨膜蛋白质，所述成熟淋巴细胞例如记忆B细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞。BCMA也在骨髓瘤细胞上表达。BCMA是非糖基化的III型跨膜蛋白质，其参与B细胞的成熟、生长和存活。

与BCMA结合的CAR或TanCAR的抗原结合结构域可以是能够结合BCMA的任何结构域。例如，抗原结合结构域可以是衍生自下表中列出的市售抗BAFF-R抗体之一的序列：

抗BCMA抗体	公司
		ab5972	Abcam
ab54834	Abcam
		SG1	Seattle Genetic Inc
LS-B2728	LS Biosciences
		LS-C18716	LS Biosciences
LS-C357630	LS Biosciences
		LS-C53526	LS Biosciences
LS-C196740	LS Biosciences

下面给出三种抗BCMA抗体的VH和VL序列，其中CDR序列加下划线。SEQ ID No.4:抗BCMA Ab 1VL

DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKG

SEQ ID No.5:抗BCMA Ab 1VH

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID No.6:抗BCMA Ab 2VL

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS

SEQ ID No.7:抗BCMA Ab 2VH

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR

SEQ ID No.8:抗BCMA Ab 3VL

EVQLVESGGGLVKPGRSLRLSCTASGFTFGDYALSWFRQAPGKGLEWVGVSRSKAYGGTTDYAASVKGRFTISRDDSKSFAYLQMNSLKTEDTAVYYCCSSGYSSGWTPFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID No.9:抗BCMA Ab 3VH

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIFNYHQRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTELTVLS

与BCMA结合的CAR或TanCAR的抗原结合结构域可以包含来自上述抗BCMA Ab 1、2或3的CDR。

与BCMA结合的CAR或TanCAR的抗原结合结构域可以包含来自如上所述的抗BCMAAb 1、2或3的VH和/或VL序列，或其具有至少70、80、90或90％序列一致性的变体，所述变体保留结合BCMA的能力。

跨膜结构域

本发明的CAR和/或Tan CAR包含跨越膜的跨膜结构域。它可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜结构域可以衍生自CD28，其提供良好的受体稳定性。

跨膜结构域可以包含如SEQ ID No.10所示的序列。

SEQ ID No.10

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

细胞内T细胞信号传导结构域(胞内域)

本发明的CAR可以包含激活胞内域或与其相关联，即CAR的信号传输部分部分。在抗原识别后，受体聚簇且信号被传输至细胞。最普遍使用的胞内域组分是含有3个ITAM的CD3-zeta的胞内域组分。这在抗原结合后传输激活信号至T细胞。CD3-zeta可以不提供完全有能力的激活信号，且可以需要另外的共刺激信号传导。例如，可以与CD3-Zeta一同使用嵌合CD28和OX40，以传输增殖/存活信号，或可以全部三个一起使用。

本发明的CAR或TanCAR的胞内域可以包含CD28胞内域和OX40和CD3-Zeta胞内域。

胞内域可以包含：

(i)含有ITAM的胞内域，例如来自CD3zeta的胞内域；和/或

(ii)共刺激结构域，例如来自CD28的胞内域；和/或

(iii)传输存活信号的结构域，例如TNF受体家族胞内域，如OX-40或4-1BB。

含有ITAM基序的胞内域可以在本发明中充当激活胞内域。已知几种蛋白质含有具有一个或多个ITAM基序的胞内域。仅举几例，此类蛋白质的实例包括CD3epsilon链、CD3gamma链和CD3delta链，。ITAM基序可以很容易地识别为通过任何两种其他氨基酸从亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸，产生签名YxxL/I(SeQ ID NO.51)。典型地但不总是，这些基序中的两个通过分子的尾部的6和8个之间的氨基酸(YxxL/Ix(6-8)YxxL/I)分开。因此，本领域技术人员可以容易地找到含有一个或多个ITAM的现有蛋白质以传递激活信号。此外，鉴于基序简单且不需要复杂的二级结构，本领域技术人员可以设计含有人工ITAM的多肽以传递激活信号(参见WO 2000/063372，其涉及合成信号传导分子)。

一些胞内域和共刺激结构域的序列如下给出。

SEQ ID No.11(CD28共刺激胞内域)

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEQ ID No.12(OX40胞内域)

RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

SEQ ID No.13(4-1BB胞内域)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID No.14(CD3zeta胞内域)

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

CAR可以包含如SEQ ID No.11-14所示的任何序列的变体，其具有至少80、85、90、95、98或99％的序列一致性，条件是变体序列保留抗原识别后诱导T细胞信号传导，即向T细胞提供相关的激活/增殖或存活信号的能力。

已经描述了许多系统，其中抗原识别部分在与信号传输部分分开的分子上，例如WO015/150771；WO2016/124930和WO2016/030691中描述的那些。本发明的CAR或TanCAR可以缺少信号传导胞内域。

本发明还提供了包含TACI结合抗原结合结构域和跨膜结构域的抗原结合组分；其能够与包含信号传导结构域的细胞内信号传导组分相互作用。本发明还提供了CAR信号传导系统，其包含此类抗原结合组分和细胞内信号传导组分。

信号肽

本发明的细胞可以包含信号肽，使得当CAR或TanCAR在细胞内表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后被引导至其得以表达的细胞表面。

信号肽的核心可以含有长段的疏水性氨基酸，其倾向于形成单个alpha螺旋。信号肽可以以短的带正电荷的氨基酸段开始，其有助于在易位期间实施多肽的适当拓扑。在信号肽的末端处，典型地存在一段由信号肽酶识别并切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位的完成期间或之后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白质。然后通过特异性蛋白酶消化游离信号肽。

信号肽可以在分子的氨基末端处。

本发明的CAR可以具有通式：

信号肽-抗原结合结构域-间隔区结构域-跨膜结构域-细胞内T细胞信号传导结构域(胞内域)。

信号肽可以包含SEQ ID No.15或其具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入、取代或添加)的变体，条件是信号肽仍然起作用以引起CAR的细胞表面表达。

SEQ ID No.15:METDTLLLWVLLLWVPGSTG

SEQ ID No.15的信号肽紧凑且高效。预计在末端甘氨酸后产生约95％的切割，从而通过信号肽酶产生有效去除。

间隔区

本发明的CAR和/或TanCAR可以包含间隔区序列，以将抗原结合结构域与跨膜结构域连接，并在空间上将抗原结合结构域与胞内域分开。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同方向上定向以使抗原结合成为可能。举例来说，间隔区序列可以将跨膜结构域连接到TACI结合结构域，并在空间上将TACI结合结构域与胞内域分开。或者，间隔区序列可以将BCMA结合结构域与跨膜结构域连接，并在空间上将BCMA结合结构域与胞内域分开。或者，本发明的间隔区序列可以将BAFF-R结合结构域与跨膜结构域连接，并在空间上将BAFF-R结合结构域与胞内域分开。

间隔区序列可以例如包含IgG1Fc区、IgG1铰链或CD8茎部，或其组合。或者，间隔区可以包含备选序列，其具有与IgG1Fc区、IgG1铰链或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。

可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。这些间隔物的氨基酸序列的实例如下给出：

SEQ ID No.16(人IgG1的铰链-CH2CH3)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD

SEQ ID No.17(人CD8茎部):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID No.18(人IgG1铰链):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

SEQ ID No.19(IgG1铰链-Fc)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK

SEQ ID No.20(经修饰的IgG1铰链–Fc以去除Fc受体识别基序)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVA*GPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK

经修饰的残基加下划线；*表示缺失。

接头

本发明的第一方面的第二实施方案的TanCAR包含连接串联的两个抗原结合结构域的接头序列。举例来说，通过接头连接在一起的两个抗原结合结构域可以结合抗原TACI和抗原BCMA。或者，通过接头连接在一起的两个抗原结合结构域可以结合抗原TACI和抗原BAFF-R。以下给出了高度柔性接头的实例：

SEQ ID No.21(Gly-Ser接头)

SGGGS

核酸序列

本发明的第二方面涉及编码TanCAR的核酸序列。

当由靶细胞表达时，核酸导致编码的TanCAR在靶细胞的细胞表面处表达。

核酸序列可以是RNA或DNA，例如cDNA。

核酸构建体

本发明提供了包含两个或更多个核酸序列的核酸构建体。例如，核酸构建体可以编码：

-结合TACI的第一CAR和结合TACI以外的抗原的第二CAR；

-结合TACI的第一CAR、结合TACI以外的抗原的第二CAR和自杀基因；或

-TanCAR和自杀基因

当由靶细胞表达时，核酸引起编码的多肽在靶细胞内或表面处独立地表达。

核酸构建体中的核酸序列可以通过“共表达”序列分开，该序列一旦翻译，使得两种多肽能够在细胞内或细胞上分开表达。

在上述结构中，“coexpr”是使两种多肽能够共表达的核酸序列。它可以是编码切割位点的序列，使得核酸构建体产生包含通过切割位点接合的两种或更多种多肽。切割位点可以是自切割的，使得当产生多肽时，其立即被切割成单个多肽而不需要任何外部切割活性。

切割位点可以是使两种或更多种多肽能够分开的任何序列。

出于方便在本文中使用术语“切割”，但切割位点可以通过除经典切割之外的机制使多肽分开成单个实体。例如，对于口蹄疫病毒(FMDV)2A自切割肽(见下文)，已提出各种模型来解释“切割”活性：宿主细胞蛋白酶的蛋白酶解、自身蛋白酶解或翻译作用(Donnellyet al(2001)J.Gen.Virol.82:1027-1041)。此类“切割”的确切机制对于本发明的目的并不重要，只要切割位点当位于编码蛋白质的核酸序列之间时，导致蛋白质表达为单独的实体。

切割位点可以是弗林蛋白酶(furin)切割位点。

弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的酶。该家族的成员是前蛋白转化酶，其将潜在的前体蛋白质加工成其生物活性产物。弗林蛋白酶是钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其可以在其配对的碱性氨基酸加工位点处有效切割前体蛋白质。弗林蛋白酶底物的实例包括原甲状旁腺(proparathyroid)激素、转化生长因子beta 1前体、前白蛋白、前beta分泌酶、膜1型基质金属蛋白酶、前神经生长因子的beta亚基和血管性血友病因子。弗林蛋白酶切割碱性氨基酸靶序列下游的蛋白质(规范地，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg′(SEQID No.52))并富集在高尔基体中。

切割位点可以是烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点。

TEV蛋白酶是高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，其是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。它对其靶切割位点非常特异，并因此经常用于体外和体内融合蛋白的受控切割。共有TEV切割位点是ENLYFQ\S(其中′\′表示切割的肽键)(SEQ IDNo.53)。哺乳动物细胞，例如人细胞，不表达TEV蛋白酶。因此，在本发明核酸构建体包含TEV切割位点并在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，外源TEV蛋白酶也必须在哺乳动物细胞中表达。

切割位点可以编码自切割肽。

“自切割肽”是指肽，所述肽发挥作用使得当包含蛋白质和自切割肽的多肽产生时，其立即被“切割”或分开成不同且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。

自切割肽可以是来自口疮病毒属(aphthovirus)或心病毒属(cardiovirus)的2A自切割肽。口疮病毒属和心病毒属的初级2A/2B切割由在其自身C-末端处的2A“切割”介导。在口疮病毒属如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎A病毒中，2A区域是约18个氨基酸的短区段，其与蛋白质2B的N-末端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表能够在其自身C-末端处介导“切割”的自主元件(Donelly et al(2001)如上)。

已在除了口疮病毒属或心病毒属之外的小核糖核酸病毒(picornavirus)、“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒、锥虫属内的C型轮状病毒和重复序列以及细菌序列中发现了“2A样”序列(Donelly et al(2001)如上)。切割位点可以包含这些2A样序列之一，例如：

YHADYYKQRLIHDVEMNPGP(SEQ ID No.22)

HYAGYFADLLIHDIETNPGP(SEQ ID No.23)

QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID No.24)

ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID No.25)

AARQMLLLLSGDVETNPGP(SEQ ID No.26)

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID No.27)

TRAEIEDELIRAGIESNPGP(SEQ ID No.28)

TRAEIEDELIRADIESNPGP(SEQ ID No.29)

AKFQIDKILISGDVELNPGP(SEQ ID No.30)

SSIIRTKMLVSGDVEENPGP(SEQ ID No.31)

CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP(SEQ ID No.32)

YPIDFGGFLVKADSEFNPGP(SEQ ID No.33)

切割位点可以包含如SEQ ID No.27所示的2A样序列(RAEGRGSLLTCGDVEENPGP)。

自杀基因

由于T细胞植入并且是自主的，因此期望选择性地删除患者中的CAR T细胞的方法。自杀基因是遗传上可编码的机制，其导致面对不可接受的毒性时选择性破坏输注的T细胞。自杀基因的最早临床经验是用疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，其使得T细胞对更昔洛韦(Ganciclovir)易感。HSV-TK是一种高效的自杀基因。然而，预先形成的免疫应答可能限制其用于相当大的免疫抑制的临床环境，例如半相合干细胞移植。诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)是通过用经修饰的FKBP12替换胱天蛋白酶9的激活结构域而构建的自杀基因。iCasp9由另外的惰性小分子二聚化的化学诱导剂(CID)激活。iCasp9最近在半相合HSCT的环境中进行了测试，并可以中止GvHD。iCasp9的最大限制是依赖于临床级专有CID的可用性。iCasp9和HSV-TK两者都是细胞内蛋白质，因此当用作唯一的转基因时，它们已经与标志物基因共表达以允许选择转导的细胞。

iCasp9自杀基因可以包含如SEQ ID No.34所示的序列或其具有至少80、90、95或98％序列一致性的变体。

SEQ ID No.34

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS

WO2013/153391描述了称为RQR8的标志物/自杀基因，其可以用抗体QBEnd10检测并且表达细胞用治疗性抗体利妥昔单抗裂解。

自杀基因可以包含如SEQ ID No.35所示的序列或其具有至少80、90、95或98％序列一致性的变体。

SEQ ID No.35

MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV

自杀基因可以与CAR或TanCAR表达为单一多肽，例如通过在两个序列之间使用自切割肽。

载体

本发明还提供了载体，其包含根据本发明的核酸序列或核酸构建体。此类载体可以用于将核酸序列或构建体引入到宿主细胞中，使其表达并产生一种或多种CAR、tanCAR和/或自杀基因。

载体可以是例如质粒或合成mRNA或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体。

载体可以能够转染或转导效应细胞。

细胞

本发明提供了细胞，其任选地表达一种或多种CAR/TanCAR以及自杀基因。

细胞可以包含根据本发明的核酸序列或构建体。

宿主细胞可以是免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。宿主细胞可以是溶细胞性免疫细胞。

对于除T细胞之外的细胞，例如NKT细胞，CAR的信号传导结构域可以与T细胞信号传导结构域不同，并且可以针对特定细胞类型进行定制。

可以通过用编码CAR或编码TanCAR的核酸转导或转染细胞来制备细胞。

细胞可以是离体T细胞。T细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品。在用编码CAR或TanCAR的核酸转导之前，可以激活和/或扩增T细胞，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。

药物组合物

本发明还涉及药物组合物，其包含多个根据本发明的第一方面的细胞。

本发明还提供了包含以下的混合物的药物组合物：

(i)表达第一CAR的第一细胞群；和

(ii)表达第二CAR的第二细胞群

第二CAR可以与BCMA结合。

本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和任选的一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以例如是适合于静脉内输注的形式。

治疗方法

本发明的细胞可以能够杀伤癌细胞，例如晚期B细胞恶性肿瘤。

本发明的细胞可以从患者自己的外周血(第1方)离体产生，或者在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第2方)或来自不相关供体的外周血(第3方)的背景中产生。或者，细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞的离体分化。在这些情况下，通过包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染的许多方法之一引入编码CAR或TanCAR的DNA或RNA来产生细胞。

本发明还提供了用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括以下步骤：

(i)施用表达第一CAR的第一细胞群

(ii)施用表达第二CAR的第二细胞群

其中第一和第二CAR结合不同的抗原并且第一或第二CAR结合跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。

可以在施用具有对除TACI之外的抗原的结合特异性的细胞群之前、之后或同时向患者施用TACI-CAR细胞群。

还提供了用于此类方法的试剂盒，其包含：

(i)表达第一CAR的第一细胞群

(ii)表达第二CAR的第二细胞群

第一和第二细胞群可以在试剂盒中单独提供(例如在单独的容器中)，用于随后、分开或同时施用。第一细胞群可以在第二细胞群之前、之后或与之相同的时间向患者施用。

本发明的方法可以用于治疗癌性疾病，特别是与增强的TACI/BCMA表达相关的浆细胞病症或B细胞病症。

浆细胞病症包括浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)和重链疾病以及意义不明的临床上不明确的单克隆丙种球蛋白病/闷烧多发性骨髓瘤。

疾病可以是多发性骨髓瘤。

与升高的TACI/BCMA表达水平相关的B细胞病症的实例是CLL(慢性淋巴细胞白血病)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

用于治疗疾病的方法涉及本发明的药物组合物的治疗用途。在这方面，药物组合物可以向患有现有疾病或状况的受试者施用，以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。本发明的方法可以引起或促进细胞介导的对表达TACI或表达TACI/BCMA的细胞(例如浆细胞)的杀伤。

细胞因子释放综合征的抑制

本发明的第十三方面涉及用于避免和/或减少受试者中细胞因子释放综合征的方法。

本发明人已发现TACI在髓样细胞如单核细胞和巨噬细胞上表达，其分泌促炎细胞因子如IL-6。这些细胞因子与细胞因子释放综合征有关。因此，可以通过经由TACI靶向单核细胞和巨噬细胞来预防、减少或治疗患者的CRS。

细胞因子如IL-6的分泌也认为有助于与癌症，特别是实体瘤相关的敌对微环境。还可以靶向TACI来防止或减少髓样细胞分泌细胞因子，以改善微环境并使其更有益于有效的抗癌免疫应答。

抗TACI剂可以抑制受试者中髓样细胞分泌细胞因子。抗TACI剂可以杀伤受试者中的髓样细胞，例如通过凋亡或其他细胞死亡的机制。抗TACI剂可以改善肿瘤微环境。

可以使用抗TACI抗体靶向TACI。该药剂可以例如是抗TACI抗体-药物缀合物(ADC，双特异性抗体或双特异性T细胞接合子(BiTE)。

或者，可以使用抗TACI嵌合抗原受体(CAR)靶向TACI。CAR可以包含基于APRIL，TACI的天然配体的结合结构域，如WO2015/052538中所述；或者它可以包含和抗TACI scFv。

抗TACI剂可以是根据本发明第一方面的细胞或者可以包含根据本发明第一方面的细胞。

当细胞包含或门(本发明的第一方面的第一实施方案)或TanCAR(本发明的第一方面的第二实施方案)的情况下，第二抗原结合结构域可以结合任何其他抗原，例如任何其他肿瘤相关抗原。

第二抗原结合结构域可以结合以下肿瘤相关抗原之一：

在治疗癌症期间可以减少或避免CRS。第二抗原结合结构域可以靶向与该癌症相关的抗原。癌症可以是多发性骨髓瘤、血液学恶性肿瘤或实体瘤。癌症可以是上表中列出的癌症之一。

抗TACI剂可以用于治疗CRS。用于治疗CRS的方法涉及本发明的药剂(例如细胞)的治疗用途。本文中，可以向患有现有CRS或CRS相关状况的受试者施用药剂，以减轻、减少或改善与CRS相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断CRS的进展。

受试者可以先前已经用表达CAR的细胞治疗。

用于预防CRS的方法涉及本发明的药剂(例如细胞)的预防用途。对于该用途，可以向未显示CRS的任何症状的受试者施用药剂，以预防或损害CRS的原因或者以减少或预防与CRS相关的至少一种症状的发展。受试者可以即将接受免疫疗法，例如基于CAR的治疗。

对于预防用途，可以在基于CAR的疗法之前施用抗TACI剂，例如在预处理方案中。或者，抗TACI剂可以与基于CAR的疗法共同施用。

现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而并不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1–BCMA在骨髓瘤细胞的表面上的表达

通过对来自已知患有明显疾病的多发性骨髓瘤患者的新鲜骨髓样品进行CD138免疫磁性选择来分离原代骨髓瘤细胞。将这些细胞用与PE缀合的BCMA特异性J6MO mAb(GSK)染色。同时，使用PE Quantibrite珠子试剂盒(Becton Dickenson)按照制造商的说明书生成具有已知数量的结合位点的珠子的标准品。通过将来自骨髓瘤细胞的平均荧光强度与源自珠子的标准曲线相关联，得到骨髓瘤细胞上的BCMA拷贝数。发现骨髓瘤细胞表面上BCMA拷贝数的范围低：每个细胞348.7-4268.4个BCMA拷贝，平均值为1181，以及中位数为1084.9(图2)。这比例如CD19和GD2(CAR的经典靶标)低得多。

实施例2–TACI CAR的设计和生成

免疫和杂交瘤生成

将编码人TACI的基因克隆在载体pVAC2中。用吸附于金纳米颗粒的编码TACI的质粒DNA免疫5只BalBC小鼠。使用Gene-Gun^TM(Biorad)系统肌肉内递送包被的金纳米颗粒。在21天的过程中对小鼠加强3次。通过ELISA和流式细胞术筛选来自小鼠的测试血液的抗TACI抗体的滴度。

选择五只具有TACI阳性血清的小鼠用于最终免疫加强，然后收获脾脏用于B细胞分离和杂交瘤产生。进行使用来自所选小鼠的淋巴细胞的10×96孔板的杂交瘤融合。通过针对重组人TACI纯化蛋白(Peprotech，310-17)的ELISA筛选来筛选杂交瘤上清液的反应性抗TACI抗体，代表性数据显示在图6a中。通过流式细胞术，在经过工程化改造以过表达TACI的SupT1细胞上测试ELISA阳性杂交瘤上清液。作为对照，使用表达BCMA的SupT1细胞，图6b。扩增候选杂交瘤。

杂交瘤扩增和克隆

通过流式细胞术，表达最强和最特异性抗TACI应答的四种亲本克隆杂交瘤(2H6、2G2 1G6、4B11)得以鉴定、扩增，并原种克隆(stock clone)以生成分泌单克隆抗体的杂交瘤。通过有限稀释获得杂交瘤克隆。

单克隆杂交瘤细胞系的抗体测序

根据制造商的说明书，使用试剂从单克隆杂交瘤细胞中分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA，并使用NanoDrop2000C评估浓度。根据制造商的说明书，使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。使用5′RACE PCR方法扩增VH和VL的抗体片段。将DNA片段平端克隆到含有T突出端的载体(TOPO-Thermofisher)中。对每条重链和轻链的5个菌落进行测序，并获得共有序列。克隆的序列与VH和VL区的CDR序列一起显示在上面的第15-16页。

以可溶性Fc标记和CAR形式克隆TACI结合抗体。

使用标准分子生物学技术将可变重链和轻链克隆成scFv形式。通过流式细胞术测试TACI scFv结合细胞的能力以及通过BIAcore测试其结合动力学，图8。

将ScFv抗体工程化为嵌合抗原受体形式。为了证明CAR形式的表达，将每个CAR的scFv克隆到SFG逆转录病毒载体中，与人铰链、TYRP跨膜结构域和CD28OX40和CD3zeta胞内域在单个开放阅读框中，图7a。用该载体转导T细胞，并通过用与兔IgG1的Fc结构域融合的重组TACI染色，在表达盒的T细胞表面上检测CAR。

实施例3–TACI-CAR T细胞对靶细胞的杀伤

通过用编码CAR、gag/pol和包膜蛋白RD114的质粒瞬时转染293T细胞产生逆转录病毒。3天后，收获上清液并将其用于以包被有retronectin的平板上的逆转录病毒相同的滴度转导PHA/IL2激活的PBMC。转导后6天通过流式细胞术确认CAR表达，并且PBMC以1:1的比例与TACI+BFP SupT1细胞或BCMA+BFP SupT1细胞共培养。在一天和三天后测定靶细胞杀伤。同样在一天和三天后，除去上清液并通过ELISA测定干扰素-γ水平。结果如图7b和c中所示。

实施例4–TACI-CAR对髓样细胞产生IL-6的影响

髓样细胞(细胞系和从外周血分离的原代细胞两者)用来自体外暴露于靶细胞的CAR-T细胞的条件培养基处理，以研究响应于由激活的CAR-T细胞产生的细胞因子，髓样细胞的IL-6分泌。

还研究了在用来自暴露于靶细胞的CAR-T细胞的条件培养基处理之前和之后髓样细胞的TACI表达。

使用CAR-T细胞、靶细胞和髓样细胞建立共培养物，以研究TACI介导的CAR-T细胞对髓样细胞的杀伤对IL-6产生的影响。测试了两种不同类型的CAR-T细胞：表达APRIL CAR的T细胞(参见图9A)和表达CD19/22 CAR的T细胞(参见图9B)。APRIL CAR包含截短形式的APRIL作为抗原结合结构域。其序列如上文SEQ ID No.2给出。截短的APRIL保留BCMA和TACI结合，但不再具有蛋白聚糖结合的能力。CD19/CD22 CAR T细胞表达两种CARS，一种针对CD19，一种针对CD22。表达CD19/22 CAR的T细胞不杀伤髓样细胞并充当阴性对照。

还研究了在靶细胞激活后在存在CAR-T细胞分泌的细胞因子的情况下，Trametinib(MEK抑制剂)抑制髓样细胞的IL-6的可能性。

实施例5–基于APRIL的CAR能够杀伤产生IL-6的单核细胞

CRS是由高水平细胞因子如IL-6引起的CART疗法的主要不良反应之一。为了研究患者中CRS触发的潜在机制，我们分析了来自APRIL CART细胞与MM1s靶细胞以1:1的比例接种的48小时共培养物的上清液中促炎细胞因子的浓度。通过Luminex Multiplex测定法进行的该分析显示GM-CSF和IFNg是测试的细胞因子组中最丰富的两种细胞因子(图10A)。这些细胞因子不存在于来自未转导的T细胞和MM1s细胞的共培养物的上清液中(图10B)。为了研究GM-CSF和IFNg对单核细胞中IL-6产生的影响，将从3个健康供体中分离的人原代单核细胞或THP1单核细胞样细胞单独地或在存在IFNg(50ng/ml)或GM-CSF(10ng/ml)或两者的组合的情况下培养48小时。温育后，通过ELISA测量培养基中的IL-6水平。结果显示在图11中。当与未处理的对照或单一细胞因子处理相比时，发现原代单核细胞和THP1细胞两者都响应于IFNg和GM-CSF的组合而具有增加的IL-6产生。还发现人原代单核细胞在48小时温育后响应于IFNg和GM-CSF的组合而显示出独特的形态变化(图11B)。

为了研究APRIL CAR-T细胞对单核细胞的细胞毒活性，将APRIL CART与THP1细胞共培养72小时。还测试了表达对照CAR的T细胞，其中CAR对T细胞抗原TRBC1具有特异性。如通过FACS测定的，APRIL CAR-T细胞而非未转导的或TRBC1CAR-T细胞显示出对这些单核细胞的高度细胞毒性作用(图12)。

实施例6–在存在单核细胞衍生抑制细胞的情况下APRIL CAR产生优异的靶细胞杀伤

恶性浆细胞的存活由与骨髓微环境的相互作用支持(Kawano et al(2015)Immunol.Rev.263:160-172)。这些相互作用包括肿瘤相关巨噬细胞、髓样衍生抑制细胞(MDSC)和树突状细胞(DC)。这些细胞类型均支持骨髓瘤细胞群并抑制肿瘤定向的免疫应答。具有高水平的骨髓巨噬细胞的骨髓浸润的患者预后不良(Suyani et al(2013)AnnHematology 92:669-677)，并且多发性骨髓瘤患者的外周血和骨髓中MDSC的数量显著增加(Gorgun et al(2013)Blood 121:2975-2987)。

同样地，该免疫抑制性骨髓微环境已经显示出降低内源性T细胞活性，过继转移的CAR-T细胞受到骨髓瘤患者的骨髓微环境中的免疫抑制细胞的影响。MDSC、巨噬细胞和DC衍生自单核细胞，因此我们开发了一种体外系统，用于在存在从自体外周血单核细胞(PBMC)培养的这些单核细胞衍生物的情况下评估CAR介导的肿瘤细胞溶解。

使用泛单核细胞分离微珠(Miltenyl)从PBMC分离单核细胞，并在细胞因子中培养一周以得到M2单核细胞、MDSC和DC。这些细胞具有类似于在骨髓瘤患者的骨髓中发现的肿瘤浸润性巨噬细胞的抑制性表型(Gutiérrez-González et al(2016)Blood 128:2241-2252)。然后在不存在或存在这些抑制性细胞类型的情况下，将源自相同供体的CAR T细胞与人骨髓瘤细胞系(HMCL)MM.1s共培养。

测试了两种类型的CAR，即APRIL CAR和抗BCMA CAR，BCMA CAR包含衍生自抗BCMA单克隆抗体的基于scFv的抗原结合结构域(BCMAscFv CAR)。在该系统中，在存在M2单核细胞、MDSC和DC的情况下，观察到BCMAscFv CAR显著减弱的肿瘤杀伤(图13)。相反，在存在单核细胞衍生的抑制细胞的情况下APRIL CAR介导的杀伤得以维持。

通过FACS分析，我们证实M2单核细胞、MDSC和DC表达TACI(图13a)。APRIL CAR T细胞的双重靶向能力允许直接靶向表达TACI的免疫抑制细胞。因此，虽然这些单核细胞衍生物抑制仅靶向BCMA的CAR T细胞的肿瘤杀伤，但APRIL CAR介导的杀伤得以维持。

在上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应该过度限于此类具体实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 奥托路斯有限公司

<120> 嵌合抗原受体

<130> P110923PCT

<150> GB 1619097.7

<151> 2016-11-11

<160> 69

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly

1 5 10 15

Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu

35 40 45

Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg

50 55 60

Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp

65 70 75 80

Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn

85 90 95

Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys

100 105 110

Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys

115 120 125

Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg

130 135 140

Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala

145 150 155 160

Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe

165 170 175

Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr

180 185 190

Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr

195 200 205

Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile

210 215 220

Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro

225 230 235 240

His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu

245 250

<210> 2

<211> 134

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp

1 5 10 15

Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu

20 25 30

Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu

35 40 45

Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln

50 55 60

Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys

65 70 75 80

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85 90 95

Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile

100 105 110

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115 120 125

Leu Gly Phe Val Lys Leu

130

<210> 3

<211> 285

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu

1 5 10 15

Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro

20 25 30

Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu

35 40 45

Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val

50 55 60

Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg

65 70 75 80

Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly

85 90 95

Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu

100 105 110

Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn

115 120 125

Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln

130 135 140

Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys

145 150 155 160

Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser

165 170 175

Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr

180 185 190

Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met

195 200 205

Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu

210 215 220

Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu

225 230 235 240

Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly

245 250 255

Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu

260 265 270

Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

275 280 285

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA抗体VL序列, 抗BCMA Ab 1 VL

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu

20 25 30

Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA抗体VH序列, 抗BCMA Ab 1 VH

<400> 5

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA抗体VL序列, 抗BCMA Ab 2 VL

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA抗体VH序列, 抗BCMA Ab 2 VH

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA抗体VL序列, 抗BCMA Ab 3 VL

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Leu Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ser Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Phe

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Cys Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Thr Pro Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA抗体VH序列, 抗BCMA Ab 3 VH

<400> 9

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Asn Tyr His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Ser

100 105 110

<210> 10

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 跨膜结构域

<400> 10

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 11

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28共刺激胞内域

<400> 11

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 12

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40胞内域

<400> 12

Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr

20 25 30

Leu Ala Lys Ile

35

<210> 13

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB胞内域

<400> 13

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3zeta胞内域

<400> 14

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 15

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 16

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔区序列, 人IgG1的铰链-CH2CH3

<400> 16

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp

225 230

<210> 17

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔区序列, 人CD8茎部

<400> 17

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔区序列, 人IgG1铰链

<400> 18

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Pro Lys

20

<210> 19

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔区序列, IgG1铰链-Fc

<400> 19

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

65 70 75 80

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

100 105 110

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys

225 230 235

<210> 20

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔区序列, 经修饰的IgG1铰链 - Fc以去除Fc受体识别基序

<400> 20

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys

225 230 235

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Gly-Ser接头

<400> 21

Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 22

Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val Glu Met

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 23

His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu Thr

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 24

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 25

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 25

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 26

Ala Ala Arg Gln Met Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 27

Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 28

Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Gly Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 29

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 29

Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Asp Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 30

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 30

Ala Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Val Glu Leu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 31

Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Val Ser Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 32

Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile Glu Gln

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点

<400> 33

Tyr Pro Ile Asp Phe Gly Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 34

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> iCasp9自杀基因序列

<400> 34

Met Leu Glu Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg

1 5 10 15

Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met

20 25 30

Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro

35 40 45

Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu

50 55 60

Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro

85 90 95

His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Val Asp Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser

115 120 125

Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys

130 135 140

Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly

145 150 155 160

Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg

165 170 175

Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr

180 185 190

Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His

195 200 205

Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln

210 215 220

Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys

225 230 235 240

Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys

245 250 255

Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly

260 265 270

Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu

275 280 285

Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln

290 295 300

Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro

305 310 315 320

Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val

325 330 335

Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp

340 345 350

Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu

355 360 365

Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met

370 375 380

Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser

385 390 395 400

Ala Ser

<210> 35

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RQR8自杀基因序列

<400> 35

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser

35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

115 120 125

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val

145 150 155

<210> 36

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2H6 ScFv

<400> 36

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr His Gly Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn

180 185 190

Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met

210 215 220

Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

245

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2H6 CDR H1

<400> 37

Asn Tyr Val Met His

1 5

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2H6 CDR H2

<400> 38

Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2H6 CDR H3

<400> 39

Gly Thr His Gly Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2H6 CDR L1

<400> 40

Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln

1 5 10 15

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2H6 CDR L2

<400> 41

Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser

1 5

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2H6 CDR L3

<400> 42

Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro

1 5

<210> 43

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2G2 ScFv

<400> 43

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Ala Gln Tyr Ser Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ser Arg Ile His Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Gly Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

130 135 140

Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr

145 150 155 160

Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg

180 185 190

Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr

210 215 220

Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys Arg

245

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2G2 CDR H1

<400> 44

Thr Phe Gly Met Gly Val Gly

1 5

<210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2G2 CDR H2

<400> 45

His Ile Trp Trp Asp Asp Ala Gln Tyr Ser Asn Pro Ala Leu Arg Ser

1 5 10 15

<210> 46

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2G2 CDR H3

<400> 46

Arg Ile His Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2G2 CDR L1

<400> 47

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2G2 CDR L2

<400> 48

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 49

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 2G2 CDR L3

<400> 49

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr

1 5

<210> 50

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DXL基序, 保守的6残基序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是Phe, Tyr或Trp

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是Val或Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是Arg或Gly

<400> 50

Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa

1 5

<210> 51

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ITAM基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是Leu或Ile

<400> 51

Tyr Xaa Xaa Xaa

1

<210> 52

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 碱性氨基酸弗林蛋白酶靶序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是Arg或Lys

<400> 52

Arg Xaa Xaa Arg

1

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点

<400> 53

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

<210> 54

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 VH序列

<400> 54

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Gly Asp Arg Ala Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 55

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 CDR H1

<400> 55

Ser Tyr Gly Val Asp

1 5

<210> 56

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 CDR H2

<400> 56

Ile Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser

1 5 10 15

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 CDR H3

<400> 57

Gly Asp Arg Ala Ala Asp Tyr

1 5

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 VL序列

<400> 58

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Val Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Met Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 CDR L1

<400> 59

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 CDR L2

<400> 60

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 61

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 1G6 CDR L3

<400> 61

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro

1 5

<210> 62

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 VH序列

<400> 62

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Thr Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Gly Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 CDR H1

<400> 63

Asn Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 CDR H2

<400> 64

Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 CDR H3

<400> 65

Gly Tyr Gly Ala Tyr

1 5

<210> 66

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 VL序列

<400> 66

Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ile Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Thr Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 CDR L1

<400> 67

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 CDR L2

<400> 68

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe

1 5

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TACI结合剂, 4B11 CDR L3

<400> 69

Gln Gln Tyr Tyr Thr Trp

1 5

Claims

1.细胞，其包含与不同的抗原结合的第一和第二嵌合抗原受体(CAR)，其中所述第一CAR结合跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。

2.根据权利要求1的细胞，其中所述第二CAR结合BCMA。

3.细胞，其包含tanCAR，所述tanCAR包含与不同的抗原结合的第一和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域结合抗原跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。

4.根据权利要求3的细胞，其中所述第二抗原结合结构域结合BCMA。

5.核酸序列，其编码如权利要求3或4中定义的tanCAR。

6.根据权利要求5的核酸序列，其具有以下结构：

AgB1-接头-AgB2-间隔区-TM-endo

其中

AgB1是编码所述tanCAR的第一抗原结合结构域的核酸序列；

接头是编码所述tanCAR的接头的核酸序列；

AgB2是编码所述tanCAR的第二抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区是编码所述tanCAR的间隔区的核酸序列；

TM是编码所述tanCAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo是编码所述tanCAR的胞内域的核酸序列；

所述核酸序列当在细胞中表达时编码在所述细胞表面处串联表达所述第一和第二抗原结合结构域的多肽。

7.根据权利要求6的核酸序列，其中所述接头编码包含Gly-Ser柔性接头的序列。

8.根据权利要求5至7中任一项的核酸序列，其中在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用备选密码子以避免同源重组。

9.核酸构建体，其编码如权利要求1或2中定义的第一CAR；和如权利要求1或2中定义的第二CAR。

10.根据权利要求9的核酸构建体，其具有以下结构：

AgB1-间隔区1-TM1-endo1-coexpr-AgB2-间隔区2-TM2-endo2

其中

AgB1是编码所述第一CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区1是编码所述第一CAR的间隔区的核酸序列；

TM1是编码所述第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo1是编码所述第一CAR的胞内域的核酸序列；

coexpr是使所述第一和第二CAR能够共表达的核酸序列；

AgB2是编码所述第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区2是编码所述第二CAR的间隔区的核酸序列；

TM2是编码所述第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo2是编码所述第二CAR的胞内域的核酸序列；

所述核酸构建体当在细胞中表达时编码在切割位点处被切割的多肽，使得所述第一和第二CAR在所述细胞的表面处共表达。

11.根据权利要求10的核酸构建体，其中coexpr编码包含自切割肽的序列。

12.根据权利要求9至11中任一项的核酸构建体，其中在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用备选密码子以避免同源重组。

13.载体，其包含根据权利要求5至8中任一项的核酸序列，或根据权利要求9至12中任一项的核酸构建体。

14.根据权利要求13的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。

15.试剂盒，其包含

(i)第一核酸序列，其编码如权利要求1或2中定义的第一CAR，所述核酸序列具有以下结构：

AgB1-间隔区1-TM1-endo1

其中

AgB1是编码所述第一CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区1是编码所述第一CAR的间隔区的核酸序列；

TM1是编码所述第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo1是编码所述第一CAR的胞内域的核酸序列；和

AgB2-间隔区2-TM2-endo2

其中

AgB2是编码所述第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

间隔区2是编码所述第二CAR的间隔区的核酸序列；

TM2是编码所述第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo2是编码所述第二CAR的胞内域的核酸序列。

16.试剂盒，其包含：第一载体，其包含如权利要求15中定义的第一核酸序列；和第二载体，其包含如权利要求15中定义的第二核酸序列。

17.根据权利要求16的试剂盒，其中所述载体是整合病毒载体或转座子。

18.用于制备根据权利要求1至4中任一项的细胞的方法，其包括将以下各项引入到细胞中的步骤：根据权利要求5至8中任一项的核酸序列；根据权利要求10至12中任一项的核酸构建体；根据权利要求13或14的载体或根据权利要求15至17中任一项的序列或载体的试剂盒。

19.根据权利要求18的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。

20.药物组合物，其包含多个根据权利要求1至4中任一项的细胞。

21.药物组合物，其包含：

(i)表达第一CAR的第一细胞群；和

(ii)表达第二CAR的第二细胞群

其中所述第一和第二CAR结合不同的抗原并且所述第一CAR结合跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。

22.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据权利要求20或21的药物组合物的步骤。

23.用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括以下步骤：

(i)施用表达第一CAR的第一细胞群

(ii)施用表达第二CAR的第二细胞群

24.根据权利要求22或23的方法，其包括以下步骤：

(i)从受试者分离含有细胞的样品；

(ii)用以下各项转导或转染所述细胞：根据权利要求5至8中任一项的核酸序列；根据权利要求10至12中任一项的核酸构建体；根据权利要求13或14的载体或者根据权利要求15至17中任一项的序列或载体的试剂盒；和

(iii)向所述受试者施用来自(ii)的所述细胞。

25.用于根据权利要求23的方法的试剂盒，其包含：

(i)表达第一CAR的第一细胞群

(ii)表达第二CAR的第二细胞群

26.根据权利要求22至24中任一项的方法，其中所述疾病是癌症。

27.根据权利要求26的方法，其中疾病是成熟B细胞恶性肿瘤。

28.根据权利要求26或27的方法，其中所述疾病是多发性骨髓瘤。

29.根据权利要求20或21的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。

30.根据权利要求1至4中任一项的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

31.tanCAR，其包含与不同的抗原结合的第一和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域结合抗原跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物(TACI)。

32.用于避免和/或减少受试者中细胞因子释放综合征的方法，其包括向所述受试者施用抗TACI剂的步骤。

33.根据权利要求32的方法，其中所述抗TACI剂是抗TACI抗体。

34.根据权利要求32的方法，其中所述抗TACI剂是表达抗TACI嵌合抗原受体(CAR)的细胞。

35.根据权利要求34的方法，其中所述抗TACI CAR包含两种单独的组分：抗原结合组分，其包含抗原结合结构域和跨膜结构域；和细胞内信号传导组分，其包含胞内域

其中所述抗原结合组分和细胞内信号传导组分在所述细胞表面处缔合以形成功能性CAR复合物。

36.根据权利要求34的方法，其中所述抗TACI CAR具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含来自APRIL的BCMA结合结构域。

37.根据权利要求34的方法，其中所述抗TACI剂是根据权利要求1至4中任一项的细胞。

38.根据权利要求32至37中任一项的方法，其中所述受试者正在接受或即将接受基于CAR的免疫疗法。

39.根据权利要求32至38中任一项的方法，其中所述抗TACI剂抑制所述受试者中髓样细胞(myeloid cell)分泌细胞因子。

40.根据权利要求32至38中任一项的方法，其中所述抗TACI剂杀伤所述受试者中的髓样细胞。

41.抗TACI剂，其用于以下的方法中：

在受试者中

a)避免和/或减少细胞因子释放综合征；

b)抑制髓样细胞分泌细胞因子；和/或

c)杀伤髓样细胞。