JP6957471B2 - キメラ抗原受容体およびその使用 - Google Patents
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Description
[0001]本出願は、2015年9月11日に出願されたオーストラリア仮特許出願第2015903719号の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
[0019]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、機能障害性P2X7受容体に結合する抗体の1つまたは複数のCDR領域に対するアミノ酸配列相同性を含む結合ペプチドを含む。一部の実施形態において、結合ペプチドは、機能障害性P2X7受容体に結合する抗体のVH鎖および/またはVL鎖のCDR1、2、および3ドメインに対するアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号10、32、33、または34に記載される配列の30位から35位、50位から67位、または98位から108位にわたる領域のうちのいずれか1つに少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または94%同一である1つまたは複数のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号10、32、33、または34に記載される配列の30位から35位、50位から67位、または98位から108位にわたる配列のうちの1つまたは複数を含む。一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号10、32、33、または34に記載される配列のうちの1つまたは複数を含む。
[0023]第3の態様において、本発明は、本発明の第2の態様による核酸分子を含む核酸コンストラクトを提供する。一部の実施形態において、核酸分子の発現は、転写制御配列の制御下にある。一部の実施形態において、転写制御配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。
[0029]本発明の第4および第5の態様の一部の実施形態において、細胞は、活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第1のCARと、共刺激性受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第2のCARとを含む。一部の実施形態において、活性化受容体は、CD3共受容体複合体のメンバーであるか、またはFc受容体である。一部の実施形態において、共刺激性受容体は、CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4−1BB(CD137)、およびICOSからなる群から選択される。
[0091]一部の実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号10、配列番号32、配列番号33、もしくは配列番号34に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの機能性バリアントを含む。
[0140]本発明の第4の態様の一部の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、2つまたはそれ以上の異なるCARを含む。
[0151]上述のように、細胞の免疫応答は、典型的には、活性化シグナル(典型的には抗原に応答して)および共刺激性シグナルが同時に経験される場合にのみ誘導される。したがって、2つまたはそれ以上のCARが組み合わさって、細胞内活性化シグナルおよび細胞内共刺激シグナルの両方を提供する2つまたはそれ以上のCARを含む、上述の実施形態の一部による遺伝子改変された細胞を有することにより、十分な免疫応答が、CARによる同種抗原の認識に応答して誘導され得ることを確実にする。あるいは、遺伝子改変された細胞は、機能障害性P2X7受容体を認識する抗原認識ドメインを有する1つのCARのみを含み得、共刺激性受容体を構成的に発現し、それによって、CARが活性化されたときに同時に共刺激がもたらされる可能性を増大させてもよい。あるいは、遺伝子改変された細胞は、共刺激性受容体およびそのリガンドの両方を構成的に発現するようにさらに改変してもよい。この場合には、細胞は、共刺激を継続的に受け、細胞の免疫活性化のためには、活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有するCARの活性化のみが必要となる。
[0181]本発明の第6の態様の一部の実施形態において、仲介物は、機能障害性P2X7受容体に結合するプローブであり、キメラ抗原受容体は、プローブを認識する。好ましくは、プローブは、抗体またはアプタマーである。
[0192]本発明の第4または第5の態様による遺伝子改変された細胞を作製する際、治療において利用可能な細胞の総数を増加させるように、インビトロで細胞集団を増殖させることが望ましい場合がある。これは、細胞を、CARの抗原に曝露するステップを使用して行うことができる。したがって、第8の態様において、本発明は、本発明の第4または第5の態様による遺伝子改変された細胞をインビトロで増殖させる方法であって、細胞を、CARの抗原に曝露するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、細胞を、サイトカインに曝露するさらなるステップを含む。
PEP2−2−3結合ペプチドキメラ抗原受容体(CAR)の設計および発現についてのプロトコール
[0205]本発明の実施形態による抗非機能性(nf)P2X7受容体CARの設計およびその発現のプロセスを詳しく示す例示的なプロトコールを、以下に詳述する。
[0206]抗nfP2x7キメラ抗原受容体(CAR)を、図1に図示される概略図に従って設計した。
[0212]設計したCARを、図2に図示されるBLIVレンチウイルスプラスミド(System Biosciences、California、USA)に組み込んだが、これは、蛍光および生体発光のレポータータンパク質である緑色蛍光タンパク質(GFP)およびホタルルシフェラーゼ(FLuc)を含む。BLIVプラスミドは、GFPレポータータンパク質のコーディング配列とFLucレポータータンパク質のコーディング配列との間に、T2Aコーディング配列をさらに含み、それによって、FLucタンパク質とGFPタンパク質との翻訳後分離が可能となる。
BLIV−CARベクターのクローニングおよび評価
[0216]New England Biolabsの5−アルファコンピテント大腸菌細胞(ギブソンアセンブリクローニングキットで提供される)に、生成したBLIV−CARベクターを、製造業者の説明書に従って形質転換した。概要:
− NEBの5−アルファコンピテント大腸菌細胞のチューブを、10分間氷上で解凍した。
− 1pg〜100ngのBLIV−CARプラスミドDNAを含有する1〜5μlを、細胞混合物に添加し、チューブを4から5回左右に揺らすことによって、混合した。
− 大腸菌およびプラスミドの混合物を、氷上に30分間、混合することなく静置した。
− 細胞およびプラスミドの混合物に、42℃で30秒間熱ショックを与えた後、氷上に5分間、混合することなく静置した。
− 950μlのSOCを混合物に添加した後、60分間37℃に加熱し、激しく振盪させた。
− 選択プレートを調製し、37℃に加熱した。
− 細胞の10倍連続希釈物を、SOC溶液中に調製した。
− 各希釈物50〜100μlを、選択プレートに撒き、37℃で終夜インキュベートした。
[0219]以下の方法に従って、293T細胞を使用して、3プラスミドプロトコールによりレンチウイルスをパッケージングした。
1日目:293T細胞が、翌日に90〜95%コンフルエントになるように、細胞を、T−225フラスコに10%血清を有する35mlのDMEM培地に播種した。
2日目:生成したBLIV−CARプラスミド(または未改変のBLIVプラスミド)のうちのいずれか30ug、30ugのgag−polプラスミドデルタ8.2、および15ugのVSV−Gプラスミド(pMD2.G)を、OptiMEM培地に添加して、最終体積750ulにし、混合した。300ulのPEI溶液を添加し、室温で少なくとも20分間インキュベートした。混合物を、次いで、コンフルエントな293T細胞に添加した後、37℃でインキュベートした。
3日目:プラスミド混合物を添加した24時間後に、上清を293T細胞からデカンテーションし、4℃で保管した。デカンテーションした混合物を、35mlの新しい培地と置き換えた後、37℃でさらにインキュベートした。
4日目:プラスミド混合物を添加した48時間後に、培地を除去し、24時間で採取した上清と合わせた。合わせた上清を、15分間、1500gで回転処理して、残っている細胞残屑をすべて除去した。上清を0.45umのフィルターに通して濾過した後、WX超遠心分離器において17,000rpmで1時間回転処理した。遠心分離した後、上清を、手作業で、チューブに50〜200ulを残してデカンテーションした。遠心チューブを、混入および蒸発を防ぐために50mlのネジ蓋のチューブに入れ、ウイルスを4℃で終夜再懸濁させた。
5日目:ウイルスを、遠心チューブの底部から再懸濁させ、新しい1.5mlのチューブに移した。再懸濁したウイルスを、微小遠心チューブにおいて5000rpmで5分間回転処理して、残っている残屑をすべて除去した。
[0221]108個のCD8 T細胞を、RosetteSep(商標)ヒトCD8+T細胞単離キット(Stemcell technologies、Vancouver、Canada)を製造業者の説明書に従って使用して、50mlのヒト血液から単離した。純度の分析により、図7に図示されるように、精製された細胞の76.6%が、CD8+であったことが示された。
− BT549細胞を、単一細胞懸濁液として調製し、PBS中で2回洗浄して、残留血清をすべて除去した。
− 細胞を、室温のPBS中に再懸濁させた。
− 細胞増殖色素eFluor(登録商標)670の10μM溶液を、室温のPBS中に調製した。
− 等量の10μM色素溶液を、調製したBT549細胞に添加して、最終濃度5μMの色素溶液を得た。
− 色素溶液中のBT549細胞を、暗所において37℃で10分間インキュベートした後、10%血清を含有する低温培養培地を4倍量添加することによって標識化を停止した後、暗所において氷上で5分間インキュベートした。
− 最後に、細胞を培養培地中で3回洗浄した後、所望される濃度で培養培地中に再懸濁させた。
[0225]24時間の共培養後に、細胞を採取し、蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して分析した。膜挿入型色素を含有する標的細胞の数を定量して、共培養したT細胞が、標的細胞の死滅または細胞増殖の停止をもたらしたかどうかを評価した。CD8+T細胞が標的細胞を殺滅させる有効性を定量するために使用したゲーティングおよび分析の戦略は、図8に図示されており、図9に定量されている。図8Aは、標識したCD8+T細胞のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図8Bは、標識したBT549標的細胞のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図8Cは、対照CD8+T細胞およびBT549標的を24時間共培養した後のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図8Dは、BLIV−CAR−長ヒンジを形質導入したCD8+T細胞およびBT549標的細胞を24時間共培養した後のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。図8Eは、BLIC−CAR−短ヒンジを形質導入したCD8+T細胞およびBT549標的細胞を24時間共培養した後のゲーティングおよびヒストグラム分析を図示する。
代替的な抗nfP2X7キメラ抗原受容体の設計
[0228]本発明の実施形態による抗非機能性(nf)P2X7受容体CARの設計およびT細胞における発現のプロセスを詳しく示すさらなる例示的なプロトコールを、以下に詳述する。
[0233]図11を参照すると、ホモサピエンスCD8a分子(CD8A)転写産物バリアント1(配列番号30に記載されるアミノ酸配列および配列番号31に記載されるヌクレオチド配列を有する)のリーダー配列11を、PEP2−2−1−1結合ペプチド12(配列番号32に記載されるアミノ酸配列および配列番号35に記載されるヌクレオチド配列を有する)のN末端に連結させることによって、抗原認識ドメインを調製した。
[0237]設計したPEP2−2−1−1、PEP2−472−2、およびPEP2−2−12 CARのヌクレオチド配列を、遺伝子ブロック技術(gBlock(商標)Gene Fragments−Integrated DNA Technologies、Iowa、USA)を使用して構築し、ギブソンアセンブリクローニングキット(New England Biolabs inc.Ipswich MA、USA−カタログ番号E5510S)を製造業者の説明書に従って使用して、アセンブルした。クローニングベクター(制限部位を含む)に組み込むためのPEP2−2−1−1、PEP2−472−2、またはPEP2−2−12 CARのヌクレオチドコンストラクトの配列は、それぞれ、配列番号35、36、および37に記載されている。
[0241]上述の3つのCARコンストラクトのそれぞれのライゲーションミックスを、製造業者の説明書に従って、化学的にコンピテントなSURE2細胞(Agilent)に形質転換した。概要:
− SURE2細胞を、氷上で解凍した。解凍した後、細胞を、緩徐に混合し、100μlの細胞アリコートを、予備冷却した14mlの丸底チューブに入れた。
− 2μlのβ−メルカプトエタノールを、各細胞アリコートに添加した。
− チューブを混合し、氷上で10分間インキュベートし、2分ごとに緩徐に旋回させた。
− 0.1〜50ngの各pCDH−CARベクターを、細胞アリコートに添加した。
− アリコートを緩徐に混合した後、氷上で30分間インキュベートした。
− チューブを、水浴において30秒間42℃で熱パルス処理した後、氷上で2分間インキュベートした。
− 0.9mlの予備加熱した(42℃)NZY+培養液を、各チューブに添加した後、225〜250rpmで激しく混ぜながら37℃で1時間インキュベートした。
− 最大200μlの形質転換混合物を、抗生物質を含有するLB寒天プレートに入れた後、37℃で終夜インキュベートした。
− コロニーを採取し、さらに終夜培養した。
− プラスミドDNAを、Quicklyseミニプレップキット(QIAGEN)を用いて培養クローンから単離し、EcoRI/Not I消化により消化させて、適切なサイズのCAR−pCDHベクターを有するクローンを特定した。
[0246]一過的にトランスフェクトしたHek293T細胞において、リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を標準的な研究室プロトコールに従って使用して、レンチウイルスのパッケージングを行った(Brown,C.Y.ら、2010.Robust,reversible gene knockdown using a single lentiviral short hairpin RNA vector.Hum Gene Ther 21,1005−1017)。概要:
− 12.5ugのレンチウイルスベクターDNAを、T75cmフラスコにおいて、トランスフェクション1回当たり、3.75ugのpMD2.g(VSV−Gエンベロープ発現ベクター)、6.25ugのpRSV−Rev、および7.5ugのpCMVdelta8.2と、75ulのリポフェクチンを製造業者のプロトコールに従って使用して混合し、終夜インキュベートした。
− 翌朝、培地を取り替え、ウイルスを含む上清を、48時間後に採取した。
− 採取した上清を、300×gで5分間遠心分離した後、0.45umのフィルターを通して濾過した。
− 濾過した上清からのウイルス粒子を、超遠心分離(68,000×gで90分間、4℃、Beckman SW32ローター)によって濃縮した。上清を除去し、ウイルスペレットを、氷上でDMEM中に緩徐に再懸濁させた。
− 100ulのウイルスアリコートを、必要になるまで−70℃で保管した。
抗nf−P2X7CARを発現するCD8 T細胞の産生
[0249]以下の方法に従って、ヒトCD8細胞を精製し、形質導入した。
nf−P2X7受容体または野生型(WT)P2X7受容体を発現する標的細胞の産生
[0253]抗nf−P2X7−CARを発現するCD8細胞の有効性を評価するために、非機能性P2X7受容体(K193A変異を有する)または野生型のP2X7受容体の細胞外ドメインのいずれかを細胞表面に過剰発現するHek293T細胞を、調製した。
− まず、attB隣接DNAフラグメント(EXD2_K193A、配列番号47、およびEXD2_WT、配列番号48)と、attP含有pDONR−107ベクターとの間でBP組換え反応を行って、エントリークローンを生成した。BP組換え反応を使用して、化学的にコンピテントなE.cloni(登録商標)10G細胞(Lucigen(登録商標))を製造業者のプロトコールに従って形質転換した。
− 形質転換した細胞を、50ug/mlのカナマイシン(Sigma)を含有するLB寒天プレートに播種し、37℃で終夜インキュベートした。
− 各プレートから2つのクローンを選択して、カナマイシン(SIGMA)(50ug/ml)を有するLB培養液中で微量培養物(2mL)を調製した。37℃で終夜インキュベーションの後、撹拌を行った。
− 翌日、QIAGEN QuickLyseミニプレップキットを使用して、微量培養物からプラスミドDNAを抽出した。
− 診断用Bam H1−HF(NEB)およびPmel(NEB)消化を行って、組換えクローンを特定した。Bam H1およびBam H1/PmeI消化した後、ゲル電気泳動(図18)によって、EXD2_K193AおよびEXD2_WTクローンの両方が、正しく消化されたことを確認した。
− 形質転換した細胞を、100ug/mlのアンピシリン(SIGMA)を含有するLB寒天プレートに播種し、37℃で終夜インキュベートした。
− 各プレートから6個のクローンを選択して、アンピシリン(50ug/ml)を有するLB培養液中に微量培養物(2mL)を調製し、これを、撹拌しながら37℃で終夜インキュベートした。
− 翌日、プラスミドDNAを単離し、Bam H1消化を行って、組換えクローンを特定した。組換えクローンは、適切なサイズの3つのバンド(3431、1056、および5844bp、図19を参照されたい)の存在によって特定した。図19において見ることができるように、各プレートから選択された6つすべてのクローンで、適切なサイズの制限酵素処理フラグメントが得られた。
− EXD2_K193AまたはEXD2_WTを含有するpLV−416コンストラクトを形質導入した2つのクローンを、表7に記載されるプライマーで配列決定して、コンストラクトが適切であったことを確認した。
− HEK293細胞を、トランスフェクションの前日に播種した(フラスコ1つ当たり7×106個の細胞)。
− HEK293T細胞に、レンチウイルスパッケージングベクター、ならびにpLV−416−EXD2およびpLV−416−EXD2_WTのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション効率をモニタリングするために、GFP発現プラスミド(1ug)も含んだ。
− 終夜インキュベートした後、トランスフェクション試薬を含有する培地を除去し、10mlの新しい培地(10%FCSを含むDMEM)と置き換えた。10mlの培地を、24時間後に採取し、必要になるまで−80℃において2mlのアリコートで保管した。別の10mlの新しい培地(10%FCSを含むDMEM)をフラスコに添加し、これを、さらに24時間後に採取した。
− ウイルス粒子を、1200rpmで培地を遠心分離することによって、採取した培地から単離した後、0.45umのフィルターに通して濾過した。ウイルス粒子とともに、濾過した培地を、HEK293細胞のトランスフェクションに使用した。
− HEK293細胞を、形質導入の前日に、T25フラスコに播種した(フラスコ1つ当たり7×105個の細胞)。
− 翌日に、培地を各フラスコから除去し、上述のプロトコールに従って生成したウイルス粒子を含有する新しい培地を、表8に記載される比に従って添加した。
− 8ug/mLの最終濃度まで、各フラスコにポリブレンを添加した。
− 対照pLV−411−GFPウイルスを形質導入したHEK293T細胞を、形質導入後72時間、GFP発現に関してモニタリングした(図21を参照されたい)。
− 形質導入していない細胞は、すべてが、G418補充培地で培養した4日後に死滅した。形質導入した細胞株は、G418を含む培地で正常に成長を続けた。
[0262]nf−P2X7−CARの機能性を評価するために、PEP2−2−1−1またはPEP2−472−2 CARコンストラクト(上述のように調製)のそれぞれを形質導入したCD8細胞を、96ウェルの丸底培養プレートにおいて、nf−P2X7受容体を発現する1×104個の標的細胞(上述のように調製)および非機能性P2X7受容体を発現するMDA−MB−231乳がん細胞(231 P2X7細胞)とともに、1:1の比で4時間共培養した。
− 45分前から4時間、100μlの標的細胞につき10μlの溶解溶液(10倍)を各ウェルに添加した。
− さらに45分後、プレートを250×gで4分間遠心分離した。
− 各ウェルから50μlのアリコートを採取し、96ウェルの平底プレートに移した。
− 移したアリコートを含むプレートの各ウェルに、50μlのCytoTox 96(登録商標)試薬を添加し、プレートを、室温で30分間、ホイルで覆った。
− 30分後に、50μlの停止溶液を各ウェルに添加し、490nmでの吸光度を各ウェルから読み取った。
発明の態様
[態様1]抗原認識ドメインとシグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体であって、抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体を認識する、キメラ抗原受容体。
[態様2]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体のアデノシン三リン酸(ATP)結合部位と関連するエピトープを認識する、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
[態様3]機能障害性P2X7受容体が、野生型(機能性)P2X7受容体のATP結合能力と比較して低減されたATPに結合する能力を有する、請求項1または2に記載のキメラ抗原受容体。
[態様4]機能障害性P2X7受容体が、受容体を機能障害性にする立体配置の変化を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様5]立体配置の変化が、アミノ酸のトランス配置からシス配置への変化である、請求項4に記載のキメラ抗原受容体。
[態様6]トランス配置からシス配置へ変化したアミノ酸が、機能障害性P2X7受容体のアミノ酸210位のプロリンである、請求項5に記載のキメラ抗原受容体。
[態様7]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体のアミノ酸210位のプロリンを含むエピトープを認識する、請求項1から6のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様8]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体のアミノ酸200位のグリシンからアミノ酸216位システインにわたる1つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープを認識する、請求項1から7のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様9]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体に結合する抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様10]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体に結合する抗体の抗原結合フラグメント(Fab)部分のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様11]前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項9または10に記載のキメラ抗原受容体。
[態様12]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体に結合する一本鎖可変フラグメント(scFv)のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様13]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体に結合する多価一本鎖可変フラグメント(scFv)のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様14]多価一本鎖可変フラグメント(scFv)が、二価scFvまたは三価scFvである、請求項13に記載のキメラ抗原受容体。
[態様15]抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体に結合する単一抗体ドメイン(sdAb)のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様16]シグナル伝達ドメインが、活性化受容体に由来する部分を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様17]活性化受容体が、CD3共受容体複合体のメンバーである、請求項16に記載のキメラ抗原受容体。
[態様18]CD3共受容体複合体に由来する部分が、CD3−ζである、請求項17に記載のキメラ抗原受容体。
[態様19]活性化受容体が、Fc受容体である、請求項16に記載のキメラ抗原受容体。
[態様20]Fc受容体に由来する部分が、FcεRIまたはFcγRIである、請求項19に記載のキメラ抗原受容体。
[態様21]シグナル伝達ドメインが、共刺激性受容体に由来する部分を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様22]シグナル伝達ドメインが、活性化受容体に由来する部分と、共刺激性受容体に由来する部分とを含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
[態様23]共刺激性受容体が、CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4−1BB(CD137)、およびICOSからなる群から選択される、請求項21または22に記載のキメラ抗原受容体。
[態様24]請求項1から23のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
[態様25]請求項24に記載の核酸分子を含む、核酸コンストラクト。
[態様26]核酸分子の発現が、転写制御配列の制御下にある、請求項25に記載の核酸コンストラクト。
[態様27]転写制御配列が、構成的プロモーターである、請求項26に記載の核酸コンストラクト。
[態様28]転写制御配列が、誘導性プロモーターである、請求項26に記載の核酸コンストラクト。
[態様29]内部リボソーム進入部位(IRES)をさらに含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
[態様30]核酸コンストラクトが、ベクターである、請求項25から29のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
[態様31]ベクターが、ウイルスベクターである、請求項30に記載の核酸コンストラクト。
[態様32]請求項1から23のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む、遺伝子改変された細胞。
[態様33]2つまたはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体を含む、請求項32に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様34]請求項24に記載の核酸分子、または請求項25から31のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト、または前記核酸コンストラクトのゲノム組込み形態を含む、遺伝子改変された細胞。
[態様35]核酸分子または核酸コンストラクトが、2つまたはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体をコードする、請求項34に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様36]2つまたはそれ以上の異なるキメラ抗原受容体が、異なるシグナル伝達ドメインを有する、請求項33または35に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様37]活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体と、共刺激性受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体とを含む、請求項32から36のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様38]活性化受容体が、CD3共受容体複合体のメンバーであるか、またはFc受容体である、請求項37に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様39]共刺激性受容体が、CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4−1BB(CD137)、およびICOSからなる群から選択される、請求項37または38に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様40]共刺激性受容体を構成的に発現するようにさらに改変される、請求項32から36のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様41]共刺激性受容体のリガンドを発現し、それによって細胞の自己刺激が促進されるように、さらに改変される、請求項40に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様42]サイトカインを分泌するようにさらに改変される、請求項32から41のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様43]サイトカインが、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−17、およびIL−21、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項42に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様44]白血球である、請求項32から43のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様45]末梢血単核細胞(PBMC)である、請求項32から44のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様46]リンパ球である、請求項32から45のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様47]T細胞である、請求項32から46のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様48]T細胞が、CD4+T細胞である、請求項47に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様49]T細胞が、CD8+T細胞である、請求項47に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様50]ナチュラルキラー細胞である、請求項32から46のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様51]ナチュラルキラーT細胞である、請求項32から46のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
[態様52]機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を殺滅させる方法であって、機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変された細胞に曝露するステップを含み、キメラ抗原受容体が、機能障害性P2X7受容体に方向付けられている、方法。
[態様53]キメラ抗原受容体が、機能障害性P2X7受容体を直接的に認識する、請求項52に記載の方法。
[態様54]キメラ抗原受容体が、機能障害性P2X7受容体を、仲介物を介して認識する、請求項52に記載の方法。
[態様55]仲介物が、機能障害性P2X7受容体に結合するプローブであり、キメラ抗原受容体が、プローブを認識する、請求項54に記載の方法。
[態様56]機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を、プローブに曝露するステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
[態様57]プローブが、抗体またはアプタマーである、請求項55または56に記載の方法。
[態様58]プローブが、タグを含み、キメラ抗原受容体が、タグを認識する、請求項55から57のいずれか一項に記載の方法。
[態様59]機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を殺滅させる方法であって、機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を、請求項32から51のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞に曝露するステップを含む、方法。
[態様60]機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を、外因性サイトカインに曝露するステップをさらに含む、請求項52から59のいずれか一項に記載の方法。
[態様61]遺伝子改変された細胞が、機能障害性P2X7受容体を発現する細胞にとって自己である遺伝子改変された細胞である、請求項52から60のいずれか一項に記載の方法。
[態様62]機能障害性P2X7受容体を発現する細胞が、対象の体内にある、請求項52から61のいずれか一項に記載の方法。
[態様63]機能障害性P2X7受容体を発現する細胞が、がん細胞である、請求項52から62のいずれか一項に記載の方法。
[態様64]がん細胞が、脳のがん、食道がん、口腔がん、舌がん、甲状腺がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、上皮細胞がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、および精巣がんのうちの1つまたは複数から選択される、請求項63に記載の方法。
[態様65]がん細胞が、肺がん、食道がん、胃がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、膣がん、上皮細胞がん、皮膚がん、血液関連のがん、乳がん、子宮内膜がん、子宮がん、および精巣がんのうちの1つまたは複数から選択される、請求項63に記載の方法。
[態様66]がんが、転移性である、請求項63から65のいずれか一項に記載の方法。
[態様67]がんが、ステージIIIのがんである、請求項63から66のいずれか一項に記載の方法。
[態様68]がんが、ステージIVのがんである、請求項63から66のいずれか一項に記載の方法。
[態様69]請求項32から51のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を、インビトロで増殖させる方法であって、前記細胞を、キメラ抗原受容体の抗原に曝露するステップを含む、方法。
[態様70]前記細胞を、サイトカインに曝露するステップをさらに含む、請求項69に記載の方法。
[態様71]請求項32から51のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を、インビトロで増殖させる方法であって、前記細胞を、キメラ抗原受容体の抗原に曝露し、同時に前記細胞をサイトカインに曝露するステップを含む、方法。
[態様72]サイトカインが、IL−2サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、IL−10サブファミリー、IL−1サブファミリー、IL−17サブファミリー、またはTGF−βサブファミリーのメンバーである、請求項70または71に記載の方法。
[態様73]サイトカインが、IFN−γ、IL−2、IL−5、IL−7、IL−8、IL−10、IL−12、IL−13、IL−15、IL−17、IL−18、TNF−α、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、およびGM−CSF、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項70または71に記載の方法。
[態様74]請求項32から51のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を、インビトロで増殖させる方法であって、前記細胞を、固定化された抗CD3抗体および抗CD28抗体に曝露するステップを含む、方法。
[態様75]請求項32から51のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[態様76]サイトカインをさらに含む、請求項75に記載の医薬組成物。
[態様77]サイトカインが、IL−2サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、IL−10サブファミリー、IL−1サブファミリー、IL−17サブファミリー、またはTGF−βサブファミリーのメンバーである、請求項76に記載の医薬組成物。
[態様78]サイトカインが、IFN−γ、IL−2、IL−5、IL−7、IL−8、IL−10、IL−12、IL−13、IL−15、IL−17、IL−18、TNF−α、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、およびGM−CSF、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項76に記載の医薬組成物。
[態様79]仲介物をさらに含む、請求項75から78のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[態様80]仲介物が、機能障害性P2X7受容体に結合するプローブであり、キメラ抗原受容体が、プローブを認識する、請求項79に記載の医薬組成物。
[態様81]プローブが、抗体またはアプタマーである、請求項80に記載の医薬組成物。
[態様82]プローブが、タグを含み、キメラ抗原受容体が、タグを認識する、請求項80または81に記載の医薬組成物。
Claims (19)
- 機能障害性P2X7受容体を認識する抗原認識ドメインと、
ここで機能障害性P2X7受容体は、野生型(機能性)P2X7受容体のATP結合能力と比較して低減されたATPに結合する能力を有し、機能障害性P2X7受容体は、受容体を機能障害性にする立体配置の変化を有し、立体配置の変化は、P2X7受容体のアミノ酸210位のプロリンのトランス配置からシス配置への変化である、
膜貫通ドメインと
活性化受容体の細胞内シグナル伝達部分および/または共刺激受容体の細胞内シグナル伝達部分を含むシグナル伝達ドメインと
を含むキメラ抗原受容体。 - 抗原認識ドメインが、抗体の抗原結合部位または抗体のフラグメントの抗原結合部位に配列相同性を有する部分を含む、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
- 抗原認識ドメインが、少なくとも、抗体の重鎖または抗体の軽鎖由来の相補性決定領域1(CDR1)、CDR2およびCDR3に配列相同性を有する部分を含む、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
- 抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体のアデノシン三リン酸(ATP)結合部位と関連するエピトープを認識する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 抗原認識ドメインが、機能障害性P2X7受容体のアミノ酸210位のプロリンを含むエピトープを認識する、請求項1から4のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 活性化受容体が、CD3共受容体複合体のメンバーおよび/またはFc受容体であり、かつ/または共刺激性受容体が、CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4−1BB(CD137)、およびICOSからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
- 請求項7に記載の核酸分子を含む、核酸ベクター。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、または請求項7に記載の核酸分子、または請求項8に記載の核酸ベクターを含む、遺伝子改変された細胞。
- 白血球、末梢血単核細胞(PBMC)、リンパ球、T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルキラーT細胞である、請求項9に記載の遺伝子改変された細胞。
- 機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を殺滅させる方法における使用のための請求項9または10に記載の遺伝子改変された細胞であって、該方法は、機能障害性P2X7受容体を発現する細胞を、該遺伝子改変された細胞に曝露するステップを含む、前記遺伝子改変された細胞。
- 機能障害性P2X7受容体を発現する細胞にとって自己である、請求項11に記載の遺伝子改変された細胞。
- 機能障害性P2X7受容体を発現する細胞が、がん細胞である、請求項11に記載の遺伝子改変された細胞。
- がんの治療のための医薬の製造における、請求項9または10に記載の遺伝子改変された細胞の使用。
- がん細胞が、脳のがん、食道がん、口腔がん、舌がん、甲状腺がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、上皮細胞がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、および精巣がんのうちの1つまたは複数から選択される、請求項11〜13のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
- ウイルスベクターの調製のための、請求項7に記載の核酸分子、または請求項8に記載の核酸ベクター。
- 宿主細胞のウイルス形質導入のための、請求項7に記載の核酸分子を含むウイルスベクター、または請求項8に記載の核酸ベクター。
- 請求項9または10に記載の遺伝子改変された細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- がん細胞が、脳のがん、食道がん、口腔がん、舌がん、甲状腺がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、上皮細胞がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、および精巣がんのうちの1つまたは複数から選択される、請求項14に記載の使用。
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