BR112012015561B1

BR112012015561B1 - anticorpos dirigidos contra receptores p2x7 oligoméricos não funcionais

Info

Publication number: BR112012015561B1
Application number: BR112012015561-0A
Authority: BR
Inventors: Gidley-Baird Angus; Ronald Pilkington Glenn; Alexander Barden Julian
Original assignee: Biosceptre International Ltd
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2019-11-12
Also published as: JP2013515013A; EP3321285A1; JP5992831B2; AU2010336032B2; AU2010336032A1; ES2732021T3; BR112012015561A8; CA2784345A1; WO2011075789A1; ES2667003T3; EP2516470A4; CN102762595B; US8835609B2; US20150218283A1; AU2010336032C1; CA2784345C; US20120329076A1; CN102762595A; EP2516470B1; US9428587B2

Abstract

anticorpos dirigidos contra receptores p27x7 oligoméricos não funcionais. a invenção se refere a receptores purinérgicos, a anticorpos e seus fragmentos relacionados para ligação aos referidos receptores, à produção dos referidos anticorpos e fragmentos e ao uso dos referidos anticorpos e fragmentos para detecçã de câncer e terapia anticâncer. em partcular, os anticorpos descritos sse ligam especificamente aos receptores p2x7 não funcionais expressos por células vivas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA RECEPTORES P2X7 OLIGOMÉRICOS NÃO FUNCIONAIS.

Campo da invenção

A invenção refere-se a receptores purinérgicos, a anticorpos e seus fragmentos relacionados para ligação aos referidos receptores e fragmentos e ao uso dos referidos anticorpos e fragmentos para a detecção de câncer e terapia anticâncer.

Antecedentes da invenção

Referência a qualquer técnica anterior na memória descritiva não é, e não deve ser tomada como reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que esta técnica anterior faz parte do conhecimento geral comum na Austrália ou qualquer outra jurisdição ou que se pode esperar que esta técnica anterior seja razoavelmente certificada, compreendida e considerada como relevante por um especialista na técnica.

Os receptores purinérgicos (P2X) são canais seletivos para cátions ATP dependentes. Cada receptor é constituído por três subunidades de proteínas ou monômeros. Até o momento foram identificados sete genes separados que codificam os monômeros P2X: Ρ2Χι, P2X₂, P2X3, P2X4, P2X₅, P2X₆, P2X₇.

Os receptores P2X₇ são de particular interesse uma vez que se entende que a expressão destes receptores deve ser limitada a células que possuem potencial de se submeter a morte celular programada, tais como os timócitos, células dendríticas, linfócitos, macrófagos e monócitos. Existe alguma expressão de receptores P2X₇ na homeostase normal, tais como nos eritrócitos.

Curiosamente, um receptor P2X₇ que contém um ou mais monômeros com uma isomerização cis em Pro210 (de acordo com a SEQ ID NO: 1) e que é destituído da função de ligação do ATP foi encontrado em células que se entende são capazes de serem submetidas à morte celular programada, tais como as células pré-neoplásicas e células neoplásicas. Esta isoforma do receptor foi referida como um receptor não funcional.

2/93

Os anticorpos gerados a partir de imunização com um peptídeo que inclui Pro210 em cis se ligam a receptores P2X₇ não funcionais. No entanto, os mesmos não se ligam a receptores P2X₇ capazes de ligação de ATP. Assim, estes anticorpos são úteis para detectar seletivamente muitas formas de carcinoma e cânceres hematopoiéticos e para o tratamento de algumas destas doenças.

Os documentos W002/057306A1 e W003/020762A1 discutem uma sonda para distinguir entre receptores P2X₇ funcionais e receptores P2X₇ não funcionais sob a forma de um anticorpo monoclonal.

Até à data, tem sido muito difícil a obtenção de reagentes serológicos que se ligam a receptores P2X₇ não funcionais em células vivas com afinidade desejável. Os reagentes de afinidade mais elevada são geralmente desejáveis em aplicações para a detecção e tratamento do câncer.

Existe uma necessidade de reagentes melhorados para a ligação a receptores P2X₇, particularmente para novos anticorpos e seus respectivos fragmentos que são capazes de discriminar entre receptores P2X₇que se ligam ou não se ligam ao ATP em células vivas. Existe também uma necessidade de anticorpos e seus fragmentos que exibam ligação preferencial a um receptor P2X₇, como é expresso em células vivas com capacidade reduzida para se ligar a um receptor P2X₇ uma vez que a célula alvo morreu.

Sumário da invenção

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 1.

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

a CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de:

(carregada/polar/aromática)carregada/aromática)XXXY (aromá3/93 tica/alifática)(carregada/neutra)(neutra/alifática).

Por toda a memória descritiva X representa qualquer aminoácido.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 2:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: N(Y/F)XXXY(Y/F)EX.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 3:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: N(Y/F) (neutra)(carregada)(neutra)Y(Y/F)E(neutra).

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 4:

FR1 -CDR1 -FR2 - CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de com4/93 plementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: NFLESYFEA.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 5:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: N(Y/F) (carregada)(neutra)(carregada)Y(Y/F)E(neutra).

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 6:

FR1 -CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 ê CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: NYRGDYYET.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 7:

FR1-CDR1-FR2 - CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

5/93 em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: H (aromática)XXXYYN I.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 8:

FR1-CDR1-FR2 - CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: H(YF)(neutra)(carregada)(carregada)YYNI.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 9:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: H(Y/F) (neutra)(carregada)(neutra)YYNL

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 10:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de com6/93 plementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: HYSKEYYNI.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 11:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: HFQRGYYNI.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 12:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: (Y/N)(aromática)XXXYY(carregada)(neutra).

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 13:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

7/93

	em que: CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: (Y/N) (aromática)(neutra)(neutra)(neutra)YYDV. Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao an-
5	tígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 14: FR1-CDR1-FR2 - CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que: FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;
10	CDR1, COR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade; em que:
-	CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: (Y/N)(aromática)(neutra)(neutra)(neutra) YYEV.
15	Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao an-
	tígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 15:
	FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:
20	FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework; CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de Complementaridade; em que: CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: YFPLVYYDV.
25	Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 16: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:
30	FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework; CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

8/93 em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: NYLPMYYEV.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 17:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: Y(carregada)XXXY(neutra)(neutra)(neutra).

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 18:

FR1 -CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: YHVIQYLGP.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 19:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

9/93

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: HYSSRFFDV, NFKLMYYNV, NYRGDYYET, HFSRGYYDV, NFLESYFEA, NYLPMYYEV, HYIKVYYEA, HYSSRFFEV, NFRVMFFKA, HFQRGYYNI, HYSSRFFEV, YHVIQYLGP, HYSKEYYNI, YFPLVYYDV, DFTVPFYNA, NYDKKYFDV, YFPLVYYDV.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 20:

FR1-CDR1-FR2 - CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR1 tem uma sequência de aminoácidos de KASQNVGTNVA.

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de qualquer modalidade anterior que descreve uma sequência de CDR3.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 21:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR1 tem uma sequência de aminoácidos de SYYMS.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 22:

10/93

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR2 tem uma sequência de aminoácidos de SASFRYS.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 23:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR2 tem uma sequência de aminoácidos de AINSNGGSTYYPDTVKG.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para a ligação um receptor P2X7, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 24:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR1 tem uma sequência de aminoácidos de KASQNVGTNVA.

11/93

CDR2 tem uma sequência de aminoácidos de SASFRYS

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 25:

FR1-CDR1-FR2 - CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR1 tem uma sequência de aminoácidos de SYYMS.

CDR2 tem uma sequência de aminoácidos de AINSNGGSTYYPDTVKG.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno de acordo com qualquer modalidade descrita acima, em que FR1 é MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC ou DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno de acordo com qualquer modalidade descrita acima, em que FR2 é WYQQKPGQSPKALIY ou WVRQTPEKRLELVA.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno de acordo com qualquer modalidade descrita acima, em que FR3 é GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC ou RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTR.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno de acordo com qualquer modalidade descrita acima, em que FR4 é FGSGTRLEIK ou WGAGTTVTVSS.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao an

12/93 tígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 26:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 - ligante -FR1aCDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a em que:

FR1, FR2, FR3, FR4, FR1a, FR2a, FR3a e FR4a são cada regiões framework;

CDR1, CDR2, CDR3, CDR1a, CDR2a, CDR3a são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR1 tem uma sequência de aminoácidos de KASQNVGTNVA.

CDR2 tem uma sequência de aminoácidos de SASFRYS.

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de qualquer modalidade anterior que descreve uma sequência de CDR3 ou QQYNSYPFT.

CDR1a tem uma sequência de aminoácidos de SYYMS.

CDR2a tem uma sequência de aminoácidos de AINSNGGSTYYPDTVKG.

CDR3a tem uma sequência de aminoácidos de qualquer modalidade anterior que descreve uma sequência de CDR3 ou QQYNSYPFT (SEQ ID NO: 33) quando CDR3 é uma sequência de aminoácidos de qualquer modalidade anterior que descreve uma sequência de CDR3.

FR1 tem uma sequência de aminoácidos de MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC (SEQ ID NO: 25).

FR2 tem uma sequência de aminoácidos de WYQQKPGQSPKALIY (SEQ ID NO: 26).

FR3 tem uma sequência de aminoácidos de GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC (SEQ ID NO: 27).

FR4 tem uma sequência de aminoácidos de FGSGTRLEIK (SEQ ID NO: 28).

FR1a tem uma sequência de aminoácidos de DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 29).

FR2a tem uma sequência de aminoácidos de VWRQTPEKR

13/93

LELVA (SEQ ID NO: 30).

FR3a tem uma sequência de aminoácidos de RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTR (SEQ ID NO: 31).

FR4a tem uma sequência de aminoácidos de WGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 32).

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 27:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de:

(carregada/polar/aromática)(aromática) (carregada/neutra)(carregada)(carregada/neutra)Y(aromática) (carregada)(neutra).

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 28:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de:

(carregada/polar/aromática)(F/Y)(carregada/neutra)(R/K)(carregada/neutra)(Y)(Y/F)( E/F)V.

Em uma modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao an

14/93 tígeno para ligação a um receptor P2X₇, o sítio de ligação ao antígeno sendo definido pela fórmula geral 30:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 em que:

FR1, FR2, FR3 e FR4 são cada regiões framework;

CDR1, CDR2 e CDR3 são cada regiões determinantes de complementaridade;

em que:

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos de: (H/N)(F/Y)(S/D)(R/K)(G/K)Y(Y/F)DV.

Em uma modalidade, o ligante de fórmula geral 26 tem uma sequência de aminoácidos de 15 resíduos de aminoácidos. Tipicamente, o ligante compreende predominantemente glicina e resíduos de serina. De preferência, o ligante é GGGGSGGGGSGGGGS.

Em uma modalidade, o sítio de ligação ao antígeno da invenção tem uma sequência de aminoácido de CDR3 que compreende HFSRGYYDV ou NYDKKYFDV.

Em uma modalidade, o sítio de ligação ao antígeno da invenção tem uma sequência de aminoácido CDR3 que consiste em HFSRGYYDV ou NYDKKYFDV.

Em outras modalidades, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno que tem uma sequência tal como aqui descrito, ou que inclui uma sequência de CDR e/ou FR como aqui descrito e que inclui uma ou mais mutações para aumentar a afinidade do referido sítio para ligação a um receptor P2X₇.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno tal como aqui descrito em que uma sequência de aminoácidos que forma uma ou mais de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 é uma sequência humana.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno como aqui descrito em que uma sequência de aminoácidos que forma uma ou mais de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 é uma

15/93 sequência de canino ou felino.

O sítio de ligação ao antígeno pode ser modificado para ter sequências a partir de um animal em particular, por exemplo, pode ser quimérico (isto é, contendo algumas mas não todas as sequências encontradas no indivíduo que recebe o anticorpo). Alternativamente, pode consistir em sequências alogênicas ou isogênicas. Um exemplo destas últimas é um anticorpo de cão para uso no tratamento de um cão.

O animal do qual o anticorpo é derivado pode incluir um animal doméstico, animal de estimação ou animais de produção, incluindo cães, gatos, vacas, porcos, cavalos e ovelhas.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um domínio variável de imunoglobulina antirreceptor P2X₇, anticorpo, Fab, dab, scFv incluindo um sítio de ligação ao antígeno que tem uma sequência tal como aqui descrito, ou que inclui uma sequência de CDR e/ou FR como aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um diacorpo (diabody) ou triacorpo (triacorpo) que inclui um sítio de ligação ao antígeno que tem uma sequência tal como aqui descrito, ou que inclui uma sequência de CDR e/ou FR como aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado uma proteína de fusão que inclui um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo ou triacorpo como aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um conjugado sob a forma de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo ou proteína de fusão tal como aqui descrito, conjugados a um rótulo ou um agente citotóxico.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um anticorpo para ligação a um sítio de ligação ao antígeno de um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, ou conjugado ou como aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um ácido nucleico que codifica um sítio de ligação ao antígeno, ou uma sequência de CDR

16/93 e/ou FR tal como aqui descrito, ou um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado como aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um vetor que inclui um ácido nucleico aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionada uma célula que inclui um vetor ou ácido nucleico aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um animal ou tecido derivados dos mesmos, incluindo uma célula aqui descrita.

Em uma outra modalidade, é proporcionada uma composição farmacêutica que inclui um sítio de ligação ao antígeno, ou que inclui uma sequência de CDR e/ou FR como aqui descrito, ou um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, ou conjugado como aqui descrito e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em uma outra modalidade, é proporcionada uma composição de diagnóstico que inclui um sítio de ligação ao antígeno, ou que inclui uma sequência de CDR e/ou FR como aqui descrito, ou um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado como aqui descrito, um diluente e opcionalmente um rótulo.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um kit ou artigo de fabricação, que inclui um sítio de ligação ao antígeno, ou que inclui uma sequência de CDR e/ou FR, tal como aqui descrito, ou um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado como aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um uso de uma sequência de acordo com um ou mais de CDR1, CDR2, FR1, FR2, FR3 e FR4, como aqui descrito para produzir um sítio de ligação ao antígeno para a ligação a um receptor P2X₇.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um uso de um sítio de ligação ao antígeno ou uma sequência de CDR e/ou FR como aqui des

17/93 crito para produzir um sítio de ligação ao antígeno antirreceptor P2X₇ que tem afinidade aumentada para o receptor P2X₇.

Em uma outra modalidade, é proporcionada uma biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos produzidos a partir da mutação de um sítio de ligação ao antígeno ou uma sequência de CDR e/ou FR como aqui descrito, em que pelo menos uma molécula de ácido nucleico na referida biblioteca codifica um sítio de ligação ao antígeno para a ligação a um receptor P2X₇.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para produzir um sítio de ligação aoantígeno anti-P2X₇ como aqui descrito, que inclui expressar um ácido nucleico tal como aqui descrito em uma célula ou animal, como aqui descrito.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para o tratamento de câncer ou de um estado ou doença associados com a expressão do receptor P2X₇ não funcional em um indivíduo, incluindo a etapa de proporcionar um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição farmacêutica como aqui descrito a um indivíduo com necessidade de tratamento para o câncer ou o referido estado ou doença.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um uso de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição farmacêutica como aqui descrito na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer ou de um estado ou doença associados com a expressão do receptor P2X₇ não funcional.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição farmacêutica como aqui descrito para o tratamento de câncer ou de um estado ou doença associados com a expressão do receptor P2X₇ não funcional.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para o diagnóstico de câncer ou doença ou estado associados com a expressão do receptor P2X7 não funcional, que inclui a etapa de colocar tecidos ou células

18/93 para os quais a presença ou ausência de câncer será determinada em contato com um reagente sob a forma de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição de diagnóstico como aqui descrito e detectar a ligação do reagente com os tecidos ou células. O método pode ser operado in vivo ou in vitro.

Tipicamente, os sítios de ligação ao antígeno de acordo com a invenção se ligam a receptores P2X₇ não funcionais, especialmente receptores em que o Pro210 de P2X₇ está na conformação cis. Em certas modalidades os sítios de ligação ao antígeno de acordo com a invenção não se ligam a receptores P2X₇ funcionais, especialmente receptores em que o Pro210 de P2X₇ está na conformação trans.

Tipicamente, os sítios de ligação ao antígeno de acordo com a invenção se ligam a receptores P2X₇ não funcionais em células vivas. Em algumas modalidades, os sítios de ligação ao antígeno não se ligam, ou se ligam com uma afinidade muito baixa ou indetectável a receptores não funcionais em células mortas ou moribundas. Se um sítio de ligação ao antígeno da invenção se liga ou não se liga a um receptor P2X₇ pode ser determinado usando métodos padrão conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, os sítios de ligação ao antígeno de acordo com a invenção se ligam a receptores P2X₇ em células vivas com afinidades (K_D) na faixa de cerca de 1 pM a cerca de 1 μΜ. Tipicamente, quando o sítio de ligação ao antígeno é parte de uma IgM a afinidade para receptores P2X₇em células vivas é entre cerca de 1 pM a cerca de 1 nM, de preferência cerca de 1 pM a cerca de 50 pM. Tipicamente, quando o sítio de ligação ao antígeno é parte de uma IgG a afinidade para receptores P2X₇ em células vivas é entre cerca de 1 pM a cerca de 1 nM, de preferência entre cerca de 1 pM a cerca de 100 pM. Tipicamente, quando o sítio de ligação ao antígeno é parte de um Fab a afinidade para receptores P2X₇ em células vivas é entre cerca de 100 pM a cerca de 100 nM, de preferência cerca de 1 nM a cerca de 100 nM. Tipicamente, quando o sítio de ligação ao antígeno é parte de um scFv a afinidade para receptores P2X₇ em células vivas é entre cerca de

19/93 nM a cerca de 1 μΜ, de preferência cerca de 10 nM a cerca de 100 nM. Tipicamente, quando o sítio de ligação ao antígeno é parte de um dab a afinidade para receptores P2X₇ em células vivas é entre cerca de 10 nM a cerca de 10 μΜ, de preferência cerca de 100 nM até cerca de 1 μΜ.

Em certas modalidades, os sítios de ligação ao antígeno da invenção e as moléculas que compreendem os mesmos são capazes de induzir a apoptose.

Em certas modalidades, os sítios de ligação ao antígeno da invenção e as moléculas que compreendem os mesmos são capazes de induzir a ativação da caspase.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Receptor P2X₇ humano completo (SEQ ID NO: 1).

Figura 2. Uma sequência de domínio extracelular do receptor P2X₇. O receptor P2X₇ (47-306) (SEQ ID NO: 2) (ECD2) é constituído pelos aminoácidos 47 a 306 da SEQ ID NO: 1. Os aminoácidos riscados designam os aminoácidos que são deletados da sequência completa do receptor P2X₇.

Figura 3. Uma sequência de domínio extracelular do receptor P2X₇. O receptor P2X₇ (47-332) (SEQ ID NO: 3) (ECD1) é constituído pelos aminoácidos 47 a 332 da SEQ ID NO: 1. Os aminoácidos riscados designam os aminoácidos que são deletados da sequência completa do receptor P2X₇.

Figura 4. Estrutura do vetor de expressão para 2F6 V_H.

Figura 5. Estrutura do vetor de expressão para 2F6 V[_.

Figura 6. (a) Sequência de 2F6 scFv com His tag (cauda de Histidina) adicionada para detecção (SEQ ID NO: 4). A sequência de 2F6 scFv mostrada tem a seguinte estrutura organizacional (em ordem a partir do Nterminal para o C-terminal) FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 ligante - FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a - AAA epitopo Flag® (DYKDDDDK) - AAA — His tag. (b) Purificação de 2F6 lgG2a recombinante por HPLC por exclusão de tamanho. A lgG2a recombinante foi separada por HPLC e é mostrado um exemplo de cromatograma obtido por HPLC.

Figura 7. ΗΡ-SEC da purificação de 2F6 mlgG2a.

20/93

Figura 8. SDS PAGE mostrando a pureza do produto anticorpo final.

Figura 9. (a) Ensaios de Inibição de Células In Vitro. Constatouse que a forma IgM do anticorpo original à forma do trímero do receptor P2X₇ não funcional expresso em células cancerosas inibe o crescimento de células usando a técnica de coloração Cell Titer Blue Assay. É mostrado um exemplo no qual se observa que o anticorpo IgM de controle não tem qualquer efeito sobre o crescimento celular (colunas da esquerda) para concentrações crescentes de 2,5-40 pg/mL enquanto o 2F6 inibiu o crescimento celular (colunas da direita) com a mesma faixa de dose em um ensaio de crescimento de 3 dias, (b), (c), (d) De modo similar, outros tipos de células foram inibidos por incubação com a forma IgM do anticorpo. O crescimento ao longo de 5 dias é inibido a um maior grau do que ao longo de 3 dias. Os dados de crescimento são traçados em gráfico em relação às curvas de crescimento de controle obtidas utilizando o anticorpo IgM de controle. O crescimento de COLO205 foi inibido de forma significativa ao longo de 3 dias e as células foram eliminadas ao longo de 5 dias, mesmo a uma dose baixa de 2,5 pg/mL. Isto indica que linhas de células diferentes que expressam níveis ligeiramente diferentes de receptor são mais ou menos susceptíveis à ligação ao anticorpo, (e) Em contraste, a forma lgG2a recombinante do anticorpo demonstrou inibição celular mais fraca, como mostrado nas figuras seguintes obtida ao longo de 3 dias. O ensaio de inibição de crescimento celular (Cell Titer Blue) demonstrou que a forma lgG_2a do anticorpo tinha reduzido a inibição do crescimento celular no tumor em comparação com a inibição provocada usando a forma IgM do anticorpo, em conformidade com a afinidade de ligação reduzida da IgG que contém dois domínios de ligação, em vez de dez.

Figura 10. Bloqueio de Reação em Ensaio de Morte Celular. O ensaio de inibição de crescimento celular Cell Titer Blue é usado ao longo de três dias de crescimento celular com a linha de células de câncer da mama MCF-7. Observe-se que as células de controle viáveis na coluna da direita não têm anticorpo ou peptídeo. A coluna da esquerda é o sinal derivado das

21/93 células incubadas com 10 pg/mL do anticorpo 2F6 IgM contendo 500 pg/mL do peptídeo contendo epitopo (o epitope E200-300 descrito como 200/300 na Figura), suficiente para bloquear a inibição do crescimento de células evidenciado pelos dados nas três colunas centrais que mostram que a inibição do crescimento não é afetada pela presença de 50 pg/mL, 5 pg/mL ou 0 pg/mL de peptídeo, respectivamente. A inibição total do crescimento das células ocorre após 5 dias de exposição ao 2F6.

Figura 11. Mecanismo de Morte Celular Induzida por 2F6 com Ativação de caspase 3/7 Associada com a Reativação da Apoptose. Nesta experiência o efeito da droga de controle Gemcitabina é mostrado do lado esquerdo, conhecido por ativar caspases através da indução de apoptose em células cancerosas COLO205. Em contraste, a ausência da droga ou anticorpo não tem qualquer efeito (coluna de células apenas). A presença de IgM de controle em doses até 40 pg/mL, de modo similar, não tem efeito sobre a ativação da caspase, enquanto quantidades crescentes do anticorpo 2F6 mostra um aumento constante na ativação da Caspase 3/7 associada com a indução da apoptose pelo anticorpo ao longo do período de tempo de 3 dias da experiência.

Figura 12. Eliminação Celular Direta por 2F6 IgM. Imagens de microscopia confocal de células MCF-7 na presença de anticorpo IgM de controle (a) é IgM 2F6 (b) durante 24 h.

Figura 13. (a) 2-2-1 hFc ligado a células tumorais 4T1 vivas mostrando alguma ligação membranosa (aumento da obj. 40x). (b) 2-2-1 hFc ligado a células moribundas juntamente com detritos membranosos de células já mortas, (c) 2-2-1 hFc ligado a células tumorais LL vivas mostrando clara ligação membranosa. (d) 2-2-1 hFc ligado a detritos membranosos de células já mortas.

Figura 14. (a) 2F6 hlgG1 ligado a células tumorais 4T1 vivas mostrando clara ligação membranosa (aumento da obj. 40x). (b) 2F6 hlgG1 ligado apenas a células moribundas, (c) 2F6 hlgG1 ligado a células tumorais LL vivas mostrando clara ligação membranosa. (d) 2F6 hlgG1 ligado a células moribundas sem ligação com os glóbulos vermelhos do sangue adjacen

22/93 tes que expressam o receptor P2X₇ capaz de função.

Figura 15. Inibição do número de metástases pulmonares no Dia 14 no modelo de xenoenxerto 4T1 isogênico por 2F6hlgG1. A redução global no volume do tumor foi de 89% com a maioria das metástases no grupo de tratamento muito menores do que no grupo não tratado.

Figura 16. Inibição do número de metástases pulmonares no modelo de xenoenxerto isogênico de tumor pulmonar de Lewis (Lewis Lung, LL) pelo Dia 11. Os cinco grupos são o controle não tratado (Grupo 1), policlonal de ovelha E200-300 a 10 mg/kg (Grupo 2), 2F6hlgG1 a 1 mg/kg (Grupo 3) e a 10 mg/kg (Grupo 4) e Sorafenib a 5 mL/kg por dia (Grupo 5). Tanto o policlonal de ovelhas como o 2F6 hlgG1 foram equipotentes com Sorafenib com 96% de inibição.

Figura 17. Maturação da Afinidade de Sequências CDR3 a partir de 2F6. As sequências de aminoácidos de derivados scFv/Fab maturadas por afinidade referidas como clones mutantes com a sequência do tipo selvagem (WT, wild type) 2F6 CDR3 no topo da lista.

Figura 18. ELISA de IgM, lgG2a e Precursores de Fab. ELISA de Fab Derivado de 2F6 Precursor Maturado por Afinidade (escala 0,01-12,5 pg/mL para IgM e lgG2a; 0,1-100 pg/mL para Fabs). Os valores de EC₅₀ para o IgM original e o lgG2a recombinante foram medidos como sendo 0,14 e 1,6 pg/mL, respectivamente. O Fab WT exibiu um valor de EC₅o muito baixo, enquanto as espécies de Fab maturadas por afinidade precursoras foram selecionadas a partir de rastreio de ScFv (n° 10, n° 21, n° 42 e n° 66) ligadas muito mais firmemente com um EC₅o na faixa de 2-4 pg/mL ou cerca de 125 vezes mais fortes do que o WT, que coincide com a afinidade do anticorpo lgG_2a completamente formado.

Figura 19. (a) Resultados de citometria de fluxo para ligação de Fabs recombinantes a células tumorais COLO205 colorretais. Um anticorpo anti-FLAG Sigma secundário (n° F4049) foi usado para detectar a ligação dos anticorpos primários. O 2F6 Fab WT ligou-se fracamente na mesma faixa de concentração. Os valores de EC₅o para os quatro Fabs precursores são muito semelhantes aos valores obtidos a partir de medições por ELISA.

23/93 (b) Resultados de ligação melhores muito semelhantes foram obtidos para células PC3 da próstata.

Figura 20. Foi feita uma comparação com várias preparações de 2F6 lgG2a recombinante para determinar a força de ligação relativa do anticorpo formatado WT a células PC3 em comparação com os Fabs maturados por afinidade. lgG2a n° 010-001-332 da Rockland foi usado para controle para determinar o fundo (diamante). A ligação do anticorpo WT totalmente formatado foi comparável à ligação suscitada pelos Fabs precursores.

Figura 21. A verificação da falta de ligação ao receptor P2X₇funcional em linfócitos humanos pelos Fabs precursores foi determinada por citometria de fluxo. O anticorpo anti-FLAG n° F4049 Sigma foi usado como o anticorpo secundário. O anticorpo abeam HLA foi usado como controle. Nenhuma ligação foi detectada acima do fundo, tal como determinado pelo sinal apenas secundário na coluna do lado esquerdo. A ordem ou anticorpo primário da esquerda para a direita ao longo do eixo x é a mesma que a ordem da legenda de cima para baixo.

Figura 22. Resultados de citometria de fluxo para ligação de anticorpo policlonal de ovelha purificado de alta afinidade a células PC3 que apresenta ligação significativamente mais forte do que 2F6 hlgG2a WT e indica as melhorias que podem ser esperadas a partir de uma variedade de Fabs maturados por afinidade uma vez convertido em ligantes divalentes IgG.

Descrição detalhada das modalidades

Referência será agora feita em pormenor a certas modalidades da invenção. Embora a invenção seja descrita em conjunto com as modalidades, será entendido que a intenção não é limitar a invenção a essas modalidades. Pelo contrário, a invenção se destina a cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes, que podem ser incluídas dentro do âmbito da presente invenção como definido pelas reivindicações.

Um especialista na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, que poderiam ser usados na prática da presente invenção. A presente invenção não é de modo

24/93 algum limitada aos métodos e materiais descritos.

Será entendido que a invenção divulgada e definida na presente memória descritiva se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais das características individuais mencionadas ou evidentes a partir do texto ou desenhos. Todas estas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos da invenção.

Como aqui utilizado, salvo outra interpretação imposta pelo contexto, o termo compreender e variações do termo, tais como compreendendo, compreende e compreendido, não se destinam a excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.

A invenção proporciona sítios de ligação ao antígeno que são capazes de se ligarem a receptores P2X₇ não funcionais expressos por células vivas. Esses receptores estão em uma forma oligomérica de ordem superior. Esta forma oligomérica é de dois ou mais monômeros receptores P2X₇que se associaram. Tipicamente, a forma oligomérica é um trímero de três monômeros receptores P2X₇. Uma vantagem dos locais de ligação ao antígeno da invenção que ligam formas oligoméricas de P2X₇ de ordem superior é que a captação por formas monoméricas do receptor P2X₇ libertado de células lisadas ou apoptóticas será reduzida em comparação com anticorpos que se ligam apenas a receptores P2X₇ monoméricos.

Para efeitos da interpretação desta memória descritiva, as seguintes definições serão aplicáveis e, sempre que adequado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. No caso em que qualquer definição apresentada entre em conflito com qualquer documento aqui incorporado por referência, a definição apresentada adiante prevalecerá.

Receptorpurinérgico refere-se, de uma maneira genérica, a um receptor que usa uma purina (tal como ATP) como um ligante.

Receptor P2X₇ refere-se, de uma maneira genérica, a um receptor purinérgico formado de três subunidades de proteínas ou monômeros, com pelo menos um dos monômeros tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente como apresentado na SEQ ID NO: 1 (ver Figura 1).

25/93

Receptor Ρ2Χ₇ pode ser um receptor funcional ou não funcional, tal como descrito adiante. O Receptor P2X₇ abrange variantes de ocorrência natural do receptor P2X₇, por exemplo, em que os monômeros P2X₇ são variantes de splicing, variantes alélicos e isoformas incluindo formas truncadas 5 ou secretadas de ocorrência natural dos monômeros que formam o receptor

P2X₇ (por exemplo, uma forma que consiste na sequência de domínio extracelular ou forma truncada da mesma), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas alternativamente spliced) e variantes alélicas de ocorrência natural. Em certas modalidades da invenção, a sequência nativa de 10 polipeptídeos monoméricos de P2X₇ aqui divulgada é constituída por polipeptídeos de sequência nativa madura ou completa que compreende a sequência de aminoácidos completa apresentada na SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades o receptor P2X₇ pode ter uma sequência de aminoácidos que é modificada, por exemplo vários dos aminoácidos na sequência apresentada 15 na SEQ ID NO: 1 podem ser substituídos, deletados, ou um resíduo pode ser inserido.

Receptor P2X₇ funcional refere-se, de uma maneira genérica, a uma forma do receptor P2X₇ que tem um sítio de ligação ou fissura para a ligação ao ATP. Quando ligado ao ATP, o receptor forma uma estrutura se20 melhante a poro que permite o ingresso de íons cálcio dentro do citosol, do qual uma consequência pode ser a morte celular programada. Na homeostase normal, a expressão de receptores P2X₇ funcionais é geralmente limitada a células que sofrem morte celular programada, tais como os timócitos, células dendríticas, linfócitos, macrófagos e monócitos. Pode haver também 25 alguma expressão de receptores P2X₇ funcionais nos eritrócitos.

Receptor P2X₇ não funcional refere-se, de uma maneira genérica, a uma forma de um receptor P2X₇ em que um ou mais dos monômeros tem uma isomerização cis em Pro210 (de acordo com a SEQ ID NO: 1). A isomerização pode surgir a partir de qualquer evento molecular que leva ao 30 dobramento inadequado do monômero, incluindo, por exemplo, a mutação da sequência primária do monômero ou o processamento pós-traducional anormal. Uma consequência da isomerização é que o receptor é incapaz de

26/93 se ligar ao ATP. Nestas circunstâncias, o receptor não pode formar um poro e isto limita a extensão em que os íons cálcio podem entrar no citosol. Os receptores P2X₇ não funcionais são expressas em uma grande variedade de cânceres epiteliais e hematopoiéticos.

Domínio extracelular (ECD) aqui usado são o receptor P2X₇(47-306) (SEQ ID NO: 2, ver Figura 2) (ECD2) e o receptor P2X₇ (47-332) (SEQ ID NO: 3) (ECD1). O receptor P2X₇ (47-306) (SEQ ID NO: 2) é constituído pelos aminoácidos 47 a 306 da SEQ ID NO: 1. O receptor P2X₇ (47332) (SEQ ID NO: 3, ver Figura 3) é constituído pelos aminoácidos 47 a 332 de SEQ ID NO: 1.

Anticorpos ou imunoglobulinas ou Igs são proteínas gamaglobulina que são encontradas no sangue ou outros fluidos corporais de vertebrados que funcionam no sistema imunológico para se ligarem ao antígeno, portanto, identificando e neutralizando objetos estranhos.

Os anticorpos são geralmente uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente. As duas cadeias H estão ligadas uma à outra por uma ou mais ligações dissulfeto, dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes dissulfeto internas espaçadas regularmente.

As cadeias H e L definem domínios Ig específicos. Mais particularmente, cada cadeia H tem no N-terminal, um domínio variável (V_H) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios Ch para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem no N-terminal, um domínio variável (Vl), seguido por um domínio constante (Cl) na sua outra extremidade. O V_L está alinhado com o V_H e o Cl está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (Ch1).

Os anticorpos podem ser atribuídos a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, tendo cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As classes yea são ainda divididas em subclasses, com base em diferenças relativamente pequenas na sequência e função Ch, por exemplo, os seres huma

27/93 nos expressam as seguintes subclasses: lgG1 e lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. A cadeia L de qualquer espécie de vertebrados pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

O domínio constante inclui a porção Fc que compreende as porções carboxi-terminal de ambas as cadeias H mantidas juntas por ligações dissulfeto. As funções efetoras dos anticorpos, tais como ADCC são determinadas por sequências na região Fc, cuja região é também a parte reconhecida por receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.

O emparelhamento de um domínio V_H e Vl forma uma região variável ou domínio variável, incluindo os domínios amino-terminal da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como VH. O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como VL. O domínio V contém um sítio de ligação ao antígeno que afeta a ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo específico para o seu antígeno específico. As regiões V abrangem cerca de 110 resíduos de aminoácidos e consistem em alongamentos relativamente invariantes chamados regiões framework (FRs) (geralmente cerca de 4) de 15 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas regiões hipervariáveis (geralmente cerca de 3) que têm cada 912 aminoácidos de comprimento. As FRs amplamente adoptam uma configuração de folhas β e as regiões hipervariáveis formam alças de ligação, e em alguns casos fazem parte da estrutura de folha β.

Região hipervariável”, HVR, ou HV se refere às regiões de um domínio variável de anticorpos que são hipervariáveis em sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis, três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Um certo número de delimitações da região hipervariável estão em uso e estão englobadas no presente documento. As Regiões Determinantes de Complementaridade segundo Kabat (CDR) são baseadas na variabilidade de sequência e são as mais comumente utilizadas (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public health Service, Nati28/93 onal Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

Framework ou resíduos FR são aqueles resíduos de domínio variável que não sejam os resíduos da região hipervariável aqui definida.

Um peptídeo para formar um sítio de ligação ao antígeno se refere de uma maneira genérica a um peptídeo que pode formar uma conformação que confere a especificidade de um antígeno para o antígeno. Exemplos incluem anticorpo inteiro ou estruturas relacionadas a anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpos inteiros, incluindo um domínio variável, domínios variáveis e seus fragmentos, incluindo as cadeias leve e pesada, ou fragmentos de cadeias leves e pesadas que incluem algumas, mas não todas as regiões hipervariáveis ou regiões constantes.

Um anticorpo intacto ou inteiro é um que compreende um sítio de ligação ao antígeno bem como um Cl e, pelo menos, domínios constantes de cadeia pesada, Ch1, Ch2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou sequência de aminoácidos variante da mesma.

Estruturas relacionadas a anticorpos inteiros incluem formas multimerizadas de anticorpos inteiros.

Fragmentos de anticorpos inteiros, incluindo um domínio variável incluem Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formado a partir de fragmentos de anticorpos.

O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira, juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (V_H), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch1). Cada fragmento Fab é monovalente com respeito à ligação ao antígeno, isto é, tem um único sítio de ligação ao antígeno.

Um fragmento Fab' difere dos fragmentos Fab por ter alguns resíduos adicionais no terminal carboxi do domínio Ch1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes supor29/93 tam um grupo tiol livre.

Um fragmento F(ab')2 corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfeto com atividade de ligação ao antígeno divalente e é ainda capaz de ligação cruzada ao antígeno.

Um Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve em associação apertada, não covalente.

Em uma espécie Fv(scFv) de cadeia única, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um ligante peptídico flexível de tal modo que as cadeias leve e pesada podem se associar em uma estrutura dimérica análoga àquela em uma espécie Fv de duas cadeias. A partir da dobragem destes dois domínios emanam seis alças hipervariáveis (3 alças cada a partir da cadeia H e L), que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação ao antígeno e conferem especificidade de ligação ao antígeno ao anticorpo.

Fv de cadeia única também abreviado como sFv ou scFv são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpos Vh e V_L ligados para formar uma única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipeptídeo scFv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domíniosV_H e Vl que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno.

Um domínio variável único é metade de um Fv (compreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) que tem a capacidade de reconhecer e ligar ao antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que o sítio de ligação completo.

Os diacorpos se referem a fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Os fragmentos de anticorpo pequenos são preparados através da construção de fragmentos sFv (ver parágrafo anterior) com ligantes curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os

30/93 domínios Vh e Vl de tal modo que é obtido o emparelhamento intercadeias, mas não intracadeias dos domínios V, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento que tem dois sítios de ligação ao antígeno.

Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv crossover em que os domínios V_H e V_L dos dois anticorpos estão presentes em cadeias polipeptídicas diferentes. Triacorpos e tetracorpos também são geralmente conhecidos na técnica.

Um anticorpo isolado é um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente preexistente. Componentes contaminantes são materiais que interferiríam com usos terapêuticos para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos.

Um anticorpo humano refere-se a um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que tenha sido feita usando qualquer uma das técnicas para produção de anticorpos humanos, tal como aqui divulgadas. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando vários métodos conhecidos na técnica, incluindo a tecnologia de bibliotecas de exposição de biomoléculas em fagos (phage display). Os anticorpos humanos podem ser preparados por administração do antígeno a um animal transgênico, que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta à estimulação antigênica, mas cujos loci endógenos foram desativados.

As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada do anticorpo não humano. De um modo geral, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho, cão, gato ou um primata não

31/93 humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade do anticorpo desejado. Em alguns casos, os resíduos da região framework (FR) de imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou sübstancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou sübstancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.

Anticorpo monoclonal refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos sübstancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico ou determinante no antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados pela metodologia de hibridoma, ou podem ser feitos usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas, de animal eucariótico ou planta. Os anticorpos monoclonais podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos expressos em fagos.

Os anticorpos monoclonais aqui incluem anticorpos quiméricos em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências

32/93 correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Os anticorpos quiméricos de interesse na presente invenção incluem anticorpos primatizados que compreendem sequências de ligação ao antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macacos do Velho Mundo, Símios etc.), e sequências da região constante humanas.

O termo anticorpo receptor anti-P2X₇ ou um anticorpo que se liga ao receptor P2X₇ se refere a um anticorpo que é capaz de ligação ao receptor P2X₇ com afinidade suficiente de tal forma que o anticorpo é útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico para atingir o receptor P2X₇, tipicamente o receptor P2X₇ não funcional. De preferência, a extensão da ligação de um anticorpo do receptor P2X₇ a uma proteína do receptor não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao receptor P2X₇ como medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga ao receptor P2X₇ tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, ou < 0,1 nM. Um anticorpo antirreceptor P2X₇ não funcional é geralmente um anticorpo que tem algumas ou todas estas características serológicas e que se liga a receptores P2X₇ não funcionais, mas não a receptores P2X₇ funcionais.

Um anticorpo maturado por afinidade é um com uma ou mais alterações em um ou mais dos seus HVRs que resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com um anticorpo progenitor que não possui esta(s) alteração(ões). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolar ao antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica.

Um anticorpo bloqueador ou um anticorpo antagonista é um anticorpo que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Os anticorpos bloqueadores ou anticorpos antagonistas preferidos substancialmente ou completamente inibem a atividade biológica do antíge33/93 no.

Um anticorpo agonista, tal como aqui utilizado, é um anticorpo que imita, pelo menos, uma das atividades funcionais de um polipeptídeo de interesse.

Afinidade de ligação se refere de uma maneira genérica à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Geralmente, afinidade de ligação se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre os membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar prontamente, enquanto que os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Vários métodos de medição de afinidade de ligação são conhecidos na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para os fins da presente invenção.

Tal como aqui utilizado, as propriedades dos aminoácidos estão definidas na tabela seguinte:

Aminoácido	código de 3 letras	código de 1 letra	Propriedades
Alanina	Ala	A	alifática hidrofóbica neutra
Arginina	Arg	R	polar hidrofílica carregada (+)
Asparagina	Asn	N	polar hidrofílica neutra
Aspartato	Asp	D	polar hidrofílica carregada (-)
Cisteína	Cys	C	polar hidrofóbica neutra
Glutamina	Gin	Q	polar hidrofílica neutra
Glutamato	Glu	E	polar hidrofílica carregada (-)
Glicina	Gly	G	alifática neutra
Histidina	His	H	aromática polar hidrofílica carregada (+)
Isoleucina	lie	I	alifática hidrofóbica neutra

34/93

Leucina	Leu	L	alifática hidrofóbica neutra
Lisina	Lys	K	polar hidrofílica carregada (+)
Metionina	Met	M	hidrofóbica neutra
Fenilalanina	Phe	F	aromática hidrofóbica neutra
Prolina	Pro	P	hidrofóbica neutra
Serina	Ser	S	polar hidrofílica neutra
Treonina	Thr	T	polar hidrofílica neutra
Triptofano	Trp	w	aromática hidrofóbica neutra
Tirosina	Tyr	Y	aromática polar hidrofóbica
Valina	Vai	V	alifática hidrofóbica neutra

Os inventores determinaram as sequências CDR de vários clones de domínio variável que constataram se ligam ao receptor P2X₇ não funcional. Estas sequências CDR estão apresentadas na Tabela 1a adiante.

Em uma modalidade, é proporcionado um peptídeo que tem uma sequência tal como apresentado na Tabela 1a ou b. Estes peptídeos são particularmente úteis para a construção de sítios de ligação ao antígeno, domínios variáveis, anticorpos e fragmentos relacionados.

Tabela 1a: sequências CDR

CDR1	CDR2	CDR3
KASQNVGTN- VA (SEQ ID NO: 5)	SASFRYS (SEQ ID NO: 6)	(carregada/polar/aromática)(carregada/aromática) XXXY(aromática/alifática)(carregada/neutra) (neutra/alifática)
N(Y/F)XXXY(Y/F)EX
N(Y/F)(neutra)(carregada)(neutra)Y(Y/F)E(neutra)
NFLESYFEA (SEQ ID NO: 7)
N(Y/F)(carregada)(neutra)(carregada)Y(Y/F)E(neutra)
NYRGDYYET (SEQ ID NO: 8)
H(aromática)XXXYYNI
H(Y/F)(neutra)(carregada)(neutra)YYNl
H(Y/F)(neutra)(carregada)(carregada)YYNI
HYSKEYYNI (SEQ ID NO: 9)
HFQRGYYNI (SEQ ID NO: 10)

35/93

		(Y/N)(aromática)XXXYY(carregada)(neutra)
(Y/N)(aromática)(neutra)(neutra)(neutra)YYDV
(Y/N)(aromática)(neutra)(neutra)(neutra)YYEV
YFPLVYYDV (SEQ ID NO: 11)
NYLPMYYEV (SEQ ID NO: 12)
Y(carregada)XXXY(neutra)(neutra)(neutra)
NFKLMYYNV (SEQ ID NO: 13)
(carregada/polar/aromática)(aromática)(carregada/ neutra)(carregada)(carregada/neutra)Y(aromática) (carregada)(neutra)
(carregada/polar/aromática)(F/Y)(carregada/ neutra)(R/K)(carregada/neutra)(Y)(Y/F)(E/D)V
(H/N)(F/Y)(S/D)(R/K)(G/K)Y(Y/F)DV
HFSRGYYDV (SEQ ID NO: 14)
HYIKVYYEA (SEQ ID NO: 15)
HYSSRFFEV (SEQ ID NO: 16)
NFRVMFFKA (SEQ ID NO: 17)
HYSSRFFEV (SEQ ID NO: 18)
YHVIQYLGP (SEQ ID NO: 19)
DFTVPFYNA (SEQ ID NO: 20)
NYDKKYFDV (SEQ ID NO: 21)
YFPLVYYDV (SEQ ID NO: 22)
HYSSRFFDV (SEQ ID NO: 34)
SYYMS (SEQ ID NO: 23)	AINSNGGS YYPTVKG (SEQ ID NO: 24)	(carregada/polar/aromática) (carregada/aromática) XXXY (aromática/alifática)(carregada/neutra) (neutra/alifática)
N(Y/F)XXXY(Y/F)EX
N(Y/F)(neutra)(carregada)(neutra)Y(Y/F)E(neutra)
NFLESYFEA
N(Y/F)(carregada)(neutra)(carregada)Y(Y/F)E(neutra)
NYRGDYYET
H(aromática)XXXYYNI

36/93

		H(Y/F)(neutra)(carregada)(neutra)YYNI
H(Y/F)(neutra)(carregada)(carregada)YYNI
HYSKEYYNI
HFQRGYYNI
(Y/N)(aromática)XXXYY(carregada)(neutra)
(Y/N)(aromática)(neutra)(neutra)(neutra)YYDV
(Y/N)(aromática)(neutra)(neutra)(neutra)YYEV
YFPLVYYDV
NYLPMYYEV
Y(carregada)XXXY(neutra)(neutra)(neutra)
YHV1QYLGP
NFKLMYYNV
(carregada/polar/aromática)(aromática)(carregada/neutra)(carrega da)(carregada/neutra)Y(aromática) (carregada)(neutra)
(carregada/polar/aromática)(F/Y)(carregada/ neutra)(R/K)(carregada/neutra)(Y)(Y/F)(E/D)V
(H/N)(F/Y)(S/D)(R/K)(G/K)Y(Y/F)DV
HFSRGYYDV
HYIKVYYEA
HYSSRFFEV
NFRVMFFKA
HYSSRFFEV
DHVPFYNA
NYDKKYFDV
YFPLVYYDV
HYSSRFFDV

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Tabela 1b

Sítio de ligação ao antígeno	V_H	V_L	scFV
2F6(WT)	DVKLVESGGGLVKL GGSLKLSCAASGFT FSSYYMSWVRQTP EKRLELVAAINSNG GSTYYPDTVKGRFT ISRDNAKNTLYLQM SSLKSEDTAFYYCTRHYSSRFFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO: 35)	MADIVMTQSQK FMSTSVGDRVS VTCKASQNVGT NVAWYQQKPG QSPKALIYSASF RYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQYNSYP FTFGSGTRLEIK (SEQ ID NO: 36)	MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCK ASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYS ASFRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISN VQSEDLAEFFCQQYNSYPFTFGSGTR LEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLVE SGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSY YMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGST YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSS LKSEDTAFYYCTRHYSSRFFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 37)
Mutante n°18	DVKLVESGGGLVKL GGSLKLSCAASGFT FSSYYMSWVRQTP EKRLELVAAINSNG GSTYYPDTVKGRFT ISRDNAKNTLYLQM SSLKSEDTAFYYCTRHFSRGYYDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 38)	MADIVMTQSQK FMSTSVGDRVS VTCKASQNVGT NVAWYQQKPG QSPKALIYSASF RYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQYNSYP FTFGSGTRLEIK	MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCK ASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYS ASFRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISN VQSEDLAEFFCQQYNSYPFTFGSGTR LEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLVE SGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSY YMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGST YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSS LKSEDTAFYYCTRHFSRGYYDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 39)
Mutante n°78	DVKLVESGGGLVKL GGSLKLSCAASGFT FSSYYMSWVRQTP EKRLELVAAINSNG GSTYYPDTVKGRFT ISRDNAKNTLYLQM SSLKSEDTAFYYCTRNYDKKYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40)	MADIVMTQSQK FMSTSVGDRVS VTCKASQNVGT NVAWYQQKPG QSPKALIYSASF RYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQYNSYP FTFGSGTRLEIK	MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCK ASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYS ASFRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISN VQSEDLAEFFCQQYNSYPFTFGSGTR LEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLVE SGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSY YMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGST YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSS LKSEDTAFYYCTRNYDKKYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 41)

38/93

Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um sítio que tem pelo menos 75%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 85%, mais preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95%, mais preferencialmente 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a um sítio de ligação ao antígeno descrito acima.

Em certas modalidades, a CDR é uma CDR que tem pelo menos 75%, de preferência 80%, mais preferencialmente 85%, mais preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95%, mais preferencialmente 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma CDR apresentada na Tabela 1a.

Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno compreende ou consiste em uma sequência de V_H, V_L ou scFv apresentada na Tabela 1b ou tem uma sequência que tem 75%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 85%, mais preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95%, mais preferencialmente 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de Vh, Vl ou scFv descrita na Tabela 1b.

Em outras modalidades, é proporcionado um sítio de ligação ao antígeno ou CDR e/ou FR que tem uma sequência tal como descrito acima e que inclui uma ou mais mutações para aumentar a afinidade do referido sítio para ligação a um receptor anti-P2X₇. A mutação pode resultar em uma substituição, inserção, ou deleção de um resíduo em um ou mais de CDR1, CDR2 ou CDR3, ou um ou mais de FR1, FR2., FR3 ou FR4.

Em certas modalidades os sítios de ligação ao antígeno da invenção e as moléculas que compreendem os mesmos se ligam a um epitopo que é exclusivamente, expresso em receptores P2X₇ que não se ligam ao ATP (conhecidos como receptores não funcionais). Constatou-se que o epitopo e os peptídeos que formam o mesmo são úteis para gerar anticorpos monoclonais que se ligam a receptores P2X₇ não funcionais expressos em células vivas.

A ligação a células vivas é importante porque acredita-se que a expressão do receptor P2X₇ não funcional em ou sobre as células, sendo exemplos células epiteliais, seja um biomarcador de muitos cânceres, tais como cânceres epiteliais e outros estados patológicos. Por conseguinte, com

39/93 anticorpos monoclonais que se ligam a células vivas, torna-se possível proporcionar terapêutica sistêmica quer sob a forma do próprio anticorpo, ou um conjugado de anticorpo-agente citotóxico a uma ampla gama de doenças caracterizadas pela expressão de receptores P2X₇ não funcionais. Torna-se também possível proporcionar imagens in vivo e diagnóstico ou monitoração de doenças caracterizadas pela expressão de receptores P2X₇ não funcionais.

O epitopo é encontrado apenas no receptor P2X₇, isto é, o trímero formado a partir de monômeros P2X₇. Mais particularmente, o epitopo abrange monômeros P2X₇ adjacentes ao receptor P2X₇ trimérico. Por conseguinte, os monômeros P2X₇ individuais que não estão alinhados como em um receptor trimérico não funcional, não contêm o epitopo. Isto vantajosamente permite que se divida os tumores em fases. Isto é mais difícil de fazer com anticorpos que se ligam tanto ao receptor P2X₇ monomérico como trimérico.

Assim, em certas modalidades os sítios de ligação ao antígeno da invenção se ligam a um epitopo de um receptor P2X₇, o epitopo sendo formado de:

- uma primeira região sob a forma de uma região de um primeiro monômero de um receptor P2X₇, e

- uma segunda região sob a forma de uma região de um segundo monômero do receptor;

em que a primeira e a segunda regiões são formadas no receptor por isomerização cis de um resíduo na posição 210 da SEQ ID No: 1 de um monômero do receptor;

e em que a primeira e a segunda regiões estão dispostas adjacentes uma à outra no receptor, permitindo assim a ligação de um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-P2X₇ à primeira e à segunda regiões que formam o epitopo.

Tipicamente, o epitopo é um epitopo conformacional. Nestas modalidades, a primeira e segunda regiões cada define um espaço molecular que cada inclui um ou mais resíduos da SEQ ID NO: 1. Tipicamente, a

40/93 primeira região é uma região que define um espaço molecular, que inclui um ou mais dos resíduos da SEQ ID No: 1: que são expostos para ligação a um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo, como consequência da isomerização cis do Pro210 de um monômero que tem uma sequência apresenta5 da na SEQ ID NO: 1. Estes resíduos incluem Gly 200, His 201, Asn 202, Tyr

203, Thr 204, Thr 205, Arg 206, Asn 207, He 208, Leu 209 e Pro210. Em uma modalidade a primeira região inclui pelo menos um desses resíduos. Tipicamente, a primeira região inclui pelo menos 4 destes resíduos, embora possa ser menos, por exemplo, 2 ou 3, dependendo de quantos resíduos 10 são apresentados na segunda região. Em uma modalidade, a primeira região inclui pelo menos 1 par de resíduos apresentados na Tabela 2 adiante:

Tabela 2

His 201 Gly 200	Asn 202 Gly 200	Tyr203 Gly 200	Thr204 Gly 200	Thr205 Gly 200	Arg 206 Gly 200	Asn 207 Gly 200	He 208 Gly 200	Leu 209 Gly 200
	Asn 202 His 201	Tyr203 His 201	Thr204 His 201	Thr205 His 201	Arg 206 His 201	Asn 207 His 201	He 208 His 201	Leu 209 His 201
		Tyr203 Asn 202	Thr204 Asn 202	Thr205 Asn 202	Arg 206 Asn 202	Asn 207 Asn 202	He 208 Asn 202	Leu 209 Asn 202
			Thr204 Tyr203	Thr205 Tyr203	Arg 206 Tyr203	Asn 207 Tyr 203	He 208 Tyr203	Leu 209 Tyr203
				Thr205 Thr204	Arg 206 Thr204	Asn 207 Thr204	He 208 Thr204	Leu 209 Thr204
					Arg 206 Thr205	Asn 207 Thr205	He 208 Thr205	Leu 209 Thr205
						Asn 207 Arg 206	He 208 Arg 206	Leu 209 Arg 206
							He 208 Asn 207	Leu 209 Asn 207
								Leu 209 He 208

Em certas modalidades, a primeira região inclui 2 ou mais pares de resíduos apresentados na Tabela 2.

41/93

A primeira região pode conter adicionalmente um ou mais resíduos periféricos que estão intimamente envolvidos na formação do sítio de ligação ao ATP na maior das duas dobras do domínio extracelular. Estes são Lys 193, Phe 275 e Arg 294. Arg 125 está localizado na menor das duas dobras do domínio extracelular. Assim, em certas modalidades, a primeira região inclui ainda um ou mais dos seguintes resíduos da SEQ ID No: 1: Arg 125, Lys 193, Phe 275 e Arg 294. Será entendido que a primeira região não consiste apenas destes resíduos. Isto é, a primeira região, como discutido acima, define um espaço molecular, que inclui um ou mais dos resíduos da SEQ ID No: 1: que são expostos para ligação a um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo, como consequência da isomerização c/s do Pro210 de um monômero que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. Neste contexto, a Arg 125, Lys 193, Phe 275 e Arg 294 são fornecidos apenas adicionalmente, mas não em alternativa para por exemplo um ou mais dos resíduos Gly 200, His 201, Asn 202, Tyr 203, Thr 204, Thr 205, Arg 206, Asn 207, Lie 208, Leu 209.

Tipicamente, a segunda região é uma região que define um espaço molecular, que inclui um ou mais dos resíduos da SEQ ID No: 1: que são expostos para ligação a um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo, como consequência da isomerização c/s do Pro210 de um monômero que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. Estes resíduos incluem Lys 297, Tyr 298, Tyr 299, Lys 300, Glu 301, Asn 302, Asn 303, Vai 304, Glu 305 e Lys 306. Em uma modalidade a segunda região inclui pelo menos um desses resíduos. Tipicamente, a segunda região inclui pelo menos 4 destes resíduos, embora possa ser menos, por exemplo, 2 ou 3, dependendo de quantos resíduos são apresentados na primeira região. Em uma modalidade, a segunda região inclui pelo menos um par de resíduos apresentados na Tabela 3 adiante:

42/93

Tabela 3

Tyr298 Lys 297	Tyr299 Lys 297	Lys 300 Lys 297	Glu 301 Lys 297	Asn 302 Lys 297	Asn 303 Lys 297	Vai 304 Lys 297	Glu 305 Lys 297	Lys 306 Lys 297
	Tyr298 Tyr299	Tyr298 Lys 300	Tyr298 Glu 301	Tyr298 Asn 302	Tyr298 Asn 303	Tyr298 Vai 304	Tyr298 Glu 305	Tyr298 Lys 306
		Tyr299 Glu 301	Tyr299 Glu 301	Tyr299 Asn 302	Tyr299 Asn 303	Tyr299 Vai 304	Tyr299 Glu 305	Tyr299 Lys 306
			Lys 300 Glu 301	Lys 300 Asn 302	Lys 300 Asn 303	Lys 300 Vai 304	Lys 300 Glu 305	Lys 300 Lys 306
				Glu 301 Asn 302	Glu 301 Asn 303	Glu 301 Vai 304	Glu 301 Glu 305	Glu 301 Lys 306
					Asn 302 Asn 303	Asn 302 Vai 304	Asn 302 Glu 305	Asn 302 Lys 306
						Asn 303 Vai 304	Asn 303 Glu 305	Asn 303 Lys 306
							Vai 304 Glu 305	Vai 304 Lys 306
								Glu 305 Lys 306

Em certas modalidades, a segunda região inclui 2 ou mais pares de resíduos indicados na Tabela 3.

A segunda região pode conter adicionalmente um ou mais resí5 duos periféricos que estão intimamente envolvidos na formação do sítio de ligação ao ATP. Estes são Arg 307 e Lys 311. Assim, em certas modalidades, a segunda região inclui ainda Arg 307 e/ou Lys 311. Será entendido que a segunda região não consiste apenas destes resíduos. Isto é, a segunda região, como discutido acima, define um espaço molecular, que inclui um ou 10 mais dos resíduos da SEQ ID No: 1: que são expostos para ligação a um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo, como consequência da isomerização c/s do Pro210 de um monômero que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. Neste contexto, Arg 307 e Lys 311 são fornecidos apenas adicionalmente, mas não em alternativa para, por exemplo, um ou mais

43/93 dos resíduos Lys 297, Tyr 298, Tyr 299, Lys 300, Glu 301, Asn 302, Asn 303, Vai 304, Glu 305 e Lys 306.

Em certas modalidades, o epitopo é, ou inclui um epitopo linear. Exemplos incluem onde a primeira região inclui uma das seguintes sequên5 cias da SEQ ID NO: 1 na Tabela 4:

Nestas modalidades, a segunda região do epitopo pode incluir uma das seguintes sequências da SEQ ID No: 1 na Tabela 5:

Tabela 5

Lys 297 a Lys 300

Tyr 298 a Glu 301

Tyr 299 a Asn 301

Lys 300 a Asn 303

Glu 301 a Vai 304

Asn 301 a Glu 305

Asn 303 a Lys 306

Em certas modalidades, a primeira região contém mais resíduos do que a segunda região. Em outras modalidades, a segunda região contém mais resíduos do que a primeira região.

A primeira região e a segunda região podem, cada uma, conter de cerca de 4 a cerca de 10 resíduos, por exemplo, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos.

Onde há mais resíduos na segunda região, pode haver menos resíduos na primeira região, isto é, menos de 4, por exemplo, 2 ou 3. O mesmo se aplica vice versa.

Como aqui descrito, a primeira e segunda regiões são dispostas

44/93 adjacentes uma à outra no receptor deste modo permitindo a ligação de um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-P2X7 à primeira e segunda regiões que formam o epitopo. Em mais detalhe, os inventores constataram que embora situadas em monômeros separados, a primeira e segunda regiões em combinação formam um epitopo que pode ser ligado por um único sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Em geral, a primeira e a segunda regiões do epitopo não são espaçadas mais do que cerca de 40 Angstroms. Se a distância for maior do que esta, a afinidade de ligação do anticorpo tende a diminuir à medida que o sítio de ligação ao antígeno necessita atravessar uma distância maior através dos monômeros dentro do receptor, em cujo caso menos resíduos são ligados. Em geral, a primeira e segunda regiões são espaçadas cerca de 10 Angstroms, embora distâncias maiores, inferiores a 40 Angstroms sejam possíveis tais como 15, 20, 25, 30, 35 Angstroms.

O epitopo aqui descrito pode ser proporcionado sob uma forma substancialmente purificada ou isolada, por exemplo, como um fragmento de um receptor P2X₇ que ocorre naturalmente ou como um receptor P2X₇ sintético ou recombinante.

Marks et al. (1992) BioTechnology 10:779, que descreve maturação de afinidade por embaralhamento do domínio VH e VL; Barbas et al. (1994) Proc Nat. Acad: Sei: EUA 9 1:3809; Schier et a/. (1995) Gene 169:147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155:1994; Jackson et al (1995), J. Immunol. 154 (7): 3310; e Hawkins et al, (1992) J. Mol. Biol. 226:889, que descrevem a mutagênese aleatória da região hipervariável e/ou resíduos framework, são exemplos de procedimentos conhecidos na técnica para a maturação de afinidade de sítios de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, um ácido nucleico que codifica uma ou mais das sequências apresentadas na Tabela 1a ou b é mutagenizado para criar uma biblioteca diversificada de sequências. A biblioteca é então rastreada contra um alvo incluindo um epitopo de um receptor P2X₇ não funcional. Um método exemplificativo está apresentado nos Exemplos neste documento.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um sítio de ligação

45/93 ao antígeno, como descrito acima em que uma sequência de aminoácidos que forma um ou mais de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 é derivada de uma sequência humana ou é na forma de uma sequência humana.

O sítio de ligação ao antígeno pode ser apresentado sob uma forma humanizada, incluindo sequências de imunoglobulina não humanas (por exemplo, de murino) e humana. Tipicamente todas, exceto as sequências CDR do sítio de ligação ao antígeno, são de uma espécie não humana, tal como de camundongo, rato ou coelho. Em alguns casos, resíduos framework do sítio de ligação ao antígeno podem também ser não humanos. Quando o sítio de ligação ao antígeno é proporcionado sob a forma de um anticorpo completo, tipicamente pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc) é humana, permitindo assim várias funções efetoras humanas.

Métodos para humanizar sítios não humanos de ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica, exemplos de processos adequados, incluindo aqueles em Jones et al, (1986) Nature, 321: 522; Riechmann et al, (1988), Nature 332:323; Verhoeyen etal, (1988) Science, 239:1534.

Os métodos de exposição em fagos aqui descritos que utilizam bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas são úteis para a geração de sítios de ligação a antígenos humanos e anticorpos humanos.

Além disso, mamíferos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana podem ser utilizados. Estes camundongos podem ser gerados por inserção aleatória ou dirigida dos genes humanos de imunoglobulina da cadeia pesada e leve em células-tronco embrionárias. Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve do hospedeiro podem ser tornados não funcionais através da inserção ou por algum outro evento de recombinação, por exemplo, por deleção homozigótica da região JH do hospedeiro. As células-tronco embrionárias transfectadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos que são então criados para produzir descendentes homozigotos que expressam sí

46/93 tios de ligação a antígenos humanos. Após a imunização com um epitopo P2X₇, podem ser obtidos anticorpos monoclonais humanos. Um benefício de sistemas animais transgênicos é que é possível produzir isotipos terapeuticamente úteis porque os transgenes de imunoglobulina humana se reorganizam durante a diferenciação das células B e subsequentemente são submetidos à mudança de classe e mutação somática nos camundongos transgênicos.

Os domínios variáveis, incluindo CDRs e FRs da invenção podem ter sido feitos menos imunogênicos através da substituição de resíduos expostos na superfície de modo a fazer com que o anticorpo pareça como próprio para o sistema imunitário. Padlan, EA, 1991, Mol. Immunol. 28, 489 fornece um método exemplificativo. Em geral, a afinidade é preservada porque a embalagem interna dos resíduos de aminoácidos na proximidade do sítio de ligação ao antígeno permanece inalterada e, em geral, resíduos de CDR ou resíduos adjacentes que influenciam as características de ligação não são para ser substituídos nestes processos.

Em uma outra modalidade, é proporcionado domínio variável de imunoglobulina de um receptor anti-P2X₇, anticorpo, Fab, dab ou scFv incluindo um sítio de ligação ao antígeno como descrito acima.

Fragmentos de anticorpos de peso molecular mais baixo, em comparação com os anticorpos inteiros podem ter acesso melhorado a tumores sólidos e depuração mais rápida que pode ser particularmente útil em terapêutica e em aplicações de diagnóstico in vivo.

Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo, incluindo a digestão proteolítica de anticorpos intactos e expressão recombinante em células hospedeiras. Com relação a esta última, como descrito abaixo, fragmentos de anticorpo Fab, Fv e scFv podem ser expressos e segregados a partir de E. coli, fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de fago de anticorpos e fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados a partir E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')₂. Em uma outra abordagem, fragmentos F(ab')₂ são isolados diretamente a partir da cultura de

47/93 célula hospedeira recombinante.

Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é proporcionado sob a forma de um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Fv e scFv são adequados para a ligação não específica reduzida durante a utilização in vivo uma vez que têm sítios de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes. Proteínas de fusão incluindo scFv podem ser construídas de modo a produzir fusão de uma proteína efetora seja no terminal amino ou no terminal carboxi de um scFv. De preferência, o scFv é sob a forma de um domínio V_H fundido por um ligante a um domínio Vl. Em uma modalidade, o ligante tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento. Tipicamente, o ligante tem pelo menos 10 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o ligante em geral é constituído por resíduos de glicina ou serina. Tipicamente, o ligante é GGGGSGGGGSGGGGS.

Em uma modalidade, o scFv tem a sequência:

MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQK PGQSPKALIYSASFRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQ YNSYPFTFGSGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLVESGGGLVKLGGS LKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTRHYSSRFFDVWGAGTTVTVSS

Em uma outra modalidade, é proporcionado um diacorpo ou triacorpo ou outro anticorpo multiespecífico que inclui um sítio de ligação ao antígeno como descrito acima. Anticorpos multiespecíficos podem ser montados utilizando domínios polipeptídicos que permitem a multimerização. Exemplos incluem as regiões CH2 e CH3 do Fc e as regiões CH1 e Ckappa/lambda. Outros domínios de multimerização de proteína que ocorrem naturalmente podem ser utilizados, incluindo o domínio zipper de leucina (bZIP), motivo hélice-alça-hélice, domínio de homologia Src (SH2, SH3), um sítio EF-hand, um domínio de ligação à fosfotirosina (PTB), ou outros domínios conhecidos na técnica.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um domínio de fusão ou proteína heteróloga que inclui um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo ou tria48/93 corpo como descrito acima.

Um polipeptídeo heterólogo pode ser fundido de forma recombinante ou conjugado quimicamente a um N-terminal ou C-terminal de um sítio de ligação ao antígeno ou molécula da invenção que contém o mesmo.

O polipeptídeo heterólogo ao qual o anticorpo ou sítio de ligação ao antígeno é fundido pode ser útil para atingir células que expressam o receptor P2X₇, ou útil para alguma outra função, tal como purificação, ou para aumentar a meia vida in vivo dos polipeptídeos, ou para uso em imunoensaios utilizando métodos conhecidos na técnica.

Em modalidades preferidas, uma sequência de aminoácidos que atua como um marcador tal como um peptídeo hexa-histidina é útil para a purificação conveniente da proteína de fusão. Outras incluem, mas não estão limitados à etiqueta HA, que corresponde a um epitopo derivado da proteína hemaglutinina do vírus influenza e da etiqueta flag. Por exemplo, um scFv da invenção tanto pode ser etiquetados com flag como etiquetado com His com a sequência seguinte:

MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQK PGQSPKALIYSASFRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQ YNSYPFTFGSGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLVESGGGLVKLGGS LKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRF TISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTRHYSSRFFDVWGAGTTVTVSSA AADYKDDDDKAAAHHHHHH

Além disso, o sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo ou triacorpo da invenção podem ser modificados por glicosilação, acetilação, pegilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/de bloqueio conhecidos, divagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc.

Os sítios de ligação ao antígeno da invenção podem ser compostos de aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, peptídeos isosteros, e podem conter outros aminoácidos que não sejam os 20 aminoácidos do gene codificado. Os sítios de ligação ao antígeno da invenção podem ser modificados por

49/93 processos naturais, tais como o processamento pós-traducional, ou por técnicas de modificação química, que são bem conhecidas na técnica. Tais modificações estão bem descritas em textos básicos, assim como na literatura científica. Modificações podem ocorrer em qualquer parte do sítio de ligação ao antígeno, incluindo o esqueleto peptídico, as cadeias laterais do aminoácido e os terminais amino ou carboxilo, ou em unidades tais como hidratos de carbono. Será entendido que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou graus diferentes em vários sítios em um dado sítio de ligação ao antígeno. Além disso, um dado sítio de ligação ao antígeno pode conter muitos tipos de modificações. Um sítio de ligação ao antígeno pode ser ramificado, por exemplo, como resultado de ubiquitinação, e pode ser cíclico, com ou sem ramificação. Sítios de ligação ao antígeno cíclicos, ramificados, e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais de pós-tradução ou podem ser feitos por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma unidade do heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeos, ligação covalente de um lipídeo ou um derivado de lipídeos, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação dissulfureto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por transferência de RNA de aminoácidos para proteínas tais como arginilação, e ubiquitinação.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um conjugado sob a forma de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFsv, diacorpo, triacorpo ou proteína de fusão, como descrito acima conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, uma droga, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa bacteriana, fúngica, de plantas, ou de origem animal, ou seus fragmentos), ou um marcador como

50/93 um isótopo radioativo (isto é, conjugado de rádio). Em um outro aspecto, a invenção proporciona ainda métodos de uso dos imunoconjugados. Em um aspecto, um imunoconjugado compreende qualquer dos domínios variáveis acima, covalentemente ligados a um agente citotóxico ou um agente detec5 tável.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um anticorpo para ligação a um sítio de ligação ao antígeno de um domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado, tal como descrito acima.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um ácido nucleico que codifica um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado, tal como descrito acima.

Um polinucleotídeo que codifica um CDR ou FR de acordo com qualquer uma das fórmulas gerais acima descritas, ou um sítio de ligação ao antígeno composto do mesmo, pode ser gerado a partir de um ácido nucleico de qualquer fonte, por exemplo, por síntese química ou isolamento a partir de um cDNA ou biblioteca genômica. Por exemplo, uma biblioteca de cDNA pode ser gerada a partir de uma célula produtora de anticorpos, tal como 20 uma célula B, células de plasma ou de células de hibridoma e o ácido nucleico relevante isolado por amplificação por PGR usando oligonucleotídeos dirigidos para o clone particular de interesse. Os ácidos nucleicos isolados podem então ser clonados em vetores usando qualquer método conhecido na técnica. A sequência nucleotídica relevante pode então ser mutagenizada 25 usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese sítio-dirigida, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wi30 ley and Sons, NY), para gerar sítios de ligação ao antígeno que têm uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.

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Em uma outra modalidade, é proporcionado um vetor que inclui um ácido nucleico descrito acima. O vetor pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral, ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por meio de uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em um local(is) de endonuclease de restrição adequado usando métodos conhecidas na técnica. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vetores adequados que contêm um ou mais destes componentes emprega métodos de ligação padrão que são conhecidos dos especialistas na técnica.

O sítio de ligação ao antígeno pode ser produzido de forma recombinante, não só diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo com um local de divagem específico no terminal-N da proteína madura ou polipeptídeo. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA que codifica o sítio de ligação ao antígeno que é inserido no vetor. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, do grupo das líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II estável ao calor. Para a secreção de levedura a sequência de sinal pode ser, por exemplo, a líder da invertase da levedura, precursora do fator alfa, ou líder da fosfatase ácida ou a líder da glucoamilase de C. albicans. Na expressão de células de mamíferos, as sequências de sinal de mamífero podem ser usadas para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polipeptídeos segregados da mesma espécie ou afins, bem como as líderes de secreções virais.

As sequências polinucleotídicas que codificam os componentes polipeptídicos do sítio de ligação ao antígeno da invenção podem ser obtidas usando técnicas recombinantes padrão, como descrito acima. Os polinucleotídeos podem ser sintetizados usando sintetizador de nucleotídeos ou técni

52/93 cas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de se replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e são conhecidos na técnica podem ser usados para os fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambos) e da sua compatibilidade com a célula hospedeira particular em que reside.

Em geral, os vetores plasmídicos que contêm sequências de replicon e de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em relação a estes hospedeiros. Tanto vetores de expressão como de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite ao vetor replicar em uma ou mais células hospedeiras selecionadas, bem como sequências de marcação que são capazes de proporcionar seleção fenotípica em células transformadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322, que contém os genes que codificam a ampicilina (Amp) e de resistência à tetraciclina (Tet) e assim proporciona meios fáceis para a identificação de células transformadas, é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo de 2 pm é adequada para a levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para a clonagem de vetores em células de mamíferos. O pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos podem também conter, ou serem modificados para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas.

Além disso, os vetores de fagos que contêm sequências replicon e de controle que são compatíveis com o microrganismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em relação a estes hospedeiros. Por exemplo, um bacteriófago, tal como o XGEM.TM.-11 pode ser utilizado

53/93 para fazer um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras susceptíveis, tais como E. coli LE392.

O vetor de expressão da invenção pode compreender dois ou mais pares promotor-cístron (um cístron sendo um segmento de DNA que contém todas as informações para a produção de um único polipeptídeo). Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizada a montante (5') em relação a um cístron que modula a sua expressão. Os promotores procarióticos geralmente se enquadram em duas classes, induzível e constitutiva. O promotor induzível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cístron sob o seu controle em resposta a alterações na condição da cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura.

Um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. O promotor selecionado pode estar operativamente ligado ao DNA do cístron que codifica a cadeia leve ou pesada por remoção do promotor da fonte de DNA através de digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência de promotor isolada no vetor da invenção. Tanto a sequência do promotor nativo como muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para amplificação e/ou expressão direta dos genes alvo. Em algumas modalidades, são usados promotores heterólogos, uma vez que os mesmos geralmente permitem uma maior transcrição e maiores rendimentos de gene alvo expresso em comparação com o promotor polipeptídeo nativo alvo.

Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Os promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor PhoA, os sistemas de promotores β-galactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) e promotores híbridos tais como o promotor tac ou o trc. Os promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente ao DNA que codifica um sítio de ligação ao antígeno da invenção. No entanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tal como outros promotores co

54/93 nhecidos bacterianos ou do fago) são também adequados. As suas sequências de nucleotídeos foram publicadas, permitindo assim que uma pessoa especializada operativamente os ligue aos cístrons que codificam as cadeias leve e pesada alvo usando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários.

Em um aspecto da invenção, cada cístron dentro do vetor recombinante compreende um componente de sequência de sinal de secreção que dirige a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A sequência de sinal selecionada para o objetivo da presente invenção deve ser uma sequência que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam as sequências de sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a sequência sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste nas líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II estável ao calor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma modalidade da invenção, as sequências de sinal usadas em ambos os cístrons do sistema de expressão são sequências de sinal STII ou variantes das mesmas.

Em um outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não requer a presença de sequências de sinal de secreção no interior de cada cístron. A este respeito, as cadeias leve e pesada da imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas estirpes hospedeiras (por exemplo, as estirpes E. coli trxB) proporcionam condições no citoplasma que são favoráveis à formação de ligações dissulfeto, permitindo assim a dobragem e montagem correta das subunidades das proteínas expressas.

A presente invenção proporciona um sistema de expressão em que a proporção quantitativa dos componentes polipeptídicos expressos po

55/93 de ser modulada de forma a maximizar o rendimento dos sítios de ligação ao antígeno secretados e adequadamente montados da invenção. Essa modulação é realizada pelo menos em parte, pela modulação simultânea de forças de tradução para os componentes do polipeptídeo.

Em termos de expressão em células hospedeiras eucarióticas, as componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitadas a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição.

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariótica pode também conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de divagem específico no terminal-N da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A sequência de sinal heteróloga selecionada é de preferência uma sequência que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptida15 se de sinal) pela célula hospedeira. Na expressão de células de mamíferos, as sequências de sinal de mamífero, bem como as líderes de secreção virais, por exemplo, o sinal gD do vírus herpes simplex, estão disponíveis.

O DNA para esta região precursora é ligado em quadro de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

Geralmente, uma origem de componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem de SV40 pode ser tipicamente usada apenas porque contém o promotor precoce.

Os vetores de expressão e clonagem tipicamente conterão um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga para parar o crescimento de uma célula hospedeira. Estas células que são trans

56/93 formadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência à droga e assim sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para retomar o sítio de ligação ao antígeno que codifica o ácido nucleico, tal como DHFR ou timidina quinase, metalotioneína I e II, de preferência os genes da metalotioneína de primatas, adenosina desaminase, orni10 tina descarboxilase, etc. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregado DHFR do tipo selvagem é a linha celular CHO deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096), preparada e propagada. Por exemplo, as células transformadas com o gene de seleção DHFR são primeiro identificadas por cultura de todos os transformantes em um meio de 15 cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR.

Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente as hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com sequências de DNA que codificam um anticorpo, a proteína DHFR de tipo selvagem, e outro marcador selecionável tal como aminoglicosí20 deo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418.

Os vetores de expressão e de clonagem contêm usualmente um 25 promotor operativamente ligado ao sítio de ligação ao antígeno que codifica a sequência de ácido nucleico para síntese direta de mRNA. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos.

Genes eucarióticos têm, geralmente, uma região rica em AT lo30 calizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode

57/93 ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas incluindo enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glicoquinase.

Outros promotores de levedura que são promotores induzíveis com a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e galactose.

A transcrição do sítio de ligação ao antígeno a partir de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como o vírus polioma, vírus da varíola aviária, adenovirus (tal como o Adenovirus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovirus, vírus da hepatite B e vírus símio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

A transcrição de um DNA que codifica o sítio de ligação ao antígeno por eucariotas superiores pode ser aumentada pela inserção de uma sequência potenciadora no vetor. As sequências potenciadoras incluem aquelas conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, será usado uma potenciadora de um vírus de célula eucariota. Exemplos incluem o potenciador SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador

58/93 do promotor precoce do citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e potenciadores de adenovirus.

Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungos, insetos, plantas, animais, humanos, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) irão também conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Tais sequências estão geralmente disponíveis a partir da 5' e, ocasionalmente, 3' regiões não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica um sítio de ligação ao antígeno.

Em uma outra modalidade, é proporcionada uma célula que inclui um vetor ou ácido nucleico acima descrito. A molécula de ácido nucleico ou vetor pode estar presente na célula hospedeira geneticamente modificada ou hospedeiro, quer como uma molécula independente fora do genoma, de preferência como uma molécula que é capaz de replicação, ou pode estar integrada de forma estável no genoma da célula hospedeira ou hospedeiro.

A célula hospedeira da presente invenção pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica.

Exemplos de células procarióticas são aquelas geralmente usadas para clonagem como E. coli ou Bacillus subtilis. Além disso, as células eucarióticas compreendem, por exemplo, as células fúngicas ou de origem animal.

Exemplos para células fúngicas adequadas são células de levedura, de preferência aquelas do gênero Saccharomyces e mais preferencialmente as da espécie Saccharomyces cerevisiae.

Exemplos de células de origem animal são, por exemplo, células de inseto, células de vertebrados, de preferência células de mamíferos, tais como por exemplo, HEK293, NSO, CHO, MDCK, U2-OS, Hela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, SK-n-sh, CaSki, C33A. Estas células hospedeiras, por exemplo, as células CHO, podem proporcionar modificações pós-traducionais às moléculas de anticorpo da invenção, incluindo

59/93 a remoção do peptídeo líder, dobragem e montagem das cadeias H (pesada) e L (leve), glicosilação da molécula em lados corretos e secreção da molécula funcional.

Outras linhas de células adequadas conhecidas na técnica podem ser obtidas a partir de depósitos de linha de células, como a American Type Culture Collection (ATCC).

Em uma outra modalidade, é proporcionado um animal, que inclui uma célula descrita acima. Em certas modalidades, os animais e seus tecidos que contêm um transgene são úteis na produção dos sítios de ligação ao antígeno da invenção. A introdução das moléculas de ácido nucleico como transgenes em hospedeiros não humanos e sua subsequente expressão pode ser usada para a produção dos sítios de ligação ao antígeno, por exemplo, a expressão de tal transgene no leite do animal transgênico proporciona meios de obtenção dos sítios de ligação ao antígeno, em quantidades quantitativas. Transgenes úteis a este respeito compreendem as moléculas de ácido nucleico da invenção, por exemplo, sequências de codificação para os sítios de ligação ao antígeno aqui descritas, operativamente ligadas a estruturas do promotor e/ou potenciador de um gene específico da glândula mamária, como a caseína ou beta-lactoglobulina. Os animais podem ser mamíferos não humanos, mais preferencialmente camundongos, ratos, ovelhas, bezerros, cães, macacos ou símios.

Em uma outra modalidade, é proporcionada uma composição farmacêutica que inclui um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado, tal como descrito acima e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os métodos de preparação e administração de sítios de ligação ao antígeno dos mesmos a um indivíduo em necessidade dos mesmos são bem conhecidos ou são prontamente determinados pelos especialistas na técnica. A via de administração do sítio de ligação ao antígeno pode ser oral, parenteral, por inalação ou tópica.

O termo parenteral como aqui utilizado inclui, por exemplo, a

60/93 administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal ou vaginal.

Embora todas estas formas de administração sejam claramente contempladas como estando dentro do âmbito da invenção, uma forma para administração seria uma solução para injeção, em particular para injeção intravenosa ou intra-arterial ou por perfusão. Em geral, uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo, tampão fosfato, acetato ou citrato), um agente tensoativo (por exemplo, polisorbato), opcionalmente um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana), etc.

As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Na presente invenção, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a tampão fosfato 0,01-0,1 M e, de preferência 0,05 M ou solução salina a 0,8%. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos, tais como os baseados em dextrose de Ringer, e semelhantes. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e semelhantes.

Mais particularmente, as composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis, em tais casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida que existe fácil seringabilidade. Deve ser estável em condições de fabricação e de armazenamento e de preferência será preservada contra a ação contaminante de microrganismos, como

61/93 bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e outros), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensoativos. As formulações adequadas para utilização nos métodos terapêuticos aqui divulgados estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16th ed. (1980).

A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e outros. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação de um composto ativo (por exemplo, sítio de ligação ao antígeno) na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação dos ingredientes enumerados aqui, tal como requerido, seguido de esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e liofilização, que produz um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração. As preparações para injeções são processadas, introduzidas em recipientes, tais como ampolas, frascos, sacos, seringas ou frascos, e seladas sob condições assépticas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Além disso, as preparações podem ser embaladas e ven

62/93 didas sob a forma de um kit. Tais artigos de fabricação de preferência terão rótulos ou folhetos informativos indicando que as composições associadas são úteis para o tratamento de um indivíduo, que sofre ou está predisposto a distúrbios.

As doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento de distúrbios como aqui descrito variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em geral, o paciente é um mamífero humano, mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgênicos podem também ser tratados. As dosagens de tratamento podem ser tituladas usando métodos de rotina conhecidos dos especialistas na técnica para otimizar a segurança e a eficácia.

Para o tratamento de certos distúrbios com um sítio de ligação ao antígeno, a dosagem pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg, de preferência, pelo menos, 1 mg/kg. As doses intermédias nas faixas acima também se destinam a estar dentro do âmbito da invenção. Os indivíduos podem ser administrados com tais doses diariamente, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outro esquema determinado por análise empírica. Um tratamento exemplificativo implica a administração em doses múltiplas durante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Outros regimes de tratamento exemplificativos implicam a administração uma vez por cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Esquemas de dosagens exemplificativos incluem 110 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou mais sítios de ligação ao antígeno com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada sítio de ligação ao

63/93 antígeno administrado se enquadra dentro das faixas indicadas.

Um sítio de ligação ao antígeno aqui revelado pode ser administrado em ocasiões múltiplas. Os intervalos entre as doses individuais podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares, como indicado pela medição dos níveis sanguíneos do polipeptídeo alvo ou molécula alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmática do polipeptídeo de 1-1000 pg/mL e, em alguns métodos 25-300 pg/mL. Alternativamente, os sítios de ligação ao antígeno podem ser administrados como uma formulação de libertação sustentada, caso em que uma administração menos frequente é necessária. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia vida do sítio de ligação ao antígeno no paciente. A meia vida de um sítio de ligação ao antígeno pode também ser prolongada através da fusão a um polipeptídeo ou unidade estável, por exemplo, albumina ou PEG. Em geral, os anticorpos humanizados apresentam a meia vida mais longa, seguido por anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. Em uma modalidade, o sítio de ligação ao antígeno da invenção pode ser administrado na forma não conjugada. Em uma outra modalidade os sítios de ligação ao antígeno para utilização nos métodos aqui divulgados podem ser administrados várias vezes na forma conjugada. Em ainda outra modalidade, os sítios de ligação ao antígeno da invenção podem ser administrados na forma não conjugada, em seguida, na forma conjugada, ou vice-versa.

A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, as composições que compreendem anticorpos ou um coquetel dos mesmos são administradas a um paciente que não está ainda no estado de doença ou em um estado de pré-doença para aumentar a resistência do paciente. Tal quantidade é definida como uma dose profilática eficaz. Neste uso, as quantidades precisas dependem novamente do estado de saúde do paciente e da imunidade geral, mas geralmente variam de 0,1 a 25 mg por dose, especialmente 0,5 a 2,5 mg por dose. Uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente pouco frequentes durante

64/93 um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas.

Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada (por exemplo, de cerca de 1 a 400 mg/kg de molécula de ligação, por e5 xemplo, sítio de ligação ao antígeno por dose, com dosagens desde 5 até 25 mg sendo mais comumente utilizadas para radioimunoconjugados e doses mais elevadas para moléculas conjugadas de citotoxina-droga) em intervalos relativamente curtos é algumas vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e de preferência até que o paciente a10 presente uma melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, o patente pode ser administrado com um regime profilático.

Em uma modalidade, um indivíduo pode ser tratado com uma molécula de ácido nucleico que codifica um sítio de ligação ao antígeno (por exemplo, em um vetor). As doses para os ácidos nucleicos que codificam 15 polipeptídeos variam de cerca de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, ou 30-300 pg de DNA por paciente. As doses para vetores virais infecciosos variam de 10-100, ou mais, virions por dose.

Os agentes terapêuticos podem ser administrados por via parenteral, tópica, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracraniana, intra20 peritoneal, intranasal ou intramuscular para o tratamento profilático e/ou terapêutico, em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente em um tecido particular onde células do receptor P2X₇ não funcional se acumularam, por exemplo, injeção intracraniana. Injeção intramuscular ou perfusão intravenosa são preferidas para a administração de anticorpo, em alguns 25 métodos, anticorpos terapêuticos específicos são injetados diretamente no crânio, em alguns métodos, os anticorpos são administrados como uma composição ou dispositivo de libertação sustentada.

Um sítio de ligação ao antígeno da invenção pode, opcionalmente, ser administrado em combinação com outros agentes que são eficazes 30 no tratamento do distúrbio ou estado patológico em necessidade de tratamento (por exemplo, profilático ou terapêutico).

Em uma outra modalidade, é proporcionada uma composição

65/93 farmacêutica que inclui um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado, tal como descrito acima, um diluente e opcionalmente uma etiqueta.

Em certas modalidades, os sítios de ligação ao antígeno ou molécula que inclui o mesmo são marcados de forma detectável. Muitas etiquetas diferentes podem ser usadas, incluindo enzimas, radioisótopos, metais coloidais, compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes, e compostos bioluminescentes. Fluorocromos (fluoresceína, rodamina, vermelho do Texas, etc.), enzimas (peroxidase de rábano silvestre, βgalactosidase, fosfatase alcalina, etc.), isótopos radioativos (³²P ou ¹²⁵l), biotina, digoxigenina, metais coloidais, compostos quimioluminescentes ou bioluminescentes (dioxetanos, luminol ou acridina) são comumente usados.

Os métodos de detecção dependem do tipo de etiqueta utilizado e incluem autorradiografia, microscopia de fluorescência, reações enzimáticas diretas e indiretas. Exemplos incluem Western blotting, overlay-assays, RIA (Ensaio Radioimunológico) e IRMA (Ensaio Radioimunométrico), EIA (Ensaio Imunoenzimático), ELISA (Ensaio Imunoabsorvente Ligado a enzimas), FIA (Ensaio Imunofluorescente), e CLIA (Ensaio Imunoquimioluminescente).

Em uma outra modalidade, é fornecido um kit ou artigo de fabricação, que inclui um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição farmacêutica, como descrito acima.

Em outras modalidades, é proporcionado um kit para uso em uma aplicação terapêutica acima mencionada, o kit incluindo:

- um recipiente que contém uma composição terapêutica na forma de um ou mais de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição farmacêutica;

- um rótulo ou folheto informativo com instruções de uso.

Em certas modalidades o kit pode conter um ou mais princípios

66/93 ativos ou ingredientes adicionais para o tratamento de um câncer ou para a prevenção de uma complicação relacionada ao câncer acima descrita, ou um estado ou doença associada com a expressão do receptor P2X₇ não funcional.

O kit ou artigo de fabricação pode compreender um recipiente e um rótulo ou folheto informativo no recipiente ou associada ao mesmo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, embalagem blister, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição terapêutica que é eficaz para tratar o estado patológico e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O rótulo ou folheto informativo indica que a composição terapêutica é utilizada para tratar o estado patológico de escolha. Em uma modalidade, o rótulo ou folheto informativo inclui instruções para o uso e indica que a composição terapêutica pode ser usada para tratar um câncer ou para prevenir uma complicação resultante de câncer.

O kit pode compreender (a) uma composição terapêutica; e (b) um segundo recipiente com um segundo princípio ativo ou ingrediente nele contido. O kit nesta modalidade da invenção pode ainda compreender um folheto informativo que indica que a composição terapêutica e o outro princípio ativo podem ser usados para tratar um distúrbio ou prevenir uma complicação resultante de câncer. Alternativamente, ou adicionalmente, o kit pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas.

Em certas modalidades, a composição terapêutica pode ser fornecida sob a forma de um dispositivo, descartável ou reutilizável, incluindo um receptáculo para conter a composição terapêutica. Em uma modalidade,

67/93 o dispositivo é uma seringa. O dispositivo pode conter 1-2 mL da composição terapêutica. A composição terapêutica pode ser proporcionada no dispositivo em um estado que está pronta para uso ou em um estado que requer a mistura ou a adição de outros componentes.

Em uma outra modalidade, é fornecido um kit ou artigo de fabricação, incluindo um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpos, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou de uma composição de diagnóstico como descrito acima.

Em outras modalidades, é proporcionado um kit para uso em uma aplicação de diagnóstico acima mencionada, o kit incluindo:

- um recipiente que contém uma composição de diagnóstico na forma de um ou mais de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão ou conjugado;

- um rótulo ou folheto informativo com instruções para o uso.

O kit ou artigo de fabricação pode compreender um recipiente e um folheto informativo no recipiente ou associado com o mesmo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, embalagem blister, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição terapêutica que é eficaz para a detecção de câncer e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O rótulo ou folheto informativo indica que a composição terapêutica é utilizada para tratar o estado patológico de escolha. Em uma modalidade, o rótulo ou folheto informativo inclui instruções para uso que indica que a composição de diagnóstico pode ser usada para detectar um câncer ou uma doença ou estado patológico caracterizado pela expressão do receptor P2X₇ não funcional.

O kit pode compreender (a) uma composição de diagnóstico; e (b) um segundo recipiente com um segundo agente de diagnóstico ou segundo rótulo nele contido. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de

68/93 um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, etc.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para produzir um sítio de ligação de antígeno anti-P2X₇, tal como descrito acima, 5 incluindo expressar um ácido nucleico, como descrito acima em uma célula ou animal não humano, tal como descrito acima.

A produção de um sítio de ligação ao antígeno da invenção geralmente requer um vetor de expressão que contém um polinucleotídeo que codifica o sítio de ligação ao antígeno da invenção. Um polinucleotídeo que 10 codifica um sítio de ligação ao antígeno da invenção pode ser obtido e subclonado em um vetor para a produção de um sítio de ligação ao antígeno por tecnologia de ADN recombinante utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo as técnicas aqui descritas. Muitos sistemas de expressão diferentes são contemplados, incluindo o uso de células de mamíferos, inclu15 indo células humanas para a produção e secreção de sítios de ligação ao antígeno. Exemplos de células incluem 293F, CHO e a linha de células NSO.

Os vetores de expressão que contêm sequências codificadoras de proteínas e sinais de controle adequados de transcrição e tradução podem ser construídos usando métodos conhecidos na técnica. Estes incluem 20 técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Em certas modalidades, é proporcionado um vetor replicável que tem um ácido nucleico que codifica um sítio de ligação ao antígeno ligado operativamente a um promotor.

As células transfectadas com um vetor de expressão podem ser 25 cultivadas por técnicas convencionais para produzir um sítio de ligação ao antígeno. Assim, em certas modalidades, são proporcionadas células hospedeiras ou células transfectantes que contêm um polinucleotídeo que codifica um sítio de ligação ao antígeno da invenção ligado operativamente a um promotor. O promotor pode ser heterólogo. Vários sistemas de hospedeiro30 vetor de expressão podem ser utilizados e, em certos sistemas a maquinaria de transcrição do sistema de vetor é particularmente adaptada à célula hospedeira. Por exemplo, células de mamífero tais como células de ovário de

69/93 hamster chinês (CHO) podem ser transfectadas com um vetor que inclui o elemento promotor do gene precoce intermédio principal do citomegalovírus humano. Adicionalmente ou alternativamente, pode ser utilizada uma célula hospedeira que modula a expressão de sequências inseridas ou modifica e 5 processa o produto do gene, conforme necessário, incluindo várias formas de modificação pós-traducional. Exemplos de células hospedeiras de mamífero que têm processos de modificação pós-tradução particulares incluem CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, NSO, CRL7030 e células HsS78Bst.

Dependendo do uso pretendido para a molécula de proteína, vários vetores de expressão bacterianos podem ser vantajosamente selecionados. Em um exemplo, os vetores que causam a expressão de níveis elevados de produtos de fusão de proteína que são prontamente purificados, tal como o vetor de expressão de E. coli pUR278 podem ser usados quando 15 uma grande quantidade de um sítio de ligação ao antígeno deve ser produzido. O produto de expressão pode ser produzido na forma de uma proteína de fusão com lacZ. Outros vetores bacterianos incluem vetores pIN e semelhantes. Os vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa-S-transferase 20 (GST). Estas proteínas de fusão são geralmente solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação à matriz de afinidade de glutationa-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Uma trombina e/ou sítio de divagem da protease do fator Xa pode ser proporcionado no polipeptídeo expresso de modo que o produto do 25 gene alvo clonado pode ser libertado da unidade de GST.

O vírus de poliedrose nuclear de Autographa califomica (AcNPV) pode ser utilizado como um vetor para expressar genes estranhos em um sistema de inseto, incluindo células de Spodoptera frugiperda. O promotor particular usado pode depender do local onde a codificação da proteína é 30 inserida na sequência. Por exemplo, a sequência pode ser clonada individualmente no gene da poliedrina e colocado sob o controle do promotor da ροlied rina.

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Sistemas de expressão com base em vírus podem ser utilizados com células de mamíferos, tal como um adenovirus de modo que a sequência de codificação de interesse pode ser ligada ao promotor adenoviral tardio e sequência líder tripartida. A recombinação in vitro ou in vivo pode então ser usada para inserir este gene quimérico no genoma adenoviral. Inserções na região E1 ou E3 resultarão em um vírus recombinante viável que é capaz de expressar o sítio de ligação ao antígeno em células hospedeiras infectadas. Sinais de iniciação específicos, incluindo o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes podem ser necessários para a tradução eficiente de sequências de codificação do sítio de ligação de antígenos inseridas. Os sinais e códons de controle de iniciação e tradução podem ser obtidos de uma variedade de origens, tanto naturais como sintéticas. Elementos intensificadores de transcrição e terminadores de transcrição podem ser usados para melhorar a eficiência da expressão de um sistema com base viral.

Onde é necessária a produção de proteínas recombinantes de alto rendimento a longo prazo, a expressão estável é preferida. Em geral, é usado um gene marcador selecionável, pelo qual após a transfecção, as células são cultivadas durante 1-2 dias em um meio enriquecido e depois transferidas para um meio que contém um meio seletivo no qual as células que contêm o marcador selecionável correspondente, por exemplo, resistência a antibióticos podem ser rastreadas. O resultado é que as células que integraram de forma estável o plasmídeo nos seus cromossomas crescem e formam foci que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Os genes da timidina-quinase do vírus herpes simplex, hipoxantinaguanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase são exemplos de genes que podem ser usados em células tk”, hgpr’ ou aprt’, respectivamente, proporcionando assim sistemas de seleção apropriados. Os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato; gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico; neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418; e hygro, que confere resistência à higromicina são exemplos de genes que podem ser usados em sistemas de seleção antimetabólito.

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Um sítio de ligação ao antígeno da invenção pode ser purificado por um sistema de expressão recombinante por meio de métodos conhecidos, incluindo cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade (especialmente afinidade para os antígenos específicos da proteína A ou de Proteína G) e cromatografia em coluna de filtração em gel), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. A purificação pode ser facilitada através do fornecimento do sítio de ligação ao antígeno na forma de uma proteína de fusão.

Grandes quantidades dos sítios de ligação ao antígeno da invenção podem ser produzidos por um processo escalonável que começa com um sistema de expressão piloto em um laboratório de pesquisa que é aumentado para um biorreator de escala analítica (tipicamente biorreatores de 5 L a cerca de 50 L) ou biorreatores à escala de produção (por exemplo, mas não limitado a 75 L, 100 L, 150 L, 300 L, ou 500 L). Os processos escalonáveis desejáveis incluem aqueles em que há níveis baixos a não detectáveis de agregação tal como medido por HPSEC ou rCGE, tipicamente não mais de 5% de agregação em peso de proteínas até não mais de 0,5% em peso de agregação de proteínas. Adicionalmente ou alternativamente, níveis indetectáveis de fragmentação medidos em termos da área de pico total que representa o sítio de ligação ao antígeno intacto podem ser desejados em um processo escalonável de modo que pelo menos 80% e até 99,5% ou mais da área de pico total representa o sítio de ligação ao antígeno intacto. Em outras modalidades, o processo escalonável da invenção produz sítios de ligação ao antígeno na eficiência de produção de cerca de 10 mg/L até cerca de 300 mg/L ou mais.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para o tratamento de uma doença ou estado patológico caracterizado pela expressão do receptor P2X₇ não funcional em um indivíduo, incluindo a etapa de proporcionar um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição farmacêutica, tal como descrito acima, a um indivíduo que necessita de tratamento para o referido estado patológico. Tipicamente,

72/93 o estado patológico é o câncer, especialmente um câncer epitelial como aqui descrito. Em certas modalidades, o indivíduo tem câncer metastático ou tem o potencial para um câncer formar metástases.

As doenças pré-neoplásicas e neoplásicas são exemplos parti5 culares às quais os métodos da invenção podem ser aplicados. Exemplos gerais incluem tumores de mama, tumores colorretais, adenocarcinomas, mesotelioma, tumores de bexiga, tumores de próstata, tumor de células germinativas, hepatoma/colongio, carcinoma, tumores neuroendócrinos, neoplasia da pituitária, tumor de pequenas células redondas 20, câncer de cé10 lulas escamosas, melanoma, fibroxantoma atípico, seminomas, não seminomas, tumores estromais de células de Leydig, tumores de células de Sertoli, tumores da pele, tumores renais, tumores testiculares, tumores cerebrais, tumores ovarianos, tumores do estômago, tumores orais, tumores da bexiga, tumores ósseos, tumores cervicais, tumores do esôfago, laringe, fí15 gado tumores, tumores de pulmão, tumores vaginais e tumor de Wilm.

Exemplos de tipos de câncer específicos incluem, mas não estão limitados a adenocarcinoma, adenoma, adenofibroma, adenolinfoma, adontoma, cânceres relacionados a AIDS, neuroma do acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda, carcinoma adenocístico, câncer adrenocorti20 cal, metaplasia mielóide agnogênica, alopécia sarcoma, alveolar de partes moles, ameloblastoma, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia, angioma esclerosante, angiomatose, apudoma, câncer anal, angiossarcoma, anemia aplástica, astrocitoma, ataxia-telangiectasia, carcinoma basocelular (pele), câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer do intestino, glioma do 25 tronco cerebral, tumores cerebrais e do sistema nervoso central, câncer de mama, branquioma, tumores do SNC, tumores carcinóides, câncer cervical, tumores cerebrais na infância, câncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tecido mole da infância, condrossarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide crônica, cânceres colorretais, linfoma cutâneo de 30 células T, carcinoma (por exemplo, Walker, célula basal, basoescamoso, Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, células de Merkel, mucinoso, células não pequenas do pulmão, células de aveia, papilar, cirroso, bronquio73/93 lar, broncogênico, de células escamosas e de células de transição), carcinossarcoma, displasia cervical, cistossarcoma filode, cementoma, cordoma, coristoma, condrossarcoma, condroblastoma, craniofaringioma, colangioma, colesteatoma, cilindroma, cistoadenocarcinoma, cistoadenoma, dermatofibrossar5 coma protuberante, tumor desmoplásico de pequenas células redondas, carcinoma ductal, disgerminoma, cânceres endócrinos, câncer de endométrio, ependimoma, câncer do esôfago, sarcoma de Ewing, câncer das vias biliares extra-hepáticas, câncer de olho, olho: melanoma, retinoblastoma, câncer ddas trompas de falópio, anemia de Fanconi, fibroma, fibrossarcoma, câncer da 10 vesícula biliar, câncer gástrico, cânceres gastrointestinais, tumor carcinóide gastrointestinal, câncer do aparelho geniturinário, tumores de células germinativas, doença gestational trofoblástica, glioma, cânceres ginecológicos, tumores de células gigantes, ganglioneuroma, glioma, glomangioma, tumor de células granulosas, ginandroblastoma, malignidades hematológicas, leucemia de 15 células pilosas, câncer da cabeça e pescoço, câncer hepatocelular, câncer da mama hereditário, histiocitose, doença de Hodgkin, papilomavírus humano, mola hidatiforme, hipercalcemia, câncer da hipofaringe, hamartoma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangiopericitoma, hemangiossarcoma, hemangiossarcoma, distúrbios histiocíticos, histiocitose maligna, histiocitoma, 20 hepatoma, hidradenoma, imunoproliferativa pequeno, opoma, melanoma ontraocular, câncer das células da ilhotas, sarcoma de Kaposi, câncer do rim, histiocitosedas células de Langerhans, câncer da laringe, leiomiossarcoma, leucemia, síndrome de Li-Fraumeni, câncer de lábio, lipossarcoma, câncer do fígado, câncer de pulmão, linfedema, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma não 25 Hodgkin, leigomiossarcoma, leucemia (por exemplo, de células b, células mistas, células nulas, células T, células T crônica, associada ao HTLV-II, linfangiossarcoma, linfocítica aguda, linfocítica crônica, mastócitos e mielóide), leucosarcoma, tumor das células de Leydig, lipossarcoma, leiomioma, leiomiossarcoma, linfangioma, linfangiocitoma, linfangioma, linfangiomioma, linfangios30 sarcoma, câncer de mama masculino, tumor rabdóide do rim maligno, meduloblastoma, melanoma, câncer das células de Merkel, mesotelioma, câncer metastático, câncer de boca, neoplasia endócrina múltipla, micose fungóide,

74/93 síndromes de mielodisplasia, mieloma, distúrbios mieloproliferativos, síndrome carcinoide maligna, doença cardíaca carcinoide, meduloblastoma, meningioma, melanoma, mesenquimoma, mesonefroma, mesotelioma, mioblastoma, mioma, miosarcoma, mixoma, mixossarcoma, câncer nasal, câncer de nasofa5 ringe, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatose, síndrome de quebra de Nijmegen, câncer de pele não melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), neurilemoma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibromatose, neurofibroma, neuroma, neoplasias (por exemplo, osso, mama, sistema digestivo, colorretal, fígado), cânceres oculares, câncer de esôfago, 10 câncer da cavidade oral, câncer da orofaringe, osteossarcoma, câncer de ovário ostomia, câncer do pâncreas, câncer paranasal, câncer da paratireoide, câncer da glândula parótida, câncer do pênis, tumores neuroectodérmicos periféricos, câncer da pituitária, policitemia vera, câncer da próstata, osteoma, osteossarcoma, carcinoma do ovário, papiloma, paragangliomas, paragangli15 orna não cromafim, pinealoma, plasmacitoma, proto-oncogene, cânceres raros e distúrbios associados, carcinoma celular renal, retinoblastoma rabdomiossarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, reticuloendoteliose, rabdomioma, câncer da glândula salivar, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sézary, câncer de pele, câncer de pulmão de pequenas células (sclc), câncer de intes20 tino delgado, sarcoma de tecidos moles, tumores da medula espinal, carcinomade células escamosas (pele), câncer do estômago, sarcoma sinovial, sarcoma (por exemplo, sarcomas experimental de Ewing, de Kaposi e mastócitos), tumor das células de Sertoli, sinovioma, câncer testicular, câncer do timo, câncer da tireoide, câncer de células transicionais (bexiga), câncer de células 25 transicionais (renal-pélvis/ureter), câncer trofoblástico, teratoma, tumor das células da teca, timoma, tumor trofoblástico, câncer da uretra, câncer do sistema urinário, uroplaquinas, sarcoma uterino, câncer do útero, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumor de Wilms.

Outras doenças e estados patológicos incluem vários estados in30 flamatórios. Os exemplos podem incluir um componente proliferativo. Exemplos específicos incluem acne, angina, artrite, pneumonia aspirativa, doença, empiema, gastroenterite, inflamação, gripe intestinal, nee, enterocolite ne75/93 crosante, doença inflamatória pélvica, faringite, pid, pleurisia, dor de garganta, vermelhidão, rubor, garganta inflamada, gripe do estômago e infecções do trato urinário, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica, polineuropatia desmie5 linizante inflamatória crônica ou polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um uso de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina anticorpo, Fab, dab, scFsv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado ou composição 10 farmacêutica, como descrito acima na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

A posologia, frequência da dosagem, vias de administração, etc. são descritas em detalhe acima.

Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para o 15 diagnóstico de câncer incluindo a etapa de colocar tecidos ou células para os quais a presença ou ausência de câncer é para ser determinada em contato com um reagente na forma de um sítio de ligação ao antígeno, domínio variável de imunoglobulina, anticorpo, Fab, dab, scFv, diacorpo, triacorpo, proteína de fusão, conjugado composição ou de diagnóstico, tal como des20 crito acima e detecção para a ligação do reagente com os tecidos ou células.

O método pode ser operado in vivo ou in vitro.

Para o diagnóstico in situ, o sítio de ligação ao antígeno pode ser administrado ao organismo a ser diagnosticado por via intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, injeção intra-arterial ou outras vias de 25 tal modo que possa ocorrer uma ligação específica entre um sítio de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, com uma região eptitópica no receptor P2X₇ não funcional. O complexo anticorpo/antígeno pode convenientemente ser detectado através de uma etiqueta ligada ao sítio de ligação ao antígeno ou um seu fragmento funcional ou qualquer outro método de detec30 ção conhecido da técnica.

Os imunoensaios utilizados em aplicações de diagnóstico de acordo com a invenção e como aqui descritos, tipicamente dependem de an

76/93 tígenos, anticorpos marcados ou reagentes secundários para a detecção. Estas proteínas ou reagentes podem ser marcados com compostos geralmente conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo enzimas, radioisótopos, e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogênicas, que in5 cluem, mas não se limitam a partículas coloridas, tais como ouro coloidal e pérolas de látex. Destes, a marcação radioativa pode ser usada para quase todos os tipos de ensaios e com a maioria das variações. As etiquetas conjugadas com enzima são particularmente úteis quando a radioatividade deve ser evitada ou quando resultados rápidos são necessários. Fluorocromos, 10 embora requeiram equipamento caro para a sua utilização, proporcionam um método muito sensível de detecção. Os anticorpos úteis nestes ensaios incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, e anticorpos policlonais purificados por afinidade.

Alternativamente, o sítio de ligação ao antígeno pode ser marca15 do indiretamente por reação com substâncias marcadas que têm uma afinidade pela imunoglobulina, tais como a proteína A ou G ou segundos anticorpos. O sítio de ligação ao antígeno pode ser conjugado com uma segunda substância e detectado com uma terceira substância marcada que tem uma afinidade pela segunda substância conjugada com o sítio de ligação ao antí20 geno. Por exemplo, o sítio de ligação ao antígeno pode ser conjugado com biotina e o conjugado do sítio de ligação ao antígeno-biotina pode ser detectado usando avidina ou estreptavidina marcada. Do mesmo modo, o sítio de ligação ao antígeno pode ser conjugado com um hapteno e o conjugado do sítio de ligação ao antígeno-hapteno podem ser detectado utilizando anticor25 po marcado anti-hapteno.

Em certas modalidades, os imunoensaios utilizam um método de anticorpo duplo para detectar a presença de um analito, em que, o sítio de ligação ao antígeno é marcado indiretamente por reatividade com um segundo anticorpo que foi marcado com um marcador detectável. O segundo 30 anticorpo é de preferência um anticorpo que se liga a anticorpos do animal do qual o sítio de ligação ao antígeno é derivado. Em outras palavras, se o sítio de ligação ao antígeno for um anticorpo de camundongo, então o se

77/93 gundo anticorpo marcado é um anticorpo anticamundongo. Para que o sítio de ligação ao antígeno para seja usado no ensaio aqui descrito, esta etiqueta é, de preferência um grânulo revestido com o anticorpo, particularmente um grânulo magnético. Para que o sítio de ligação ao antígeno seja usado no imunoensaio aqui descrito, a etiqueta é de preferência uma molécula detectável, tal como uma substância radioativa, fluorescente ou eletroquimioluminescente.

Um sistema alternativo de anticorpo duplo, muitas vezes referido como sistemas de formato rápido porque estão adaptados para determinações rápidas da presença de um analito, podem também ser utilizados dentro do âmbito da presente invenção. O sistema requer uma elevada afinidade entre o sítio de ligação ao antígeno e o analito. De acordo com uma modalidade da presente invenção, a presença do receptor P2X₇ não funcional é determinada utilizando um par de sítios de ligação ao antígeno, cada um específico para a proteína do receptor P2X₇. Um dos referidos pares de sítios de ligação ao antígeno é aqui referido como um sítio de ligação ao antígeno detector e o outro do referido par de sítios de ligação ao antígeno é aqui referido como um sítio de ligação ao antígeno de captura. O sítio de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser usado como um sítio de ligação ao antígeno de captura ou um sítio de ligação ao antígeno detector. O sítio de ligação ao antígeno da presente invenção também pode ser usado tanto como um sítio de ligação ao antígeno detector como de captura juntos em um único ensaio. Uma modalidade da presente invenção, portanto, utiliza o método sanduíche do sítio de ligação ao antígeno duplo para a detecção do receptor P2X₇ não funcional em uma amostra de fluido biológico. Neste método, o analito (proteína do receptor P2X₇ não funcional) é colocado entre o sítio de ligação ao antígeno detector e o sítio de ligação ao antígeno de captura, o sítio de ligação ao antígeno de captura sendo irreversivelmente imobilizado sobre um suporte sólido. O sítio de ligação ao antígeno detector conteria um marcador detectável, a fim de identificar a presença do sanduíche sítio de ligação ao antígenoanalito e, desse modo, a presença do analito.

Exemplos de substâncias de fase sólida incluem, mas não estão

78/93 limitados a placas de microtitulação, tubos de ensaio de poliestireno, contas magnéticas, de plástico ou de vidro e lâminas que são bem conhecidas no campo de radioimunoensaio e imunoensaio enzimático. Métodos para acoplamento de sítios de ligação ao antígeno a fases sólidas são também bem 5 conhecidos dos especialistas na técnica. Mais recentemente, vários materiais porosos tais como o nylon, nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polímeros porosos têm sido empregados como suportes sólidos.

Os exemplos a seguir se destinam a ilustrar, mas de modo algum limitam a presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1 - Geração e purificação do anticorpo 2F6

Objetivo: As experiências aqui descritas detalham a geração e a purificação de um anticorpo que se liga ao receptor P2X₇, expresso em células vivas. Em particular, as experiências descrevem a geração e a purifica15 ção de um anticorpo com a sequência como apresentado na SEQ ID NO: 4 (2F6).

Antecedentes: Os sítios de ligação ao antígeno que se ligam a um monômero do receptor P2X₇ são conhecidos, no entanto, até à data não são conhecidos anticorpos que se ligam especificamente a epitopos confor20 macionais nos receptores P2X₇ expressos em células vivas em forma de trímeros, especificamente abrangendo a interface entre os monômeros adjacentes. Os sítios de ligação ao ATP formam na interface embalada corretamente entre monômeros com resíduos 200-210 sobre um monômero e resíduos 296-306 sobre o monômero adjacente exposto quando os receptores 25 são incapazes de se ligarem ao ATP como ocorre em células cancerosas.

Materiais e métodos: Geração do peptídeo E200 e E300. O complexo epitopo peptídeo E200-300 formado em parte a partir de um peptídeo E200 (resíduos 200-211 na sequência humana do receptor P2X₇) e um peptídeo E300 (resíduos 295-306 na sequência do receptor humano P2X₇), 30 espaçados com a adição do dipeptídeo GA foi feito por síntese em fase sólida em Chiron Mimotopes. Uma variedade de conjugados foi sintetizada para identificar aqueles mais prováveis de serem úteis para fins de triagem. Estes

79/93 incluíam conjugados de proteína BSA, DT, ovalbumina e KLH ligado ao Cterminal Cys que residem no peptídeo E200-300 através de maleimidocaproil-N-hidroxsuccinimida (MCS). Uma quarta variante envolvia a biotinilização do peptídeo E200-300 no C-terminal.

Camundongos BALB-C foram imunizados com E200-300 conjugado com toxóide da difteria (E200-300DT) utilizando 25 pg/dose nos dias 0, 16, 37, 56, 88 e 162. A injeção do dia 0 foi administrada por via subcutânea (sc) em adjuvante CpG (ImmunoEasy, Lote N° 11547836, 11235150 e 11549008, Qiagen). As injeções dos dias 16, 37 e 88 injeções foram dadas metade sc e metade por via intramuscular (im). As injeções dos dias 56 e 162 foram administradas por via intravenosa (iv). Quatro dias após o reforço iv final, os camundongos imunizados foram sangrados e os seus soros testados quanto à sua atividade E200-300 anti-P2X₇ por ELISA. Os três animais que apresentam o maior título E200-300 anti-P2X₇ foram sacrificados e seus baços foram removidos. As células do baço foram isoladas e fundidas com células da linha celular de mieloma do camundongo Sp2/0 a uma proporção de 5:1. As células fundidas foram plaqueadas em meio RPMI 1640. Os hibridomas foram selecionados sucessivamente em HAT seguido por HT, suplementado com IL-6 de camundongo. Clones precursores adequados foram inicialmente identificados como positivos por ELISA tanto em fase sólida como em triagens de fase de solução. Aglutinantes de baixa afinidade foram extraídos e, em seguida, o DNA sequenciado a partir dos clones precursores antes ao silenciamento induzido pelos efeitos do produto do anticorpo clonal sobre a sobrevivência da célula hospedeira.

Resultados: Após o plaqueamento as células fundidas em placas de 8 x 96 poços e duas etapas de clonagem, por diluição a 0,3 células por poço, um clone reativo com conjugado P2X₇ E200-300 albumina de soro bovino (BSA) por ELISA, sobreviveu e foi designado 2F6. O clone foi subclonado e os 24 produtos designados 2F61-2F24 foram, cada um, sequenciados. Os anticorpos em cada caso eram da classe IgM com cadeias leves Kappa.

Cada subclone foi confirmado como tendo uma sequência idêntica. As cadeias V_H e V_L foram extraídas e emendadas em uma sequência

80/93 lgG2a de camundongo (Figuras 2 e 3) com a finalidade de maior desenvolvimento molecular enquanto o IgM foi cultivado em ascite de camundongo para posterior caracterização.

A figura 6 mostra a sequência do scFv 2F6 marcado com marcas FLAG e HIS no C-terminal para caracterizações bioquímicas.

O lgG2a-2F6 de camundongo foi cultivado em células HEK293 parentais transfectadas com pcDNA3.1-mlgG2a-2F6 portadoras de resistência a G418. As células foram selecionadas em G418 durante 21 dias para criar o pool resistente.

A expressão estável foi realizada ao longo de um lote de cultura de sete dias a 37 °C em um biorreator de onda com um Sartorius 20L CultiBag. A expressão foi realizada em meio de expressão Invitrogen Freestyle 293 com o pH mantido entre 7,3 e 6,8 com controle de CO2. A cultura foi centrifugada para remover as células e o sobrenadante colhido foi processado imediatamente.

Tabela	5: Sumário da Cultura de Células
	Processo	Resultado / Comentário
Linha celular	Células HEK293	Linha celular estável que expressa lgG2a-2F6 de camundongo
Meio	Invitrogen Freestyle 293	Invitrogen Freestyle 293
Volume da cultura alvo	10 L	10 L
Densidade da inoculação	0,2x10⁶ células/mL	0,2x10⁶células/mL
Colheita	Depois de cultura de 7 dias de duração	2,9 x10⁶ células/mL 71% viáveis

Contagens celulares realizadas por exclusão de azul de tripano em Cedex HiRes, Innovatis

O sobrenadante colhido foi ajustado ao pH 7,1 e filtrado a 0,2 pm antes do carregamento de um dia para o outro a uma coluna de 61 mL de Proteína A (GE Healthcare, rProtein A Sepharose FF). A coluna foi limpa com 2CV de Triton X-100 a 0,1% seguido por sanitização com ácido acético 0,1 M em etanol a 20% antes da utilização. O anticorpo foi eluído da coluna na direção inversa com uma etapa de gradiente para ácido acético 0,1 Μ. O

81/93 pico eluído foi neutralizado com acetato de sódio 1 M até pH 5.

Tabela 7: Sumário da Cromatografia da Proteína A

	Processo	Resultado / Comentário
Sobrenadante colhido	pH ajustado a 7,1 com Tris a 1 M, pH 8,3	Adicionado 10 mL pH de partida = 7,03 pH final = 7,08
Equilíbrio	>5CV1xDPBS, pH~7,4	6,8 CV
Carga	tempo de permanência > 1 min	10 mL/min (tempo de permanência de 6,1 min)
Lavagem	>3CV1xDPBS	5,3 CV
Eluição	> 3 CV de ácido acético a 1 M	3,4 CV
Pico	Colhido manualmente	35 mL
Neutralização	Acetato de sódio a 1,0 M	3,5 mL

O pico neutralizado foi filtrado a 0,2 pm para remover quaisquer partículas antes da permuta aniônica. O pico neutralizado filtrado foi carre5 gado em uma coluna de permuta aniônica de 54 mL (GE Healthcare, Q Sepharose FF). A coluna foi limpa e sanitizada com hidróxido de sódio 0,5 M, antes de uma lavagem com alta concentração de sal e equilíbrio em ácido acético 0,1 M, pH 5,0. O tampão contínuo foi ácido acético 0,1 M, pH 5,0. O escoamento da etapa de troca aniônica foi recolhido.

__________Tabela 8: Sumário da Cromatografia de Troca Aniônica_____

	Processo	Resultado / Comentário
Lavagem com alta concentração de sal	> 1 CV de ácido acético a 0,1 M, NaCI a 2 M, pH 5,0	1 CV
Equilíbrio	> 5 CV de ácido acético a 0,1 M, pH 5,0	5,3 CV
Carga	Não especificado	10 mL/min (tempo de permanência de 5,4 min)
Escoamento	Colhido manualmente	64,8 mL
Produto concentrado	Retentado de ultrafiltração	23 mL

O escoamento concentrado da troca aniônica foi carregado diretamente em uma coluna de dessalinização de 140 mL (GE Healthcare, Sephadex G-25 fino). A coluna foi limpa e sanitizada com hidróxido de sódio

82/93

0,2 M antes de equilíbrio em DPBS 1x. O tampão contínuo foi 1x DPBS.

Em uma câmara de segurança biológica, o produto dessalinizado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm para um recipiente estéril. Amostras dos produtos finais foram removidas assepticamente do volume filtrado. 5 O volume filtrado e as amostras do produto final foram armazenadas a 4 °C.

Tabela 9: Sumário de Troca de Tampão
	Processo	Resultado / Comentário
Equilíbrio	1x DPBS, pH ~7,4 (até que os patamares de condutividade e pH sejam neutros)	Como padrão
Carga	Máximo 28 mL	23 mL carregados
Pico	Colhido manualmente	39,9 mL
Filtração	Filtro a 0,2 pm em câmara de segurança biológica	Millex GV, filtro de seringa a 0,22 pm PVDF, 33 mm
Produto final	Massa ou volume	37,6 mL

O produto final foi testado quanto a concentração de proteína, endotoxina, conteúdo de DNA, pureza e agregação. O produto foi armazenado a 4 °C antes da análise.

Tabela 10: Sumário dos resultados dos ensaios para o produto final

Teste	Método de Teste	Especificação	Resultado	Aprovado/ Reprovado
Concentração de Proteína	Absorbância a 280 nm, EC = 1,4	>1,0 mg/mL	1,6 mg/mL	Aprovado
DNA	Invitrogen Quant-iT PicoGreen kit	< 380 ng/mL	15 + 1 ng/mL	Aprovado
Endotoxina	Charles River Endosafe PTS 0,05 - 5EU/mL cartucho	< 3 EU/mL	0,121 EU/mL (0,076 EU/mg)	Aprovado
Agregação e pureza	SE-HPLC TOSOH Biosciences TSKgel G3000SWXL	<5% de agregação > 95% puro	< 1% agregado > 98% puro (figura 7)	Aprovado
SDS-PAGE	NuPAGE 4-12% gel Bis-Tris, Tampão MOPS, Corante SimplyBlue Safe	Para informação	(figura 8)	N/D

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O mesmo scFv de camundongo de 2F6 foi enxertado em um formato humano do tipo lgG1 e expresso de forma similar em células HEK293.

Conclusão: Foram identificados sítios de ligação ao antígeno na forma de precursores para ligação de alta afinidade aos receptores P2X₇ em células vivas. Os sítios de ligação ao antígeno foram selecionados para abranger a interface entre monômeros adjacentes que formam o receptor trimérico ao expor o sítio de ligação ao ATP subjacente em conformação não funcional do receptor. O epitopo composto alvo era para permanecer inacessível na conformação única do receptor montado capaz de função a fim de evitar toda reatividade cruzada com células normais que expressam o receptor P2X₇.

Exemplo 2 - Caracterização bioquímica de formas de anticorpos 2F6

Objetivo: Determinar se as formas de anticorpos 2F6, incluindo o IgM e o lgG2a de camundongo, se ligam a receptores não funcionais na superfície de células vivas.

Além disso, determinar se as formas de anticorpos 2F6 inibem uma propriedade de uma célula, por exemplo, uma célula de câncer, que expressa receptores P2X₇ não funcionais.

Antecedentes: Sabe-se que as células cancerosas expressam receptores não funcionais que consistem em um trímero de monômeros do receptor P2X₇. Quando capazes de funcionar, os receptores P2X₇ montados na superfície celular ligam-se ao ATP com o efeito que o canal formado entre os monômeros montadas em um trímero sofre uma transição para um poro mais amplo capaz de aumentar significativamente o ingresso de íons cálcio para dentro da célula para iniciar a atividade da caspase, levando à apoptose e à morte celular. A apoptose é retida ou inibida em células cancerosas que são incapazes de morrer mesmo que o receptor P2X₇ seja posicionado na superfície da célula. Estes receptores são chamados receptores P2X₇ não funcionais e têm sido encontrados em uma ampla variedade de cânceres.

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Resultados: As formas de anticorpos 2F6, tanto IgM (figuras 9a-

d) como lgG2a (figura 9e), inibiram o crescimento das células em uma variedade de linhas celulares de câncer incluindo da próstata PC3, cólon COLO205, mama MDAMB231, melanoma A375 e mama MCF7, conforme de5 terminado na técnica de coloração Cell Titer Blue Assay de crescimento celular. As células foram semeadas a uma densidade apropriada e cultivadas durante um período de 3 dias ou 5 dias para chegar a um nível próximo à confluência no final do período de teste, na presença de anticorpos de controle e na presença de anticorpos de teste, seja do tipo IgM ou lgG2a de 2F6 10 na faixa de concentração de 0-40 pg/mL. O teste de crescimento da linha de células foi realizado com densidades de semente que variam de 100-2000 células/poço. Em comparação com os anticorpos de controle que não tinham efeito sobre o crescimento dos vários tipos de células de tumores, um aumento da concentração, tanto do tipo IgM como lgG2a de 2F6 inibiu o cres15 cimento celular.

A figura 10 apresenta dados do crescimento de células MCF7 na presença ou ausência de 10 pg/mL do anticorpo 2F6 IgM. A presença do anticorpo inibe muito o crescimento das células durante 3 dias, enquanto a pré-incubação do anticorpo com epitopo peptídico solúvel em 5-50 pg/mL 20 não tem efeito sobre a inibição. No entanto, a 500 pg/mL de peptídeo, o anticorpo não é mais capaz de afetar o crescimento das células uma vez que o peptídeo eficazmente capta o anticorpo disponível, impedindo-o de ligação aos receptores na superfície celular.

Um modo de ação pelo qual o 2F6 é capaz de inibir o crescimen25 to celular foi determinado por um ensaio de apoptose ApoOne em que a atividade caspase 3/7 foi medida em combinação com o crescimento celular através da técnica de coloração Cell Titer Blue Assay. Células Colo205 foram cultivadas em um ensaio de crescimento de 3 dias com o 2F6 aumentando de 0-40 pg/mL. O controle positivo gemcitabina foi adicionado para 30 estabelecer o grau de apoptose que pode ser provocado pela presença do anticorpo ligado. A figura 11 revela claramente que a apoptose é iniciada na presença de crescentes anticorpos, com 20-40 pg/mL suficiente para iniciar

85/93 a atividade completa.

A aparência de células MCF7 cultivadas em 20 pg/mL do IgM 2F6 comparado com o anticorpo de controle que não se liga às células é mostrada nas imagens confocais na figura 12 em que muitas células já estão mortas após exposição de apenas 24 horas.

Conclusão: A interação das formas de anticorpos 2F6, tanto IgM como lgG2a, com receptores P2X₇ não funcionais nas células cancerosas provoca a inibição do crescimento celular e a indução de apoptose ou morte celular.

Exemplo 3 - Ligação do anticorpo ao tecido tumoral vivo

Objetivo: Determinar se os anticorpos dirigidos a um epitopo composto acessível único que abrange monômeros adjacentes dentro do trímero P2X₇ expresso na superfície de células cancerosas são mais capazes de se ligarem diferencialmente ao alvo na superfície de células cancerosas vivas em comparação com o alvo residual sobre células cancerosas mortas.

Antecedentes: O anticorpo 2F6 se liga através de monômeros adjacentes a receptores P2X₇ expressos sobre células cancerosas, mas não sobre receptores que são expressos em células normais que expressam receptores P2X₇ funcionais ou capazes de função, tais como aqueles em glóbulos· brancos e vermelhos. Um anticorpo capaz de se ligar especificamente a receptores P2X₇ não funcionais atingindo um epitopo confinado a um monômero do receptor é também capaz de se ligar a tais alvos monoméricos que podem ser libertados do compartimento citoplasmático de células mortas, deste modo reduzindo o potencial terapêutico à medida que o mesmo se torna parcialmente ligado por receptores P2X₇ de células mortas além de receptores P2X₇ de células vivas que necessitam um aumento da dose eficaz.

Materiais e métodos: Camundongos BALB/c fêmeas inoculados com os tumores mamários de murino 4T1 ortotópicos singênicos no panículo adiposo das suas terceiras glândulas mamárias ou camundongos fêmeas NOD/SCID inoculados com o tumor em xenoenxerto de Hep3B ortotó

86/93 pico humano em seus fígados foram tratados por via intravenosa com um anticorpo de domínio humano (2-2-1 hFc) dirigido a um alvo monomérico (epitopo E200 em P2X₇) ou 2F6-hlgG1 dirigido para o epitopo composto E200-300. Todos os procedimentos aprovados pelo Comitê de Ética em Ex5 perimentação Animal da Universidade de Adelaide (M46-2008). A penetração do anticorpo dentro dos tumores foi medida utilizando anticorpo antihumano de cabra da Jackson Immunosearch em seções do tumor que foram removidas dos camundongos dois dias após o tratamento com anticorpo. Os tumores foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% durante 48 10 horas, embebidos em parafina, seccionadas a 5 pm, desparafinizados, e corados com anticorpo humano. Foi usado o sistema de detecção secundário Biocare Mach 4, que compreende uma sonda de anticorpo específico de cabra, seguido por um polímero com HRP depois coradas com DAB.

Resultados: Os anticorpos que visam o sítio de ligação ao mo15 nômero E200 dentro do trímero ligam células vivas dentro dos tumores 4T1 (figura 13a), embora da mesma forma se ligam a células que estão mortas e moribundas, juntamente com detritos celulares (figura 13b). No caso dos tumores pulmonares de Lewis, a ligação a células vivas (figura 13c) parece moderada e membranosa mas as células já destruídas (figura 13d) continu20 am a serem capazes de captar tais anticorpos (2-2-1 hFc).

Os mesmos tipos de tumores foram investigados quanto a ligação a células residuais vivas e mortas usando 2F6 hlgG1. A ligação a células vivas em 4T1 mostrou uma etiqueta membranosa clara (figura 14a) e, em contraste com o ligante monomérico 2-2-1 hFc, a ligação do anticorpo à inter25 face entre monômeros foi largamente inibida de ligação a detritos celulares embora permanecesse ligada a células moribundas (figura 14b). De forma similar, a ligação a tumores pulmonares de Lewis mostrou ligação membranosa forte (figura 14c). As células moribundas tinham etiqueta de anticorpo residual, mas os detritos celulares permaneceram claros (figura 14d). A figu30 ra também mostra glóbulos vermelhos que permanecem completamente não etiquetados, embora os mesmos expressem receptores P2X₇, embora em uma conformação capaz de função que não expõe o epitopo E200-300 ao

87/93 anticorpo.

Conclusão: Foram produzidos sítios de ligação ao antígeno tal que um anticorpo dirigido contra o alvo complexo abrangendo a interface intermonômero tinha uma vantagem sobre os anticorpos confinados a um sítio de ligação sobre o monômero em que muito menos do anticorpo 2F6 foi mal dirigido por ligação a detritos celulares criados da morte de células vivas, reduzindo assim a dose terapêutica requerida.

Exemplo 4 - Eficácia terapêutica do 2F6 hlgG1

Objetivo: A eficácia terapêutica do 2F6 hlgG1 foi determinada em modelos de tumores de xenoenxerto em camundongos e comparada com um anticorpo policlonal de ovelha de alta afinidade produzido para o mesmo alvo e purificado por afinidade.

Antecedentes: Os anticorpos dirigidos ao alvo epitopo monomérico E200 em P2X₇ não funcional expresso em células cancerosas exibiram efeitos terapêuticos de eliminação de células tumorais e inibição do crescimento tumoral. Estes anticorpos terapêuticos ligados na faixa subnanomolar, exibem constante de ligação dois logs mais elevada do que exibe o 2F6 hlgG1. Um anticorpo policlonal de ovelha de alta afinidade similar foi desenvolvido contra o mesmo composto epitopo E200-300 para examinar a eficácia provável de um anticorpo da forma de 2F6 após a maturação de afinidade para melhorar a constante de ligação.

Materiais e métodos:

Reagentes para a cultura de células 4T1 de tumor de mama de camundongo foram obtidos a partir dos seguintes fornecedores: meio de cultura celular RPM1 1640, FCS, Glutamax, HBSS e penicilina-estreptomicina da Invitrogen Austrália (Mt Waverley, VIC, Austrália); e Azul de Tripano da Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Austrália). Matrigel™ foi obtido da BD Biosciences (North Ryde, NSW, Austrália).

Solução salina estéril (solução aquosa de cloreto de sódio a 0,9%) foi obtida da Baxter Healthcare Australia (Old Toongabbie, NSW, Austrália). Solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi obtida da SigmaAldrich. Formalina (formalina tamponada neutra a 10%) foi obtida da Austra88/93 lian Biostain (Traralgon, VIC, Austrália).

Os materiais para coloração com hematoxilina e eosina de seções de tumor foram obtidos dos seguintes fornecedores: lâminas Superfrost Plus da Menzel (Alemanha); alumínio hematoxilina e eosina da HD Scientific (NSW, Austrália); etanol, ácido clorídrico concentrado e carbonato de lítio da Sigma Aldrich; meio de montagem DePex da BDH (Reino Unido).

As células tumorais foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EUA).

As células tumorais (passagem 2 do estoque de trabalho) foram cultivadas em meio de cultura celular RPMI 1640, suplementado com FCS a 10%, Glutamax a 1% e de penicilina-estreptomicina a 1%. As células foram colhidas por tripsinização, lavadas duas vezes em HBSS e contadas. As células foram então ressuspensas em HBSS:Matrigel™ (1:1, v/v) a uma concentração final de 5 x 10⁷ células/mL.

A dosagem ocorreu a cada 3 dias a concentrações de anticorpos de 1 ou 10 mg/kg i.v. ou com PBS para o controle de tratamento ou Sorafenib a 5 mL/kg por dia como controle positivo no modelo pulmonar de Lewis. Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em grupos iguais de 10 camundongos, com base no volume do tumor no Dia 0 dos estudos.

Qualquer animal devia ser removido do estudo se o seu volume de tumor atingisse 2.000 mm³. O tratamento de qualquer animal cessaria se o seu peso corporal diminuísse para menos de 85% do que o seu peso de entrada no estudo. Os animais também seriam abatidos se fosse observada reação adversa grave ao tratamento.

Os camundongos foram anestesiados para coleta de sangue e sacrificados por sangria através de sangramento cardíaco terminal 48 horas após a dose final, nos Dias 11 ou 14 após o tratamento inicial.

O sangue total foi coletado através de punção cardíaca de todos os camundongos em todos os grupos na terminação.

Amostras de sangue foram deixadas coagular à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido por 2 horas a 4 °C, em seguida, centrifugadas (2000 x g) durante 15 minutos a 4 °C. O componente sérico foi

89/93 recolhido em criotubos frescos e armazenado a -20 °C.

O tumor foi excisado de todos os camundongos em todos os grupos, pesado e conservado em formalina tamponada neutra a 10%.

Os pulmões foram excisados de todos os camundongos. Metás5 tases pulmonares de superfície foram contadas e foram classificadas de acordo com o tamanho: pequeno (<1 mm), médio (> 1 mm e <3 mm) e grande (> 3 mm). Os pulmões excisados foram conservados em formalina tamponada neutra a 10%.

Todos os cálculos estatísticos foram realizados usando SigmaS10 tat 3.0 (SPSS Australasia, North Sydney, NSW, Austrália).

Um teste t pareado foi utilizado para determinar a significância na mudança de peso corporal dentro de um grupo de tratamento entre o Dia 0 e o dia de medição final para o grupo. Apenas os camundongos sobreviventes até ao dia de terminação foram incluídos na análise.

Um teste t foi realizado em pesos de tumor, tamanho do tumor histológico e contagens de metástases hepáticas pulmonares em todos os animais.

Uma Análise de Variância de uma Via (ANOVA) foi realizada em pesos dos tumores, tamanhos de tumores histológicos, e contagens de me20 tástases de pulmão e fígado em todos os grupos que sobreviveram até os dias de terminação dos estudos (Dia 14 para 4T1 e Dia 11 para Pulmão de Lewis).

Onde foram encontradas diferenças significativas usando a Análise de uma Via ANOVA, foi realizada Comparação Múltipla contra Procedi25 mentos do Grupo de Controle (Método Holm-Sidak). O Controle Pré-imune (Grupo 2) foi usado como o grupo de controle no Dia 9. À medida que os camundongos neste grupo morriam o Veículo de Controle (Grupo 1) foi usado como o grupo de controle no Dia 14. Embora, em alguns casos, os dados falharassem no Teste de Normalidade ou Teste de Igualdade Variância, as 30 análises estatísticas foram realizadas usando valores absolutos.

Um valor p inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados: Após 14 dias os pulmões do camundongo 4T1 fo

90/93 ram excisados dos camundongos BALBc para medir o número de metástases pulmonares. O grupo de controle de 10 camundongos tinha 6,4 ± 1,0 enquanto que o grupo tratado com 2F6 hlgG1 apresentou 3,4 ± 0,7 ou 53% de controle, como mostrado na figura 15. O volume médio de metástases 5 nos dois grupos foi ainda mais reduzido de 5,77 para 1,28 mm³ ou 22% e o volume total de metástase reduzido em 88% de 369 para 43 mm³ ou 11,8% do controle.

O modelo isogênico de pulmão de Lewis foi usado com grupos de controle adicionais. Além do grupo de controle com PBS de dez camun10 dongos (Grupo 1), um grupo de controle positivo usando Sorafenib diariamente a 5 mL/kg foi incluído (Grupo 5), juntamente com os grupos de tratamento com anticorpos consistindo em anticorpo policlonal E200-300 de ovelha purificado por afinidade a mg/kg (Grupo 2), 2F6-hlgG1 a 1 mg/kg (Grupo 3) e 2F615 hlgG1 a 10 mg/kg (Grupo 4).

Os resultados obtidos foram os seguintes:

	Metástases Médias de Superfície de Pulmão	Erro Padrão da Média (SEM)
Grupo 1	2,3 0,4
Grupo 2	0,1	0,1
Grupo 3	0,9	0,2
Grupo 4	0,2 0,1
Grupo 5	o,1	'0,1

Estes resultados estão resumidos na figura 16. A redução em metástases tumorais entre o Grupo 1 de controle e todos os outros grupos é significativa a p<0,001. O anticorpo de ovelha de alta afinidade inibiu a for20 mação de tumor igualmente bem com o 2F6 monoclonal de afinidade muito menor a 10 mg/kg, ambos iguais ao controle positivo Sorafenib, todos com inibição de 96% em relação ao PBS de controle.

Conclusão: O sítio de ligação ao epitopo intermonômero complexo alvo é acessível em células tumorais. Anticorpos com uma Kd que va25 ria de 0,5 nM (policlonal de ovelha purificado por afinidade) a 50 nM (2F6hlgG1) mostram eficácia semelhante, sugerindo que uma constante de liga91/93 ção ótima para uma terapêutica humana está na faixa inferior de nM.

Exemplo 5 - Geração e purificação de sítios de ligação ao antígeno maturado por afinidade

Objetivo: As experiências aqui descritas foram para desenvolver formas de anticorpos (isto é, scFv/Fab) que apresentaram constantes de ligação aumentadas para melhorar a ligação específica aos receptores P2X₇não funcionais nas células cancerosas sem ligar os receptores funcionais em quaisquer células normais tais como linfócitos e, assim, obter a inibição do crescimento de células cancerosas a uma menor concentração de anticorpos do que foi alcançado com os 2F6 monoclonais recombinantes WT.

Antecedentes: As formas de anticorpos 2F6 exibiram ligação específica aos receptores P2X₇ em células cancerosas vivas, no entanto, para utilização como um anticorpo de diagnóstico ou terapêutico um anticorpo pode necessitar de uma afinidade melhorada.

A sequência CDR3 HYSSRFFDV de 2F6 foi utilizada como um ponto de partida para rodadas iterativas de aleatorização e rastreio porque se pensava que fosse mais provável para produzir anticorpos precursores com afinidades aumentadas que poderíam ser explorados para fins de ensaio, em modelos de teste terapêuticos.

Materiais e métodos: Os fragmentos de genes V_H e V_L do 2F6 foram amplificados e montados em um vetor de expressão/secreção E. coli. Tanto o 2F6 scFv como o Fab foram transformados em E. coli e a expressão da construção do gene foi induzida. As culturas de E. coli foram colhidas 5 horas após a indução e o scFv e o Fab foram analisados quanto à ligação usando ELISA e Biacore contra o antígeno E200-300 imobilizado.

Métodos de rastreio incluindo SDS-PAGE e sequenciamento Nterminal foram combinados com ELISA, Biacore e citometria de fluxo contra as células cancerosas para determinar as características biofísicas do sítio de ligação ao antígeno nos domínios de ligação do anticorpo de controle antes da maturação por afinidade.

A mutagênese do 2F6 scFv foi introduzida através de uma combinação de PCR propensa a erros, aleatorização NNK e variação no com

92/93 primento da sequência de HCDR3. Uma biblioteca de mutação no vetor fagemídeo foi da ordem de 1x10⁷. Ο rastreio da biblioteca para mutantes de afinidade mais alta empregou uma combinação de exposição em fagos com ensaios de expressão de filtro usando o antígeno E200-300 biotinilado. Uma seleção clones de fagos precursores de scFv de maior afinidade foi submetida à expressão em pequena escala de fragmentos de anticorpos solúveis com afinidades medidas através de ELISA e BIAcore.

Resultados: As sequências de HCDR3 de derivados de scFv/Fab obtidas a partir da maturação por afinidade que mostrou ligação melhorada ao longo dos 2F6 são mostradas na figura 17.

As constantes de ligação são mostradas em ELISA e na tabela de resumo na figura 18. O IgM multivalente tem um valor CE₅o maior do que o formato de IgG para o alvo epitopo. O Fab recombinante 2F6 exibe ligação muito mais baixa (2 logs) do que os precursores maturados por afinidade selecionados.

Conclusão: Os sítios de ligação a antígenos de murino foram produzidos de tal modo que, em um formato Fab a afinidade relativa para o anticorpo monoclonal recombinante 2F6 foi melhorada.

Exemplo 6 - Caracterização bioquímica de Fabs maturados por afinidade

Objetivo: Determinar se os Fabs maturados por afinidade exibiram especificidade para receptores P2X₇ não funcionais expressos em células vivas.

Antecedentes: O anticorpo progenitor 2F6 forma IgM e lgG2a apenas ligados a receptores P2X₇ não funcionais expressos em células vivas com alta afinidade, não a receptores P2X₇ monoméricos, nem receptores P2X₇ funcionais. Foram realizadas experiências para confirmar que esta especificidade não foi perdida durante a maturação por afinidade.

Materiais e métodos: Foi usada citometria de fluxo para medir a ligação aumentada de Fabs recombinantes maturados por afinidade selecionados em linhas de células COLO-205 e PC3 humanas em relação à da sequência de partida de 2F6. Fabs recombinante marcados com FLAG foram

93/93 ligados a células e detectados usando um anticorpo anti-FLAG monoclonal murino F4049 da Sigma conjugado a FITC usado a uma concentração de 1:75. O anticorpo 200-300 de ovelha purificado por afinidade foi examinado quanto à comparação direta com o 2F6 mlgG2a WT por Fluxo a células PC3.

Resultados: Os Fabs ligaram-se seletivamente a receptores não funcionais em células vivas COLO-205 (figura 19a) e células PC3 (figura 19b) com maior afinidade do que o Fab 2F6 WT. Afinidades semelhantes foram observadas usando várias preparações de formato 2F6 mlgG2a que exibem ainda afinidade melhorada em relação à sequência de WT (figura 20). Em contraste, quando estes mesmos Fabs recombinantes purificados por afinidade foram testados contra linfócitos humanos que expressam receptores P2X₇ funcionais, ocorreu uma ligação insignificante. Um controle positivo HLA foi adicionado (figura 21). Em comparação com o 2F6 mlgG2a WT, a ligação a células PC3 por Fluxo utilizando o anticorpo policlonal de ovelha purificado por afinidade E200-300 apresentou ligação muito mais elevada (figura 22), de acordo com os melhoramentos esperados a partir da maturação por afinidade.

Conclusão: Foram gerados Fabs e scFvs seletivos de alta afinidade que são úteis para fins de diagnóstico e terapêuticos, de acordo com o nível obtido a partir de um título antissoro de anticorpo policlonal de ovelha que exibiu, ele próprio, eficácia terapêutica significativa, conforme apresentado nos estudos de xenoenxerto de camundongo.

Será entendido que a invenção divulgada e definida nesta memória descritiva se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais das características individuais mencionadas ou evidentes a partir do texto ou desenhos. Todas estas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de anticorpo para ligação a um receptor P2X7 não-funcional, caracterizado pelo fato de que compreende um sítio de ligação a antígeno definido pela fórmula geral 1:

FR1a - CDR1a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a ligante - FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 em que:

FR1a, FR2a, FR3a, FR4a, FR1, FR2, FR3 e FR4 são, cada uma, regiões estruturais (framework);

CDR1a, CDR2a, CDR3a, CDR1, CDR2 e CDR3 são, cada uma, regiões determinante de complementaridade;

em que:

CDR1a tem uma sequência de aminoácidos KASQNVGTNVA;

CDR2a tem uma sequência de aminoácidos SASFRYS; e

CDR3a tem uma sequência de aminoácidos QQYNSYPFT;

em que:

CDR1 tem uma sequência de aminoácidos SYYMS;

CDR2 tem uma sequência de aminoácidos

AINSNGGSTYYPDTVKG; e

CDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: HYSSRFFDV, NFKLMYYNV, NYRGDYYET, HFSRGYYDV, NFLESYFEA, NYLPMYYEV, HYIKVYYEA, HYSSRFFEV, NFRVMFFKA, HFQRGYYNI, HYSSRFFEV, YHVIQYLGP, HYSKEYYNI, YFPLVYYDV, e YFPLVYYDV.
2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos: NFLESYFEA.
3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos: NYRGDYYET.
4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de

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2/4 aminoácidos: HYSKEYYNI.
5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos: HFQRGYYNI.
6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos: YFPLVYYDV.
7. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos: NYLPMYYEV.
8. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos: YHVIQYLGP.
9. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos: HFSRGYYDV ou NYDKKYFDV.
10. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que CDR3 tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: HFSRGYYDV,

HFQRGYYNI, HYSKEYYNI e NFKLMYYNV.
11. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que FR1 tem uma sequência de aminoácidos: DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS.
12. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que FR2 tem uma sequência de aminoácidos: WVRQTPEKRLELVA.
13. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que FR3 tem uma sequência de aminoácidos: RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTR.
14. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que FR4 tem uma sequência de aminoácidos: WGAGTTVTVSS.

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15. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que:

FR1a tem uma sequência de aminoácidos MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC; FR2a tem uma sequência de aminoácidos WYQQKPGQSPKALIY; FR3a tem uma sequência de aminoácidos

GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC; e

FR4a tem uma sequência de aminoácidos FGSGTRLEIK.
16. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ligante está na forma de um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos entre 5 e 15 resíduos de aminoácidos, ou alternativamente o ligante compreende uma ligação de dissulfeto.
17. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o ligante é um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS.
18. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é selecionado de um grupo consistindo em um domínio variável de imunoglobulina, Fab, Fab', F(ab')2, dab, scFv, diacorpo (diabody), triacorpo (triabody), anticorpo linear, anticorpo de cadeia única, fragmento de anticorpo multi-específico ou Fv.
19. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer ou de um estado ou de uma doença associada à expressão do receptor P2X7 não funcional.
20. Método in vitro para o diagnóstico de câncer ou doença ou estado associado à expressão do receptor P2X7 não funcional, caracterizado pelo fato de que inclui a etapa de colocar tecidos ou células, nos quais a presença ou a ausência de câncer serão determinadas, em contato com um

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4/4 reagente na forma de um anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e detectar a ligação do reagente com os tecidos ou as células.