JP5624885B2 - 細胞外体液中のプリン作動性（ｐ２ｘ）受容体 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞外体液中のタンパク質を検出するための、プリン作動性(P2X)受容体に関し、並びに疾病または疾患、特に癌の診断のための抗体に関する。
プリン作動性(P2X)受容体は、ATP依存性カチオン選択性チャネルである。各々の受容体は、3個のタンパク質サブユニットまたは単量体からできている。これまで、P2X単量体をコードする7個の別々の遺伝子が同定されている:P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6（本明細書におけるそれぞれ図2から図7）、P2X7（図1）。
P2X7受容体は、これらの受容体の発現が、プログラム細胞死を受ける可能性を有する細胞、例えば胸腺細胞、樹状細胞、リンパ球、マクロファージおよび単球などに限定されると理解されているため、特に関心がもたれる。さらに、Pro210(図1による)のシス異性体を有する1または複数の単量体を含み、ATP結合機能を欠いているP2X7受容体が、プログラム細胞死を受けることができないと理解されている細胞、例えば前癌細胞および多くの癌腫及び血液がんの形態にある腫瘍細胞上で見つかっている。
P2X7単量体の少なくとも9つのスプライス変異体が存在することが知られている（図8から図15）。これらは、細胞質N末端及びC末端、2つの膜貫通ドメイン及び1つの細胞外ドメインを有する変異体、並びに細胞質N末端、膜貫通ドメイン及び様々な長さの欠失(truncated)細胞外ドメインを有する変異体を含む。
Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、Mack Publishing Co.、Easton、PA(1995年)
これまで、P2X7受容体は細胞質、核のみで検出されており、上述した1または複数の膜貫通ドメインによって細胞表面膜の脂質二重層に固定されている。
ある実施形態において、細胞外体液から入手可能である単離されたプリン作動性受容体、その単量体もしくは断片が提供される。
別の実施形態において、上述したプリン作動性受容体、その単量体もしくは断片への、抗プリン作動性受容体抗体またはその断片の結合により形成される免疫複合体が提供される。
さらなる実施形態において、上述したプリン作動性受容体、その単量体もしくは断片へのプリンの結合により形成される複合体が提供される。
一層さらなる実施形態において、細胞外プリン作動性受容体、その単量体もしくは断片上のエピトープに結合するための、抗体またはその断片が提供され、該エピトープは、細胞表面膜上で発現するプリン作動性受容体、その単量体もしくは断片上では発見されない。
ある実施形態において、細胞外体液がプリン作動性受容体、その単量体または断片を含むかどうかを決定するための方法であって、
- 免疫複合体を形成する条件で、細胞外体液を抗プリン作動性受容体抗体またはその断片と接触させる工程;および
- 免疫複合体が形成したかどうかを検出する工程
を含み、免疫複合体の検出は、体液がプリン作動性受容体、その単量体または断片を含むことを示す、方法が提供される。
- 免疫複合体を形成する条件で、細胞外体液を抗プリン作動性受容体抗体またはその断片と接触させる工程;および
- 免疫複合体が形成したかどうかを検出する工程
を含み、免疫複合体の検出は、体液がプリン作動性受容体、その単量体または断片を含むことを示す、方法が提供される。
他の実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- サンプル中の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、サンプルを抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片と接触させる工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
- 癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- サンプル中の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、サンプルを抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片と接触させる工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
一層さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 細胞外体液を含む組織生検の形態にあるサンプルであって、癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得たサンプルを提供する工程；
- サンプル中の細胞外体液中もしくは由来のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、サンプルを抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片と接触させる工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
- 細胞外体液を含む組織生検の形態にあるサンプルであって、癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得たサンプルを提供する工程；
- サンプル中の細胞外体液中もしくは由来のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、サンプルを抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片と接触させる工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
一層さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体に、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を投与する工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体に、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を投与する工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
一層さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片を固相に結合させる条件で、固相にサンプルを適用する工程；
- 固相に結合したプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、固相に抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を接触させる工程；
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
- 癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片を固相に結合させる条件で、固相にサンプルを適用する工程；
- 固相に結合したプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、固相に抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を接触させる工程；
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む方法が提供される。
一層さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するためのキットまたは組成物であって、
- 抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片；及び／または
- 上述したプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片；及び場合により
- 抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片あるいはプリン作動性受容体、その単量体または断片に結合するさらなる抗体；
- 上述した方法においてキットを使用するための取扱説明書
を含むキットまたは組成物が提供される。
- 抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片；及び／または
- 上述したプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片；及び場合により
- 抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片あるいはプリン作動性受容体、その単量体または断片に結合するさらなる抗体；
- 上述した方法においてキットを使用するための取扱説明書
を含むキットまたは組成物が提供される。
プリン作動性受容体の例は、P2X受容体、特にP2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7単量体を含むものである。ある実施形態では、プリン作動性受容体はP2X7受容体であり、その例は以下にさらに論じられる。
本発明者らは、様々な形態の癌を有する個体の細胞外体液中にプリン作動性(P2X)受容体を見出した。今までのP2X7受容体の全ては、1つまたは2つの膜貫通ドメインにより細胞表面脂質二重層中に結合することがわかっていたので、これは驚くべき発見である。それ故、今までの当該技術分野における教示は、プリン作動性(P2X)受容体は大部分が細胞膜上に発現するというものであった。
様々な疾病及び疾患を有する、またはこれらにかかりやすい個体の細胞外体液中に特定のプリン作動性(P2X)受容体が見出されたという発見は、意義深いものである。なぜならば、ある実施形態では、個体は、組織生検よりも一般に遥かに簡単に単離することができる細胞外体液サンプルに基づいて検査されるだろうからである。組織生検は、今までのプリン作動性(P2X)受容体の細胞膜での発現を決定するために必要とされている。
ある実施形態では、細胞外体液より入手可能な、単離されたプリン作動性(P2X)受容体、P2X単量体またはそれらの断片が提供される。典型的には、受容体はP2X7受容体、その単量体または断片である。
ある実施形態では、P2X7受容体がATPに結合することができ、及び／またはプログラムされた細胞死に導くために細胞中への陽イオンの進入用細孔を形成することができるという意味においてP2X7受容体が機能的であろうとなかろうと、P2X7受容体は少なくとも1つのP2X7単量体の配列を含む全ての受容体を包含する。ATP結合機能を損なうP2X7受容体の例は、配列番号1に示される配列のプロリン210でのシス異性体を有する受容体である。
細胞外体液は、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、精液、唾液、痰、腹水、糞便、子宮および膣の分泌物、胆汁、羊水、脳脊髄液ならびに器官および組織フラッシング液(flushing)からなる群から選択してもよい。ある状況下においては残存細胞またはその断片を含み得るが、細胞外体液は、典型的にはセルフリーである。
受容体、その単量体または断片は、以下の表1に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
受容体、その単量体または断片は、表1にリスト化される配列のいずれか一つの部分からなるアミノ酸配列を有していてもよい。典型的には、断片は少なくとも約10アミノ酸残基の長さの単量体の一部であり、約595アミノ酸長を超えない。
受容体、その単量体または断片は、20から80 kDaの範囲にある分子量を有してもよい。
受容体、その単量体または断片は、膜貫通ドメインを欠失していてもよい。
受容体、その単量体または断片は、細胞膜の断片に結合していてもよい。細胞膜断片は、細胞溶解または膜ブレブ形成の結果物であってもよい。細胞膜断片は、リポソーム様またはミセル様構造であって、プリン作動性(P2X)受容体がそれらの上に位置している形態で提供されてもよい。
ある実施形態では、受容体は、アッセイプレート、ビーズまたは組織培養容器などの固相に結合する。これらの形態の受容体は、特に、以下にさらに記述される診断用及び治療用用途において使用してもよい以下にさらに記述される受容体に対する抗体の調製に有用である。
別の実施形態では、上述したプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片に対する抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片の結合により形成される免疫複合体が提供される。
一般に、他に抗原-抗体複合体として知られている免疫複合体は、抗体を生成させる抗原上のエピトープへの抗体結合部位を介した抗体の結合によって形成される産物である。この複合体は、1を超える抗体からなっていてもよく、またはそうでなくてもよい。
典型的には、受容体はP2X7受容体であり、抗体は抗P2X7抗体またはその断片である。
免疫複合体は、このin vitroまたはin vivo検出が前癌状態および新生組織形成を含む疾病または疾患の存在、あるいはそれらへのかかりやすさを示すために特に重要である。これらの検出方法は、以下により詳細に説明される。
当該技術分野において一般に理解されているように、新生組織形成は文字通り新生物であり、通常、本来の増殖刺激の不存在下でも一般的に持続する異常な新生物または増殖を指す。新生組織形成は良性または悪性であってもよい。
前癌状態(pre-neoplasia)は一般に新生組織形成に先立つ細胞の成長形態または形質転換形態である。それは、著しい退形成(anaplasia)または細胞分化の喪失のない、組織学的に有糸分裂像の現われ及び／または過形成(hyperplasia)によって特徴付けられるであろう。前癌状態の組織は腫瘍病巣に近接する領域中に時々発見される。
細胞外体液は、ある状況下では残存細胞またはその断片を含んでもよいが、典型的にはセルフリーである。しかし、免疫複合体は、無傷細胞または全細胞の細胞表面に位置しない受容体、単量体またはその断片に結合する抗体よりも、むしろ、体液中に懸濁されまたは溶解される受容体、単量体またはその断片に結合する抗体から、優先的に形成される。
抗体はいずれかのアイソフォームの全抗体(whole antibody)であってよい。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルの抗血清から得られるものであってもよい。抗体はハイブリドーマによって、または組み換え発現によって産生されてもよい。抗体はヒト、またはCDRを異種または同種異系のフレームワーク上にグラフトさせることによって形成されるものであってもよい。
抗体が抗体断片である場合、抗体断片はdAb、Fab、Fd、Fv、F(ab’)2、scFv及びCDRからなる群から選択される。
抗体はプリン作動性(P2X)受容体の細胞外ドメインに結合してもよい。ある実施形態では、プリン作動性(P2X)受容体はP2X7受容体である。本明細書において論述されるように、P2X7受容体のたくさんのアイソフォームが存在する。抗体はこれらのアイソフォームのドメインのいずれか一つに結合してもよい。完全長アイソフォームは細胞内N末ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン、さらなる膜貫通ドメイン及びC末細胞内ドメインを含む。
P2X7受容体の細胞外ドメイン上に位置するエピトープの例を表2に示す。
抗体または抗体断片は、固相、例えばビーズまたはプレート、またはブロッティング用ペーパー、例えばニトロセルロースペーパーなどに結合されてもよく、その結果、免疫複合体は、形成された場合には固相に結合される。この実施形態では、抗体は「捕捉(capture)」抗体として機能してもよい。
代替的に、抗体または抗体の断片は、固相に結合する。
抗P2X7受容体抗体は免疫複合体の形成を検出するために標識されてもよい。
免疫複合体は、例えば免疫複合体の捕捉のために、さらなる抗体またはその断片をさらに含んでもよい。さらなる抗体またはその断片は抗P2X7受容体抗体に結合してもよい。また、さらなる抗体またはその断片は受容体またはその断片に結合してもよい。
さらなる抗体またはその断片は、上述した相などの固相に結合されてもよい。
さらなる抗体またはその断片は、免疫複合体の形成を検出するために標識されてもよい。標識の例には、フルオロフォア、染料、アイソトープなどが挙げられる。
代替的に、P2X7受容体などのプリン作動性(P2X)受容体を、検出可能な複合体を形成させるために、受容体に結合することができる化合物に接触させることによって提供してもよい。
従って、さらなる実施形態では、上述したようにP2X7受容体、その単量体または断片へのプリンまたはプリン関連化合物の結合により形成される複合体が提供される。例は、ATPまたはベンゾイル-ベンゾイルATPなどのATP類似体である。ATPは複合体の形成の検出を容易にする標識と結合または共役させてもよい。
一層さらなる実施形態では、細胞外プリン作動性受容体、その単量体または断片上のエピトープに結合するための抗体またはその断片が提供され、該エピトープは、細胞表面膜上に発現するプリン作動性受容体、その単量体または断片上には発見されない。
典型的には抗体は細胞外P2X7受容体、その単量体または断片上のエピトープに結合する。
抗体断片の例には、dAb、Fab、Fd、Fv、F(ab’)2、scFv及びCDRが挙げられる。
ある実施形態では、細胞外体液が、プリン作動性受容体、その単量体または断片を含むかどうかを決定するための方法であって、
- 免疫複合体を形成するための条件で、細胞外体液を抗プリン作動性受容体抗体またはその断片と接触させる工程;および
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出する工程
を含み、免疫複合体の検出は、液がプリン作動性受容体、その単量体または断片を含むことを示す、方法が提供される。
- 免疫複合体を形成するための条件で、細胞外体液を抗プリン作動性受容体抗体またはその断片と接触させる工程;および
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出する工程
を含み、免疫複合体の検出は、液がプリン作動性受容体、その単量体または断片を含むことを示す、方法が提供される。
典型的には、抗体は抗プリン作動性(P2X)受容体抗体、例えば抗P2X7受容体抗体またはその断片などである。
他の実施形態では、細胞外体液がP2X7受容体、その単量体または断片を含むかどうかを決定するための手段の製造における、抗P2X7受容体抗体またはその断片の使用が提供される。
他の実施形態では、細胞外体液が、細胞外プリン作動性受容体、その単量体または断片に対する抗体を含むかどうかを決定するための方法であって、
- プリン作動性受容体、その単量体または断片と、細胞外プリン作動性受容体に対する抗体の間で免疫複合体が形成される条件で、細胞外体液をプリン作動性受容体、その単量体または断片と接触させる工程;および
- 免疫複合体が形成されるかどうかを決定する工程
を含み、免疫複合体の検出は、液が、細胞外プリン作動性受容体、その単量体または断片に対する抗体を含むことを示す、方法が提供される。
- プリン作動性受容体、その単量体または断片と、細胞外プリン作動性受容体に対する抗体の間で免疫複合体が形成される条件で、細胞外体液をプリン作動性受容体、その単量体または断片と接触させる工程;および
- 免疫複合体が形成されるかどうかを決定する工程
を含み、免疫複合体の検出は、液が、細胞外プリン作動性受容体、その単量体または断片に対する抗体を含むことを示す、方法が提供される。
典型的には、プリン作動性(P2X)受容体は、P2X7受容体、その単量体または断片である。
他の実施形態では、細胞外体液が、抗P2X7受容体抗体を含むかどうかを決定するための手段の製造における細胞外体液より入手可能なP2X7受容体、その単量体または断片の使用が提供される。
細胞外体液中の、プリン作動性(P2X)受容体またはその断片などの所定のタンパク質の存在、または所定のタンパク質の発現レベルは、いくつものアッセイによって検出することができる。例としては、免疫アッセイ、クロマトグラフィーおよび質量分析が挙げられる。
免疫アッセイ、すなわち、免疫系の要素と関わるアッセイが特に好ましい。これらのアッセイは、一般に下記の1つに分類されてもよい:
(i)精製された抗原を用いて、宿主血清中の抗体を検出するアッセイ。例えば、精製された抗原は、吸着によって、または間接的に別の分子を介して固相に結合され、宿主血清または他の体液が適用され、次に、宿主抗体の存在または不存在を検出するための別の抗体が適用される;
(ii)精製された抗原を用いて、TおよびBリンパ球などの免疫細胞を検出するアッセイ。例えば、末梢白血球は、宿主から精製され、精製された抗原とともに培養される。次に、免疫性を示す1または複数の因子の存在または不存在を検出する。他の例には、精製された抗原への曝露後の細胞増殖(リンパ球の増殖または形質転換アッセイ)を測定するアッセイ;ならびに、精製された抗原への曝露後の細胞死(アポトーシスを含む)を測定するアッセイが挙げられる;
(iii)抗原に特異的な精製された抗体を用いて宿主における抗原を検出するアッセイ。例えば、精製された抗体は、固相に結合され、宿主細胞外体液が適用され、次いで検出されるべき抗原に特異的な別の抗体が適用される。ELISA、RIAなどを含むこのアプローチには多くの例がある。
(iv)精製された抗イディオタイプ抗体を用いて宿主抗体を検出するアッセイ。例えば、抗イディオタイプ抗体は、固相に吸着され、宿主血清を添加し、抗Fc抗体を添加して、抗体イディオタイプ抗体によって結合した任意の宿主抗体を結合させる。
(v)細胞外体液をそれ中に含まれるタンパク質成分から分離するアッセイ。タンパク質成分を固相上に結合させ、次いで、抗体で標識する。例にはドットブロッティング及びウェスタンブロッティングが挙げられる。
(i)精製された抗原を用いて、宿主血清中の抗体を検出するアッセイ。例えば、精製された抗原は、吸着によって、または間接的に別の分子を介して固相に結合され、宿主血清または他の体液が適用され、次に、宿主抗体の存在または不存在を検出するための別の抗体が適用される;
(ii)精製された抗原を用いて、TおよびBリンパ球などの免疫細胞を検出するアッセイ。例えば、末梢白血球は、宿主から精製され、精製された抗原とともに培養される。次に、免疫性を示す1または複数の因子の存在または不存在を検出する。他の例には、精製された抗原への曝露後の細胞増殖(リンパ球の増殖または形質転換アッセイ)を測定するアッセイ;ならびに、精製された抗原への曝露後の細胞死(アポトーシスを含む)を測定するアッセイが挙げられる;
(iii)抗原に特異的な精製された抗体を用いて宿主における抗原を検出するアッセイ。例えば、精製された抗体は、固相に結合され、宿主細胞外体液が適用され、次いで検出されるべき抗原に特異的な別の抗体が適用される。ELISA、RIAなどを含むこのアプローチには多くの例がある。
(iv)精製された抗イディオタイプ抗体を用いて宿主抗体を検出するアッセイ。例えば、抗イディオタイプ抗体は、固相に吸着され、宿主血清を添加し、抗Fc抗体を添加して、抗体イディオタイプ抗体によって結合した任意の宿主抗体を結合させる。
(v)細胞外体液をそれ中に含まれるタンパク質成分から分離するアッセイ。タンパク質成分を固相上に結合させ、次いで、抗体で標識する。例にはドットブロッティング及びウェスタンブロッティングが挙げられる。
免疫アッセイは、in vitroまたはin vivoで適用することができる。
免疫複合体の形成を必要としないさらなるアッセイフォーマットは、アッセイのアウトプット(output)が基質の触媒作用の結果であり、アウトプットが例えば光学密度の変化を測定することによって観察されるものである。
本発明の上述の実施形態において評価される細胞外体液は、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、精液、唾液、痰、腹水、糞便、子宮および膣の分泌物、胆汁、羊水、脳脊髄液、涙、ならびに器官および組織フラッシング液(flushing)からなる群から選択してもよい。ある状況下においては残存細胞またはその断片を含み得るが、細胞外体液は、典型的にはセルフリーである。
プリン作動性(P2X)受容体が細胞外体液中に発現するいずれかの疾病は、これらの方法によって検出され得ることが理解されるであろう。疾患は、典型的には、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、または他の実質細胞の成長異常などの癌である。
検出されてもよい癌腫には、限定されないが、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、および結腸癌が含まれる。一般に理解されるように、癌または腫瘍は新生組織形成の状態であり、良性または悪性であってよい。特定の実施形態では、癌は転移性疾病である。
任意の体液を用いてこれらの疾患のいずれかを検出することができるが、特定の実施形態では、いくつかの体液は、ある種の疾患を検出するために他の体液よりも適切である場合があり、例えば尿は、前立腺癌の検出により適切である。血液は、リンパ腫などの血液癌の検出により適切であろう。
別の実施形態では、個体が癌を有するかどうかを決定するための方法であって、
- 個体由来の細胞外体液のサンプルを回収する工程；
- 上述の免疫複合体を形成させる条件での、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片と細胞外体液を接触させる工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出する工程
を含む、方法が提供される。
- 個体由来の細胞外体液のサンプルを回収する工程；
- 上述の免疫複合体を形成させる条件での、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片と細胞外体液を接触させる工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出する工程
を含む、方法が提供される。
さらなる実施形態では、個体が癌を有するかどうかを決定するための、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片の使用が提供される。
さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 癌の存在または不存在あるいは癌へのかかりやすさを決定しようとする個体から得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- サンプル中の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に（上述の）免疫複合体が形成される条件で、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片とサンプルを接触させる工程；並びに
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
- 癌の存在または不存在あるいは癌へのかかりやすさを決定しようとする個体から得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- サンプル中の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に（上述の）免疫複合体が形成される条件で、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片とサンプルを接触させる工程；並びに
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
ある実施形態では、方法は、直接、間接もしくはサンドウィッチELISA、RIAまたはアッセイ系に対する液体サンプルの適用を含むアッセイなどとして実施される。サンプルは、抗体との接触に先立って処理されまたは処理されなくてもよい。
さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 細胞外体液を含む組織生検の形態にあるサンプルを提供する工程であって、該サンプルは癌の存在または不存在あるいは癌へのかかりやすさを決定しようとする個体から得られるものである、工程；
- サンプル中の細胞外体液中もしくは細胞外体液由来のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片とサンプルを接触させる工程；並びに
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
- 細胞外体液を含む組織生検の形態にあるサンプルを提供する工程であって、該サンプルは癌の存在または不存在あるいは癌へのかかりやすさを決定しようとする個体から得られるものである、工程；
- サンプル中の細胞外体液中もしくは細胞外体液由来のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片とサンプルを接触させる工程；並びに
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
ある実施形態では、方法は免疫組織化学的フォーマットで実施され、ここで、細胞外体液を含む組織切片がスライドに適用され、それによりスライドに対する液中のタンパク質の固定がもたらされ、抗体で染色される。これらの実施形態では、方法はサンプル、例えば組織切片を、細胞外空間中に免疫複合体が存在するか不存在なのかについて、評価する工程が含まれる。これらの空間の例には、腺、管(duct)または血管もしくはリンパ管などの管(vessel)の内腔の形態にある空間が含まれる。他の細胞外空間には、上皮細胞の不浸透層または半浸透層によって定義されるものが含まれ、前者の例には血液脳関門によって定義される空間があり、後者の例には、ネフロンの尿細管がある。
一層さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体に、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を投与する工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体に、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を投与する工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出して個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
方法は、免疫複合体が形成されるかどうかを検出するために、個体由来の細胞外体液のサンプルを得る工程、及びサンプルが免疫複合体を含むかどうかを決定する工程を含んでもよい。
代替的に、方法は、免疫複合体が形成されるかどうかを検出するために、個体由来の細胞外体液を含む組織生検の形でのサンプルを得る工程、及び組織生検の細胞外空間における免疫複合体の存在または不存在についてサンプルを評価する工程が含まれてもよい。
一層さらなる実施形態では、個体が癌を有するか、または癌にかかりやすいかどうかを決定するための方法であって、
- 癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片を固相に結合させる条件で、固相にサンプルを適用する工程；
- 固相に結合したプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、固相に抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を接触させる工程；並びに
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
- 癌の存在または不存在あるいは癌に対するかかりやすさを決定しようとする個体より得られる細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- 個体の細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片を固相に結合させる条件で、固相にサンプルを適用する工程；
- 固相に結合したプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片と、抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片との間に免疫複合体が形成される条件で、固相に抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片を接触させる工程；並びに
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかまたは癌にかかりやすいかどうかを決定する工程
を含む、方法が提供される。
一層さらなる実施形態では、細胞外体液が、上述のプリン作動性(P2X)受容体、その単量体または断片、あるいは上述の細胞外P2X7受容体またはその断片に対する抗体を含むかどうかを決定するためのキットまたは組成物であって、
- 抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片；及び／または
- 上述した細胞外体液より入手可能なP2X7受容体、その単量体または断片；及び場合により
- 抗P2X7受容体抗体またはその断片あるいはP2X7受容体、その単量体または断片に結合するさらなる抗体；
- 上述した方法におけるキットを使用するための取扱説明書
を含む、キットまたは組成物が提供される。
- 抗プリン作動性(P2X)受容体抗体またはその断片；及び／または
- 上述した細胞外体液より入手可能なP2X7受容体、その単量体または断片；及び場合により
- 抗P2X7受容体抗体またはその断片あるいはP2X7受容体、その単量体または断片に結合するさらなる抗体；
- 上述した方法におけるキットを使用するための取扱説明書
を含む、キットまたは組成物が提供される。
以下のプロトコルは、本発明を例示することを目的とする細胞体体液のサンプル中におけるP2X7Rを検出するための適切な方法の非制限的な例を提供する。
［実施例１］
直接ELISAによる細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
グレード3の卵巣腺癌を有する9人の患者より得た血漿サンプル(1 mL)を直接ELISA用に1：50で希釈してトリプリケート(triplicate)にした。対照血漿は左の3サンプルである（図１６）。
直接ELISAによる細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
グレード3の卵巣腺癌を有する9人の患者より得た血漿サンプル(1 mL)を直接ELISA用に1：50で希釈してトリプリケート(triplicate)にした。対照血漿は左の3サンプルである（図１６）。
わずかに低量のサンプルが、患者の血漿中の癌細胞に由来するシェッド受容体(shed receptor)の信頼できる検出用に必要であった。
［実施例２］
間接ELISAによる細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
膀胱癌患者由来のシェッド受容体を尿中で検出した。今なお疾病を有する患者及び続く治療で寛解状態にある患者を競合ELISAを用いて分離することが可能であった。尿を1：10に希釈し、スパイク(spiked)P2X7抗体を2.5μg/mLで使用した（図１７）。試験サンプル1は寛解中の患者のものであり、対照群の水準に近い一方で、試験サンプル2はシェッド受容体の存在により疾病を明らかに有していた。尿サンプル(1 mL)は検出に十分であった(トリプリケートで)。
間接ELISAによる細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
膀胱癌患者由来のシェッド受容体を尿中で検出した。今なお疾病を有する患者及び続く治療で寛解状態にある患者を競合ELISAを用いて分離することが可能であった。尿を1：10に希釈し、スパイク(spiked)P2X7抗体を2.5μg/mLで使用した（図１７）。試験サンプル1は寛解中の患者のものであり、対照群の水準に近い一方で、試験サンプル2はシェッド受容体の存在により疾病を明らかに有していた。尿サンプル(1 mL)は検出に十分であった(トリプリケートで)。
［実施例３］
ドットブロットによる細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
卵巣及び膀胱癌を有する患者由来の尿サンプルを、P2X7受容体に対するドットブロット及び様々な抗体を用いて調べた。PVDFシートをPBS中に15分間浸し、次いで空気乾燥させた。シートを次いで尿または血清（未希釈または希釈）でドットし、37℃で乾燥させた。シートを次いで試験に使用するまで4℃に配置した（乾燥）。
ドットブロットによる細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
卵巣及び膀胱癌を有する患者由来の尿サンプルを、P2X7受容体に対するドットブロット及び様々な抗体を用いて調べた。PVDFシートをPBS中に15分間浸し、次いで空気乾燥させた。シートを次いで尿または血清（未希釈または希釈）でドットし、37℃で乾燥させた。シートを次いで試験に使用するまで4℃に配置した（乾燥）。
シートをTBS中に浸した後、3% BSA/TBSで1時間ブロックキングした。
抗体を50μg/mLの3% BSA/TBSのニトロセルロースシート（1バッグあたり1シート）を含むバッグ中に添加し、振動器上で2時間インキュベーションした。
シートをTBSで3回洗浄した後、共役体(conjugate)を1/1 K濃度で3% BSA/TBS中に添加し、振動器上に1.5時間配置した。
シートをTBSで4回溶液を交換して洗浄し、次いでクロロ-1-ナフトールを用いて現像した。
染色を水道水中で中和した後、空気乾燥してビデオカメラを用いて撮影した。
図１８は、卵巣癌及び膀胱癌患者ならびに対照群患者より得た結果の例である。全ての癌陽性患者由来の尿がP2X7を含むことが観察された一方で、対照群の尿サンプルは受容体が検出可能なレベルではなかった。
［実施例４］
免疫組織化学法による細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
本発明のある実施形態において、本発明者らは、同定された腫瘍の領域を欠失させたリンパ節中にシェッド受容体(shed receptor)を検出した。転移性細胞が不存在の場合、乳癌及び前立腺癌に対するセンチネルリンパ節と考えられたリンパ節は外科手術の過程で除去され、固定され組み込まれた(embedded)。切片を非機能的P2X7受容体の存在について染色した。受容体をセンチネルリンパ節中で検出した一方で、対照群の節は髄質中にシェッド受容体を欠いていた。例には前立腺(A)及び乳房(B)が含まれ、DABの形式による茶色染色により受容体の存在が明らかになった（図１９）。
免疫組織化学法による細胞外体液中のプリン作動性(P2X)受容体の検出
本発明のある実施形態において、本発明者らは、同定された腫瘍の領域を欠失させたリンパ節中にシェッド受容体(shed receptor)を検出した。転移性細胞が不存在の場合、乳癌及び前立腺癌に対するセンチネルリンパ節と考えられたリンパ節は外科手術の過程で除去され、固定され組み込まれた(embedded)。切片を非機能的P2X7受容体の存在について染色した。受容体をセンチネルリンパ節中で検出した一方で、対照群の節は髄質中にシェッド受容体を欠いていた。例には前立腺(A)及び乳房(B)が含まれ、DABの形式による茶色染色により受容体の存在が明らかになった（図１９）。
［実施例５］
血清及び尿中のプリン作動性(P2X)受容体の検出による前立腺癌の検出
本発明のある実施形態では、本発明者らは直接ELISAを使用して、進行性前立腺癌を有する患者由来の尿及び血清中のP2X7受容体の存在を検出した。
血清及び尿中のプリン作動性(P2X)受容体の検出による前立腺癌の検出
本発明のある実施形態では、本発明者らは直接ELISAを使用して、進行性前立腺癌を有する患者由来の尿及び血清中のP2X7受容体の存在を検出した。
マイクロタイタープレートベースのEIAキットは、8ウェルがそれぞれ12連からなり、P2X7に対するE80、E140またはE200抗体で事前にコーティングされている。アッセイは、サンプル中のシェッド受容体と事前にコーティングされたマイクロタイタープレート上の制限された数の特異的結合部位に対する受容体-酵素共役体間の、競合に基づいて作用する。
一晩のインキュベーションの後、非結合試薬をPBSでウェルをすすぐことにより除去した。酵素共役体は、トレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を利用した。P2X7-HRPの結合量を、色原体基質である、2,2’-アジノ-bis(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）ジアンモニウム塩(ABTS)を添加することにより、測定した。結合したP2X7-HRP共役体は、無色のABTS溶液を青色の産物に変換させた。ABTS反応を5%のシュウ酸である反応終了用溶液を添加することにより終了させ、溶液は黄色の産物に変換された。色の強度を、マイクロプレートリーダーを用いて490 nmを参照して450 nmで測定した。色の強度は校正器またはサンプル中のP2X7エピトープ濃度に反比例した。
［実施例６］
糞便中のプリン作動性(P2X)受容体の検出による結腸癌の検出
腺癌であることがわかっている2人の患者由来の糞便サンプルを回収し、シェッド(shed)細胞バッファーを抽出した。サンプルをポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、P2X7の主なバンドをウェスタンブロットで同定した。図は、完全長の受容体に相当する配列番号2及びエピトープ200-216を含む受容体の欠失部分に対する抗体を使用して、それぞれ75 kDa及び30 kDaの分子量の2つの主要なバンドを示す。
糞便中のプリン作動性(P2X)受容体の検出による結腸癌の検出
腺癌であることがわかっている2人の患者由来の糞便サンプルを回収し、シェッド(shed)細胞バッファーを抽出した。サンプルをポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、P2X7の主なバンドをウェスタンブロットで同定した。図は、完全長の受容体に相当する配列番号2及びエピトープ200-216を含む受容体の欠失部分に対する抗体を使用して、それぞれ75 kDa及び30 kDaの分子量の2つの主要なバンドを示す。
Claims (10)
- 個体が癌を有するかどうかを決定するための方法であって、
- 癌の存在または不存在を決定しようとする個体より得られる、セルフリーの細胞外体液のサンプルを提供する工程；
- サンプル中の細胞外体液中のＰ２Ｘ７受容体、その単量体またはその断片と、抗Ｐ２Ｘ７受容体抗体またはＰ２Ｘ７受容体と結合する抗体断片との間に免疫複合体が形成される条件で、サンプルを抗Ｐ２Ｘ７受容体抗体またはＰ２Ｘ７受容体と結合する抗体断片と接触させる工程；及び
- 免疫複合体が形成されるかどうかを検出し、それにより個体が癌を有するかどうかを決定する工程
を含む、方法。 - 前記細胞外体液が、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、精液、唾液、痰、腹水、糞便、子宮および膣の分泌物、胆汁、羊水、脳脊髄液、涙、ならびに器官および組織フラッシング液からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体又は抗体断片が、モノクローナル抗体又はその断片である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記抗体又は抗体断片が、免疫複合体の形成の検出用標識に接合される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体又は抗体断片が、免疫複合体の検出用、または形成用の、固相に結合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記受容体、その単量体又はその断片が、抗Ｐ２Ｘ７受容体抗体又は抗体断片と接触させるために、固相に連結される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗Ｐ２Ｘ７受容体抗体又はその抗体断片が、配列番号２を含むアミノ酸配列を有するＰ２Ｘ７受容体と結合する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体断片が、dAb、Fab、Fd、Fv、F(ab’)2、scFv及びCDRからなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、または他の実質細胞の成長異常からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌腫が、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌及び結腸癌からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
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