JP2003033198A - Ｐ２ｘ７受容体活性の調節因子を同定する方法および産物、並びに骨格障害の治療におけるそれらの使用 - Google Patents
Ｐ２ｘ７受容体活性の調節因子を同定する方法および産物、並びに骨格障害の治療におけるそれらの使用Info
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- JP2003033198A JP2003033198A JP2002125273A JP2002125273A JP2003033198A JP 2003033198 A JP2003033198 A JP 2003033198A JP 2002125273 A JP2002125273 A JP 2002125273A JP 2002125273 A JP2002125273 A JP 2002125273A JP 2003033198 A JP2003033198 A JP 2003033198A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｐ２Ｘ７受容体活性の調節因子を同定する
方法および産物、並びに骨格障害の治療におけるそれら
の使用を提供する。 【解決手段】 化合物をスクリーニングして、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための療法的候
補を同定する方法と共に、減少した骨量および／または
骨ミネラル密度によって特徴付けられる骨格障害を治療
する方法である。該方法は、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニス
トの同定および使用に基づく。すなわち、化合物をスク
リーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度を
増加させるための療法的候補を同定する方法であって：
試験化合物と、Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、該化
合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの前
記Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にする条件下で接触さ
せ；そしてＰ２Ｘ７受容体活性の指標を検出することを
含み；前記指標の増加が、前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏ
でＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を増加させるための候補で
あることを示す、前記方法。
方法および産物、並びに骨格障害の治療におけるそれら
の使用を提供する。 【解決手段】 化合物をスクリーニングして、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための療法的候
補を同定する方法と共に、減少した骨量および／または
骨ミネラル密度によって特徴付けられる骨格障害を治療
する方法である。該方法は、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニス
トの同定および使用に基づく。すなわち、化合物をスク
リーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度を
増加させるための療法的候補を同定する方法であって：
試験化合物と、Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、該化
合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの前
記Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にする条件下で接触さ
せ；そしてＰ２Ｘ７受容体活性の指標を検出することを
含み；前記指標の増加が、前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏ
でＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を増加させるための候補で
あることを示す、前記方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分子生物学および
骨学の分野に関する。より具体的には、本発明は、化合
物をスクリーニングして、Ｐ２Ｘ７受容体活性の調節因
子を同定することによって、骨量および／または骨ミネ
ラル密度を調節するための療法的候補を同定する方法お
よび産物に関する。こうした療法的候補は、減少した骨
量および／または骨ミネラル密度によって特徴付けられ
る骨格障害の治療に有用である可能性がある。
骨学の分野に関する。より具体的には、本発明は、化合
物をスクリーニングして、Ｐ２Ｘ７受容体活性の調節因
子を同定することによって、骨量および／または骨ミネ
ラル密度を調節するための療法的候補を同定する方法お
よび産物に関する。こうした療法的候補は、減少した骨
量および／または骨ミネラル密度によって特徴付けられ
る骨格障害の治療に有用である可能性がある。
【０００２】
【従来の技術】細胞表面ＡＴＰ受容体は、代謝調節型受
容体ファミリー（Ｐ２Ｙ／Ｐ２Ｕ受容体ファミリー）お
よびイオンチャンネル型受容体ファミリー（Ｐ２Ｘ受容
体ファミリー）に分けることが可能である。代謝調節型
受容体ファミリーメンバーは、Ｇ−タンパク質カップリ
ング受容体であり、そしてイオンチャンネル型受容体フ
ァミリーメンバーはリガンド作動型チャンネルである。
１１の代謝調節型受容体ファミリーメンバーおよび７つ
のイオンチャンネル型受容体ファミリーメンバー、Ｐ２
Ｘ１からＰ２Ｘ７がある。
容体ファミリー（Ｐ２Ｙ／Ｐ２Ｕ受容体ファミリー）お
よびイオンチャンネル型受容体ファミリー（Ｐ２Ｘ受容
体ファミリー）に分けることが可能である。代謝調節型
受容体ファミリーメンバーは、Ｇ−タンパク質カップリ
ング受容体であり、そしてイオンチャンネル型受容体フ
ァミリーメンバーはリガンド作動型チャンネルである。
１１の代謝調節型受容体ファミリーメンバーおよび７つ
のイオンチャンネル型受容体ファミリーメンバー、Ｐ２
Ｘ１からＰ２Ｘ７がある。
【０００３】Ｐ２Ｘ７受容体は、Ｐ２Ｘ受容体ファミリ
ーの他のメンバー同様、ＡＴＰ作動型イオンチャンネル
である（Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔら（１９９６）， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７２：７３５−７３８； Ｒａｓｓｅｎ
ｄｒｅｎら（１９９７），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２７２：５４８２−５４８６； Ｍｉｃｈｅｌら
（１９９８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
１２５：１１９４−１２０１）。しかし、Ｐ２Ｘ７受
容体は、このファミリーの他のメンバーとは明らかに異
なる特性を示す。例えば、Ｐ２Ｘ７受容体は、活性化を
達成するのに、１ｍＭより多いＡＴＰレベルを必要とす
るが、他のＰ２Ｘ受容体は、１００μＭ未満またはそれ
に等しいＡＴＰ濃度で活性化する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ
ら（１９９８）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２
６３：１０３３７−１０３４３；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら
（１９８７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
２：８８８４−８８８８）。より高い濃度が必要である
ことは、部分的に、Ｐ２Ｘ７受容体がそのリガンドとし
てＡＴＰ4-を優先すること、そして生理学的濃度の二価
陽イオン（例えばＣａ2+およびＭｇ2+）を含む培地中に
この種の存在量が比較的低いことを反映する。Ｐ２Ｘ７
受容体のさらにユニークな特徴は、そのコンダクタンス
特性に見られる。Ｐ２Ｘ受容体はすべて、連結後、非選
択的チャンネル様特性を示すが、Ｐ２Ｘ７受容体によっ
て形成されるチャンネルは、迅速に孔へとトランスフォ
ームし、９００ダルトンもの大きさの溶質の通過を可能
にする（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら（１９８７）， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：８８８４−８８８
８； Ｖｉｒｇｉｎｉｏら（１９９９）， Ｊ． Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ． ５１９：３３５−３４６）。このトラン
スフォーメーションの分子的詳細は説明されないままで
あるが、ドメイン交換および欠失実験から、Ｐ２Ｘ７受
容体のカルボキシ末端ドメインが、孔複合体形成に関与
していることが示唆されてきており；カルボキシ末端ド
メインは、他のＰ２Ｘ受容体の匹敵するドメインよりか
なり長い（Ｎｏｒｔｈ（１９９６）， Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：４７４−４
８３）。おそらくこの孔様活性の結果として、Ｐ２Ｘ７
受容体が、１５分間より長く連続して連結し、これが細
胞死につながる可能性がある（Ｄｉ Ｖｉｒｇｉｌｉｏ
（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １
６：５２４−５２８； Ｍｕｒｇｉａら（１９９２），
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８８：８９７−９０１；
Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９９）， ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ． ４４７：７１−７５）。
ーの他のメンバー同様、ＡＴＰ作動型イオンチャンネル
である（Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔら（１９９６）， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７２：７３５−７３８； Ｒａｓｓｅｎ
ｄｒｅｎら（１９９７），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２７２：５４８２−５４８６； Ｍｉｃｈｅｌら
（１９９８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
１２５：１１９４−１２０１）。しかし、Ｐ２Ｘ７受
容体は、このファミリーの他のメンバーとは明らかに異
なる特性を示す。例えば、Ｐ２Ｘ７受容体は、活性化を
達成するのに、１ｍＭより多いＡＴＰレベルを必要とす
るが、他のＰ２Ｘ受容体は、１００μＭ未満またはそれ
に等しいＡＴＰ濃度で活性化する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ
ら（１９９８）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２
６３：１０３３７−１０３４３；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら
（１９８７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
２：８８８４−８８８８）。より高い濃度が必要である
ことは、部分的に、Ｐ２Ｘ７受容体がそのリガンドとし
てＡＴＰ4-を優先すること、そして生理学的濃度の二価
陽イオン（例えばＣａ2+およびＭｇ2+）を含む培地中に
この種の存在量が比較的低いことを反映する。Ｐ２Ｘ７
受容体のさらにユニークな特徴は、そのコンダクタンス
特性に見られる。Ｐ２Ｘ受容体はすべて、連結後、非選
択的チャンネル様特性を示すが、Ｐ２Ｘ７受容体によっ
て形成されるチャンネルは、迅速に孔へとトランスフォ
ームし、９００ダルトンもの大きさの溶質の通過を可能
にする（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら（１９８７）， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：８８８４−８８８
８； Ｖｉｒｇｉｎｉｏら（１９９９）， Ｊ． Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ． ５１９：３３５−３４６）。このトラン
スフォーメーションの分子的詳細は説明されないままで
あるが、ドメイン交換および欠失実験から、Ｐ２Ｘ７受
容体のカルボキシ末端ドメインが、孔複合体形成に関与
していることが示唆されてきており；カルボキシ末端ド
メインは、他のＰ２Ｘ受容体の匹敵するドメインよりか
なり長い（Ｎｏｒｔｈ（１９９６）， Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：４７４−４
８３）。おそらくこの孔様活性の結果として、Ｐ２Ｘ７
受容体が、１５分間より長く連続して連結し、これが細
胞死につながる可能性がある（Ｄｉ Ｖｉｒｇｉｌｉｏ
（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １
６：５２４−５２８； Ｍｕｒｇｉａら（１９９２），
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８８：８９７−９０１；
Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９９）， ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ． ４４７：７１−７５）。
【０００４】Ｐ２Ｘ７受容体は、限定された細胞分布を
示し、単球およびマクロファージおよびいくつかのリン
パ球集団を含む造血起源の細胞に主に観察される（Ｄｉ
Ｖｉｒｇｉｌｉｏ（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ １６：５２４−５２８； Ｃｏｌｌｏら
（１９９７）， Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３
６：１２７７−１２８３）。この受容体はまた、ミクロ
グリア細胞（Ｓａｎｚら（２０００）， Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． １６４：４８９３−４８９８）、いくつか
の癌細胞（Ｗｉｌｅｙら（１９８９）， Ｂｌｏｏｄ
７３：１３１６−１３２３）、精子（Ｆｏｒｅｓｔａら
（１９９６）， Ａｍ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７
０：Ｃ１７０９−Ｃ１７１４）、および樹状細胞（Ｍｕ
ｔｉｎｉら（１９９９）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１６３：１９５８−１９６５）上に存在すると報告され
ている。Ｐ２Ｘ７受容体は、リンパ球増殖（Ｂａｒｉｃ
ｏｒｄｉら（１９９９）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２７４：３３２０６−３３２０８）、受精（Ｆｏ
ｒｅｓｔａら（１９９６）， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ． ２７０：Ｃ１７０９−Ｃ１７１４）、巨細胞
形成（Ｃｈｉｏｚｚｉら（１９９７）， Ｊ． Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ． １３８：６９７−７０６）、細胞死
（Ｍｕｒｇｉａら（１９９２）， Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ． ２８８：８９７−９０１； Ｆｅｒｒａｒｉら
（１９９９）， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４７：７１−
７５）、進入するミコバクテリウムの殺作用（Ｌａｍｍ
ａｓら（１９９７）， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４３３
−４４４）、およびＩＬ−１翻訳後プロセシング（Ｈｏ
ｇｑｕｉｓｔら（１９９１）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：８４８５−
８４８９； Ｐｅｒｒｅｇａｕｘら（１９９４）Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１５１９５−１５２
０３）を含む多様なリストの細胞活性に関与することが
報告されている。さらに、Ｐ２Ｘ７受容体の連結は、ホ
スホリパーゼＤの活性化およびＮＦ−κＢのいくつかの
型の活性化と関連付けられている（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ
ら（１９９６）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：
５６２７−５６３７； Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９
７）， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３９：１６３
５−１６４３）。Ｐ２Ｘ７受容体が、ラット骨組織およ
びラット破骨細胞で発現されていることが報告されてい
る（Ｈｏｅｂｅｒｔｚら（２０００）Ｂｏｎｅ ２７：
５０３−５１０）。
示し、単球およびマクロファージおよびいくつかのリン
パ球集団を含む造血起源の細胞に主に観察される（Ｄｉ
Ｖｉｒｇｉｌｉｏ（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ １６：５２４−５２８； Ｃｏｌｌｏら
（１９９７）， Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３
６：１２７７−１２８３）。この受容体はまた、ミクロ
グリア細胞（Ｓａｎｚら（２０００）， Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． １６４：４８９３−４８９８）、いくつか
の癌細胞（Ｗｉｌｅｙら（１９８９）， Ｂｌｏｏｄ
７３：１３１６−１３２３）、精子（Ｆｏｒｅｓｔａら
（１９９６）， Ａｍ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７
０：Ｃ１７０９−Ｃ１７１４）、および樹状細胞（Ｍｕ
ｔｉｎｉら（１９９９）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１６３：１９５８−１９６５）上に存在すると報告され
ている。Ｐ２Ｘ７受容体は、リンパ球増殖（Ｂａｒｉｃ
ｏｒｄｉら（１９９９）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２７４：３３２０６−３３２０８）、受精（Ｆｏ
ｒｅｓｔａら（１９９６）， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ． ２７０：Ｃ１７０９−Ｃ１７１４）、巨細胞
形成（Ｃｈｉｏｚｚｉら（１９９７）， Ｊ． Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ． １３８：６９７−７０６）、細胞死
（Ｍｕｒｇｉａら（１９９２）， Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ． ２８８：８９７−９０１； Ｆｅｒｒａｒｉら
（１９９９）， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４７：７１−
７５）、進入するミコバクテリウムの殺作用（Ｌａｍｍ
ａｓら（１９９７）， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４３３
−４４４）、およびＩＬ−１翻訳後プロセシング（Ｈｏ
ｇｑｕｉｓｔら（１９９１）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：８４８５−
８４８９； Ｐｅｒｒｅｇａｕｘら（１９９４）Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１５１９５−１５２
０３）を含む多様なリストの細胞活性に関与することが
報告されている。さらに、Ｐ２Ｘ７受容体の連結は、ホ
スホリパーゼＤの活性化およびＮＦ−κＢのいくつかの
型の活性化と関連付けられている（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ
ら（１９９６）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：
５６２７−５６３７； Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９
７）， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３９：１６３
５−１６４３）。Ｐ２Ｘ７受容体が、ラット骨組織およ
びラット破骨細胞で発現されていることが報告されてい
る（Ｈｏｅｂｅｒｔｚら（２０００）Ｂｏｎｅ ２７：
５０３−５１０）。
【０００５】動物全体でのＩＬ−１β翻訳後プロセシン
グにおけるＰ２Ｘ７受容体の役割に取り組むため、Ｐ２
Ｘ７受容体欠損マウス系統が生成されている（Ｓｏｌｌ
ｅら（２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２７６：１２５−１３２を参照されたい）。Ｐ２Ｘ７受
容体欠損マウスは、マクロファージの細菌リポ多糖刺激
に反応したプロ−ＩＬ−１βの正常な産生を示し、そし
てｉｎ ｖｉｖｏリポ多糖注射に反応した腹腔ＩＬ−６
の正常な増加を示した。しかし、Ｐ２Ｘ７受容体欠損マ
ウスは、ＡＴＰ刺激マクロファージによる成熟ＩＬ−１
βの正常な外在化（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）
を示さず、またＡＴＰ注射に反応した腹腔ＩＬ−１の正
常な増加も示さなかった。これらの相違にもかかわら
ず、Ｐ２Ｘ７受容体欠損マウスは、健康であり、そして
妊性であり、そして明白な表現型をまったく示さない。
グにおけるＰ２Ｘ７受容体の役割に取り組むため、Ｐ２
Ｘ７受容体欠損マウス系統が生成されている（Ｓｏｌｌ
ｅら（２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２７６：１２５−１３２を参照されたい）。Ｐ２Ｘ７受
容体欠損マウスは、マクロファージの細菌リポ多糖刺激
に反応したプロ−ＩＬ−１βの正常な産生を示し、そし
てｉｎ ｖｉｖｏリポ多糖注射に反応した腹腔ＩＬ−６
の正常な増加を示した。しかし、Ｐ２Ｘ７受容体欠損マ
ウスは、ＡＴＰ刺激マクロファージによる成熟ＩＬ−１
βの正常な外在化（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）
を示さず、またＡＴＰ注射に反応した腹腔ＩＬ−１の正
常な増加も示さなかった。これらの相違にもかかわら
ず、Ｐ２Ｘ７受容体欠損マウスは、健康であり、そして
妊性であり、そして明白な表現型をまったく示さない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、化合物をスク
リーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度を
調節するための療法的候補を同定する方法を提供する。
本発明はまた、減少した骨量および／または骨ミネラル
密度によって特徴付けられる骨格障害を治療するための
方法であって、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニストの同定およ
び使用に基づく、前記方法も提供する。化合物をスクリ
ーニングする方法は、部分的に、Ｐ２Ｘ７受容体のｉｎ
ｖｉｖｏの役割およびその活性の性質決定に応じる。
リーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度を
調節するための療法的候補を同定する方法を提供する。
本発明はまた、減少した骨量および／または骨ミネラル
密度によって特徴付けられる骨格障害を治療するための
方法であって、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニストの同定およ
び使用に基づく、前記方法も提供する。化合物をスクリ
ーニングする方法は、部分的に、Ｐ２Ｘ７受容体のｉｎ
ｖｉｖｏの役割およびその活性の性質決定に応じる。
【０００７】したがって、１つの側面において、本発明
は、化合物をスクリーニングして、骨量および／または
骨ミネラル密度を調節するための療法的候補を同定する
方法であって、化合物がＰ２Ｘ７受容体活性の指標を増
加させるかまたは減少させる能力を決定することによ
る、前記方法を提供する。これらの方法では、細胞表面
上にＰ２Ｘ７受容体を発現する細胞株由来の細胞表面上
のＰ２Ｘ７受容体と、化合物を接触させる。接触工程
は、該化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガン
ドへの該Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にするであろう条
件下で行う。その後、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標を測定
する；該指標の増加または減少は、該化合物がｉｎ ｖ
ｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、
骨量および／または骨ミネラル密度を調節するための候
補であることを示す。
は、化合物をスクリーニングして、骨量および／または
骨ミネラル密度を調節するための療法的候補を同定する
方法であって、化合物がＰ２Ｘ７受容体活性の指標を増
加させるかまたは減少させる能力を決定することによ
る、前記方法を提供する。これらの方法では、細胞表面
上にＰ２Ｘ７受容体を発現する細胞株由来の細胞表面上
のＰ２Ｘ７受容体と、化合物を接触させる。接触工程
は、該化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガン
ドへの該Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にするであろう条
件下で行う。その後、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標を測定
する；該指標の増加または減少は、該化合物がｉｎ ｖ
ｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、
骨量および／または骨ミネラル密度を調節するための候
補であることを示す。
【０００８】いくつかの態様において、アッセイに既知
のＰ２Ｘ７受容体リガンドを添加せずに、Ｐ２Ｘ７受容
体と化合物を接触させ、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストを同
定する。これらの態様において、Ｐ２Ｘ７受容体活性の
指標の増加は、該化合物がＰ２Ｘ７受容体のアゴニスト
の候補であることを示す。他の態様において、既知のＰ
２Ｘ７受容体リガンドに加えて、化合物を添加し、Ｐ２
Ｘ７受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定す
る。これらの態様では、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標の増
加は、該化合物がＰ２Ｘ７受容体のアゴニストの候補で
あるか、または既知のリガンドのアゴニスト活性の増進
因子であることを示し、そして指標の減少は、該化合物
がＰ２Ｘ７受容体のアンタゴニストの候補であるか、ま
たは既知のリガンドのアゴニスト活性の阻害剤であるこ
とを示す。
のＰ２Ｘ７受容体リガンドを添加せずに、Ｐ２Ｘ７受容
体と化合物を接触させ、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストを同
定する。これらの態様において、Ｐ２Ｘ７受容体活性の
指標の増加は、該化合物がＰ２Ｘ７受容体のアゴニスト
の候補であることを示す。他の態様において、既知のＰ
２Ｘ７受容体リガンドに加えて、化合物を添加し、Ｐ２
Ｘ７受容体アゴニストおよびアンタゴニストを同定す
る。これらの態様では、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標の増
加は、該化合物がＰ２Ｘ７受容体のアゴニストの候補で
あるか、または既知のリガンドのアゴニスト活性の増進
因子であることを示し、そして指標の減少は、該化合物
がＰ２Ｘ７受容体のアンタゴニストの候補であるか、ま
たは既知のリガンドのアゴニスト活性の阻害剤であるこ
とを示す。
【０００９】前述の態様のいずれにおいても、化合物ま
たはリガンドおよび受容体の間の相互作用は、Ｐ２Ｘ７
受容体活性の指標を測定することによって決定する。好
ましい指標は、増加した細胞浸透性または増加した巨大
分子の細胞内集積；活性化炎症性細胞における増加した
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−１８翻訳後プロ
セシング；炎症誘導細胞における増加したＩＬ−６産
生；Ｌ−セレクチン分断；ストレスキナーゼ活性化；お
よびリンパ球増殖である。Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイン
を発現する細胞が破骨細胞前駆体であるいくつかの態様
において、指標は、破骨細胞への分化である。細胞が破
骨細胞であるいくつかの態様において、指標は、増加し
た吸収窩形成または増加したアポトーシスである。
たはリガンドおよび受容体の間の相互作用は、Ｐ２Ｘ７
受容体活性の指標を測定することによって決定する。好
ましい指標は、増加した細胞浸透性または増加した巨大
分子の細胞内集積；活性化炎症性細胞における増加した
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−１８翻訳後プロ
セシング；炎症誘導細胞における増加したＩＬ−６産
生；Ｌ−セレクチン分断；ストレスキナーゼ活性化；お
よびリンパ球増殖である。Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイン
を発現する細胞が破骨細胞前駆体であるいくつかの態様
において、指標は、破骨細胞への分化である。細胞が破
骨細胞であるいくつかの態様において、指標は、増加し
た吸収窩形成または増加したアポトーシスである。
【００１０】上述の態様のいずれにおいても、Ｐ２Ｘ７
受容体を発現する細胞は、天然にＰ２Ｘ７受容体を発現
する細胞であってもよいし、またはＰ２Ｘ７受容体をコ
ードする遺伝子構築物で形質転換された細胞株由来であ
ってもよい。
受容体を発現する細胞は、天然にＰ２Ｘ７受容体を発現
する細胞であってもよいし、またはＰ２Ｘ７受容体をコ
ードする遺伝子構築物で形質転換された細胞株由来であ
ってもよい。
【００１１】別の側面において、本発明は、化合物をス
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する方法であって、
化合物がＰ２Ｘ７受容体結合ドメインに結合する能力を
決定することによる、前記方法を提供する。これらの方
法では、細胞表面上にＰ２Ｘ７受容体の結合ドメインを
発現する細胞株由来の細胞表面上のＰ２Ｘ７受容体の少
なくとも結合ドメインと、化合物を接触させる。接触工
程は、化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガン
ドへの該Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインの結合を可能にす
るであろう条件下で行う。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容
体結合ドメインおよび化合物の間の結合を検出する。Ｐ
２Ｘ７受容体結合ドメインおよび化合物の間の結合は、
該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用
することによって、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための候補であることを示す。
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する方法であって、
化合物がＰ２Ｘ７受容体結合ドメインに結合する能力を
決定することによる、前記方法を提供する。これらの方
法では、細胞表面上にＰ２Ｘ７受容体の結合ドメインを
発現する細胞株由来の細胞表面上のＰ２Ｘ７受容体の少
なくとも結合ドメインと、化合物を接触させる。接触工
程は、化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガン
ドへの該Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインの結合を可能にす
るであろう条件下で行う。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容
体結合ドメインおよび化合物の間の結合を検出する。Ｐ
２Ｘ７受容体結合ドメインおよび化合物の間の結合は、
該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用
することによって、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための候補であることを示す。
【００１２】いくつかの態様において、アッセイに既知
のＰ２Ｘ７受容体リガンドを添加せずに、Ｐ２Ｘ７受容
体結合ドメインと化合物を接触させる。これらの態様で
は、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの結合は、該化合物
がＰ２Ｘ７受容体と相互作用するための候補であること
を示す。他の態様において、既知のＰ２Ｘ７受容体リガ
ンドの存在下で、化合物を添加する。これらの態様で
は、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの該化合物の結合ま
たはＰ２Ｘ７受容体結合ドメインへの既知のリガンドの
結合の減少のいずれも、該化合物がＰ２Ｘ７受容体と相
互作用するための候補であることを示す。
のＰ２Ｘ７受容体リガンドを添加せずに、Ｐ２Ｘ７受容
体結合ドメインと化合物を接触させる。これらの態様で
は、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの結合は、該化合物
がＰ２Ｘ７受容体と相互作用するための候補であること
を示す。他の態様において、既知のＰ２Ｘ７受容体リガ
ンドの存在下で、化合物を添加する。これらの態様で
は、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの該化合物の結合ま
たはＰ２Ｘ７受容体結合ドメインへの既知のリガンドの
結合の減少のいずれも、該化合物がＰ２Ｘ７受容体と相
互作用するための候補であることを示す。
【００１３】先行する方法のいくつかの態様において、
化合物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容
体結合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、化合
物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいずれかを検
出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表面上のＰ
２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、いかなる未
結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受容体結合
ドメインに結合した標識化要素を検出する。こうしたア
ッセイにおける好ましい標識は、放射性同位体、蛍光標
識、化学発光標識、酵素ドメイン、特異的結合要素、お
よび金属原子である。
化合物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容
体結合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、化合
物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいずれかを検
出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表面上のＰ
２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、いかなる未
結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受容体結合
ドメインに結合した標識化要素を検出する。こうしたア
ッセイにおける好ましい標識は、放射性同位体、蛍光標
識、化学発光標識、酵素ドメイン、特異的結合要素、お
よび金属原子である。
【００１４】上述の態様のいずれにおいても、Ｐ２Ｘ７
受容体結合ドメインを発現する細胞は、天然にＰ２Ｘ７
受容体を発現する細胞であってもよいし、またはＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインをコードする遺伝子構築物で形質
転換された細胞株由来であってもよい。形質転換細胞を
用いる場合、これらは、好ましくは、全Ｐ２Ｘ７受容
体、またはＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを
含むキメラタンパク質を発現する遺伝子構築物で形質転
換される。
受容体結合ドメインを発現する細胞は、天然にＰ２Ｘ７
受容体を発現する細胞であってもよいし、またはＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインをコードする遺伝子構築物で形質
転換された細胞株由来であってもよい。形質転換細胞を
用いる場合、これらは、好ましくは、全Ｐ２Ｘ７受容
体、またはＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを
含むキメラタンパク質を発現する遺伝子構築物で形質転
換される。
【００１５】別の側面において、本発明は、化合物をス
クリーニングして、Ｐ２Ｘ７受容体発現を調節すること
によって、骨量および／または骨ミネラル密度を調節す
るための療法的候補を同定する方法を提供する。これら
の方法では、内因性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞、あ
るいは内因性または外因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写調
節要素に機能可能であるように連結されているレポータ
ー遺伝子で形質転換された細胞を、試験しようとする化
合物と接触させる。内因性Ｐ２Ｘ７遺伝子またはレポー
ター遺伝子の発現の増加または減少は、該化合物がｉｎ
ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発現を増加させるかまたは
減少させることによって、骨量および／または骨ミネラ
ル密度を調節するための候補であることを示す。
クリーニングして、Ｐ２Ｘ７受容体発現を調節すること
によって、骨量および／または骨ミネラル密度を調節す
るための療法的候補を同定する方法を提供する。これら
の方法では、内因性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞、あ
るいは内因性または外因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写調
節要素に機能可能であるように連結されているレポータ
ー遺伝子で形質転換された細胞を、試験しようとする化
合物と接触させる。内因性Ｐ２Ｘ７遺伝子またはレポー
ター遺伝子の発現の増加または減少は、該化合物がｉｎ
ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発現を増加させるかまたは
減少させることによって、骨量および／または骨ミネラ
ル密度を調節するための候補であることを示す。
【００１６】別の側面において、本発明は、化合物をス
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する、細胞に基づく
機能的活性アッセイを提供する。これらの方法では、Ｐ
２Ｘ７受容体をコードする配列に機能可能であるように
連結されている外因性転写調節要素を含む遺伝子構築物
で形質転換された細胞株由来の細胞を、試験しようとす
る化合物と接触させる。細胞におけるＰ２Ｘ７受容体活
性の指標の増加または減少は、該化合物がｉｎｖｉｖｏ
でＰ２Ｘ７受容体活性を増加させるかまたは減少させる
ことによって、骨量および／または骨ミネラル密度を調
節するための候補であることを示す。こうした態様で
は、指標には、限定されるわけではないが、増加した細
胞浸透性または増加した巨大分子の細胞内集積；活性化
炎症性細胞における増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、
またはＩＬ−１８翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞に
おける増加したＩＬ−６産生；Ｌ−セレクチン分断；ス
トレスキナーゼ活性化；およびリンパ球増殖が含まれる
可能性がある。細胞が破骨細胞前駆体であるいくつかの
態様において、指標は、破骨細胞への分化である。細胞
が破骨細胞であるいくつかの態様において、指標は、増
加した吸収窩形成または増加したアポトーシスである。
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する、細胞に基づく
機能的活性アッセイを提供する。これらの方法では、Ｐ
２Ｘ７受容体をコードする配列に機能可能であるように
連結されている外因性転写調節要素を含む遺伝子構築物
で形質転換された細胞株由来の細胞を、試験しようとす
る化合物と接触させる。細胞におけるＰ２Ｘ７受容体活
性の指標の増加または減少は、該化合物がｉｎｖｉｖｏ
でＰ２Ｘ７受容体活性を増加させるかまたは減少させる
ことによって、骨量および／または骨ミネラル密度を調
節するための候補であることを示す。こうした態様で
は、指標には、限定されるわけではないが、増加した細
胞浸透性または増加した巨大分子の細胞内集積；活性化
炎症性細胞における増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、
またはＩＬ−１８翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞に
おける増加したＩＬ−６産生；Ｌ−セレクチン分断；ス
トレスキナーゼ活性化；およびリンパ球増殖が含まれる
可能性がある。細胞が破骨細胞前駆体であるいくつかの
態様において、指標は、破骨細胞への分化である。細胞
が破骨細胞であるいくつかの態様において、指標は、増
加した吸収窩形成または増加したアポトーシスである。
【００１７】形質転換細胞を使用する前述の態様のいず
れにおいても、細胞は、Ｐ２Ｘ７受容体、Ｐ２Ｘ７受容
体結合ドメイン、またレポーター遺伝子をコードする遺
伝子構築物で形質転換されている、トランスジェニック
非ヒト動物由来であってもよいし、またはこうした動物
の子孫であってもよい。
れにおいても、細胞は、Ｐ２Ｘ７受容体、Ｐ２Ｘ７受容
体結合ドメイン、またレポーター遺伝子をコードする遺
伝子構築物で形質転換されている、トランスジェニック
非ヒト動物由来であってもよいし、またはこうした動物
の子孫であってもよい。
【００１８】別の側面において、本発明は、化合物をス
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する、動物に基づく
アッセイであって、全非ヒト動物を使用する、前記アッ
セイを提供する。したがって、この側面において、化合
物を動物に投与し、そして該動物において、Ｐ２Ｘ７受
容体活性の指標の増加または減少を検出する。こうした
指標の増加は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受
容体活性を増加させることによって、骨量および／また
は骨ミネラル密度を増加させるための候補であることを
示す。こうした指標の減少は、該化合物がｉｎ ｖｉｖ
ｏでＰ２Ｘ７受容体活性を減少させることによって、骨
量および／または骨ミネラル密度を減少させるための候
補であることを示す。
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する、動物に基づく
アッセイであって、全非ヒト動物を使用する、前記アッ
セイを提供する。したがって、この側面において、化合
物を動物に投与し、そして該動物において、Ｐ２Ｘ７受
容体活性の指標の増加または減少を検出する。こうした
指標の増加は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受
容体活性を増加させることによって、骨量および／また
は骨ミネラル密度を増加させるための候補であることを
示す。こうした指標の減少は、該化合物がｉｎ ｖｉｖ
ｏでＰ２Ｘ７受容体活性を減少させることによって、骨
量および／または骨ミネラル密度を減少させるための候
補であることを示す。
【００１９】いくつかの態様において、動物は、通常Ｐ
２Ｘ７受容体を発現する動物であり、そして受容体に関
して正常または野生型である動物である。あるいは、動
物は、該動物で発現されるＰ２Ｘ７受容体をコードする
遺伝子構築物で形質転換されているトランスジェニック
非ヒト動物、またはこうした動物の子孫である。
２Ｘ７受容体を発現する動物であり、そして受容体に関
して正常または野生型である動物である。あるいは、動
物は、該動物で発現されるＰ２Ｘ７受容体をコードする
遺伝子構築物で形質転換されているトランスジェニック
非ヒト動物、またはこうした動物の子孫である。
【００２０】前述の態様で検出することが可能なＰ２Ｘ
７受容体活性の指標には、増加した細胞浸透性または増
加した巨大分子の細胞内集積；活性化炎症性細胞におけ
る増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−１８
翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞における増加したＩ
Ｌ−６産生；Ｌ−セレクチン分断；ストレスキナーゼ活
性化；およびリンパ球増殖が含まれる。さらに、指標に
は、破骨細胞前駆体の破骨細胞への分化、破骨細胞の増
加した吸収窩形成、または増加したアポトーシスが含ま
れる。こうした指標は、好ましくは、動物由来の体液お
よび／または生検試料を用いて評価する。さらに、指標
には、骨ミネラル密度、骨ミネラル含量、骨梁（ｔｒａ
ｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）数、骨梁分離、骨ミネラル
領域、骨体積、骨の厚み、および骨外周などの表現型的
変化が含まれる。
７受容体活性の指標には、増加した細胞浸透性または増
加した巨大分子の細胞内集積；活性化炎症性細胞におけ
る増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−１８
翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞における増加したＩ
Ｌ−６産生；Ｌ−セレクチン分断；ストレスキナーゼ活
性化；およびリンパ球増殖が含まれる。さらに、指標に
は、破骨細胞前駆体の破骨細胞への分化、破骨細胞の増
加した吸収窩形成、または増加したアポトーシスが含ま
れる。こうした指標は、好ましくは、動物由来の体液お
よび／または生検試料を用いて評価する。さらに、指標
には、骨ミネラル密度、骨ミネラル含量、骨梁（ｔｒａ
ｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）数、骨梁分離、骨ミネラル
領域、骨体積、骨の厚み、および骨外周などの表現型的
変化が含まれる。
【００２１】別の側面において、本発明は、化合物をス
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する方法であって、
化合物を動物に投与する、前記方法を提供する。これら
の態様では、動物は、外因性または内因性Ｐ２Ｘ７受容
体遺伝子転写調節要素に機能可能であるように連結され
ている外因性レポーター遺伝子で形質転換されている、
トランスジェニック非ヒト動物、またはこうした動物の
子孫である。該動物におけるレポーター遺伝子の発現の
増加または減少は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ
７受容体発現を増加させるかまたは減少させることによ
って、骨量および／または骨ミネラル密度を増加させる
かまたは減少させるための候補であることを示す。
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する方法であって、
化合物を動物に投与する、前記方法を提供する。これら
の態様では、動物は、外因性または内因性Ｐ２Ｘ７受容
体遺伝子転写調節要素に機能可能であるように連結され
ている外因性レポーター遺伝子で形質転換されている、
トランスジェニック非ヒト動物、またはこうした動物の
子孫である。該動物におけるレポーター遺伝子の発現の
増加または減少は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ
７受容体発現を増加させるかまたは減少させることによ
って、骨量および／または骨ミネラル密度を増加させる
かまたは減少させるための候補であることを示す。
【００２２】別の側面において、本発明は、化合物をス
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する、細胞不含結合
アッセイを提供する。これらの方法では、結合アッセイ
は、Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを含んで
行うが、受容体は、細胞と結合している必要はない。し
たがって、いくつかの態様において、少なくともＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインと、化合物を、該化合物の存在を
別にして、既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドへの前記Ｐ２
Ｘ７受容体結合ドメインの結合をｉｎ ｖｉｖｏで可能
にする条件下で接触させる。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受
容体結合ドメインおよび化合物の間の結合を検出する。
こうしたアッセイにおいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイ
ンおよび化合物の間の結合は、該化合物がｉｎ ｖｉｖ
ｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、骨量
および／または骨ミネラル密度を調節するための候補で
あることを示す。他の態様において、既知のＰ２Ｘ７受
容体リガンドの存在下、Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結
合ドメインと、化合物を、該化合物の存在を別にして、
該Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの該Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインの結合をｉｎｖｉｖｏで可能にする条件下で接触
させる。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインお
よび化合物またはＰ２Ｘ７受容体リガンドのいずれかの
間の結合を検出する。こうしたアッセイにおいて、Ｐ２
Ｘ７受容体結合ドメインおよび化合物の間の結合、また
はＰ２Ｘ７受容体結合ドメインおよびＰ２Ｘ７受容体リ
ガンド間の減少した結合の検出は、該化合物がｉｎ ｖ
ｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、
骨量および／または骨ミネラル密度を調節するための候
補であることを示す。
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する、細胞不含結合
アッセイを提供する。これらの方法では、結合アッセイ
は、Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを含んで
行うが、受容体は、細胞と結合している必要はない。し
たがって、いくつかの態様において、少なくともＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインと、化合物を、該化合物の存在を
別にして、既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドへの前記Ｐ２
Ｘ７受容体結合ドメインの結合をｉｎ ｖｉｖｏで可能
にする条件下で接触させる。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受
容体結合ドメインおよび化合物の間の結合を検出する。
こうしたアッセイにおいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイ
ンおよび化合物の間の結合は、該化合物がｉｎ ｖｉｖ
ｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、骨量
および／または骨ミネラル密度を調節するための候補で
あることを示す。他の態様において、既知のＰ２Ｘ７受
容体リガンドの存在下、Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結
合ドメインと、化合物を、該化合物の存在を別にして、
該Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの該Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインの結合をｉｎｖｉｖｏで可能にする条件下で接触
させる。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインお
よび化合物またはＰ２Ｘ７受容体リガンドのいずれかの
間の結合を検出する。こうしたアッセイにおいて、Ｐ２
Ｘ７受容体結合ドメインおよび化合物の間の結合、また
はＰ２Ｘ７受容体結合ドメインおよびＰ２Ｘ７受容体リ
ガンド間の減少した結合の検出は、該化合物がｉｎ ｖ
ｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、
骨量および／または骨ミネラル密度を調節するための候
補であることを示す。
【００２３】先行する態様のいずれにおいても、化合
物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容体結
合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、好ましく
は、化合物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいず
れかを検出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表
面上のＰ２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、い
かなる未結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受
容体結合ドメインに結合した標識化要素を検出する。あ
るいは、シンチレーション近接アッセイを使用する場
合、過剰な標識化要素は、検出前に洗い流す必要はな
い。前述の結合アッセイで用いられる標識には、放射性
同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素ドメイン、特異
的結合要素、および金属原子が含まれる。
物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容体結
合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、好ましく
は、化合物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいず
れかを検出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表
面上のＰ２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、い
かなる未結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受
容体結合ドメインに結合した標識化要素を検出する。あ
るいは、シンチレーション近接アッセイを使用する場
合、過剰な標識化要素は、検出前に洗い流す必要はな
い。前述の結合アッセイで用いられる標識には、放射性
同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素ドメイン、特異
的結合要素、および金属原子が含まれる。
【００２４】前述の結合アッセイの好ましい態様におい
て、非標識結合要素の１つを固定する。したがって、い
くつかの態様において、化合物を標識し、そしてＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の態様
において、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そしてＰ
２Ｘ７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の
態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインを標識し、
そして化合物を支持体上に固定する。他の態様におい
て、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そして化合物を
支持体上に固定する。他の態様において、化合物を標識
し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持体上に固定す
る。最後に、他の態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインを標識し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持
体上に固定する。固定要素に適した支持体には、アフィ
ニティーカラム、スライド、ウェル、粒子および／また
は微小粒子が含まれる。
て、非標識結合要素の１つを固定する。したがって、い
くつかの態様において、化合物を標識し、そしてＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の態様
において、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そしてＰ
２Ｘ７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の
態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインを標識し、
そして化合物を支持体上に固定する。他の態様におい
て、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そして化合物を
支持体上に固定する。他の態様において、化合物を標識
し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持体上に固定す
る。最後に、他の態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインを標識し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持
体上に固定する。固定要素に適した支持体には、アフィ
ニティーカラム、スライド、ウェル、粒子および／また
は微小粒子が含まれる。
【００２５】別の側面において、本発明は、化合物をス
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する方法であって、
凝集アッセイを使用する、前記方法を提供する。これら
の方法において、化合物を第一の粒子上に固定し、そし
てＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを第二の粒
子上に固定する。化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受
容体リガンドへの前記Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にす
る条件下で、粒子を接触させる。Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインおよび化合物の間の結合は、粒子の凝集を検出す
ることによって検出する。凝集は、該化合物がｉｎ ｖ
ｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、
骨量および／または骨ミネラル密度を調節するための候
補であることを示す。
クリーニングして、骨量および／または骨ミネラル密度
を調節するための療法的候補を同定する方法であって、
凝集アッセイを使用する、前記方法を提供する。これら
の方法において、化合物を第一の粒子上に固定し、そし
てＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを第二の粒
子上に固定する。化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受
容体リガンドへの前記Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にす
る条件下で、粒子を接触させる。Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインおよび化合物の間の結合は、粒子の凝集を検出す
ることによって検出する。凝集は、該化合物がｉｎ ｖ
ｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、
骨量および／または骨ミネラル密度を調節するための候
補であることを示す。
【００２６】別の側面において、本発明は、こうした治
療が必要な哺乳動物において、骨量および／または骨ミ
ネラル密度を増加させる方法であって、該哺乳動物にお
いて、骨量および／または骨ミネラル密度を増加させる
のに有効な量のＰ２Ｘ７受容体のアゴニストを投与する
ことによる、前記方法を提供する。別の側面において、
本発明は、減少した骨量および／または骨ミネラル密度
によって特徴付けられる骨格障害を有する哺乳動物を治
療する方法であって、該哺乳動物において、骨量および
／または骨ミネラル密度を増加させるのに有効な量のＰ
２Ｘ７受容体のアゴニストを投与することによる、前記
方法を提供する。これらの方法のいくつかの態様におい
て、哺乳動物は、骨粗しょう症、歯周炎、整形外科的骨
溶解、炎症性骨疾患、または骨折などの疾患に罹患して
いるか、またはその実質的なリスクがある。Ｐ２Ｘ７受
容体アゴニストは、全身にまたは局所に投与してもよ
い。
療が必要な哺乳動物において、骨量および／または骨ミ
ネラル密度を増加させる方法であって、該哺乳動物にお
いて、骨量および／または骨ミネラル密度を増加させる
のに有効な量のＰ２Ｘ７受容体のアゴニストを投与する
ことによる、前記方法を提供する。別の側面において、
本発明は、減少した骨量および／または骨ミネラル密度
によって特徴付けられる骨格障害を有する哺乳動物を治
療する方法であって、該哺乳動物において、骨量および
／または骨ミネラル密度を増加させるのに有効な量のＰ
２Ｘ７受容体のアゴニストを投与することによる、前記
方法を提供する。これらの方法のいくつかの態様におい
て、哺乳動物は、骨粗しょう症、歯周炎、整形外科的骨
溶解、炎症性骨疾患、または骨折などの疾患に罹患して
いるか、またはその実質的なリスクがある。Ｐ２Ｘ７受
容体アゴニストは、全身にまたは局所に投与してもよ
い。
【００２７】当業者は、本発明を説明する説明および付
随する請求項において、本明細書に用いられる用語を完
全に理解するであろう。にもかかわらず、本明細書に別
に提供されない限り、以下の用語は、この直後に記載さ
れるとおりである。
随する請求項において、本明細書に用いられる用語を完
全に理解するであろう。にもかかわらず、本明細書に別
に提供されない限り、以下の用語は、この直後に記載さ
れるとおりである。
【００２８】本明細書において、用語「Ｐ２Ｘ７受容
体」は、Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔら（１９９６）， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７２：７３５−７３８、およびＲａｓｓ
ｅｎｄｒｅｎら（１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２７２：５４８２−５４８６に記載されるヒ
ト受容体と共に、Ｐ２Ｘ７受容体活性を有するいかなる
ヒト対立遺伝子変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、並びにいか
なる哺乳動物相同体およびそれらの変異体も指す（Ｇｅ
ｎＢａｎｋ寄託番号第Ｙ０９５６１号およびＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号第Ｙ１２８５１号−第Ｙ１２８５５号も参
照されたい）。本明細書において、用語「相同体」は、
異なる種における参照タンパク質と進化的に関連し、そ
して実質的な構造的および機能的類似性を共有するタン
パク質を意味する（例えばヒトおよびラットＰ２Ｘ７受
容体）。
体」は、Ｓｕｒｐｒｅｎａｎｔら（１９９６）， Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７２：７３５−７３８、およびＲａｓｓ
ｅｎｄｒｅｎら（１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２７２：５４８２−５４８６に記載されるヒ
ト受容体と共に、Ｐ２Ｘ７受容体活性を有するいかなる
ヒト対立遺伝子変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、並びにいか
なる哺乳動物相同体およびそれらの変異体も指す（Ｇｅ
ｎＢａｎｋ寄託番号第Ｙ０９５６１号およびＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号第Ｙ１２８５１号−第Ｙ１２８５５号も参
照されたい）。本明細書において、用語「相同体」は、
異なる種における参照タンパク質と進化的に関連し、そ
して実質的な構造的および機能的類似性を共有するタン
パク質を意味する（例えばヒトおよびラットＰ２Ｘ７受
容体）。
【００２９】本明細書において、用語「Ｐ２Ｘ７活性」
は、以下のいかなる１つ以上も意味する：増加した細胞
浸透性；増加した巨大分子の細胞内集積；活性化炎症性
細胞における増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、または
ＩＬ−１８翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞における
増加したＩＬ−６産生；Ｌ−セレクチン分断；ストレス
キナーゼ活性化；リンパ球増殖；破骨細胞前駆体の破骨
細胞への分化；破骨細胞による増加した吸収窩形成；ま
たは破骨細胞の増加したアポトーシス。これらの活性は
ＡＴＰによって刺激されることが知られる。しかし、本
発明の方法において、これらの活性は、Ｐ２Ｘ７受容体
リガンドの存在下または非存在下で、試験化合物によっ
て刺激される。
は、以下のいかなる１つ以上も意味する：増加した細胞
浸透性；増加した巨大分子の細胞内集積；活性化炎症性
細胞における増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、または
ＩＬ−１８翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞における
増加したＩＬ−６産生；Ｌ−セレクチン分断；ストレス
キナーゼ活性化；リンパ球増殖；破骨細胞前駆体の破骨
細胞への分化；破骨細胞による増加した吸収窩形成；ま
たは破骨細胞の増加したアポトーシス。これらの活性は
ＡＴＰによって刺激されることが知られる。しかし、本
発明の方法において、これらの活性は、Ｐ２Ｘ７受容体
リガンドの存在下または非存在下で、試験化合物によっ
て刺激される。
【００３０】本明細書において、用語「Ｐ２Ｘ７受容体
の結合ドメイン」または「Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイ
ン」は、天然に存在する非免疫グロブリンリガンドにｉ
ｎ ｖｉｖｏで結合するＰ２Ｘ７受容体タンパク質の部
分を意味する。本明細書において、Ｐ２Ｘ７受容体の結
合ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｙ０９５６１
号のアミノ酸残基およそ１−２２に対応する、該分子の
少なくとも細胞外ドメインを含み、そして好ましくは、
ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｙ０９５６１号の残基およそ
２３−４１に対応する、第一の膜貫通ドメインを含む。
の結合ドメイン」または「Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイ
ン」は、天然に存在する非免疫グロブリンリガンドにｉ
ｎ ｖｉｖｏで結合するＰ２Ｘ７受容体タンパク質の部
分を意味する。本明細書において、Ｐ２Ｘ７受容体の結
合ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｙ０９５６１
号のアミノ酸残基およそ１−２２に対応する、該分子の
少なくとも細胞外ドメインを含み、そして好ましくは、
ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｙ０９５６１号の残基およそ
２３−４１に対応する、第一の膜貫通ドメインを含む。
【００３１】本明細書において、用語「Ｐ２Ｘ７受容体
リガンド」は、Ｐ２Ｘ７受容体に結合し、そしてアゴニ
ストとして作用する、いかなる分子も意味する。いくつ
かのＰ２Ｘ７受容体アゴニストがすでに同定されている
（ＢｕｒｎｓｔｏｃｋおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（２００
０）， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈ
ｅｒ． ２９５：８６２−８６９を参照されたい）。例
えば、Ｐ２Ｘ７受容体の既知のアゴニストは、アデノシ
ン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−（４−ベンゾイル）
−ベンゾイル−ＡＴＰ、３’−Ｏ−（４−ベンゾイル）
−ベンゾイル−ＡＴＰ（Ｂｚ−ＡＴＰ）、および１−
α，β−メチレンＡＴＰ（α，β−ｍｅＡＴＰ）を含
む。一般の当業者に明らかになるであろうように、これ
らの化合物の化学的変異体、誘導体および類似体と共
に、天然Ｐ２Ｘ７受容体リガンドＡＴＰの化学的変異
体、誘導体および類似体もまた、Ｐ２７受容体リガンド
として含まれるさらなるアゴニストの候補である。
リガンド」は、Ｐ２Ｘ７受容体に結合し、そしてアゴニ
ストとして作用する、いかなる分子も意味する。いくつ
かのＰ２Ｘ７受容体アゴニストがすでに同定されている
（ＢｕｒｎｓｔｏｃｋおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（２００
０）， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈ
ｅｒ． ２９５：８６２−８６９を参照されたい）。例
えば、Ｐ２Ｘ７受容体の既知のアゴニストは、アデノシ
ン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−（４−ベンゾイル）
−ベンゾイル−ＡＴＰ、３’−Ｏ−（４−ベンゾイル）
−ベンゾイル−ＡＴＰ（Ｂｚ−ＡＴＰ）、および１−
α，β−メチレンＡＴＰ（α，β−ｍｅＡＴＰ）を含
む。一般の当業者に明らかになるであろうように、これ
らの化合物の化学的変異体、誘導体および類似体と共
に、天然Ｐ２Ｘ７受容体リガンドＡＴＰの化学的変異
体、誘導体および類似体もまた、Ｐ２７受容体リガンド
として含まれるさらなるアゴニストの候補である。
【００３２】本明細書において、アッセイに関し、句
「Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへのＰ２Ｘ７受容体結合ドメ
インの結合を可能にする条件」は、Ｐ２Ｘ７受容体およ
びＰ２Ｘ７受容体リガンドが、ｉｎ ｖｉｖｏでこれら
が結合するのと実質的に同じ度合いに結合することが可
能であるような、生理学的条件と同一の、または実質的
に類似の、アッセイ媒体中の温度、圧力、ｐＨ、イオン
濃度およびモル浸透圧濃度の条件を意味する。こうした
条件は、アッセイ媒体が、潜在的に、スクリーニングさ
れる化合物を除き、受容体−リガンド結合の有効な阻害
剤または競合因子を実質的に含まないことを仮定する。
「Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへのＰ２Ｘ７受容体結合ドメ
インの結合を可能にする条件」は、Ｐ２Ｘ７受容体およ
びＰ２Ｘ７受容体リガンドが、ｉｎ ｖｉｖｏでこれら
が結合するのと実質的に同じ度合いに結合することが可
能であるような、生理学的条件と同一の、または実質的
に類似の、アッセイ媒体中の温度、圧力、ｐＨ、イオン
濃度およびモル浸透圧濃度の条件を意味する。こうした
条件は、アッセイ媒体が、潜在的に、スクリーニングさ
れる化合物を除き、受容体−リガンド結合の有効な阻害
剤または競合因子を実質的に含まないことを仮定する。
【００３３】本明細書において、句「Ｐ２Ｘ７受容体結
合ドメインをコードする遺伝子構築物」は、Ｐ２Ｘ７受
容体の少なくとも結合ドメインのアミノ酸配列をコード
する遺伝子配列を含むか、または該アミノ酸配列をコー
ドする遺伝子配列に相補的であり、そして該構築物で形
質転換されている細胞において、発現されることが可能
である、組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体分子
を意味する。該構築物は、Ｐ２Ｘ７タンパク質を一過的
に発現することが可能であるか、または細胞のゲノムに
安定して組み込まれ、そして誘導性にまたは恒常的に該
タンパク質を発現することが可能である。本明細書にお
いて、「核酸類似体」は、生存細胞内で、相補的核酸の
順方向または逆方向転写を指示するか、あるいはコード
されるポリペプチドの翻訳を指示するため、核酸に十分
な構造的および機能的類似性を有する分子を意味する。
合ドメインをコードする遺伝子構築物」は、Ｐ２Ｘ７受
容体の少なくとも結合ドメインのアミノ酸配列をコード
する遺伝子配列を含むか、または該アミノ酸配列をコー
ドする遺伝子配列に相補的であり、そして該構築物で形
質転換されている細胞において、発現されることが可能
である、組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体分子
を意味する。該構築物は、Ｐ２Ｘ７タンパク質を一過的
に発現することが可能であるか、または細胞のゲノムに
安定して組み込まれ、そして誘導性にまたは恒常的に該
タンパク質を発現することが可能である。本明細書にお
いて、「核酸類似体」は、生存細胞内で、相補的核酸の
順方向または逆方向転写を指示するか、あるいはコード
されるポリペプチドの翻訳を指示するため、核酸に十分
な構造的および機能的類似性を有する分子を意味する。
【００３４】本明細書において、遺伝子操作に関し、用
語「形質転換する」は、その細胞または生物において発
現されるポリペプチド配列をコードし、そして／または
遺伝子座の発現を達成するように、その細胞または生物
のゲノムに組み込まれる、外因性核酸または核酸類似体
を、細胞または生物に導入することを意味する。用語
「形質転換する」は、こうした核酸または核酸類似体を
導入する多様な方法をすべて含むよう用いられ、限定さ
れるわけではないが、当該技術分野において、形質転
換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレ
ーション、弾道注入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃ
ｔｉｏｎ）、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
語「形質転換する」は、その細胞または生物において発
現されるポリペプチド配列をコードし、そして／または
遺伝子座の発現を達成するように、その細胞または生物
のゲノムに組み込まれる、外因性核酸または核酸類似体
を、細胞または生物に導入することを意味する。用語
「形質転換する」は、こうした核酸または核酸類似体を
導入する多様な方法をすべて含むよう用いられ、限定さ
れるわけではないが、当該技術分野において、形質転
換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレ
ーション、弾道注入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃ
ｔｉｏｎ）、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００３５】本明細書において、用語「外因性」は、参
照遺伝子配列またはゲノムに関し、第二の遺伝子配列
が、参照配列に隣接して、または参照ゲノム内に、天然
に存在しないことを意味する。
照遺伝子配列またはゲノムに関し、第二の遺伝子配列
が、参照配列に隣接して、または参照ゲノム内に、天然
に存在しないことを意味する。
【００３６】本明細書において、用語「レポーター遺伝
子」は、発現された際、検出可能な生化学的または表現
型的影響を有する、いかなる遺伝子配列も意味する。本
明細書において、句「ＡをＢと接触させる」は、Ａおよ
びＢが、ＡおよびＢを溶液中で混合することによるよう
に、またはＡの溶液を支持体上のＢに注ぐことによるよ
うに、分子レベルで相互作用するのに十分な物理的近接
に置かれることを意味する。本明細書において、句「Ａ
をＢと接触させる」は、「ＢをＡと接触させる」と同等
であることが意図され、そしてどちらかの要素が他のも
のに対して固定されているか、またはどちらかの要素が
他のものに向かって動かされることを示すことを意図し
ない。
子」は、発現された際、検出可能な生化学的または表現
型的影響を有する、いかなる遺伝子配列も意味する。本
明細書において、句「ＡをＢと接触させる」は、Ａおよ
びＢが、ＡおよびＢを溶液中で混合することによるよう
に、またはＡの溶液を支持体上のＢに注ぐことによるよ
うに、分子レベルで相互作用するのに十分な物理的近接
に置かれることを意味する。本明細書において、句「Ａ
をＢと接触させる」は、「ＢをＡと接触させる」と同等
であることが意図され、そしてどちらかの要素が他のも
のに対して固定されているか、またはどちらかの要素が
他のものに向かって動かされることを示すことを意図し
ない。
【００３７】本明細書において、用語「療法的に有効な
量」は、意味のある患者利益を示すのに十分であり、す
なわち骨損傷の非癒合骨折のサイズを減少させるか、骨
増殖または治癒を促進するか、骨量を増加させるか、ま
たは骨ミネラル密度を増加させるのに十分である、薬剤
組成物または方法の各活性構成要素の総量を意味する。
単独で投与される個々の活性成分に適用した際、該用語
は、その成分のみを指す。組み合わせに適用した際、該
用語は、組み合わせて、連続してまたは同時に投与した
のであっても、療法的効果を生じる活性成分の合わせた
量を指す。
量」は、意味のある患者利益を示すのに十分であり、す
なわち骨損傷の非癒合骨折のサイズを減少させるか、骨
増殖または治癒を促進するか、骨量を増加させるか、ま
たは骨ミネラル密度を増加させるのに十分である、薬剤
組成物または方法の各活性構成要素の総量を意味する。
単独で投与される個々の活性成分に適用した際、該用語
は、その成分のみを指す。組み合わせに適用した際、該
用語は、組み合わせて、連続してまたは同時に投与した
のであっても、療法的効果を生じる活性成分の合わせた
量を指す。
【００３８】本明細書において、用語「調節する」また
は「達成する」は、増加または減少いずれかを意味す
る。本明細書において、用語「増加」および「減少」
は、それぞれ、統計的に有意な増加（すなわちｐ＜０．
１）および統計的に有意な減少（すなわちｐ＜０．１）
を意味する。
は「達成する」は、増加または減少いずれかを意味す
る。本明細書において、用語「増加」および「減少」
は、それぞれ、統計的に有意な増加（すなわちｐ＜０．
１）および統計的に有意な減少（すなわちｐ＜０．１）
を意味する。
【００３９】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳
細な説明から、そして請求項から明らかであろう。本発
明は、特定の態様と関連して記載されているが、実施す
ることが可能な他の変更および修飾もまた、本発明の一
部であり、そしてまた付随する請求項の範囲内であるこ
とが理解されるであろう。本出願は、一般的に本発明の
原理にしたがう、本発明のいかなる同等物、変動、使
用、または適応も含むよう意図され、当該技術分野内の
既知のまたは習慣的な実施の範囲内に入り、そして過度
の実験を伴わずに確かめることが可能な、本開示からの
逸脱を含む。核酸およびポリペプチドを作成しそして用
いることに関するさらなる手引きは、分子生物学、タン
パク質科学、および免疫学の標準的な教科書に見られる
（例えばＤａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌ
ｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク， １９
８６； Ｈａｍｅｓら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＩＬ Ｐｒｅｓｓ，１
９８５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａ
ｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｄｒａｃｏｐ
ｏｌｉら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｅ．
Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎ
ｄ Ｓｏｎｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｅ．
Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ
ｎｄ Ｓｏｎｓを参照されたい）。本明細書において言
及されるすべての刊行物は、本明細書にその全体を援用
する。
細な説明から、そして請求項から明らかであろう。本発
明は、特定の態様と関連して記載されているが、実施す
ることが可能な他の変更および修飾もまた、本発明の一
部であり、そしてまた付随する請求項の範囲内であるこ
とが理解されるであろう。本出願は、一般的に本発明の
原理にしたがう、本発明のいかなる同等物、変動、使
用、または適応も含むよう意図され、当該技術分野内の
既知のまたは習慣的な実施の範囲内に入り、そして過度
の実験を伴わずに確かめることが可能な、本開示からの
逸脱を含む。核酸およびポリペプチドを作成しそして用
いることに関するさらなる手引きは、分子生物学、タン
パク質科学、および免疫学の標準的な教科書に見られる
（例えばＤａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌ
ｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク， １９
８６； Ｈａｍｅｓら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＩＬ Ｐｒｅｓｓ，１
９８５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａ
ｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｄｒａｃｏｐ
ｏｌｉら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｅ．
Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎ
ｄ Ｓｏｎｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｅ．
Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ
ｎｄ Ｓｏｎｓを参照されたい）。本明細書において言
及されるすべての刊行物は、本明細書にその全体を援用
する。
【００４０】
【発明の実施の形態】本発明は、部分的に、ｉｎ ｖｉ
ｖｏのＰ２Ｘ７受容体の役割およびその活性の発見およ
び性質決定に依存する。具体的には、本発明は、部分的
に、Ｐ２Ｘ７受容体が、海綿骨（ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ
ｂｏｎｅ）および皮質骨量の制御、並びに海綿骨構築
の発展を含む、骨量増大および維持に重要な役割を果た
すという発見に基づく。したがって、本発明は、化合物
をスクリーニングして、骨量および／または骨ミネラル
密度を調節するための療法的候補を同定する方法と共
に、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニストを用い、減少した骨量
および／または骨ミネラル密度によって特徴付けられる
骨格障害を治療する方法を提供する。
ｖｏのＰ２Ｘ７受容体の役割およびその活性の発見およ
び性質決定に依存する。具体的には、本発明は、部分的
に、Ｐ２Ｘ７受容体が、海綿骨（ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ
ｂｏｎｅ）および皮質骨量の制御、並びに海綿骨構築
の発展を含む、骨量増大および維持に重要な役割を果た
すという発見に基づく。したがって、本発明は、化合物
をスクリーニングして、骨量および／または骨ミネラル
密度を調節するための療法的候補を同定する方法と共
に、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニストを用い、減少した骨量
および／または骨ミネラル密度によって特徴付けられる
骨格障害を治療する方法を提供する。
【００４１】Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストおよびアンタゴ
ニストの候補 Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストまたはアンタゴニストを同定
するため、スクリーニングすることが可能な化合物種の
例には、限定されるわけではないが、核酸（例えばＤＮ
ＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプ
チド、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ
ｓ）、および小分子が含まれる。
ニストの候補 Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストまたはアンタゴニストを同定
するため、スクリーニングすることが可能な化合物種の
例には、限定されるわけではないが、核酸（例えばＤＮ
ＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプ
チド、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ
ｓ）、および小分子が含まれる。
【００４２】候補化合物は、天然に存在する化合物のラ
イブラリーおよびコンビナトリアル・ケミストリーによ
って産生される合成化合物のライブラリー両方を含む、
当該技術分野に知られる多くのアプローチのいずれかを
用いて得られる剤のライブラリーから同定することが可
能である。
イブラリーおよびコンビナトリアル・ケミストリーによ
って産生される合成化合物のライブラリー両方を含む、
当該技術分野に知られる多くのアプローチのいずれかを
用いて得られる剤のライブラリーから同定することが可
能である。
【００４３】分子ライブラリーの合成のための方法の例
は、当該技術分野において、例えば：米国特許第５，７
３８，９９６号；米国特許第５，８０７，６８３号；Ｄ
ｅＷｉｔｔら（１９９３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：６９０９；
Ｅｒｂら（１９９４）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：１１４２２； Ｚｕ
ｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）， Ｊ． Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８； Ｃｈｏら（１９９
３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒ
ｒｅｌｌら（１９９４）， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．
Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９；
Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅ
ｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６
１； Ｇａｌｌｏｐら（１９９４），Ｊ． Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３；およびＬａｍ（１９９
７），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １
２：１４５に見出すことが可能である。
は、当該技術分野において、例えば：米国特許第５，７
３８，９９６号；米国特許第５，８０７，６８３号；Ｄ
ｅＷｉｔｔら（１９９３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：６９０９；
Ｅｒｂら（１９９４）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：１１４２２； Ｚｕ
ｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）， Ｊ． Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８； Ｃｈｏら（１９９
３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒ
ｒｅｌｌら（１９９４）， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．
Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９；
Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅ
ｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６
１； Ｇａｌｌｏｐら（１９９４），Ｊ． Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３；およびＬａｍ（１９９
７），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １
２：１４５に見出すことが可能である。
【００４４】剤のライブラリーは、溶液中に（例えばＨ
ｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、あるいはビーズ上
に（Ｌａｍ（１９９１）， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８
２−８４）、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ（１９９３），
Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌上に
（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上に（米国
特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４０３，
４８４号；および米国特許第５，２２３，４０９号）、
プラスミド上に（Ｃｕｌｌら（１９９２）， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
９：１８６５−１８６９）、またはファージ上に（Ｓｃ
ｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）， Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ（１９９
０）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；
Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：６３７８
−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ（１９９１）， Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）存
在していてもよい。
ｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、あるいはビーズ上
に（Ｌａｍ（１９９１）， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８
２−８４）、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ（１９９３），
Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌上に
（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上に（米国
特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４０３，
４８４号；および米国特許第５，２２３，４０９号）、
プラスミド上に（Ｃｕｌｌら（１９９２）， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
９：１８６５−１８６９）、またはファージ上に（Ｓｃ
ｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）， Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ（１９９
０）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；
Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：６３７８
−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ（１９９１）， Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）存
在していてもよい。
【００４５】細胞に基づく機能アッセイ
本発明は、化合物をスクリーニングして、骨量および／
または骨ミネラル密度を調節するための療法的候補を同
定する、いくつかの方法であって、Ｐ２Ｘ７受容体の少
なくとも結合ドメインを発現する生存細胞を使用する、
前記方法を提供する。これらの方法は、Ｐ２Ｘ７受容体
を天然に発現する細胞、あるいはＰ２Ｘ７受容体発現を
引き起こすかまたは増進するよう遺伝的に操作されてい
る細胞を使用する。細胞は、哺乳動物（例えばヒト、サ
ル、マウス、ラット、イヌ、ハムスター、ウサギ、ヤ
ギ）のものであってもよいし、あるいはヒトまたは他の
哺乳動物Ｐ２Ｘ７受容体を発現するよう遺伝的に操作さ
れている他の真核（例えば昆虫または酵母）または原核
（例えば細菌）細胞であってもよい。細胞は不死化細胞
株、細胞培養、または一次細胞調製から得てもよいし、
あるいは動物（例えばヒトまたは他の哺乳動物、または
非ヒトトランスジェニック動物）から直接得てもよい。
Ｐ２Ｘ７受容体への結合を評価する好ましい態様におい
て、細胞は、ヒトＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメ
インを発現する、ヒト、マウス、ラット、またはハムス
ター細胞である。最も好ましい態様において、細胞は、
内因性にＰ２Ｘ７受容体を発現する、哺乳動物、より好
ましくは、ヒトまたはネズミ細胞であり、そして／また
はマクロファージまたは破骨細胞である。Ｐ２Ｘ７受容
体のＣ末端は、チャンネルまたは孔形成に関与すると考
えられるため、細胞を遺伝子構築物で形質転換する際、
構築物が全Ｐ２Ｘ７受容体をコードするか、またはその
配列が、天然Ｐ２Ｘ７ Ｃ末端配列と同等に機能するＣ
末端配列に連結されている結合ドメインを含むキメラタ
ンパク質をコードすることが好ましい（例えばキメラヒ
ト−ラットＰ２Ｘ７受容体の産生を報告する、Ｒａｓｓ
ｅｎｄｒｅｎら（１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２７２：５４８２−５４８６を参照された
い）。
または骨ミネラル密度を調節するための療法的候補を同
定する、いくつかの方法であって、Ｐ２Ｘ７受容体の少
なくとも結合ドメインを発現する生存細胞を使用する、
前記方法を提供する。これらの方法は、Ｐ２Ｘ７受容体
を天然に発現する細胞、あるいはＰ２Ｘ７受容体発現を
引き起こすかまたは増進するよう遺伝的に操作されてい
る細胞を使用する。細胞は、哺乳動物（例えばヒト、サ
ル、マウス、ラット、イヌ、ハムスター、ウサギ、ヤ
ギ）のものであってもよいし、あるいはヒトまたは他の
哺乳動物Ｐ２Ｘ７受容体を発現するよう遺伝的に操作さ
れている他の真核（例えば昆虫または酵母）または原核
（例えば細菌）細胞であってもよい。細胞は不死化細胞
株、細胞培養、または一次細胞調製から得てもよいし、
あるいは動物（例えばヒトまたは他の哺乳動物、または
非ヒトトランスジェニック動物）から直接得てもよい。
Ｐ２Ｘ７受容体への結合を評価する好ましい態様におい
て、細胞は、ヒトＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメ
インを発現する、ヒト、マウス、ラット、またはハムス
ター細胞である。最も好ましい態様において、細胞は、
内因性にＰ２Ｘ７受容体を発現する、哺乳動物、より好
ましくは、ヒトまたはネズミ細胞であり、そして／また
はマクロファージまたは破骨細胞である。Ｐ２Ｘ７受容
体のＣ末端は、チャンネルまたは孔形成に関与すると考
えられるため、細胞を遺伝子構築物で形質転換する際、
構築物が全Ｐ２Ｘ７受容体をコードするか、またはその
配列が、天然Ｐ２Ｘ７ Ｃ末端配列と同等に機能するＣ
末端配列に連結されている結合ドメインを含むキメラタ
ンパク質をコードすることが好ましい（例えばキメラヒ
ト−ラットＰ２Ｘ７受容体の産生を報告する、Ｒａｓｓ
ｅｎｄｒｅｎら（１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２７２：５４８２−５４８６を参照された
い）。
【００４６】第一の側面において、本発明は、生存細胞
において、化合物がＰ２Ｘ７受容体活性の指標を増加さ
せるかまたは減少させる能力を決定する方法を提供す
る。これらの方法では、細胞表面上にＰ２Ｘ７受容体を
発現する細胞株由来の細胞と、化合物を接触させる。接
触工程は、化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リ
ガンドへの該Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にするであろ
う条件下で行う。したがって、例えば、接触工程は、生
理学的に許容しうる緩衝溶液または細胞を増殖させる細
胞培地中で行うことが可能である。好ましくは、この条
件は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件の実質的な複製であるよう選
択する。
において、化合物がＰ２Ｘ７受容体活性の指標を増加さ
せるかまたは減少させる能力を決定する方法を提供す
る。これらの方法では、細胞表面上にＰ２Ｘ７受容体を
発現する細胞株由来の細胞と、化合物を接触させる。接
触工程は、化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リ
ガンドへの該Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にするであろ
う条件下で行う。したがって、例えば、接触工程は、生
理学的に許容しうる緩衝溶液または細胞を増殖させる細
胞培地中で行うことが可能である。好ましくは、この条
件は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件の実質的な複製であるよう選
択する。
【００４７】細胞を試験化合物と接触させた後、Ｐ２Ｘ
７受容体活性の指標を測定する。指標の増加または減少
は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互
作用することによって、骨量および／または骨ミネラル
密度を調節するための候補であることを示す。Ｐ２Ｘ７
受容体活性の適切な指標を以下に論じる。
７受容体活性の指標を測定する。指標の増加または減少
は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互
作用することによって、骨量および／または骨ミネラル
密度を調節するための候補であることを示す。Ｐ２Ｘ７
受容体活性の適切な指標を以下に論じる。
【００４８】スクリーニング法を用いてＰ２Ｘ７受容体
アゴニストを同定する際の、細胞に基づくスクリーニン
グ法のいくつかの態様において、アッセイ培地にいかな
る既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドも添加せず、Ｐ２Ｘ７
受容体と試験化合物を接触させる。したがって、これら
の態様において、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標のいかなる
増加も、該化合物がＰ２Ｘ７受容体のアゴニストの候補
であることを示す。
アゴニストを同定する際の、細胞に基づくスクリーニン
グ法のいくつかの態様において、アッセイ培地にいかな
る既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドも添加せず、Ｐ２Ｘ７
受容体と試験化合物を接触させる。したがって、これら
の態様において、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標のいかなる
増加も、該化合物がＰ２Ｘ７受容体のアゴニストの候補
であることを示す。
【００４９】他の態様において、上述のもののような既
知のＰ２Ｘ７受容体リガンドを、試験しようとする化合
物に加えて、アッセイ培地に添加する。これらの態様に
おいて、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標の増加は、該化合物
が、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニストまたは既知のリガンド
のアゴニスト活性の増進因子いずれかの候補であること
を示す。逆に、該指標の減少は、該化合物が、Ｐ２Ｘ７
受容体のアンタゴニストまたは既知のリガンドのアゴニ
スト活性の阻害剤いずれかの候補であることを示す。好
ましい態様において、アッセイ培地に添加されるＰ２Ｘ
７受容体の既知のリガンドはＡＴＰである。
知のＰ２Ｘ７受容体リガンドを、試験しようとする化合
物に加えて、アッセイ培地に添加する。これらの態様に
おいて、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標の増加は、該化合物
が、Ｐ２Ｘ７受容体のアゴニストまたは既知のリガンド
のアゴニスト活性の増進因子いずれかの候補であること
を示す。逆に、該指標の減少は、該化合物が、Ｐ２Ｘ７
受容体のアンタゴニストまたは既知のリガンドのアゴニ
スト活性の阻害剤いずれかの候補であることを示す。好
ましい態様において、アッセイ培地に添加されるＰ２Ｘ
７受容体の既知のリガンドはＡＴＰである。
【００５０】細胞に基づく結合アッセイ
別の側面において、本発明は、化合物をスクリーニング
して、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するた
めの療法的候補を同定する方法であって、化合物がＰ２
Ｘ７受容体結合ドメインに結合する能力を決定すること
による、前記方法を提供する。これらの方法では、表面
上にＰ２Ｘ７受容体の結合ドメインを発現する細胞株由
来の細胞表面上のＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメ
インと、化合物を接触させる。接触工程は、化合物の存
在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの該Ｐ２Ｘ７
受容体結合ドメインの結合を可能にするであろう条件下
で行う。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインお
よび化合物の間の結合を検出する。Ｐ２Ｘ７受容体結合
ドメインおよび化合物の間の結合は、該化合物がｉｎ
ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによっ
て、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するため
の候補であることを示す。
して、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するた
めの療法的候補を同定する方法であって、化合物がＰ２
Ｘ７受容体結合ドメインに結合する能力を決定すること
による、前記方法を提供する。これらの方法では、表面
上にＰ２Ｘ７受容体の結合ドメインを発現する細胞株由
来の細胞表面上のＰ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメ
インと、化合物を接触させる。接触工程は、化合物の存
在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの該Ｐ２Ｘ７
受容体結合ドメインの結合を可能にするであろう条件下
で行う。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインお
よび化合物の間の結合を検出する。Ｐ２Ｘ７受容体結合
ドメインおよび化合物の間の結合は、該化合物がｉｎ
ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによっ
て、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するため
の候補であることを示す。
【００５１】いくかの態様において、アッセイに既知の
Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを添加せずに、Ｐ２Ｘ７受容体
結合ドメインと、化合物を接触させる。これらの態様に
おいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの結合は、該化
合物がＰ２Ｘ７受容体と相互作用するための候補である
ことを示す。他の態様では、既知のＰ２Ｘ７受容体リガ
ンドの存在下で、化合物を添加する。これらの態様にお
いて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの化合物の結合、
またはＰ２Ｘ７受容体結合ドメインへの既知のリガンド
の結合の減少は、該化合物がＰ２Ｘ７受容体と相互作用
するための候補であることを示す。
Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを添加せずに、Ｐ２Ｘ７受容体
結合ドメインと、化合物を接触させる。これらの態様に
おいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの結合は、該化
合物がＰ２Ｘ７受容体と相互作用するための候補である
ことを示す。他の態様では、既知のＰ２Ｘ７受容体リガ
ンドの存在下で、化合物を添加する。これらの態様にお
いて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインへの化合物の結合、
またはＰ２Ｘ７受容体結合ドメインへの既知のリガンド
の結合の減少は、該化合物がＰ２Ｘ７受容体と相互作用
するための候補であることを示す。
【００５２】先行する態様のいずれにおいても、化合
物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容体結
合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、好ましく
は、化合物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいず
れかを検出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表
面上のＰ２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、い
かなる未結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受
容体結合ドメインに結合した標識化要素を検出する。こ
うしたアッセイで用いることが可能な標識には、限定さ
れるわけではないが、放射性同位体（例えば32Ｐ、
35Ｓ）、蛍光標識（例えばフルオレセインイソチオシア
ネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニ
ン、アロフィコシアニン、およびフルオレスカミン）、
化学発光標識（例えばルシフェリン、ルミノール、イソ
ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、およびシュウ酸エステル）、酵素ドメイン（例え
ばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、およびペルオキシダーゼ）、特異的結合要素（例
えばｃ−ｍｙｃエピトープ、ビオチンまたは（ストレプ
ト）アビジン、プロテインＡ、レクチン、免疫グロブリ
ン）、および金属原子（例えばＡｕ）が含まれる。
物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容体結
合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、好ましく
は、化合物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいず
れかを検出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表
面上のＰ２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、い
かなる未結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受
容体結合ドメインに結合した標識化要素を検出する。こ
うしたアッセイで用いることが可能な標識には、限定さ
れるわけではないが、放射性同位体（例えば32Ｐ、
35Ｓ）、蛍光標識（例えばフルオレセインイソチオシア
ネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニ
ン、アロフィコシアニン、およびフルオレスカミン）、
化学発光標識（例えばルシフェリン、ルミノール、イソ
ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、およびシュウ酸エステル）、酵素ドメイン（例え
ばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、およびペルオキシダーゼ）、特異的結合要素（例
えばｃ−ｍｙｃエピトープ、ビオチンまたは（ストレプ
ト）アビジン、プロテインＡ、レクチン、免疫グロブリ
ン）、および金属原子（例えばＡｕ）が含まれる。
【００５３】上述の態様のいずれにおいても、Ｐ２Ｘ７
受容体結合ドメインを発現する細胞は、Ｐ２Ｘ７受容体
を天然に発現する細胞であってもよいし、またはＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインをコードする遺伝子構築物で形質
転換されている細胞株由来であってもよい。形質転換細
胞を用いる場合、これらは、全Ｐ２Ｘ７受容体、または
Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを含むキメラ
タンパク質を発現する遺伝子構築物で形質転換されてい
てもよい。
受容体結合ドメインを発現する細胞は、Ｐ２Ｘ７受容体
を天然に発現する細胞であってもよいし、またはＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインをコードする遺伝子構築物で形質
転換されている細胞株由来であってもよい。形質転換細
胞を用いる場合、これらは、全Ｐ２Ｘ７受容体、または
Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを含むキメラ
タンパク質を発現する遺伝子構築物で形質転換されてい
てもよい。
【００５４】動物に基づく系
別の側面において、本発明は、化合物をスクリーニング
して、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するた
めの療法的候補を同定する方法であって、全非ヒト動物
を使用する、前記方法を提供する。したがって、この側
面では、化合物を動物に投与し、そして該動物におい
て、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標の増加または減少を検出
する。こうした指標の増加は、該化合物がｉｎ ｖｉｖ
ｏでＰ２Ｘ７受容体活性を増加させることによって、骨
量および／または骨ミネラル密度を増加させるための候
補であることを示す。該指標の減少は、該化合物がｉｎ
ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体活性を減少させることによ
って、骨量および／または骨ミネラル密度を減少させる
ための候補であることを示す。Ｐ２Ｘ７受容体活性の適
切な指標を以下に論じる。
して、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するた
めの療法的候補を同定する方法であって、全非ヒト動物
を使用する、前記方法を提供する。したがって、この側
面では、化合物を動物に投与し、そして該動物におい
て、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標の増加または減少を検出
する。こうした指標の増加は、該化合物がｉｎ ｖｉｖ
ｏでＰ２Ｘ７受容体活性を増加させることによって、骨
量および／または骨ミネラル密度を増加させるための候
補であることを示す。該指標の減少は、該化合物がｉｎ
ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体活性を減少させることによ
って、骨量および／または骨ミネラル密度を減少させる
ための候補であることを示す。Ｐ２Ｘ７受容体活性の適
切な指標を以下に論じる。
【００５５】いくつかの態様において、動物は、通常Ｐ
２Ｘ７受容体を発現する動物であり、そして受容体に関
して正常または野生型である動物である。あるいは、動
物は、該動物で、好ましくは内因性Ｐ２Ｘ７受容体を発
現する組織において、発現されるＰ２Ｘ７受容体をコー
ドする遺伝子構築物で形質転換されているトランスジェ
ニック非ヒト動物、またはこうした動物の子孫である。
形質転換ベクターを、胚盤胞または胚性幹細胞を形質転
換するために産生し、そして用いることが可能であり、
そしてこれらの形質転換細胞を、その後、当該技術分野
に知られる方法によって、トランスジェニック動物を産
生するのに用いることが可能である（例えばＳｏｌｌｅ
ら（２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２
７６：１２５−１３２）。
２Ｘ７受容体を発現する動物であり、そして受容体に関
して正常または野生型である動物である。あるいは、動
物は、該動物で、好ましくは内因性Ｐ２Ｘ７受容体を発
現する組織において、発現されるＰ２Ｘ７受容体をコー
ドする遺伝子構築物で形質転換されているトランスジェ
ニック非ヒト動物、またはこうした動物の子孫である。
形質転換ベクターを、胚盤胞または胚性幹細胞を形質転
換するために産生し、そして用いることが可能であり、
そしてこれらの形質転換細胞を、その後、当該技術分野
に知られる方法によって、トランスジェニック動物を産
生するのに用いることが可能である（例えばＳｏｌｌｅ
ら（２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２
７６：１２５−１３２）。
【００５６】非ヒトトランスジェニック動物由来の細胞
は、当該技術分野に知られる技術を用いて、組織または
器官から単離し、そして上述の細胞に基づく活性アッセ
イおよび細胞に基づく結合アッセイに用いることが可能
である。こうした細胞はまた、以下に論じられるような
細胞不含結合アッセイ、抗体生成、およびそれらに匹敵
するもののＰ２Ｘ７受容体タンパク質の供給源として、
用いてもよい。例えば、血液、または限定されるわけで
はないが、リンパ節、扁桃腺、脾臓、腸のパイアー斑、
および骨髄などの被験者の二次リンパ器官から、当該技
術分野に知られるいずれかの方法によって、免疫細胞を
収集するか、または単離することが可能である（例えば
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， ニューヨーク州ニューヨーク
（１９９１）， ｐ．２１を参照されたい）。こうした
供給源から得た免疫細胞は、典型的には、主に、分化お
よび成熟の多様な段階の再循環するリンパ球およびマク
ロファージを含む。所望により、望ましい場合、望まし
い細胞（例えば樹状細胞、Ｔ細胞、およびマクロファー
ジ）の存在を確認するため、形態学的観察および免疫化
学染色などの標準的技術を用いることが可能である。本
発明の細胞に基づく方法に用いられる免疫細胞は、標準
的技術によって収集することが可能である。例えば、シ
リンジを用いて血液を抜き取り、これをＦｉｃｏｌｌ−
Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）勾配遠心分離に
供して、細胞を分離することが可能である。保存剤不含
ヘパリンで抗凝血処理した血液は、通常、０．５−１．
０ｘ１０6リンパ球／ｍｌを生じる。分離した血液細胞
（例えばマクロファージ）は、本方法で使用する前に、
標準的技術によって凍結してもよい。好ましい態様にお
いて、用いる免疫細胞は、リンパ球およびマクロファー
ジを含む精製白血球である。
は、当該技術分野に知られる技術を用いて、組織または
器官から単離し、そして上述の細胞に基づく活性アッセ
イおよび細胞に基づく結合アッセイに用いることが可能
である。こうした細胞はまた、以下に論じられるような
細胞不含結合アッセイ、抗体生成、およびそれらに匹敵
するもののＰ２Ｘ７受容体タンパク質の供給源として、
用いてもよい。例えば、血液、または限定されるわけで
はないが、リンパ節、扁桃腺、脾臓、腸のパイアー斑、
および骨髄などの被験者の二次リンパ器官から、当該技
術分野に知られるいずれかの方法によって、免疫細胞を
収集するか、または単離することが可能である（例えば
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， ニューヨーク州ニューヨーク
（１９９１）， ｐ．２１を参照されたい）。こうした
供給源から得た免疫細胞は、典型的には、主に、分化お
よび成熟の多様な段階の再循環するリンパ球およびマク
ロファージを含む。所望により、望ましい場合、望まし
い細胞（例えば樹状細胞、Ｔ細胞、およびマクロファー
ジ）の存在を確認するため、形態学的観察および免疫化
学染色などの標準的技術を用いることが可能である。本
発明の細胞に基づく方法に用いられる免疫細胞は、標準
的技術によって収集することが可能である。例えば、シ
リンジを用いて血液を抜き取り、これをＦｉｃｏｌｌ−
Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）勾配遠心分離に
供して、細胞を分離することが可能である。保存剤不含
ヘパリンで抗凝血処理した血液は、通常、０．５−１．
０ｘ１０6リンパ球／ｍｌを生じる。分離した血液細胞
（例えばマクロファージ）は、本方法で使用する前に、
標準的技術によって凍結してもよい。好ましい態様にお
いて、用いる免疫細胞は、リンパ球およびマクロファー
ジを含む精製白血球である。
【００５７】単球由来マクロファージは、細胞を１−２
時間培養フラスコに接着させ、非接着細胞を洗い流し、
そしてインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を加えた適
切な培地（例えば２０％ヒト血清、２ｍＭグルタミン、
５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−
１−ピペラジン−エタン−スルホン酸）、および１００
μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ １６
４０）中で７−１２日間、接着細胞を培養することによ
って、免疫細胞から単離することが可能である（例えば
Ｂｌａｎｃｈａｒｄら（１９９５）， Ｊ． Ｃｅｌ
ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：４５２−４６４；およ
びＢｌａｎｃｈａｒｄら（１９９１），Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． １４７：２５７９−２５８５を参照された
い）。
時間培養フラスコに接着させ、非接着細胞を洗い流し、
そしてインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を加えた適
切な培地（例えば２０％ヒト血清、２ｍＭグルタミン、
５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−
１−ピペラジン−エタン−スルホン酸）、および１００
μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ １６
４０）中で７−１２日間、接着細胞を培養することによ
って、免疫細胞から単離することが可能である（例えば
Ｂｌａｎｃｈａｒｄら（１９９５）， Ｊ． Ｃｅｌ
ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：４５２−４６４；およ
びＢｌａｎｃｈａｒｄら（１９９１），Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． １４７：２５７９−２５８５を参照された
い）。
【００５８】Ｐ２Ｘ７活性の指標
本明細書に記載される細胞に基づくまたは動物に基づく
方法のいずれにおいても、試験化合物またはリガンドお
よび受容体の間の相互作用は、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指
標を測定することによって決定することが可能である。
これらの指標は、Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ刺激と関連す
ることが知られる。したがって、本発明の方法におい
て、これらの指標は、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドによる同
時刺激を伴い、そして伴わず、アッセイする。これらの
指標には、限定されるわけではないが、増加した細胞浸
透性または増加した巨大分子の細胞内集積；活性化炎症
性細胞における増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、また
はＩＬ−１８翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞におけ
る増加したＩＬ−６産生；Ｌ−セレクチン分断（例えば
Ｇｕら（１９９８）， Ｂｌｏｏｄ ９２：９４６−９
５１を参照されたい）；ストレスキナーゼ活性化（例え
ばＨｕｍｐｈｒｅｙｓら（２０００）， Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（３５）：２６７９２−２６
７９８を参照されたい）；およびリンパ球増殖が含まれ
る。
方法のいずれにおいても、試験化合物またはリガンドお
よび受容体の間の相互作用は、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指
標を測定することによって決定することが可能である。
これらの指標は、Ｐ２Ｘ７受容体のＡＴＰ刺激と関連す
ることが知られる。したがって、本発明の方法におい
て、これらの指標は、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドによる同
時刺激を伴い、そして伴わず、アッセイする。これらの
指標には、限定されるわけではないが、増加した細胞浸
透性または増加した巨大分子の細胞内集積；活性化炎症
性細胞における増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、また
はＩＬ−１８翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞におけ
る増加したＩＬ−６産生；Ｌ−セレクチン分断（例えば
Ｇｕら（１９９８）， Ｂｌｏｏｄ ９２：９４６−９
５１を参照されたい）；ストレスキナーゼ活性化（例え
ばＨｕｍｐｈｒｅｙｓら（２０００）， Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（３５）：２６７９２−２６
７９８を参照されたい）；およびリンパ球増殖が含まれ
る。
【００５９】用いる細胞が破骨細胞前駆体である態様で
は、指標は、破骨細胞への分化であってもよいし、そし
て細胞が破骨細胞である態様では、指標は増加した吸収
窩形成（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９９８），
Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１１：４９５−５００を参
照されたい）または増加したアポトーシス（例えばＨｏ
ｇｑｕｉｓｔら（１９９１）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：８４８５
−８４８９； Ｍｏｄｄｅｒｍａｎら（１９９４），
Ｃａｌｃｉｆ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ． ５５
（２）：１４１−１５０を参照されたい）であってもよ
い。こうした指標は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細
胞を用いて、または動物由来の体液および／または生検
試料を用いて、評価する。
は、指標は、破骨細胞への分化であってもよいし、そし
て細胞が破骨細胞である態様では、指標は増加した吸収
窩形成（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９９８），
Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１１：４９５−５００を参
照されたい）または増加したアポトーシス（例えばＨｏ
ｇｑｕｉｓｔら（１９９１）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：８４８５
−８４８９； Ｍｏｄｄｅｒｍａｎら（１９９４），
Ｃａｌｃｉｆ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ． ５５
（２）：１４１−１５０を参照されたい）であってもよ
い。こうした指標は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細
胞を用いて、または動物由来の体液および／または生検
試料を用いて、評価する。
【００６０】Ｐ２Ｘ７活性のこうした指標を測定する方
法は、本明細書および文献に記載される。例えば、細胞
浸透性における変化は、細胞の電気生理学的変化および
／または染色剤などの巨大分子の細胞集積によって測定
することが可能である（例えばＭｉｃｈｅｌら（１９９
８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２
４：１１９４−１２０１； Ｖｉｒｇｉｎｉｏら（１９
９９）， Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１９：３３５−
３４６；および以下の実施例を参照されたい）。インタ
ーロイキンの翻訳後プロセシングおよび産生の変化は、
免疫沈降および／またはＥＬＩＳＡアッセイを用いて測
定することが可能である（例えばＳｏｌｌｅら（２００
１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：１２
５−１３２；および以下の実施例を参照されたい）。リ
ンパ球増殖の変化は、標準的細胞計数技術によって測定
することが可能である（例えばＢａｒｉｃｏｒｄｉら
（１９９９）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７
４：３３２０６−３３２０８；Ｃｈｅｎ（１９９６），
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３：１３９５−４０３； Ｊｅ
ｏｕｎｇ（１９９５）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２７０：１８３６７−７３を参照されたい）。
法は、本明細書および文献に記載される。例えば、細胞
浸透性における変化は、細胞の電気生理学的変化および
／または染色剤などの巨大分子の細胞集積によって測定
することが可能である（例えばＭｉｃｈｅｌら（１９９
８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２
４：１１９４−１２０１； Ｖｉｒｇｉｎｉｏら（１９
９９）， Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１９：３３５−
３４６；および以下の実施例を参照されたい）。インタ
ーロイキンの翻訳後プロセシングおよび産生の変化は、
免疫沈降および／またはＥＬＩＳＡアッセイを用いて測
定することが可能である（例えばＳｏｌｌｅら（２００
１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：１２
５−１３２；および以下の実施例を参照されたい）。リ
ンパ球増殖の変化は、標準的細胞計数技術によって測定
することが可能である（例えばＢａｒｉｃｏｒｄｉら
（１９９９）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７
４：３３２０６−３３２０８；Ｃｈｅｎ（１９９６），
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３：１３９５−４０３； Ｊｅ
ｏｕｎｇ（１９９５）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２７０：１８３６７−７３を参照されたい）。
【００６１】さらに、本明細書に記載される動物に基づ
く方法のいずれにおいても、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標
は、限定されるわけではないが、骨ミネラル密度、骨ミ
ネラル含量、骨梁数、骨梁分離、骨ミネラル領域、骨体
積、骨の厚み、および骨外周のようなパラメーターの表
現型的変化を含む可能性がある。特に、増加したＰ２Ｘ
７活性の指標は、より高い体積測定皮質−皮質下骨ミネ
ラル含量、より高い体積測定皮質−皮質下骨ミネラル密
度、より高い体積測定皮質骨ミネラル含量、より高い体
積測定皮質骨ミネラル密度、より高い骨梁体積、より厚
い骨梁厚、より多い骨梁数、および／または遠位大腿骨
幹端でのより低い骨梁分離；またはより高い体積測定皮
質−皮質下骨ミネラル含量、より高い体積測定皮質骨ミ
ネラル含量、より多い体積測定皮質骨ミネラル領域、よ
り高い体積測定骨梁ミネラル含量、より高い体積測定総
骨ミネラル含量、より高い体積測定総骨ミネラル密度、
より高い骨膜外周、および／または大腿骨幹でのより高
い皮質内（ｅｎｄｏｃｏｒｔｉｃａｌ）外周を含む可能
性がある。
く方法のいずれにおいても、Ｐ２Ｘ７受容体活性の指標
は、限定されるわけではないが、骨ミネラル密度、骨ミ
ネラル含量、骨梁数、骨梁分離、骨ミネラル領域、骨体
積、骨の厚み、および骨外周のようなパラメーターの表
現型的変化を含む可能性がある。特に、増加したＰ２Ｘ
７活性の指標は、より高い体積測定皮質−皮質下骨ミネ
ラル含量、より高い体積測定皮質−皮質下骨ミネラル密
度、より高い体積測定皮質骨ミネラル含量、より高い体
積測定皮質骨ミネラル密度、より高い骨梁体積、より厚
い骨梁厚、より多い骨梁数、および／または遠位大腿骨
幹端でのより低い骨梁分離；またはより高い体積測定皮
質−皮質下骨ミネラル含量、より高い体積測定皮質骨ミ
ネラル含量、より多い体積測定皮質骨ミネラル領域、よ
り高い体積測定骨梁ミネラル含量、より高い体積測定総
骨ミネラル含量、より高い体積測定総骨ミネラル密度、
より高い骨膜外周、および／または大腿骨幹でのより高
い皮質内（ｅｎｄｏｃｏｒｔｉｃａｌ）外周を含む可能
性がある。
【００６２】細胞不含結合アッセイ
別の側面において、本発明は、化合物をスクリーニング
して、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するた
めの療法的候補を同定する、細胞不含結合アッセイを提
供する。これらの方法において、結合アッセイは、Ｐ２
Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを用いて行うが、
受容体タンパク質は、細胞と結合している必要はない。
したがって、いくつかの態様において、少なくともＰ２
Ｘ７受容体結合ドメインと、化合物を、該化合物の存在
を別にして、既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドへの前記Ｐ
２Ｘ７受容体の結合をｉｎ ｖｉｖｏで可能にする条件
下で接触させる。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインおよび化合物の間の結合を検出する。こうしたア
ッセイにおいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインおよび化
合物の間の結合は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ
７受容体と相互作用することによって、骨量および／ま
たは骨ミネラル密度を調節するための候補であることを
示す。他の態様において、既知のＰ２Ｘ７受容体リガン
ドの存在下、Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメイン
と、化合物を、該化合物の存在を別にして、該Ｐ２Ｘ７
受容体リガンドへの該Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインの結
合を可能にする条件下で接触させる。その後、あるとす
れば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインおよび化合物または
Ｐ２Ｘ７受容体リガンドのいずれかの間の結合を検出す
る。こうしたアッセイにおいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインおよび化合物の間の結合、またはＰ２Ｘ７受容体
結合ドメインおよびＰ２Ｘ７受容体リガンド間の減少し
た結合の検出は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７
受容体と相互作用することによって、骨量および／また
は骨ミネラル密度を調節するための候補であることを示
す。
して、骨量および／または骨ミネラル密度を調節するた
めの療法的候補を同定する、細胞不含結合アッセイを提
供する。これらの方法において、結合アッセイは、Ｐ２
Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメインを用いて行うが、
受容体タンパク質は、細胞と結合している必要はない。
したがって、いくつかの態様において、少なくともＰ２
Ｘ７受容体結合ドメインと、化合物を、該化合物の存在
を別にして、既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドへの前記Ｐ
２Ｘ７受容体の結合をｉｎ ｖｉｖｏで可能にする条件
下で接触させる。あるとすれば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインおよび化合物の間の結合を検出する。こうしたア
ッセイにおいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインおよび化
合物の間の結合は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ
７受容体と相互作用することによって、骨量および／ま
たは骨ミネラル密度を調節するための候補であることを
示す。他の態様において、既知のＰ２Ｘ７受容体リガン
ドの存在下、Ｐ２Ｘ７受容体の少なくとも結合ドメイン
と、化合物を、該化合物の存在を別にして、該Ｐ２Ｘ７
受容体リガンドへの該Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインの結
合を可能にする条件下で接触させる。その後、あるとす
れば、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインおよび化合物または
Ｐ２Ｘ７受容体リガンドのいずれかの間の結合を検出す
る。こうしたアッセイにおいて、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインおよび化合物の間の結合、またはＰ２Ｘ７受容体
結合ドメインおよびＰ２Ｘ７受容体リガンド間の減少し
た結合の検出は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７
受容体と相互作用することによって、骨量および／また
は骨ミネラル密度を調節するための候補であることを示
す。
【００６３】先行する態様のいずれにおいても、化合
物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容体結
合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、好ましく
は、化合物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいず
れかを検出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表
面上のＰ２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、い
かなる未結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受
容体結合ドメインに結合した標識化要素を検出する。あ
るいは、シンチレーション近接アッセイを使用する場
合、過剰な標識化要素は、検出前に洗い流す必要はな
い。前述の結合アッセイで用いることが可能な標識は、
上述のように、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標
識、酵素ドメイン、特異的結合要素、および金属原子で
ある。
物、既知のリガンド、および／またはＰ２Ｘ７受容体結
合ドメイン間の結合の検出を容易にするため、好ましく
は、化合物または既知のＰ２Ｘ７受容体リガンドのいず
れかを検出可能標識で標識する。標識化要素を、細胞表
面上のＰ２Ｘ７受容体結合ドメインと接触させた後、い
かなる未結合標識化要素も洗い流し、そしてＰ２Ｘ７受
容体結合ドメインに結合した標識化要素を検出する。あ
るいは、シンチレーション近接アッセイを使用する場
合、過剰な標識化要素は、検出前に洗い流す必要はな
い。前述の結合アッセイで用いることが可能な標識は、
上述のように、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標
識、酵素ドメイン、特異的結合要素、および金属原子で
ある。
【００６４】前述の結合アッセイの好ましい態様におい
て、非標識結合要素の１つを固定する。したがって、い
くつかの態様において、化合物を標識し、そしてＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の態様
において、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そしてＰ
２Ｘ７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の
態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインを標識し、
そして化合物を支持体上に固定する。他の態様におい
て、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そして化合物を
支持体上に固定する。他の態様において、化合物を標識
し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持体上に固定す
る。最後に、他の態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインを標識し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持
体上に固定する。これらの要素を固定するのに適した支
持体には、アフィニティーカラム、スライド、ウェル、
粒子および／または微小粒子が含まれる。
て、非標識結合要素の１つを固定する。したがって、い
くつかの態様において、化合物を標識し、そしてＰ２Ｘ
７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の態様
において、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そしてＰ
２Ｘ７受容体結合ドメインを支持体上に固定する。他の
態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインを標識し、
そして化合物を支持体上に固定する。他の態様におい
て、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを標識し、そして化合物を
支持体上に固定する。他の態様において、化合物を標識
し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持体上に固定す
る。最後に、他の態様において、Ｐ２Ｘ７受容体結合ド
メインを標識し、そしてＰ２Ｘ７受容体リガンドを支持
体上に固定する。これらの要素を固定するのに適した支
持体には、アフィニティーカラム、スライド、ウェル、
粒子および／または微小粒子が含まれる。
【００６５】別の側面において、化合物をスクリーニン
グして、骨量および／または骨ミネラル密度を調節する
ための療法的候補を同定する方法であって、凝集アッセ
イを使用する、前記方法が提供する。これらの方法にお
いて、化合物を第一の粒子上に固定し、そしてＰ２Ｘ７
受容体の少なくとも結合ドメインを第二の粒子上に固定
する。化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガン
ドへの前記Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にする条件下
で、粒子を接触させる。Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインお
よび化合物の間の結合は、粒子の凝集を検出することに
よって検出する。凝集は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏで
Ｐ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、骨量およ
び／または骨ミネラル密度を調節するための候補である
ことを示す。凝集は、濁度測定を含む、標準的な技術を
用いて測定する。本発明の使用に適した粒子には、１μ
ｍ−１０００μｍの範囲のサイズを有する、ラテック
ス、ポリ酢酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧ
Ａ）、ポリ（コ−乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、および類似の
微小球体が含まれる。
グして、骨量および／または骨ミネラル密度を調節する
ための療法的候補を同定する方法であって、凝集アッセ
イを使用する、前記方法が提供する。これらの方法にお
いて、化合物を第一の粒子上に固定し、そしてＰ２Ｘ７
受容体の少なくとも結合ドメインを第二の粒子上に固定
する。化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガン
ドへの前記Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にする条件下
で、粒子を接触させる。Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインお
よび化合物の間の結合は、粒子の凝集を検出することに
よって検出する。凝集は、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏで
Ｐ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、骨量およ
び／または骨ミネラル密度を調節するための候補である
ことを示す。凝集は、濁度測定を含む、標準的な技術を
用いて測定する。本発明の使用に適した粒子には、１μ
ｍ−１０００μｍの範囲のサイズを有する、ラテック
ス、ポリ酢酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧ
Ａ）、ポリ（コ−乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、および類似の
微小球体が含まれる。
【００６６】Ｐ２Ｘ７発現の調節因子に関するアッセイ
別の側面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子の
転写を調節することによってＰ２Ｘ７受容体の発現を調
節することが可能な化合物をスクリーニングする方法を
提供する。こうした化合物は、骨量および／または骨ミ
ネラル密度を調節するための療法的候補である。
転写を調節することによってＰ２Ｘ７受容体の発現を調
節することが可能な化合物をスクリーニングする方法を
提供する。こうした化合物は、骨量および／または骨ミ
ネラル密度を調節するための療法的候補である。
【００６７】これらの方法の１つの態様において、内因
性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を用い、そして当該技
術分野に知られる標準法を用いて、Ｐ２Ｘ７ ｍＲＮＡ
またはタンパク質レベルを検出することによって、Ｐ２
Ｘ７受容体をコードする配列の発現を測定する。あるい
は、外因性または内因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写調節
要素に機能可能であるように連結されている外因性レポ
ーター遺伝子で形質転換された細胞株由来の細胞を使用
する。これらの細胞を、試験しようとする化合物と接触
させ、そしてレポーター遺伝子の発現の増加または減少
は、該化合物が、ｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発現
を増加させるかまたは減少させることによって、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための候補であ
ることを示す。これらの方法で用いることが可能なレポ
ーター遺伝子の限定されない例には、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガ
ラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が含ま
れる（例えばＪｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７），Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． ５：３８７；
Ｔｅｒｒｉら（１９８９）， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：
３４３； Ｋｏｎｃｚら（１９８７），Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：１３
１； Ｄｅ Ｂｌｏｃｋら（１９８４）， ＥＭＢＯ
Ｊ． ３：１６８１を参照されたい）。内因性Ｐ２Ｘ７
受容体転写調節要素が、レポーター遺伝子に機能可能で
あるように連結される場合、限定されるわけではない
が、相同組換えベクターまたは部位特異的挿入ベクター
を含む、多様な形質転換ベクターを、当該技術分野に知
られる方法にしたがって、産生することが可能である。
例えば、レポーター遺伝子の発現がＰ２Ｘ７受容体遺伝
子転写調節要素によって制御されるであろうように、Ｐ
２Ｘ７受容体遺伝子をレポーター遺伝子配列で相同組換
えし、そして置換することを可能にするのに十分なＰ２
Ｘ７受容体遺伝子配列が隣接する、レポーター遺伝子の
コード配列を含む、相同組換えのための遺伝子構築物を
調製することが可能である。あるいは、当該技術分野に
公知の方法によって、外因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写
調節配列を、遺伝子構築物中で、外因性レポーター遺伝
子に機能可能であるように連結することが可能である。
これらの構築物は、細胞のゲノムに挿入される（例えば
相同組換え、部位特異的挿入、または無作為挿入によっ
て）か、または染色体外に存在する（例えばプラスミド
として）ように設計される。
性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を用い、そして当該技
術分野に知られる標準法を用いて、Ｐ２Ｘ７ ｍＲＮＡ
またはタンパク質レベルを検出することによって、Ｐ２
Ｘ７受容体をコードする配列の発現を測定する。あるい
は、外因性または内因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写調節
要素に機能可能であるように連結されている外因性レポ
ーター遺伝子で形質転換された細胞株由来の細胞を使用
する。これらの細胞を、試験しようとする化合物と接触
させ、そしてレポーター遺伝子の発現の増加または減少
は、該化合物が、ｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発現
を増加させるかまたは減少させることによって、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための候補であ
ることを示す。これらの方法で用いることが可能なレポ
ーター遺伝子の限定されない例には、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガ
ラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が含ま
れる（例えばＪｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７），Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． ５：３８７；
Ｔｅｒｒｉら（１９８９）， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：
３４３； Ｋｏｎｃｚら（１９８７），Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：１３
１； Ｄｅ Ｂｌｏｃｋら（１９８４）， ＥＭＢＯ
Ｊ． ３：１６８１を参照されたい）。内因性Ｐ２Ｘ７
受容体転写調節要素が、レポーター遺伝子に機能可能で
あるように連結される場合、限定されるわけではない
が、相同組換えベクターまたは部位特異的挿入ベクター
を含む、多様な形質転換ベクターを、当該技術分野に知
られる方法にしたがって、産生することが可能である。
例えば、レポーター遺伝子の発現がＰ２Ｘ７受容体遺伝
子転写調節要素によって制御されるであろうように、Ｐ
２Ｘ７受容体遺伝子をレポーター遺伝子配列で相同組換
えし、そして置換することを可能にするのに十分なＰ２
Ｘ７受容体遺伝子配列が隣接する、レポーター遺伝子の
コード配列を含む、相同組換えのための遺伝子構築物を
調製することが可能である。あるいは、当該技術分野に
公知の方法によって、外因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写
調節配列を、遺伝子構築物中で、外因性レポーター遺伝
子に機能可能であるように連結することが可能である。
これらの構築物は、細胞のゲノムに挿入される（例えば
相同組換え、部位特異的挿入、または無作為挿入によっ
て）か、または染色体外に存在する（例えばプラスミド
として）ように設計される。
【００６８】発現に基づくアッセイはまた、内因性にま
たは一過的にＰ２Ｘ７受容体を発現する動物に対して行
うことが可能である。これらの方法の１つの態様におい
て、外因性または内因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写調節
要素に機能可能であるように連結されている外因性レポ
ーター遺伝子で形質転換されているトランスジェニック
非ヒト動物、またはこうした動物の子孫である動物を使
用してもよい。動物における、Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子ま
たはレポーター遺伝子の発現の増加または減少は、該化
合物が、ｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発現を増加さ
せるかまたは減少させることによって、骨量および／ま
たは骨ミネラル密度を増加させるかまたは減少させるた
めの候補であることを示す。形質転換ベクターは、上述
のように産生し、そして胚盤胞または胚性幹細胞を形質
転換するため、用いることが可能であり、そしてこれら
の形質転換細胞を、その後、当該技術分野に知られる方
法によって、トランスジェニック動物を産生するのに用
いることが可能である（例えばＳｏｌｌｅら（２００
１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：１２
５−１３２を参照されたい）。
たは一過的にＰ２Ｘ７受容体を発現する動物に対して行
うことが可能である。これらの方法の１つの態様におい
て、外因性または内因性Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写調節
要素に機能可能であるように連結されている外因性レポ
ーター遺伝子で形質転換されているトランスジェニック
非ヒト動物、またはこうした動物の子孫である動物を使
用してもよい。動物における、Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子ま
たはレポーター遺伝子の発現の増加または減少は、該化
合物が、ｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発現を増加さ
せるかまたは減少させることによって、骨量および／ま
たは骨ミネラル密度を増加させるかまたは減少させるた
めの候補であることを示す。形質転換ベクターは、上述
のように産生し、そして胚盤胞または胚性幹細胞を形質
転換するため、用いることが可能であり、そしてこれら
の形質転換細胞を、その後、当該技術分野に知られる方
法によって、トランスジェニック動物を産生するのに用
いることが可能である（例えばＳｏｌｌｅら（２００
１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：１２
５−１３２を参照されたい）。
【００６９】遺伝子構築物
本発明の形質転換細胞および／またはトランスジェニッ
ク非ヒト動物を産生するため、多様な標準的組換え遺伝
子構築物を使用することが可能である。
ク非ヒト動物を産生するため、多様な標準的組換え遺伝
子構築物を使用することが可能である。
【００７０】標的細胞ゲノムに特異的にまたは非特異的
に挿入することが可能な、広い範囲のいずれかのベクタ
ーの構造的構成要素として、遺伝子構築物を標的細胞に
導入することが可能である。適切な発現ベクターには、
細菌、プラスミド、酵母、およびウイルスベクターが含
まれる。ウイルスベクターには、限定されるわけではな
いが、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅ
ｘ ｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノウイルス（ａｄｅｎ
ｏｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ関連ウイルスベクタ
ー、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ）ベクタ
ー、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクタ
ー、仮性狂犬病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ
ｖｉｒｕｓ）ベクター、アルファ−ヘルペスウイルス
（ａｌｐｈａ−ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）ベクター、
およびそれらに匹敵するものが含まれる。ウイルスベク
ター、特に非複製細胞を修飾するのに適したウイルスベ
クター、およびこうしたベクターを目的のポリヌクレオ
チドの発現と組み合わせて使用する方法の完全な概説
は、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗ
ｙ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， サンディ
エゴ， １９９５に見出すことが可能である。レトロウ
イルスベクターは、米国特許第５，４４９，６１４号に
記載されるものなどのレトロウイルスパッケージング細
胞株と組み合わせて用いることが可能である。非ネズミ
哺乳動物細胞を、遺伝子修飾のための標的細胞として用
いる場合、広宿主性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）または
汎親和性（ｐａｎｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞株
を用いて、適切なベクターをパッケージングすることが
可能である（Ｏｒｙら（１９９６）， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１１
４００−１１４０６）。代表的なレトロウイルスベクタ
ーは、例えば、米国特許第５，５２１，０７６号に記載
される。
に挿入することが可能な、広い範囲のいずれかのベクタ
ーの構造的構成要素として、遺伝子構築物を標的細胞に
導入することが可能である。適切な発現ベクターには、
細菌、プラスミド、酵母、およびウイルスベクターが含
まれる。ウイルスベクターには、限定されるわけではな
いが、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅ
ｘ ｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノウイルス（ａｄｅｎ
ｏｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ関連ウイルスベクタ
ー、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ）ベクタ
ー、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクタ
ー、仮性狂犬病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ
ｖｉｒｕｓ）ベクター、アルファ−ヘルペスウイルス
（ａｌｐｈａ−ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）ベクター、
およびそれらに匹敵するものが含まれる。ウイルスベク
ター、特に非複製細胞を修飾するのに適したウイルスベ
クター、およびこうしたベクターを目的のポリヌクレオ
チドの発現と組み合わせて使用する方法の完全な概説
は、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗ
ｙ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， サンディ
エゴ， １９９５に見出すことが可能である。レトロウ
イルスベクターは、米国特許第５，４４９，６１４号に
記載されるものなどのレトロウイルスパッケージング細
胞株と組み合わせて用いることが可能である。非ネズミ
哺乳動物細胞を、遺伝子修飾のための標的細胞として用
いる場合、広宿主性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）または
汎親和性（ｐａｎｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞株
を用いて、適切なベクターをパッケージングすることが
可能である（Ｏｒｙら（１９９６）， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１１
４００−１１４０６）。代表的なレトロウイルスベクタ
ーは、例えば、米国特許第５，５２１，０７６号に記載
される。
【００７１】Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインの発現を引き
起こすかまたは増進することを意図する遺伝子構築物
は、典型的には、Ｐ２Ｘ７配列に外因性である（そして
おそらく標的細胞のゲノムに外因性である）転写調節要
素に機能可能であるように連結されている、少なくとも
Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインをコードする遺伝子配列を
含むであろう。これらの転写調節要素は、転写プロモー
ター領域および所望によりエンハンサー配列を含むであ
ろう。構築物に組み込まれる転写プロモーターおよびエ
ンハンサーの例には、限定されるわけではないが、細胞
または組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、
および制御可能プロモーターが含まれる。特定の例に
は、限定されるわけではないが、単純疱疹チミジンキナ
ーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍ
ｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモーター／エン
ハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後
期プロモーター、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉ
ａ ｖｉｒｕｓ）７．５Ｋプロモーター、鳥ベータグロ
ビンプロモーター、ヒストンプロモーター（例えばマウ
スヒストンＨ３−６１４プロモーター）、ベータアクチ
ンプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス
（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕ
ｓ）３５Ｓプロモーターが含まれる（一般的には、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｖｏｌ Ｉ−ＩＩＩ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８
９）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８９−２０００版を
参照されたい）。
起こすかまたは増進することを意図する遺伝子構築物
は、典型的には、Ｐ２Ｘ７配列に外因性である（そして
おそらく標的細胞のゲノムに外因性である）転写調節要
素に機能可能であるように連結されている、少なくとも
Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインをコードする遺伝子配列を
含むであろう。これらの転写調節要素は、転写プロモー
ター領域および所望によりエンハンサー配列を含むであ
ろう。構築物に組み込まれる転写プロモーターおよびエ
ンハンサーの例には、限定されるわけではないが、細胞
または組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、
および制御可能プロモーターが含まれる。特定の例に
は、限定されるわけではないが、単純疱疹チミジンキナ
ーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍ
ｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモーター／エン
ハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後
期プロモーター、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉ
ａ ｖｉｒｕｓ）７．５Ｋプロモーター、鳥ベータグロ
ビンプロモーター、ヒストンプロモーター（例えばマウ
スヒストンＨ３−６１４プロモーター）、ベータアクチ
ンプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス
（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕ
ｓ）３５Ｓプロモーターが含まれる（一般的には、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｖｏｌ Ｉ−ＩＩＩ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８
９）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８９−２０００版を
参照されたい）。
【００７２】骨格障害の治療法
別の側面において、本発明は、こうした治療が必要な哺
乳動物において、骨量および／または骨ミネラル密度を
増加させる方法であって、該哺乳動物において、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を増加させるのに有効な量
のＰ２Ｘ７受容体のアゴニストを投与することによる、
前記方法を提供する。別の側面において、本発明は、減
少した骨量および／または骨ミネラル密度によって特徴
付けられる骨格障害を有する哺乳動物を治療する方法で
あって、該哺乳動物において、骨量および／または骨ミ
ネラル密度を増加させるのに有効な量のＰ２Ｘ７受容体
のアゴニストを投与することによる、前記方法を提供す
る。これらの方法のいくつかの態様において、哺乳動物
は、骨粗しょう症、歯周炎、整形外科的骨溶解、炎症性
骨疾患、または骨折、あるいは他の骨傷害などの疾患に
罹患しているか、またはその実質的なリスクがある。骨
への障害または損傷が局在している態様（例えば歯周炎
または骨折）では、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストの投与
が、障害または損傷の部位での、またはその近傍での、
ペースト、ゲル、または移植持続放出処方の投与による
ように、やはり局在していることが好ましい。
乳動物において、骨量および／または骨ミネラル密度を
増加させる方法であって、該哺乳動物において、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を増加させるのに有効な量
のＰ２Ｘ７受容体のアゴニストを投与することによる、
前記方法を提供する。別の側面において、本発明は、減
少した骨量および／または骨ミネラル密度によって特徴
付けられる骨格障害を有する哺乳動物を治療する方法で
あって、該哺乳動物において、骨量および／または骨ミ
ネラル密度を増加させるのに有効な量のＰ２Ｘ７受容体
のアゴニストを投与することによる、前記方法を提供す
る。これらの方法のいくつかの態様において、哺乳動物
は、骨粗しょう症、歯周炎、整形外科的骨溶解、炎症性
骨疾患、または骨折、あるいは他の骨傷害などの疾患に
罹患しているか、またはその実質的なリスクがある。骨
への障害または損傷が局在している態様（例えば歯周炎
または骨折）では、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストの投与
が、障害または損傷の部位での、またはその近傍での、
ペースト、ゲル、または移植持続放出処方の投与による
ように、やはり局在していることが好ましい。
【００７３】Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストは、生理学的お
よび／または薬学的に許容しうるキャリアー中の療法組
成物として投与する。例えば、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニス
トは、一般的に、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ， 第１４版， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ニュー
ヨーク（１９９８）に記載されるように、患者に投与す
ることが可能である。キャリアーの特性は、投与経路に
応じるであろう。
よび／または薬学的に許容しうるキャリアー中の療法組
成物として投与する。例えば、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニス
トは、一般的に、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ， 第１４版， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ニュー
ヨーク（１９９８）に記載されるように、患者に投与す
ることが可能である。キャリアーの特性は、投与経路に
応じるであろう。
【００７４】投与は、当業者に決定されるように、状態
および反応に応じ、多量（ｂｏｌｕｓ）、間欠、または
連続投与であってもよい。いくつかの好ましい態様にお
いて、アゴニストは局所（例えば病巣内）および／また
は全身投与される。用語「局所投与」は、体の定義され
る領域に搬送することを指し、一方、用語「全身投与」
は、経口摂取による、あるいは筋内、静脈内、皮下、ま
たは腹腔内注射による、全生物への搬送を含むことを意
味する。
および反応に応じ、多量（ｂｏｌｕｓ）、間欠、または
連続投与であってもよい。いくつかの好ましい態様にお
いて、アゴニストは局所（例えば病巣内）および／また
は全身投与される。用語「局所投与」は、体の定義され
る領域に搬送することを指し、一方、用語「全身投与」
は、経口摂取による、あるいは筋内、静脈内、皮下、ま
たは腹腔内注射による、全生物への搬送を含むことを意
味する。
【００７５】こうした組成物は、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニ
ストに加え、キャリアー、希釈剤、充填剤、塩、緩衝
剤、安定化剤、可溶化剤、および当該技術分野に公知の
他の成分を含んでもよい。薬剤組成物はまた、骨形成ま
たは維持を増進する、他の活性因子および／または剤も
含んでもよい。こうしたさらなる因子および／または剤
を薬剤組成物中に含み、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストと相
乗効果を生じるか、またはアゴニストに引き起こされる
副作用を最小限にすることが可能である。
ストに加え、キャリアー、希釈剤、充填剤、塩、緩衝
剤、安定化剤、可溶化剤、および当該技術分野に公知の
他の成分を含んでもよい。薬剤組成物はまた、骨形成ま
たは維持を増進する、他の活性因子および／または剤も
含んでもよい。こうしたさらなる因子および／または剤
を薬剤組成物中に含み、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストと相
乗効果を生じるか、またはアゴニストに引き起こされる
副作用を最小限にすることが可能である。
【００７６】薬剤組成物は、リポソームの形であっても
よく、この中で、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストは、他の薬
学的に許容しうるキャリアーに加え、水性溶液中にあ
る、ミセル、不溶性単層、液晶、または薄膜層のような
凝集形で存在する脂質などの両親媒性剤と組み合わされ
ている。リポソーム形成に適した脂質には、限定なし
に、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リ
ゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸、およびそれ
らに匹敵するものが含まれる。１つの特に有用な脂質キ
ャリアーは、リポフェクチンである。こうしたリポソー
ム処方の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７
１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第
４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，
３２３号に開示されるように、当該技術分野のレベル内
である。薬剤組成物はさらに、細胞への剤の搬送を増進
する、シクロデキストリンおよびそれに匹敵するものな
どの化合物、または遅延放出ポリマーを含んでもよい。
よく、この中で、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストは、他の薬
学的に許容しうるキャリアーに加え、水性溶液中にあ
る、ミセル、不溶性単層、液晶、または薄膜層のような
凝集形で存在する脂質などの両親媒性剤と組み合わされ
ている。リポソーム形成に適した脂質には、限定なし
に、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リ
ゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸、およびそれ
らに匹敵するものが含まれる。１つの特に有用な脂質キ
ャリアーは、リポフェクチンである。こうしたリポソー
ム処方の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７
１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第
４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，
３２３号に開示されるように、当該技術分野のレベル内
である。薬剤組成物はさらに、細胞への剤の搬送を増進
する、シクロデキストリンおよびそれに匹敵するものな
どの化合物、または遅延放出ポリマーを含んでもよい。
【００７７】本発明の治療法を実施する際、療法的に有
効な量の１つ、２つ、またはそれ以上のＰ２Ｘ７受容体
アゴニストを、減少した骨量および／または骨ミネラル
密度によって特徴付けられる疾患または障害に罹患した
被験者に投与する。アゴニストは、本発明の方法にした
がい、単独で、あるいは疾患または障害の他の既知の療
法と組み合わせて、投与することが可能である。１つ以
上の他の療法と共に投与する際、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニ
ストは、他の治療と同時に、または連続して投与するこ
とが可能である。連続して投与する場合、主治医が、他
の療法と組み合わせて、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストを投
与する、適切な順序を決定するであろう。
効な量の１つ、２つ、またはそれ以上のＰ２Ｘ７受容体
アゴニストを、減少した骨量および／または骨ミネラル
密度によって特徴付けられる疾患または障害に罹患した
被験者に投与する。アゴニストは、本発明の方法にした
がい、単独で、あるいは疾患または障害の他の既知の療
法と組み合わせて、投与することが可能である。１つ以
上の他の療法と共に投与する際、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニ
ストは、他の治療と同時に、または連続して投与するこ
とが可能である。連続して投与する場合、主治医が、他
の療法と組み合わせて、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストを投
与する、適切な順序を決定するであろう。
【００７８】本発明の方法を実施するため、薬剤組成物
中のＰ２Ｘ７受容体アゴニストの投与は、移植、経口摂
取、吸入、あるいは皮膚、皮下、筋内、または静脈内注
射などの、多様な慣用的方法で、行うことが可能であ
る。
中のＰ２Ｘ７受容体アゴニストの投与は、移植、経口摂
取、吸入、あるいは皮膚、皮下、筋内、または静脈内注
射などの、多様な慣用的方法で、行うことが可能であ
る。
【００７９】Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストが、全身的と対
照的に、局所的に（例えば損傷部位に）投与される場
合、正常組織取り込みは、減少するはずである。Ｐ２Ｘ
７受容体アゴニストは、該アゴニストを生体適合性マト
リックス素材中に混合し、そしてこの混合物を治療しよ
うとする部位またはその近傍に移植するかまたは適用す
ることによって、局所投与することが可能である。例え
ば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧ
Ａ）、ポリ（コ−乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、およびそれら
に匹敵するものなどの生体適合性ポリマーは、Ｐ２Ｘ７
受容体アゴニストを含む、生物侵食性移植物に成形する
ことが可能である。あるいは、当該技術分野に知られ
る、多様なパップ剤またはワックスをＰ２Ｘ７受容体ア
ゴニストと混合し、そして体内（例えば歯周損傷）部位
に適用することが可能である。さらに、タンパク質をリ
ポソーム表面に挿入することによって、リポソームにＰ
２Ｘ７受容体アゴニストを被包し、そしてこれらのリポ
ソームを選択された組織に標的化する方法を利用するこ
とが可能である（Ｐａｇｎａｎら（２０００）， Ｊ．
Ｎａｔｌ． Ｃａｎ． Ｉｎｓｔ． ９２：２５３−
６１； Ｙｕら（１９９９）， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅ
ｓ． １６：１３０９−１５）。
照的に、局所的に（例えば損傷部位に）投与される場
合、正常組織取り込みは、減少するはずである。Ｐ２Ｘ
７受容体アゴニストは、該アゴニストを生体適合性マト
リックス素材中に混合し、そしてこの混合物を治療しよ
うとする部位またはその近傍に移植するかまたは適用す
ることによって、局所投与することが可能である。例え
ば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧ
Ａ）、ポリ（コ−乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、およびそれら
に匹敵するものなどの生体適合性ポリマーは、Ｐ２Ｘ７
受容体アゴニストを含む、生物侵食性移植物に成形する
ことが可能である。あるいは、当該技術分野に知られ
る、多様なパップ剤またはワックスをＰ２Ｘ７受容体ア
ゴニストと混合し、そして体内（例えば歯周損傷）部位
に適用することが可能である。さらに、タンパク質をリ
ポソーム表面に挿入することによって、リポソームにＰ
２Ｘ７受容体アゴニストを被包し、そしてこれらのリポ
ソームを選択された組織に標的化する方法を利用するこ
とが可能である（Ｐａｇｎａｎら（２０００）， Ｊ．
Ｎａｔｌ． Ｃａｎ． Ｉｎｓｔ． ９２：２５３−
６１； Ｙｕら（１９９９）， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅ
ｓ． １６：１３０９−１５）。
【００８０】療法的に有効な量のＰ２Ｘ７受容体アゴニ
ストを経口投与する際、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストは、
錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形で
あろう。錠剤型で投与する際、薬剤組成物はさらに、ゼ
ラチンまたはアジュバントなどの固体キャリアーも含ん
でもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約５から９
５％のＰ２Ｘ７受容体アゴニストを、そして好ましくは
約２５から９０％のＰ２Ｘ７受容体アゴニストを含むこ
とが可能である。液体型で投与される際、水、石油、ピ
ーナツ油、ミネラルオイル、ダイズ油、ゴマ油などの動
物または植物起源の油、あるいは合成油などの液体キャ
リアーを添加してもよい。薬剤組成物の液体型は、さら
に、生理学的生理食塩水溶液、デキストロースまたは他
の多糖溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレン
グリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコ
ールを含んでもよい。液体型で投与する際、薬剤組成物
は、重量約０．５から９０％のＰ２Ｘ７受容体アゴニス
トを、そして好ましくは約１から５０％のＰ２Ｘ７受容
体アゴニストを含む。
ストを経口投与する際、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストは、
錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形で
あろう。錠剤型で投与する際、薬剤組成物はさらに、ゼ
ラチンまたはアジュバントなどの固体キャリアーも含ん
でもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約５から９
５％のＰ２Ｘ７受容体アゴニストを、そして好ましくは
約２５から９０％のＰ２Ｘ７受容体アゴニストを含むこ
とが可能である。液体型で投与される際、水、石油、ピ
ーナツ油、ミネラルオイル、ダイズ油、ゴマ油などの動
物または植物起源の油、あるいは合成油などの液体キャ
リアーを添加してもよい。薬剤組成物の液体型は、さら
に、生理学的生理食塩水溶液、デキストロースまたは他
の多糖溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレン
グリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコ
ールを含んでもよい。液体型で投与する際、薬剤組成物
は、重量約０．５から９０％のＰ２Ｘ７受容体アゴニス
トを、そして好ましくは約１から５０％のＰ２Ｘ７受容
体アゴニストを含む。
【００８１】療法的に有効な量のＰ２Ｘ７受容体アゴニ
ストを、静脈内、皮下、筋内、または腹腔内注射する
際、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストは、発熱物質不含の非経
口的に許容しうる水性溶液の形であろう。ｐＨ、等張
性、安定性、およびそれらに匹敵するものに関する、こ
うした非経口的に許容しうる溶液の調整は、当該技術分
野の範囲内である。静脈内、皮下、筋内、または腹腔内
注射に好ましい薬剤組成物は、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニス
トに加え、等張ビヒクルを含むはずである。薬剤組成物
はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤、また
は当業者に知られる他の添加物も含んでもよい。
ストを、静脈内、皮下、筋内、または腹腔内注射する
際、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストは、発熱物質不含の非経
口的に許容しうる水性溶液の形であろう。ｐＨ、等張
性、安定性、およびそれらに匹敵するものに関する、こ
うした非経口的に許容しうる溶液の調整は、当該技術分
野の範囲内である。静脈内、皮下、筋内、または腹腔内
注射に好ましい薬剤組成物は、Ｐ２Ｘ７受容体アゴニス
トに加え、等張ビヒクルを含むはずである。薬剤組成物
はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤、また
は当業者に知られる他の添加物も含んでもよい。
【００８２】薬剤組成物中のＰ２Ｘ７受容体の量は、治
療される異常の性質および重症度に、そして患者が経験
した先の治療の性質に応じるであろう。究極的には、主
治医が、個々の患者各々を治療するＰ２Ｘ７受容体アゴ
ニストの量を決定するであろう。同様に、薬剤組成物を
用いた静脈内療法の期間は、治療される疾患の重症度、
並びに個々の患者各々の状態および潜在的な特異体質的
反応に応じて、異なるであろう。究極的には、主治医
が、本発明の薬剤組成物を用いた、静脈内療法の適切な
期間を決定するであろう。初めに、主治医は、低用量の
Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストを投与し、そして患者の反応
を観察することが可能である。患者にとって最適な療法
的効果が得られるまで、より多い用量のＰ２Ｘ７受容体
アゴニストを投与してもよく、そしてその時点で、投薬
量をさらに増加しない。
療される異常の性質および重症度に、そして患者が経験
した先の治療の性質に応じるであろう。究極的には、主
治医が、個々の患者各々を治療するＰ２Ｘ７受容体アゴ
ニストの量を決定するであろう。同様に、薬剤組成物を
用いた静脈内療法の期間は、治療される疾患の重症度、
並びに個々の患者各々の状態および潜在的な特異体質的
反応に応じて、異なるであろう。究極的には、主治医
が、本発明の薬剤組成物を用いた、静脈内療法の適切な
期間を決定するであろう。初めに、主治医は、低用量の
Ｐ２Ｘ７受容体アゴニストを投与し、そして患者の反応
を観察することが可能である。患者にとって最適な療法
的効果が得られるまで、より多い用量のＰ２Ｘ７受容体
アゴニストを投与してもよく、そしてその時点で、投薬
量をさらに増加しない。
【００８３】本発明の方法を実施するのに用いられる多
様な薬剤組成物は、ｋｇ体重または器官重量当たり、約
１０μｇから約２０ｍｇのＰ２Ｘ７受容体アゴニストを
含むことが意図される。
様な薬剤組成物は、ｋｇ体重または器官重量当たり、約
１０μｇから約２０ｍｇのＰ２Ｘ７受容体アゴニストを
含むことが意図される。
【００８４】本明細書に記載される発明が、より完全に
理解されることを可能にするため、以下の実施例を示
す。これらの実施例は、例示目的のためのみであり、そ
していかなる方式でも本発明を限定すると解釈されない
ことを理解しなければならない。
理解されることを可能にするため、以下の実施例を示
す。これらの実施例は、例示目的のためのみであり、そ
していかなる方式でも本発明を限定すると解釈されない
ことを理解しなければならない。
【００８５】
【実施例】実施例１ Ｐ２Ｘ７受容体欠損マウスにおける骨形態
骨量を制御する際のＰ２Ｘ７受容体の役割を直接調べる
ため、末梢定量的コンピューター連動断層撮影（ｐＱＣ
Ｔ）および標準的な骨組織形態計測法を用いて、Ｐ２Ｘ
７受容体欠損マウス系統の骨表現型を性質決定した。骨
量および骨構造の相違を、野生型対照と比較した。これ
らの相違は、Ｐ２Ｘ７受容体が、骨量を増加させるの
に、そして海綿骨構築を制御するのに役割を果たすこと
を示す。
ため、末梢定量的コンピューター連動断層撮影（ｐＱＣ
Ｔ）および標準的な骨組織形態計測法を用いて、Ｐ２Ｘ
７受容体欠損マウス系統の骨表現型を性質決定した。骨
量および骨構造の相違を、野生型対照と比較した。これ
らの相違は、Ｐ２Ｘ７受容体が、骨量を増加させるの
に、そして海綿骨構築を制御するのに役割を果たすこと
を示す。
【００８６】Ａ．研究プロトコル
Ｐ２Ｘ７受容体ノックアウト（ＫＯ）マウスは、先に記
載されるように生成した（Ｓｏｌｌｅら（２００１），
Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２７６：１２５−１３２）。１３のメス野生型（Ｗ
Ｔ）マウスおよび１３のＰ２Ｘ７受容体ＫＯマウスの重
量を測定し、そして８週齢で剖検した。各マウス由来の
右大腿をｐＱＣＴによって解析し、そして体積測定総骨
ミネラル含量および密度、骨梁ミネラル含量および密
度、並びに皮質骨ミネラル含量および密度を測定した。
各マウス由来の左大腿は、骨組織形態計測解析のため、
４μｍの切片にプロセシングした。
載されるように生成した（Ｓｏｌｌｅら（２００１），
Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２７６：１２５−１３２）。１３のメス野生型（Ｗ
Ｔ）マウスおよび１３のＰ２Ｘ７受容体ＫＯマウスの重
量を測定し、そして８週齢で剖検した。各マウス由来の
右大腿をｐＱＣＴによって解析し、そして体積測定総骨
ミネラル含量および密度、骨梁ミネラル含量および密
度、並びに皮質骨ミネラル含量および密度を測定した。
各マウス由来の左大腿は、骨組織形態計測解析のため、
４μｍの切片にプロセシングした。
【００８７】Ｂ．末梢定量的コンピューター連動断層撮
影（ｐＱＣＴ） 各マウス由来の右大腿を、遠位大腿骨幹端、始原海綿骨
部位、および大腿骨幹、皮質骨部位で解析した。切除し
た大腿は、ソフトウェアバージョン５．４０を備えたｐ
ＱＣＴ Ｘ線装置（Ｓｔｒａｔｅｃ ＸＣＴ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｍ，Ｎｏｒｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ， ウィスコンシン州フォートアトキンソ
ン）でスキャンした。遠位大腿骨幹端の１ｍｍ厚横断面
切片は、遠位端から２．５ｍｍ近位で取り、そして中大
腿骨幹の１ｍｍ厚横断面切片は、遠位端から７ｍｍ近位
で取り、０．１０ｍｍのボクセルサイズであった。皮質
骨は、輪郭モード２および皮質モード４を用いて定義
し、そして解析した。３４０ｍｇ／ｃｍ3の外側閾値設
定を用い、軟部組織から皮質殻を区別し、そして５２９
ｍｇ／ｃｍ3の内側閾値設定を用い、皮質内表面に沿っ
た皮質骨を区別した。骨梁は、剥離モード４を用い、皮
質骨および皮質下骨を海綿骨から区別するため、６５５
ｍｇ／ｃｍ3の閾値設定で、測定した。定義された海綿
骨の１％のさらなる同心円剥離を用い、皮質骨および皮
質下骨が解析から除外されていることを確実にした。先
に記載されるように、総骨、骨梁、および皮質骨に関し
て体積測定含量、密度、および領域を測定した（Ｂｅａ
ｍｅｒら（１９９６）， Ｂｏｎｅ， １８：３９７−
４０３）。さらに、皮質骨膜および骨内膜外周を測定し
た。上述の方法を用い、総骨、骨梁、および皮質領域の
体積測定含量、密度および領域のｅｘ ｖｉｖｏの精度
は、位置を変え、０．９９％から３．４９％の範囲であ
ることが決定された。
影（ｐＱＣＴ） 各マウス由来の右大腿を、遠位大腿骨幹端、始原海綿骨
部位、および大腿骨幹、皮質骨部位で解析した。切除し
た大腿は、ソフトウェアバージョン５．４０を備えたｐ
ＱＣＴ Ｘ線装置（Ｓｔｒａｔｅｃ ＸＣＴ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｍ，Ｎｏｒｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ， ウィスコンシン州フォートアトキンソ
ン）でスキャンした。遠位大腿骨幹端の１ｍｍ厚横断面
切片は、遠位端から２．５ｍｍ近位で取り、そして中大
腿骨幹の１ｍｍ厚横断面切片は、遠位端から７ｍｍ近位
で取り、０．１０ｍｍのボクセルサイズであった。皮質
骨は、輪郭モード２および皮質モード４を用いて定義
し、そして解析した。３４０ｍｇ／ｃｍ3の外側閾値設
定を用い、軟部組織から皮質殻を区別し、そして５２９
ｍｇ／ｃｍ3の内側閾値設定を用い、皮質内表面に沿っ
た皮質骨を区別した。骨梁は、剥離モード４を用い、皮
質骨および皮質下骨を海綿骨から区別するため、６５５
ｍｇ／ｃｍ3の閾値設定で、測定した。定義された海綿
骨の１％のさらなる同心円剥離を用い、皮質骨および皮
質下骨が解析から除外されていることを確実にした。先
に記載されるように、総骨、骨梁、および皮質骨に関し
て体積測定含量、密度、および領域を測定した（Ｂｅａ
ｍｅｒら（１９９６）， Ｂｏｎｅ， １８：３９７−
４０３）。さらに、皮質骨膜および骨内膜外周を測定し
た。上述の方法を用い、総骨、骨梁、および皮質領域の
体積測定含量、密度および領域のｅｘ ｖｉｖｏの精度
は、位置を変え、０．９９％から３．４９％の範囲であ
ることが決定された。
【００８８】Ｃ．遠位大腿骨幹端の海綿骨組織形態計測
先に記載されるように、組織形態計測のため、石灰質を
除去していない、４μｍ厚の遠位大腿骨幹端のメタクリ
ル酸メチル包埋縦切片を調製した（Ｊｅｅら（１９９
７）， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐ
ｈｏｌｏｇｙ中，Ｔａｋａｈａｓｈｉ監修， 日本・新
潟市： Ｎｉｓｈｉｍｕｓａ， ｐｐ８７−１１２）。
切片を修飾マッソンのトリクローム染色で染色した。画
像解析系（Ｏｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ， Ｉｎｃ．，
ジョージア州アトランタ）を組織形態計測解析で用い
た。組織形態計測測定は、成長板−骨端接合部に対して
０．５ｍｍおよび２．５ｍｍの間の近位の遠位大腿骨幹
端の海綿骨組織中で行い、そして側方次元の皮質内表面
に拡張した。骨梁体積および構造に関する測定および計
算には、先に記載されるように、骨梁体積、骨梁厚、骨
梁数、および骨梁分離が含まれた（Ｊｅｅら（１９９
７）、上記）。
除去していない、４μｍ厚の遠位大腿骨幹端のメタクリ
ル酸メチル包埋縦切片を調製した（Ｊｅｅら（１９９
７）， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐ
ｈｏｌｏｇｙ中，Ｔａｋａｈａｓｈｉ監修， 日本・新
潟市： Ｎｉｓｈｉｍｕｓａ， ｐｐ８７−１１２）。
切片を修飾マッソンのトリクローム染色で染色した。画
像解析系（Ｏｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ， Ｉｎｃ．，
ジョージア州アトランタ）を組織形態計測解析で用い
た。組織形態計測測定は、成長板−骨端接合部に対して
０．５ｍｍおよび２．５ｍｍの間の近位の遠位大腿骨幹
端の海綿骨組織中で行い、そして側方次元の皮質内表面
に拡張した。骨梁体積および構造に関する測定および計
算には、先に記載されるように、骨梁体積、骨梁厚、骨
梁数、および骨梁分離が含まれた（Ｊｅｅら（１９９
７）、上記）。
【００８９】Ｄ．結果
ＷＴ対照（１９．８５±０．７グラム）に比較し、Ｐ２
Ｘ７受容体ＫＯマウス（１９．３３±０．４グラム）の
体重の有意な相違はなかった。同様に、Ｐ２Ｘ７受容体
ＫＯ（１４．８３±０．３７ ｍｍ）およびＷＴ対照
（１４．５５±０．４７ ｍｍ）の間の大腿長に有意な
相違はなかった。しかし、ＷＴ対照に比較し、ＫＯマウ
スは、遠位大腿骨幹端で、有意に低い体積測定皮質−皮
質下骨ミネラル含量（−１３％）、体積測定皮質−皮質
下骨ミネラル密度（−７％）、体積測定皮質骨ミネラル
含量（−１３％）、および体積測定皮質骨ミネラル密度
（−５％）を有した。同様に、ＫＯマウスは、ＷＴ対照
に比較した際、大腿骨幹で、有意に低い体積測定総骨ミ
ネラル含量（−１２％）、体積測定総骨ミネラル密度
（−１１％）、体積測定皮質−皮質下骨ミネラル含量
（−１０％）、体積測定骨梁ミネラル含量（−２６
％）、体積測定皮質骨ミネラル領域（−８％）、および
体積測定皮質骨ミネラル含量（−１０％）、骨膜外周
（−６％）、および皮質内外周（−９％）を有した。
Ｘ７受容体ＫＯマウス（１９．３３±０．４グラム）の
体重の有意な相違はなかった。同様に、Ｐ２Ｘ７受容体
ＫＯ（１４．８３±０．３７ ｍｍ）およびＷＴ対照
（１４．５５±０．４７ ｍｍ）の間の大腿長に有意な
相違はなかった。しかし、ＷＴ対照に比較し、ＫＯマウ
スは、遠位大腿骨幹端で、有意に低い体積測定皮質−皮
質下骨ミネラル含量（−１３％）、体積測定皮質−皮質
下骨ミネラル密度（−７％）、体積測定皮質骨ミネラル
含量（−１３％）、および体積測定皮質骨ミネラル密度
（−５％）を有した。同様に、ＫＯマウスは、ＷＴ対照
に比較した際、大腿骨幹で、有意に低い体積測定総骨ミ
ネラル含量（−１２％）、体積測定総骨ミネラル密度
（−１１％）、体積測定皮質−皮質下骨ミネラル含量
（−１０％）、体積測定骨梁ミネラル含量（−２６
％）、体積測定皮質骨ミネラル領域（−８％）、および
体積測定皮質骨ミネラル含量（−１０％）、骨膜外周
（−６％）、および皮質内外周（−９％）を有した。
【００９０】遠位大腿骨幹端海綿骨組織形態計測解析
は、ＫＯマウスが、有意により低い骨梁体積（−３２
％）、骨梁厚（−１８％）、および骨梁数（−１９
％）、並びに有意により高い骨梁分離（＋４０％）を有
することを示した。
は、ＫＯマウスが、有意により低い骨梁体積（−３２
％）、骨梁厚（−１８％）、および骨梁数（−１９
％）、並びに有意により高い骨梁分離（＋４０％）を有
することを示した。
【００９１】これらのデータは、体重および骨長が、Ｐ
２Ｘ７受容体を欠くマウスおよび野生型対照の間で異な
らないが、Ｐ２Ｘ７受容体を欠くマウスで、より低い海
綿骨および皮質骨量、並びに劣った海綿骨構築が見られ
ることを示す。実施例２ 細胞に基づくアッセイの腹腔マクロファージ単離 腹腔マクロファージは、頚椎脱臼によって動物を屠殺し
た直後に、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲｏｓｗ
ｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ（ＲＰＭＩ）培地５ｍｌを動物（例えばマウス）の
腹腔に注入することによって採取する。注入培地は、外
部表面を擦ることによって腹腔全体に分散させ、腹腔に
進入するため、腹膜を覆う皮膚に穴を開け、そしてトラ
ンスファーピペットの補助で、注入液体を回収する。多
数の動物由来の洗浄液をプールし、そして遠心分離（３
００ｘｇ）によって細胞を収集する。細胞ペレットは、
５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での遠心分離によって、
２回洗浄する。実施例３ Ｐ２Ｘ７受容体仲介巨大分子取り込み Ｐ２Ｘ７受容体の１つの活性は、ＡＴＰ活性化に反応
し、蛍光色素ＹｏＰｒｏイエローなどの巨大有機分子の
転位を促進することである（Ｖｉｒｇｉｎｉｏら（１９
９９）Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１９：３３５−３４
６）。野生型動物から単離された腹腔マクロファージを
細胞外ＹｏＰｒｏイエローの存在下で、５ｍＭ ＡＴＰ
で活性化すると、蛍光強度の時間依存増加が観察され
る。蛍光のこの増加は、色素分子の内部侵入後のＤＮＡ
への結合から生じ；ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増
加する。ＡＴＰの非存在下で、蛍光強度の有意な増加は
観察されず、形質膜が、ヌクレオチド三リン酸の非存在
下で、ＹｏＰｒｏイエローに対し不透過性であることが
示される。本発明の１つの態様にしたがい、ＡＴＰに同
時に曝露し、または曝露せず、蛍光色素などの巨大有機
分子のＰ２Ｘ７受容体仲介転位を調節する能力に関し、
化合物を試験する。
２Ｘ７受容体を欠くマウスおよび野生型対照の間で異な
らないが、Ｐ２Ｘ７受容体を欠くマウスで、より低い海
綿骨および皮質骨量、並びに劣った海綿骨構築が見られ
ることを示す。実施例２ 細胞に基づくアッセイの腹腔マクロファージ単離 腹腔マクロファージは、頚椎脱臼によって動物を屠殺し
た直後に、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲｏｓｗ
ｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ（ＲＰＭＩ）培地５ｍｌを動物（例えばマウス）の
腹腔に注入することによって採取する。注入培地は、外
部表面を擦ることによって腹腔全体に分散させ、腹腔に
進入するため、腹膜を覆う皮膚に穴を開け、そしてトラ
ンスファーピペットの補助で、注入液体を回収する。多
数の動物由来の洗浄液をプールし、そして遠心分離（３
００ｘｇ）によって細胞を収集する。細胞ペレットは、
５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での遠心分離によって、
２回洗浄する。実施例３ Ｐ２Ｘ７受容体仲介巨大分子取り込み Ｐ２Ｘ７受容体の１つの活性は、ＡＴＰ活性化に反応
し、蛍光色素ＹｏＰｒｏイエローなどの巨大有機分子の
転位を促進することである（Ｖｉｒｇｉｎｉｏら（１９
９９）Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１９：３３５−３４
６）。野生型動物から単離された腹腔マクロファージを
細胞外ＹｏＰｒｏイエローの存在下で、５ｍＭ ＡＴＰ
で活性化すると、蛍光強度の時間依存増加が観察され
る。蛍光のこの増加は、色素分子の内部侵入後のＤＮＡ
への結合から生じ；ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増
加する。ＡＴＰの非存在下で、蛍光強度の有意な増加は
観察されず、形質膜が、ヌクレオチド三リン酸の非存在
下で、ＹｏＰｒｏイエローに対し不透過性であることが
示される。本発明の１つの態様にしたがい、ＡＴＰに同
時に曝露し、または曝露せず、蛍光色素などの巨大有機
分子のＰ２Ｘ７受容体仲介転位を調節する能力に関し、
化合物を試験する。
【００９２】単離マクロファージを用いて、Ｐ２Ｘ７受
容体機能をアッセイする際、腹腔マクロファージは、遠
心分離によって、等張培地（１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．２、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１
８ｍＭ ＣａＣｌ2、０８ｍＭ ＭｇＣｌ2）で洗浄し、
そして生じた細胞ペレットを等張培地に懸濁し、約１ｘ
１０6細胞／ｍｌの最終細胞濃度を達成する。この細胞
懸濁物を５０μｌ、プレート（例えばＭｉｃｒｏｆｌｕ
ｏｒ “Ｂ”Ｕ底プレート、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、バージ
ニア州シャンティリー）のウェルに入れ、そして等張培
地中に溶解された蛍光色素（例えば２μＭ ＹｏＰｒｏ
イエロー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴ
ン州ユージーン）５０μｌを各ウェルに添加する。５ｍ
Ｍ ＡＴＰを添加し、または添加せず、試験化合物また
は対照ビヒクルをウェルに添加する。３７℃で、時間の
関数として、蛍光を監視する。ＹｏＰｒｏイエローに関
しては、励起は４５０ｎｍであり、そして発光は、５３
０ｎｍで測定する。Ｐ２Ｘ７受容体活性を刺激する試験
化合物は、試験化合物を欠く対照試料に比較して、蛍光
を増加させる。実施例４ 単離マクロファージにおけるＩＬ−１β翻訳後プロセシ
ング マウスなどの動物から単離した腹腔マクロファージを、
リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激し、そして［35Ｓ］メチオニ
ンで標識する。これらの放射標識細胞は、その後、５ｍ
Ｍ ＡＴＰなどの分泌刺激の非存在下または存在下で培
養し、その後、細胞および培地を別個に採取し、細胞
は、界面活性剤抽出によって可溶化し、そしてＩＬ−１
βは、培地および細胞抽出物から、免疫沈降によって回
収する。
容体機能をアッセイする際、腹腔マクロファージは、遠
心分離によって、等張培地（１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．２、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１
８ｍＭ ＣａＣｌ2、０８ｍＭ ＭｇＣｌ2）で洗浄し、
そして生じた細胞ペレットを等張培地に懸濁し、約１ｘ
１０6細胞／ｍｌの最終細胞濃度を達成する。この細胞
懸濁物を５０μｌ、プレート（例えばＭｉｃｒｏｆｌｕ
ｏｒ “Ｂ”Ｕ底プレート、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、バージ
ニア州シャンティリー）のウェルに入れ、そして等張培
地中に溶解された蛍光色素（例えば２μＭ ＹｏＰｒｏ
イエロー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴ
ン州ユージーン）５０μｌを各ウェルに添加する。５ｍ
Ｍ ＡＴＰを添加し、または添加せず、試験化合物また
は対照ビヒクルをウェルに添加する。３７℃で、時間の
関数として、蛍光を監視する。ＹｏＰｒｏイエローに関
しては、励起は４５０ｎｍであり、そして発光は、５３
０ｎｍで測定する。Ｐ２Ｘ７受容体活性を刺激する試験
化合物は、試験化合物を欠く対照試料に比較して、蛍光
を増加させる。実施例４ 単離マクロファージにおけるＩＬ−１β翻訳後プロセシ
ング マウスなどの動物から単離した腹腔マクロファージを、
リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激し、そして［35Ｓ］メチオニ
ンで標識する。これらの放射標識細胞は、その後、５ｍ
Ｍ ＡＴＰなどの分泌刺激の非存在下または存在下で培
養し、その後、細胞および培地を別個に採取し、細胞
は、界面活性剤抽出によって可溶化し、そしてＩＬ−１
βは、培地および細胞抽出物から、免疫沈降によって回
収する。
【００９３】マクロファージをプレート上に蒔き（例え
ば１ｘ１０6細胞／ウェル）、そして１μｇ／ｍｌ大腸
菌ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイスの血清
型０５５ Ｂ５）で７５−９０分間刺激する。その後、
１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレ
プトマイシン、１％透析ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌ ＬＰ
Ｓ、およびｐＨ７．３の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むメ
チオニン不含ＲＰＭＩ培地（「パルス培地」）２ｍｌ
で、細胞をリンスする。その後、８３μＣｉ／ｍｌの35
Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、イリ
ノイ州シカゴ）を含むパルス培地１ｍｌを各ウェルに添
加し、そして３７℃で１時間、細胞を標識する。続い
て、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌス
トレプトマイシン、１％ ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、
１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ、およびｐＨ７．３の２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（「追跡培
地」）で、標識細胞を２回リンスする。試験化合物およ
び／または５ｍＭ ＡＴＰを含むまた含まない追跡培地
１ｍｌを各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間、
細胞を追跡する。培地を採取し、そして遠心分離（６０
００ｘｇ、５分間）によって清澄にし、細胞および／ま
たは細胞破片を除去する。細胞単層を、１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍｇ／
ｍｌオボアルブミン、１ｍＭヨード酢酸、１μｇ／ｍｌ
ペプスタチン、および１μｇ／ｍｌロイペプチンで構成
される溶解緩衝液１ｍｌに懸濁する。ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００およびプロテアーゼ阻害剤の濃縮ストックからア
リコットを添加することによって、清澄な培地試料を、
これらの試薬の同じ最終濃度に調整する。氷上で３０分
間インキュベーションした後、ＴＬＡ−４５ローター
（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州パロアルト）中
で、４５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することに
よって、すべての試料を清澄にし、生じた上清を回収
し、そしてヤギ抗ネズミＩL−１β血清を用いて、試料
からＩＬ−１βを免疫沈降する。免疫沈降物は、ＳＤＳ
ゲル電気泳動によって分画し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｉ
ｍａｇｅｒで、乾燥ゲルをスキャンすることによって、
個々のＩＬ−１βポリペプチド種に関連する放射能の量
を測定する。実施例５ ｉｎ ｖｉｖｏのＩＬ−１β翻訳後プロセシング ｉｎ ｖｉｖｏで細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に曝露された
マウスなどの動物の腹腔マクロファージは、成熟ＩＬ−
１βの有効な外在化を引き出すのに、５ｍＭＡＴＰなど
の分泌刺激を必要とする（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９
９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：２８２１−２８
２８）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−１βプロセシングの
度合いを測定するため、動物をＬＰＳで初回免疫刺激
し、そして２時間後、ＡＴＰを含むまたは含まない、そ
して／または試験化合物を含むまたは含まないＰＢＳの
ｉｐ注射を行う。その後、これらの動物由来の腹腔洗浄
液を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっ
て、ＩＬ−１β含量に関して評価する。
ば１ｘ１０6細胞／ウェル）、そして１μｇ／ｍｌ大腸
菌ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイスの血清
型０５５ Ｂ５）で７５−９０分間刺激する。その後、
１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレ
プトマイシン、１％透析ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌ ＬＰ
Ｓ、およびｐＨ７．３の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むメ
チオニン不含ＲＰＭＩ培地（「パルス培地」）２ｍｌ
で、細胞をリンスする。その後、８３μＣｉ／ｍｌの35
Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、イリ
ノイ州シカゴ）を含むパルス培地１ｍｌを各ウェルに添
加し、そして３７℃で１時間、細胞を標識する。続い
て、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌス
トレプトマイシン、１％ ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、
１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ、およびｐＨ７．３の２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（「追跡培
地」）で、標識細胞を２回リンスする。試験化合物およ
び／または５ｍＭ ＡＴＰを含むまた含まない追跡培地
１ｍｌを各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間、
細胞を追跡する。培地を採取し、そして遠心分離（６０
００ｘｇ、５分間）によって清澄にし、細胞および／ま
たは細胞破片を除去する。細胞単層を、１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍｇ／
ｍｌオボアルブミン、１ｍＭヨード酢酸、１μｇ／ｍｌ
ペプスタチン、および１μｇ／ｍｌロイペプチンで構成
される溶解緩衝液１ｍｌに懸濁する。ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００およびプロテアーゼ阻害剤の濃縮ストックからア
リコットを添加することによって、清澄な培地試料を、
これらの試薬の同じ最終濃度に調整する。氷上で３０分
間インキュベーションした後、ＴＬＡ−４５ローター
（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州パロアルト）中
で、４５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することに
よって、すべての試料を清澄にし、生じた上清を回収
し、そしてヤギ抗ネズミＩL−１β血清を用いて、試料
からＩＬ−１βを免疫沈降する。免疫沈降物は、ＳＤＳ
ゲル電気泳動によって分画し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｉ
ｍａｇｅｒで、乾燥ゲルをスキャンすることによって、
個々のＩＬ−１βポリペプチド種に関連する放射能の量
を測定する。実施例５ ｉｎ ｖｉｖｏのＩＬ−１β翻訳後プロセシング ｉｎ ｖｉｖｏで細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に曝露された
マウスなどの動物の腹腔マクロファージは、成熟ＩＬ−
１βの有効な外在化を引き出すのに、５ｍＭＡＴＰなど
の分泌刺激を必要とする（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９
９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：２８２１−２８
２８）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−１βプロセシングの
度合いを測定するため、動物をＬＰＳで初回免疫刺激
し、そして２時間後、ＡＴＰを含むまたは含まない、そ
して／または試験化合物を含むまたは含まないＰＢＳの
ｉｐ注射を行う。その後、これらの動物由来の腹腔洗浄
液を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっ
て、ＩＬ−１β含量に関して評価する。
【００９４】マウス群に１μｇのＬＰＳを腹腔内（ｉ
ｐ）注射する。ＬＰＳ注射の２時間後、マウスに３０ｍ
Ｍ ＡＴＰ（ｐＨ７に調整）を含むまたは含まない、試
験化合物を含むまたは含まない、リン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）ｐＨ７をｉｐ注射する。ＡＴＰまたはＰＢＳ
注射の３０分後または１２０分後、マウスを屠殺し、そ
して５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ ３ｍｌで、腹腔を洗
浄する。腹腔洗浄液を回転して落とし、そして上清を収
集し、そしてＥＬＩＳＡ（それぞれＡｍｅｒｓｈａｍ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バージニア州アーリント
ンハイツおよびＥｎｄｏｇｅｎ、マサチューセッツ州ウ
ォーバーン）を用いて、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の存
在に関して試験する。実施例６ ｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生能力の性質決定 ＩＬ−１シグナル伝達は、ＩＬ−６などの他のサイトカ
インの産生を導く可能性がある（Ａｌｌｅｎら（２００
０）， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１：８５９−
８６９）。このカスケード効果を評価するため、マウス
などの動物を、ＬＰＳ（または対照としてＰＢＳ）の注
射によって初回免疫刺激し、そして２時間後、ＡＴＰま
たは試験化合物（または対照としてＰＢＳ）を投与し、
ＩＬ−１翻訳後プロセシングを促進する。動物をさらな
る期間（例えば４時間）、インキュベーションし、そし
てインキュベーション過程中、数回、腹腔洗浄液を収集
し、そしてＥＬＩＳＡによってサイトカインに関して解
析する。ＬＰＳの最初の初回免疫刺激注射を受け、そし
て続いてＰＢＳを投与されたマウスは、１および２時間
で、ＰＢＳおよびＡＴＰの組み合わせを注射されたマウ
スから回収されたものより上昇したＩＬ−６レベルを生
じる（４から５ｎｇ／ｍｌ）。しかし、４時間までに、
ＬＰＳ−ＰＢＳ処理動物から回収されたＩＬ−６レベル
は、ベースラインに戻った。一方、ＬＰＳ初回免疫刺激
され、続いてＡＴＰに曝露されたマウスは、洗浄液ＩＬ
−６の劇的な増加を示し、４時間の時点で、＞２５ｎｇ
／ｍｌのピーク値に達する。実施例７ 部分的受容体精製 ネズミ腹腔マクロファージ細胞ペレットを、遠心分離に
よって空洞化緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、
３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオ
スレイトール、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μ
ｇ／ｍｌペプスタチン）中で１回洗浄する。その後、細
胞ペレットを、空洞化緩衝液２．５ｍｌに再懸濁し、そ
して細胞を窒素空洞化によって破壊する（７５０ｐｓｉ
で氷上１５分間）。生じた細胞溶解物は、０．１％サポ
ニンに調整し、氷上で３０分間インキュベーションし、
そして続いて遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ロー
ター中で、５０，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）によ
って細胞膜を回収する。ガラス管−テフロン（登録商
標）乳棒ホモジナイザーの補助で、膜ペレットを２ｍｌ
の空洞化緩衝液中に懸濁し、そして総タンパク質解析
（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）のため、
アリコットまたは懸濁物を取っておく。膜を再び遠心分
離によって収集し、その後、ペレットを１００μｌの２
ＸＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に懸濁する。タンパク質は
さらに、４−２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖ
ｅｘ、カリフォルニア州サンディエゴ）上での分離、お
よび／または抗Ｐ２Ｘ７受容体血清（Ａｌｏｍｏｎｅ、
イスラエル・エルサレム）によって精製する。実施例８ 破骨細胞分化およびアポトーシスに関するアッセイ 骨髄破骨細胞分化培養系（例えばマウスまたはラット）
は、先に記載されるように確立する（Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉら（１９８８）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １
２２：１３７３−１３８１； Ｇｒａｓｓｅｒら（１９
９７）， Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６５：
１５９−１７１； Ｋｅら（１９９８）， Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：２０６８−２０７６）。簡
潔には、骨髄を収集し、５ｘ１０5／ｃｍ2の密度で細胞
を蒔き、そしてその後、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを含み
または含まず、ビヒクルまたは試験化合物で、細胞を処
理する。第３日、新鮮な化合物を含む培地で５０％置き
換えて、細胞培養を６日間維持し、その後、第６日に、
破骨細胞染色および定量的観察を行う。培養中に形成さ
れた破骨細胞を視覚化するため、酒石酸耐性酸ホスファ
ターゼ（ＴＲＡＰ）に関する組織化学染色を行う。アポ
トーシス細胞を同定するため、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディア
ナポリス）の指示にしたがい、ＴＤＴ仲介ｄＵＴＰニッ
ク端標識（ＴＵＮＥＬ）によって、断片化核ＤＮＡを標
識する。培養第３日、先に記載されるように、ｐ５３お
よびＣＤ６１特異的モノクローナル抗体（それぞれ、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ
州ケンブリッジ、およびＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフ
ォルニア州サンディエゴ）を用いて、ｐ５３およびＣＤ
６１同時位置決定を行う。顕微鏡（例えばＯｌｙｍｐｕ
ｓ ＢＨ−２）下で、標識細胞を調べ、そして計数す
る。同等物 本発明は、本明細書に記載される特定の態様によって、
範囲に限定されるものではない。むしろ、本明細書に記
載されるものに加え、前述の説明および付随する図か
ら、本発明の多様な修飾が当業者に明らかとなるであろ
う。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に属する
と意図される。
ｐ）注射する。ＬＰＳ注射の２時間後、マウスに３０ｍ
Ｍ ＡＴＰ（ｐＨ７に調整）を含むまたは含まない、試
験化合物を含むまたは含まない、リン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）ｐＨ７をｉｐ注射する。ＡＴＰまたはＰＢＳ
注射の３０分後または１２０分後、マウスを屠殺し、そ
して５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ ３ｍｌで、腹腔を洗
浄する。腹腔洗浄液を回転して落とし、そして上清を収
集し、そしてＥＬＩＳＡ（それぞれＡｍｅｒｓｈａｍ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バージニア州アーリント
ンハイツおよびＥｎｄｏｇｅｎ、マサチューセッツ州ウ
ォーバーン）を用いて、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の存
在に関して試験する。実施例６ ｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生能力の性質決定 ＩＬ−１シグナル伝達は、ＩＬ−６などの他のサイトカ
インの産生を導く可能性がある（Ａｌｌｅｎら（２００
０）， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１：８５９−
８６９）。このカスケード効果を評価するため、マウス
などの動物を、ＬＰＳ（または対照としてＰＢＳ）の注
射によって初回免疫刺激し、そして２時間後、ＡＴＰま
たは試験化合物（または対照としてＰＢＳ）を投与し、
ＩＬ−１翻訳後プロセシングを促進する。動物をさらな
る期間（例えば４時間）、インキュベーションし、そし
てインキュベーション過程中、数回、腹腔洗浄液を収集
し、そしてＥＬＩＳＡによってサイトカインに関して解
析する。ＬＰＳの最初の初回免疫刺激注射を受け、そし
て続いてＰＢＳを投与されたマウスは、１および２時間
で、ＰＢＳおよびＡＴＰの組み合わせを注射されたマウ
スから回収されたものより上昇したＩＬ−６レベルを生
じる（４から５ｎｇ／ｍｌ）。しかし、４時間までに、
ＬＰＳ−ＰＢＳ処理動物から回収されたＩＬ−６レベル
は、ベースラインに戻った。一方、ＬＰＳ初回免疫刺激
され、続いてＡＴＰに曝露されたマウスは、洗浄液ＩＬ
−６の劇的な増加を示し、４時間の時点で、＞２５ｎｇ
／ｍｌのピーク値に達する。実施例７ 部分的受容体精製 ネズミ腹腔マクロファージ細胞ペレットを、遠心分離に
よって空洞化緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、
３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオ
スレイトール、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μ
ｇ／ｍｌペプスタチン）中で１回洗浄する。その後、細
胞ペレットを、空洞化緩衝液２．５ｍｌに再懸濁し、そ
して細胞を窒素空洞化によって破壊する（７５０ｐｓｉ
で氷上１５分間）。生じた細胞溶解物は、０．１％サポ
ニンに調整し、氷上で３０分間インキュベーションし、
そして続いて遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ロー
ター中で、５０，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）によ
って細胞膜を回収する。ガラス管−テフロン（登録商
標）乳棒ホモジナイザーの補助で、膜ペレットを２ｍｌ
の空洞化緩衝液中に懸濁し、そして総タンパク質解析
（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）のため、
アリコットまたは懸濁物を取っておく。膜を再び遠心分
離によって収集し、その後、ペレットを１００μｌの２
ＸＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に懸濁する。タンパク質は
さらに、４−２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖ
ｅｘ、カリフォルニア州サンディエゴ）上での分離、お
よび／または抗Ｐ２Ｘ７受容体血清（Ａｌｏｍｏｎｅ、
イスラエル・エルサレム）によって精製する。実施例８ 破骨細胞分化およびアポトーシスに関するアッセイ 骨髄破骨細胞分化培養系（例えばマウスまたはラット）
は、先に記載されるように確立する（Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉら（１９８８）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １
２２：１３７３−１３８１； Ｇｒａｓｓｅｒら（１９
９７）， Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６５：
１５９−１７１； Ｋｅら（１９９８）， Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：２０６８−２０７６）。簡
潔には、骨髄を収集し、５ｘ１０5／ｃｍ2の密度で細胞
を蒔き、そしてその後、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドを含み
または含まず、ビヒクルまたは試験化合物で、細胞を処
理する。第３日、新鮮な化合物を含む培地で５０％置き
換えて、細胞培養を６日間維持し、その後、第６日に、
破骨細胞染色および定量的観察を行う。培養中に形成さ
れた破骨細胞を視覚化するため、酒石酸耐性酸ホスファ
ターゼ（ＴＲＡＰ）に関する組織化学染色を行う。アポ
トーシス細胞を同定するため、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディア
ナポリス）の指示にしたがい、ＴＤＴ仲介ｄＵＴＰニッ
ク端標識（ＴＵＮＥＬ）によって、断片化核ＤＮＡを標
識する。培養第３日、先に記載されるように、ｐ５３お
よびＣＤ６１特異的モノクローナル抗体（それぞれ、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ
州ケンブリッジ、およびＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフ
ォルニア州サンディエゴ）を用いて、ｐ５３およびＣＤ
６１同時位置決定を行う。顕微鏡（例えばＯｌｙｍｐｕ
ｓ ＢＨ−２）下で、標識細胞を調べ、そして計数す
る。同等物 本発明は、本明細書に記載される特定の態様によって、
範囲に限定されるものではない。むしろ、本明細書に記
載されるものに加え、前述の説明および付随する図か
ら、本発明の多様な修飾が当業者に明らかとなるであろ
う。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に属する
と意図される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 フア・チュー・ケ
アメリカ合衆国コネチカット州06340，グ
ロトン，イースタン・ポイント・ロード,
ファイザー・グローバル・リサーチ・アン
ド・ディベロプメント
Claims (12)
- 【請求項１】 化合物をスクリーニングして、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を増加させるための療法的
候補を同定する方法であって：試験化合物と、Ｐ２Ｘ７
受容体を発現する細胞を、該化合物の存在を別にして、
Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの前記Ｐ２Ｘ７受容体の結合
を可能にする条件下で接触させ；そしてＰ２Ｘ７受容体
活性の指標を検出することを含み；前記指標の増加が、
前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作
用することによって、骨量および／または骨ミネラル密
度を増加させるための候補であることを示す、前記方
法。 - 【請求項２】 化合物をスクリーニングして、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための療法的候
補を同定する方法であって：試験化合物およびＰ２Ｘ７
受容体リガンドと、Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、
該化合物の存在を別にして、前記Ｐ２Ｘ７受容体リガン
ドへの前記Ｐ２Ｘ７受容体の結合を可能にする条件下で
接触させ；そしてＰ２Ｘ７受容体活性の指標の増加また
は減少を検出することを含み；前記指標の増加または減
少が、前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体と
相互作用することによって、骨量および／または骨ミネ
ラル密度を調節するための候補であることを示す、前記
方法。 - 【請求項３】 前記細胞が破骨細胞前駆体を含み、そ
して前記指標が破骨細胞への分化であり、並びに／ある
いは前記細胞が破骨細胞であり、そして前記指標が増加
した吸収窩形成または増加したアポトーシスである、請
求項１または２の方法。 - 【請求項４】 化合物をスクリーニングして、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための療法的候
補を同定する方法であって：Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイ
ンを細胞表面上に発現する細胞および所望により追加の
Ｐ２Ｘ７受容体リガンドと、化合物を、該化合物の存在
を別にして、Ｐ２Ｘ７受容体リガンドへの前記Ｐ２Ｘ７
受容体結合ドメインの結合を可能にする条件下で接触さ
せ；そして前記Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインおよび少な
くとも１つの前記化合物および前記Ｐ２Ｘ７受容体リガ
ンドの間の結合を検出することを含み；前記Ｐ２Ｘ７受
容体結合ドメインおよび前記化合物の間の結合の検出、
または前記Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインおよび前記Ｐ２
Ｘ７受容体リガンドの間の増加したもしくは減少した結
合の検出が、前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受
容体と相互作用することによって、骨量および／または
骨ミネラル密度を調節するための候補であることを示
す、前記方法。 - 【請求項５】 化合物をスクリーニングして、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための療法的候
補を同定する方法であって：Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転写
調節要素の調節下でコード配列を発現する細胞と、試験
化合物を接触させ；そして前記化合物が、前記コード配
列の発現を増加させるかまたは減少させるかどうか検出
することを含み；前記コード配列の発現の増加または減
少が、前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発
現を調節することによって、骨量および／または骨ミネ
ラル密度を調節するための候補であることを示す、前記
方法。 - 【請求項６】 前記細胞が、Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子転
写調節要素に機能可能であるように連結されている、レ
ポーター遺伝子コード配列で形質転換され、レポーター
遺伝子発現の増加または減少が、前記化合物がｉｎ ｖ
ｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体発現を調節することによって、
骨量および／または骨ミネラル密度を調節するための候
補であることを示す、請求項５の方法。 - 【請求項７】 化合物をスクリーニングして、骨量お
よび／または骨ミネラル密度を調節するための療法的候
補を同定する方法であって：化合物を提供し；前記化合
物を、Ｐ２Ｘ７受容体を発現する非ヒト動物に投与し；
そして前記化合物が、前記動物において、Ｐ２Ｘ７受容
体活性の指標を増加させるかまたは減少させるかどうか
を検出することを含み；前記指標の増加が、前記化合物
がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体活性を増加させるこ
とによって、骨量および／または骨ミネラル密度を増加
させるための候補であることを示し、そして前記指標の
減少が、前記化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＰ２Ｘ７受容体
活性を減少させることによって、骨量および／または骨
ミネラル密度を減少させるための候補であることを示
す、前記方法。 - 【請求項８】 前記動物が、トランスジェニック非ヒ
ト動物であって、前記動物で発現されるＰ２Ｘ７受容体
をコードする外因性核酸配列で形質転換されている、前
記非ヒト動物、またはこうした動物の子孫である、請求
項７の方法。 - 【請求項９】 前記指標が、増加した細胞浸透性；増
加した巨大分子の細胞内集積；活性化炎症性細胞におけ
る増加したＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−１８
翻訳後プロセシング；炎症誘導細胞における増加したＩ
Ｌ−６産生；増加したＬ−セレクチン分断；ストレスキ
ナーゼ活性化；およびリンパ球増殖からなる群より選択
される、請求項１、２または７の方法。 - 【請求項１０】 前記指標が、破骨細胞前駆体の破骨
細胞への分化；破骨細胞における増加した吸収窩形成ま
たは増加したアポトーシス、並びに骨ミネラル密度、骨
ミネラル含量、骨梁数、骨梁分離、骨ミネラル領域、骨
体積、骨の厚み、および骨外周からなる群より選択され
る表現型的変化を含む、請求項７の方法。 - 【請求項１１】 化合物をスクリーニングして、骨量
および／または骨ミネラル密度を調節するための療法的
候補を同定する方法であって：Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメ
インおよび所望により追加のＰ２Ｘ７受容体リガンド
と、試験化合物を、該化合物の存在を別にして、Ｐ２Ｘ
７受容体リガンドへの前記Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメイン
の結合を可能にする条件下で接触させ；そして前記Ｐ２
Ｘ７受容体結合ドメインおよび少なくとも１つの前記化
合物および前記Ｐ２Ｘ７受容体リガンドの間の結合を検
出することを含み；前記Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインお
よび前記化合物の間の結合の検出、または前記Ｐ２Ｘ７
受容体結合ドメインおよび前記Ｐ２Ｘ７受容体リガンド
の間の減少した結合の検出が、前記化合物がｉｎ ｖｉ
ｖｏでＰ２Ｘ７受容体と相互作用することによって、骨
量および／または骨ミネラル密度を調節するための候補
であることを示す、前記方法。 - 【請求項１２】 こうした治療が必要な哺乳動物にお
いて、骨量および／または骨ミネラル密度を増加させる
方法であって、前記哺乳動物に、前記哺乳動物におい
て、骨量および／または骨ミネラル密度を増加させるの
に有効な量のＰ２Ｘ７受容体のアゴニストを投与するこ
とを含む、前記方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28752301P | 2001-04-30 | 2001-04-30 | |
| US60/287523 | 2001-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003033198A true JP2003033198A (ja) | 2003-02-04 |
Family
ID=23103278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002125273A Pending JP2003033198A (ja) | 2001-04-30 | 2002-04-26 | Ｐ２ｘ７受容体活性の調節因子を同定する方法および産物、並びに骨格障害の治療におけるそれらの使用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003033198A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010539454A (ja) * | 2007-09-14 | 2010-12-16 | バイオセプター・インターナショナル・リミテッド | 細胞外体液中のプリン作動性（ｐ２ｘ）受容体 |
-
2002
- 2002-04-26 JP JP2002125273A patent/JP2003033198A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010539454A (ja) * | 2007-09-14 | 2010-12-16 | バイオセプター・インターナショナル・リミテッド | 細胞外体液中のプリン作動性（ｐ２ｘ）受容体 |
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|
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