JP2005512508A - Dkk媒介性相互作用を変調する試薬および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)DkkまたはそのLRP5/LRP6/HBM結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkkまたはそのLRP5/LRP6/HBM結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。特に好ましい実施形態では、Dkk−1とLRP5/LRP6/HBMとの結合は低下させられる。
(a)DkkまたはそのLRP5/LRP6/HBM結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkkとLRP5、LRP6、HBM、またはそのLRP5/LRP6/HBMのDkk結合フラグメントとの相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。特に好ましい実施形態では、Dkk−1とLRP5/LRP6/HBMとの相互作用は低下させられる。
(a)DkkまたはそのLRP5/LRP6/HBM結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkkまたはLRP5/LRP6/HBM結合フラグメントに結合するかどうかを決定するステップと、
(c)さらに前記化合物がDkkとLRP5、LRP6、HBM、またはLRP5/LRP6/HBMのDkk結合フラグメントとの相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。
(a)Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(a)1つ以上のDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkkとDkk相互作用タンパク質との相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。
(a)Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントに結合するかどうかを決定するステップと、
(c)さらに前記化合物がDkkとDkk相互作用タンパク質との相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(a)1つ以上のDkkタンパク質またはそのLRP5/LRP6結合フラグメントを潜在的結合パートナーへ曝露させるステップと、
(b)潜在的結合パートナーがDkkタンパク質またはそのLRP5/LRP6結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(a)(1)調節可能な1つ以上のDkk相互作用タンパク質遺伝子、(2)1つ以上のDkk相互作用タンパク質遺伝子のノックアウトまたは(3)1つ以上のDkk相互作用タンパク質遺伝子のノックインを有する1群のトランスジェニック動物を用意するステップと、
(b)ステップ(a)におけるトランスジェニック動物群に対して各々第2群のコントロール動物を用意するステップと、
(c)トランスジェニック動物群およびコントロール動物群を骨量または脂質濃度を変調する潜在的Dkkを変調する化合物へ曝露させるステップと、
(d)トランスジェニック動物群とコントロール動物群とを比較し、そして該化合物がコントロール動物と比較してトランスジェニック動物における骨量または脂質濃度に及ぼす作用を決定するステップと
を含む方法を提供することである。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(a)Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントを前記少なくとも1つの化合物の存在下でDkkのリガンド結合ドメインと混合するステップと、
(b)前記Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントへ結合したDkkの前記結合ドメインの量を前記少なくとも1つの化合物を含まないコントロールと比較して測定するステップと、
(c)該化合物が前記Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントへのDkkの前記結合ドメインの結合の量を減少させるかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供することである。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(i)少なくとも1つの真核細胞を培養するステップであって、このとき真核細胞が
a)第1のペプチドまたは転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第1の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
b)第2のペプチドまたは転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第2の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
(このとき第1のペプチドまたはそのセグメントおよび第2のペプチドまたはそのセグメントの結合は転写活性化タンパク質を再構成する)、
c)再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントであって、該レポーターエレメントの発現が選択された表現型を作り出すレポーターエレメントとを含む
ことを特徴とするステップと、
(ii)選択された表現型を検出するために適した条件下で1つの化合物を真核細胞と一緒に培養するステップと、
(iii)該化合物が選択された表現型を作り出すレポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって該化合物がペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと
(このとき(1)前記第1のペプチドはDkkペプチドであり、第2のペプチドはLRP5、HBM、LRP6、およびLRP5/LRP6/HBMのDkk結合部分から選択されるペプチドである、または(2)前記第1のペプチドはDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントであり、前記第2のペプチドはDkkペプチドである)、を含む方法が含まれる。
(i)少なくとも1つの酵母細胞を培養するステップであって、このとき酵母細胞が
a)第1のペプチドまたは転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第1の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
b)第2のペプチドまたは転写活性化タンパク質の転写活性ドメインへ結合したそのセグメントを含む第2の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
(このとき第1のペプチドまたはそのセグメントおよび第2のペプチドまたはそのセグメントの結合は転写活性化タンパク質を再構成する)、
c)再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントであって、該レポーター遺伝子の発現が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントと、を含むステップと、
(ii)選択された表現型を検出するために適した条件下で1つの化合物を酵母細胞と一緒に培養するステップと、
(iii)該化合物が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって該化合物がペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと
(このとき前記第1のペプチドはDkkペプチドであり、第2のペプチドはLRP5、HBM、LRP6、およびLRP5/LRP6/HBMのDkk結合フラグメントである)、を含む方法が含まれるレスキュースクリーニングを提供する。
(i)少なくとも1つの酵母細胞を培養するステップであって、このとき酵母細胞が、
a)第1のペプチドまたは転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインへ結合したそのセグメントを含む第1の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
b)第2のペプチドまたは転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインへ結合したそのセグメントを含む第2の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
(このとき第1のペプチドまたはそのセグメントおよび第2のペプチドまたはそのセグメントの結合は転写活性化タンパク質を再構成する)、
c)再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントであって、該レポーターエレメントの発現が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントと、を含むステップと、
(ii)選択された表現型を検出するために適した条件下で1つの化合物を酵母細胞と一緒に培養するステップと、
(iii)該化合物が選択された表現型が現れるのを防止するレポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって該化合物がペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと、
(このとき前記第1のペプチドはDkk相互作用もしくはDkk−1相互作用タンパク質ペプチドであり、第2のペプチドはDkkもしくはDkk−1ペプチドである)、
を含む方法が含まれるレスキュースクリーニングを提供する。
a)1つの化合物の存在下および不在下において1つ以上のDkk相互作用タンパク質、またはそのDkk結合フラグメントと、DkkまたはそのLRP5/LRP6/HBM結合フラグメントとの結合に及ぼす影響を測定するステップと、
b)1つ以上のDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントとDkkまたはそのLRP5/LRP6/HBMフラグメントとの間の結合を変調する化合物を潜在的Dkkを変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法を提供する。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(a)DkkをコードするmRNAおよび1種の物質をアフリカツメガエル(Xenopus)割球内へ注入するステップと、
(b)体軸重複を評価する、またはマーカー遺伝子発現を解析するステップと;および
(c)体軸重複またはマーカー遺伝子発現における変化を引き出す物質を、DkkとWntシグナル伝達経路との相互作用を変調する物質であると同定するステップと
を含む方法を提供する。このとき該物質は特にDkk相互作用タンパク質をコードするmRNA、そのフラグメント、siRNA、shRNA、アンチセンスヌクレオチド、および抗体から選択することができる。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。また別の実施形態では、HBM、LRP5/6、いずれかのWnt(Wnt1〜Wnt19、特にWnt1、Wnt3、Wnt3a、およびWnt10bを含む)、Wntアンタゴニスト、またはこれらの組み合わせのmRNAがアフリカツメガエル割球内に共注入される。また別の実施形態では、解析されるマーカー遺伝子はSiamois、Xnr3、slug、Xbra、HNK−1、endodermin、Xlhbox8、BMP2、BMP4、XLRP6、EF−1またはODCを含むことができよう。
(a)Dkkおよび潜在的Dkk相互作用タンパク質をコードする構築物、そのmRNAフラグメント、siRNA、shRNA、もしくはアンチセンス、をLRP5/HBM/LRP6/Dkk/Dkk相互作用タンパク質に対する抗体を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
(b)Wnt反応性プロモーターへ連結したレポーター遺伝子の発現における変化を評価するステップと、
(c)Dkk構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかのタンパク質をDkk相互作用タンパク質であると同定するステップと
を含む方法を提供する。また別の好ましい実施形態では、該細胞はHOB−03−CE6、HEK293、またはU2OS細胞であってよい。
(a)LRP5/LRP6/HBMを固体表面へ固定化するステップと、
(b)分泌Dkkタンパク質もしくは分泌エピトープタグDkkおよび試験化合物を用いて固体表面を処理するステップと、
(c)Dkkもしくはエピトープタグに対する抗体を使用して、またはエピトープタグの活性を直接に測定するステップによって、該化合物がDkkとLRP5/LRP6/HBMとの間の結合を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。
(a)第1蛍光タグを使用してLRP5、LRP6、もしくはHBM蛍光融合タンパク質を作製するステップと、
(b)第2蛍光タグを含むDkk融合タンパク質を作製するステップと、
(c)試験化合物を添加するステップと、
(d)蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)または生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)を使用して該化合物がDkkとLRP5/LRP6/HBMの相互作用を変調するかどうかを決定するために蛍光タグ放出の比率における変化を評価するステップと
を含む方法を提供する。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(a)DkkとLRP5、LRP6、もしくはHBM、またはLRP5、LRP6、もしくはHBMのDkk結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと;および
(b)前記化合物がDkkとLRP5、LRP6、もしくはHBM、またはLRP5、LRP6、もしくはHBMのDkk結合フラグメントへ結合したかどうかを決定し、そして前記化合物がDkkとLRP5、LRP6、もしくはHBMとの相互作用を変調するかどうかを決定するステップと、を含む方法を提供する。
(a)LRP5/LRP6/HBMを固体表面へ不動化するステップと、
(b)分泌Dkkタンパク質もしくは分泌エピトープタグDkkおよび試験化合物を用いて固体表面を処理するステップと、
(c)Dkkに対する抗体もしくはエピトープタグを使用して、または1つのエピトープタグの活性を直接的に測定することによって該化合物がDkkとLRP5/LRP6/HBM相互との結合を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。1つの好ましい実施形態では、該エピトープタグはアルカリホスファターゼ、ヒスチジン、mycまたはV5タグである。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
(a)DkkおよびWntタンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
(b)Wnt反応性プロモーターへ連結したレポーターエレメントの発現における変化を評価するステップと、
(c)Dkk構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかの化合物をDkk/Wnt相互作用を変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法を提供する。
(a)(1)調節可能な1つ以上のDkk遺伝子、(2)Dkk遺伝子のノックアウト、もしくは(3)1つ以上のDkk遺伝子のノックインを有する1群のトランスジェニック動物を提供するステップと、
(b)ステップ(a)におけるトランスジェニック動物群に対して各々第2群のコントロール動物を提供するステップと、
(c)骨量または脂質濃度を変調する潜在的Dkkを変調する化合物へトランスジェニック動物群およびコントロール動物群を曝露させるステップと、
(d)トランスジェニック動物とコントロール動物群とを比較し、そしてコントロール動物群とを比較してトランスジェニック動物における骨量または脂質濃度に該化合物が及ぼす作用を決定するステップと
を含む方法を提供する。1つの好ましい実施形態では、DkkはDkk−1である。
一般に、本出願における用語は、それらの用語が当分野で理解されている方法に一致して使用した。明細書およびクレームを理解する際に役立つように、以下の定義を提供する。
LRP5(Zmax)内の多型でHBMと指名されたG171Vは、これによりそれらの全体が参照することにより本明細書組み込まれる同時継続出願の国際特許出願第PCT/US 00/16951号、および米国特許出願第09/543,771号および第09/544,398号に記載されている関連被検対象の集団中で高骨量表現型を与えると同定されている(Littleら,Am J Hum Genet.70:11−19(2002))。LRP5はさらにまた、その全体が参照することにより本明細書組み込まれる国際公開第WO98/46743号にも記載されている。LRP5機能の消失は、骨に有害な作用を及ぼすことが証明されている(Gongら,Cell 107:513−523(2001))。さらに、HBM多型およびLRP5はまた心臓の健康および脂質媒介性障害において重要な可能性がある。したがって、それらの活性を変調する方法は心臓障害および脂質関連性障害を治療および/または防止する方法として機能することができる。
本発明に使用することが意図されるポリペプチドには、DkkおよびDkk相互作用タンパク質活性を変調するものが含まれる。好ましいポリペプチドおよびペプチドには、Wnt経路を変調するものが含まれる。好ましい配列の例には、図2に例示したY2Hベイト配列、図3(配列番号171〜188)および図4(配列番号189〜192)のペプチドアプタマー、図5に同定したDkk−1相互作用タンパク質のポリペプチド、図6に示したようなポリペプチド、DkkのLRP結合ドメイン(hDkk1のアミノ酸138〜266)、システインリッチドメイン2(a.a.hDkkのアミノ酸183〜245)、システインリッチドメイン1(a.a.hDkkのアミノ酸97〜138)、および図13(配列番号204〜213を含む)のLRP5結合アプタマーが含まれる。Dkk−1を例示したが、その他のDkkタンパク質も実質的に類似の領域を含有しており、同様に本発明にしたがって使用することができる。
本発明はさらにまた、Dkk、特にDkk−1、およびLRP5ペプチドアプタマーの模倣物を提供する。そのようなアプタマーは、化学者にとって該アプタマーの模倣物化合物を構成するための有用な構造的ガイドである。該アプタマーおよびそれらの模倣物はLRP−もしくはDkk−媒介性の疾患および状態を治療するための治療薬として有用である。
本発明はさらにまた、DkkおよびDkk相互作用タンパク質、および/またはLRP5(さらにLRP6およびHBM)の生物学的活性を変調するためにこれらのタンパク質と相互作用するポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸分子を提供する。好ましい実施形態は、好ましくは単離形または精製形にある図7の核酸、図5に列挙したDkk−1相互作用タンパク質、Dkk−1のポリペプチドアプタマー(図3−配列番号171〜188)、LRP5(図4−配列番号189〜192)、図12のポリヌクレオチド(配列番号193〜203)によってコードされた図13のペプチドアプタマー(配列番号204〜214を含む)、LRP6およびHBM、および本明細書記載した関連融合タンパク質を含むDkk−1タンパク質のフラグメントをコードする核酸を提供する。ここで使用する「核酸」は上記のようなペプチドをコードする、またはこのようなペプチドをコードする核酸配列に相補的である、または該核酸のセンスもしくはアンチセンス鎖のいずれかへハイブリダイズして適切なストリンジェンシー条件下でそれに安定性で結合し続けるRNA、DNA、またはcDNAであると定義されている。該核酸は、該ペプチド配列と少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、およびより好ましくは少なくとも約85%の配列同一性を共有するポリペプチドをコードしていてよい;少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、および99%以上もまた想定されている。特に想定されているのはゲノムDNA、cDNA、mRNA、アンチセンス分子、酵素的に活性な核酸(例えば、リボザイム)、ならびに代替バックボーンに基づく核酸である、または天然原由来であろうと合成されたものであろうと選択的塩基を含んでいる。しかしこのようなハイブリダイジングもしくは相補的核酸は、さらにコードして適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、または本発明に従ったタンパク質をコードする核酸に対して相補的であるものを含むあらゆる先行技術核酸に照らして新規かつ非自明であると定義されている。
Dkkの核酸分子を同定できれば、当業者はDkkファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することができる(Krupnikら,1999を参照)。さらに、本明細書開示した核酸分子を使用すると、当業者はDkk−1に加えてDkk−1様タンパク質をコードする核酸分子を単離することができる。本明細書開示したDkk相互作用タンパク質およびそれらの対応する核酸分子を使用すると、当業者はさらにDkk−1と相互作用する他の関連タンパク質ファミリーメンバーを単離することができる。
本発明は、さらにまたポリペプチドコーディング配列を含有する組換えDNA分子(rDNA)を提供する。ここで使用するrDNA分子はインサイチュで分子操作を受けているDNA分子である。rDNA分子を作製する方法は当分野においてよく知られているが、例えばSambrookら,「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989)を参照。好ましいrDNA分子では、コードするDNA配列は発現制御配列および/またはベクター配列へ機能的に連結されている。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。本発明のタンパク質の発現のために有用である真核細胞は、該細胞系が細胞培養法と適合し、発現ベクターの伝播および遺伝子産物の発現と適合する限り、限定されない。好ましい真核宿主細胞には酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル、もしくはヒト細胞系からのような脊椎動物細胞が含まれるがそれらに限定されず、さらに例えば軟骨を備える無脊椎動物からの細胞を含むこともできる。好ましい真核宿主細胞にはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(ATCCアクセッション番号CCL61)、NIHスイスマウス胚細胞NIH/3T3(ATCC番号CRL1658)、ベビーハムスター腎細胞(BHK)、HOB−03−CE6骨芽細胞およびその他の真核組織様培養細胞系が含まれるが、それらに限定されない。
本発明はさらにまた、Dkkタンパク質およびそのポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子、ならびにDkk(例えば、LRP5、LRP6およびHBM、図5のタンパク質のようなDkk相互作用タンパク質)および分子アナログに結合するタンパク質およびポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドには全長Dkkおよびそのポリペプチドフラグメント、Dkk結合タンパク質およびそのポリペプチドが含まれる。好ましくは、これらのタンパク質は哺乳動物タンパク質であり、最も好ましくはヒトタンパク質およびその生物学的に活性なフラグメントである。また別の実施形態には共通ポリペプチド配列からの少なくとも約3、5、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、または200アミノ酸残基の連続アミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子;アミノ酸残基が該ポリペプチド配列またはそのフラグメントのN末端もしくはC末端へ、またはその中に挿入されている共通ポリペプチド配列のアミノ酸配列変異体;および他の保存残基によって置換されている共通ポリペプチド配列またはそのフラグメントのアミノ酸配列変異体が含まれる。ポリペプチドをコードする組換え核酸分子には、例えば相同的組換え、部位特異的もしくはPCR突然変異誘発による所定の突然変異を含有するもの、および脊椎動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ラクダ、爬虫類、ヤギ、鳥類、魚類、ウシ、ヒツジ、ウマおよび非ヒト霊長類種)ならびに無脊椎動物を含むがそれらに限定されない他の動物種の組換えDkkタンパク質もしくはポリペプチドフラグメント、および上記の種およびヒト配列のDkk結合タンパク質の対立遺伝子または他の天然型変異体およびホモログが含まれる。ここで同様に想定されるのは一般に知られているDkk、Dkk相互作用タンパク質、もしくはそれらのフラグメントの誘導体であるが、このときDkk、Dkk相互作用タンパク質、もしくはそれらのフラグメントは置換、化学的、酵素的、またはその他の適切な手段によって天然型アミノ酸以外の成分(例えば、酵素もしくはラジオアイソトープのような検出可能な成分)およびDkkの可溶形を用いて共有的に修飾されている。さらにまた、本発明が内因性配列にハイブリダイズし、そしてそれでも同一ポリペプチドをコードするサイレント突然変異を含む核酸を含むことも想定されている。
本発明のまた別の実施形態は、DkkもしくはDkk相互作用タンパク質の結合パートナーを単離および同定する際に使用する方法を提供する。DkkもしくはDkk相互作用タンパク質またはそのポリペプチドフラグメントは、潜在的結合パートナーとDkkもしくはDkk相互作用タンパク質との結び付きを許容する条件下で潜在的結合パートナーまたは細胞の抽出液もしくは分画と混合することができる。混合後、DkkもしくはDkk相互作用タンパク質と結び付いたペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその他の分子は該混合物から分離される。該ポリペプチドに結合した結合パートナーはその後、精製してさらに分析することができる。DkkおよびDkk相互作用タンパク質の結合パートナーならびにDkkとその相互作用タンパク質の1つ(例えば、LRP5、LRP6、HBM、または図5に列挙したタンパク質)との相互作用を防止する物質の決定は、当分野において知られているような多数の様々な競合アッセイを使用して実施できる。例えば、本明細書記載したようなDkkの最小配列を使用するとDkk−1との結合およびその逆についてLRP5(またはLRP6、HBM、またはその他のリガンド結合パートナー)と競合する抗体を同定することができる。最小Dkk配列は96ウェルプレート(またはその他の固体基質)の底部に結合することができ、そして抗体または他の潜在的結合物質(例えば、ポリペプチド、模倣物、ホモログ、抗体フラグメント等)を競合アッセイにおいてスクリーニングして例えばDkkの天然リガンド結合パートナーよりも大きい結合親和性を備える物質を同定することができる。
レポーター遺伝子活性によって可視化されるような他のWnt反応性転写因子、LEFの変調。1つの例には、ルシフェラーゼレポーター遺伝子へ融合したLEF1プロモーター領域の活性化が含まれる(Hsuら,Mol.Cell.Biol.18:4807−18(1999))。
細胞増殖、細胞周期もしくはアポトーシスにおける変化。Shimizuら,Cell.Growth Differ.8:1349−58(1997)を含むWnt媒介性細胞形質転換を記載した多数の例がある。
Wnt活性化のインジケーターとしての脱リン酸化β−カテニンの安定化および細胞局在化(Shimizuら,1997)。
本発明のまた別の実施形態はDkkをコードする核酸の発現を変調する物質を同定する方法を提供する。このようなアッセイは、本発明の核酸の発現レベルにおける変化を監視するために利用できるあらゆる手段を利用できる。ここで使用する物質は、細胞中での核酸の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる場合は、Dkkの発現を変調すると言われる(例えば、mRNA)。
本発明のまた別の実施形態は、Dkk、Dkk相互作用タンパク質、および/またはLRP5/LRP6/HBMタンパク質の少なくとも1つの活性を変調する物質を同定する、または好ましくはDkk/Dkk相互作用タンパク質複合体もしくはLRP5(またはLRP6/HBM)/Dkk複合体、またはDkkの生物学的に活性なフラグメント(例えば、LRP5/LRP6/HBMに結合するドメインを含んでいる)またはDkk相互作用タンパク質複合体の1つの活性を特異的に変調する物質を同定する方法を提供する。このような方法またはアッセイは当分野で知られているような所望の活性を監視または検出するあらゆる手段を利用できる(例えば、Wuら,Curr.Biol.10:1611−4(2000);Fediら,J.Biol.Chem.274:19465−72(1991);Grotewoldら,Mech.Dev.89:151−3(1999);Shibataら,Mech.Dev.96:243−6(2000);Wangら,Oncogene 19:1843−8(2000);およびGlinkaら,Nature 391:357−62(1998)を参照されたい)。Dkkを変調する可能性がある物質には、例えばDkk−1を誘導できる癌抑制タンパク質であるp53が含まれる。DNAの損傷もまたp53の安定化および活性化を介してDkk−1発現をアップレギュレートすることが観察されている(Wangら,Oncogene 19:1843−48(2000));およびShouら,Oncogene 21:878−89(2002))。さらにFediら(1999)は、Dkk−1がNIH−3T3細胞のWnt2−誘導発癌性形質転換を遮断できることを証明したと言われている。さらにその上、Dkk発現を発達中の骨格においてBMPシグナル伝達により変調できることが示唆されている(Mukhopadhyayら,Dev.Cell.1:423−34(2001);およびGrotewoldら,EMBO J.21:966−75(2002))。Grotewoldらはさらに、UV照射およびその他の遺伝毒性刺激を含むストレスシグナルに反応して変化したDkk発現レベルについて述べている。彼らは、Dkk発現が前アポトーシス性であると提案している。高骨量を付与するHBM構築物を発現する動物においては、骨芽細胞アポトーシス作用の低下が観察された。そこでHBMおよびHBM様変異体はプログラムされた細胞死におけるDkkの役割を制御/変化させる可能性がある。Dkk活性を変調する可能性がある他の物質には、図5に同定されたDkk相互作用タンパク質が含まれる。
DkkまたはLRP5/LRP6/HBMに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにこれらの抗体のフラグメントは、当分野においてよく知られているように作製できる。例えば、適切な宿主動物は適切な免疫プロトコールおよび本発明のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を使用して免役することができる。免疫に使用するためのペプチドは、典型的には約8〜40残基長である。必要または所望であれば、ポリペプチド免疫原を適切な担体へ抱合させることができる。ウシ血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)のような担体、またはその他の担体タンパク質を用いて免疫原性抱合体を作製する方法は当分野においてよく知られている(Harlowら,1988を参照)。一部の状況では、例えばカルボジミド試薬を使用した直接抱合が有効なことがある;他の例では、Pierce Chemical Co.,ロックフォード、ILによって供給されるもののような連結試薬が該ポリペプチドもしくはハプテンへの接近可能性を提供するために望ましいことがある。ハプテンペプチドは、例えば担体への連結を促進するためにシステイン残基を含むアミノもしくはカルボキシ末端のどちらかで伸長させることができる、またはシステイン残基を割り込ませることができる。免疫原の投与は一般に、当分野において一般に理解されているように、概して適切な時間に渡る注入および適切なアジュバントを使用して実施される。免疫スケジュール中には、抗体形成の妥当性を決定するために抗体の力価が取得される。
これらの方法によってアッセイできる物質は、無作為に選択でき、または合理的に選択もしくは構成できる。ここで使用するように、1つの物質が、該物質がDkk−1単独、Dkk−1相互作用タンパク質単独の関連に含まれる特異的配列を考慮に入れずに、またはそれらの関連基質、結合パートナー等を用いて無作為に選択される場合は、無作為に選択されると言われる。無作為に選択された物質の例は、化学ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリーの使用、または生物の成長用ブロスの使用である。
本発明のペプチド物質は、当分野で知られているような標準固相(もしくは液相)ペプチド合成法を使用して作製できる。さらに、これらのペプチドをコードするDNAは市販で入手できるオリゴヌクレオチド合成用機器を使用して合成でき、標準組換え製造システムを使用して組換え的に製造できる。非核酸コード化アミノ酸を含めなければならない場合には、固相ペプチド合成法を使用したポリペプチドの製造が不可避である。
LRP5、Dkk、およびDkk相互作用タンパク質のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはポリペプチドのような本発明のタンパク質および核酸は、他のWnt経路媒介性活性の骨量変調および脂質変調に関係している。DkkもしくはDkk相互作用タンパク質、または例えばDkkもしくはDkk相互作用タンパク質の少なくとも1つの活性の各々アゴニストおよびアンタゴニストのような物質の発現を変調(すなわち、アップレギュレートおよびダウンレギュレート)する物質を使用すると、DkkもしくはDkk相互作用タンパク質の機能および活性と関連する生物学的および病理学的プロセスを変調することができる。
Dkkおよび/またはLRP5もしくはLRP6および/または例えば図5に示したもののようなDkk相互作用タンパク質を条件付きで発現するトランスジェニック動物モデルを作製することができる。これらの動物は、Dkk−1/Dkk−1相互作用タンパク質の相互作用および/またはLRP5/Dkk相互作用の生理学的作用について試験するための研究用ツールとして使用できる。あるいはまた、Dkk単独のまたはHBMのトランスジェニック形に加えてトランスジェニック形を発現する、またはDkk相互作用タンパク質単独のもしくはDkkのトランスジェニック形に加えて発現するトランスジェニック動物を作製することができる。HBMもしくはLRP5を発現するトランスジェニック動物をDkkもしくはDkk相互作用タンパク質を発現するトランスジェニック動物と交配させると、両方の所望の遺伝子を発現するヘテロ接合体ならびにホモ接合体動物を得ることができる。
また別の実施態様は、Dkkと相互作用する、LRP5もしくはLRP6との相互作用からDkkを遮断する、またはいずれか他のDkkリガンド相互作用を遮断する、または例えば図5に示したもののようなDkk相互作用タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングするためのペプチドおよびヌクレオチドアプタマーテクノロジーの使用を想定している。ペプチドアプタマーは、その中で可変ペプチドドメインが足場タンパク質から表示される分子である。チオレドキシンA(trxA)は、一般にスカフォールドのために使用される。ペプチド挿入断片はtrxAの触媒部位を破壊する。ペプチドアプタマーを拘束および/または提示する足場タンパク質として多数のタンパク質も使用できることは認識されている。拘束されたペプチドアプタマーを表示できた他の足場タンパク質にはスタフィロコッカスヌクレアーゼ、プロテアーゼインヒビターのエグリンC、Streptomyces tendeaアルファアミラーゼインヒビターのTendamistat、Sp1、および緑色蛍光タンパク質(GFP)(Hoppe−Seylerら,J.Steroid Biochem Mol.Biol.78:105−11(2001)において検討された)、およびファージ表示のためのスタフィロコッカスもしくはM13からのS1ヌクレアーゼが含まれよう。アプタマーを固定させてその生体活性形態で提示できるあらゆる分子が適切であろう。
LRP5/Zmax1第1βプロペラモジュールの構造モデルはSpringerら(1998),J.Molecular Biology,283:837−862におけるモデル予測に基づいて生成された。該モデルに基づいて、一定のアミノ酸残基がLRP5/HBM/Zmax1の重要な変異体であると同定された。以下の3つのカテゴリーはそのような変異体の例を提供する。
A214V(ブレード5内の171に等価の位置;アラニンは他のプロペラでは保存されていない)、
E128V(ブレード3内の171に等価の位置;グルタミン酸塩は他のプロペラでは保存されていない)、
A65V(ブレード2内の171に等価の位置;アラニンはプロペラ1〜3では保存されているが、4では保存されていない)、
G199V(ブレード5内の接近可能な内側位置;グリシンはプロペラ1〜3では保存されているが、4では保存されていない)、および
M282V(ブレード1内の接近可能な内側位置;メチオニンはプロペラ1〜3では保存されているが、4では保存されていない)。
G171K(荷電側鎖を導入する)、
G171F(環状側鎖を導入する)、
G171I(分岐状側鎖を導入する)、および
G171Q(プロペラ4残基を導入する)。
2ハイブリッド系は、タンパク質:タンパク質相互作用を試験するために極めて有用である。例えばChienら,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88:9578−82(1991);Fieldsら,Trends Genetics 10:286−92(1994);Harperら,Cell 75:805−16(1993);Vojtekら,Cell 74:205−14(1993);Lubanら,Cell 73:1067−78(1993);Liら,FASEB J.7:957−63(1993);Zangら,Nature 364:308−13(1993);Golemisら,Mol.Cell.Biol.12:3006−14(1992);Satoら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9238−42(1994);Coghlanら,Science 267:108−111(1995);Kalpanaら,Science 266:2002−6(1994);Helpsら,FEBS Lett.340:93−8(1994);Yeungら,Genes&Devel.8:2087−9(1994);Durfeeら,Genes&Devel.7:555−569(1993);Paetkauら,Genes&Devel.8:2035−45);Spaargarenら,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:12609−13(1994);Yeら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:12629−33(1994);および米国特許第5,989,808号;第6,251,602号;および第6,284,519号を参照されたい。
本発明を、例示するために提供されており、いかなる意味でも本発明を限定することは意図されていない以下の実施例を参照しながら説明する。当分野でよく知られている標準的技術または下記に詳細に説明する技術を利用した。
ヒト骨芽細胞ライブラリー(すなわち、HOB03C5、Bodine and Komm,Bone 25:535−43(1999))によって記載されているようなヒト骨芽細胞系からのカスタムGibco生成Y2H適合cDNAライブラリー)に対するスクリーニングにおいて、Dkk−1との相互作用を同定した。このスクリーニングのために使用したLRP5リガンド結合ドメイン(LBD)ベイトを図2BおよびCに示した。基本プロトコールは以下の通りである:
関心ベイトを含有する酵母株のオーバーナイト培養は、30℃で2%グルコースを含有する適切な選択培地20mL中で増殖させる。このオーバーナイト培養は40mg/Lのアデニンを補給したYPDmedia内へ倍率10倍に希釈し、30℃で4時間増殖させる。
相互作用選択(大きな正方形の)プレートからの酵母コロニーは無菌爪楊枝を用いて採集し、適切な選択培地を含有するプレート上にパッチし、30℃で2日間培養する。
96ウェルプレートからの10μL(上記から取り置いた)は、100μL SDおよび2%グルコース培地を含有する別の96ウェルプレート内に移す。細胞密度は分光光度計を使用してOD600で測定すると、OD600は通常は0.03〜0.1である。50μLのガラクトシダーゼ反応混合液(Tropix)は照度計(Hewlett Packard Lumicount)のために特別構成されたマイクロプレート(Marsh社)へ添加する。その後50μLの希釈細胞を添加し、ピペッティングにより混合する。この反応液を室温で60〜120分間培養する。相対光度単位(RLUs)は照度計によって読み取る。各プレートは、関心ベイトおよび空プレイベクターを含有する二倍体酵母によって構成されたネガティブコントロールを含有する。陽性とスコア付けされるためには、試験された二倍体はネガティブコントロールの少なくとも2倍の高さのRLU数を有していなければならない。
酵母2ハイブリッド(Y2H)相互作用タンパク質のまた別の解析には、相互作用の原因となるタンパク質モチーフの解離が含まれる。Y2Hスクリーニングにおいて同定された複数のクローンの配列アライメントは、この相互作用の原因となる最小共通領域を同定するのに役立つことができる。適切なクローンが欠如している場合は、相互作用ドメインの欠失マッピングが必要である。
最小相互作用ドメイン:プライマーは、プールされたZmax1/LRP5リガンド結合ドメイン(LBD)ベイト:LBD1(Leu969−Pro1376)およびLBD4(Arg1070−Pro1376)を用いて一次骨芽細胞株(HOB03C5)ライブラリーをスクリーニングすることによって単離されたDkk−1クローンのPCRのために構成された。5’〜3’方向に与えられるプライマーは次の通りであった。
最小相互作用ドメイン:図6は、D4、D5、D8、D9およびD12の二倍体中で増殖が観察されたが、D3、D11およびD12のハイブリッドでは増殖が観察されなかったことを示している。カルボキシ末端(C−末端)欠失は、可能性のあるN−グリコシル化部位(Arg246−His266)を含有するDkk−1のC−末端アミノ酸はZmax1/LRP5 LBDベイトとの相互作用のためには必要ではないが、Cys2ドメイン、Gly183−Cys245は必要とされることを示す。N末端欠失はさらにまた、2つのシステインドメイン間の領域、すなわちVal139〜Lys182もまた必要であることも証明した。2つの最小相互作用ドメイン構築物が単離された:D12(Val139−His266)およびD8(Cys97−Cys245)。Dkk−1相互作用物質に対して類似の構築物を作製できよう。
[ペプチドアプタマーライブラリーの構築]
古典的酵母2ハイブリッド(Y2H)アッセイを使用して関心タンパク質標的(もしくはベイト)へ結合するキメラタンパク質を同定するための手段を提供するペプチドアプタマーライブラリーであるTpepを構築した。該Tpepライブラリーは、大腸菌チオレドキシン(trxA)のジスルフィドループの状況内でS.セレヴィシエGal4活性化ドメインへのC末端融合として発現した拘束されたランダムペプチドから構成されるコンビナトリアルアプタマーライブラリーである。TpepライブラリーはtrxA足場タンパク質を含有する制限酵素修飾組換えY2HプレイベクターであるpPC86(Gibco社)を使用して生成した。
アプタマーコード配列は以下の通り生成した。適切な制限酵素認識部位によって取り囲まれた適切な16アミノ酸のDNAをコードするランダム伸長はセミランダムオリゴヌクレオチド合成法によって生成した。合成オリゴヌクレオチドはPCR増幅し、制限消化し、trxA足場タンパク質内の許容部位内へクローン化した。クローニング戦術は、ランダムオリゴヌクレオチド配列が足場タンパク質コード配列とインフレームとなるように挿入し、足場タンパク質−アプタマーキメラの発現を生じさせることであった。足場タンパク質はそれ自体が、標準のY2Hアッセイにおいてアプタマーが発現して機能的となるのに適切なpPC86ベクター内で、Gal4の活性化ドメインとインフレームである。アプタマーを作製するためのまた別の方法は当業者には明白であろう。
第1に、pPC86のGal4(Gibco社)の活性化ドメイン内に位置するRsrII制限酵素認識部位を部位特異的突然変異誘発(Quickchange(商標)キット、Stratagene社)によって排除した。Gal4の活性化ドメインのアミノ酸配列はこの修飾によって変化しなかった。相違する制御相互作用の強度はこの修飾によって変化していないことが検証された。
Dkk−1相互作用タンパク質を同定するために酵母2ハイブリッドスクリーニングにおいてDkk−1ベイト配列を利用した。Y2Hについての方法は、LRPベイトの代わりに図2CからのDkk−1ベイトを使用したこと以外は実施例1で使用した方法と同様に実施した。スクリーニングはHelaおよび胎児脳ライブラリー(Infitrogen Corporation社、カールズバッド、CA)を使用して実施した。多数のライブラリーを使用して追加のDkk−1相互作用タンパク質を同定し、その他のライブラリーで見いだされた相互作用を確証した。
以下の抗体生成実施例の各々では、これらの線状ペプチドの合成に続いて2匹のニュージーランドウサギ内への注入が行われる。引き続いてのブーストおよびブリードは標準10週間プロトコールにしたがって行われる。エンドユーザーは5mgのペプチド、ブリード前のアリコート、2匹のウサギ各々からのほぼ80mLの粗血清を受け取り、ELISA滴定データを入手する。
HBM多型対野生型LRP/Zmaxを区別する抗体を入手するために次のペプチドに対する抗体を生成した:MYWTDWVETPRIE(配列番号123)(突然変異体ペプチド)およびMYWTDWGETPRIE(配列番号124)(陰性選択のための野生型ペプチド)。免疫蛍光試験データは、親和性精製後の抗体がHBMには特異的であるがLRP5を認識しないことを確証した(図17)。
LRP5単一特異的ポリクローナル抗体を以下のLRP5のアミノ酸配列に対して生成した:ペプチド1(a.a.265−277)−KRTGGKRKEILSA(配列番号125)、ペプチド2(a.a.1178−1194)−ERVEKTTGDKRTRIQGR(配列番号126)、およびペプチド3(a.a.1352−1375)−KQQCDSFPDCIDGSDE(配列番号127)。免疫蛍光により生成したこれらの抗体がLRP5を検出することを確証した。
Dkk−1単一特異的ポリクローナル抗体を以下のDkk−1のアミノ酸配列に対して生成した:ヒトDkk−1のペプチド1(a.a.71−85)−GNKYQTIDNYQPYPC(配列番号118)、ペプチド2(a.a.165−186)−LDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEG(配列番号119)、ペプチド3(a.a.246−266)−RIQKDHHQASNSSRLHTCQRH(配列番号120)、ペプチド4(a.a.147−161)−RGEIEETITESFGND(配列番号121)、およびペプチド5(232−250)−EIFQRCYCGEGLSCRIQKD(配列番号122)。図26は、選択した様々なペプチドの位置、それらとDkk−1アミノ酸配列および生成したポリクローナル抗体との関係を示している。
アフリカツメガエル胚は、Wntシグナル伝達の変調を評価するために情報を提供する明確に確立されたインビボアッセイ系である(McMahonら,Cell 58:1075−84(1989);Smith and Harland,1991;Wodarz and Nusse 1998における検討)。
ベクターpCS2+を使用して構築物を作製した。DNA挿入断片はベクターSP6プロモーターに対してセンス方向にサブクローニングした。pCS2+ベクターはSV40ウイルスポリアデニル化シグナルおよび該挿入断片の下流のT3プロモーター配列(アンチセンスmRNAを生成するため)を含有している。
アフリカツメガエル胚内へ顕微注入するためのmRNAは、テンプレートとして上記のpCS2+ベクター内のcDNA構築物を使用してインビトロ転写によって生成した。RNAはSp6ポリメラーゼ反応のためのAmbion mMessage mMachine high yield capped RNA転写キット(製品番号1340)を使用して製造業者の取扱説明書にしたがって合成した。RNA産物は無菌ガラス蒸留水中で最終量を50μLとし、製造業者の取扱説明書にしたがって放射標識RNA精製G50−SephadexのためのQuick Spin Column(Roche社、製品番号1274015)に通して精製した。生じた溶出液を最終的にフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを用いて抽出し、標準プロトコール(Sambrookら,1989)を使用してイソプロパノール沈降させた。最終RNA量は約50μLであった。RNA濃度は260nmおよび280nmでの吸光度値によって決定した。RNA完全性は変性(ホルムアルデヒド)アガロースゲル電気泳動法の臭化エチジウム染色によって可視化した(Sambrookら,1989)。種々の量のRNA(2pg〜1ng)を4細胞もしくは8細胞アフリカツメガエル胚の腹側割球内に注入した。これらのプロトコールは、Moonら,Technique−J.of Methods in Cell and Mol.Biol.1:76−89(1989)、およびPeng,Meth.Cell.Biol.36:657−62(1991)に記載されている。
インビトロ転写RNAを精製し、4細胞もしくは8細胞(受胎約2時間後)アフリカツメガエル胚の腹側割球内に注入した。ステージ10.5(受胎約11時間後)で、注入した胚を計72時間培養し、その後重複体軸(背側化)の存在についてスクリーニングした(図7)。ポジティブコントロール(Christianら,1991)としてのXWnt8注入(2〜10pg)胚およびネガティブコントロールとしての水注入または非注入胚を使用して、公表されているZmax(LRPt5)+Wnt5a(各々、500および20pg)が体軸重複を誘導できるという観察所見を複製した。Wnt5a(20pg)単独では体軸重複を誘導できなかった(以前にMoonら(1993)によって報告されたように)。さらにまた注入したRNAの量が胚発生を混乱させないことを証明するためにネガティブコントロールとしてGFP RNA(100〜770pg)も注入した(図示していない)。驚くべきことに、HBM+WNt5a(各々、500および20pg)はZmax/LRP5)+Wnt5aに比較してこの表現型の約3.5倍強力な反応を産生したが(フィッシャーの直接確率検定によりp=0.043)、これはHBM突然変異がWnt経路を活性化していることを示唆している(図8および9)。HBM/Wnt5a胚はさらにまたZmax(LRP5)/Wnt5a胚より「前方化」していると思われるが、これも同様に機能獲得性突然変異を示唆している。
Wnt活性は分泌Frizzled関連タンパク質(SFRPs)、Cerberus、Wnt阻害因子−1およびDkk−1を含む多数のタンパク質によって相殺され得る(Krupnikら,1999)。Dkkファミリーのタンパク質はDkk−1〜4およびSoggy、Dkk−3様タンパク質から構成される。Dkk−1およびDkk−4はWnt媒介性アフリカツメガエル胚発生を相殺するが、Dkk−2、Dkk−3およびSoggyは相殺しないことが証明されている。Wntタンパク質と直接相互作用することによってWnt活性を相殺するこれらのタンパク質の多数とは相違して、Dkk−1は近年同定された2つのWntコ受容体であるLRP5およびLRP6へ結合することによって機能する(Maoら,2001;Baficoら,2001)。この相互作用の詳細については、本発明者らおよびMaoらによって、LRP6の欠失構築物を使用して試験されており、これはEGFリピート3および4がDkk−1相互作用にとって重要であることを証明した。そこで、2つのDkkタンパク質、Dkk−1およびDkk−2の活性が種々のWntメンバーであるLRP5、LRP6、およびHBMと呼ばれるLRP5の突然変異体形を用いて試験された。本発明では、LRP5とHBMとの間でWnt媒介性シグナル伝達へのDkk作用に関して何らかの機能的相違が存在するかどうかについて探索する。HBM媒介性Wntシグナル伝達を模倣する因子を同定するために、Dkk−1ペプチド、拘束LRP5ペプチドアプタマー、拘束Dkk−1ペプチドアプタマーおよびDkk−1に対するポリクローナル抗体(上記実施例5中)を含む種々の試薬を開発した。
種々のLRP5拘束ペプチドを開発した。詳細には、LRP5のLBDと相互作用する4つのペプチド(図4、図12における構築物OST259〜262)およびLRP5の細胞形質ドメインと相互作用する3つのペプチド(図12における構築物OST266からOST268)である。さらに2つのDkk−1ペプチドを開発した:Dkk−1アミノ酸139〜266および96〜245に対応し、LRP5と相互作用するDkk−1の最小領域(図6)を含有する図12における構築物OST264およびOST265。LRP5 LBD相互作用タンパク質およびDkk−1ペプチドをコードするcDNAクローンを分泌についてペプチドを標的とするためにKozakおよびシグナル配列を添加してpcDNA3.1内へサブクローニングした。LRP5の細胞形質ドメインと相互作用する3つのペプチドをコードする構築物もまたpcDNA3.1内にサブクローニングした。しかしこれら後者の構築物はシグナル配列を含有していない。
これらの実験の結果は、Wnt1およびLRP5の存在下でDkk−1がTCF−ルシフェラーゼ活性を統計的有意に相殺したことを示している(図14)。これとは顕著に対照的に、Dkk−1はHBM/Wnt1媒介性TCF−ルシフェラーゼ活性には全く影響を及ぼさなかった(図14)。同様の実験で、Dkk−1はさらにLRP5/Wnt3aを相殺することはできたが、HBM/Wnt3a媒介性TCF−ルシフェラーゼ活性を相殺することはできなかった(図15)。これらの結果は、HBM突然変異がHOB03CE6骨芽細胞におけるWnt1およびWnt3aシグナル伝達のアンタゴニストとしてDkk−1を不活性にすることを指摘している。Wnt1を用いた他の実験では、Dkk−1はLRP5もしくはHBM媒介性TCF−ルシフェラーゼ活性に何の影響も及ぼさなかった(図14)。これとは対照的に、Wnt3aの存在下でLRP5もしくはHBMのどちらかを用いた場合、Dkk−2はTCF−ルシフェラーゼ活性を相殺することができた(図15)。これらの後者の結果は、HBM突然変異がWnt3aの存在下ではDkk−2の作用に影響を及ぼさないことを指摘している。さらにまたHOB−03−CE6細胞中の密接に関連するLRP6 cDNAを使用して実験を実施した。これらの実験では、LRP6/Wnt1およびLRP6/Wnt3a媒介性TCF−ルシフェラーゼはLRP5と同様の方法で調節された。詳細には、Dkk−1はLRP6/Wnt1媒介性TCF−ルシフェラーゼ活性を相殺したが、Dkk−2は作用を及ぼさなかった(図14)。しかし、Dkk−2とLRP5/Wnt3aとの作用と同様に、Dkk−2はLRP6/Wnt3a媒介性TCF−ルシフェラーゼ活性を相殺することができた(図15)。
Dkk−LRP相互作用の小分子インヒビター(もしくは部分的インヒビター)は、極めて素晴らしい骨形成性治療薬である可能性がある。この重要なタンパク質−タンパク質相互作用を調査するための1つの方法は、上記に説明し、当分野でよく知られているY2H技術を実質的に使用することである。例えばLRP5 LBDのようなLRP5の領域は、Dkkと機能的に相互作用することが見いだされている。この相互作用を、ベイトおよびプレイが相互作用する場合にのみ活性化される例えばlacZもしくはルシフェラーゼのような当分野でよく知られているレポーターエレメントを使用して定量した。Y2Hアッセイを使用して、LRP−Dkk相互作用を変調する化合物についてスクリーニングした。このような変調は、より弱いもしくは崩壊した相互作用を意味するレポーターエレメント活性化の減少、またはより強力な相互作用を意味するレポーターエレメント活性化の増強によって視認できるであろう。そこで、Y2Hアッセイを高スループット・スクリーニング技術として使用すると、Dkkと潜在的治療薬として機能する可能性があるLRP5/LRP6/HBMとの相互作用を破壊または増強する化合物を同定することができる。
高スループットアッセイを開発するために、U2OS細胞およびHEK293細胞中の外因性LRP5/6の低レベル発現を利用して実施例7に記載したTCF−ルシフェラーゼアッセイを修正した。しかし、HOB−03−CE6細胞および、LRP5、LRP6もしくはHBMが発現するかどうかに依存してDkkへの示差的反応を示す他のあらゆる細胞を使用できる。U2OS(ヒト肉芽腫)およびHEK293(ATCC)細胞を使用して、TCF−ルシフェラーゼおよびtk−Renillaレポーターエレメント構築物をWnt3a/1およびDkkと一緒に共トランスフェクトした。外因性LRP5/6を使用して、Wnt3a単独はTCFレポーター遺伝子活性化を刺激することができた。Wnt3a/Wnt1およびレポーター(TCF−luciおよびtk−Renilla)を用いてDkkを共トランスフェクトすると、Dkkはレポーターエレメント活性を抑制する。さらにWnt3a/Wnt1によって活性化されたTCF−luciシグナルはWnt3a/Wnt1およびレポーターを含有する細胞へDkk富裕馴化培地を添加することにより抑制できる。このアッセイは、さらにDkk1の点突然変異構築物(C220A)によってTCF−レポーター阻害の欠如によって妥当性が確認される。
LRPへのDkkの結合を調査するためのさらなる方法はELISAアッセイによるものである。このアッセイの可能性のある2つの順列を例示する。LRP5は組織培養プレートウェルのような固体表面に固定した。当業者であれば、例えばナイロンもしくはニトロセルロース膜、シリコーンチップ、ガラススライド、ビーズ等のような他の支持体を利用できることを認識するであろう。この実施例では、使用したLRP5の形状は実質的にLRP5の細胞外ドメインがヒトIgGのFc部分へ融合している融合タンパク質であった。LRP5−Fc融合タンパク質は安定細胞系からのCHO細胞抽出液中で生成した。LRP5−Fc融合タンパク質は抗ヒトFc抗体を介して、または例えばタンパク質Aもしくはタンパク質G被覆プレートによって固体表面上に固定化した。このプレートをその後洗浄して結合していないタンパク質を除去した。分泌Dkkタンパク質もしくは分泌Dkk−エピトープタグ付きタンパク質(または精製Dkkもしくは精製Dkk−エピトープタグ付きタンパク質)を含有する馴化培地をウェル内でインキュベートし、Dkkもしくはエピトープタグのどちらかに対する抗体を使用してLRPへのDkkの結合を調査した。DKk−V5エピトープタグ付きタンパク質は、アルカリホスファターゼタグ付き抗V5抗体を使用して検出されるであろう。
拘束ペプチドアプタマー構築物OST258〜263(258はシグナル配列を単独で含有し、263は無関係の拘束ペプチドを含有している)(図12および13)を使用して、制限エンドヌクレアーゼ消化によってベクターを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを使用してRNAを生成したこと以外は、実質的に実施例7に記載した通りにRNAを生成した。
タンパク質−タンパク質相互作用における摂動を調査するための極めて優れた方法は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)による方法である。FRETは、蛍光分子であるドナーが極めて近位にあるアクセプター発色団分子へエネルギーを転移させる量子力学的プロセスである。この系はLRP5とAxinとの分子間相互作用について特性解析するために文献で使用され成功が得られている(Maoら,Molec.Cell Biol.7:801−809)。このような試験では多数の異なる蛍光タグを利用することができ、関心タンパク質に蛍光標識するためには数種の方法がある。例えば、CFP(シアン蛍光タンパク質)およびYFP(黄色蛍光タンパク質)は各々がドナーおよびアクセプターとして使用できる。ドナーおよびアクセプターを備える融合タンパク質は、人工的に作製し、発現させ、そして精製することができる。
Claims (114)
- 被検対象におけるLRP5、LRP6またはHBM活性を調節する方法であって、LRP5、LRP6またはHBM活性を調節するための有効量でDkk活性を変調する組成物を投与するステップを含む方法。
- DkkがDkk−1である請求項1、24、28、33、36、37、48、64、65、93、98、101、105、107、111、または112のいずれかの方法。
- DkkがDkk−1であり、Dkk活性が阻害される請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- Dkk活性が骨量および/または脂質濃度を変調する請求項1または24の方法。
- 骨量を増加させる、および/または脂質濃度を低下させる請求項4の方法。
- 骨量における増加が骨折率の低下、骨強度の増加、骨密度の増加、骨塩密度の増加、骨梁連結性の増加、骨梁密度の増加、皮質骨密度の増加、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの1つ以上を介して決定される請求項5の方法。
- 前記組成物がDkk相互作用タンパク質、またはそのDkk結合フラグメントからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物が、1つ以上のDkk相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、siRNA、またはshRNA分子を含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkkペプチドアプタマーを含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkkペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkkのLRP5、LRP6、もしくはHBMへの結合を阻害する請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkkのLRP5、LRP6、もしくはHBMへの結合を増強する請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントのDkkへの結合を阻害する請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記組成物がDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントのDkkへの結合を増強する請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記被検対象が脊椎動物または無脊椎動物である請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記被検対象が哺乳動物である請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記被検対象が、イヌ、ネコ、ヒツジ、霊長類、ウマ、ブタ、ヤギ、ラクダ、鳥類、ウシ、または齧歯動物である請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記霊長類がヒトである請求項19の方法。
- 前記組成物がLRP5ペプチドアプタマーを含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 前記ペプチドアプタマーがOST262(配列番号208)である請求項21の方法。
- 前記組成物がLRP5抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントを含む請求項1、24、28、または33のいずれかの方法。
- 被検対象におけるDkk−Wnt経路活性を調節する方法であって、Dkk−Wnt経路活性を調節するための有効量でDkk活性を変調する組成物を投与するステップを含む方法。
- Wntが1つ以上のWnt1〜Wnt19である請求項24、101又は107の方法。
- WntがWnt1、Wnt3、Wnt3a又はWnt10bである請求項25の方法。
- Dkk活性を変調する、またはLRP5/LRP6/HBMとのDkk相互作用を変調する前記組成物がWntシグナル伝達を変調するための有効量で投与される請求項24の方法。
- 被検対象において骨量を変調する方法であって、前記被検対象における骨量を変調するための有効量でDkk活性またはLRP5、LRP6、もしくはHBMとのDkk相互作用を変調する組成物を前記被検対象に投与するステップを含む方法。
- 骨量を増加させる請求項28の方法。
- 骨量における増加が骨折率の低下、骨強度の増加、骨密度の増加、骨塩密度の増加、骨梁連結性の増加、骨梁密度の増加、皮質骨密度の増加、骨径の増加、および無機質骨含量の増加のうちの1つ以上を介して決定される請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被検対象が、骨の発達障害、骨折、年齢関連性骨量減少、軟骨形成異常、薬物誘発性骨障害、骨の高度の代謝回転、高カルシウム血症、骨化過剰症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨粗鬆症、ぺージェット病、変形性関節症、およびくる病からなる群から選択される骨量障害を有する請求項28ないし36の方法。
- LRP5、LRP6若しくはHBMとのDkk相互作用又はDkk活性を変調する前記組成物が骨梁および/または皮質組織の量を変調するための有効量で投与される請求項28の方法。
- 被検対象における脂質濃度を変調する方法であって、前記被検対象における脂質濃度を変調するための有効量でDkk活性またはLRP5、LRP6、もしくはHBMとのDkk相互作用を変調する組成物を前記被検対象に投与するステップを含む方法。
- 脂質濃度を低下させる請求項33の方法。
- 前記被検対象が脂質変調障害を有し、前記脂質変調障害が心臓状態、アテローム性動脈硬化症、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性アポタンパク質CII欠損症、家族性3型高リポタンパク血症、家族性高コレステロール血症、家族性高トリグリセリド血症、多種リポタンパク型高脂血症、透析および/または糖尿病を原因とする脂質濃度上昇、および病因不明の脂質濃度上昇からなる群から選択される請求項33又は36の方法。
- 被検対象における低骨量もしくは高骨量および/または高脂質もしくは低脂質濃度を診断する方法であって、前記被検対象が(a)高骨量もしくは低骨量および/または(b)高脂質もしくは低脂質濃度を有するかどうかを決定するために、前記被検対象におけるDkk、LRP5、LRP6、HBMおよび/またはHBM様変異体の発現を検査するステップと、Dkk、LRP5、LRP6、HBM、またはHBM様変異体が過剰もしくは過小発現しているかどうかを決定するステップとを含む方法。
- LRP5、LRP6もしくはHBMとDkkとの相互作用、またはLRP5、LRP6もしくはHBMのDkk結合フラグメントとDkkとの相互作用を変調する化合物をスクリーニングする方法であって
(a)DkkおよびそのLRP5、LRP6および/またはHBM結合フラグメントを化合物に曝露させるステップと、
(b)前記化合物がLRP5/LRP6/HBM結合フラグメントとのDkk相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法。 - 前記変調が、前記化合物がDkkまたはそのLRP5、LRP6もしくはHBM結合フラグメントに結合するかどうかによって決定される請求項37の方法。
- DkkまたはそのLRP結合フラグメントが基質に付着される請求項37の方法。
- 前記化合物がDkk相互作用タンパク質、またはそのDkk結合フラグメントからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む請求項37の方法。
- 前記化合物がDkkペプチドアプタマーを含む請求項37または48の方法。
- 前記化合物がDkkペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項37または48の方法。
- 前記化合物がDkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項37または48の方法。
- 前記化合物がLRP5ペプチドアプタマーを含む請求項37または48の方法。
- 前記ペプチドアプタマーがOST262(配列番号208)である請求項44の方法。
- 前記化合物がLRP5抗体を含む請求項37または48の方法。
- 前記化合物がDkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物である請求項37または48の方法。
- DkkとDkk相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントを1つの化合物に曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントに結合したかどうかを決定するステップと、
(c)前記化合物がDkk相互作用タンパク質とDkkとの相互作用を変調するかどうかをさらに決定するステップと
を含む方法。 - 前記Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントが基質に付着される請求項48の方法。
- LRP5、LRP6またはHBM活性変調化合物とそのための医薬上許容される担体とを含む組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM活性変調化合物が、Dkkに結合する化合物を含んでおり、それによりDkkとLRP5、LRP6、もしくはHBMとの相互作用を変調する請求項50の組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM変調化合物が、1つ以上のDkk相互作用タンパク質およびそのDkk結合フラグメントを含む請求項50の組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM変調化合物が、Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントに結合するモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントである請求項50の組成物。
- 前記モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Primatized(登録商標)抗体、または二重特異性抗体である請求項53の組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM変調化合物が、1つ以上のDkk相互作用タンパク質をコードする核酸を認識して結合するアンチセンス、siRNA、またはshRNA分子を含む請求項50の組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM変調化合物が、Dkkペプチドアプタマーを含む請求項50の組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM変調化合物が、Dkkペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項50の組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM変調化合物が、Dkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項50の組成物。
- 前記LRP5、LRP6またはHBM変調化合物が、Dkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項50の組成物。
- 前記化合物がLRP5ペプチドアプタマーを含む請求項50の組成物。
- 前記ペプチドアプタマーがOST262である請求項60の組成物。
- 前記化合物がLRP5抗体を含む請求項50の組成物。
- Dkk活性を変調する化合物とそのために医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
- DkkとLRP5/LRP6/HBMとの相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
(a)第1蛍光タグを使用してLRP5、LRP6、もしくはHBM蛍光融合タンパク質を作製するステップと、
(b)第2蛍光タグを含むDkk融合タンパク質を作製するステップと、
(c)試験化合物を添加するステップと、
(d)前記化合物がDkkとLRP5/LRP6/HBMとの相互作用を変調するかどうかを決定するために蛍光共鳴エネルギー転移法(FRET)または生物蛍光共鳴エネルギー転移法(BRET)を使用して蛍光タグ発光の比率における変化を評価するステップと
を含む方法。 - Dkkタンパク質に対する結合パートナーを同定する方法であって、
(a)1つ以上のDkkタンパク質またはそのLRP5/LRP6結合フラグメントを潜在的結合パートナーへ曝露させるステップと、
(b)前記潜在的結合パートナーがDkkタンパク質またはそのLRP5/LRP6結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法。 - Dkk相互作用タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸とインフレームであるGal4もしくはLexAの活性化ドメインとインフレームである足場タンパク質をコードする核酸を含むDkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーをコードする核酸。
- 請求項66の核酸を含むベクター。
- 前記足場タンパク質がtrxAである請求項66の核酸。
- その自然環境における細胞外相互作用を通して結合するペプチド結合対の第1のペプチドと第2のペプチドとの結合相互作用に及ぼす化合物の変調活性を検出する方法であって、
(i)
a)転写活性化タンパク質DNA結合ドメインへ結合した第1のペプチドまたはそのセグメントを含む第1の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
b)転写活性化タンパク質転写活性化ドメインへ結合した第2のペプチドまたはそのセグメントを含む第2の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
(このとき第1のペプチドまたはそのセグメントと第2のペプチドまたはそのセグメントとの結合は転写活性化タンパク質を再構成する)、
c)再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントと(このとき前記レポーターエレメントの発現は選択された表現型を生じる)、
を含む少なくとも1つの真核細胞を培養するステップと、
(ii)前記真核細胞を化合物の存在下で前記選択された表現型を検出するために適合する条件下で培養するステップと、
(iii)前記化合物が前記選択された表現型を生成する前記レポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって前記化合物が前記ペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと(このとき、(1)前記第1のペプチドはDkkペプチドであり、第2のペプチドはLRP5、HBM、LRP6およびLRP5/LRP6/HBMのDkk結合部分から選択されたペプチドである、または(2)前記第1のペプチドはDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントであり、前記第2のペプチドはDkkペプチドである)、
を含む方法。 - 前記真核細胞が酵母細胞である請求項69の方法。
- 前記酵母細胞がサッカロミセスである請求項70の方法。
- サッカロミセス細胞がサッカロミセス・セレヴィシエである請求項71の方法。
- DkkがDkk−1であり、前記化合物が1つ以上のDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントを含む請求項69の方法。
- 前記化合物がアッセイに直接的に添加される請求項73の方法。
- 前記化合物が前記第1および第2のペプチドに加えて前記真核細胞によって組換え的に発現させられる請求項73の方法。
- 前記化合物がDkkペプチドアプタマーを含む請求項69の方法。
- 前記化合物がDkkペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項69の方法。
- 前記化合物がDkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項69の方法。
- 前記化合物がDkk相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項69の方法。
- 真核細胞がさらに、転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびレポーターエレメントをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択された少なくとも1つの内因性ヌクレオチド配列を含んでおり、前記内因性ヌクレオチド配列の少なくとも1つが突然変異もしくは欠失によって不活化されている請求項69の方法。
- 前記ペプチド結合対がリガンドと前記リガンドが結合する受容体とを含む請求項69の方法。
- 前記転写活性化タンパク質がGal4、Gcn4、Hap1、Adr1、Swi5、Ste12、Mcm1、Yap1、Ace1、Ppr1、Arg81、Lac9、Qa1F、VP16、または哺乳動物核受容体である請求項69の方法。
- 前記異種融合タンパク質の少なくとも1つが自己複製プラスミドから発現させられる請求項69の方法。
- 前記DNA結合ドメインが転写活性化タンパク質の異種DNA結合ドメインである請求項69の方法。
- 前記DNA結合タンパク質が哺乳動物ステロイド受容体および細菌LexAタンパク質からなる群から選択される請求項84の方法。
- 前記レポーターエレメントがlacZ、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするポリヌクレオチド、およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される請求項69の方法。
- 前記レポーターエレメントがlacZである請求項86の方法。
- 前記試験サンプルがLRP5ペプチドアプタマーを含む請求項69の方法。
- 前記ペプチドアプタマーがOST262(配列番号208)である請求項88の方法。
- 前記試験サンプルがLRP5抗体を含む請求項69の方法。
- Dkk−1が組織特異的な方法でノックアウトされているトランスジェニック動物。
- 前記組織特異性が骨組織、癌組織、または肝組織である請求項91のトランスジェニック動物。
- Dkk活性を変調する潜在的化合物を同定するための方法であって、
a)1つの化合物の存在下および不在下において、1つ以上のDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントと、Dkkまたはそのフラグメントとの結合に及ぼす影響を測定するステップと、
b)1つ以上のDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントとDkkまたはそのフラグメントとの間の結合を変調する化合物を、潜在的Dkkを変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法。 - 図3(配列番号171〜188)または図4(配列番号189〜192)のペプチドアプタマー。
- 以下の1つ以上のアミノ酸配列のペプチドGNKYQTIDNYQPYPC(配列番号118)、LDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEG(配列番号119)、RIQKDHHQASNSSRLHTCQRH(配列番号120)、RGEIEETITESFGND(配列番号121)、EIFQRCYCGEGLSCRIQKD(配列番号122)、MYWTDWVETPRIE(配列番号123)、MYWTDWGETPRIE(配列番号124)、KRTGGKREILSA(配列番号125)、ERVEKTTGDKRTRIQGR(配列番号126)、KQQCDSFPDCIDGSDE(配列番号127)、またはAsn34−His266(配列番号110)、Asn34−Cys245(配列番号111)、Asn34−Lys182(配列番号112)、Cys97−His266(配列番号113)、Val139−His266(配列番号114)、Gly183−His266(配列番号115)、Cys97−Cys245(配列番号116)、もしくはVal139−Cys245(配列番号117)からなる群から選択されるDkk−1アミノ酸配列を認識して結合する抗体もしくは抗体フラグメント。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項95の抗体もしくは抗体フラグメント。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項95の抗体もしくは抗体フラグメント。
- DkkとWntシグナル伝達経路との相互作用を変調するDkk相互作用タンパク質を同定する方法であって、
(a)Dkkおよび潜在的Dkk相互作用タンパク質mRNAをアフリカツメガエル(Xenopus)割球内へ注入するステップと、
(b)体軸重複を評価する、またはマーカー遺伝子発現を解析するステップと、
(c)体軸重複またはマーカー遺伝子発現における変化を引き出す組成物を、DkkとWntシグナル伝達経路との相互作用を変調するDkk相互作用タンパク質であると同定するステップと
を含む方法。 - HBM、LRP5/6、いずれかのWnt、Wntアンタゴニスト、Wnt経路変調剤、またはこれらの組み合わせのmRNAが、アフリカツメガエル割球内に共注入される請求項98の方法。
- 解析されるマーカー遺伝子がSiamois、Xnr3、slug、Xbra、HNK−1、endodermin、Xlhbox8、BMP2、BMP4、XLRP6、EF−1またはODCである請求項98の方法。
- DkkとWntシグナル伝達経路との相互作用を変調するDkk相互作用タンパク質を同定するための方法であって、
(a)Dkkおよび潜在的Dkk相互作用タンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
(b)Wnt反応性プロモーターへ連結したレポーター遺伝子の発現における変化を評価するステップと、
(c)Dkk構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかのタンパク質をDkk相互作用タンパク質であると同定するステップと
を含む方法。 - 前記細胞が、HOB−03−CE6、HEK293、またはU2OS細胞である請求項101の方法。
- 前記Wnt反応性プロモーターがTCFまたはLEFである請求項101の方法。
- 前記細胞が、CMV β−ガラクトシダーゼを用いて共トランスフェクトされる請求項101の方法。
- DkkとLRP5/LRP6/HBMとの相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
(a)LRP5/LRP6/HBMを固体表面へ固定化するステップと、
(b)分泌Dkkタンパク質もしくは分泌エピトープタグDkkおよび試験化合物を用いて固体表面を処理するステップと、
(c)Dkkもしくはエピトープタグに対する抗体を使用して、またはエピトープタグの活性を直接に測定するステップによって、前記化合物がDkkとLRP5/LRP6/HBMとの間の結合を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法。 - エピトープタグが、アルカリホスファターゼ、ヒスチジンまたはV5タグである請求項105の方法。
- DkkとWntシグナル伝達経路との相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
(a)DkkおよびWntタンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
(b)Wnt反応性プロモーターへ連結したレポーターエレメントの発現における変化を評価するステップと、
(c)Dkk構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかの化合物をDkk/Wnt相互作用を変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法。 - WNt3aおよびWnt1構築物が、前記細胞内へ共トランスフェクトされる請求項107の方法。
- 前記細胞が、U2OS、HOB−03−CE6、またはHEK293細胞である請求項107の方法。
- 使用されるレポーターエレメントが、TCF−ルシフェラーゼ、tk−Renilla、またはその組み合わせである請求項107の方法。
- 哺乳動物におけるDkk−媒介性活性を変調する化合物を試験する方法であって、
(a)(1)調節可能な1つ以上のDkk遺伝子、(2)Dkk遺伝子のノックアウト、もしくは(3)1つ以上のDkk遺伝子のノックインを有する1群のトランスジェニック動物を提供するステップと、
(b)ステップ(a)におけるトランスジェニック動物群に対して各々第2群のコントロール動物を提供するステップと、
(c)骨量または脂質濃度を変調する潜在的Dkk変調化合物へトランスジェニック動物群および対照動物群を曝露させるステップと、
(d)トランスジェニック動物群と対照動物群とを比較し、そして前記化合物が対照動物群に比してトランスジェニック動物における骨量または脂質濃度に及ぼす作用を決定するステップと
を含む方法。 - DkkとDkk相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングするための方法であって、
(a)Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントを1つの化合物へ曝露させるステップと、
(b)前記化合物がDkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法。 - 前記変調が、前記化合物が前記Dkk相互作用タンパク質またはそのDkk結合フラグメントに結合するかどうかによって決定される請求項112の方法。
- 図3(配列番号171〜188)または図4(配列番号189〜192)に示した配列を認識して結合する抗体もしくは抗体フラグメント。
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