CN110054691B - 一种抗人p2rx7单克隆抗体的杂交瘤细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CCTCC NO:C201927，以原核表达的重组人P2RX7胞外段蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术经融合、筛选、反复克隆化，获得能稳定分泌抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明的有益效果是该发明所制备的抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体能够识别P2RX7胞外段天然抗原，所获得的单克隆抗体不仅在P2RX7的基础研究中，而且在P2RX7抗原抗体免疫反应的检测中均具有很高的使用价值。

Description

一种抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系

技术领域

本发明属于生物技术及细胞工程技术领域，涉及分泌抗人嘌呤受体P2X7(purinergic receptor P2X7，P2RX7)单克隆抗体杂交瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体，以及所述单克隆抗体的纯化和异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记，主要应用于检测免疫细胞上P2RX7表达。

背景技术

在细胞损伤、缺氧或炎症状态时，体内多种细胞释放大量ATP，进入细胞外间隙的ATP及其分解产物ADP和AMP作用于P2受体。P2受体包括离子通道型P2X受体(P2X1～7)和代谢型G-蛋白偶联P2Y受体(P2Y1/2/4/6/11/12/13/14)，其中ATP/P2RX7信号通路参与诱导炎性细胞因子分泌，与炎症发生发展密切相关。T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等多种免疫细胞上均可检测到P2RX7的表达。不同细胞利用ATP/P2RX7信号通路发挥不同的功能。在多种自身免疫性疾病的研究中已证实ATP/P2RX7信号通路对病程、病情的调控作用。P2RX7亚基的胞外环上有ATP结合位点，胞内含有一个短链N端和一个长链C端，C端为P2X7受体的主要功能结构域。N端的结构序列高度保守，由 395个氨基酸残基组成，与P2X7受体家族其它亚型有35％-40％的同源性；C端由200个氨基酸残基组成，是P2X受体家族成员中最长的，与P2X受体家族其它亚型无同源性。研究证实应用小鼠的P2X7受体抗体阻断P2X7受体的体内信号传导，可减轻ATP诱导的炎症反应。因此P2X7受体抗体成为治疗炎症及自身免疫性疾病的新靶标，而且可以从源头减少促炎因子的释放，因而靶向P2X7受体的药物可能较靶向其它参与炎症或免疫性疾病的促炎因子等具有更广阔治疗效果和应用范围。目前主要使用P2X7受体拮抗剂研究及治疗相关炎症及自身免疫性疾病，如临床使用P2X7受体拮抗剂AZD9056及EC-224.535治疗自生免疫性疾病类风湿性关节炎，但效果不明显。因此本领域急切需要靶向且高效的治疗患者的抗P2X7受体抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系，本发明的有益效果是该发明所制备的抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体能够识别P2RX7胞外段天然抗原，所获得的单克隆抗体不仅在 P2RX7的基础研究中，而且在P2RX7抗原抗体免疫反应的检测中均具有很高的使用价值。

本发明所采用的技术方案中杂交瘤细胞系的保藏号为CCTCC NO. C201927，抗人P2RX7的单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年3月12日，分类命名：抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系。保藏单位地址：中国武汉武汉大学

进一步，杂交瘤细胞系分泌的抗P2RX7单克隆抗体。

进一步，抗P2RX7单克隆抗体纯化后经过二甲亚砜(DMSO)法制备的异硫氰酸荧光素的荧光素标记物。

进一步，杂交瘤细胞系是通过杂交瘤技术以原核表达的重组P2RX7胞外段蛋白作为免疫原建立。

附图说明

图1是纯化抗体SDS-PAGE分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

一、建立细胞系

1.抗原的制备

1)对人P2RX7蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2RX7胞外段基因编码序列插入到表达载体 pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；

2)将构建好的含有P2RX7胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21 表达菌株中并进行IPTG诱导表达；

3)包涵体通过亲和层析纯化P2RX7蛋白：包涵体采用20mM PB，300mMNaCl 含1％Triton X-100，5mM DTT洗涤后，以20mM PB，300mMNaCl，8M Urea， 20mM Imidazole，1mMDTT缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，超声裂解包涵体离心后取上清，上清过滤后上柱，使用100mM Imidazole洗脱咪目标蛋白，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH7.4)， 4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，2mM EDTA]中复性，复性后 P2RX7蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，-80℃冻存，用于后续免疫实验小鼠。

2.抗原免疫

1)动物免疫

以纯化的人P2RX7胞外段蛋白为免疫原，常规方法免疫6-8周龄雌性 BALB/c小鼠5只，首次基础免疫皮下注射抗原100μg/只，使用完全弗氏佐剂。每隔3周加强免疫一次，共三次(50μg/只)。第三次免疫后一周采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对P2RX7胞外段蛋白的效价。融合前2-3天，进行最后一次免疫(直接注射，不加佐剂，不乳化)。

2)抗血清效价检测及筛选

根据实验需要设计包被酶标板，并在板条上做上标记。用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)包被液，将P2RX7胞外段蛋白稀释成需要的1μg/mL浓度，混匀后加入板条中，每孔100μL，4℃冰箱过夜。次日，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。抗血清按1:500，3倍稀释，每孔100μL，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去孔内液体，洗板3次，向每孔中加入100μL 1:20,000稀释的酶标二抗(山羊抗鼠-HRP)，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去孔内液体，洗板4次，每孔先加入100mLTMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。每孔加入100μL 1M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将 OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。3免后鼠抗血清间接ELISA结果显示，P2RX7胞外段蛋白3免后鼠抗血清效价均在121.5K左右。均可用于后续的细胞融合实验。下一步将选择效价较高的2#小鼠进行细胞融合实验。

3.杂交瘤细胞的制备

a)饲养细胞的制备

以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。融合的前一天，颈椎脱臼法安乐死BALB/c小鼠，75％酒精体表消毒和固定后，用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜。用注射器注射8ml DMEM培养液至腹腔，反复冲洗，回收冲洗液， 1000r/min离心10min,弃上清。用含20％胎牛血清的DMEM重选细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/mL。将上述细胞悬液加入96孔板，0.1mL/每孔，37℃，5％CO₂培养箱过夜培养。

b)免疫脾细胞制备

三次免疫后血清ELISA效价在1:10,000以上的小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射抗原100μg。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min。无菌取脾脏，把脾脏放入内有10mLDMEM基础培养液的培养皿中清洗1次。将脾脏转移到内置筛网的另一个平皿中，用无菌注射器内心研磨脾脏。加DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10mL离心管中，用不含血清的DMEM洗涤脾细胞2次，1000 rpm/min离心5min，收集脾细胞计数，用于细胞融合。

c)骨髓瘤细胞制备

融合前一周，用含10％FBS DMEM培养基扩大培养骨髓瘤细胞SP2/0。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞于50 mL离心管，1000rpm/min离心5min。弃上清，然后加入20mL DMEM基础培养基，重悬细胞后计数，用于细胞融合。

d)细胞融合及HAT选择杂交瘤

按1:5比例混合骨髓瘤细胞和免疫脾细胞，在50mL离心管内用DMEM基础培养基洗1次，1000rpm/min离心5min，弃上清。摇动离心管使细胞松散均匀。缓慢加入预热的0.8mL50％PEG，反应90s，然后加入20mLDMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10min。1000rpm/min 离心5min，弃上清，然后加入HAT DMEM培养基，重悬融合细胞，把融合细胞加入含有饲养细胞的96孔板中，100μL/每孔。然后将细胞培养板置37℃， 5％CO₂培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50％以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。

4.杂交瘤细胞的筛选

在检测的前一天，用PBS包被1μg/mL抗原于ELISA板，4℃过夜。次日吸取细胞培养上清100μL/孔进行ELISA检测，根据ELISA结果判断阳性孔(样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔)。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。

5.杂交瘤细胞的克隆化和冻存

a)杂交瘤细胞的克隆—克隆化方案为有限稀释法

于克隆化前一天，同前述方法制备饲养细胞，细胞浓度为1×10⁵/ml，将上述细胞悬液加入96孔板，0.1ml/每孔，37℃，5％CO₂培养箱过夜培养。

克隆化过程：吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4mLDMEM培养基(N为细胞计数结果)，取100μL细胞悬液到离心管中，吹匀后留1mL，补加DMEM到4mL，吹匀，留100μL(约2滴)在管底。在离心管中加DMEM 至5mL，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2mL左右，补加DMEM至5mL，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8mL左右，补加DMEM至2.8-3mL左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至 100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。同法共进行3次亚克隆。

首次亚克隆：经过细胞融合，共铺4块96孔细胞培养板，通过ELISA筛选检测，获得强阳性细胞株14株，选取9株(1E11、1H7、2D12、2F2、2G3、3B5、 3E6、4A7、4F6)针对P2RX7蛋白有较高特异性且细胞长势最快的强阳性融合细胞株进行下第二次细胞亚克隆实验。第二次亚克隆，通过ELISA筛选检测后，选取2E12、4B3、4G11共3株强阳性融合细胞株进行第三次亚克隆实验，并对单克隆上清进行筛选，最终只有4B3融合母孔亚克隆后，获得针对P2RX7蛋白有较高特异性的强阳性单克隆细胞株。

b)杂交瘤细胞的冻存

细胞冻存液：70％胎牛血清+20％DMEM基础培养基+10％二甲基亚砜

待杂交瘤细胞密度达到90％，直接弃上清，轻轻拍打培养瓶两侧数次，收集细胞悬液，1000rpm，离心5min，弃上清，使用细胞细胞冻存液重悬菌体，终浓度为1×10⁶/mL，加入写好细胞名称的冻存管，转至程序降温盒内，-80℃冰箱过夜，第二天转至液氮内长期保存。

将制备抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:C201927，保藏日：2019年3月12日，分类命名：抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

二.单克隆抗体制备及鉴定

1.单克隆抗体亚型鉴定

根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。用PBS包被液将P2RX7 蛋白稀释成需要的0.1μg/mL浓度，混匀后加入板条中，每孔100μL，4℃冰箱过夜。包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。单克隆细胞上清，每孔100μL，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μL稀释好的酶标二抗，酶标二抗：IgG1-HRP，IgG2a-HRP，IgG2b-HRP，IgG3-HRP， IgM-HRP，1:1,000。37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。每孔加入100μL 1M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将 OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

通过亚型鉴定试剂盒检测得出，获得的十一株细胞亚型均为IgG1型的单克隆。且对11株单克隆阳性细胞上清进行筛选得出4B3A4细胞株上清梯度效果较好，且细胞状态较好，下一步安排4B3A4细胞株进行细胞表达、抗体纯化等实验。

2.采用体外培养法生产单克隆抗体

选择细胞长势较好，ELISA效价较高的1株4B3A4单克隆细胞株进行细胞表达。

3.单克隆抗体的纯化和效价测定

将ProteinA琼脂糖凝胶介质装入亲和纯化层析柱，将4B3A4细胞上清缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在 PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度及抗体效价的测定。抗体纯化后纯度在85％以上(见附图1)，抗体浓度：0.3mg/mL。间接ELISA效价检测，4B3A4纯化抗体效价大于256K。

三、单克隆抗体的异硫氰酸荧光素标记

1.单克隆抗体的纯化

用ProteinA胶装柱，将细胞上清进行上样孵育，洗脱纯化抗体即可。

2.单克隆抗体的异硫氰酸荧光素(FITC)标记

纯化后的单克隆抗体的FITC标记物的制备方案为DMSO法，具体操作步骤如下：

将所用试剂及Anti-P2RX7抗体蛋白恢复至室温，称取一定量的FITC，每 1.0mgFITC用180μL的DMSO溶解成5.5mg/mL的溶剂。将FITC 7.02μL缓慢加入到0.52mgAnti-P2RX7抗体蛋白溶液中。室温下避光旋转反应1h。反应结束后，用1×PBS透析过夜，次日，换液继续透析5h。透析结束后，检测标记后抗体蛋白浓度为0.26mg/Ml，收集并分装，-80℃避光保存。

四、单克隆抗体激光共聚焦成像

肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1ml,血液室温放置，8小时内进行检测。取200μL肝素抗凝的人外周血全血至5mL带盖无菌离心管内，加入10μL FITC标记的Anti-P2RX7抗体(FITC-P2RX7)进行细胞表面标记染色，室温避光孵育30分钟。加入4mL红细胞裂解工作液，室温裂解10分钟，500g，离心 5min，离心后弃上清。加入1mL stainingbuffer(PBS+3％胎牛血清)，500g，离心5min，洗涤细胞，离心后弃上清。重复上述staining buffer洗涤步骤一次后，加入2mL stainingbuffer重悬细胞后，加入激光共聚焦专用皿中，使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。结果显示FITC主要聚集与细胞膜上。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (1)

1.一种抗人P2RX7单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于：杂交瘤细胞系的保藏号为CCTCC NO:C201927。

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