ES2667003T3 - Anticuerpos para receptores P2X7 oligoméricos no funcionales - Google Patents

Anticuerpos para receptores P2X7 oligoméricos no funcionales Download PDF

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ES2667003T3 ES10838429.8T ES10838429T ES2667003T3 ES 2667003 T3 ES2667003 T3 ES 2667003T3 ES 10838429 T ES10838429 T ES 10838429T ES 2667003 T3 ES2667003 T3 ES 2667003T3
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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un receptor P2X7 no funcional, que comprende un sitio de unión a antígeno definido por una fórmula general: FR1 a - CDR1 a - FR2a - CDR2a - FR3a - CDR3a - FR4a - enlazador - FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la que: FR1, FR2, FR3, FR4, FR1a, FR2a, FR3a y FR4a son cada una regiones marco; CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 a, CDR2a, CDR3a son cada una regiones determinantes de complementariedad; en la que: CDR1 a tiene una secuencia de aminoácidos de KASQNVGTNVA; CDR2a tiene una secuencia de aminoácidos de SASFRYS; y CDR3a tiene una secuencia de aminoácidos de QQYNSYPFT; en la que: CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos de: SYYMS; CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos de: AINSNGGSTYYPDTVKG; y CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: HFSRGYYDV, HFQRGYYNI, HYSKEYYNI y NFKLMYYNV.

Description

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FR1 -CDR1 -FR2 -CDR2 -FR3 -CDR3 -FR4 en la que: 5 FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas; CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad; en la que: CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos de KASQNVGTNVA. CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier caso previo que describe una secuencia de CDR3. En un caso se proporciona un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por fórmula general 21: 15 FR1 -CDR1 -FR2 -CDR2 -FR3 -CDR3 -FR4 en la que: FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas; CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad; en la que: 25 CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos de SYYMS. CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier caso previo que describe una secuencia de CDR3. En un caso se proporciona un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por fórmula general 22: FR1 -CDR1 -FR2 -CDR2 -FR3 -CDR3 -FR4 en la que: 35 FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas; CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad; en la que: CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos de SASFRYS. CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier caso previo que describe una secuencia de CDR3. En un caso se proporciona un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por fórmula general 23: 45 FR1 -CDR1 -FR2 -CDR2 -FR3 -CDR3 -FR4 en la que: FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas; CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad; en la que: 55 CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos de AINSNGGSTYYPDTVKG. CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier caso previo que describe una secuencia de CDR3. En un caso se proporciona un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por fórmula general 24: FR1 -CDR1 -FR2 -CDR2 -FR3 -CDR3 -FR4 en la que: 65 FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas; 7
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En un caso, el sitio de unión a antígeno de la divulgación tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 que comprende HFSRGYYDV o NYDKKYFDV.
En un caso, el sitio de unión a antígeno de la divulgación tiene una secuencia de aminoácidos de CDR3 que consiste 5 en HFSRGYYDV o NYDKKYFDV.
En otros casos se proporciona un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia como se describe en el presente documento, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento y que incluye una o más mutaciones para aumentar la afinidad de dicho sitio para unirse con un receptor P2X7.
En otro caso se proporciona un sitio de unión a antígeno como se describe en el presente documento en el que una secuencia de aminoácidos que forma una o más de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 es una secuencia humana.
15 En otro caso se proporciona un sitio de unión a antígeno como se describe en el presente documento en el que una secuencia de aminoácidos que forma una o más de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 es una secuencia canina o felina.
El sitio de unión a antígeno puede modificarse técnicamente para tener secuencias de un animal particular, por ejemplo puede ser quimérico (es decir que contiene algunas pero no todas las secuencias halladas en el individuo que recibe el anticuerpo). Como alternativa, puede consistir en secuencias alogénicas o singénicas. Un ejemplo de estas últimas es un anticuerpo de perro para su uso en el tratamiento de un perro.
El animal del que se obtiene el anticuerpo puede incluir un animal doméstico, de compañía o de granja, incluyendo 25 perros, gatos, vacas, cerdos, caballos y ovejas.
En otro caso se proporciona un dominio variable de inmunoglobulina anti receptor P2X7, anticuerpo, Fab, dab, scFv que incluye un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia como se describe en el presente documento o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento.
En otro caso se proporciona un diacuerpo o triacuerpo que incluye un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia como se describe en el presente documento o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento.
35 En otro caso se proporciona una proteína de fusión que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo como se describe en el presente documento.
En otro caso se proporciona un conjugado en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo o proteína de fusión como se describe en el presente documento conjugado con un marcador o un agente citotóxico.
En otro caso se proporciona un anticuerpo para unión con un sitio de unión a antígeno de un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento.
45 En otro caso se proporciona un ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno o una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento.
En otro caso se proporciona un vector que incluye un ácido nucleico descrito en el presente documento.
En otro caso se proporciona una célula que incluye un vector o ácido nucleico descrito en el presente documento.
En otro caso se proporciona un animal o tejido obtenido del mismo que incluye una célula descrita en el presente 55 documento.
En otro caso se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro caso se proporciona una composición de diagnóstico que incluye un sitio de unión a antígeno o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se
65 describe en el presente documento, un diluyente y opcionalmente un marcador.
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En otro caso se proporciona un kit o artículo de fabricación que incluye un sitio de unión a antígeno o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento.
5 En otro caso se proporciona un uso de una secuencia de acuerdo con una o más de CDR1, CDR2, FR1, FR2, FR3 y FR4 como se describe en el presente documento para producir un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7.
En otro caso se proporciona un uso de un sitio de unión a antígeno o una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento para producir un sitio de unión a antígeno anti receptor P2X7 que tiene afinidad aumentada por el receptor P2X7.
En otro caso se proporciona una biblioteca de moléculas de ácido nucleico producida a partir de la mutación de un
15 sitio de unión a antígeno o una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, en la que al menos una molécula de ácido nucleico en dicha biblioteca codifica un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7.
En otro caso se proporciona un método para producir un sitio de unión a antígeno anti P2X7 como se describe en el presente documento que incluye expresar un ácido nucleico como se describe en el presente documento en una célula o un animal como se describe en el presente documento.
En otro caso se proporciona un método para el tratamiento del cáncer o una afección o enfermedad asociada con expresión de receptor P2X7 no funcional en un individuo que incluye la etapa de proporcionar un sitio de unión a
25 antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se describe en el presente documento a un individuo que requiera tratamiento para cáncer o dicha afección o enfermedad.
En otro caso se proporciona un uso de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer o una afección o enfermedad asociada con la expresión del receptor P2X7 no funcional.
En otro caso se proporciona un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab,
35 scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se describe en el presente documento para el tratamiento de cáncer o una afección o enfermedad asociada con expresión de receptor P2X7 no funcional.
En otro caso se proporciona un método para el diagnóstico del cáncer o enfermedad o afección asociada con expresión de receptor P2X7 no funcional, que incluye la etapa de poner en contacto tejidos o células para los que la presencia o ausencia de cáncer debe determinarse con un reactivo en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición de diagnóstico como se describe en el presente documento y detectar la unión del reactivo con los tejidos o células. El método puede realizarse in vivo o in vitro.
45 Típicamente los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación se unen con receptores P2X7 no funcionales, especialmente receptores en los que Pro210 de P2X7 está en conformación cis. En ciertos casos los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación no se unen con receptores P2X7 funcionales, especialmente receptores en los que Pro210 de P2X7 está en conformación trans.
Típicamente los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación se unen con receptores P2X7 no funcionales en células vivas. En algunos casos, los sitios de unión a antígeno no se unen o se unen con afinidad muy baja o indetectable con receptores no funcionales en células muertas o moribundas. Si un sitio de unión a antígeno de la divulgación se une o no con un receptor P2X7 puede determinarse usando métodos convencionales
55 conocidos en la técnica.
En un caso, los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación se unen con receptores P2X7 en células vivas con afinidades (KD) en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 μM. Típicamente, cuando el sitio de unión a antígeno es parte de un IgM la afinidad por receptores P2X7 en células vivas es de entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 1 nM, preferentemente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 pM. Típicamente, cuando el sitio de unión a antígeno es parte de un IgG la afinidad por receptores P2X7 en células vivas es de entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 1 nM, preferentemente de entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 100 pM. Típicamente, cuando el sitio de unión a antígeno es parte de un Fab la afinidad por receptores P2X7 en células vivas es de entre aproximadamente 100 pM y aproximadamente 100 65 nM, preferentemente de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM. Típicamente, cuando el sitio de unión
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Figura 11. Mecanismo de muerte celular inducida por 2F6 con activación de caspasa 3/7 asociada con reactivación de apoptosis. En este experimento el efecto del fármaco de control Gemcitibina se muestra a la izquierda, y se sabe que activa caspasas mediante la inducción de apoptosis en células cancerosas COLO205. Por el contrario, la ausencia de fármaco o anticuerpo no tiene ningún efecto (columna solamente con células). La
5 presencia de IgM de control a dosis de hasta 40 μg/ml de forma similar no tiene ningún efecto en la activación de caspasa mientras que cantidades crecientes de anticuerpo 2F6 muestran un aumento continuo en la activación de caspasa 3/7 asociada con inducción de apoptosis por el anticuerpo durante el ciclo temporal de 3 días del experimento.
10 Figura 12. Destrucción celular directa por IgM 2F6. Imágenes de microscopio confocal de células MCF-7 en presencia de anticuerpo IgM de control (a) e IgM 2F6 (b) durante 24 h.
Figura 13. (a) hFc 2-2-1 unido a células tumorales 4T1 que muestran algo de unión membranosa (obj x40). (b) hFc 2-2-1 unido a células moribundas junto con el residuo membranoso de células ya destruidas. (c) hFc 2-2-1
15 unido a células tumorales LL vivas que muestran clara unión membranosa. (d) hFc 2-2-1 unido a residuo membranoso de células ya destruidas.
Figura 14. (a) hlgG1 2F6 unido a células tumorales 4T1 que muestran clara unión membranosa (obj x40). (b) hlgG1 2F6 unido solamente a células moribundas. (c) hlgG1 2F6 unido a células tumorales LL vivas que
20 muestran clara unión membranosa. (d) hlgG1 2F6 unido a células moribundas sin unión con glóbulos rojos adyacentes que expresan receptor P2X7 con capacidad de función.
Figura 15. Inhibición del número de metástasis pulmonares el día 14 en el modelo de xenoinjerto singénico 4T1 por 2F6hlgG1. La reducción general en el volumen tumoral fue del 89 % con la mayoría de metástasis en el
25 grupo de tratamiento mucho menor que en el grupo no tratado.
Figura 16. Inhibición del número de metástasis pulmonares en el modelo de xenoinjerto singénico de pulmón de Lewis (LL) el día 11. Los cinco grupos son el control no tratado (Grupo 1), E200-300 policlonal de oveja a 10 mg/kg (Grupo 2), 2F6hlgG1 a 1 mg/kg (Grupo 3) y a 10 mg/kg (Grupo 4) y Sorafenib a 5 ml/kg diariamente
30 (Grupo 5). hIgG1 tanto policlonal de oveja como 2F6 fueron equipotentes con Sorafenib con 96 % de inhibición.
Figura 17. Maduración de afinidad de secuencias de CDR3 de 2F6. Las secuencias de aminoácidos de derivados de scFv/Fab de afinidad madurada se enumeraron como clones mutantes con la secuencia de CDR3 2F6 de tipo silvestre (WT) en la parte superior de la lista.
35 Figura 18. ELISA de candidatos de IgM, IgG2a y Fab. ELISA de Fab derivado de 2F6 de afinidad madurada de candidatos (escala 0,01-12,5 μg/ml para IgM e IgG2a; 0,1-100 μg/ml para Fab). Los valores de CE50 para el IgM original y el IgG2a recombinante se midieron como 0,14 y 1,6 μg/ml respectivamente. El Fab WT mostró una CE50 muy baja mientras que la especie de Fab de afinidad madurada de candidatos seleccionada de exploración de
40 ScFv (n.º 10, n.º 21, n.º 42 y n.º 66) se unió mucho más estrechamente con una CE50 en el intervalo de 2-4 μg/ml
o aproximadamente 125 veces más fuerte que WT, que coincide con la afinidad del anticuerpo IgG2a completamente formado.
Figura 19. (a) Resultados de citometría de flujo para unión de Fab recombinantes con células tumorales
45 COLO205 colorrectales vivas. Se usó un anticuerpo secundario anti FLAG Sigma (n.º F4049) para detectar la unión de los anticuerpos primarios. Fab 2F6 WT se unió débilmente sobre el mismo intervalo de concentraciones. La CE50 para los cuatro Fab candidatos es muy similar a los valores obtenidos a partir de mediciones de ELISA.
(b) Se obtuvieron resultados de unión mejorados muy similares para células PC3 de próstata.
50 Figura 20. Se realizó una comparación con diversas preparaciones de IgG2a 2F6 recombinante para determinar la fuerza de unión relativa del anticuerpo con formato WT para células PC3 en comparación con los Fab de afinidad madurada. Se usó IgG2a Rockland n.º 010-001-332 para control para determinar el fondo (rombo). La unión del anticuerpo WT con formato completo fue comparable a la unión inducida por los Fab candidatos.
55 Figura 21. La verificación de la falta de unión con el receptor P2X7 funcional en linfocitos humanos por los Fab candidatos se determinó por citometría de flujo. El anticuerpo anti FLAG Sigma n.º F4049 se usó como el secundario. El anticuerpo de HLA Abcam se usó como un control. No se detectó unión por encima del fondo como se determinó mediante la señal solo secundaria en la columna izquierda. El orden del anticuerpo primario de izquierda a derecha a lo largo del eje x es el mismo que el orden de la leyenda de arriba a abajo.
60 Figura 22. Resultados de citometría de flujo para unión de anticuerpo policlonal de oveja purificado de alta afinidad con células PC3 que muestra unión significativamente más fuerte que hIgG2a 2F6 WT e indica las mejoras que pueden esperarse de una serie de Fab de afinidad madurada una vez convertidos en agentes de unión de IgG divalentes.
65 13
imagen9
Las cadenas H y L definen dominios Ig específicos. Más particularmente, cada cadena H tiene, en el extremo N, un dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas α y γ y cuatro dominios CH para los isotipos µ y ε. Cada cadena L tiene, en el extremo N, un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL está alineado con el VH y el CL está alineado con el primer dominio
5 constante de la cadena pesada (CH1).
Pueden asignarse anticuerpos a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas α, δ, ε, γ, y µ, respectivamente. Las clases γ y α se dividen adicionalmente en subclases basándose en diferencias relativamente menores en la secuencia y función de CH, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de su dominios constantes.
El dominio constante incluye la parte Fc que comprende las partes carboxilo terminales de ambas cadenas H que se
15 mantienen unidas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos tales como ADCC se determinan por secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por receptores de Fc (FcR) hallados en ciertos tipos de células.
El emparejamiento de un VH y VL entre sí forma "región variable" o "dominio variable" incluyendo los dominios amino terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede denominarse "VH". El dominio variable de la cadena ligera puede denominarse "VL". El dominio V contiene un sitio de unión a antígeno que afecta a la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Las regiones V abarcan aproximadamente 110 restos de aminoácidos y consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones marco conservadas (FR) (generalmente aproximadamente 4) de
25 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" (generalmente aproximadamente 3) que son cada una de 9-12 aminoácidos de longitud. Las FR adoptan en gran medida una configuración de lámina β y las regiones hipervariables de bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de lámina β.
"Región hipervariable", "HVR" o "HV" se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en el VH (HI, H2, H3) y tres en el VL (LI, L2, L3). Están en uso varias delimitaciones de regiones hipervariables y están abarcadas en el presente documento. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencias y son las más habitualmente
35 usadas (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
Los restos de "marco conservado" o "FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable definidos en el presente documento.
"Un péptido para formar un sitio de unión a antígeno" se refiere en general a un péptido que puede formar una conformación que confiere la especificidad de un antígeno por antígeno. Los ejemplos incluyen anticuerpo completo
o estructuras relacionadas con anticuerpo completo, fragmentos de anticuerpos completos que incluyen un dominio
variable, dominios variables y fragmentos de los mismos, incluyendo cadenas ligeras y pesadas, o fragmentos de 45 cadenas ligeras y pesadas que incluyen algunas pero no todas de las regiones hipervariables o regiones constantes.
Un anticuerpo "intacto" o "completo" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno así como un CL y al menos dominios constantes de cadena pesada, CHI, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o variante de secuencia de aminoácidos de los mismos.
Las "estructuras relacionadas con anticuerpo completo" incluyen formas multimerizadas de anticuerpo completo.
Los "fragmentos de anticuerpos completos que incluyen un dominio variable" incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2
55 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CHI). Cada fragmento Fav es monovalente con respecto a unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno.
Un fragmento Fab' difiere de los fragmentos Fab por tener pocos restos adicionales en el extremo carboxilo del dominio CHI incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el resto (o los restos) de cisteína de los dominios constantes portan un
65 grupo tiol libre.
15
Un fragmento F(ab’)2 corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y aún tiene capacidad de entrecruzamiento con antígeno.
Un "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. 5 Este fragmento consiste en un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente, estrecha.
En una especie de Fv monocatenario (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden unirse covalentemente por un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga de la de una especie de Fv bicatenario. A partir del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles de cada una de las cadenas H y L) que aportan los restos de aminoácidos para unión a antígeno y confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo.
"Fv monocatenario" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden
15 dominios de anticuerpo VH y VL conectados para formar una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para unión a antígeno.
Un "dominio variable sencillo" es la mitad de un Fv (que comprende solamente tres CDR específicos para un antígeno) que tiene la capacidad de reconocer y unirse con un antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión completo.
"Diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma
25 cadena polipeptídica (VH-VL). Los fragmentos de anticuerpos pequeños se preparan construyendo fragmentos sFv (véase párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 restos) entre los dominios VH y VL de modo que se consiga emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno.
Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "de cruce" en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. También se conocen en general en la técnica triacuerpos y tetracuerpos.
Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente
35 preexistente. Los componentes contaminantes son materiales que interferirían con usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.
Un "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se desvela en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en este campo, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos. Los anticuerpos humanos pueden prepararse administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a una provocación antigénica, pero
45 cuyos loci endógenos se han desactivado.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se reemplazan restos de una región hipervariable del receptor por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo, perro, gato o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, los restos de región marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan
55 para refinar adicionalmente el rendimiento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.
"Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los 65 anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que se dirigen contra un único sitio antigénico o determinante
16
imagen10
Aminoácido
Código de 3 letras Código de 1 letra Propiedades
Histidina
His H aromático polar hidrófilo con carga (+)
Isoleucina
Ile I alifático hidrófobo neutro
Leucina
Leu L alifático hidrófobo neutro
Lisina
Lys K polar hidrófilo con carga (+)
Metionina
Met M hidrófobo neutro
Fenilalanina
Phe F aromático hidrófobo neutro
Prolina
Pro P hidrófobo neutro
Serina
Ser S polar hidrófilo neutro
Treonina
Thr T polar hidrófilo neutro
Triptófano
Trp W aromático hidrófobo neutro
Tirosina
Tyr Y aromático polar hidrófobo
Valina
Val V alifático hidrófobo neutro
Los inventores han determinado las secuencias de CDR de varios clones de dominio variable que han descubierto que se unen con el receptor P2X7 no funcional. Estas secuencias de CDR se muestran en la Tabla 1a posterior.
5 En un caso se proporciona un péptido que tiene una secuencia como se muestra en la Tabla 1a o b. Estos péptidos son particularmente útiles para construir sitios de unión a antígeno, dominios variables, anticuerpos y fragmentos relacionados.
Tabla 1a: Secuencias de CDR
CDR1
CDR2 CDR3
KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 5)
SASFRYS (SEQ ID NO: 6) (con carga/polar/aromático) (con carga/aromático) XXXY (aromático/alifático)(con carga/neutro) (neutro/alifático)
N(Y/F)XXXY(Y/F)EX
N(Y/F)(neutro)(con carga)(neutro)Y(Y/F)E(neutro)
NFLESYFEA (SEQ ID NO: 7)
N(Y/F)(con carga)(neutro)(con carga)Y(Y/F)E(neutro)
NYRGDYYET (SEQ ID NO: 8)
H(aromático)XXXYYNI
H(Y/F)(neutro)(con carga)(neutro)YYNI
H(Y/F)(neutro)(con carga)(con carga)YYNI
HYSKEYYNI (SEQ ID NO: 9)
HFQRGYYNI (SEQ ID NO: 10)
(Y/N)(aromático)XXXYY(con carga)(neutro)
(Y/N)(aromático)(neutro)(neutro)(neutro)YYDV
(Y/N)(aromático)(neutro)(neutro)(neutro)YYEV
YFPLVYYDV (SEQ ID NO: 11)
NYLPMYYEV (SEQ ID NO: 12)
Y(con carga)XXXY(neutro)(neutro)(neutro)
NFKLMYYNV (SEQ ID NO: 13)
(con carga/polar/aromático)(aromático)(con carga/neutro) (con carga)(con carga/neutro)Y(aromático)(con carga)(neutro)
(con carga/polar/aromático)(F/Y)(con carga/neutro)(R/K) (con
18
CDR1
CDR2 CDR3
carga/neutro)(Y)(Y/F)(E/D)V
(H/N)(F/Y)(S/D)(R/K)(G/K)Y(Y/F)DV
HFSRGYYDV (SEQ ID NO: 14)
HYIKVYYEA (SEQ ID NO: 15)
HYSSRFFEV (SEQ ID NO: 16)
NFRVMFFKA (SEQ ID NO: 17)
HYSSRFFEV (SEQ ID NO: 18)
YHVIQYLGP (SEQ ID NO: 19)
DFTVPFYNA (SEQ ID NO: 20)
NYDKKYFDV (SEQ ID NO: 21)
YFPLVYYDV (SEQ ID NO: 22)
HYSSRFFDV (SEQ ID NO: 34)
SYYMS (SEQ ID NO: 23)
AINSNGG STYYPDT VKG (SEQ ID NO: 24) (con carga/polar/aromático) (con carga/aromático) XXXY (aromático/alifático)(con carga/neutro) (neutro/alifático)
N(Y/F)XXXY(Y/F)EX
N(Y/F)(neutro)(con carga)(neutro)Y(Y/F)E(neutro)
NFLESYFEA
N(Y/F)(con carga)(neutro)(con carga)Y(Y/F)E(neutro)
NYRGDYYET
H(aromático)XXXYYNI
H(Y/F)(neutro)(con carga)(neutro)YYNI
H(Y/F)(neutro)(con carga)(con carga)YYNI
HYSKEYYNI
HFQRGYYNI
(Y/N)(aromático)XXXYY(con carga)(neutro)
(Y/N)(aromático)(neutro)(neutro)(neutro)YYDV
(Y/N)(aromático)(neutro)(neutro)(neutro)YYEV
YFPLVYYDV
NYLPMYYEV
Y(con carga)XXXY(neutro)(neutro)(neutro)
YHVIQYLGP
NFKLMYYNV
(con carga/polar/aromático)(aromático)(con carga/neutro) (con carga)(con carga/neutro)Y(aromático)(con carga)(neutro)
(con carga/polar/aromático)(F/Y)(con carga/neutro)(R/K) (con carga/neutro)(Y)(Y/F)(E/D)V
(H/N)(F/Y)(S/D)(R/K)(G/K)Y(Y/F)DV
HFSRGYYDV
HYIKVYYEA
19
CDR1
CDR2 CDR3
HYSSRFFEV
NFRVMFFKA
HYSSRFFEV
DFTVPFYNA
NYDKKYFDV
YFPLVYYDV
HYSSRFFDV
Tabla 1b
Sitio de
VH VL scFV
unión a
antígeno
2F6
(WT)
imagen11 imagen12 imagen13
imagen14
20
Sitio de
VH VL scFV
unión a
antígeno
Mutante
n.º 18
imagen15 imagen16 imagen17
Mutante
n.º 78
imagen18 imagen19 imagen20
21
Sitio de
VH VL scFV
unión a
antígeno
imagen21
imagen22 imagen23
En ciertos casos el sitio de unión a antígeno es uno que tiene al menos 75 %, preferentemente 80 %, más preferentemente 85 %, más preferentemente 90 %, más preferentemente 95 %, más preferentemente 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con un sitio de unión a antígeno descrito anteriormente.
5 En ciertos casos la CDR es una que tiene al menos 75 %, preferentemente 80 %, más preferentemente 85 %, más preferentemente 90 %, más preferentemente 95 %, más preferentemente 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una CDR mostrada en la Tabla 1a.
10 En ciertos casos el sitio de unión a antígeno comprende o consiste en una secuencia de VH, VL o scFv mostrada en la Tabla 1b o tiene una secuencia que tiene 75 %, preferentemente 80 %, más preferentemente 85 %, más preferentemente 90 %, más preferentemente 95 %, más preferentemente 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia de VH, VL o scFV descrita en la Tabla 1b.
15 En otros casos se proporciona un sitio de unión a antígeno o CDR y/o FR que tiene una secuencia como se ha descrito anteriormente y que incluye una o más mutaciones para aumentar la afinidad de dicho sitio para unirse con un anti receptor P2X7. La mutación puede dar como resultado una sustitución, inserción o supresión de un resto en una o más de CDR1, CDR2 o CDR3, o una o más de FR1, FR2, FR3 o FR4.
20 En ciertos casos los sitios de unión a antígeno de la divulgación y moléculas que los comprenden se unen con un epítopo que se expresa exclusivamente en receptores P2X7 que se unen con ATP (conocidos de otro modo como "receptores no funcionales"). Se ha descubierto que el epítopo y péptidos que lo forman son útiles para generar anticuerpos monoclonales que se unen con receptores P2X7 no funcionales expresados en células vivas.
25 La unión a células vivas es importante porque se cree que la expresión del receptor P2X7 no funcional en o sobre células, siendo ejemplos células epiteliales, es un biomarcador de muchos cánceres tales como cánceres epiteliales y otras afecciones. Por consiguiente, con anticuerpos monoclonales que se unen con células vivas se hace posible proporcionar productos terapéuticos sistémicos en forma del anticuerpo en sí mismo, o un conjugado de anticuerpoagente citotóxico, para una amplia serie de enfermedades caracterizadas por la expresión de receptores P2X7 no
30 funcionales. También se hace posible proporcionar captura de imágenes in vivo y diagnóstico o supervisión de enfermedades caracterizadas por la expresión de receptores P2X7 no funcionales.
22
imagen24
como alternativa a por ejemplo uno o más de los restos Gly 200, His 201, Asn 202, Tyr 203, Thr 204, Thr 205, Arg 206, Asn 207, Ile 208, Leu 209.
Típicamente la segunda región es una que define un espacio molecular que incluye uno o más de los restos de SEQ
5 ID NO: 1: que se exponen para unión con un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo como consecuencia de isomerización en cis de Pro210 de un monómero que tienen una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. Estos restos incluyen Lys 297, Tyr 298, Tyr 299, Lys 300, Glu 301, Asn 302, Asn 303, Val 304, Glu 305 y Lys 306. En un caso la segunda región incluye al menos uno de estos restos. Típicamente la segunda región incluye al menos 4 de estos restos, aunque pueden ser menos, por ejemplo, 2 o 3, dependiendo de cuántos restos se presenten en la primera
10 región. En un caso, la segunda región incluye al menos 1 par de restos mostrados en la Tabla 3 a continuación:
Tabla 3
Tyr 298 Lys 297
Tyr 299 Lys 297 Lys 300 Lys 297 Glu 301 Lys 297 Asn 302 Lys 297 Asn 303 Lys 297 Val 304 Lys 297 Glu 305 Lys 297 Lys 306 Lys 297
Tyr 298 Tyr 299
Tyr 298 Lys 300 Tyr 298 Glu 301 Tyr 298 Asn 302 Tyr 298 Asn 303 Tyr 298 Val 304 Tyr 298 Glu 305 Tyr 298 Lys 306
Tyr 299 Glu 301
Tyr 299 Glu 301
Tyr 299 Asn 302 Tyr 299 Asn 303 Thr 299 Val 304 Tyr 299 Glu 305 Tyr 299 Lys 306
Lys 300 Glu 301
Lys 300 Asn 302 Lys 300 Asn 303 Lys 300 Val 304 Lys 300 Glu 305 Lys 300 Lys 306
Glu 301 Asn 302
Glu 301 Asn 303 Glu 301 Val 304 Glu 301 Glu 305 Glu 301 Lys 306
Asn 302 Asn 303
Asn 302 Val 304 Asn 302 Glu 305 Asn 302 Lys 306
Asn 303 Val 304
Asn 303 Glu 305 Asn 303 Lys 306
Val 304 Glu 305
Val 304 Lys 306
Glu 305 Lys 306
15 En ciertos casos la segunda región incluye 2 o más pares de restos mostrados en la Tabla 3.
La segunda región puede contener adicionalmente uno o más restos periféricos que están implicados de forma íntima en la formación del sitio de unión a ATP. Estos son Arg 307 y Lys 311. Por lo tanto en ciertos casos, la segunda región incluye además Arg 307 y/o Lys 311. Se entenderá que la segunda región no consiste solamente en 20 estos restos. Es decir, la segunda región, como se ha analizado anteriormente, define un espacio molecular que incluye uno o más de los restos de SEQ ID NO: 1: que se exponen para unión con un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo como consecuencia de isomerización en cis de Pro210 de un monómero que tienen una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. En este contexto, los Arg 307 y Lys 311 se proporcionan solamente además de, pero no como alternativa a por ejemplo uno o más de los restos Lys 297, Tyr 298, Tyr 299, Lys 300, Glu 301, Asn 302, Asn
25 303, Val 304, Glu 305 y Lys 306.
En ciertos casos, el epítopo es o incluye un epítopo lineal. Los ejemplos incluyen en los que la primera región incluye una de las siguientes secuencias de SEQ ID NO: 1 en la tabla 4:
30 Tabla 4
Gly 200 a Tyr 203
His 201 a Thr 204
Asn 202 a Thr 205
Tyr 203 a Arg 206
Thr 204 a Asn 207
Thr 205 a Ile 208
Arg 206 a Leu 209
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Un polinucleótido que codifica una CDR o FR de acuerdo con una cualquiera de las fórmulas generales descritas anteriormente, o un sitio de unión a antígeno comprendido por las mismas, puede generarse a partir de un ácido nucleico de cualquier fuente, por ejemplo, por síntesis química o aislamiento de una biblioteca de ADNc o genómica. Por ejemplo una biblioteca de ADNc puede generarse a partir de una célula productora tal como un linfocito B, célula
5 plasmática o célula de hibridoma y el ácido nucleico relevante aislado por amplificación por PCR usando oligonucleótidos dirigidos al clon particular de interés. Pueden después clonarse ácidos nucleicos aislados en vectores usando cualquier método conocido en la técnica. La secuencia de nucleótidos relevante puede después mutarse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar sitios de unión a antígeno que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos.
15 En otro caso se proporciona un vector que incluye un ácido nucleico descrito anteriormente. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector por una diversidad de procedimientos. En general, se inserta ADN en un sitio o sitios de endonucleasas de restricción apropiados usando técnicas conocidas en este campo. Los componentes de vector incluyen en general, pero sin limitación, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligamiento convencionales que son conocidas por los expertos en la materia.
El sitio de unión a antígeno puede producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un
25 polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o el polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN codificante de sitio de unión a antígeno que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina termoestable II. Para secreción de levadura la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, líder de factor alfa o líder de fosfatasa ácida o el líder de glucoamilasa de C. albicans. En la expresión de células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o una especie relacionada, así como líderes secretores víricos.
35 Pueden obtenerse secuencias polinucleotídicas que codifican componentes polipeptídicos del sitio de unión a antígeno de la divulgación usando técnicas recombinantes convencionales como se ha descrito anteriormente. Pueden sintetizarse polinucleótidos usando sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en hospedadores procariotas. Pueden usarse muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la técnica para el fin de la presente divulgación. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos para insertar en el vector y la célula hospedadora particular para transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo o ambos) y su compatibilidad con la célula hospedadora particular en la que reside.
45 En general, se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y de control que se obtienen de especies compatibles con la célula hospedadora en relación con estos hospedadores. Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células hospedadoras seleccionadas, así como marcar secuencias que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Dichas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levadura y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322, que contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y por lo tanto proporciona medios fáciles para identificar células transformadas, es adecuado para la mayoría de bacterias gramnegativas, el origen de plásmido de 2 µm es adecuado para levadura y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de
55 mamífero. pBR322, sus derivados u otros plásmidos microbianos o bacteriófago también pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden usarse por el organismo microbiano para expresión de proteínas endógenas.
Además, pueden usarse vectores de fagos que contienen secuencias de replicón y control que son compatibles con el microorganismo hospedador como vectores transformantes en relación con estos hospedadores. Por ejemplo, puede utilizarse bacteriófago tal como λGEM.TM.-11 para preparar un vector recombinante que puede usarse para transformar células hospedadoras susceptibles tales como E. coli LE392.
El vector de expresión de la divulgación puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón (siendo un cistrón 65 un segmento de ADN que contiene toda la información para la producción de un polipéptido individual). Un promotor
28
es una secuencia reguladora no traducida localizada cadena arriba (5’) de un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas típicamente se dividen en dos clases, inducibles y constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que inicia niveles aumentados de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en la condición de cultivo, por ejemplo la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.
Se conoce bien un gran número de promotores reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales. El promotor seleccionado puede unirse operativamente con ADN cistrónico que codifica la cadena ligera
o pesada retirando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de la divulgación. Tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterólogos pueden usarse para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunos casos se utilizan promotores heterólogos, ya que en general permiten mayor transcripción y mayores rendimientos de gen diana expresado en comparación con el promotor de polipéptido diana nativo.
Se conocen bien promotores reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales. Los promotores
15 adecuados para uso con hospedadores procariotas incluyen el promotor de PhoA, los sistemas promotores de βgalactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor de tac o el de trc. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica un sitio de unión a antígeno de la divulgación. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como promotores bacterianos o de fagos conocidos) también son adecuados. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo de este modo a un experto en la materia unirlos operativamente con cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada diana usando enlazadores o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido.
En un aspecto de la divulgación, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de
25 secuencia señal de secreción que dirige la traslocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el fin de la presente divulgación debería ser una que sea reconocida y procesada (es decir escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan las secuencias señal nativas de los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina termoestable II (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA y MBP. En un caso de la divulgación, las secuencias señal usadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias señal de STII o variantes de las mismas.
35 En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas de acuerdo con la divulgación puede producirse en el citoplasma de la célula hospedadora y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias señal de secreción dentro de cada cistrón. A ese respecto, se expresan cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, se pliegan y se ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas hospedadoras (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB-) proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, permitiendo de este modo el plegamiento y ensamblaje apropiados de subunidades proteicas expresadas.
La presente divulgación proporciona un sistema de expresión en el que la relación cuantitativa de componentes polipeptídicos expresados puede modularse para maximizar la producción de sitios de unión a antígeno secretados y
45 ensamblados de forma apropiada de la divulgación. Dicha modulación se consigue al menos en parte modulando simultáneamente fuerzas de traducción para los componentes polipeptídicos.
Con respecto a expresión en células hospedadoras eucariotas, los componentes de vector incluyen en general, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.
Un vector para uso en una célula hospedadora eucariota también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o el polipéptido maduro de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferentemente una que sea reconocida y procesada (es
55 decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal del herpes simple gD.
El ADN para dicha región precursora se liga en fase de lectura con ADN que codifica el anticuerpo.
En general, no es necesario un componente de origen de replicación para vectores de expresión de mamífero. Por ejemplo, el origen de SV40 puede usarse típicamente solamente porque contiene el promotor temprano.
Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado marcador 65 seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteína que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras
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de ácido nucleico o vector puede estar presente en la célula hospedadora o el hospedador modificado genéticamente como una molécula independiente fuera del genoma, preferentemente como una molécula que tiene capacidad de replicación, o puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula hospedadora o el hospedador.
5 La célula hospedadora de la presente divulgación puede ser cualquier célula procariota o eucariota.
Son ejemplos de células procariotas las usadas en general para clonación como E. coli o Bacillus subtilis. Además, las células eucariotas comprenden, por ejemplo, células fúngicas o animales.
Son ejemplos de células fúngicas adecuadas células levaduras, preferentemente las del género Saccharomyces y más preferentemente las de la especie Saccharomyces cerevisiae.
Son ejemplos de células animales, por ejemplo, células de insecto, células de vertebrado, preferentemente células
15 de mamífero, tales como por ejemplo HEK293, NSO, CHO, MDCK, U2-OS, Hela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A. Estas células hospedadoras, por ejemplo células CHO, pueden proporcionar modificaciones postraduccionales a las moléculas de anticuerpo de la divulgación, incluyendo retirada del péptido líder, plegamiento y ensamblaje de cadenas H (pesada) y L (ligera), glucosilación de la molécula en lados correctos y secreción de la molécula funcional.
Pueden obtenerse líneas celulares adecuadas adicionales conocidas en la técnica de depósitos de línea celular, como la colección americana de cultivos tipo (ATCC).
En otro caso se proporciona un animal que incluye una célula descrita anteriormente. En ciertos casos, los animales
25 y tejidos de los mismos que contienen un transgén son útiles en la producción de los sitios de unión a antígeno de la divulgación, La introducción de las moléculas de ácido nucleico como transgenes en hospedadores no humanos y su expresión posterior pueden emplearse para la producción de los sitios de unión a antígeno, por ejemplo, la expresión de dicho transgén en la leche del animal transgénico proporciona medios para obtener los sitios de unión a antígeno en cantidades cuantitativas. Los transgenes útiles a este respecto comprenden las moléculas de ácido nucleico de la divulgación, por ejemplo, secuencias codificantes de los sitios de unión a antígeno descritos en el presente documento, unidas operativamente a estructuras promotoras y/o potenciadoras de un gen específico de glándulas mamarias, como caseína o betalactoglobulina. El animal puede ser mamíferos no humanos, más preferentemente ratones, ratas, ovejas, terneros, perros, monos o simios.
35 En otro caso se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se ha descrito anteriormente y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los expertos en la materia conocen bien o determinan fácilmente métodos para preparar y administrar sitios de unión a antígeno de los mismos a un sujeto que lo necesite. La vía de administración del sitio de unión a antígeno puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica.
El término parenteral como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal.
45 Aunque todas estas formas de administración se contemplan claramente como dentro del alcance de la divulgación, una forma de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Habitualmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (por ejemplo tampón de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo polisorbato), opcionalmente un agente estabilizante (por ejemplo albúmina humana), etc.
Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Los vehículos acuosos incluyen agua,
55 soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medio tamponado. En la divulgación objeto, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, tampón fosfato 0,01-0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina 0,8 %. Otros vehículos parenterales habituales incluyen soluciones de fosfato sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reforzadores de líquidos y nutrientes, reforzadores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.
Más en particular, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones (cuando sean solubles en agua) o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de 65 soluciones o dispersiones inyectables estériles, en esos casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida
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