ES2629442T3 - Nuevos antígenos transmembranales en serpentina expresados en cánceres humanos y utilizaciones de los mismos - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos del producto génico 8P1D4 (STEAP-1) que está codificado por la secuencia de codificación del ADNc mostrado en la SEC ID N.º 1

Description

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DESCRIPCION

Nuevos antlgenos transmembranales en serpentina expresados en canceres humanos y utilizaciones de los mismos CAMPO DE LA INVENClON

[0001] La invencion descrita en la presente memoria se refiere a una familia de nuevos genes y sus protelnas codificadas y antlgenos tumorales, denominados STEAP-1. Tambien se describen procedimientos de diagnostico y terapeuticos, y composiciones utiles en el tratamiento de diversos canceres, incluyendo particularmente el cancer de prostata, el cancer de colon, el cancer de vejiga, el cancer de ovario y el cancer pancreatico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] El cancer es la segunda causa principal de mortalidad humana despues de la enfermedad coronaria. En todo el mundo, cada ano, mueren millones de personas a causa del cancer. Solo en Estados Unidos, el cancer provoca la muerte de bastante mas de medio millon de personas al ano, siendo diagnosticados unos 1,4 millones de nuevos casos anualmente. Mientras que las muertes por enfermedad coronaria han descendido significativamente, aquellas provocadas por el cancer van generalmente en aumento. Se preve que, a comienzos del siglo que viene, el cancer se habra convertido en la principal causa de mortalidad.

[0003] Por todo el mundo, son varios los canceres que destacan como los mas mortlferos. En concreto, los carcinomas de pulmon, de prostata, de mama, de colon, de pancreas y de ovario representan las mayores causas de mortalidad por cancer. Estos y casi la totalidad del resto de los carcinomas comparten su caracterlstica letal comun. Con muy pocas excepciones, la metastasis a partir de un carcinoma es fatal. Ademas, incluso para aquellos pacientes con cancer que sobreviven inicialmente a sus canceres primarios, la experiencia comun ha demostrado que sus vidas se ven alteradas de manera espectacular. Muchos pacientes de cancer experimentan una gran ansiedad debida a su preocupacion por sufrir una posible reaparicion o un fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cancer experimentan debilidad flsica despues del tratamiento.

[0004] En general, el problema fundamental en el tratamiento de los canceres mas letales es la falta de terapias sistemicas eficaces y no toxicas. La Medicina Molecular, que todavla esta en panales, promete redefinir los modos en los que estos canceres estan siendo tratados. Sin lugar a dudas, existe un esfuerzo intensivo a nivel mundial dirigido al desarrollo de nuevos enfoques moleculares para el diagnostico y el tratamiento del cancer. Por ejemplo, hay un gran interes por identificar los genes y las protelnas verdaderamente especlficos de tumores que podrlan ser usados como marcadores de diagnostico y pronostico y/o dianas o agentes terapeuticos. Los esfuerzos de investigacion en estos campos se estan intensificando, y la creciente disponibilidad de las tecnologlas moleculares utiles ha acelerado la adquisicion de un conocimiento significativo acerca del cancer. No obstante, el progreso es lento y, en general, desigual.

[0005] Recientemente, ha surgido un interes particularmente fuerte por identificar antlgenos especlficos de tumores de la superficie celular que podrlan ser utiles como dianas para diversas estrategias de tratamiento inmunoterapeutico o de moleculas pequenas. Se ha publicado un gran numero de tales antlgenos de la superficie celular, y algunos, segun fuentes fidedignas, han demostrado estar asociados con uno o mas canceres. Se ha prestado mucha atencion al desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas dirigidas a estos antlgenos. Sin embargo, se han obtenido pocos tratamientos inmunologicos oncologicos verdaderamente eficaces.

[0006] El uso de anticuerpos monoclonales frente a antlgenos especlficos de tumores o sobre-expresados en el tratamiento de canceres solidos es instructivo. Aunque la terapia con anticuerpos ha sido bien investigada durante unos 20 anos, solo muy recientemente, se ha materializado en los correspondientes compuestos farmaceuticos. Un ejemplo es el anticuerpo monoclonal contra HER2/neu humanizado, la Herceptina, recientemente autorizada para su uso en el tratamiento de los canceres de mama metastasicos que sobre-expresan el receptor HER2/neu. Otro es el anticuerpo contra CD20/linfoma de celulas B quimerico humano/de raton, Rituxan, autorizado para el tratamiento del linfoma de no Hodgkin. Se estan evaluando otros varios anticuerpos para el tratamiento del cancer en pruebas cllnicas o en investigacion pre-cllnica, incluyendo un anticuerpo monoclonal IgC2 completamente humano especlfico del receptor del factor de crecimiento epidermico (Yang et al., 1999, Cancer Res. 59: 1236). Es evidente que la terapia con anticuerpos esta finalmente emergiendo de una larga fase embrionaria. No obstante, todavla existe una necesidad enorme por nuevos antlgenos tumorales mas especlficos para la aplicacion de terapias con anticuerpos y otras terapias biologicas. Ademas, existe la correspondiente necesidad por antlgenos tumorales que puedan ser utiles como marcadores para los procedimientos de diagnostico y formacion de imagenes basados en anticuerpos, que es de esperar que conduciran al desarrollo mas temprano de diagnosticos y a una mayor precision en los pronosticos.

[0007] Segun lo tratado mas adelante, el tratamiento del cancer de prostata sirve como un buen ejemplo del limitado alcance en el que se ha traducido la Biologla Molecular en el progreso real del campo cllnico. Con limitadas excepciones, la situacion es mas o menos la misma para el resto de carcinomas principales mencionados anteriormente.

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[0008] En todo el mundo, el cancer de prostata es el cuarto cancer mas frecuente en hombres. En America del Norte y Europa del Norte, es, con mucho, el cancer mas comun en varones, siendo la segunda causa principal de mortalidad por cancer en hombres. Solo en Estados Unidos, bastante mas de 40.000 hombres mueren anualmente por esta enfermedad, estando solo detras del cancer de pulmon. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavla no existe un tratamiento eficaz del cancer de prostata metastasico. La prostatectomla quirurgica, la terapia por radiacion, la terapia hormonal de ablacion y la quimioterapia continuan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, en muchos casos, estos tratamientos son claramente ineficaces. Ademas, estos tratamientos a menudo estan asociados con consecuencias significativamente no deseables.

[0009] En el ambito del diagnostico, el analisis del PSA en suero ha sido una herramienta muy util. No obstante, la especificidad y la utilidad general del PSA son ampliamente consideradas como deficientes en varios aspectos. No se ha demostrado la capacidad del analisis del PSA, ni de ningun otro analisis ni marcador biologico, para identificar fiablemente la enfermedad en un estadio temprano. De manera similar, no hay un marcador disponible para predecir la aparicion de la fase metastasica comunmente fatal de la enfermedad. El diagnostico del cancer de prostata metastasico se realiza mediante linfadenectomla pelvica laparoscopica o quirurgica abierta, escaner con radionuclidos de todo el cuerpo, radiografla esqueletica y/o analisis de biopsias de lesiones oseas. Es evidente que mejores procedimientos de diagnostico de formacion de imagenes y otros menos invasivos ofrecen la promesa de acabar con las dificultades que estos procedimientos suponen para el paciente, as! como mejorar las opciones terapeuticas. Sin embargo, hasta que haya marcadores de los tumores de prostata capaces de identificar fiablemente la enfermedad en un estadio temprano, de predecir la susceptibilidad a la metastasis y de generar imagenes precisas de los tumores, el tratamiento del cancer de prostata continuara siendo sumamente diflcil. Por consiguiente, existe una enorme necesidad por marcadores tumorales moleculares mas especlficos en el tratamiento del cancer de prostata.

[0010] Existen algunos marcadores conocidos que son expresados predominantemente en la prostata, tales como el antlgeno de membrana especlfico de la prostata (PSM), una hidrolasa con una identidad del 85% con una neuropeptidasa de rata (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 749: Bzdega et al., 1997; J. Neurochem. 69: 2270). Sin embargo, la expresion del PSM en el intestino delgado y en el cerebro (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54: 1807), as! como su posible papel en el catabolismo de neuropeptidos en el cerebro, genera preocupacion por su posible neurotoxicidad con terapias contra PSM. Los resultados preliminares obtenidos con el uso de un anticuerpo monoclonal contra PSM marcado con indio-111 para generar imagenes del cancer de prostata recurrente son algo prometedores (Sodee et al., 1996, clin Nuc Med 21: 759-766). Los marcadores de cancer de prostata mas recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 7252) y el antlgeno de celulas madre de prostata (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sd. EE.UU. 95:1735). El PCTA-1, una galectina nueva, es en buena parte secretado en el medio de expresion celular y puede ser prometedor como un marcador de diagnostico en suero del cancer de prostata (Su et al., 1996). El PSCA, una molecula de la superficie celular unida a GPI, fue formado a partir de ADNc de LAPC-4 y es unico en tanto en cuanto es expresado fundamentalmente en celulas basales de tejido de prostata normal y en epitelios cancerosos (Reiter et al., 1998). Tambien se esta investigando activamente en la elaboracion de vacunas para el cancer de prostata con una variedad de antlgenos, incluyendo el PSM y el PSA.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

[0011] La presente invencion se refiere a una nueva familia de antlgenos transmembranales en serpentina de la superficie celular. Dos de las protelnas en esta familia se expresan exclusivamente o predominantemente en la prostata, as! como en el cancer de prostata, y de este modo, los miembros de esta familia se han denominado “STEAP” (Six Transmembrane Epithelial Antigens of the Prostate). En la presente memoria se describen y caracterizan cuatro STEAP humanos particulares. Los STEAP humanos muestran un grado elevado de conservacion estructural entre ellos, pero no muestran homologla estructural significativa con cualquier protelna humana conocida.

[0012] El miembro prototipo de la familia de STEAP, STEAP-1 parece ser una protelna de membrana de tipo IIIa que se expresa predominantemente en celulas de prostata en tejidos humanos normales. Estructuralmente, la STEAP-1 es una protelna de 339 aminoacidos caracterizada por tener una topologla molecular de seis dominios transmembrana y extremos N y C intracelulares, lo que sugiere que se pliega de una manera “en serpentina” en tres bucles extracelulares y dos bucles intracelulares. La expresion de la protelna STEAP-1 se mantiene a niveles elevados a traves de los diversos estadios del cancer de prostata. Ademas, la STEAP-1 esta muy sobreexpresada en otros canceres humanos. En concreto, se ha confirmado definitivamente la expresion en la superficie celular de STEAP-1 en una variedad de celulas de prostata y cancerosas de prostata, celulas cancerosas de vejiga y celulas cancerosas de colon. Estas caracterlsticas indican que la STEAP-1 es un antlgeno tumoral de la superficie celular especlfico expresado a niveles elevados en los canceres de prostata, vejiga, colon y otros canceres.

[0013] STEAP-2, STEAP-3 y STEAP-4 tambien se describen en la presente memoria. Todas estan estructuralmente relacionadas, pero muestran perfiles de expresion unicos. STEAP-2, como STEAP-1, es especlfico de la prostata en tejidos humanos normales y tambien se expresa en cancer de prostata. En cambio, STEAP-3 y STEAP-4 parecen mostrar un patron de expresion limitado diferente.

[0014] Tal como se define en la reivindicacion 9, la invencion proporciona polinucleotidos en forma aislada que

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codifican las protelnas STEAP-1 y fragmentos de las mismas. Tambien se proporcionan ADN, ARN, hlbrido de ADN/ARN, y moleculas relacionadas, polinucleotidos u oligonucleotidos complementarios a los genes o secuencias de ARNm de STEAP, o a partes de los mismos, y polinucleotidos u oligonucleotidos que se hibridan con los genes, ARNm de STEAP o con polinucleotidos que codifican la STEAP. Tambien se proporcionan procedimientos para aislar los ADNc y los genes que codifican STEAP. Tambien se proporcionan moleculas de ADN recombinante que contienen polinucleotidos de STEAP, celulas transformadas o transducidas con tales moleculas y sistemas de vectores huesped para la expresion de productos genicos de STEAP. La invencion proporciona ademas protelnas STEAP y fragmentos polipeptldicos de las mismas, tal como se define en las reivindicaciones. La descripcion proporciona ademas anticuerpos que se unen con protelnas STEAP y con fragmentos polipeptldicos de las mismas, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamlferos, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable, y anticuerpos conjugados con radionuclidos, toxinas u otras composiciones terapeuticas. La descripcion proporciona ademas procedimientos para detectar la presencia de polinucleotidos y protelnas STEAP en diversas muestras biologicas, as! como procedimientos para identificar celulas que expresen una STEAP. La descripcion proporciona ademas diversas composiciones terapeuticas y estrategias para tratar el cancer de prostata, incluyendo particularmente, la terapia con anticuerpos, vacunas y moleculas pequenas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

[0015]

FIGURa 1: Estructura de STEAP-1. 1A: Secuencias de nucleotidos y de aminoacidos deducidas del ADNc del clon 10 (8P1 B4) de STEAP-1 (SEC ID N.° 1 y 2, respectivamente). La metionina inicial se indica en negrita en la posicion del residuo de aminoacido 1, y se indican seis dominios transmembrana putativos en negrita y subrayados. 1B: representacion esquematica de la orientacion transmembranal de STEAP-1. Los residuos de aminoacido que limitan los dominios extracelulares predichos se indican y corresponden al esquema de numeracion de la FIGURA 1A. 1C: La secuencia no codificante 5' rica en G/C del gen STEAP-1 esta determinada por las secuencias solapantes del clon 10 y del clon 3.

FIGURA 2: Expresion predominante de STEAP-1 en el tejido de prostata. El ADNc de la primera cadena se preparo a partir de 16 tejidos normales, los xenoinjertos LAPC (4AD, 4AI y 9AD) y celulas HeLa. La normalizacion se realizo mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, realizada usando cebadores derivados de ADNc (8P1D4) de StEaP-1 (FIGUrA 1A), muestran la expresion predominante de STEAP-1 en prostata normal y los xenoinjertos LAPC. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar STEAP-1:

8P1 04.1 5' ACTTTGTTGATGACCAGGATTGGA 3' (SEC ID N.° 4)

8P1 D4.2 5' CAGAACTTCAGCACACACAGGAAC 3' (SEC ID N.° 5)

FIGURA 3: Analisis de transferencia Northern de la expresion de STEAP-1 en diversos tejidos humanos normales y xenoinjertos de cancer de prostata, que muestran una expresion predominante de STEAP-1 en tejido de prostata. FIGURA 3A: Se sondaron dos transferencias Northern de multiples tejidos (Clontech) con un clon 10 de ADNc de STEAP de longitud completa (FIGURA 1A; SEC ID N.° 1). En el lateral, se indican los patrones de peso en kilobases (kb). Cada carril contiene 2 pg de ARNm que fue normalizado usando una sonda de p-actina. FIGURA 3B: Se sondaron transferencias de puntos de ARN de multiples tejidos (Clontech, Catalogo de transferencia maestro humano n.° 77701) con un clon 10 de ADNc de STEAP-1 (FIGURA 1A; SEC ID N.° 1), mostrando una expresion aproximadamente cinco veces mayor en el tejido de prostata en comparacion con otros tejidos con una expresion detectable significativa. FIGURA 4: Secuencia de nucleotidos del clon GTH9 de STEAP-1 (SEC ID N.° 6) correspondiente a un mensaje de 4 kb sobre las transferencias Northern (FIGURA 3A). La secuencia contiene un intron de 2399 pares de bases en comparacion con la secuencia del clon 10 de STEAP-1 de la FIGURA 1A; las regiones codificantes son los nucleotidos 96-857 y 3257-3510 (indicados en negrita). El ATG inicial esta en negrita y subrayado, el codon de terminacion esta en negrita y subrayado, y los llmites intron-exon estan subrayados.

FIGURA 5: Expresion de STEAP-1 en multiples llneas celulares de cancer de prostata y multiples canceres, y en xenoinjertos de cancer de prostata. Se prepararon los filtros para los xenoinjertos y las llneas celulares con 10 pg de ARN total por carril. Se analizaron las transferencias usando el clon 10 de STEAP-1 como sonda. Todas las muestras de ARN fueron normalizadas mediante tincion con bromuro de etidio y el posterior analisis con una sonda de p-actina. FIGURA 5A: Expresion en diversas llneas celulares cancerosas y en xenoinjertos de prostata. Los carriles son los siguientes: (1) celulas PrEC, (2) tejido de prostata normal, (3) xenoinjerto LAPC-4 AD, (4) xenoinjerto LAPC-4 Al , (5) xenoinjerto lApC-9 AD, (6) xenoinjerto LAPC-9 Al, (7) celulas LNCaP, (8) celulas PC-3, (9) celulas DU145, (10) celulas PANC-1, (11) celulas BxPC-3, (12) celulas HPAC, (13) celulas Capan-1, (14) celulas CACO-2, (15) celulas LOVO, (16) celulas t84, (17) celulas COlO-205, (18) celulas KCL-22(leucemia linfocltica aguda, LLA), (19) celulas HT1197, (20) celulas SCABER, (21) celulas UM-UC-3, (22) celulas TCCSUP, (23) celulas J82, (24) celulas 5637, (25) celulas RD- ES (Sarcoma de Ewing, SEW), (26) celulas CAMA-1, (27) celulas DU4475, (28) celulas MCF-7, (29) celulas MOA-MB- 435s, (30) celulas NTERA-2, (31) celulas NCCIT, (32) celulas TERA-1, (33) celulas TERA-2, (34) celulas A431, (35) celulas HeLa, (36) celulas OV-1063, (37) celulas PA-1, (38) celulas SW 626, (39) celulas CAOV-3. FIGURA 5B: La expresion de STEAP-1 en xenoinjertos LAPC desarrollados subcutaneamente (sc) en comparacion con la expresion en xenoinjertos LAPC-4 y LAPC-9 desarrollados en la tibia (it) de ratones.

FIGURA 6: Analisis de transferencia Western de la expresion de la protelna STEAP-1 en tejidos y multiples llneas celulares. Se sondaron las transferencias Western de los lisados celulares preparados a partir de xenoinjertos de

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cancer de prostata y ilneas celulares con una preparacion de anticuerpos contra STEAP-1 policlonales (para mas information, vease el ejemplo XX). Las muestras contienen 20 pg de protelna y fueron normalizadas con un sondeo contra Grb-2 de transferencias Western.

FIGURA 7: Biotinilacion de STEAP-1 en la superficie celular. FIGURA 7A: Biotinilacion de celulas 293T en la superficie celular transfectadas solo con vector o con vector que contiene ADNc que codifica STEAP-1 marcada con 6His. Se inmunoprecipitaron los lisados celulares con anticuerpos especlficos, se transfirieron a una membrana y se sondaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rabano picante. Los carriles 1-4 y 6 se corresponden con inmunoprecipitados de lisados preparados a partir de celulas 293T que expresan STEAP-1. Los carriles 5 y 7 son inmunoprecipitados de celulas transfectadas con vectores. Las inmunoprecipitaciones se realizaron usando los siguientes anticuerpos: (1) no inmune de oveja, (2) contra antlgeno T grande, (3) contra CD71 (receptor de transferrina), (4) contra His, (5) contra His, (6) contra STEAP-1, (7) contra STEAP-1. FIGURA 7B: las llneas celulares de cancer de prostata (LNCaP, PC-3, DU145), de cancer de vejiga (UM-UC-3, TCCSUP) y de cancer de colon (LOVO, COLO) bien fueron biotiniladas (+) o no (-) antes de la lisis. Se sondaron transferencias Western de protelnas purificadas sobre gel de estreptavidina con anticuerpos contra STEAP-1. Los marcadores del peso molecular se indican en kilodaltons (kD).

FIGURA 8: Analisis inmunohistoqulmico de la expresion de STEAP-1 usando anticuerpo policlonal contra STEAP-1. Los tejidos fueron fijados en formalina al 10% e introducidos en parafina. Se tineron las secciones titulares usando anticuerpos policlonales contra STEAP-1 dirigidos frente al peptido N-terminal. Las muestras incluyen: (a) celulas LNCaP sondadas en presencia de peptido STEAP-1 N-terminal 1, (b) LNCaP mas peptido inespeclfico 2, (c) tejido de prostata normal, (d) carcinoma de prostata de grado 3, (e) carcinoma de prostata de grado 4, (f) xenoinjerto LAPC-9 AD, (g) vejiga normal, (h) colon normal. Todas las imagenes estan amplificadas x 400.

FIGURA 9: Secuencias parciales de nucleotidos y de aminoacidos deducidas de ADNc del clon GTA3 de STEAP-2 (98P4B6) (SEC ID N.° 7 y 8). La secuencia del extremo 5' de este clon contiene un ORF de 173 aminoacidos. FIGURA 10: Secuencias de nucleotidos de mas miembros de la familia STEAP identificados mediante la busqueda en la base de datos dbest con la secuencia proteica de STEAP-1. Ademas de STEAP-1, se indican otros tres miembros de la familia STEAP con sus numeros de acceso del GenBank. Uno de estos corresponde al gen 98P4B6 que fue identificado mediante SSH.

FIGURA 11: Comparacion estructural primaria de las protelnas de la familia STEAP. FIGURA 11A: Alineamiento de las secuencias de aminoacidos de STEAP-1 (clon 10 de 8P1D4) y STEAP-2 (98P4B6). Se realizo el alineamiento usando el programa de alineamiento SIM de la pagina web de Baylor College of Medicine Search Launcher. Los resultados muestran una identidad del 61,4% en un solapamiento de 171 aminoacidos; Puntuacion: 576,0; frecuencia de huecos: 0,0%. FIGURA 11B. El alineamiento de las secuencias de aminoacidos de STEAP-1 con las secuencias ORF parciales de STEAP-2 y otras dos protelnas miembros de la familia putativa usando el programa PIMA (programa PIMA 1.4 en la direction de Internet <http:\\dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331\multi-align\multi-align.html>); los dominios transmembrana identificados por el programa SOSUI (disponible en la direccion de Internet <http:\\
www.tuat.ac.jp\~mitaku\ adv_sosui\submit.html>)estan en negrita.

FIGURA 12: Expresion predominante de Al139607 en placenta y prostata. Se preparo ADNc de la primera cadena a partir de 16 tejidos normales. La normalization se realizo mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, realizada usando cebadores para Al139607, muestra la expresion predominante de Al139607 en placenta y en prostata tras 25 ciclos de amplification. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar Al139607:

Al139607.1 5' TTAGGACAACTTGATCACCAGCA 3' (SEC ID N.° 13)

Al139607.2 5'TGTCCAGTCCAAACTGGGTTATTT3' (SEC ID N.° 14)

FIGURA 13: Expresion predominante de R80991 en hlgado. Se preparo ADNc de la primera cadena a partir de 16 tejidos normales. La normalizacion se realizo mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi- cuantitativa, realizada usando cebadores para R80991, muestra la expresion predominante de R80991 en hlgado tras 25 ciclos de amplificacion. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar R80991:

R80991.1 5' AGGGAGTTCAGCTTCGTTCAGTC 3' (SEC ID N.° 15)

R80991.2 5' GGTAGAACTTGTAGCGGCTCTCCT 3' (SEC ID N.° 16)

FIGURA 14: Expresion predominante de STEAP-2 (98P4B6) en tejido de prostata. El ADNc de la primera cadena se preparo a partir de 8 tejidos normales, los xenoinjertos LAPC (4AD, 4AI y 9AD) y celulas HeLa. La normalizacion se realizo mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, realizada usando cebadores para 98P486, muestra la expresion predominante de 98P4B6 en prostata normal y los xenoinjertos LAPC. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar STEAP-II:

98P4B6.1 5'GACTGAGCTGGAACTGGAATTTGT 3' (SEC ID N.° 17)

98P4B6.2 5'TTTGAGGAGACTTCATCTCACTGG 3' (SEC ID N.° 18)

FIGURA 15: Expresion inferior del gen STEAP-2/98P4B6 especlfico de la prostata en xenoinjertos de cancer de prostata determinada mediante analisis de transferencia Northern. Se obtuvieron filtros de tejido normal humano (A y B) en Clontech y contienen 2 pg de ARNm por carril. Se preparo el filtro para los xenoinjertos (C) con 10 pg de ARN total por carril. Se analizaron las transferencias usando el clon 98P4B6 derivado de SSH como sonda. Todas las

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FIGURA 16: Expresion de STEAP-2 en prostata y seleccion de lineas celulares de cancer segun lo determinado mediante analisis de transferencia Northern. Se prepararon los filtros para los xenoinjertos y las lineas celulares con 10 pg de ARN total por carril. Se analizaron las transferencias usando un clon 98P4B6 derivado de SSH como sonda. Todas las muestras de ARN fueron normalizadas mediante tincion con bromuro de etidio.

FIGURA 17: Localizacion cromosomica de los miembros de la familia STEAP. Las localizaciones cromosomicas de los genes STEAP descritos en la presente memoria fueron determinadas usando el grupo de hibridos de radiacion GeneBridge4 (Research Genetics, Huntsville AI). El mapeado para STEAP-2 y Al139607 fue realizado usando el grupo de hibridos de radiacion G3 de Stanford (Research Genetics, Huntsville AI).

FIGURA 18: Representation esquematica de los limites intron-exon del ORF del gen STEAP-1 humano. Se identifico un total de 3 intrones (I) y 4 exones (e). FIGURA 19: Analisis de transferencia Southern Zooblot del gen STEAP- 1 en diversas especies. Se preparo ADN genomico de varios organismos diferentes, incluyendo humanos, de mono, de perro, de raton, de pollo y Drosophila. Se digirieron diez microgramos de cada muestra de ADN con EcoRI, se transfirieron sobre nitrocelulosa y se sondaron con una sonda de STEAP-1. Los patrones de tamano se indican en el lateral en kilobases (kb).

FIGURA 20: Analisis de transferencia Southern de BAC de raton con una sonda de STEAP-1. Se preparo ADN de celulas humanas para aislar ADN genomico y de un clon de BAC de raton (12P11) que contiene el gen STEAP de raton. Cada muestra de ADN fue digerida con EcoRI, transferida sobre nitrocelulosa y sondada. Se compararon ocho microgramos de ADN genomico con 250 ng de ADN de BAC de raton.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0016] A no ser que se defina lo contrario, todos los terminos de la tecnica, anotaciones y otra terminologia cientifica usada en la presente memoria pretenden tener los significados comunmente entendidos por aquellos expertos en la tecnica a la que pertenece esta invention. En algunos casos, los terminos que tienen significados comunmente entendidos se definen en la presente memoria para aclarar y/o facilitar su consulta, y no deberia entenderse necesariamente que la inclusion de tales definiciones en la presente memoria represente una diferencia sustancial frente a lo que se entiende en general en la tecnica. Las tecnicas y los procedimientos descritos o a los que se hace referencia en la presente memoria, en general, se comprenden bien y se emplean comunmente mediante el uso de metodologia convencional por parte de los expertos en la tecnica, tales como, por ejemplo, las metodologias de donation molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” II edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Segun lo apropiado, los procedimientos que implican el uso de equipos y reactivos comercialmente disponibles se llevan a cabo generalmente segun los protocolos y/o parametros definidos por el fabricante, a no ser que se indique lo contrario.

[0017] Como se usan en la presente memoria, los terminos “cancer de prostata avanzado”, “cancer de prostata avanzado localmente”, “enfermedad avanzada” y “enfermedad avanzada localmente” significan canceres de prostata que se han extendido a traves de la capsula de la prostata, y pretenden incluir la enfermedad en estadio C en virtud del sistema de la Asociacion Urologica Estadounidense (AUA), la enfermedad en estadio C1-C2 en virtud del sistema de Whitmore-Jewett y la enfermedad en estadio T3-T4 y N+ segun el sistema TNM (tumor, nodo, metastasis). En general, la cirugia no esta recomendada para los pacientes con enfermedad avanzada localmente, y estos pacientes tienen resultados favorables sustancialmente menores en comparacion con los pacientes que tienen cancer de prostata localizado clinicamente (confinado en un organo). La enfermedad localmente avanzada se identifica clinicamente mediante pruebas palpables de induration mas alla del limite lateral de la prostata, o de asimetria o induration sobre la base de la prostata. El cancer de prostata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad patologicamente tras una prostactectomia radical si el tumor invade o penetra en la capsula prostatica, se extiendo en el interior del margen quirurgico o invade las vesiculas seminales.

[0018] Como se usan en la presente memoria, los terminos “cancer de prostata metastasico” y “enfermedad metastasica” significan los canceres de prostata que se han extendido hasta los nodulos linfaticos regionales o hasta puntos distantes, y pretenden incluir la enfermedad en estadio D segun el sistema AUA y en estadio TxNxM+ segun el sistema TNM. Como sucede en el caso del cancer de prostata localmente avanzado, la cirugia no esta generalmente indicada para pacientes con la enfermedad metastasica, siendo la terapia hormonal (ablation androgena) la modalidad preferida de tratamiento. Los pacientes con cancer de prostata metastasico finalmente desarrollan un estado refractario a los androgenos a los 12 a 18 meses del inicio del tratamiento, y aproximadamente la mitad de estos pacientes mueren a los 6 meses. La zona mas comun para la metastasis del cancer de prostata es el hueso. Las metastasis de hueso del cancer de prostata son, a fin de cuentas, caracteristicamente osteoblasticas mas que osteoliticas (es decir, que resultan en la formation neta de hueso). Las metastasis oseas se encuentran mas frecuentemente en la espina, seguida por el femur, la pelvis, las costillas, el craneo y el humero. Otras zonas comunes para la metastasis incluyen los nodulos linfaticos, los pulmones, el higado y el cerebro. El cancer de prostata metastasico se diagnostica comunmente mediante linfadenectomia pelvica laparoscopica o abierta, escaner con radionuclidos de todo el cuerpo, radiografia esqueletica y/o biopsia de la lesion osea.

[0019] Como se usa en la presente memoria, el termino “polinucleotido” significa una forma polimerica de nucleotidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, bien ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido, y pretende incluir formas mono- y bicatenarias de ADN.

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[0020] Como se usa en la presente memoria, el termino “polipeptido” significa un pollmero de al menos 10 aminoacidos. A lo largo de la memoria, se usan las denominaciones estandar de tres letras o de una sola letra para los aminoacidos.

[0021] Como se usan en la presente memoria, los terminos “hibridarse”, “hibridacion”, “se hibrida” y similares, usados en el contexto de los polinucleotido, pretenden referirse a las condiciones de hibridacion convencionales, preferiblemente, tales como la hibridacion en formamida al 50%/6 x SSC/ SDS al 0,1%/ 100 pg/ml de ADNmc, en las que las temperaturas para la hibridacion son superiores a 37 grados C y las temperaturas para el lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% estan por encima de 55 grados C, y lo mas preferible, es que sean condiciones de hibridacion rigurosas.

[0022] En el contexto de las comparaciones entre las secuencias de aminoacidos, el termino “identidad” se usa para expresar el porcentaje de residuos de aminoacido en la misma posicion relativa que son iguales.

[0023] Tambien en este contexto, el termino “homologla” se usa para expresar el porcentaje de los residuos de aminoacido en las mismas posiciones relativas que son bien identicos o similares, usando los criterios de los aminoacidos conservados del analisis BLAST, como se entiende generalmente en la tecnica. Mas adelante, se proporciona mas information acerca de las sustituciones de aminoacidos que son consideradas conservadoras segun tales criterios.

[0024] A lo largo de esta memoria, se entendera que la palabra “comprenden”, o las variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, implican la inclusion de un elemento, un numero entero o una etapa establecidos, o un grupo de elementos, de numeros enteros o de etapas establecido, pero sin la exclusion de ningun otro elemento, numero entero o etapa, o grupo de elementos, numeros enteros o etapas.

[0025] Cualquier description de documentos, actas, materiales, dispositivos, artlculos o similares que haya sido incluida en la presente memoria es unicamente a efectos de proporcionar un contexto para la presente invention. No se supondra que alguna o la totalidad de estas cuestiones forman parte de la base de la tecnica anterior o pertenecen al conocimiento general comun del campo relevante para la presente invencion, pues existlan antes de la fecha de prioridad de cada revindication de esta solicitud.

[0026] A lo largo de los sub-apartados que figuran a continuation, se proporcionan mas definiciones. CARACTERISTICAS MOLECULARES Y BIOQUIMICAS DE STEAP-1

[0027] La presente invencion se refiere a una nueva de protelnas denominada STEAP. En el presente documento se describen especlficamente cuatro STEAP mediante caracterlsticas estructurales, moleculares y bioqulmicas. Como se describe mas detalladamente en los ejemplos que figuran a continuacion, las STEAP han sido caracterizadas en una variedad de modos. Por ejemplo, se realizaron analisis de secuencias de aminoacidos y que codifican nucleotidos a efectos de identificar los elementos estructurales conservados en la familia se STEAP. Se llevaron a cabo amplios analisis de RT-PCR y de transferencia Northern de la expresion del ARNm de STEAP para establecer la selection de tejidos normales y cancerosos que expresan los mensajes de STEAP. Se realizaron analisis de transferencia Western, inmunohistoqulmicos y de citometrla de flujo de la expresion de la protelna STEAP para determinar los perfiles de expresion de protelna, la localization en la superficie celular y la topologla molecular general de STEAP.

[0028] El miembro prototipo de la familia de STEAP, STEAP-1, es una protelna de la superficie celular de seis transmembranas de 339 aminoacidos con una homologla no identificable con ninguna protelna humana conocida. La figura 1A muestra las secuencias de nucleotidos ADNc y de aminoacidos deducida de STEAP-1 humana. En la Figura 1B, se muestra un esquema topologico general de la protelna STEAP-1 integrada en la membrana celular. La expresion de STEAP-1 es predominantemente especlfica de la prostata en tejidos normales. Especlficamente, los amplios analisis del ARNm de STEAP-1 y la expresion de la protelna en tejidos humanos normales muestran que la protelna STEAP-1 se expresa predominantemente en la prostata y, en un grado mucho menor, en la vejiga. El ARNm de STEAP-1 tambien es relativamente especlfico de la prostata, detectandose solo un nivel de expresion muy bajo en otros tejidos normales. En el cancer, el ARNm de STEAP-1 y la protelna se expresan constantemente a niveles elevados en el cancer de prostata y durante todos los estadios de la enfermedad. STEAP-1 tambien se expresa en otros canceres. Especlficamente, el ARNm de STEAP-1 se expresa a niveles muy altos en el cancer de vejiga, de colon, pancreatico y de ovario (as! como en otros canceres). Ademas, la expresion en la superficie celular de la protelna STEAP-1 se ha establecido en canceres de prostata, vejiga y colon. Por lo tanto, STEAP-1 tiene todas las caracterlsticas distintivas de una excelente diana terapeutica para el tratamiento de ciertos canceres, incluyendo particularmente los carcinomas de prostata, de colon y de vejiga.

[0029] STEAP-2 es una protelna transmembrana muy homologa codificada por un gen distinto. Las secuencias de STEAP-1 y STEAP-2 muestran un grado elevado de conservation estructural, particularmente a lo largo de sus dominios transmembrana predichos. Las secuencias de nucleotidos de ADNc parcial y de aminoacidos deducida de STEAP-2 se muestran en la figura 9. Los genes de STEPA-1 y STEAP-2 se localizan en el cromosoma 7, pero en diferentes brazos. STEAP-2 muestra un ARNm y un perfil de expresion de protelna marcadamente diferente con

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relacion a STEAP-1, lo que sugiere que estos dos miembros de la familia de STEAP se pueden regular diferencialmente. STEAP-2 parece ser especifico de prostata, ya que no se detecta una expresion de ARNm significativa en una variedad tejidos normales. En el cancer de prostata, la STEAP-2 tambien aparece que sigue una evolucion diferente con respecto a STEAP-1, ya que la expresion de STEAP-2 esta regulada por descenso en al menos algunos canceres de prostata. Ademas, la expresion de STEAP-2 en otros canceres no de prostata analizados parece estar generalmente ausente, aunque se detecta una expresion a nivel elevado de STEAP-2 (como STEAP-1) en el sarcoma de Ewing.

[0030] STEAP-3 y STEAP-4 parecen estar estrechamente relacionados con STEAP-1 y STEAP-2 a nivel estructural y ambos parecen ser tambien proteinas de membrana. STEAP-3 y STEAP-4 muestran perfiles de expresion unicos. STEAP-3, por ejemplo, parece tener un patron de expresion que esta predominantemente limitado a placenta y, en menor grado, se observa expresion en prostata, pero no en otros tejidos normales analizados. STEAP-4 parece expresarse predominantemente en higado. Ni STEAP-3 ni STEAP-4 parecen expresarse en xenoinjertos de cancer de prostata que muestran una expresion a nivel elevado de STEAP-1 y STEAP-2.

[0031] Tres de las cuatro STEAP descritas en este documento se mapean en el cromosoma 7 humano (STEAP-1, STEAP-2, STEAP-3). Lo interesante es que STEAP-1 se mapea en 7p22 (7p22.3), una gran region de ganancia alelica descrita tanto para los canceres de prostata primarios como para los recurrentes (Visakorpi et al., 1995 Cancer Res. 55: 342, Nupponen et al., 1998 American J. Pathol. 153: 141), lo que sugiere que la regulacion por incremento de STEAP-1 en el cancer podria incluir mecanismos genomicos.

[0032] Se desconoce la funcion de STEAP. Otras moleculas de la superficie celular que contienen seis dominios transmembrana incluyen canales ionicos (Dolly y Parcej, 1996 J Bioenerg Biomembr 28:231) y canales de agua o acuaporinas (Reizer et al., 1993 Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28:235). Los estudios estructurales muestran que ambos tipos de moleculas se ensamblan en complejos tetramericos para formar canales funcionales (Christie. 1995, Clin Exp Pharmacol Physiol 22:944, Walz et al., 1997 Nature 387:624, Cheng et al., 1997 Nature 387:627). La tincion inmunohistoquimico de STEAP-1 en la glandula de la prostata parece estar concentrada en los limites de celula-celula, detectandose una menor tincion en el lado luminal. Esto puede sugerir un papel para la STEAP-1 en las uniones estrechas, las uniones con huecos o la adhesion celular. Para analizar estas posibilidades, se pueden analizar ovocitos de xenopus (u otras celulas) que expresen STEAP usando experimentos con pinzas de voltaje y pinzas de placa para determinar si la STEAP funciona como un canal ionico. Tambien se puede medir el volumen de las celulas ovocitos para determinar si STEAP presenta propiedades de canal de agua. Si las STEAP funcionan como proteinas canal o de union de huecos, pueden servir como excelentes dianas para la inhibicion usando, por ejemplo, anticuerpos, moleculas pequenas y polinucleotidos capaces de inhibir la expresion o la funcion. El patron de expresion restringido a tejido normal y los niveles elevados de expresion en tejido canceroso sugieren que la interferencia con la funcion de las STEAP puede matar selectivamente celulas cancerosas.

[0033] Dado que la familia de genes de STEAP se expresa predominantemente en tejido epitelial, parece posible que las proteinas STEAP funcionen como canales ionicos o proteinas de union de huecos en la funcion de las celulas epiteliales. Los canales ionicos han estado implicados en la proliferacion y la invasion de las celulas cancerosas de prostata (Lalani et al., 1997, Cancer Metastasis Rev 16:29). Las celulas cancerosas de prostata tanto humanas como de rata contienen subpoblaciones de celulas con niveles de expresion mas altos y mas bajos de los canales del sodio. Los niveles mas altos de expresion de los canales del sodio se correlacionan con una invasion mas agresiva in vitro (Smith et al., 1998. FEBS Lett. 423:19). De manera similar, se ha demostrado que un bloqueo especifico de los canales del sodio inhibe la invasion de celulas PC-3 in vitro (Laniado et al., 1997, Am. J. Pathol. 150:1213), mientras que la inhibicion especifica de los canales del potasio en celulas LNCaP inhibio la proliferacion celular (Skryma et al., 1997, Prostate 33:112). Estos informes sugieren un papel para los canales ionicos en el cancer de prostata y tambien demuestran que las moleculas pequenas que inhiben la funcion de los canales ionicos pueden interferir en la proliferacion del cancer de prostata.

POLINUCLEOTIDOS STEAP

[0034] Un aspecto de la invencion proporciona polinucleotidos, segun la reivindicacion 9, correspondientes a todo o parte de una secuencia que codifica STEAP-1, en forma aislada. Tambien se describen polinucleotidos que codifican una proteina STEAP y fragmentos de la misma, ADN, ARN, hibridos ADN/ARN, y moleculas relacionadas, polinucleotidos u oligonucleotidos complementarios a un gen o a la secuencia de ARNm de STEAP, o una parte de los mismos, y polinucleotidos u oligonucleotidos que se hibridan con el gen, con el ARNm de STEAP o con un polinucleotido que codifica STEAP (colectivamente, “polinucleotidos de STEAP”). Como se usan en la presente memoria, los genes y las proteinas STEAP pretenden incluir los genes y las proteinas STEAP-1 y STEAP-2, y los genes y las proteinas correspondientes a los numeros de acceso del GeneBank Al139607 y R80991 (STEAP-3 y STEAP-4, respectivamente) y los genes y proteinas correspondientes a otras proteinas STEAP y variantes estructuralmente similares de los anteriores. Tales otras proteinas y variantes de STEAP, generalmente, tendran secuencias codificantes que seran muy homologas a las secuencias que codifican STEAP-1 y/o STEAP-2, y preferiblemente compartiran al menos aproximadamente el 50% de identidad de aminoacidos y al menos aproximadamente el 60% de homologia de aminoacidos (utilizando el criterio BLAST), mas preferiblemente compartiendo el 70% o mas homologia (utilizando el criterio BLAST).

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[0035] Las secuencias de genes de los miembros de la familia STEAP descritos en este documento codifican protelnas STEAP que comparten dominios unicos de secuencias de aminoacidos altamente conservadas que los distinguen de otras protelnas. Las protelnas que incluyen uno o mas de estos dominios unicos altamente conservados pueden estar relacionados con los miembros de la familia STEAP o pueden representar nuevas protelnas STEAP. Haciendo referencia a la Figura 11A, que es una alineacion de la secuencia de aminoacidos de las secuencias de protelnas completa de STEAP-1 y parcial de STEAP-2, las secuencias de STEAP-1 y STEAP-2 comparten una identidad del 61% y una homologla del 79%, con una conservacion de la secuencia especialmente estrecha en los dominios transmembrana predichos. Haciendo referencia a la Figura 11B, que es una alineacion de aminoacidos de las estructuras disponibles de los cuatro miembros de la familia STEAP, es evidente una conservacion muy estrecha en las zonas de solapamiento, en particular en los dominios transmembrana cuarto y quinto y el bucle intracelular predicho entre ellos. Las comparaciones de secuencias de aminoacidos muestran que (1) STEAP-2 y STEAP-3 son un 50% identicas y un 69% homologas en sus secuencias solapantes; (2) STEAP-2 y STEAP-4 son un 56% identicas y un 87% homologas en sus secuencias solapantes; (3) STEAP-3 y STEAP-1 son un 37% identicas y un 63% homologas en sus secuencias solapantes; (4) STEAP-3 y STEAP-4 son un 38% identicas y un 57% homologas en sus secuencias solapantes; y (5) STEAP 4 y STEAP- 1 son un 42% identicas y un 65% homologas en sus secuencias solapantes.

[0036] Un polinucleotido STEAP puede comprender un polinucleotido que tiene la secuencia de nucleotidos de la STEAP-1 humana segun lo mostrado en la Figura 1A (SEC ID N.° 1) o la secuencia de nucleotidos de STEAP-2 humana segun lo mostrado en la figura 9 (SEC ID N.° 7), una secuencia complementaria a cualquiera de las anteriores o un fragmento de polinucleotido de STEAP de cualquiera de los anteriores. Otro polinucleotido STEAP comprende un polinucleotido que codifica la secuencia de aminoacidos de la protelna STEAP-1 humana segun lo mostrado en la Figura 1A (SEC ID N.° 2) o que codifica la secuencia de aminoacidos de la protelna STEAP-2 humana en la figura 9 (SEC ID N.° 8), una secuencia complementaria a cualquiera de las anteriores o un fragmento de polinucleotido de cualquiera de las anteriores. Otro polinucleotido de STEAP comprende un polinucleotido que es capaz de hibridarse en condiciones rigurosas al ADNc de STEAP-1 humana mostrado en la figura 1 (SEC ID N.° 1) o a un fragmento de polinucleotido del mismo. Otro polinucleotido de STEAP comprende un polinucleotido que es capaz de hibridarse en condiciones rigurosas al ADNc de STEAP-2 humana mostrado en la figura 9 (SEC ID N.° 1) o a un fragmento de polinucleotido del mismo

[0037] Se contemplan especlficamente ADN genomico, ADNc, ribozimas y moleculas antisentido, as! como moleculas de acido nucleico basadas en una estructura alternativa o que incluyen bases alternativas, bien derivadas de fuentes naturales o sintetizadas. Por ejemplo, las moleculas antisentido pueden ser ARN u otras moleculas, incluyendo acidos nucleicos peptldicos (ANP) o moleculas de no acido nucleico, tales como derivados de fosforotioato, que se unen especlficamente con ADN o ARN de un modo dependiente del par de bases. El experto en la tecnica puede obtener facilmente estas clases de moleculas de acido nucleico usando los polinucleotidos STEAP y las secuencias de polinucleotidos descritas en la presente memoria.

[0038] Tambien se describen cebadores y parejas de cebadores que permiten la amplificacion especlfica de los polinucleotidos de la invencion o de cualquier parte especlfica de los mismos, y sondas que se hibridan selectiva o especlficamente con las moleculas de acido nucleico de la invencion o con cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden estar marcadas con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisotopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Tales sondas y cebadores se pueden usar para detectar la presencia de un polinucleotido de STEAP en una muestra y como procedimientos para detectar una celula que expresa una protelna STEAP. Los ejemplos de tales sondas incluyen polinucleotidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de la STEAP-1 humana mostrada en la Figura 1A (SEC ID N.° 1) y polipeptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ARNm de STEAP-2 humana mostrada en la figura 1A (SEC ID N.° 2). Los ejemplos de las parejas de cebadores capaces de amplificar especlficamente los ARNm de STEAP tambien se describen en los ejemplos que figuran a continuacion. Como sera entendido por el experto en la tecnica, se puede preparar un gran numero de cebadores y sondas diferentes en base a las secuencias proporcionadas en la presente memoria y usarlos para amplificar eficazmente y/o detectar un ARNm de STEAP o un ARNm que codifique un miembros particular de la familia de STEAP (por ejemplo, STEAP-1).

[0039] Como se usa en la presente memoria, se dice que un polinucleotido esta “aislado” cuando esta sustancialmente separado de los polinucleotidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes distintos del gen de STEAP o que codifican polipeptidos diferentes al producto genico STEAP o a fragmentos del mismo. El experto en la tecnica puede emplear facilmente estos procedimientos de aislamiento de acidos nucleicos para obtener un polinucleotido STEAP aislado.

[0040] Los polinucleotidos de STEAP de la presente descripcion son utiles para una variedad de objetivos, incluyendo, pero no limitandose a su uso como sondas y cebadores para la amplificacion y/o la deteccion del gen o genes de STEAP, ARNm de STEAP o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnostico y/o el pronostico del cancer de prostata y otros canceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresion de los polipeptidos STEAP; como herramientas para modular la inhibicion de la expresion del gen o genes de STEAP y/o la traduccion del transcrito o transcritos de STEAP; y como agentes terapeuticos.

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PROCEDIMIENTOS PARA AISLAR MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN STEAP

[0041] Las secuencias de ADNc de STEAP descritas en la presente memoria permiten el aislamiento de otros polinucleotidos que codifican el o los productos genicos de STEAP, as! como el aislamiento de polinucleotidos que codifican

[0042] homologos del producto genico de STEAP, isoformas alternativamente empalmadas, variantes alelicas y formas mutantes del producto genico de STEAP. Se conocen diversos procedimientos de clonacion molecular que pueden ser empleados para aislar ADNc de longitud completa que codifiquen un gen de STEAP (vease, por ejemplo, Sambrook, J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, II edicion., Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al., Eds., Wiley e hijos, 1995). Por ejemplo, se pueden emplear convenientemente metodologlas de clonacion en fagos Lambda, usando los sistemas de clonacion comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Se pueden identificar clones de fagos que contienen ADNc de genes STEAP sondando con un ADNc de STEAP marcado o con un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realizacion, se puede sintetizar el ADNc de STEAP-1 (Figura 1A), o una parte del mismo, y usarlo como sonda para recuperar los ADNc de solapamiento y de longitud completa correspondientes a un gen de STEAP. De manera similar, se puede utilizar la secuencia de ADNc de STEAP-2. Se puede aislar un gen STEAP mediante el cribado de bancos de ADN genomico, bancos de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bancos de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con sondas o cebadores de ADN de STEAP.

MOLECULAS DE ADN RECOMBINANTE Y SISTEMAS DE HUESPED-VECTOR

[0043] La presente descripcion tambien proporciona moleculas de ADN o ARN recombinante que contienen un polinucleotido STEAP, segun las reivindicaciones, incluyendo, pero no limitandose a, fagos, plasmidos, fagemidos, cosmidos, YAC, BAC, as! como diversos vectores virales y no virales conocidos en la tecnica, y celulas transformadas o transfectadas con tales moleculas de ADN o ARN recombinante. Como se usa en la presente memoria, una molecula de ADN o ARN recombinante es una molecula de ADN o ARN que ha sido sometida a una manipulacion molecular in vitro. Los procedimientos para generar tales moleculas son conocidos (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0044] La presente invention proporciona ademas un sistema de huesped-vector que comprende una molecula de ADN recombinante que contiene un polinucleotido STEAP, segun las reivindicaciones, dentro de una celula huesped procariota o eucariota adecuada. Los ejemplos de celulas huesped eucariotas adecuadas incluyen una celula de levadura, una celula vegetal o una celula animal, tal como una celula de mamlfero o una celula de insecto (por ejemplo, una celula infectable por baculovirus, tal como una celula Sf9). Los ejemplos de celulas de mamlfero adecuadas incluyen diversas llneas celulares de cancer de prostata, tales como LNCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr1, otras llneas celulares de cancer de prostata transfectables o transducibles, as! como un numero de celulas de mamlfero usadas habitualmente para la expresion de protelnas recombinantes (por ejemplo, celulas COS, CHO, 293, 293T). Mas concretamente, se puede usar un polinucleotido que comprende la secuencia que codifica STEAP para generar protelnas STEAP o fragmentos de las mismas usando cualquier numero de sistemas huesped-vector usados habitualmente y ampliamente conocidos en la tecnica.

[0045] Existe una amplia selection de sistemas de huesped-vector adecuados para la expresion de protelnas STEAP o fragmentos de las mismas disponibles, vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; “Current Protocols in Molecular Biology”, 1995, supra). Los vectores preferidos para la expresion en mamlferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller et al., 1991, MC8 11:1785). Usando estos vectores de expresion, se puede expresar preferiblemente STEAP en varias llneas celulares de cancer de prostata y de no prostata, incluyendo, por ejemplo, 293, 283T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP y TsuPr1. Los sistemas de huesped-vector de la invencion son utiles para la production de una protelna STEAP o un fragmento de la misma. Tales sistemas de huesped-vector se pueden emplear para estudiar las propiedades funcionales de STEAP y de las mutaciones de STEAP.

[0046] Las protelnas codificadas por los genes de STEAP, o por fragmentos de los mismos, tendran una variedad de usos, incluyendo, pero no limitandose a, la generation de anticuerpos y en procedimientos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unan al producto genico de STEAP. Los anticuerpos dirigidos contra una protelna STEAP o un fragmento de los mismos pueden ser utiles en los analisis de diagnostico y pronostico, metodologlas de generacion de imagenes (incluyendo, particularmente, la formation de imagenes de canceres) y procedimientos terapeuticos en el tratamiento de los canceres humanos caracterizados por la expresion de una protelna STEAP, tales como el cancer de prostata, de colon, de mama, carcinomas cervicales y de vejiga, canceres de ovario, canceres testiculares y canceres pancreaticos. Se contemplan diversos analisis inmunologicos utiles para la detection de protelnas STEAP, incluyendo, pero no limitandose a, diversos tipos de radioinmunoanalisis, analisis de inmunoabsorcion ligada a una enzima (ELISA), analisis de inmunofluorescencia ligada a una enzima (ELIFA), procedimientos inmunocitoqulmicos y similares. Tales anticuerpos pueden ser marcados y usados como reactivos para la generacion de imagenes inmunologicas capaces de detectar celulas de prostata (por ejemplo, en procedimientos de generacion de imagenes radioescintigraficas). Las protelnas STEAP tambien pueden ser particularmente utiles en la generacion de vacunas contra el cancer, tal y como se describe mas adelante.

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PROTEINAS STEAP

[0047] Otro aspecto de la presente invencion proporciona varias protelnas STEAP y fragmentos polipeptidicos de las mismas, segun las reivindicaciones. Como se usa en la presente memoria, una protelna STEAP se refiere a una protelna que tiene o incluye la secuencia de aminoacidos de la STEAP-1 humana segun lo proporcionado en la Figura 1A (SEC ID N.° 2), STEAP-2 humana segun lo proporcionado en la Figura 9 (SEC ID N.° 8), la secuencia de aminoacidos de otros homologos y variantes de STEAP de mamlfero, as! como las variantes alelicas y los mutantes por sustituciones conservadoras de estas protelnas que tengan la actividad biologica de las STEAP.

[0048] Las protelnas STEAP de la invencion se definen en las reivindicaciones. Las protelnas de fusion que combinan partes de diferentes protelnas STEAP, o fragmentos de las mismas, as! como las protelnas de fusion de una protelna STEAP y un polipeptido heterologo tambien se incluyen. Como se usa en la presente memoria, el termino “polipeptido STEAP” se refiere a un fragmento de polipeptido o a una protelna STEAP de al menos 10 aminoacidos, preferiblemente, de al menos 15 aminoacidos.

[0049] Una realizacion especlfica de una protelna STEAP comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de STEAP-1 humana como se muestra en la Figura 1A (SEQ ID. NO 2). Otra realizacion de una protelna STEAP comprende un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacidos parcial de STEAP-2 como se muestra en la Figura 9 (SEQ ID. NO 8). Otra realizacion comprende un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacidos parcial de STEAP-3 como se muestra en la Figura 11B. Otra realizacion comprende un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacidos parcial de STEAP-4 como se muestra en la Figura 11B.

[0050] En general, las variantes alelicas naturales de STEAP humana compartiran un grado elevado de identidad estructural y de homologla (por ejemplo, un 90% o mas de identidad). Comunmente, las variantes alelicas de las protelnas STEAP contendran sustituciones de aminoacidos conservadoras dentro de las secuencias de STEAP descritas en la presente memoria o contendran una sustitucion de un aminoacido de una posicion correspondiente en un homologo de STEAP-1. Una clase de variantes alelicas de STEAP seran protelnas que comparten un grado elevado de homologla con al menos una pequena region de una determinada secuencia de aminoacidos de STEAP, pero contendran ademas un alejamiento radical de la secuencia, tal como una sustitucion no conservadora, un truncamiento, una insercion o un desplazamiento de marco. Tales alelos representan las protelnas STEAP mutantes, que comunmente no desempenan las mismas funciones biologicas o no tienen todas las caracterlsticas biologicas.

[0051] Las sustituciones de aminoacidos conservadoras se pueden hacer frecuentemente en una protelna sin alterar bien la configuration o la funcion de la protelna. Tales cambios incluyen la sustitucion de cualquiera entre isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoacidos hidrofobos; acido aspartico (D) por acido glutamico (E) y viceversa; glutamina (O) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Tambien se pueden considerar otras sustituciones como conservadoras, en funcion del medio del aminoacido en particular y de su papel en la estructura tridimensional de la protelna. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, tal y como la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofoba, puede ser frecuentemente intercambiada por leucina e isoleucina, y a veces, por valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en las ubicaciones en las que la caracterlstica significativa del residuo de aminoacido es su carga y las pK que difieren entre estos dos residuos de aminoacido no son significativas. Hay otros cambios mas que se pueden considerar “conservadores” en determinados medios.

[0052] Las protelnas STEAP pueden ejemplarizarse de muchas formas, preferiblemente, de forma aislada. Como se usa en la presente memoria, se dice que una protelna esta “aislada” cuando se emplean procedimientos flsicos, mecanicos o qulmicos para separar la protelna STEAP de los constituyentes celulares que estan normalmente asociados con la protelna. Cualquier experto en la tecnica puede emplear facilmente procedimientos de purification estandar para obtener una protelna STEAP aislada. Una molecula de protelna STEAP purificada estara sustancialmente libre de otras protelnas o moleculas que impidan la union de STEAP con un anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificacion dependeran del uso pretendido. Las realizaciones de una protelna STEAP incluyen una protelna STEAP purificada y una protelna STEAP soluble funcional. En una forma, tales protelnas STEAP solubles funcionales o los fragmentos de las mismas conservan la capacidad para unirse con un anticuerpo u otro ligando.

[0053] La invencion tambien proporciona polipeptidos STEAP que comprenden fragmentos biologicamente activos de la secuencia de aminoacidos de STEAP, tales como un polipeptido correspondiente a parte de las secuencias de aminoacidos de STEAP-1, segun lo mostrado en la Figura 1A (SEC ID N.° 2), tal como se define en las reivindicacion 2 o la reivindicacion 3. Tales polipeptidos de la invencion presentan propiedades de una protelna STEAP, tales como la capacidad para provocar la generation de anticuerpos que se unan especlficamente con un epltopo asociado con una protelna STEAp. Los polipeptidos que comprenden las secuencias de aminoacidos que son unicas para una protelna STEAP particular (en comparacion con otras protelnas STEAP) se pueden usar para generar anticuerpos que reaccionaran especlficamente con la protelna STEAP particular. Por ejemplo, en referencia al alineamiento de aminoacidos de las estructuras de STEAP-1 y STEAP-2 mostradas en la Figura 11A, el experto en la tecnica apreciara facilmente que cada molecula contiene tramos de la secuencia unica para su estructura. Estos tramos unicos se

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pueden usar para generar anticuerpos especificos contra STEAP-1 o STEAP-2.

[0054] Los polipeptidos STEAP se pueden generar usando la tecnologla de slntesis de peptidos estandar o usando procedimientos de escision qulmica conocidos en la tecnica basados en las secuencias de aminoacidos de las protelnas STEAP humanas descritas en la presente memoria. Alternativamente, se pueden usar procedimientos recombinantes para generar moleculas de acido nucleico que codifiquen un fragmento polipeptldico de una protelna STEAP. En este aspecto, las moleculas de acido nucleico que codifican STEAP descritas en la presente memoria proporcionan medios para generar fragmentos definidos de protelnas STEAP. Los polipeptidos STEAP son particularmente utiles en la generacion y la caracterizacion de anticuerpos especificos de un dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epltopo extracelular o intracelular de una protelna STEAP), en la generacion de anticuerpos especificos de un miembro de la familia de STEAP (por ejemplo, anticuerpos contra STEAP-1 o STEAP- 2), que identifiquen agentes o factores celulares que se unan con una STEAP o dominio de STEAP particular, y en diversos contextos terapeuticos, incluyendo, pero no limitandose a, vacunas contra el cancer. Es posible predecir y/o identificar polipeptidos STEAP que contienen estructuras particularmente interesantes usando diversas tecnicas analiticas conocidas en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, los procedimientos de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schuttz o el analisis de Jameson-Woff, o en base a la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente utiles en la generacion de anticuerpos contra STEAP especificos de una subunidad o en la identificacion de factores celulares que se unen con STEAP.

ANTICUERPOS CONTRA STEAP

[0055] La presente descripcion proporciona anticuerpos que se unen con a protelnas y polipeptidos STEAP. Los anticuerpos mas preferidos se uniran selectivamente con la protelna STEAP y no se uniran (o se uniran debilmente) con las proteinas y polipeptidos no STEAP. Los anticuerpos contra STEAP que estan particularmente contemplados incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, asi como fragmentos que contienen el dominio de union antigenica y/o una o mas regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. Como se usa en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una parte de la region variable de la molecula de inmunoglobulina que se une con su diana, es decir, la region de union antigenica.

[0056] Para algunas aplicaciones, puede ser deseable generar anticuerpos que reaccionen especificamente con una proteina STEAP y/o un epitopo en un determinado dominio estructural. Por ejemplo, los anticuerpos preferidos utiles para los objetivos de terapia contra el cancer y generacion de imagenes de diagnostico son aquellos que reaccionan con un epitopo en una region extracelular de la proteina STEAP cuando se expresa en celulas cancerosas. Se pueden generar tales anticuerpos usando protelnas STEAP descritas en la presente memoria, o usando peptidos derivados de los dominios extracelulares predichos de las mismas, como inmunogeno. A tal efecto, con referencia al esquema topologico de la protelna STEAP-1 mostrado en la Figura 18, se pueden seleccionar las regiones de los bucles extracelulares que hay entre los dominios transmembrana indicados y usarlas para disenar los inmunogenes apropiados para desarrollar anticuerpos especificos de un dominio extracelular.

[0057] Los anticuerpos contra STEAP pueden ser particularmente utiles en las estrategias terapeuticas, en los analisis de diagnostico y pronostico y en las metodologias de generacion de imagenes para el cancer de prostata. La descripcion proporciona diversos analisis inmunologicos utiles para la deteccion y la cuantificacion de proteinas y polipeptidos STEAP y STEAP mutantes. Tales analisis comprenden generalmente uno para mas anticuerpos contra STEAP capaces de reconocer y unirse con una protelna STEAP o una protelna STEAP mutante, segun sea lo apropiado, y se pueden realizar en diversos formatos de analisis inmunologicos conocidos en la tecnica, incluyendo, pero no limitandose a, diversos tipos de radioinmunoanalisis, analisis de inmunoabsorcion unida a enzimas (ELISA), analisis de inmunofluorescencia unida a enzimas (ELIFA), y similares. Ademas, tambien se proporcionan procedimientos inmunologicos de generacion de imagenes capaces de detectar el cancer de prostata, incluyendo, pero no limitandose a, procedimientos radioescintigraficos de generacion de imagenes, en los que se usan anticuerpos contra STEAP marcados. Tales analisis pueden ser utiles clinicamente en la deteccion, el control y el pronostico del cancer de prostata, particularmente, el cancer de prostata avanzado.

[0058] Los anticuerpos contra STEAP tambien se pueden usar en procedimientos para purificar proteinas y polipeptidos STEAP y STEAP mutantes, y para aislar homologos de STEAP y moleculas relacionadas. Por ejemplo, en una realizacion, el procedimiento de purificacion de una proteina STEAP comprende incubar un anticuerpo contra STEAP, que ha sido acoplado a una matriz solida, con un lisado u otra solucion que contenga STEAP en condiciones que permitan que el anticuerpo contra STEAP se una con STEAP; lavar la matriz solida para eliminar las impurezas; y eluir la STEAP del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos contra STEAP incluyen generar anticuerpos contra idiopaticos que imiten a la protelna STEAP.

[0059] Tambien es posible usar terapeuticamente los anticuerpos contra STEAP mediante, por ejemplo, la modulacion o la inhibicion de la actividad biologica de una protelna STEAP, o el reconocimiento y destruccion de las celulas cancerosas de prostata que expresen una proteina STEAP. La terapia del cancer de prostata y de otros canceres con anticuerpos se describe mas especificamente en un apartado a parte que figura mas adelante.

[0060] En la tecnica se conocen diversos procedimientos para la preparacion de anticuerpos. Por ejemplo, es posible

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preparar anticuerpos mediante la inmunizacion de un huesped mamlfero adecuado usando una protelna o un peptido STEAP, o un fragmento de los mismos, en forma aislada o inmunoconjugada (“Antibodies: A Laboratory Manual”, CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies. Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Ademas, tambien se pueden usar protelnas de fusion de STEAP, tales como una protelna de fusion de STEAP y GST. En una realization particular, se puede producir una protelna de fusion de GST que comprenda toda o la mayorla de la secuencia de aminoacidos del marco de lectura abierto de la Figura 1A, y usarla como un inmunogeno para generar anticuerpos apropiados. Tambien se pueden usar celulas que expresen o sobreexpresen STEAP para las inmunizaciones. De manera similar, se puede usar cualquier celula disenada geneticamente para expresar STEAP. Tales estrategias pueden dar como resultado la production de anticuerpos monoclonales con mayores capacidades para reconocer la STEAP endogena. Otro inmunogeno util comprende protelnas STEAP unidas a la membrana plasmatica de globulos rojos de oveja.

[0061] La secuencia de aminoacidos de STEAP como la mostrada en la Figura 1A (SEC ID N.° 2) se puede usar para seleccionar regiones especlficas de la protelna STEAP para generar anticuerpos. Por ejemplo, se pueden usar analisis de hidrofobicidad e hidrofilidad de la secuencia de aminoacidos de STEAP para identificar las regiones hidrofilas de la estructura de STEAP. Es posible identificar facilmente las regiones de la protelna STEAP que muestran una estructura inmunogenica, as! como otras regiones y dominios, usando otros diversos procedimientos conocidos en la tecnica, tales como los analisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Para la generation de anticuerpos que reconozcan especlficamente una protelna STEAP mutante, se prefieren las secuencias de aminoacidos unicas para el mutante (en comparacion con la STEAP de tipo natural).

[0062] Los procedimientos para preparar una protelna o un polipeptido para su uso como un inmunogeno y para preparar conjugados inmunogenicos de una protelna con un vehlculo, tal como ASB, KLH u otras protelnas transportadoras, son conocidos en la tecnica. En algunos casos, se puede usar la conjugation directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos, pueden ser eficaces reactivos de union, tales como aquellos suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administration de un inmunogeno de STEAP se realiza generalmente mediante la inyeccion durante un perlodo de tiempo adecuado y el uso de un adyuvante adecuado, tal y como se entiende en la tecnica en general. Durante el plan de inmunizacion, se pueden tomar tltulos de anticuerpos para determinar la idoneidad de la formation de los anticuerpos.

[0063] Se prefieren los anticuerpos monoclonales contra STEAP, y se pueden producir mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden preparar llneas celulares inmortalizadas que secreten un anticuerpo monoclonal deseado usando el procedimiento estandar de Kohler y Milstein, o las modificaciones que producen la inmortalizacion de los linfocitos o las celulas del bazo, como se conoce en general. Las llneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados son cribadas selectivamente mediante inmunoanalisis en el que el antlgeno es la protelna STEAP o un fragmento de STEAP. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado que secreta el anticuerpo deseado, se pueden expandir las celulas y producirse los anticuerpos bien a partir de cultivos in vitro o de fluido ascltico.

[0064] Como se menciona anteriormente, se pueden usar numerosos polipeptidos STEAP como inmunogenes para generar anticuerpos monoclonales usando procedimientos tradicionales. Una realizacion particular comprende un anticuerpo que tine inmunohistoqulmicamente celulas 293T transfectadas con un plasmido de expresion que porta la secuencia codificante de STEAP-1, celulas transfectadas que expresan la protelna STEAP-1, pero no tinen inmunohistoqulmicamente las celulas 293T no transfectadas. En el ejemplo 5 de la presente memoria, se proporciona un analisis para la caracterizacion de tales anticuerpos.

[0065] En otra realizacion de esta description, se pueden generar anticuerpos monoclonales contra STEAP-1 usando celulas NIH 3T3 que expresen STEAP-1 como un inmunogeno para generar los mAb que reconozcan los epltopos de la superficie celular de STEAP-1. Se pueden evaluar selectivamente mAb reactivos mediante ELISA basado en una celula usando celulas PC-3 que sobre-expresen STEAP-1. En otra realizacion especlfica, 3 peptidos que representan las regiones extracelulares de la protelna STEAP-1, (especlficamente, REVIHPLATSHQQyFyKIPILV, (SEC ID N.° 19) RRSYRYKLLNWAYQQVOONKEDAWIEHDVWRMEI (SEC ID N.° 20) y WIDIKQFVWYTPPTF (SEC ID N.° 21)) son acoplados a globulos rojos de oveja para la inmunizacion. En otra realizacion especlfica, la protelna STEAP-1 recombinante generada con una etiqueta de His amino-terminal usando un sistema de expresion adecuado (por ejemplo, sistema de expresion de baculovirus pBlueBac4.5, Invitrogen) se purifica usando una columna de Nlquel, y se usa como inmunogeno.

[0066] Tambien se pueden producir los anticuerpos o sus fragmentos usando la tecnologla actual mediante procedimientos recombinantes. Las regiones que se unen especlficamente con las regiones deseadas de la protelna STEAP tambien se pueden producir en el contexto de los anticuerpos quimericos o injertados en CDR que proceden de multiples especies. Tambien se pueden producir anticuerpos contra STEAP humanizados o humanos, y se prefieren para su uso en contextos terapeuticos. Se conocen diversos enfoques para producir tales anticuerpos humanizados, e incluyen procedimientos quimericos o de injertos en CDR; los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen la expresion en fagos y procedimientos transgenicos (para su consulta, vease Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).

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[0067] Se pueden generar anticuerpos monoclonales contra STEAP completamente humanos usando tecnologlas de clonacion que empleen grandes genotecas combinatorias de Ig humanas (es decir, expresion en fagos) (Griffiths y Hoogenboom, “Building an In vitro immune system: human antibodies from phage display libraries”, en: “Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man”. Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton y Barbas, “Human Antibodies from combinatorial libraries”, Id., pp 65-82). Tambien se pueden producir anticuerpos monoclonales contra STEAP completamente humanos usando ratones transgenicos disenados geneticamente para que contengan locus de genes de inmunoglobulina humana segun lo descrito en la solicitud de patente PCT WO98/24893, Kucherlapati y Jakobovits et al., publicada el 3 de diciembre de 1997 (vease tambien, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. invest. Drugs 7(4): 607-614). Este procedimiento evita la manipulacion in vitro necesaria con la tecnologla de expresion en fagos y produce eficazmente anticuerpos humanos autenticos de afinidad elevada.

[0068] Se puede establecer la reactividad de los anticuerpos contra STEAP con una protelna STEAP mediante un numero de procedimientos conocidos, incluyendo los analisis de transferencia Western, de inmunoprecipitacion, de ELISA y de FACS, que usan, segun lo apropiado, protelnas y peptidos STEAP, celulas que expresan STEAP o extractos de las mismas.

[0069] Es posible marcar un anticuerpo contra STEAP, o un fragmento del mismo, con un marcador detectable, o conjugarlo con una segunda molecula, tal como un agente citotoxico y usarlo para dirigir la segunda molecula a una celula positiva en STEAP (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, en DeVita, Jr., V.T. et al., eds, “Cancer: Principles and Practise of Oncology”. IV ed., J.B. Lippincott Co., Filadelfia, 2624-2636). Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, un radioisotopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima.

PROCEDIMIENTOS PARA LA DETECCION DE STEAP

[0070] Otro aspecto de la presente descripcion se refiere a procedimientos para detectar polinucleotidos STEAP y protelnas STEAp, as! como a procedimientos para identificar una celula que exprese STEAP.

[0071] Mas concretamente, la presente descripcion proporciona analisis para la deteccion de polinucleotidos STEAP en una muestra biologica, tal como suero, hueso, prostata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los polinucleotidos STEAP detectables incluyen, por ejemplo, un gen de STEAP o fragmentos del mismo, ARNm de STEAP, ARNm de variantes de empalme alternativo de STEAP y moleculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleotido STEAP. Se conoce un numero de procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleotidos STEAP en la tecnica y se pueden emplear.

[0072] En una realization de la presente descripcion, un procedimiento para detectar un ARNm de STEAP en una muestra biologica comprende producir ADNc de la muestra mediante transcription inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc as! producido usando polinucleotidos STEAP como cebadores de sentido y antisentido para amplificar los ADNc de STEAP ADNc en la misma; y detectar la presencia de ADNc de STEAP amplificado. En otra realizacion, un procedimiento para detectar un gen de STEAP en una muestra biologica comprende en primer lugar aislar ADN genomico de la muestra; amplificar el ADN genomico aislado usando polinucleotidos STEAP como cebadores de sentido y antisentido para amplificar el gen de STEAP en la misma; y detectar la presencia del gen de STEAP amplificado. Se puede disenar cualquier numero de combinaciones apropiadas de sondas de sentido y antisentido a partir de las secuencias de nucleotidos proporcionadas para STEAP-1 (Figura 1A; SEC ID NO. 1), STeAp-2 (Figura; SEC ID NO 7), STEAP-3 (Figura 10; SEC ID No 11), o StEaP-4 (Figura 10; SEC ID NO: 12), segun se apropiado, y se utilice para este proposito.

[0073] La presente descripcion tambien proporciona analisis para detectar la presencia de una protelna STEAP en un tejido de otra muestra biologica, tal como suero, hueso, prostata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los procedimientos para detectar una protelna STEAP tambien son conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitacion, analisis inmunohistoqulmico, analisis de transferencia Western, analisis de union molecular, ELISA, ELIFA y similares.

[0074] Por ejemplo, en una realizacion de esta descripcion, un procedimiento para detectar la presencia de una protelna STEAP en una muestra biologica comprende en primer lugar poner en contacto la muestra con un anticuerpo contra STEAP-1, un fragmento reactivo con STEAP del mismo o una protelna recombinante que contenga una region de union antigenica de un anticuerpo contra STEAP; y a continuation detectar la union de la protelna STEAP-1 en la muestra con el mismo.

[0075] Tambien se proporcionan procedimientos para identificar una celula que exprese STEAP. En una realizacion, un analisis para identificar una celula que exprese un gen de STEAP comprende detectar la presencia del ARNm de STEAP en la celula. Los procedimientos para la deteccion de ARNm determinados en celulas son conocidos e incluyen, por ejemplo, analisis de hibridacion en los que se usan sondas de ADN complementario (tales como la hibridacion in situ usando ribosondas de STEAP marcadas, transferencia Northern y tecnicas relacionadas) y diversos analisis de amplification de acidos nucleicos (tales como la RT-PCR usando cebadores complementarios especlficos

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para STEAP y otros procedimientos de detection de tipo amplification, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un analisis para identificar una celula que exprese un gen de STEAP comprende detectar la presencia de la protelna STEAP en la celula o secretada por la celula. Hay diversos procedimientos para la deteccion de protelnas que son conocidos en la tecnica y que se pueden emplear para la deteccion de protelnas STEAP y de celulas que expresen STEAP.

[0076] Los analisis de expresion de STEAP tambien pueden ser utiles como una herramienta para la identification y la evaluation de los agentes que modulen la expresion de genes de STEAP. Por ejemplo, la expresion de STEAP-1 esta regulada por incremento de manera significativa en el cancer de colon, de vejiga, pancreatico, de ovario y otros tipos de cancer. La identificacion de una molecula o de un agente biologico que podrla inhibir la sobreexpresion de STEAP-1 puede ser de valor terapeutico en el tratamiento del cancer. Es posible identificar tal agente usando un filtro que cuantifique la expresion de STEAP mediante RT-PCR, la hibridacion de acidos nucleicos o la union con anticuerpos.

ANALISIS PARA DETERMINAR EL ESTADO DE LA EXPRESION DE STEAP

[0077] La determinacion del estado de los patrones de expresion de STEAP en un individuo se puede usar para diagnosticar el cancer y puede proporcionar information de pronostico util en la definition de las opciones terapeuticas apropiadas. De manera similar, el estado de la expresion de STEAP puede proporcionar informacion util para predecir la susceptibilidad a determinados estadios, la progresion y/o la agresividad tumoral de una enfermedad. La presente description proporciona los procedimientos y los analisis para determinar el estado de la expresion de STEAP y diagnosticar canceres que expresen STEAP.

[0078] En un aspecto, la presente descripcion proporciona analisis utiles en la determination de la presencia del cancer en un individuo que comprende detectar un aumento significativo del ARNm de STEAP o de la expresion de la protelna STEAP en una muestra analltica de celulas o tejidos en comparacion con los niveles de expresion en la correspondiente celula o tejido normal. En una realization, se evalua la presencia del ARNm de STEAP-1 en muestras titulares del colon, pancreas, vejiga, ovario, cuello de utero, testlculos o mama. La presencia de una expresion de STEAP-1 significativa en cualquiera de estos tejidos puede ser util para indicar la aparicion, la presencia y/o la gravedad de estos canceres, ya que los correspondientes tejidos normales no expresan el ARNm de STEAP-1. En una realizacion relacionada, se puede determinar el estado de la expresion de STEAP-1 a nivel proteico en lugar de a nivel de acido nucleico. Por ejemplo, dicho procedimiento o analisis comprenderla determinar el nivel de la protelna STEAP-1 expresada por celulas en una muestra analltica de tejido y comparar el nivel as! determinado con el nivel de STEAP expresado en la correspondiente muestra normal. En una realizacion, se evalua la presencia de la protelna STEAP-1, por ejemplo, usando procedimientos inmunohistoqulmicos. Los anticuerpos contra STEAP-1 o patrones de union con STEAP capaces de detectar la expresion de la protelna STEAP se pueden usar en una variedad de formatos anallticos conocidos en la tecnica a tal efecto.

[0079] La sangre periferica se puede analizar convenientemente en cuanto a la presencia de celulas cancerosas, incluyendo el cancer de prostata, de colon, pancreatico, de vejiga y de ovario, usando RT-PCR para detectar la expresion de STEAP-1. La presencia de ARNm de STEAP-1 amplificable mediante RT-PCR proporciona un indicio de la presencia de uno de estos tipos de cancer. Actualmente, se estan evaluando los analisis de deteccion por RT-PCR para las celulas tumorales de sangre periferica para su uso en el diagnostico y el tratamiento de un numero de tumores solidos humanos. En el campo del cancer de prostata, estos incluyen analisis de RT-PCR para la deteccion de celulas que expresen PSA y PSM (Verkalk et al, 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 11952000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Los analisis de RT-PCR son conocidos en la tecnica.

[0080] En otro enfoque, se puede usar un analisis sensible recientemente descrito para detectar y caracterizar celulas de carcinoma en sangre (Racila et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95: 4589-4594). Este analisis combina el enriquecimiento inmunomagnetico con analisis inmunohistoqulmicos y de citometrla de flujo de multiples parametros, y es muy sensible para la deteccion de celulas cancerosas en sangre, y de el se ha publicado que es capaz de detectar una celula epitelial en 1 ml de sangre periferica.

[0081] Un aspecto relacionado de la presente descripcion se dirige a predecir la susceptibilidad a desarrollar cancer en un individuo. En una realizacion, un procedimiento para predecir la susceptibilidad al cancer comprende detectar ARNm de STEAP o protelna STEAP en una muestra de tejido, indicando su presencia la susceptibilidad al cancer, y siendo el grado de expresion del ARNm de STEAP presente proporcional al grado de susceptibilidad.

[0082] Otro aspecto relacionado de la presente descripcion se dirige a procedimientos para medir la agresividad tumoral. En una realizacion, un procedimiento para medir la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de ARNm de STEAP o de protelna STEAP expresado por las celulas en una muestra del tumor, comparar el nivel as! determinado con el nivel de ARNm de STEAP o de protelna STEAP expresado en el correspondiente tejido normal tomado del mismo individuo o en una muestra de referencia de tejido normal, de manera que el grado de la expresion de ARNm de STEAP o de protelna STEAP en la muestra del tumor en comparacion con la muestra normal indica el grado de agresividad.

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[0083] En la presente memoria, se describen procedimientos para detectar y cuantificar la expresion de ARNm de STEAP o de proteina STEAP, y usan la deteccion estandar de acidos nucleicos y proteinas, asi como tecnologias de cuantificacion conocidas en la tecnica. Los procedimientos estandar para la deteccion y la cuantificacion del ARNm de STEAP incluyen la hibridacion in situ usando ribosondas de STEAp marcadas, transferencia Northern y tecnicas relacionadas en las que se usan sondas de polinucleotido STEAP, analisis RT-PCR en los que se usan cebadores especificos de STEAP y otros procedimientos de deteccion de tipo amplificacion, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realizacion especifica, se puede usar una RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresion del ARNm de STEAP segun lo descrito en los ejemplos que figuran a continuacion. Se puede usar cualquier numero de cebadores capaces de amplificar STEAP a tal efecto, incluyendo, pero no limitandose a, los diversos conjuntos de cebadores descritos especificamente en la presente memoria. A tal efecto, se pueden usar procedimientos estandar para la deteccion y la cuantificacion de la proteina. En una realizacion especifica, se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales especificamente reactivos con la proteina STEAP de tipo natural en un analisis inmunohistoquimico de tejido de biopsia.

GENERACION DE IMAGENES DE DIAGNOSTICO DE CANCERES HUMANOS

[0084] Los perfiles de expresion de STEAP-1 y STEAP-2 indican que los anticuerpos especificos de las mismas pueden ser particularmente utiles en formas de radionuclido y otras formas de generacion de imagenes de diagnostico de ciertos canceres. Por ejemplo, el analisis inmunohistoquimico de la proteina STEAP-1 sugiere que en tejidos normales, STEAP-1 se restringe predominantemente a la prostata y a la vejiga. La orientacion transmembranal de STEAP-1 (y presumiblemente STEAP-2) proporciona una diana facilmente identificable por los anticuerpos especificamente reactivos con los epitopos extracelulares. Esta expresion restringida a un tejido y la localizacion de STEAP en la superficie celular de multiples canceres convierte a STEAP en un candidato ideal para la generacion de imagenes de diagnostico. Por consiguiente, se pueden usar tecnicas de generacion de imagenes in vivo para generar imagenes de canceres humanos que expresen una proteina STEAP.

[0085] Por ejemplo, la proteina STEAP-1 de la superficie celular se expresa a niveles muy altos en varios canceres humanos, particularmente, en canceres de prostata, vejiga, colon y ovario y en el sarcoma de Ewing. Ademas, en tejidos normales, la expresion de la proteina STEAP-1 se restringe en buena parte a la prostata. De este modo, los anticuerpos radiomarcados especificamente reactivos con epitopos extracelulares de STEAP-1 pueden ser particularmente utiles en la generacion de imagenes in vivo de tumores solidos de los anteriores canceres. Tales anticuerpos contra STEAP-1 marcados pueden proporcionar sensibilidades de un nivel muy elevado para la deteccion de la metastasis de estos canceres.

[0086] Preferiblemente, en los procedimientos de generacion de imagenes de diagnostico se usan anticuerpos monoclonales.

INMUNOTERAPIA DEL CANCER Y VACUNAS CONTRA EL CANCER

[0087] La presente descripcion proporciona diversos tratamientos inmunoterapeuticos para el cancer de prostata, incluyendo terapia con anticuerpos, vacunas in vivo y procedimientos de inmunoterapia ex vivo, que utilizan polinucleotidos y polipeptidos correspondientes a STEAP y a anticuerpos contra STEAP. Estas aplicaciones terapeuticas se describen mas detalladamente en los siguientes apartados.

[0088] Los solicitantes han ido acumulando pruebas importantes y convincentes de que STEAP-1 se expresa fuertemente de manera uniforme por la superficie de celulas epiteliales glandulares de la prostata y celulas de cancer de prostata. Para mas informacion, veanse los analisis inmunohistoquimicos y de transferencia Western de la expresion de la proteina STEAP-1 presentados en los ejemplos 3C (y 3D), asi como los perfiles de expresion de ARNm de STEAP-1 obtenidos a partir de los datos generados mediante transferencia Northern y RT-PCR presentados en los ejemplos 1 y 3A, 3B. En concreto, los resultados del analisis inmunohistoquimico muestran que la superficie de las celulas epiteliales (normales o cancerosas) de la prostata humana parece estar revestida uniformemente por STEAP- 1. El analisis bioquimico confirma la ubicacion de STEAP-1 en la superficie celular sugerida inicialmente por sus elementos estructurales primarios de las 6 transmembranas putativas y por la tincion pericelular claramente visualizada por tincion inmunohistoquimica.

[0089] STEAP-1 se expresa uniformemente a niveles elevados por la superficie de los epitelios glandulares de la prostata, una situation ideal para las estrategias de intervention inmunoterapeutica que dirigen epitopos de STEAP extracelulares. Cabria esperar que la administration sistemica de composiciones inmunorreactivas con STEAP diera como resultado un amplio contacto de la composition con las celulas epiteliales de la prostata mediante la union de los epitopos extracelulares de STEAP-1. Ademas, dada casi la ausencia de expresion de la proteina STEAP-1 en los tejidos humanos normales, existen razones mas que suficientes para esperar una intensisima sensibilidad sin los efectos toxicos, inespecificos y/o sin diana provocados por la union de la composicion inmunoterapeutica con STEAP- 1 sobre organos y tejidos no diana.

[0090] Ademas del alto nivel de expresion de STEAP-1 en la prostata y en celulas de cancer de prostata, STEAP-1 parece estar sustancialmente sobre-expresado en una variedad de otros canceres humanos, incluyendo cancer de

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vejiga, colon, pancreatico y ovario. En concreto, se detecta un alto nivel de expresion del ARNm de STEAP-1 en todos los tejidos y las lineas celulares de cancer de prostata analizados, y en la mayoria de las lineas celulares de cancer pancreatico, de colon y de vejiga analizadas. Tambien se observa un alto nivel de expresion de STEAP-1 en algunas lineas celulares de cancer de ovario. Se observa un nivel de expresion menor en algunas lineas celulares de cancer de mama, testicular y cervical. Tambien se detecta un nivel de expresion muy alto en una linea celular de sarcoma de Ewing. Los solicitantes han demostrado que la proteina STEAP-1 de la superficie celular se expresa en canceres de vejiga y de colon, mientras que no hay proteina STEAP-1 de la superficie celular (o intracelular) detectable en el colon normal, y hay una baja expresion en vejiga normal. Los anticuerpos especificamente reactivos con los dominios extracelulares de STEAP-1 pueden ser utiles en el tratamiento de estos canceres sistematicamente, bien como conjugados con toxinas o agentes terapeuticos, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferacion o la funcion celular.

[0091] La proteina STEAP-2 se expresa tambien en el cancer de prostata, y puede expresarse en otros tipos de cancer tambien. El analisis de ARNm de STEAP-2 por RT-PCR y transferencia Northern muestra que la expresion esta restringida a la prostata en tejidos normales, tambien se expresa en algunos canceres de prostata, pancreas, colon, testicular, ovario y otros canceres. Por lo tanto, los anticuerpos reactivos con STEAP-2 pueden ser utiles en el tratamiento de la prostata y otros canceres. Del mismo modo, aunque todavia no caracterizado por los solicitantes, la expresion de STEAP-3 y STEAP-4 (asi como otros STEAP) pueden estar asociados con algunos tipos de cancer. Por lo tanto, los anticuerpos reactivos con estas proteinas de los miembros de la familia de STEAP tambien pueden ser utiles terapeuticamente.

[0092] Es posible introducir anticuerpos contra STEAP en un paciente tal que el anticuerpo se una con STEAP en las celulas cancerosas y medie la destruccion de las celulas y del tumor y/o inhiba el crecimiento de las celulas o del tumor. Los mecanismos mediante los cuales tales anticuerpos ejercen un efecto terapeutico pueden incluir la citolisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, modulacion de la funcion fisiologica de STEAP, inhibicion de la union con ligandos o de las rutas de transduccion de senales, modulacion de la diferenciacion de las celulas tumorales, modificacion de los perfiles de los factores de angiogenesis tumoral y/o la induction de la apoptosis. Tambien se pueden usar terapeuticamente anticuerpos contra STEAP conjugados con agentes terapeuticos o toxicos para administrar el agente terapeutico o toxico directamente en las celulas tumorales que portan STEAP.

[0093] La inmunoterapia del cancer en la que se usan los anticuerpos contra STEAP puede seguir las ensenanzas generadas por diversos enfoques que han sido empleados con exito con respecto a otros tipos de cancer, incluyendo, pero no limitandose al cancer de colon (Arlen et al., 1998, Crit Rev Immunol 18:133-138), mieloma multiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cancer gastrico (Kasprzyk et al., 1992. Cancer Res 52: 2771-2776), linfoma de celulas B (Funakoshi et al., 1996, J Immunther Emphasis Tumor Immunol 19: 93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk Res 20: 581-589), cancer colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res 54: 6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res 55: 4398-4403) y cancer de mama (Shepard et al., 1991, J Clin Immunol 11:117-127).

[0094] Aunque la terapia con anticuerpos contra STEAP puede ser util para todos los estadios de los anteriores canceres, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en canceres avanzados o metastasicos. Puede ser preferible combinar el procedimiento de terapia con anticuerpos con un regimen quimioterapeutico o de radiaciones en pacientes que no hayan recibido un tratamiento quimioterapeutico, mientras que el tratamiento con la terapia de anticuerpos de la invention puede estar indicado para los pacientes que hayan recibido una o mas quimioterapias. Ademas, la terapia con anticuerpos tambien puede permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente, en pacientes que no toleren muy bien la toxicidad del agente quimioterapeutico.

[0095] Puede ser deseable la evaluation de pacientes de cancer que no sea de prostata en cuanto a la presencia y el nivel de sobre-expresion de STEAP, preferiblemente, usando evaluaciones inmunohistoquimicas de tejido tumoral, generation cuantitativa de imagenes de STEAP u otras tecnicas capaces de indicar fiablemente la presencia y el grado de sobreexpresion de STEAP. Puede preferirse el analisis inmunohistoquimico de biopsias tumorales o muestras quirurgicas a tal efecto. Los procedimientos para el analisis inmunohistoquimico de tejidos tumorales son conocidos en la tecnica.

[0096] Los anticuerpos monoclonales contra STEAP utiles en el tratamiento del cancer de prostata y de otros canceres incluyen aquellos que son capaces de iniciar una potente respuesta inmune frente al tumor y aquellos que son capaces de dirigir la citotoxicidad. A este respecto, los mAb contra STEAP pueden provocar una lisis de las celulas tumorales mediante mecanismos de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o mediada por el complemento, los cuales requieren una portion Fc intacta de la molecula de inmunoglobulina para su interaction con los sitios del receptor Fc de las celulas efectoras o proteinas del complemento. Ademas, son utiles los mAb contra STEAP que ejercen un efecto biologico directo sobre el crecimiento tumoral. Los mecanismos potenciales mediante los cuales pueden actuar tales mAb directamente citotoxicos incluyen la inhibicion del crecimiento celular, la modulacion de la diferenciacion celular, la modulacion de los perfiles de los factores angiogenicos tumorales y la induccion de la apoptosis. Es posible evaluar los mecanismos mediante los cuales un determinado mAb contra STEAP ejerce un efecto contra tumores usando cualquier numero de analisis in vitro disenados para determinar la ADCC, ADMMC, la

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lisis celular mediada por el complemento, etcetera, tal y como se sabe en la tecnica en general.

[0097] La actividad anti-tumoral de un determinado mAb contra STEAP o de una combination de mAb contra STEAP puede ser evaluada in vivo usando un modelo animal adecuado. Por ejemplo, los modelos de cancer de prostata xenogenicos, en los que se introducen explantes de cancer de prostata humanos o tejidos de xenoinjertos pasados en animales cuyo sistema inmune esta afectado, tales como ratones desnudos o SCID, son apropiados en relation con el cancer de prostata y han sido descritos (Klein et al., 1997. Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la solicitud de patente via PCT WO98/16628, Sawyers et al., publicada el 23 de abril de 1998, describe diversos modelos de xenoinjerto de cancer de prostata humano capaces de repetir el desarrollo de tumores primarios, micrometastasis y la formation de la metastasis osteoblastica caracterlstica de los ultimos estadios de la enfermedad. La eficacia puede ser precisa usando analisis que midan la inhibition de la formacion tumoral, la regresion del tumor o la metastasis, y similares.

[0098] Cabe destacar que el uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros no humanos, mAb quimericos humanos/de raton, puede inducir respuestas inmunes de moderadas a fuertes en algunos pacientes. En los casos mas graves, tal respuesta inmune puede conducir a la amplia formacion de complejos inmunes que pueden provocar potencialmente una insuficiencia renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferidos usados en la practica de los procedimientos terapeuticos descritos en la presente memoria son aquellos que bien son completamente humanos o humanizados y que se unen especlficamente con el antlgeno diana 20P1F12/TMPRSS2 con una afinidad alta, pero que presentan una antigenicidad nula o baja en el paciente.

[0099] Los procedimientos de esta description contemplan la administration de mAb individuales contra STEAP, as! como de combinaciones o “cocteles” de diferentes mAb. Tales cocteles de mAb pueden tener ciertas ventajas en tanto en cuanto contienen mAb que explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente mAb citotoxicos con mAb que se atienen a la funcionalidad de los efectores inmunes. Tales mAb en combinacion pueden presentar efectos terapeuticos sinergicos. Ademas, la administracion de mAb contra STEAP puede combinarse con otros agentes terapeuticos, incluyendo, pero no limitandose a, diversos agentes quimioterapeuticos, bloqueadores de androgenos y moduladores inmunes (por ejemplo, IL-2, GM-CSF). Los mAb contra STEAP pueden ser administrados bien en forma “desnuda” o no conjugada, o pueden tener agentes terapeuticos conjugados a los mismos.

[0100] Los anticuerpos monoclonales contra STEAP usados en la practica del procedimiento de la presente descripcion pueden ser formulados en composiciones farmaceuticas que comprendan un vehlculo adecuado para el procedimiento de administracion deseado. Los vehlculos adecuados incluyen cualquier material que, cuando se combine con los mAb contra STEAP, conserve la funcion anti-tumoral del anticuerpo y no sea reactivo con los sistemas inmunes de los sujetos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de entre un numero de vehlculos farmaceuticos estandar, tales como soluciones esteriles salinas tamponadas con fosfato, agua bacteriostatica, y similares.

[0101] Las formulaciones de anticuerpo contra STEAP se pueden administrar por cualquier via capaz de administrar los anticuerpos a la zona del tumor. Las vlas potencialmente eficaces de administracion incluyen, pero no se limitan a, la via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradermica y similares. La via de administracion preferida es mediante inyeccion intravenosa. Una formulation preferida para la inyeccion intravenosa comprende los mAb contra STEAP en una solution de agua conservada bacteriostatica, agua no conservada esteril y/o diluida en polivinilcloruro o bolsas de polietileno que contienen cloruro sodico esteril al 0,9% para inyeccion, USP. La preparation de mAb contra STEAP puede ser liofilizada y almacenada como un polvo esteril, preferiblemente, al vaclo, y a continuation ser reconstituida en agua bacteriostatica que contiene, por ejemplo, conservante de alcohol bencllico o en agua esteril antes de la inyeccion.

[0102] El tratamiento generalmente implicara la administracion repetida de la preparacion de anticuerpos contra STEAP por una via aceptable de administracion, tal como mediante inyeccion intravenosa (IV), habitualmente, a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb a la semana pueden ser eficaces y bien toleradas. Basandose en la experiencia cllnica con el mAb Herceptina en el tratamiento del cancer de mama metastasico, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV seguida por dosis semanales de aproximadamente 2/mg/kg IV de la preparacion de mAb contra STEAP puede representar un regimen de dosificacion aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusion de 90 minutos o de mayor duration. La dosis de mantenimiento periodico se puede administrar como una infusion de 30 minutos o mas tiempo, siempre y cuando la dosis inicial sea bien tolerada. Sin embargo, como entendera cualquier experto en la tecnica, diversos factores influiran en el regimen de dosificacion ideal en un determinado caso. Tales factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de union y la vida media del mAb o de los mAb usados, el grado de sobreexpresion de STEAP en el paciente, el alcance del antlgeno STEAP emitido circulante, el nivel de concentration de anticuerpos en estado estable deseado, la frecuencia del tratamiento y la influencia de los agentes quimioterapeuticos usados en combinacion con el procedimiento de tratamiento.

[0103] Optimamente, los pacientes deberlan ser evaluados en cuanto al nivel de antlgeno STEAP emitido circulante en suero para ayudar a la determination del regimen de dosificacion mas eficaz y de los factores relacionados. Tales

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evaluaciones tambien se pueden usar para controlar los objetivos planteados durante la terapia, y tambien pueden ser utiles para medir el exito terapeutico en combinacion con la evaluacion de otros parametros (tales como los niveles de PSA en suero en una terapia contra el cancer de prostata).

VACUNAS CONTRA EL CANCER

[0104] La presente description proporciona ademas vacunas contra el cancer de prostata que comprenden una protelna STEAP o un fragmento de la misma. El uso de un antlgeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral y mediada por celulas para su uso en una terapia frente al cancer es conocido en la tecnica, y se ha empleado en el cancer de prostata con el uso de inmunogenes de PSMA humanos y de PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997. J. Immunol: 159: 3113-3117). Es posible poner tales procedimientos facilmente en practica empleando una protelna STEAP, o un fragmento de la misma, o una molecula de acido nucleico que codifique STEAP y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar apropiadamente el inmunogeno de STEAP.

[0105] Por ejemplo, se pueden usar sistemas de administration de genes vlricos para administrar una molecula de acido nucleico que codifica STEAP. Los diversos sistemas de administracion de genes vlricos que se pueden usar en la practica de este aspecto de la presente descripcion incluyen, pero no se limitan al, virus de la viruela, de la viruela aviar, de la viruela del canario, adenovirus, gripe, poliovirus, virus adeno-asociado, lentivirus y virus Sindbus (Restifo, 1996. Curr. Opin. Immunol 8: 658-663). Tambien se pueden emplear sistemas de administracion no vlricos usando ADN desnudo que codifica una protelna STEAP o un fragmento de la misma introducidos en el paciente (por ejemplo, intramuscularmente) para inducir una respuesta anti-tumoral. En una realization, se puede emplear el ADNc de STEAP humana de longitud completa. En otra realizacion, se pueden emplear moleculas de acido nucleico de STEAP que codifican epltopos de linfocitos T citotoxicos (CTL) especlficos. Los epltopos de CTL se pueden determinar usando algoritmos especlficos (por ejemplo, Epimer. Brown University) para identificar peptidos en una protelna STEAP que sean capaces de unirse optimamente con alelos de HLA especificados.

[0106] Tambien se pueden emplear diversas estrategias ex vivo. Un enfoque implica el uso de celulas dendrlticas para presentar un antlgeno STEAP al sistema inmune de un paciente. Las celulas dendrlticas expresan el MHC de clase I y II, el coestimulador B7 e IL-12, y son por tanto celulas que presentan antlgenos muy especializados. En el cancer de prostata, las celulas dendrlticas autologas pulsadas con peptidos del antlgeno de la membrana especlfico de la prostata (PSMA) se estan usando en una prueba cllnica en fase I para estimular los sistemas inmunes de pacientes de cancer (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Las celulas dendrlticas se pueden usar para presentar peptidos STEAP en celulas T en el contexto de la molecula del MHC de clase I y II. En una realizacion, se pulsan celulas dendrlticas autologas con peptidos STEAP capaces de unirse con moleculas del MHC. En otra realizacion, las celulas dendrlticas son pulsadas con la protelna STEAP completa. Otra realizacion mas implica disenar geneticamente la sobre-expresion del gen de STEAP en celulas dendrlticas usando diversos vectores de aplicacion conocidos en la tecnica, tales como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociado, transfection de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869) y tranfeccion de ARN derivado del tumor (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med 186:1177-1182).

[0107] Tambien se pueden usar anticuerpos contra STEAP anti-idiotipos en la terapia contra el cancer como vacuna para inducir una respuesta inmune en celulas que expresan una protelna STEAP. Especlficamente, la generation de anticuerpos anti-idiotipos se conoce en la tecnica y se puede adaptar facilmente a la generacion de anticuerpos contra STEAP anti-idiotipos que imiten un epltopo en una protelna STEAP (vease, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al., 1996. Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Es posible usar tal anticuerpo anti-idiotipo en terapia contra idiotipos como la que se emplea actualmente con otros anticuerpos anti-idiotipos dirigidos contra antlgenos tumorales.

[0108] Se pueden emplear procedimientos de inmunizacion genetica para generar respuestas profilacticas o humorales terapeuticas e inmunes celulares dirigidas contra celulas cancerosas que expresan STEAP. Se pueden inyectar directamente en el musculo o en la piel de un individuo constructos que comprenden ADN que codifica una protelna/un inmunogeno STEAP y secuencias apropiadas reguladoras, tal que las celulas del musculo o de la piel incorporen el constructo y expresen la protelna/el inmunogeno STEAP codificado. La expresion del inmunogeno de la protelna STEAP da lugar a la generacion de una inmunidad humoral y celular profilactica o terapeutica frente al cancer de prostata. Se pueden usar varias tecnicas de inmunizacion genetica terapeuticas y profilacticas conocidas en la tecnica (para su consulta, veanse la information y las referencias publicadas en la direction de Internet
www.genweb.com).

EQUIPOS

[0109] Para el uso en las aplicaciones de diagnostico y terapeuticas descritas o sugeridas anteriormente, tambien se proporcionan equipos. Tales equipos pueden comprender un vehlculo que este dividido en compartimentos para recibir en confinamiento una o mas formas de envase tales como viales, tubos, y similares, cada una de los cuales comprende uno de los elementos separados para ser usado en el procedimiento. Por ejemplo, una de las formas de envase puede

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comprender una sonda que es o puede ser detectablemente marcada. Tal sonda puede ser un anticuerpo o un polinucleotido especifico de una proteina STEAP o un gen de STEAP o un mensaje, respectivamente. Cuando el equipo utiliza la hibridacion del acido nucleico para detectar el acido nucleico diana, el equipo tambien puede tener envases que contienen el nucleotido nucleotidos para la amplificacion de la secuencia de acidos nucleicos diana y/o un envase que comprenda formas de marcaje, como proteinas de union a la biotina, tales como avidina o estreptavidina, unidas con una molecula indicadora, tal como un marcador enzimatico, fluorescente, o radionucleotidico.

EJEMPLOS

[0110] Varios aspectos de la presente descripcion y de la presente invencion se describen e ilustran adicionalmente mediante varios ejemplos que se presentan a continuacion, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invencion segun lo reivindicado. El alcance de la invencion esta definido por las reivindicaciones.

EJEMPLO 1: AISLAMIENTO DE FRAGMENTO DE ADNc DEL GEN STEAP-1

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Lineas celulares y tejidos humanos

[0111] Todas las lineas celulares de cancer humanas usadas en este estudio fueron obtenidas de la ATCC. Todas las lineas celulares se mantuvieron en OMEM con suero de ternero fetal al 10%. Las PrEC (celulas epiteliales primarias de la prostata) fueron obtenidas en Clonetics y se desarrollaron en medios PrEBM complementados con factores de crecimiento (Clonetics).

[0112] Todos los xenoinjertos de cancer de prostata humanos fueron proporcionados inicialmente por Charles Sawyers (UCLA) (Klein et al., 1997). Los xenoinjertos LAPc-4 AD y LAPC-9 AD fueron pasados segun lo habitual como pequenos pedazos de tejido a SCID macho receptores. Los xenoinjertos LAPC-4 Al y LAPC-9 Al se obtuvieron segun lo descrito anteriormente (Klein et al., 1997) y se pasaron a ratones SCID macho castrados y hembra. Se obtuvo del paciente una muestra de tejido de hiperplasia prostatica benigna.

[0113] Los tejidos humanos para el analisis del ARN y las proteinas se obtuvieron en el Centro de Tejidos Humanos (HTRC) de UCLA (Los Angeles, CA) y en GualTek, Inc. (Santa Barbara, CA).

Aislamiento del ARN:

[0114] Se homogenizaron el tejido tumoral y las lineas celulares en un reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de tejido o 10 ml/108 celulas para aislar el ARN total. Se purifico el ARN de poli(A) del ARN total usando equipos Mini y Midi de ARNm Oligotex de Qiagen. Se cuantificaron el ARNm y el ARN total mediante analisis espectrofotometrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron mediante electroforesis sobre gel.

Oligonucleotidos:

[0115] Se usaron los siguientes oligonucleotidos purificados mediante CLAR:

RSACDN (cebador de sintesis de ADNc):

[0116] 5TTTTGTACAAGCTT303' (SEC ID N.° 22)

Adaptador 1:

[0117]

5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3’

3'GGCCCGTCCA5' (SEQ ID NO: 23)

Adaptador 2:

5‘GTAATACGACT CACTATAGGGCAGCGTGGT C GCGGCCGAGGT3' .

3’CGGCTCCAS* (SEQ ID NO: 24)

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Cebador de PCR 1:

[0119] 5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEC ID N.° 25)

Cebador anidado (NP) 1:

[0120] 5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3' (SEC ID N.° 26)

Cebador anidado (NP)2:

[0121] 5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3' (SEC ID N.° 27)

Hibridacion sustractiva por supresion:

[0122] La hibridacion sustractiva por supresion (SSH) se uso para identificar los ADNc correspondientes a los genes que pueden estar sobre-regulados en el cancer de prostata dependiente de androgenos en comparacion con la hiperplasia prostatica benigna.

[0123] Los ADNc bicatenarios correspondientes al xenoinjerto LAPC AD (probador) y al tejido de HPB (conductor) se sintetizaron a partir de 2 |jg de ARN poli(A)+ aislado a partir del xenoinjerto y del tejido de HPB, segun lo descrito anteriormente, usando el equipo de sustraccion de ADNc seleccionado por PCR de CLONTECH y 1 ng de oligonucleotido RSACDN como cebador

[0124] Las slntesis de la primera y de la segunda cadena se llevaron a cabo segun lo descrito en el protocolo del manual de usuario del equipo (n.° de protocolo de Clontech PT1117-1, n.° de catalogo K1804-1). El ADNc resultante fue digerido con Rsa I durante 3 h a 37°C. Se extrajo el ADNc digerido con fenol/cloroformo (1:1) y etanol precipitado.

[0125] Se genero el ADNc conductor (HPB) mediante la combinacion en una proporcion de 4 a 1 de ADNc de HPB digerido por Rsa I con ADNc digerido procedente de hlgado de raton para garantizar la sustraccion de los genes murinos del ADNc probador (LAPC-4 aD).

[0126] El ADNc probador (LAPC-4 AD) fue generado por medio de la dilucion de 1 jl de ADNc de LAPS-4 AD digerido con Rsa I (400 ng) en 5 jl de agua. Se ligo entonces el ADNc diluido (2 jl, 160 ng) con 2 jl de adaptador 1 y adaptador 2 (10jM), en reacciones de union separadas, en un volumen total de 10 jl a 16°C toda la noche, utilizando 400 u de aDn ligasa de T4 (CLONTECH). La union fue terminada con 1 j1 de eDtA 0,2M y calentamiento a 72°C durante 5 min.

[0127] La primera hibridacion se realizo mediante la adicion de 1,5 jl (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de los dos tubos que contenlan 1,5 jl (20 ng) de adaptador 1 y Adaptador 2 unidos al ADNc probador. En un volumen final de 4 jl, se cubrieron las muestras con aceite mineral, se desnaturalizaron en un termociclador MJ Research a 98°C durante 1,5 minutos, y luego se dejo que se hibridaran durante 8 h a 68°C. Se mezclaron entonces las dos hibridaciones junto con 1 jl mas de ADNc conductor desnaturalizado recien preparado y se permitio su hibridacion durante toda la noche a 68°C. Se diluyo entonces la segunda hibridacion en 200 jl de Hepes 20mM, pH 8,3; NaCl 50mM, EDTA 0,2mM, se calento a 70°C durante 7 min y se almaceno a -20°C.

Amplification por PCR, donation y secuenciacion de los Fragmentos Genicos Generados a partir de la SSH:

[0128] Para la amplificacion de los fragmentos genicos que resultan de las reaccione de SSH, se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la primera reaction de PCR, se anadio 1 jl de la mezcla final de hibridacion diluida a 1 jl de cebador de PCR 1 (10jM), 0,5 jl de mezcla de dNTP (10jM), 2,5 jl de tampon de reaccion x 10 (CLONTECH) y 0,5 jl de mezcla de 50 x ADNc polimerasa Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 jl. La PCR 1 fue realizada utilizando las siguientes condiciones: 75°C durante 5 min., 94°C durante 25 s., luego 27 ciclos de 94°C durante 10 s., 66°C durante 30 s., 72°C durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones de PCR primarias por separado para cada experimento. Los productos fueron reservados y diluidos 1:10 con agua. Para la reaccion de PCR secundaria, se anadio 1 jl procedente de la reaccion de PCR primaria que habla sido reservada y diluida a la misma mezcla de reaccion usada durante la PCR 1, a exception de que se usaron los cebadores NP1 y NP2 (10jM) en lugar del cebador de PCR 1. La PCR 2 se realizo utilizando 10-12 ciclos de 94°C durante 10 s., 68°C durante 30 s., 72°C durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.

[0129] Los productos de PCR fueron insertados en el pCR2.1 utilizando el equipo de clonacion del vector T/A (Invitrogen). Las E. coli transformadas fueron sometidas a selection azul/blanco y con ampicilina. Se recogieron las colonias de color blanco y se colocaron en placas de 96 pocillos para someterlas a crecimiento en medio de cultivo llquido durante toda la noche. Para la identification de los insertos, la amplificacion por PCR se realizo en 1 ml de cultivo bacteriano usando las condiciones de la PCR1 y con NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR fueron analizados usando electroforesis en gel de agarosa al 2%.

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[0130] Los clones bacterianos se almacenaron en glicerol al 20% bajo el formato de 96 pocillos. El ADN del plasmido fue preparado, secuenciado y sometido a busquedas de homologla con otros acidos nucleicos en las bases de datos GenBank, dBest y NCI-CGAP.

Analisis de la expresion por RT-PCR:

[0131] Los ADNc de la primera cadena fueron generados a partir de 1 pg de ARNm con oligo(dT)12-18 como cebador usando el sistema de pre-amplificacion Superscript de Gibco-BRL. Se uso el protocolo de los fabricantes, y se incluyo una incubacion durante 50 min a 42°C con transcriptasa inversa seguida por un tratamiento con RNasa H a 37°C durante 20 min. Una vez completada la reaccion, se aumento el volumen hasta 200 pl con agua antes de la normalization. Se obtuvieron en Clontech ADNc de la primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes.

[0132] La normalizacion de los ADNc de la primera cadena de multiples tejidos se realizo usando los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' para amplificar p-actina. Se amplifico el ADNc de la primera cadena (5 pl) en un volumen total de 50 pl que contenla cebadores 0,4pM, 0,2pM de cada dNTP, 1 x tampon de PCR (Clontech, Tris-HCl 10mM; MgCl2 1,5mM; KCI 50mM, pH 8,3) y 1 x ADN polimerasa de Klentaq (Clontech). Se retiraron cinco pl de la reaccion PCR en los ciclos 18, 20 y 22, y se usaron para una electroforesis sobre gel de agarosa. La PCR se realizo usando un termociclador MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalizacion inicial fue a 94°C durante 15 s., seguida por los ciclos 18, 20 y 22 de 94°C durante 15 s., 66°C durante 2 min, 72°C durante 5 s. Se llevo a cabo un alargamiento final a 72°C durante 2 min. Tras la electroforesis sobre gel de agarosa, se compararon las intensidades de las bandas de p-actina de 283 pb de multiples tejidos mediante inspection ocular. Se calcularon los factores de dilution para los ADNc de la primera cadena para dar como resultado intensidades de bandas de p-actina iguales en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR. Fueron necesarias tres series de normalizacion para alcanzar intensidades de banda iguales en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR.

[0133] Para determinar los niveles de expresion del gen 8P1D4, se analizaron 5 pl del ADNc de la primera cadena normalizado por PCR usando 25, 30 y 35 ciclos de amplification usando los siguientes pares de cebadores, que fueron disenados con la ayuda de MIT (Para mas information, vease
www.genome.wi.mitedu):

5' ACT TTG TTG ATG ACC AGG A TT GGA 3' (SEC ID N.° 28)

5' CAG AAC TTC AGC ACA CAC AGG AAC 3' (SEC ID N.° 29)

[0134] Se realizo un analisis semi-cuantitativo de la expresion mediante la comparacion de los productos PCR en los numeros de ciclo que proporcionaron intensidades de banda ligeras.

RESULTADOS:

[0135] Los experimentos de SSH fueron realizados segun lo descrito en el apartado de Materiales y Procedimientos, mas arriba, y conducen al aislamiento de numerosos clones de fragmentos genicos candidatos. Todos los clones candidatos fueron secuenciados y sometidos al analisis de homologla en comparacion con todas las secuencias en las principales bases de datos genicas y de EST con la finalidad de proporcionar informacion acerca de la identidad del correspondiente gen y ayudar a guiar la decision de analizar un gen en particular durante la expresion diferencial. En general, los fragmentos genicos que no tenlan homologla con ninguna de las secuencias conocidas en cualquiera de las bases de datos consultadas, considerados, por tanto, representantes de genes novedosos, as! como los fragmentos genicos que mostraron homologla con marcadores de secuencias expresadas previamente secuenciadas (EST), fueron sometidos a analisis de expresion diferencial por RT-PCR y/o analisis Northern.

[0136] Uno de los clones de ADNc, denominado 8P1D4, era de una longitud de 436 pb y mostro homologla con una secuencia de EST de la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP. El ADNc de longitud completa que codifica el gen 8P1D4 fue posteriormente aislado usando este ADNc y renombrado como STEAP-1 (Ejemplo 2, mas adelante). La secuencia de nucleotidos del ADNc de 8P1D4 corresponde a los residuos de nucleotido 150 a 585 de la secuencia de ADNc de STEAP-1 segun lo mostrado en la Figura 1A. Otro clon, denominado 28P3E1, de una longitud de 561 pb, mostro homologla con un numero de secuencia de EST de la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP o de otras bases de datos. Parte de la secuencia de 28P3E1 (356 pb) es identica a un EST derivado de tejido fetal humano. Una vez obtenido y secuenciado el ADNc de longitud completa de STEAP-1, se hizo evidente que este clon tambien corresponde a STEAP-1 (mas especlficamente, a los residuos 622 hasta el extremo 3' de la secuencia de nucleotidos de STEAP-1 segun lo mostrado en la Figura 1A).

[0137] El analisis de expresion diferencial por RT-PCR en el que se usaron los cebadores derivados del clon de ADNc de 8P1D4 mostro que el gen 8P1D4 (STEAP-1) se expresa a niveles aproximadamente iguales en la prostata normal y en los xenoinjertos LAPC-4 y LAPC-9 (Figura 2, grupo A). Otro analisis de expresion por RT-PCR de los ADNc de la primera cadena de 16 tejidos normales mostro los mayores niveles de expresion de 8P1D4 en la prostata. Se pudo detectar una expresion de un nivel sustancialmente inferior en otros varios tejidos normales (es decir, colon, ovario, intestino delgado, bazo y testlculos) solo a los 30 ciclos de amplificacion en cerebro, pancreas, colon e intestino delgado (Figura 2, grupos B y C).

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EJEMPLO 2:

AISLAMIENTO DE ADNc DE LONGITUD COMPLETA CODIFICANTE DE STEAP-1

[0138] Se uso el fragmento del gen 8P1D4 de 436 pb (Ejemplo 1) para aislar mas ADNc codificantes del gen 8P1D4/STEAP-1. En slntesis, se evaluo selectivamente un banco de ADNc de prostata humanos (Clontech) con una sonda marcada generada a partir de ADNc de 8P1D4 de 436 pb. Uno de los clones positivos, el clon 10, es de una longitud de 1195 pb y codifica una protelna de 339 aminoacidos que tiene secuencias de nucleotidos y aminoacidos codificadas que no portan una homologla significativa con ninguno de los genes o protelnas humanos conocidos (homologla con una protelna de lesion de rinon de rata recientemente descrita en la solicitud internacional W098/53071). La protelna codificada contiene al menos 6 motivos transmembrana predichos que implican una orientacion hacia la superficie celular (vease la Figura 1A, motivos transmembrana predichos subrayados). Estas caracterlsticas estructurales conducen a la denominacion de “STEAP” como “Six Transmembrane Epithetial Antigens of the Prostate". La identificacion posterior de otras protelnas STEAP condujo a la redenominacion del producto genico 8P1D4 como “STEAP-1”. Las Secuencias de ADNc y de aminoacidos codificadas de STEAP-1 se muestran en la Figura 1A y se corresponden con las SEC ID N.° 1 y 2, respectivamente. El clon 10 del ADNc de STEAP-1 fue depositado en la coleccion de cultivos tipo americana (“ATCC”) (Mannassas, VA) como el clon 10.1 del plasmido 8P1D4 el 26 de agosto de 1998 con el numero de acceso a la ATCC: 98849. Se puede separar el clon de ADNc de STEAP-1 de la misma usando una digestion doble con EcoRI/XbaI (EcoRI en el extremo 5' y XbaI en el extremo 3').

EJEMPLO 3:

anAlisis DE LA EXPRESION DEL GEN Y DE LA PROTEINA STEAP-1

[0139] Para comenzar la caracterizacion de las caracterlsticas biologicas de STEAP-1, se realizo una amplia evaluation de la expresion del ARNm de STEAP-1 y de la protelna STEAP-1 en una variedad de muestras de tejido humano. Esta evaluacion incluyo la transferencia Northern, la transferencia Western y el analisis inmunohistoqulmico de la expresion de STEAP-1 en un gran numero de tejidos humanos normales, xenoinjertos y llneas celulares de cancer de prostata humanos, y otras diversas llneas celulares humanas de cancer.

Ejemplo 3A: Analisis de transferencia Northern de la expresion del ARNm de STEAP-1 en tejidos humanos normales

[0140] El analisis inicial de la expresion del ARNm de STEAP-1 en tejidos humanos normales fue llevado a cabo por medio del transferencia Northern de dos pruebas de tejido multiple obtenidas de Clontech (Palo Alto, California), que comprendlan un total de 16 tejidos humanos normales diferentes, usando el clon 10 de STEAP-1 como sonda. Las muestras de ARN fueron normalizadas de forma cuantitativa con una sonda p-actina. En la Figura 3A, se muestran los resultados. El nivel de expresion mas elevado fue detectado en la prostata normal, detectandose un nivel de expresion aproximadamente 5-10 veces menor en el colon y el hlgado. Estas transferencias Northern mostraron dos transcriptos de aproximadamente 1,4 kb y 4,0 kb, el primero de los cuales corresponde al ADNc de longitud completa del clon 10 de STEAP-1, que codifica el marco de lectura abierto entero de STEAP-1. El transcripto mas largo fue clonado por separado como un ADNc de 3627 pb de un banco de prostata normal, cuya secuencia contiene un intron de 2399 pb (Figura 4).

[0141] Se amplio este analisis inicial usando la sonda del clon 10 de STEAP-1 para analizar una matriz de transferencia de puntos de ARN de 37 tejidos humanos normales (Clontech, Palo Alto, CA; Human Master Blot™). En la Figura 3B, se muestran los resultados, que presentan una fuerte expresion de STEAP-1 solo en prostata. Se detecto un nivel muy bajo de expresion de ARN de STEAP-1 en tejido de hlgado, pulmon, traquea e hlgado fetal, a un nivel quizas 5 veces inferior al de la prostata. No se detecto expresion en ninguno de los tejidos restantes. Basandose en estos analisis, parece que la expresion de STEAP-1 significativa es especlfica de la prostata en tejidos normales.

Ejemplo 3B: Analisis por transferencia Northern de la expresion de ARNm de STEAP-1 en xenoinjertos y llneas celulares de cancer de prostata

[0142] Para analizar la expresion de STEAP-1 en tejidos y llneas celulares humanos de cancer, se analizaron ARN derivados de xenoinjertos de cancer de prostata humanos y un amplio grupo de llneas celulares cancerosas y no cancerosas de prostata mediante transferencia Northern usando el clon 10 de ADNc de STEAP-1 como sonda. Todas las muestras de ARN fueron normalizadas cuantitativamente mediante tincion con bromuro de etidio y el posterior analisis con una sonda de p-actina marcada.

[0143] Los resultados, presentados en la Figura 5, muestran un nivel elevado de expresion de STEAP-1 en todos los xenoinjertos LAPC y en todas las llneas celulares de cancer de prostata. La expresion en los xenoinjertos LAPC-9 fue superior en comparacion con los xenoinjertos LAPC-4, sin que se observara una diferencia significativa entre las subllneas dependientes de androgenos y las independientes de androgenos (Figura 5A). La expresion en el xenoinjerto LAPC-4 fue comparable con la expresion en la prostata normal. Se detectaron niveles inferiores de expresion en celulas PrEC (Clonetics), que representan el compartimiento celular basal de la prostata. Los analisis de

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las ilneas celulares de cancer de prostata mostraron los niveles de expresion mas elevados en LNCaP, una ilnea celular de carcinoma de prostata dependiente de androgenos. Tambien se detecto una expresion significativa en las llneas celulares independientes de androgenos PC-3 y OU145. Ademas se detectaron niveles elevados de expresion de STEAP en tumores de LAPC-4 y LAPC-9 que fueron desarrollados en la tibia de ratones como un modelo de la metastasis osea del cancer de prostata (Figura 5B).

[0144] Significativamente, tambien se detecto una expresion de STEAP-1 muy fuerte en muchas de las llneas celulares humanas de cancer no de prostata analizadas (Figura 5A). Particularmente, se observo un nivel alto de expresion en celulas RD-ES, una llnea celular derivada del sarcoma de Ewing (EWS). Ademas, se detecto un nivel muy elevado de expresion en varias llneas celulares de cancer de colon (por ejemplo, CaCo-2, LoVo, T84 y Colo-205), llneas celulares de carcinoma de vejiga (por ejemplo, SCABER, UM-UC-3, TCCSUP y 5637), llneas celulares de cancer de ovario (por ejemplo, OV-1063 y SW 626) Y llneas celulares de cancer pancreatico (por ejemplo, HPAC, Capan-1, PANC-1 y BxpC- 3). Estos resultados, combinados con la ausencia de una expresion fuerte en los correspondientes tejidos normales (Figura 3), indican que STEAP-1 puede estar generalmente sobre-regulada en estos tipos (as! como en otros tipos) de canceres humanos.

Ejemplo 3C: Analisis de transferencia Western de la expresion de la proteina STEAP-1 en cancer de prostata y otros canceres

[0145] Se sintetizo un peptido de 15 unidades correspondiente a los residuos de aminoacido 14 a 28 de la secuencia de aminoacidos de STeAp-1 segun lo mostrado en la Figura 1A (WKMKPRRNLEEDDYL) (SEC ID N.° 30), y se uso para inmunizar ovejas para generar los anticuerpos policlonales de las ovejas frente al terminal amino de la proteina (contra STEAP-1) como se explica a continuacion. Se conjugo el peptido con KLH (hemocianina de lapa californiana). Se inmunizo inicialmente a la oveja con 400 pg de peptido en adyuvante completo de Freund. Se volvieron a administrar al animal posteriormente cada dos semanas 200 pg de peptido en adyuvante incompleto de Freund. Se purifico por afinidad el anticuerpo contra STEAP del suero de oveja usando peptido STEAP unido con Affigel 10 (Bio Rad). Se almacena el anticuerpo purificado en solucion salina tamponada con fosfato con azida de sodio al 0,1%.

[0146] Para probar la especificidad del anticuerpo, se clono ADN de STEAP en un vector de expresion retroviral (pSRatkneo, Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Se infectaron celulas NIH 3T3 con retrovirus que codifican STEAP-1 y se seleccionaron en G418 durante 2 semanas. Los analisis de transferencia Western de extractos proteicos de celulas NIH 3T3 infectadas y no infectadas mostraron la expresion de una proteina con un peso molecular aparente de 36 kD, solo en las celulas infectadas (Figura 6, carriles marcados con “3T3 STEAP” y “3T3”).

[0147] Se uso el anticuerpo policlonal contra STEAP-1 para sondar transferencias Western de lisados celulares preparados a partir de una variedad de tejidos de xenoinjertos de cancer de prostata, lineas celulares de cancer de prostata u otras lineas celulares de cancer no de prostata. Se normalizaron cuantitativamente las muestras de proteinas (20 pg cada una) sondando las transferencias con un anticuerpo contra Grb-2.

[0148] En la Figura 6, se muestran los resultados. La proteina STEAP-1 fue detectada en todos los xenoinjertos de cancer de prostata LAPC, en todas las lineas celulares de cancer de prostata, en una muestra de cancer de prostata primario y en su control de prostata normal comparado. La mayor expresion de la proteina STEAP-1 fue detectada en el xenoinjerto LAPC-9 y en las celulas LNCaP, coincidiendo con los analisis de transferencia Northern descritos inmediatamente antes. Tambien se observo un alto nivel de expresion en la llnea celular de carcinoma de vejiga UM- UC-3. Tambien se detecto la expresion en otras llneas celulares de cancer (Figura 6).

Ejemplo 3D: Analisis inmunohistoauimico de la expresion de la proteina STEAP-1 en muestras quirurgicas y de biopsia de tumores de prostata

[0149] Para determinar la extension de la expresion de la proteina STEAP-1 en materiales cllnicos, se prepararon secciones tisulares a partir de una variedad de biopsias y muestras quirurgicas de cancer de prostata para su analisis inmunohistoqulmico. Los tejidos fueron fijados en formalina al 10%, introducidos en parafina y seccionados segun el protocolo estandar. Se usaron secciones cubiertas por parafina y fijadas en formalina de celulas LNCaP como control positivo. Se tineron las secciones con un anticuerpo policlonal contra STEAP-1 dirigido frente un epltopo N-terminal de STEAP-1 (segun lo descrito inmediatamente antes). Se tineron las secciones de LNCaP en presencia de una cantidad en exceso de inmunogeno del peptido N-terminal STEAP-1 usado para generar el anticuerpo policlonal (peptido 1) o un peptido inespeclfico derivado de una region distinta de la proteina STEAP-1 (peptido 2; YQQVQQNKEDAWIEH).

[0150] En la Figura 8, se muestran los resultados. Las celulas LNCaP mostraron una tincion peri-celular uniformemente fuerte en todas las celulas (Figura 8b). El peptido N-terminal STEAP en exceso (peptido 1) fue capaz de inhibir competitivamente la tincion del anticuerpo (Figura 8a), mientras que el peptido 2 no tuvo efecto (Figura 8b). De manera similar, se observo una tincion peri-celular uniformemente fuerte en los xenoinjertos de cancer de prostata LAPC-9 (Figura 8f) y LAPC-4 (datos no mostrados). Estos resultados son claros y sugieren que la tincion es especlfica de STEAP. Ademas, estos resultados localizan visualmente STEAP en la membrana plasmatica, lo que corrobora los hallazgos bioqulmicos presentados en el ejemplo 4 que se presenta a continuacion.

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[0151] Los resultados obtenidos con las diversas muestras cilnicas se muestran en la Figura 8c (tejido de prostata normal), la Figura 8d (carcinoma prostatico de grado 3) y la Figura 8e (carcinoma prostatico de grado 4), y tambien se incluyen en los resultados resumidos mostrados en la TABLA 1. Se observo una tincion de ligera a fuerte en los epitelios glandulares de todas las muestras de cancer de prostata analizadas, as! como en todas las muestras obtenidas a partir de prostata normal o de la enfermedad benigna. La senal parece ser mas fuerte en la membrana celular de las celulas epiteliales, especialmente, en las uniones entre celulas (Figura 8c, d y e) y tambien se inhibe con un exceso de peptido 1 N-terminal STEAP (datos no mostrados). Tambien se observa alguna tincion de las celulas basales en la prostata normal (Figura 8c), que se hace mas evidente al examinar las glandulas atroficas (datos no mostrados). sTeAP-1 parece estar expresada en todos los estadios del cancer de prostata, pues tanto los grados mas bajos (Figura 8d), como los grados mas altos (Figura 8e) y el cancer de prostata metastasico (representado por LAPC- 9; Figura 8f) presentan una tincion fuerte.

[0152] La tincion inmunohistoqulmica de un gran grupo de tejidos no prostaticos normales mostro una expresion de STEAP-1 no detectable en 24 de 27 de estos tejidos normales (Tabla 1). Solo tres muestras de tejido mostraron cierto grado de tincion contra STEAP-1. En concreto, la vejiga normal presento niveles bajos de tincion de la superficie celular del epitelio de transicion (Figura 8g). El pancreas y la pituitaria mostraron niveles bajos de tincion citoplasmatica (Tabla 1). No esta claro si la tincion citoplasmatica observada es especlfica o se debe a una union inespeclfica del anticuerpo, pues la trasferencia Northern mostro una expresion de STEAP-1 escasa a nula en el pancreas (Figura 3). El colon normal, que presento niveles de ARNm mas elevados que el pancreas mediante transferencia Northern (Figura 3), presento una tincion no detectable con los anticuerpos contra STEAP (Figura 8h). Estos resultados indican que la expresion en la superficie celular de STEAP-1 en tejidos normales parece estar restringida a la prostata y a la vejiga.

TABLA 1: TINCION INMUNOHISTOQUIMICA DE TEJIDOS HUMANOS CON ANTICUERPO POLICLONAL

CONTRA STEAP-1

INTENSIDAD DE

TEJIDO

LA TINCION

NINGUNA

Cerebelo, corteza cerebral, medula espinal, corazon, musculo esqueletico, arteria, timo, bazo, medula osea, nodulo linfatico, pulmon, colon, hlgado, estomago, rinon, testlculo, ovario, trompas de Falopio, placenta, utero, mama, glandula suprarrenal, glandula tiroidea, piel, vejiga (3/5)

DE LIGERA A MODERADA

Vejiga (2/5), glandula pituitaria (citoplasmatica), pancreas (citoplasmatica), BPH (3/5), cancer de prostata (3/10)

FUERTE

Prostata (2/2), BPH (2/5), cancer de prostata**(7/10)

* En los casos en los que se analiza mas de una muestra por tejido, los numeros entre parentesis indican cuantas muestras corresponden a la categorla de tincion/total analizado. ** Los grados del cancer de prostata varlan de los grados de Gleason 3 a 5.

EJEMPLO 4:

CARACTERIZACION BIOQUIMICA DE LA PROTEINA STEAP-1

[0153] Para caracterizar inicialmente la protelna STEAP-1, se clono el clon 10 de ADNc (SEC ID N.° 1) en el plasmido de Myc-His pcDNA 3.1 (Invitrogen), que codifica un marcador de 6His en el terminal carboxilo, se transfecto en celulas 293T y se analizo por citometrla de flujo usando anticuerpo monoclonal contra His (sonda de His, Santa Cruz), as! como el anticuerpo policlonal contra sTeAP-1 anteriormente descrito. La tincion de las celulas se realizo sobre una celula intacta, as! como en celulas permeabilizadas. Los resultados indicaron que solo las celulas permeabilizadas se tineron con ambos anticuerpos, lo que sugiere que ambos terminales de la protelna STEAP-1 estan localizados intracelularmente. Por lo tanto, es posible que uno o mas de los terminales de la protelna STEAP-1 esten asociados con organulos intracelulares en lugar de con la membrana plasmatica.

[0154] Para determinar si la protelna STEAP-1 se expresa en la superficie celular, se marcaron celulas 293T transfectadas en STEAP-1 con un reactivo de biotinilacion que no se introduce en las celulas vivas. Entonces se sometio STEAP-1 a una inmunoprecipitacion desde extractos celulares usando anticuepos contra His y contra STEAP. Se inmunoprecipitaron el antlgeno T grande de SV40, una protelna intracelular que se expresa a niveles elevados en las celulas 293T, y el receptor endogeno de la transferrina de la superficie celular como controles negativo y positivo, respectivamente. Tras la inmunoprecipitacion, se transfirieron las protelnas a una membrana y se visualizaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rabano picante. En la Figura 7, se muestran los resultados de este analisis. Solo se marcaron con biotina el receptor de la transferrina (control positivo) y STEAP-1, mientras que el antlgeno T grande de SV40 (control negativo) no se marco detectablemente (Figura 7A). Como solo se marcan las protelnas de la superficie celular con esta tecnica, es evidente, a partir de estos resultados, que STEAP-1 es una protelna de la superficie celular. En combinacion con los resultados obtenidos en el analisis de la citometrla de flujo, es evidente que STEAP-1 es una protelna de la superficie celular con terminales amino y carboxilo intracelulares.

[0155] Ademas, los resultados anteriores junto con las predicciones sobre la estructura secundaria de STEAP-1

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muestran que STEAP-1 es una protelna de membrana de tipo Ilia con una topologla molecular de seis posibles dominios transmembrana, 3 bucles extracelulares y 2 bucles intracelulares, y dos extremos intracelulares. En la Figura 1B, se muestra una representacion esquematica de la topologla de la protelna STEAP-1 en relacion con la membrana celular.

[0156] Ademas, se analizaron celulas de cancer de prostata, vejiga y colon directamente para la expresion de STEAP- 1 en la superficie celular mediante estudios de biotinilacion. En slntesis, se purificaron por afinidad protelnas de la superficie celular biotiniladas con gel de estreptavidina y se sondaron con el anticuerpo policlonal contra STEAP-1 descrito anteriormente. La transferencia Western de las protelnas purificadas con estreptavidina muestra claramente la biotinilacion de la superficie celular de STEAP-1 endogena en todas las celulas analizadas de cancer de prostata (LNCaP, PC-3, DU145), vejiga (UM-UC-3, TCCSUP) y colon (LoVo, Colo), as! como en las celulas NIH 3T3 infectadas con un retrovirus codificante de STEAP-1, pero no en las celulas NIH 3T3 no expresadoras usadas como control negativo (Figura 7B). En otro control negativo, no se detecto la protelna STEAP-1 en precipitados de estreptavidina de celulas que no expresaban la STEAP biotinilada (Figura 7B).

EJEMPLO 5:

IDENTIFICACION Y ANALISIS ESTRUCTURAL DE STEAP-2 Y OTROS MIEMBROS DE LA FAMILIA STEAP HUMANA

[0157] STEAP-1 no tiene homologla con ningun gen humano conocido. En un intento por identificar mas genes que fueran homologos con STEAP-1, se uso la secuencia de la protelna STEAP-1 como sonda electronica para identificar los miembros de la familia en la base de datos de EST (marcadores de secuencias de expresion) de acceso publico (dbest). Se realizo la consulta sobre la secuencia de la protelna STEAP-1 en la base de datos dbest usando la funcion “tblastn” de NCBI (Centro Nacional de Information Biotecnologica). Este analisis revelo mas posibles homologos de STEAP-1 o miembros de la familia STEAP, como se describe mas detalladamente a continuation.

[0158] Ademas, los experimentos de donation de los solicitantes tambien identificaron un fragmento de ADNc obtenido mediante SSH relacionado con STEAP-1, el clon 98P486. Este clon fue aislado de la clonacion por SSH usando ADNc de prostata normal como probador y ADNc de LAPC-4 AD como conductor. Posteriormente, se aislo una gran secuencia parcial del clon 98P4B6 de un banco de prostata normal; este clon codifica un ORF de 173 aminoacidos con homologla con la estructura primaria de STEAP-1, siendo por tanto denominada STEAP-2.

[0159] En la Figura 9, se muestran la secuencia de nucleotidos parcial de STEAP-2 y la secuencia de aminoacidos del ORF codificada. En la figura 11A, se muestra un alineamiento de los aminoacidos de las estructuras primarias de STEAP-1 y STEAP-2 parcial. STEAP-1 y STEAP-2 comparten una identidad del 61% por su solapamiento de 171 residuos de aminoacido (Figura 11A). A pesar de su homologla, STEAP-1 y STEAP-2 muestran patrones de expresion significativamente divergentes en tejidos y celulas normales y cancerosos, y tambien se mapean en diferentes ubicaciones sobre los brazos opuestos del cromosoma 7 humano (veanse los ejemplos 6 y 7 a continuacion).

[0160] Dos EST identificados mediante sondeo electronico con la secuencia de la protelna STEAP-1, Al139607 y R80991, codifican los ORF que portan una estrecha homologla con las secuencias de STEAP y STEAP-2, y parecen por tanto representar dos STEAP mas. Sus secuencias de nucleotidos se reproducen en la Figura 10 y sus secuencias de aminoacidos de tipo STEAP del ORF codificadas se muestran en la Figura 11B. Los ORF codificados por estos EST son unicos, pero muestran relaciones estructurales muy claras tanto con STEAP-1 como con STEAP-2, particularmente, en los dominios transmembrana conservados. Por consiguiente, estos EST parecen corresponder a miembros de la familia STEAP distintos y han sido, por tanto, designados como STEAP-3 (correspondiente a la STEAP Al139607) y STEAP-4 (correspondiente a R80991).

[0161] En la figura 11B, se muestra una alineacion de los aminoacidos de la secuencia de la protelna STEAP-1 completa con las secuencias de los aminoacidos de STEAP-2, STEAP-3 y STEAP-4 parciales. Este alineamiento muestra una similitud estructural entre las cuatro protelnas de la familia STEAP, particularmente, en los dominios transmembrana predichos, incluso a pesar de contar unicamente con la informacion de las secuencias parciales de las tres. Las protelnas STEAP-3 y STEAP-4 parecen estar mas estrechamente relacionadas con STEAP-2 que con STEAP-1 o que entre si. Especlficamente, STEAP-3 presenta una identidad del 50% y una homologla del 69% con STEAP-2, frente al 37% de identidad y al 63% de homologla que muestra con STEAP-1. STEAP-4 presenta una identidad del 56% y una homologla del 87% con STEAP-2, frente al 42% de identidad y al 65% de homologla que muestra con STEAP-1. STEAP-3 y STEAP-4 son un 38% identicas y un 57% homologas entre si. Estas cifras son estimaciones basadas en la informacion de las secuencias incompletas. Sin embargo, estas cifras sugieren la conservation de al menos alguno de los dominios transmembrana, lo que sugiere caracterlsticas topologicas comunes, si no caracterlsticas funcionales.

EJEMPLO 6:

ANALISIS DE LA EXPRESION DE STEAP-2 Y OTROS MIEMBROS DE LA FAMILIA STEAP HUMANA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ejemplo 6A: Expresion especifica de un tejido de los miembros de la familia STEAP en tejidos humanos normales

[0162] El analisis de la expresion de los miembros de la familia STEAP en tejidos normales se realizo mediante RT- PCR. Todos los miembros de la familia STEAP parecen presentar patrones de expresion restringidos a determinados tejidos. La expresion de Al139607 se detecta en placenta y en prostata tras 25 ciclos de amplificacion (Figura 12). Tras 30 ciclos, la expresion de Al139607 tambien se detecta en otros tejidos. La mayor expresion de R80991 se detecta en hlgado normal, aunque tambien se detecta expresion en otros tejidos tras 30 ciclos de amplificacion (Figura 13). No se detecto la expresion de R80991 ni de Al139607 en los xenoinjertos de cancer prostata lApC mediante la RT-PCR.

[0163] El analisis de RT-PCR de STEAP-2 muestra la expresion en todos los xenoinjertos de cancer de prostata LAPC y en la prostata normal (Figura 14, grupo A). El analisis de 8 tejidos humanos normales muestra la expresion especifica de la prostata tras 25 ciclos de amplificacion (Figura 14, grupo B). Se detecto un nivel de expresion inferior en otros tejidos solo tras 30 ciclos de amplificacion. La transferencia Northern para STEAP-2 muestra un patron de 2 transcriptos (de un tamano de aproximadamente 3 y 8 kb) solo expresado en prostata (y a niveles significativamente inferiores en el xenoinjerto LAPC) sin que se detectara la expresion en ninguno de los otros 15 tejidos humanos normales analizados (Figura 15, grupo C). Por lo tanto, la expresion de STEAP-2 en los tejidos humanos normales parece ser muy especifica de la prostata.

Ejemplo 6B: Expresion de STEAP-2 en diversas lineas celulares de cancer

[0164] Los anteriores resultados de la RT-PCR sugerian que los diferentes miembros de la familia STEAP presentan patrones de expresion en diferentes tejidos. Lo interesante es que STEAP-2, que parece ser muy especifica de la prostata, parece ser expresada a niveles inferiores en los xenoinjertos LAPS. En esto es contraria a STEAP-1, que se expresa a un nivel elevado en tejido de prostata tanto normal como maligno.

[0165] Para caracterizar mejor esta diferencia sugerida en el perfil de expresion del cancer de prostata de STEAP-2 (en comparacion con STEAP-1), se realizo una transferencia Northern en ARN derivado de los xenoinjertos LAPC, asi como varias lineas celulares de cancer de prostata y de otros canceres, usando una sonda especifica de STEAP-2 (clon de ADNc marcado 98P486). En la Figura 16, se muestran los resultados, que se pueden resumir segun lo siguiente. STEAP-2 se expresa a un nivel elevado en la prostata normal y en algunos de los xenoinjertos y lineas celulares de cancer de prostata. Mas concretamente, se observo una expresion muy fuerte en el xenoinjerto LAPC-9 AD y en las celulas LNCaP. Se observo una expresion significativamente atenuada o nula en el resto de los xenoinjertos y las lineas celulares de cancer de prostata. Tambien se hizo evidente un nivel de expresion muy alto en la linea celular de sarcoma de Ewing RD-ES. A diferencia de STEAP-1, que se expresa a un nivel elevado en las lineas celulares de cancer derivadas de tumores de vejiga, colon, pancreas y ovario, STEAP-2 muestra una expresion de baja a no detectable en estas mismas lineas celulares (comparar con la Figura 5). Lo interesante es que STEAP-2 tampoco se detecto en las celulas PrEC, que son representativas del compartimiento de las celulas basales normales de la prostata. Estos resultados sugieren que la expresion de STEAP-1 y STEAP-2 esta regulada de manera diferente. Mientras que STEAP-1 puede ser un gen que generalmente este sobre-regulado en el cancer, STEAP-2 puede ser un gen que esta mas restringido a la prostata normal y al cancer de prostata.

EJEMPLO 7:

LOCALIZACION CROMOSOMICA DE LOS GENES DE STEAP

[0166] La localizacion cromosomica de STEAP-1 fue determinada usando el grupo de hibridos por radiacion (RH) humanos/de hamster GeneBridge 4 (Walter et al., 1994, Nat. Genetics 7:22) (Research Genetics. Huntsville Al), mientras que STEAP-2 y los homologos de STEAP fueron mapeados usando el grupo de hibridos por radiacion Stanford G3 (Stewart et al., 1997, Genome Res. 7: 422).

[0167] Se usaron los siguientes cebadores de PCR para STEAP-1:

8P1D4.1 5' ACTTTGTTGATGACCAGGATTGGA 3' (SEC ID N.° 28)

8P1 D4.2 5' CAGAACTTCAGCACACACAGGAAC 3' (SEC ID N.° 29)

[0168] El vector de mapeo de STEAP-1 resultante para los 93 ADN del grupo de hibridos por radiacion (210000020110101000100000010111010122100011100111011010100010001000101001 021000001111001010000) y el programa de mapeo disponible en la direccion de Internet
http://www-genome.wi.mil.edu/cgi- bin/contig/rhmapper.pl localizaron el gen STEAP-1 localizo al gen STEAP-1 en el cromosoma 7p22.3, telomerico a D7S531.

[0169] Se usaron los siguientes cebadores de PCR para 98P4B6/STEAP-2:

98P4B6.1 5'GACTGAGCTGGAACTGGAATTTGT 3' (SEC ID N.° 17)

98P4B6.2 5' TTTGAGGAGACTTCATCTCACTGG 3' (SEC ID N.° 18)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0170] El vector resultante (000001001000000000000000000000001001000000000010001000 00000000001000010101010010011) y el programa de mapeo disponible en la direccion de Internet <h
ftp://www- shgc.stanford.edu/RH/rhserverformnew.html> mapea el gen 98P4B6 (STEAP-2) en el cromosoma 7q21.

[0171] Se usaron los siguientes cebadores de PCR para Al139607:

Al139607.1 5'TT AGGACAACTTGATCACCAGCA 3' (SEC ID N.° 13)

Al139607.2 5'TGTCCAGTCCAAACTGGGTTATTT3' (SEC ID N.° 14)

[0172] El vector resultante (0000000010000000000000000000100010000020000000100010000 0001000000100010001010000010) y el programa de mapeo disponible en la direccion de Internet <h
ftp://www- shgc.stanford.edu/RH/rhserverformnew.html> mapea Al139607 en el cromosoma 7q21.

[0173] Se usaron los siguientes cebadores de PCR para R80991:

R80991.3 5' ACAAGAGCCACCTCTGGGTGAA 3' (SEC ID N.° 15)

R80991.4 5' AGTTGAGCGAGTTTGCAATGGAC 3' (SEC ID N.° 16)

[0174] El vector resultante (00000000000200001020000000010000000000000000000010000 000001000011100000001001000001) y el programa de mapeo disponible en la direccion de Internet <h
ftp://www- shgc.stanford.edu/RH/rhserverformnew.html> mapea R80991 en el cromosoma 2q14-q21, cerca de D2S2591.

[0175] En resumen, los resultados anteriores muestran que tres de los miembros de la familia STEAP humana putativa se ubican en el cromosoma 7, como se representa esquematicamente en la Figura 17. En concreto, el gen STEAP-1 se localiza en la region fatelomerica del brazo corto del cromosoma 7, en 7p22.3, mientras que STEAP-2 y Al139607 se ubican en el brazo largo del cromosoma 7, en 7q21 (Figura 17). R80991 se mapea en el cromosoma 2q14-q21.

EJEMPLO 8:

IDENTIFICACION DE LOS LIMITES INTRON-EXON DE STEAP-1

[0176] Se identificaron clones genomicos para STEAP-1 buscando en el GenBank clones de BAC que contenlan secuencias de STEAP-1, dando como resultado la identificacion de los numeros de acceso AC004969 (PAC DJ1121E10) y AC005053 (BAC RG041D11). Usando las secuencias derivadas de los clones de PAC y BAC para STEAP, se definieron los llmites intron-exon (Figura 18). Se identifico un total de 4 exones y 3 intrones en la region codificante del gen STEAP. Se pueden usar los conocimientos sobre la estructura exacta exon-intron del gen STEAP- 1 para disenar cebadores en las secuencias intronicas que, a su vez, puedan ser usados para la amplificacion genomica de los exones. Tal amplificacion permite el analisis de polimorfismos configuracionales de cadenas simples (SSCP) para buscar los polimorfismos asociados con el cancer. Se pueden secuenciar exones mutantes o polimorficos y compararlos con las STEAP de tipo natural. Tales analisis pueden ser utiles en la identificacion de pacientes que sean mas susceptibles a padecer un cancer de prostata agresivo, as! como otros tipos de cancer, particularmente, canceres de colon, de vejiga, pancreatico, de ovario, cervical y testicular.

[0177] El analisis de transferencia Southern muestra que el gen STEAP-1 existe en varias especies, incluyendo el raton (Figura 19). Por lo tanto, se evaluo selectivamente un banco de BAC de raton (Mouse ES 129-V version I, Genome Systems, FRAC-4431) con ADNc humano para STEAP-1 (clon 10, ejemplo 2). Se identifico un clon positivo, 12P11, y se confirmo mediante transferencia Southern (Figura 20). La informacion sobre los llmites intron-exon para las STEAP humanas se puede usar para identificar las secuencias codificantes de la STEAP-1 de raton.

[0178] Se puede usar el clon genomico de STEAP-1 de raton para estudiar el papel biologico de STEAP-1 durante el desarrollo y la tumorigenesis. Especlficamente, se puede insertar el clon de STEAP-1 genomico de raton en un vector de un gen noqueado (K/O) para la perturbacion dirigida del gen en los ratones, usando procedimientos generalmente conocidos en la tecnica. Ademas, se puede descubrir el papel de las STEAP en los procesos metabolicos y la funcion de las celulas epiteliales. Tales ratones K/O pueden ser cruzados con otros modelos de ratones con cancer de prostata, tales como el modelo TRAMP (Greenberg et al., 1995, PNAS 92:3439), para determinar si STEAP influye en el desarrollo y en la progresion de canceres de prostata mas o menos agresivos y metastasicos.

[0179] A lo largo de esta solicitud, varias publicaciones estan referenciadas entre parentesis.

[0180] La presente invencion no se limita en su alcance por las realizaciones aqul descritas, que pretenden ser ilustraciones individuales de aspectos individuales de la invencion. Diversas modificaciones a los modelos y procedimientos de la invencion, ademas de los descritos en este documento, seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion y ensenanzas anteriores.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Polipeptido aislado que tiene la secuencia de aminoacidos del producto genico 8P1D4 (STEAP-1) que esta codificado por la secuencia de codificacion del ADNc mostrado en la SEC ID N.° 1.
2. 2. Fragmento de polipeptido aislado de la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEC ID N.° 2 que tiene al menos 15 aminoacidos contiguos de dicha secuencia de aminoacidos.
3. 3. Polipeptido aislado, segun la reivindicacion 2, seleccionado entre SEC ID N.° 19, SEC ID N.° 20, SEC ID N.° 21, SEC ID N.° 30 y SEC ID N.° 31.
4. 4. Polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos que es una variante alelica o una variante por sustitucion conservadora del producto genico 8P1D4 (STEAP-1) codificado por la secuencia de codificacion del ADNc mostrado en la SEC ID N.° 1, en el que el polipeptido aislado es al menos un 90% identico con la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEC ID N.° 2 sobre su longitud completa.
5. 5. Polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por el ADNc depositado con ATCC 98849.
6. 6. Polipeptido aislado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, fusionado a un polipeptido heterologo.
7. 7. Polipeptido aislado, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipeptido es soluble.
8. 8. Composicion terapeutica, que comprende un polipeptido, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un vehlculo.
9. 9. Polinucleotido aislado seleccionado del grupo que consiste en

   (a) un polinucleotido que tiene la secuencia de codificacion de 8P1D4 (STEAP-1) tal como se muestra en la SEC ID N.° 1, en la que T tambien puede ser U;

   (b) un polinucleotido que tiene la secuencia del ADNc contenido en el plasmido 8P1D4 clon 10.1, depositado con la American Type Culture Collection con No. de acceso 98849; y

   (c) un polinucleotido que codifica un polipeptido, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. 10. Vector de expresion recombinante que contiene un polinucleotido, segun la reivindicacion 9.
11. 11. Celula huesped que contiene un vector de expresion, segun la reivindicacion 10.
12. 12. Proceso para producir una protelna STEAP-1 que comprende cultivar una celula huesped, segun la reivindicacion 11, en condiciones suficientes para la produccion del polipeptido y recuperar la protelna STEAP-1 del cultivo.