ES2619681T3 - Novedosos epítopos P2X7 - Google Patents

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Abstract

Un péptido que consiste en una secuencia dentro de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3, siendo dicho péptido útil como inmunógeno para generar un anticuerpo que es capaz de unirse selectivamente a un receptor P2X7 que no se une a ATP, pero no a un receptor P2X7 que se une a ATP, en donde el péptido incluye la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2.

Description

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El anticuerpo puede marcarse para la detección de la formación del complejo inmunitario.
El complejo inmunitario puede incluir adicionalmente un anticuerpo o un fragmento del mismo, tal como un anticuerpo de captura para la captura del complejo inmunitario. El anticuerpo o el fragmento del mismo 5 adicionalmente pueden unirse al anticuerpo anti-receptor P2X7. Además, el anticuerpo o el fragmento del mismo adicionalmente puede unirse al receptor o al fragmento del mismo.
El anticuerpo o el fragmento del mismo adicionalmente puede unirse a una fase sólida tal como a una fase descrita anteriormente.
10 El anticuerpo adicionalmente puede marcarse para la detección de la formación del complejo inmunitario. Ejemplos de marcadores incluyen fluoróforos, colorantes, isótopos, etc.
En ciertos casos, se proporciona un método para determinar si una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular 15 incluye un receptor P2X7 que no se une a ATP, a un monómero o a un fragmento del mismo, que incluye:
-poner en contacto una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular con un anticuerpo o con un fragmento del mismo en condiciones para formar un complejo inmunitario como se describe anteriormente, y
20 -detectar si un complejo inmunitario se ha formado,
en el cual la detección de un complejo inmunitario determina que una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular incluye un receptor P2X7 que no se une a ATP, a un monómero o a un fragmento del mismo.
25 En otros casos, se proporciona un uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo descrito anteriormente en la fabricación de un medio para determinar si una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular contiene un receptor P2X7, un monómero o un fragmento del mismo.
En otros casos, se proporciona un método para determinar si una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular 30 contiene un anticuerpo contra un receptor P2X7 que no se une a ATP, un monómero o un fragmento del mismo, que incluye:
-poner en contacto una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular con un péptido como se describe anteriormente, en condiciones para formar un complejo inmunitario entre el péptido y un anticuerpo en la célula, 35 en el tejido o en el fluido corporal extracelular, y
- detectar si se ha formado un complejo inmunitario,
en el cual la detección de un complejo inmunitario determina que una célula, un tejido o un fluido corporal 40 extracelular contiene un anticuerpo contra un receptor P2X7 que no se une a ATP, a un monómero o a un fragmento del mismo.
En otros casos, se proporciona un uso de un péptido descrito anteriormente en la fabricación de un medio para determinar si una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular contiene un anticuerpo contra un receptor P2X7 45 que no se une a ATP, a un monómero o a un fragmento del mismo.
La presencia de una proteína dada, o el nivel de expresión de una proteína dada en una célula hospedadora, en un tejido o en un fluido corporal extracelular, puede detectarse por cualquiera de varios ensayos. Los ejemplos incluyen inmunoensayos, cromatografía y espectrometría de masas.
50 Los inmunoensayos, es decir, los ensayos que implican un elemento del sistema inmunitario, son particularmente preferidos. Estos ensayos pueden clasificarse, en general, en uno de:
(i) ensayos en que se usa antígeno purificado para detectar un anticuerpo en suero del hospedador. Por ejemplo,
55 el antígeno purificado se une a una fase sólida por adsorción o indirectamente a través de otra molécula y se aplica suero del hospedador seguido por otro anticuerpo para detectar la presencia o la ausencia del anticuerpo del hospedador;
(ii) ensayos en que se usa antígeno purificado para detectar células inmunitarias, tales como linfocitos T y B. Por
60 ejemplo, se purifican glóbulos blancos periféricos de un hospedador y se cultivan con antígeno purificado. Después se detecta la presencia o la ausencia de uno o más factores que indican inmunidad. Otros ejemplos incluyen ensayos que miden la proliferación celular (ensayos de proliferación o de transformación de linfocitos) después de exposición a antígeno purificado, y ensayos que miden la muerte celular (incluyendo apoptosis) después de exposición a antígeno purificado;
65
(iii) ensayos en que se usa anticuerpo purificado específico para el antígeno para detectar el antígeno en el hospedador. Por ejemplo, el anticuerpo purificado se une a una fase sólida, después se aplica al tejido del hospedador seguido por otro anticuerpo específico para el antígeno a detectar. Hay muchos ejemplos de este enfoque incluyendo ELISA, RIA;
5
(iv) ensayos en que se usa un anticuerpo anti-idiotípico purificado para detectar el anticuerpo del hospedador. Por ejemplo, se adsorbe anticuerpo anti-idiotípico a la fase sólida, se añade suero del hospedador y se añade anticuerpo anti-Fc para que se una a cualquier anticuerpo del hospedador que se haya unido por el anticuerpo anti-idiotípico.
10 Los inmunoensayos pueden aplicarse in vitro o in vivo.
En un caso, la enfermedad es típicamente un cáncer tal como carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. Los carcinomas que pueden detectarse incluyen, aunque sin limitación, cánceres de próstata, de mama, de piel, de
15 pulmón, del cuello del útero, de útero, de estómago, de esófago, de vejiga y de colon.
Aunque puede usarse cualquier fluido corporal para detectar cualquiera de estas enfermedades, algunos fluidos corporales pueden ser más apropiados que otros para detectar ciertas enfermedades, por ejemplo, la orina puede ser más apropiada para detectar cáncer de próstata, y la sangre para detectar cánceres hemáticos tales como
20 linfoma.
En otro caso, se proporciona un método para determinar si un individuo tiene un cáncer, que incluye las etapas de:
-poner en contacto una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular con un péptido como se describe 25 anteriormente en condiciones para formar un complejo inmunitario entre el péptido y un anticuerpo en la célula, el tejido o el fluido corporal extracelular; o
-poner en contacto una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular con un anticuerpo o con un fragmento del mismo en condiciones para formar un complejo inmunitario como se describe anteriormente, y 30 -detectar si se ha formado un complejo inmunitario,
en el cual la detección de un complejo inmunitario determina que un individuo tiene un cáncer.
35 En un caso adicional, se proporciona el uso de un anticuerpo anti-receptor purinérgico (P2X) o un fragmento del mismo como se describe anteriormente, o un péptido como se describe anteriormente para determinar si un individuo tiene un cáncer.
En ciertos casos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de mama invasivo,
40 melanoma, adenocarcinoma del intestino, cáncer seroso de ovario, cáncer escamoso celular del cuello del útero, cáncer de endometrio, cáncer pulmonar microcítico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células transicionales de la vejiga, tumor del estroma gastrointestinal, tumor del estroma del endometrio, cáncer de la pituitaria, mesotelioma, linfoma de Hodgkin y tiroides papilar.
45 En más casos adicionales, se proporciona un kit o composición para determinar si una célula, un tejido o un fluido corporal extracelular contiene un receptor P2X7 que no se une a ATP, a un monómero o a un fragmento del mismo,
o un fragmento contra el mismo, que incluye:
- un péptido como se describe anteriormente; y/o
50 -un anticuerpo o un fragmento del mismo como se describe anteriormente; y/o
- receptor P2X7 que no se une a ATP, un monómero o un fragmento del mismo; y opcionalmente
55 -un anticuerpo adicional para unirse al péptido, al anticuerpo o al fragmento del mismo o el receptor P2X7 que no se une a ATP, un monómero o un fragmento del mismo;
- instrucciones por escrito para el uso del kit en un método descrito anteriormente.
60 Se proporcionan kits que contienen los reactivos necesarios para realizar los ensayos de la presente divulgación. El kit puede incluir uno o más compartimentos, cada uno para recibir uno o más recipientes tales como: (a) un primer recipiente que comprende uno de los componentes de la presente divulgación descrita anteriormente; y (b) uno o más recipientes diferentes que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos de lavado, reactivos capaces de detectar la presencia del anticuerpo o del péptido.
65
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de Fc, tal como unión a receptores de Fc, particularmente FcγR (por ejemplo, FcγR1, RIIA, RIIB, RIIIA, RIIIB).
Sin limitarse a teoría alguna, se cree que la región Fc puede afectar a la eficacia de anticuerpos monoclonales antitumorales por unión a células efectoras inmunitarias con receptores de Fc y modulando la citotoxicidad mediada
5 por células, la endocitosis, la fagocitosis, la liberación de citoquinas inflamatorias, la citotoxicidad mediada por el complemento y la presentación de antígeno. A este respecto, los anticuerpos policlonales o mezclas de anticuerpos monoclonales serán ventajosos porque se unirán a diferentes epítopos y, por tanto, tendrán una densidad mayor de Fc sobre la superficie celular en comparación con el uso de un anticuerpo monoclonal individual. Por supuesto, para potenciar su eficacia en la reducción de las células diana, o cuando los anticuerpos no modificados no son terapéuticamente eficaces, pueden usarse anticuerpos conjugados con toxinas o con agentes citotóxicos.
Las composiciones de anticuerpo pueden usarse en solitario o en combinación con otros agentes terapéuticos para aumentar la eficacia de los tratamientos tradicionales o para abordar células anormales no abordadas por los anticuerpos. La combinación del método de terapia con anticuerpos con un régimen quimioterapéutico, de radiación
15 o quirúrgico puede ser preferido en pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico, mientras que el tratamiento con la terapia de anticuerpos puede estar indicada para pacientes que han recibido una o más quimioterapias. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos también puede posibilitar el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente en pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico. Además, el tratamiento de pacientes con cáncer con el anticuerpo con tumores resistentes a agentes quimioterapéuticos podría inducir la sensibilidad y receptividad a estos agentes en combinación.
En un aspecto, los anticuerpos se usan de forma complementaria con agentes citotóxicos terapéuticos, incluyendo, a modo de ejemplo y no de limitación, busulfán, tioguanina, idarrubicina, arabinósido de citosina, 6-mercaptopurina,
25 doxorrubicina, daunorrubicina, etopósido e hidroxiurea. Otros agentes útiles como complementos para terapia de anticuerpos son compuestos dirigidos específicamente a la molécula celular anormal encontrada en el estado patológico. Estos agentes serán específicos de la enfermedad. Por ejemplo, para tratar la leucemia mieloide crónica que surge de la actividad BCR-ABL, una clase de compuestos útiles es inhibidores de la actividad abl quinasa, tales como Imatinib, un inhibidor de la bcr-abl quinasa y oligonucleótidos antisentido contra bcr (por ejemplo, Oblimersen). Otros agentes incluyen, entre otros, interferón-alfa, anti-CD52 humanizado, inhibidor de desacetilasa FR901228 (depsipéptido), y similares.
La cantidad de las composiciones necesaria para conseguir un efecto terapéutico se determinará de forma empírica según procedimientos convencionales para el propósito particular. En general, para administrar las composiciones
35 ex vivo o in vivo para propósitos terapéuticos, las composiciones se dan a una dosis farmacológicamente eficaz. Por "cantidad farmacológicamente eficaz" o "dosis farmacológicamente eficaz" es una cantidad suficiente para producir el efecto fisiológico deseado o cantidad capaz de conseguir el resultado deseado, particularmente para tratar o volver a tratar el trastorno o afección patológica, incluyendo reducir o eliminar uno o más síntomas o manifestaciones del trastorno o de la enfermedad.
Como ilustración, la administración de anticuerpos a un paciente que padece cáncer de próstata proporciona un beneficio terapéutico no solamente cuando se erradica o se mejora la enfermedad subyacente, sino también cuando el paciente presenta una disminución en la gravedad o en la duración de los síntomas asociados con la enfermedad. El beneficio terapéutico también incluye detener o ralentizar la progresión de la enfermedad o del trastorno
45 subyacente, independientemente de si se logra mejora.
La cantidad administrada al hospedador variará dependiendo de lo que se esté administrando, del propósito de la administración, tal como profilaxis o terapia, del estado del hospedador, del modo de administración, de la cantidad de administraciones, del intervalo entre las administraciones y similares. Estas pueden determinarse empíricamente por los expertos en la materia y pueden ajustarse para el grado de respuesta terapéutica. Los factores a considerar en la determinación de una dosis apropiada incluyen, aunque sin limitación, tamaño y peso del sujeto, la edad y género del sujeto, la gravedad del síntoma, la fase de la enfermedad, el método de suministro del agente, la vida media de los agentes y la eficacia de los agentes. La fase de la enfermedad a considerar incluye si la enfermedad es aguda o crónica, en fase recidivante o remitente, y la progresividad de la enfermedad. Determinar las dosificaciones
55 y los tiempos de administración para una cantidad terapéuticamente eficaz pertenece a las habilidades de los expertos en la materia.
Para cualquier composición de la presente divulgación, la dosis terapéuticamente eficaz se determina fácilmente por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede estimarse una dosis eficaz inicial a partir de cultivo celular u otros ensayos in vitro. Por ejemplo, Sliwkowsky, MX et al., Semin. Oncol. 26. supl. 12) 60-70 (1999) describe mediciones in vivo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Después puede formularse una dosis en modelos animales para generar una concentración en circulación o concentración tisular, incluyendo la de la CI50 determinada por los ensayos de cultivo celular.
65 Además, la toxicidad y la eficacia terapéutica, en general, se determinan por ensayos de cultivo celular y/o animales
experimentales, típicamente determinando una DL50 (dosis letal para el 50 % de la población de ensayo) y DE50 (eficacia terapéutica en el 50 % de la población de ensayo). La relación de la dosis de toxicidad y de eficacia terapéutica es índice terapéutico. Se prefieren composiciones, individualmente o en combinación, que muestran altos índices terapéuticos. La determinación de la cantidad eficaz pertenece a las habilidades de los expertos en la
5 materia, particularmente dada la divulgación detallada proporcionada en la presente memoria. También se encuentran directrices en libros de referencia convencionales, por ejemplo, Fingl y Woodbury, General Principles In: The Pharmaceutical Basis of Therapeutics pág. 1-46 (1975), y las referencias citadas en el mismo.
Para conseguir una dosis de tolerancia inicial, se da consideración a la posibilidad de que los anticuerpos pueden ser inmunogénicos en seres humanos y en primates no humanos. La respuesta inmunitaria puede ser biológicamente significativa y puede alterar la eficacia terapéutica del anticuerpo incluso si el anticuerpo está compuesto parcial o principalmente de secuencias de inmunoglobulina humana tal como, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo quimérico o humanizado. En ciertos casos, se administra una dosis alta inicial de anticuerpo de modo que se establezca un grado de tolerancia inmunológica para el anticuerpo terapéutico.
15 La dosis de tolerancia es suficiente para prevenir o reducir la inducción de una respuesta de anticuerpos a administración repetida del anticuerpo específico de células progenitoras comprometidas.
Los intervalos preferidos para la dosis de tolerancia son entre 10 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal, incluidos. Los intervalos más preferidos para la dosis de tolerancia son entre 20 y 40 mg/kg, incluidos. Los intervalos aún más preferidos para la dosis de tolerancia son entre 20 y 25 mg/kg, incluidos.
Dentro de estos regímenes terapéuticos, la dosis terapéuticamente eficaz de anticuerpos se administra preferentemente en el intervalo de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, incluidos. Las segundas dosis terapéuticamente
25 eficaces más preferidas están en el intervalo de 0,2 a 5 mg/kg de peso corporal, incluidos. Dosis terapéuticamente eficaces aún más preferidas están en el intervalo de 0,5 a 2 mg/kg, incluidas. Dentro de casos alternativos, la dosis o las dosis terapéuticas posteriores pueden estar en la misma o en diferente formulación que la dosis de tolerancia y/o pueden administrarse por la misma vía o por una diferente que la dosis de tolerancia.
Para los propósitos de esta divulgación, los métodos de administración se eligen dependiendo de la afección que se esté tratando, la forma de los presentes anticuerpos y la composición farmacéutica.
La administración de las composiciones de anticuerpo puede hacerse de una diversidad de modos, incluyendo, aunque sin limitación, de forma continua, subcutánea, intravenosa, oral, tópica, transdérmica, intraperitoneal,
35 intramuscular o intravesical. Por ejemplo, las formulaciones de micropartículas, microesferas y microencapsuladas son útiles para administraciones orales, intramusculares o subcutáneas. Los liposomas y las nanopartículas son adicionalmente adecuadas para administraciones intravenosas. La administración de las composiciones farmacéuticas puede ser a través de una única vía o de forma concurrente por varias vías. Por ejemplo, la administración intraperitoneal puede venir acompañada por inyecciones intravenosas. Preferentemente, las dosis terapéuticas se administran por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea.
Las composiciones pueden administrarse una vez o varias veces. En algunos casos, las composiciones pueden administrarse una vez al día, unas pocas o varias veces al día, o incluso múltiples veces al día, dependiendo de, entre otras cosas, la indicación que se esté tratando y el criterio del médico que prescribe.
45 La administración de las composiciones también puede conseguirse a través de métodos de liberación sostenida o de suministro a largo plazo, que son bien conocidos para los expertos en la materia. Por "liberación sostenida" o "liberación a largo plazo", como se usa en la presente memoria, se entiende que el sistema de suministro administra una cantidad farmacéuticamente terapéutica de los presentes compuestos durante más de un día, preferentemente más de una semana y mucho más preferentemente al menos aproximadamente de 30 días a 60 días, o más. Los sistemas de liberación a largo plazo pueden comprender sólidos o geles implantables que contienen los anticuerpos, tales como polímeros biodegradables descritos anteriormente; bombas, incluyendo bombas peristálticas y bombas con propelente de fluorocarburo; bombas osmóticas y mini-osmóticas; y similares.
55 El método de la divulgación contempla la administración de anticuerpos monoclonales individuales y cualquier anticuerpo que reconozca los antígenos particulares reconocidos por estos anticuerpos, así como combinaciones de diferentes mAb. Dos o más anticuerpos monoclonales pueden proporcionar un efecto mejorado en comparación con un anticuerpo individual. Alternativamente, una combinación de un anticuerpo con un anticuerpo que se una a un antígeno diferente puede proporcionar un efecto mejorado en comparación con un anticuerpo individual. Dichos cócteles de mAb pueden tener ciertas ventajas en la medida en que contienen mAb, que explotan diferentes mecanismos efectores o combinan mAb directamente citotóxicos con mAb que dependen de la funcionalidad de los efectores inmunitarios. Dichos mAb en combinación pueden mostrar efectos terapéuticos sinérgicos.
Se entenderá que la divulgación divulgada y definida en esta memoria se amplía a todas las combinaciones 65 alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes a partir del texto o de los
dibujos. Todas estas combinaciones diferentes constituyen diversos aspectos alternativos de la divulgación.
Los siguientes protocolos se proporcionan como ejemplos no limitantes para el propósito de ilustración de la invención. 5
Ejemplos
Ejemplo 1
Se creó un anticuerpo anti-P2X7 no funcional contra el péptido KYYKENNVEKRTLIKVF (SEQ ID NO: 2) o Lys-Tyr-Tyr-Lys-Glu-Asn-Asn-Val-Glu-Lys-Arg-Thr-Leu-Ile-Lys-Val-Phe, que representa los aminoácidos 297-313 de la proteína P2X7 humana. El péptido se sintetizó por química en faso sólida (Mimotopes Pty Ltd, Melbourne, Australia) hasta alta pureza (>95 %) juzgada por espectrometría de masas. Se unió un resto Cys (C) C-terminal a la secuencia y a este se unió el reticulante MCS (éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-maleimido-caproico) para conjugar el
15 péptido a proteínas vehículo incluyendo por separado toxoide diftérico, albúmina sérica bovina y ovoalbúmina por Mimotopes.
Ejemplo 2
Se inmunizaron conejos blancos hembra de Nueva Zelanda, con edades entre 10-12 semanas, según el siguiente programa.
En el día uno, cada conejo recibió 200 ug de epítopo P2X7 conjugado con toxoide diftérico (peso total de antígeno ~500 ug del epítopo conjugado). Este péptido conjugado se suministró por Mimotopes Pty Ltd como una solución
25 estable.
El conjugado de epítopos se diluyó en PBS estéril hasta una concentración de 500 ug por 0,8 ml de PBS. A esto se añadió 0,1 ml de solución DEAE/dextrano/QUILA™ (2,5 mg de QUILA™ más 25 mg de DEAE/dextrano por ml de PBS) y 1,2 ml de montanide 15A50V. Esta solución se emulsionó usando jeringas luerloc de vidrio y acoplamiento luerloc de orificio estrecho.
A los animales se les inyectó 2 ml de la emulsión con adyuvante de epítopo en múltiples sitios subcutáneos e intramusculares.
35 Lo anterior se repitió a las 6 semanas y a las 9 semanas después de las inyecciones iniciales. En la semana 10, a los conejos se les inyectó por vía intravenosa 1 ml de PBS estéril que contenía 50 ug de epítopo P2X7 conjugado con DT. Cuatro días después, los conejos se mezclaron y se clasificó el suero que contenía el anticuerpo para futuro análisis y uso en inmunoensayos.
Ejemplo 3
Se usó el procedimiento del Ejemplo 2 excepto que se inyectó a ratones 20 ug de epítopo P2X7 (~50 ug de conjugado con DT) en 0,2 ml de emulsión con adyuvante de epítopo.
45 Cuatro días después de la inyección intravenosa, se midieron los títulos de anticuerpo en sangre de ratón y se seleccionaron los ratones con el mayor título como donantes de bazo para fusiones de hibridoma.
Ejemplo 4
Los ratones seleccionados anteriormente se usaron como donantes de células esplénicas y estas células se fusionaron con células de mieloma SP20 de ratón para formar líneas celulares de hibridoma según la modificación en formato de placa de 96 pocillos del protocolo original descrito por Kohler y Milstein.
Las líneas celulares se seleccionaron por estabilidad y por producción del anticuerpo específico contra epítopos 55 P2X7 particulares.
Ejemplo 5
Se seleccionó un anticuerpo monoclonal con afinidad adecuadamente alta por el epítopo diana para el estudio IHC. Las características de unión del anticuerpo se ensayaron midiendo la interacción con el epítopo diana en un instrumento Biacore. Se consiguió un total de 550 unidades de resonancia de unión en el tiempo de carga de 60 segundos que muestra asociación lenta. Fue evidente una disociación muy lenta después del cese de la carga sin disminución medible de la unión sobre los posteriores 10 minutos.
65 Ejemplo 6
imagen8

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  1. imagen1
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