ES2796698T3 - Anticuerpos anti-CD166 activables y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD166 que comprende: un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD166 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD166 humano y CD166 de mono cynomolgus, donde el AB comprende la secuencia de aminoácidos VH CDR1 GFSLSTYGMGVG (SEQ ID NO: 127), la secuencia de aminoácidos VH CDR2 NIWWSEDKH (SEQ ID NO: 128), la secuencia de aminoácidos VH CDR3 IDYGNDYAFTY (SEQ ID NO: 129), la secuencia de aminoácidos VL CDR1 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 130) o RSSQSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 131), la secuencia de aminoácidos VL CDR2 QMSNLAS (SEQ ID NO: 132) o QMSNRAS (SEQ ID NO: 133), y la secuencia de aminoácidos VL CDR3 AQNLELPYT (SEQ ID NO: 134); un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD166 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, y donde el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud; un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que es un sustrato para una proteasa; y un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), donde el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-LP1-CM-LP2-AB, y donde cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de 1 a 20 aminoácidos de longitud.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CD166 activables y procedimientos de uso de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere generalmente a anticuerpos activables que se unen específicamente a CD166 y a procedimientos para elaborar y usar estos anticuerpos anti-CD166 y anticuerpos activables anti-CD166 en una diversidad de indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y profilácticas.
Antecedentes de la invención
Las terapias basadas en anticuerpos han demostrado tratamientos eficaces para varias enfermedades, pero en algunos casos, las toxicidades debidas a una expresión diana amplia han limitado su eficacia terapéutica. Además, los productos terapéuticos basados en anticuerpos han mostrado otras limitaciones, tal como la depuración rápida de la circulación después de la administración. Los anticuerpos anti-CD166 comercialmente disponibles que reconocen tanto CD166 humano como cynomolgus se describen en KE et al. (DIFFERENTIATION, 2009, 77(3), pág. 256-262) y se conoce la eficacia terapéutica de un Fv anti-CD166 monocatenario a partir de WIIGER et al. (CANCER IMMUNOLOGY, 2010, 59(11), pág. 1665-1674).
En el ámbito de los productos terapéuticos de molécula pequeña, se han desarrollado estrategias para proporcionar profármacos de una entidad química activa. Dichos profármacos se administran en una forma relativamente inactiva (o significativamente menos activa). Una vez administrado, el profármaco se metaboliza in vivo en el compuesto activo. Dichas estrategias de profármaco pueden proporcionar una mayor selectividad del fármaco para su objetivo previsto y para una reducción de los efectos adversos. Los anticuerpos activables que comprenden un resto de enmascaramiento y un resto escindible, conjugados con un fármaco, se conocen por los documentos WO2010/081173 y WO2014/197612.
Existe una necesidad continua en el campo de los productos terapéuticos basados en anticuerpos para anticuerpos que imitan las características deseables del profármaco de molécula pequeña.
Resumen de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD166 que comprende: un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD166 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD166 humano y CD166 de mono cynomolgus, donde el AB comprende la secuencia de aminoácidos VH CDR1 GFSLSTYGMGVG (SEQ ID NO: 127), la secuencia de aminoácidos Vh CDR2 NIWWSEDKH (SEQ ID NO: 128), la secuencia de aminoácidos VH CDR3 IDYGNDYAFTY (SEQ ID NO: 129), la secuencia de aminoácidos VL CDR1 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 130) o RSSQSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 131), la secuencia de aminoácidos VL CDR2 QMSNLAS (SEQ ID NO: 132) o QMSNRAS (SEQ ID NO: 133), y la secuencia de aminoácidos VL CDR3 AQNLELPYT (SEQ ID NO: 134); un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD166 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, y donde el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud; un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que es un sustrato para una proteasa; y un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), donde el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-LP1-CM-LP2-AB, y donde cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el MM del anticuerpo activable de la invención: (i) tiene una constante de disociación para la unión al AB que es mayor que la constante de disociación del AB a CD166; y/o (ii) no interfiere ni compite con el AB por la unión al CD166 cuando el anticuerpo activable está en un estado escindido; y/o (iii) la secuencia polipeptídica es diferente de la del CD166 humano; y/o (iv) la secuencia polipeptídica no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB.
En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scAb y un dAb.
En algunas realizaciones, el AB se une específicamente a CD166 humano. En algunas realizaciones, el AB comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO: 122, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 123-126.
En algunas realizaciones, los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable de la invención comprende: una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de las s Eq ID NOS: 121, 122 o 239; y una secuencia de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, y 363-474.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo activable conjugado que, en un estado activado, se une a CD166 que comprende: el anticuerpo activable de la invención; y un agente conjugado con el AB.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable o el anticuerpo activable conjugado de la invención, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 135-238.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable o el anticuerpo activable conjugado de la invención, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 18-87 y 318-358.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable o el anticuerpo activable conjugado de la invención, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 219-238.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable o el anticuerpo activable conjugado de la invención, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 70-87 y 336-358.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable o el anticuerpo activable conjugado de la invención, el agente es una toxina o fragmento de la misma.
Opcionalmente, el agente es un inhibidor de microtúbulos; o un agente que daña el ácido nucleico; o se selecciona del grupo que consiste en una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma, y una pirrolobenzodiazepina o un derivado de la misma; o el agente es auristatina E o un derivado de la misma, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina D (MMAD), un maitansinoide seleccionado del grupo que consiste en DM1 y DM4, maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una duocarmicina, una pirrolobenzodiazepina, o un dímero de pirrolobenzodiazepina; y/o el agente es un resto detectable; opcionalmente donde el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable o el anticuerpo activable conjugado de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 121 y 122, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 123-126, 363-370, 373, 374, 377, 378, 381, 382, 385, 386, 389, 390, 393, 394, 397, 398, 401, 402, 405, 406, 409, 410, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 425, 426, 429, 430, 433, 434, 437, 438, 441, 442, 445, 446, 449, 450, 453, 454, 457, 458, 461, 462, 465, 466, 469, 470, 473, y 474.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable o el anticuerpo activable conjugado de la invención:
(i) el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde la combinación de secuencias de aminoácidos se selecciona de una fila individual en la Tabla A, donde, para una combinación dada, (a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias VH CDR correspondientes a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A, (b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias VL CDR correspondientes a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A, (c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de máscara (MM) correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A, y (d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A; y/o
(ii) el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde, para una combinación dada de secuencias de aminoácidos, (a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia VH o las secuencias VH CDR seleccionadas del grupo que consiste en: la secuencia VH o las secuencias VH CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B, (b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia VL o las secuencias VL CDR seleccionadas del grupo que consiste en: la secuencia VL o las secuencias VL CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B, (c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de máscara (MM) seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias MM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B, y (d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias CM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B; y/o
(iii) el anticuerpo activable comprende: una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, 122 o 239; y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, y 363-474.
En algunas realizaciones del anticuerpo activable conjugado de la invención, el agente está conjugado con el AB a través de un enlazador. Opcionalmente, el enlazador al que el agente está conjugado con el AB comprende un resto SPDB, un resto vc, o un resto PEG2-vc, y/o el enlazador y la toxina conjugados con el AB comprenden un resto SPDB-DM4, un resto vc-MMAD, un resto vc-MMAE, un resto vc-duocarmicina, o un resto PEG2-vc-MMAD; o el enlazador es un enlazador escindible o un enlazador no escindible.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado comprende secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina seleccionados de una fila individual en la Tabla C, donde, para la combinación dada: (a) el AB comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena pesada o la secuencia de dominio variable de cadena pesada correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla C, (b) el AB comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena ligera o la secuencia de dominio variable de cadena ligera correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla C, y (c) el enlazador y la toxina comprenden el enlazador y la toxina correspondientes a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla C.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo activable de la invención, o el anticuerpo activable conjugado de la invención, y un vehículo.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente adicional, opcionalmente donde el agente adicional es un agente terapéutico.
En aspecto más de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo activable de la invención.
En aún un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la invención.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo activable cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo o el anticuerpo activable, donde la célula comprende la molécula de ácido nucleico de la invención reivindicada, o el vector de la invención reivindicada.
En un aspecto más de la invención, se proporciona un procedimiento para elaborar un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD166, comprendiendo el procedimiento: (a) cultivar una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6, 7, 9, y 10; y (b) recuperar el anticuerpo activable; y/u opcionalmente (c) conjugar un agente de la reivindicación 8 con el anticuerpo activable recuperado.
En otro aspecto de la invención, se proporciona el anticuerpo activable de la invención, el anticuerpo activable conjugado de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso como un medicamento.
En un aspecto más de la invención, se proporciona el anticuerpo activable de la invención, el anticuerpo activable conjugado de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en un procedimiento para tratar, aliviar un síntoma de, o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad asociada con células que expresan CD166, donde el trastorno o enfermedad es cáncer.
En algunas realizaciones, el cáncer es un adenocarcinoma, un cáncer del conducto biliar (biliar), un cáncer de vejiga, un cáncer de hueso, un cáncer de mama, un cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer de mama triple negativo, un cáncer de endometrio, un cáncer de mama con receptor de estrógenos positivo, un carcinoide, un cáncer de cuello del útero, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, una leucemia, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células no pequeñas, un cáncer de pulmón de células pequeñas, un linfoma, un melanoma, un cáncer orofaríngeo, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración, un cáncer de riñón, un sarcoma, un cáncer de piel, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital, o un cáncer urotelial.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un colangiocarcinoma, un cáncer de endometrio, cáncer de mama triple negativo (TNBC), un cáncer de mama con receptor de estrógenos positivo, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), un carcinoma de próstata, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), cáncer orofaríngeo, cáncer de cuello del útero, un cáncer de ovario, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), y cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, los dos péptidos de unión (L1 y L2) no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), donde n es un entero de al menos uno.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), y GSSSG (SEQ ID NO: 8).
En algunas realizaciones, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 12), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 13), o GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 14).
En algunas realizaciones, LP2 comprende la secuencia de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 15), GSSGT (SEQ ID NO: 16) o GSSG (SEQ ID NO: 17).
En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 100 nM o menos para la unión a CD166.
En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 100 nM o menos para la unión a CD166 de mamífero. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 10 nM o menos para la unión a CD166 de mamífero. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 5 nM o menos para la unión a CD166. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 1 nM o menos para la unión a CD166. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 0,5 nM o menos para la unión a CD166. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 0,1 nM o menos para la unión a CD166. En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de 0,01 nM a 100 nM, de 0,01 nM a 10 nM, de 0,01 nM a 5 nM, de 0,01 nM a 1 nM, de 0,01 a 0,5 nM, de 0,01 nm a 0,1 nM, de 0,01 nm a 0,05 nM, de 0,05 nM a 100 nM, de 0,05 nM a 10 nM, de 0,05 nM a 5 nM, de 0,05 nM a 1 nM, de 0,05 a 0,5 nM, de 0,05 nm a 0,1 nM, de 0,1 nM a 100 nM, de 0,1 nM a 10 nM, de 0,1 nM a 5 nM, de 0,1 nM a 1 nM, de 0,1 a 0,5 nM, de 0,5 nM a 100 nM, de 0,5 nM a 10 nM, de 0,5 nM a 5 nM, de 0,5 nM a 1 nM, de 1 nM a 100 nM, de 1 nM a 10 nM, de 1 nM a 5 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 10 nM, o de 10 nM a 100 nM, para la unión a CD166 de mamífero.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en un estado no escindido se une específicamente a CD166 de mamífero con una constante de disociación inferior o igual a 1 nM, inferior o igual a 5 nM, inferior o igual a 10 nM, inferior o igual a 15 nM, inferior o igual a 20 nM, inferior o igual a 25 nM, inferior o igual a 50 nM, inferior o igual a 100 nM, inferior o igual a 150 nM, inferior o igual a 250 nM, inferior o igual a 500 nM, inferior o igual a 750 nM, inferior 0 igual a 1000 nM, y 122. /o inferior o igual a 2000 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en un estado no escindido se une específicamente a CD166 de mamífero con una constante de disociación superior o igual a 1 nM, superior o igual a 5 nM, superior o igual a 10 nM, superior o igual a 15 nM, superior o igual a 20 nM, superior o igual a 25 nM, superior o igual a 50 nM, superior o igual a 100 nM, superior o igual a 150 nM, superior o igual a 250 nM, superior o igual a 500 nM, superior o igual a 750 nM, superior o igual a 1000 nM, y 122. /o superior o igual a 2000 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en un estado no escindido se une específicamente al CD166 de mamífero con una constante de disociación en el intervalo de 1 nM a 2000 nM, de 1 nM a 1000 nM, de 1 nM a 750 nM, de 1 nM a 500 nM, de 1 nM a 250 nM, de 1 nM a 150 nM, de 1 nM a 100 nM, de 1 nM a 50 nM, de 1 nM a 25 nM, de 1 nM a 15 nM, de 1 nM a 10 nM, de 1 nM a 5 nM, de 5 nM a 2000 nM, de 5 nM a 1000 nM, de 5 nM a 750 nM, de 5 nM a 500 nM, de 5 nM a 250 nM, de 5 nM a 150 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 50 nM, de 5 nM a 25 nM, de 5 nM a 15 nM, de 5 nM a 10 nM, de 10 nM a 2000 nM, de 10 nM a 1000 nM, de 10 nM a 750 nM, de 10 nM a 500 nM, de 10 nM a 250 nM, de 10 nM a 150 nM, de 10 nM a 100 nM, de 10 nM a 50 nM, de 10 nM a 25 nM, de 10 nM a 15 nM, de 15 nM a 2000 nM, de 15 nM a 1000 nM, de 15 nM a 750 nM, de 15 nM a 500 nM, de 15 nM a 250 nM, de 15 nM a 150 nM, de 15 nM a 100 nM, de 15 nM a 50 nM, de 15 nM a 25 nM, de 25 nM a 2000 nM, de 25 nM a 1000 nM, de 25 nM a 750 nM, de 25 nM a 500 nM, de 25 nM a 250 nM, de 25 nM a 150 nM, de 25 nM a 100 nM, de 25 nM a 50 nM, de 50 nM a 2000 nM, de 50 nM a 1000 nM, de 50 nM a 750 nM, de 50 nM a 500 nM, de 50 nM a 250 nM, de 50 nM a 150 nM, de 50 nM a 100 nM, de 100 nM a 2000 nM, de 100 nM a 1000 nM, de 100 nM a 750 nM, de 100 nM a 500 nM, de 100 nM a 250 nM, de 100 nM a 150 nM, de 150 nM a 2000 nM, de 150 nM a 1000 nM, de 150 nM a 750 nM, de 150 nM a 500 nM, de 150 nM a 250 nM, de 250 nM a 2000 nM, de 250 nM a 1000 nM, de 250 nM a 750 nM, de 250 nM a 500 nM, de 500 nM a 2000 nM, de 500 nM a 1000 nM, de 500 nM a 750 nM, de 500 nM a 500 nM, de 500 nM a 250 nM, de 500 nM a 150 nM, de 500 nM a 100 nM, de 500 nM a 50 nM, de 750 nM a 2000 nM, de 750 nM a 1000 nM, o de 1000 nM a 2000 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en un estado activado se une específicamente a CD166 de mamífero con una constante de disociación es inferior o igual a 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM, o 10 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en un estado activado se une específicamente a CD166 de mamífero con una constante de disociación es superior o igual a 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM, o 10 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en un estado activado se une específicamente al CD166 de mamífero con una constante de disociación en el intervalo de 0,01 nM a 100 nM, de 0,01 nM a 10 nM, de 0,01 nM a 5 nM, de 0,01 nM a 1 nM, de 0,01 a 0,5 nM, de 0,01 nm a 0,1 nM, de 0,01 nm a 0,05 nM, de 0,05 nM a 100 nM, de 0,05 nM a 10 nM, de 0,05 nM a 5 nM, de 0,05 nM a 1 nM, de 0,05 a 0,5 nM, de 0,05 nm a 0,1 nM, de 0,1 nM a 100 nM, de 0,1 nM a 10 nM, de 0,1 nM a 5 nM, de 0,1 nM a 1 nM, de 0,1 a 0,5 nM, de 0,5 nM a 100 nM, de 0,5 nM a 10 nM, de 0,5 nM a 5 nM, de 0,5 nM a 1 nM, de 1 nM a 100 nM, de 1 nM a 10 nM, de 1 nM a 5 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 10 nM, o de 10 nM a 100 nM.
En algunas realizaciones, el CD166 de mamífero se selecciona del grupo que consiste en un CD166 humano y un CD166 de mono cynomolgus. En algunas realizaciones, el AB se une específicamente a CD166 humano o CD166 de mono cynomolgus con una constante de disociación de menos de 1 nM. En algunas realizaciones, el CD166 de mamífero es un CD166 humano. En algunas realizaciones, el CD166 de mamífero es un CD166 de cynomolgus.
En algunas realizaciones, el AB tiene una o más de las siguientes características: (a) el AB se une específicamente a CD166 humano; y (b) el AB se une específicamente a CD166 humano y a CD166 de mono cynomolgus.
En algunas realizaciones, el AB tiene una o más de las siguientes características: (a) el AB se une específicamente a CD166 humano y a CD166 de mono cynomolgus; (b) el AB inhibe la unión de CD6 de mamífero a CD166 de mamífero; (c) el AB inhibe la unión de CD6 humano a CD166 humano; y (d) el AB inhibe la unión de CD6 de mono cynomolgus a CD166 de mono cynomolgus.
En algunas realizaciones, el AB bloquea la capacidad de un ligando natural o receptor para unirse al CD166 de mamífero con una CE50 inferior o igual a 5 nM, inferior o igual a 10 nM, inferior o igual a 50 nM, inferior o igual a 100 nM, inferior o igual a 500 nM, y/o inferior o igual a 1000 nM. En algunas realizaciones, el AB bloquea la capacidad del CD6 de mamífero para unirse al CD166 de mamífero con una CE50 inferior o igual a 5 nM, inferior o igual a 10 nM, inferior o igual a 50 nM, inferior o igual a 100 nM, inferior o igual a 500 nM, y/o inferior o igual a 1000 nM. En algunas realizaciones, el ligando natural o receptor de CD166 es CD6.
En algunas realizaciones, el AB bloquea la capacidad de un ligando natural para unirse al CD166 de mamífero con una CE50 de 5 nM a 1000 nM, de 5 nM a 500 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 50 nM, de 5 nM a 10 nM, de 10 nM a 1000 nM, de 10 nM a 500 nM, de 10 nM a 100 nM, de 10 nM a 50 nM, de 50 nM a 1000 nM, de 50 nM a 500 nM, de 50 nM a 100 nM, de 100 nM a 1000 nM, de 100 nM a 500 nM, de 500 nM a 1000 nM. En algunas realizaciones, el AB bloquea la capacidad del CD6 de mamífero para unirse al CD166 de mamífero con una CE50 de 5 nM a 1000 nM, de 5 nM a 500 nM, de 5 nM a 100 nM, de 5 nM a 50 nM, de 5 nM a 10 nM, de 10 nM a 1000 nM, de 10 nM a 500 nM, de 10 nM a 100 nM, de 10 nM a 50 nM, de 50 nM a 1000 nM, de 50 nM a 500 nM, de 50 nM a 100 nM, de 100 nM a 1000 nM, de 100 nM a 500 nM, de 500 nM a 1000 nM. En algunas realizaciones, el ligando natural o receptor de CD166 es CD6.
En algunas realizaciones, el AB de la presente descripción inhibe o reduce el crecimiento, proliferación y/o metástasis de células que expresan CD166 de mamífero. Sin pretender quedar vinculado por ninguna teoría, el AB de la presente descripción puede inhibir o reducir el crecimiento, la proliferación y/o la metástasis de las células que expresan CD166 de mamífero al unirse específicamente a CD166 e inhibir, bloquear y/o prevenir la unión de un ligando o receptor natural a CD166 de mamífero. En algunas realizaciones, el ligando o receptor natural de CD166 de mamífero es CD6 de mamífero.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de secuencias en una fila dada de la Tabla A o cualquier combinación de una secuencia de máscara (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla B.
En algunas realizaciones, los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) y los conjugados de anticuerpo activablefármaco (AADC) pueden incluir uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de una secuencia de cadena ligera o una secuencia de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de cadena pesada o una secuencia de dominio variable de cadena pesada, un enlazador y una toxina en una fila dada de la Tabla C, o cualquier combinación de una secuencia de cadena ligera o una secuencia de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de cadena pesada o una secuencia de dominio variable de cadena pesada, un enlazador y una toxina de la Tabla C.
En algunas realizaciones, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que es mayor que la constante de disociación del AB a CD166.
En algunas realizaciones, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que no es mayor que la constante de disociación del AB a CD166.
En algunas realizaciones, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que es menor que la constante de disociación del AB a CD166.
En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB no es mayor de 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 veces o más, o entre 1-5, 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000­ 10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces o más que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, el MM no interfiere ni compite con el AB por unirse a CD166 cuando el anticuerpo activable está en un estado escindido.
En algunas realizaciones, el MM es un polipéptido de aproximadamente 2 a 40 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el MM es un polipéptido de hasta aproximadamente 40 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica MM es diferente de la de CD166. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica MM no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica MM es diferente de la de CD166 y no es más de un 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % o 10 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos dos veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos cinco veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos 10 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos 20 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos 40 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos 100 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos 1000 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 de tal forma que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD166 es al menos 10.000 veces mayor que la Kd del AB cuando no se acopla al MM hacia CD166.
En algunas realizaciones, en presencia de CD166, el MM reduce la capacidad del AB para unirse a CD166 en al menos un 90 % cuando el CM no está escindido, en comparación con cuando el CM se escinde cuando se ensaya in vitro usando un ensayo de desplazamiento de diana tal como, por ejemplo, el ensayo descrito en la Publicación PCT N.° WO 2010/081173.
En algunas realizaciones, el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 135-238.
En algunas realizaciones, la proteasa que escinde el CM está activa, por ejemplo, regulada positivamente o no regulada de ningún modo, en tejido enfermo, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa.
En algunas realizaciones, la proteasa se localiza conjuntamente con CD166 en un tejido, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos dos veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos cinco veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 10 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 20 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable está en el estado escindido), el AB se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 40 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que, en el estado escindido, el Ab se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 50 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que, en el estado escindido, el Ab se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 100 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que, en el estado escindido, el AB se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a CD166 se reduce para tener lugar con una constante de disociación que sea al menos 200 veces mayor que la constante de disociación de una unión de AB no modificado a CD166, mientras que, en el estado escindido, el AB se une a CD166.
En algunas realizaciones, el CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el CM es un polipéptido que incluye un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). En algunas realizaciones, cada una de la secuencia de sustrato CM1 y la secuencia de sustrato CM2 del sustrato CM1-CM2 es independientemente un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos una proteasa que está o se cree que está regulada positivamente o no está regulada de ningún modo en el cáncer. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos una proteasa que está o se cree que está regulada positivamente en la inflamación. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos una proteasa que está o se cree que está regulada positivamente, o no está regulada de ningún modo, en la autoinmunidad.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos una proteasa seleccionada del grupo que consiste en una metaloproteasa de matriz (MMP), trombina, una elastasa de neutrófilos, una proteasa de cisteína, legumaína y una serina proteasa, tal como matriptasa (MT-SP1), y urocinasa (uPA). Sin quedar ligados a la teoría, se cree que estas proteasas están reguladas positivamente, o no reguladas de ningún modo, en al menos uno de cáncer, inflamación y/o autoinmunidad.
Los sustratos ejemplares incluyen, pero sin limitación, sustratos escindibles por una o más de las siguientes enzimas o proteasas enumeradas en la Tabla 4.
En algunas realizaciones, el CM se selecciona para su uso con una proteasa específica, por ejemplo, una proteasa que se sabe que se localiza junto con la diana del anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos una MMP. Los ejemplos de MMP incluyen las MMP enumeradas en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una proteasa seleccionada del grupo que consiste en MMP 9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11 y MMP19. En algunas realizaciones, el Cm es un sustrato para MMP9. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para MMP14.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato que incluye la secuencia TGRGPSWV (SEQ ID NO: 18); SARGPSRW (SEQ ID NO: 19); TARGPSFK (SEQ ID NO: 20); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 21); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 22); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 23); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 24); AARGPAIH (SEQ ID NO: 25); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 26); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 27); RGPATPIM (SEQ ID NO: 28); RGPA (SEQ ID NO: 29); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 30); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 31); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 32); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 33); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 34); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 35); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 36); PLGL (SEQ ID NO: 37); LSGRSGNH (SEQ ID NO: 318); SGRSANPRG (SEQ ID NO: 319); LSGRSDDH (SEQ ID NO: 320); LSGRSDIH (SEQ ID NO: 321); LSGRSDQH (SEQ ID NO: 322); LSGRSDTH (SEQ ID NO: 323); LSGRSDYH (SEQ ID NO: 324); LSGRSDNP (SEQ ID NO: 325); LSGRSANP (SEQ ID NO: 326); LSGRSANI (SEQ ID NO: 327); LSGRSDNI (SEQ ID NO: 328); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 329); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 330); WATPRPMR (SEQ ID NO: 331); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 332); ISSGL (SEQ ID NO: 333); ISSGLLS (SEQ ID NO: 334); y/o ISSGLL (SEQ ID NO: 335).
En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 21). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TGRGPSWV (SEQ ID NO: 18). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PLTGRSGG (SEQ ID NO: 24). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 30). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 31). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 32). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PLGL (SEQ ID NO: 37). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SARGPSRW (SEQ ID NO: 19). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TARGPSFK (SEQ ID NO: 20). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GGWHTGRN (SEQ ID NO: 22). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos HTGRSGAL (SEQ ID NO: 23). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos AARGPAIH (SEQ ID NO: 25). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RGPAFNPM (SEQ ID NO: 26). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SSRGPAYL (SEQ ID NO: 27). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RGPATPIM (SEQ ID NO: 28). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RGPA (SEQ ID NO: 29). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSGNH (SEQ ID NO: 318). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SGRSANPRG (SEQ ID NO: 319). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDDH (SEQ ID NO: 320). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDIH (SEQ ID NO: 321). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDQH (SEQ ID NO: 322). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDTH (SEQ ID NO: 323). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDYH (SEQ ID NO: 324). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNP (SEQ ID NO: 325). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSANP (SEQ ID NO: 326). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSANI (SEQ ID NO: 327). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNI (SEQ ID NO: 328). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos MIAPVAYR (SEQ ID NO: 329). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 330). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 331). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos FRLLDWQW (SEQ ID NO: 332). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGL (SEQ ID NO: 333). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLS (SEQ ID NO: 334). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos y/o ISSGLL (SEQ ID NO: 335).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una MMP e incluye la secuencia ISSGLSS (SEQ ID NO: 38); QNQALRMA (SEQ ID NO: 39); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 40); STFPFGMF (SEQ ID NO: 41); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 42); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 43), ISSGLLSS (SEQ ID NO: 44), LKAAPRWA (SEQ ID NO: 45); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 46); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 47); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 48); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 49); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 50); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 51); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 52); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 53); y/o PAGLWLDP (SEQ ID NO: 54).
En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLSS (SEQ ID NO: 38). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 39). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 40). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 41). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PVGYTSSL (SEQ ID NO: 42). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 43). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 44). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 45). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 46). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LPGGLSPW (SEQ ID NO: 47). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos MGLFSEAG (SEQ ID NO: 48). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SPLPLRVP (SEQ ID NO: 49). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 50). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 51). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 52). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 53). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 54).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para trombina. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para trombina, e incluye la secuencia GPRSFGL (Se Q ID NO: 55) o GPRSFG (SEQ ID NO: 56). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GPRSFGL (SEQ ID NO: 57). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos GPRSFG (SEQ ID NO: 58).
En algunas realizaciones, el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 59); NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 60); TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 61); TSGRSANP (SEQ ID NO: 62); VAGRSMRP (SEQ ID NO: 63); VVPEGRRS (SEQ ID NO: 64); ILPRSPAF (SEQ ID NO: 65); MVLGRSLL (SEQ ID NO: 66); QGRAITFI (SEQ ID NO: 67); SPRSIMLA (SEQ ID NO: 68); y SMLRSMPL (SEQ ID NO: 69).
En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 59). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 60). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 61). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos TSGRSANP (SEQ ID NO: 62). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos VAGRSMRP (SEQ ID NO: 63). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos VVPEGRRS (SEQ ID NO: 64). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ILPRSPAF (SEQ ID NO: 65). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos MVLGRSLL (SEQ ID NO: 66). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos QGRAITFI (SEQ ID NO: 67). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SPRSIMLA (SEQ ID NO: 68). En algunas realizaciones, el CM comprende la secuencia de aminoácidos SMLRSMPL
(SEQ ID NO: 69).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una elastasa de neutrófilos. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una serina proteasa. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para uPA. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para legumaína. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para matriptasa.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una cisteína proteasa. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una cisteína proteasa, tal como una catepsina.
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato CM1-CM2 e incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70), que también se denomina en el presente documento sustrato 2001; ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO:
71); AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 72); TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 73);
VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 74); TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 75);
AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID No : 76), que también se denomina en el presente documento sustrato 3001;
LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 77); VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 78);
LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 79); LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 80);
LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 81); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 82);
LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 83); QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 84);
LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 85); QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 86);
ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 87); GLSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 336);
GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 337); ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 338), que también se denomina en el presente documento sustrato 2003; AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 339), que también se denomina en el presente documento sustrato 2004; AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 340), que también se denomina en el presente documento sustrato 2005; ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 341), que también se denomina en el presente documento sustrato 2006; ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 342), que también se denomina en el presente documento sustrato 2007; ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 343), que también se denomina en el presente documento sustrato 2008; ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 344), que también se denomina en el presente documento sustrato 2009; ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID n O: 345), que también se denomina en el presente documento sustrato
2010; ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 346), que también se denomina en el presente documento sustrato 2011;
ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 347), que también se denomina en el presente documento sustrato 2012;
ISSGLLSGRSANI (Se Q ID NO: 348), que también se denomina en el presente documento sustrato 2013;
sustrato 30 trato 3007; sustrato 30 sustrato 30
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sustrato 30
ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 357), que también se denomina en el presente documento sustrato 2014; y/o AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 358), que también se denomina en el presente documento sustrato 3014.
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 71). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGTSTSGRSANpRG (SEQ ID NO: 72).
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO:
73). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ
ID NO: 74). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP
(SEQ ID No : 75). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNH
(SEQ ID NO: 76). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGAVGLLAPP
(SEQ ID NO: 77). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH
(SEQ ID NO: 78). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP
(SEQ ID NO: 79). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 80). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 81). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID n O: 82). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGSGGSQNq A lRMA (SEQ ID NO: 83). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 84). En algunas realizaciones, el sustrato
CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSGNHGGSGGSQNQa Lr MA (SEQ ID NO: 85). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 86). En algunas
rea izaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 87). En algunas rea izaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia GLSGRSDNHGGAVGLLa Pp (SEQ ID NO: 336). En algunas rea izaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia y/o GLSGRSDNHGGVHMPlGf LGP (SEQ ID NO: 337). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 338). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPTSGRSANPRG (Se Q ID NO: 339). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 340). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 341). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 342). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 343). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 344). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 345). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 346). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 347). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 348). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 349). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 350). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 351). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 352). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 353). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 354). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 355). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSg RsANI (SEQ ID NO: 356), ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 357). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 358).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas. En algunas realizaciones, cada proteasa se selecciona del grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas, donde una de las proteasas se selecciona del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa, y la otra proteasa se selecciona del grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas seleccionadas del grupo que consiste de una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye al menos un primer CM y un segundo CM. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM son cada uno polipéptidos de no más de 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM en el anticuerpo activable en el estado no escindido tienen la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM1-CM2-AB o AB-CM2-CM1-MM. En algunas realizaciones, al menos uno del primer CM y el segundo CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa seleccionada del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una proteasa de cisteína, uPA, legumaína y matriptasa. En algunas realizaciones, el primer CM se escinde por un primer agente de escisión seleccionado del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa en un tejido diana, y el segundo CM se escinde por un segundo agente de escisión en un tejido diana. En algunas realizaciones, la otra proteasa se selecciona del grupo que consiste en las que se muestran en la T abla 4. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa, y el primer CM y el segundo CM son sustratos diferentes para la enzima. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada del grupo que consiste en las mostradas en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son proteasas diferentes. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión se localizan conjuntamente en el tejido diana. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM se escinden por al menos un agente de escisión en el tejido diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se expone y se escinde por una proteasa de modo que, en el estado activado o escindido, el anticuerpo activado incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye al menos una porción de LP2 y/o una secuencia CM después de que la proteasa haya escindido el CM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente conjugado con el AB o el AB de un anticuerpo activable es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. Como se usa en el presente documento, un fragmento de una toxina es un fragmento que conserva actividad tóxica. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador que incluye al menos una secuencia de sustrato CM1-CM2. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador que es escindible en un entorno intracelular o lisosómico. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN, un agente de escisión de ADN, un reticulador de ADN, un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 5. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se conjuga con uno o más equivalentes de un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se conjuga con un equivalente del agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se conjuga con dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez equivalentes del agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es parte de una mezcla de anticuerpos activables que tienen un número homogéneo de equivalentes de agentes conjugados. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es parte de una mezcla de anticuerpos activables que tienen un número heterogéneo de equivalentes de agentes conjugados. En algunas realizaciones, la mezcla de anticuerpos activables es tal que el número promedio de agentes conjugados con cada anticuerpo activable está entre cero y uno, entre uno y dos, entre dos y tres, entre tres y cuatro, entre cuatro y cinco, entre cinco y seis, entre seis y siete, entre siete y ocho, entre ocho y nueve, entre nueve y diez, y diez, y más. En algunas realizaciones, la mezcla de anticuerpos activables es tal que el número promedio de agentes conjugados con cada anticuerpo activable es uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende una o más modificaciones de secuencia de aminoácidos específicas del sitio, de modo que el número de residuos de lisina y/o cisteína aumenta o disminuye con respecto a la secuencia de aminoácidos original del anticuerpo activable, aumentando o disminuyendo correspondientemente así, en algunas realizaciones, el número de agentes que pueden conjugarse con el anticuerpo activable, o limitando en algunas realizaciones la conjugación de los agentes con el anticuerpo activable de una manera específica del sitio. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable modificado se modifica con uno o más aminoácidos no naturales de una manera específica del sitio, limitando así, en algunas realizaciones, la conjugación de los agentes con solo los sitios de los aminoácidos no naturales.
En algunas realizaciones, el agente es un agente antiinflamatorio.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal se conjuga con el anticuerpo activable a través de un espaciador. En algunas realizaciones, el espaciador se conjuga con el anticuerpo activable en ausencia de un péptido señal. En algunas realizaciones, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable en la disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal del espaciador-MM-CM-AB. Un ejemplo de un espaciador unido directamente al extremo N-terminal del MM del anticuerpo activable es QGQSGQ (SEQ ID NO: 88). Otros ejemplos de un espaciador unido directamente al extremo N-terminal del MM del anticuerpo activable incluyen QGQSGQG (SEQ ID NO: 305), QGQSG (SEQ ID NO: 306), QGQS (SEQ ID NO: 307), QGQ (SEQ ID NO: 308), QG (SEQ ID NO: 309), y Q. Otros ejemplos de un espaciador unido directamente al extremo N-terminal del MM del anticuerpo activable incluyen GQSGQG (SeQ ID NO: 359), QSGQG (SEQ ID NO: 360), SGQG (SEQ ID NO: 361), GQG (SEQ ID NO: 362), y G. En algunas realizaciones, no hay un espaciador unido al extremo N-terminal del MM. En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 88). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQG (SEQ ID NO: 305). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSG (SEQ ID NO: 306). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQS (SEQ ID NO: 307). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQ (SEQ ID NO: 308). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QG (SEQ ID NO: 309). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos el residuo aminoacídico Q. En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQSGQG (SEQ ID NO: 359). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QSGQG (SEQ ID NO: 360). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos SGQG (SEQ ID NO: 361). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQG (SEQ ID NO: 362). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos G. En algunas realizaciones, el espaciador está ausente.
En algunas realizaciones, el AB del anticuerpo activable contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el AB se puede genomanipular para incluir uno o más enlaces disulfuro.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 122.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 123-126.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 122, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 123-126.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de secuencias en una fila dada de la Tabla A o cualquier combinación de una secuencia de máscara (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla B.
T l A : m in i n n i r iv l n i- D1
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T l B: m n n ni r iv l ni- D1
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En algunas realizaciones, un anticuerpo activable de la presente descripción incluye uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de secuencias seleccionadas de la Tabla A o la Tabla B, donde el polipéptido incluye una combinación de una secuencia de enmascaramiento seleccionada de la columna titulada "Secuencia de enmascaramiento (MM)" de la Tabla A o la Tabla B, una secuencia de sustrato de la columna titulada "Secuencia de sustrato (CM)" de la Tabla A o la Tabla B, un dominio variable de cadena ligera o CDR de cadena ligera de la columna titulada "VL o VL CDR" o "VL CDR SEQ ID NOs" de la Tabla A o la Tabla B, y un dominio variable de cadena pesada o CDR de cadena pesada de la columna titulada "VH o VH CDR" o "VH CDR SEQ ID Nos" de la Tabla A o la Tabla B. Para ejemplo, un anticuerpo activable de la presente descripción incluye las secuencias de aminoácidos de la combinación n.° 54, que incluye la secuencia de enmascaramiento de SEQ ID NO: 222, la secuencia de sustrato de SEQ ID NO: 76, un dominio variable de cadena ligera que incluye las secuencias VL CDR de las SEQ ID NOS: 130, 132 y 134, y un dominio variable de cadena pesada que incluye las secuencias VH CDR de 127, 128 y 129. Por lo tanto, en el presente documento se describe un anticuerpo activable que incluye al menos la combinación de secuencias en cualquier fila dada de la Tabla A. De manera similar, se describe en el presente documento cualquier combinación de una secuencia de máscara (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla B. También se describe en el presente documento un anticuerpo activable que incluye al menos cualquier combinación de una secuencia de enmascaramiento, una secuencia de sustrato, una CDR de cadena pesada variable o CDR de cadena pesada variable, y cadena ligera variable o CDR de cadena ligera variable seleccionadas de las columnas correspondientes de la Tabla A o Tabla B. En algunas realizaciones ejemplares, un anticuerpo activable que incluye al menos la combinación de secuencias en cualquier fila dada de la Tabla A o cualquier combinación de una secuencia de máscara (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla B se pueden combinar con una o más toxinas, incluyendo una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma, o una pirrolobenzodiazepina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones ejemplares, un anticuerpo activable que incluye al menos la combinación de secuencias en cualquier fila dada de la Tabla A o cualquier combinación de una secuencia de máscara (MM), una secuencia de sustrato (CM), una secuencia de dominio variable de cadena ligera o secuencias CDR de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada o secuencias CDR de dominio variable de cadena pesada de la Tabla B se pueden combinar con una o más toxinas, incluyendo auristatina E, monometil auristatina F (MmAF), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina D (MMAD), maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una pirrolobenzodiazepina, un dímero de pirrolobenzodiazepina, y/o una duocarmicina.
Cualquiera de las combinaciones en la Tabla A o la Tabla B como se han descrito anteriormente se puede combinar con regiones constantes de inmunoglobulina humana para dar como resultado IgG completamente humanas, incluyendo IgG1, IgG2, IgG4, o regiones constantes mutadas para dar lugar a IgG humanas con funciones alteradas tales como IgG1 N297A, IgG1 N297Q o IgG4 S228P. Las combinaciones descritas en la Tabla A o la Tabla B no están limitadas por las combinaciones particulares que se muestran en cualquier fila dada y, por lo tanto, pueden incluir cualquier secuencia de máscara de la columna 2 de la Tabla A (o columna 1 de la Tabla B) combinada con cualquier secuencia de sustrato de la columna 3 de la Tabla A (o columna 2 de la Tabla B) combinada con cualquier secuencia VL o conjunto de secuencias VL CDR de la columna 4 de la Tabla A (o columna 3 o Tabla B) combinadas con cualquier secuencia VH o conjunto de secuencias VH CDR de la columna 5 de la Tabla A (o columna 4 de la Tabla B). Además de las secuencias de máscara descritas en la columna 2 de la Tabla A o la columna 1 de la Tabla B, cualquier secuencia de máscara descrita en el presente documento puede usarse en una combinación. Además de las secuencias de sustrato descritas en la columna 3 de la Tabla A o la columna 2 de la Tabla B, cualquier CM descrito en este documento puede usarse en una combinación. Además de la secuencia de región variable de cadena ligera o las secuencias CDR de cadena ligera descritas en la columna 4 de la Tabla A o la columna 3 de la Tabla B, cualquier secuencia de región variable de cadena ligera o secuencias CDR de cadena ligera descritas en el presente documento pueden usarse en una combinación. Además de la secuencia de región variable de cadena pesada o las secuencias CDR de cadena pesada descritas en la columna 5 de la Tabla A o la columna 4 de la Tabla B, cualquier secuencia de región variable de cadena pesada o secuencias CDR de cadena pesada descritas en el presente documento pueden usarse en una combinación.
En algunas realizaciones, los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) y los conjugados de anticuerpo activablefármaco (AADC) pueden incluir uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de una secuencia de cadena ligera o una secuencia de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de cadena pesada o una secuencia de dominio variable de cadena pesada, un enlazador y una toxina en una fila dada de la Tabla C, o cualquier combinación de una secuencia de cadena ligera o una secuencia de dominio variable de cadena ligera, y una secuencia de cadena pesada o una secuencia de dominio variable de cadena pesada, un enlazador y una toxina de la Tabla C.
Tabla C: Combinaciones anti-CD166 ADC ADC activable anti-CD166
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Se describe en el presente documento un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de la presente descripción o conjugado de anticuerpo activable-fármaco (AADc ) de la presente descripción puede incluir uno o más polipéptidos que incluyen la combinación de secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina enumerados en un fila dada de la Tabla C. Por lo tanto, un conjugado de anticuerpo activable-fármaco (ADC) de la presente descripción o conjugado de anticuerpo activable-fármaco (AADC) de la presente descripción que incluye la combinación de secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina enumerados en una fila dada o proporcionados como una combinación específica. Por ejemplo, un conjugado de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción puede incluir las secuencias de aminoácidos de la combinación n.° 55, que incluye una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 239, una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 246, y un enlazador-toxina spdb-DM4. En otro ejemplo de los AADC divulgados y descritos en el presente documento, un conjugado de anticuerpo activable-fármaco de la presente descripción puede incluir las secuencias de aminoácidos de la combinación n.° 33, que incluye una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 239, una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 244, y un enlazador-toxina vc-MMAE.
Cualquiera de las combinaciones en la Tabla C que enumera una región variable de cadena pesada o cadena ligera se puede combinar con regiones constantes de inmunoglobulina humana para dar como resultado IgG completamente humanas, incluyendo IgG1, IgG2, IgG4, o regiones constantes mutadas para dar lugar a IgG humanas con funciones alteradas tales como IgG1 N297A, IgG1 N297Q o IgG4 S228P. Las combinaciones descritas en la Tabla C no están limitadas por las combinaciones particulares mostradas en cualquier fila dada, y por lo tanto pueden incluir cualquier secuencia de cadena pesada o secuencia de región variable de cadena pesada de la columna de la columna 2 de la Tabla C combinada con cualquier secuencia de cadena ligera o secuencia de región variable de cadena ligera de la columna 3 de la Tabla C combinada con cualquier enlazador de la columna 4 en combinación con cualquier toxina de la columna 5. Además de las secuencias de cadena pesada o secuencias de región variable de cadena pesada enumeradas en la columna 2, cualquier secuencia de cadena pesada o secuencia de región variable de cadena pesada descrita en el presente documento puede usarse en una combinación. Además de las secuencias de cadena ligera o las secuencias de región variable de cadena ligera enumeradas en la columna 3, cualquier secuencia de cadena ligera o secuencia de región variable de cadena ligera descrita en el presente documento puede usarse en una combinación. Además de los enlazadores enumerados en la columna 4, cualquier enlazador descrito en el presente documento puede usarse en una combinación. Además de las toxinas enumeradas en la columna 5, cualquier toxina descrita en el presente documento puede usarse en una combinación.
En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo correspondiente; por ejemplo, la pK del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es similar a la del anticuerpo correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 15 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 11 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 9 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 7 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 5 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 2 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 24 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 20 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 18 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 16 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 14 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 horas cuando se administra a un organismo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado es monoespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado es multiespecífico, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, biespecífico o trifuncional. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado se formula como parte de una molécula de captador de linfocitos T pro-biespecífico (BITE). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado se formula como parte de un linfocito T modificado por el receptor de antígeno pro-quimérico (CAR) u otro receptor modificado por ingeniería genética.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo se incorpora en un anticuerpo activable multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos un brazo del anticuerpo activable multiespecífico se une específicamente a CD166. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo se incorpora en un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos un brazo del anticuerpo activable biespecífico se une específicamente a CD166.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD166, anticuerpos anti-CD166 conjugados, anticuerpos anti-CD166 activables y/o anticuerpos anti-CD166 activables conjugados descritos en el presente documento se usan junto con uno o más agentes adicionales o una combinación de más agentes. Los agentes adicionales adecuados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación prevista, tal como, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD166, anticuerpos anti-CD166 conjugados, anticuerpos anti-CD166 activables y/o anticuerpos anti-CD166 activables conjugados pueden usarse junto con un agente quimioterapéutico o antineoplásico adicional.
En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son un agente quimioterapéutico, tal como un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en docetaxel, paclitaxel, abraxano (es decir, paclitaxel conjugado con albúmina), doxorrubicina, oxaliplatino, carboplatino, cisplatino, irinotecan y gemcitabina.
En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son un inhibidor de punto de control, un inhibidor de cinasa, un agente dirigido a inhibidores en el microambiente tumoral, y/o un agonista de linfocitos T o células NK. En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son radioterapia, en solitario o en combinación con otro u otros agentes adicionales tal como un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son una vacuna, un oncovirus y/o un agente activador de DC tal como, a modo de ejemplo no limitativo, un agonista del receptor tipo toll (TLR) y/o a-CD40. En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son un anticuerpo dirigido a tumor diseñado para destruir el tumor a través de ADCC o a través de conjugación directa con una toxina (por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).
En algunas realizaciones, el inhibidor de punto de control es un inhibidor de un objetivo seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4, LAG-3, PD-1, CD166, TIGIT, TIM-3, B7H4 y Vista. En algunas realizaciones, el inhibidor de cinasa se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de B-RAFi, MEKi y Btk, tales como ibrutinib. En algunas realizaciones, el inhibidor de cinasa es crizotinib. En algunas realizaciones, el inhibidor del microambiente tumoral se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de IDO, un inhibidor de a-CSF1R, un inhibidor de a-CCR4, un TGF-beta, una célula supresora derivada de mieloide, o un linfocito de T regulador. En algunas realizaciones, el agonista se selecciona del grupo que consiste en Ox40, GITR, CD137, ICOS, CD27, y HVEM.
En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de CTLA-4. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de CD166. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de TIGIT. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de TIM-3. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de B7H4. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de Vista. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de B-RAFi. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de MEKi. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de Btk. En algunas realizaciones, el inhibidor es ibrutinib. En algunas realizaciones, el inhibidor es crizotinib. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de IDO. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de a-CSF1R. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de a-CCR4. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de TGF-beta. En algunas realizaciones, el inhibidor es una célula supresora derivada de mieloides. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de linfocito T regulador.
En algunas realizaciones, el agonista es Ox40. En algunas realizaciones, el agonista es GITR. En algunas realizaciones, el agonista es CD137. En algunas realizaciones, el agonista es ICOS. En algunas realizaciones, el agonista es CD27. En algunas realizaciones, el agonista es HVEM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo conjugado, anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado se administra durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales tales como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio y/o un agente inmunosupresor. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional se formulan en una única composición terapéutica, y el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional se administran simultáneamente. Como alternativa, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional están separados entre sí, por ejemplo, cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CDl66 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional se administran simultáneamente, o el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado se administran antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CDl66 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado se administran después de la administración del agente adicional, o el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional se administran de forma alterna. Como se describe en el presente documento, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional se administran en dosis únicas o en dosis múltiples.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran simultáneamente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales pueden formularse en una composición única o administrarse en forma de dos o más composiciones por separado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran secuencialmente, o el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado se administran durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales tales como, a modo de ejemplo no limitativo, un agente quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio y/o un agente inmunosupresor, tal como un agente alquilante, un antimetabolito, un agente antimicrotúbulos, un inhibidor de topoisomerasa, un antibiótico citotóxico, y/o cualquier otro agente que dañe el ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente adicional es un taxano, tal como paclitaxel (por ejemplo, Abraxane®). En algunas realizaciones, el agente adicional es un antimetabolito, tal como gemcitabina. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente alquilante, tal como quimioterapia a base de platino, tal como carboplatino o cisplatino. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente dirigido, tal como un inhibidor de cinasa, por ejemplo, sorafenib o erlotinib. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente dirigido, tal como otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, bevacizumab), un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo multiespecífico. En algunas realizaciones, el agente adicional es un inhibidor de proteosoma, tal como bortezomib o carfilzomib. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente inmunomodulador, tal como lenalidomida o IL-2. En algunas realizaciones, el agente adicional es radiación. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente considerado estándar de cuidado por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente quimioterapéutico bien conocido por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, el agente adicional es otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o otro anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el agente adicional es otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o otro anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo contra la misma diana que el primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el primer anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, contra CD166. En algunas realizaciones, el agente adicional es otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, otro anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o otro anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo contra una diana diferente de la diana del primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el primer anticuerpo conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo, anticuerpo activable o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo activable conjugado o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Como ejemplo no limitante, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y/o el AB de un anticuerpo activable es una pareja de unión para cualquier diana enumerada en la Tabla 1.
Tabla 1: Dianas eem lares
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Como un ejemplo no limitante, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y/o el AB de un anticuerpo activable es o se deriva de un anticuerpo enumerado en la Tabla 2.
Tabla 2: Fuentes ejemplares para Ab
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E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l a n t i c u e r p o a d i c io n a l o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o , a n t i c u e r p o c o n j u g a d o o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o , a n t i c u e r p o a c t i v a b le o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o , y / o e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le c o n j u g a d o o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o e s u n a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l , a n t i c u e r p o d e d o m in io , c a d e n a s e n c i l l a , f r a g m e n t o F a b , u n f r a g m e n t o F ( a b ' ) 2, u n s c F v , u n s c A b , u n d A b , u n a n t i c u e r p o d e c a d e n a p e s a d a d e d o m in io ú n ic o , o u n a n t i c u e r p o d e c a d e n a l i g e r a d e d o m in io ú n ic o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l a n t i c u e r p o a d i c io n a l o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o , a n t i c u e r p o c o n j u g a d o o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o , a n t i c u e r p o a c t i v a b le o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o , y / o e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le c o n j u g a d o o f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o e s u n a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l d e r a t ó n , d e o t r o r o e d o r , q u im é r i c o , h u m a n i z a d o o c o m p le t a m e n t e h u m a n o .
L a d e s c r i p c ió n t a m b ié n p r o p o r c io n a p r o c e d i m i e n t o s p a r a p r o d u c i r u n a n t i c u e r p o a n t i - C D 166 y / o u n p o l i p é p t i d o d e a n t i c u e r p o a n t i - C D 166 a c t i v a b le m e d ia n t e e l c u l t i v o d e u n a c é l u la e n c o n d i c io n e s q u e c o n d u c e n a la e x p r e s i ó n d e l p o l ip é p t i d o , d o n d e la c é l u la c o m p r e n d e u n a m o lé c u la d e á c i d o n u c l e ic o a i s la d a q u e c o d i f i c a u n a n t i c u e r p o y / o u n a n t i c u e r p o a c t i v a b le d e s c r i t o e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o , y / o v e c t o r e s q u e in c lu y e n e s t a s s e c u e n c ia s d e á c id o n u c l e ic o a i s la d a s . L a d e s c r i p c ió n p r o p o r c io n a p r o c e d i m i e n t o s p a r a p r o d u c i r u n a n t i c u e r p o y / o a n t i c u e r p o a c t i v a b le m e d ia n t e e l c u l t i v o d e u n a c é l u la e n c o n d i c io n e s q u e c o n d u c e n a la e x p r e s i ó n d e l a n t i c u e r p o y / o a n t i c u e r p o a c t i v a b le , d o n d e la c é l u la c o m p r e n d e u n a m o lé c u la d e á c i d o n u c l e ic o a i s l a d a q u e c o d i f i c a u n a n t i c u e r p o y / o u n a n t i c u e r p o a c t i v a b le d e s c r i t o e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o , y / o v e c t o r e s q u e in c lu y e n e s t a s s e c u e n c ia s d e á c i d o n u c l e ic o a i s la d a s .
L a i n v e n c ió n t a m b ié n p r o p o r c io n a u n p r o c e d i m i e n t o d e f a b r i c a c i ó n d e a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s q u e , e n u n e s t a d o a c t i v a d o , s e u n e n a C D 166 c o m o s e d e f in e e n la s r e i v i n d ic a c io n e s , ( a ) c u l t i v a n d o u n a c é l u la q u e c o m p r e n d e u n a c o n s t r u c c ió n d e á c i d o n u c l e ic o q u e c o d i f i c a e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le e n c o n d i c io n e s q u e c o n d u c e n a la e x p r e s i ó n d e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le , d o n d e e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le c o m p r e n d e u n r e s t o d e e n m a s c a r a m ie n t o ( M M ) , u n r e s t o e s c i n d ib le ( C M ) , y u n a n t i c u e r p o o u n f r a g m e n t o d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o ( A B ) q u e s e u n e e s p e c í f i c a m e n t e a C D 166 , ( i ) d o n d e e l C M e s u n p o l ip é p t i d o q u e f u n c io n a c o m o u n s u s t r a t o p a r a u n a p r o t e a s a ; y ( i i ) d o n d e e l C M s e p o s i c io n a e n e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le d e t a l f o r m a q u e , c u a n d o e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le e s t á e n e l e s t a d o n o e s c in d id o , e l M M in t e r f ie r e c o n la u n ió n e s p e c í f i c a d e l A B a l C D 166 , y e n u n e s t a d o e s c in d id o , e l M M n o i n t e r f ie r e n i c o m p i t e c o n la u n ió n e s p e c í f i c a d e l A B a C D 166 ; y ( b ) r e c u p e r a n d o e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le . E l A B , e l M M y / o e l C M a d e c u a d o s in c lu y e n c u a l q u i e r a d e l A B , M M , y / o C M d e s c r i t o s e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o .
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el MM y el CM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un péptido de unión entre el CM y el AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), y donde el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM. En algunas realizaciones, los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: espaciador-MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM-espaciador.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), donde n es un entero de al menos uno.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), y GSSSG (SEQ ID NO: 8).
En algunas realizaciones, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 12), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 13), o GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 14).
En algunas realizaciones, LP2 comprende la secuencia de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 15), GSSGT (SEQ ID NO: 16) o GSSG (SEQ ID NO: 17).
La descripción proporciona procedimientos para prevenir, retrasar la progresión de, tratar, aliviar un síntoma de, o mejorar de otro modo una enfermedad mediada por CD166 en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado descrito en el presente documento a un sujeto que lo necesite.
La descripción también proporciona procedimientos para prevenir, retrasar la progresión de, tratar, aliviar un síntoma de, o mejorar de otro modo un cáncer en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado descrito en el presente documento a un sujeto que lo necesite. Se sabe que CD166 se expresa en una diversidad de cánceres, tales como, a modo de ejemplo no limitativo, cualquier cáncer epitelial o de células escamosas, cualquier tipo de cáncer carcinoide y/o neuroendocrino. Ejemplos de cánceres incluyen, pero sin limitación, adenocarcinoma, cáncer del conducto biliar (biliar), cáncer de vejiga, cáncer de mama, por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer de mama con receptor de estrógenos positivo; cáncer carcinoide; cáncer de cuello del útero; colangiocarcinoma; cáncer colorrectal; de endometrio; glioma; cáncer de cabeza y cuello, por ejemplo, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón, por ejemplo, NSCLC, SCLC; linfoma; melanoma; cáncer orofaríngeo; cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata, por ejemplo, carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración; cáncer de riñón; cáncer de piel; cáncer de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer de testículo; cáncer de tiroides; y cáncer urotelial.
En algunas realizaciones, el cáncer es cualquier cáncer epitelial o escamoso. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cuello del útero, cáncer orofaríngeo, y/o cáncer de cabeza y cuello.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de vejiga, un cáncer de hueso, un cáncer de mama, un carcinoide, un cáncer de cuello del útero, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un cáncer epitelial, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un melanoma, un cáncer orofaríngeo, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata, un cáncer de riñón, un sarcoma, un cáncer de piel, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital, y/o un cáncer urotelial.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama triple negativo (TNBC), cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), carcinoma colorrectal mutante Ras, un cáncer epitelial raro, cáncer orofaríngeo, cáncer de cuello del útero, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), y/o cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con un tumor que expresa CD166. En algunas realizaciones, el cáncer se debe a un tumor que expresa CD166.
Se puede administrar un anticuerpo anti-CD166, un anticuerpo anti-CD166 conjugado, un anticuerpo anti-CD166 activable y/o un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado usado en cualquiera de las realizaciones de estos procedimientos y usos en cualquier estadio de la enfermedad. Por ejemplo, tal anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado pueden administrarse a un paciente que padece cáncer de cualquier estadio, desde temprano a metastásico. Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente en el presente documento.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal de compañía. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal bajo el cuidado de un veterinario.
El anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y formulaciones terapéuticas de los mismo se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de CD166. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de CD166 se identifica usando cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante cualquiera de una diversidad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican utilizando cualquiera de una diversidad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
La administración de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o la actividad aberrante de CD166 se considera exitosa si se logra cualquiera de una diversidad de objetivos clínicos o de laboratorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o la actividad aberrante de CD166 se considera exitosa si uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno se alivia, se reduce, se inhibe o no progresa a un estado posterior, es decir, peor. La administración de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o la actividad aberrante de CD166 se considera exitosa si la enfermedad o trastorno entra en remisión o no progresa a un estado posterior, es decir, peor.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y formulaciones terapéuticas de los mismos se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno, tal como sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica, donde las células enfermas del sujeto expresan CD166. En algunas realizaciones, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de CD166. En algunas realizaciones, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o actividad normal de CD166. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno, donde las células enfermas del sujeto expresan CD166, se identifica usando cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante cualquiera de una diversidad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican utilizando cualquiera de una diversidad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y las formulaciones terapéuticas de los mismos se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD166 o la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de dichas células, tal como los sujetos que padecen cáncer u otras afecciones neoplásicas. En algunas realizaciones, las células están asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de CD166. En algunas realizaciones, las células están asociadas con la expresión y/o actividad normal de CD166. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con las células que expresan CD166 se identifica usando cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante cualquiera de una diversidad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican utilizando cualquiera de una diversidad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
La administración de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con las células que expresan CD166 se considera exitosa si se logra cualquiera de una diversidad de objetivos clínicos o de laboratorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD166 se considera exitosa si uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno se alivia, se reduce, se inhibe o no progresa a un estado posterior, es decir, peor. La administración de un anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD166 se considera exitosa si la enfermedad o trastorno entra en remisión o no progresa a un estado posterior, es decir, peor.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o el anticuerpo anti-CD166 activable conjugado se administra durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales, tales como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio, y/o un agente inmunosupresor. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran simultáneamente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales pueden formularse en una composición única o administrarse en forma de dos o más composiciones por separado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166, anticuerpo anti-CD166 conjugado, anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado y el uno o más agentes adicionales se administran secuencialmente.
La descripción también proporciona procedimientos y kits para usar los anticuerpos anti-CD166 activables y/o los anticuerpos anti-CD166 activables conjugados en una diversidad de indicaciones de diagnóstico y/o profilácticas. Por ejemplo, la descripción proporciona procedimientos y kits para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y una diana de interés en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto a un sujeto o muestra con un anticuerpo activable anti-CD166, donde el anticuerpo anti -CD166 activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable anti-CD166 en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a CD166, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, cuando el AB está en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB al CD166, y cuando el AB está en un estado escindido y activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica de AB a CD166; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable anti-CD166 activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable anti-CD166 activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión y CD166 están presentes en el sujeto o la muestra, y donde ningún nivel detectable de anticuerpo activable anti-CD166 activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión, CD166 o tanto el agente de escisión como CD166 están ausentes en el sujeto o la muestra.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable es un anticuerpo anti-CD166 activable al que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo anti-CD166 activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye un marcador detectable. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador detectable incluye un agente de formación de imágenes, un agente de contraste, una enzima, un marcador fluorescente, un cromóforo, un colorante, uno o más iones metálicos, o un marcador basado en ligando. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de formación de imágenes comprende un radioisótopo. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), proteína fluorescente roja tdimer2 (RFP2 tdimer), HCRED, o un derivado de europio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador luminiscente comprende un derivado de N-metilacridio. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el marcador comprende un marcador Alexa Fluor®, tal como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador basado en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un roedor.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el procedimiento es un procedimiento in vivo. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in s itu. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento e x vivo. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vitro.
En algunas realizaciones de los procedimientos y kits, el procedimiento se usa para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable anti-CD166 de la descripción, seguido del tratamiento administrando ese anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, CD166) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable anti-CD166 que se ensaya en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo anti-CD166 activable que comprende tal CM, y a continuación se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD166 activable y/o anticuerpo anti-CD166 activable conjugado que se ensayó. Asimismo, los pacientes que den negativo para cualquiera de o tanto la diana (por ejemplo, CD166) como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otros anticuerpos activables anti-CD166 hasta que se identifique un anticuerpo activable anti-CD166 adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable anti-CD166 que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de enfermedad). En algunas realizaciones, a continuación al paciente se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD166 activable y/o conjugado para el que el paciente dio positivo. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden incluir un anticuerpo de la invención y un vehículo. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que representa la unión de diversos anticuerpos anti-CD166 de la presente descripción a la proteína CD166 humana.
La figura 2 es una representación esquemática del esquema de selección para péptidos de enmascaramiento anti-CD166 de la presente descripción. Los cuadros indican poblaciones con los parámetros de clasificación indicados entre los cuadros. Todas las clasificaciones FACS se realizaron en BSA al 0,5 % con exceso de isotipo de ratón para bloquear la unión no específica al Mab M9 marcado con Alexa Fluor 488 (VH de SEQ ID NO: 119, VL de SEQ ID NO: 120).
Las figuras 3A y 3B son una serie de gráficos que representan la capacidad del anticuerpo anti-CD166 CD166 M9 vK1/HcB (VH de SEQ ID NO: 121, VL de SEQ ID NO: 123) de la presente descripción y diversos anticuerpos activables anti-CD166 de la presente descripción para unirse a CD166 humano.
La figura 4 es un gráfico que representa la capacidad de diversos anticuerpos activables anti-CD166 de la descripción para unirse a CD166 humano cuando se activan proteolíticamente.
La figura 5 es un gráfico que representa la capacidad de diversos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados de la descripción para unirse a CD166 humano cuando se activan proteolíticamente.
Las figuras 6A-6D son una serie de imágenes que demuestran que un anticuerpo anti-CD166 activable de la descripción se activa (es decir, se escinde) en muestras de tejido de cáncer de colon, y el anticuerpo anti-CD166 activable no se activa en muestras de tejido sanas. Las figuras 6A y 6C representan los resultados del análisis IHC en las muestras de tumor y de tejido sano, y las figuras 6B y 6D representan los resultados del ensayo de imagen in s itu en las muestras de tumor y de tejido sano.
Las figuras 7A-7D son una serie de imágenes que demuestran que un anticuerpo anti-CD166 activable de la descripción se activa (es decir, se escinde) en muestras de tejido de cáncer de pulmón, y el anticuerpo anti-CD166 activable no se activa en muestras de tejido sanas. Las figuras 7A y 7C representan los resultados del análisis IHC en las muestras de tumor y de tejido sano, y las figuras 7B y 7D representan los resultados del ensayo de imagen in situ en las muestras de tumor y de tejido sano.
Las figuras 8A-8D son una serie de imágenes que demuestran que un anticuerpo anti-CD166 activable de la descripción no se activa en muestras de tejido sano. Las figuras 8A y 8C representan los resultados del análisis IHC en las muestras de tejido sano, y las figuras 8B y 8D representan los resultados del ensayo de imagen in situ en las muestras de tejido sano.
La figura 9 es una serie de gráficos que representan la potencia de un anticuerpo anti-CD166 conjugado de la descripción contra una línea celular de cáncer de mama, una línea celular de cáncer de próstata, una línea celular de cáncer de páncreas, una línea celular de cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, y una línea celular CD166 como control negativo.
La figura 10 es un gráfico que representa la eficacia de un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado (AADC, Activatable Antibody Drug Complex) de la descripción en un modelo de cáncer de mama.
La figura 11 es un gráfico que representa la eficacia de un conjugado CD166 AADC DM4 de la presente descripción (es decir, un anticuerpo anti-CD166 activable de la descripción conjugado con DM4) en el modelo de cáncer de pulmón de células no pequeñas H292 (NSCLC).
La figura 12 es un gráfico que representa la eficacia del conjugado CD166 AADC DM4 de la presente descripción en el modelo de cáncer de pulmón de células no pequeñas H1975 (NSCLC).
La figura 13 es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos anti-CD166 de la descripción para unirse a CD166 humano y de mono de cynomolgus con una afinidad equivalente.
La figura 14 es un gráfico que representa los resultados de un estudio de tolerabilidad en monos cynomolgus usando un anticuerpo anti-CD166 activable de la descripción.
La figura 15 es un gráfico que demuestra que el anticuerpo activable anti-CD166 conjugado de la presente descripción se tolera bien a la dosis terapéutica proyectada.
Las figuras 16A, 16B y 16C son una serie de gráficos que representan la capacidad de diversos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados de la descripción para unirse a CD166 humano cuando dichos anticuerpos activables conjugados se activan proteolíticamente.
La figura 17 es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos anti-CD166 de la presente descripción para unirse a células H292 humanas y células epiteliales de riñón primario de mono cynomolgus con una afinidad comparable.
La figura 18 es un gráfico que representa la capacidad de los anticuerpos anti-CD166 de la presente descripción para inhibir la unión de células HuT-78 humanas al receptor CD6.
Las figuras 19A-19C son gráficos que representan la capacidad de los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción para unirse a células CD166 y humanas en formas activadas por proteasa (escindidas) e inactivadas (escindidas).
Las figuras 20A y 20B son gráficos que representan un ensayo de citotoxicidad ejemplar de los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción a células H292 y HCC1806 humanas.
Las figuras 21A-21D son gráficos que representan la capacidad de los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción para inducir una respuesta inmunológica en las células.
La figura 22 es un gráfico que representa la capacidad de los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción para inducir una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en las células. La figura 23 son gráficos que representan la eficacia de los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción contra múltiples modelos de tumor de xenoinjerto derivado de células y derivado de paciente.
Las figuras 24A a 24D son gráficos que representan la citotoxicidad de los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármacos de la presente descripción contra múltiples líneas celulares derivadas de cáncer de endometrio, y un ensayo que muestra los niveles de expresión de CD166 en las células derivadas de cáncer de endometrio. Las figuras 25A y 25B representan estudios ejemplares de la unión in situ de anticuerpos anti-CD166 de la presente descripción en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón.
La figura 26 es un gráfico que representa la eficacia de los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción contra un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón de ratón.
Descripción detallada de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
La descripción proporciona anticuerpos monoclonales (mAb) y anticuerpos monoclonales activables que se unen específicamente a CD166, también conocido como grupo de diferenciación 166, molécula de adhesión celular leucocitaria activada (ALCAM), y/o MEMD. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos monoclonales activables son internalizados por células que contienen CD166. CD166 es una molécula de adhesión celular que se une a CD6, un receptor de superficie celular que pertenece a la superfamilia de proteínas ricas en cisteína del receptor scavenger (SRCR) (SRCRSF). Se sabe que CD166 está asociado con interacciones célula-célula y célula-matriz, la adhesión celular, la migración celular, y la activación y proliferación de linfocitos T. La expresión y/o actividad aberrante de CD166 y la señalización relacionada con CD166 se han implicadas en la patogénesis de muchas enfermedades y trastornos, tales como cáncer, inflamación y autoinmunidad. Por ejemplo, CD166 está altamente expresado en una diversidad de tipos de cáncer tales como, por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón como, tal NSCLC y/o SCLC, cáncer orofaríngeo, cáncer de cuello del útero, y cáncer de cabeza y cuello, tal como HNSCC.
La descripción proporciona anticuerpos anti-CD166, anticuerpos anti-CD166 conjugados, anticuerpos anti-CD166 activables y/o anticuerpos anti-CD166 activables conjugados que son útiles en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de CD166. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD166 activables se usan en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de un cáncer u otra afección neoplásica.
La descripción proporciona anticuerpos anti-CD166, anticuerpos anti-CD166 conjugados, anticuerpos anti-CD166 activables y/o anticuerpos anti-CD166 activables conjugados que son útiles en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan CD166. En algunas realizaciones, las células están asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de CD166. En algunas realizaciones, las células están asociadas con la expresión y/o actividad normal de CD166. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD166 activables se usan en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de un cáncer u otra afección neoplásica.
La descripción proporciona anticuerpos anti-CD166, anticuerpos anti-CD166 conjugados, anticuerpos anti-CD166 activables y/o anticuerpos anti-CD166 activables conjugados que son útiles en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno en el que las células enfermas expresan CD166. En algunas realizaciones, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de CD166. En algunas realizaciones, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o actividad normal de CD166. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD166 activables se usan en procedimientos para tratar, prevenir, retrasar la progresión de, mejorar y/o aliviar un síntoma de un cáncer u otra afección neoplásica.
Los anticuerpos anti-CD166 activables y/o los anticuerpos anti-CD166 activables conjugados incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD166 acoplado a un resto de enmascaramiento (MM), de modo que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a CD166. En algunas realizaciones, el Mm se acopla a través de una secuencia que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que se localiza conjuntamente con CD166 en un sitio de tratamiento en un sujeto.
Los anticuerpos anti-CD166 activables ejemplares incluyen, por ejemplo, anticuerpos activables que incluyen una cadena pesada y una cadena ligera que son, o se derivan de, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera mostradas a continuación (las secuencias CDR, que se definieron de acuerdo con la definición de AbM proporcionada en el sitio web del Dr. Andrew C. R. Martin, available at www_bioinf_org_uk/abs/) se muestran en negrita y subrayadas):
muM9 VH:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLANIWWSEDKHYNSALKS
RLTISKDTSNNQVFLKISSVDTADTATYYCVQIDYGNDYAFTYWGQGTLVTVSA (SEQ ID
NO: 119)
muM9 VL:
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRF
SSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 120)
huM9b VH:
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPPGKALEWLANIWWSEDKHYSP
SLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCVQIDYGNDYAFTYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 121)
huM9c VH:
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPPGKALEWLANIWWSEDKHYSP
SLKSRLTITKDTSKNQVVLTITNVDPVDTATYYCVQIDYGNDYAFTYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 122)
hM9vK-1 VL:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN
LASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 123)
hM9vK-2 VL:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN
LASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 124)
hM9vK-3a VL:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN
RASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 125)
hM9vK-3b VL:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN
RASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 126)
Los anticuerpos anti-CD166 activables ejemplares incluyen, por ejemplo, anticuerpos activables que incluyen una cadena pesada y una cadena ligera que son, o se derivan de, la variable de cadena pesada y cadena ligera que se muestra a continuación:
HuCD166_HcC
Secuencia de aminoácidos
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPPGKALEWLANIWWSEDKHYSPSLKS
RLTITKDTSKNQVVLTITNVDPVDTATYYCVQIDYGNDYAFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP
SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT
YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 239)
HuCD166_Lc1
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRF
SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT
ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV
THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 240)
Los anticuerpos anti-CD166 activables ejemplares incluyen, por ejemplo, anticuerpos activables que incluyen una combinación de una secuencia de región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 1 (VH CDR1, también denominada en el presente documento CDRH1), una secuencia de región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 2 (VH CDR2, también denominada en el presente documento CDRH2), una secuencia de región determinante de complementariedad variable de cadena pesada 3 (VH CDR3, también denominada en el presente documento CDRH3), una secuencia de región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 1 (VL CDR1, también denominada en el presente documento CDRL1), una secuencia de región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 2 (VL CDR2, también denominada en el presente documento CDRL2), y una secuencia de región determinante de complementariedad variable de cadena ligera 3 (VL CDR3, también denominada en el presente documento CDRL3), donde al menos una secuencia CDR se selecciona del grupo que consiste en una secuencia VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLSTYGMGVG (SEQ ID NO: 127); una secuencia VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos NIWWSEDKH (SEQ ID NO: 128); una secuencia VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos IDYGNDYAFTY (SEQ ID NO: 129); una secuencia VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 130) o RSSQSLLHSNGITYLY (SEQ iD NO: 131); una secuencia VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos QMSNLAS (SEQ ID NO: 132) o QMSNRAS (SEQ ID NO: 133); y una secuencia Vl CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos AQNLELPYT (SEQ ID NO: 134).
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N.° 20150071937, 20090070890, y/o 20090203538.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una cadena pesada que comprende una secuencia VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, y/o VL CDR3 que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos CDR mostrada en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N.° 20150071937, 20090070890, y/o 20090203538.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una cadena ligera que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una cadena pesada que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en la Tabla 12, y una cadena ligera que comprende o se deriva de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera de las combinaciones mostradas en el Grupo A en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye la combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera mostradas en el Grupo B en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye la combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera mostradas en el Grupo C en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye la combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y de región variable de cadena ligera mostradas en el Grupo D en la Tabla 12.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo A en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo A en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo A en la Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo A en la Tabla 12.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo B en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo B en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo B en la Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo B en la Tabla 12.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo C en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo C en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo C en la Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo C en la Tabla 12.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo D en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena ligera mostradas en el Grupo D en la Tabla 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una combinación de las CDR de una secuencia de cadena pesada de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo D en la Tabla 12 y las CDR de una secuencia de cadena ligera de las secuencias de cadena pesada mostradas en el Grupo D en la Tabla 12.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable incluye una secuencia CDR mostrada en la Tabla 13, una combinación de secuencias VL CDR (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3) seleccionadas del grupo que consiste en las combinaciones mostradas en una fila individual en la Tabla 13, una combinación de secuencias VH CDR (VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) seleccionadas del grupo que consiste en las combinaciones mostradas en la Tabla 13, o una combinación de secuencias VL CDR y VH CDR (VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3) seleccionadas del grupo que consiste en las combinaciones mostradas en la Tabla 13.
Tabla 13. Secuencias CDR para anticuerpos y anticuerpos activables que se unen a CD166
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En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable comprende o se deriva de un anticuerpo fabricado, secretado o producido de otro modo por un hibridoma, tal como, por ejemplo, el hibridoma o hibridomas descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 20040048319 y depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el número de depósito PTA-4478. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable comprende o se deriva de un anticuerpo fabricado, secretado o producido de otro modo por un hibridoma, tal como, por ejemplo, el hibridoma o hibridomas descritos en la patente de EE.UU. N.° 6.022.540 y depositados en la ATCC con el número de depósito HB 11789.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 activable comprende o se deriva de un anticuerpo fabricado, secretado o producido de otro modo por un hibridoma, tal como, por ejemplo, el hibridoma o hibridomas descritos en la patente de EE.UU. N.° 5.998.172 y depositados en la ATCC con el número de depósito HB 12136, HB 12137, HB 12138, HB12139, HB 12140, y/o HB 12141.
Los anticuerpos anti-CD166 y los AB en los anticuerpos activables de la descripción se unen específicamente a una diana CD166, tal como, por ejemplo, CD166 de mamífero y/o CD166 humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos anti-CD166 y los AB que se unen al mismo epítopo de CD166 que un anticuerpo de la descripción y/o un anticuerpo activable activado descrito en el presente documento. También se incluyen en la descripción los anticuerpos anti-CD166 y los AB que compiten con un anticuerpo anti-CD166 y/o un anticuerpo activable anti-CD166 activado descrito en el presente documento para la unión a una diana CD166, por ejemplo, CD166 humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos anti-CD166 y los AB que compiten de forma cruzada con un anticuerpo anti-CD166 y/o un anticuerpo activable anti-CD166 activado descrito en el presente documento para la unión a una diana CD166, por ejemplo, CD166 humano.
Los anticuerpos anti-CD166 activables proporcionados en el presente documento incluyen un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, el resto de enmascaramiento es una secuencia de aminoácidos que está acoplada o unida de otro modo al anticuerpo anti-CD166 y se posiciona dentro de la construcción de anticuerpo anti-CD166 activable de modo que el resto de enmascaramiento reduce la capacidad del anticuerpo anti-CD166 para unirse específicamente a CD166. Los restos de enmascaramiento adecuados se identifican usando cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los restos de enmascaramiento peptídicos se identifican usando los procedimientos descritos en la publicación PCT N.° WO 2009/025846 de Daugherty et al.
Los anticuerpos anti-CD166 activables proporcionados en el presente documento incluyen un resto escindible. En algunas realizaciones, el resto escindible incluye una secuencia de aminoácidos que es un sustrato para una proteasa, generalmente una proteasa extracelular. Los sustratos adecuados se identifican usando cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los sustratos peptídicos se identifican usando los procedimientos descritos en la patente de EE.UU. N.° 7.666.817 de Daugherty et al.; en la patente de EE.UU. N.° 8.563.269 de Stagliano et al.; y en la publicación PCT N.° WO 2014/026136 de La Porte et al. (Véase también Boulware et al. "Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics". Biotechnol Bioeng. 106.3 (2010): 339-46).
Los sustratos ejemplares incluyen, pero sin limitación, sustratos escindibles por una o más de las siguientes enzimas o proteasas enumeradas en la Tabla 4.
T l 4: Pr nzim m l r
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Los anticuerpos anti-CD166 activables descritos en el presente documento superan una limitación de los productos terapéuticos de anticuerpos, particularmente los productos terapéuticos de anticuerpos que se sabe que son tóxicos al menos en cierto grado in vivo.La toxicidad mediada por la diana constituye una limitación importante para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos anti-CD166 activables proporcionados en el presente documento están diseñados para abordar la toxicidad asociada con la inhibición de la diana en tejidos normales por anticuerpos terapéuticos tradicionales. Estos anticuerpos anti-CD166 activables permanecen enmascarados hasta que se activan proteolíticamente en el sitio de la enfermedad. Comenzando con un anticuerpo anti-CD166 como anticuerpo terapéutico parental, los anticuerpos anti-CD166 activables se genomanipularon acoplando el anticuerpo a una máscara inhibidora a través de un enlazador que incorpora un sustrato de proteasa.
Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental a la diana.
La Kd del AB modificado con un MM hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10­ 1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000- 10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces mayor que la Kd del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificador con un MM hacia la diana es al menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000. 000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10­ 1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000- 100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000­ 1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana.
La constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es generalmente mayor que la Kd del AB hacia la diana. La Kd del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces mayor que la Kd del AB hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del MM hacia el AB es generalmente menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana. La afinidad de unión del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es aproximadamente igual a la Kd del AB hacia la diana. En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB no es mayor que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es menor que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es mayor que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que no es mayor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que no es menor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es aproximadamente igual a la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es menor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es mayor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que no es más de 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, o 1.000 veces mayor que la Kd para la unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, el MM tiene una Kd para la unión al AB que es entre 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1.000, 20-100, 20-1000, o 100­ 1.000 veces mayor que la Kd para la unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es menor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que no es mayor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es aproximadamente igual a la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que no es menor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es mayor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, o 1.000 menor que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es entre 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1.000, 20-100, 20-1000, o 100-1.000 veces menor que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, el MM tiene una afinidad para la unión al AB que es de 2 a 20 veces menor que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, un MM no unido covalentemente al AB y a una concentración equimolar con respecto al AB no inhibe la unión del AB a la diana. Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental a la diana. En comparación con la unión del AB no modificado con un MM o la unión del AB parental a la diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM puede reducirse en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso un 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
El MM inhibe la unión del AB a la diana. El MM se une al dominio de unión a antígeno del AB e inhibe la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir estéricamente la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir alostéricamente la unión del AB a su diana. En estas realizaciones, cuando el AB se modifica o se acopla a un MM y en presencia de la diana, no hay unión o no hay sustancialmente ninguna unión del AB a la diana, o no más del 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, o del 50 % de unión del AB a la d ia n a , e n c o m p a r a c ió n c o n la u n ió n d e l A B n o m o d i f i c a d o c o n u n M M , e l A B p a r e n t a l , o e l A B n o a c o p la d o a u n M M a la d ia n a , d u r a n t e a l m e n o s 2 , 4 , 6 , 8 , 12 , 28 , 24 , 30 , 36 , 48 , 60 , 72 , 84 , o 96 h o r a s , o 5 , 10 , 15 , 30 , 45 , 60 , 90 , 120 , 150 , o 18 0 d í a s , o 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , o 12 m e s e s o m á s c u a n d o s e m id e in v ivo o e n u n e n s a y o in vitro. C u a n d o u n A B e s t á a c o p la d o o m o d i f i c a d o p o r u n M M , e l M M " e n m a s c a r a " o r e d u c e o in h ib e d e o t r o m o d o la u n ió n e s p e c í f i c a d e l A B a la d ia n a . C u a n d o u n A B e s t á a c o p la d o o m o d i f i c a d o p o r u n M M , d i c h o a c o p la m ie n t o o m o d i f i c a c ió n p u e d e e f e c t u a r u n c a m b io e s t r u c t u r a l q u e r e d u c e o in h ib e la c a p a c id a d d e l A B p a r a u n i r s e e s p e c í f i c a m e n t e a s u d ia n a . U n A B a c o p la d o o m o d i f i c a d o c o n u n M M p u e d e r e p r e s e n t a r s e m e d ia n t e la s s i g u ie n t e s f ó r m u l a s ( e n o r d e n d e s d e u n a r e g ió n t e r m in a l a m in o ( N ) a u n a r e g ió n t e r m in a l c a r b o x i l o ( C ) :
( M M ) -( A B )
( A B ) -( M M )
( M M ) - L -( A B )
( A B ) - L -( M M )
, d o n d e M M e s u n r e s t o d e e n m a s c a r a m ie n t o , e l A B e s u n a n t i c u e r p o o f r a g m e n t o d e a n t i c u e r p o d e l m is m o , y L e s u n e n l a z a d o r . E n m u c h a s r e a l i z a c io n e s , p u e d e s e r d e s e a b le i n s e r t a r u n o o m á s e n l a z a d o r e s , p o r e j e m p lo , e n l a z a d o r e s f le x i b le s , e n la c o m p o s i c ió n p a r a p r o p o r c io n a r f le x i b i l i d a d .
E n c ie r t a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s u n a p a r e j a d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o c o n t ie n e o s u s t a n c i a lm e n t e n o t i e n e h o m o l o g í a c o n n i n g u n a p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 5 % , 10 % , 15 % , 20 % , 25 % , 30 % , 35 % , 40 % , 45 % , 50 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , o u n 80 % s im i l a r a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 5 % , 10 % , 15 % , 20 % , 25 % , 30 % , 35 % , 40 % , 45 % , 50 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , o u n 80 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e j a d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 25 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 50 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 20 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e j a d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 10 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B .
E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , lo s a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s in c lu y e n u n A B q u e e s t á m o d i f i c a d o p o r u n M M y t a m b ié n in c lu y e u n o o m á s r e s t o s e s c i n d ib le s ( C M ) . D i c h o s a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s e x h i b e n u n ió n a c t i v a b le / c o n m u t a b le , a la d i a n a d e l A B . L o s a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s g e n e r a lm e n t e in c lu y e n u n a n t i c u e r p o o f r a g m e n t o d e a n t i c u e r p o ( A B ) , m o d i f i c a d o p o r o a c o p la d o a u n r e s t o d e e n m a s c a r a m ie n t o ( M M ) y u n r e s t o m o d i f i c a b le o e s c i n d ib le ( C M ) . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l C M c o n t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e s i r v e c o m o s u s t r a t o p a r a a l m e n o s u n a p r o t e a s a .
L o s e l e m e n t o s d e lo s a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s e s t á n d i s p u e s t o s d e m a n e r a q u e e l M M y e l C M s e p o s i c io n a n d e t a l f o r m a q u e , e n u n e s t a d o e s c i n d id o ( o r e la t i v a m e n t e a c t i v o ) y e n p r e s e n c i a d e u n a d ia n a , e l A B s e u n e a u n a d ia n a , m ie n t r a s q u e e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le e s t á e n u n e s t a d o n o d i s u e l t o ( o r e la t i v a m e n t e in a c t i v o ) e n p r e s e n c i a d e la d ia n a , la u n ió n e s p e c í f i c a d e l A b a s u d i a n a s e r e d u c e o s e in h ib e . L a u n ió n e s p e c í f i c a d e l A B a s u d i a n a p u e d e r e d u c i r s e d e b id o a la i n h ib i c ió n o e l e n m a s c a r a m ie n t o d e la c a p a c id a d d e l A B p a r a u n i r s e e s p e c í f i c a m e n t e s u d i a n a p o r e l M M . L a K d d e l A B m o d i f i c a d o c o n u n M M y u n C M h a c ia la d i a n a e s a l m e n o s 5 , 10 , 25 , 50 , 100 , 250 , 500 , 1.000 , 2.500 , 5.000 , 10.000 , 50.000 , 100.000 , 500.000 , 1.000.000 , 5.000.000 , 10.000.000 , 50 .000 .000 o m á s , o e n t r e 5 - 10 , 10 - 100 , 10 - 1.000 , 10 - 10.000 , 10 - 100.000 , 10 - 1.000.000 , 10 - 10.000.000 , 100 - 1.000 , 100 - 10.000 , 100 - 100.000 , 100 - 1.000.000 , 100 - 10.000.000 , 1.000 - 10.000 , 1.000 - 100.000 , 1.000 - 1.000.000 , 1000 - 10.000.000 , 10.000 - 100.000 , 10.000 - 1.000.000 , 10.000 - 10.000.000 , 100.000 - 1 .000 .000 , o 100 .000 - 10 .000.000 v e c e s m a y o r q u e la K d d e l A B n o m o d i f i c a d o c o n u n M M y u n C M o d e l A B p a r e n t a l h a c ia la d ia n a . P o r e l c o n t r a r i o , la a f in i d a d d e u n ió n d e l A B m o d i f i c a d o c o n u n M M y u n C M h a c ia la d i a n a e s a l m e n o s 5 , 10 , 25 , 50 , 100 , 250 , 500 , 1.000 , 2.500 , 5.000 , 10.000 , 50.000 , 100.000 , 500.000 , 1.000 . 000 , 5.000.000 , 10.000.000 , 50.000.000 o m á s , o e n t r e 5 - 10 , 10 - 100 , 10 - 1.000 , 10 - 10.000 , 10 - 100 .000 , 10 ­ 1.000.000 , 10 - 10.000.000 , 100 - 1.000 , 100 - 10.000 , 100 - 100.000 , 100 - 1.000.000 , 100 - 10.000.000 , 1.000 - 10.000 , 1.000 - 100.000 , 1.000 - 1.000.000 , 1000 - 10 .000.000 , 10.000 - 100 .000 , 10 .000 - 1.000.000 , 10.000 - 10.000.000 , 100.000 ­ 1.000.000 , o 100 .000 - 10 .000.000 v e c e s m e n o r q u e la a f in i d a d d e u n ió n d e l A B n o m o d i f i c a d o c o n u n M M y u n C M o d e l A B p a r e n t a l h a c ia la d ia n a .
C u a n d o e l A B s e m o d i f i c a c o n u n M M y u n C M y e s t á e n p r e s e n c i a d e la d ia n a , p e r o n o e n p r e s e n c i a d e u n a g e n t e m o d i f i c a d o r ( p o r e j e m p lo , a l m e n o s u n a p r o t e a s a ) , la u n ió n e s p e c í f i c a d e l A B a s u d i a n a s e r e d u c e o s e in h ib e , e n c o m p a r a c ió n c o n la u n ió n e s p e c í f i c a d e l A B n o m o d i f i c a d o c o n u n M M y u n C M o d e l A B p a r e n t a l a la d ia n a . E n c o m p a r a c ió n c o n la u n ió n d e l A B p a r e n t a l o la u n ió n d e u n A B n o m o d i f i c a d o c o n u n M M y u n C M a s u d ia n a , la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM y un CM puede reducirse en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso un 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
Como se usa en el presente documento, el término estado escindido se refiere a la condición de los anticuerpos activables después de la modificación del CM por al menos una proteasa. El término estado no escindido, como se usa en el presente documento, se refiere a la condición de los anticuerpos activables en ausencia de escisión del CM por una proteasa. Como se ha analizado anteriormente, el término "anticuerpos activables" se usa en el presente documento para referirse a un anticuerpo activable tanto en su estado no escindido (nativo) como en su estado escindido. Será evidente para el experto en la técnica que, en algunas realizaciones, un anticuerpo activable escindido puede carecer de un MM debido a la escisión del CM por una proteasa, dando como resultado la liberación de al menos el MM (por ejemplo, cuando el MM no está unido a los anticuerpos activables por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro entre residuos de cisteína).
Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable exhibe un primer nivel de unión a una diana cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana en el estado no inhibido, no enmascarado y/o escindido (es decir, una segunda conformación), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión. En general, el acceso de la diana al AB del anticuerpo activable es mayor en presencia de un agente de escisión capaz de escindir el CM, es decir, una proteasa, que en ausencia de dicho agente de escisión. Por lo tanto, cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, se inhibe la unión del AB a la diana y puede enmascararse de la unión a la diana (es decir, la primera conformación es tal que el AB no puede unirse a la diana), y en el estado escindido, el AB no se inhibe o se desenmascara con respecto a la unión a la diana.
El CM y el AB de los anticuerpos activables se seleccionan de manera que el AB represente un resto de unión para una diana dada, y el CM representa un sustrato para una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa se colocaliza con la diana en un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico en un sujeto. Como se usa en el presente documento, colocalizado se refiere a estar en el mismo sitio o relativamente cerca. En algunas realizaciones, una proteasa escinde un CM que produce un anticuerpo activado que se une a una diana situada cerca del sitio de escisión. Los anticuerpos activables descritos en el presente documento encuentran un uso particular donde, por ejemplo, una proteasa capaz de escindir un sitio en el CM, es decir, una proteasa, está presente a niveles relativamente más altos en el tejido que contiene la diana de un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico que en el tejido de sitios sin tratamiento (por ejemplo, en tejido sano). En algunas realizaciones, un CM de la descripción también se escinde por una o más proteasas. En algunas realizaciones, una o más proteasas son las que se localizan conjuntamente con la diana y las que son responsables de la escisión del CM in vivo.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables proporcionan una toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otro modo podrían ser resultado de la unión del AB en sitios sin tratamiento si el AB no se enmascara o se inhibe de otro modo su unión a la diana.
En general, un anticuerpo activable puede diseñarse seleccionando un AB de interés y construyendo el resto del anticuerpo activable de manera que, cuando esté conformacionalmente limitado, el m M proporcione el enmascaramiento del AB o la reducción de la unión del AB a su diana. Se deben tener en cuenta los criterios de diseño estructural para proporcionar esta característica funcional.
Se proporcionan anticuerpos activables que exhiben un fenotipo conmutable de un rango dinámico deseado para la unión a la diana en una conformación inhibida frente a una no inhibida. El rango dinámico generalmente se refiere a una relación de (a) un nivel máximo detectado de un parámetro en un primer conjunto de condiciones con respecto a (b) un valor mínimo detectado de ese parámetro en un segundo conjunto de condiciones. Por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo activable, el rango dinámico se refiere a la relación de (a) un nivel máximo detectado de unión de la proteína diana a un anticuerpo activable en presencia de al menos una proteasa capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables con respecto a (b) un nivel mínimo detectado de unión de la proteína diana a un anticuerpo activable en ausencia de la proteasa. El rango dinámico de un anticuerpo activable puede calcularse como la relación de la constante de disociación de un tratamiento del agente de escisión de anticuerpos activables (por ejemplo, enzima) con respecto a la constante de disociación del tratamiento del agente de escisión de anticuerpos activables. Cuanto mayor sea el rango dinámico de un anticuerpo activable, mejor será el fenotipo conmutable del anticuerpo activable. Los anticuerpos activables que tienen valores de rango dinámico relativamente más altos (por ejemplo, mayor de 1) exhiben fenotipos conmutables más deseables de tal manera que la unión de la proteína diana por los anticuerpos activables se produce en mayor medida (por ejemplo, predominantemente) en presencia de un agente de escisión (por ejemplo, una enzima) capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables que en ausencia de un agente de escisión.
L o s a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s s e p u e d e n p r o p o r c io n a r e n u n a d i v e r s i d a d d e c o n f i g u r a c io n e s e s t r u c t u r a l e s . A c o n t in u a c ió n , s e p r o p o r c io n a n f ó r m u l a s e je m p la r e s p a r a a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s . S e c o n t e m p la e s p e c í f i c a m e n t e q u e e l o r d e n N a C -t e r m in a l d e l A B , M M y C M p u e d e i n v e r t i r s e d e n t r o d e u n a n t i c u e r p o a c t i v a b le . T a m b i é n s e c o n t e m p la e s p e c í f i c a m e n t e q u e e l C M y e l M M p u e d e n s o l a p a r s e e n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s , p o r e je m p lo , d e m o d o q u e e l C M e s t é c o n t e n i d o d e n t r o d e l M M .
P o r e j e m p lo , lo s a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s p u e d e n r e p r e s e n t a r s e m e d ia n t e la s ig u ie n t e f ó r m u l a ( e n o r d e n d e s d e u n a r e g ió n t e r m in a l a m in o ( N ) a u n a r e g ió n t e r m in a l c a r b o x i l o ( C ) :
( M M ) -( C M ) -( A B )
( A B ) -( C M ) -( M M )
, d o n d e M M e s u n r e s t o d e e n m a s c a r a m ie n t o , C M e s u n r e s t o e s c i n d ib le , y A B e s u n a n t i c u e r p o o f r a g m e n t o d e l m is m o . C a b e s e ñ a la r q u e a u n q u e M M y C M e s t á n in d ic a d o s c o m o c o m p o n e n t e s d i s t i n t o s e n la s f ó r m u l a s a n t e r io r e s , e n t o d a s la s r e a l i z a c io n e s e je m p la r e s ( i n c l u id a s la s f ó r m u l a s ) d e s c r i t a s e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o s e c o n t e m p la q u e la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e l M M y e l C M p o d r í a n s o l a p a r s e , p o r e je m p lo , d e m o d o q u e e l C M e s t é t o t a l o p a r c ia lm e n t e c o n t e n i d o d e n t r o d e l M M . A d e m á s , la s f ó r m u l a s a n t e r i o r e s p r o p o r c io n a n s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s a d i c i o n a le s q u e p u e d e n p o s i c io n a r s e e n e l e x t r e m o N - t e r m i n a l o C - t e r m i n a l c o n r e s p e c t o a lo s e l e m e n t o s d e a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s .
E n c ie r t a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s u n a p a r e j a d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o c o n t ie n e o s u s t a n c i a lm e n t e n o t i e n e h o m o l o g í a c o n n i n g u n a p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 5 % , 10 % , 15 % , 20 % , 25 % , 30 % , 35 % , 40 % , 45 % , 50 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , o u n 80 % s im i l a r a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 5 % , 10 % , 15 % , 20 % , 25 % , 30 % , 35 % , 40 % , 45 % , 50 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , o u n 80 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e j a d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 50 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 25 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 20 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e j a d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l M M n o e s m á s d e u n 10 % id é n t i c o a c u a l q u i e r p a r e ja d e u n ió n n a t u r a l d e l A B . E n m u c h a s r e a l i z a c io n e s p u e d e s e r d e s e a b le in s e r t a r u n o o m á s e n l a z a d o r e s , p o r e je m p lo , e n l a z a d o r e s f le x ib le s , e n la c o n s t r u c c ió n d e a n t i c u e r p o a c t i v a b le p a r a p r o p o r c io n a r f l e x i b i l i d a d e n u n a o m á s d e la u n ió n M M - C M , la u n ió n C M -A B , o a m b a s . P o r e je m p lo , e l A B , M M y / o C M p u e d e n n o c o n t e n e r u n n ú m e r o s u f i c i e n t e d e r e s id u o s ( p o r e j e m p lo , G ly , S e r , A s p , A s n , e s p e c ia l m e n t e G ly y S e r , p a r t i c u l a r m e n t e G ly ) p a r a p r o p o r c io n a r la f l e x i b i l i d a d d e s e a d a . C o m o t a l , e l f e n o t i p o c o n m u t a b l e d e d i c h a s c o n s t r u c c io n e s d e a n t i c u e r p o a c t i v a b le p u e d e b e n e f i c ia r s e d e la i n t r o d u c c i ó n d e u n o o m á s a m in o á c id o s p a r a p r o p o r c io n a r u n e n l a z a d o r f le x i b le . A d e m á s , c o m o s e d e s c r ib e a c o n t in u a c ió n , c u a n d o e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le s e p r o p o r c io n a c o m o u n a c o n s t r u c c ió n c o n f o r m a c io n a l m e n t e l i m i t a d a , s e p u e d e i n s e r t a r o p e r a t i v a m e n t e u n e n l a z a d o r f l e x i b le p a r a f a c i l i t a r la f o r m a c i ó n y e l m a n t e n im ie n t o d e u n a e s t r u c t u r a c í c l i c a e n e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le n o e s c in d id o .
P o r e je m p lo , e n c ie r t a s r e a l i z a c io n e s , u n a n t i c u e r p o a c t i v a b le c o m p r e n d e u n a d e la s s i g u ie n t e s f ó r m u l a s ( d o n d e la f ó r m u l a a c o n t in u a c ió n r e p r e s e n t a u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e n la d i r e c c i ó n N a C - t e r m i n a l o C a N - t e r m in a l ) :
( M M ) - L 1 -( C M ) -( A B )
( M M ) -( C M ) - L 2 -( A B )
( M M ) - L 1 -( C M ) - L 2 -( A B )
, d o n d e M M , C M y A B s o n c o m o s e h a n d e f in id o a n t e r io r m e n t e ; d o n d e L 1 y L 2 e s t á n c a d a u n o i n d e p e n d ie n t e y o p c i o n a l m e n t e p r e s e n t e s o a u s e n t e s , s o n lo s m is m o s o d i f e r e n t e s e n l a z a d o r e s f l e x i b le s q u e in c lu y e n a l m e n o s 1 a m in o á c id o f le x i b le ( p o r e j e m p lo , G ly ) . A d e m á s , la s f ó r m u l a s a n t e r i o r e s p r o p o r c io n a n s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s a d i c i o n a le s q u e p u e d e n p o s i c i o n a r s e e n e l e x t r e m o N - t e r m i n a l o C - t e r m i n a l c o n r e s p e c t o a lo s e l e m e n t o s d e a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s . L o s e j e m p lo s in c lu y e n , p e r o s in l i m i t a c ió n , r e s t o s d e d i r e c c i o n a m ie n t o ( p o r e je m p lo , u n l i g a n d o p a r a u n r e c e p t o r d e u n a c é l u la p r e s e n t e e n u n t e j i d o d ia n a ) y r e s t o s q u e e x t ie n d e n la s e m iv i d a e n s u e r o ( p o r e je m p lo , p o l ip é p t i d o s q u e s e u n e n a p r o t e í n a s s é r i c a s , t a l c o m o in m u n o g lo b u l i n a ( p o r e j e m p lo , I g G ) o a l b ú m in a s é r ic a ( p o r e je m p lo , a l b ú m in a s é r ic a h u m a n a ( H A S ) ) .
E l C M s e e s c i n d e e s p e c í f i c a m e n t e p o r a l m e n o s u n a p r o t e a s a a u n a v e l o c id a d d e a p r o x i m a d a m e n t e 0 , 0 0 1 - 1 5 0 0 x 1 04 M '1S ' 1 o a l m e n o s 0 , 00 1 , 0 , 00 5 , 0 , 01 , 0 , 05 , 0 , 1 , 0 , 5 , 1 , 2 , 5 , 5 , 7 , 5 , 10 , 15 , 20 , 25 , 50 , 75 , 100 , 125 , 150 , 2 00 , 25 0 , 500 , mediante mutagénesis de sitio dirigido, conversión química, o mala incorporación de aminoácidos no naturales.
También se proporcionan procedimientos para preparar un conjugado de un anticuerpo anti-CD166 activable que tiene uno o más enlaces disulfuro intercatenarios en el AB y uno o más enlaces disulfuro intracatenarios en el MM, y se proporciona un reactivo farmacológico con tioles libres. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial de enlaces disulfuro intercatenarios en el anticuerpo activable con un agente reductor, tal como, por ejemplo, TCEP; y conjugar el reactivo farmacológico con tioles libres con el anticuerpo activable parcialmente reducido. Como se usa en el presente documento, el término reducción parcial se refiere a situaciones donde un anticuerpo anti-CD166 activable se pone en contacto con un agente reductor y se reducen menos de todos los enlaces disulfuro, por ejemplo, menos de todos los sitios posibles de conjugación. En algunas realizaciones, se reducen menos del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o menos del 5 % de todos los posibles sitios de conjugación.
En otras realizaciones más, se proporciona un procedimiento para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo anti-CD166 activable que da como resultado selectividad en la colocación del agente. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial del anticuerpo anti-CD166 activable con un agente reductor de manera que cualquiera de los sitios de conjugación en el resto de enmascaramiento u otra porción no AB del anticuerpo activable no se reduzca, y la conjugación del agente con tioles intercatenarios en el AB. El uno o más sitios de conjugación se seleccionan para permitir el posicionamiento deseado de un agente para permitir que tenga lugar la conjugación en un sitio deseado. El agente reductor es, por ejemplo, TCEP. Las condiciones de reacción de reducción, tales como, por ejemplo, la relación de un agente reductor con respecto a un anticuerpo activable, la duración de la incubación, la temperatura durante la incubación, el pH de la solución de reacción de reducción, etc., se determinan identificando las condiciones que producen un anticuerpo activable conjugado en el que el MM conserva la capacidad de enmascarar eficaz y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. La relación del agente de reducción con respecto al anticuerpo anti-CD166 activable variará dependiendo del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la relación de agente reductor con respecto a anticuerpo anti-CD166 activable estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5, o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a alrededor 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para reducir los enlaces disulfuro intercatenarios en el AB de un anticuerpo anti-CD166 activable y conjugar un agente, por ejemplo, un agente que contiene tiol tal como un fármaco, con los tioles intercatenarios resultantes para localizar selectivamente uno o más agentes en el AB. El procedimiento generalmente incluye reducir parcialmente el AB con un agente reductor para formar al menos dos tioles intercatenarios sin formar todos los tioles intercatenarios posibles en el anticuerpo activable; y conjugar el agente con los tioles intercatenarios del AB parcialmente reducido. Por ejemplo, el AB del anticuerpo activable se reduce parcialmente durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 37 °C en una relación deseada de agente reductor:anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la relación de agente reductor con respecto a anticuerpo activable estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5, o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a alrededor 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
El reactivo que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína o N-acetilcisteína. El agente reductor puede ser, por ejemplo, TCEP. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable reducido puede purificarse antes de la conjugación, usando, por ejemplo, cromatografía en columna, diálisis o diafiltración. Como alternativamente, el anticuerpo reducido no se purifica después de la reducción parcial y antes de la conjugación.
La descripción también proporciona anticuerpos anti-CD166 activables parcialmente reducidos en los que al menos un enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo activable se ha reducido con un agente reductor sin alterar ningún enlace disulfuro intracatenario en el anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD166, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana CD166, y un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa. En algunas realizaciones, el MM está acoplado al AB a través del CM. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del MM en el anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM. En algunas realizaciones, el agente reductor es TCEP.
La descripción también proporciona anticuerpos activables parcialmente reducidos en los que al menos un enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo activable se ha reducido con un agente reductor sin alterar ningún enlace disulfuro intracatenario en el anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, por ejemplo, CD166, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana, y un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para al menos una proteasa. En algunas realizaciones, el MM está acoplado al AB a través del CM. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del MM en el anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N-terminal al extremo C-terminal como se indica a continuación: MM-CM-AB o AB-CM-MM. En algunas realizaciones, el agente reductor es TCEP.
En aún otras realizaciones, un procedimiento para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo anti-CD166 activable que da como resultado selectividad en la colocación del agente proporcionando un anticuerpo anti-CD166 activable con un número definido y posiciones de residuos de lisina y/o cisteína. En algunas realizaciones, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína es mayor o menor que el número de residuos correspondientes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo parental o anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína puede dar como resultado un número definido de equivalentes de agente que pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD166 o el anticuerpo anti-CD166 activable. En algunas realizaciones, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína puede dar como resultado un número definido de equivalentes de agente que pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD166 o el anticuerpo anti-CD166 activable de una manera específica del sitio. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable modificado se modifica con uno o más aminoácidos no naturales de una manera específica del sitio, limitando así, en algunas realizaciones, la conjugación de los agentes con solo los sitios de los aminoácidos no naturales. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD166 o el anticuerpo anti-CD166 activable con un número definido y posiciones de residuos de lisina y/o cisteína pueden reducirse parcialmente con un agente reductor como se analiza en el presente documento, de modo que cualquier sitio de conjugación en el resto de enmascaramiento u otra porción no AB del anticuerpo activable no se reduce, y conjugando el agente con los tioles intercatenarios en el AB.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables descritos en el presente documento también incluyen un agente conjugado con el anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el agente conjugado es un agente terapéutico, tal como un agente antiinflamatorio y/o antineoplásico. En dichas realizaciones, el agente se conjuga con un resto de carbohidrato del anticuerpo activable, por ejemplo, en algunas realizaciones, donde el resto de carbohidrato se encuentra fuera de la región de unión a antígeno del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con un grupo sulfhidrilo del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, el agente es un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
En algunas realizaciones, el agente es un resto detectable tal como, por ejemplo, una etiqueta u otro marcador. Por ejemplo, el agente es o incluye un aminoácido radiomarcado, uno o más restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante procedimientos ópticos o calorimétricos), uno o más radioisótopos o radionúclidos, uno o más marcadores fluorescentes, uno o más marcadores enzimáticos, y/o uno o más agentes quimioluminiscentes. En algunas realizaciones, los restos detectables están unidos por moléculas espadadoras.
La descripción también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Los agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatina y derivados de las mismas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, Dm a F, DMAE). Por ejemplo, el agente es monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 5. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina o un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD) unido al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en el presente documento "vc-MMAD". En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE) unida al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-paraaminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en el presente documento "vc-MMAE". En algunas realizaciones, el agente está unido al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD) unido al AB usando un enlazador de maleimida bis-PEG-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en el presente documento "PEG2-vc-MMAD". Las estructuras de vc-MMAD, vc-MMAE y PEG2-vc-MMAD se muestran a continuación:
vc-MMAD:
Figure imgf000061_0001
vc-MMAE:
Figure imgf000061_0002
PEG2-vc-MMAD:
Figure imgf000062_0001
L a d e s c r i p c ió n t a m b ié n p r o p o r c io n a a n t i c u e r p o s a c t i v a b le s c o n j u g a d o s q u e in c lu y e n u n a n t i c u e r p o a c t i v a b le u n id o a la c a r g a ú t i l d e m o n o m e t i l a u r i s t a t i n a D ( M M A D ) , d o n d e e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le in c lu y e u n a n t i c u e r p o o u n f r a g m e n t o 5 d e u n ió n a a n t í g e n o d e l m is m o ( A B ) q u e s e u n e e s p e c í f i c a m e n t e a u n a d ia n a , u n r e s t o d e e n m a s c a r a m ie n t o ( M M ) q u e in h ib e la u n ió n d e l A B d e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le e n u n e s t a d o n o e s c i n d id o a la d ia n a , y u n r e s t o e s c i n d ib le ( C M ) a c o p la d o a l A B , y e l C M e s u n p o l ip é p t i d o q u e f u n c io n a c o m o u n s u s t r a t o p a r a a l m e n o s u n a M M P p r o t e a s a .
E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l a n t i c u e r p o a c t i v a b le c o n j u g a d o c o n M M A D p u e d e c o n j u g a r s e u s a n d o c u a l q u i e r a d e v a r i o s 0 p r o c e d i m i e n t o s p a r a u n i r a g e n t e s a lo s A B : ( a ) u n ió n a lo s r e s t o s d e c a r b o h i d r a t o d e A B , o ( b ) u n ió n a g r u p o s s u l f h i d r i l o d e A B , o ( c ) u n ió n a g r u p o s a m in o d e l A B , o ( d ) u n ió n a g r u p o s c a r b o x i l a t o d e l A B .
Figure imgf000062_0002
a s
E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l c o m p o n e n t e d e p o l i e t i l e n g l i c o l ( P E G ) d e u n e n l a z a d o r d e la p r e s e n t e d e s c r ip c ió n s e f o r m a 0 a p a r t i r d e 2 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l , 3 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l , 4 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l , 5 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l , 6 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l , 7 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l 8 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l , 9 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l o a l m e n o s 10 m o n ó m e r o s d e e t i l e n g l i c o l . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s d e la p r e s e n t e d e s c r ip c ió n , e l c o m p o n e n t e P E G e s u n p o l í m e r o r a m i f i c a d o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s d e la p r e s e n t e d e s c r ip c ió n , e l c o m p o n e n t e P E G e s u n p o l í m e r o n o r a m i f i c a d o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l c o m p o n e n t e d e p o l í m e r o P E G s e f u n c io n a l i z a c o n u n 5 g r u p o a m in o o d e r i v a d o d e l m is m o , u n g r u p o c a r b o x i lo o d e r i v a d o d e l m is m o , o t a n t o u n g r u p o a m in o o d e r iv a d o d e l m is m o c o m o g r u p o c a r b o x i lo o d e r i v a d o d e l m is m o .
E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l c o m p o n e n t e P E G d e u n e n l a z a d o r d e la p r e s e n t e d e s c r i p c ió n e s u n g r u p o a m in o - t e t r a -e t i l e n g l i c o l - c a r b o x i l o o d e r iv a d o d e l m is m o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l c o m p o n e n t e P E G d e u n e n l a z a d o r d e la 0 p r e s e n t e d e s c r i p c ió n e s u n g r u p o a m in o - t r i e t i l e n g l i c o l - c a r b o x i l o o d e r iv a d o d e l m is m o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l c o m p o n e n t e P E G d e u n e n l a z a d o r d e la p r e s e n t e d e s c r i p c ió n e s u n g r u p o a m in o - d i - e t i l e n g l i c o l - c a r b o x i l o o d e r iv a d o d e l m is m o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , u n d e r i v a d o a m in o e s la f o r m a c i ó n d e u n e n l a c e a m id a e n t r e e l g r u p o a m in o y u n g r u p o c a r b o x i lo c o n e l q u e e s t á c o n j u g a d o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , u n d e r i v a d o d e c a r b o x i lo e s la f o r m a c i ó n d e u n e n l a c e a m id a e n t r e e l g r u p o c a r b o x i lo y u n g r u p o a m in o c o n e l q u e e s t á c o n j u g a d o . E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , u n 5 d e r iv a d o d e c a r b o x i l o e s la f o r m a c i ó n d e u n e n l a c e é s t e r e n t r e e l g r u p o c a r b o x i lo y u n g r u p o h i d r o x i lo c o n e l q u e e s t á c o n ju g a d o .
L a s t o x in a s e n z i m á t i c a m e n t e a c t i v a s y f r a g m e n t o s d e la s m is m a s q u e p u e d e n u s a r s e in c lu y e n la c a d e n a A d e d i f t e r ia , lo s f r a g m e n t o s a c t i v o s n o l i g a n t e s d e la t o x in a d i f t é r i c a , la c a d e n a A d e e x o t o x i n a ( d e P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) , la 0 c a d e n a A d e r ic in o , la c a d e n a A d e a b r in a , la c a d e n a A d e m o d e c in a , la a l f a - s a r c in a , p r o t e í n a s d e A l e u r i t e s f o r d i i , p r o t e í n a s d e d ia n t in a , p r o t e í n a s d e P h y t o l a c a a m e r i c a n a ( P A P I , P A P I I y P A P - S ) , in h ib i d o r d e m o m o r d i c a c h a r a n t ia , c u r c in a , c r o t i n a , in h ib i d o r d e s a p a o n a r ia o f f i c in a l i s , g e l o n in a , m i t o g e l in a , r e s t r i c t o c in a , f e n o m ic i n a , e n o m i c in a y lo s t r i c o t e c e n o s . U n a d i v e r s i d a d d e r a d io n u c le id o s e s t á n d i s p o n i b le s p a r a la p r o d u c c i ó n d e a n t i c u e r p o s r a d io c o n ju g a d o s . L o s e j e m p lo s in c lu y e n 212B i, 131I, 131In , 90Y , y 186R e .
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tal como glutareldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de bis-flúor activo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo (véase el documento WO94/11026).
La Tabla 5 enumera algunos de los agentes farmacéuticos ejemplares que pueden emplearse en la descripción descrita en el presente documento, pero de ninguna manera pretende ser una lista exhaustiva.
Tabla 5: Agentes farmacéuticos ejemplares para conjugación
AGENTES CITOTÓXICOS
Auristatinas Turbostatina
Auristatina E Fenstatinas
Monometil auristatina D (MMAD) Hidroxifenstatina
Monometil auristatina E (MMAE) Espongistatina 5
Desmetil auristatina E (DMAE) Espongistatina 7
Auristatina F Halistatina 1
Monometil auristatina F (MMAF) Halistatina 2
Desmetil auristatina F (DMAF) Halistatina 3
Derivados de auristatina, por ejemplo, amidas de Briostatinas modificadas
la misma
Auristatina tiramina Halocomstatinas
Auristatina quinolina Pirrolobencimidazoles (PBI)
Dolastatinas Cibrostatina 6
Derivados de dolastatina Doxaliform
Dolastatina 16 DmJ Análogos de antraciclinas
Dolastatina 16 Dpv
Maitansinoides, por ejemplo, DM-1; DM-4
Derivados maitansinoides Análogo de cemadotina (CemCH2-SH)
Duocarmicina Variante de la toxina A de Pseudomonas (PE38) Derivados de duocarmicina Variante de la toxina A de Pseudomonas (ZZ-PE38) Alfa-amanitina ZJ-101
Antraciclinas OSW-1
Doxorrubicina Derivados de 4-nitrobenciloxicarbonilo de O6-bencilguanina
Daunorrubicina Inhibidores de topoisomerasa
Briostatinas Hemiasterlina
Camptotecina Cefalotaxina
Derivados de camptotecina Homoharringtonina
Camptotecina 7-sustituida Dímeros de pirrolobenzodiacepina (PBD)
10, 11- Pirrolobenzodiazepenos funcionalizados Difluorometilendioxicocamptotecina
Combretastatinas Caliqueamicina
Debromoaplisiatoxina Podofilotoxinas
Kahalalido F Taxanos
Discodermolida Alcaloides de vinca
Ecteinascidinas
REACTIVOS DE DETECCIÓN CONJUGABLES ANTIVIRALES Fluoresceína y derivados de la misma Aciclovir Isotiocianato de fluoresceína (FITC)
Vira A
Symmetrel PRODUCTOS RADIOFARMACÉUTICOS
1251
ANTIFÚNGICOS 1311
Nistatina 89Zr 111In
ANTINEOPLÁSTICOS ADICIONALES 1231
Adriamicina 1311
Cerubidina 99 mTc
Bleomicina 201Tl
Alkeran 133Xe
Velban 11C
Oncovin 62Cu
Fluorouracilo 18F
Metotrexato 68Ga
Tiotepa 13N
Bisantreno 15O
Novantrona 38K
Tioguanina 82Rb
Procarabizina 99mTc (Tecnecio)
Citarabina
METALES PESADOS ANTIBACTERIANOS Bario
Aminoglucósidos Oro
Estreptomicina Platino
Neomicina
Kanamicina ANTIMICOPLASMALES
Amikacina Tilosina
Gentamicina Espectinomicina
Tobramicina
Estreptomicina B
Espectinomicina
Ampicilina
Sulfanilamida
Polimixina
Cloranfenicol
Los expertos en la técnica reconocerán que una gran diversidad de restos posibles se pueden acoplar a los anticuerpos resultantes de la descripción (véase, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, Nueva York, (1989)).
El acoplamiento se puede lograr mediante cualquier reacción química que se unirá a las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el resto conserven sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. En algunas realizaciones, la unión es, sin embargo, una unión covalente. La unión covalente se puede lograr mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de unión bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente descripción, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidas en la técnica, sino que es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes (véanse Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).
En algunas realizaciones, además de las composiciones y procedimientos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo activable conjugado también puede modificarse para la conjugación específica del sitio a través de secuencias de aminoácidos modificadas insertadas o incluidas de otro modo en la secuencia de anticuerpo activable. Estas secuencias de aminoácidos modificadas están diseñadas para permitir la colocación controlada y/o la dosificación del agente conjugado dentro de un anticuerpo activable conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir sustituciones de cisteína en posiciones en las cadenas ligeras y pesadas que proporcionan grupos tiol reactivos y no afectan negativamente al plegamiento y ensamblaje de proteínas, ni alteran la unión al antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se puede diseñar para incluir o de otro modo introducir uno o más residuos de aminoácidos no naturales dentro del anticuerpo activable para proporcionar sitios adecuados para la conjugación. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir o introducir de otro modo secuencias peptídicas enzimáticamente activables dentro de la secuencia de anticuerpo activable.
Se describen enlazadores adecuados en la bibliografía ( véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res.
44:201-208 (1984), que describen el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también, la patente de EE.UU. N.° 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetilhidrazida halogenada acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico. En algunas realizaciones, los enlazadores adecuados incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida); (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metilalfa-(2-piridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat. N.° 21651G); (iv) Sulfo-LC-SpDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. N.° 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. N.° 24510) conjugada con EDC. Los enlazadores adicionales incluyen, pero sin limitación, SMCC ((succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), SPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio) butanoato), o sulfo-SPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo butanoato).
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen atributos diferentes, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen éster de NHS son menos solubles que los ésteres de sulfo-NHS. Además, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, en general, son menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se escinde in vitro, lo que da como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodimida (tal como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida en solitario.
En algunas realizaciones, los enlazadores son escindibles. En algunas realizaciones, los enlazadores no son escindibles. En algunas realizaciones, están presentes dos o más enlazadores. Los dos o más enlazadores son todos iguales, es decir, escindibles o no escindibles, o los dos o más enlazadores son diferentes, es decir, al menos uno escindible y al menos uno no escindible.
La presente descripción utiliza varios procedimientos para unir agentes a los AB: (a) unión a los restos de carbohidrato de AB, o (b) unión a grupos sulfhidrilo de AB, o (c) unión a grupos amino del AB, o (d) unión a grupos carboxilato del AB. De acuerdo con la descripción, los AB pueden estar unidos covalentemente a un agente a través de un enlazador intermedio que tiene al menos dos grupos reactivos, uno para reaccionar con el AB y otro para reaccionar con el agente. El enlazador, que puede incluir cualquier compuesto orgánico compatible, se puede elegir de modo que la reacción con el AB (o agente) no afecte negativamente a la reactividad y la selectividad del AB. Además, la unión del enlazador al agente podría no destruir la actividad del agente. Los enlazadores adecuados para la reacción con anticuerpos oxidados o fragmentos de anticuerpos oxidados incluyen aquellos que contienen una amina seleccionada del grupo que consiste en grupos de amina primaria, amina secundaria, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida y tiosemicarbazida. Dichos grupos funcionales reactivos pueden existir como parte de la estructura del enlazador, o pueden introducirse mediante la modificación química adecuada de enlazadores que no contienen dichos grupos.
De acuerdo con la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a AB reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos reactivos capaces de reaccionar con un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo reducido o fragmento. Dichos grupos reactivos incluyen, pero sin limitación: grupos haloalquilo reactivos (incluyendo, por ejemplo, grupos haloacetilo), grupos p-mercuribenzoato y grupos aptos para reacciones de adición de tipo Michael (incluyendo, por ejemplo, maleimidas y grupos del tipo descrito por Mitra y Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110).
De acuerdo con la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a Ab ni oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos amino primarios presentes en residuos de lisina no modificados en el Ab. Dichos grupos reactivos incluyen, pero sin limitación, ésteres NHS carboxílicos o carbónicos, ésteres sulfo-NHS carboxílicos o carbónicos, ésteres 4-nitrofenilcarboxílicos o carbónicos, ésteres pentafluorofenilcarboxílicos o carbónicos, acil imidazoles, isocianatos e isotiocianatos.
De acuerdo con la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a Ab ni oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos de ácido carboxílico presentes en los residuos de aspartato o glutamato en el Ab, que se han activado con reactivos adecuados. Los reactivos activadores adecuados incluyen EDC, con o sin NHS o sulfo-NHS añadido, y otros agentes deshidratantes utilizados para la formación de carboxamida. En estos casos, los grupos funcionales presentes en los enlazadores adecuados incluirán aminas primarias y secundarias, hidrazinas, hidroxilaminas e hidrazidas.
El agente puede estar unido al enlazador antes o después de que el enlazador esté unido al AB. En ciertas aplicaciones, puede ser deseable producir primero un intermedio AB-enlazador en el que el enlazador esté libre de un agente asociado. Dependiendo de la aplicación particular, un agente específico puede unirse entonces covalentemente en el enlazador. En algunas realizaciones, el Ab se une primero al MM, CM y enlazadores asociados y a continuación se une al enlazador para fines de conjugación.
Enlazadores ramificados: En realizaciones específicas, se utilizan enlazadores ramificados que tienen múltiples sitios para la unión de agentes. Para los enlazadores de sitios múltiples, una unión covalente única a un AB dará como resultado un intermediario AB-enlazador capaz de unirse a un agente en varios sitios. Los sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo o cualquier sitio químico al que se puedan unir agentes.
En algunas realizaciones, se puede lograr una actividad específica más alta (o una relación más alta de agentes con respecto a AB) mediante la unión de un enlace de sitio único en una pluralidad de sitios en el AB. Esta pluralidad de sitios puede introducirse en el AB por cualquiera de los dos procedimientos. Primero, se pueden generar múltiples grupos aldehído y/o grupos sulfhidrilo en el mismo AB. En segundo lugar, se puede unir a un aldehído o sulfhidrilo del AB un "enlazador ramificado" que tiene múltiples sitios funcionales para su posterior unión a los enlazadores. Los sitios funcionales del enlazador ramificado o del enlazador de múltiples sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo, o puede ser cualquier sitio químico al que se puedan unir los enlazadores. Se pueden obtener actividades específicas aún más altas combinando estos dos enfoques, es decir, uniendo enlazadores de múltiples sitios en varios sitios en el AB.
Enlazadores escindióles: Los enlazadores peptídicos que son susceptibles a la escisión por enzimas del sistema del complemento, tales como, pero sin limitación, activador de plasminógeno tipo u, activador de plasminógeno tisular, tripsina, plasmina u otra enzima que tenga actividad proteolítica pueden usarse en una realización de la presente descripción. De acuerdo con un procedimiento de la presente descripción, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por complemento. El anticuerpo se selecciona de una clase que puede activar el complemento. Por lo tanto, el conjugado anticuerpo-agente activa la cascada del complemento y libera el agente en el sitio diana. De acuerdo con otro procedimiento de la presente descripción, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por enzimas que tienen una actividad proteolítica, tal como un activador de plasminógeno tipo u, un activador de plasminógeno tisular, plasmina o tripsina. Estos enlazadores escindibles son útiles en anticuerpos activables conjugados que incluyen una toxina extracelular, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, cualquiera de las toxinas extracelulares mostradas en la Tabla 5.
En la Tabla 6 se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de enlazadores escindibles.
Tabla 6: Secuencias de enlazadores ejemplares para conjugación
Tipos de secuencias escindibles Secuencia de aminoácidos
Secuencias escindibles de plasmina
Pro-urocinasa PRFKIIGG (SEQ ID NO: 89)
PRFRIIGG (SEQ ID NO: 90)
TGFp SSRHRRALD (SEQ ID NO: 91)
Plasminógeno RKSSIIIRMRDWL (SEQ ID NO: 92)
Estafilocinasa SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 93)
SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 94)
Secuencias escindibles del Factor Xa IEGR (SEQ ID NO: 95)
IDGR (SEQ ID NO: 96)
GGSIDGR (SEQ ID NO: 97)
Secuencias escindibles de MMP
Gelatinasa A PLGLWA (SEQ ID NO: 98)
Secuencias escindibles de colagenasa
Colágeno de piel de ternero (cadena a1(I)) GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 99)
Colágeno de piel de ternero (cadena a2(I)) GPQGLLGA (SEQ ID NO: 100)
Colágeno de cartílago bovino (cadena a1(II)) GIAGQ (SEQ ID NO: 101)
Colágeno de hígado humano (cadena a1(III)) GPLGIAGI (SEQ ID NO: 102)
a 2 M humano GPEGLRVG (SEQ ID NO: 103)
PZP humano YGAGLGVV (SEQ ID NO: 104)
AGLGVVER (SEQ ID NO: 105)
AGLGISST (SEQ ID NO: 106)
aiM de rata EPQALAMS (SEQ ID NO: 107)
QALAMSAI (SEQ ID NO: 108)
a 2 M de rata AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 109)
MDAFLESS (SEQ ID NO: 110)
ail3(2J) de rata ESLPVVAV (SEQ ID NO: 111)
ail3(27J) de rata SAPAVESE (SEQ ID NO: 112)
Colagenasa de fibroblasto humano DVAQFVLT (SEQ ID NO: 113)
(escisiones autolíticas) VAQFVLTE (SEQ ID NO: 114)
AQFVLTEG (SEQ ID NO: 115)
PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 116)
Además, los agentes pueden unirse mediante enlaces disulfuro (por ejemplo, los enlaces disulfuro en una molécula de cisteína) al AB. Dado que muchos tumores liberan naturalmente altos niveles de glutatión (un agente reductor), esto puede reducir los enlaces disulfuro con la posterior liberación del agente en el sitio de administración. En algunas realizaciones, el agente reductor que modificaría un CM también modificaría el enlazador del anticuerpo activable conjugado.
E s p a c ia d o re s y e le m e n to s esc in d ib le s : En algunas realizaciones, puede ser necesario construir el enlazador de tal manera que se optimice el espacio entre el agente y el AB del anticuerpo activable. Esto se puede lograr mediante el uso de un enlazador de la estructura general:
W -(CH 2 )n - Q
donde
W es --NH--CH2-- o --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un entero de 0 a 20.
En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender un elemento espaciador y un elemento escindible. El elemento espaciador sirve para posicionar el elemento escindible lejos del núcleo del AB de manera que el elemento escindible sea más accesible para la enzima responsable de la escisión. Algunos de los enlazadores ramificados descritos anteriormente pueden servir como elementos espaciadores.
A lo largo de este análisis, debe entenderse que la unión del enlazador al agente (o del elemento espaciador al elemento escindible, o elemento escindible al agente) no necesita ser un modo particular de unión o reacción. Cualquier reacción que proporcione un producto de estabilidad y compatibilidad biológica adecuadas es aceptable.
Complemento de suero y selección de enlazadores: De acuerdo con un procedimiento de la presente descripción, cuando se desea la liberación de un agente, se usa un AB que es un anticuerpo de una clase que puede activar el complemento. El conjugado resultante conserva tanto la capacidad de unirse al antígeno como la activación de la cascada del complemento. Por lo tanto, de acuerdo con esta realización de la presente descripción, un agente se une a un extremo del enlazador escindible o el elemento escindible y el otro extremo del grupo de enlazador se une a un sitio específico en el AB. Por ejemplo, si el agente tiene un grupo hidroxilo o un grupo amino, puede estar unido al extremo carboxi de un péptido, aminoácido u otro enlazador adecuadamente elegido a través de un enlace éster o amida, respectivamente. Por ejemplo, dichos agentes pueden unirse al péptido enlazador mediante una reacción de carbodimida. Si el agente contiene grupos funcionales que interferirán con la unión al enlazador, estos grupos funcionales de interferencia pueden bloquearse antes de la unión y desbloquearse una vez que se realiza el producto conjugado o intermedio. A continuación, el extremo opuesto o amino del enlazador se usa directamente o después de una modificación adicional para la unión a un AB que es capaz de activar el complemento.
Los enlazadores (o elementos espaciadores de los enlazadores) pueden tener cualquier longitud deseada, un extremo de los cuales puede unirse covalentemente a sitios específicos en el AB del anticuerpo activable. El otro extremo del enlazador o elemento espaciador puede estar unido a un enlazador aminoacídico o peptídico.
Por lo tanto, cuando estos conjugados se unen al antígeno en presencia del complemento, el enlace amida o éster que une el agente al enlazador se escindirá, dando como resultado la liberación del agente en su forma activa. Estos conjugados, cuando se administran a un sujeto, lograrán la administración y liberación del agente en el sitio diana, y son particularmente eficaces para la administración in vivo de agentes farmacéuticos, antibióticos, antimetabolitos, agentes antiproliferativos y similares, como se presentan, pero sin limitación, los de la Tabla 5.
Enlazadores para la liberación sin activación del complemento: En aún otra aplicación de administración dirigida, se desea la liberación del agente sin activación del complemento ya que la activación de la cascada del complemento finalmente lisará la célula diana. Por lo tanto, este enfoque es útil cuando la administración y liberación del agente debe realizarse sin destruir la célula diana. Este es el objetivo cuando se desea la administración de mediadores celulares tales como hormonas, enzimas, corticosteroides, neurotransmisores, genes o enzimas a las células dianas. Estos conjugados pueden prepararse uniendo el agente a un AB que no es capaz de activar el complemento a través de un enlazador que es ligeramente susceptible a la escisión por las proteasas séricas. Cuando este conjugado se administra a un individuo, los complejos antígeno-anticuerpo se formarán rápidamente, mientras que la escisión del agente se producirá lentamente, lo que dará como resultado la liberación del compuesto en el sitio diana.
Reticuladores bioquímicos: En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede conjugarse con uno o más agentes terapéuticos usando ciertos reticuladores bioquímicos. Los reactivos de reticulación forman puentes moleculares que unen grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para unir dos proteínas diferentes de forma escalonada, se pueden usar reticuladores heterobifuncionales que eliminen la formación de homopolímeros no deseados.
Los enlazadores de peptidilo escindibles por proteasas lisosómicas también son útiles, por ejemplo, Val-Cit, Val-Ala u otros dipéptidos. Además, pueden usarse enlazadores lábiles a los ácidos escindibles en el entorno de bajo pH del lisosoma, por ejemplo: bis-sialil éter. Otros enlazadores adecuados incluyen sustratos lábiles a catepsina, particularmente aquellos que muestran una función óptima a un pH ácido.
Se hace referencia a reticuladores heterobifuncionales ejemplares en la Tabla 7.
Tabla 7: Reticuladores heterobifuncionales ejemplares
RETICULADORES HETEROBIFUNCIONALES
Enlazador Reactivo a Ventajas y aplicaciones Longitud del brazo espaciador después de la reticulación (Angstroms)
SMPT Aminas primarias Mayor estabilidad 11,2 A
Sulfhidrilos
SPDP Aminas primarias Tiolación Reticulación escindible 6,8 A
Sulfhidrilos
LC-SPDP Aminas primarias Brazo espaciador extendido 15,6 A
Sulfhidrilos
Sulfo-LC- Aminas primarias Brazo espaciador extensor Soluble en 15,6 A
SPDP Sulfhidrilos agua
SMCC Aminas primarias Grupo reactivo de maleimida estable 11,6 A
Sulfhidrilos Conjugación de enzima-anticuerpo
Conjugación de hapteno-proteína
portadora
Sulfo-SMCC Aminas primarias Grupo reactivo de maleimida estable 11,6 A
Sulfhidrilos Soluble en agua
Conjugación de enzima-anticuerpo
MBS Aminas primarias Conjugación de enzima-anticuerpo 9,9 A
Sulfhidrilos Conjugación de hapteno-proteína
portadora
Sulfo-MBS Aminas primarias Soluble en agua 9,9 A
Sulfhidrilos
SIAB Aminas primarias Conjugación de enzima-anticuerpo 10,6 A
Sulfhidrilos
Sulfo-SIAB Aminas primarias Soluble en agua 10,6 A
Sulfhidrilos
SMPB Aminas primarias Brazo espaciador extendido 14,5 A
Sulfhidrilos Conjugación de enzima-anticuerpo
Sulfo-SMPB Aminas primarias Brazo espaciador extendido Soluble en 14,5 A
Sulfhidrilos agua
EDE/Sulfo- Aminas primarias Conjugación de hapteno-vehículo 0
NHS Grupos carboxilo
ABH Carbohidratos No Reacciona con grupos de azúcar 11,9 A
selectivo
E n la za d o re s n o e sc in d ib le s o un ió n d ire c ta : En algunas realizaciones de la descripción, el conjugado puede diseñarse de modo que el agente se administre a la diana pero no se libere. Esto puede lograrse uniendo un agente a un AB directamente o mediante un enlazador no escindible.
Estos enlazadores no escindibles pueden incluir aminoácidos, péptidos, D-aminoácidos u otros compuestos orgánicos que pueden modificarse para incluir grupos funcionales que posteriormente pueden utilizarse en la unión a AB por los procedimientos descritos en el presente documento. Una fórmula general para un enlazador orgánico de este tipo podría ser
W -(CH2)n - Q
donde
W es --NH--CH2-- o --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un entero de 0 a 20.
Conjugados no escindióles'. En algunas realizaciones, un compuesto puede estar unido a AB que no activan el complemento. Cuando se usan AB que son incapaces de activar el complemento, esta unión se puede lograr usando enlazadores que sean susceptibles de escisión por complemento activado o usando enlazadores que no sean susceptibles de escisión por complemento activado.
Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las patentes de EE.UU. N.° 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la patente de EE.UU: N.° 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente descripción pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Definiciones:
A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente descripción tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la técnica. El término "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad. Por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más compuestos. Como tal, los términos "un", "una", "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar indistintamente. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligo- o polinucleótidos descritas en el presente documento se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva.Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se usan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes.
Según se utiliza de acuerdo con la presente divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas, por ejemplo, de unión antígeno, de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une de forma específica (inmunorreacciona con) a un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" o "se une inmunoespecíficamente" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (Kd > 10'6). Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, anticuerpo de dominio, monocatenarios, Fab y fragmentos F(ab')2 , scFv, y una biblioteca de expresión de Fab.
Se sabe que la unidad estructural de anticuerpo básica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, tales como IgG1 , IgG2 , y otras. Además, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (c Dr ) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAb contienen un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única por él.
El término "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión a antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas relativas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de las Secuencias de Kabat de proteínas de interés inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de linfocitos T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse contra péptidos N-terminales o C-terminales de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 pM; en algunas realizaciones, <100 nM y en algunas realizaciones, <10 nM.
Como se usa en el presente documento, los términos "unión específica", "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se puede expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, donde una Kd menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Uno de estos procedimientos implica medir las tasas de formación de complejos de sitio de unión a antígeno/antígeno y la disociación, donde esas tasas dependen de las concentraciones de las parejas de complejos, la afinidad de la interacción, y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la "constante de la tasa de asociación" (Kasociación ) como la "constante de la tasa de disociación" (Kdisociación) pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación (véase Nature 361:186-87 (1993)). La relación de Kdisociación /Kasociación permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd (véase, generalmente, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente descripción se une específicamente a la diana, cuando la constante de unión (Kd) es <1 pM, en algunas realizaciones <100 nM, en algunas realizaciones <10 nM, y en algunas realizaciones <100 pM a aproximadamente 1 pM, según se mide por ensayos tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
El término "polinucleótido aislado", como se usa en el presente documento, significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Los polinucleótidos de acuerdo con la descripción incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en el presente documento, y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en el presente documento.
El término "proteína aislada" a la que se hace referencia en el presente documento significa una proteína de ADNc, ARN recombinante u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de obtención, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza.
El término "polipéptido" se usa en el presente documento como un término genérico para referirse a proteínas nativas, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas nativas y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos de acuerdo con la descripción comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en el presente documento, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en el presente documento, así como las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tal como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.
El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otra manera es de origen natural.
El término "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a las posiciones de los componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas, y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión. El término "polinucleótido" al que se hace referencia en el presente documento significa nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenarias y bicatenarias.
El término oligonucleótido al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos entre sí por enlaces oligonucleotídicos de origen natural y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprende una longitud de 200 bases o menos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y en algunas realizaciones, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son generalmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la descripción son oligonucleótidos de sentido o antisentido.
El término "nucleótidos de origen natural" al que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" al que se hace referencia en el presente documento incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonmidato, y similares.Véanse, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc.
106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente de EE.u U. N.° 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección, si se desea.
Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a Edición, E.S. Golub y D.R. Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales, tales como los aminoácidos a-, a-disustituidos, los aminoácidos N-alquilo, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente descripción. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, ycarboxiglutamato, £-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3­ metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptido utilizada en el presente documento, la dirección de la izquierda es la dirección del terminal amino y la dirección de la derecha es la dirección del terminal carboxi, de acuerdo con el uso y la convención estándar.
De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5'; la dirección de la izquierda de las secuencias de polinucleótidos bicatenarias se conoce como la dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes se denomina dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que se encuentran 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas arriba", las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en el extremo 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas abajo".
Según se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de hueco predeterminados, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, en algunas realizaciones, al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, en algunas realizaciones, al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia, y en algunas realizaciones, al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia.
En algunas realizaciones, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Como se analiza en el presente documento, las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o las moléculas de inmunoglobulina se contemplan incluidas por la presente descripción, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos se mantengan al menos al 75 %, en algunas realizaciones, al menos al 80 %, 90 %, 95 %, y en algunas realizaciones, al 99 %. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados respecto a sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) los aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi alifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante sobre la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional ensayando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en el presente documento. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Los extremos amino y carboxi adecuados de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. En algunas realizaciones, se usan procedimientos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas pronosticados que tienen lugar en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen procedimientos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la descripción.
Las sustituciones de aminoácidos adecuadas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural.
Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadoras) pueden hacerse en la secuencia natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución conservadora de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que se produce en la secuencia parental, ni alterar otros tipos de la estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
El término "fragmento de polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi-terminal y/o una o más deleciones internas, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de largo, en algunas realizaciones, al menos 14 aminoácidos de largo, en algunas realizaciones, al menos 20 aminoácidos de largo, usualmente al menos 50 aminoácidos de largo, y en algunas realizaciones, al menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos que están compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene una unión específica a la diana, en condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución conservadora de aminoácidos (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos típicamente tienen al menos 20 aminoácidos de longitud, en algunas realizaciones, al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud completa.
El término "agente" se usa en el presente documento para representar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos.
Como se usa en el presente documento, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por procedimientos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutica. Se conocen en la técnica y se pueden usar diversos procedimientos para marcar polipéptidos y glucoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, los marcadores están unidos por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Otros términos químicos en el presente documento se usan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ilustra en el The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y en algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, en algunas realizaciones, más de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 % y el 99 %. En algunas realizaciones, la especie objeto se purifica a una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante procedimientos de detección convencionales), donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Los anticuerpos y/o anticuerpos activables de la descripción se unen específicamente a una diana dada, por ejemplo, una proteína diana humana tal como CD166 humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos y/o anticuerpos activables que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos y/o anticuerpos activables descritos en el presente documento. También se incluyen en la descripción los anticuerpos y/o anticuerpos activables por anticuerpos que compiten con un anticuerpo anti-CD166 y/o un anticuerpo activable anti-CD166 descrito en el presente documento para unirse a CD166, por ejemplo, CD166 humano. También se incluyen en la descripción los anticuerpos y/o anticuerpos activables por anticuerpos que compiten de forma cruzada con un anticuerpo anti-CD166 y/o un anticuerpo activable anti-CD166 descrito en el presente documento para unirse a CD166, por ejemplo, CD166 humano.
Los expertos en la técnica reconocerán que es posible determinar, sin demasiada experimentación, si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o humanizado murino) tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal utilizado en los procedimientos descritos en el presente documento determinando si el primero evita que el segundo se una a la diana. Si el anticuerpo monoclonal que se está ensayando compite con el anticuerpo monoclonal de la descripción, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal de la descripción, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítopo, o uno estrechamente relacionado. Un procedimiento alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la descripción es preincubar el anticuerpo monoclonal de la descripción con la diana y a continuación añadir el anticuerpo monoclonal que se está ensayando para determinar si el anticuerpo monoclonal que se está ensayando se inhibe en su capacidad de unirse a la diana. Si el anticuerpo monoclonal que se ensaya se inhibe, entonces, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica, o funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal de la descripción.
Anticuerpos activables multiespecíficos
La descripción también proporciona anticuerpos activables anti-CD166 multiespecíficos. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en el presente documento son anticuerpos multiespecíficos que reconocen CD166 y al menos uno o más antígenos o epítopos diferentes, y que incluyen al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido al menos a un dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico de tal forma que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del dominio de unión a antígeno o epítopo para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el MM está acoplado al dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico a través de un resto escindible (CM) que funciona como un sustrato para al menos una proteasa. Los anticuerpos multiespecíficos activables proporcionados en el presente documento son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, exhiben unión a una diana que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a las células efectoras inmunes, también denominados en el presente documento anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a células efectoras inmunes. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a leucocitos, también denominados en el presente documento anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a leucocitos. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a linfocitos T, también denominados en el presente documento anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a linfocitos T. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos se acoplan a un antígeno de superficie en un leucocito, tal como en un linfocito T, en una célula asesina natural (NK), en una célula mononuclear mieloide, en un macrófago, y/o en otra célula efectora inmune. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un linfocito T. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula mononuclear, tal como una célula mononuclear mieloide. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para unirse o interactuar de otro modo con más de una diana y/o más de un epítopo, también denominados en el presente documento anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos. Como se usa en el presente documento, los términos "diana" y "antígeno" se usan indistintamente.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a células efectoras inmunes de la descripción incluyen un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD166 y un anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes o porción de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes o porción de unión a antígeno del mismo se enmascara. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células efectoras inmunes, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a CD166, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a CD166. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células efectoras inmunes, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a CD166, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a CD166. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras no inmunes es un anticuerpo dirigido a un cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo efector de células no inmunes es una IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes es un scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido a CD166 (por ejemplo, el anticuerpo efector de células no inmunes) es una IgG, y el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes es un scFv. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un linfocito T. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula mononuclear mieloide.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a linfocitos T de la descripción incluyen un anticuerpo dirigido a CD166 o fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo de acoplamiento de linfocitos T o porción de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del anticuerpo dirigido a CD166 o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T o porción de unión a antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a linfocitos T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a CD166, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a CD166. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a linfocitos T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a CD166, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a CD166.
En algunas realizaciones de un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a células efectoras inmunes, un antígeno es CD166, y otro antígeno es típicamente un receptor estimulador o inhibidor presente en la superficie de un linfocito T, una célula asesina natural (NK), una célula mononuclear mieloide, un macrófago y/u otra célula efectora inmune, tales como, pero sin limitación, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, o VISTA. En algunas realizaciones, el antígeno es un receptor estimulador presente en la superficie de un linfocito T o una célula NK; los ejemplos de dichos receptores estimuladores incluyen, pero sin limitación, pero sin limitación, CD3, CD27, CD28, CD137 (también denominado 4-1BB), GITR, HVEM, ICOS, NKG2D, y OX40. En algunas realizaciones, el antígeno es un receptor inhibidor presente en la superficie de un linfocito T; los ejemplos de dichos receptores inhibitorios incluyen, pero sin limitación, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3 y K iR expresados en NK. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de linfocitos T también puede estar sustituido por un ligando o dominio de ligando que se une a un receptor de linfocitos T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunes, tales como, pero sin limitación, B7-1, B7-2, B7H3, PDL1, PDL2, o TNFSF9.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a linfocitos T incluye un scFv épsilon anti-CD3 (CD3e, también denominado en el presente documento CD3e y CD3) y un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del scFv anti-CD3£ y/o el anticuerpo de direccionamiento o la porción de unión a antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a CD166, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a CD166. En algunas realizaciones, el CD3e scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a CD166, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal forma que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a CD166.
En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una primera diana y/o un primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una segunda diana y/o un segundo epítopo. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a dos o más dianas diferentes. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a dos o más epítopos diferentes en la misma diana. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a una combinación de dos o más dianas diferentes y dos o más epítopos diferentes en la misma diana.
En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende una IgG tiene los dominios variables de IgG enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende un scFv tiene los dominios de scFv enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento y al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde cada uno de los dominios variables de IgG y los dominios de scFv está acoplado a su propio resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por un antígeno de superficie de linfocitos T. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro antígeno diana. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un epítopo de un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro epítopo del antígeno diana.
En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo carboxilo de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG, o al extremo carboxilo de tanto la cadena pesada como ligera de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo amino de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo amino de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG, o al extremo amino de tanto la cadena pesada como ligera de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse a cualquier combinación de uno o más extremos carboxilo y uno o más extremos amino de un anticuerpo activable de IgG. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de la IgG. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de al menos un scFv. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de una IgG, y un resto de enmascaramiento (MM) unido a un resto escindible (CM) está unido y enmascara un dominio de unión a antígeno de al menos un scFv.
La descripción proporciona ejemplos de estructuras de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen, pero sin limitación, lo siguiente: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2: (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VHCH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; o (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, donde: VL y VH representan los dominios variables de cadena ligera y pesada de la primera especificidad, contenidos en la IgG; VL* y v H* representan los dominios variables de la segunda especificidad, contenidos en el scFv; L1 es un péptido enlazador que conecta el resto de enmascaramiento (MM) y el resto escindible (CM); L2 es un péptido enlazador que conecta el resto escindible (CM), y el anticuerpo; L3 es un péptido enlazador que conecta los dominios variables del scFv; L4 es un péptido enlazador que conecta el anticuerpo de la primera especificidad con el anticuerpo de la segunda especificidad; CL es el dominio constante de cadena ligera; y c H1, CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada. Las primera y segunda especificidades pueden ser hacia cualquier antígeno o epítopo.
En algunas realizaciones de un anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a linfocitos T, un antígeno es CD166, y otro antígeno es típicamente un receptor estimulador (también denominado en el presente documento como activador) o inhibidor presente en la superficie de un linfocito T, una célula asesina natural (NK), una célula mononuclear mieloide, un macrófago y/u otra célula efectora inmune, tales como, pero sin limitación, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137 (también denominado TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, lAg 3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, o VISTA. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de linfocitos T también puede estar sustituido por un ligando o dominio de ligando que se une a un receptor de linfocitos T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunes.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento es un anticuerpo anti-CD166 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo de direccionamiento puede estar en forma de un anticuerpo activable. En algunas realizaciones, los scFv pueden estar en forma de un Pro-scFv (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2009/025846, WO 2010/081173).
En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión a CD3e, y comprende o se deriva de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD3e, por ejemplo, CH2527, FN18, H2C, OKT3, 2C11, UCHT1, o V9. En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión a CTLA-4 (también denominado en el presente documento CTLA y CTLA4).
En algunas realizaciones, el scFv anti-CTLA-4 incluye la secuencia de aminoácidos:
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQ
QKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTF
GGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFS
SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT
AVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS (SEQ ID NO: 117)
En algunas realizaciones, el scFv anti-CTLA-4 incluye la secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nO: 117. En algunas realizaciones, el scFv anti-CD3s incluye la secuencia de aminoácidos:
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVK
QRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARY
YDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS
SSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYC
QQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 118)
En algunas realizaciones, el scFv anti-CD3s incluye la secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118. En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión de uno o más linfocitos T, una o más células NK y/o uno o más macrófagos. En algunas realizaciones, el scFv es específico para unirse a una diana seleccionada del grupo que consiste en B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, o VISTA.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente está conjugado con el anticuerpo activable multiespecífico a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN o un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 5. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico puede diseñarse para incluir uno o más enlaces disulfuro.
La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo activable multiespecífico descrito en el presente documento, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La descripción proporciona procedimientos para producir un anticuerpo activable multiespecífico cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula comprende tal molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula comprende tal vector.
La descripción también proporciona un procedimiento para fabricar anticuerpos activables multiespecíficos de la descripción (a) cultivando una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable multiespecífico en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable multiespecífico, y (b) recuperando el anticuerpo activable multiespecífico. El AB, el Mm y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en el presente documento.
La descripción también proporciona anticuerpos activables multiespecíficos y/o composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o primer epítopo y un segundo anticuerpo o antígeno fragmento del mismo (AB2) que se une a una segunda diana o un segundo epítopo, donde al menos el AB 1 está acoplado o unido de otro modo a un resto de enmascaramiento (MM1), de modo que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el MM1 se acopla a AB1 a través de una primera secuencia de resto escindible (CM1) que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que se colocaliza con la diana de AB1 en un sitio de tratamiento o un sitio de diagnóstico en un sujeto. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en el presente documento son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, exhiben unión a la diana de AB1 que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en el presente documento.
La descripción también proporciona composiciones y procedimientos que incluyen un anticuerpo activable multiespecífico que incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una diana y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB2), donde al menos el primer AB en el anticuerpo activable multiespecífico está acoplado a un resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, cada AB está acoplado a un m M que disminuye la capacidad de su AB correspondiente a cada diana. Por ejemplo, en realizaciones de anticuerpos activables biespecíficos, el AB1 está acoplado a un primer resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana, y a B2 está acoplado a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos regiones de AB; en dichas realizaciones, el AB1 está acoplado a un primer resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB 1 para unirse a su diana, el AB2 está acoplado a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana, el AB3 está acoplado a un tercer resto de enmascaramiento (MM3) que disminuye la capacidad de AB3 para unirse a su diana, y así sucesivamente para cada AB en el anticuerpo activable multiespecífico. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye además al menos un resto escindible (CM) que es un sustrato para una proteasa, donde el CM une un MM a un AB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una diana y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB2), donde al menos el primer AB en el anticuerpo activable multiespecífico se acopla a través de un primer resto escindible (CM1) a un resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad del AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones de anticuerpos activables biespecíficos, el AB1 está acoplado a través de CM1 a MM1, y el AB2 está acoplado a través de un segundo resto escindible (CM2) a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos regiones de AB; en algunas de estas realizaciones, el AB1 está acoplado a través de CM1 a m M1, el AB2 está acoplado a través de CM2 a MM2, y el AB3 está acoplado a través de un tercer resto escindible (CM3) a un tercer resto de enmascaramiento (MM3) que disminuye la capacidad del AB3 para unirse su diana, y así sucesivamente para cada AB en el anticuerpo activable multiespecífico. El AB, el MM y/o el CM adecuados incluyen cualquiera del AB, MM, y/o CM descritos en el presente documento.
Anticuerpos activables que tienen radicales estéricos no ligantes o parejas de unión para radicales estériles no ligantes
La descripción también proporciona anticuerpos activables que incluyen restos estéricos no ligantes (NB) o parejas de unión (BP) para restos estéricos no ligantes, donde el BP recluta o atrae de otro modo el NB al anticuerpo activable. Los anticuerpos activables proporcionados en el presente documento incluyen, por ejemplo, un anticuerpo activable que incluye un resto estérico no ligante (NB), un enlazador escindible (CL) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une a una diana; un anticuerpo activable que incluye una pareja de unión para un resto estérico no ligante (BP), un CL y un AB; y un anticuerpo activable que incluye un BP para el que se ha reclutado un NB, un CL y un AB que se une a la diana. Los anticuerpos activables en los que el NB está unido covalentemente al CL y al AB del anticuerpo activable o está asociado por interacción con un BP que está unido covalentemente al CL y al AB del anticuerpo activable se denominan en el presente documento "anticuerpos activables que contienen NB". Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable exhibe un primer nivel de unión a una diana cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana cuando el anticuerpo activable está en un estado no inhibido, no enmascarado y/o escindido (es decir, una segunda conformación, es decir, un anticuerpo activado), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión a la diana. Las composiciones de anticuerpos activables pueden exhibir una biodisponibilidad aumentada y una biodistribución más favorable en comparación con los productos terapéuticos de anticuerpos convencionales.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables proporcionan una toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otro modo podrían ser resultado de la unión en sitios sin tratamiento y/o sitios de diagnóstico si el AB no se enmascara o se inhibe de otro modo la unión a tal sitio.
Los anticuerpos activables anti-CD166 que incluyen un resto estérico no ligante (NB) pueden prepararse usando los procedimientos expuestos en la publicación PCT N.° WO 2013/192546.
Uso de anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y anticuerpos activables conjugados
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la descripción se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan a las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Se pueden encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tal como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente descripción, siempre que el principio activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts". J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en los mismos para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Se usan formulaciones terapéuticas de la descripción, que incluyen un anticuerpo anti-CD166 y/o un anticuerpo anti-CD166 activable, tal como, a modo de ejemplo no limitante, un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para prevenir, tratar o mejorar de otro modo una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad diana aberrante. Por ejemplo, se usan formulaciones terapéuticas de la descripción, que incluyen un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado, para tratar o mejorar de otro modo un cáncer u otra afección neoplásica, inflamación, un trastorno inflamatorio y/o una enfermedad autoinmune. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido o una neoplasia hematológica donde se expresa la diana. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido donde se expresa la diana. En algunas realizaciones, el cáncer es una neoplasia hematológica donde se expresa la diana. En algunas realizaciones, la diana se expresa en el parénquima (por ejemplo, en el cáncer, la porción de un órgano o tejido que a menudo lleva a cabo una o más funciones del órgano o tejido). En algunas realizaciones, la diana se expresa en una célula, tejido u órgano. En algunas realizaciones, la diana se expresa en el estroma (es decir, el marco de soporte conectivo de una célula, tejido u órgano). En algunas realizaciones, la diana se expresa en un osteoblasto. En algunas realizaciones, la diana se expresa en el endotelio (vasculatura). En algunas realizaciones, la diana se expresa en una célula madre cancerosa. En algunas realizaciones, el agente al que se conjuga el anticuerpo y/o el anticuerpo activable es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente con el que se conjuga el anticuerpo y/o el anticuerpo activable es un agente que daña el ácido nucleico.
La eficacia de la prevención, mejora o tratamiento se determina en asociación con cualquier procedimiento conocido para diagnosticar o tratar la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad diana, tal como, por ejemplo, la expresión y/o actividad diana aberrante. Prolongar la supervivencia de un sujeto o retrasar de otro modo la progresión de la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad diana, por ejemplo, la expresión y/o actividad diana aberrante, en un sujeto indica que el anticuerpo, anticuerpo conjugado, anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado confiere un beneficio clínico.
Un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado se pueden administrar en forma de composiciones farmacéuticas. Los principios y consideraciones que intervienen en la preparación de dichas composiciones, así como la orientación en la elección de los componentes, se proporcionan, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, Nueva York.
En algunas realizaciones donde se usan fragmentos de anticuerpos, se selecciona el fragmento más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que conserven la capacidad de unirse a la secuencia de proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, por ejemplo, en algunas realizaciones, aquellas con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. En algunas realizaciones, o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (para ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Pat. de EE.UU. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado contiene un marcador detectable. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv, o F(ab) 2 ). El término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende incluir el marcado directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o el anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcado final de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Por lo tanto, se incluye dentro del uso del término "muestra biológica" la sangre y una fracción o componente de la sangre, incluyendo suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el procedimiento de detección de la descripción se puede usar para detectar un ARNm de analito, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro, así como in v ivo .Por ejemplo, las técnicas in v itro para la detección de un ARNm de analito incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in s itu .L as técnicas in v itro para la detección de una proteína de analito incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones, tinción inmunoquímica e inmunofluorescencia.Las técnicas in v itro para la detección de un ADN genómico de analito incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos para realizar inmunoensayos se describen, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las técnicas in v ivo para la detección de una proteína de analito incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-proteína de analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden detectarse mediante técnicas de imagen estándar.
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción también son útiles en una diversidad de formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una realización, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a pacientes que corren el riesgo de desarrollar uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente se puede determinar utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunas realizaciones de la descripción, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. T ras el diagnóstico, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado de la descripción también es útil en la detección de una diana en muestras de pacientes y, por consiguiente, son útiles como productos de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos y/o anticuerpos activables, y las versiones conjugadas de los mismos, de la descripción se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar niveles de diana en una muestra de paciente.
En una realización, un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado de la descripción se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el pocillo o pocillos de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado sirven como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable, y/o las versiones conjugadas de los mismos, con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de leche o albúmina para impedir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que se marca de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel de marcador detectable, y la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba se determina en comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos y anticuerpos activables de la descripción, y las versiones conjugadas de los mismos, en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible estadificar una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados en diversos estadios de la progresión de la enfermedad, y/o en diversos puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada estadio de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada estadio.
Un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado también se pueden usar en procedimientos de diagnóstico y/o de formación de imágenes. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vitro. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vivo. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in situ. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos activables que tienen un CM escindible enzimáticamente pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas realizaciones, un entorno de potencial de reducción aumentado tal como el que puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una célula o tejido dado de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción aumentado dependiendo de la naturaleza del CM) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede seleccionarse como sustrato para al menos una proteasa encontrada en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, tal como en un absceso, en un órgano y similares), y similares. El AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Usando los procedimientos como se describen en el presente documento, o cuando sea apropiado, procedimientos familiares para un experto en la técnica, un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente o marcador radiactivo o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo y/o anticuerpo activable. Los marcadores detectables adecuados se analizan en el contexto de los procedimientos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales a continuación. Usando un AB específico para una proteína o péptido de la patología, junto con al menos una proteasa cuya actividad es elevada en el tejido de la enfermedad de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido de la enfermedad en relación con los tejidos donde la enzima específica del CM no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel más bajo que en el tejido de la enfermedad o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las proteínas pequeñas y los péptidos se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y dado que la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles inferiores en tejidos que no son de la enfermedad o está presente en conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido de la enfermedad aumenta en relación con los tejidos que no son de la enfermedad.
En otro ejemplo, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por una enzima, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, donde los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por agente reductor, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos procedimientos, los anticuerpos activables pueden marcarse de manera detectable y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido, tal como un portaobjetos o una perla). El marcador detectable puede posicionarse en una porción del anticuerpo activable que no se libera después de la escisión, por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente inactivado u otro marcador que no sea detectable hasta que se haya producido la escisión. El ensayo se puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos activables inmovilizados, marcados de forma detectable con una muestra que se sospecha que contiene una enzima y/o agente reductor durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la escisión, que se lava a continuación para eliminar el exceso de muestra y contaminantes. La presencia o ausencia del agente de escisión (por ejemplo, enzima o agente reductor) en la muestra se evalúa a continuación mediante un cambio en la señal detectable de los anticuerpos activables antes de entrar en contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia y/o un aumento en la señal detectable debido a la escisión del anticuerpo activable por el agente de escisión en la muestra.
Dichos procedimientos de detección pueden adaptarse para proporcionar también la detección de la presencia o ausencia de una diana que sea capaz de unir el AB de los anticuerpos activables cuando se escinde. Por lo tanto, los ensayos se pueden adaptar para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de una diana de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede detectarse por la presencia y/o un aumento en el marcador detectable de los anticuerpos activables como se ha descrito anteriormente, y la presencia o ausencia de la diana puede detectarse mediante la detección de un complejo diana-AB, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-diana marcado de forma detectable.
Los anticuerpos activables también son útiles en la formación de imágenes in situ para la validación de la activación de anticuerpos activables, por ejemplo, por escisión de proteasa, y la unión a una diana particular.La formación de imágenes in situ es una técnica que permite la localización de la actividad proteolítica y la diana en muestras biológicas tales como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar tanto la unión a una diana dada como la actividad proteolítica basándose en la presencia de un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula congelada o tejido derivado de un sitio de enfermedad (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos sanos. Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo activable se marca con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un colorante fluorescente (por ejemplo, un fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), un marcador Alexa Fluor®), un colorante de infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, nanocristales Qdot®), un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación tal como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección del marcador en una muestra que se ha incubado con el anticuerpo activable marcado indica que la muestra contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la proteasa puede confirmarse usando inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en el presente documento, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo tal como A11, que es específico para la proteasa matriptasa e inhibe la actividad proteolítica de la matriptasa; véase, por ejemplo, la publicación internacional número WO 2010/129609, publicada el 11 de noviembre de 2010. El mismo enfoque del uso de inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en el presente documento, y/o usando un agente inhibidor más selectivo puede usarse para identificar una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la diana puede confirmarse usando un agente que es específico para la diana, por ejemplo, otro anticuerpo, o el marcador detectable puede competir con la diana no marcada. En algunas realizaciones, podría usarse un anticuerpo activable no marcado, con detección mediante un anticuerpo secundario marcado o un sistema de detección más complejo.
Técnicas similares también son útiles para la formación de imágenes in vivo donde la detección de la señal fluorescente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable.
Estas técnicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de la actividad de proteasa en una diversidad de células, tejidos y organismos basados en el CM específico de proteasa en el anticuerpo activable.
La descripción proporciona procedimientos para usar los anticuerpos y/o anticuerpos activables en una diversidad de indicaciones de diagnóstico y/o profilácticas. Por ejemplo, la descripción proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y una diana de interés en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado activado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra con un anticuerpo activable en presencia de una diana de interés, por ejemplo, la diana, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado activado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable, comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado activado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, un dominio de unión a antígeno (AB) que se une específicamente a la diana, y un marcador detectable, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB y no es una forma modificada de una pareja de unión natural del AB; donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado escindido y activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y donde el marcador detectable se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM; y (ii) midiendo un nivel de marcador detectable en el sujeto o muestra, donde un nivel detectable del marcador detectable en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra, y donde el nivel no detectable del marcador detectable en el sujeto o muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado (por ejemplo, un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico) descrito en el presente documento para su uso en el contacto con un sujeto o muestra biológica, y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se pueden detectar en el sujeto o la muestra biológica.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable en presencia de la diana, y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable, de modo que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o muestra biológica. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto N-terminal escindible con respecto al sitio de escisión de la proteasa. En algunas realizaciones, se enmascara un único sitio de unión a antígeno del AB. En algunas realizaciones donde un anticuerpo de la descripción tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos un sitio de unión a antígeno está enmascarado y al menos un sitio de unión a antígeno no está enmascarado. En algunas realizaciones, todos los sitios de unión a antígeno están enmascarados. En algunas realizaciones, la etapa de medición incluye el uso de un reactivo secundario que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado descrito en el presente documento para su uso en el contacto de sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable en presencia de la diana, y la medición de un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable, de modo que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o muestra biológica. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (Mm ), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, por ejemplo, una proteasa, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto N-terminal escindible con respecto al sitio de escisión de la proteasa. En algunas realizaciones, se enmascara un único sitio de unión a antígeno del AB. En algunas realizaciones donde un anticuerpo de la descripción tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos un sitio de unión a antígeno está enmascarado y al menos un sitio de unión a antígeno no está enmascarado. En algunas realizaciones, todos los sitios de unión a antígeno están enmascarados. En algunas realizaciones, la etapa de medición incluye el uso de un reactivo secundario que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado descrito en el presente documento para su uso en el contacto con un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica, de tal forma que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se puede detectar en el sujeto o muestra biológica, y donde el nivel no detectable del anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable.
La descripción proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM, y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no pueden detectarse en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado descrito en el presente documento para su uso en el contacto de un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no pueden detectarse en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %.
La descripción también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM; y (ii) midiendo un nivel de marcador detectable en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable, de tal forma que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %. Tal anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) que se escinde por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido (es decir, no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión de origen natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión de interés en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado descrito en el presente documento para su uso en el contacto de un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde el anticuerpo activable incluye un marcador detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del CM, donde un nivel detectable del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana, o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se pueden detectar en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido del marcador detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de marcador detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable incluye un marcador detectable. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador detectable incluye un agente de formación de imágenes, un agente de contraste, una enzima, un marcador fluorescente, un cromóforo, un colorante, uno o más iones metálicos, o un marcador basado en ligando. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de formación de imágenes comprende un radioisótopo. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), proteína fluorescente roja tdimer2 (RFP2 tdimer 2), HCRED, o un derivado de europio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador luminiscente comprende un derivado de N-metilacridio. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el marcador comprende un marcador Alexa Fluor®, tal como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el marcador basado en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un roedor.
En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vivo. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in s itu. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento e x vivo. En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vitro.
En algunas realizaciones, la formación de imágenes in s itu y/o la formación de imágenes in v ivo son útiles en procedimientos para identificar qué pacientes tratar. Por ejemplo, en la formación de imágenes in situ, los anticuerpos activables se usan para cribar muestras de pacientes para identificar a aquellos pacientes que tienen la proteasa o proteasas y la diana o dianas en la ubicación apropiada, por ejemplo, en un sitio de tumor.
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in s itu para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que den negativo para cualquiera de o tanto la diana (por ejemplo, la diana) como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo activable para el que el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in v ivo para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Del mismo modo, los pacientes con resultados negativos pueden ser identificados como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo activable para el que el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones de los procedimientos y kits, el procedimiento o kit se usa para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que den negativo tanto para las dianas (por ejemplo, la diana) como para la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otros anticuerpos activables hasta que se identifique un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de enfermedad). En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo para cualquiera de la diana (por ejemplo, la diana) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo para cualquiera de la diana (por ejemplo, la diana) se identifican como candidatos no adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otros anticuerpos activables hasta que se identifique un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de enfermedad). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende un marcador detectable.
En algunas realizaciones, se usa un procedimiento o kit para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable anti-diana y/o un anticuerpo activable conjugado (por ejemplo, un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico) de la descripción, seguido de tratamiento mediante la administración de ese anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para las dianas (por ejemplo, la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado que se ensaya en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con dicho anticuerpo y/o tal anticuerpo activable conjugado que comprende tal CM, y a continuación se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado que se ensayó. Asimismo, los pacientes que dan negativo para cualquiera de o tanto la diana (por ejemplo, la diana) como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otro anticuerpo y/o anticuerpo activable conjugado hasta que se identifique un anticuerpo adecuado y/o un anticuerpo activable conjugado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de enfermedad). En algunas realizaciones, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado para el que el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el MM es un péptido que tiene una longitud de aproximadamente 4 a 40 aminoácidos. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable comprende un péptido enlazador, donde el péptido enlazador se posiciona entre el MM y el CM. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable comprende un péptido enlazador, donde el péptido enlazador se posiciona entre el AB y el CM. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable comprende un primer péptido enlazador (L1) y un segundo péptido enlazador (L2), donde el primer péptido enlazador se posiciona entre el MM y el CM, y el segundo péptido enlazador se posiciona entre el AB y el Cm . En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, cada uno de L1 y L2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud, y donde cada uno de L1 y L2 no necesita ser el mismo enlazador. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, uno o ambos de L1 y L2 comprenden un polímero de glicina-serina. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, al menos uno de L1 y L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), donde n es un número entero de al menos uno. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, al menos uno de L1 y L2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula (GGS)n, donde n es un número entero de al menos uno. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, al menos uno de L1 y L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 3), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 5), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 7), y Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 8).
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el AB comprende una secuencia de anticuerpo o de fragmento de anticuerpo que se selecciona de las secuencias de anticuerpos de reacción cruzada presentadas en el presente documento. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el AB comprende un fragmento Fab, un scFv o un anticuerpo monocatenario (scAb).
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de escisión es una proteasa que se colocaliza en el sujeto o muestra con la diana y el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para la proteasa, donde la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el CM está acoplado al extremo N-terminal del AB. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el CM está acoplado al extremo C-terminal del AB. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el CM está acoplado al extremo N-terminal de una cadena VL del AB.
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción se usan en formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una realización, se administra un anticuerpo activable a pacientes que están en riesgo de desarrollar una o más de la inflamación, trastornos inflamatorios, cáncer u otros trastornos mencionados anteriormente.
La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente se puede determinar utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunas realizaciones de la descripción, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. T ras el diagnóstico, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción también son útiles en la detección de la diana en muestras de pacientes y, por consiguiente, son útiles como productos de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos, anticuerpos conjugados, los anticuerpos activables y/o los anticuerpos activables conjugados de la descripción se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar niveles diana en una muestra de paciente.
En una realización, un anticuerpo y/o un anticuerpo activable de la descripción se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el pocillo o pocillos de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable sirven como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de leche o albúmina para impedir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que se marca de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel de marcador detectable, y la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba se determina en comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos y/o anticuerpos activables de la descripción en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible estadificar una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados en diversos estadios de la progresión de la enfermedad, y/o en diversos puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada estadio de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada estadio.
También pueden usarse anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados en procedimientos de diagnóstico y/o de formación de imágenes. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vitro. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vivo. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in situ. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos activables que tienen un CM escindible enzimáticamente pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas realizaciones, un entorno de potencial de reducción aumentado tal como el que puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una célula o tejido dado de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción aumentado dependiendo de la naturaleza del CM) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede seleccionarse como sustrato de proteasa para una proteasa encontrada en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, tal como en un absceso, en un órgano y similares), y similares. El AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Usando procedimientos familiares para un experto en la técnica, un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente o marcador radiactivo o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo activable. Los marcadores detectables adecuados se analizan en el contexto de los procedimientos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales a continuación. Usando un AB específico para una proteína o péptido de la patología, junto con una proteasa cuya actividad es elevada en el tejido de la enfermedad de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido de la enfermedad en relación con los tejidos donde la enzima específica del CM no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel más bajo que en el tejido de la enfermedad o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las proteínas pequeñas y los péptidos se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y dado que la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles inferiores en tejidos que no son de la enfermedad o está presente en conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido de la enfermedad aumenta en relación con los tejidos que no son de la enfermedad.
En otro ejemplo, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por una enzima, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, donde los anticuerpos activables contienen un CM susceptible de escisión por agente reductor, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos procedimientos, los anticuerpos activables pueden marcarse de manera detectable y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido, tal como un portaobjetos o una perla). El marcador detectable puede posicionarse en una porción del anticuerpo activable que no se libera después de la escisión, por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente inactivado u otro marcador que no sea detectable hasta que se haya producido la escisión. El ensayo se puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos activables inmovilizados, marcados de forma detectable con una muestra que se sospecha que contiene una enzima y/o agente reductor durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la escisión, que se lava a continuación para eliminar el exceso de muestra y contaminantes. La presencia o ausencia del agente de escisión (por ejemplo, enzima o agente reductor) en la muestra se evalúa a continuación mediante un cambio en la señal detectable de los anticuerpos activables antes de entrar en contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia y/o un aumento en la señal detectable debido a la escisión del anticuerpo activable por el agente de escisión en la muestra.
Dichos procedimientos de detección pueden adaptarse para proporcionar también la detección de la presencia o ausencia de una diana que sea capaz de unir el a B de los anticuerpos activables cuando se escinde. Por lo tanto, los ensayos se pueden adaptar para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de una diana de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede detectarse por la presencia y/o un aumento en el marcador detectable de los anticuerpos activables como se ha descrito anteriormente, y la presencia o ausencia de la diana puede detectarse mediante la detección de un complejo diana-AB, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-diana marcado de forma detectable.
Los anticuerpos activables también son útiles en la formación de imágenes in situ para la validación de la activación de anticuerpos activables, por ejemplo, por escisión de proteasa, y la unión a una diana particular.La formación de imágenes in situ es una técnica que permite la localización de la actividad proteolítica y la diana en muestras biológicas tales como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar tanto la unión a una diana dada como la actividad proteolítica basándose en la presencia de un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula congelada o tejido derivado de un sitio de enfermedad (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos sanos. Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo activable se marca con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un colorante fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), un colorante de infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, nanocristales Qdot®), un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación tal como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección del marcador en una muestra que se ha incubado con el anticuerpo activable marcado indica que la muestra contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la proteasa puede confirmarse usando inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en el presente documento, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo tal como A11, que es específico para la proteasa matriptasa e inhibe la actividad proteolítica de la matriptasa; véase, por ejemplo, la publicación internacional número WO 2010/129609, publicada el 11 de noviembre de 2010. El mismo enfoque del uso de inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en el presente documento, y/o usando un agente inhibidor más selectivo puede usarse para identificar una proteasa o clase de proteasas específicas para el CM del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la diana puede confirmarse usando un agente que es específico para la diana, por ejemplo, otro anticuerpo, o el marcador detectable puede competir con la diana no marcada. En algunas realizaciones, podría usarse un anticuerpo activable no marcado, con detección mediante un anticuerpo secundario marcado o un sistema de detección más complejo.
Técnicas similares también son útiles para la formación de imágenes in vivo donde la detección de la señal fluorescente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable.
Estas técnicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de la actividad de proteasa en una diversidad de células, tejidos y organismos basados en el CM específico de proteasa en el anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, la formación de imágenes in situ y/o la formación de imágenes in vivo son útiles en procedimientos para identificar qué pacientes tratar. Por ejemplo, en la formación de imágenes in situ, los anticuerpos activables se usan para cribar muestras de pacientes para identificar a aquellos pacientes que tienen la proteasa o proteasas y la diana o dianas en la ubicación apropiada, por ejemplo, en un sitio de tumor.
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in situ para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que dan negativo para cualquiera o tanto la diana como la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se ensaya). En algunas realizaciones, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad).
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in vivo para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la descripción. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que dan negativo se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se está ensayando). En algunas realizaciones, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes CM hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un CM que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad).
Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la descripción (también denominados en el presente documento "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Dichas composiciones comprenden típicamente el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo. Los ejemplos adecuados de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5 %. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.
Una composición farmacéutica de la descripción se formula para ser compatible con su vía de administración prevista.
Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, una solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En algunas realizaciones, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se agita y se expectora o se traga. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos, y similares, pueden incluir cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saporífero tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N.° 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la descripción se dicta por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de compuestos de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
EJEMPLO 1. Caracterización de los anticuerpos anti-CD166
Los estudios proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la unión de los anticuerpos anti-CD166 de la descripción.
La unión de diversos anticuerpos anti-CD166 de la descripción se confirmó mediante ELISA (figura 1). Se ensayaron los anticuerpos anti-CD166 humanos que comprendían las si uientes secuencias VH VL:
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El mAb M9 se obtuvo usando tecnología de hibridoma de ratón, y las secuencias restantes se generaron humanizando la secuencia de mAb M9. Los expertos en la técnica apreciarán que la capacidad de generar anticuerpos anti-CD166 se vio obstaculizada durante mucho tiempo, porque los investigadores no pudieron generar hibridomas y/o anticuerpos en ratones que recibieron CD166 humano. Por el contrario, los anticuerpos anti-CD166 presentados en el presente documento se generaron contra CD166 humano en ratones.
El anticuerpo CD166-anticuerpo M9 que comprende VH de SEQ ID NO: 119, VL de SEQ ID NO: 120 se usó como control positivo, y se usó un anticuerpo de control de isotipo como control negativo.
Como se muestra en la figura 1, todos los anticuerpos anti-CD166 humanizados mostraron una unión comparable a CD166 M9. Usando un protocolo ELISA estándar, la proteína CD166 humana se absorbió en placas ELISA y posteriormente se incubó con la concentración de anticuerpo indicada. El anticuerpo unido se detectó con una FAB peroxidasa anti-humana secundaria.
EJEMPLO 2. Descubrimiento de la máscara
Los estudios proporcionados en el presente documento se diseñaron para identificar y caracterizar restos de enmascaramiento para su uso en anticuerpos anti-CD166 activables de la descripción.
El mab anti-CD166 de ratón M9 (VH de SEQ ID NO: 119, VL de SEQ ID NO: 120 se usó para cribar una biblioteca de péptidos X 15 con restricción de cisteína con una diversidad total de 3x1011, donde X es cualquier aminoácidos, usando un procedimiento similar al descrito en la publicación internacional PCT número WO 2010/081173, publicada el 15 de julio de 2010. El cribado consistió en dos rondas de MACS y cuatro rondas de clasificación FACs . El proceso de clasificación se describe en la figura 2.
Se secuenciaron clones individuales de las poblaciones M2F1.1, M2F2.1, M2F3.1 y M2F4.1 y los resultados se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9. Secuencias peptídicas de enmascaramiento:
M2F1.1
JF16490 YLCQRHPLALKYCTN (SEQ ID NO: 135)
JF16492 PLCVPTQLLRSCYNY (SEQ ID NO: 136)
JF16493 AVCHPLANVETQCLD (SEQ ID NO: 137)
JF16494 PHCHPLFNNTYCYRH (SEQ ID NO: 138)
JF16495 PLCRPIELLASCPMK (SEQ ID NO: 139)
JF16496 GAACVSAWGFFCECC (SEQ ID NO: 140)
JF16498 DCAKDILHLMPHCSM (SEQ ID NO: 141)
JF16501 NTCMHPLLLQGCKTY (SEQ ID NO: 142)
JF16503 YLGCLLYAGPGCEGG (SEQ ID NO: 143)
JF16506 ARCPHPLLLSICENN (SEQ ID NO: 144)
JF16507 ELCPHPLPFGFCNNY (SEQ ID NO: 145)
JF16508 ALYCHPPYIRCEEMT (SEQ ID NO: 146)
M2F2.1
JF16534 TSLCHPVMIMYCKTG (SEQ ID NO: 147)
JF16535 PLCHPLEQASWCNMD (SEQ ID NO: 148)
JF16536 PHPCPRTGSRMCHFS (SEQ ID NO: 149)
JF16537 SGCRHPLPLKACGTN (SEQ ID NO: 150)
JF16538 GLCHPIRLHNTQCTI (SEQ ID NO: 151)
JF16539 KCMHPLNLHNINCNH (SEQ ID NO: 152)
JF16540 PICHPLREFMNTCFK (SEQ ID NO: 153)
JF16541 NCHPLDVVGWLGCMK (SEQ ID NO: 154)
JF16542 YNNVCHPLFCSQHTY (SEQ ID NO: 155)
JF16543 TFCHPLFSLNYCGHK (SEQ ID NO: 156)
JF16544 FCHPLTLSNNKQCNR (SEQ ID NO: 157)
JF16545 LSHCAVLLLRVCSGS (SEQ ID NO: 158)
JF16546 KIHCHPLRLGTCLVG (SEQ ID NO: 159)
JF16547 ETCAHPLDMRMCRHN (SEQ ID NO: 160)
JF16548 PLCYPLILMSSCWLG (SEQ ID NO: 161)
M2F1.1
JF16549 YGICHPAPDLPCMQI (SEQ ID NO: 162) JF16550 TACHPLYNVEHLCEI (SEQ ID NO: 163) JF16551 TACNKSVCVAGCCLL (SEQ ID NO: 164) JF16552 LHPLCSYMKSCMKNN (SEQ ID NO: 165) JF16553 THCHCMVYFCPCRWS (SEQ ID NO: 166)
M2F3.1
JF16554 PKCPHPLHLANCYAS (SEQ ID NO: 167) JF16555 KTCYHPTPVIAXNSY (SEQ ID NO: 168) JF16556 AKCLPPLIQYCRCIK (SEQ ID NO: 169) JF16557 HACQHPLQLHTCKHN (SEQ ID NO: 170) JF16558 LCHPLVLSAWESCSN (SEQ ID NO: 171) JF16559 WPLCSFGKSFCAQNA (SEQ ID NO: 172) JF16560 ECQSFEHFLTNNCHS (SEQ ID NO: 173) JF16561 SCKHPLVMPNLKCTR (SEQ ID NO: 174) JF16562 YPCHPLQLSIPHCTK (SEQ ID NO: 175) JF16563 ICHPLTHTMEYMCMN (SEQ ID NO: 176) JF16564 TLCHPLTFSVPTCTN (SEQ ID NO: 177) JF16565 PLCQPNRLLQACGNT (SEQ ID NO: 178) JF16566 TLCRHPLALDGCQNN (SEQ ID NO: 179) JF16567 QPMCYQPAHPLCNTI (SEQ ID NO: 180) JF16568 SNCHPLLFQHYHCML (SEQ ID NO: 181) JF16569 EKCYHPLTLAHCQNH (SEQ ID NO: 182) JF16571 NKCFVHPLAMPNCNS (SEQ ID NO: 183) JF16572 VNNCLLMTRAHCTSY (SEQ ID NO: 184) JF16573 LPCWAFAVNPLHCGD (SEQ ID NO: 185)
M2F4.1
JS7503 VNNCLLMTRAHCTSY (SEQ ID NO: 186) JS7504 SSCPHPLGLTGCNDK (SEQ ID NO: 187)
JS7505 NKCFVHPLAMPNCNS (SEQ ID NO: 188) JS7506 FVGCHSVYVSGCLRA (SEQ ID NO: 189) JS7507 NMCHPPHNIYSICNM (SEQ ID NO: 190) JS7509 LTCHLLPGLTLH-TK (SEQ ID NO: 191) JS7510 RTCHPLPGLTLHCTK (SEQ ID NO: 192) JS7511 HPLCFESMKNCFPNY (SEQ ID NO: 193) JS7513 TTCHPLSFTHNYCIT (SEQ ID NO: 194) JS7515 RDCGFDAVRADCLFG (SEQ ID NO: 195) JS7516 RTCSTHPLTMPQCNY (SEQ ID NO: 196) JS7517 MKCHPLQLTGNTCSM (SEQ ID NO: 197) JS7518 SGCPHPLQLITCSTA (SEQ ID NO: 198) M2F1.1
JS7519 KCFPAFHDGPLACAS (SEQ ID NO: 199)
JS7520 LKCQHPLPMSHCQPQ (SEQ ID NO: 200)
JS7521 AFCGFSVIHPLCSGA (SEQ ID NO: 201)
JS7522 SVHCAVLKLDGCLGW (SEQ ID NO: 202)
JS7523 TLPCHPIMVLGCTPM (SEQ ID NO: 203)
JS7525 HYPCMKYNPLNCSMS (SEQ ID NO: 204)
JS7526 LKCPHPLSLNGCTLK (SEQ ID NO: 205)
JS7527 VYSCMANNPLDCFTQ (SEQ ID NO: 206)
JS7528 PICHPLVTLMSYCNK (SEQ ID NO: 207)
JS7529 DWCSFWAGQSVWCTS (SEQ ID NO: 208)
JS7530 STCHPLTPFHDKCRY (SEQ ID NO: 209)
JS7531 PVCPPLVTLMSYCNK (SEQ ID NO: 210)
JS7532 STCHPLPTLMPYCNS (SEQ ID NO: 211)
JS7533 FPLCGIGPAFCDTTV (SEQ ID NO: 212)
JS7534 PTCHPLVLSVPCPKI (SEQ ID NO: 213)
JS7537 GPLCDYFVFYSCRGS (SEQ ID NO: 214)
JS7538 HTCYHPLKLGQCEMF (SEQ ID NO: 215)
JS7539 RTCIHPLPLHQCHKP (SEQ ID NO: 216)
JS7540 ACHPINFNSIVYCNN (SEQ ID NO: 217)
JS7542 SHPCSVVNLPGCEPD (SEQ ID NO: 218)
Las máscaras se truncaron y se escaneó la alanina para generar familias de anticuerpos activables con diferentes eficiencias de enmascaramiento. Las secuencias se muestran a continuación en la Tabla 10. La "a" indica la posición de la alanina incorporada como parte del barrido. Es equivalente a "A".
T l 1 . Tr n mi n rri l nin i nm r mi n
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Estos péptidos de enmascaramiento se usaron para generar los anticuerpos activables anti-CD166 de la descripción. Las secuencias para algunos de estos anticuerpos activables anti-CD166 se muestran a continuación en la Tabla 11. En algunas realizaciones, estos anticuerpos activables anti-CD166 incluyen el resto escindible 2001 (ISSGLLSGRSDNH; SEQ ID NO: 70), el resto escindible 3001 (AVGLLAPPGGLSGRSDNH; SEQ ID NO: 76), el resto escindible 2007 (ISSGLLSGRSDIH; SEQ ID NO: 342), el resto escindible 2008 (ISSGLLSGRSDQH; SEQ ID NO: 343), el resto escindible 2011 (ISSGLLSGRSDNP; SEQ ID NO: 346), el resto escindible 2012 (ISSGLLSGRSANP; SEQ ID NO: 347), el resto escindible 2013 (ISSGLLSGRSANI; SEQ ID NO: 348), el resto escindible 3007 (AVGLLAPPGGLSGRSDIH; SEQ ID NO: 350), el resto escindible 3008 (AVGLLAPPGGLSGRSDQH; SEQ ID NO: 351), el resto escindible 3011 (AVGLLAPPGGLSGRSDNP; SEQ ID NO: 354), el resto escindible 3012 (AVGLLAPPGGLSGRSANP; SEQ ID NO: 355), o un resto escindible 3013 (AVGLLAPPGGLSGRSANI; SEQ ID NO: 356), como se indica.
Si bien ciertas secuencias que se muestran a continuación incluyen la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 305, los expertos en la técnica aprecian que los anticuerpos anti-CD166 activables de la descripción pueden incluir cualquier secuencia espaciadora adecuada, como, por ejemplo, una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en QGQSGQG (SEQ ID NO: 305), QGQSGQ (SEQ ID NO: 88), QGQSG (SEQ ID NO: 306), QGQS (SEQ ID NO: 307), QGQ (SEQ ID NO: 308), QG (SEQ ID NO: 309), GQSGQG (SEQ ID NO: 359), QSGQG (SEQ ID NO: 360), SGQG (SEQ ID NO: 361), Gq G (SEQ ID NO: 362), G o Q. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CD166 activables de la descripción no pueden tener una secuencia espaciadora unida a su extremo N-terminal.
Tabla 11. Secuencias de anticuerpos activables anti-CD166
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC):
Secuencia de aminoácidos
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTYGMGVGWIRQPPGKALEWLANIWWSEDKHYSPSLKS
RLTITKDTSKNQVVLTITNVDPVDTATYYCVQIDYGNDYAFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP
SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT
YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 239)
Secuencia de nucleótidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): CAGATCACCCTGAAAGAGTCCGGCCCCACCCTGGTGAAACCCACCCAGACCCTGACCCTGACATGCA CCTTCTCCGGCTTCAGCCTGTCCACCTACGGCATGGGCGTGGGCTGGATCAGGCAGCCTCCTGGCAA GGCCCTGGAATGGCTGGCCAACATCTGGTGGTCCGAGGACAAGCACTACTCCCCCAGCCTGAAGTCC CGGCTGACCATCACCAAGGACACCTCCAAGAACCAGGTGGTGCTGACAATCACAAACGTGGACCCCG TGGACACCGCCACCTACTACTGCGTGCAGATCGACTACGGCAACGACTACGCCTTCACCTACTGGGG CCAGGGCACACTGGTGACAGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCT TCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGC CCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCA GTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCT GCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCT GTTCCCCCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTG GACGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACG CCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCT GCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCC ATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCCCCTA GCCGGGAAGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGA TATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG GACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCA ACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCT GAGCCCCGGCAAG (SEQ ID NO: 241)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.6_2001 (SEQ ID NO: 310)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 242)
[espaciador (SEQ ID NO: 480)] [HuCD166Lc1_7614.6_2001 (SEQ ID NO: 311)] Secuencia de nucleótidos [CAGGGCCAGTCTGGACAGGGC][CTGTGTCACCCTGCCGTGCTGTCTGCCTGGGAGTCCTGTTCCT CCGGCGGTGGCTCCTCTGGCGGCTCCATCTCCTCTGGCCTGCTGTCCGGCAGATCCGACAACCACGG CGGAGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGCCCGTGACACCTGGCGAGCCTGCC TCCATCAGCTGCCGGTCCTCCAAGTCCCTGCTGCACTCCAACGGCATCACCTACCTGTACTGGTATC TGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACCAGATGTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCC CGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACOGACTTCACCCTGAAGATOTCCCGGGTGGAAGCCGAG Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): GACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAACTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC TGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAA GTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGG AAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACA GCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGC CTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCGGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 243)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_2001 (SEQ ID NO: 312)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 244)
[espaciador (SEQ ID NO: 480)] [huCD166Lc1_7614.8_2001 (SEQ ID NO: 313)] Secuencia de nucleótidos [CAGGGCCAGTCTGGACAGGGC][CTGTGTCACCCTCTGGTGGCCTCTGCCTGGGAGTCCTGTTCCT CCGGCGGTGGCTCCTCTGGCGGCTCCATCTCCTCTGGCCTGCTGTCCGGCAGATCCGACAACCACGG CGGAGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGCCCGTGACACCTGGCGAGCCTGCC TCCATCAGCTGCCGGTCCTCCAAGTCCCTGCTGCACTCCAACGGCATCACCTACCTGTACTGGTATC TGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATOTACOAGATGTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCC CGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGCGTGGAAGCCGAG GACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAACTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC TGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAA GTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGG AAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACA GCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGC CTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGCGGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 245)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3001 (SEQ ID NO: 314)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 246)
[espaciador (SEQ ID NO: 481)] [huCD166Lc1_7614.6_3001 (SEQ ID NO: 315)] Secuencia de nucleótidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [CAGGGACAGTCTGGCCAGGGC][CTGTGTCACCCTGCTGTGCTGTCTGCCTGGGAGTCCTGTTCCA GCGGCGGAGGCTCCTCTGGCGGCTCTGCTGTGGGCCTGCTGGCTCCACCTGGCGGCCTGTCCGGCAG ATCTGACAACCACGGCGGCTCCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGCCCGTGACTCCT GGCGAGCCTGCCTCCATCTCCTGCCGGTCCTCCAAGTCCCTGCTGCACTCCAACGGCATCACCTACC TGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACCAGATGTCCAACCTGGC CTCCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGG GTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAACTGCCCTACACCTTCGGCC AGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGA CGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCC AAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGG ACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGACTGAGCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGG GGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 247)
[espaciador (SEQ ID NO: 309)] [huCD166Lc1_7614.8_3001 (SEQ ID NO: 316)] Secuencia de aminoácidos [QG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEP ASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
] (SEQ ID NO: 248)
[espaciador (SEQ ID NO: 483)] [huCD166Lc1_7614.8_3001 (SEQ ID NO: 317)] Secuencia de nucleótidos [[CAGGGCC][TGTGTCACCCTCTGGTGGCCTCTGCCTGGGAGTCCTGTTCCTCCGGCGGAGGCTCC TCTGGCGGCTCTGCTGTGGGCCTGCTGGCTCCACCTGGCGGCCTGTCCGGCAGATCTGACAACCACG GCGGCTCCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGCCCGTGACTCCTGGCGAGCCTGCCTC CATCTCCTGCCGGTCCTCCAAGTCCCTGCTGCACTCCAACGGCATCACCTACCTGTACTGGTATCTG CAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACCAGATGTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCG ACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGA CGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAACTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTG GAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGT CCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAA GGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGC ACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCT GCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC] (SEQ ID NO: 478)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3001 (SEQ ID NO: 316)] Secuencia de aminoácidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLPV TPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC] (SEQ ID NO: 303)
[espaciador (SEQ ID NO: 482)] [huCD166Lc1_7614.8_CM2 (SEQ ID NO: 479)] Secuencia de nucleótidos [CAGGGCCAGTCTGGCCAGGGC][CTGTGTCACCCTCTGGTGGCCTCTGCCTGGGAGTCCTGTTCCT CCGGCGGAGGCTCCTCTGGCGGCTCTGCTGTGGGCCTGCTGGCTCCACCTGGCGGCCTGTCCGGCAG ATCTGACAACCACGGCGGCTCCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGCCCGTGACTCCT GGCGAGCCTGCCTCCATCTCCTGCCGGTCCTCCAAGTCCCTGCTGCACTCCAACGGCATCACCTACC TGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTCAGCTGCTGATCTACCAGATGTCCAACCTGGC CTCCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGG
Figure imgf000103_0001
AGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGA CGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCC AAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGG ACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCA CAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGG GGCGAGTGC (SEQ ID NO: 304)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.6_2001 (SEQ ID NO: 364)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 363)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.8_2001 (SEQ ID NO: 366)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 365)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.6_3001 (SEQ ID NO: 368)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 367)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.8_3001 (SEQ ID NO: 370)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLPV TPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 369)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.6_2007 (SEQ ID NO: 372)] Secuencia de aminoácidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 371)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.6_2007 (SEQ ID NO: 374)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 373)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3007 (SEQ ID NO: 376)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC] (SEQ ID NO: 375)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.6_3007 (SEQ ID NO: 378)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 377)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.6_2008 (SEQ ID NO: 380)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 379)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.6_2008 (SEQ ID NO: 382)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 381)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3008 (SEQ ID NO: 384)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC] (SEQ ID NO: 383)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.6_3008 (SEQ ID NO: 386)] Secuencia de aminoácidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 385)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.6_2011 (SEQ ID NO: 388)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 387)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.6_2011 (SEQ ID NO: 390)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 389)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3011 (SEQ ID NO: 392)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC] (SEQ ID NO: 391)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.6_3011 (SEQ ID NO: 394)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 393)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.6_2012 (SEQ ID NO: 396)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 395)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.6_2012 (SEQ ID NO: 398)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 397)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3012 (SEQ ID NO: 400)] Secuencia de aminoácidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK
ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC] (SEQ ID NO: 399)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.6_3012 (SEQ ID NO: 402)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 401)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.6_2013 (SEQ ID NO: 404)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 403)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.6_2013 (SEQ ID NO: 406)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE
PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 405)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3013 (SEQ ID NO: 408)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK
ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC] (SEQ ID NO: 407)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.6_3013 (SEQ ID NO: 410)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPAVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 409)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.8_2007 (SEQ ID NO: 412)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE
PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 411)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.8_2007 (SEQ ID NO: 414)] Secuencia de aminoácidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 413)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3007 (SEQ ID NO: 416)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK
ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC] (SEQ ID NO: 415)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.8_3007 (SEQ ID NO: 418)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 417)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.8_2008 (SEQ ID NO: 420)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 419)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.8_2008 (SEQ ID NO: 422)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 421)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3008 (SEQ ID NO: 424)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK
ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC] (SEQ ID NO: 423)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.8_3008 (SEQ ID NO: 426)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 425)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.8_2011 (SEQ ID NO: 428)] Secuencia de aminoácidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE
PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 427)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.8_2011 (SEQ ID NO: 430)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 429)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3011 (SEQ ID NO: 432)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK
ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC] (SEQ ID NO: 431)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.8_3011 (SEQ ID NO: 434)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 433)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.8_2012 (SEQ ID NO: 436)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE
PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 435)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.8_2012 (SEQ ID NO: 438)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 437)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3012 (SEQ ID NO: 440)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC] (SEQ ID NO: 439)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.8_3012 (SEQ ID NO: 442)] Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC):
Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 441)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.8_2013 (SEQ ID NO: 444)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 443)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614.8_2013 (SEQ ID NO: 446)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 445)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3013 (SEQ ID NO: 448)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC] (SEQ ID NO: 447)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614.8_3013 (SEQ ID NO: 450)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVASAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 449)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614_2001 (SEQ ID NO: 452)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 451)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614_2001 (SEQ ID NO: 454)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 453)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614_3001 (SEQ ID NO: 456)] Secuencia de aminoácidos
Cadena pesada de anticuerpo activable anti-CD166 (HuCD166_HcC): [[QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC] (SEQ ID NO: 455)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614_3001 (SEQ ID NO: 458)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 457)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614_2011 (SEQ ID NO: 460)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 459)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614_2011 (SEQ ID NO: 462)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 461)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614_3011 (SEQ ID NO: 464)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC] (SEQ ID NO: 463)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614_3011 (SEQ ID NO: 466)] Secuencia de aminoácidos [[QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIVMTQSPLSLP VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 465)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614_2012 (SEQ ID NO: 468)] Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C] (SEQ ID NO: 467)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL HuCD166Lc1_7614_2012 (SEQ ID NO: 470)] C a d e n a pe sad a de a n ticu e rp o ac tiva b le a n ti-C D 166 (H u C D 166 _ H cC ):
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGE
PASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
AEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 469)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614_3012 (SEQ ID NO: 472)] Secuencia de aminoácidos
[[QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK
ISRVEAEDVGVYYCAONLELPYTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC] (SEQ ID NO: 471)
[espaciador (SEQ ID NO: 305)] [Dominio VL huCD166Lc1_7614_3012 (SEQ ID NO: 474)] Secuencia de aminoácidos
[[QGQSGQG][LCHPLVLSAWESCSSGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGSDIVMTQSPLSLP
VTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLK
ISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGQGTKLEIK] (SEQ ID NO: 473)
EJEMPLO 3. Generación de anticuerpos anti-CD166 activables
Los estudios proporcionados en el presente documento se diseñaron para generar anticuerpos anti-CD166 activables de la descripción.
Se generaron anticuerpos activables anti-CD166 con diferentes eficiencias de enmascaramiento (es decir, una medición de la capacidad del MM del anticuerpo activable para bloquear la unión del AB del anticuerpo activable a su diana). Los péptidos 16522 y 7614 se mutaron por truncamiento y barrido de alanina como se describe en el Ejemplo 2, y estas variantes de péptidos de enmascaramiento se usaron para generar familias de anticuerpos activables anti-CD166 con un rango de enmascaramiento múltiple. La capacidad del anticuerpo anti-CD166 CD166 M9 vK1/HcB (VH de SEQ ID NO: 121, VL de SEQ ID NO: 123) y diversos anticuerpos activables anti-CD166 para unirse a CD166 humano se evaluó usando un ELISA de unión a CD166 (figura 3a , 3B). Los anticuerpos activables anti-CD166 ensayados incluyeron la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 121, la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 123, un resto escindible (CM) que comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70), denominado en el presente documento sustrato 2001, y uno de los restos de enmascaramiento mostrados en la Tabla 10. Las secuencias completas se han mostrado anteriormente en la Tabla 11.
Usando un protocolo ELISA estándar, la proteína CD166 humana se absorbe en placas ELISA y posteriormente se incubó con la concentración indicada de anticuerpo o anticuerpo activable. El anticuerpo unido o anticuerpo detectable se detectó con una FAB peroxidasa anti-humana secundaria. A continuación, en la Tabla 17, se muestra un resumen de las constantes de disociación (Kd) in vitro aparentes ejemplares de los anticuerpos activables de la presente invención con respecto al polipéptido CD166 según lo determinado por ELISA, así como el aumento respectivo en la Kd con respecto al anticuerpo anti-CD166 M9 parental (vk-1/HcB). Excepto para el anticuerpo anti-CD166 M9 parental, la máscara para cada anticuerpo activable es como se indica según se describe en el presente documento, y la secuencia del sustrato fue 2001 (ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70)).
T l 17: n n i i i n ELI A r n n i r n i- D1 iv l s
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0001
EJEMPLO 4. Activación de anticuerpos anti-CD166 activables
Los estudios proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la activación de anticuerpos anti-CD166 activables.
La figura 4 es un gráfico que representa la capacidad de diversos anticuerpos activables anti-CD166 de la descripción para unirse a CD166 humano cuando se activan proteolíticamente. Como se muestra en la figura 4, los anticuerpos activables anti-CD166 recuperan la unión del anticuerpo cuando se activan proteolíticamente. La unión del anticuerpo anti-CD166 (huM9 HcC/vk-1; VH de SEQ ID NO: 122, VL de SEQ ID NO: 123), diversos anticuerpos anti-CD166 activables de la descripción, y anticuerpos activables anti-CD166 activados por uPA se evaluó usando un ELISA de unión a CD166. Los anticuerpos activables anti-CD166 ensayados incluían la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 122, la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 123, cualquiera de un resto escindible (CM1, sustrato 2001) que comprendía la secuencia de aminoácidos ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70) o un resto escindible (CM2, sustrato 3001) que comprendía la secuencia de aminoácidos AVGLLa Pp GGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76), y uno de los restos de enmascaramiento mostrados en la Tabla 10. Las secuencias completas se han mostrado anteriormente en la Tabla 11.
Usando un protocolo ELISA estándar, la proteína CD166 humana se absorbe en placas ELISA y posteriormente se incubó con la concentración indicada de anticuerpo o anticuerpo activable. El anticuerpo unido o anticuerpo detectable se detectó con una FAB peroxidasa anti-humana secundaria.
En un estudio ejemplar, se determinó la afinidad de unión de los anticuerpos anti-CD166 (anti-CD166 HcC/vk-1 de la presente descripción y los anticuerpos activables anti-CD166 (anti-CD166-7614.6-3001) de la presente descripción a células humanas (células de cáncer de mama humano HCC1806) y CD166 humano. En estas condiciones, las afinidades de unión (Kd) ejemplares aparentes por ELISA son de 96,2 nM y 1,3 nM para el anticuerpo activable anti-CD166 y el anticuerpo anti-CD166 de la presente descripción, respectivamente. En el ensayo de unión de células HCC1806 ejemplar medido por citometría de flujo, las afinidades de unión aparentes (Kd) son de 372 nM y 3,2 nM para el anticuerpo activable anti-CD166 y el anticuerpo anti-CD166 de la presente descripción, respectivamente. Los resultados ejemplares demostraron que el anticuerpo activable anti-CD166, en un estado sin escindir, demostró una menor afinidad de unión al polipéptido CD166 aislado y CD166 en las células, en comparación con el anticuerpo anti-CD166 de la presente descripción.
La figura 5 es un gráfico que representa la capacidad de diversos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados de la descripción para efectuar la destrucción celular de células HCC1806 cuando se activan proteolíticamente con uPA.
Estos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados también se denominan en el presente documento "CD166 AADC" o conjugados de anticuerpo activable CD166-fármaco (Activatable Antibody Drug Conjugates). Los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados ensayados incluían la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 122, la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 123, un resto escindible (CM1, sustrato 2001) que comprendía la secuencia de aminoácidos ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70), uno de los restos de enmascaramiento mostrados en la Tabla 10, y el maitansinoide DM4 conjugado con el anticuerpo activable a través de un enlazador SPDB. Las secuencias completas de los anticuerpos activables se han mostrado anteriormente en la Tabla 11. Todos los anticuerpos activables conjugados descritos en el presente documento se produjeron por TCRS (The Chemistry Research Solution).
Como se muestra en la figura 5, diversos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados de la descripción se comportan como el isotipo-DM4 cuando se enmascaran, pero cuando se activan proteolíticamente con uPA, estos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados muestran una muerte celular similar a la del huCD166 ADC. La capacidad de los conjugados farmacológicos para destruir las células HCC1806 se evaluó añadiendo la concentración indicada de ADC o AADC e incubando las células durante 3 días. La viabilidad celular se midió usando el ensayo CellTiter Glo. Se observaron resultados similares cuando se ensayó un anticuerpo activable conjugado con un agente de daño al ácido nucleico en dichos ensayos de destrucción celular.
Los siguientes estudios se diseñaron para evaluar la activación y la unión de anticuerpos activables anti-CD166 en muestras de tumor tras la exposición a una o más proteasas.
Se analizaron muestras tumorales de xenoinjerto y muestras de tejido sano usando análisis inmunohistoquímico (IHC) y un ensayo de formación de imágenes in situ que se describe en la publicación PCT N.° WO 2014/107599. Brevemente, este ensayo in situ utiliza un anticuerpo anti-CD166 activable de la descripción, el anticuerpo parental correspondiente, y una versión modificada del anticuerpo anti-CD166 activable en el que el CM se reemplaza con un enlazador no escindible, al que se hace referencia en el presente documento generalmente como anticuerpo anti-CD166 modificado por NSUB. El anticuerpo parental se usa como control positivo, mientras que la versión no escindible del anticuerpo anti-CD166 activable se usa como control negativo. A continuación se colocan secciones de tejido congelado de xenoinjerto en el portaobjetos de vidrio, se aclaran dos veces con PBS-T seguido de PBS, seguido de 30 minutos de pretratamiento del tejido con cóctel de inhibidores de proteasa de amplio espectro o tampón en solitario. A continuación un marcador detectable tal como Alexa Fluor-680® se conjuga con cada uno del anticuerpo anti-CD166 activable y el anticuerpo modificado por NSUB anti-CD166. El anticuerpo anti-CD166 activable marcado de forma detectable y el anticuerpo modificado por NSUB anti-CD166 se aplican a continuación sobre el tejido y se incuban durante una hora en la oscuridad (para evitar el blanqueo de la fluorescencia). Después de la incubación con 1 |jg/ml de las secciones tumorales incubadas se aclararon tres veces con PBS-T seguido de PBS y se contratiñeron con marcador nuclear DAPI durante 1 minuto. El análisis de microscopía de fluorescencia se utiliza a continuación para detectar la tinción positiva. La tinción positiva del anticuerpo anti-CD166 activable que se elimina mediante el pretratamiento de las secciones de tejido con inhibidores de proteasa indica que la unión del anticuerpo anti-CD166 activable a la muestra de tejido es el resultado del evento proteolítico. La tinción positiva del anticuerpo anti-CD166 activable también debe eliminarse cuando el tejido se trata previamente con un exceso de anticuerpo parental no marcado ("frío"). Además, la incubación del tejido tumoral debe revelar una tinción positiva para el anticuerpo parental que no se ve afectado por el pretratamiento del tejido con inhibidores de la proteasa, pero se elimina cuando el tejido se trata previamente con un anticuerpo parental no marcado. No debe detectarse ninguna señal para el anticuerpo modificado por NSUB anti-CD166 detectado en el tejido pretratado, en el tejido no pretratado con inhibidores de proteasa, o en el tejido pretratado con anticuerpo parental no marcado.
Las figuras 6A-6D son una serie de imágenes que demuestran que el anticuerpo anti-CD166 activable se activa (es decir, se escinde) en muestras de tejido de cáncer de colon, y el anticuerpo anti-CD166 activable no se activa en muestras de tejido sano. Las figuras 6a y 6C representan los resultados del análisis IHC en las muestras de tumor y de tejido sano, y las figuras 6B y 6D representan los resultados del ensayo de imagen in situ en las muestras de tumor y de tejido sano.
Las figuras 7A-7D son una serie de imágenes que demuestran que el anticuerpo anti-CD166 activable se activa (es decir, se escinde) en muestras de tejido de cáncer de pulmón, y el anticuerpo anti-CD166 activable no se activa en muestras de tejido sano. Las figuras 7A y 7C representan los resultados del análisis IHC en las muestras de tumor y de tejido sano, y las figuras 7B y 7D representan los resultados del ensayo de imagen in situ en las muestras de tumor y de tejido sano.
Las figuras 8A-8D son una serie de imágenes que demuestran que el anticuerpo anti-CD166 activable no se activa en muestras de tejido sano. Las figuras 8A y 8C representan los resultados del análisis IHC en las muestras de tejido sano, y las figuras 8B y 8D representan los resultados del ensayo de imagen in situ en las muestras de tejido sano.
EJEMPLO 5. Potencia de los anticuerpos anti-CD166 conjugados
Este ejemplo demuestra que un anticuerpo anti-CD166 conjugado de la descripción ("CD166 ADC") muestra actividad de destrucción in vitro en comparación con un conjugado de anticuerpo de control ("ADC de control").
La figura 9 es una serie de gráficos que representan la potencia de un anticuerpo anti-CD166 conjugado de la descripción contra una línea celular de cáncer de mama, una línea celular de cáncer de próstata, una línea celular de cáncer de páncreas, una línea celular de cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, y una línea celular CD166 como control negativo.
EJEMPLO 6. Eficacia de anticuerpos anti-CD166 activables conjugados en modelos de tumor
Este ejemplo demuestra la eficacia de un anticuerpo anti-CD166 activable conjugado de la descripción ("CD166 AADC" o conjugado de anticuerpo activable CD166-fármaco (Activatable Antibody Drug Conjugate)) en diversos modelos de cáncer.
La figura 10 es un gráfico que representa la eficacia de un AADC que incluye un anticuerpo anti-CD166 activable de la descripción conjugada con el maitansinoide DM4, en comparación con un control conjugado con isotipo DM4, y un ADC que incluye una versión conjugada de DM4 del anticuerpo parental para el anticuerpo anti-CD166 activable. La eficacia se mide como el volumen tumoral medio medido en diversos puntos de tiempo después de la administración (5 mg/kg IV los días 1 y 8) en un modelo de cáncer de mama.
Como se muestra en la figura 10, la eficacia del AADC es equivalente a la eficacia observada con el ADC.
La figura 11 es un gráfico que representa la eficacia de los anticuerpos anti-CD166 activables de CD166 de la descripción, en comparación con el control conjugado con isotipo DM4, y el anticuerpo anti-CD166 parental conjugado con CD166 ADC DM4. La eficacia se mide como el volumen tumoral medio medido en diversos puntos de tiempo después de la administración (5 mg/kg IV los días 1 y 8) en el modelo de cáncer de pulmón de células no pequeñas H292 (NSCLC).
Los tumores de xenoinjerto H292 se trataron con control de isotipo-DM4, huCD166-DM4 ADC, huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC, o huCD166_7614.6_CM1-DM4 ADDC, donde CM1 y CM2 son los sustratos 2001 y 3001 descritos en el presente documento, respectivamente. Los tumores crecieron hasta un promedio de 150 mm3, a continuación, los ratones se asignaron al azar en grupos de ocho y se dosificaron los días 1 y 8 con los artículos de prueba indicados. Se representa el volumen tumoral medio ± SEM.
Como se muestra en la figura 11, la eficacia de ambos AADC ensayados es equivalente a la eficacia observada con el ADC.
La figura 12 es un gráfico que representa la eficacia del anticuerpo anti-CD166 activable conjugado CD166 AADC DM4, también denominado en el presente documento huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC (donde CM2 es el sustrato 3001), en comparación con el control conjugado con el isotipo-DM4, y el anticuerpo anti-CD166 parental conjugado con CD166 ADC DM4. La eficacia se mide como el volumen tumoral medio medido en diversos puntos de tiempo después de la administración (5 mg/kg IV los días 1 y 8) en el modelo de cáncer de pulmón de células no pequeñas H1975 (NSCLC).
Como se muestra en la figura 12, la eficacia del AADC es equivalente a la eficacia observada con el ADC.
EJEMPLO 7. Análisis de tolerabilidad de anticuerpos anti-CD166 activables
Los anticuerpos anti-CD166 de la descripción se caracterizaron por su especificidad de especie hacia la unión al CD166 humano y otras proteínas estrechamente relacionadas.
Como se muestra en la figura 13, los anticuerpos anti-CD166 de la descripción se unen a CD166 humano y de mono Cynomolgus con afinidad equivalente. Ninguno de los anticuerpos anti-CD166 de la descripción ensayados se unió a CD166 de rata o ratón. La Kd de unión del anticuerpo anti-CD166 al CD166 humano y al CD166 de cynomolgus en estos estudios de unión ejemplares es de 1,3 nM para ambos.
A continuación, se analizaron los niveles de expresión de CD166 en diversos tipos de tejido normal humano y de mono de cynomolgus. Como se muestra en la Tabla 3 a continuación, los niveles de expresión de CD166 fueron casi idénticos a los de las muestras de tejido humano y de mono cynomolgus analizadas:
Tabla . Niv l x r i n D1 n m r i n rm l r h m n n molgus
Figure imgf000115_0001
Se detectó una expresión de CD166 significativa en muestras de tejido hepático tanto humano como de cynomolgus.
En los estudios farmacocinéticos iniciales, se descubrió que los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados de la descripción evitan la pérdida de antígeno (es decir, la depuración rápida de anticuerpos debido a la abundancia de antígeno CD166 expresado naturalmente en todo el cuerpo).
La figura 14 demuestra los resultados de un estudio de tolerabilidad en monos cynomolgus usando la administración de 5 mg/kg de un anticuerpo activable anti-CD166 conjugado de la descripción. Estos estudios se realizaron con huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC (donde CM2 es el sustrato 3001). Se seleccionaron 5 mg/kg, ya que es la dosis terapéutica utilizada para otros conjugados de anticuerpos DM4 que incluyen una unión SPDB.
La farmacocinética del conjugado de fármaco huCD166-7614.6-CM1 DM4 (donde CM1 es el sustrato 2001) y el anticuerpo huCD166 no conjugado se evaluaron en monos cynomolgus después de una dosis única de 5 mg/kg o 3 mg/kg, respectivamente. Los niveles séricos totales de IgG humana se midieron usando un ELISA de tipo sándwich de anti-IgG humana. Consistente con evitar las pérdidas específicas, el CD166 AADC mostró una exposición significativamente mayor que el anticuerpo. Los monos tratados con el conjugado farmacológico huCD166-7614.6-CM1 DM4 no tenían toxicidades observables. Después de 21 días, no hubo observaciones clínicas, ni signos de toxicidad específica, ni signos de toxicidad hepática. Como se muestra en la figura 14, la depuración de un conjugado de anticuerpo anti-CD166 DM4 se comparó con el anticuerpo parental. La unión al antígeno estaba por debajo del nivel de cuantificación.
La figura 15 es un gráfico que demuestra que el anticuerpo activable anti-CD166 conjugado es bien tolerado a la dosis terapéutica proyectada. Estos estudios se realizaron usando huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC (donde CM2 es el sustrato 3001).
Por lo tanto, a diferencia de la terapia ADC tradicional, no hay evidencia de daño hepático en los monos cynomolgus de sp u é s de la ad m in is tra c ió n de un an ticu e rp o ac tiva b le a n ti-C D 166 co n ju g a d o de la descripc ión .
EJEMPLO 8. Activación dependiente de proteasa de anticuerpos activables anti-CD166
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la activación dependiente de proteasa de anticuerpos activables anti-CD166 activables y anticuerpos activables conjugados de la descripción.
Las figuras 16A, 16B y 16C son gráficos que representan la capacidad de diversos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados con anti-CD166 de la descripción para unirse a CD166 humano en células HCC1806 en presencia o ausencia de activación dependiente de proteasa. Estos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados también se denominan en el presente documento "CD166 AADC" o "conjugados de anticuerpo activable CD166-fármaco (Activatable Antibody Drug Conjugates)". Como se muestra en la figura 16A, los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados están bloqueados para que no se unan a CD166 en las células HCC1806. En contraste, como se muestra en las figuras 16B y 16C, los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados recuperan la actividad de unión del anticuerpo que es similar a la actividad de unión del anticuerpo anti-CD166 conjugado enmascarado y el anticuerpo anti-CD166 no enmascarado cuando los AADC se activaron proteolíticamente con matriptasa (MT-SP1) o metaloproteasa de matriz 14 (MMP-14).
La unión del anticuerpo anti-CD166 (VH de SEQ ID NO: 122, VL de SEQ ID NO: 123), diversos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados y no conjugados de la descripción, y anticuerpos activables anti-CD166 conjugados activados por proteasa de la descripción se evaluaron usando un ensayo de unión basado en citometría de flujo. Los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados y no conjugados ensayados incluían la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 122, la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 123, cualquiera de un resto escindible (CM1, sustrato 2001) que comprendía la secuencia de aminoácidos ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70) o un resto escindible (CM2, sustrato 3001) que comprendía la secuencia de aminoácidos AVGLLAPPGGLSGRSDn H (SEQ ID NO: 76), y uno de los restos de enmascaramiento mostrados en la Tabla 10. Las secuencias completas se han mostrado anteriormente en la Tabla 11. Los anticuerpos anti-CD166 conjugados y los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados incluían el maitansinoide DM4 conjugado con el anticuerpo activable a través de un enlazador SPDB. En un ensayo típico, las células HCC1806 se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-CD166, anticuerpo activable, anticuerpo conjugado o anticuerpo activable en PBS FBS al 2 % durante 1 h en hielo. Después del lavado 2X con PBS FBS al 2 %, las células se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humano de cabra, conjugado con AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch), durante 30-45 min en hielo. A continuación, las células se lavaron 2X con PBS FBS al 2 % y se fijaron con formaldehído al 1 %. El anticuerpo unido se detectó utilizando un citómetro Guava EasyCyte y se midió la mediana de intensidad de fluorescencia (MFI) de la población celular.
Como se muestra en la figura 16A, los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados están bloqueados para que no se unan a CD166 en las células HCC1806. Como se muestra en las figuras 16B y 16C, diversos anticuerpos activables anti-CD166 conjugados y no conjugados de la descripción se comportan similares entre sí cuando se enmascaran, pero cuando los anticuerpos activables anti-CD166 conjugados se activaron proteolíticamente con una proteasa, mostraron una unión similar a la del anticuerpo parental huCD166 no enmascarado y el huCD166 ADC no enmascarado.
EJEMPLO 9. Unión de conjugados de anticuerpo anti-CD166 activable-fármaco a tejidos humanos
Los estudios ejemplares en este Ejemplo muestran las propiedades de unión de los conjugados de anticuerpo anti-CD166-fármaco (ADC) y los conjugados de anticuerpo anti-CD166 activable-fármaco (AADC) de la presente descripción a tejidos humanos.
En este estudio, las secciones de tejido congelado derivadas de próstata humana normal, ovario, seno, páncreas y aurícula derecha (Cat. N.° T1234201, T1234086, T1234183, T1234188, y T1234127, respectively; BioChain, Newark, CA) se prepararon y se bloquearon usando protocolos estándar, y a continuación se incubaron con 0,4 pg/ml con un anti-CD166 ADC de la presente descripción (anti-CD166-spdb-DM4), un anti-CD166 AADC de la presente descripción (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4), un anti-CD166 AADC activado de la presente descripción (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4 incubado con uPA purificada durante 16 horas a 37 °C), o un ADC de control de isotipo (chKTI- spdb-DM4, una anticuerpo inhibidor de tripsina anti-soja de IgG1 humana quimérica, conjugado con spdb-DM4). Después de la incubación con los artículos de prueba, las secciones se trataron con 2,5 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-DM4 de ratón (Immunogen). La detección de la carga útil de DM4 se logró mediante la incubación con un anticuerpo anti-ratón conjugado con un polímero HRP (EnvisionTM polímero marcado con System-HRP anti-ratón, Dako, K4006) seguido de la adición de un sustrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB Plus, Dako, K3467). Los tejidos se contratiñeron con hematoxilina y las imágenes se adquirieron en un escáner de portaobjetos virtuales Olympus VS120.
Los resultados ejemplares de este estudio mostraron que el anti-CD166 AADC de la presente descripción (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4) mostró una falta de inmunotinción en cada una de las cinco secciones de tejido humano en consonancia con su estado enmascarado, y similar al observado con el ADC de control de isotipo. La activación del anti-CD166 AADC de la presente descripción por uPA restableció la unión del anti-CD166 AADC activado en dos de los tejidos de más alta expresión, próstata y mama. La intensidad de la tinción y la distribución del anti-CD166 AADC activado por uPA de la presente descripción fueron similares a las del conjugado de anticuerpo anti-CD166 parentalfármaco (anti-CD166-spdb-DM4).
EJEMPLO 10. Unión de anticuerpos anti-CD166 a cánceres humanos
Este ejemplo muestra que CD166 se expresa en una diversidad de tumores derivados de pacientes mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) usando un anticuerpo anti-CD166.
En este estudio, se prepararon muestras de tumor incorporadas en parafina fijadas con formalina (FFPE) en micromatrices de tejido (US Biomax) y se bloquearon usando protocolos estándar, y a continuación se incubaron con 5 |jg/ml de anticuerpo monoclonal de conejo anti-CD166 EPR2759[2] (Abcam, ab109215). La detección del anticuerpo anti-CD166 se realizó mediante incubación con 5 jg/m l de anticuerpo de burro anti-IgG de conejo conjugado por biotinilación (Jackson Immunoresearch, 711-065-152), seguido de la adición de ABC-HRP Elite Standard (Vector Laboratories, PK -6100) para formar el complejo avidina-biotina-HRP, seguido de la adición de un sustrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB Plus, Dako, K3467). Los tejidos se contratiñeron con hematoxilina y las imágenes se adquirieron en un escáner de portaobjetos virtuales Olympus VS120.
A cada núcleo de tejido se le asignó una puntuación IHC de "negativo" (sin tinción), "débil" (intensidad 1+ en <70 % de las células tumorales o 2+ en <30 % de las células tumorales), "moderado" (intensidad 1+ en >70 % de las células tumorales o 2+ en >30 % a <70 % de las células tumorales o 3+ en <30 % de las células tumorales), o "fuerte" (intensidad 2+ en >70 % de las células tumorales o 3+ en >30 % de las células tumorales), y el porcentaje de muestras ensayadas que muestran tinción IHC "moderada" o "fuerte" para anti-CD166 se muestran en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4: Ensa o IHC de la expresión de CD166 en cánceres derivados de pacientes
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EJEMPLO 11. Unión de los anticuerpos anti-CD166 a células humanas y de cynomolgus
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar los anticuerpos activables anti-CD166 de la descripción para la unión a células humanas y de cynomolgus en un ensayo de citometría de flujo.
La figura 17 es un gráfico que representa la capacidad de un anticuerpo anti-CD166 (anti-huCD166) de la descripción para unirse a células H292 humanas o células epiteliales de riñón primario de cynomolgus, según lo medido por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 17, los anticuerpos anti-CD166 de la presente descripción demostraron afinidades de unión comparables a CD166 en la superficie celular tanto de células humanas como de cynomolgus.
La unión del anticuerpo anti-CD166 (huM9 vk-1/HcC; VH de SEQ ID NO: 122, VL de SEQ ID NO: 123) de la presente descripción a células H292 humanas y células epiteliales renales primarias de cynomolgus se evaluó utilizando un ensayo de unión basado en citometría de flujo. En un ensayo típico, las células H292 o las células epiteliales renales primarias de cynomolgus se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-CD166 en PBS FBS al 2 % durante 1 h en hielo. Después del lavado 2X con PBS FBS al 2 %, las células se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humano de cabra, conjugado con AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch), durante 30-45 min en hielo. A continuación, las células se lavaron 2X con PBS FBS al 2 % y se fijaron con formaldehído al 1 %. El anticuerpo unido se detectó utilizando un citómetro Guava EasyCyte y se midió la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la población celular.
Como se muestra en la figura 17, un anticuerpo anti-CD166 de la presente descripción se unió a células humanas y de cynomolgus con afinidad comparable (CE50 de 3,1 nM para células humanas, y CE50 de 1,7 nM para células de cynomolgus).
EJEMPLO 12. Inhibición de la unión celular a CD6 por los anticuerpos anti-CD166
En este estudio ejemplar, los anticuerpos anti-CD166 de la presente descripción demuestran la capacidad de bloquear la adhesión de células de linfoma humano a CD6 inmovilizado, el receptor para el cual CD166 es el ligando.
La figura 18 es un gráfico que representa la capacidad de un anticuerpo anti-CD166 (anti-huCD166; vk-1/HcC) de la presente descripción para bloquear la adhesión de células de linfoma humano HuT-78 a CD166 humano inmovilizado. En este ensayo, las células HuT-78 que expresan CD166 se marcan con fluorescencia y se incuban con proteína CD6 recombinante inmovilizada en placas de plástico. Después de varios lavados, las células HuT-78 unidas se detectan midiendo la fluorescencia y se informan como un porcentaje de la fluorescencia total (antes del lavado). MAB656 es un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD166 que, según se informa, inhibe la adhesión celular en este ensayo (R&D Systems), presumiblemente al interrumpir la interacción CD166 con su receptor, CD6. En este ensayo ejemplar, el anticuerpo anti-CD166 de la presente descripción y MAB656 mostraron niveles similares de inhibición de la adhesión celular a CD6. Ambos anticuerpos mostraron casi una CE50 de aproximadamente 3,7 nM. Un anticuerpo de control de isotipo no mostró inhibición de la adhesión celular.
EJEMPLO 13. Activación dependiente de proteasa de anticuerpos activables anti-CD166
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la activación dependiente de proteasa de anticuerpos anti-CD166 activables y anticuerpos activables conjugados de la descripción.
La figura 19A es un gráfico que representa la unión in vitro a CD166 en un ensayo ELISA de un anticuerpo anti-CD166 (anti-huCD166 HcC/vk-1, "Cd 166 Ab"), un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), un anticuerpo activable anti-CD166 (anti-CD166-7614.6-3001, "CD166 Pb"), un conjugado de anticuerpo activable-fármaco (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"). Como se indicó, los ensayos también se realizaron con conjugado de anticuerpo activable anti-CD166 activado con proteasa-fármaco, usando urocinasa (uPA), matriptasa (MT-SP1) o metaloproteasa de matriz 14 (MMP14) como se indica. Usando un protocolo ELISA estándar, la proteína CD166 humana se absorbió en placas ELISA y posteriormente se incubó con la concentración de anticuerpo indicada. El anticuerpo unido se detectó con un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante.
Las figuras 19B y 19C son gráficos que representan la unión a células HCC1806 o H292 humanas en un ensayo de citometría de flujo de un anticuerpo anti-CD166 (anti-huCD166 HcC/vk-1, "CD166 Ab"), un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), un anticuerpo activable anti-CD166 (anti-CD166-7614.6-3001, "CD166 Pb"), un conjugado de anticuerpo activable-fármaco (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"). Como se indicó, los ensayos también se realizaron con conjugado de anticuerpo activable anti-CD166 activado con proteasa-fármaco, usando urocinasa (uPA), matriptasa (MT-SP1) o metaloproteasa de matriz 14 (MMP14) como se indica. Como control, también se ensayó el anticuerpo de isotipo IgG1 conjugado con spdb-DM4 ("ADC de isotipo IgG1"). En un ensayo típico, las células H292 o las células HCC1806 se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-CD166 en PBS FBS al 2 % durante 1 h en hielo. Después del lavado 2X con PBS FBS al 2 %, las células se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humano de cabra, conjugado con AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch), durante 30-45 min en hielo. A continuación, las células se lavaron 2X con PBS FBS al 2 % y se fijaron con formaldehído al 1 %. El anticuerpo unido se detectó utilizando un citómetro Guava EasyCyte y se midió la mediana de intensidad de fluorescencia (MFI) de la población celular.
T l 14: ni n l n r i n n i r n i- D1 D1 l l h m n
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Como se muestra por los resultados ejemplares en la Tabla 14, el CD166-AADC no escindido demostró una Kd aparente aumentada en comparación con el CD166-ADC no enmascarado en ensayos ELISA y de citometría de flujo. La activación del CD166-AADC por las tres proteasas pareció restaurar la afinidad de unión del conjugado de anticuerpo anti-CD166 activable-fármaco a un nivel comparable al del CD166-ADC no enmascarado.
Las figuras 20A y 20B son gráficos que representan la citotoxicidad in vitro para células humanas HCC1806 o H292 de un anticuerpo anti-CD166 (anti-huCD166 HcC/vk-1, "CD166 Ab"), un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), un anticuerpo activable anti-CD166 (anti-CD166-7614.6-3001, "CD166 Pb"), un conjugado de anticuerpo activable-fármaco (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"). Como se indicó, los ensayos también se realizaron con conjugado de anticuerpo activable anti-CD166 activado con proteasa-fármaco, usando urocinasa (uPA), matriptasa (MT-SP1) o metaloproteasa de matriz 14 (MMP14) como se indica. Como control, también se ensayó el anticuerpo de isotipo IgG1 conjugado con spdb-DM4 ("ADC de isotipo IgG1"). En un ensayo típico, las células H292 o las células HCC1806 se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpo, anticuerpo activable, conjugado de anticuerpo activable-fármaco o conjugado de anticuerpo activable-fármaco tratado con proteasa, y se incubaron las células durante 3 a 5 días. La viabilidad celular se midió usando el ensayo CellTiter Glo. Los resultados de estos ensayos de citotoxicidad se resumen a continuación en la Tabla 15.
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Estos resultados ejemplares de la Tabla 15 y las figuras 20A y 20B demuestran que los conjugados de anticuerpo anti-CD166 activable-fármaco (CD166-AADC) de la presente descripción que se activan proteolíticamente con proteasa que reconocen la secuencia de sustrato (CM) muestran un aumento múltiple de la citotoxicidad a las células humanas en comparación con el anti-CD166 AADC no escindido correspondiente. Además, el anti-CD166 AADC activado demuestra una citotoxicidad que es comparable al anti-CD166 ADC no enmascarado.
EJEMPLO 14. Ensayo de riesgo inmunológico de los anticuerpos anti-CD166 activables
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la capacidad de los conjugados de anticuerpo anti-CD166 activable-fármaco (CD166-AADC) de la presente descripción para desencadenar una respuesta inmunitaria en un ensayo in vitro.
En estos estudios ejemplares, las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se ensayaron en in vitro para determinar la liberación y proliferación de citocinas en respuesta al tratamiento con un conjugado de anticuerpo anti-CD166 activable-fármaco (anti-CD166-7614.6-3001-spdb- DM4, "CD166-AADC"), un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco (anti-CD166 (vk-1/HcC)-spdb-DM4, "CD166-ADC"), un control positivo anti-CD3 (anticuerpo OKT3), y un conjugado farmacológico de anticuerpo de control de isotipo ("Isotipo") en las siguientes concentraciones:
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En este estudio ejemplar, se evaluaron cinco donantes sanos normales en dos formatos separados, artículo de prueba de capa húmeda y soluble. Se midió un panel estándar de citocinas Th1 y Th2 que incluía IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa e IFNy 24 h después del tratamiento. Como se muestra en la figura 21A-21D, el ajuste de la dosis de CD166-AADC o del CD166-ADC correspondiente no mostró una liberación significativa de citocinas de los PBMC humanos, en comparación con un control positivo (anti-CD3, OKT3) y anticuerpos de control negativo (isotipo ADC). Además, a diferencia del anticuerpo de control positivo OKT3, ni CD166-AADC ni CD166-ADC indujeron la proliferación de PBMC, evaluada el día 8 después del tratamiento.
EJEMPLO 16. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de anticuerpos anti-CD166 activables conjugados
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) in vitro para células humanas de conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción.
La figura 22 es un gráfico que representa un ensayo ADCC in vitro en células de adenocarcinoma de ovario humano (SKOV3) usando un conjugado de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción (anti-huCD166 (HcC/vk-1)-7614.6-3001-spdb-DM4, "CDl66-AADC"), un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), un control positivo anti-EGFR, y un control de isotipo IgG1-spdb-DM4 ("ADC de isotipo IgG1")
Las actividades de ADCC en este ensayo ejemplar se evaluaron usando un bioensayo informador ADCC (Promega). En este ensayo, los linfocitos T de Jurkat transfectados de manera estable con FcRYlIIa y un indicador de luciferasa inducible por NF-AT se incubaron con células SKOV3 que expresaban CD166 en presencia de CD166-AADC o anticuerpos de control. La actividad de la luciferasa se estimula en función de la unión del anticuerpo a las células diana, el acoplamiento del receptor FcRYlIIa y la señalización aguas abajo en las células efectoras. En las células SKOV3, que expresan altos niveles de CD166 y EGFR, la incubación con CD166-AADC o CD166-ADC mostró una actividad similar a un ADC de control de isotipo IgG1, y menor que la observada con el anticuerpo anti-EGFR de control positivo. Ajuste de dosis de CD166-AADC o CD166-ADC en el ensayo. Estos datos sugieren que CD166-AADC, así como CD166-ADC, tienen un potencial limitado para ADCC.
EJEMPLO 17. Eficacia de los anticuerpos anti-CD166 activables conjugados contra modelos tumorales de xenoinjerto derivado de células y de pacientes
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la eficacia in vivo de conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción contra xenoinjertos derivados de células y pacientes en un modelo de tumor de ratón.
En estos estudios ejemplares, se ensayaron múltiples modelos de xenoinjerto derivado de línea celular humana y derivado de paciente (PDX) que representan diversos tipos de cáncer. Dos modelos de xenoinjerto derivado de la línea celular (células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas H292 (NSCLC) y células de carcinoma de mama triple negativo HCC1806), y dos modelos de xenoinjerto derivado de paciente (PDX) para carcinoma de ovario (CTG-0791) y colangiocarcinoma (CTG-0941). Para cada modelo, los ratones portadores de tumor se asignaron al azar en grupos y el tratamiento se comenzó con un conjugado de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción (anti-huCD166 (HcC/vk-1)-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166 -AADC"), un conjugado SPDB-DM4 de control de isotipo, o un vehículo de control como se indica. Los artículos de prueba se administraron por vía intravenosa los días de estudio 0 y 7, a 3 o 5 mg/kg como se indica.
Como se representa en la figura 23, el tratamiento con CD166-AADC, en o por debajo de la dosis terapéutica esperada en seres humanos, condujo a regresiones tumorales y respuestas duraderas en la mayoría de los ratones. Otros estudios ejemplares similares se resumen en la Tabla 16 a continuación.
T l 1 : Efi i l n n i r iv l n i- D1 -f rm
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EJEMPLO 18.Citotoxic¡dad in v i t r o de anticuerpos anti-CD166 activables conjugados contra líneas celulares derivadas de cáncer de endometrio
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la eficacia in vitro de conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción contra líneas celulares derivadas de cáncer de endometrio.
Como se muestra en las figuras 24A-24C, estos estudios ejemplares mostraron la citotoxicidad in vitro contra líneas celulares derivadas de cáncer de endometrio de útero humano (líneas celulares HEC-1-A, AN3-CA, y KLE) de un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), y conjugados de anticuerpo activable-fármaco (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-7614.6-AADC"; y anti-CD166-7614.8-3001-spdb-DM4, "CD166-7614.8-AADC"). Se usó un control de isotipo-ADC (chKTI-spdb-DM4) como control. En un ensayo típico, las células se incubaron con las concentraciones indicadas de conjugado de anticuerpo-fármaco, o conjugado de anticuerpo activable-fármaco, y se incubaron las células durante 3 a 5 días. La viabilidad celular se midió usando el ensayo CellTiter Glo. Estos resultados ejemplares mostraron que los anti-CD166-AADC y los anti-CD166-ADC de la presente descripción demostraron citotoxicidad contra todas las líneas celulares en comparación con el control negativo. Estos resultados ejemplares también mostraron que los anti-CD166-AADC no escindidos mostraron una citotoxicidad inferior que los anti-CD166-ADC de la presente descripción debido a su menor afinidad con respecto a la diana debido al sustrato de máscara. La susceptibilidad relativa de las líneas celulares con respecto a los artículos anti-CD166 de la presente descripción parecía correlacionarse con el nivel de expresión de CD166 en cada célula. Como se muestra en la figura 24D, para determinar la cantidad relativa de CD166 expresado en superficie en cada línea celular de endometrio, se realizó un ensayo de citometría de flujo usando anti-CD166 de la presente descripción.
EJEMPLO 18. C ito to x ic id a d in v i t r o de conjugados de anticuerpo anti-CD166 conjugado-fármaco contra diversas líneas celulares derivadas de cáncer
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la eficacia in vitro de conjugados de anticuerpo anti-CD166-fármaco de la presente descripción contra líneas celulares derivadas de cáncer de endometrio.
En estos estudios ejemplares, la citotoxicidad in vitro de conjugados de anticuerpo anti-CD166-fármaco (anti-CD166 (vk-1/HcC)-spdb-DM4, "CD166-ADC") se ensayó contra múltiples líneas celulares derivadas de cáncer humano. En un ensayo típico, las células se incubaron con concentraciones de CD166-ADC durante 3 a 5 días a diversas concentraciones (de 0,1 nM a 50 nM). La viabilidad celular se midió usando el ensayo CellTiter Glo. La citotoxicidad del CD166-ADC se comparó con un control de isotipo negativo (chKTI-spdb-DM4. En el caso de la línea celular de cáncer de próstata PC3 y las líneas celulares de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello SAS, el artículo ensayado era anti-CD166-vc-MMAD, y el control negativo era palivizumab-vc-MMAD isotípico. Los resultados de estos ensayos de citotoxicidad se resumen a continuación en la Tabla 8.
Tabla 8: Citotoxicidad in v i t r o de un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco con respecto a células de cáncer humanas
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EJEMPLO 19: Imágenes in v iv o de anticuerpos anti-CD166 activables en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón de ratón
Este ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD166 activables de la presente descripción demuestran una activación in v ivo dependiente de proteasa asociada a tumor y la unión a CD166 expresado en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón (NSCLC) de ratón mediante imagen fluorescente in vivo.
La figura 25A muestra imágenes in v ivo de ratones vivos con xenoinjertos de tumor de pulmón (células H292) usando anticuerpos anti-CD166 activables y anti-CD166 conjugados por fluorescencia de la presente descripción. En este estudio, a ratones hembra n u /n u de 7-8 semanas de edad (n = 3) se les implantó por vía subcutánea en el costado posterior derecho 5 x 106 células H292, una línea celular derivada de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano. Después del crecimiento de los tumores de 300 a 380 mm3, se administraron un anticuerpo anti-CD166 (vk-1/HcC) de la presente descripción ("CD166-Ab"), anticuerpos anti-CD166 activables con diferentes secuencias de máscara y secuencias de sustrato de la presente descripción (anti-CD166-7614.6-3001, anti-CD166-7614.8-2001), o un anticuerpo anti-CD166 enmascarado de la presente descripción que carece de un dominio CM ("CD166 7614.6-NSUB") como un reactivo de prebloqueo para cada uno de los ratones a una dosis de 5 mg/kg. Como control, se administró un anticuerpo isotipo (palivizumab) de manera similar. Aproximadamente 48 horas después, a los ratones se les inyectó anticuerpo anti-CD166 marcado con AlexaFluor 750 (anti-CD166-AF750). Los ratones se sometieron a imágenes fluorescentes in v ivo 24, 72 y 96 horas después de la administración del anti-CD166-AF750, usando una señal de excitación de 745 nm y detectando una señal de emisión de 800 nm. Se representan ratones representativos visualizados a las 96 horas. La escala muestra la magnitud relativa de la señal fluorescente detectada. La figura 25B muestra la relación media de tumor-fondo (TBR) para cada artículo de prueba medido para los ratones.
Los resultados de este estudio ejemplar mostraron que las señales fluorescentes del anticuerpo anti-CD166 no enmascarado de la presente descripción y los anticuerpos anti-CD166 activables de la presente descripción pudieron unirse a CD166 en el xenoinjerto, bloqueando así la unión posterior de anti-CD166 marcado con fluorescencia. Por el contrario, un anticuerpo anti-CD166 enmascarado correspondientemente pero que carecía de un sitio de escisión de proteasa (CM) no bloqueó la unión posterior de CD166-AF750 en un grado comparable al control de isotipo. Sin quedar ligando a ninguna teoría en particular, este estudio ejemplar demostró que los anticuerpos anti-CD166 activables de la presente descripción pueden activarse in v ivo mediante la escisión de proteasa asociada a tumor, permitiendo así que el anticuerpo anti-CD166 activable activado se una a CD166 en el tumor de xenoinjerto en un grado comparable al anticuerpo anti-CD166 no enmascarado de la presente descripción. El anticuerpo anti-CD166 enmascarado que carecía de un dominio de escisión de proteasa (CM) de la presente descripción no fue activable de la misma manera y, por lo tanto, no se unió apreciablemente al xenoinjerto tumoral.
EJEMPLO 20. Eficacia de anticuerpos anti-CD166 activables conjugados contra modelos de tumor de xenoinjerto derivado de células
Los estudios ejemplares proporcionados en el presente documento se diseñaron para evaluar la eficacia in vivo de conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco (AADC) de la presente descripción contra xenoinjertos derivados de células en un modelo de tumor de ratón.
En estos estudios ejemplares, los conjugados de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco de la presente descripción se ensayaron para determinar su eficacia contra un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón de de cáncer de pulmón (células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) humano H292). En este estudio, los ratones portadores de tumor se trataron con un conjugado de anticuerpo anti-CD166-fármaco y un conjugado de anticuerpo activable anti-CD166-fármaco (AADC) de la presente descripción, incluyendo anti-CD166-7614-2001-spdb-DM4 ("CD166-7614-2001-DM4"), anti-CD166-7614.6-2001-spdb-DM4 ("CD166-7614.6-2001-DM4"), anti-CD166-7614.8-3001-spdb-DM4 ("CD166-7614.8-3001-DM4"), anti-huCD166-spdb-DM4 ("CD166-DM4"), y un control de isotipo (palivizumab-spdb-DM4; "Isotipo-DM4"). Se administraron por vía intravenosa 5 mg/kg de artículos de prueba los días de estudio 1 y 8 a cada ratón, y el volumen tumoral medio (MTV) del xenoinjerto H292 se midió los días indicados.
Como se representa en la figura 26, el tratamiento con los conjugados de anticuerpo anti-CD166 activable-fármaco de la presente descripción dio como resultado una disminución del MTV con el tiempo en un grado comparable al observado con el conjugado de anti-CD166-DM4-fármaco no enmascarado. El anti-CD166-DM4 AADC que tiene una máscara con un efecto notablemente mayor en la disminución de la afinidad de unión del anticuerpo parental a CD166 (véase, por ejemplo, Tabla 17) parece tener una eficacia notablemente menor que los anti-CD166 AADC que tienen máscaras inferiores.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD166 que comprende:
un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a CD166 de mamífero, donde el AB se une específicamente a CD166 humano y CD166 de mono cynomolgus, donde el AB comprende la secuencia de aminoácidos VH CDR1 GFSLSTYg Mg VG (SEQ ID NO: 127), la secuencia de aminoácidos VH CDR2 NIWWSEDKH (SEQ ID NO: 128), la secuencia de aminoácidos VH CDR3 IDYGNDYAFTY (SEQ ID NO: 129), la secuencia de aminoácidos VL CDR1 RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 130) o RSSQSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 131), la secuencia de aminoácidos VL CDR2 QMSNLAS (SEQ ID NO: 132) o QMSNRAS (SEQ ID NO: 133), y la secuencia de aminoácidos VL CDR3 AQNLELPYT (SEQ ID NO: 134); un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB a CD166 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, y donde el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud;
un resto escindible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que es un sustrato para una proteasa; y un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2),
donde el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de la siguiente manera: MM-LP1-CM-LP2-AB, y donde cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de 1 a 20 aminoácidos de longitud.
2. El anticuerpo activable de la reivindicación 1, donde el MM:
(i) tiene una constante de disociación para la unión al AB que es mayor que la constante de disociación del AB al CD166; y/o
(ii) no interfiere ni compite con el AB por unirse al CD166 cuando el anticuerpo activable está en un estado escindido; y/o
(iii) la secuencia polipeptídica es diferente de la del CD166 humano; y/o
(iv) la secuencia polipeptídica no es más de un 50 % idéntica a cualquier pareja de unión natural del AB.
3. El anticuerpo activable de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde:
(i) el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un scFv, un scAb, y un dAb; y/o
(ii) el AB se une específicamente a CD166 humano; y/o
(iii) el AB comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 o la SEQ ID NO: 122, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 123-126; y/o
(iv) los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí.
4. El anticuerpo activable de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el anticuerpo activable comprende:
una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 121, 122 o 239; y una secuencia de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, y 363-474.
5. Un anticuerpo activable conjugado que, en un estado activado, se une a CD166 que comprende:
el anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y
un agente conjugado con el AB.
6. El anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o el anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 5, donde
el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 135-238; y/o
el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 18-87 y 318-358.
7. El anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o el anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, donde
el MM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 219-238, y/o
el CM comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 70-87 y 336-358.
8. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5-7; opcionalmente donde el agente es una toxina o fragmento de la misma; y/u opcionalmente donde:
(i) el agente es un inhibidor de microtúbulos; o
(ii) el agente es un agente que daña el ácido nucleico; o
(iii) el agente se selecciona del grupo que consiste en una dolastatina o un derivado de la misma, una auristatina o un derivado de la misma, un maitansinoide o un derivado del mismo, una duocarmicina o un derivado de la misma, una caliqueamicina o un derivado de la misma, y una pirrolobenzodiazepina o un derivado de la misma; o (iv) el agente es auristatina E o un derivado de la misma, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina D (MMAD), un maitansinoide seleccionado del grupo que consiste en DM1 y DM4, maitansinoide DM4, maitansinoide DM1, una duocarmicina, una pirrolobenzodiacepina, o un dímero de pirrolobenzodiacepina; y/o
(v) el agente es un resto detectable; opcionalmente donde el resto detectable es un agente de diagnóstico.
9. El anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 7, o el anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 121 y 122, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 123-126, 363-370, 373, 374, 377, 378, 381, 382, 385, 386, 389, 390, 393, 394, 397, 398, 401, 402, 405, 406, 409, 410, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 425, 426, 429, 430, 433, 434, 437, 438, 441, 442, 445, 446, 449, 450, 453, 454, 457, 458, 461, 462, 465, 466, 469, 470, 473, y 474.
10. El anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6, 7, y 9, o el anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, donde:
(i) el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde la combinación de secuencias de aminoácidos se selecciona de una fila individual en la Tabla A,
donde, para una combinación dada,
(a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias VH CDR correspondientes a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A,
(b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de las secuencias VL CDR correspondientes a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A,
(c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de máscara (MM) correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A, y
(d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla A; y/o
(ii) el anticuerpo activable comprende una combinación de secuencias de aminoácidos, donde, para una combinación dada de secuencias de aminoácidos,
(a) la cadena pesada del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia VH o las secuencias VH CDR seleccionadas del grupo que consiste en: la secuencia VH o las secuencias VH CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B,
(b) la cadena ligera del AB comprende las secuencias de aminoácidos de la secuencia VL o las secuencias VL CDR seleccionadas del grupo que consiste en: la secuencia VL o las secuencias VL CDR enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B,
(c) el MM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de máscara (MM) seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias MM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B, y
(d) el CM comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de sustrato (CM) seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias CM enumeradas en la columna correspondiente de la Tabla B; y/o
(iii) el anticuerpo activable comprende: una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, 122 o 239; y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, y 363-474.
11. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, donde el agente está conjugado con el AB a través de un enlazador, y opcionalmente,
donde el enlazador al que el agente está conjugado con el AB comprende un resto SPDB, un resto vc, o un resto PEG2-vc, y/o
donde el enlazador y la toxina conjugados con el AB comprenden un resto SPDB-DM4, un resto vc-MMAD, un resto vc-MMAE, un resto vc-duocarmicina, o un resto PEG2-vc-MMAD; o
donde el enlazador es un enlazador escindible o un enlazador no escindible.
12. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 5,
donde el anticuerpo activable conjugado comprende secuencias de aminoácidos, un enlazador y una toxina seleccionados de una fila individual en la Tabla C, donde, para la combinación dada:
(a) el AB comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena pesada o la secuencia de dominio variable de cadena pesada correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla C,
(b) el AB comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de cadena ligera o la secuencia de dominio variable de cadena ligera correspondiente a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla C, y
(c) el enlazador y la toxina comprenden el enlazador y la toxina correspondientes a la combinación dada en la fila individual enumerada en la Tabla C.
13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6, 7, 9, y 10, o el anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5-12 y un vehículo.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13 que comprende un agente adicional, opcionalmente donde el agente adicional es un agente terapéutico.
15. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6, 7, 9, y 10.
16. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 15.
17. Un procedimiento para producir un anticuerpo activable mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo o el anticuerpo activable, donde la célula comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15 o el vector de la reivindicación 16.
18. Un procedimiento para fabricar un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a CD166, comprendiendo el procedimiento:
(a) cultivar una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6, 7, 9, y 10; y
(b) recuperar el anticuerpo activable; y/u opcionalmente
(c) conjugar un agente de la reivindicación 8 con el anticuerpo activable recuperado.
19. El anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6, 7, 9, y 10, el anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 6-12, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, para su uso como un medicamento.
20. El anticuerpo activable de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6, 7, 9, y 10, el anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5-12, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, para usar en un procedimiento para tratar, aliviar un síntoma de, o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad asociada con células que expresan CD166, donde el trastorno o enfermedad es cáncer.
21. El anticuerpo activable, el anticuerpo activable conjugado, o la composición farmacéutica, para su uso según la reivindicación 20, donde:
(i) el cáncer es un adenocarcinoma, un cáncer del conducto biliar (biliar), un cáncer de vejiga, un cáncer de hueso, un cáncer de mama, un cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer de mama triple negativo, un cáncer de endometrio, un cáncer de mama con receptor de estrógenos positivo, un carcinoide, un cáncer de cuello del útero, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, una leucemia, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células no pequeñas, un cáncer de pulmón de células pequeñas, un linterna, un melanoma, un cáncer orofaríngeo, un cáncer de ovario, un cáncer de páncreas, un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración, un cáncer de riñón, un sarcoma, un cáncer de piel, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital, o un cáncer urotelial; o
(ii) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un colangiocarcinoma, un cáncer de endometrio, cáncer de mama triple negativo (TNBC), un cáncer de mama con receptor de estrógenos positivo, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), un carcinoma de próstata, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), cáncer orofaríngeo, cáncer de cuello del útero, un cáncer de ovario, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), y cáncer de próstata.
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