ES2919879T3 - Sustratos escindibles con metaloproteasa de matriz y con serina proteasa y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

Sustratos escindibles con metaloproteasa de matriz y con serina proteasa y procedimientos de uso de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2919879T3
ES2919879T3 ES16704511T ES16704511T ES2919879T3 ES 2919879 T3 ES2919879 T3 ES 2919879T3 ES 16704511 T ES16704511 T ES 16704511T ES 16704511 T ES16704511 T ES 16704511T ES 2919879 T3 ES2919879 T3 ES 2919879T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
activatable
agent
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16704511T
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen James Moore
Margaret Thy Luu Nguyen
Daniel R Hostetter
Olga Vasiljeva
Jason Gary Sagert
Jonathan Alexander Terrett
James William West
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytomx Therapeutics Inc
Original Assignee
Cytomx Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cytomx Therapeutics Inc filed Critical Cytomx Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2919879T3 publication Critical patent/ES2919879T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Abstract

La invención se relaciona generalmente con polipéptidos que incluyen al menos un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una proteasa de la seroína (Sp), a anticuerpos activables y otras moléculas más grandes que incluyen estos polipéptidos que incluyen al menos un CM1 que es un sustrato para al menos una proteasa MMP y al menos un CM2 que es un sustrato para al menos una protasa de SPE y a los métodos de hacer y usar estos polipéptidos que incluyen al menos un CM1 que es un sustrato para al menos una proteasa MMP y al menos un CM2 que es un sustrato para al menos una proteasa SPE en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sustratos escindibles con metaloproteasa de matriz y con serina proteasa y procedimientos de uso de los mismos
Campo de la invención
La invención se relaciona generalmente con polipéptidos que incluyen al menos un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa. (SP), a anticuerpos activables y otras moléculas más grandes que incluyen estos polipéptidos que incluyen al menos un CM1 que es un sustrato para al menos una proteasa MMP y un CM2 que es un sustrato para al menos una proteasa SP, y a procedimientos para hacer y usar estos polipéptidos que incluyen al menos un c M1 que es un sustrato para al menos una proteasa MMP y un c M2 que es un sustrato para al menos una proteasa SP en una variedad de indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y profilácticas.
Antecedentes de la invención
Las proteasas son enzimas que degradan las proteínas rompiendo los enlaces peptídicos entre los residuos de aminoácidos. Las proteasas se producen naturalmente en todos los organismos y están involucradas en una variedad de reacciones fisiológicas desde la simple degradación hasta vías altamente reguladas. Se sabe que algunas proteasas rompen enlaces peptídicos específicos en función de la presencia de una secuencia de aminoácidos particular dentro de una proteína.
Gerspach y col. (2006), Cancer Immunology Immunotherapy, 55:12, pp. 1590-1600, describe profármacos de TNF que comprenden un enlazador selectivo de uPA o específico de uPA-MMP-2 dual. WO2014/052462 describe anticuerpos activables que incluyen un resto de enmascaramiento (MM), un resto escindible (CM) y un anticuerpo (AB) que se une específicamente al receptor de interleucina-6 (IL-6R). WO2014/107599 describe procedimientos y composiciones para detectar actividad de proteasa específica en muestras biológicas usando anticuerpos activables.
Por consiguiente, existe la necesidad de identificar nuevos sustratos para proteasas y usar estos sustratos en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas.
Resumen de la Invención
La invención se define mediante el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
La divulgación proporciona secuencias de aminoácidos que incluyen al menos un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). Estas secuencias de aminoácidos se denominan colectivamente en esta invención como "sustratos de CM1-CM2". Este término no pretende transmitir ningún requisito relacionado con la orientación u otra disposición estructural del primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). Por lo tanto, el término "sustratos de CM1-CM2" abarca sustratos de CM1-CM2 que tienen la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue: CM1-CM2 o CM2-CM1. El término "sustratos de CM1-CM2" también abarca sustratos en los que al menos una parte de la secuencia de CM1 se solapa con al menos una parte de la secuencia de CM2.
Los sustratos de CM1-CM2 descritos en esta invención son útiles en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas. Por ejemplo, estos sustratos de CM1-CM2 son útiles en anticuerpos activables que incluyen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (AB) que incluyen al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido a al menos un dominio de unión a antígeno o epítopo de AB de tal manera que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB para unirse a su diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye al menos un primer CM (CM1) y un segundo CM (CM2). En algunas realizaciones, al menos una porción de la secuencia del sustrato de CM1 se superpone con al menos una porción de la secuencia de CM2. En algunas realizaciones, la secuencia del sustrato de CM1 y la secuencia del sustrato de CM2 comparten al menos un residuo de aminoácido en común. En algunas realizaciones, la secuencia del sustrato de CM1 y la secuencia del sustrato de CM2 comparten al menos dos residuos de aminoácido en común. En algunas realizaciones, la secuencia del sustrato de CM1 y la secuencia del sustrato de CM2 comparten al menos tres residuos de aminoácido en común. En algunas realizaciones, la secuencia del sustrato de CM1 y la secuencia del sustrato de CM2 comparten tres o más residuos de aminoácido en común.
En algunas realizaciones, CM1 y CM2 son polipéptidos separados que están unidos entre sí de forma operativa.
En algunas realizaciones, CM1 y CM2 son polipéptidos separados que están directamente unidos entre sí, es decir, el extremo N de un sustrato está unido directamente al extremo C del otro polipéptido sustrato. En algunas realizaciones, el extremo N del CM1 está conectado directamente al extremo C del CM2. En algunas realizaciones, el extremo N del CM2 está conectado directamente al extremo C del CM1.
En algunas realizaciones, CM1 y CM2 son polipéptidos separados que se unen entre sí de forma operativa a través de al menos un resto de unión.
En algunas realizaciones, el primer resto escindible CM1 y el segundo resto escindible CM2 en el anticuerpo activable en el estado no escindido tienen la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue: MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2- CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB o AB-CM1-CM2-MM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre el resto de enmascaramiento (MM) y CM1. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre MM y CM1 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace entre MM y CM1 (LP") y un péptido de enlace entre CM1 y CM2 (LP'). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre MM y CM1, un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre CM2 y el resto de enmascaramiento (MM). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace entre AB y CM1 (LP") y un péptido de enlace entre CM1 y CM2 (LP'). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1, un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM.
En algunas realizaciones, LP' es GG. En algunas realizaciones, LP' es GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP). Ejemplos de MMP incluyen MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26 y MMP27.
En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para MMP2, MMP9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, y/o MMP19. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para MMP2. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para MMP9. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para MMP14. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para dos o más MMP. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para al menos MMP9 y MMP14. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para al menos MMP2 y MMP9. En algunas realizaciones, CMl es un sustrato para al menos MMP2 y MMP14. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para tres o más MMP. En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para al menos MMP2, MMP9 y MMP14. En algunas realizaciones, el CM1 comprende dos o más sustratos para la misma MMP. En algunas realizaciones, el CM1 comprende al menos dos o más sustratos de MMP2. En algunas realizaciones, el CM1 comprende al menos dos o más sustratos de MMP9. En algunas realizaciones, el CM1 comprende al menos dos o más sustratos de MMP14.
En algunas realizaciones, CM1 es un sustrato para una MMP e incluye al menos la secuencia ISSGLLSS (SEQ ID NO: 20); QNQALRMA (SEQ ID NO: 21); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 351); STFPFGMF (SEQ ID NO: 352); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 353); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 354); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 355); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 356); WATPRPMR (SEQ ID NO: 357); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 358); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 359); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 360); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 361); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 362); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 363); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 364); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 365); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 366); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 367); PAGLWLDP (SEQ ID NO: 368); ISSGLSS (SEQ ID NO: 369); ISSGL (SEQ ID NO: 480); ISSGLLS (SEQ ID NO: 481); ISSGLL (SEQ ID NO: 482) y/o VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 411).
En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 20). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO 21). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 351). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 352). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos PVGYTSSL (SEQ ID NO: 353). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 354). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos MIAPVAYR (SEQ ID NO: 355). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 356). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 357). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos FRLLDWQW (SEQ ID NO: 358). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 359). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 360). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos LPGGLSPW (SEQ ID NO: 361). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos MGLFSEAG (SEQ ID NO: 362). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos SPLPLRVP (SEQ ID NO: 363). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 364). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 365). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 366). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 367). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 368). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLSS (SEQ ID NO: 369). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 411). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos ISSGL (SEQ ID NO: 480). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLS (SEQ ID NO: 481). En algunas realizaciones, el CM1 comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLL (SEQ ID NO: 482).
En algunas realizaciones, CM2 es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). En algunas realizaciones, la SP se selecciona de entre el activador de plasminógeno de tipo u (uPA, también denominado uroquinasa), matriptasa (también denominado en esta invención como MT-SP1 o MTSP1) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de otras SP que escinden un CM2 descrito en esta invención incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, proteína activada C; catepsina A; catepsina G; quimasa; una proteasa de factor de coagulación tal como, por ejemplo, FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa; elastasa; granzima B; guanidinobenzoatasa; HtrA1; elastasa de neutrófilos humanos; lactoferrina; marapsina; NS3/4A; RITMO4; plasmina; PSA; tPA; trombina; triptasa; una proteasa de serina transmembrana de tipo II (TTSP) tal como, por ejemplo, DESC1, DPP-4, FAP, hepsina, matriptasa-2, TMPRSS2, TMPRSS3, y/o TMPRSS4.
Por ejemplo, los CM2 adecuados son escindidos por al menos una serina proteasa e incluyen la secuencia TGRGPSWV (SEQ ID NO: 370); SARGPSRW (SEQ ID N°: 371); TARGPSFK (SEQ ID NO: 372); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 18); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 373); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 374); PLTGRSGG (SEQ ID N°: 375); AARGPAIH (SEQ ID NO: 376); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 377); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 378); RGPATPIM (SEQ ID NO: 379); RGPA (SEC ID N°: 380); LSGRSGNH (SEQ ID N°: 412); TSTSGRSANPRG (SEC ID N°: 413); TSGRSANP (SEQ ID N°: 414); SGRSANPRG (SEQ ID NO: 468); VAGRSMRP (SEQ ID NO: 415); LSGRSDDH (SEQ ID NO: 547); LSGRSDIH (SEQ ID N°: 548); LSGRSDQH (SEQ ID NO: 549); LSGRSDTH (SEC ID N°: 550); LSGRSDYH (SEQ ID NO: 551); LSGRSDNP (SEQ ID N°: 552); LSGRSANP (SEQ ID NO: 553); LSGRSANI (SEQ ID NO: 554); y/o LSGRSDNI (SEQ ID NO: 71).
En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos TGRGPSWV (SEQ ID NO: 370). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos SARGPSRW (SEQ ID NO: 371). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos TARGPSFK (SEQ ID NO: 372). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 18). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos GGWHTGRN (SEQ ID NO: 373). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos HTGRSGAL (SEQ ID NO: 374). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos PLTGRSGG (SEQ ID NO: 375). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos AARGPAIH (SEQ ID NO: 376). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos RGPAFNPM (SEQ ID NO: 377). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos SSRGPAYL (SEQ ID NO: 378). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos RGPATPIM (SEQ ID NO: 379). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos RGPA (SEQ ID NO: 380). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSGNH (SEQ ID NO: 412). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 413). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos SGRSANPRG (SEQ ID NO: 468). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos TSGRSANP (SEQ ID NO: 414). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos VAGRSMRP (SEQ ID NO: 415). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDDH (SEQ ID NO: 547). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDIH (SEQ ID NO: 548). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDQH (SEQ ID NO: 549). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDTH (SEQ ID NO: 550). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDYH (SEQ ID NO: 551). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNP (SEQ ID NO: 552). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSANP (SEQ ID NO: 553). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSANI (SEQ ID NO: 554). En algunas realizaciones, CM2 comprende la secuencia de aminoácidos LSGRSDNI (SEQ ID NO: 71).
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 1); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 2); AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 3); TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 4); VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 5); TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 6); AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 7); LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 8); VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 9); LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 10); LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 11); LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 12); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 13); LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 14); QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 15); LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 16); QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 17); ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 22); ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 469); AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 470); AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 471); ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 483); ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 484); ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 485); ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 486); ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 487); ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 488); ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 489); ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 490); AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 515); AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 516); AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 517); AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 518); AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 519); AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 520); AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 521); AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 522); ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 555) y/o AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 557).
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGTSTSGRSAn Pr G (SEQ ID n O: 3). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia TSTSGRSANPRGGGAVGLLa Pp (SEQ ID NO: 4). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ iD NO: 5). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia TSTSGRSANPRGGGVHMPLg FlGP (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 9). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 13). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 14). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 15). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 16). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 17). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 22). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 469). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 470). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 471). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDDH (s Eq ID NO: 483). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 484). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 485). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID n O: 486). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 487). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 488). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 489). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSANI (Se Q ID NO: 490). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 515). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDIH (Se Q ID NO: 516). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 517). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 518). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 519). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 520). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 521). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSANI (Se Q ID NO: 522). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia ISSGLLSGRSDNI (SEQ iD NO: 555). En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 incluye la secuencia AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 557).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB, o AB-CM1-CM2-MM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), y el anticuerpo en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM1-LP1- CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM1-LP1-CM2-CM1 -LP2-AB o AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM. En algunas realizaciones, cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los dos péptidos de enlace no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre el resto de enmascaramiento (MM) y CM1. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre MM y CM1 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace entre MM y CM1 (LP") y un péptido de enlace entre CM1 y CM2 (LP'). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre MM y CM1, un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre CM2 y el resto de enmascaramiento (MM). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace entre AB y CM1 (LP") y un péptido de enlace entre CM1 y CM2 (LP'). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1, un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM.
En algunas realizaciones, LP' es GG. En algunas realizaciones, LP' es GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 381) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 382), donde n es un entero de al menos uno.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 383), GGSGG (SEQ ID NO: 384), GSGSG (SEQ ID NO: 385), GSGGG (SEQ ID NO: 386), GGGSG (SEQ ID NO: 387), y GSSSG (SEQ ID NO: 388).
En algunas realizaciones, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 389), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 390), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 391), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 392), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 393), o GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 394).
En algunas realizaciones, LP2 comprende la secuencia de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 395), GSSGT (SEQ ID NO: 396) o GSSG (SEQ ID NO: 397).
En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 100 nM o menos para la unión a la diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (AB) del mismo que se une específicamente a una diana. En algunas realizaciones, el AB es un anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, el AB es un fragmento inmunológicamente activo. En algunas realizaciones, el AB es un fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el AB es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de dominio, un fragmento Fab de cadena sencilla, un fragmento F(ab')2 un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de un solo dominio o un anticuerpo de cadena ligera de un solo dominio. En algunas realizaciones, tal AB es un anticuerpo monoclonal de ratón, otro roedor, quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, la proteasa MMP se co-localiza con la diana en un tejido, y la proteasa MMP escinde el CM1 en el anticuerpo cuando el anticuerpo se expone a la proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa SP se colocaliza con la diana en un tejido, y la proteasa SP escinde el sustrato CM2 en el anticuerpo cuando el anticuerpo se expone a la proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa MMP y/o la proteasa SP se co-localizan con la diana en un tejido, y la proteasa MMP y/o la proteasa SP escinde el sustrato CM1-CM2 en el anticuerpo cuando el anticuerpo se expone a la proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa MMP y la proteasa SP se colocalizan con la diana en un tejido, y al menos una de las proteasas MMP y SP escinde el sustrato CM1-CM2 en el anticuerpo cuando el anticuerpo se expone a la proteasa.
En algunas realizaciones, cada una de la secuencia de sustrato CM1 y la secuencia de sustrato CM2 del sustrato CM1-CM2 es independientemente un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato CM1 del sustrato CM1-CM2 es un sustrato para al menos una MMP y comprende una secuencia polipeptídica que no es sustancialmente idéntica a ninguna secuencia polipeptídica, por ejemplo, cualquier secuencia polipeptídica animal, que se escinde naturalmente por la misma proteasa MMP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de CM1 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una MMP y comprende una secuencia polipeptídica que no es sustancialmente idéntica a ninguna secuencia polipeptídica de mamífero que es escindida naturalmente por la misma proteasa MMP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de CM1 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una MMP y comprende una secuencia polipeptídica que no es sustancialmente idéntica a ninguna secuencia polipeptídica humana que es escindida naturalmente por la misma proteasa MMP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de c M1 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una MMP y comprende una secuencia polipeptídica que no es más del 90 % o más idéntica a cualquier secuencia polipeptídica, por ejemplo, cualquier secuencia polipeptídica animal, que se escinde naturalmente por la misma proteasa MMP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de c M1 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una MMP y comprende una secuencia polipeptídica que no es más del 90 % o más idéntica a cualquier secuencia polipeptídica de mamífero que se escinde naturalmente por la misma proteasa MMP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de c M1 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una MMP y comprende una secuencia polipeptídica que no es más del 90 % o más idéntica a cualquier secuencia polipeptídica humana que es escindida naturalmente por la misma proteasa MMP.
En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato CM2 del sustrato CM1-CM2 es un sustrato para al menos una SP y comprende una secuencia polipeptídica que no es sustancialmente idéntica a ninguna secuencia polipeptídica, por ejemplo, cualquier secuencia polipeptídica animal, que se escinde naturalmente por la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de CM2 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una SP y comprende una secuencia polipeptídica que no es sustancialmente idéntica a ninguna secuencia polipeptídica de mamífero que es escindida naturalmente por la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de CM2 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una SP y comprende una secuencia polipeptídica que no es sustancialmente idéntica a ninguna secuencia polipeptídica humana que es escindida naturalmente por la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de CM2 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una SP y comprende una secuencia polipeptídica que no es más del 90 % o más idéntica a cualquier secuencia polipeptídica, por ejemplo, cualquier secuencia polipeptídica animal, que se escinde naturalmente por la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de CM2 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una SP y comprende una secuencia polipeptídica que no es más del 90 % o más idéntica a cualquier secuencia polipeptídica de mamífero que se escinde naturalmente por la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, la secuencia de sustrato de CM2 del sustrato de CM1-CM2 es un sustrato para al menos una SP y comprende una secuencia polipeptídica que no es más del 90 % o más idéntica a cualquier secuencia polipeptídica humana que es escindida naturalmente por la misma proteasa SP.
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555 y 557. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471,483-490, 515-522, 555 y 557, así como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une a una diana y un resto de enmascaramiento (MM) que reduce la capacidad del dominio de unión a antígeno o epítopo del AB para unirse a su diana.
En algunas realizaciones, un anticuerpo activable comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, y 557, y un anticuerpo anti-Jagged que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-Jagged descrito en esta invención. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469­ 471, 483-490, 515-522, 555 y 557, y un anticuerpo que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 162 o SEQ ID NO: 164 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 67 o SEQ ID NO: 163.
En algunas realizaciones, el CM1-CM2 se incluye en un anticuerpo activable que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439 , 477, 479, 507-514, 539-546, 561 y 562, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 67.
En algunas realizaciones, el CM1-CM2 se incluye en un anticuerpo activable que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439, 477, 479, 507-514, 539-546, 561, y 562, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 163.
En algunas realizaciones, un anticuerpo activable comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, y 557, y un anticuerpo anti-EGFR que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-EGFR descrito en esta invención. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469­ 471, 483-490, 515-522, 555, y 557, y un anticuerpo que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 111; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109 o la SEQ ID NO: 110.
En algunas realizaciones, el CM1-CM2 se incluye en un anticuerpo activable que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 449, 451,453, 455, 457, 459, 461,463, 465, 467 , 472, 474, 499-506, 531-538, 559 y 560, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 108.
En algunas realizaciones, el CM1-CM2 se incluye en un anticuerpo activable que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 449, 451,453, 455, 457, 459, 461,463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, y 560, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 109.
En algunas realizaciones, el CM1-CM2 se incluye en un anticuerpo activable que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 449, 451,453, 455, 457, 459, 461,463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, y 560, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 110.
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 también es un sustrato para al menos una proteasa adicional.
En algunas realizaciones, la al menos una proteasa adicional es una proteasa MMP diferente a la proteasa MMP que escinde el CM1. En algunas realizaciones, la al menos una proteasa adicional es una proteasa MMP seleccionada de entre el grupo que consiste en MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; y MMP27.
En algunas realizaciones, la al menos una proteasa adicional es una proteasa SP diferente a la proteasa SP que escinde el CM2. En algunas realizaciones, la al menos una proteasa SP adicional se selecciona de entre el grupo que consiste en uPA; matriptasa; proteína activada C; catepsina A; catepsina G; quimasa; una proteasa de factor de coagulación tal como, por ejemplo, FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa; elastasa; granzima B; guanidinobenzoatasa; HtrA1; elastasa de neutrófilos humanos; lactoferrina; marapsina; NS3/4A; RITMO4; plasmina; PSA; tPA; trombina; triptasa; una serina proteasa transmembrana de tipo II (Tt SP) tal como, por ejemplo, DESC1, DPP-4, FAP, hepsina, matriptasa-2, TMPRSS2, TMPRSS3 y TMPRSS4.
En algunas realizaciones, la al menos una proteasa adicional se selecciona de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 6.
T l : Pr nzim m l r
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
La divulgación también proporciona un anticuerpo que incluye al menos un primer CM1 y un segundo CM2 y está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, el primer CM1 y el segundo CM2 son cada uno polipéptidos de no más de 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable conjugado que, en el estado no escindido, tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2-AB-Agente, Agente-AB-CM2-CM1 -MM, MM-CM2-CM1-AB-Agente o Agente-AB-CM1-CM2-MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable conjugado que, en el estado no escindido, tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: Agente-MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM -Agente, Agente-MM-CM2-CM1-AB o AB-CM1-CM2-MM-Agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable conjugado que, en el estado no escindido, tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: Agente-MM-CM1-CM2-AB-Agente, Agente-AB-CM2-CM1-MM-Agente, Agente-MM-CM2-CM1-AB-Agente, o Agente-AB-CM1-CM2-MM-Agente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable conjugado que comprende un resto de enmascaramiento (MM), un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), y el anticuerpo en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N al extremo C de la siguiente manera: MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-Agente, Agente-AB-LP2-CM2-CM 1-LP1-MM, MM1-LP1-CM2-CM1 -LP2-AB-Agente o Agente-AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM. En algunas realizaciones, cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los dos péptidos de enlace no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable conjugado que comprende un resto de enmascaramiento (MM), un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), y el anticuerpo en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N al extremo C de la siguiente manera: Agente-MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM-Agente, Agente-MM1 -LP1-CM2-CM1-LP2-AB o AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-Agente. En algunas realizaciones, cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los dos péptidos de enlace no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable conjugado que comprende un resto de enmascaramiento (MM), un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), y el anticuerpo en el estado no escindido tiene la disposición estructural del extremo N al extremo C de la siguiente manera: Agente-MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-Agente, Agente-AB-LP2-CM2-CM 1 -LP1-MM-Agente, Agente-MM1-LP1-CM2-CM1 -LP2-AB-Agente o Agente-AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-Agente. En algunas realizaciones, cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los dos péptidos de enlace no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre el resto de enmascaramiento (MM) y CM1. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre MM y CM1 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace entre MM y CM1 (LP") y un péptido de enlace entre CM1 y c M2 (LP'). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre MM y Cm 1, un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y AB.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre CM2 y el resto de enmascaramiento (MM). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y c M1 y un péptido de enlace (LP") entre
CM2 y MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace entre AB y CM1 (LP") y un péptido de enlace entre CM1 y CM2 (LP'). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado incluye un péptido de enlace (LP") entre AB y CM1, un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2 y un péptido de enlace (LP") entre CM2 y MM.
En algunas realizaciones, LP' es GG. En algunas realizaciones, LP' es GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 381) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 382), donde n es un entero de al menos uno.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 383), GGSGG (SEQ ID NO: 384), GSGSG (SEQ ID NO: 385), GSGGG (SEQ ID NO: 386), GGGSG (SEQ ID NO: 387), y GSSSG (SEQ ID NO: 388).
En algunas realizaciones, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 389), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 390), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 391), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 392), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 393), o GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 394).
En algunas realizaciones, LP2 comprende la secuencia de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 395), GSSGT (SEQ ID NO: 396) o GSSG (SEQ ID NO: 397).
En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 está enlazado o unido de otro modo a un anticuerpo. Por ejemplo, el CM1-CM2 se usa para unir uno o más agentes al anticuerpo o al fragmento de unión al antígeno del mismo (AB) que se une a una diana determinada, de modo que el CM1-CM2 se escinde cuando se expone a la MMP. y/o la SP, y el agente es liberado del AB. Dianas ejemplares incluyen, entre otras, las dianas que se muestran en la Tabla 1. AB ejemplares incluyen, entre otros, los anticuerpos que se muestran en la Tabla 2.
En algunas realizaciones, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 100 nM o menos para la unión a la diana.
En una realización, el anticuerpo incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo que se une a la diana es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de dominio, un fragmento Fab de cadena sencilla, un fragmento F(ab')2 , un scFv, un scAb, un dAb, un dominio único anticuerpo de cadena pesada o un anticuerpo de cadena ligera de dominio único. En algunas realizaciones, tal anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo que se une a la diana es un anticuerpo monoclonal de ratón, otro roedor, quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, el MM tiene una constante de disociación para la unión al AB que no es mayor que la constante de disociación del AB a la diana.
En algunas realizaciones, el MM no interfiere ni compite con el AB por unirse a la diana cuando el anticuerpo activable está en un estado escindido.
En algunas realizaciones, el MM es un polipéptido de aproximadamente 2 a 40 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, el MM es un polipéptido de hasta aproximadamente 40 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, la secuencia del polipéptido MM es diferente de la de cualquier compañero de unión natural del AB. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica MM no es más de un 50 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB. En algunas realizaciones, la secuencia del polipéptido MM no es más del 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % o 10 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB.
En algunas realizaciones, el agente conjugado con el AB o el AB de un anticuerpo activable es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. Como se usa en el presente documento, un fragmento de una toxina es un fragmento que conserva actividad tóxica. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador que incluye al menos una secuencia de sustrato CM1-CM2. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN o un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el agente es un agente antiinflamatorio.
En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o anticuerpo activable también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo conjugado y/o el anticuerpo activable conjugado incluye una etiqueta detectable. En algunas realizaciones, la etiqueta detectable incluye un agente de formación de imágenes, un agente de contraste, una enzima, una etiqueta fluorescente, un cromóforo, un colorante, uno o más iones metálicos o una etiqueta basada en ligando. En algunas realizaciones, el agente de formación de imágenes comprende un radioisótopo. En algunas realizaciones, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunas realizaciones, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa. En algunas realizaciones, la etiqueta fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), proteína fluorescente roja tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED o un derivado del europio. En algunas realizaciones, la etiqueta luminiscente comprende un derivado de N-metilacridinio. En algunas realizaciones, la etiqueta comprende una etiqueta Alexa Fluor® , como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas realizaciones, la etiqueta basada en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o el AB del anticuerpo activable contienen naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el AB se puede diseñar para incluir uno o más enlaces disulfuro.
En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o el anticuerpo conjugado es monoespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o el anticuerpo conjugado es multiespecífico, denominado en esta invención anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos multiespecíficos conjugados. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico y/o el anticuerpo multiespecífico conjugado es biespecífico o trifuncional. En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o el anticuerpo conjugado se formula como parte de una molécula pro-Bispecific T Cell Engager (pro-BITE). En algunas realizaciones, el anticuerpo y/o el anticuerpo conjugado se formulan como parte de una célula T modificada pro-receptor de antígeno quimérico (pro-CAR) u otro receptor diseñado u otra célula inmunoefectora, tal como una célula NK modificado con CAR. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado se formulan como parte de una célula T modificada pro-receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado se formulan como parte de una célula NK modificada pro-receptor de antígeno quimérico (CAR).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado son monoespecíficos. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado son multiespecíficos, denominados en esta invención anticuerpos activables multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados. Como se usa en esta invención, términos tales como "anticuerpo activable" y todas las variaciones gramaticales de los mismos, a menos que se indique lo contrario, pretenden abarcar, pero no se limitan a, realizaciones en las que el anticuerpo activable es un anticuerpo activable multiespecífico de la divulgación. Como se usa en esta invención, términos tales como "anticuerpo activable conjugado" y todas las variaciones gramaticales de los mismos, a menos que se indique lo contrario, pretenden abarcar, pero no se limitan a, realizaciones en las que el anticuerpo activable conjugado es un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado es biespecífico o trifuncional. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado se formulan como parte de una molécula pro-Bispecific T Cell Engager (pro-BITE). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado se formula como parte de una célula T modificada con pro-receptor de antígeno quimérico (pro­ CAR) u otro receptor diseñado.
En algunas realizaciones, los anticuerpos, conjugados de anticuerpos, anticuerpos activables, anticuerpos activables conjugados, anticuerpos activables multiespecíficos y/o anticuerpos activables multiespecíficos conjugados descritos en esta invención se usan junto con uno o más agentes adicionales o una combinación de agentes adicionales. Los agentes adicionales adecuados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación prevista, tal como, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos activables, los anticuerpos activables conjugados, los anticuerpos activables multiespecíficos y/o los anticuerpos activables multiespecíficos conjugados pueden usarse junto con un agente quimioterapéutico o antineoplásico adicional.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable multiespecífico. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención son anticuerpos multiespecíficos que reconocen dos o más antígenos o epítopos diferentes y que incluyen al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido a al menos un dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico de tal manera que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del dominio de unión a antígeno o epítopo para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el MM se acopla al dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico a través de un sustrato CM1-CM2 que funciona como sustrato para al menos una proteasa MMP y al menos una proteasa SP. Los anticuerpos multiespecíficos activables proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es.decir, sano, y, cuando se activan, se unen a una diana que es al menos comparable al correspondiente, anticuerpo multiespecífico no modificado.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, que incluye, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia VH CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1, esa secuencia incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 398); una secuencia de VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYAd Sv KG (SEQ ID n O: 399); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 400) y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia v L CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de las secuencias VL CDR1, la secuencia de VL CDR2, y la secuencia de VL CDR3 se selecciona de entre una secuencia de VL CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 401); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 402); una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403), y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que une específicamente una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia Vh CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 398); una secuencia de VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 399); una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 400), y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que une específicamente una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de la secuencia VL CDR1, la secuencia VL CDR2 y la secuencia VL CDR3 se selecciona de entre una secuencia VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 401); una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 402); una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403), y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, que incluye, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH c DR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 398); la secuencia de VH CD2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 399); la secuencia VH CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID n O: 400); la secuencia VL CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 401); la secuencia VL CDR2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 402); y la secuencia VL CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 398); la secuencia de VH CD2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG ( SEQ ID NO: 399);la secuencia VH CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 400); la secuencia VL CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY ( SEQ ID NO: 401); la secuencia VL CDR2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS ( SEQ ID NO: 402); y la secuencia VL CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia VH CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 404); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 405); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 406); y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de la secuencia VL CDR1, la secuencia VL CDR2 y la secuencia VL c DR3 se selecciona de entre una secuencia VL CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 407); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 408); una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409), y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2 y una secuencia VH CDR3, donde al menos una de la secuencia VH CDR1, la secuencia VH CDR2 y la secuencia VH CDR3 se selecciona de entre una secuencia VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 404); una secuencia de VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 405); una secuencia de VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 406); y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una de la secuencia VL CDR1, la secuencia VL CDR2 y la secuencia VL CDR3 se selecciona de entre una secuencia VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 407); una secuencia de VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 408); una secuencia de VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409), y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 404); la secuencia VH CD2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (Se Q ID NO: 405); la secuencia VH CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 406); la secuencia VL CDR1 incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 407); la secuencia VL CDR2 incluye al menos la secuencia de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 408); y la secuencia VL CDR3 incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a EGFR y que contiene una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde la secuencia VH CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 404); la secuencia VH CD2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS ( SEQ ID NO: 405);la secuencia VH CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos ALTYYDYEFAY ( SEQ ID NO: 406); la secuencia VL CDR1 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSIGTNIH ( SEQ ID NO: 407); la secuencia VL CDR2 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos KYASESIS ( SEQ ID NO: 408); y la secuencia VL CDR3 incluye una secuencia que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, que incluye, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555 y 557, y un anticuerpo anti-Jagged que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-Jagged descrito en esta invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, que incluye, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555 y 557, y un anticuerpo que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 162 o SEQ ID NO: 164 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 67 o SEQ ID NO: 163.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, que incluye, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación incluye al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439, 477, 479, 507-514, 539-546, 561 y 562.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, y 557, y un anticuerpo anti-EGFR que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-EGFR descrito en esta invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, y 557, y un anticuerpo que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 111; y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 108, la SEQ ID NO: 109 o la SEQ ID NO: 110.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, y 560.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, que incluye, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o el anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación incluye al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439, 477, 479, 507-514, 539- 546, 561 y 562.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado proporcionado en esta invención, incluidos, entre otros, un anticuerpo activable multiespecífico y/o un anticuerpo activable multiespecífico conjugado de la divulgación, incluye al menos una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, y 560.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN o un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador que incluye al menos una secuencia de sustrato CM1-CM2. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el agente es un agente antiinflamatorio.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo conjugado incluye una etiqueta detectable. En algunas realizaciones, la etiqueta detectable incluye un agente de formación de imágenes, un agente de contraste, una enzima, una etiqueta fluorescente, un cromóforo, un colorante, uno o más iones metálicos o una etiqueta basada en ligando. En algunas realizaciones, el agente de formación de imágenes comprende un radioisótopo. En algunas realizaciones, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunas realizaciones, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o pgalactosidasa. En algunas realizaciones, la etiqueta fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), proteína fluorescente roja tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED o un derivado del europio. En algunas realizaciones, la etiqueta luminiscente comprende un derivado de N-metilacridinio. En algunas realizaciones, la etiqueta comprende una etiqueta Alexa Fluor® , como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas realizaciones, la etiqueta basada en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal se conjuga con el anticuerpo activable a través de un espaciador. En algunas realizaciones, el espaciador se conjuga con el anticuerpo activable en ausencia de un péptido señal. En algunas realizaciones, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable en la disposición estructural desde el extremo N al extremo C del espaciador-MM-CM1-CM2 sustrato-AB. Un ejemplo de un espaciador unido directamente al extremo N de MM del anticuerpo activable es una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en QGQSGQ (SEQ ID NO: 410), GQSGQ (SEQ ID NO: 416), QSGQ (SEQ ID NO: 417), SGQ (SEQ ID NO: 418), GQ, y Q En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 410). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQSGQ (SEQ ID NO: 416). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QSGQ (SEQ ID NO: 417). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos SGQ (SEQ ID NO: 418). En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQ. En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos Q.
En algunas realizaciones, el AB del anticuerpo activable contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el AB se puede genomanipular para incluir uno o más enlaces disulfuro.
En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo correspondiente; por ejemplo, la pK del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es similar a la del anticuerpo correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 15 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 11 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 9 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 7 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 5 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 2 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 24 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 20 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 18 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 16 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 14 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 horas cuando se administra a un organismo.
La divulgación también proporciona composiciones y procedimientos que incluyen un anticuerpo activable que incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a una diana dada, donde el AB se acopla a un resto de enmascaramiento (MM) que disminuye la capacidad del AB para unirse a su diana En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye además un sustrato CM1-CM2 que es un sustrato para al menos una MMP y al menos una SP. Las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención permiten la unión de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en el AB sin comprometer la actividad (por ejemplo, el enmascaramiento, la activación o la actividad de unión) del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención permiten la unión de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en el a B sin reducir o alterar de otro modo uno o más enlaces disulfuro dentro del MM. Las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención producen un anticuerpo activable que se conjuga con uno o más agentes, por ejemplo, cualquiera de una variedad de agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o profilácticos, por ejemplo, en algunas realizaciones, sin ninguno de los agentes siendo conjugado al MM del anticuerpo activable. Las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta invención producen anticuerpos activables conjugados en los que el MM conserva la capacidad de enmascarar efectiva y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. Las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invbención producen anticuerpos activables conjugados en los que el anticuerpo activable todavía está activado, es.decir, escindido, en presencia de una MMP que puede escindir el sustrato CM1-CM2.
Los anticuerpos activables tienen al menos un punto de conjugación para un agente, pero en los procedimientos y composiciones que se proporcionan en esta invención están disponibles menos de todos los posibles puntos de conjugación para la conjugación con un agente. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en los enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro intercatenarios. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre involucrados en enlaces de sulfuro intercatenarios, pero no átomos de azufre involucrados en enlaces disulfuro intracatenarios. En algunas realizaciones, el uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre de cisteína u otros residuos de aminoácidos que contienen un átomo de azufre. Dichos residuos pueden aparecer de forma natural en la estructura del anticuerpo o pueden incorporarse al anticuerpo mediante mutagénesis de sitio dirigido, conversión química, o mala incorporación de aminoácidos no naturales.
También se proporcionan procedimientos para preparar un conjugado de un anticuerpo activable que tiene uno o más enlaces disulfuro intercatenarios en el AB y uno o más enlaces disulfuro intracatenarios en el m M, y se proporciona un fármaco reactivo con tioles libres. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial de enlaces disulfuro intercatenarios en el anticuerpo activable con un agente reductor, tal como, por ejemplo, TCEP; y conjugar el reactivo farmacológico con tioles libres con el anticuerpo activable parcialmente reducido. Como se usa en esta invención, el término reducción parcial se refiere a situaciones donde un anticuerpo activable se pone en contacto con un agente reductor y se reducen menos de todos los enlaces disulfuro, por ejemplo, menos de todos los sitios posibles de conjugación. En algunas realizaciones, se reducen menos del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o menos del 5 % de todos los posibles sitios de conjugación.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo activable que da como resultado la selectividad en la colocación del agente. El procedimiento generalmente incluye la reducción parcial del anticuerpo activable con un agente reductor de manera que cualquiera de los sitios de conjugación en el resto de enmascaramiento u otra porción no AB del anticuerpo activable no se reduzca, y se conjugue el agente con tioles intercatenarios en el AB. El uno o más sitios de conjugación se seleccionan para permitir el posicionamiento deseado de un agente para permitir que tenga lugar la conjugación en un sitio deseado. El agente reductor es, por ejemplo, TCEP. Las condiciones de reacción de reducción, tales como, por ejemplo, la relación de un agente reductor con respecto a un anticuerpo activable, la duración de la incubación, la temperatura durante la incubación, el pH de la solución de reacción de reducción, etc., se determinan identificando las condiciones que producen un anticuerpo activable conjugado donde el MM conserva la capacidad de enmascarar efectiva y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. La relación del agente de reducción con respecto al anticuerpo activable variará dependiendo del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la relación de agente reductor con respecto a anticuerpo activable estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5, o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a alrededor 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para reducir los enlaces disulfuro intercatenarios en el AB de un anticuerpo activable y conjugar un agente, por ejemplo, un agente que contiene tiol tal como un fármaco, con los tioles intercatenarios resultantes para localizar selectivamente uno o más agentes en el AB. El procedimiento generalmente incluye reducir parcialmente el AB con un agente reductor para formar al menos dos tioles intercatenarios sin formar todos los tioles intercatenarios posibles en el anticuerpo activable; y conjugar el agente con los tioles intercatenarios del AB parcialmente reducido. Por ejemplo, el AB del anticuerpo activable se reduce parcialmente durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 37 °C en una relación deseada de agente reductor:anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la relación de agente reductor con respecto a anticuerpo activable estará en un intervalo de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5, o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 8:1 a alrededor 1:1. En algunas realizaciones, la relación está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
El reactivo que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína o N-acetilcisteína. El agente reductor puede ser, por ejemplo, TCEP. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable reducido puede purificarse antes de la conjugación, usando, por ejemplo, cromatografía en columna, diálisis o diafiltración. En algunas realizaciones, el anticuerpo reducido no se purifica después de la reducción parcial y antes de la conjugación.
La divulgación también proporciona anticuerpos activables parcialmente reducidos en los que al menos un enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo activable se ha reducido con un agente reductor sin alterar ningún enlace disulfuro intracatenario en el anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana, y un sustrato CM1-CM2 acoplado al AB, donde el sustrato CM1-CM2 es un polipéptido que funciona como sustrato para al menos una MMP y una SP. En algunas realizaciones, el MM está acoplado al AB a través de un sustrato CM1-CM2. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del MM en el anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM. En algunas realizaciones, el agente reductor es TCEP.
La divulgación también proporciona anticuerpos activables parcialmente reducidos, incluidos, entre otros, anticuerpos activables multiespecíficos de la divulgación, en los que al menos un enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo activable se ha reducido con un agente reductor sin perturbar o comprometer de otro modo la actividad y/o eficacia del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana, y un sustrato CM1-CM2 acoplado al AB, y el sustrato CM1-CM2 es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa. La actividad y/o la eficacia del anticuerpo activable es, a modo de ejemplo no limitativo, actividad de enmascaramiento, activación del anticuerpo activable, y/o actividad de unión del anticuerpo activable activado. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, uno o más enlaces disulfuro intracatenarios del MM en el anticuerpo activable no se alteran por el agente reductor. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM. En algunas realizaciones, el agente reductor es TCEP.
La divulgación también proporciona anticuerpos activables conjugados que incluyen un anticuerpo activable vinculado a la carga útil de monometil auristatina D (MMAD), donde el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana, un resto de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido a la diana, y el sustrato CM1-CM2 acoplado al AB, y el sustrato CM1-CM2 es un polipéptido que funciona como sustrato para al menos una proteasa MMP y al menos una proteasa SP.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable conjugado con MMAD puede conjugarse usando cualquiera de varios procedimientos para unir agentes a los AB: (a) unión a los restos de carbohidrato de AB, o (b) unión a grupos sulfhidrilo de AB, o (c) unión a grupos amino del AB, o (d) unión a grupos carboxilato del AB.
En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con una cisteína en el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con una lisina en el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con otro residuo del AB a través de un enlazador, tal como los residuos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador que contiene tiol. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el enlazador se selecciona de entre el grupo que consiste en los enlazadores mostrados en las Tablas 5 y 6. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable y la carga útil de MMAD están unidos a través de un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo. En algunas realizaciones, la carga útil de MMAD se conjuga con el AB usando la tecnología de reducción parcial y de conjugación descrita en esta invención.
La divulgación también proporciona polipéptidos y otras moléculas más grandes que incluyen una o más de las secuencias de sustrato CM1-CM2 presentadas en esta invención. A modo de ejemplo no limitante, las secuencias de sustrato CM1-CM2 presentadas en esta invención son útiles en composiciones de profármacos y procedimientos de uso de las mismas. Estas secuencias de sustrato CM1-CM2 presentadas en esta invención también son útiles en sondas y otros agentes de detección y procedimientos de uso de los mismos. Por ejemplo, las secuencias de sustrato CM1-CM2 presentadas en esta invención se pueden usar junto con flúor y otros inhibidores para producir agentes de detección, como agentes de formación de imágenes y/o otros agentes de diagnóstico. Los expertos en la técnica apreciarán que las secuencias de sustrato CM1-CM2 presentadas en esta invención son útiles en cualquier composición. y/o procedimiento en la técnica que usaría un sustrato que es escindible por al menos una MMP y al menos una SP.
La divulgación también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo y/o un anticuerpo activable descrito en esta invención, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La divulgación proporciona procedimientos para producir un anticuerpo y/o un anticuerpo activable cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo y/o anticuerpo activable, donde la célula comprende tal vector.
La divulgación proporciona un procedimiento para fabricar un anticuerpo conjugado de la divulgación que se une a una diana dada (a) cultivando una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo, (i) donde el anticuerpo incluye un sustrato CM1-CM2, y (ii) donde el sustrato CM1-CM2 es un polipéptido que funciona como sustrato para una metaloproteasa de matriz y una serina proteasa; (b) recuperar el anticuerpo; y (c) conjugar el anticuerpo recuperado con uno o más agentes adicionales.
La divulgación también proporciona un procedimiento para fabricar los anticuerpos activables de la divulgación que se unen en un estado activado a una diana dada (a) cultivando una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato CM1-CM2 y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, (i) donde el sustrato CM1-CM2 es un polipéptido que funciona como sustrato para una MMP y una SP; y (ii) donde el sustrato CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable de manera que, en un estado no escindido, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana y en un estado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (b) recuperar el anticuerpo activable.
La divulgación también proporciona un procedimiento para fabricar los anticuerpos activables conjugados de la divulgación que se unen en un estado activado a una diana dada (a) cultivando una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato CM1-CM2 y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, (i) donde el sustrato CM1-CM2 es un polipéptido que funciona como sustrato para una MMP y una SP; y (ii) donde el sustrato CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable de manera que, en un estado no escindido, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana y en un estado escindido, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; (b) recuperar el anticuerpo activable; y (c) conjugar el anticuerpo recuperado con uno o más agentes adicionales.
La divulgación proporciona procedimientos para impedir, retrasar la progresión, tratar, aliviar un síntoma o mejorar de otro modo una enfermedad relacionada con la diana en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo conjugado activable descrito en esta invención a un sujeto que lo necesite.
La divulgación proporciona procedimientos para impedir, retrasar la progresión, tratar, aliviar un síntoma o mejorar de otro modo la inflamación y/o un trastorno inflamatorio en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención a un sujeto que lo necesite. La divulgación también proporciona procedimientos para impedir, retrasar la progresión, tratar, aliviar un síntoma o mejorar de otro modo el cáncer en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo conjugado activable descrito en esta invención a un sujeto que lo necesita. La divulgación también proporciona procedimientos para impedir, retrasar la progresión, tratar, aliviar un síntoma o mejorar de otro modo una enfermedad autoinmune en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo conjugado activable descrito en esta invención a un sujeto que lo necesite.
Un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado usado en cualquiera de las realizaciones de estos procedimientos y usos puede administrarse en cualquier etapa de la enfermedad. Por ejemplo, tal anticuerpo conjugado, anticuerpo activable y/o anticuerpo conjugable activable puede administrarse a un paciente que padece cáncer en cualquier etapa, desde temprano hasta metastásico. Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente en esta invención.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un roedor En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal de compañía. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal al cuidado de un veterinario.
El anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y las formulaciones terapéuticas de los mismos se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante de la diana. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante de la diana se identifica usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican usando cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican utilizando cualquiera de una diversidad de pruebas clínicas y/o de laboratorio, tal como un examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
La administración de un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo conjugado activable a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con expresión y/o actividad aberrante de la diana se considera exitosa si se logra cualquiera de una variedad de objetivos clínicos o de laboratorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo conjugado activable a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con expresión y/o actividad aberrante de la diana se considera exitosa si uno o más de los síntomas asociados con la la enfermedad o el trastorno se alivia, reduce, inhibe o no progresa a un estado posterior, es.decir, peor. La administración de un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo conjugado activable a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante de la diana se considera exitosa si la enfermedad o trastorno entra en remisión o no progresa a un estado posterior, es.decir, peor.
En algunas realizaciones, los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados descritos en esta invención se usan junto con uno o más agentes adicionales o una combinación de agentes adicionales. Los agentes adicionales adecuados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación prevista, tal como, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos, anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados pueden usarse junto con un agente quimioterapéutico o antineoplásico adicional.
En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son un agente quimioterapéutico, tal como un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en docetaxel, paclitaxel, abraxano (es decir, paclitaxel conjugado con albúmina), doxorrubicina, oxaliplatino, carboplatino, cisplatino, irinotecan y gemcitabina.
En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son un inhibidor de punto de control, un inhibidor de quinasa, un agente dirigido a inhibidores en el microambiente tumoral, y/o un agonista de células T o NK. En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son radioterapia, en solitario o en combinación con otro u otros agentes adicionales tal como un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son una vacuna, un oncovirus y/o un agente activador de DC tal como, a modo de ejemplo no limitativo, un agonista del receptor tipo toll (TLR) y/o a-CD40. En algunas realizaciones, el uno o más agentes adicionales son un anticuerpo dirigido a tumor diseñado para destruir el tumor a través de ADCC o a través de conjugación directa con una toxina (por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).
En algunas realizaciones, el inhibidor de punto de control es un inhibidor de una diana seleccionado de entre el grupo que consiste en CTLA-4, LAG-3, PD-1, p D-1, TIGIT, TIM-3, B7H4, BTLA, y Vista. En algunas realizaciones, el inhibidor de quinasa se selecciona de entre el grupo que consiste en inhibidores de B-RAFi, MEKi y Btk, tales como ibrutinib. En algunas realizaciones, el inhibidor de cinasa es crizotinib. En algunas realizaciones, el inhibidor del microambiente tumoral se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de IDO, un inhibidor de a-CSF1R, un inhibidor de a-CCR4, un TGF-beta, una célula supresora derivada de mieloide, o un linfocito de T regulador. En algunas realizaciones, el agonista se selecciona de entre el grupo que consiste en Ox40, GITR, CD137, ICOS, CD27, y HVEM.
En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de CTLA-4. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de TIGIT. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de TIM-3. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de B7H4. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de Vista. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de B-RAFi. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de MEKi. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de Btk. En algunas realizaciones, el inhibidor es ibrutinib. En algunas realizaciones, el inhibidor es crizotinib. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de IDO. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de a-CSF1R. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de a-CCR4. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de TGF-beta. En algunas realizaciones, el inhibidor es una célula supresora derivada de mieloides. En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de linfocito T regulador.
En algunas realizaciones, el agonista es Ox40. En algunas realizaciones, el agonista es GITR. En algunas realizaciones, el agonista es CD137. En algunas realizaciones, el agonista es ICOS. En algunas realizaciones, el agonista es CD27. En algunas realizaciones, el agonista es HVEM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable se administran durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio y/o un agente inmunosupresor. En algunas realizaciones, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional se formulan en una única composición terapéutica, y el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional se administran simultáneamente. Alternativamente, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional están separados entre sí, por ejemplo, cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional se administran simultáneamente, o el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional se administran en momentos diferentes durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable se administran antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable se administran después de la administración del agente adicional, o el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional se administran de forma alterna. Como se describe en esta invención, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional se administran en dosis únicas o en dosis múltiples.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y los agentes adicionales se administran simultáneamente. Por ejemplo, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el o los agentes adicionales pueden formularse en una única composición o administrarse como dos o más composiciones separadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y los agentes adicionales se administran secuencialmente, o el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugable activable se administran durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales tales como, a modo de ejemplo no limitante, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente quimioterapéutico, tal como un agente alquilante, un antimetabolito, un agente antimicrotúbulo, un inhibidor de topoisomerasa, un antibiótico citotóxico y/o cualquier otro agente que dañe los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el agente adicional es un taxano, como paclitaxel (por ejemplo, Abraxane®). En algunas realizaciones, el agente adicional es un antimetabolito, tal como gemcitabina. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente alquilante, tal como quimioterapia a base de platino, tal como carboplatino o cisplatino. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente dirigido, tal como un inhibidor de cinasa, por ejemplo, sorafenib o erlotinib. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente dirigido, tal como otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, bevacizumab), un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo multiespecífico. En algunas realizaciones, el agente adicional es un inhibidor de proteosoma, tal como bortezomib o carfilzomib. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente inmunomodulador, tal como lenalidomida o IL-2. En algunas realizaciones, el agente adicional es radiación. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente considerado estándar de cuidado por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente quimioterapéutico bien conocido por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, el agente adicional es un anticuerpo, otro anticuerpo conjugado, otro anticuerpo activable y/u otro anticuerpo conjugado activable. En algunas realizaciones, el agente adicional es un anticuerpo, otro anticuerpo conjugado, otro anticuerpo activable y/o otro anticuerpo activable conjugado contra la misma diana que el primer anticuerpo conjugado, anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado. En algunas realizaciones, el agente adicional es un anticuerpo, otro anticuerpo conjugado, otro anticuerpo activable y/u otro anticuerpo conjugado activable contra una diana diferente a la diana del primer anticuerpo conjugado, anticuerpo activable y/o anticuerpo conjugado activable.
En algunas realizaciones, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado y los agentes adicionales se administran simultáneamente. Por ejemplo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado y el o los agentea adicionales pueden formularse en una sola composición o administrarse como dos o más composiciones separadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo conjugado activable y los agentes adicionales se administran secuencialmente, 0 el anticuerpo y/o los anticuerpos conjugados y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo y/o anticuerpos conjugados se administra antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo y/o los anticuerpos conjugados se administran después de la administración del agente adicional, o el anticuerpo y/o los anticuerpos conjugados y el agente adicional se administran de forma alterna. Como se describe en esta invención, el anticuerpo y/o los anticuerpos conjugados y el agente adicional están en dosis únicas o en dosis múltiples.
La divulgación también proporciona procedimientos y kits para usar los anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados en una variedad de indicaciones de diagnóstico y/o profilácticas.
Las composiciones farmacéuticas según la divulgación pueden incluir un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo conjugado activable de la divulgación y un vehículo. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A y 1B son una serie de gráficos que representan los resultados de los ensayos ELISA de unión a Jagged 1 humanos que demuestran la unión del anticuerpo anti-Jagged y los anticuerpos activables enmascarados y activados. Tanto los anticuerpos activables (A) 2001 como (B) 1001/l P'/0001 que contienen sustrato fueron activados por uPA (una serina proteasa), MMP14 (una MMP) y uPA en combinación con MMP14. Los anticuerpos activables activados mostraron una unión equivalente al anticuerpo anti-Jagged.
La Figura 2 es un gráfico que representa las concentraciones séricas de IgG humana para el anticuerpo anti-Jagged y los anticuerpos activables 1001/LP/0001 y 2001 después de una dosis intravenosa única de 5 mg/kg. El anticuerpo anti-Jagged se elimina rápidamente debido a la eliminación mediada por la diana. Por el contrario, los anticuerpos activables anti-Jagged permanecen enmascarados en circulación.
La Figura 3 es un gráfico que representa el volumen del tumor HCC1806 (media del grupo ± SEM n=8) gráfico frente al tiempo después de la dosis inicial (SEM - Standard Error of the Mean = Error Estándar de la Media). Los grupos recibieron dosis el día 1 y el día 8 del estudio. Los grupos de anticuerpo anti-Jagged-SPDB-DM4 y anticuerpo activable anti-Jagged 2001-SPDB-DM4 mostraron regresión tumoral mientras que el grupo de isotipo-SPDB-DM4 no mostró inhibición del crecimiento tumoral.
La figura 4 es un gráfico que representa el porcentaje de peso corporal inicial (media del grupo n=8) ploteados frente al tiempo después de la dosis inicial. Los grupos recibieron dosis el día 1 y el día 8 del estudio. Los animales en el grupo tratado con anti-Jagged-SPDB-DM4 a Dc mostraron una pérdida de peso corporal significativa, mientras que los animales tratados con PBS, Isotipo-SPDB-DM4 ADC y el anticuerpo activable anti-Jagged 2001-SPDB-DM4 no mostraron una pérdida de peso significativa.
La Figura 5 es un gráfico que representa la activación in vivo de anticuerpos activables de EGFR medidos en plasma 8 días después de la dosis de 12,5 mg/kg de tales anticuerpos activables de EGFR en ratones portadores de tumores con xenoinjerto H292.
La Figura 6 es un gráfico que representa la eficacia in vivo de los anticuerpos activables de EGFR en ratones portadores de tumores con xenoinjerto H292.
La Figura 7 es un gráfico que representa la evaluación in situ de la activación de anticuerpos activables de EGFR en un microentorno tumoral de xenoinjerto H292.
Las Figuras 8A, 8B, 8C, 8D, 8E y 8F son una serie de gráficos que representan el volumen tumoral de los tumores de xenoinjerto H292 en ratones nu/nu en varios momentos después de la administración con una inmunoglobulina intravenosa de control (IgIV, Figura 8A), el anticuerpo anti-EGFR cetuximab (Figura 8B), el anticuerpo activable anti-EGFR denominado en esta invención anticuerpo activable anti-EGFR 2001, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 449 (Figura 8C); el anticuerpo activable anti-EGFR denominado en esta invención anticuerpo activable anti-EGFR 2003, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 472 (Figura 8D); o el anticuerpo activable anti-EGFR denominado en esta invención anticuerpo activable anti-EGFR 2005, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 474 (Figura 8E). Para los datos que se muestran en las Figuras 8C y 8D, cada grupo perdió un animal debido a la pérdida de peso corporal. La Figura 8F es un gráfico que plotea y compara los datos presentados en las Figuras 8A-8E en un único gráfico.
La Figura 9 es un gráfico que representa la toxicidad medida por la pérdida de peso corporal (BW) después de la administración con una inmunoglobulina intravenosa de control de isotipo (IgIV), una dosis de 20 mg/kg del anticuerpo anti-Jagged denominado en esta invención 4D11, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162, una dosis de 10 mg/kg del anticuerpo 4D11, una dosis de 5 mg/kg del anticuerpo 4D11, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2001, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67, y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 420, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 1004/LP/0001, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67, y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 432, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2003, que incluye la secuencia de cadena de SEQ ID NO: 67, y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 477, y el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2005, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67, y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 479. Los resultados se muestran como porcentaje de cambio de peso corporal relativo (BW) (%) en varios momentos del estudio.
La Figura 10 es un gráfico que representa la toxicidad medida por la pérdida de peso corporal (BW) después de la administración con una inmunoglobulina intravenosa de control de isotipo (IgIV), una dosis de 20 mg/kg del anticuerpo anti-Jagged denominado en esta invención 4D11, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162, una dosis de 10 mg/kg del anticuerpo 4D11, una dosis de 5 mg/kg del anticuerpo 4D11, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2001 ("2001"), que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 420, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 1004/LP'/0001, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 432, y el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 1004/LP'/0003, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 424. Los resultados se muestran como porcentaje de cambio de peso corporal relativo (BW) (%) en varios momentos del estudio.
Las Figuras 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F, 11G y 11H y la Figura 12 son una serie de gráficos que representan la eficacia de diversos sustratos de la divulgación cuando se incorporan en anticuerpos anti-EGFR activables de la divulgación. La eficacia de los sustratos se evaluó midiendo el volumen del tumor (TV mm3) en varios momentos después de la administración.
La Figura 13 es un gráfico que representa la toxicidad medida en función de la pérdida de peso corporal (BW) en ratones DBA/1 después de la administración con inmunoglobulina intravenosa de control (IgIV), con anticuerpos anti-Jagged de la divulgación, y con anticuerpos anti-Jagged activables de la divulgación que incluyen varios sustratos de la divulgación.
La figura 14 es un gráfico que representa la reconstrucción 3D de los datos de formación de imágenes FLIT-pCT para cetuximab y dos anticuerpos activables EGFR que contienen sustratos en tándem en H292 (flechas abiertas) y modelo de tumor de xenoinjerto coimplantado FaDu (flechas rellenas).
Descripción detallada de la invención
La divulgación proporciona secuencias de aminoácidos que incluyen al menos un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). Estos sustratos de CM1-CM2 son útiles en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas. Por ejemplo, estos sustratos de CM1-CM2 son útiles en anticuerpos activables que incluyen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (AB) que incluyen al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido a al menos un dominio de unión a antígeno o epítopo de AB de tal manera que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB para unirse a su diana.
Los ejemplos de trabajo proporcionados en esta invención demuestran que estos sustratos de CM1-CM2 exhiben una serie de características de escisión deseables cuando se exponen a al menos una proteasa MMP y/o a al menos una proteasa SP en condiciones específicas.
La divulgación también proporciona anticuerpos que incluyen uno o más de estos sustratos de CM1-CM2. Por ejemplo, estos sustratos de CM1-CM2 son útiles cuando se conjugan anticuerpos con uno o más agentes adicionales para producir anticuerpos conjugados. Estos sustratos de CM1-CM2 también son útiles en anticuerpos activables. y/o conjugados de anticuerpos activables.
Los anticuerpos conjugados, anticuerpos activables, y/o los anticuerpos activables conjugados incluyen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana. Clases ejemplares de dianas de un AB incluyen, pero no se limitan necesariamente a, receptores de la superficie celular y proteínas de unión secretadas (p. ej., factores de crecimiento), enzimas solubles, proteínas estructurales (p. ej., colágeno, fibronectina) y similares. En algunas realizaciones, los anticuerpos conjugados y/o los anticuerpos activables tienen un AB que se une a una diana extracelular, generalmente una diana de proteína extracelular. En algunas realizaciones, los anticuerpos conjugados y/o los anticuerpos activables están diseñados para la captación celular y se pueden cambiar dentro de una célula.
Como ejemplo no limitativo, el AB es un compañero vinculante para cualquier diana enumerada en la Tabla 1.
Tabla 1: Dianas e emplares
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Como ejemplo no limitante, el AB es o se deriva de un anticuerpo enumerado en la Tabla 2.
T l 2: F n m l r r A
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000025_0003
Figure imgf000026_0001
Ejemplos de anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o los anticuerpos activables conjugados de la divulgación incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen al receptor de la interleucina 6 (IL-6R) y que incluyen una cadena pesada y una cadena ligera que son, o se derivan del anticuerpo denominado en esta invención anticuerpo "Av1", que se une al receptor de interleucina-6 (IL-6R). Las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada de Av1 y la cadena ligera de Av1 se muestran a continuación en SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 101, respectivamente.
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo Av1:
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYN
P S L KS RVTISRDNSKNTLYLQMNS L RAE DTAVYY CARS LARTTAMD YWGQGSLVTVS SAS T
KG PSVF P LAP S S KST S GGTAAL GC LVKDY F P E PVTVSWN S GALTSGVHTFPAVLQS S G L YS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 100 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera del anticuerpo Av1:
DIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSR
FSGSG3GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 101 )
Ejemplos de anticuerpos activables y/o los anticuerpos activables conjugados de la divulgación incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen al receptor de interleucina 6 (IL-6R) y que incluyen una cadena pesada y una cadena ligera que son, o se derivan del anticuerpo Av1 y un resto de enmascaramiento. Anticuerpos activables ejemplares y/o los anticuerpos activables conjugados de la divulgación incluyen una secuencia de aminoácidos unida al extremo N de la cadena ligera AV1. Estas secuencias de aminoácidos de extremo N incluyen, por ejemplo, YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 102); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 103); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 104); QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 105); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 106); o QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 107). También debe apreciarse que dichas secuencias de aminoácidos pueden unirse al extremo N de la cadena pesada de AV1 o al extremo C de la cadena pesada o ligera de AV1.
Anticuerpos activables ejemplares de la divulgación incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y que incluyen una cadena pesada y una cadena ligera que son, o se derivan de, un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en el anticuerpo mencionado en esta invención como el anticuerpo "c225v5" (también denominado en esta invención como el anticuerpo C225v5), el anticuerpo denominado en esta invención como el anticuerpo "c225v4" (también denominado en esta invención como el anticuerpo C225v4), y el anticuerpo denominado en esta invención como el "c225v6" anticuerpo (también denominado en esta invención como anticuerpo C225v6), cada uno de los cuales se une a EGFR. El anticuerpo c225v5, el anticuerpo c225v4 y el anticuerpo c225v6 comparten la misma secuencia de cadena ligera, denominada en esta invención "cadena ligera c225". Las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada c225v5, el anticuerpo c225v4, el anticuerpo c225v6 y la cadena ligera c225 se muestran a continuación.
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo C225v5:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT
PFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 108 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo C225v4:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT
PF T S RLS I NKDNSKSQVFFKMNS L QSNDTAI YYCARALT YYDYE FAYWGQGTLVTVSAAST
KG PSVF P LAP S S KST S GGTAAL GC LVKDY F P E PVTVSWN 5 GALTSGVHTFPAVLQ33 G L YS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTPÍVDKKVEPPtSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV3HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN3TYRW
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 109 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo C225v6:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT
P F T S R L S INKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAAST
KGPSVFPLAP3 SKSTSGGTAALGCLVKDY FPE PVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ3 SGLY 3
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRW
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS
LTCLVKGFYP3DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 110 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera del anticuerpo C225:
Q ILL TQ SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSG3GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 111 )
Anticuerpos conjugados ejemplares y/o los anticuerpos activables de la divulgación incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged-1, Jagged-2 y/o tanto Jagged-1 como Jagged-2, y que incluyen una combinación de una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable que son, o se derivan de, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable que se muestran a continuación. Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR {SEQ ID
NO: 112 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc4
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 113 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc5
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 114 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc5
EVQLLESGGGLVQPGG3LRLSCAASGFTFSSYAM3WVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTI5RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYHGQFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 115 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc7
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 116 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc7
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 118 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc8
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIGRTNPFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc13
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 120 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc13
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 121 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc16
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 122 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc16
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCAKSPPYYGQFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 123 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc19
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 124 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc19
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc21
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 126 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc21
EVQLLESGGGLVQPGGSIRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc24
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 128 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc24
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 129 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc26
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR {SEQ ID
NO: 130)
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc26
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc27
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA5SLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 132 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc27
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc28
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAA5SLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 134 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc28
EVQLLESGGGLVQPGGS1RLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc30
DIQMTQSPSSL3ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVP3R
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 136 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc30
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 137 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc31
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 138 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc31
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc32
D IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 140)
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc32
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 141 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc37
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 142 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc37
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPHNGQFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc39
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 144 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc39
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 145 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc40
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 146 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada Hc40
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 147 )
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable Lc47
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 148 )
Secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable Hc47
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTEYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 149 )
Cadena ligera variable 4B2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLDAPPQFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 150 )
Cadena pesada variable 4B2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
Cadena ligera variable 4D11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSG3GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 152 )
Cadena pesada variable 4D11
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
Cadena ligera variable 4E7
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 154 )
Cadena pesada variable 4E7
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTKYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 155 )
Cadena ligera variable 4E11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALDAPLMFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 156 )
Cadena pesada variable 4E11
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEPMGQLTEYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 157 )
Cadena ligera variable 6B7
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR { 5EQ ID
NO: 158)
Cadena pesada variable 6B7
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 159 )
Cadena ligera variable 6F8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 160 )
Cadena pesada variable 6F8
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 161 )
Anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos conjugados activables ejemplares de la divulgación incluyen, por ejemplo, anticuerpos que se unen a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged-1, Jagged-2 y/o Jagged-1 y Jagged-2, y que incluyen una combinación de una región de cadena pesada y una región de cadena ligera que son, o se derivan de, las secuencias de cadena pesada y cadena ligera que se muestran a continuación.
4D11 Secuencia de cadenas ligeras:
D I QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSG3GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 162 )
4D11 Secuencia de cadenas pesadas:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 67)
Secuencia de cadena pesada 4D11v2
EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSAST
KG PSVFP LAP S S KST S GGTAAL GC LVKDY F P E PVTVSWN5 GALTSGVHTFPAVLQS S G L YS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 163 )
4Dllv2 Secuencia de cadena ligera
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLXK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 164)
Los anticuerpos activables y las composiciones de anticuerpos activables proporcionadas en esta invención contienen al menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo (denominados colectivamente como AB en toda la divulgación) que se une específicamente a una diana, por ejemplo, una diana humana, donde el AB está modificado por un resto de enmascaramiento (MM).
En algunas realizaciones, el resto de enmascaramiento se selecciona para su uso con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico. Por ejemplo, restos de enmascaramiento adecuados para usar con anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MM que incluyen la secuencia CISPRG (SEQ ID NO: 165). A modo de ejemplos no limitativos, el MM puede incluir una secuencia como CISPRGC (SEQ ID NO: 166); CISPRGCG (SEQ ID NO: 167); CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 168); CISPRGCPDGPYVM (SEQ ID N°: 169), CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID N°: 170) y CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID N°: 171). Otros restos de enmascaramiento adecuados incluyen cualquiera de las máscaras específicas de EGFR descritas en la Publicación PCT No. WO 2010/081173, tales como, a modo de ejemplo no limitativo, GSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 172); CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 173); CNHHYFYTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 174); ADHVFWGSYGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 175); CHHVYWGHCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 176); CPHFTTTSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO 177) CNHHYHYYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: CPHVSFGSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO 179) CPYYTLSYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 180); CNHVYFGTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO 181) CNHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 182); CHHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO 183) YNPCATPMCCISPRGCPG (SEQ ID NO: 184); CNHHYFYTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 185) CNHHYHYYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 186); CNHVYFGTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 187) CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 188); CPHFTTTSCGCISPRGCG (SEQ ID NO 189) CNHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 190); CHHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 191) CPYYTLSYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 192); CPHVSFGSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 193) ADHVFWGSYGCISPRGCG (SEQ ID NO: 194); YNPCATPMCCISPRGCG (SEQ ID NO: 195) CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 196); C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG (SEQ ID N°: 197); CISPRGCGQPIPSVK (SEQ ID NO: 198); CISPRGCTQPYHVSR (SEQ ID NO: 199); y/o CISPRGCNAVSGLGS (SEQ ID NO: 200).
Restos de enmascaramiento adecuados para usar con anticuerpos que se unen a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, incluyen, a modo de ejemplo no limitante, restos de enmascaramiento que incluyen una secuencia tal como QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 201); QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 202); PWCMQRQDFLRCPQP (SEQ ID NO: 203); QLGLPAYMCTFECLR (SEQ ID NO: 204); CNLWVSGGDCGGLQG (SEQ ID NO: 205); SCSLWTSGSCLPHSP (SEQ ID N°: 206); YCLQLPHYMQAMCGR (SEQ ID NO: 207); CFLYSCTDVSYWNNT (SEQ ID N°: 208); PWCMQRQDYLRCPQP (SEQ ID NO: 209); CNLWISGGDCRGLAG (SEQ ID NO: 210); CNLWVSGGDCRGVQG (SEQ ID NO: 211); CNLWVSGGDCRGLRG (SEQ ID NO: 212); CNLWISGGDCRGLPG (SEQ ID NO: 213); CNLWVSGGDCRDAPW (SEQ ID NO: 214); CNLWVSGGDCRDLLG (SEQ ID NO: 215); CNLWVSGGDCRGLQG (SEQ ID NO: 216); CNLWLHGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 217); CNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 218); CTTWFCGGDCGVMRG (SEQ ID NO: 219); CNIWGPSVDCGALLG (SEQ ID NO: 220); CNIWVNGGDCRSFEG (SEQ ID NO: 221); YCLNLPRYMQDMCWA (SEQ ID NO: 222); YCLALPHYMQADCAR (SEQ ID NO: 223); CFLYSCGDVSYWGSA (SEQ ID NO: 224); CYLYSCTDSAFWNNR (SEQ ID NO: 225); CYLYSCNDVSYWSNT (SEQ ID NO: 226); CFLYSCTDVSYW (SEC ID N°: 227); CFLYSCTDVAYWNSA (SEQ ID NO: 228); CFLYSCTDVSYWGDT (SEQ ID NO: 229); CFLYSCTDVSYWGNS (SEC ID N°: 230); CFLYSCTDVAYWNNT (SEQ ID N°: 231); CFLYSCGDVSYWGNPGLS (SEQ ID NO: 232); CFLYSCTDVAYWSGL (SEQ ID N°: 233); CYLYSCTDGSYWNST (SEQ ID NO: 234); CFLYSCSDVSYWGNI (SEQ ID N°: 235); CFLYSCTDVAYW (SEC ID N°: 236); CFLYSCTDVSYWGST (SEQ ID N°: 237); CFLYSCTDVAYWGDT (SEQ ID NO: 238); GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG (SEQ ID NO: 239); GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG (SEQ ID NO: 240); GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG (SEQ ID NO: 241); GCNIWANGGDCRGWIDNIDG (SEQ ID NO: 242); GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG (SEQ ID NO: 243); GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG (SEQ ID NO: 244); GGPALCNIWLNGGDCRGWSG (SEQ ID NO: 245); GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG (SEQ ID NO: 246); GQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 247); GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG (SEQ ID NO: 248); GTPGGCNIWANGGDCRGWEG (SEQ ID NO: 249); GASQYCNLWINGGDCRGWRG (SEQ ID NO: 250); GCNIWLVGGDCRPWVEGG (SEQ ID NO: 251); GCNIWAVGGDCRPFVDGG (SEQ ID NO: 252); GCNIWLNGGDCRAWVDTG (SEQ ID NO: 253); GCNIWIVGGDCRPFINDG (SEQ ID NO 254); GCNIWLNGGDCRPVVFGG (SEQ ID NO: 255); GCNIWLSGGDCRMFMNEG (SEQ ID NO: 256); GCNIWVNGGDCRSFVYSG (SEQ ID NO: 257); GCNIWLNGGDCRGWEASG (SEQ ID NO: 258); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 259); GCNIWLNGGDCRTFVASG (SEQ ID NO: 260); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 261); GFLENCNIWLNGGDCRTG (SEQ ID NO: 262); GIYENCNIWLNGGDCRMG (SEQ ID NO: 263); y/o GIPDNCNIWINGGDCRYG (SEQ ID NO: 264).
Restos de enmascaramiento adecuados para usar con anticuerpos que se unen a una diana de interleucina 6, por ejemplo, el receptor de interleucina 6 (IL-6R), incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, restos de enmascaramiento que incluyen una secuencia como q Gq SGQYGSCsW n YVHIFMDC (SEQ ID NO: 265 ); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 266); QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 267); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 268); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID N°: 269); ESSCVWNYVHIYMDC (SEQ ID NO: 270); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 271); YRTCSWNYVGIFLDC (SEQ ID NO: 272); YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 273); YGSCSWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 274); YGSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 275); YTSCNWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 276); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 277); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 278); WSNCHWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 279); DRSCTWNYVRISYDC (SEQ ID NO: 280); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 281); SRSCIWNYAHIHLDC (SEQ ID NO: 282); SMSCYWQYERIFLDC (SEQ ID N°: 283); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 284); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 285); YKSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 286); YGSCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 287); FSSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 288); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 289); YGSCQWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 290); YRSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 291); NMSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 292); FGPCTWNYARISWDC (SEQ ID NO: 293); XXsCXWXYvhIfXdC (SEQ ID NO: 294); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 295); RDTGGQCRWDYVHIFMDC (SEQ ID NO: 296); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 297); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 298); DGGPAGCSWNYVH IFMEC (SEQ ID NO: 299); AVGPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 300); CTWNYVHIFMDCGEGEGP (SEQ ID NO 301); GGVPEGCTWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 302); AEVPAGCWWNYVH IFMEC (SEQ ID NO: 303); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 304); SGASGGCKWNYVHIFMDC (SEQ ID NO 305); TPGCRWNYVHIFMECEAL (SEQ ID NO: 306); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO 307); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID N°: 308); RGACDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 309); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 310); XGafDIPFPAHWvPnT (SEQ ID NO: 311); RGDGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 312); SGVGRDRDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 313); WAGGNDCDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 314); WGDGMDVDIPFPAHWVPVT (SEQ ID NO: 315) ; AGSGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 316); ESRSGYADIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 317); y/o RECGRCGDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 318).
Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental a la diana.
La Kd del AB modificado con un MM hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10­ 1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000­ 1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces mayor que la Kd del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificador con un MM hacia la diana es al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10­ 100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000­ 10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana.
La constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es generalmente mayor que la Kd del AB hacia la diana. La Kd del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces mayor que la Kd del AB hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del MM hacia el AB es generalmente menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana. La afinidad de unión del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 o incluso 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana.
Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o se inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental a la diana. En comparación con la unión del AB no modificado con un MM o la unión del AB parental a la diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM puede reducirse en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso un 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro .
El MM inhibe la unión del AB a la diana. El MM se une al dominio de unión a antígeno del AB e inhibe la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir estéricamente la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir alostéricamente la unión del AB a su diana. En estas realizaciones, cuando el AB se modifica o se acopla a un MM y en presencia de la diana, no hay unión o no hay sustancialmente ninguna unión del AB a la diana, o no más del 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, o del 50 % de unión del AB a la diana, en comparación con la unión del AB no modificado con un MM, el AB parental, o el AB no acoplado a un MM a la diana, durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro .
Cuando un AB está acoplado o modificado por un MM, el MM "enmascara" o reduce o inhibe de otro modo la unión específica del AB a la diana. Cuando un AB está acoplado o modificado por un MM, dicho acoplamiento o modificación puede efectuar un cambio estructural que reduce o inhibe la capacidad del AB para unirse específicamente a su diana.
Un AB acoplado o modificado con un MM se puede representar mediante las siguientes fórmulas (en orden desde una región terminal amino (N) hasta una región terminal carboxilo (C):
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
donde MM es un resto de enmascaramiento, AB es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, y L es un enlazador. En muchas realizaciones, puede ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en la composición para proporcionar flexibilidad.
En ciertas realizaciones, el MM no es una pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no contiene o sustancialmente no tiene homología con ninguna pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % similar a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 25 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 50 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 20 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 10 % idéntico a cualquier compañero de unión natural del AB.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables incluyen un AB que está modificado por un MM y también incluye al menos un resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sujeto para al menos una serina proteasa (SP). Dichos anticuerpos activables exhiben unión activable/conmutable, a la diana del AB. Los anticuerpos activables generalmente incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB), modificado o acoplado a un resto de enmascaramiento (MM) y un sustrato de CM1-CM2.
Los elementos de los anticuerpos activables están dispuestos de manera que el sustrato MM y CM1-CM2 se colocan de tal manera que en un estado escindido (o relativamente activo) y en presencia de una diana, el AB se une a una diana mientras que en un estado no escindido (o relativamente activo). inactivo) en presencia de la diana, se reduce o inhibe la unión específica del AB a su diana. La unión específica del AB a su diana puede reducirse debido a la inhibición o el enmascaramiento de la capacidad del AB para unirse específicamente su diana por el MM.
La Kd del AB modificado con un sustrato MM y CM1-CM2 hacia la diana es de al menos 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000 , 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000 , 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces mayor que la Kd del AB no modificado con un MM y un sustrato de CM1-CM2 o del AB parental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificado con un MM y un sustrato CM1-CM2 hacia la diana es de al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10- 10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000­ 1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000­ 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM y un sustrato CM1-CM2 o del AB parental hacia la diana.
Cuando el AB se modifica con un MM y un sustrato de CM1-CM2 y está en presencia de la diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo, un MMP y un SP), la unión específica del AB a su diana es reducida o inhibida, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM y un sustrato de CM1-CM2 o del AB original a la diana. Cuando se compara con la unión del AB parental o la unión de un AB no modificado con un MM y un sustrato de CM1-CM2 a su diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM y un sustrato de CM1-CM2 puede ser reducido en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso 100 % durante al menos 2 , 4 , 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 o 180 días , o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide en un ensayo in vivo o en un ensayo in vitro .
Como se usa en esta invención, el término estado escindido se refiere a la condición de los anticuerpos activables tras la modificación, es decir, escisión, del sustrato de CM1-CM2 por al menos una metaloproteasa de matriz y/o al menos una serina proteasa. El término estado no escindido o completamente no escindido, como se usa en esta invención, se refiere a la condición de los anticuerpos activables en ausencia de escisión del sustrato de CM1-CM2 por una MMP y/o una SP. Como se ha analizado anteriormente, el término "anticuerpos activables" se usa en esta invención para referirse a un anticuerpo activable tanto en su estado no escindido (nativo) como en su estado escindido. Un anticuerpo activable en su estado escindido también se denomina en esta invención anticuerpo activado. y/o anticuerpo activable activado. Será evidente para el experto en la materia que en algunas realizaciones, un anticuerpo activable escindido puede carecer de un MM debido a la escisión del sustrato de CM1-CM2 por la proteasa, lo que da como resultado la liberación de al menos el MM.
Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable exhibe un primer nivel de unión a una diana cuando está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana en el estado desinhibido, desenmascarado. y/o estado escindido (es decir, una segunda conformación), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión. En general, el acceso de la diana al AB del anticuerpo activable es mayor en presencia de un agente de escisión capaz de escindir el sustrato de CM1-CM2 que en ausencia de dicho agente de escisión. Por lo tanto, cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, el AB se inhibe de la unión a la diana y se puede enmascarar de la unión a la diana (es decir, la primera conformación es tal que el AB no puede unirse a la diana), y en el estado escindido el AB es no se inhibe o se desenmascara para la unión a la diana.
El sustrato de CM1-CM2 y AB de los anticuerpos activables se seleccionan de modo que AB represente un resto de unión para una diana determinada, y el sustrato de CM1-CM2 represente un sustrato para una MMP y una SP, donde la MMP y/o las SP se co-localizan con la diana en un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico en un sujeto. Los anticuerpos activables descritos en esta invención encuentran un uso particular cuando, por ejemplo, una m Mp y una SP, cada una capaz de escindir un sitio en el sustrato de CM1-CM2, están presentes en niveles relativamente más altos en el tejido que contiene la diana de un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico. que en tejido de sitios no tratados (por ejemplo, en tejido sano).
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables proporcionan una toxicidad y/o efectos secundarios adversos reducidos que de otro modo podrían ser resultado de la unión del AB en sitios sin tratamiento si el AB no se enmascara o se inhibe de otro modo su unión a la diana.
En general, un anticuerpo activable puede diseñarse seleccionando un AB de interés y construyendo el resto del anticuerpo activable de manera que, cuando esté conformacionalmente limitado, el m M proporcione el enmascaramiento del AB o la reducción de la unión del AB a su diana. Se deben tener en cuenta los criterios de diseño estructural para proporcionar esta característica funcional.
Se proporcionan anticuerpos activables que exhiben un fenotipo conmutable de un rango dinámico deseado para la unión a la diana en una conformación inhibida frente a una no inhibida. El intervalo dinámico generalmente se refiere a una relación de (a) un nivel máximo detectado de un parámetro en un primer conjunto de condiciones con respecto a (b) un valor mínimo detectado de ese parámetro en un segundo conjunto de condiciones. Por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo activable, el intervalo dinámico se refiere a la proporción de (a) un nivel máximo detectado de unión de la proteína diana a un anticuerpo activable en presencia de una MMP y una SP que son capaces de escindir el sustrato de CM1-CM2 de los anticuerpos activables para (b) un nivel mínimo detectado de proteína diana que se une a un anticuerpo activable en ausencia de la proteasa. El intervalo dinámico de un anticuerpo activable puede calcularse como la relación de la constante de disociación de un tratamiento del agente de escisión de anticuerpos activables (porejemplo, enzima) con respecto a la constante de disociación del tratamiento del agente de escisión de anticuerpos activables. Cuanto mayor sea el intervalo dinámico de un anticuerpo activable, mejor será el fenotipo conmutable del anticuerpo activable. Los anticuerpos activables que tienen valores de intervalo dinámico relativamente más altos (por ejemplo, mayor de 1) exhiben fenotipos conmutables más deseables de tal manera que la unión de la proteína diana por los anticuerpos activables se produce en mayor medida (por ejemplo, se produce predominantemente) en presencia de un agente de escisión (por ejemplo, una enzima) capaz de escindir el sustrato de CM1-CM2 de los anticuerpos activables que en ausencia de un agente de escisión.
Los anticuerpos activables se pueden proporcionar en una diversidad de configuraciones estructurales. A continuación se proporcionan fórmulas ejemplares para anticuerpos activables. Se contempla específicamente que el orden de los extremos N a C del AB, m M y sustrato de CM1-CM2 puede invertirse dentro de un anticuerpo activable. También se contempla específicamente que el CM y el MM pueden superponerse en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, de modo que el sustrato de CM1-CM2 esté contenido al menos parcialmente dentro del MM.
Por ejemplo, los anticuerpos activables se pueden representar mediante la siguiente fórmula (en orden desde una región de extremo amino (N) hasta una región de extremo carboxilo (C):
(MM)-(CM1-CM2 sustrato)-(AB)
(AB)-(CM1-CM2 sustrato)-(MM)
donde MM es un resto de enmascaramiento, el sustrato de CM1-CM2 es un resto escindible y AB es un anticuerpo o fragmento del mismo. Como se señaló anteriormente, el término "sustrato de CM1-CM2" no pretende transmitir ningún requisito relacionado con la orientación u otra disposición estructural del primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). Por lo tanto, el término "sustratos de CM1-CM2" abarca sustratos de CM1-CM2 que tienen la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue: CM1-CM2 o CM2-CM1. El término "sustratos de CM1-CM2" también abarca sustratos en los que al menos una porción de la secuencia de CM1 se solapa con al menos una porción de la secuencia de CM2. También se debe tener en cuenta que aunque el sustrato MM y CM1-CM2 se indican como componentes distintos en las fórmulas anteriores, en todas las realizaciones ejemplares (incluidas las fórmulas) descritas en esta invención se contempla que las secuencias de aminoácidos del sustrato MM y CM1-CM2 podría superponerse, por ejemplo, de modo que el sustrato de CM1-CM2 esté total o parcialmente contenido dentro del MM. Además, las fórmulas anteriores proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales que pueden posicionarse en el extremo N-terminal o C-terminal con respecto a los elementos de anticuerpos activables.
En ciertas realizaciones, el MM no es una pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no contiene o sustancialmente no tiene homología con ninguna pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % similar a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, o un 80 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 50 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 25 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 20 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB. En algunas realizaciones, el MM no es más de un 10 % idéntico a cualquier pareja de unión natural del AB.
En muchas realizaciones, puede ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en la construcción de anticuerpo activable para proporcionar flexibilidad en una o más de la unión del sustrato de MM-CM1-CM2, el sustrato de CM1-CM2- Unión A b , o ambas. Por ejemplo, el sustrato AB, MM y/o CM1-CM2 puede no contener una cantidad suficiente de residuos (por ejemplo, Gly, Ser, Asp, Asn, especialmente Gly y Ser, particularmente Gly) para proporcionar la flexibilidad deseada. Como tal, el fenotipo conmutable de dichas construcciones de anticuerpo activable puede beneficiarse de la introducción de uno o más aminoácidos para proporcionar un enlazador flexible. Además, como se describe a continuación, cuando el anticuerpo activable se proporciona como una construcción conformacionalmente limitada, se puede insertar operativamente un enlazador flexible para facilitar la formación y el mantenimiento de una estructura cíclica en el anticuerpo activable no escindido.
Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un anticuerpo activable comprende una de las siguientes fórmulas (donde la fórmula a continuación representa una secuencia de aminoácidos en dirección delo extremo N al C o dirección del extremo C al N):
(MM)-L1-(CM1-CM2 sustrato)-(AB)
(MM)-(CM1-CM2 sustrato)-L2-(AB)
(MM)-L1 -(CM 1-CM2 sustrato)-L2-(AB)
donde MM, sustrato de CM1-CM2 y AB son como se definen anteriormente; donde L1 y L2 están cada uno independientemente y opcionalmente presentes o ausentes, son enlazadores flexibles iguales o diferentes que incluyen al menos 1 aminoácido flexible (p.ej., Gly). Además, las fórmulas anteriores proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales que pueden posicionarse en el extremo N-terminal o C-terminal con respecto a los elementos de anticuerpos activables. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, restos de direccionamiento (por ejemplo, un ligando para un receptor de una célula presente en un tejido diana) y restos que extienden la semivida en suero (por ejemplo, polipéptidos que se unen a proteínas séricas, tal como inmunoglobulina (por ejemplo, IgG) o albúmina sérica (por ejemplo, albúmina sérica humana (HAS))
El sustrato de CM1-CM2 se escinde específicamente por al menos una MMP a una velocidad de aproximadamente 0,001-1500 x 104 M"1S"1 o al menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, o 1500 x 104 M'1S'1 y se escinde específicamente por al menos un SP en una tasa de aproximadamente 0,001-1500 x 104 M'1S'1 o al menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, o 1500 x 104 M'1S'1.
Para la escisión específica por una enzima, se establece contacto entre la enzima y el sustrato de CM1-CM2. Cuando el anticuerpo activable que comprende un AB acoplado a un MM y un sustrato de CM1-CM2 está en presencia de actividad enzimática diana y suficiente, el sustrato de CM1-CM2 puede escindirse. La actividad enzimática suficiente puede referirse a la capacidad de la enzima para ponerse en contacto con el sustrato de CM1-CM2 y efectuar la escisión. Se puede prever fácilmente que una enzima puede estar en las proximidades del sustrato de CM1-CM2 pero no puede escindirse debido a otros factores celulares o modificación de proteínas de la enzima.
Los enlazadores adecuados para su uso en las composiciones descritas en esta invención generalmente son los que proporcionan flexibilidad del AB modificado o los anticuerpos activables para facilitar la inhibición de la unión del AB a la diana. Dichos enlazadores generalmente se denominan enlazadores flexibles. Los enlazadores adecuados se pueden seleccionar fácilmente y pueden ser de cualquiera de las longitudes adecuadas, tales como de 1 aminoácido (por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluyendo de 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, de 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, de 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, o de 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, y pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos de longitud.
Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 381) y (GGGS)n (SEQ iD No : 382), donde n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un enlace neutro entre los componentes. La glicina accede significativamente a más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (véase Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173--142 (1992)). Enlazadores flexibles ejemplares incluyen, pero sin limitación, Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 383), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 384, Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 385), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 386), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 387), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 388), y similares. El experto en la técnica reconocerá que el diseño de los anticuerpos activables puede incluir enlazadores que sean total o parcialmente flexibles, de modo que el enlazador puede incluir un enlazador flexible, así como una o más porciones que confieran una estructura menos flexible para proporcionar una estructura de los anticuerpos activables deseada.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables descritos en esta invención también incluyen un agente conjugado con el anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el agente conjugado es un agente terapéutico, tal como un agente antiinflamatorio y/o antineoplásico. En dichas realizaciones, el agente se conjuga con un resto de carbohidrato del anticuerpo activable, por ejemplo, en algunas realizaciones, donde el resto de carbohidrato se encuentra fuera de la región de unión a antígeno del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el anticuerpo activable. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con un grupo sulfhidrilo del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, el agente es un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo(es decir, un radioconjugado).
En algunas realizaciones, el agente es un resto detectable tal como, por ejemplo, una etiqueta u otro marcador. Por ejemplo, el agente es o incluye un aminoácido radiomarcado, uno o más restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante procedimientos ópticos o calorimétricos), uno o más radioisótopos o radionúclidos, uno o más marcadores fluorescentes, uno o más marcadores enzimáticos, y/o uno o más agentes quimioluminiscentes. En algunas realizaciones, los restos detectables están unidos por moléculas espaciadoras.
La divulgación también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatina y derivados de la misma (porejemplo auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, DMAF, Dm a E). Por ejemplo, el agente es monometil auristatina E (MmAE) o monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina o un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida caproil-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente se une al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD) unido al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-para-aminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en el presente documento "vc-MMAD". En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE) unida al AB usando un enlazador de maleimida PEG-valina-citrulina-paraaminobenciloxicarbonilo, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina en esta invención "vc-MMa E". Las estructuras de vc-MMAD y vc-MMAE se muestran a continuación:
vc-MMAD
Figure imgf000040_0001
vc-MMAE:
Figure imgf000040_0002
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de difteria, los fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricino, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una diversidad de radionucleidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 9°Y, y 186Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tal como glutareldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de bis-flúor activo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. ( Véase WO94/11026).
La Tabla 3 enumera algunos de los agentes farmacéuticos ejemplares que pueden emplearse en la divuilgación descrita en esta invención, pero de ninguna manera pretende ser una lista exhaustiva.
T l : A n f rm i m l r r n i n
Figure imgf000040_0003
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000042_0001
Los expertos en la técnica reconocerán que una gran diversidad de restos posibles se pueden acoplar a los anticuerpos resultantes de la divulgación. (Véase, por ejemplo, “Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
El acoplamiento se puede lograr mediante cualquier reacción química que se unirá a las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el resto conserven sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. En algunas realizaciones, la unión es, sin embargo, una unión covalente. La unión covalente se puede lograr mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de unión bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente descripción, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidas en la técnica, sino que es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes (Véase Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen y col., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta y col., Science 238:1098 (1987).
En algunas realizaciones, además de las composiciones y procedimientos proporcionados en esta invención, el anticuerpo activable conjugado también puede modificarse para la conjugación específica del sitio a través de secuencias de aminoácidos modificadas insertadas o incluidas de otro modo en la secuencia de anticuerpo activable. Estas secuencias de aminoácidos modificadas están diseñadas para permitir la colocación controlada y/o la dosificación del agente conjugado dentro de un anticuerpo activable conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir sustituciones de cisteína en posiciones en las cadenas ligeras y pesadas que proporcionan grupos tiol reactivos y no afectan negativamente al plegamiento y ensamblaje de proteínas, ni alteran la unión al antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable se puede diseñar para incluir o de otro modo introducir uno o más residuos de aminoácidos no naturales dentro del anticuerpo activable para proporcionar sitios adecuados para la conjugación. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir o introducir de otro modo secuencias peptídicas enzimáticamente activables dentro de la secuencia de anticuerpo activable.
Se describen enlazadores adecuados en la bibliografía. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. y col., Cancer Res.
44:201-208 (1984) que describen el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también, Patente de EE.UU. N° 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetilhidrazida halogenada acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico. En algunas realizaciones, los enlazadores adecuados incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-d itio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat n.° 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamido]hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. N° 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida: Pierce Chem. Co., Cat. N° 24510) conjugado con EDC. Enlazadores adicionales incluyen, pero no se limitan a, SMCC, sulfo-SMCC, SPDB o sulfo-SPDB.
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen atributos diferentes, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen éster de NHS son menos solubles que los ésteres de sulfo-NHS. Además, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, en general, son menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se escinde in vitro, lo que da como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodimida (tal como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida en solitario.
En algunas realizaciones, los enlazadores son escindibles. En algunas realizaciones, los enlazadores no son escindibles. En algunas realizaciones, están presentes dos o más enlazadores. Los dos o más enlazadores son todos iguales, es decir, escindibles o no escindibles, o los dos o más enlazadores son diferentes, es decir, al menos uno escindible y al menos uno no escindible.
La presente divulgación utiliza varios procedimientos para unir agentes a los AB: (a) unión a los restos de carbohidrato de AB, o (b) unión a grupos sulfhidrilo de AB, o (c) unión a grupos amino del AB, o (d) unión a grupos carboxilato del AB. Según la divulgación, los AB pueden estar unidos covalentemente a un agente a través de un enlazador intermedio que tiene al menos dos grupos reactivos, uno para reaccionar con el AB y otro para reaccionar con el agente. El enlazador, que puede incluir cualquier compuesto orgánico compatible, se puede elegir de modo que la reacción con el AB (o agente) no afecte negativamente a la reactividad y la selectividad del AB. Además, la unión del enlazador al agente podría no destruir la actividad del agente. Los enlazadores adecuados para la reacción con anticuerpos oxidados o fragmentos de anticuerpos oxidados incluyen aquellos que contienen una amina seleccionada del grupo que consiste en grupos de amina primaria, amina secundaria, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida y tiosemicarbazida. Dichos grupos funcionales reactivos pueden existir como parte de la estructura del enlazador, o pueden introducirse mediante la modificación química adecuada de enlazadores que no contienen dichos grupos.
Según la presente divulgación, los enlazadores adecuados para la unión a AB reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos reactivos capaces de reaccionar con un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo reducido o fragmento. Dichos grupos reactivos incluyen, pero sin limitación: grupos haloalquilo reactivos (incluyendo, por ejemplo, grupos haloacetilo), grupos p-mercuribenzoato y grupos aptos para reacciones de adición de tipo Michael (incluyendo, por ejemplo, maleimidas y grupos del tipo descrito por Mitra y Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110).
Según la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a Ab ni oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos amino primarios presentes en residuos de lisina no modificados en el Ab. Dichos grupos reactivos incluyen, pero sin limitación, ésteres NHS carboxílicos o carbónicos, ésteres sulfo-NHS carboxílicos o carbónicos, ésteres 4-nitrofenilcarboxílicos o carbónicos, ésteres pentafluorofenilcarboxílicos o carbónicos, acil imidazoles, isocianatos e isotiocianatos.
De acuerdo con la presente descripción, los enlazadores adecuados para la unión a Ab ni oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos de ácido carboxílico presentes en los residuos de aspartato o glutamato en el Ab, que se han activado con reactivos adecuados. Los reactivos activadores adecuados incluyen EDC, con o sin NHS o sulfo-NHS añadido, y otros agentes deshidratantes utilizados para la formación de carboxamida. En estos casos, los grupos funcionales presentes en los enlazadores adecuados incluirán aminas primarias y secundarias, hidrazinas, hidroxilaminas e hidrazidas.
El agente puede estar unido al enlazador antes o después de que el enlazador esté unido al AB. En ciertas aplicaciones, puede ser deseable producir primero un intermedio AB-enlazador donde el enlazador esté libre de un agente asociado. Dependiendo de la aplicación particular, un agente específico puede unirse a continuación covalentemente en el enlazador. En algunas realizaciones, el AB se une primero al MM, sustrato de CM1-CM2 y enlazadores asociados y a continuación se une al enlazador para fines de conjugación.
Enlazadores ramificados: En realizaciones específicas, se utilizan enlazadores ramificados que tienen múltiples sitios para la unión de agentes. Para los enlazadores de sitios múltiples, una unión covalente única a un AB dará como resultado un intermediario AB-enlazador capaz de unirse a un agente en varios sitios. Los sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo o cualquier sitio químico al que se puedan unir agentes.
En algunas realizaciones, se puede lograr una actividad específica más alta (o una relación más alta de agentes con respecto a AB) mediante la unión de un enlace de sitio único en una pluralidad de sitios en el AB. Esta pluralidad de sitios puede introducirse en el AB por cualquiera de los dos procedimientos. Primero, se pueden generar múltiples grupos aldehído y/o grupos sulfhidrilo en el mismo AB. En segundo lugar, se puede unir a un aldehído o sulfhidrilo del AB un “enlazador ramificado” que tiene múltiples sitios funcionales para su posterior unión a los enlazadores. Los sitios funcionales del enlazador ramificado o del enlazador de múltiples sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo, o puede ser cualquier sitio químico al que se puedan unir los enlazadores. Se pueden obtener actividades específicas aún más altas combinando estos dos enfoques, es decir, uniendo enlazadores de múltiples sitios en varios sitios en el AB.
Enlazadores escindióles: Los enlazadores peptídicos que son susceptibles a la escisión por enzimas del sistema del complemento, tales como, pero sin limitación, activador de plasminógeno tipo u, activador de plasminógeno tisular, tripsina, plasmina u otra enzima que tenga actividad proteolítica pueden usarse en una realización de la presente divulgación. Según un procedimiento de la presente divulgación, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por complemento. El anticuerpo se selecciona de una clase que puede activar el complemento. Por lo tanto, el conjugado anticuerpo-agente activa la cascada del complemento y libera el agente en el sitio diana. Según otro procedimiento de la presente divulgación, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escisión por enzimas que tienen una actividad proteolítica, tal como un activador de plasminógeno tipo u, un activador de plasminógeno tisular, plasmina o tripsina. Estos enlazadores escindibles son útiles en anticuerpos activables conjugados que incluyen una toxina extracelular, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, cualquiera de las toxinas extracelulares mostradas en la Tabla 3.
En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de enlazadores escindibles.
Tabla 4: Secuencias de enlazadores eem lares ara conu ación
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Además, los agentes pueden unirse mediante enlaces disulfuro (por ejemplo, los enlaces disulfuro en una molécula de cisteína) al AB. Dado que muchos tumores liberan naturalmente altos niveles de glutatión (un agente reductor), esto puede reducir los enlaces disulfuro con la posterior liberación del agente en el sitio de administración. En algunas realizaciones, el agente reductor que modificaría un sustrato de CM1-CM2 también modificaría el enlazador del anticuerpo activable conjugado.
Espaciadores y elementos escindióles'. En algunas realizaciones, puede ser necesario construir el enlazador de tal manera que se optimice el espacio entre el agente y el AB del anticuerpo activable. Esto se puede lograr mediante el uso de un enlazador de la estructura general.
W -(CH2)n - Q
donde
W es —NH—CH2— o --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un entero de 0 a 20.
En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender un elemento espaciador y un elemento escindible. El elemento espaciador sirve para posicionar el elemento escindible lejos del núcleo del AB de manera que el elemento escindible sea más accesible para la enzima responsable de la escisión. Algunos de los enlazadores ramificados descritos anteriormente pueden servir como elementos espaciadores.
A lo largo de este análisis, debe entenderse que la unión del enlazador al agente (o del elemento espaciador al elemento escindible, o elemento escindible al agente) no necesita ser un modo particular de unión o reacción. Cualquier reacción que proporcione un producto de estabilidad y compatibilidad biológica adecuadas es aceptable.
Complemento de suero y selección de enlazadores. Según un procedimiento de la presente divulgación, cuando se desea la liberación de un agente, se usa un AB que es un anticuerpo de una clase que puede activar el complemento. El conjugado resultante conserva tanto la capacidad de unirse al antígeno como la activación de la cascada del complemento. Por lo tanto, de acuerdo con esta realización de la presente descripción, un agente se une a un extremo del enlazador escindible o el elemento escindible y el otro extremo del grupo de enlazador se une a un sitio específico en el AB. Por ejemplo, si el agente tiene un grupo hidroxilo o un grupo amino, puede estar unido al extremo carboxi de un péptido, aminoácido u otro enlazador adecuadamente elegido a través de un enlace éster o amida, respectivamente. Por ejemplo, dichos agentes pueden unirse al péptido enlazador mediante una reacción de carbodimida. Si el agente contiene grupos funcionales que interferirán con la unión al enlazador, estos grupos funcionales de interferencia pueden bloquearse antes de la unión y desbloquearse una vez que se realiza el producto conjugado o intermedio. A continuación, el extremo opuesto o amino del enlazador se usa directamente o después de una modificación adicional para la unión a un AB que es capaz de activar el complemento.
Los enlazadores (o elementos espaciadores de los enlazadores) pueden tener cualquier longitud deseada, un extremo de los cuales puede unirse covalentemente a sitios específicos en el AB del anticuerpo activable. El otro extremo del enlazador o elemento espaciador puede estar unido a un enlazador aminoacídico o peptídico.
Por lo tanto, cuando estos conjugados se unen al antígeno en presencia del complemento, el enlace amida o éster que une el agente al enlazador se escindirá, dando como resultado la liberación del agente en su forma activa. Estos conjugados, cuando se administran a un sujeto, lograrán la administración y liberación del agente en el sitio diana, y son particularmente eficaces para la administración in vivo de agentes farmacéuticos, antibióticos, antimetabolitos, agentes antiproliferativos y similares, como se presentan, pero sin limitación, los de la Tabla 3.
Enlazadores para la liberación sin activación del complemento: En aún otra aplicación de administración dirigida, se desea la liberación del agente sin activación del complemento ya que la activación de la cascada del complemento finalmente lisará la célula diana. Por lo tanto, este enfoque es útil cuando la administración y liberación del agente debe realizarse sin destruir la célula diana. Este es el objetivo cuando se desea la administración de mediadores celulares tales como hormonas, enzimas, corticosteroides, neurotransmisores, genes o enzimas a las células dianas. Estos conjugados pueden prepararse uniendo el agente a un AB que no es capaz de activar el complemento a través de un enlazador que es ligeramente susceptible a la escisión por las proteasas séricas. Cuando este conjugado se administra a un individuo, los complejos antígeno-anticuerpo se formarán rápidamente, mientras que la escisión del agente se producirá lentamente, lo que dará como resultado la liberación del compuesto en el sitio diana.
Reticuladores bioquímicos: En algunas realizaciones, el anticuerpo activable puede conjugarse con uno o más agentes terapéuticos usando ciertos reticuladores bioquímicos. Los reactivos de reticulación forman puentes moleculares que unen grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para unir dos proteínas diferentes de forma escalonada, se pueden usar reticuladores heterobifuncionales que eliminen la formación de homopolímeros no deseados.
Los enlazadores de peptidilo escindibles por proteasas lisosómicas también son útiles, por ejemplo, Val-Cit, Val-Ala u otros dipéptidos. Además, pueden usarse enlazadores lábiles a los ácidos escindibles en el entorno de bajo pH del lisosoma, por ejemplo: bis-sialil éter. Otros enlazadores adecuados incluyen sustratos lábiles a catepsina, particularmente aquellos que muestran una función óptima a un pH ácido.
Se hace referencia a reticuladores heterobifuncionales ejemplares en la Tabla 5.
T l : R i l r h r if n i n l m l r
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Enlazadores no escindibles o unión directa: En algunas realizaciones de la descripción, el conjugado puede diseñarse de modo que el agente se administre a la diana pero no se libere. Esto puede lograrse uniendo un agente a un AB directamente o mediante un enlazador no escindible.
Estos enlazadores no escindibles pueden incluir aminoácidos, péptidos, D-aminoácidos u otros compuestos orgánicos que pueden modificarse para incluir grupos funcionales que posteriormente pueden utilizarse en la unión a AB por los procedimientos descritos en el presente documento. Una fórmula general para un enlazador orgánico de este tipo podría ser
W -(CH2)n - Q
donde
W es —NH—CH2— o --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un entero de 0 a 20.
Conjugados no escindibles: En algunas realizaciones, un compuesto puede estar unido a AB que no activan el complemento. Cuando se usan AB que son incapaces de activar el complemento, esta unión se puede lograr usando enlazadores que sean susceptibles de escisión por complemento activado o usando enlazadores que no sean susceptibles de escisión por complemento activado.
Los anticuerpos descritos en esta invención también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y las Patentes de EE.UU. n° 4485045 y 4544545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de EE.UU: N° 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente descripción pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro.
Definiciones:
A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente descripción tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la materia. El término "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad. Por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más compuestos. Como tal, los términos "un", "una", "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar indistintamente. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligo- o polinucleótidos descritas en esta invención se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal descritas en esta invención son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se usan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes.
Según se utiliza según la presente divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
Como se usa en esta invención, "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas, por ejemplo, de unión antígeno, de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une de forma especifica (inmunorreacciona con) a un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" o "se une inmunoespecíficamente" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (Kd > 10-6). Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, anticuerpo de dominio, monocatenarios, Fab y fragmentos F(ab')2 , scFv, y una biblioteca de expresión de Fab.
Se sabe que la unidad estructural de anticuerpo básica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50--70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, tales como IgG1, IgG2, y otras. Además, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (c Dr ) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAb contienen un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única por él.
El término "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión a antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas relativas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La asignación de aminoácidos a cada dominio está según las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia y col. Nature 342:878-883 (1989).
Como se usa en esta invención, el término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de células T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse contra péptidos N-terminales o C-terminales de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 pM; en algunas realizaciones, <100 nM y en algunas realizaciones, <10 nM.
Como se usa en esta invención, los términos "unión específica", "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se puede expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, donde una Kd menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Uno de estos procedimientos implica medir las tasas de formación de complejos de sitio de unión a antígeno/antígeno y la disociación, donde esas tasas dependen de las concentraciones de las parejas de complejos, la afinidad de la interacción, y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la "constante de la tasa de asociación" (Kasociación ) como la "constante de la tasa de disociación" (Kdisociación) pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación (Véase Nature 361:186--87 (1993)). La relación de Kdisociación / Kasociación permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. (Véase, generalmente, Davies y col. (1990) Annual Rev Biochem 59:439--473). Se dice que un anticuerpo de la presente divulgación se une específicamente a la diana, cuando la constante de unión (Kd) es <1 pM, en algunas realizaciones <100 nM, en algunas realizaciones <10 nM, y en algunas realizaciones <100 pM a aproximadamente 1 pM, según se mide por ensayos tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
El término "polinucleótido aislado", como se usa en esta invención, significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido donde el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Los polinucleótidos según la divulgación incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en esta invención, y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en esta invención.
El término "proteína aislada" a la que se hace referencia en esta invención significa una proteína de ADNc, ARN recombinante u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de obtención, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza.
El término "polipéptido" se usa en esta invención como un término genérico para referirse a proteínas nativas, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas nativas y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos según la divulgación comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada mostradas en esta invención, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostradas en esta invención, así como las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tal como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.
El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otra manera es de origen natural.
El término "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a las posiciones de los componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas, y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión. El término "polmudeótido" al que se hace referencia en el presente documento significa nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenarias y bicatenarias.
El término oligonucleótido al que se hace referencia en esta invención incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos entre sí por enlaces oligonucleotídicos de origen natural y no naturales. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprende una longitud de 200 bases o menos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y en algunas realizaciones, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son generalmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la divulgación son oligonucleótidos de sentido o antisentido.
El término "nucleótidos de origen natural" al que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en esta invención incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" al que se hace referencia en esta invención incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonmidato y similares. Véase por ejemplo, LaPlanche y col. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y col. J. Am. Chem. Soc.
106:6077 (1984), Stein y col. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon y col. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y col. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec y col. Patente de EE. Uu . No. 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para la detección, si se desea.
Como se usa en esta invención, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a Edición, E.S. Golub y D.R. Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales, tales como los aminoácidos a, a-disustituidos, los aminoácidos N-alquilo, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente divulgación. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4- hidroxiprolina). En la notación de polipéptido utilizada en esta invención, la dirección de la izquierda es la dirección del extremo amino y la dirección de la derecha es la dirección del extremo carboxi, según el uso y la convención estándar.
De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5'; la dirección de la izquierda de las secuencias de polinucleótidos bicatenarias se conoce como la dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes se denomina dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que se encuentran 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas arriba", las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en el extremo 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias aguas abajo".
Según se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de hueco predeterminados, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, en algunas realizaciones, al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, en algunas realizaciones, al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia, y en algunas realizaciones, al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia.
En algunas realizaciones, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Como se analiza en esta invención, las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o las moléculas de inmunoglobulina se contemplan incluidas por la presente divulgación, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos se mantengan al menos al 75 %, en algunas realizaciones, al menos al 80 %, 90 %, 95 %, y en algunas realizaciones, al 99 %. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados respecto a sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) los aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi alifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante sobre la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional ensayando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en el presente documento. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Los extremos amino y carboxi adecuados de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. En algunas realizaciones, se usan procedimientos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas pronosticados que tienen lugar en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen procedimientos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie y col. Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según la divulgación.
Las sustituciones de aminoácidos adecuadas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadoras) pueden hacerse en la secuencia natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución conservadora de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que se produce en la secuencia parental, ni alterar otros tipos de la estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton y col. Nature 354:105 (1991).
El término "fragmento de polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi-terminal y/o una o más deleciones internas, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de largo, en algunas realizaciones, al menos 14 aminoácidos de largo, en algunas realizaciones, al menos 20 aminoácidos de largo, usualmente al menos 50 aminoácidos de largo, y en algunas realizaciones, al menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo", como se usa en esta invención, se refiere a polipéptidos que están comprendidos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene una unión específica a la diana, en condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución conservadora de aminoácidos (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos típicamente tienen al menos 20 aminoácidos de longitud, en algunas realizaciones, al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud completa.
El término "agente" se usa en esta invención para representar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos.
Como se usa en esta invención, los términos "etiqueta" o "marcado" se refieren a la incorporación de una etiqueta detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por procedimientos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutica. Se conocen en la técnica y se pueden usar diversos procedimientos para marcar polipéptidos y glucoproteínas. Ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, las siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 9°Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánido), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (porejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, los marcadores están unidos por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en esta invención, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Otros términos químicos en esta invención se usan según el uso convencional en la técnica, como se ilustra en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Como se usa en esta invención, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y en algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objetivo comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, en algunas realizaciones, más de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 % y el 99 %. En algunas realizaciones, la especie objeto se purifica a una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante procedimientos de detección convencionales), donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Los anticuerpos activables de la divulgación se unen específicamente a una diana dada, por ejemplo, una proteína diana humana. También se incluyen en la divulgación los anticuerpos activables que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos activables descritos en esta invención.
Los expertos en la técnica reconocerán que es posible determinar, sin demasiada experimentación, si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o humanizado murino) tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal utilizado en los procedimientos descritos en esta invención determinando si el primero evita que el segundo se una a la diana. Si el anticuerpo monoclonal que se está ensayando compite con el anticuerpo monoclonal de la divulgación, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal de la divulgación, a continuación los dos anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítopo, o uno estrechamente relacionado. Un procedimiento alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la divulgación es preincubar el anticuerpo monoclonal de la divulgación con la diana y a continuación añadir el anticuerpo monoclonal que se está ensayando para determinar si el anticuerpo monoclonal que se está ensayando se inhibe en su capacidad de unirse a la diana. Si el anticuerpo monoclonal que se ensaya se inhibe, a continuación, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica, o funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal de la divulgación.
Anticuerpos activables multiespecíficos
La divulgación también proporciona anticuerpos activables multiespecíficos. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención son anticuerpos multiespecíficos que reconocen dos o más antígenos o epítopos diferentes y que incluyen al menos un resto de enmascaramiento (MM) unido a al menos un dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico de tal manera que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del dominio de unión a antígeno o epítopo para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el MM se acopla al dominio de unión a antígeno o epítopo del anticuerpo multiespecífico a través de un sustrato de CM1-CM2 que funciona como sustrato para al menos una proteasa m Mp y al menos un SP. Los anticuerpos multiespecíficos activables proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, exhiben unión a una diana que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a las células efectoras inmunes, también denominados en esta invención anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a células efectoras inmunes. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a leucocitos, también denominados en esta invención anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a leucocitos. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para acoplarse a linfocitos T, también denominados en el presente documento anticuerpos activables multiespecíficos de acoplamiento a linfocitos T. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos se acoplan a un antígeno de superficie en un leucocito, tal como en un linfocito T, en una célula asesina natural (NK), en una célula mononuclear mieloide, en un macrófago, y/o en otra célula efectora inmune. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un linfocito T. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula mononuclear, tal como una célula mononuclear mieloide. En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos están diseñados para unirse o interactuar de otro modo con más de una diana y/o más de un epítopo, también denominados en el presente documento anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos. Como se usa en esta invención, los términos "diana" y "antígeno" se usan indistintamente.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos que se acoplan a células efectoras inmunitarias de la divulgación incluyen un anticuerpo dirigido o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo que se une a células efectoras inmunitarias o una parte de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno de los anticuerpos de unión o unión a antígeno o fragmento del mismo y/o el anticuerpo que se acopla a la célula efectora inmunitaria o la porción del mismo que se une al antígeno está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a células efectoras inmunes, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento ( MM2), de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une a la célula efectora inmune o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana que se une a la célula efectora inmune, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1 ) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad de AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras no inmunes es un anticuerpo dirigido a un cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo efector de células no inmunes es una IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a células efectoras inmunes es un scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido (por ejemplo, un anticuerpo efector de células no inmunes) es una IgG y el anticuerpo que se acopla a las células efectoras inmunes es un scFv. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un leucocito. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es un linfocito T. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula NK. En algunas realizaciones, la célula efectora inmune es una célula mononuclear mieloide.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos que se acoplan a células T de la divulgación incluyen un anticuerpo dirigido o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo que se une a células T o una parte de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno de los anticuerpos dirigidos o unión a antígeno el fragmento del mismo y/o el anticuerpo que se acopla a las células T o la porción del mismo que se une al antígeno está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a linfocitos T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento ( MM2), de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo de unión a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de unión a células T, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1 ) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad de AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos que se acoplan a células T incluyen un anticuerpo dirigido al cáncer o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un anticuerpo que se une a células T o una porción de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno de los anticuerpos dirigidos contra el cáncer o de unión a antígeno o fragmento del mismo y/o el anticuerpo que se acopla a las células T o la porción del mismo que se une al antígeno está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de unión a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de unión a células T, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1 ) de modo que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido contra el cáncer o su fragmento de unión a antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde se une el AB2 a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento de MM2 reduce la capacidad de AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo de unión a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de unión a células T, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1 ) tal que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad de AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo dirigido contra el cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2 ) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables multiespecíficos que se acoplan a las células T incluyen un anticuerpo IgG dirigido al cáncer o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un scFv que se une a las células T, donde al menos uno de los anticuerpos IgG dirigidos al cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo y/ o el anticuerpo que se acopla a las células T o su porción de unión al antígeno está enmascarado. En algunas realizaciones, el anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de acoplamiento a linfocitos T, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG dirigido al cáncer o su fragmento de unión a antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 es unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer. En algunas realizaciones, el anticuerpo de unión a células T o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a una primera diana de unión a células T, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1 ) tal que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a la primera diana, y el anticuerpo IgG que se dirige al cáncer o su fragmento de unión al antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que se une al antígeno ( AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer.
En algunas realizaciones de un anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a una célula efectora inmune, un antígeno es típicamente un antígeno presente en la superficie de una célula tumoral u otro tipo celular asociado con la enfermedad, como, entre otros, cualquier diana enumerada en la Tabla 1, tales como, entre otros, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3 o CD71 (receptor de transferrina), y otro antígeno suele ser un receptor estimulante o inhibidor presente en la superficie de una célula T, célula asesina natural (NK), célula mononuclear mieloide, macrófago y/u otra célula efectora inmunitaria, como, entre otras, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 o VISTA. En algunas realizaciones, el antígeno es un receptor estimulador presente en la superficie de un linfocito T o una célula NK; los ejemplos de dichos receptores estimuladores incluyen, pero sin limitación, pero sin limitación, CD3, CD27, CD28, c D137 (también denominado 4-1BB), GITR, HVEM, Ic Os , NKG2D, y OX40. En algunas realizaciones, el antígeno es un receptor inhibidor presente en la superficie de un linfocito T; los ejemplos de dichos receptores inhibitorios incluyen, pero sin limitación, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3 y KIR expresados en NK. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de linfocitos T también puede estar sustituido por un ligando o dominio de ligando que se une a un receptor de linfocitos T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunes, tales como, pero sin limitación, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, o TNFSF9.
Una realización de la divulgación es un anticuerpo activable multiespecífico que es activable en un microambiente canceroso y que incluye un anticuerpo, por ejemplo, un IgG o scFv, dirigido a una diana tumoral y un anticuerpo agonista, por ejemplo, un IgG o scFv, dirigido a un receptor coestimulador expresado en la superficie de una célula T o célula Nk activada, donde al menos uno de los anticuerpos diana del cáncer y/o el anticuerpo agonista está enmascarado. Ejemplos de receptores coestimuladores incluyen, entre otros, CD27, CD137, GITR, HVEM, NKG2D y OX40. En esta realización, el anticuerpo activable multiespecífico, una vez activado por las proteasas asociadas a tumores, se entrecruzaría y activaría de manera efectiva los receptores coestimuladores expresados por células T o células NK de una manera dependiente del tumor para mejorar la actividad de las células T que están respondiendo a cualquier antígeno tumoral a través de su antígeno endógeno de células T o receptores activadores de NK. La naturaleza dependiente de la activación de estos receptores coestimuladores de células T o células NK centraría la actividad del anticuerpo activable multiespecífico activado en células T específicas de tumor, sin activar todas las células T independientemente de su especificidad antigénica. En una realización, al menos el anticuerpo receptor coestimulador del anticuerpo activable multiespecífico está enmascarado para impedir la activación de células T autorreactivas que pueden estar presentes en tejidos que también expresan el antígeno reconocido por el anticuerpo dirigido al tumor en el anticuerpo multiespecífico. anticuerpo activable, pero cuya actividad está restringida por la falta de participación del co-receptor.
Una realización de la divulgación es un anticuerpo activable multiespecífico que es activable en una enfermedad caracterizada por sobreestimulación de células T, tal como, pero sin limitarse a, un microambiente de enfermedad autoinmune o enfermedad inflamatoria. Tal anticuerpo activable multiespecífico incluye un anticuerpo, por ejemplo, IgG o scFv, dirigido a una diana que comprende un antígeno de superficie expresado en un tejido diana por una célula T en una enfermedad autoinmune o inflamatoria y un anticuerpo, por ejemplo, IgG o scFv, dirigido a un receptor inhibidor expresado en la superficie de una célula T o una célula n K, donde al menos uno de los anticuerpos diana del tejido de la enfermedad y/o el anticuerpo del receptor inhibidor de células T está enmascarado. Ejemplos de receptores inhibidores incluyen, pero no se limitan a, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3 y KIR expresados por NK. Ejemplos de un antígeno tisular dirigido por las células T en la enfermedad autoinmune incluyen, entre otros, un antígeno de superficie expresado en mielina o células nerviosas en la esclerosis múltiple o un antígeno de superficie expresado en células de los islotes pancreáticos en la diabetes tipo 1. En esta realización, el anticuerpo activable multiespecífico, cuando se localiza en el tejido bajo un ataque autoinmune o inflamación, se activa y se acopla conjuntamente con el receptor inhibidor de células T o células NK para suprimir la actividad de las células T autorreactivas que responden a cualquier antígeno de enfermedad dirigido al tejido a través de su TCR endógeno o receptores activadores. En una realización, se enmascaran al menos uno o varios anticuerpos para impedir la supresión de las respuestas de células T en tejidos no enfermos en los que también se puede expresar el antígeno diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico de acoplamiento a linfocitos T incluye un scFv épsilon anti-CD3 (CD3£, también denominado en esta invención CD3e y CD3) y un anticuerpo de direccionamiento o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde al menos uno del scFv anti-CD3£ y/o el anticuerpo de direccionamiento o la porción de unión a antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el CD3£ scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3£, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3£. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento ( MM2), de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el scFv de CD3£ incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3£, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse CD3£, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2 ) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a las células T incluye un scFv anti-CD3e y un anticuerpo dirigido contra el cáncer o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde al menos uno de los scFv anti-CD3£ y/o el anticuerpo dirigido contra el cáncer o la porción de unión a antígeno del mismo está enmascarada. En algunas realizaciones, el CD3£ scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3£, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3£. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido contra el cáncer o su fragmento de unión a antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde se une el AB2 a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento de MM2 reduce la capacidad de AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer. En algunas realizaciones, el scFv de CD3£ incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3£, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse CD3£, y el anticuerpo dirigido contra el cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) tal que el acoplamiento de MM2 reduce la capacidad de AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a las células T incluye un scFv anti-CD3£ y un anticuerpo IgG dirigido contra el cáncer o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde al menos uno de los scFv anti-CD3£ y/o el anticuerpo IgG dirigido contra el cáncer o la porción de unión a antígeno del mismo está enmascarada. En algunas realizaciones, el CD3£ scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3£, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3£. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG dirigido al cáncer o su fragmento de unión a antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 es unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer. En algunas realizaciones, el scFv de CD3£ incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3£, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3£, y el anticuerpo IgG dirigido contra el cáncer o su fragmento de unión al antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que se une al antígeno (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde se une el AB2 a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento de MM2 reduce la capacidad de AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a las células T incluye un scFv anti-CD3 épsilon (CD3£) que se deriva de OKT3, donde al menos uno de los anticuerpos dirigidos o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el OKT3 scFv u OKT3 El scFv derivado está enmascarado. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o el scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3£, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad de AB1 para unirse a CD3£. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento ( MM2), de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o el scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento (MM2) tal que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a las células T incluye un scFv de OKT3 o un scFv derivado de OKT3 y un anticuerpo dirigido contra el cáncer o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde al menos uno de los scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 y/o el anticuerpo dirigido al cáncer o la porción de unión al antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o el scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad de AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido contra el cáncer o su fragmento de unión a antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde se une el AB2 a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento de MM2 reduce la capacidad de AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o el scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo dirigido contra el cáncer o fragmento del mismo que se une al antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que se une al antígeno (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a las células T incluye un scFv de OKT3 o un scFv derivado de OKT3 y un anticuerpo IgG dirigido contra el cáncer o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde al menos uno de los scFv de OKT3 o scFv derivado de OKT3 y/o el anticuerpo IgG dirigido al cáncer o la porción de unión al antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o el scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad de AB1 para unirse a CD3e. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG dirigido al cáncer o su fragmento de unión a antígeno incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 es unido a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer. En algunas realizaciones, el scFv de OKT3 o el scFv derivado de OKT3 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CD3e, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CD3e, y el anticuerpo IgG dirigido contra el cáncer o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana relacionada con el cáncer, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de tal manera que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana relacionada con el cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a las células T incluye un scFv anti-CTLA-4, donde al menos uno de los anticuerpos dirigidos o fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el scFv anti-CTLA-4 está enmascarado. En algunas realizaciones, el CTLA-4 scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CTLA-4, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento ( MM2), de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el scFv anti-CTLA-4 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CTLA-4, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4, y el anticuerpo dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a las células T incluye un scFv antiCTLA-4 y un anticuerpo IgG dirigido o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde al menos uno de los scFv anti-CTLA-4 y/o el IgG dirigido el anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo está enmascarado. En algunas realizaciones, el CTLA-4 scFv incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CTLA-4, donde el AB1 está unido a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal forma que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG dirigido o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 está unido a un resto de enmascaramiento. (MM2) de modo que el acoplamiento del MM2 reduce la capacidad del AB2 para unirse a la segunda diana. En algunas realizaciones, el scFv anti-CTLA-4 incluye un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une a CTLA-4, donde el AB1 se une a un resto de enmascaramiento (MM1) de tal manera que el acoplamiento del MM1 reduce la la capacidad del AB1 para unirse a CTLA-4, y el anticuerpo dirigido IgG o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye un segundo anticuerpo o fragmento del mismo que incluye un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une a una segunda diana, donde el AB2 se une a un resto de enmascaramiento (MM2) de modo que el acoplamiento de MM2 reduce la capacidad de AB2 para unirse a la segunda diana.
En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una primera diana y/o un primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una segunda diana y/o un segundo epítopo. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a dos o más dianas diferentes. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a dos o más epítopos diferentes en la misma diana. En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos a múltiples antígenos y/o anticuerpos activables dirigidos a múltiples antígenos se unen a una combinación de dos o más dianas diferentes y dos o más epítopos diferentes en la misma diana.
En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende una IgG tiene los dominios variables de IgG enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico que comprende un scFv tiene los dominios de scFv enmascarados. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde al menos uno de los dominios variables de IgG está acoplado a un resto de enmascaramiento y al menos uno de los dominios de scFv está acoplado a un resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo activable multiespecífico tiene tanto dominios variables de IgG como dominios de scFv, donde cada uno de los dominios variables de IgG y los dominios de scFv está acoplado a su propio resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por un antígeno de superficie de linfocitos T. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro antígeno diana. En algunas realizaciones, un dominio de anticuerpo de un anticuerpo activable multiespecífico tiene especificidad por un epítopo de un antígeno diana, y otro dominio de anticuerpo tiene especificidad por otro epítopo del antígeno diana.
En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo carboxilo de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG, o al extremo carboxilo de tanto la cadena pesada como ligera de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse al extremo amino de la cadena pesada de un anticuerpo activable de IgG, al extremo amino de la cadena ligera de un anticuerpo activable de IgG, o al extremo amino de tanto la cadena pesada como ligera de un anticuerpo activable de IgG. En un anticuerpo activable multiespecífico, un scFv puede fusionarse a cualquier combinación de uno o más extremos carboxilo y uno o más extremos amino de un anticuerpo activable de IgG. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un sustrato de CM1-CM2 se une y enmascara un dominio de unión a antígeno de la IgG. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un sustrato de CM1-CM2 se une y enmascara un dominio de unión a antígeno de al menos un scFv. En algunas realizaciones, un resto de enmascaramiento (MM) unido a un sustrato de CM1-CM2 se une y enmascara un dominio de unión a antígeno de una IgG y un resto de enmascaramiento (MM) unido a un sustrato de CM1-CM2 se une a un antígeno y enmascara el dominio de unión de al menos un scFv.
La divulgación proporciona ejemplos de estructuras de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen, entre otros, los siguientes: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*'L3-VL*'L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2; (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL-CL)2:(VH *-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH *-L3-VL*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3 -VH*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL *-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VH *-L3-VL *-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL *-L3-VH *-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1 -CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM 1-CM2 sustrato-LI -MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VH *-L3-VL * -L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH * -L3-VL * )2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1 -CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VH*-L3-VL* -L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL * -L3-VH * )2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VL * -L3-VH *-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM1-CM2 sustrato-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH* -L3-VL*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; or (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM1-CM2 sustrato-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, donde: VL y VH representan los dominios variables ligero y pesado de la primera especificidad, contenidos en la IgG; VL* y VH* representan los dominios variables de la segunda especificidad, contenidos en el scFv; L1 es un péptido enlazador que conecta el resto de enmascaramiento (MM) y el sustrato de CM1-CM2; L2 es un péptido enlazador que conecta el sustrato de CM1-CM2 y el anticuerpo; L3 es un péptido enlazador que conecta los dominios variables del scFv; L4 es un péptido enlazador que conecta el anticuerpo de la primera especificidad con el anticuerpo de la segunda especificidad; Cl es el dominio constante de la cadena ligera; y CH1, CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada. Las primera y segunda especificidades pueden ser hacia cualquier antígeno o epítopo.
En algunas realizaciones de un anticuerpo activable multiespecífico que se acopla a células T, un antígeno es típicamente un antígeno presente en la superficie de una célula tumoral u otro tipo celular asociado con una enfermedad, tal como, entre otros, cualquier diana enumerada en la Tabla 1, tales como, entre otros, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3 o CD71 (receptor de transferrina), y otro antígeno suele ser un receptor estimulador (también denominado en esta invención activador) o inhibidor presente en el superficie de una célula T, célula asesina natural (NK), célula mononuclear mieloide, macrófago y/u otra célula efectora inmunitaria, como, entre otras, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137 (también conocido como TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 o VISTA. El dominio del anticuerpo que confiere especificidad al antígeno de superficie de la célula T también puede sustituirse por un ligando o un dominio de ligando que se une a un receptor de células T, un receptor de células NK, un receptor de macrófagos y/u otro receptor de células efectoras inmunitarias. tales como, entre otros, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2 o TNFSF9. En algunas realizaciones de un anticuerpo activable dirigido a múltiples antígenos, se selecciona un antígeno de entre el grupo de dianas enumeradas en la Tabla 1, y otro antígeno se selecciona de entre el grupo de dianas enumeradas en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es un anticuerpo anti-EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v5, que es específico para unirse a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225, que es específico para unirse a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v4, que es específico para unirse a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es C225v6, que es específico para unirse a EGFR. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es un anticuerpo anti-Jagged. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es 4D11, que es específico para unirse a Jagged 1 y Jagged 2 humanos y de ratón. En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido es 4D11v2, que es específico para unirse a Jagged 1 y Jagged 2 humanos y de ratón.
En algunas realizaciones, el anticuerpo dirigido puede estar en forma de un anticuerpo activable. En algunas realizaciones, los scFv(s) pueden estar en forma de un Pro-scFv (véanse, por ejemplo, WO 2009/025846, WO 2010/081173).
En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión a CD3e, y comprende o se deriva de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD3e, por ejemplo, CH2527, FN18, H2C, OkT3, 2C11, UCHT1, o V9. En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión a CTLA-4 (también denominado en esta invención CTLA y CTLA4).
En algunas realizaciones, el scFv anti-CTLA-4 incluye la secuencia de aminoácidos:
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQ
QKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTF
GGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFS
SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTI3RDNSKNTLYLQMNSLRAEDT
AVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS (SEQ ID WO: 347 )
En algunas realizaciones, el scFv anti-CTLA-4 incluye la secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 347.
En algunas realizaciones, el scFv anti-CD3£ incluye la secuencia de aminoácidos:
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVK
QRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARY
YDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS
S S V S YMNWYQQKSGTS PKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYC
QQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 349 )
En algunas realizaciones, el scFv anti-CD3£ incluye la secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 349.
En algunas realizaciones, el scFv es específico para la unión de uno o más linfocitos T, una o más células NK y/o uno o más macrófagos. En algunas realizaciones, el scFv es específico para unirse a una diana seleccionada de entre el grupo que consiste en B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, o VISTA.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente está conjugado con el anticuerpo activable multiespecífico a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador que incluye al menos una secuencia de sustrato CM1-CM2. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN o un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 4. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico puede diseñarse para incluir uno o más enlaces disulfuro.
La descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo activable multiespecífico descrito en el presente documento, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La divulgación proporciona procedimientos para producir un anticuerpo activable multiespecífico cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula comprende tal molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula comprende tal vector.
La divulgación también proporciona un procedimiento para fabricar anticuerpos activables multiespecíficos de la divulgación (a) cultivando una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable multiespecífico en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable multiespecífico, y (b) recuperando el anticuerpo activable multiespecífico.
La divulgación también proporciona anticuerpos activables multiespecíficos y/o composiciones de anticuerpos activables multiespecíficos que incluyen al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o primer epítopo y un segundo anticuerpo o antígeno fragmento del mismo (AB2) que se une a una segunda diana o un segundo epítopo, donde al menos el AB 1 está acoplado o unido de otro modo a un resto de enmascaramiento (MM1), de modo que el acoplamiento del MM1 reduce la capacidad del AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el MM1 se acopla a AB1 a través de un sustrato de CM1-CM2 para un MMP y una SP, donde al menos uno de los MMP y la SP se coubica con la diana de AB1 en un sitio de tratamiento o un sitio de diagnóstico en un sujeto. Los anticuerpos activables multiespecíficos proporcionados en esta invención son estables en circulación, se activan en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico, pero no en tejido normal, es decir, tejido sano, y, cuando se activan, exhiben unión a la diana de AB1 que es al menos comparable al anticuerpo correspondiente multiespecífico no modificado.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende un péptido de unión entre MM1 y el sustrato de CM1-CM2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende un péptido de enlace entre el sustrato de CM1-CM2 y el AB1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), y al menos una porción del anticuerpo activable multiespecífico tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue en el estado no escindido: MM1-LP1-CM1-CM2 sustrato-LP2-AB1 o AB1-LP2-CM1-CM2 sustrato-LP1-MM1. En algunas realizaciones, los dos péptidos de enlace no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 381) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 382), donde n es un entero de al menos uno. En algunas realizaciones, al menos uno de LP1 o LP2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en GGSG (SEQ ID NO: 383), g Gs GG (SEQ ID NO: 384), GSGSG (SEQ ID NO: 385), GSGGG (SEQ ID NO: 386), GGGSG (SEQ ID NO: 387), y GSSSG (SEQ ID NO: 388).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un péptido de unión (LP') entre CM1 y CM2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un primer péptido de enlace (LP1), un segundo péptido de enlace (LP2) y un péptido de enlace (LP') entre CM1 y CM2, y al menos una porción del anticuerpo activable multiespecífico tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue en el estado no escindido: MM1-LP1-CM1-CM2 sustrato-LP2-AB1 o AB1-LP2-CM1-CM2 sustrato-LP1-MM1. En algunas realizaciones, los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí.
En algunas realizaciones, LP' es GG. En algunas realizaciones, LP' es GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB1) que se une específicamente a una primera diana o primer epítopo y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB2) que se une específicamente a una segunda diana o segundo epítopo. En algunas realizaciones, cada uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de dominio, un fragmento Fab de cadena sencilla, un fragmento F(ab')2 ,un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio único y un anticuerpo de cadena ligera de dominio único. En algunas realizaciones, cada uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico es un anticuerpo monoclonal de roedor (p. ej., ratón o rata), quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, cada uno de los AB en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una constante de disociación de aproximadamente 100 nM o menos para unirse a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, MM1 tiene una constante de disociación para unirse a su AB correspondiente que es mayor que la constante de disociación del AB a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, MM1 tiene una constante de disociación para unirse a su AB correspondiente que no es más que la constante de disociación del AB a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, MM1 no interfiere ni compite con su AB correspondiente para unirse a la diana o epítopo correspondiente cuando el anticuerpo activable multiespecífico está en un estado escindido.
En algunas realizaciones, MM1 es un polipéptido de aproximadamente 2 a 40 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, MM1 tiene una secuencia polipeptídica que es diferente de la diana del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, MM1 tiene una secuencia polipeptídica que no es más del 50 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones, MM1 tiene una secuencia polipeptídica no es más de un 25 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones, MM1 tiene una secuencia polipeptídica que no es más del 10 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de manera que la constante de disociación (Kd) del Ab cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 20 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de manera que la constante de disociación (Kd) del Ab cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 40 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo, de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 100 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de manera que la constante de disociación (Kd) del Ab cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 1000 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de MM1 reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo, de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 10.000 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM1 hacia su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, MM1 es una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre un MM descrito en esta invención.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye al menos un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que inhibe la unión del AB2 a su diana cuando el anticuerpo activable multiespecífico está en un estado no escindido, y un resto escindible adicional (CM') acoplado a AB2, donde CM' es un sustrato de CM1-CM2 o un polipéptido que funciona como sustrato para una segunda proteasa. En algunas realizaciones, CM es un polipéptido de no más de 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, CM' es un sustrato de CM1-CM2, donde cada uno de CM1 y CM2 en el sustrato de CM1-CM2 tiene independientemente una longitud de no más de 15 aminoácidos.
En algunas realizaciones, la proteasa MMP, la proteasa SP, y/o la segunda proteasa se colocaliza con el segunda diana o epítopo en un tejido, y donde la proteasa MMP, la proteasa SP, y/o la segunda proteasa escinde el CM' en el anticuerpo activable multiespecífico cuando el anticuerpo activable multiespecífico se expone a la proteasa MMP, la proteasa SP, y/o la segunda proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa MMP, la proteasa SP, y/o la segunda proteasa se colocaliza con la primera diana o epítopo y la segunda diana o epítopo en un tejido. En algunas realizaciones, la proteasa MMP, la proteasa SP, y/o la segunda proteasa es la misma proteasa MMP y la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, la proteasa MMP, la proteasa SP y/o la segunda proteasa no son la misma proteasa MMP ni la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, el sustrato CM1-CM2 y CM' son sustratos diferentes para la misma proteasa MMP y la misma proteasa SP. En algunas realizaciones, la proteasa que escinde CM' se selecciona de entre el grupo que consiste en las que se muestran en la Tabla 6.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico, por ejemplo, MM1 y al menos MM2, tiene una constante de disociación para unirse a su AB correspondiente que es mayor que la constante de disociación del AB a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una constante de disociación para unirse a su AB correspondiente que no es mayor que la constante de disociación del AB a su diana o epítopo correspondiente.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico no interfiere ni compite con su AB correspondiente para unirse a la diana o epítopo correspondiente cuando el anticuerpo activable multiespecífico está en un estado escindido.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico es un polipéptido de aproximadamente 2 a 40 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia polipeptídica que es diferente de la de la diana del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia polipeptídica que no es más del 50 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia polipeptídica que no es más del 25 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB correspondiente. En algunas realizaciones, cada uno de los MM en el anticuerpo activable multiespecífico tiene una secuencia polipeptídica que no es más del 10 % idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB correspondiente.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo, de modo que la constante de disociación (Kd) del Ab cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es de al menos 20 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia su correspondiente diana o epítopo.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 40 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia su correspondiente diana o epítopo.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 100 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia su correspondiente diana o epítopo.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es al menos 1000 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia su correspondiente diana o epítopo.
En algunas realizaciones, el acoplamiento de cada uno de los MM reduce la capacidad del AB correspondiente para unirse a su diana o epítopo, de modo que la constante de disociación (Kd) del Ab cuando se acopla al MM hacia su diana o epítopo correspondiente es de al menos 10.000 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia su correspondiente diana o epítopo.
En algunas realizaciones, cada uno de los MM es una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre un MM descrito en esta invención.
En algunas realizaciones, la proteasa que escinde la secuencia del sustrato de CM1-CM2 se colocaliza con la diana de AB1 en el anticuerpo activable multiespecífico en un tejido, y la proteasa MMPy/o La proteasa SP, es decir, al menos una de la proteasa MMP y la proteasa SP, escinde el sustrato de CM1-CM2 en el anticuerpo activable multiespecífico cuando el anticuerpo activable multiespecífico se expone a las proteasas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye más de una secuencia de sustrato de CM1-CM2 y la proteasa MMP y/o la proteasa SP que escinde al menos una secuencia de sustrato de CM1-CM2 se co­ localiza con la diana de al menos una de las regiones AB en el anticuerpo activable multiespecífico en un tejido, y la proteasa MMP y/o La proteasa SP escinde el sustrato de CM1-CM2 en el anticuerpo activable multiespecífico cuando el anticuerpo activable multiespecífico se expone a las proteasas.
En algunas realizaciones, cada sustrato de CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos dos veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato de CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones Ab se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos tres veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato de CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones Ab se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos cuatro veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato de CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos cinco veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato de CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones Ab se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos diez veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato de CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones Ab se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos 20-veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato de CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones Ab se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos 40-veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos 50-veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones Ab se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos 100-veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
En algunas realizaciones, cada sustrato CM1-CM2 se coloca en el anticuerpo activable multiespecífico de manera que, en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable multiespecífico a una diana de una de las regiones AB se reduce para que se produzca con una constante de disociación que sea al menos 200-veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une a su diana, y mientras que en el estado escindido, el AB se une a su diana.
La divulgación también proporciona composiciones y procedimientos que incluyen un anticuerpo activable multiespecífico que incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una diana y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB2), donde al menos el primer AB en el anticuerpo activable multiespecífico está acoplado a un resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, cada AB está acoplado a un m M que disminuye la capacidad de su AB correspondiente a cada diana. Por ejemplo, en realizaciones de anticuerpos activables biespecíficos, el AB1 está acoplado a un primer resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana, y a B2 está acoplado a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos regiones de AB; en dichas realizaciones, el AB1 está acoplado a un primer resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana, el AB2 está acoplado a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana, el AB3 está acoplado a un tercer resto de enmascaramiento (MM3) que disminuye la capacidad de AB3 para unirse a su diana, y así sucesivamente para cada AB en el anticuerpo activable multiespecífico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye además al menos un sustrato de CM1-CM2 que es un sustrato para una proteasa MMP y una proteasa SP, donde el sustrato CM1-CM2 une un MM a un AB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico incluye al menos un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB1) que se une específicamente a una diana y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB2), donde al menos el primer AB en el anticuerpo activable multiespecífico se acopla a través de un primer sustrato CM1-CM2 a un resto de enmascaramiento (MM1) que disminuye la capacidad de AB1 para unirse a su diana. En algunas realizaciones de anticuerpos activables biespecíficos, AB1 se acopla a través del primer sustrato de CM1-CM2 a MM1, y AB2 se acopla a través de un segundo sustrato de CM1-CM2 a un segundo resto de enmascaramiento (MM2) que disminuye la capacidad de AB2 para unirse a su diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable multiespecífico comprende más de dos regiones AB; en algunas de estas realizaciones, AB1 se acopla a través del primer sustrato de CM1-CM2 a MM1, AB2 se acopla a través del segundo sustrato de CM1-CM2 a MM2, y AB3 se acopla a través de un tercer sustrato de CM1-CM2 a un tercer resto de enmascaramiento (MM3 ) que disminuye la capacidad de AB3 para unirse a su diana, y así sucesivamente para cada AB en el anticuerpo activable multiespecífico.
Anticuerpos activables que tienen restos estéricos no ligantes o compañeros de unión para fracciones estéricas no ligantes
La divulgación también proporciona anticuerpos activables que incluyen restos estéricos no ligantes (NB) o parejas de unión (BP) para restos estéricos no ligantes, donde el BP recluta o atrae de otro modo el NB al anticuerpo activable. Los anticuerpos activables proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, un anticuerpo activable que incluye un resto estérico (NB) no ligante, un sustrato CM1-CM2 y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une a una diana; un anticuerpo activable que incluye un compañero de unión para un resto estérico (BP) que no se une, un sustrato CM1-CM2 y un AB; y un anticuerpo activable que incluye un BP al que se ha reclutado un Nb , un sustrato CM1-CM2 y un AB que se une a la diana. Los anticuerpos activables en los que el NB está unido covalentemente al sustrato de CM1-CM2 y AB del anticuerpo activable o está asociado por interacción con un BP que está unido covalentemente al sustrato de CM1-CM2 y AB del anticuerpo activable se denominan aquí como "Anticuerpos activables que contienen NB". Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable exhibe un primer nivel de unión a una diana cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana cuando el anticuerpo activable está en un estado desinhibido, desenmascarado y/o escindido (es decir, una segunda conformación, es decir, anticuerpo activado), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión a la diana. Las composiciones de anticuerpos activables pueden exhibir una biodisponibilidad aumentada y una biodistribución más favorable en comparación con los productos terapéuticos de anticuerpos convencionales.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables proporcionan una toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otro modo podrían ser resultado de la unión en sitios sin tratamiento y/o sitios de diagnóstico si el AB no se enmascara o se inhibe de otro modo la unión a tal sitio.
En una realización, el anticuerpo activable incluye un resto estérico (NB) que no se une; un sustrato de CM1-CM2; y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el NB es un polipéptido que no se une específicamente al AB; el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; el sustrato de CM1-CM2 se coloca de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB a la diana; y el NB no inhibe la escisión del sustrato de CM1-CM2 por la enzima. Como se usa en esta invención y en todo el documento, el término polipéptido se refiere a cualquier polipéptido que incluye al menos dos residuos de aminoácidos, incluidos polipéptidos más grandes, proteínas de longitud completa y fragmentos de los mismos, y el término polipéptido no se limita a polipéptidos de cadena única y puede incluir conjuntos múltiples, por ejemplo, polipéptidos multicadena. En los casos en los que el polipéptido tiene una longitud más corta, por ejemplo, menos de 50 aminoácidos en total, los términos péptido y polipéptido se usan indistintamente en esta invención, y en los casos en que el polipéptido tiene una longitud más larga, por ejemplo, 50 aminoácidos o más , los términos polipéptido y proteína se usan indistintamente en esta invención.
En una realización, el anticuerpo activable incluye un resto estérico (NB) que no se une; un sustrato de CM1-CM2; y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a la diana, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se une específicamente al AB; (ii) el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido de hasta 50 aminoácidos de longitud que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el sustrato de CM1-CM2 se coloca de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB a la diana; y (iv) el NB no inhibe la escisión del sustrato CM1-CM2 por la enzima. Por ejemplo, cada secuencia de sustrato CM1 y la secuencia de sustrato CM2 en el sustrato de CM1-CM2 independiente tiene una longitud de hasta 15 aminoácidos.
En una realización, el anticuerpo activable incluye un resto estérico (NB) que no se une; un sustrato de CM1-CM2; y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a la diana, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se une específicamente al AB; (ii) el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el sustrato de CM1-CM2 se coloca de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB a la siana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB a la diana; (iv) el NB no inhibe la escisión del sustrato de CM1-CM2 por la enzima; y (v) el anticuerpo activable tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue en el estado no escindido: NB-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-NB.
En una realización, el anticuerpo activable incluye un resto estérico (NB) que no se une; un sustrato de CM1-CM2; y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a la diana, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se une específicamente al AB; (ii) el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el sustrato de CM1-CM2 se coloca de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB a la diana, y donde el NB en el anticuerpo activable no escindido reduce la capacidad del AB para unirse a la diana en al menos 50 %, por ejemplo, por al menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, en al menos un 100 % en comparación con la capacidad del AB escindido para unirse a la diana; y (iv) el NB no inhibe la escisión del sustrato CM1-CM2 por la enzima. La reducción en la capacidad del AB para unirse a la diana se determina, por ejemplo, usando un ensayo como se describe en esta invención o un ensayo de desplazamiento de la diana in vitro como, por ejemplo, el ensayo descrito en Publicaciones PCT Nos. WO 2009/025846 y WO 2010/081173.
En una realización, el anticuerpo activable incluye un compañero de unión (BP) para un resto estérico (NB) que no se une; un sustrato de CM1-CM2; y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el BP es un polipéptido que se une al NB cuando se expone al mismo; el NB no se une específicamente al AB; el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; el sustrato de CM1-CM2 se coloca de manera que en un estado no escindido en presencia del NB, el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB a la diana y el BP no interfiere con la unión del AB a la diana; y el NB y el BP no inhiben la escisión del sustrato de CM1-CM2 por la enzima. En algunos ejemplos de esta realización, el BP del anticuerpo activable se une opcionalmente al NB. En una realización, el NB es reclutado por el BP del anticuerpo activable in vivo.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable se formula como una composición. En algunas de estas realizaciones, la composición también incluye el NB, donde el NB se coformula con el anticuerpo activable que incluye el BP, el sustrato de CM1-CM2 y el AB. En algunos ejemplos de esta realización, el BP se selecciona de entre el grupo que consiste en un péptido de enlace a albúmina, un péptido de enlace a fibrinógeno, un péptido de enlace a fibronectina, un péptido de enlace a hemoglobina, un péptido de enlace a transferrina, un péptido de enlace a dominio de inmunoglobulina y otros péptidos de unión a proteínas de suero.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el NB es una proteína globular soluble. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el NB es una proteína que circula en el torrente sanguíneo. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el NB se selecciona de entre el grupo que consiste en albúmina, fibrinógeno, fibronectina, hemoglobina, transferrina, un dominio de inmunoglobulina y otras proteínas séricas.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el sustrato CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una proteasa. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, la proteasa se co-localiza en un tejido, y la proteasa escinde el sustrato de CM1-CM2 en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido de hasta 50 aminoácidos de longitud. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) que tiene una longitud de hasta 15 aminoácidos, por ejemplo, 3 aminoácidos de longitud, 4 aminoácidos de longitud, 5 aminoácidos de longitud. largos, 6 aminoácidos largos, 7 aminoácidos largos, 8 aminoácidos largos, 9 aminoácidos largos, 10 aminoácidos largos, 11 aminoácidos largos, 12 aminoácidos largos, 13 aminoácidos largos, 14 aminoácidos largos, o 15 aminoácidos de largo.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable tiene la disposición estructural desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal de la siguiente manera en el estado no escindido: sustrato NB-CM1-CM2-AB, sustrato AB-CM1-CM2 -NB, BP-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-BP. En realizaciones en las que el anticuerpo activable incluye un BP y el anticuerpo activable está en presencia del NB correspondiente, el anticuerpo activable tiene una disposición estructural desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal de la siguiente manera en el estado no escindido: NB:BP-CM1-CM2-AB, NB:BP-CM2-CM1-AB, AB-CM1-CM2-BP:NB o AB-CM2-CM1-BP:NB, donde ":" representa una interacción, por ejemplo, unión, entre el NB y el BP.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un objetivo dado y es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo de dominio, cadena sencilla, fragmento Fab, un F(ab')2 , un scFv, una costra, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio único o un anticuerpo de cadena ligera de dominio único. En algunas realizaciones, tal anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo que se une a la diana es un anticuerpo monoclonal de ratón, otro roedor, quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable incluye una combinación de una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos presentada en esta invención y una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos presentada en esta invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye una combinación de una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos presentada en esta invención, y una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos presentada en esta invención.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado de entre el grupo enumerado en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulo. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN o un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el ADN. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable también incluye un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable es un agente de diagnóstico.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable también inclguye un espaciador. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable también incluye un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal se conjuga con el anticuerpo activable a través de un espaciador. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo correspondiente; por ejemplo, la pK del anticuerpo activable es mayor que la del anticuerpo correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es similar a la del anticuerpo correspondiente. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 15 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 11 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 9 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 7 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 días cuando se administra a un organismo. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 5 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 2 días cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 24 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 20 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 18 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 16 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 14 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 horas cuando se administra a un organismo. En algunas realizaciones, la semivida en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 horas cuando se administra a un organismo.
La divulgación también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica cualquiera de estos anticuerpos activables, así como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La divulgación proporciona procedimientos para producir un anticuerpo activable cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula comprende tal secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula comprende tal vector.
La constante de disociación (Kd) del anticuerpo activable que contiene NB hacia la diana es mayor que la Kd del AB hacia la diana cuando no está asociado con el NB o NB:BP. La constante de disociación (Kd) del anticuerpo activable que contiene NB hacia la diana es mayor que la Kd del AB parental hacia la diana. Por ejemplo, la Kd del anticuerpo activable que contiene NB hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2,500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000­ 10.000.000, 100.000-1.000.000, or 100.000-10.000.000 veces mayores que la Kd del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o la Kd del AB partental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del anticuerpo activable que contiene NB hacia la diana es menor que la afinidad de unión del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o menor que la afinidad de unión del AB parental hacia la diana. Por ejemplo, la afinidad de unión del anticuerpo activable que contiene NB hacia la diana es de al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2,500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10­ 10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100­ 10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, o 100.000-10.000.000 veces más baja que la afinidad vinculante el AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o menor que la afinidad de unión del AB parental hacia la diana.
Cuando el anticuerpo activable que contiene NB está en presencia de la diana, la unión específica del AB a la diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP. Cuando el anticuerpo activable que contiene NB está en presencia de la diana, la unión específica del AB a la diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB parental a la diana. Cuando se compara con la unión del AB no asociado con un NB o NB:BP o la unión del AB parental a la diana, la capacidad del anticuerpo activable que contiene NB para unirse a la diana se reduce, por ejemplo, en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vitro y/o in vivo.
Cuando el anticuerpo activable que contiene NB está en presencia de la diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo, una proteasa u otra enzima), la unión específica del AB a la diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP. Cuando el anticuerpo activable que contiene NB está en presencia de la diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo, una proteasa, otra enzima, agente reductor o luz), la unión específica del AB a la diana se reduce o es inhibida, en comparación con la unión específica del AB parental a la diana. En comparación con la unión del AB no modificado con un NB o NB:BP o la unión del anticuerpo activable que contiene NB para unirse a la diana cuando se reduce, por ejemplo, en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso un 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, el anticuerpo activable incluye un agente conjugado con el AB para producir un conjugado de anticuerpo activable. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente de diagnóstico. En algunas realizaciones, el agente es un marcador detectable. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable, el agente es una toxina o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador. En algunas realizaciones del conjugado de anticuerpo activable, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente es un agente que daña el ácido nucleico, tal como un alquilador de ADN o un intercalador de ADN, u otro agente que dañe el a Dn . En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo enumerado en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina D (MMAD). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una caliqueamicina o derivado de la misma. En algunas realizaciones, el agente es una pirrolobenzodiazepina. En algunas realizaciones, el agente es un dímero de pirrolobenzodiazepina.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activables, los anticuerpos activables son anticuerpos activables de unión a doble diana. Dichos anticuerpos activables de doble unión a diana contienen dos Abs que pueden unirse a la misma o diferentes dianas. En realizaciones específicas, los anticuerpos activables de direccionamiento dual contienen anticuerpos biespecíficos o fragmentos de anticuerpos.
Los anticuerpos activables que se unen a doble diana están diseñados para tener un sustrato de CM1-CM2 que se pueda escindir mediante un agente de escisión que se colocaliza en un tejido diana con una o ambas dianas capaces de unirse a los AB de los anticuerpos activables. Se pueden diseñar anticuerpos activables de unión a diana doble con más de un AB para la misma o diferentes dianas para que tengan más de un sustrato de CM1-CM2, donde el primer sustrato de CM1-CM2 es escindible por un agente de escisión en un primer tejido diana y donde el segundo sustrato de CM1-CM2 puede escindirse mediante un agente de escisión en un segundo tejido diana, uniéndose una o más de las dianas a los AB de los anticuerpos activables. En una realización, los tejidos diana primero y segundo están separados espacialmente, por ejemplo, en diferentes sitios del organismo. En una realización, los tejidos diana primero y segundo son el mismo tejido separado temporalmente, por ejemplo, el mismo tejido en dos puntos diferentes en el tiempo, por ejemplo, el primer punto en el tiempo es cuando el tejido es un tumor en etapa temprana, y el segundo punto en el tiempo es cuando el tejido es un tumor en etapa tardía.
La divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos activables descritos en esta invención. La divulgación también proporciona vectores que incluyen estos ácidos nucleicos. Los anticuerpos activables descritos en esta invención se producen cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula incluye estas moléculas de ácido nucleico o vectores.
La divulgación también proporciona procedimientos para fabricar anticuerpos activables. En una realización, el procedimiento incluye las etapas de (a) cultivar una célula que incluye una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye (i) un resto estérico no vinculante (NB); (ii) un sustrato de CM1-CM2; y (iii) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana, donde (1) el NB no se une específicamente al AB; (2) el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (3) el sustrato de CM1-CM2 se coloca de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB a la diana; y (4) el NB no inhibe la escisión del sustrato de CM1-CM2 por la enzima; y (b) recuperar el anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye las etapas de (a) cultivar una célula que incluye una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye (i) un compañero de unión (BP) para un resto estérico no vinculante (NB); (ii) un sustrato de CM1-CM2; y (iii) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a una diana, donde (1) el NB no se une específicamente al AB; (2) el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (3) el sustrato de CM1-CM2 se coloca de manera que en un estado no escindido en presencia del NB, el NB interfiere con la unión del AB a la diana y en un estado escindido, el NB no interfiere con la unión del AB a la diana y el BP no interfiere con la unión del AB a la diana; y (4) el NB y el BP no inhiben la escisión del sustrato de CM1-CM2 por la enzima; y (b) recuperar el anticuerpo activable. En algunos ejemplos de esta realización, el BP del anticuerpo activable se une opcionalmente al NB.
Uso de anticuerpos activables y anticuerpos activables conjugados
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas según la divulgación se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan a las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Se pueden encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tal como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente descripción, siempre que el principio activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman W n "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts". J Pharm Sci.89(8):967--78 (2000), Powell y col. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238--311 (1998) y las citas en los mismos para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Las formulaciones terapéuticas de la divulgación, que incluyen un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado, se usan para impedir, tratar o mejorar de otro modo una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante de la diana. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas de la divulgación, que incluyen un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado, se usan para tratar o mejorar de otro modo la inflamación, un trastorno inflamatorio, una enfermedad autoinmune y/o un cáncer u otra afección neoplásica. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido o una neoplasia hematológica donde se expresa la diana. En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido donde se expresa la diana. En algunas realizaciones, el cáncer es una neoplasia hematológica donde se expresa la diana. En algunas realizaciones, la diana se expresa en el parénquima (por ejemplo, en el cáncer, la porción de un órgano o tejido que a menudo lleva a cabo una o más funciones del órgano o tejido). En algunas realizaciones, la diana se expresa en una célula, tejido u órgano. En algunas realizaciones, la diana se expresa en el estroma (es decir, el marco de soporte conectivo de una célula, tejido u órgano). En algunas realizaciones, la diana se expresa en un osteoblasto. En algunas realizaciones, la diana se expresa en el endotelio (vasculatura). En algunas realizaciones, la diana se expresa en una célula madre cancerosa. En algunas realizaciones, el agente al que se conjuga el anticuerpo activable es un inhibidor de microtúbulos. En algunas realizaciones, el agente con el que se conjuga el anticuerpo activable es un agente que daña el ácido nucleico.
La eficacia de la prevención, mejora o tratamiento se determina en asociación con cualquier procedimiento conocido para diagnosticar o tratar la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad diana, tal como, por ejemplo, la expresión y/o actividad diana aberrante. Prolongar la supervivencia de un sujeto o retrasar de otro modo la progresión de la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad de la diana, por ejemplo, la expresión y/o actividad de la diana aberrante, en un sujeto indica que el anticuerpo, anticuerpo conjugado, anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado confiere un beneficio clínico.
Un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado se pueden administrar en forma de composiciones farmacéuticas. Los principios y consideraciones que intervienen en la preparación de dichas composiciones, así como la orientación en la elección de los componentes, se proporcionan, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, y col., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, Nueva York.
En algunas realizaciones donde se usan fragmentos de anticuerpos, se selecciona el fragmento más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que conserven la capacidad de unirse a la secuencia de proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. (Véase, por ejemplo, Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, por ejemplo, en algunas realizaciones, aquellas con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. En algunas realizaciones, o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (para ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Pat. de e E.UU. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como LUPRON DEPOT ™ (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado contiene una etiqueta detectable. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv, o F(ab)2) . El término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende incluir el marcado directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o el anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcado final de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Por lo tanto, se incluye dentro del uso del término "muestra biológica" la sangre y una fracción o componente de la sangre, incluyendo suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el procedimiento de detección de la descripción se puede usar para detectar un ARNm de analito, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro, así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de un ARNm de analito incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de una proteína de analito incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), Western blots, inmunoprecipitaciones, tinción inmunoquímica e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de un ADN genómico de analito incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos para realizar inmunoensayos se describen, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las técnicas in vivo para la detección de una proteína de analito incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-proteína de analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden detectarse mediante técnicas de imagen estándar.
Los anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la divulgación también son útiles en una diversidad de formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una realización, se administra un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a pacientes que corren el riesgo de desarrollar uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente se puede determinar utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunas realizaciones, se administra un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. Tras el diagnóstico, se administra un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado de la divulgación también es útil en la detección de una diana en muestras de pacientes y, por consiguiente, son útiles como diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos y/o anticuerpos activables, y las versiones conjugadas de los mismos, de la divulgación se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar niveles de diana en una muestra de paciente.
En una realización, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado de la divulgación se inmoviliza en un soporte sólido (por ejemplo, los pocillos de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado sirven como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de leche o albúmina para impedir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que se marca de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel de etiqueta detectable, y la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba se determina en comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos de la divulgación, y las versiones conjugadas de los mismos, en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible estadificar una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados en diversos estadios de la progresión de la enfermedad, y/o en diversos puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada estadio de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada estadio.
Un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado también se pueden usar en procedimientos de diagnóstico y/o de formación de imágenes. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vitro. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vivo. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in situ. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos activables que tienen un sustrato de CM1-CM2 escindible enzimáticamente pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el sustrato de CM1-CM2. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas realizaciones, un entorno de potencial de reducción aumentado tal como el que puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una célula o tejido dado de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un mayor potencial de reducción dependiendo de la naturaleza del sustrato de CM1-CM2) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el sustrato de CM1-CM2 puede seleccionarse para ser sustrato para una metaloproteasa de matriz (MMP) y una serina proteasa (SP) que se encuentran en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana, en un sitio confinado biológicamente (por ejemplo, como en un absceso, en un órgano y similares), y similares. El AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Usando procedimientos como los descritos en esta invención, o cuando sea apropiado, procedimientos familiares para un experto en la técnica, una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta fluorescente o una etiqueta radiactiva o un radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo y/o anticuerpo activable. Los marcadores detectables adecuados se analizan en el contexto de los procedimientos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales a continuación. Usando un AB específico para una proteína o péptido del estado patológico, junto con una MMP cuya actividad es elevada en el tejido patológico de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido patológico en relación con los tejidos donde la enzima específica del sustrato de CM1-CM2 no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel más bajo que en el tejido enfermo o está inactiva (p. ej., en forma de zimógeno o en un complejo con un inhibidor). Dado que las proteínas y los péptidos pequeños se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y debido a que la enzima específica para el sustrato de CM1-CM2 no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles más bajos en tejidos no afectados por la enfermedad o está presente en conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido con enfermedad aumenta en relación con los tejidos sin enfermedad.
En otro ejemplo, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un sustrato de CM1-CM2 susceptible de escisión por una enzima, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un sustrato de CM1-CM2 susceptible de escisión por agente reductor, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos procedimientos, los anticuerpos activables pueden marcarse de manera detectable y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido, tal como un portaobjetos o una perla). El marcador detectable puede posicionarse en una porción del anticuerpo activable que no se libera después de la escisión, por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente inactivado u otro marcador que no sea detectable hasta que se haya producido la escisión. El ensayo se puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos activables inmovilizados, marcados de forma detectable con una muestra que se sospecha que contiene una enzima y/o agente reductor durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la escisión, que se lava a continuación para eliminar el exceso de muestra y contaminantes. La presencia o ausencia del agente de escisión (por ejemplo, enzima o agente reductor) en la muestra se evalúa a continuación mediante un cambio en la señal detectable de los anticuerpos activables antes de entrar en contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia y/o un aumento en la señal detectable debido a la escisión del anticuerpo activable por el agente de escisión en la muestra.
Dichos procedimientos de detección pueden adaptarse para proporcionar también la detección de la presencia o ausencia de una diana que sea capaz de unir el a B de los anticuerpos activables cuando se escinde. Por lo tanto, los ensayos se pueden adaptar para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de una diana de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede detectarse por la presencia y/o un aumento en la etiqueta detectable de los anticuerpos activables como se ha descrito anteriormente, y la presencia o ausencia de la diana puede detectarse mediante la detección de un complejo diana-AB, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-diana marcado de forma detectable.
Los anticuerpos activables también son útiles en la formación de imágenes in situ para la validación de la activación de anticuerpos activables, por ejemplo, por escisión de proteasa, y la unión a una diana particular. La formación de imágenesin situ es una técnica que permite la localización de la actividad proteolítica y la diana en muestras biológicas tales como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar tanto la unión a una diana dada como la actividad proteolítica basándose en la presencia de una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula congelada o tejido derivado de un sitio de enfermedad (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos sanos Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo activable se marca con una etiqueta detectable. La etiqueta detectable puede ser un colorante fluorescente (p. ej., un fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), una etiqueta de Alexa Fluor® ), un colorante infrarrojo cercano (NIR) (p. ej., nanocristales Qdot® un colorante coloidal metal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección de la etiqueta en una muestra que se ha incubado con el anticuerpo activable marcado indica que la muestra contiene la diana y contiene una metaloproteasa de matriz (MMP) y una serina proteasa (SP) que son específicas para el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la MMP puede confirmarse usando inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo tal como A11, que es específico para la proteasa matriptasa (MT-SP1) e inhibe la actividad proteolítica de la matriptasa; véase, por ejemplo, la publicación internacional número WO 2010/129609, publicada el 11 de noviembre de 2010. La misma estrategia de usar inhibidores de proteasa de amplio espectro como los descritos en esta invención y/o usar un agente inhibidor más selectivo puede usarse para identificar una MMP y una SP específicas para el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la diana puede confirmarse usando un agente que es específico para la diana, por ejemplo, otro anticuerpo, o la etiqueta detectable puede competir con la diana no marcada. En algunas realizaciones, podría usarse un anticuerpo activable no marcado, con detección mediante un anticuerpo secundario marcado o un sistema de detección más complejo.
Técnicas similares también son útiles para la obtención de imágenes in vivo donde la detección de la señal fluorescente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene la diana y contiene una m Mp y un SP que es específico para el sustrato de CM1- CM2 del anticuerpo activable.
Estas técnicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de la actividad de proteasa en una diversidad de células, tejidos y organismos basados en el sustrato de CM1-CM2 específico de proteasa en el anticuerpo activable.
La divulgación proporciona procedimientos para usar los anticuerpos y/o anticuerpos activables en una diversidad de indicaciones de diagnóstico y/o profilácticas. Por ejemplo, la divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y una diana de interés en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto a un sujeto o muestra con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o un fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB y no es una forma modificada de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido, no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado escindido, activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) medir un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra y donde ningún nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no suficientemente presentes en el sujeto o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable.
La divulgación también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto a un sujeto o muestra con un anticuerpo activable en presencia de una diana de interés, por ejemplo, la diana, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión y un dominio de unión a antígeno o un fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en una estado no escindido, no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB y no es una forma modificada de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido, no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado escindido, activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) medir un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra y donde no hay nivel detectable de anticuerpo activable activado el anticuerpo en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable.
La divulgación también proporciona kits para usar en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable que comprende un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana de interés, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB y no es una forma modificada de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido, no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado escindido, activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y (ii) medir un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra y donde no hay nivel detectable de anticuerpo activable activado el anticuerpo en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable.
La divulgación también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto a un sujeto o muestra con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión, un dominio de unión a antígeno (AB) que se une específicamente a la diana y una etiqueta detectable, donde el anticuerpo activable en un estado no escindido y no activado comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C como sigue: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB y no es una forma modificada de un compañero de unión natural del AB; donde, en un estado no escindido, no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB a la diana, y en un estado escindido, activado, el MM no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana; y donde la etiqueta detectable se coloca en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del sustrato de CM1-CM2; y (ii) medir un nivel de etiqueta detectable en el sujeto o la muestra, donde un nivel detectable de la etiqueta detectable en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o la muestra y donde el nivel no detectable de la etiqueta detectable en el sujeto o la muestra indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable.
La divulgación también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado (por ejemplo, un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico) descrito en esta invención para su uso en el contacto con un sujeto o muestra biológica, y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o la muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o la muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se pueden detectar en el sujeto o la muestra biológica.
La divulgación también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable en presencia de la diana, y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable, de modo que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o muestra biológica. Dicho anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en una forma no escindida (es decir, el estado no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto N-terminal escindible con respecto al sitio de escisión de la proteasa. En algunas realizaciones, se enmascara un único sitio de unión a antígeno del AB. En algunas realizaciones donde un anticuerpo de la divulgación tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos un sitio de unión a antígeno está enmascarado y al menos un sitio de unión a antígeno no está enmascarado. En algunas realizaciones, todos los sitios de unión a antígeno están enmascarados. En algunas realizaciones, la etapa de medición incluye el uso de un reactivo secundario que comprende una etiqueta detectable.
La divulgación también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención para su uso en el contacto de un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable en presencia de la diana, y la medición de un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica, y donde el nivel no detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable, de modo que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o muestra biológica. Dicho anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en una forma no escindida (es decir, el estado no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto de enmascaramiento. En algunas realizaciones, el marcador detectable está unido al resto N-terminal escindible con respecto al sitio de escisión de la proteasa. En algunas realizaciones, se enmascara un único sitio de unión a antígeno del AB. En algunas realizaciones donde un anticuerpo de la descripción tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos un sitio de unión a antígeno está enmascarado y al menos un sitio de unión a antígeno no está enmascarado. En algunas realizaciones, todos los sitios de unión a antígeno están enmascarados. En algunas realizaciones, la etapa de medición incluye el uso de un reactivo secundario que comprende una etiqueta detectable.
La divulgación también proporciona kits para su uso en procedimientos de detección de la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención para su uso en el contacto con un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde el anticuerpo activable incluye una etiqueta detectable que se coloca en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del sustrato de CM1-CM2, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica de modo que la unión a la diana y/o la escisión por proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o la muestra biológica, y donde no se detecta un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable.
La divulgación proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o una muestra biológica con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye una etiqueta detectable que se coloca en un porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del sustrato de CM1-CM2 y (ii) medir un nivel de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o la muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión por proteasa del anticuerpo activable no pueden detectarse en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de etiqueta detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %. Dicho anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en una forma no escindida (es decir, el estado no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde el Mm del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con el específico unión del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable.
La descripción también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la diana en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado descrito en el presente documento para su uso en el contacto de un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no pueden detectarse en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo activable activado en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de etiqueta detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %.
La divulgación también proporciona procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un sujeto o una muestra (i) poniendo en contacto un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye una etiqueta detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del sustrato de CM1-CM2; y (ii) midiendo un nivel de etiqueta detectable en el sujeto o muestra biológica, donde un nivel detectable de la etiqueta detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no está suficientemente presente en el sujeto o muestra biológica a un nivel detectable, de tal forma que la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no puede detectarse en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de la etiqueta detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de etiqueta detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %. Dicho anticuerpo activable incluye un resto de enmascaramiento (MM), un sustrato de CM1-CM2 que es escindido por el agente de escisión, y un dominio de unión a antígeno o fragmento del mismo (AB) que se une específicamente a la diana, donde el anticuerpo activable en una forma no escindida (es decir, el estado no activado) comprende una disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2 sustrato-AB o AB-CM1-CM2 sustrato-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB a la diana, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo activable en un estado no escindido interfiere con la unión específica del AB a la diana, y donde el MM de un anticuerpo activable en un estado escindido (es decir, activado) no interfiere ni compite con la unión específica del AB a la diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable.
La divulgación también proporciona kits para su uso en procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión de interés en un sujeto o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado descrito en esta invención para su uso en el contacto de un sujeto o muestra biológica y medios para detectar el nivel de anticuerpo activable activado y/o anticuerpo activable conjugado en el sujeto o muestra biológica, donde el anticuerpo activable incluye una etiqueta detectable que se posiciona en una porción del anticuerpo activable que se libera después de la escisión del sustrato de CM1-CM2, donde un nivel detectable de la etiqueta detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión, la diana, o tanto el agente de escisión como la diana están ausentes y/o no están suficientemente presentes en el sujeto o muestra biológica, de modo que la unión a la diana y/o la escisión de la proteasa del anticuerpo activable no se pueden detectar en el sujeto o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de la diana detectable en el sujeto o muestra biológica indica que el agente de escisión y la diana están presentes en el sujeto o muestra biológica. Un nivel reducido de etiqueta detectable es, por ejemplo, una reducción de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % y/o aproximadamente el 100 %.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable incluye una etiqueta detectable. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la etiqueta detectable incluye un agente de formación de imágenes, un agente de contraste, una enzima, una etiqueta fluorescente, un cromóforo, un colorante, uno o más iones metálicos, o una etiqueta basada en ligando. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de formación de imágenes comprende un radioisótopo. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la etiqueta fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), proteína fluorescente roja tdimer2 (RFP2 tdimer), HCRED, o un derivado de europio. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la etiqueta luminiscente comprende un derivado de N-metilacridinio. En algunas realizaciones de estos procedimientos, la etiqueta comprende una etiqueta Alexa Fluor® , tal como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, la etiqueta basado en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, un gato, un perro, un caballo), un animal de granja, un animal de trabajo o un animal de zoológico. En algunas realizaciones, el sujeto es un roedor.
En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vivo . En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in situ . En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento ex vivo . En algunas realizaciones de estos procedimientos, el procedimiento es un procedimiento in vitro .
En algunas realizaciones, la formación de imágenes in situ y/o la formación de imágenes in vivo son útiles en procedimientos para identificar qué pacientes tratar. Por ejemplo, en la formación de imágenes in situ, los anticuerpos activables se usan para cribar muestras de pacientes para identificar a aquellos pacientes que tienen la proteasa o proteasas y la diana o dianas en la ubicación apropiada, por ejemplo, en un sitio de tumor.
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in situ para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la divulgación. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (p. ej., la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable que se está analizando (p. ej., acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con dicho anticuerpo activable que comprende dicho sustrato de CM1-CM2. Del mismo modo, los pacientes que dan negativo para una o ambas dianas (por ejemplo, la diana) y la proteasa que escinde el sustrato en el sustrato de CM1-CM2 en el anticuerpo activable que se está analizando mediante estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes sustratos de CM1-CM2 hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (p. ej., un anticuerpo activable que comprende un sustrato de CM1-CM2). que es escindido por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable para el que el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in vivo para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la divulgación. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (p. ej., la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable que se está analizando (p. ej., acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con dicho anticuerpo activable que comprende dicho sustrato de CM1-CM2. Del mismo modo, los pacientes con resultados negativos pueden ser identificados como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes sustratos de CM1-CM2 hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (p. ej., un anticuerpo activable que comprende un sustrato de CM1-CM2). que es escindido por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable para el que el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones de los procedimientos y kits, el procedimiento o kit se usa para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la divulgación. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (p. ej., la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato en el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable que se está analizando en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con dicho anticuerpo activable que comprende dicho sustrato de CM1-CM2. Del mismo modo, los pacientes que dan negativo tanto para las dianas (por ejemplo, la diana) como para la proteasa que escinde el sustrato en el sustrato de CM1-CM2 en el anticuerpo activable que se está analizando mediante estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otros anticuerpos activables hasta que se identifique un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (p. ej., un anticuerpo activable que comprende un sustrato de CM1-CM2 que el paciente escinde en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo para cualquiera de la diana (por ejemplo, la diana) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal sustrato de CM1-CM2. En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo para cualquiera de la diana (por ejemplo, la diana) se identifican como candidatos no adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal sustrato de CM1-CM2. En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otros anticuerpos activables hasta que se identifique un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (p. ej., un anticuerpo activable que comprende un sustrato de CM1-CM2 que el paciente escinde en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, el anticuerpo activable es un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no se conjuga con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable se posiciona en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable en el sujeto o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable.
En algunas realizaciones, se usa un procedimiento o kit para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable anti-diana y/o un anticuerpo activable conjugado (por ejemplo, un anticuerpo activable con el que se conjuga un agente terapéutico) de la divulgación, seguido de tratamiento mediante la administración de ese anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para las dianas (p. ej., la diana) como para una proteasa que escinde el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado que se analiza en estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con dicho anticuerpo y/o dicho anticuerpo conjugado activable que comprende dicho sustrato de CM1-CM2, y luego se administra al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable y/o conjugado del anticuerpo activable que se ensayó. Asimismo, los pacientes que dan negativo para cualquiera de o tanto la diana (por ejemplo, la diana) como la proteasa que escinde el sustrato en el sustrato CM1-CM2 en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, dichos pacientes pueden analizarse con otro anticuerpo y/o anticuerpo activable conjugado hasta que se identifique un anticuerpo adecuado y/o un anticuerpo activable conjugado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado que comprende un sustrato de CM1-CM2 que se escinde por el paciente en el sitio de enfermedad). En algunas realizaciones, al paciente se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo activable y/o anticuerpo activable conjugado para el que el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el MM es un péptido que tiene una longitud de aproximadamente 4 a 40 aminoácidos. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable comprende un péptido enlazador, donde el péptido enlazador se posiciona entre el MM y el sustrato de CM1-CM2. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable comprende un péptido enlazador, donde el péptido enlazador se posiciona entre el AB y el sustrato de CM1-CM2. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el anticuerpo activable comprende un primer péptido enlazador (LI) y un segundo péptido enlazador (L2), donde el primer péptido enlazador se posiciona entre el Mm y el sustrato de CM1-CM2, y el segundo péptido enlazador se posiciona entre el AB y el sustrato de CM1-CM2. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, cada uno de L1 y L2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud, y donde cada uno de L1 y L2 no necesita ser el mismo enlazador. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, uno o ambos de L1 y L2 comprenden un polímero de glicina-serina. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, al menos uno de L1 y L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en (GS)n, (GSGGS)n (Se Q ID NO: 381) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 382), donde n es un número entero de al menos uno. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, al menos uno de L1 y L2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula (GGS)n, donde n es un número entero de al menos uno. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, al menos uno de L1 y L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en Gly-Gly-Ser-Gly (s Eq ID NO: 383), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 384), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 385), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 386), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 387), y Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 388).
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el AB comprende una secuencia de anticuerpo o de fragmento de anticuerpo que se selecciona de entre las secuencias de anticuerpos de reacción cruzada presentadas en esta invención. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el AB comprende un fragmento Fab, un scFv o un anticuerpo de cadena simple (scAb).
En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el agente de escisión es una proteasa que se colocaliza en el sujeto o muestra con la diana y el sustrato de CM1-CM2 es un polipéptido que funciona como un sustrato para la proteasa, donde la proteasa escinde el sustrato de CM1-CM2 en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa. En algunas realizaciones de estos procvedimientos y kits, cada una de la secuencia de sustrato CM1 y la secuencia de sustrato CM2 del sustrato CM1-CM2 es independientemente un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sustrato de CM1-CM2 está acoplado al extremo N del AB. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sustrato de CM1-CM2 está acoplado al extremo C del AB. En algunas realizaciones de estos procedimientos y kits, el sustrato de CM1-CM2 está acoplado al extremo N de una cadena VL del AB.
Los anticuerposactivables y/o anticuerpos activables conjugados de la divulgación se usan en formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una realización, se administra un anticuerpo activable a pacientes que están en riesgo de desarrollar una o más de la inflamación, trastornos inflamatorios, cáncer u otros trastornos mencionados anteriormente.
La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente se puede determinar utilizando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunas realizaciones de la divulgación, se administra un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. Tras el diagnóstico, se administra un anticuerpo activable y/o un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Los anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la divulgación también son útiles en la detección de la diana en muestras de pacientes y, por consiguiente, son útiles como productos de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos activables y/o los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar niveles diana en una muestra de paciente.
En una realización, un anticuerpo activable de la divulgación se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el pocillo o pocillos de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado activable sirve como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de leche o albúmina para impedir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que se marca de manera detectable. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel de etiqueta detectable, y la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba se determina en comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos de la divulgación en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible estadificar una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados en diversos estadios de la progresión de la enfermedad, y/o en diversos puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada estadio de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada estadio.
También pueden usarse anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados en procedimientos de diagnóstico y/o de formación de imágenes. En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vitro . En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in vivo . En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos in situ . En algunas realizaciones, dichos procedimientos son procedimientos ex vivo . Por ejemplo, los anticuerpos activables que tienen un sustrato de CM1-CM2 escindible enzimáticamente pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el sustrato de CM1-CM2. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo, (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas realizaciones, un entorno de potencial de reducción aumentado tal como el que puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una célula o tejido dado de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un mayor potencial de reducción dependiendo de la naturaleza del sustrato de CM1-CM2) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el sustrato de CM1-CM2 puede seleccionarse como sustrato de proteasa para una proteasa encontrada en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, tal como en un absceso, en un órgano y similares), y similares. El AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Usando procedimientos familiares para un experto en la técnica, una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta fluorescente o etiqueta radiactiva o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo activable. Los marcadores detectables adecuados se analizan en el contexto de los procedimientos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales a continuación. Usando un AB específico para una proteína o péptido de la patología, junto con una proteasa cuya actividad es elevada en el tejido de la enfermedad de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido de la enfermedad en relación con los tejidos donde la enzima específica del sustrato de CM1-CM2 no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel más bajo que en el tejido de la enfermedad o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las proteínas y los péptidos pequeños se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y debido a que la enzima específica para el sustrato de CM1-CM2 no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles más bajos en tejidos no afectados por la enfermedad o está presente en conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido con enfermedad aumenta en relación con los tejidos sin enfermedad.
En otro ejemplo, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un sustrato de CM1-CM2 susceptible de escisión por una enzima, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, cuando los anticuerpos activables contienen un sustrato de CM1-CM2 susceptible de escisión por agente reductor, los anticuerpos activables pueden usarse para detectar (ya sea cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos procedimientos, los anticuerpos activables pueden marcarse de manera detectable y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido, tal como un portaobjetos o una perla). El marcador detectable puede posicionarse en una porción del anticuerpo activable que no se libera después de la escisión, por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente inactivado u otro marcador que no sea detectable hasta que se haya producido la escisión. El ensayo se puede realizar, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos activables inmovilizados, marcados de forma detectable con una muestra que se sospecha que contiene una enzima y/o agente reductor durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la escisión, que se lava a continuación para eliminar el exceso de muestra y contaminantes. A continuación, se evalúa la presencia o ausencia del agente de escisión (por ejemplo, enzima o agente reductor) en la muestra mediante un cambio en la señal detectable de los anticuerpos activables antes del contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia y/o un aumento de la señal detectable debida a la escisión del anticuerpo activable por el agente de escisión en la muestra.
Dichos procedimientos de detección pueden adaptarse para proporcionar también la detección de la presencia o ausencia de una diana que sea capaz de unir el a B de los anticuerpos activables cuando se escinde. Por lo tanto, los ensayos se pueden adaptar para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de una diana de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede detectarse por la presencia y/o un aumento en la etiqueta detectable de los anticuerpos activables como se ha descrito anteriormente, y la presencia o ausencia de la diana puede detectarse mediante la detección de un complejo diana-AB, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo anti-diana marcado de forma detectable.
Los anticuerpos activables también son útiles en la formación de imágenes in situ para la validación de la activación de anticuerpos activables, por ejemplo, por escisión de proteasa, y la unión a una diana particular. La formación de imágenesin situ es una técnica que permite la localización de la actividad proteolítica y la diana en muestras biológicas tales como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar tanto la unión a una diana dada como la actividad proteolítica basándose en la presencia de una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula congelada o tejido derivado de un sitio de enfermedad (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos sanos. Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo activable se marca con una etiqueta detectable. La etiqueta detectable puede ser un colorante fluorescente (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), un colorante infrarrojo cercano (NIR) (p. ej., nanocristales Qdot® , un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación tal como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección de la etiqueta en una muestra que se ha incubado con el anticuerpo activable marcado indica que la muestra contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la proteasa puede confirmarse usando inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo tal como A11, que es específico para la proteasa matriptasa (MT-SP1) e inhibe la actividad proteolítica de la matriptasa; véase, por ejemplo, la publicación internacional número WO 2010/129609, publicada el 11 de noviembre de 2010. El mismo enfoque del uso de inhibidores de proteasa de amplio espectro tales como los descritos en esta invención, y/o usando un agente inhibidor más selectivo puede usarse para identificar una proteasa o clase de proteasas específicas para el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la presencia de la diana puede confirmarse usando un agente que es específico para la diana, por ejemplo, otro anticuerpo, o la etiqueta detectable puede competir con la diana no marcada. En algunas realizaciones, podría usarse un anticuerpo activable no marcado, con detección mediante un anticuerpo secundario marcado o un sistema de detección más complejo.
Técnicas similares también son útiles para la formación de imágenes in vivo donde la detección de la señal fluorescente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, incluido un ser humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable.
Estas técnicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de la actividad de proteasa en una diversidad de células, tejidos y organismos basados en el sustrato de CM1-CM2 específico de proteasa en el anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, la formación de imágenes in situ y/o la formación de imágenes in vivo son útiles en procedimientos para identificar qué pacientes tratar. Por ejemplo, en la formación de imágenes in situ, los anticuerpos activables se usan para cribar muestras de pacientes para identificar a aquellos pacientes que tienen la proteasa o proteasas y la diana o dianas en la ubicación apropiada, por ejemplo, en un sitio de tumor.
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in situ para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la divulgación. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (sustrato de CM1-CM2) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal sustrato de CM1-CM2. Asimismo, los pacientes que dan negativo para cualquiera o tanto la diana como la proteasa que escinde el sustrato en el sustrato de CM1-CM2 en el anticuerpo activable que se ensaya usando estos procedimientos se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se ensaya). En algunas realizaciones, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes sustrato de CMs hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un sustrato de CM1-CM2 que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad).
En algunas realizaciones, se usa la formación de imágenes in vivo para identificar o reajustar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la divulgación. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (sustrato de CM1-CM2) del anticuerpo activable que se está ensayando (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal sustrato de CM1-CM2. Asimismo, los pacientes que dan negativo se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se está ensayando). En algunas realizaciones, dichos pacientes que dan negativo con respecto a un primer anticuerpo activable pueden analizarse con otros anticuerpos activables que comprenden diferentes sustrato de CMs hasta que se identifica un anticuerpo activable adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable que comprende un sustrato de CM1-CM2 que se escinde por el paciente en el sitio de la enfermedad).
Composiciones Farmacéuticas
Los anticuerpos conjugados, anticuerpos activables y/o anticuerpos activables conjugados de la divulgación (también denominados en esta invención "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Dichas composiciones comprenden típicamente el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en esta invención, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo. Los ejemplos adecuados de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5 %. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.
Una composición farmacéutica de la descripción se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (porejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), tópica), transmucosa y rectal Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, una solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En algunas realizaciones, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se agita y se expectora o se traga. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos, y similares, pueden incluir cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saporífero tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etilén vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se usa en esta invención, se refiere a conjuntos físicamente discretos adecuados como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada conjunto una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la divulgación se dicta por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de compuestos de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1. Anticuerpos activables anti-Jagged escindibles de metaloproteasa de matriz (MMP) y serina proteasa (SP)
Este ejemplo demuestra la generación y evaluación de anticuerpos activables que se unen a una diana Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, donde los anticuerpos activables se activan en presencia de al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos una serina proteasa.
Los estudios descritos en esta invención utilizaron las siguientes secuencias de sustrato, donde LP' es un péptido de enlace entre CM1 y CM2. Para el sustrato CM1-CM2 1001/LP'/0001, LP' es GGSGGS (SEQ ID NO: 350), y para todos los demás CM1-CM2 en la tabla a continuación, LP' es GG:
Figure imgf000082_0001
La construcción de cadenas ligeras del anticuerpo activable Anti-Jagged se realizó como sigue.
Los sustratos de CM1-CM2 se incorporaron en el vector de anticuerpo activable Jagged (descrito en la Publicación PCT No. WO2013/192550) como sigue. Usando técnicas estándar de biología molecular, los cebadores directos (F) que codifican los sustratos de CM1-CM2 (consulte la Tabla A) y el cebador inverso (R) CX1198 se usaron para amplificar el sustrato y el dominio VL del anticuerpo activable Jagged y posteriormente se clonaron en el vector de anticuerpo activable usando los sitios de restricción Xhol y BsiWI. Los vectores resultantes codificaron las siguientes cadenas ligeras de anticuerpos activables anti-Jagged.
T l A: r iliz r n r ir l v r x r i n M1- M2
Figure imgf000083_0001
Anticuerpo activable Lc Anti-Jagged 2001 con secuencia espadadora Secuencia de nucleótidos
C e a g g c c a g t c t g g c c a g t g c a a ~ a t t . t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c t a t c t c r t t c c g g a c t g c t g t c c g g c a g a t c c g a c a a a c a c g g ::ggsggctctqflcatctiaga tgact:cag t ctcc:aL.c:::i.c:ct tg tc tg c a tc tg ta g g ag a c a g a g t i i t t a t c a í t t g t t g g g f i a a g l i c a g a g i i t t a g c a g i j t a t t t a a ü t t g g t i t t a g t a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a c j c t c c t g a i c t a t g c g y c a t q c a g t t t g c a a a g i g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g q q g a g a g t g t (SEQ ID NO: 48 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL
QPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ1KS GTASWCLLNNF
YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG
LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 49)
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2001 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g q c g g c t c t a t c t c t t c c g g a c t g c t g t c c g g c a g a t c c g a c a a t c a c g g c g g a g g c t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a q c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 419 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 420 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1001/LP'/0001 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a g t q c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c t a t c t c t t c t g g c c t g c t g t c t a g c g g c g g c t c c g g c g g a t c t c t g t c t g g c a g a t c t g a c a a c c a c g g c g g a g g c t c c g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g q c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g c g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a e e e t g a c g c t g a g c a a a g e a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c a t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 50 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNHGGGSDIQMTQSP
SSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT
DFTLTIS SLQPEDFAT YYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQ1KSGTA
SWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 51 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1001/LP'/0001 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c t a t c t c t t c t g g c c t g c t g t c t a q c g g c g g c t c c g g c g g a t c t c t g t c t g g c a g a t c t g a c a a c c a c g g c g g a g g c t c c g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a e t c t c a c e a t e a g c a g t c t q c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a q a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t c t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 421 )
Secuencia de aminoácidos
CN TWT jVGGDCRGWQGGSSGGST SSGLLSSGGSGGSLSGRSDNHGGGSDIQMTQS PSSLSAS
VGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI
SSLQPEDFATYYCQQTWAP PLFGQGTKVE IKR.TVAAPSVFIFPP5DEQLKSGTASWCLL
NNFYPREAKVQWKVDNAIQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTITLSKADYEKHKVYACEVT
5 HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 422 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1004/LP'/0003 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a c t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g a t c t g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c t c c t g g c g g c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c t c g g g g c g g a g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c e c t g t c t g e a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a q c t c c t g a t c t a t g c -|0 g g c a t c c a g t t t g c a a a c t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g q a t c t g q g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a q c a a a g c a g a c t a c g a q a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 52 )
Secuencia de aminoácidos
15
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGTSTSGRSANPRGGGSDIQMTQSPS
SLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTD
FTLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAFSVFIFPPSDEQLKSGTAS
WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 53 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1004/ LP'/ 0003 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t . t . g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g a t c t g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c t c c t g g c g g c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c t c g g g g c g g a g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c e a t c a e t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g q a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 423 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGTSTSGRSANPRGGGSDIQMTQS PSSLSASV
GDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS
SLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 424)
Anticuerpo activable Anti-Jagged 0003/LP'/1004 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a c t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c c a g a g g t g g c g g a g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c a c c a g g c g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 54 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSTSTSGRSANPRGGGAVGLLAPPGGSDIQMTQSPS
SLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTD
FTLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAFSVFIFP PSDEQLKSGTAS
WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 55 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 0003/ LP'/ 1004 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c c a g a g g t g g c g g a g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c a c c a g g c g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c e a t c a e t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c e c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 425 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSTSTSGRSANPRGGGAVGLLAPPGGSDIQMTQSPSSLSASV
GDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS
S LQP E D FAT Y YCQQTWAP P L FGQGT KVEI KRTVAAPSVFIF P P 3 DEQL KS GTASWC L LN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE3VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 426 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1003/LP'/0003 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a g t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c t g t g c a t a t g c c c c t g g g c t t t c t g g g c c c t g g c g g c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c t c g g g g c g g a g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c e a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c e a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t c c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 56 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSVHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRGGGSDIQMTQS
PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT
ASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK
VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 57 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1003/ LP'/ 0003 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c t g t g c a t a t g c c c c t g g g c t t t c t g g g c c c t g g c g g c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c t c g g g g c g g a g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a q q c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 427 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSVHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRGGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCL
LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV
THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 428)
Anticuerpo activable Anti-Jagged 0003/LP'/1003 Lc con secuencia espaciadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a g t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c c a g a g g c g g c g g a g t g c a t a t g c c t c t g g g c t t t c t g g g a c c t g g c g g c t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g o g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a q t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a c c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 58 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSTSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGPGGSDIQMTQS
PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGT
A3WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD3TYSLSSTLTLSKADYEKHK
VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO; 59 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 0003/ LP'/ 1003 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c c a c a t c t a c c t c t g g c a g a t c c g c c a a c c c c a g a g g c g g c g g a g t g c a t a t g c c t c t g g g c t t t c t g g g a c c t g g c g g c t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 429 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSTSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGPGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCRASQSI SSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCL
LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHfG/YACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 430 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1004/LP'/0001 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a g t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g a t c t g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c t c c t g g t g g c c t g t c t g g c a g a t c t g a t a a c c a c g g c g c c t c c g a c a t c c a g a t q a c c c a q t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a q a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a a c c t g a c g c t g a c c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 60 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSENHGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCL
LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV
5 THQGL55PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 61 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1004/ LP'/ 0001 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g a t c t g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c t c c t g g t g g c c t g t c t g g c a g a t c t g a t a a c c a c g g c g g c t c c g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g c a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c e a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g q c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c -|0 t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 431 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRV
15
TITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP
EDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHfíVYACEVTHQGLS S PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 432 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 0001/LP'/1004 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de nucleótidos
20
C a a g g c c a g t c t g g c c a c t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g c t c t g g c c t g t c t g g c a g a t c c g a t a a c c a t g g c g g c g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c t c c t g g t g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g q t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a o a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGLSGRSDNHGGAVGLIAPPGGSDIQMTQSPSSLS
ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSIQSGVPSRFSGSGSGTDFTL
TISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWC
LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 63 )
Anticuerpo activable Anti-Jaaaed 0001/ LP'/ 1004 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t q a t t g c a g g g g c t g q c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g c t
c t g g c c t g t c t g g c a g a t c c g a t a a c c a t g g c g g c g c t g t g g g a c t g c t g g c t c c t c c t g g t g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g c a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a c a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 433 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGLSGRSDNHGGAVGLLAPPGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4 34 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1003/LP'/0001 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a g t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c t g t g c a t a t g c c c c t g g g c t t t c t g g g a c c t g g c g g c c t g t c t g g c a g a t c c g a t a a t c a c g g c g g c t c c g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g e a a a g t g g g g t c c e a t c a a g g t t c a g t g g e a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t c c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a e a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 64 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSVHMPLGFLGPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSL
SASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT
LTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ3GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 65 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 1003/ LP'/ 0001 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g c g g c t c t g t g c a t a t g c c c c t g g g c t t t c t g g g a c c t g g c g g c c t g t c t g g c a g a t c c g a t a a t c a c g g c g g c t c c g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c . c c t a a g c t c c t g a t c t . a t g c g g c a t G c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c q t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a q t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 435 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSVHMPLGFLGPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGD
RVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL
QPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNF
YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG
LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 436 )
Anticuerpo activable Anti-Jaaaed 0001/LP'/1003 Lc con secuencia espaciadora
Secuencia de nucleótidos
C a a g g c c a g t c t g g c c a c t g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g c t c t g g c c t g t c t g q c a g a t c t g a t a a c c a c g g c g g c g t g c a c a t g c c c c t g g g c t t t c t g g c a c c t g g c g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t q c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g c g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID NO: 6 6 )
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGLSGRSDNHGGVHMPIGFLGPGGSDIQMTQSPSS
LSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDF
TLTISSLQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAÍCVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSISSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 437 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 0001/ LP'/ 1003 Lc
Secuencia de nucleótidos
T g c a a t a t t t g g c t c g t a g g t g g t g a t t g c a g g g g c t g g c a g g g g g g c t c g a g c g g a g g c t c t g g c c t g t c t g g c a g a t c t g a t a a c c a c g g c g g c g t g c a c a t g c c c c t g g g c t t t c t g g g a c c t g g c g g a t c t g a c a t c c a g a t g a c c c a g t c t c c a t c c t c c c t g t c t g c a t c t g t a g g a g a c a g a g t c a c c a t c a c t t g c c g g g c a a g t c a g a g c a t t a g c a g c t a t t t a a a t t g g t a t c a g c a g a a a c c a g g g a a a g c c c c t a a g c t c c t g a t c t a t g c g g c a t c c a g t t t g c a a a g t g g g g t c c c a t c a a g g t t c a g t g g c a g t g g a t c t g g g a c a g a t t t c a c t c t c a c c a t c a g c a g t c t g c a a c c t g a a g a t t t t g c a a c t t a c t a c t g t c a a c a g a c g g t t g t g g c g c c t c c g t t a t t c g g c c a a g g g a c c a a g g t g g a a a t c a a a c g t a c g g t g g c t g c a c c a t c t g t c t t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a c g c c c t c c a a t c g g g t a a c t c c c a g g a g a g t g t c a c a g a g c a g g a c a g c a a g g a c a g c a c c t a c a g c c t c a g c a g c a c c c t g a c g c t g a g c a a a g c a g a c t a c g a g a a a c a c a a a g t c t a c g c c t g c g a a g t c a c c c a t c a g g g c c t g a g c t c g c c c g t c a c a a a g a g c t t c a a c a g g g g a g a g t g t (SEQ ID
NO: 438 )
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGLSGRSDNHGGVHMPLGFLGPGGSDIQMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS
LQPEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL3STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 439 )
Anticuerpo activable anti-Jagged Hc
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 67)
La unión y activación in vitro del anticuerpo activable anti-Jagged CM1-CM2 se evaluó como sigue.
Los anticuerpos activables anti-Jagged se expresaron a partir de células HEK-293 transfectadas transitoriamente y se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de proteína A. Para verificar que los anticuerpos activables anti-Jagged CM1-CM2 pudieran ser activados tanto por MMP como por serina proteasas, los anticuerpos activables purificados se digirieron con uPA y/o MMP14 y posteriormente se evaluó su capacidad para unirse a Jagged 1-Fc humano mediante ELISA. Placas ELISA (Greiner Bio-One #655061) fueron recubiertos con Jag1-Fc humano (R & D #1277-JG-050) en solución salina equilibrada de Hank pH 7,4 (Hb Ss ) (Teknova #H8057) a la 1 microgram/ml toda la noche a 4°C; como se usa en esta invención, microgramo(s) también se representa por ug y pg. Las placas se bloquearon con 2 % de leche descremada en polvo (NFDM) en HBSS durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Se eliminó el bloque y se añadió el anticuerpo anti-Jagged 4D11, un anticuerpo activable anti-Jagged CM1-CM2 o un anticuerpo activable digerido a la concentración indicada en 2% NFDM/HBSS y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa de ELISA se lavó 3 veces con exceso de HBSS, TWEEN al 0,05 % (HBSS-T) antes de añadir la IgG antihumana de ratón, específica de F'Ab(2) conjugada con HRP (Jackson ImmunoResearch #209-035-097) diluido a 1:30.000 en NFDM/HBSS al 2 %. Posteriormente, la placa ELISA se lavó 3 veces con HBSS-T y se reveló con sustrato TMB de 1 Etapa. (Pierce/Thermo Fisher #NC0140927). Las placas se leyeron a OD450 y se plotearon usando el software Prism.
La Figura 1 demuestra que los anticuerpos activables anti-Jagged CM1-CM2 (a) se enmascararon de manera efectiva antes de la escisión por uPA o MMP14 y (b) mostraron una unión equivalente al anticuerpo cuando se escindió por uPA o MMP14 o una combinación de uPA y MMP14.
La farmacocinética del sustrato de CM1-CM2 del anticuerpo activable anti-Jagged se evaluó en ratones desnudos sin tumor de la siguiente manera.
Como sustituto de la estabilidad de la máscara y el sustrato, la farmacocinética de los anticuerpos activables anti-Jagged que contienen los sustratos de CM1-CM2 2001 y 1001/LP'/0001 se compararon con la del anticuerpo anti-Jagged en ratones sin tumor. El anticuerpo anti-Jagged humano/de ratón de reacción cruzada muestra una eliminación rápida en ratones debido a la unión de Jagged 1/2 en tejidos normales. Si el anticuerpo activable anti-Jagged CM1-c M2 permanece enmascarado (estable) en circulación, a continuación el anticuerpo activable debe evitar la eliminación mediada por la diana y mostrar una vida media sérica prolongada.
La farmacocinética plasmática del anticuerpo anti-Jagged y los anticuerpos activables se evaluaron como sigue. Como se muestra en la Tabla B, cada grupo consistía en 2 cohortes de 5 ratones. A los ratones se les administró una dosis intravenosa única de 5 mg/kg del compuesto indicado. Se recogió plasma heparinizado con litio de la cohorte 1 a las 24 horas, 96 horas y 10 días después de la dosis, mientras que se recogió plasma de la cohorte 2 a las 48 horas, 7 días y 14 días por vía retroorbitaria con anestesia con isoflurano. Los niveles de IgG humana en plasma total se detectaron utilizando un ELISA tipo sándwich de IgG humana. Brevemente, las placas ELISA (Costar 3590 Fisher Scientific Cat. # 07-200-35) se recubrieron con AffiniPure Goat Anti-Human IgG F(ab')2 Fragment Specific, (Jackson ImmunoResearch Cat. # 109-006-097) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1 ug/ml toda la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con Superblock (ScyTek Laboratories Cat. # AAA500) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Se eliminó el bloque y se añadió a la placa una dilución apropiada de estándar (artículo de prueba) y muestras de prueba (muestras de plasma) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa ELISA se lavó 3 veces con exceso de PBS, TWEEN al 0,05 % (PBS-T) antes de agregar la peroxidasa de rábano picante (HRP) específica de fragmento de IgG F(ab)2 de cabra antihumana AffiniPure (Jackson ImmunoResearch Cat. # 109-035-097) diluida a 1:25.000. Posteriormente, la placa ELISA se lavó 3 veces con PBS-T y se reveló con sustrato TMB de 1 Etapa (Pierce/Thermo Pescador #NC0140927) siguiendo el protocolo de los fabricantes. Los niveles de IgG humana en suero se calcularon comparando los valores de la muestra de prueba con la curva estándar. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante un análisis no compartimental con muestreo escaso (Phoenix WinNonlin v6.3).
Como se muestra en la Figura 2, el anticuerpo anti-Jagged se eliminó rápidamente y estuvo por debajo del límite de detección del ensayo el día 10. Por el contrario, los anticuerpos activables anti-Jagged CM1-CM2 1001/LP'/0001 y 2001 mostraron una vida media significativamente prolongada, lo que indica que los anticuerpos activables permanecieron estables y bien enmascarados en circulación.
Tabla B. Grupos y dosificación para el análisis farmacocinético de los anticuerpos activables anti-Jagged CM1-CM2
2001 1001/LP'/0001.
Figure imgf000097_0001
La evaluación in vivo de la seguridad y eficacia de un sustrato anti-Jagged CM1-CM2 que contiene un conjugado de fármaco de anticuerpo activable se realizó de la siguiente manera.
Se evaluó la eficacia del sustrato anti-Jagged CM1-CM2 que contiene conjugado de fármaco de anticuerpo activable 2001, que comprendía el anticuerpo activable anti-Jagged 2001 conjugado con maitansinoid DM4 (ver, por ejemplo, US 7.276.497) a través de un enlazador SPDB. en el modelo de tumor de xenoinjerto HCC1806 de la línea celular de cáncer de mama humano. Las células HCC1806 se recogieron durante el crecimiento en fase logarítmica y se resuspendieron en Matrigel al 50 % (BD Biosciences) en PBS a una concentración de 5 * 107 células/ml. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho 5 * 106 células y se les permitió crecer hasta un volumen medio de 100-150 mm3. Los ratones se aleatorizaron y se dosificaron como se indica en la Tabla C. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron dos veces por semana durante la duración del estudio, y se obtuvieron medidas de eficacia y seguridad, respectivamente.
La Figura 3 muestra el volumen tumoral medio del grupo ± el error estándar de la media (SEM) para PBS, Isotipo-SPDB-DM4, conjugado de fármaco anti-Jagged-SPDB-DM4 (ADC) y anticuerpo activable anti-Jagged 2001 animales tratados con fármacos conjugados. Ninguno de los grupos de control (PBS ni Isotipo-SPDB-DM4) mostró inhibición del crecimiento tumoral, mientras que los grupos conjugados de fármaco con anticuerpo activable anti-Jagged ADC y anti-Jagged 2001 mostraron regresión tumoral. Los animales tratados con el ADC anti-Jagged mostraron efectos secundarios significativos medidos por la pérdida de peso, como se muestra en la Figura 4. Sin embargo, los animales tratados con el conjugado de fármaco y anticuerpo activable anti-Jagged 2001 no mostraron pérdida de peso (también se muestra en la Figura 4) demostrando que la actividad del conjugado de fármaco y anticuerpo activable anti-Jagged CM1-CM2 estaba localizada en el tumor.
Tabla C: Grupos y programa de dosis para el estudio HCC1806
Figure imgf000098_0001
Ejemplo 2. Anticuerpos activables anti-EGFR escindibles de metaloproteasa de matriz (MMP) y serina proteasa (SP)
Este ejemplo demuestra la generación y evaluación de anticuerpos activables que se unen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), donde los anticuerpos activables se activan en presencia de al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos una serina proteasa.
Los anticuerpos anti-EGFR activables usados en este Ejemplo se generaron usando un procedimiento similar a los procedimientos usados en el Ejemplo 1 para generar anticuerpos anti-Jagged activables.
Los estudios descritos en esta invención utilizaron las siguientes secuencias de sustrato, donde LP' es un péptido de enlace entre CM1 y CM2. Para todos los sustratos de CM1-CM2 de la siguiente Tabla, LP' es GGSGGS (SEQ ID NO: 350):
Figure imgf000098_0002
Figure imgf000099_0001
Cadena pesada anti-EGFR (Hc):
Secuencia de nucleótidos:
CAGGTACAGCTGAAACAGTCTGGACCCGGGCTTGTACAGCCTAGTCAGTCACTGTCTATCA
CCTGTACCGTCTCAGGTTTTAGCCTGACAAATTACGGTGTGCATTGGGTACGCCAGTCTCC
CGGTAAGGGGCTGGAGTGGCTCGGCGTGATCTGGTCCGGGGGGAACACAGATTATAATACT
CCTTTCACATCTAGACTGTCCATCAACAAAGACAACTCCAAATCGCAGGTTTTTTTCAAGA
TGAATTCCCTGCAATCACAGGACACTGCCATCTATTATTGCGCGAGGGCCCTGACTTATTA
TGACTATGAGTTCGCTTATTGGGGCCAGGGGACGCTTGTGACCGTAAGCGCTGCTAGTACC
AAGGGCCCCAGTGTGTTCCCCCTTGCCCCCAGCAGTAAGTCCACCTCAGGTGGCACAGCTG
CCCTTGGGTGCCTTGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACCGTGAGCTGGAATTCCGG
AGCCCTTACCAGCGGTGTGCATACCTTTCCGGCCGTCCTGCAAAGCAGCGGACTTTACAGT
CTGTCTAGCGTGGTCACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGTACACAGACGTATATTTGCAACG
TTAATCACAAACCCTCAAACACAAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCTAAATCATGTGATAA
GACACATACATGCCCTCCCTGCCCTGCACCGGAGCTCTTAGGTGGACCTTCAGTCTTTTTA
TTTCCACCTAAACCCAAAGATACACTTATGATCTCACGGACACCCGAGGTGACCTGCGTTG
T CGTGGATGTCTCACACGAAGACCCTGAAGTGAAATT CAATTGGTATGTTGACGGTGTTGA
GGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTATAATAGCACCTATAGGGTAGTC
AGCGTACTGACTGTTCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGTAAAGAGTACAAATGCAAGGTCT
CAAACAAGGCTCTCCCTGCCCCGATCGAGAAGACAATTTCTAAGGCCAAAGGGCAGCCCCG
GGAACCACAAGTCTATACCCTGCCACCCAGTCGGGATGAACTAACAAAAAATCAGGTGTCT
CTAACCTGCCTGGTGAAGGGATTTTACCCTTCCGATATAGCTGTGGAGTGGGAGTCTAATG
GCCAACCAGAGAATAATTACAAGACTACCCCCCCCGTTCTTGACAGTGATGGCTCGTTCTT
CTTATACTCAAAATTAACAGTCGACAAATCCCGATGGCAACAGGGCAATGTGTTTAGCTGT
AG C GT GAT GCAT GAAGCC CT GCACAACCAT TACACACAGAAGTCT CT GT CCTT GTCACCTG
GCAAG (SEQ ID NO: 6 8 )
Secuencia de aminoácidos:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT
PFTSRLSINKDNSKSQVFFKSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKG
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP
PK P KDT LMIS RT PEVT CWVDVS HE D PEVKFNWY VDGVEVHNAKT KPRE E QYN ST Y R W S V
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSL3PGK (SEQ ID NO: 69)
Cadena ligera anti-EGFR:
Secuencia de nucleótidos:
ACCCAAATCCTCCTGACCCAGTCCCCTGTTATCCTTTCTGTGTCGCCCGGGGAGCGCGTTA
GCTTTAGCTGCCGCGCCAGTCAGTCAATCGGAACAAACATCCATTGGTACCAGCAGCGTAC
GAACGGCAGTCCAAGGCTGCTGATCAAATACGCAAGTGAATCTATATCGGGGATTCCGTCT
CGGTTCAGCGGATCCGGAAGCGGGACTGACTTTACGCTCTCCATAAATAGCGTCGAAAGTG
AGGACATTGCAGACTATTACTGTCAGCAGAATAACAACTGGCCGACCACATTTGGGGCCGG
AACCAAGTTGGAACTGAAGCGCACTGTGGCAGCTCCTAGTGTTTTTATTTTCCCCCCTTCT
GACGAGCAACTGAAAAGTGGTACAGCTTCAGTAGTTTGTTTGCTCAATAATTTCTACCCAC
GG GAAG CAAAG GT GCAGT GGAAAGT CGACAAC GCATTACAGAG C G G CAACT CT CAAGAAAG
CGTGACGGAGCAGGATAGCAAGGACTCAACATATTCCTTGTCTTCCACTCTCACTCTGTCA
AAGGCTGATTATGAGAAGCATAAGGTGTATGCGTGCGAAGTGACACACCAGGGATTATCAA
GCCCAGTGACCAAGTCCTTTAACCGTGGCGAATGC (SEQ ID NO: 70 ) Secuencia de aminoácidos:
Q IL L T Q S PVILSVS PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSG3GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLiNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQE3VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 111 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 0001 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAGGGCCAGAGCGGCCAATGCATCTCCCCCCGCGGTTGTCCCGACGGGCCGTACGTGATGT
ACGGCAGCTCCGGCGGCAGTGGGGGTAGCGGTGGGTCCGGGCTGAGTGGCCGGTCCGACAA
TCACGGGAGCTCGGGAACACAGATTCTGCTGACGCAATCTCCCGTGATCCTCTCGGTCTCA
CCCGGCGAACGGGTCTCGTTCAGCTGCAGAGCGTCCCAATCAATCGGGACCAATATTCACT
GGTACCAGCAAAGGACTAATGGGTCTCCCCGGCTGCTGATAAAATACGCCTCCGAGTCTAT
CTCGGGCATCCCATCCCGATTTAGTGGTAGCGGAAGCGGCACTGATTTCACCTTGTCTATT
AACAGCGTAGAATCTGAGGACATTGCAGACTATTACTGTCAGCAGAATAACAATTGGCCTA
CAACTTTCGGCGCCGGGACCAAACTAGAGTTAAAGCGTACTGTGGCTGCCCCCAGCGTTTT
TATTTTTCCGCCCAGCGACGAACAGCTGAAGTCAGGCACAGCCTCTGTGGTGTGTCTCCTG
AATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAAGTTCAGTGGAAAGTGGACAATGCCTTGCAGTCCG
GAAACAGTCAAGAGTCCGTGACCGAGCAGGACAGTAAGGATAGCACGTATAGCCTCTCTAG
TACTTTAACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCATGCGAAGTGACC
CATCAGGGGCTTTCCTCCCCCGTCACCAAGTCTTTCAATCGCGGGGAGTGT (SEQ ID
NO: 72 )
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVS
PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI
NSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGL3SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 73 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 0001:
Secuencia de nucleótidos
TGCATCTCCCCCCGCGGTTGTCCCGACGGGCCGTACGTGATGTACGGCAGCTCCGGCGGCA
GTGGGGGTAGCGGTGGGTCCGGGCTGAGTGGCCGGTCCGACAATCACGGGAGCTCGGGAAC
ACAGATTCTGCTGACGCAATCTCCCGTGATCCTCTCGGTCTCACCCGGCGAACGGGTCTCG
TTCAGCTGCAGAGCGTCCCAATCAATCGGGACCAATATTCACTGGTACCAGCAAAGGACTA
ATGGGTCTCCCCGGCTGCTGATAAAATACGCCTCCGAGTCTATCTCGGGCATCCCATCCCG
ATTTAGTGGTAGCGGAAGCGGCACTGATTTCACCTTGTCTATTAACAGCGTAGAATCTGAG
GACATTGCAGACTATTACTGTCAGCAGAATAACAATTGGCCTACAACTTTCGGCGCCGGGA
CCAAACTAGAGTTAAAGCGTACTGTGGCTGCCCCCAGCGTTTTTATTTTTCCGCCCAGCGA
CGAACAGCTGAAGTCAGGCACAGCCTCTGTGGTGTGTCTCCTGAATAACTTCTACCCCAGA
GAGGCCAAAGTTCAGTGGAAAGTGGACAATGCCTTGCAGTCCGGAAACAGTCAAGAGTCCG
TGACCGAGCAGGACAGTAAGGATAGCACGTATAGCCTCTCTAGTACTTTAACACTGTCCAA
GGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCATGCGAAGTGACCCATCAGGGGCTTTCCTCC
CCCGTCACCAAGTCTTTCAATCGCGGGGAGTGT (SEQ ID NO: 440 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVS
E S CRASQSIGTN 1HWYQQRTNGSPRLLI POYASESISGIPSRESGSGSGTDFTLSINS VESE
DIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC
Figure imgf000102_0001
441 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 0002 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAAGGTCAGTCCGGACAGTGTATTTCCCCTAGAGGTTGCCCTGACGGGCCGTATGTCATGT
ACGGTAGTTCTGGCGGTAGTGGCGGATCTGGCGGCAGTGGGCTGAGCGGACGTAGCGGGAA
TCACGGCTCATCCGGGACGCAGATACTGCTGACCCAGTCCCCCGTGATCCTGTCCGTGTCA
CCGGGCGAAAGGGTCAGTTTCTCTTGCCGAGCATCACñGTCCATAGGTACGAATATCCATT
GGTACCAGCAGCGGACCAATGGGAGCCCAAGACTGCTCATTAAGTACGCATCTGAGAGTAT
CTCAGGCATTCCAAGCAGGTTTTCCGGCAGTGGGAGCGGCACTGACTTCACCCTCAGCATT
AACAGCGTGGAAAGCGAAGACATTGCAGATTACTACTGCCAACAGAACAATAACTGGCCTA
CTACATTCGGGGCAGGAACTAAGTTGGAGCTCAAACGTACCGTCGCTGCTCCTAGCGTATT
TATTTTCCCTCCTAGCGATGAACAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGTGTTGTGTGCTTACTG
AACAACTTTTATCCCCGGGAGGCCAAGGTACAATGGAAGGTGGACAATGCCCTCCAATCAG
GGAACAGCCAGGAGTCTGTTACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCTC
TACCCTTACATTGAGCAAGGCTGATTATGAGAAGCATAAGGTCTACGCTTGTGAGGTGACC
CATCAGGGGCTCAGCAGCCCGGTGACAAAAAGCTTTAACCGGGGGGAATGC (SEQ ID
NO: 74 )
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSGNHGSSGTQILLTQSPVILSVS
PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI
NSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO; 75 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 0002:
Secuencia de nucleótidos:
TGTATTTCCCCTAGAGGTTGCCCTGACGGGCCGTATGTCATGTACGGTAGTTCTGGCGGTA
GTGGCGGATCTGGCGGCAGTGGGCTGAGCGGACGTAGCGGGAATCACGGCTCATCCGGGAC
GCAGATACTGCTGACCCAGTCCCCCGTGATCCTGTCCGTGTCACCGGGCGAAAGGGTCAGT
TTCTCTTGCCGAGCATCACAGTCCATAGGTACGAATATCCATTGGTACCAGCAGCGGACCA
ATGGGAGCCCAAGACTGCTCATTAAGTACGCATCTGAGAGTATCTCAGGCATTCCAAGCAG
GTTTTCCGGCAGTGGGAGCGGCACTGACTTCACCCTCAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAA
GACATTGCAGATTACTACTGCCAACAGAACAATAACTGGCCTACTACATTCGGGGCAGGAA
CTAAGTTGGAGCTCAAACGTACCGTCGCTGCTCCTAGCGTATTTATTTTCCCTCCTAGCGA
TGAACAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGTGTTGTGTGCTTACTGAACAACTTTTATCCCCGG
GAGGCCAAGGTACAATGGAAGGTGGACAATGCCCTCCAATCAGGGAACAGCCAGGAGTCTG
TTACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCTCTACCCTTACATTGAGCAA
GGCTGATTATGAGAAGCATAAGG'TCTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAGGGGCTCAGCAGC
CCGGTGACAAAAAGCTTTAACCGGGGGGAATGC (SEQ ID NO: 442 ) Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSGNHGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVS
FSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESE
DIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 443 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 1001 con secuencia espaciadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAGGGGCAGTCTGGGCAGTGTATTAGCCCCAGGGGGTGCCCCGACGGGCCTTACGTGATGT
ATGGCAGCTCCGGTGGCAGCGGAGGCTCTGGCGGGAGTGGGATCAGTTCCGGCCTGCTGAG
CTCCGGGTCAAGCGGGACCCAGATCTTGCTCACCCAATCACCAGTGATCCTAAGCGTGAGC
CCTGGCGAACGGGTCAGCTTCTCTTGCCGGGCATCTCAGAGTATTGGCACTAACATACACT
GGTACCAGCAGCGAACCAATGGGTCCCCCCGCCTTCTAATCAAATATGCTAGCGAATCCAT
TTCAGGAATTCCTAGCCGATTTAGCGGCAGCGGATCAGGCACTGACTTCACTCTGTCAATC
AACTCAGTTGAAAGCGAGGACATTGCAGACTACTATTGCCAGCAGAATAATAATTGGCCCA
CTACATTTGGAGCTGGAACAAAATTGGAGCTTAAGAGGACAGTGGCTGCGCCTAGTGTATT
TATCTTTCCCCCCTCTGACGAACAGTTGAAATCGGGAACCGCATCCGTCGTCTGTTTACTG
AACAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAATGCTTTGCAGTCTG
GCAACAGCCAGGAAAGCGTGACGGAGCAGGACTCAAAGGATAGTACATACTCCCTGTCCTC
CACCCTGACTCTGAGTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTGACG
CACCAAGGGCTATCGAGCCCGGTCACCAAGTCTTTCAATCGTGGAGAATGC (SEQ ID
NO: 76)
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSSGSSGTQILLTQSPVILSVS
PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI
NSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 77 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 1001:
Secuencia de nucleótidos:
TGTATTAGCCCCAGGGGGTGCCCCGACGGGCCTTACGTGATGTATGGCAGCTCCGGTGGCA
GCGGAGGCTCTGGCGGGAGTGGGATCAGTTCCGGCCTGCTGAGCTCCGGGTCAAGCGGGAC
CCAGATCTTGCTCACCCAATCACCAGTGATCCTAAGCGTGAGCCCTGGCGAACGGGTCAGC
TTCTCTTGCCGGGCATCTCAGAGTATTGGCACTAACATACACTGGTACCAGCAGCGAACCA
ATGGGTCCCCCCGCCTTCTAATCAAATATGCTAGCGAATCCATTTCAGGAATTCCTAGCCG
ATTTAGCGGCAGCGGATCAGGCACTGACTTCACTCTGTCAATCAACTCAGTTGAAAGCGAG
GACATTGCAGACTACTATTGCCAGCAGAATAATAATTGGCCCACTACATTTGGAGCTGGAA
CAAAATTGGAGCTTAAGAGGACAGTGGCTGCGCCTAGTGTATTTATCTTTCCCCCCTCTGA
CGAACAGTTGAAATCGGGAACCGCATCCGTCGTCTGTTTACTGAACAACTTCTATCCCAGA
GAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAATGCTTTGCAGTCTGGCAACAGCCAGGAAAGCG
TGACGGAGCAGGACTCAAAGGATAGTACATACTCCCTGTCCTCCACCCTGACTCTGAGTAA
GGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTGACGCACCAAGGGCTATCGAGC
CCGGTCACCAAGTCTTTCAATCGTGGAGAATGC (SEQ ID NO: 444 ) Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSSGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVS
FSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESE
DIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 445 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 1002 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAGGGGCAATCAGGACAATGCATCAGCCCTAGGGGCTGCCCAGACGGCCCATATGTGATGT
ACGGTAGCTCTGGGGGCTCAGGAGGCAGCGGGGGAAGCGGACAAAACCAGGCCTTACGAAT
GGCTGGCAGCTCTGGCACCCAGATATTGCTGACGCAGAGTCCAGTTATCCTTAGTGTCAGC
CCTGGTGAACGGGTTTCATTTAGTTGCCGTGCCTCCCAGTCTATTGGAACGAACATTCATT
GGTACCAGCAAAGGACCAACGGTTCACCCAGGTTGCTTATCAAGTATGCTTCAGAGTCAAT
CTCCGGGATTCCCTCAAGGTTTTCAGGCTCTGGCTCAGGTACCGATTTTACGCTGAGCATC
AACTCCGTGGAGAGTGAGGACATTGCTGATTATTACTGTCAGCAGAATAACAATTGGCCGA
CAACTTTCGGCGCCGGCACAAAGCTGGAACTTAAGCGTACTGTGGCTGCGCCATCTGTCTT
CATTTTTCCGCCCTCGGACGAGCAGTTGAAGTCAGGGACCGCCTCTGTCGTGTGCCTTCTC
AATAACTTC TAT C C CAGAGAG G CTAAAGTC CAGT G GAAAGTT GATAATGCACTT CAGAGCG
GGAATAGCCAGGAGAGCGTGACGGAACAGGACTCTAAGGACTCCACCTATTCTCTCTCATC
CACCCTTACTCTCTCTAAAGCCGACTACGAAAAGCATAAGGTTTATGCTTGCGAAGTCACT
CATCAAGGGCTATCTAGTCCGGTCACTAAAAGCTTCAACAGAGGTGAATGT (SEQ ID
NO: 73 )
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGQNQALRMAGSSGTQILLTQSPVILSVS
PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSI
NSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 79 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 1002:
Secuencia de nucleótidos:
TGCATCAGCCCTAGGGGCTGCCCAGACGGCCCATATGTGATGTACGGTAGCTCTGGGGGCT
CAGGAGGCAGCGGGGGAAGCGGACAAAACCAGGCCTTACGAATGGCTGGCAGCTCTGGCAC
CCAGATATTGCTGACGCAGAGTCCAGTTATCCTTAGTGTCAGCCCTGGTGAACGGGTTTCA
TTTAGTTGCCGTGCCTCCCAGTCTATTGGAACGAACATTCATTGGTACCAGCAAAGGACCA
ACGGTTCACCCAGGTTGCTTATCAAGTATGCTTCAGAGTCAATCTCCGGGATTCCCTCAAG
GTTTTCAGGCTCTGGCTCAGGTACCGATTTTACGCTGAGCATCAACTCCGTGGAGAGTGAG
GACATTGCTGATTATTACTGTCAGCAGAATAACAATTGGCCGACAACTTTCGGCGCCGGCA
CAAAGCTGGAACTTAAGCGTACTGTGGCTGCGCCATCTGTCTTCATTTTTCCGCCCTCGGA
CGAGCAGTTGAAGTCAGGGACCGCCTCTGTCGTGTGCCTTCTCAATAACTTCTATCCCAGA
GAGGCTAAAGTCCAGTGGAAAGTTGATAATGCACTTCAGAGCGGGAATAGCCAGGAGAGCG
TGACGGAACAGGACTCTAAGGACTCCACCTATTCTCTCTCATCCACCCTTACTCTCTCTAA
AGCCGACTACGAAAAGCATAAGGTTTATGCTTGCGAAGTCACTCATCAAGGGCTATCTAGT
CCGGTCACTAAAAGCTTCAACAGAGGTGAATGT (SEQ ID NO: 446 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGQNQALRMAGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVS
FSO PASQSIGTN 1HWYQQRTNGSPRLLIKYA S E S ISG IP S R F SG SG S G T D F T L S IN S VESE
DIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC
Figure imgf000106_0001
447 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 2001 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAAGGCCAGTCTGGACAATGTATCAGCCCCCGTGGCTGTCCAGACGGTCCTTACGTTATGT
ATGGATCTAGCGGGGGCTCTGGAGGGTCTGGCGGCTCTGGAATCTCTAGTGGACTTCTCTC
CG GAAGAAGCGATAAT CATGGAT CCAG C GG GACACAAAT CCT GTT GACACAGT CC CCAGTG
ATCCTGTCAGTCTCGCCCGGAGAAAGGGTGTCTTTCTCTTGTAGGGCTAGTCAGTCTATCG
GAACTAACATCCATTGGTACCAGCAGCGGACAAATGGGAGCCCGAGGCTTCTGATCAAGTA
TGCTTCAGAGAGTATAAGCGGCATCCCCTCAAGATTTAGTGGCAGCGGGTCCGGGACAGAT
TTCACCTTGTCAATCAATTCTGTCGAATCCGAAGACATTGCAGACTACTATTGCCAGCAAA
ACAACAACTGGCCCACCACTTTCGGTGCTGGAACCAAACTCGAGCTGAAACGCACTGTGGC
AGCTCCTTCAGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGACGAGCAGTTGAAATCGGGGACAGCCTCA
GTGGTGTGTCTACTGAACAACTTTTACCCCCGGGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTCGACA
AT G C GCT GCAAT CAGGGAACAGT CAGGAGT CAGT TACAGAGCAGGACT C TAAG GACAGTAC
ATATTCTTTGAGTTCCACCTTGACATTAAGCAAGGCAGACTACGAGAAACACAAGGTGTAC
GCATGTGAAGTTACACACCAGGGCCTTTCCTCCCCAGTTACGAAAAGCTTCAACAGAGGCG
Figure imgf000106_0002
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPV
ILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTD
FTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAFSVFIFPPSDEQLKSGTAS
WCLLNNFYPR.EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 81 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 2001:
Secuencia de nucleótidos:
TGTATCAGCCCCCGTGGCTGTCCAGACGGTCCTTACGTTATGTATGGATCTAGCGGGGGCT
CTGGAGGGTCTGGCGGCTCTGGAATCTCTAGTGGACTTCTCTCCGGAAGAAGCGATAATCA
TGGATCCAGCGGGACACAAATCCTGTTGACACAGTCCCCAGTGATCCTGTCAGTCTCGCCC
GGAGAAAGGGTGTCTTTCTCTTGTAGGGCTAGTCAGTCTATCGGAACTAACATCCATTGGT
ACCAGCAGCGGACAAATGGGAGCCCGAGGCTTCTGATCAAGTATGCTTCAGAGAGTATAAG
CGGCATCCCCTCAAGATTTAGTGGCAGCGGGTCCGGGACAGATTTCACCTTGTCAATCAAT
TCTGTCGAATCCGAAGACATTGCAGACTACTATTGCCAGCAAAACAACAACTGGCCCACCA
CTTTCGGTGCTGGAACCAAACTCGAGCTGAAACGCACTGTGGCAGCTCCTTCAGTGTTCAT
CTTCCCACCTAGCGACGAGCAGTTGAAATCGGGGACAGCCTCAGTGGTGTGTCTACTGAAC
AACTTTTACCCCCGGGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTCGACAATGCGCTGCAATCAGGGA
ACAGTCAGGAGTCAGTTACAGAGCAGGACTCTAAGGACAGTACATATTCTTTGAGTTCCAC
CT T GACAT TAAG CAAGGCAGACTACGAGAAACACAAG GTGTACGCATGT GAAGT TACACAC
CAGGGCCTTTCCTCCCCAGTTACGAAAAGCTTCAACAGAGGCGAATGC (SEQ ID
NO: 448 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 44 9)
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 2002 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAAGGTCAGAGTGGCCAATGCATATCGCCCAGAGGATGTCCTGACGGACCCTACGTGATGT
ACGGGAGTTCTGGGGGGAGTGGAGGCTCTGGCGGGTCAGGGATTAGTTCCGGCCTCTTGTC
TGGACGCTCCGGAAATCACGGATCATCTGGGACCCAGATCCTCCTGACCCAGTCTCCCGTC
ATTCTGTCTGTTTCTCCAGGCGAGCGGGTTTCATTTAGCTGTAGGGCCAGTCAGAGCATTG
GCACCAACATCCATTGGTACCAGCAGAGAACTAATGGCAGTCCCAGACTGCTCATTAAATA
TGCAAGCGAATCAATTTCCGGGATTCCTTCTCGCTTCTCGGGATCTGGATCTGGCACCGAC
TTCACGCTGTCCATCAACAGCGTGGAGAGTGAGGACATCGCCGATTACTACTGCCAGCAGA
ACAACAACTGGCCAACAACTTTTGGCGCCGGGACCAAGCTTGAGTTAAAGAGAACCGTAGC
TGCACCCTCTGTTTTCATTTTCCCACCCTCAGACGAGCAGCTTAAGTCAGGAACTGCCAGT
GTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCGAGAGAGGCTAAAGTCCAGTGGAAGGTAGACA
ATGCCCTTCAGTCTGGCAACTCTCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGATTCTAAGGACTCCAC
GTACAGT CTGAGTT CCACCCT CAC CCTCAGTAAGGCAGACTAC GAGAAGCACAAAGT CTAC
GCATGTGAGGTTACTCACCAGGGGCTCAGCTCTCCCGTGACGAAGTCATTTAACAGAGGTG
AGTGC (SEQ ID NO: 82 )
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSGNHGSSGTQILLTQSPV
ILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTD
FTLSIN SVESED IA D YYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAFSVFIFPPSDEQLKSGTAS
WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 83 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti-EGFR 2002:
Secuencia de nucleótidos:
TGCATATCGCCCAGAGGATGTCCTGACGGACCCTACGTGATGTACGGGAGTTCTGGGGGGA
GTGGAGGCTCTGGCGGGTCAGGGATTAGTTCCGGCCTCTTGTCTGGACGCTCCGGAAATCA
CGGATCATCTGGGACCCAGATCCTCCTGACCCAGTCTCCCGTCATTCTGTCTGTTTCTCCA
GGCGAGCGGGTTTCATTTAGCTGTAGGGCCAGTCAGAGCATTGGCACCAACATCCATTGGT
ACCAGCAGAGAACTAATGGCAGT C CCAGACT GCT CATTAAATAT GCAAGCGAATCAAT TTC
CGGGATTCCTTCTCGCTTCTCGGGATCTGGATCTGGCACCGACTTCACGCTGTCCATCAAC
AG C GT G GAGAGT GAGGACAT C G C C GATTAC TACT GC CAGCAGAACAACAACT G GC CAACAA
CTTTTGGCGCCGGGACCAAGCTTGAGTTAAAGAGAACCGTAGCTGCACCCTCTGTTTTCAT
TTTCCCACCCTCAGACGAGCAGCTTAAGTCAGGAACTGCCAGTGTGGTGTGCCTGCTGAAC
AACTTCTACCCGAGAGAGGCTAAAGTCCAGTGGAAGGTAGACAATGCGCTTCAGTCTGGCA
ACT CT CAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGATT CTAAGGACT CCAC GTACAGT CT GAGT T C CAC
CCTCACCCTCAGTAAGGCAGACTACGAGAAGCACAAAGTCTACGCATGTGAGGTTACTCAC
CAGGGGCTCAGCTCTCCCGTGACGAAGTCATTTAACAGAGGTGAGTGC (SEQ ID
NO: 450 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSGNHGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 451 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0001/ LP'/ 1001 con secuencia espaciadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAGGGACAGTCGGGACAGTGCATTTCTCCGAGAGGCTGCCCTGACGGCCCATACGTAATGT
ACGGATCATCCGGTGGCAGTGGAGGGTCCGGGGGATCCGGTCTAAGCGGCAGAAGTGATAA
TCATGGAGGCTCTGGCGGGAGCATCAGCTCCGGATTGCTTTCCAGCGGAAGTTCTGGCACT
CAAATTCTGCTGACACAAAGCCCTGTGATCTTGTCAGTCTCACCTGGCGAGCGGGTGAGCT
TTTCATGCCGGGCTTCCCAGAGCATCGGTACAAATATTCACTGGTATCAGCAGAGAACCAA
TGGCAGTCCGCGGTTGCTGATTAAGTATGCGAGCGAGAGCATATCAGGCATACCAAGCAGA
TTTAGCGGGAGTGGCTCTGGGACCGATTTTACACTCAGTATAAATTCAGTGGAGAGCGAGG
ATATAGCCGACTACTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCAGGGAC
CAAGCTTGAACTGAAGCGTACAGTTGCCGCCCCAAGCGTATTTATTTTCCCTCCAAGCGAC
GAACAGCTGAAAAGCGGTACCGCAAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTACCCAAGGG
AAGCTAAGGTGCAGTGGAAGGTTGACAATGCGCTGCAGTCAGGCAACTCCCAGGAATCGGT
AACAGAGCAGGACTCCAAGGATTCAACTTATAGTCTTAGTAGTACCCTTACTCTTTCCAAA
GCTGATTATGAAAAACACAAAGTGTATGCATGCGAGGTGACCCACCAAGGACTGTCATCTC
CTGTCACCAAGTCCTTCAACCGGGGAGAGTGT (SEQ ID NG: 84 )
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGGSGGSISSGLLSSGSSGT
Q ILL T Q SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSGSGTDFTLSINSVE5EDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 85 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0001/ LP'/ 1001:
Secuencia de nucleótidos:
TGCATTTCTCCGAGAGGCTGCCCTGACGGCCCATACGTAATGTACGGATCATCCGGTGGCA
GTGGAGGGTCCGGGGGATCCGGTCTAAGCGGCAGAAGTGATAATCATGGAGGCTCTGGCGG
GAGCATCAGCTCCGGATTGCTTTCCAGCGGAAGTTCTGGCACTCAAATTCTGCTGACACAA
AGCCCTGTGATCTTGTCAGTCTCACCTGGCGAGCGGGTGAGCTTTTCATGCCGGGCTTCCC
AGAGCATCGGTACAAATATTCACTGGTATCAGCAGAGAACCAATGGCAGTCCGCGGTTGCT
GATTAAGTATGCGAGCGAGAGCATATCAGGCATACCAAGCAGATTTAGCGGGAGTGGCTCT
GGGACCGATTTTACACTCAGTATAAATTCAGTGGAGAGCGAGGATATAGCCGACTACTACT
GCCAGCAAAACAATAACTGGCCCACCACCTTCGGCGCAGGGACCAAGCTTGAACTGAAGCG
TACAGTTGCCGCCCCAAGCGTATTTATTTTCCC.TCCAAGCGACGAACAGCTGAAAAGCGGT
AC'CGCAAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTACCCAAGGGAAGCTAAGGTGCAGTGGA
AGGTTGACAATGCGCTGCAGTCAGGCAACTCCCAGGAATCGGTAACAGAGCAGGACTCCAA
GGATTCAACTTATAGTCTTAGTAGTACCCTTACTCTTTCCAAAGCTGATTATGAAAAACAC
AAAGTGTATGCATGCGAGGTGACCCACCAAGGACTGTCATCTCCTGTCACCAAGTCCTTCA
ACCGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 452 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGGSGGSISSGLLSSGSSGTQILLTQ
SPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HW YQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGS
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (3EQ ID NO: 453 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1001/ LP'/ 0001 con secuencia espaciadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAAGGTCAGAGCGGCCAGTGCATTAGTCCTCGCGGTTGCCCTGATGGACCATACGTAATGT
ATGGAAGCTCTGGTGGATCCGGGGGCTCTGGCGGATCAGGAATCTCCAGCGGGCTGCTCTC
ATCAGGTGGCAGCGGGGGCTCATTAAGCGGCCGAAGTGACAATCACGGCTCGTCCGGTACA
CAGATTCTGCTCACTCAGTCACCCGTTATACTGTCTGTGTCGCCTGGAGAGCGTGTCAGCT
TTTCATGTAGAGCCTCGCAGTCAATAGGCACGAATATACACTGGTACCAGCAGAGAACTAA
TGGAAGCCCAAGGTTGCTCATCAAATACGCATCTGAGTCGATTAGCGGCATTCCGTCCAGG
TTTAGTGGCAGTGGAAGCGGCACCGATTTCACTTTGTCTATTAACTCTGTGGAAAGCGAGG
ACATCGCCGATTATTATTGTCAGCAGAATAACAATTGGCCCACCACCTTCGGTGCCGGTAC
TAAGCTGGAGCTGAAACGTACAGTTGCCGCTCCCTCTGTGTTTATTTTCCCTCCCTCGGAT
GAGCAACTCAAATCAGGGACAGCGAGTGTCGTATGTCTCCTGAACAATTTTTACCCACGTG
AAGCTAAAGTTCAGTGGAAGGTGGACAACGCTCTGCAGTCCGGCAACAGTCAGGAAAGCGT
AACTGAACAGGACTCAAAGGATAGCACTTACTCCTTGAGCAGCACTCTCACTCTTTCCAAG
GCTGATTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCGTGTGAAGTCACCCATCAGGGACTGTCAAGTC
CGGTGACTAAATCATTTAACAGGGGCGAATGC (SEQ ID NO: 8 b)
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNHGSSGT
Q IL L T Q S PVILSVS PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESI S G I P S R
FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDST Y SLSSTL TL SK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKS FNRGEC ( SEQ ID NO: 87 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1001/ LP'/ 0001:
Secuencia de nucleótidos:
TGCATTAGTCCTCGCGGTTGCCCTGATGGACCATACGTAATGTATGGAAGCTCTGGTGGAT
CCGGGGGCTCIGGCGGATCAGGAATCTCCAGCGGGCTGCTCTCATCAGGTGGCAGCGGGGG
CTCATTAAGCGGCCGAAGTGACAATCACGGCTCGTCCGGTACACAGATTCTGCTCACTCAG
TCACCCGTTATACTGTCTGTGTCGCCTGGAGAGCGTGTCAGCTTTTCATGTAGAGCCTCGC
AGTCAATAGGCACGAATATACACTGGTACCAGCAGAGAACTAATGGAAGCCCAAGGTTGCT
CATCAAATACGCATCTGAGTCGATTAGCGGCATTCCGTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGAAGC
GGCACCGATTTCACTTTGTCTATTAACTCTGTGGAAAGCGAGGACATCGCCGATTATTATT
GTCAGCAGAATAACAATTGGCCCACCACCTTCGGTGCCGGTACTAAGCTGGAGCTGAAACG
TACAGTTGCCGCTCCCTCTGTGTTTATTTTCCCTCCCTCGGATGAGCAACTCAAATCAGGG
ACAG CGAGTGTCGTATGTCTCCT GAACAAT T T T T ACC CACGT GAAGCTAAAGT T CAGT GGA
AGGTGGACAACGCTCTGCAGTCCGGCAACAGTCAGGAAAGCGTAACTGAACAGGACTCAAA
GGATAGCACTTACTCCTTGAGCAGCACTCTCACTCTTTCCAAGGCTGATTATGAGAAGCAC
AAGGTGTACGCGTGTGAAGTCACCCATCAGGGACTGTCAAGTCCGGTGACTAAATCATTTA
ACAGGGGCGAATGC
Figure imgf000111_0001
454 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNHGSSGTQILLTQ
SPVIL3VSPGERVSFSCRASGSIGTN1HW YQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGS
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ( SEQ ID NO; 455 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0002/ LP'/ 1001 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAGGGCCAGAGTGGGCAGTGTATTTCCCCTCGCGGATGTCCCGACGGTCCATACGTAATGT
ATGGGTCAAGCGGGGGATCAGGAGGAAGTGGAGGCTCCGGACTCAGCGGTCGCTCCGGCAA
TCACGGGGGGTCTGGCGGATCAATAAGTTCGGGCCTCCTGAGCTCCGGTTCATCTGGCACT
CAGATCCTGCTCACGCAGTCGCCGGTAATACTGAGTGTCTCACCAGGCGAGCGTGTCAGCT
TCAGCTGTCGCGCCTCACAGTCAATCGGCACAAATATCCATTGGTACCAGCAAAGGACCAA
TGGCAGCCCTAGGCTGCTGATAAAATACGCATCCGAGTCAATTTCAGGGATTCCATCGAGA
TTCTCGGGCAGCGGAAGTGGGACCGACTTTACTCTCTCCATCAACAGCGTCGAGTCGGAGG
ACATCGCGGACTACTACTGCCAGCAGAATAACAATTGGCCAACAACATTCGGCGCAGGAAC
AAAGCTAGAGCTCAAGAGGACAGTGGCTGCACCCAGTGTATTCATCTTCCCACCTAGCGAC
GAGCAACTGAAGAGCGGGACGGCTTCCGTCGTTTGTCTATTAAATAATTTCTATCCCCGTG
AGGCTAAAGTTCAGTGGAAGGTTGATAATGCGTTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGT
CACAGAGCAGGATTCTAAGGATTCAACCTATAGCTTAAGCTCTACACTTACGCTTTCTAAA
GCCGATTATGAAAAACACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTTACCCACCAGGGCCTGAGCAGCC
CCGTGACCAAGTCGTTCAACCGGGGCGAGTGT (SEQ ID NG: 88 )
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSGNHGGSGGSISSGLLSSGSSGT
Q IL L T Q S PV IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSGSGTDFTLSINSVE3EDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGIS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 89 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0002/ LP'/ 1001:
Secuencia de nucleótidos:
TGTATTTCCCCTCGCGGATGTCCCGACGGTCCATACGTAATGTATGGGTCAAGCGGGGGAT
CAGGAGGAAGTGGAGGCTCCGGACTCAGCGGTCGCTCCGGCAATCACGGGGGGTCTGGCGG
ATCAATAAGTTCGGGCCTCCTGAGCTCCGGTTCATCTGGCACTCAGATCCTGCTCACGCAG
TCGCCGGTAATACTGAGTGTCTCACCAGGCGAGCGTGTCAGCTTCAGCTGTCGCGCCTCAC
AGTCAATCGGCACAAATATCCATTGGTACCAGCAAAGGACCAATGGCAGCCCTAGGCTGCT
GATAAAATACGCATCCGAGTCAATTTCAGGGATTCCATCGAGATTCTCGGGCAGCGGAAGT
GGGACCGACTTTACTCTCTCCATCAACAGCGTCGAGTCGGAGGACATCGCGGACTACTACT
GCCAGCAGAAT AACAAT T GG C CAACAACAT T C GGCG CAGGAACAAAG C T AGAG C T CAAGAG
GACAGTGGCTGCACCCAGTGTATTCATCTTC.CCACCTAGCGACGAGCAACTGAAGAGCGGG
ACGGCTTCCGTCGTTTGTCTATTAAATAATTTCTATCCCCGTGAGGCTAAAGTTCAGTGGA
AGGTTGATAATGCGTTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACAGAGCAGGATTCTAA
GGATTCAACCTATAGCTTAAGCTCTACACTTACGCTTTCTAAAGCCGATTATGAAAAACAC
AAGGTGTACGCTTGTGAGGTTACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGTCGTTCA
ACCGGGGCGAGTGT (SEQ ID NO: 456 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSGNHGGSGGSISSGLLSSGSSGTQILLTQ
SPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HW YQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGS
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTT FGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 457 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1001/ LP'/ 0002 con secuencia espaciadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAAGGACAGAGCGGACAGTGTATCTCACCTCGCGGCTGCCCCGACGGCCCTTACGTCATGT
ACGGCTCCTCGGGTGGGTCCGGGGGAAGTGGCGGGTCTGGCATTAGTTCAGGGCTCTTATC
TTCCGGCGGAAGCGGGGGATCTCTTTCCGGGCGGAGTGGCAATCACGGCAGTAGCGGAACT
CAGATCCTACTCACTCAGTCACCAGTGATCCTGTCTGTCAGTCCAGGGGAGAGAGTGTCTT
TCAGTTGTAGAGCTTCCCAGTCTATTGGGACAAACATTCACTGGTATCAACAGCGAACTAA
TGGATCGCCAAGACTCCTGATTAAATATGCTTCTGAGAGCATCTCTGGAATTCCATCAAGA
TTCTCAGGGAGTGGTAGCGGCACCGATTTTACGTTATCGATCAATTCCGTTGAGAGCGAAG
ATATCGCGGACTATTACTGTCAGCAGAACAATAACTGGCCTACAACGTTCGGGGCAGGGAC
GAAATTGGAGCTGAAGCGGACCGTCGCCGCGCCAAGCGTGTTCATCTTCCCCCCTAGCGAC
GAGCAATTGAAAAGCGGCACCGCAAGTGTGGTTTGCCTGCTGAACAACTTTTATCCTCGCG
AGGCGAAAGTGCAGTGGAAAGTCGACAATGCACTCCAGTCAGGGAACAGCCAAGAGTCCGT
TACT GAACAAGACT CTAAAGATAGTACTTATAGCTTATC CAGCACACT GACGC T CAGTAAG
GCCGATTATGAAAAACATAAGGTGTATGCGTGTGAGGTTACCCATCAAGGATTGTCATCAC
CCGTCACCAAATCCTTTAACAGAGGAGAATGT (SEQ ID NG: 90)
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNHGSSGT
Q ILL T Q SP V IL SV S PGERVS FSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGS P R L L IK Y A S E S IS G IP S R
FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 91)
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1001/ LP'/ 0002:
Secuencia de nucleótidos:
TGTATCTCACCTCGCGGCTGCCCCGACGGCCCTTACGTCATGTACGGCTCCTCGGGTGGGT
CCGGGGGAAGTGGCGGGTCTGGCATTAGTTCAGGGCTCTTATCTTCCGGCGGAAGCGGGGG
ATCTCTTTCCGGGCGGAGTGGCAATCACGGCAGTAGCGGAACTCAGATCCTACTCACTCAG
TCACCAGTGATCCTGTCTGTCAGTCCAGGGGAGAGAGTGTCTTTCAGTTGTAGAGCTTCCC
AGTCTATTGGGACAAACATTCACTGGTATCAACAGCGAACTAATGGATCGCCAAGACTCCT
GATTAAATATGCTTCTGAGAGCATCTCTGGAATTCCATCAAGATTCTCAGGGAGTGGTAGC
GGCACCGATTTTACGTTATCGATCAATTCCGTTGAGAGCGAAGATATCGCGGACTATTACT
GTCAGCAGAACAATAACTGGCCTACAACGTTCGGGGCAGGGACGAAATTGGAGCTGAAGCG
GACCGTCGCCGCGCCAAGCGTGTTCATCTTCCCCCCTAGCGACGAGCAATTGAAAAGCGGC
ACCGCAAGTGTGGTTTGCCTGCTGAACAACTTTTATCCTCGCGAGGCGAAAGTGCAGTGGA
AAGTCGACAATGCACTCCAGTCAGGGAACAGCCAAGAGTCCGTTACTGAACAAGACTCTAA
AGATAGTACTTATAGCTTATCCAGCACACTGACGCTCAGTAAGGCCGATTATGAAAAACAT
AAGGTGTATGCGTGTGAGGTTACCCATCAAGGATTGTCATCACCCGTCACCAAATCCTTTA
ACAGAGGAGAATGT (SEQ ID NO: 458 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNHGSSGTQILLTQ
S P V IL S V S PGERVSFSCPASQSIGTN1HWYQQRTNGSP R L L IK Y A S E S IS G IP SR F S G S G S
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 459 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0001/ LP'/ 1002 con secuencia espaciadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAG G GTCAAAGTGGACAGTGTATCTCGCCCCGCGGCTGCCCAGACG G C CCATATGT GAT GT
ATGGTTCTTCCGGTGGATCCGGCGGATCAGGTGGGTCTGGCCTCTCAGGTCGTTCCGACAA
CCACGGCGGCTCAGGTGGGTCTCAGAATCAGGCACTGCGGATGGCCGGATCTTCTGGCACC
CAGATATTGCTCACACAGTCACCAGTTATTCTGTCCGTATCTCCAGGAGAACGGGTATCTT
T CT CT T GTAGG GCAAGCCAGT CCAT C GGAACAAACAT C CATT G GTACCAGCAGCGGACCAA
TGGCAGTCCACGGCTTCTGATCAAGTATGCTAGTGAAAGCATTAGCGGGATTCCAAGCCGA
TTTTCTGGGTCGGGTAGTGGAACCGACTTCACCCTGAGCATTAACTCTGTCGAATCCGAAG
ATATTGCTGACTATTACTGTCAGCAGAACAACAATTGGCCGACTACGTTTGGCGCCGGAAC
CAAATTAGAACTTAAGAGAACCGTGGCCGCTCCCTCTGTCTTCATTTTCCCGCCTTCCGAC
GAACAGCTGAAGAGCGGAACTGCCTCCGTGGTGTGCCTGTTGAATAACTTTTATCCAAGGG
AAGCAAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAATGCTCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGT
GACTGAACAGGACAGTAAAGACTCAACCTACTCACTGAGCAGTACTCTCACATTATCCAAA
GCCGATTATGAAAAGCATAAGGTTTATGCATGCGAGGTTACCCACCAGGGACTGAGCTCCC
CCGTGACCAAAAGCTTCAATAGGGGTGAGTGC (SEQ ID NO: 92)
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGGSGGSQNQALRMAGSSGT
Q ILL T Q SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 93)
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0001/ LP'/ 1002:
Secuencia de nucleótidos:
TGTATCTCGCCCCGCGGCTGCCCAGACGGCCCATATGTGATGTATGGTTCTTCCGGTGGAT
CCGGCGGATCAGGTGGGTCTGGCCTCTCAGGTCGTTCCGACAACCACGGCGGCTCAGGTGG
GTCTCAGAATCAGGCACTGCGGATGGCCGGATCTTCTGGCACCCAGATATTGCTCACACAG
TCACCAGTTATTCTGTCCGTATCTCCAGGAGAACGGGTATCTTTCTCTTGTAGGGCAAGCC
AGTCCATCGGAACAAACATCCATTGGTACCAGCAGCGGACCAATGGCAGTCCACGGCTTCT
GATCAAGTATGCTAGTGAAAGCATTAGCGGGATTCCAAGCCGATTTTCTGGGTCGGGTAGT
GGAACCGACTTCACCCTGAGCATTAACTCTGTCGAATCCGAAGATATTGCTGACTATTACT
GTCAGCAGAACAACAATTGGCCGACTACGTTTGGCGCCGGAACCAAATTAGAACTTAAGAG
AACCGTGGCCGCTCCCTCTGTCTTCATTTTCCCGCCTTCCGACGAACAGCTGAAGAGCGGA
ACTGCCTCCGTGGTGTGCCTGTTGAATAACTTTTATCCAAGGGAAGCAAAGGTGCAGTGGA
AAGTGGACAATGCTCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACTGAACAGGACAGTAA
AGACTCAACCTACTCACTGAGCAGTACTCTCACATTATCCAAAGCCGATTATGAAAAGCAT
AAGGTTTATGCATGCGAGGTTACCCACCAGGGACTGAGCTCCCCCGTGACCAAAAGCTTCA
ATAGGGGTGAGTGC (SEQ ID NO: 460 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGGSGGSQNQALRMAGSSGTQILLTQ
SPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HW YQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGS
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (3EQ ID NO: 461 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1002/ LP'/ 0001 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAGGGGCAGTCCGGACAATGCATCAGCCCCCGAGGCTGCCCTGATGGCCCCTACGTGATGT
ACGGGTCCAGCGGTGGCAGCGGGGGCTCAGGGGGGAGCGGGCAGAATCAGGCCCTGAGAAT
GGCGGGTGGATCCGGGGGGTCCCTTTCTGGCAGGTCCGATAACCACGGTTCTAGTGGAACA
CAGATTTTGCTGACACAAAGTCCCGTCATCCTCTCTGTGTCTCCCGGTGAGCGGGTCAGTT
TTTCCTGCCGAGCGTCCCAGAGCATCGGGACAAATATCCATTGGTACCAGCAGAGAACGAA
CGGCTCTCCTAGACTGCTCATCAAGTACGCCTCGGAAAGTATTTCCGGCATTCCCTCCCGT
TTCAGCGGCTCCGGAAGTGGTACAGATTTTACCCTGAGTATTAATTCCGTCGAATCTGAGG
ACATAGCCGACTACTATTGCCAACAGAATAACAATTGGCCAACAACTTTTGGCGCCGGGAC
TAAGCTGGAGCTGAAACGGACCGTCGCAGCACCAAGTGTTTTCATCTTCCCACCAAGTGAC
GAGCAGCTGAAATCCGGAACAGCGAGCGTGGTGTGCCTACTCAATAACTTCTATCCACGCG
AAGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCTCTGCAGTCCGGCAATAGCCAGGAAAGCGT
GACAGAG CAAGATT C TAAGGACAGTACGTAT T CACT GT C CAGTAC G CT CACCT TAAGCAAG
GCTGACTACGAAAAACACAAGGTCTACGCCTGTGAGGTCACACATCAGGGCCTCTCCAGTC
CGGTTACAAAAAGTTTCAATCGCGGGGAATGT (SEQ ID NO: 94)
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGQNQALRMAGGSGGSLSGRSDNHGSSGT
Q ILL TQ SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKS FNRGEC ( SEQ ID NO: 95)
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1002/ LP'/ 0001:
Secuencia de nucleótidos:
TGCATCAGCCCCCGAGGCTGCCCTGATGGCCCCTACGTGATGTACGGGTCCAGCGGTGGCA
GCGGGGGCTCAGGGGGGAGCGGGCAGAATCAGGCCCTGAGAATGGCGGGTGGATCCGGGGG
GTCCCTTTCTGGCAGGTCCGATAACCACGGTTCTAGTGGAACACAGATTTTGCTGACACAA
AGTCCCGTCATCCTCTCTGTGTCTCCCGGTGAGCGGGTCAGTTTTTCCTGCCGAGCGTCCC
AGAGCATCGGGACAAATATCCATTGGTACCAGCAGAGAACGAACGGCTCTCCTAGACTGCT
CATCAAGTACGCCTCGGAAAGTATTTCCGGCATTCCCTCCCGTTTCAGCGGCTCCGGAAGT
GGTACAGATTTTACCCTGAGTATTAATTCCGTCGAATCTGAGGACATAGCCGACTACTATT
GCCAACAGAATAACAATTGGCCAACAACTTTTGGCGCCGGGACTAAGCTGGAGCTGAAACG
GACCGTCGCAGCACCAAGTGTTTTCATCTTCCCACCAAGTGACGAGCAGCTGAAATCCGGA
ACAGCGAGCGTGGTGTGCCTACTCAATAACTTCTATCCACGCGAAGCCAAGGTGCAGTGGA
AAGTGGACAACGCTCTGCAGTCCGGCAATAGCCAGGAAAGCGTGACAGAGCAAGATTCTAA
GGACAGTACGTATTCACTGTCCAGTACGCTCACCTTAAGCAAGGCTGACTACGAAAAACAC
AAGGTCTACGCCTGTGAGGTCACACATCAGGGCCTCTCCAGTCCGGTTACAAAAAGTTTCA
ATCGCGGGGAATGT (SEQ ID NO: 462 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGQNQALRMAGGSGGSLSGRSDNHGSSGTQILLTQ
SPVIL3VSPGERVSFSCRASGSIGTN1HW YQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGS
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO; 463 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0002/ LP'/ 1002 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAAGGCCAATCCGGTCAGTGCATCAGTCC.C.AGAGGCTGCCCTGACGGGCCC.TACGTGATGT
ATGGTAGCTCAGGGGGCTCCGGCGGCTCCGGCGGAAGCGGACTTAGCGGCCGTAGCGGCAA
CCATGGGGGTTCTGGAGGATCCCAGAATCAGGCTCTGCGCATGGCTGGAAGCAGCGGTACC
CAGATCCTGCTCACCCAATCACCCGTCATCTTGTCTGTGAGTCCTGGCGAAAGGGTGTCGT
TCTCTTGTCGCGCGTCCCAGTCCATTGGGACCAACATTCATTGGTACCAGCAGAGGACTAA
CGGGAGCCCCCGCCTGCTGATCAAATACGCCAGTGAATCTATCTCTGGAATCCCATCACGA
TTTTCAGGGTCCGGTAGTGGGACCGACTTCACTTTGAGTATTAACAGTGTGGAATCCGAGG
ACATAGCCGACTATTACTGTCAGCAGAACAATAACTGGCCAACAACCTTTGGCGCCGGGAC
AAAGTTAGAGCTTAAGCGGACTGTTGCAGCCCCCTCCGTTTTTATCTTCCCGCCCAGTGAT
GAACAGCTGAAAAGCGGTACCGCCTCCGTAGTGTGCCTTCTCAATAATTTTTACCCCAGAG
AAGCTAAAGTACAGTGGAAAGTCGACAACGCCCTCCAGAGCGGCAACAGTCAGGAGTCCGT
CACCGAGCAGGATTCTAAAGACTCAACATATAGCCTTTCGTCCACCCTAACACTTTCAAAA
GCAGACTATGAAAAACATAAGGTGTATGCCTGCGAGGTCACACACCAGGGGCTCAGCTCTC
CAGTTACTAAGTCATTCAACCGCGGAGAGTGT (SEQ ID NG: 96)
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSGNHGGSGGSQNQALRMAGSSGT
Q ILL T Q SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGIS S PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 97)
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 0002/ LP'/ 1002:
Secuencia de nucleótidos:
TGCATCAGTCCCAGAGGCTGCCCTGACGGGCCCTACGTGATGTATGGTAGCTCAGGGGGCT
CCGGCGGCTCCGGCGGAAGCGGACTTAGCGGCCGTAGCGGCAACCATGGGGGTTCTGGAGG
ATCCCAGAATCAGGCTCTGCGCATGGCTGGAAGCAGCGGTACCCAGATCCTGCTCACCCAA
TCACCCGTCATCTTGTCTGTGAGTCCTGGCGAAAGGGTGTCGTTCTCTTGTCGCGCGTCCC
AGTCCATTGGGACCAACATTCATTGGTACCAGCAGAGGACTAACGGGAGCCCCCGCCTGCT
GATCAAATACGCCAGTGAATCTATCTCTGGAATCCCATCACGATTTTCAGGGTCCGGTAGT
GGGACCGACTTCACTTTGAGTATTAACAGTGTGGAATCCGAGGACATAGCCGACTATTACT
GTCAGCAGAACAATAACTGGCCAACAACCTTTGGCGCCGGGACAAAGTTAGAGCTTAAGCG
GACTGTTGCAGCCCCCTCCGTTTTTATCTTCCCGCCCAGTGATGAACAGCTGAAAAGCGGT
ACC GCCTCCGT AGT GTGCCTTCT CAATAAT T T T TAC C C CAGAGAAG CTAAAGTACAGT GGA
AAGTCGACAACGCCCTCCAGAGCGGCAACAGTCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGATTCTAA
AGACTCAACATATAGCCTTTCGTCCACCCTAACACTTTCAAAAGCAGACTATGAAAAACAT
AAGGTGTATGCCTGCGAGGTCACACACCAGGGGCTCAGCTCTCCAGTTACTAAGTCATTCA
ACCGCGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 464 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSGNHGGSGGSQNQALRMAGSSGTQILLTQ
SPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HW YQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGS
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 465 )
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1002/ LP'/ 0002 con secuencia espadadora:
Secuencia de nucleótidos:
CAGGGCCAATCAGGTCAGTGCATTAGCCCCCGAGGGTGTCCCGATGGGCCCTACGTAATGT
ACGGATCATCGGGCGGATCTGGGGGCTCCGGTGGCTCTGGTCAGAATCAAGCTCTGCGCAT
GGCCGGAGGTAGCGGTGGAAGCCTGAGCGGCCGAAGTGGAAACCACGGCTCCTCTGGCACT
CAGATTCTTCTCACGCAGTCGCCCGTGATCTTGTCCGTGAGCCCAGGCGAGCGGGTGAGCT
TCTCTTGCCGGGCCAGCCAAAGTATAGGTACAAATATTCACTGGTACCAACAGCGAACCAA
CGGGTCGCCTAGGTTGCTCATAAAGTACGCATCCGAGAGTATAAGCGGCATACCATCTAGG
TTCTCAGGTAGCGGCAGCGGGACCGATTTTACCCTCAGCATTAATTCGGTTGAATCTGAAG
ATATCGCCGATTATTATTGTCAGCAGAATAACAATTGGCCTACTACTTTCGGCGCCGGAAC
AAAGCTGGAACTTAAGCGCACAGTGGCCGCTCCTTCTGTCTTTATCTTCCCTCCATCTGAC
GAGCAATTAAAGAGTGGGACAGCCTCGGTGGTGTGTTTGCTCAATAACTTCTATCCAAGGG
AGGCAAAGGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCTCTCCAGAGTGGGAATTCCCAGGAGTCCGT
GAC C GAG CAGGATT C TAAAGATAGCACATAC T CACT GTCTTCCACCCT GACC C T GT C CAAG
GCAGACTACGAGAAGCACAAAGTTTACGCCTGTGAAGTGACACACCAGGGCCTCAGCTCTC
CTGTCACAAAGAGTTTTAATCGGGGCGAGTGT (SEQ ID NO: 98)
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGQNQALRMAGGSGGSLSGRSGNHGSSGT
Q ILL TQ SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN3QESVTEQDSKDST Y SLSSTL TL SK
ADYEKHKVYACEVTHQGISS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 99)
Cadena ligera de anticuerpo activable anti- EGFR 1002/ LP'/ 0002:
Secuencia de nucleótidos:
TGCATTAGCCCCCGAGGGTGTCCCGATGGGCCCTACGTAATGTACGGATCATCGGGCGGAT
CTGGGGGCTCCGGTGGCTCTGGTCAGAATCAAGCTCTGCGCATGGCCGGAGGTAGCGGTGG
AAGCCTGAGCGGCCGAAGTGGAAACCACGGCTCCTCTGGCACTCAGATTCTTCTCACGCAG
TCGCCCGTGATCTTGTCCGTGAGCCCAGGCGAGCGGGTGAGCTTCTCTTGCCGGGCCAGCC
AAAGTATAGGTACAAATATTCACTGGTACCAACAGCGAACCAACGGGTCGCCTAGGTTGCT
CATAAAGTACGCATCCGAGAGTATAAGCGGCATACCATCTAGGTTCTCAGGTAGCGGCAGC
GGGACCGATTTTACCCTCAGCATTAATTCGGTTGAATCTGAAGATATCGCCGATTATTATT
GTCAGCAGAATAACAATTGGCCTACTACTTTCGGCGCCGGAACAAAGCTGGAACTTAAGCG
CACAGTGGCCGCTCCTTCTGTCTTTATCTTCCCTCCATCTGACGAGCAATTAAAGAGTGGG
ACAGCCTCGGTGGTGTGTTTGCTCAATAACTTCTATCCAAGGGAGGCAAAGGTGCAGTGGA
AGGTCGATAACGCTCTCCAGAGTGGGAATTCCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGATTCTAA
AGATAGCACATACTCACTGTCTTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCAGACTACGAGAAGCAC
AAAGTTTACGCCTGTGAAGTGACACACCAGGGCCTCAGCTCTCCTGTCACAAAGAGTTTTA
ATCGGGGCGAGTGT (SEQ ID NO: 466 )
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGQNQALRMAGGSGGSLSGRSGNHGSSGTQILLTQ
SPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HW YQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGS
GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG
TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C ( S E Q I D NO: 4 67 )
Los siguientes materiales se utilizaron en los estudios descritos en esta invención.
Reactivos y cepas: U-PA humano (Research & Diagnostics Systems, Inc.) se utilizó sin modificaciones. Matriptasa humana (Research & Diagnostics Systems, Inc.) se utilizó sin modificaciones. MMP14 humano (Research & Diagnostics Systems, Inc.) se activó siguiendo el protocolo suministrado y se usó sin modificaciones. Se utilizó tampón MMP14 HCM (HEPES 50 mM (pH 6,8), CaCh10 mM, MgCh0,5 Mg). Se usó u-PA y tampón de matriptasa TBST (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05 %, pH 7,4).
Se usaron los siguientes procedimientos para evaluar la actividad del sustrato in Vitro en anticuerpos activables. Proteólisis de sustrato: la capacidad de los sustratos en los anticuerpos activables para ser escindidos por u-PA, matriptasa y/o MMP14 se determinó como sigue. Las muestras se incubaron durante la noche durante 16 a 24 horas a 37 °C en presencia o ausencia de proteasa en PBS pH 7,2. Se prepararon productos de digestión de proteasa para mantener una proporción de anticuerpo activable a proteasa de 9 a 1. La proteólisis se confirmó mediante electroforesis capilar, ELISA o SDS-PAGE.
Cinética de escisión del sustrato (kcat/Km): la capacidad de los anticuerpos activables de EGFR que contienen sustratos, 2001, 2002, 0001/LP'/100l o 1001/LP'/0001, para ser escindidos por matriptasa y/o MMP14 se determinó de la siguiente manera. Las digestiones con matriptasa proteasa se realizaron en TBST, Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05 %, pH 7,4. Las digestiones con proteasa MMP14 se realizaron en HCM, HEPES 50 mM (pH 6,8), CaCl2l0 mM, MgCb 0,5 mM Se combinaron concentraciones variables de matriptasa titulada en el sitio activo o MMP14 con una concentración fija de anticuerpo activable para mantener una proporción de sustrato a proteasa de al menos 50. Las muestras que comprendían estos sustratos se incubaron a 37 °C durante un máximo de 24 horas. Para detener la reacción, se añadieron 5 j l de la digestión a 7 j l de tampón de muestra HT Protein Express (Caliper LifeSciences) que contenía 2-mercaptoetanol 20 mM durante 1o minutos a 95 °C. Después de la desnaturalización por calor, se añadieron 32 j l de ddH2O y las muestras se analizaron en un LabChip GXII según las instrucciones del fabricante. Se usó el software LabChip GXII para cuantificar el área del pico de la cadena ligera. La conversión del producto se calculó sustituyendo las áreas de los picos de las cadenas ligeras en la siguiente ecuación: LC escindida/(LC escindida LC no escindida), LC = área de los picos de las cadenas ligeras. Los valores de kcat/Km se determinaron con la siguiente ecuación
Figure imgf000119_0001
donde C es la conversión del producto, t es el tiempo (s) y p es la concentración de proteasa (M), lo que supone que la concentración de sustrato está por debajo de la Km y por encima de la concentración de proteasa.
Los siguientes procedimientos se pueden usar para evaluar la estabilidad del sustrato in vivo de los anticuerpos activables descritos en esta invención.
Esta sección describe el procedimiento experimental para evaluar la estabilidad in vivo de los sustratos de las realizaciones cuando se incorporaron en anticuerpos activables de EGFR y se inyectaron en ratones.
Tres ratones desnudos (Crl:NU-Foxnlnu) recibieron una sola dosis IP de cada anticuerpo activable de EGFR que contenía 2001,2002, 0001/LP'/1001, 1001/LP'/0001, 1001/LP'/0002, 0001/LP'/1002, o 0002/LP'/1002 sustratos a 12,5 mg/kg el día 0. Los ratones fueron sacrificados el día 4 (~96 horas después de la dosis) por asfixia con CO2 y la sangre se recogió inmediatamente como plasma-EDTA y se almacenó a -80 °C.
Los anticuerpos activables de EGFR se purificaron a partir de plasma mediante inmunoprecipitación de IgG antihumana utilizando perlas magnéticas. Los anticuerpos activables de EGFR eluidos se prepararon para el análisis mediante electroforesis capilar como se describe en la sección kcat/Km. Brevemente, se añadieron 5 j l de IgG eluida a 7 j l de tampón de muestra Protein Express con 2-mercaptoetanol. El procedimiento de cuantificación de la estabilidad circulante fue idéntico a la cuantificación de la conversión del producto.
Los siguientes procedimientos se utilizan para evaluar la eficacia in vivo de los anticuerpos activables.
Esta sección describe el procedimiento experimental para evaluar que los anticuerpos activables de EGFR que comprenden sustratos escindibles por matriptasa, sustratos escindibles por MMP14 o sustratos de las realizaciones, es decir, sustratos escindibles por matriptasa y MMP14, son eficaces in vivo. Siete anticuerpos activables de EGFR que comprenden secuencias de sustrato de 0001,0002, 1001, 2001,2002, 0001/LP'/1001 o 1001/LP'/0001, escindible por una o ambas matriptasas y/o MMP14 se administraron a las 12,5 mg/kg por vía intraperitoneal (ip) a ratones portadores de tumores (cáncer de pulmón) con xenoinjerto H292 el día 0. Los ratones se sangraron retroorbitalmente el día 8 (~192 horas después de la dosis). La sangre se recogió inmediatamente como plasma-EDTA y se almacenó a -80 °C. Los anticuerpos activables de EGFR se purificaron a partir de plasma mediante inmunoprecipitación de IgG antihumana utilizando perlas magnéticas. Los anticuerpos activables de EGFR eluidos se prepararon para su análisis mediante electroforesis capilar. Brevemente, se añadieron 5 j l de IgG eluida a 7 j l de tampón de muestra Protein Express con 2-mercaptoetanol. La cuantificación de la estabilidad circulante fue idéntica a la cuantificación de la conversión del producto.
En el día 8, los tres anticuerpos activables de EGFR que contenían sustratos escindibles con matriptasa o sustratos escindibles con MMP14, 0001, 0002 o 1001, demostraron un porcentaje medio (%) valores de activación que van del 14 % al 15 % y los cuatro anticuerpos activables de EGFR que contienen sustratos, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 o 1001/LP'/0001, de las realizaciones, es decir, sustratos escindibles por matriptasa y MMP14, valores de activación en % medios demostrados de 28 % a 33 %. La activación media en % se calcula como ((suma de conversión de producto del grupo de prueba)*100 %)/(número de animales en el grupo de prueba).
Los siete anticuerpos activables de EGFR que contienen secuencias de sustrato de 0001, 0002, 1001, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 o 1001/LP'/0001also comprendía el resto de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 168) y el anticuerpo anti-EGFR C225v5 que comprende una cadena ligera (SEQ ID NO: 111) y una cadena pesada (SEQ ID NO: 108). La configuración de la cadena ligera del anticuerpo activable enmascaraba el resto - sustrato - cadena ligera de C225v5.
En el día 21, los tres anticuerpos activables de EGFR que contenían sustratos escindibles con matriptasa o sustratos escindibles con MMP14, 0001, 0002 o 1001, demostraron una inhibición del crecimiento tumoral que oscilaba entre el 41 % y el 57 % medido como porcentaje de inhibición media (%) y los cuatro anticuerpos activables de EGFR que contienen sustratos, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 o 1001/LP'/0001, de las realizaciones, es decir, sustratos escindibles por matriptasa y MMP14, demostraron una inhibición del crecimiento tumoral que oscilaba entre el 77 % y el 80 %, medida por la media % inhibición. La inhibición iridia en % se calcula como (media(C)-media(C0))-(media(T)-media(T0)) / (media(C)-media(C0)) * 100%, donde T es el valor del grupo de prueba actual, TO es el valor inicial del grupo de prueba actual, C es el valor del grupo de control y C0 es el valor inicial del grupo de control. El anticuerpo EGFR cetuximab en el día 21 demostró una inhibición del 86 % en este estudio.
Ejemplo 3. Imágenes in situ de anticuerpos anti-EGFR activables
El presente ejemplo describe el uso de formación de imágenes in situ de anticuerpos activables anti-EGFR no marcados. La escisión y la unión se detectaron usando un anticuerpo secundario que se une específicamente a la porción AB del anticuerpo activable.
La formación de imágenes In situ de la activación y unión de un anticuerpo activable anti-EGFR no marcado 3954-2001-C225v5 en tejido tumoral de cáncer de pulmón H292 se realizó de la siguiente manera: Se colocaron secciones de tejido congeladas sobre portaobjetos de vidrio. Se aplicó sobre el tejido una solución que contenía anticuerpos activables anti-EGFR no marcados y se incubó, por ejemplo, durante 1 hora a temperatura ambiente (alrededor de 22-24 °C) en un tampón de incubación de tampón Hepes 10 mM pH 7,4, que contiene NaCl 150 mM, ZnCb10 pM, CaCl22 mM y Tween 20 al 0,005 %; anticuerpo activable a una concentración de aproximadamente 1 pg/ml. Las condiciones de dicha incubación se pueden ajustar para que conduzcan al agente de escisión en la sección de tejido, por ejemplo, variando el pH de la solución (p. ej., dentro de un intervalo de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 8,5), la temperatura de la incubación (p. ej., dentro de un intervalo de alrededor de 20 °C a alrededor de 40 °C, p. ej., temperatura ambiente o 37 °C), el tiempo de incubación (p. ej., dentro de un intervalo de alrededor de 15 minutos a alrededor de 150 minutos, y/o las concentraciones de anticuerpos activables (por ejemplo, dentro de un intervalo de alrededor de 0,05 pg/ml a unos 10 pg/ml). A continuación, el tejido se lavó exhaustivamente para eliminar el material no unido. La presencia de anticuerpo activado en el tejido se detectó utilizando un anticuerpo IgG antihumano secundario marcado con AlexaFluor-647. Las condiciones de esa detección se pueden ajustar al reactivo de detección ya la modalidad de detección (p. ej., marcado con fluorescencia). Por ejemplo, cuando se usó una etiqueta fluorescente, el tejido se sometió a microscopía fluorescente. Como se muestra en la Figura 6, el anticuerpo activable anti-EGFR 3954-2001-C225v5 demostró una tinción con una intensidad y un patrón comparables a los del anticuerpo anti-EGFR original. La señal fluorescente del anticuerpo activable anti-EGFR 3954-2001-C225v5 se inhibió significativamente mediante el pretratamiento del tejido con un 1:100 dilución del juego combinado de inhibidores de amplio espectro III (539134, e Md Millipore, Billerica, MA) y EDTA 50 mM.
Ejemplo 4. Anticuerpos activables adicionales de m etaloproteasa de matriz (MMP) y serina proteasa (SP)
Este ejemplo demuestra la generación y evaluación de secuencias de sustrato adicionales que se activan en presencia de al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos una serina proteasa.
Los estudios descritos en esta invención utilizaron las siguientes secuencias de sustrato:
Figure imgf000120_0001
La capacidad de los sustratos, 2001, 1004/LP'/0001, 1004/LP'/0003, 2003, 2004 o 2005 para ser escindido por matriptasa humana y/o el uPA humano se determinó como se describe anteriormente en el Ejemplo 2.
Sustrato 2003 demostró un aumento de aproximadamente 50 veces en la cinética de división de la matriptasa en comparación con el sustrato 2001, y el sustrato 2005 demostró un aumento de aproximadamente 50 veces en la cinética de división de la matriptasa en comparación con el sustrato 1004/LP70001.
Los sustratos de 2003 y 2005 también demostraron aumentos modestos en el intervalo de aproximadamente 3 a 4 veces en la cinética de uPA en comparación con 2001 y 1004/LP'/0001, respectivamente. Se encontró que los sustratos 2003 y 2005 también se escindían en presencia de uPA de ratón.
Los sustratos 2003, 2004 y 2005 se incorporaron en los siguientes anticuerpos activables:
Cadena pesada anti-EGFR:
Secuencia de aminoácidos:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT
P F T S R L SINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAAST
KG P SVF P LAP S S KS T S GGTAALGC LVKDY F P E PVTVSWN S GALTSGVHTFPAVLQS S G LYS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDT LM IS RT P EVT C VW DVS H E D P E VK FNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTY R W
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS
LTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLY3KLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 108 )
Cadena ligera anti-EGFR:
Secuencia de aminoácidos:
Q ILL TQ SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSG3GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL3STLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGIS3PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 111 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2003:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSANPRGGSSGTQILLTQSPVILSV
SPG ER V SFSCRASOSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASE SIS G IP S R F S G SG S G T D F T L S
INSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCL
LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN3QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV
THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4 72 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2003 con secuencia espaciadora:
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSANPRGGSSGTQILLTQS
PVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASE S ISG IP S R F SG SG S G
TDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT
ASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK
VYACEVTHQGLSS PVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 473 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2005:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPSGRSANPRGGSSGTQILLTQSPVIL
SVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASE S ISG IPSRFSG SG SG TD FT
L S INSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 474 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2005 con secuencia espaciadora:
Secuencia de aminoácidos:
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPSGRSANPRGGSSGTQILLT
QSPVILSVSPGERVSFSCRA3QSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSG
SGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS
GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 475 )
Los sustratos utilizados en todos los anticuerpos activables anti-EGFR mostrados anteriormente fueron escindidos por matriptasa humana, uPA humana, metaloproteasa de matriz humana 14 (MMP14) y metaloproteasa de matriz humana 9 (MMP9).
Esta sección describe la evaluación de varios anticuerpos activables anti-EGFR que se muestran arriba en un estudio de eficacia tumoral H292 usando tumores de xenoinjerto H292 en ratones nu/nu. El estudio de eficacia del tumor H292 se describe en el Ejemplo 2 y también se describe en la Publicación PCT No. WO 2013/163631.
En este estudio, los ratones fueron agrupados y dosificados como se muestra en la siguiente tabla utilizando una inmunoglobulina intravenosa de control (IgIV), el anticuerpo anti-EGFR cetuximab, el anticuerpo activable anti-EGFR denominado en esta invención anticuerpo activable anti-EGFR 2001, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 449; el anticuerpo activable anti-EGFR denominado en esta invención anticuerpo activable anti-EGFR 2003, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 472; o el anticuerpo activable anti-EGFR denominado en esta invención anticuerpo activable anti-EGFR 2005, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 474:
Figure imgf000122_0001
La eficacia de los sustratos utilizados en los anticuerpos anti-EGFR que se muestran arriba se evaluó midiendo el volumen del tumor (TV mm3) en varios momentos posteriores a la administración. Los resultados del estudio se muestran en las Figuras 8A-8F.
Esta sección describe la evaluación de varios anticuerpos activables anti-Jagged en un estudio de toxicología utilizando procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 2 con respecto a los datos que se muestran en la Figura 4.
En este estudio, la toxicidad se midió en función de la pérdida de peso corporal (BW) en ratones DBA/1 después de la administración de una inmunoglobulina intravenosa de control (IgIV), una dosis de 20 mg/kg del anticuerpo anti-Jagged denominado en esta invención 4D11, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162, una dosis de 10 mg/kg del anticuerpo 4D11, una dosis de 5 mg/kg del anticuerpo 4D11, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2001, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 420, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 1004/LP'/0001, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 432, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 1004/LP'/0003, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 424, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2003, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 477 mostrada más abajo, y el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2005, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 479 mostrada más abajo.
Anticuerpo activable Anti-Jaaaed 2003 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSANPRGGGSDIQMTQSPSSLSASVG
DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS
LQPEDFAT Y YCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 476 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2003 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSANPRGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT
CRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF
ATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA
KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PV
TKSFNRGEC (SEQ ID NO: 477 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2005 Lc con secuencia espadadora
Secuencia de aminoácidos
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPSGRSANPRGGGSDIQMTQSPSSLSAS
VGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI
SS LQPEDFAT Y YCQQTWAP PLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL
NNFYPREAKVQWKVDNAIQSGNSQES'VTEQDSKDSTYS L S S T I T L SKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 478 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2005 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPSGRSANPRGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVT
IT C R A S Q S IS S YLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE
DFATYYOQQTWAPPL FGQGTKVEIKRTVAAPRVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR
EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 479 )
En el estudio representado en la Figura 9, los ratones fueron agrupados y dosificados como se muestra en la siguiente tabla:
Figure imgf000124_0002
Los resultados se muestran en la Figura 9 como porcentaje de cambio de peso corporal relativo (BW) (%) en varios puntos de tiempo durante el estudio.
Los resultados se muestran en la Figura 10 como porcentaje de cambio de peso corporal relativo (BW) (%) en varios puntos de tiempo durante el estudio.
Como se muestra en las Figuras 8A-8F, Figura 9 y Figura 10, los anticuerpos activables que incluyen los sustratos escindibles de la divulgación son seguros y eficaces. En particular, el sustrato 2003 ha demostrado una eficacia comparable al sustrato 2001 y una seguridad comparable a la IgIV, y el sustrato 2005 ha demostrado una eficacia comparable a la de los parenhtales y una seguridad comparable a la dosis de los parentales 4-veces menor.
Ejemplo 5. Anticuerpos adicionales activables de metaloproteasa de matriz (MMP) y serina proteasa (SP) Este ejemplo demuestra la generación y evaluación de secuencias de sustrato adicionales que se activan en presencia de al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos una serina proteasa.
Los estudios descritos en esta invención utilizaron las siguientes secuencias de sustrato:
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
Los expertos en la técnica apreciarán que las secuencias de nucleótidos presentadas en esta invención son ejemplares, y el experto en la materia también puede usar otras combinaciones de codones y/o secuencia o secuencias de nucleótidos degeneradas para expresar la misma secuencia peptídica.
Los sustratos 2006-2014 y los sustratos 3006-3014 se incorporaron en los siguientes anticuerpos activables:
Cadena pesada anti-EGFR:
Secuencia de aminoácidos:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNT
P F T S R L SINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST Y R W
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRBPQVYTLPPSRDELTKNQVS
LTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 108 )
Cadena ligera anti-EGFR:
Secuencia de aminoácidos:
Q ILL TQ SP V IL SV S PGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSR
FSGSG3GTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK
ADYEKHKVYACEVTHQGIS3PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 111 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2006:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDDHGSSGTQILLTQSP VILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 499 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2007:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSD1HGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESIS G IP SR F SG SG SG TD F TLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFEPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 500 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2008:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDQHGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVE S E DIADYYC QQNNNWPTT FGAGT KL E L KRTVAAP SV F I F P PS DEQL KS GTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 501 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2009:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDTHGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 502 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2010:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDYHGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW CLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO; 503 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2011:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDNPGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASOSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLS S PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 504 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2012:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSANPGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFEPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 505 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2013:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSANIGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFEPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 50 S )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 2014:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGISSGLLSGRSDNIGSSGTQILLTQSPVILSVSP
GERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIN
SVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN
NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5 59 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3006:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSDDHGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 531 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3007:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSD1HGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS1SSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 532 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3008:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSDQHGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSISSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 533 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3009:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSDTHGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ LD NO: 534 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3010:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSDYHGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTT FGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWECVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 535 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3011:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSDNPGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIF P P S DEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 536 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3012:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSANPGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ LD NO: 537 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3013:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSANIGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTN1HWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 538 )
Cadena ligera de anticuerpos activables anti-EGFR 3014:
Secuencia de aminoácidos:
CISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGAVGLLAPPGGLSGRSDNIGSSGTQILLTQSPVI
LSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDF
TLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV
VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 560)
Los dieciocho anticuerpos activables de EGFR que contienen secuencias de sustrato de sustrato 2006 (SEQ ID NO: 483), sustrato 2007 (SEQ ID NO: 484), sustrato 2008 (SEQ ID NO: 485), sustrato 2009 (SEQ ID NO: 486) , sustrato 2010 (SEQ ID NO: 487), sustrato 2011 (SEQ ID NO: 488), sustrato 2012 (SEQ ID NO: 489), sustrato 2013 (SEQ ID NO: 490), 2014 (SEQ ID NO: 555), sustrato 3006 (SEQ ID NO: 515), sustrato 3007 (SEQ ID NO: 516), sustrato 3008 (SEQ ID NO: 517), sustrato 3009 (SEQ ID NO: 518), sustrato 3010 (SEQ ID NO: 519), el sustrato 3011 (SEQ ID NO: 520), el sustrato 3012 (SEQ ID NO: 521), el sustrato 3013 (SEQ ID NO: 522) o el sustrato 3014 (SEQ ID NO: 557) también comprendían el resto de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 168) y anticuerpo anti-EGFR C225v5 que comprende una cadena ligera (SEQ ID NO: 111) y una cadena pesada (SEQ ID NO: 108). La configuración de la cadena ligera del anticuerpo activable enmascaraba el resto - sustrato - cadena ligera de C225v5.
La escisión de anticuerpos activables anti-EGFR que comprenden sustratos 2001, 2006-2010 y 2012 por matriptasa humana usando técnicas similares a las descritas en esta invención mostró un intervalo de valores de kcat/Km que va de 6E+02 a 2E+04. La escisión de anticuerpos activables anti-EGFR que comprenden los sustratos 2001,2006-2010, 2012 y 2013 por la metaloproteasa de matriz humana 14 (MMP14) utilizando técnicas similares a las descritas en esta invención mostró un intervalo de valores de kcat/Km que van de 1E+04 a 5E+04. In vivo, estos anticuerpos también exhibieron una estabilidad comparable de 4 días en ratones normales y con tumores usando técnicas similares a las descritas en esta invención.
Esta sección describe la evaluación de varios anticuerpos activables anti-EGFR que se muestran arriba en un estudio de eficacia tumoral H292 usando tumores de xenoinjerto H292 en ratones nu/nu. El estudio de eficacia del tumor H292 se describe en el Ejemplo 2 y también se describe en la Publicación PCT No. WO 2013/163631.
En este estudio, los ratones se agruparon y se dosificaron como se muestra en la siguiente Tabla utilizando un anticuerpo activable PBS de control, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 108 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 111; el anticuerpo activable anti-EGFR C225v5-3954-2001, el anticuerpo activable anti-EGFR C225v5-3954-2006, el anticuerpo activable anti-EGFR C225v5-3954-2007, etc., como se muestra en la siguiente Tabla:
Figure imgf000129_0001
Figure imgf000130_0001
La eficacia de los sustratos usados en los anticuerpos anti-EGFR que se muestran arriba se evaluó midiendo el volumen del tumor (TV mm3) en varios momentos posteriores a la administración. Los resultados se muestran en las Figuras 11A-11H y 12.
Esta sección describe la evaluación de varios anticuerpos activables anti-Jagged en un estudio de toxicología utilizando procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 2 con respecto a los datos que se muestran en la Figura 4.
En este estudio, dosis de 20 mg/kg del anticuerpo anti-Jagged denominado en esta invención 4D11, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162, una 10 mg/kg dosis del anticuerpo 4D11, un 5 mg/kg dosis del anticuerpo 4D11, el anticuerpo activable anti-Jagged denominado en esta invención anticuerpo activable anti-Jagged 2006, que incluye la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 67, y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 507-514 que se muestra abajo.
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2006 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDDHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAP PLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 507 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2007 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSD1HGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
R A S Q S IS SYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 508 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2008 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RA SQ SIS SYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAP PLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 509 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2009 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDTHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAP PLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 510 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2010 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDYHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAPPIFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD3TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 511 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2011 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 512 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2012 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAP PLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 513 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2013 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 514 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 2014 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSISSGLLSGRSDNIGGGSDIQ MTQSPSSISASVGDRVTITC
RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT
KSFNRGEC (SEQ ID NO: 561 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3006 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDDHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5 39 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3007 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSD1HGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL3KADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5 40 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3008 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDQHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5 41 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3009 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDTHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5 42 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3010 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGG5SGGSAVGLLAPPGGLSGRSDYHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PE DFAT Y YCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL3KADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5 43 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3011 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGG3SGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGGSDIQMTQSP5SLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PE DFAT Y YCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL3KADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5 44 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3012 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 545 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3013 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 546 )
Anticuerpo activable Anti-Jagged 3014 Lc
Secuencia de aminoácidos
CNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNIGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ
PEDFATYYCQQTWAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY
PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL
SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 562 )
Todos los dieciocho anticuerpos activables anti-Jagged que contienen secuencias de sustrato del sustrato 2006 (SEQ ID NO: 483), sustrato 2007 (SEQ ID NO: 484), sustrato 2008 (SEQ ID NO: 485), sustrato 2009 (SEQ ID NO: 486), sustrato 2010 (SEQ ID NO: 487), sustrato 2011 (SEQ ID NO: 488), sustrato 2012 (SEQ ID NO: 489), sustrato 2013 (SEQ ID NO: 490), 2014 (SEQ ID NO: 555); sustrato 3006 (SEQ ID NO: 515); sustrato 3007 (SEQ ID NO: 516); sustrato 3008 (SEQ ID NO: 517); sustrato 3009 (SEQ ID NO: 518); sustrato 3010 (SEQ ID NO: 519); sustrato 3011 (SEQ ID NO: 520); sustrato 3012 (SEQ ID NO: 521); sustrato 3013 (SEQ ID NO: 522); o sustrato 3014 (SEQ ID NO: 557) también comprendía el resto de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos y el anticuerpo anti-Jagged 4D11 que comprende una cadena ligera (SEQ ID NO: 162) y una cadena pesada (SEQ ID NO: 67). La configuración de la cadena ligera del anticuerpo activable enmascaraba el resto - sustrato - cadena ligera de 4D11.
En este estudio, los ratones fueron agrupados y dosificados como se muestra en la siguiente Tabla:
Figure imgf000133_0001

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido aislado que comprende un sustrato CM1-CM2 que comprende al menos un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos al menos una serina proteasa (SP), donde el sustrato CM1-CM2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 7, 555 y 557.
2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, donde la MMP es MMP2, MMP9 o MMP14.
3. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la SP es uPA o matriptasa.
4. Un polipéptido aislado que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une a una diana, y al menos un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y al menos un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP) donde el sustrato CM1-CM2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, 7, 555, y 557.
5. El polipéptido aislado de la reivindicación 4, donde la MMP, la SP o ambas, la MMP y la SP, están co­ localizadas en un tejido con la diana.
6. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de entre el grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 ,un scFv, un scAb, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio único y un anticuerpo de cadena ligera de dominio único.
7. El polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde el AB está unido al CM1, y/u opcionalm ente
donde el AB está vinculado directamente al CM1 y/u opcionalmente;
donde el AB se une al CM1 a través de un péptido de enlace.
8. El polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde el AB está unido al CM2; y/u opcionalmente
donde el AB está vinculado directamente al CM2; y/u opcionalmente
donde el AB se une al CM2 a través de un péptido de enlace.
9. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8, donde la MMP es MMP2, MMP9 o MMP14; y/u opcionalmente
donde la SP es uPA o matriptasa.
10. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9, donde el polipéptido aislado comprende un resto de enmascaramiento (MM); y/u opcionalmente
donde el MM tiene una constante de disociación para unirse al AB que es mayor que la constante de disociación del AB para unirse a la diana; y/u opcionalmente
donde el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud.
11. El polipéptido aislado de la reivindicación 10, donde el MM está unido al CM1 de manera que el polipéptido aislado en un estado no escindido comprende la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM1-CM2-AB o AB-CM2- CM1-MM; y/u opcionalmente
donde el polipéptido aislado comprende un péptido de enlace entre el MM y el CM1; y/u opcionalmente donde el polipéptido aislado comprende un péptido de enlace
Figure imgf000438_0001
entre CM2 y el AB.
12. El polipéptido aislado de la reivindicación 10, donde el MM está unido a CM2 de manera que el polipéptido aislado en un estado no escindido comprende la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera: MM-CM2-CM1-AB o AB-CM1-CM2-MM; y/u opcionalmente
donde el polipéptido aislado comprende un péptido de enlace entre el MM y el CM2; y/u opcionalmente donde el polipéptido aislado comprende un péptido de enlace
Figure imgf000438_0002
entre CM1 y el AB.
13. El polipéptido aislado de la reivindicación 10, donde el polipéptido aislado comprende un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), y donde el polipéptido aislado tiene la disposición estructural desde el extremo N hasta el extremo C de la siguiente manera en el estado no escindido: MM-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM-LP1-CM2-CM1-LP2-AB o AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM ; y/u opcionalmente donde los dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí; y/u opcionalmente
donde cada uno de LP1 y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud.
14. El polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde la secuencia de aminoácidos del MM es diferente de la de la diana y no tiene más del 10 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB .
15. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, donde el MM no interfiere ni compite con el AB para unirse a la diana en un estado escindido.
16. El polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 4-15, donde el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 420, 432, 561 y 562, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 67; y/u opcionalmente
donde el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 449, 559 y 560, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 108.
17. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 420, 432, 561 y 562; y/u opcionalmente
donde el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 449, 559 y 560.
18. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 10-17, donde la MMP es MMP2, MMP9 o MMP14; y/u opcionalmente
donde la SP es uPA o matriptasa.
19. Un anticuerpo activable conjugado que comprende el polipéptido aislado como en cualquiera de las reivindicaciones 4-18 conjugado con un agente; y/u opcionalmente
donde el agente se conjuga con el AB a través de un enlazador; y/u opcionalmente
donde el enlazador químico es un enlazador escindible o no escindible.
20. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 19, donde el agente es una toxina; y/u opcionalmente
donde el agente es un inhibidor de microtúbulos; y/u opcionalmente
donde el agente es un agente que daña el ácido nucleico; y/u opcionalmente
donde el agente se selecciona de entre el grupo que consiste en una dolastatina, una auristatina, un maitansinoide, una duocarmicina y una caliqueamicina; y/u opcionalmente
donde el agente es auristatina E; y/u opcionalmente
donde el agente es monometil auristatina E (MMAE); y/u opcionalmente
donde el agente es monometil auristatina D (MMAD) y/u opcionalmente
donde el agente es un maitansinoide seleccionado de entre el grupo que consiste en DM1 y DM4.
21. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, donde el agente es un resto detectable; y/u opcionalmente
donde el resto detectable es un agente de diagnóstico.
22. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 4-18 y un vehículo; y/u opcionalmente
que comprende un agente adicional; y/u opcionalmente
donde el agente adicional es un agente terapéutico.
23. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
24. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 23.
25. Un procedimiento para producir un anticuerpo o un anticuerpo activable mediante el cultivo de una célula en condiciones que conduzcan a la expresión del polipéptido aislado como en cualquiera de las reivindicaciones 4-18, donde la célula comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 23.
26. Un procedimiento para fabricar un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une a una diana, comprendiendo el procedimiento:
(a) cultivar una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado como en cualquiera de las reivindicaciones 4-18;
y
(b) recuperar el anticuerpo activable.
27. El polipéptido aislado como en cualquiera de las reivindicaciones 4-18, el anticuerpo activable conjugado como en cualquiera de las reivindicaciones 19-21, o la composición farmacéutica como en la reivindicación 22 para uso en el tratamiento del cáncer, opcionalmente con un agente adicional que es opcionalmente un agente terapéutico.
ES16704511T 2015-01-20 2016-01-20 Sustratos escindibles con metaloproteasa de matriz y con serina proteasa y procedimientos de uso de los mismos Active ES2919879T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562105490P 2015-01-20 2015-01-20
US201562258015P 2015-11-20 2015-11-20
US201662278713P 2016-01-14 2016-01-14
PCT/US2016/014132 WO2016118629A1 (en) 2015-01-20 2016-01-20 Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2919879T3 true ES2919879T3 (es) 2022-07-28

Family

ID=55358121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16704511T Active ES2919879T3 (es) 2015-01-20 2016-01-20 Sustratos escindibles con metaloproteasa de matriz y con serina proteasa y procedimientos de uso de los mismos

Country Status (21)

Country Link
US (5) US11046759B2 (es)
EP (2) EP3247393B1 (es)
JP (2) JP6996981B2 (es)
KR (1) KR20170108052A (es)
CN (6) CN114716513A (es)
AU (2) AU2016209403A1 (es)
BR (1) BR112017015468A2 (es)
CA (1) CA2974087A1 (es)
DK (1) DK3247393T3 (es)
EA (1) EA201791647A1 (es)
ES (1) ES2919879T3 (es)
HK (1) HK1247131A1 (es)
HR (1) HRP20220631T8 (es)
HU (1) HUE058974T2 (es)
IL (2) IL300408A (es)
MA (1) MA41374A (es)
PL (1) PL3247393T3 (es)
PT (1) PT3247393T (es)
RS (1) RS63276B1 (es)
SG (2) SG11201705901PA (es)
WO (1) WO2016118629A1 (es)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4032538A3 (en) 2009-03-02 2022-10-26 Massachusetts Institute of Technology Methods and products for in vivo enzyme profiling
CA2915412A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 Therapix Biosciences Ltd. Humanized antibodies to cluster of differentiation 3 (cd3)
JP6847660B2 (ja) 2013-06-07 2021-03-24 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー リガンドをコードする合成バイオマーカーのアフィニティベースの検出
WO2015013671A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
AU2014324884B2 (en) 2013-09-25 2020-03-26 Cytomx Therapeutics, Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2015116933A2 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
BR112017001579A2 (pt) 2014-07-25 2017-11-21 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd3 ativáveis, anticorpos anti-cd3 multiespecíficos, anticorpos anti-cd3 ativáveis multiespecíficos e métodos de uso dos mesmos
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
WO2016182064A1 (ja) 2015-05-13 2016-11-17 中外製薬株式会社 多重抗原結合分子融合体、医薬組成物、線状エピトープの同定方法、および多重抗原結合分子融合体の製造方法
WO2017040344A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Amunix Operating Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
EP3440013A4 (en) 2016-04-08 2021-03-17 Massachusetts Institute of Technology METHOD FOR SPECIFIC PROFILING OF PROTEASE ACTIVITY ON LYMPH NODES
CA3022928A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and uses for remotely triggered protease activity measurements
BR112019008223A2 (pt) 2016-11-03 2019-07-16 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos anti-ctla-4 ativáveis e usos dos mesmos
KR102533814B1 (ko) 2016-11-28 2023-05-19 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 리간드 결합 활성을 조정 가능한 리간드 결합 분자
EP3546574A4 (en) 2016-11-28 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN AND POLYPEPTIDE BINDING AREA INCLUDING A TRANSPORT SECTION
AU2017371225A1 (en) 2016-12-09 2019-05-16 Seagen Inc. Bivalent antibodies masked by coiled coils
EP3598866A1 (en) * 2016-12-29 2020-01-29 Development Center for Biotechnology Klk6-mediated cns-specific antibody prodrug activation
CA3059358A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Methods to spatially profile protease activity in tissue and sections
EP3619235A1 (en) 2017-04-11 2020-03-11 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
JP2020530554A (ja) * 2017-07-20 2020-10-22 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化抗体の特性を定性的および／または定量的に分析する方法およびその使用
CN111278461A (zh) 2017-08-16 2020-06-12 百时美施贵宝公司 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法
US11472889B2 (en) 2017-10-14 2022-10-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
CA3083259A1 (en) 2017-11-28 2019-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide including antigen-binding domain and carrying section
JP7266532B2 (ja) 2017-11-28 2023-04-28 中外製薬株式会社 リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子
US11054428B2 (en) 2018-03-05 2021-07-06 Massachusetts Institute Of Technology Inhalable nanosensors with volatile reporters and uses thereof
EP3762420A1 (en) * 2018-03-09 2021-01-13 CytomX Therapeutics, Inc. Activatable cd147 antibodies and methods of making and use thereof
WO2019183218A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Systems and methods for quantitative pharmacological modeling of activatable antibody species in mammalian subjects
TW202014436A (zh) 2018-05-02 2020-04-16 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 抗體、可活化之抗體、雙特異性抗體、及雙特異性可活化之抗體及使用彼之方法
JP2021523741A (ja) 2018-05-14 2021-09-09 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なインターロイキン１２ポリペプチド及びその使用方法
CA3100007A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
US20210253672A1 (en) 2018-05-30 2021-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule containing single domain antibody
US20200048350A1 (en) 2018-07-24 2020-02-13 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
MX2021003543A (es) 2018-09-27 2021-06-23 Xilio Dev Inc Polipeptidos de citocinas enmascaradas.
WO2020076970A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
US20210380679A1 (en) 2018-10-11 2021-12-09 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
US20210340273A1 (en) 2018-10-11 2021-11-04 Inhlbrx, inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020118109A2 (en) * 2018-12-06 2020-06-11 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
US11835522B2 (en) 2019-01-17 2023-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Sensors for detecting and imaging of cancer metastasis
CN113631194A (zh) 2019-03-21 2021-11-09 伊缪诺金公司 制备细胞结合剂-药物缀合物的方法
FI3958977T3 (fi) 2019-04-26 2023-12-12 Immunogen Inc Kamptotesiinijohdannaisia
SG11202112541RA (en) 2019-05-14 2021-12-30 Werewolf Therapeutics Inc Separation moieties and methods and use thereof
KR20220017430A (ko) 2019-06-05 2022-02-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 절단 부위 결합 분자
CN114423499A (zh) * 2019-06-06 2022-04-29 佳努克斯治疗公司 与肿瘤激活的t细胞衔接子相关的组合物和方法
WO2020251878A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
KR102386849B1 (ko) * 2019-10-14 2022-04-13 포항공과대학교 산학협력단 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 이의 제조방법
IL294879A (en) 2020-01-29 2022-09-01 Inhibrx Inc Monodomain antibodies of cd28 and their multivalent and multispecific constructs
KR20230024252A (ko) * 2020-03-23 2023-02-20 자임워크스 비씨 인코포레이티드 차폐된 il12 융합 단백질 및 이의 사용 방법
WO2021207657A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions containing activatable antibodies
IL297225A (en) 2020-04-10 2022-12-01 Cytomx Therapeutics Inc Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
US11512113B2 (en) 2020-08-11 2022-11-29 Janux Therapeutics, Inc. Cleavable linker compositions and methods
KR20230135575A (ko) 2020-12-09 2023-09-25 재눅스 테라퓨틱스 인크. Psma 및 이펙터 세포 항원을 표적화하는 종양 활성화항체와 관련된 조성물 및 방법
US20220227832A1 (en) 2020-12-21 2022-07-21 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating cd45-gate car
TW202304958A (zh) 2021-03-16 2023-02-01 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 經遮蔽之可活化之細胞介素構築體及相關之組成物及方法
WO2023034825A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Cytomx Therapeutics, Inc. Method for determining protease activity in a biological sample
WO2023060188A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and combination methods
CA3233663A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Na CAI Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
US20230174995A1 (en) 2021-10-15 2023-06-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
AU2022365116A1 (en) 2021-10-15 2024-05-02 Amgen Inc. Activatable polypeptide complex
WO2023064955A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd3, anti-egfr, heteromultimeric bispecific polypeptide complex
US20240116997A1 (en) 2022-02-23 2024-04-11 Bright Peak Therapeutics Ag Activatable il-18 polypeptides
WO2023172654A2 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Glympse Bio, Inc. Method of protease detection
WO2023183888A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antigen-binding protein constructs and uses of the same
WO2023183923A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable dual-anchored masked molecules and methods of use thereof
WO2023192606A2 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd3-binding proteins and methods of use thereof
WO2023192973A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
WO2023222580A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Byondis B.V. Novel masked antibodies
WO2024030845A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030858A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030850A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2024030847A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
WO2024030843A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
WO1988001513A1 (en) 1986-08-28 1988-03-10 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
AU2764497A (en) 1996-05-10 1997-12-05 Danisco A/S Alpha-glucuronidases of aspergillus, production thereof and their uses
AUPO930697A0 (en) 1997-09-19 1997-10-09 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The Catalytic antibodies and a method of producing same
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
EP1078051B1 (en) 1998-05-13 2007-12-12 Domantis Limited Phage-display system for the selection of correctly folded proteins
WO2001059064A2 (en) 2000-01-31 2001-08-16 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20110131679A2 (en) 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
WO2001091798A2 (en) 2000-06-01 2001-12-06 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
EP1328632A2 (en) 2000-08-04 2003-07-23 Eli Lilly And Company C1q-related factor, homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
ATE513563T1 (de) 2000-10-09 2011-07-15 Isis Innovation Therapeutische und toleranz-induzierende antikörper
AU2002230630A1 (en) 2000-11-08 2002-05-21 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for determining protease cleavage site motifs
NZ527971A (en) * 2001-03-27 2006-03-31 Dendreon Corp Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 9, the encoded polypeptides and methods based thereon
AU2002315525A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-21 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 20, the encoded polypeptides and methods based thereon
US7439319B2 (en) 2001-09-14 2008-10-21 Burnham Institute For Medical Research Selective substrates for matrix metalloproteinases
WO2003038083A1 (en) 2001-10-29 2003-05-08 Bayer Healthcare Ag Regulation of human type i adenylate cyclase
JP2006503545A (ja) * 2002-02-14 2006-02-02 ラター， ウィリアム ジェイ． 処置される宿主における切断についてのキメラ分子
US20040109855A1 (en) 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
AU2003265866A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Vit Lauermann Targeted release
US20080166375A1 (en) * 2003-05-06 2008-07-10 The Government Of The United States Of America, As Rep. By The Secretary Of Health And Human Service Activation of Recombinant Diphtheria Toxin Fusion Proteins by Specific Proteases Highly Expressed on the Surface of Tumor Cells
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US9079936B2 (en) 2003-07-01 2015-07-14 University Of Maryland, Baltimore Derivatives of APF and methods of use
US7947289B2 (en) * 2004-02-09 2011-05-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Multimeric protein toxins to target cells having multiple identifying characteristics
GB0417430D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Uc3 A novel HPV vaccine comprising peptides from host cell proteins
AU2006235276A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. CACNA1E in cancer diagnosis, detection and treatment
EP1919931A4 (en) 2005-08-31 2010-01-20 Univ California CELLULAR LIBRARIES OF PEPTIDE SEQUENCES (CLIPS) AND METHODS OF USE THEREOF
JP2009529522A (ja) 2006-03-10 2009-08-20 ディアト 酵素で切断可能なリンカーを介して抗体に複合された抗癌剤
EP2061814B1 (en) 2006-10-27 2012-06-06 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
TWI412367B (zh) * 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
MX2009013137A (es) * 2007-06-06 2010-04-30 Domantis Ltd Metodos para seleccionar polipeptidos resistentes a la proteasa.
GB0724331D0 (en) * 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
MX2009012968A (es) * 2007-06-06 2010-04-01 Domantis Ltd Polipeptidos, dominios variables de anticuerpo y antagonistas.
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
GB0819287D0 (en) 2008-10-22 2008-11-26 Univ Bradford Compounds
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
EP2385955B1 (en) 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
WO2010088691A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Washington State University Compositions and methods for treating or preventing conditions and diseases associated with mannheimia haemolytica
CN102348715B (zh) * 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
AU2010215761B2 (en) * 2009-02-23 2017-04-06 Cytomx Therapeutics, Inc Proproteins and methods of use thereof
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
US20120157824A1 (en) 2009-09-02 2012-06-21 Nanoscale Corporation Mri and optical assays for proteases
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US20110214205A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Monsanto Technology Llc. Isolated Novel Nucleic Acid and Protein Molecules from Foxtail Millet and Methods of Using Those Molecules to Generate Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits
ES2600463T3 (es) 2010-05-20 2017-02-09 Allergan, Inc. Toxinas clostridiales degradables
PL391627A1 (pl) * 2010-06-25 2012-01-02 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
WO2012025525A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
US20160151505A1 (en) 2011-05-16 2016-06-02 Koninklijke Philips N.V. Bio-orthogonal drug activation
US8846042B2 (en) * 2011-05-16 2014-09-30 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific FAB fusion proteins and methods of use
MX356433B (es) * 2011-06-28 2018-05-29 Inhibrx Lp Polipéptidos de fusión con domino de proteína ácida del suero, y métodos de uso de los mismos.
JP2015516813A (ja) 2012-04-27 2015-06-18 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド 上皮成長因子受容体を結合する活性化可能抗体及びその使用方法
US9856314B2 (en) 2012-06-22 2018-01-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
CN104661677A (zh) 2012-06-22 2015-05-27 西托姆克斯治疗公司 抗Jagged 1/Jagged 2交叉反应抗体、可活化的抗Jagged抗体及其使用方法
WO2014026136A2 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
US9487590B2 (en) 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
JP6605957B2 (ja) * 2013-01-04 2019-11-13 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド 生体系におけるプロテアーゼ活性を検出するための組成物及び方法
WO2014176284A1 (en) 2013-04-22 2014-10-30 Avelas Biosciences, Inc. Selective drug delivery compositions and methods of use
WO2014193973A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
KR20160018579A (ko) * 2013-06-04 2016-02-17 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화가능 항체를 접합하기 위한 조성물 및 방법
AU2014324884B2 (en) 2013-09-25 2020-03-26 Cytomx Therapeutics, Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2015116933A2 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
BR112017001579A2 (pt) * 2014-07-25 2017-11-21 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd3 ativáveis, anticorpos anti-cd3 multiespecíficos, anticorpos anti-cd3 ativáveis multiespecíficos e métodos de uso dos mesmos
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CA2978942A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179335A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
EA201792414A1 (ru) 2015-05-04 2018-06-29 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Антитела против cd166, активируемые антитела против cd166 и способы их применения
EP3322732A2 (en) 2015-07-13 2018-05-23 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
BR112019008223A2 (pt) 2016-11-03 2019-07-16 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos anti-ctla-4 ativáveis e usos dos mesmos
EP3592775A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 CytomX Therapeutics, Inc. Cd147 antibodies, activatable cd147 antibodies, and methods of making and use thereof
WO2018222949A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
WO2020118109A2 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP4079323A1 (en) 2022-10-26
US20220380453A9 (en) 2022-12-01
CN107531758B (zh) 2022-02-11
EP3247393B1 (en) 2022-03-09
EP3247393A1 (en) 2017-11-29
US11046759B2 (en) 2021-06-29
US20230021301A9 (en) 2023-01-19
HRP20220631T8 (hr) 2022-07-08
US11548944B2 (en) 2023-01-10
US20210347886A1 (en) 2021-11-11
PT3247393T (pt) 2022-07-01
US20230212283A1 (en) 2023-07-06
CN114907446A (zh) 2022-08-16
EA201791647A1 (ru) 2018-04-30
US20190241652A9 (en) 2019-08-08
BR112017015468A2 (pt) 2018-06-05
KR20170108052A (ko) 2017-09-26
CN114716513A (zh) 2022-07-08
RS63276B1 (sr) 2022-06-30
WO2016118629A1 (en) 2016-07-28
SG10201913901QA (en) 2020-03-30
CN114478704A (zh) 2022-05-13
IL253599A0 (en) 2017-09-28
US20160289324A1 (en) 2016-10-06
IL253599B2 (en) 2023-07-01
CN114685661A (zh) 2022-07-01
US11472875B1 (en) 2022-10-18
IL253599B1 (en) 2023-03-01
US11548943B2 (en) 2023-01-10
MA41374A (fr) 2017-11-28
PL3247393T3 (pl) 2022-06-27
AU2021257963A1 (en) 2021-11-25
HK1247131A1 (zh) 2018-09-21
CA2974087A1 (en) 2016-07-28
SG11201705901PA (en) 2017-08-30
HRP20220631T1 (hr) 2022-06-24
CN107531758A (zh) 2018-01-02
US20210355208A1 (en) 2021-11-18
AU2016209403A1 (en) 2017-08-03
CN114685611A (zh) 2022-07-01
HUE058974T2 (hu) 2022-10-28
IL300408A (en) 2023-04-01
JP2018504925A (ja) 2018-02-22
JP2022046569A (ja) 2022-03-23
DK3247393T3 (da) 2022-05-23
JP6996981B2 (ja) 2022-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2919879T3 (es) Sustratos escindibles con metaloproteasa de matriz y con serina proteasa y procedimientos de uso de los mismos
ES2910407T3 (es) Anticuerpos anti-CD71 activables y procedimientos de uso de los mismos
ES2796698T3 (es) Anticuerpos anti-CD166 activables y procedimientos de uso de los mismos
ES2932777T3 (es) Sustratos de matriptasa y activador del plasminógeno-u y otros motivos escindibles y métodos de uso de los mismos
JP6660294B2 (ja) 活性化可能抗体を結合するための組成物及び方法
TW202039561A (zh) 基質金屬蛋白酶可切割且絲胺酸蛋白酶或半胱胺酸蛋白酶可切割之受質和彼之使用方法
JP2018520092A (ja) 抗ＩＴＧａ３抗体、活性化可能抗ＩＴＧａ３抗体、およびその使用方法
KR20200058406A (ko) 활성화 가능한 항-cd166 항체 및 이의 사용 방법
JP2018529312A (ja) 抗ｐｄ−１抗体、活性化可能抗ｐｄ−１抗体、およびその使用方法
JP2018509182A (ja) 抗ｐｄｌ１抗体、活性化可能抗ｐｄｌ１抗体、およびその使用方法
BR112021008526A2 (pt) anticorpos anti-cd166 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
EA042544B1 (ru) Расщепляемые матриксными металлопротеиназами и расщепляемые сериновыми протеиназами вещества и способы их использования
BR112016006665B1 (pt) Polipeptídeo isolado que compreende uma região clivável (cm) que é um substrato de metaloproteinase de matriz, uso terapêutico do mesmo e método para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e um alvo de interesse em uma amostra