BR112016006665B1 - Polipeptídeo isolado que compreende uma região clivável (cm) que é um substrato de metaloproteinase de matriz, uso terapêutico do mesmo e método para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e um alvo de interesse em uma amostra - Google Patents

Abstract

SUBSTRATOS DE METALOPROTEINASE DE MATRIZ E OUTRAS PORÇÕES CLIVÁVEIS E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS. A invenção refere-se, geralmente, aos polipeptídeos que incluem uma porção clivável que é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP), aos anticorpos ativáveis e outras moléculas maiores que incluem a porção clivável que é um substrato para, pelo menos, uma protease MMP, e aos métodos para produzir e utilizar estes polipeptídeos que incluem uma porção clivável que é um substrato para, pelo menos, uma protease MMP em uma variedade de indicações terapêuticas, diagnósticas e profiláticas.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório US No. 61/882,377, depositado em 25 de setembro de 2013, e o Pedido de Patente Provisório US No. 61/971,332, depositado em 27 de março, 2014, cujos conteúdos são incorporados aqui por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção refere-se, geralmente, aos polipeptídeos que incluem uma região clivável que é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP), aos anticorpos ativáveis e outras moléculas maiores que incluem a região clivável que é um substrato para, pelo menos, uma protease MMP, e aos métodos para produzir e utilizar estes polipeptídeos que incluem uma região clivável que é um substrato para, pelo menos, uma protease MMP em uma variedade de indicações terapêuticas, diagnósticas e profiláticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] As proteases são enzimas que degradam proteínas através da quebra das ligações peptídicas entre os resíduos de aminoácidos. As proteases ocorrem naturalmente em todos os organismos e estão envolvidas em uma variedade de reações fisiológicas desde uma simples degradação até em vias altamente reguladas. Algumas proteases são conhecidas por quebrarem as ligações peptídicas específicas com base na presença de uma determinada sequência de aminoácidos dentro de uma proteína.

[004] Logo, existe uma necessidade de identificar novos substratos para as proteases e usar estes substratos em uma variedade de indicações terapêuticas, diagnósticas e profiláticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A divulgação proporciona sequências de aminoácidos que incluem uma região clivável (CM) que é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP). Estas CMs são úteis em uma variedade de indicações terapêuticas, diagnósticas e profiláticas.

[006] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP). Exemplos para MMP incluem MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; e MMP27. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MM9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, e MMP19. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MM9. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MM14. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para duas ou mais MMPs. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, MMP9 e MMP14. Em algumas formas de realização, a CM compreende dois ou mais substratos para a mesma MMP. Em algumas formas de realização, a CM compreende, pelo menos, dois ou mais substratos para MMP9. Em algumas formas de realização, a CM compreende, pelo menos, dois ou mais substratos para MMP14.

[007] [7] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para uma MMP e inclui a sequência ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14); QNQALRMA (SEQ ID NO: 15); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16); STFPFGMF (SEQ ID NO: 17); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 22); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32); PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33); e/ou ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[008] Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 15). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 17). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 22). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[009] [9] Em algumas formas de realização, a CM está ligada ou, de alguma forma, fixada a um anticorpo. Por exemplo, a CM é usada para ligar um ou mais agentes ao anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (AB), que se liga a um determinado alvo, de tal modo que a CM é clivada quando exposta à MMP e o agente é liberado do AB. Dentre os exemplos de alvos, incluem-se, mas não se limitam a, os alvos mostrados na Tabela 1. Exemplos do AB incluem, mas não se limitam a, os alvos mostrados na Tabela 2. Em algumas formas de realização, o anticorpo no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: Agente-CM-AB ou AB-CM-Agente. Em algumas fromas de realização, o anticorpo compreende um peptídeo de ligação entre o AB e a CM. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende um peptídeo de ligação entre a CM e o agente conjugado.

[010] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: Agente-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM- LP1-Agente. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros.

[011] Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de, pelo menos, um.

[012] Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5 ), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8).

[013] Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157).

[014] Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[015] Em algumas formas de realização, o AB tem uma constante de equilíbrio de dissociação de cerca de 100 nM ou menos para a ligação ao alvo.

[016] Em algumas formas de realização, o anticorpo inclui um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo, ou fragmento imunologicamente ativo do mesmo, que se liga ao alvo é um anticorpo monoclonal, anticorpo de domínio, cadeia única, fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um scFv, um scAb, um dAb, um anticorpo de cadeia pesada de domínio único, ou um anticorpo de cadeia leve de domínio único. Em algumas formas de realização, o referido um anticorpo, ou um fragmento imunologicamente ativo do mesmo, que se liga ao alvo é um anticorpo monoclonal humanizado ou inteiramente humano, quimérico, murino, ou de outro roedor.

[017] Em algumas formas de realização, a protease MMP está colocalizada com o alvo em um tecido, e a protease MMP cliva a CM do anticorpo quando o anticorpo é exposto à protease.

[018] Em algumas formas de realização, a CM é um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento.

[019] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP). Exemplos para MMP incluem MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; e MMP27. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MM9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, e MMP19. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MMP9. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para a MMP14. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para duas ou mais MMPs. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, MMP9 e MMP14. Em algumas formas de realização, a CM compreende dois ou mais substratos para a mesma MMP. Em algumas formas de realização, a CM compreende, pelo menos, dois ou mais substratos para MMP9. Em algumas formas de realização, a CM compreende, pelo menos, dois ou mais substratos para MMP14.

[020] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para uma MMP e inclui a sequência ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14); QNQALRMA (SEQ ID NO: 15); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16); STFPFGMF (SEQ ID NO: 17); PYGYTSSL (SEQ ID NO: 18); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 22); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32); PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33); e/ou ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[021] Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 15). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 17). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 22). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[022] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP) e inclui uma sequência motivo que é reconhecida pela MMP9. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma MMP e inclui uma sequência motivo que é reconhecida por MMP14.

[023] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma MMP, e o polipeptídeo CM e/ou a região CM de qualquer polipeptídeo que compreenda a CM, compreende um polipeptídeo que possui um comprimento inferio a 15 aminoácidos de comprimento, inferior a 14 aminoácidos, inferior a 13 aminoácidos, inferior a 12 aminoácidos, inferior a 11 aminoácidos, ou inferior a 10 aminoácidos de comprimento.

[024] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma MMP e compreende uma sequência polipeptídica que não é substancialmente idêntica a qualquer sequência polipeptídica humano que é naturalmente clivada pela mesma protease MMP. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma MMP e compreende uma sequência polipeptídica que não é mais do que 90% ou mais idêntica a qualquer sequência polipeptídica humana que é naturalmente clivada pela mesma protease MMP.

[025] Em algumas formas de realização, a sequência motivo é um substrato para, pelo menos, MMP e inclui uma sequência consenso central da CM (core CM consensus sequence) mostrada nas Tabelas 8A-8M abaixo. Em algumas formas de realização, a sequência motivo inclui um subgênero, isto é, um subconjunto da sequência consenso central da CM mostrado nas Tabelas 8A-8M abaixo.

[026] Em algumas formas de realização, a sequência motivo é um substrato para, pelo menos, MMP9 e inclui uma sequência consenso central da CM apresentada nas Tabelas 8A a 8D. Em algumas formas de realização, a sequência motivo é um substrato para, pelo menos, MMP9 e inclui um subgênero, isto é, um subconjunto da sequência consenso central da CM mostrado nas Tabelas 8A-8D abaixo.

[027] Em algumas formas de realização, a sequência motivo é um substrato para, pelo menos, MMP14 e inclui uma sequência consenso central da CM mostrada nas Tabelas 8E-8M. TABELA 8A. Sequência consenso central de CM Clivável por MMP9 1 TABELA 8B. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP9 2 TABELA 8C. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP9 3 TABELA 8D. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP9 4 TABELA 8E. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 5 TABELA 8F-1. Consenso Principal da CM 6 Subgênero do Consenso Principal da CM 6 TABELA 8F-2. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 6A TABELA 8G. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 7 TABELA 8H-1. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 8 TABELA 8H-2. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 8 TABELA 8I. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 9 TABELA 8J. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 10 TABELA 8K. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 11 TABELA 8L. Sequência consenso central da CM Clivável por MMP14 12 TABELA 8M. Sequência consenso central ds CM Clivável por MMP14 13

[028] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 352, 371, 394, 410, 425, 436, 453, 458, 473, 485, e 486. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 353-363, 372-375, 376-378, 395-401, 411-419, 426-433, 437-449, 454-456, 459-469, 475-482, e 487-495. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 353-363. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 372-375. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 376-378. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 395-401. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 411-419. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 426-433. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 437-449. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 454-456. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 459-469. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 475-482. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por 487-495.

[029] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 317, 324, 329 e 340. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 318-323, 325-327, 330-335, e 341-347. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 318-323. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 325-327. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 330-335. Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 341-347.

[030] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 1 compreendendo a sequência de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21).

[031] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 2 compreendendo a sequência de aminoácidos WDHPISLL (SEQ ID NO: 328). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 2 compreendendo a sequência de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 22).

[032] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 3 compreendendo a sequência de aminoácidos LTFPTYIF (SEQ ID NO: 336). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 3 compreendendo a sequência de aminoácidos MTFPTYIF (SEQ ID NO: 337). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 3 compreendendo a sequência de aminoácidos LTFPTYWF (SEQ ID NO: 338). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 3 compreendendo a sequência de aminoácidos MTFPTYWF (SEQ ID NO: 339). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 3 compreendendo a sequência de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 17).

[033] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 4 compreendendo a sequência de aminoácidos DWLYWMGI (SEQ ID NO: 348). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 4 compreendendo a sequência de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 4 compreendendo a sequência de aminoácidos DWLYWMSI (SEQ ID NO: 349). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 4 compreendendo o sequência de aminoácidos DWLYWPSI (SEQ ID NO: 350). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 4 compreendendo a sequência de aminoácidos HWHLGPPT (SEQ ID NO: 351).

[034] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 5 compreendendo a sequência de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 5 compreendendo a sequência de aminoácidos SYSGLLSH (SEQ ID NO: 364). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 5 compreendendo a sequência de aminoácidos SVSGLLSS (SEQ ID NO: 365). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 5 compreendendo a sequência de aminoácidos SVSGLRSH (SEQ ID NO: 366). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central 5 de CM compreendendo a sequência de aminoácidos SVSGLRSS (SEQ ID NO: 367). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 5 compreendendo a sequência de aminoácidos TLSGLRSP (SEQ ID NO: 368). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 5 compreendendo a sequência de aminoácidos TSSGLRSP (SEQ ID NO: 369). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 5 compreendendo a sequência de aminoácidos TVSGLRSP (SEQ ID NO: 370).

[035] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos AFQALRM (SEQ ID NO: 379). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos AHQALRM (SEQ ID NO: 380). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos ANQALRM (SEQ ID NO: 381). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos ANQALRMA (SEQ ID NO: 382). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLEALRAL (SEQ ID NO: 383). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLNALRAL (SEQ ID NO: 384). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLQALRAL (SEQ ID NO: 385). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLSALRAL (SEQ ID NO: 386). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLESLRAL (SEQ ID NO: 387). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLNSLRAL (SEQ ID NO: 388). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLQSLRAL (SEQ ID NO: 389). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos LLSSLRAL (SEQ ID NO: 390). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos QFQALRM (SEQ ID NO: 391). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos QHQALRM (SEQ ID NO: 392). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos QNQALRM (SEQ ID NO: 393). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 6 compreendendo a sequência de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 15).

[036] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LKAAPVWA (SEQ ID NO: 403). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LKAAPRWF (SEQ ID NO: 404). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LKAAPVWF (SEQ ID NO: 405). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LYAAPRWA (SEQ ID NO: 406). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LYAAPVWA (SEQ ID NO: 407). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LYAAPRWF (SEQ ID NO: 408). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 7 compreendendo a sequência de aminoácidos LYAAPVWF (SEQ ID NO: 409).

[037] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 8 compreendendo a sequência de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 8 compreendendo a sequência de aminoácidos LPAGLLL (SEQ ID NO: 402). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 8 compreendendo a sequência de aminoácidos LPAGLLLR (SEQ ID NO: 420). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 8 compreendendo a sequência de aminoácidos LPAHLVLL (SEQ ID NO: 421). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 8 compreendendo a sequência de aminoácidos LPSHLVLL (SEQ ID NO: 422). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 8 compreendendo a sequência de aminoácidos LPAHLVLV (SEQ ID NO: 423). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 8 compreendendo a sequência de aminoácidos LPSHLVLV (SEQ ID NO: 424).

[038] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 9 compreendendo a sequência de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central 9 de CM compreendendo a sequência de aminoácidos RRHDGLRA (SEQ ID NO: 434). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 9 compreendendo os RRHDGLRS sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 435).

[039] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 10 compreendendo a sequência de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 10 compreendendo a sequência de aminoácidos IANLLSMV (SEQ ID NO: 450). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 10 compreendendo a sequência de aminoácidos ILNLLSMV (SEQ ID NO: 451). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 10 compreendendo a sequência de aminoácidos IQNLLSMV (SEQ ID NO: 452).

[040] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 11 compreendendo a sequência de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 11 compreendendo a sequência de aminoácidos PASLWYTQ (SEQ ID NO: 457).

[041] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 12 compreendendo a sequência de aminoácidos ALGLLRLP (SEQ ID NO: 470). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 12 compreendendo a sequência de aminoácidos ALGLLSLP (SEQ ID NO: 471). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 12 compreendendo a sequência de aminoácidos ASGLLRFP (SEQ ID NO: 472). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 12 compreendendo a sequência de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31).

[042] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 13 compreendendo a sequência de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 13 compreendendo a sequência de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32).

[043] Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 13 compreendendo a sequência de aminoácidos LLLPAHGG (SEQ ID NO: 474). Em algumas formas de realização, a CM compreende uma sequência consenso central da CM 13 compreendendo a sequência de aminoácidos LLLPLLGS (SEQ ID NO: 483).

[044] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, duas proteases. Em algumas formas de realização, pelo menos uma protease é uma MMP e, pelo menos, uma protease é selecionada a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7. TABELA 7: Exemplos de proteases e/ou enzimas

[045] Em algumas formas de realização, o anticorpo inclui, pelo menos, uma primeira CM e uma segunda CM. Em algumas formas de realização, cada primeira CM e segunda CM são polipetídeos de não mais do que 15 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, a primeira CM e a segunda CM no anticorpo no estado não clivado têm o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: Agente-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-Agente, Agente-CM2-CM1-AB, ou AB-CM1-CM2-Agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre o agente e CM1. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre CM1 e CM2. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre CM2 e AB. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre o agente e CM1 e um peptídeo de ligação entre CM2 e AB. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre o agente e CM1 e um peptídeo de ligação entre CM1 e CM2. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre CM1 e CM2 e um peptídeo de ligação entre CM2 e AB. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre o agente e CM1, um peptídeo de ligação entre CM1 e CM2, e um peptídeo de ligação entre CM2 e AB.

[046] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui, pelo menos, uma primeira CM que inclui um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP) e uma segunda CM que inclui uma sequência substrato. Exemplos de substratos para a segunda CM (CM2) incluem, mas não se limitam a, os substratos cliváveis por uma ou mais das seguintes enzimas ou proteases listadas na Tabela 7.

[047] Em algumas formas de realização, a CM2 é selecionada para ser utilizada com uma protease específica. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, uma protease selecionada a partir do grupo composto por uma metaloproteinase de matriz (MMP), uma elastase neutrofílica, ativador de plasminogênio tipo-u (uPA, também referida como uroquinase), legumaína, matriptase (também referida aqui como MT-SP1 ou MTSP1), trombina, uma cisteína protease, tal como a catepsina, ADAM 17, BMP-1, HtrA 1, e um TMPRSS, tais como TMPRSS3 ou TMPRSS4.

[048] Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma elastase neutrofílica. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a uPA. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para legumaína. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a matriptase. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a trombina. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma cisteína protease. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma catepsina. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para ADAM17. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a BMP-1. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para HtrA 1. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma TMPRSS. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para TMPRSS3. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para TMPRSS4.

[049] Por exemplo, CM2 apropriados são clivados por, pelo menos, uma protease e incluem a sequência TGRGPSWV (SEQ ID NO: 34); SARGPSRW (SEQ ID NO: 35); TARGPSFK (SEQ ID NO: 36); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 37); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 38); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 39); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 40); AARGPAIH (SEQ ID NO: 41); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 42); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 43); RGPATPIM (SEQ ID NO: 44); RGPA (SEQ ID NO: 45); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 46); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 47); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 48); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 49); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 126); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 50); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 51); PLGL (SEQ ID NO: 52); GPRSFGL (SEQ ID NO: 315) e/ou GPRSFG (SEQ ID NO: 316).

[050] Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos TGRGPSWV (SEQ ID NO: 34). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SARGPSRW (SEQ ID NO: 35). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos TARGPSFK (SEQ ID NO: 36). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 37). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GGWHTGRN (SEQ ID NO: 38). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos HTGRSGAL (SEQ ID NO: 39). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos PLTGRSGG (SEQ ID NO: 40). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos AARGPAIH (SEQ ID NO: 41). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos RGPAFNPM (SEQ ID NO: 42). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SSRGPAYL (SEQ ID NO: 43). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos RGPATPIM (SEQ ID NO: 44). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos RGPA (SEQ ID NO: 45). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 46). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 47). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 48). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SPLTGRSG (SEQ ID NO: 49). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 50). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SGGPLGVR (SEQ ID NO: 51). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos PLGL (SEQ ID NO: 52). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GPRSFGL (SEQ ID NO: 315). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GPRSFG (SEQ ID NO: 316).

[051] Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, uma MMP. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, uma MMP listada na Tabela 7. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para MM9. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a MMP14. Em algumas formas de realização, CM1 é substrato para uma primeira MMP, e CM2 é um substrato para uma segunda MMP, em que a primeira MMP e a segunda MMP sãa MMPs diferentes. Em algumas formas de realização, CM1 é uma primeira sequência substrato para uma MMP, e CM2 é um segundo substrato para a mesma MMP, onde a CM1 e CM2 possuem sequências substrato diferentes. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para duas ou mais MMPs. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, MMP9 ou MMP14. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para duas ou mais MMPs. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, MMP9 e MMP14. Em algumas formas de realização, CM1 e CM2 são ambas substratos para MMP9. Em algumas formas de realização, CM1 e CM2 são ambas substratos para MMP14. Em algumas formas de realização, CM1 é um substrato para MM9 e CM2 é um substrato para MM14. Em algumas formas de realização, CM1 é um substrato para MM14 e CM2 é um substrato para MM9.

[052] Em algumas formas de realização, pelo menos, um de CM1 e/ou CM2 é um substrato para uma MMP e inclui a sequência ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14); QNQALRMA (SEQ ID NO: 15); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16); STFPFGMF (SEQ ID NO: 17); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 22); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32), PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33); e/ou ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[053] Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são a mesma protease, e a primeira CM e a segunda CM são diferentes substratos para a enzima. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são proteases diferentes. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem estão colocalizados no tecido alvo. Em algumas formas de realização, a primeira CM e a segunda CM são clivadas por, pelo menos, um agente de clivagem no tecido alvo.

[054] Em algumas formas de realização, o agente conjugado ao AB é um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, o agente é um agente antineoplásico. Em algumas formas de realização, o agente é uma toxina ou um fragmento da mesma. Conforme utilizado aqui, um fragmento de uma toxina é um fragmento que detém a atividade tóxica. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante que inclui, pelo menos, uma sequência substrato clivável por MMP. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante não clivável. Em algumas formas de realização, o agente é um inibidor de microtúbulos. Em algumas formas de realização, o agente é um agente de dano ao ácido nucleico, tal como um agente alquilante de DNA ou agente intercalante de DNA, ou outro agente de dano ao DNA. Em algumas formas de realização, o agente é um agente selecionado a partir do grupo listado na Tabela 3. Em algumas formas de realização, o agente é uma dolastatina. Em algumas formas de realização, o agente é uma auristatina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é auristatina E ou um derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina E (MMAE). Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina D (MMAD). Em algumas formas de realização, o agente é um derivado de maitansinóide ou maitansinóide. Em algumas formas de realização, o agente é DM1 ou DM4. Em algumas formas de realização, o agente é uma duocarmicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma caliqueamicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma pirrolbenzodiazepina.

[055] Em algumas formas de realização, o agente é um agente anti- inflamatório.

[056] Em algumas formas de realização, o anticorpo também inclui uma região detectável. Em algumas formas de realização, a região detectável é um agente de diagnóstico.

[057] Em algumas formas de realização, o anticorpo conjugado e/ou anticorpo conjugado ativável inclui um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável inclui um agente de imagem, um agente de contraste, uma enzima, um marcador fluorescente, um cromóforo, um corante, um ou mais íons metálicos, ou um marcador que utiliza ligante. Em algumas formas de realização, o agente de imagem compreende um radioisótopo. Em algumas formas de realização, o radioisótopo é o índio ou tecnécio. Em algumas formas de realização, o agente de contraste compreende o iodo, gadolínio ou óxido de ferro. Em algumas formas de realização, a enzima compreende a peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, ou β-galactosidase. Em algumas formas de realização, o marcador fluorescente compreende proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha modificada (MRFP), proteína tdimer2 fluorescente vermelha (RFP tdimer2), HCRED, ou um derivado de európio. Em algumas formas de realização, o marcador luminescente compreende um derivado de N-metilacridio. Em algumas formas de realização, o marcador compreende um marcador Alexa Fluor®, tais como Alex Fluor® 680 ou Alexa Fluor® 750. Em algumas formas de realização, o marcador que utiliza ligante compreende a biotina, avidina, estreptavidina ou um ou mais haptenos.

[058] Em algumas formas de realização, o AB do anticorpo contém naturalmente uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas formas de realização, o AB pode ser modificado de modo a incluir uma ou mais ligações dissulfeto.

[059] Em algumas formas de realização, o anticorpo e/ou o anticorpo conjugado é monoespecífico. Em algumas formas de realização, o anticorpo e/ou anticorpo conjugada é multiespecífico, aqui referidos como anticorpos multiespecíficos e/ou anticorpos conjugados multiespecíficos. Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico e/ou anticorpo conjugado multiespecífico é biespecífico ou trifuncional. Em algumas formas de realização, o anticorpo e/ou o anticorpo conjugado é formulado como parte de uma molécula pró-BITE (pro-Bispecific T Cell Engager). Em algumas formas de realização, o anticorpo e/ou o anticorpo conjugado é formulado como parte de uma célula T modificada com Receptor de Antígeno pró-Quimérico (pró-CAR) ou outro receptor construído.

[060] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável é monoespecífico. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável é multiespecífico, aqui referido como anticorpos multiespecíficos ativáveis e/ou anticorpos conjugados multiespecíficos ativáveis. Conforme utilizado aqui, os termos como "anticorpo ativável" e todas as suas variações gramaticais, salvo indicação em contrário, pretendem incluir, mas não se limitam a, as formas de realização em que o anticorpo ativável é um anticorpo multiespecífico ativável da divulgação. Conforme utilizado aqui, os termos como "anticorpo conjugado ativável" e todas as suas variações gramaticais, salvo indicação em contrário, pretendem incluir, mas não se limitam a, as formas de realização em que o anticorpo conjugado ativável é um anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação. Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável é biespecífico ou trifuncional. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável é formulado como parte de uma molécula pró- BITE (pro-Bispecific T Cell Engager). Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável é formulado como parte de uma célula T modificada com Receptor de Antígeno pró-Quimérico (pró-CAR) ou outro receptor construído.

[061] Em algumas formas de realização, os anticorpos ativáveis, anticorpos conjugados ativáveis, anticorpos multiespecíficos ativáveis, e/ou anticorpos conjugados multiespecíficos ativáveis aqui descritos são utilizados em conjunto com um ou mais agentes adicionais ou uma combinação de agentes adicionais. Os agentes adicionais adequados incluem as terapias farmacêuticas e/ou cirúrgicas atuais para uma aplicação pretendida, tal como, por exemplo, o câncer. Por exemplo, os anticorpos ativáveis, anticorpos conjugados ativáveis, anticorpos multiespecíficos ativáveis, e/ou anticorpos conjugados multiespecíficos ativáveis podem ser utilizados em conjunto com um agente quimioterápico adicional ou agente antineoplásico.

[062] Os anticorpos ativáveis descritos aqui em um estado ativado, se ligam a um determinado alvo e incluem: (i) um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (AB) do mesmo que se liga especificamente ao alvo; (ii) uma região de mascaramento (MM) que inibe a ligação do AB ao alvo em um estado não clivado; e (iii) uma região clivável (CM) acoplada a AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma metaloproteinase de matriz.

[063] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável no estado não seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM.

[064] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um peptídeo de ligação entre a MM e a CM.

[065] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um peptídeo de ligação entre a CM e o AB.

[066] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região Nterminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2- CM-LP1-MM.

[067] Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento.

[068] Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros.

[069] Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um.

[070] Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8).

[071] Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157).

[072] Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[073] Em algumas formas de realização, o AB tem uma constante de equilíbrio de dissociação de cerca de 100 nM ou menos para a ligação ao alvo.

[074] Em algumas formas de realização, o anticorpo inclui um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo, ou fragmento imunologicamente ativo do mesmo, que se liga ao alvo é um anticorpo monoclonal, anticorpo de domínio, cadeia única, fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um scFv, um scAb, um dAb, um anticorpo de cadeia pesada de domínio único, ou um anticorpo de cadeia leve de domínio único. Em algumas formas de realização, o referido um anticorpo, ou um fragmento imunologicamente ativo do mesmo, que se liga ao alvo é um anticorpo monoclonal humanizado ou inteiramente humano, quimérico, murino, ou de outro roedor.

[075] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo multiespecífico ativável. Os anticorpos multiespecíficos ativáveis proporcionados aqui são anticorpos multiespecíficos que reconhecem dois ou mais antígenos ou epítopos diferentes e que incluem, pelo menos, uma região de mascaramento (MM) ligada a, pelo menos, um domínio de ligação ao antígeno ou epítopo do anticorpo multiespecífico de tal modo que o acoplamento de MM reduz a capacidade do domínio de ligação ao antígeno ou epítopo de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização, a MM é acoplada ao domínio de ligação ao antígeno ou epítopo do anticorpo multiespecífico através de uma região clivável (CM) que funciona como um substrato para, pelo menos, uma protease MMP. Os anticorpos multiespecíficos ativáveis proporcionados aqui são estáveis na circulação, sendo ativados nos locais de terapia e/ou diagnóstico pretendidos, mas não em tecido saudável normal, e, quando ativados, se liga a um alvo que é pelo menos comparável ao anticorpo multiespecífico não modificado correspondente.

[076] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2, e contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, e uma sequência de VH CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VH CDR1, da sequência de VH CDR2 e da sequência de VH CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VH CDR1 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 498); uma sequência de VH CD2 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 499); uma sequência de VH CDR3 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 500), e combinações das mesmas.

[077] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2, e que contém uma combinação de uma sequência VL CDR1, uma sequência VL CDR2, e uma sequência de VL CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VL CDR1, da sequência de VL CDR2, e da sequência de VL CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VL CDR1, que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 501); uma sequência de VL CDR2 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 502); uma sequência de VL CDR3 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 503), e combinações das mesmas.

[078] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, incluindo, mas não se limitando a um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2, e que contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, e uma sequência de VH CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VH CDR1, da sequência de VH CDR2 e da sequência de VH CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VH CDR1 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 498); uma sequência de VH CD2 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 499); uma sequência de VH CDR3 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 500), e combinações das mesmas.

[079] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2, e que contém uma combinação de uma sequência VL CDR1, uma sequência de VL CDR2, e uma sequência de VL CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VL CDR1, da sequência de VL CDR2, e da sequência de VL CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VL CDR1, que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 501); uma sequência de VL CDR2 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 502); e uma sequência de VL CDR3 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 503), e combinações das mesmas.

[080] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2, e que contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, uma sequência de VH CDR3, uma sequência VL CDR1, uma sequência de VL CDR2 e uma sequência de VL CDR3, em que a sequência VH CDR1 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 498); a sequência de VH CD2 inclui, pelo menos, o sequência de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 499); a sequência de VH CDR3 compreende, pelo menos, a sequência de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 500); a sequência de VL CDR1 inclui, pelo menos, o sequência de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 501); a sequência de VL CDR2 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 502); e a sequência de VL CDR3 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 503).

[081] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2, e que contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, uma sequência de VH CDR3, uma sequência VL CDR1, uma sequência de VL CDR2 e uma sequência de VL CDR3, em que a sequência de VH CDR1 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 498); a sequência de VH CD2 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 499); a sequência de VH CDR3 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos DIGGRSAFDY ( SEQ ID NO: 500); a sequência de VL CDR1 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 501); a sequência de VL CDR2 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 502); e a sequência de VL CDR3 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 503).

[082] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e que contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, e uma sequência de VH CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VH CDR1, da sequência de VH CDR2, e da sequência de VH CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VH CDR1 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 504); uma sequência de VH CD2 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 505); uma sequência de VH CDR3 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 506); e combinações das mesmas.

[083] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a EGFR e que contém uma combinação de uma sequência de VL CDR1, uma sequência de VL CDR2, e uma sequência de VL CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VL CDR1, da sequência de VL CDR2, e da sequência de VL CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VL CDR1 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 507); uma sequência de VL CDR2 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 508); e uma sequência de VL CDR3 que inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 509), e combinações das mesmas.

[084] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a EGFR e que contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, e uma sequência de VH CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VH CDR1, da sequência de VH CDR2 e da sequência de VH CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VH CDR1 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 504); uma sequência de VH CD2 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 505); uma sequência de VH CDR3 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 506); e combinações das mesmas.

[085] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a EGFR e que contém uma combinação de uma sequência de VL CDR1, uma sequência de VL CDR2, e uma sequência de VL CDR3, em que pelo menos uma da sequência de VL CDR1, a sequência de VL CDR2, e a sequência de VL CDR3 é selecionada a partir de uma sequência de VL CDR1, que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 507); uma sequência de VL CDR2 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 508); e uma sequência de VL CDR3 que inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 509), e combinações das mesmas.

[086] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a EGFR e que contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, uma sequência de VH CDR3, uma sequência de VL CDR1, uma sequência de VL CDR2, e uma sequência de VL CDR3, em que a sequência de VH CDR1 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 504); a sequência de VH CD2 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 505); a sequência de VH CDR3 compreende, pelo menos, a sequência de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 506); a sequência de VL CDR1 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 507); a sequência de VL CDR2 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 508); e a sequência de VL CDR3 inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 509).

[087] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a EGFR e que contém uma combinação de uma sequência de VH CDR1, uma sequência de VH CDR2, uma sequência de VH CDR3, uma sequência de VL CDR1, uma sequência de VL CDR2, e uma sequência de VL CDR3, em que a sequência de VH CDR1 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos NYGVH (SEQ ID NO: 504 ); a sequência de VH CD2 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 505); a sequência de VH CDR3 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 506); a sequência de VL CDR1 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 507); a sequência de VL CDR2 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos KYASESIS (SEQ ID NO: 508); e a sequência de VL CDR3 inclui uma sequência que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 509).

[088] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 54, 56, 57, 58, 61, 63, 65, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, e 114. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de cadeia leve selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 55, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, e 113. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada selecionado a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 54, 56, 57, 58, 61, 63, 65, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88,90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, e 114 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 55, 59 , 60, 62, 64, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107,109, 111 e 113.

[089] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 54, 56, 57, 58, 61, 63, 65, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 , 104, 106, 108, 110, 112, e 114. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de cadeia leve que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 55, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, e 113. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável proporcionado aqui, compreendendo, mas não se limitando a, um anticorpo multiespecífico ativável e/ou anticorpo conjugado multiespecífico ativável da divulgação, inclui, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 54, 56, 57, 58, 61, 63, 65, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86 , 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, e 114 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 55, 59, 60, 62, 64, 67, 69 , 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 e 113.

[090] Em algumas formas de realização, a MM tem uma constante de equilíbrio de dissociação para se ligar a AB que é maior do que a constante de equilíbrio de dissociação do AB ao alvo.

[091] Em algumas formas de realização, a MM tem uma constante de equilíbrio de dissociação para se ligar a AB que não é maior do que a constante de equilíbrio de dissociação do AB ao alvo.

[092] Em algumas formas de realização, a MM não interfere ou compete com AB para se ligar ao alvo em um estado clivado.

[093] Em algumas formas de realização, a MM é um polipeptídeo de cerca de 2 a 40 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, a MM é um polipeptídeo de até cerca de 40 aminoácidos de comprimento.

[094] Em algumas formas de realização, a sequência polipeptídica de MM é diferente da sequência de qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a sequência polipeptídica de MM não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a sequência polipeptídica de MM não é mais do que 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, ou 10% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do do AB.

[095] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, duas vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[096] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, três vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[097] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, cinco vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[098] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, 10 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[099] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, 20 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[0100] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, 40 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[0101] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, 100 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[0102] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado a MM em relação ao alvo é, pelo menos, 1.000 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[0103] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade de AB de se ligar ao alvo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB, quando acoplado à MM, ao alvo é, pelo menos, 10.000 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado a MM em relação ao alvo.

[0104] Em algumas formas de realização, a protease MMP está colocalizada com o alvo em um tecido, e a MMP cliva a CM no anticorpo ativável quando o anticorpo ativável é exposto a MMP.

[0105] Em algumas formas de realização, na presença do alvo, a MM reduz a capacidade de AB de se ligar ao alvo em, pelo menos, 90% quando a CM é clivada, em comparação quando a CM é clivada, em avaliações in vitro utilizando-se um teste de deslocamento de alvo (target displacement assay), tal como, por exemplo, o teste descrito nas publicações PCT Nos. WO 2009/025846 e WO 2010/081173.

[0106] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, duas vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que, no estado clivado, (isto é, quando o anticorpo ativável está no estado clivado), AB se liga ao alvo.

[0107] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, cinco vezes maior do que o a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que, no estado clivado, (isto é, quando o anticorpo ativável está no estado clivado), AB se liga ao alvo.

[0108] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, dez vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que, no estado clivado, (isto é, quando o anticorpo ativável está no estado clivado), AB se liga ao alvo.

[0109] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, 20 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que, no estado clivado, (isto é, quando o anticorpo ativável está no estado clivado), AB se liga ao alvo.

[0110] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, 40 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que no estado clivado, AB se liga ao alvo.

[0111] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, 50 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que no estado clivado, AB se liga ao alvo.

[0112] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, 100 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que no estado clivado, AB se liga ao alvo.

[0113] Em algumas formas de realização, a CM é posicionada no anticorpo ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo ativável ao alvo com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, 200 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao alvo, ao passo que no estado clivado, AB se liga ao alvo.

[0114] Em algumas formas de realização, a CM é um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento.

[0115] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP). Exemplos para MMP incluem MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; e MMP27. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MM9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, e MMP19. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MM9. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para MM14. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para duas ou mais MMPs. Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, MMP9 e MMP14. Em algumas formas de realização, a CM compreende dois ou mais substratos para a mesma MMP. Em algumas formas de realização, a CM compreende pelo menos dois ou mais substratos para MMP9. Em algumas formas de realização, a CM compreende pelo menos dois ou mais substratos para MMP14.

[0116] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para uma MMP e inclui a sequência ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14); QNQALRMA (SEQ ID NO: 15); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16); STFPFGMF (SEQ ID NO: 17); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 22); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32), PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33); e/ou ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[0117] Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 15). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos STFPFGMF (SEQ ID NO: 17). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos WATPRPMR (SEQ ID NO: 22). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33). Em algumas formas de realização, a CM compreende a sequência de aminoácidos ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[0118] Em algumas formas de realização, a CM é um substrato para, pelo menos, duas proteases. Em algumas formas de realização, pelo menos uma protease é uma MMP e, pelo menos, uma protease é selecionada a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7.

[0119] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui, pelo menos, uma primeira CM e uma segunda CM. Em algumas formas de realização, cada primeira CM e segunda CM são polipetídeos de não mais do que 15 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, a primeira CM e a segunda CM no anticorpo ativável apresenta o arranjo estrutural, da região N- terminal a região C-terminal, da seguinte forma: no estado não clivado: MM-CM1- CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB, ou AB-CM1-CM2-MM. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre MM e CM1. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre a CM1 e CM2. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre CM2 e AB. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre MM e CM1 e um peptídeo de ligação entre CM2 e AB. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre MM e CM1 e um peptídeo de ligação entre CM1 e CM2. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre CM1 e CM2 e um peptídeo de ligação entre CM2 e AB. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre MM e CM1, um peptídeo de ligação entre CM1 e CM2, e um peptídeo de ligação entre CM2 e AB.

[0120] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui, pelo menos, uma primeira CM que inclui um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP) e uma segunda CM que inclui uma sequência substrato. Exemplos de substratos para a segunda CM (CM2) incluem, mas não se limitam a, os substratos cliváveis por uma ou mais das seguintes enzimas ou proteases listadas na Tabela 7.

[0121] Em algumas formas de realização, a CM2 é selecionada para ser utilizada com uma protease específica. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, uma protease selecionada a partir do grupo composto por uma metaloproteinase de matriz (MMP), um elastase neutrofílica, ativador de plasminogênio tipo-u (uPA, também referido como uroquinase), legumaína, matriptase (MT-SP1), trombina, uma cisteína protease, tal como a catepsina, ADAM 17, BMP-1, HtrA 1, e um TMPRSS, tal como TMPRSS3 ou TMPRSS4.

[0122] Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma elastase neutrofílica. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a uPA. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para legumaína. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a matriptase. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a trombina. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma cisteína protease. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma catepsina. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para ADAM17. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para a BMP-1. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para HtrA 1. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para uma TMPRSS. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para TMPRSS3. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para TMPRSS4.

[0123] Por exemplo, CM2 adequadas são clivadas por pelo menos uma protease e incluem a sequência TGRGPSWV (SEQ ID NO: 34); SARGPSRW (SEQ ID NO: 35); TARGPSFK (SEQ ID NO: 36); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 37); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 38); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 39); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 40); AARGPAIH (SEQ ID NO: 41); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 42); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 43); RGPATPIM (SEQ ID NO: 44); RGPA (SEQ ID NO: 45); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 46); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 47); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 48); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 49); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 126); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 50); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 51); PLGL (SEQ ID NO: 52); GPRSFGL (SEQ ID NO: 315) e/ou GPRSFG (SEQ ID NO: 316).

[0124] Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos TGRGPSWV (SEQ ID NO: 34). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SARGPSRW (SEQ ID NO: 35). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos TARGPSFK (SEQ ID NO: 36). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 37). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GGWHTGRN (SEQ ID NO: 38). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos HTGRSGAL (SEQ ID NO: 39). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos PLTGRSGG (SEQ ID NO: 40). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos AARGPAIH (SEQ ID NO: 41). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos RGPAFNPM (SEQ ID NO: 42). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SSRGPAYL (SEQ ID NO: 43). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos RGPATPIM (SEQ ID NO: 44). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos RGPA (SEQ ID NO: 45). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 46). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 47). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 48). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SPLTGRSG (SEQ ID NO: 49). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 50). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos SGGPLGVR (SEQ ID NO: 51). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos PLGL (SEQ ID NO: 52). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GPRSFGL (SEQ ID NO: 315). Em algumas formas de realização, a CM2 compreende a sequência de aminoácidos GPRSFG (SEQ ID NO: 316)

[0125] Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, uma MMP. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, uma MMP listada na Tabela 7. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para MM9. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para MMP14. Em algumas formas de realização, CM1 é substrato para uma primeira MMP, e CM2 é um substrato para uma segunda MMP, em que a primeira MMP e a segunda MMP são MMPs diferentes. Em algumas formas de realização, CM1 CM1 é uma primeira sequência substrato para uma MMP, e CM2 é um segundo substrato para a mesma MMP, onde a CM1 e CM2 possuem sequências substrato diferentes. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para duas ou mais MMPs. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, MMP9 ou MMP14. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para duas ou mais MMPs. Em algumas formas de realização, a CM2 é um substrato para, pelo menos, MMP9 e MMP14. Em algumas formas de realização, CM1 e CM2 são ambas substratos para MMP9. Em algumas formas de realização, CM1 e CM2 são ambas substratos para MMP14. Em algumas formas de realização, CM1 é um substrato para MM9 e CM2 é um substrato para MM14. Em algumas formas de realização, CM1 é um substrato para MM14 e CM2 é um substrato para MM9.

[0126] Em algumas formas de realização, pelo menos uma de CM1 e/ou CM2 é um substrato para uma MMP e inclui a sequência ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14); QNQALRMA (SEQ ID NO: 15); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16); STFPFGMF (SEQ ID NO: 17); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 22); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32), PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33); e/ou ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[0127] Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são a mesma metaloproteinase de matriz, e a primeira CM e a segunda CM são diferentes substratos para a enzima. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são proteases diferentes, em que, pelo menos, uma protease é uma MMP. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem estão colocalizados no tecido alvo. Em algumas formas de realização, a primeira CM e a segunda CM são clivados por, pelo menos, um agente de clivagem no tecido alvo.

[0128] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é exposto e clivado por uma MMP, de modo que, no estado ativado ou clivado, o anticorpo ativado inclui uma sequência de aminoácidos de cadeia leve que inclui, pelo menos, uma região de LP2 e/ou sequência de CM após a MMP ter clivado a CM.

[0129] Em algumas formas de realização, a CM compreende o lado não principal (non-prime side) do sítio de clivagem da protease; isto é, a CM compreende, pelo menos, os aminoácidos P1 e P2, e, em algumas formas de realização, compreende os aminoácidos P1, P2 e P3 e em algumas formas de realização, compreende os aminoácidos P1, P2, P3, e P4. Em algumas formas de realização, a CM compreende o lado não principal e o lado principal do sítio de clivagem da protease. Em algumas formas de realização, a CM compreende o lado não principal, mas não tem, pelo menos, parte do lado principal do sítio de clivagem da protease. Em algumas formas de realização, a CM compreende o lado não principal, mas carece do lado principal do sítio de clivagem da protease. Tal CM pode ser ligada diretamente ou através de um ligante a um anticorpo ou outra molécula, tal como aqui descrito, como, mas não se limitando a, uma unidade de detecção.

[0130] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB que é ou é derivado de cetuximab ou panitumumab; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 160, 167-200, e 497; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB que é ou é derivado de cetuximab ou panitumumab; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 160, 167-200, e 497; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-EGFR ativável inclui também um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0131] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que contém a sequência de VH CDR1 de SEQ ID NO: 504, a sequência de VH CDR2 de SEQ ID NO: 505, a sequência de VH CDR3 de SEQ ID NO: 506, a sequência de VL CDR1 de SEQ ID NO: 507, a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 508, e a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 509; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 160, 167-200, e 497; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que contém a sequência de VH CDR1 de SEQ ID NO: 504, a sequência de VH CDR2 de SEQ ID NO: 505, a sequência de VH CDR3 de SEQ ID NO: 506, a sequência de VL CDR1 de SEQ ID NO: 507, a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 508, e a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 509; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 160, 167-200, e 497; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-EGFR ativável também inclui um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0132] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID NO: 56, 57 ou 58 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 59; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 160, 167-200, e 497; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID NO: 56, 57 ou 58 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 59; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 160, 167-200, e 497; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-EGFR ativável inclui também um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0133] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência da cadeia pesada de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 59; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID NO: 56 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 59; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-EGFR ativável também inclui um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n ( SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0134] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que contém a sequência de VH CDR1 de SEQ ID NO: 504, a sequência de VH CDR2 de SEQ ID NO: 505, a sequência de VH CDR3 de SEQ ID NO: 506, a sequência de VL CDR1 de SEQ ID NO: 507, a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 508, e a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 509; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-EGFR ativável, que inclui, pelo menos, um AB compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que contém a sequência de VH CDR1 de SEQ ID NO: 504, a sequência de VH CDR2 de SEQ ID NO: 505, a sequência de VH CDR3 de SEQ ID NO: 506, a sequência de VL CDR1 de SEQ ID NO: 507, a VL CDR2 sequência de SEQ ID NO: 508, e a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 509; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-EGFR ativável também inclui um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0135] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-Jagged ativável que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência da cadeia pesada de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, 63, 65, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, ou 114 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 60, 62, 64, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, ou 113; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 201-263, e 496; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-Jagged ativável que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID NO: 61, 63, 65, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, ou 114 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve SEQ ID NO: 60, 62, 64, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, ou 113; uma MM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 201-263, e 496; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Jagged ativável também inclui um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C- terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0136] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-Jagged ativável que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência da cadeia pesada de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 111; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 217; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-Jagged ativável que inclui, pelo menos, um AB compreendendo a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID NO: 112 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 111; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 217; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Jagged ativável também inclui um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS) n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Em algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0137] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-Jagged ativável que inclui, pelo menos, um AB compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que contém a sequência de VH CDR1 de SEQ ID NO: 498, a sequência de VH CDR2 de SEQ ID NO: 499, a sequência de VH CDR3 de SEQ ID NO: 500, a sequência de VL CDR1 de SEQ ID NO: 501, a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 502, e a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 503; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 217; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 14-33 e 159. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo anti-Jagged ativável que inclui, pelo menos, um AB compreendendo uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que contém a sequência de VH CDR1 de SEQ ID NO: 498, a sequência de VH CDR2 de SEQ ID NO: 499, a sequência de VH CDR3 de SEQ ID NO: 500, a sequência de VL CDR1 de SEQ ID NO: 501, a VL CDR2 sequência de SEQ ID NO: 502, e a sequência de VL CDR2 de SEQ ID NO: 503; uma MM compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NO: 217; e uma CM compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pelas sequências apresentadas nas Tabelas 8A-8M. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Jagged ativável também inclui um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, LP1 compreende a sequência de aminoácidos GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 155), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 156), ou GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 157). Dentro algumas formas de realização, LP2 compreende a sequência de aminoácidos GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 158), GSSGT (SEQ ID NO: 12) ou de GSSG (SEQ ID NO: 13).

[0138] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável também inclui um agente conjugado ao AB. Em algumas formas de realização, o agente é um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, o agente é um agente antineoplásico. Em algumas formas de realização, o agente é uma toxina ou um fragmento da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB por meio de um ligante. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o agente é um inibidor de microtúbulos. Em algumas formas de realização, o agente é um agente causador de dano a ácido nucleico, tal como um agente alquilante de DNA ou agente intercalante de DNA, ou outro agente de dano ao DNA. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante que inclui, pelo menos, uma sequência substrato clivável por MMP. Em algumas formas de realização, o agente é um agente selecionado a partir do grupo listado na Tabela 3. Em algumas formas de realização, o agente é uma dolastatina. Em algumas formas de realização, o agente é uma auristatina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é auristatina E ou um derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina E (MMAE). Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina D (MMAD). Em algumas formas de realização, o agente é um derivado de maitansinóide ou maitansinóide. Em algumas formas de realização, o agente é DM1 ou DM4. Em algumas formas de realização, o agente é uma duocarmicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma caliqueamicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma pirrolbenzodiazepina.

[0139] Em algumas formas de realização, o agente é um agente anti- inflamatório.

[0140] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui também uma região detectável. Em algumas formas de realização, a região detectável é um agente de diagnóstico.

[0141] Em algumas formas de realização, o anticorpo conjugado inclui um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável inclui um agente de imagem, um agente de contraste, uma enzima, um marcador fluorescente, um cromóforo, um corante, um ou mais íons metálicos, ou um marcador que utiliza ligante. Em algumas formas de realização, o agente de imagem compreende um radioisótopo. Em algumas formas de realização, o radioisótopo é índio ou tecnécio. Em algumas formas de realização, o agente de contraste compreende iodo, gadolínio ou óxido de ferro. Em algumas formas de realização, a enzima compreende a peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, ou β-galactosidase. Em algumas formas de realização, o marcador fluorescente compreende a proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha modificada (MRFP), proteína tdimer2 fluorescente vermelha (RFP tdimer2), HCRED, ou um derivado de európio. Em algumas formas de realização, o marcador luminescente compreende um derivado de N-metilacridio. Em algumas formas de realização, o marcador compreende um marcador Alexa Fluor®, tais como Alex Fluor® 680 ou Alexa Fluor® 750. Em algumas formas de realização, o marcador que utiliza ligante compreende a biotina, avidina, estreptavidina ou um ou mais haptenos.

[0142] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável também inclui um peptídeo sinal. Em algumas formas de realização, o peptídeo sinal é conjugado ao anticorpo ativável através de um espaçador. Em algumas formas de realização, o espaçador é conjugado ao anticorpo ativável na ausência de um peptídeo sinal. Em algumas formas de realização, o espaçador é unido diretamente a MM do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, o espaçador é unido diretamente a MM do anticorpo ativável no arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, de espaçador-MM-CM-AB. Um exemplo de um espaçador diretamente unido à região N-terminal de MM do anticorpo ativável é QGQSGQ (SEQ ID NO: 53). Em algumas formas de realização, o espaçador inclui, pelo menos, a sequência de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 53).

[0143] Em algumas formas de realização, o AB do anticorpo ativável contém naturalmente uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas formas de realização, AB pode ser modificado de modo a incluir uma ou mais ligações dissulfeto.

[0144] Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é maior do que a do anticorpo correspondente; por exemplo, a pK do anticorpo ativável é maior do que a do anticorpo correspondente. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é semelhante à do anticorpo correspondente. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 15 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 12 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 11 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 10 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 9 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 8 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 7 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 6 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 5 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia- vida sérica do anticorpo ativável é pelo menos 4 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 3 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 2 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 24 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 20 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 18 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 16 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 14 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia- vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 12 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 10 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 8 horas, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 6 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 4 horas, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 3 horas quando administrado a um organismo.

[0145] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável é monoespecífico. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável é multiespecífico, por exemplo, como exemplo não limitante, bi-específico ou trifuncional. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável é formulado como parte de uma molécula pró-BITE (pro-Bispecific T Cell Engager). Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável é formulado como parte de uma célula T modificada com Receptor de Antígeno pró- Quimérico (pró-CAR) ou outro receptor construído.

[0146] A divulgação também proporciona composições e métodos que incluem um anticorpo ativável que inclui um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB), que se liga especificamente a um determinado alvo, em que AB é acoplado a uma região de mascaramento (MM) que diminui a capacidade de AB de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui ainda uma região clivável (CM) que é um substrato para, pelo menos, uma MMP. As composições e métodos proporcionados aqui permitem a ligação de um ou mais agentes a um ou mais resíduos de cisteína em AB, sem comprometer a atividade (por exemplo, a atividade de mascaramento, ativação ou ligação) do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, as composições e métodos proporcionados aqui permitem a ligação de um ou mais agentes a um ou mais resíduos de cisteína em AB, sem reduzir, ou de outra forma alterar, uma ou mais ligações dissulfeto dentro da MM. As composições e métodos proporcionados aqui produzem um anticorpo ativável que é conjugado a um ou mais agentes, por exemplo, qualquer um de uma variedade de agentes terapêuticos, profiláticos e/ou de diagnóstico, por exemplo, em algumas formas de realização, sem nenhum do(s) agente(s) estando conjugado(s) a MM do anticorpo ativável. As composições e métodos proporcionados aqui produzem anticorpos conjugados ativáveis onde a MM mantém a capacidade de mascarar eficaz e eficientemente o AB do anticorpo ativável em um estado não clivado. As composições e métodos proporcionados aqui produzem anticorpos conjugados ativáveis em que o anticorpo ativável é ainda ativado, isto é, clivado, na presença de uma MMP que pode clivar a CM.

[0147] Os anticorpos ativáveis têm, pelo menos, um ponto de conjugação com um agente, contudo, nos métodos e composições proporcionados aqui, apenas pontos possíveis de conjugação estão disponíveis para conjugação com um agente. Em algumas formas de realização, o um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre envolvidos nas ligações dissulfeto. Em algumas formas de realização, o um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre envolvidos nas ligações dissulfeto intercadeias. Em algumas formas de realização, o um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre envolvidos no ligações dissulfeto intercadeias, e não os átomos de enxofre envolvidos nas ligações dissulfeto intracadeia. Em algumas formas de realização, o um ou mais pontos de conjugação são átomos de enxofre da cisteína ou de outros resíduos de aminoácidos que contenham um átomo de enxofre. Tais resíduos podem ocorrer naturalmente na estrutura do anticorpo ou podem ser incorporados no anticorpo por mutagênese sítio dirigida, conversão química, ou mis-incorporation de aminoácidos não naturais.

[0148] Também são proporcionados métodos de preparação de um conjugado de um anticorpo ativável tendo uma ou mais ligações dissulfeto intercadeias em AB e uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia na MM, e um fármaco reativo a tióis livres é fornecido. O método geralmente inclui reduzir parcialmente as ligações dissulfeto intercadeias do anticorpo ativável com um agente redutor, tal como, por exemplo, TCEP; e conjugar o fármaco reativo a tióis livres com o anticorpo ativável parcialmente reduzido. Conforme utilizado aqui, o termo redução parcial refere-se às situações em que um anticorpo ativável é posto em contato com um agente redutor e apenas algumas ligações dissulfeto, por exemplo, apenas os sítios possíveis de conjugação são reduzidos. Em algumas formas de realização, menos de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou menos de 5% de todos os possíveis sítios de conjugação são reduzidos.

[0149] Em algumas formas de realização, é proporcionado um método para reduzir e conjugar um agente, por exemplo, um fármaco, com um anticorpo ativável que resulta na seletividade na colocação do agente. O método geralmente inclui reduzir parcialmente o anticorpo ativável com um agente redutor, de modo que quaisquer sítios de conjugação na região de mascaramento ou outra região não-AB do anticorpo ativável não sejam reduzidos, e conjugar o agente com os tióis intercadeias no AB. O(s) sítio(s) de conjugação é/ são selecionado(s) de modo a permitir a colocação desejada de um agente a fim de permitir que a conjugação ocorra em um local desejado. O agente redutor é, por exemplo, TCEP. As condições da reação de redução, tais como, por exemplo, a proregião entre agente redutor e anticorpo ativável, a duração da incubação, a temperatura durante a incubação, o pH da solução de reação de redução, etc, são determinados pela identificação das condições que produzem um anticorpo conjugado ativável onde a MM mantém a capacidade de mascarar eficaz e eficientemente o AB do anticorpo ativável em um estado não clivado. A proregião entre agente redutor e anticorpo ativável variará dependendo do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, a proregião entre agente redutor e anticorpo ativável estará em uma faixa de cerca de 20: 1 a 1: 1, de cerca de 10: 1 a 1: 1, de cerca de 9: 1 a 1: 1, de cerca de 8: 1 a 1: 1, de cerca de 7: 1 a 1: 1, de cerca de 6: 1 a 1: 1, de cerca de 5: 1 a 1: 1, de cerca de 4: 1 a 1: 1, de cerca de 3 : 1 a 1: 1, a partir de cerca de 2: 1 a 1: 1, de cerca de 20: 1 a 1: 1,5, de cerca de 10: 1 a 1: 1,5, de cerca de 9: 1 a 1: 1,5, de cerca de 8 : 1 a 1: 1,5, de cerca de 7: 1 a 1: 1,5, de cerca de 6: 1 a 1: 1,5, de cerca de 5: 1 a 1: 1,5, de cerca de 4: 1 a 1: 1,5, de cerca de 3 : 1 a 1: 1,5, de cerca de 2: 1 a 1: 1,5, de cerca de 1,5: 1 a 1: 1,5, ou de cerca de 1: 1 a 1: 1,5. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 5: 1 a 1: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 5: 1 a 1,5: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 4: 1 a 1: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 4: 1 a 1,5: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 8: 1 a cerca de 1: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 2,5: 1 a 1: 1.

[0150] Em algumas formas de realização, um método para reduzir as ligações dissulfeto intercadeias no AB de um anticorpo ativável e para conjugar um agente, por exemplo, um agente contendo tiol, tal como um fármaco, com os tióis intercadeias resultantes para localizar seletivamente o(s) agente(s) no AB é proporcionado. O método geralmente inclui reduzir parcialmente o AB com um agente redutor para formar pelo menos dois tióis intercadeias sem formar todos os possíveis tióis intercadeias no anticorpo ativável; e conjugar o agente com os tióis intercadeia do AB parcialmente reduzido. Por exemplo, o AB do anticorpo ativável é parcialmente reduzido por cerca de 1 hora a aproximadamente 37°C a uma proregião desejada de agente redutor: anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, a proregião entre agente redutor e anticorpo ativável estará em uma faixa de cerca de 20: 1 a 1: 1, de cerca de 10: 1 a 1: 1, de cerca de 9: 1 a 1: 1, de cerca de 8 : 1 a 1: 1, de cerca de 7: 1 a 1: 1, de cerca de 6: 1 a 1: 1, de cerca de 5: 1 a 1: 1, de cerca de 4: 1 a 1: 1, de cerca de 3 : 1 a 1: 1, de cerca de 2: 1 a 1: 1, de cerca de 20: 1 a 1: 1,5, de cerca de 10: 1 a 1: 1,5, de cerca de 9: 1 a 1: 1,5, de cerca de 8 : 1 a 1: 1,5, de cerca de 7: 1 a 1: 1,5, de cerca de 6: 1 a 1: 1,5, de cerca de 5: 1 a 1: 1,5, de cerca de 4: 1 a 1: 1,5, de cerca de 3 : 1 a 1: 1,5, de cerca de 2: 1 a 1: 1,5, de cerca de 1,5: 1 a 1: 1,5, ou de cerca de 1: 1 a 1: 1,5. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 5: 1 a 1: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 5: 1 a 1,5: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 4: 1 a 1: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 4: 1 a 1,5: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 8: 1 a cerca de 1: 1. Em algumas formas de realização, a proregião está na faixa de cerca de 2,5: 1 a 1: 1.

[0151] O reagente contendo tiol pode ser, por exemplo, cisteína ou N- acetilcisteína. O agente redutor pode ser, por exemplo, TCEP. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável reduzido pode ser purificado antes da conjugação, utilizando, por exemplo, cromatografia em coluna, diálise ou diafiltração. Em algumas formas de realização, o anticorpo reduzido não é purificado após a redução parcial e antes da conjugação.

[0152] A divulgação também proporciona anticorpos ativáveis parcialmente reduzidos em que pelo menos uma ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo ativável foi reduzido com um agente redutor, sem alterar quaisquer ligações dissulfeto intracadeia no anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno (AB) do mesmo, que se liga especificamente ao alvo, uma região de mascaramento (MM) que inibe a ligação do AB do anticorpo ativável em um estado não clivado ao alvo, e uma região clivável (CM) acoplada a AB, em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para, pelo menos, uma MMP. Em algumas formas de realização, a MM é acoplada a AB através da CM. Em algumas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia do anticorpo ativável não é alterada pelo agente redutor. Em algumas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia da MM no anticorpo ativável não é alterada pelo agente redutor. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM. Em algumas formas de realização, agente redutor é TCEP.

[0153] A divulgação também proporciona anticorpos ativáveis parcialmente reduzidos, compreendendo, mas não se limitando a, os anticorpos multiespecíficos ativáveis da divulgação, em que pelo menos uma ligação dissulfeto intercadeias no anticorpo ativável foi reduzida com um agente redutor sem alterar, ou de outro modo comprometer, a atividade e/ou a eficácia do anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno (AB) do mesmo, que se liga especificamente a um alvo, uma região de mascaramento (MM) que inibe a ligação do AB do anticorpo ativável em um estado não clivado ao alvo, e uma região clivável (CM) acoplada a AB, e a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease. A atividade e/ou a eficácia do anticorpo ativável é, como exemplo não limitante, a atividade de mascaramento, a ativação do anticorpo ativável, e/ou a atividade de ligação do anticorpo ativável ativado. Em algumas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia do anticorpo ativável não é alterada pelo agente redutor. Em algumas formas de realização, uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia da MM no anticorpo ativável não é alterada pelo agente redutor. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável no estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM. Em algumas formas de realização, agente redutor é TCEP.

[0154] A divulgação também proporciona anticorpos ativáveis conjugados que incluem um anticorpo ativável ligado a carga de monometil auristatina D (MMAD), em que o anticorpo ativável inclui um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno (AB) do mesmo, que se liga especificamente a um alvo, uma região de mascaramento (MM) que inibe a ligação do AB do anticorpo ativável em um estado não clivado ao alvo, e a região clivável (CM) acoplada a AB, e a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para, pelo menos, uma protease MMP.

[0155] Em algumas formas de realização, o anticorpo conjugado ativável com MMAD pode ser conjugado utilizando-se qualquer um dos vários métodos para ligar os agentes a ABs: (a) ligação às regiões de carboidrato do AB, ou (b) ligação aos grupos sulfidrila do AB, ou (c) ligação aos grupos amina do AB, ou (d) ligação aos grupos carboxilato do AB.

[0156] Em algumas formas de realização, a carga de MMAD é conjugada com AB através de um ligante. Em algumas formas de realização, a carga de MMAD é conjugada com uma cisteína no AB através de um ligante. Em algumas formas de realização, a carga de MMAD é conjugada com uma lisina no AB através de um ligante. Em algumas formas de realização, a carga de MMAD é conjugada com outro resíduo do AB através de um ligante, tal como os resíduos aqui divulgados. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante contendo tiol. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante não clivável. Em algumas formas de realização, o ligante é selecionado a partir do grupo composto pelos ligantes apresentados nas Tabelas 5 e 6. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e a carga de MMAD estão ligados através de um ligante de caproil-valina-citrulina maleimida. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e a carga de MMAD estão ligados através de um ligante de PEG-valina-citrulina maleimida. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e a carga de MMAD estão ligados através de um ligante de caproil-valina-citrulina-para-aminobenziloxicarbonila maleimida. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável e a carga de MMAD estão ligados através de um ligante de PEG-valina-citrulina-para-aminobenziloxicarbonila maleimida. Em algumas formas de realização, a carga de MMAD é conjugada com AB utilizando-se a tecnologia de redução e a conjugação parcial descrita aqui.

[0157] Em algumas formas de realização, o alvo é selecionado a partir do grupo de alvos listados na Tabela 1. Em algumas formas de realização, o alvo é o EGFR. Em algumas formas de realização, o alvo é uma proteína Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2. Em algumas formas de realização, o alvo é o receptor de interleucina 6 (IL-6R). Em algumas formas de realização, o AB é ou é derivada de um anticorpo selecionado a partir do grupo de anticorpos listados na Tabela 2. Em algumas formas de realização, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo composto por um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um scFv, um scAb, um dAb, um anticorpo de cadeia pesada de domínio único, ou um anticorpo de cadeia leve de domínio único. Em algumas formas de realização, o AB tem uma constante de equilíbrio de dissociação de cerca de 100 nM ou menos para a ligação ao alvo. Em algumas formas de realização, a MM tem uma constante de equilíbrio de dissociação para se ligar a AB que é maior do que a constante de equilíbrio de dissociação do AB ao alvo. Em algumas formas de realização, a MM não interfere ou compete com o AB do anticorpo ativável em um estado clivado para se ligar ao alvo. Em algumas formas de realização, a MM é um polipeptídeo de não mais do que 40 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, a sequência polipeptídica da MM é diferente daquela do alvo, e a sequência polipeptídica da MM não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não inclui mais de 25% de identidade de sequência de aminoácidos em relação ao alvo. Em algumas formas de realização, a MM não inclui mais de 10% de identidade de sequência de aminoácidos em relação ao alvo. Em algumas formas de realização, a CM é um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, a protease MMP está colocalizada com o alvo em um tecido, e a protease MMP cliva a CM no anticorpo ativável quando o anticorpo ativável é exposto à protease MMP. Em algumas formas de realização, a protease MMP é uma protease MMP9. Em algumas formas de realização, a protease MMP é uma protease MMP14. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre a MM e a CM. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um peptídeo de ligação entre a CM e o AB. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e o anticorpo ativável em um estado não clivado apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros. Em algumas formas de realização, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8). Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui uma segunda CM; em algumas formas de realização, a segunda MC é um substrato para uma enzima selecionada a partir do grupo constituído por aquelas apresentadas na Tabela 7.

[0158] A divulgação também proporciona polipetídeos e outras moléculas maiores, que incluem uma ou mais das sequências substrato cliváveis por MMP apresentadas aqui. Como exemplo não limitante, as sequências substrato cliváveis por MMP apresentadas aqui são úteis em composições de pró-fármacos e aos métodos de utilização dos mesmos. Estas sequências substrato cliváveis por MMP apresentadas aqui são também úteis em sondas e outros agentes de detecção e nos métodos de utilização dos mesmos. Por exemplo, as sequências substrato cliváveis por MMP apresentadas aqui podem ser utilizadas em conjunto com Fluors e outros supressores para produzir agentes de detecção, tais como os agentes de imagem e/ou outros agentes de diagnóstico. Os técnicos no assunto compreenderão que as sequências substrato cliváveis por MMP apresentadas aqui são úteis em qualquer composição e/ou método no estado da arte que usa um substrato que é clivável por uma ou mais MMPs, tais como a MMP9 e/ou MMP14.

[0159] A divulgação também proporciona uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo e/ou um anticorpo ativável descrito aqui, assim como vetores que incluem essas sequências de ácidos nucleicos isolados. A divulgação proporciona métodos para produzir um anticorpo e/ou anticorpo ativável por meio de uma cultura de células sob condições que conduzam à expressão do anticorpo e/ou anticorpo ativável, em que a célula compreende um tal vetor.

[0160] A divulgação proporciona um método para produzir um anticorpo conjugado da divulgação que se liga a um determinado alvo por meio de uma (a) cultura de células compreendendo um construto de ácido nucleico que codifica o anticorpo sob condições que levam à expressão do anticorpo, (i) em que o anticorpo inclui uma região clivável (CM), e (ii) em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma metaloproteinase de matriz; (b) da recuperação do anticorpo; e (c) da conjugação do anticorpo recuperado com um ou mais agentes adicionais.

[0161] A divulgação também proporciona um método para produzir os anticorpos ativáveis da divulgação que se ligam, em um estado ativado, a um determinado alvo por meio de uma (a) cultura de uma célula compreendendo um construto de ácido nucleico que codifica o anticorpo ativável sob condições que levam à expressão do anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável compreende uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM), e um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno (AB) do mesmo, que se liga especificamente ao alvo, (i) em que a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma MMP; e (ii) em que a CM é posicionada no anticorpo ativável de modo que, em um estado não clivado, a MM interfere com a ligação específica do AB ao alvo e, em um estado clivado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (b) da recuperação do anticorpo ativável.

[0162] A divulgação proporciona métodos para prevenir, retardar o progresso, tratar, aliviar um sintoma de, ou de outra forma melhorar, uma doença relacionada ao alvo em um indivíduo através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável descrito aqui a um indivíduo que precise do mesmo.

[0163] A divulgação proporciona métodos para prevenir, retardar o progresso, tratar, aliviar um sintoma de, ou de outra forma melhorar a inflamação e/ou uma doença inflamatória em um indivíduo através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável descrito aqui a um indivíduo que precise do mesmo. A divulgação também proporciona métodos para prevenir, retardar o progresso, tratar, aliviar um sintoma de, ou de outra forma melhorar o câncer em um indivíduo através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável descrito aqui a um indivíduo que precise do mesmo. A divulgação também proporciona métodos para prevenir, retardar o progresso, tratar, aliviar um sintoma de, ou de outra forma melhorar uma doença autoimune em um indivíduo através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável descrito aqui a um indivíduo que precise do mesmo.

[0164] Um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável, utilizado em qualquer uma das formas de realização destes métodos e usos, podem ser administrados em qualquer fase da doença. Por exemplo, o referido anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável pode ser administrado a um paciente que sofre de câncer em qualquer fase, da fase inicial a metastática. Os termos indivíduo e paciente são utilizados aqui alternadamente.

[0165] Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero, tal como um humano, primata não humano, animal doméstico (por exemplo, gato, cão, cavalo), animal de criação, animal de trabalho, ou animais de zoológico. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um roedor. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um humano. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um animal doméstico. Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal sob os cuidados de um veterinário.

[0166] O anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável e formulações terapêuticas do mesmo são administrados a um indivíduo que sofre ou é susceptível a uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou à atividade aberrante do alvo. Um indivíduo que sofre, ou é susceptível a uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou à atividade aberrante do alvo, é identificado utilizando-se qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos no estado da arte. Por exemplo, os indivíduos que sofrem de câncer ou de outra condição neoplásica são identificados utilizando-se qualquer uma de uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, tais como, exame físico e análise de sangue, urina e/ou fezes para avaliação do estado de saúde. Por exemplo, indivíduos que sofrem de inflamação e/ou uma doença inflamatória são identificados utilizando-se qualquer uma de uma variedade de testes clínicos e/ou laboratoriais, tais como, o exame físico e/ou análise de fluidos corporais, por exemplo, análise de sangue, urina e/ou fezes para avaliar o estado de saúde.

[0167] A administração de um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou à atividade aberrante do alvo é considerada bem sucedida se qualquer um de uma variedade de objetivos clínicos ou laboratoriais for conseguido. Por exemplo, a administração de um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou à atividade aberrante do alvo é considerada bem sucedida se um ou mais dos sintomas associados à doença ou distúrbio for aliviado, reduzido, inibido ou não progride para outro estado, isto é, pior. A administração de um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável a um paciente que sofre de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou à atividade aberrante do alvo é considerada bem sucedida se a doença ou distúrbio entrar em remissão ou não progredir para outro estado, isto é, pior.

[0168] Em algumas formas de realização, o anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável é administrado durante e/ou depois do tratamento em combinação com um ou mais agentes adicionais, tais como, como exemplo não limitante, um agente anti-inflamatório, um agente imunossupressor, um agente quimioterápico, tal como um agente alquilante, um antimetabólito, um agente antimicrotúbulos, um inibidor de topoisomerase, um antibiótico citotóxico, e/ou qualquer outro agente causador de dano a ácido nucleico. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um taxano, tal como o paclitaxel (por exemplo, Abraxane®). Em algumas formas de realização, o agente adicional é um antimetabólito, tais como gemcitabina. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um agente alquilante, tal como os regimes de quimioterapia à base de platina, tal como carboplatina ou cisplatina. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um agente direcionado, tal como um inibidor de quinase, por exemplo, sorafenib ou erlotinib. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um agente direcionado, tal como outro anticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal (por exemplo, o bevacizumab), um anticorpo biespecífico, ou um anticorpo multiespecífico. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um inibidor de proteossoma, tal como bortezomib ou carfilzomib. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um agente imunomodulador, tal como lenalidomida ou IL-2. Em algumas formas de realização, o agente adicional é a radiação. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um agente considerado como padrão de tratamento pelos técnicos no assunto. Em algumas formas de realização, o agente adicional é um agente quimioterápico bem conhecido pelos técnicos no assunto.

[0169] Em algumas formas de realização, o agente adicional é um anticorpo, um outro anticorpo conjugado, um outro anticorpo ativável e/ou um outro anticorpo conjugado ativável. Em algumas formas de realização, o anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável e o(s) agente(s) adicional (is) são administrados simultaneamente. Por exemplo, o anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável e o(s) agente(s) adicional (is) podem ser formulados em uma única composição ou administrada como duas ou mais composições separadas. Em algumas formas de realização, o anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável e o(s) agente (s) adicional (is) são administrados Sequêncialmente, ou o anticorpo e/ou o anticorpo conjugado e o(s) agente (s) adicional (is) são administrados em momentos diferentes durante um regime de tratamento. Por exemplo, o anticorpo e/ou os anticorpos conjugado é administrado antes da administração do agente adicional, o anticorpo e/ou os anticorpos conjugados é administrado após a administração do agente adicional, ou o anticorpo e/ou os anticorpos conjugados e o agente adicional são administrados de forma alternada. Conforme descrito aqui, o anticorpo e/ou os anticorpos conjugados e o agente adicional são administrados em doses únicas ou em doses múltiplas.

[0170] Em algumas formas de realização, a CM está ligada, ou de outra forma anexada, a um anticorpo ativável que inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um determinado alvo acoplado a uma região de mascaramento (MM), de modo que o acoplamento de MM a AB reduz a capacidade do anticorpom ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmom de se ligar ao alvo. Em algumas formas de realização, a MM é acoplada através do CM. Exemplos de alvos incluem, mas não se limitam a, os alvos mostrados na Tabela 1. Exemplos do AB incluem, mas não se limitam a, os alvos mostrados na Tabela 2. Os anticorpos ativáveis proporcionados aqui são estáveis na circulação, sendo ativados nos locais de terapia e/ou diagnóstico pretendidos, mas não em tecido saudável normal ou outro tecido não relacionado ao tratamento e/ou diagnóstico, e, quando ativados, se ligam ao alvo que é pelo menos comparável ao anticorpo não modificado correspondente.

[0171] A divulgação também proporciona métodos e kits para a utilização dos anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos conjugados ativáveis em uma variedade de indicações profiláticas e/ou diagnósticas.

[0172] Em algumas formas de realização, A divulgação proporciona métodos e kits para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e um alvo de interesse em um indivíduo ou em uma amostra por meio: (i) do contato de um indivíduo ou amostra com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável compreende uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno, ou um fragmento (AB) do mesmo, que se liga especificamente ao alvo de interesse, em que o anticorpo ativável no estado não ativado e não clivado, compreende um arranjo estrutural da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação natural do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; e (b) em que, em um estado não clivado e não ativado, a MM interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e, em um estado clivado e ativado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (ii) da medição de um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou na amostra, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou na amostra indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra, em que nenhum nível detectável do anticorpo ativável ativado no indivíduo ou na amostra indica que o agente de clivagem, o alvo ou ambos o agente de clivagem e o alvo estão ausentes no indivíduo ou na amostra.

[0173] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável com o qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado sobre o AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou na amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0174] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o anticorpo ativável inclui um marcador detectável. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador detectável inclui um agente de imagem, um agente de contraste, uma enzima, um marcador fluorescente, um cromóforo, um corante, um ou mais íons metálicos, ou um marcador que utiliza ligante. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o agente de imagem compreende um radioisótopo. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o radioisótopo é índio ou tecnécio. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o agente de contraste compreende iodo, gadolínio ou óxido de ferro. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, a enzima compreende a peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou β-galactosidase. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador fluorescente compreende proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha modificada (MRFP), proteína tdimer2 fluorescente vermelha (RFP tdimer2), HCRED, ou um derivado de európio. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador luminescente compreende um derivado de N-metilacridio. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador compreende um marcador Alexa Fluor®, tais como Alex Fluor® 680 ou Alexa Fluor® 750. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador que utiliza ligante compreende a biotina, avidina, estreptavidina ou um ou mais haptenos.

[0175] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o indivíduo é um mamífero. Em algumas formas de realização destes métodos, o indivíduo é um humano. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero não humano, tal como um primata não humano, animal doméstico (por exemplo, gato, cão, cavalo), animal de criação, animal de trabalho, ou animal de zoológico. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um roedor. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um humano. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um animal doméstico. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um animal sob os cuidados de um veterinário.

[0176] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o método é um método in vivo. Em algumas formas de realização destes métodos, o método é um método in situ. Em algumas formas de realização destes métodos, o método é um método ex vivo. Em algumas formas de realização destes métodos, o método é um método in vitro.

[0177] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o método é utilizado para identificar, ou de outra forma refinar, uma população de pacientes adequada para o tratamento com um anticorpo ativável da divulgação, seguido de tratamento através da administração desse anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável a um indivíduo que precise do mesmo. Por exemplo, os pacientes com resultado positivo para o alvo ou pelo menos uma MMP que cliva o substrato na região clivável (CM) do anticorpo ativável testado nestes métodos, são identificados como candidatos adequados para o tratamento com o referido anticorpo ativável compreendendo a referida CM, e, portanto, é administrada ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável que foi testado. Do mesmo modo, os pacientes com resultado negativo para um ou ambos o alvo e a MMP que cliva o substrato na CM do anticorpo ativável testado usando estes métodos, podem ser identificados como candidatos adequados para uma outra forma de terapia. Em algumas formas de realização, tais pacientes podem ser testados com outros anticorpos ativáveis até que seja identificado um anticorpo ativável adequado para o tratamento (por exemplo, um anticorpo ativável que compreende uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas formas de realização, é administrada ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável e/ou conjugado para o qual o paciente teve resultado positivo.

[0178] As composições farmacêuticas, de acordo com A divulgação, podem incluir um anticorpo da divulgação e um carreador. Estas composições farmacêuticas podem ser incluídas em kits, tais como, por exemplo, kits de diagnóstico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0179] As Figuras 1A e 1B são uma série de gráficos que ilustram a capacidade do anticorpo anti-EGFR ativável contendo uma região de mascaramento que compreende a sequência de aminoácidos CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 160), uma região de clivagem que compreende o substrato 520 para MMP14 (também referido aqui como MN520) ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14), e as cadeias pesada e leve do anticorpo C225v5 anti-EGFR, onde todo o construto de anticorpo ativável é referido aqui como Pb-MN520, para inibir o crescimento de tumor no modelo de câncer de pulmão H292 de xenotransplante.

[0180] As figuras 2A e 2B são uma série de gráficos que ilustram a clivagem do pool de substrato referido aqui como SMP87 por 5 nM para MMP9.

[0181] As figuras 3A e 3B são uma série de gráficos que ilustram a clivagem da sequência substrato VAGRSMRP (SEQ ID NO: 484) por 5 nM para MMP9.

[0182] A Figura 4 é um gráfico que descreve a correlação de frequência e função da sequência substrato.

[0183] As figuras 5A e 5B são uma série de gráficos que ilustram a clivagem do pool de substrato SMP39 por 60 nM para MMP14.

[0184] As Figuras 6A e 6B são uma série de gráficos que ilustram a clivagem da sequência substrato QNQALRMA (SEQ ID NO: 15) por 30 nM para MMP14.

[0185] As Figuras 7A e 7B são uma série de representações esquemáticas das plataformas de apresentação de peptídeos utilizados nos exemplos de trabalho proporcionados aqui. A Figura 7A é uma representação esquemática da sequência da plataforma de apresentação referida aqui como "plataforma de apresentação CYTX-DP-XXXXXXXX" ou "CYTX-DP-XXXXXXXX" (SEQ ID NO: 512). A Figura 7B é uma representação esquemática da sequência da plataforma de apresentação referida aqui como "plataforma de apresentação SP-CYTX-DP-XXXXXXXX" ou "SP- CYTX-DP-XXXXXXXX" (SEQ ID NO: 513), onde SP-CYTX-DP-XXXXXXXX (SEQ ID NO: 513) é a plataforma CYTX-DP-XXXXXXXX (SEQ ID NO: 512) com um peptídeo sinal.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0186] A divulgação proporciona sequências de aminoácidos que incluem uma região clivável (CM) que é um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz (MMP). Estas CMs são úteis em uma variedade de indicações terapêuticas, diagnósticas e profiláticas.

[0187] Os exemplos de trabalho proporcionados aqui demonstram que essas CM, quando apresentadas em uma plataforma de apresentação de peptídeos, exibem um número de características de clivagem desejáveis quando expostas a uma protease MMP em condições específicas. Por exemplo, a Tabela 9 ilustra (a) a percentagem de substratos para MMP9 selecionados, testados na plataforma de apresentação CYTX-PD, apresentou, pelo menos, 20% de clivagem quando incubados com 50 nM para MMP9 humano por 1 hora a 37°C em 50 mM de Tris HCl, pH 7,4, suplementado com 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2 e 0,05% (p/v) de Brij-35 (> 20% de clivagem com 50 nM para MMP9); (b) a percentagem de substratos para MMP14 selecionados, testados na plataforma de apresentação CYTX-PDs, apresentou, pelo menos, 20% de clivagem quando incubados com 50 nM para MMP14 humana por 1 hora a 37°C em 50 mM de HEPES, pH 6,8, suplementado com 10 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2 (> 20% de clivagem com 50 nM para MMP14); e (c) a percentagem de substratos selecionados para MMP9 ou substratos selecionados para MMP14, testados na plataforma de apresentação CYTX-PD, apresentou, pelo menos, 20% de clivagem quando incubados com 500 pM de plasmina humana por 1 hora a 37°C em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 100 mM de NaCl, 0,01% de Tween 20 e 1 mM de EDTA (< 20% de clivagem com 500 pM de plasmina).

[0188] Em algumas formas de realização, um substrato para MMP9, quando exibido na plataforma CYTX-DP, apresenta pelo menos 20% de clivagem quando incubado com 50 nM para MMP9 humano por 1 hora a 37°C em 50mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2, e 0,05% (p/v) de Brij- 35. Em algumas formas de realização, um substrato para MMP9, quando exibido na plataforma CYTX-DP, apresenta menos de 20% de clivagem quando incubado com 500 pM de plasmina humana por 1 hora a 37°C em 50mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 100 mM de NaCl, 0,01% de Tween 20 e 1 mM de EDTA. Em algumas formas de realização, um substrato para MMP9, quando exibido na plataforma CYTX-DP, apresenta pelo menos 20% de clivagem quando incubadas com 50 nM para MMP9 humano por 1 hora a 37°C em 50mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 150 mM de NaCl , 10 mM de CaCl2, e 0,05% (p/v) de Brij-35 e spresenta menos de 20% de clivagem quando incubado com 500 pM de plasmina humana por 1 hora a 37°C em 50mM de 50mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 100 mM de NaCl, 0,01% de Tween 20 e 1 mM de EDTA.

[0189] Em algumas formas de realização, um substrato para MMP14 apresenta pelo menos 20% de clivagem quando incubado com 50 nM para MMP14 humana por 1 hora a 37°C em 50 mM de HEPES, pH 6,8, suplementado com 10 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2. Em algumas formas de realização, um substrato para MMP14, quando exibido na plataforma CYTX-DP, apresenta menos de 20% de clivagem quando incubado com 500 pM de plasmina humana por 1 hora a 37°C em 50mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 100 mM de NaCl, 0,01% de Tween 20 e 1 mM de EDTA. Em algumas formas de realização, um substrato para MMP14 apresenta pelo menos 20% de clivagem quando incubado com 50 nM para MMP14 humana por 1 hora a 37°C em mM de HEPES 50, pH 6,8, suplementado com 10 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2 e apresenta menos de 20% de clivagem quando incubado com 500 pM de plasmina humana por 1 hora a 37°C em 50mM de Tris- HCl, pH 7,4, suplementado com 100 mM de NaCl, 0,01% de Tween 20e 1 mM de EDTA .

[0190] Em algumas formas de realização, o valor observado de kcat/KM de um substrato em um anticorpo ativável para MMP9 é maior do que 100 M-1s-1. Em algumas formas de realização, o valor observado de kcat/KM de um substrato em um anticorpo ativável para MMP9 é maior do que 1.000 M-1s-1. Em algumas formas de realização, o valor observado de kcat/KM de um substrato em um anticorpo ativável para MMP9 é maior do que 10.000 M-1s-1.

[0191] Em algumas formas de realização, o valor observado de kcat/KM de um substrato em um anticorpo ativável para MMP14 é maior do que 100 M-1s-1. Em algumas formas de realização, o valor observado de kcat/KM de um substrato em um anticorpo ativável para MMP14 é maior do que 1.000 M-1s-1. Em algumas formas de realização, o valor observado de kcat/KM de um substrato em um anticorpo ativável para MMP14 é maior do que 10.000 M-1s-1.

[0192] A divulgação proporciona também anticorpos que incluem um ou mais destes substratos cliváveis por MMP. Por exemplo, estes substratos cliváveis por MMP são úteis na conjugação dos anticorpos com um ou mais agentes adicionais para a produção de anticorpos conjugados. Estes cliváveis por MMP são úteis em construtos de anticorpos ativáveis.

[0193] Os anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis incluem um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno (AB) do mesmo, que se liga especificamente a um alvo. Exemplos de classes de alvos de um AB incluem, mas não se limitam necessariamente a, os receptores de superfície celular e proteínas de ligação secretadas (por exemplo, fatores de crescimento), enzimas solúveis, proteínas estruturais (por exemplo, colágeno, fibronectina) e outros similares. Em algumas formas de realização, os anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis tem um AB que se liga a um alvo extracelular, normalmente, uma proteína alvo extracelular. Em algumas formas de realização, os anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis são delineados para a absorção celular e são alternáveis dentro de uma célula.

[0194] Como um exemplo não limitante, o AB é um parceiro de ligação para qualquer alvo listado na Tabela 1. TABELA 1: Exemplos de Alvos

[0195] Como um exemplo não limitante, o AB é ou é derivado de um anticorpo listado na Tabela 2. TABELA 2: Exemplos de fontes para Abs

[0196] Os exemplos de anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis dA divulgação incluem, por exemplo, anticorpos que se ligam ao receptor de interleucina 6 (IL-6R) e que incluem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que são, ou são derivados de, o anticorpo referido aqui como anticorpo "AV1", que se liga ao receptor de interleucina-6 (IL-6R). As sequências de aminoácidos para a cadeia pesada de AV1 e para cadeia leve de AV1 são mostradas a seguir na SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55, respectivamente. Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo AV1: QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIG YISYSGITTYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLARTTAMD YWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKdYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKdTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 54) Sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo AV1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKdSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 55)

[0197] Exemplos de anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis dA divulgação incluem, por exemplo, os anticorpos que se ligam ao receptor de interleucina 6 (IL-6R) e que incluem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que são, ou são derivados de, o anticorpo AV1 e uma região de mascaramento. Exemplos de anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis dA divulgação incluem uma sequência de aminoácidos ligada à região N-terminal da cadeia leve de AV1. Estas sequências de aminoácidos N-terminais incluem, por exemplo, YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 161); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 162); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 163); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 165); ou QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 166). Contempla-se também que tais sequências de aminoácidos podem ser ligadas à região N-terminal da cadeia pesada de AV1 ou à região C-terminal da cadeia pesada ou leve de AV1.

[0198] Exemplos de anticorpos ativáveis dA divulgação incluem, por exemplo, os anticorpos que se ligam ao receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) e que incluem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que são, ou são derivados de, um anticorpo selecionado a partir do grupo constituído pelo anticorpo referido aqui como anticorpo "c225v5", o anticorpo referido aqui como anticorpo "c225v4", e o anticorpo referido aqui como anticorpo "c225v6", em que cada destes se liga a EGFR. O anticorpo c225v5, o anticorpo c225v4, e o anticorpo c225v6 compartilham a mesma sequência da cadeia leve, referida aqui como "cadeia leve de c225". As sequências de aminoácidos para a cadeia pesada de c225v5, o anticorpo c225v4, o anticorpo c225v6, e a cadeia leve de c225 são mostradas abaixo. Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo C225v5: QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLG VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKdNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEF AYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKdYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKdTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 56) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo C225v4: QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLG VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKdNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEF AYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKdYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKdTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK* (SEQ ID NO: 57) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo C225v6: QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLG VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKdNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEF AYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKdYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKdTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO: 58) Sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo C225: QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASE SISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKdSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID NO: 59)

[0199] Exemplos de anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis dA divulgação incluem, por exemplo, os anticorpos que se ligam a um alvo, por exemplo, Jagged, Jagged-1, Jagged-2 e/ou ambos Jagged-1 e Jagged-2, e que inclui uma combinação de uma região variável de cadeia pesada e uma região cadeia leve variável que são, ou são derivados de, as sequências variáveis da cadeia leve e variáveis da cadeia pesada mostradas abaixo. Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 60) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSA FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 61) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 62) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYHG QFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 64) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQ FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 67) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc8 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIGRTNPFDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 68) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 69) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc13 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 70) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc16 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 71) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc16 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYYG QFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 72) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc19 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 73) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc19 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQ FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 74) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc21 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 75) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc21 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSA FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 76) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc24 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 77) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc24 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 78) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc26 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 79) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc26 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSA FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 80) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc27 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 81) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc27 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFYG QFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 82) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc28 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 83) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc28 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQ FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 84) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc30 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 85) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc30 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYAKSAAAFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 86) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc31 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 87) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc31 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSA FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 88) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc32 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 89) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc32 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIDPEGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 90) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc37 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 91) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc37 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPHNG QFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 92) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc39 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 93) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc39 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 94) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc40 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 95) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc40 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQ FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 96) Sequência de aminoácidos da cadeia leve variável Lc47 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 97) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável Hc4 7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIDEMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 98) Cadeia Leve Variável 4B2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLDAPPQFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 99) Cadeia Pesada Variável 4B2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSA FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 100) Cadeia Leve Variável 4D11 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 101) Cadeia Pesada Variável 4D11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSAF DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 102) Cadeia Leve Variável 4E7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 103) Cadeia Pesada Variável 4E7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEEMGWQTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 104) Cadeia Leve Variável 4E11 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALDAPLMFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 105) Cadeia Pesada Variável 4E11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIEPMGQLTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSAF DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 106) Cadeia Leve Variável 6B7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 107) Cadeia Pesada Variável 6B7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIDEMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 108) Cadeia Leve Variável 6F8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 109) Cadeia Pesada Variável 6F8 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIDEMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 110)

[0200] Exemplos de anticorpos conjugados e/ou anticorpos ativáveis dA divulgação incluem, por exemplo, os anticorpos que se ligam a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged-1, Jagged-2 e/ou ambos Jagged-1 e Jagged-2, e que incluem uma combinação de uma região de cadeia pesada e uma região de cadeia leve que são, ou são derivados de, as sequências da cadeia pesada e da cadeia leve mostradas abaixo. Sequência da Cadeia Leve 4D11: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKdSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 111) Sequência da Cadeia Pesada 4D11: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSAF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKdYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKdTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 112) Sequência da Cadeia Pesada 4D11v2 EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS SIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKdIGGRSAF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKdYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKdTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 113) Sequência da Cadeia Leve 4D11v2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKdSTYSLSSTLTLXKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 114).

[0201] Os anticorpos ativáveis e composições de anticorpos ativáveis proporcionados aqui contém, pelo menos, um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo (coletivamente referido como AB ao longo da descrição) que se liga especificamente a um alvo, por exemplo, um alvo humano, em que o AB é modificado por uma região de mascaramento (MM).

[0202] Em algumas formas de realização, a região de mascaramento é selecionada para ser utilizada com um anticorpo ou fragmento de anticorpo específico. Por exemplo, regiões de mascaramento apropriadas para serem utilizadas com os anticorpos que se ligam a EGFR incluem as MMs que compreendem a sequência CISPRG (SEQ ID NO: 167). Como forma de exemplos não limitantes, a MM pode incluir uma sequência, tal como a CISPRGC (SEQ ID NO: 497); CISPRGCG (SEQ ID NO: 168); CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 160); CISPRGCPDGPYVM (SEQ ID NO: 169), CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID NO: 170) e CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID NO: 171). Outras regiões de mascaramento apropriadas incluem qualquer uma das máscaras específicas para EGFR divulgadas na Publicação PCT No. WO2010/081173, tais como os exemplos não limitantes, GSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 172); CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 173); CNHHYFYTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 174); ADHVFWGSYGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 175); CHHVYWGHCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 176); CPHFTTTSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 177); CNHHYHYYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 178); CPHVSFGSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 179); CPYYTLSYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 180); CNHVYFGTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 181); CNHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 182); CHHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 183); YNPCATPMCCISPRGCPG (SEQ ID NO: 184); CNHHYFYTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 185); CNHHYHYYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 186); CNHVYFGTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 187); CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 188); CPHFTTTSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 189); CNHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 190); CHHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 191); CPYYTLSYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 192); CPHVSFGSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 193); ADHVFGSWYGCISPRGCG (SEQ ID NO: 194); YNPCATPMCCISPRGCG (SEQ ID NO: 195); CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 196); C(N/P)(H/V/F)(Y/V)(F/W/T/G)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG (SEQ ID NO: 197); CISPRGCGQPIPSVK (SEQ ID NO: 198); CISPRGCTQPYHVSR (SEQ ID NO: 199); e/ou CISPRGCNAVSGLGS (SEQ ID NO: 200).

[0203] As regiões de mascaramento apropriadas para serem utilizadas com os anticorpos que se ligam a um alvo Jagged, por exemplo, Jagged 1 e/ou Jagged 2, incluem, como exemplo não limitante, regiões de mascaramento que incluem uma sequência, tal como QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 496); QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 201); PWCMQRQDFLRCPQP (SEQ ID NO: 202); QLGLPAYMCTFECLR (SEQ ID NO: 203); CNLWVSGGDCGGLQG (SEQ ID NO: 204); SCSLWTSGSCLPHSP (SEQ ID NO: 205); YCLQLPHYMQAMCGR (SEQ ID NO: 206); CFLYSCTDVSYWNNT (SEQ ID NO: 207); PWCMQRQDYLRCPQP (SEQ ID NO: 208); CNLWISGGDCRGLAG (SEQ ID NO: 209); CNLWVSGGDCRGVQG (SEQ ID NO: 210); CNLWVSGGDCRGLRG (SEQ ID NO: 211); CNLWISGGDCRGLPG (SEQ ID NO: 212); CNLWVSGGDCRDAPW (SEQ ID NO: 213); CNLWVSGGDCRDLLG (SEQ ID NO: 214); CNLWVSGGDCRGLQG (SEQ ID NO: 215); CNLWLHGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 216); CNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 217); CTTWFCGGDCGVMRG (SEQ ID NO: 218); CNIWGPSVDCGALLG (SEQ ID NO: 219); CNIWVNGGDCRSFEG (SEQ ID NO: 220); YCLNLPRYMQDMCWA (SEQ ID NO: 221); YCLALPHYMQADCAR (SEQ ID NO: 222); CFLYSCGDVSYWGSA (SEQ ID NO: 223); CYLYSCTDSAFWNNR (SEQ ID NO: 224); CYLYSCNDVSYWSNT (SEQ ID NO: 225); CFLYSCTDVSYW (SEQ ID NO: 226); CFLYSCTDVAYWNSA (SEQ ID NO: 227); CFLYSCTDVSYWGDT (SEQ ID NO: 228); CFLYSCTDVSYWGNS (SEQ ID NO: 229); CFLYSCTDVAYWNNT (SEQ ID NO: 230); CFLYSCGDVSYWGNPGLS (SEQ ID NO: 231); CFLYSCTDVAYWSGL (SEQ ID NO: 232); CYLYSCTDGSYWNST (SEQ ID NO: 233); CFLYSCSDVSYWGNI (SEQ ID NO: 234); CFLYSCTDVAYW (SEQ ID NO: 235); CFLYSCTDVSYWGST (SEQ ID NO: 236); CFLYSCTDVAYWGDT (SEQ ID NO: 237); GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG (SEQ ID NO: 238); GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG (SEQ ID NO: 239); GCNIWLVGGDCRG WIEDSNG (SEQ ID NO: 240); GCNIWANGGDCRGWIDNIDG (SEQ ID NO: 241); GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG (SEQ ID NO: 242); GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG (SEQ ID NO: 243); GGPALCNIWLNGGDCRGWSG (SEQ ID NO: 244); GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG (SEQ ID NO: 245); GQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 246); GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG (SEQ ID NO: 247); GTPGGCNIWANGGDCRGWEG (SEQ ID NO: 248); GASQYCNLWINGGDCRGWRG (SEQ ID NO: 249); GCNIWLVGGDCRPWVEGG (SEQ ID NO: 250); GCNIWAVGGDCRPFVDGG (SEQ ID NO: 251); GCNIWLNGGDCRAWVDTG (SEQ ID NO: 252); GCNIWIVGGDCRPFINDG (SEQ ID NO: 253); GCNIWLNGGDCRPVVFGG (SEQ ID NO: 254); GCNIWLSGGDCRMFMNEG (SEQ ID NO: 255); GCNIWVNGGDCRSFVYSG (SEQ ID NO: 256); GCNIWLNGGDCRGWEASG (SEQ ID NO: 257); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 258); GCNIWLNGGDCRTFVASG (SEQ ID NO: 259); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 260); GFLENCNIWLNGGDCRTG (SEQ ID NO: 261); GIYENCNIWLNGGDCRMG (SEQ ID NO: 262); e/ou GIPDNCNIWINGGDCRYG (SEQ ID NO: 263).

[0204] As regiões de mascaramento apropriadqs para serem utilizadqs com os anticorpos que se ligam a um alvo de interleucina 6, por exemplo, receptor de interleucina 6 (IL-6R), incluem, como exemplo não limitante, regiões de mascaramento que incluem uma sequência tal como QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 264); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 265); QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 266); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 267); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID NO: 268); ESSCVWNYVHIYMDC (SEQ ID NO: 269); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 270); YRTCSWNYVGIFLDC (SEQ ID NO: 271); Y GSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 161); YGSCSWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 272); YGSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 273); YTSCNWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 274); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 275); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 276); WSNCHWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 277); DRSCTWNYVRISYDC (SEQ ID NO: 278); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 279); SRSCIWNYAHIHLDC (SEQ ID NO: 280); SMSCYWQYERIFLDC (SEQ ID NO: 281); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 282); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 283); YKSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 284); YGSCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 285); FSSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 286); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 287); YGSCQWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 288); YRSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 289); NMSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 290); FGPCTWNYARISWDC (SEQ ID NO: 291); XXsCXWXYvhlfXdC (SEQ ID NO: 292); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 163); RDTGGQCRWDYVHIFMDC (SEQ ID NO: 293); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 294); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 295); DGGPAGCSWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 296); AVGPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 297); CTWNYVHIFMDCGEGEGP (SEQ ID NO: 298); GGVPEGCTWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 299); AEVPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 300); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 301); SGASGGCKWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 302); TPGCRWNYVHIFMECEAL (SEQ ID NO: 303); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 304); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID NO: 305); RGACDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 306); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 162); XGafDIPFPAHWvPnT (SEQ ID NO: 307); RGDGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 308); SGVGRDRDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 309); WAGGNDCDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 310); WGDGMDVDIPFPAHWVPVT (SEQ ID NO: 311); AGSGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 312); ESRSGYADIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 313); e/ou RECGRCGDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 314).

[0205] Quando o AB é modificado com uma MM e está na presença do alvo, a ligação específica do AB ao seu alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB não modificado com uma MM ou a ligação específica do AB original ao alvo.

[0206] A Ka do AB modificado com uma MM ao alvo é, de pelo menos, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000000, 50.000, 10 milhões, 50 milhões ou mais, ou entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1,000-100.000, 1,0001.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000 10.000.000, 100.000-1.000.000, ou 100.000-10.000.000 vezes maior do que a Kd do AB não modificado com uma MM ou do AB original ao alvo. Por outro lado, a afinidade de ligação do AB modificado com uma MM ao alvo é, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou maior, ou entre 5-10, 10100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1,000100.000, 1,000-1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, ou 100.000-10.000.000 vezes menor do que a afinidade de ligação do AB não modificado com uma MM ou do AB original ao alvo.

[0207] A constante de dissociação (Kd) da MM ao AB é geralmente maior do que a Kd do AB ao alvo. A Kd da MM ao AB pode ser, pelo menos, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000, ou mesmo, 10.000.000 vezes maior do que a Kd do AB ao alvo. Por outro lado, a afinidade de ligação da MM ao AB é geralmente mais baixa do que a afinidade de ligação do AB ao alvo. A afinidade de ligação da MM ao AB pode ser, pelo menos, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000, ou mesmo, 10.000.000 vezes menor do que a afinidade de ligação do AB ao alvo.

[0208] Quando o AB é modificado com uma MM e está na presença do alvo a ligação específica do AB ao seu alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB não modificado com uma MM ou a ligação específica do AB original ao alvo. Quando comparada com a ligação do AB não modificado com uma MM ou a ligação do AB original ao alvo, a capacidade de AB de se ligar ao alvo quando modificado com uma MM pode ser reduzida em, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e até 100% por pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ou 96 horas, ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 180 dias, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses ou mais quando medida in vivo ou em um ensaio in vitro.

[0209] A MM inibe a ligação do AB ao alvo. A MM se liga ao domínio de ligação ao antígeno do AB e inibe a ligação do AB ao alvo. A MM pode inibir estericamente a ligação do AB ao alvo. A MM pode inibir alostericamente a ligação do AB ao seu alvo. Nestas formas de realização, quando o AB é modificado ou acoplado a uma MM e, na presença de alvo, não existe ligação ou substancialmente nenhuma ligação do AB ao alvo, ou não mais do que 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, ou 50% de ligação do AB ao alvo em comparação com a ligação do AB não modificado com uma MM, o AB original, ou o AB não acoplado a uma MM, ao alvo por, pelo menos, 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ou 96 horas, ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 180 dias, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses ou mais quando medida in vivo ou em um ensaio in vitro.

[0210] Quando um AB é acoplado a ou modificado por uma MM, a MM 'mascara/ encobre' ou de outro modo reduz ou inibe a ligação específica do AB ao alvo. Quando um AB é acoplado a ou modificado por uma MM, tal acoplamento ou modificação pode efetuar uma mudança estrutural, que reduz ou inibe a capacidade de AB de se ligar especificamente ao alvo.

[0211] Um AB acoplado a ou modificado com uma MM pode ser representado pelas seguintes fórmulas (seguindo a ordem de uma região amino (N) terminal a região carboxi (C) terminal): (MM) - (AB) (AB) - (MM) (MM) -L- (AB) (AB) -L- (MM) em que MM é uma região de mascaramento, o AB é um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo, e o símbolo L representa um ligante. Em muitas formas de realização, pode ser desejável introduzir um ou mais ligantes, por exemplo, ligantes flexíveis, na composição, de modo a proporcionar flexibilidade.

[0212] Em certas formas de realização, a MM não é um parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM contém nenhuma ou substancialmente nenhuma homologia com qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% semelhante a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 25% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 20% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 10% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB.

[0213] Em algumas formas de realização, os anticorpos ativáveis incluem um AB que é modificado por uma MM e também inclui uma ou mais regiões cliváveis (CM). Os referidos anticorpos ativáveis apresentam ligação ativável/alternável ao alvo do AB. Os anticorpos ativáveis geralmente incluem um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB), modificado por ou acoplada a uma região de mascaramento (MM) e uma região clivável modificável (CM). Em algumas formas de realização, a CM contém uma sequência de aminoácidos que serve como um substrato para, pelo menos, uma metaloproteinase de matriz de interesse.

[0214] Os elementos dos anticorpos ativáveis são dispostos de modo que a MM e a CM estejam posicionadas para que, em um estado clivado (ou relativamente ativado), e na presença de um alvo, o AB se ligue a um alvo, enquanto que, em um estado não clivado (ou relativamente inativado), na presença do alvo, a ligação específica do AB ao seu alvo é reduzida ou inibida. A ligação do AB ao seu alvo específico pode ser reduzida devido à inibição ou mascaramento da capacidade de AB de se ligar especificamente ao alvo pela MM.

[0215] A Kd do AB modificado com uma MM e uma CM ao alvo é, pelo menos, 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou maior, ou entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 1001.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1,000-100.000, 1,000-1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.0001.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, ou 100.000-10.000.000 vezes maior do que a Kd do AB não modificado com uma MM e uma CM ou do AB original ao alvo. Por outro lado, a afinidade de ligação do AB modificado com uma MM e uma CM ao alvo é, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou maior, ou entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 101.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1,000-100.000, 1,000-1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, ou 100.000-10.000.000 vezes menor do que a afinidade de ligação do AB não modificado com uma MM e uma CM ou do AB original ao alvo.

[0216] Quando o AB é modificado com uma MM e uma CM e está na presença do alvo, mas não na presença de um agente modificador (por exemplo, uma MMP), a ligação específica do AB ao seu alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB não modificado com uma MM e uma CM ou do AB original ao alvo. Quando comparada com a ligação do AB original ou a ligação de um AB não modificado com uma MM e uma CM ao seu alvo, a capacidade de AB de se ligar ao alvo, quando modificado com uma MM e uma CM, pode ser reduzida em, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e até 100% por, pelo menos, 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ou 96 horas ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 180 dias, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses ou mais quando medida in vivo ou em um ensaio in vitro.

[0217] Conforme utilizado aqui, o termo estado clivado refere-se à condição dos anticorpos ativáveis após a modificação da CM por pelo menos uma metaloproteinase de matriz. O termo estado não clivado, conforme utilizado aqui, refere-se à condição dos anticorpos ativáveis na ausência de clivagem da CM por uma MMP. Conforme discutido acima, o termo "anticorpos ativáveis" é utilizado aqui para se referir a um anticorpo ativável tanto no seu estado não clivado (nativo), bem como no seu estado clivado. Será evidente para o técnico no assunto que, em algumas formas de realização, um anticorpo ativável clivado pode crecer de uma MM, devido à clivagem da CM pela protease, resultando na liberação, pelo menos, da MM (por exemplo, onde a MM não está unida aos anticorpos ativáveis por uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação dissulfeto entre os resíduos de cisteína)).

[0218] Entende-se por ativável ou alternável quando o anticorpo ativável apresenta um primeiro nível de ligação a um alvo, quando encontra-se em um estado inibido, mascarado/ encoberto ou não clivado (isto é, uma primeira conformação), e um segundo nível de ligação ao alvo no estado desinibido, desmascarado e/ou clivado (isto é, uma segunda conformação), em que o segundo nível de ligação ao alvo é maior do que o primeiro nível de ligação. Em geral, o acesso do alvo ao AB do anticorpo ativável é maior na presença de um agente de clivagem capaz de clivar a CM, do que na ausência de um referido agente de clivagem. Assim, quando o anticorpo ativável está no estado não clivado, o AB é inibido de se ligar ao alvo e pode ser mascarado para não se ligar ao alvo (isto é, a primeira conformação é tal que o AB não pode se ligar ao alvo), e, no estado clivado, o AB não é inibido ou é desmascarado para se ligar ao alvo.

[0219] A CM e o AB dos anticorpos ativáveis são selecionados de modo que o AB represente uma região de ligação a um determinado alvo, e a CM represente um substrato para uma MMP que está colocalizada com o alvo em um local de tratamento ou local de diagnóstico em um indivíduo. Os anticorpos ativáveis descritos aqui possuem utilidade particular, por exemplo, quando uma MMP capaz de clivar um sítio na CM está presente em níveis relativamente mais elevados em tecidos contendo alvo de um local de tratamento ou local de diagnóstico do que no tecido de locais não relacionados ao tratamento (por exemplo, em tecido saudável).

[0220] Em algumas formas de realização, os anticorpos ativáveis possuem toxicidade e/ou efeitos colaterais adversos reduzidos que poderiam resultar da ligação do AB em locais não relacionados ao tratamento se o AB não fosse mascarado ou, de alguma forma, inibido de se ligar ao alvo.

[0221] Em geral, um anticorpo ativável pode ser concebido através da seleção de um AB de interesse e da construção do restante do anticorpo ativável de modo que, quando rígido conformacionalmente, a MM proporcione o mascaramento do AB ou reduza a ligação do AB ao seu alvo. Critérios de desenho estrutural podem ser levados em conta para proporcionar esta característica funcional.

[0222] Os anticorpos ativáveis que exibem um fenótipo alternável de uma faixa dinâmica desejada para se ligar ao alvo em uma conformação inibida versus uma conformação desinibida são proporcionados. A faixa dinâmica geralmente refere-se a uma razão entre (a) um nível máximo detectado de um parâmetro sob um primeiro conjunto de condições e (b) um valor mínimo detectado daquele parâmetro sob um segundo conjunto de condições. Por exemplo, no contexto de um anticorpo ativável, a faixa dinâmica refere-se à razão entre (a) um nível máximo detectado da proteína alvo que se liga a um anticorpo ativável na presença de uma MMP capaz de clivar a CM do anticorpo ativável e (b) um nível mínimo detectado da proteína alvo que se liga a um anticorpo ativável na ausência da protease. A faixa dinâmica de um anticorpo ativável pode ser calculada como a razão entre a constante de equilíbrio de dissociação de um tratamento com agente de clivagem de anticorpo ativável (por exemplo, enzima) e a constante de equilíbrio de dissociação do tratamento com agente de clivagem de anticorpos ativáveis. Quanto maior a faixa dinâmica de um anticorpo ativável, melhor o fenótipo alternável do anticorpo ativável. Os anticorpos ativáveis com valores de faixa dinâmica relativamente superiores (por exemplo, maior do que 1) apresentam fenótipos alternáveis mais desejáveis de tal modo que a ligação da proteína alvo pelos anticorpos ativáveis ocorre em uma maior escala (por exemplo, ocorre predominantemente) na presença de um agente de clivagem (por exemplo, enzima) capaz de clivar a CM dos anticorpos ativáveis do que na ausência de um agente de clivagem.

[0223] Os anticorpos ativáveis podem ser proporcionados em uma variedade de conformações estruturais. Exemplos de fórmulas para anticorpos ativáveis são proporcionados abaixo. Contempla-se, especificamente, que a ordem da região N- terminal a região C-terminal do AB, MM e CM pode ser invertida em um anticorpo ativável. Contempla-se, especificamente, também que a CM e a MM podem se sobrepor na sequência de aminoácidos, de tal modo que a CM esteja contida dentro da MM, por exemplo.

[0224] Por exemplo, os anticorpos ativáveis pode ser representado pela seguinte fórmula geral (na ordem de uma região amino (N-) terminal para a região carboxila (C-) terminal: (MM) - (CM) - (AB) (AB) - (CM) - (MM) em que MM é uma região de mascaramento, CM é uma região clivável, e AB é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Deve-se obeservar que, embora a MM e a CM sejam indicadas como componentes distintos nas fórmulas acima, em todos os exemplos de formas de realização (incluindo as fórmulas) descritos aqui, está contemplado que as sequências de aminoácidos da MM e da CM podem se sobrepor, por exemplo, de tal modo que a CM esteja completa ou parcialmente contida dentro da MM. Além disso, as fórmulas mencionadas acima proporcionam sequências de aminoácidos adicionais que podem ser posicionadas na região N- terminal ou região C-terminal dos elementos dos anticorpos ativáveis.

[0225] Em certas formas de realização, a MM não é um parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM contém nenhuma ou substancialmente nenhuma homologia com qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou semelhante a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural da AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 25% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 20% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB. Em algumas formas de realização, a MM não é mais do que 10% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB.

[0226] Em muitas formas de realização, pode ser desejável introduzir um ou mais ligantes, por exemplo, ligantes flexíveis, no construto do anticorpo ativável de modo a proporcionar flexibilidade em uma ou mais das junções MM-CM, das junções CM-AB, ou ambas. Por exemplo, o AB, a MM, e/ou a CM podem não conter um número suficiente de resíduos (por exemplo, Gly, Ser, Asp, Asn, especialmente Gly e Ser, particularmente, Gly) para proporcionar a flexibilidade desejada. Sendo assim, o fenótipo alternável de tais construtos de anticorpo ativável pode beneficiar a introdução de um ou mais aminoácidos para originar um ligante flexível. Além disso, como descrito abaixo, em que o anticorpo ativável é fornecido como um construto conformacionalmente rígido, um ligante flexível pode ser operacionalmente inserido para facilitar a formação e a manutenção de uma estrutura cíclica no anticorpo ativável não clivado.

[0227] Por exemplo, em certas formas de realização, um anticorpo ativável compreende uma das seguintes fórmulas (onde a fórmula abaixo representa uma sequência de aminoácidos em qualquer direção N- a C-terminal ou direção C- a N- terminal): (MM)-L1-(CM)-(AB) (MM)-(CM)-L2-(AB) (MM)-L1-(CM)-L2-(AB) em que MM, CM, e AB são como definidos acima; em que cada L1 e L2 está independente e opcionalmente presente ou ausente, e é o mesmo ligante flexível ou diferente que inclui, pelo menos, 1 aminoácido flexível (por exemplo, Gly). Além disso, as fórmulas mencionadas acima fornecem as sequências de aminoácidos adicionais que podem ser posicionadas na região N-terminal ou região C-terminal dos elementos dos anticorpos ativáveis. Exemplos incluem, mas não se limitam a, as regiões direcionadas (por exemplo, um ligante para um receptor de uma célula presente em um tecido alvo), e regiões que aumentam a meia-vida sérica (por exemplo, polipetídeos que se ligam a proteínas séricas, tais como a imunoglobulina (por exemplo, IgG) ou albumina do soro (por exemplo, albumina de soro humano (HAS)).

[0228] A CM é especificamente clivada por, pelo menos, uma MMP, a uma velocidade de cerca de 0,001 x 104 1,500 M-1S-1 ou, pelo menos, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10 , 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1.000, 1250, ou 1500 x 104 M-1S-1.

[0229] Para a clivagem específica por uma enzima, é realizado o contato entre a enzima e a CM. Quando o anticorpo ativável compreende um AB acoplado a uma MM e uma CM está na presença do alvo e atividade enzimática adequada, a CM pode ser clivada. Atividade enzimática adequada pode referir-se à capacidade da enzima em fazer contato com a CM e realizar a clivagem. Imagina-se facilmente que uma enzima pode estar na vizinhança da CM, mas é incapaz de clivar por causa de outros fatores celulares ou da modificação proteica da enzima.

[0230] Os ligantes adequados para utilização nas composições descritas aqui são geralmente aqueles que fornecem flexibilidade ao AB modificado ou aos anticorpos ativáveis, a fim de facilitar a inibição da ligação do AB ao alvo. Tais ligantes são geralmente referidos como ligantes flexíveis. Os ligantes adequados podem ser facilmente selecionados e podem ter qualquer um de diferentes comprimentos adequados, tais como de um aminoácido (por exemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, e podem ter 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 aminoácidos de comprimento.

[0231] Exemplos de ligantes flexíveis incluem os polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, e outros ligantes flexíveis conhecidos no estado da arte. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativamente não estruturadas e, portanto, podem ser capazes de servir como uma ligação neutra entre os componentes. A glicina acessa significativamente mais espaço phi-psi do que até mesmo a alanina, e é muito menos restrita do que resíduos com cadeias laterais mais longas (vide Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Exemplos de ligantes flexíveis incluem, mas não se limitam a, a Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 3), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4), Ser-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 5), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6), Gly-Gly- Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 7), Gly-Ser-Ser-Ser -Gly (SEQ ID NO: 8), e similares. O técnico no assunto reconhecerá que o desenho de um anticorpo ativável pode incluir ligantes que são total ou parcialmente flexíveis, de tal modo que o ligante pode incluir um ligante flexível, bem como uma ou mais regiões que conferem uma estrutura menos flexível para gerar uma estrutura desejada de anticorpos ativáveis .

[0232] Em algumas formas de realização, os anticorpos ativáveis descritos aqui, também incluem um agente conjugado ao anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, o agente conjugado é um agente terapêutico, tal como um anti-inflamatório e/ou um agente antineoplásico. Em tais formas de realização, o agente é conjugado a uma região carboidrato do anticorpo ativável, por exemplo, em algumas formas de realização, onde a região carboidrato encontra-se fora da região de ligação ao antígeno do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno no anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado a um grupo sulfidrila do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno no anticorpo ativável.

[0233] Em algumas formas de realização, o agente é um agente citotóxico, tal como uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado) .

[0234] Em algumas formas de realização, o agente é uma região detectável tal como, por exemplo, uma etiqueta/ marcador ou outro marcador. Por exemplo, o agente é ou inclui um aminoácido radiomarcado, uma ou mais regiões biotinila que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos), um ou mais radioisótopos ou radionuclídeos, um ou mais marcadores fluorescentes, um ou mais marcadores enzimáticos, e/ou um ou mais agentes quimioluminescentes. Em algumas formas de realização, as regiões detectáveis são ligadas por moléculas espaçadoras.

[0235] A divulgação também se refere aos imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico, tal como uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (por exemplo, um radioconjugado). Agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, as dolastatinas e derivados das mesmas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, DMAF, DMAE). Por exemplo, o agente é o monometil auristatina E (MMAE) ou o monometil auristatina D (MMAD). Em algumas formas de realização, o agente é um agente selecionado a partir do grupo listado na Tabela 3. Em algumas formas de realização, o agente é uma dolastatina. Em algumas formas de realização, o agente é uma auristatina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é auristatina E ou um derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina E (MMAE). Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina D (MMAD). Em algumas formas de realização, o agente é um derivado de maitansinóide ou maitansinóide. Em algumas formas de realização, o agente é DM1 ou DM4. Em algumas formas de realização, o agente é uma duocarmicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma caliqueamicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma pirrolbenzodiazepina.

[0236] Em algumas formas de realização, o agente é ligado ao AB utilizando- se um ligante de caproil-valina-citrulina maleimida ou um ligante de PEG-valina- citrulina maleimida. Em algumas formas de realização, o agente é ligado ao AB utilizando-se um ligante de caproil-valina-citrulina maleimida. Em algumas formas de realização, o agente é ligado ao AB utilizando-se um ligante de PEG-valina-citrulina maleimida. Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina D (MMAD) ligado ao AB utilizando-se um ligante de PEG-valina-citrulina-para- aminobenziloxicarbonila maleimida, e este construto de carga de ligante (linker payload construct) é referido aqui como "vc-MMAD". Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina E (MMAE), ligado ao AB utilizando-se uma ligante de PEG-valina-citrulina-para-aminobenziloxicarbonila maleimida, e este construto de carga de ligante é referido aqui como "vc-MMAE". As estruturas de vc- MMAD e vc-MMAE são mostradas abaixo: vc-MMAD: vc-MMAE:

[0237] As toxinas enzimaticamente ativas e os fragmentos das mesmas que podem ser utilizados incluem a cadeia A da toxina diftérica, fragmentos ativos não ligantes da toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Dentre os exemplos, incluem-se o 212Bi, 131I, 131In, 90Y, e 186Re.

[0238] Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são produzidos utilizando-se uma variedade de agentes bifuncionais de acoplamento à proteína, tais como N-succinimidil-3-(2-piridiltio) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como, adipimidato de dimetila HCL), ésteres ativos (tais como, suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como, glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis- diazônio (tal como, bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como, 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis-ativos (tais como, 1,5-difluor- 2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:. 1098 (1987). O ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triaminopentacético marcado com Carbono-14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. (vide WO94/11026).

[0239] A Tabela 3 lista alguns dos exemplos de agentes farmacêuticos que podem ser utilizados na presente divulgação, sem ser, contudo, uma lista completa. TABELA 3: Exemplos de Agentes Farmacêuticos para Conjugação Agentes Citotóxicos

[0240] Os técnicos no assunto reconhecerão que uma grande variedade de possíveis regiões pode ser acoplada aos anticorpos resultantes da divulgação. (Vide, por exemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse e R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, Nova Iorque, (1989), cujo conteúdo total é incorporado aqui por referência).

[0241] O acoplamento pode ser realizado por qualquer reação química que ligue as duas moléculas, desde que o anticorpo e a outra região mantenham as suas respectivas atividades. Esta ligação pode incluir muitos mecanismos químicos, por exemplo, ligação covalente, ligação por afinidade, intercalação, ligação coordenada e complexação. Em algumas formas de realização, a ligação é, no entanto, a ligação covalente. A ligação covalente pode ser conseguida pela condensação direta das cadeias laterais existentes ou pela incorporação de moléculas ponte externas. Muitos agentes de ligação bivalentes ou polivalentes são úteis no acoplamento de moléculas proteicas, tais como os anticorpos da presente divulgação, a outras moléculas. Por exemplo, agentes de acoplamento representativos podem incluir os compostos orgânicos, tais como os tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, di-isocianatos, glutaraldeido, diazobenzenos e diaminas de hexametileno. Esta listagem das várias classes de agentes de acoplamento conhecidos no estado da arte não pretende ser completa, mas, ao invés disso, é um exemplo dos agentes de acoplamento mais comuns. (Vide Killen e Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); e Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).

[0242] Em algumas formas de realização, além das composições e métodos proporcionados aqui, o anticorpo conjugado ativável também pode ser modificado para a conjugação sítio-específica por meio das sequências de aminoácidos modificadas inseridas ou, de outro modo, incluídas na sequência do anticorpo ativável. Estas sequências de aminoácidos modificadas são concebidas de modo a permitir a colocação controlada e/ou dosagem do agente conjugado dentro de um anticorpo conjugado ativável. Por exemplo, o anticorpo ativável pode ser modificado de modo a incluir substituições de cisteína nas posições das cadeias leves e pesadas, as quais fornecem grupos tióis reativos e não impactam negativamente na conformação e na montagem da proteína, nem alteram a ligação ao antígeno. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável pode ser manipulado de modo a não incluir ou introduzir um ou mais resíduos de aminoácidos não-naturais dentro do anticorpo ativável para proporcionar sítios adequados para conjugação. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável pode ser manipulado de modo a incluir, ou de outra forma introduzir, enzimaticamente sequências peptídicas ativáveis dentro da sequência do anticorpo ativável.

[0243] Os ligantes adequados encontram-se descritos na literatura. (Vide, por exemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44: 201-208 (1984) descreve o uso de MBS (éster M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Vide também, Patente US No. 5,030,719, que descreve o uso do derivado de acetil hidrazida halogenado acoplado a um anticorpo por meio de um oligopeptídeo de ligação. Em algumas formas de realização, os ligantes adequados incluem: (i) EDC cloridrato de (1-etil-3- (3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil- alfa-(2-pridilditio)-tolueno (Pierce Chem Co., Cat (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6- [3-(2-piridilditio) propionamida] hexanoato (Pierce Chem Co., Cat # 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6[3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem Co. # 2165-L); e (v) sulfo-NHS. (N-hidroxisulfosuccinimida: Pierce Chem Co., Cat # 24510) conjugada a EDC. Ligantes adicionais incluem, mas não se limitam a, SMCC, Sulfo-SMCC, SPDB, ou sulfo-SPDB.

[0244] Os ligantes acima descritos contêm componentes que têm diferentes atributos, gerando, assim, conjugados com diferentes propriedades físico-químicas. Por exemplo, os ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquila são mais estáveis do que os ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Ligantes contendo NHS-éster são menos solúveis do que os ésteres sulfo-NHS. Além disso, o ligante SMPT contém uma ligação dissulfeto estericamente impedida, e pode formar conjugados com o aumento da estabilidade. Ligações dissulfeto, são, em geral, menos estáveis do que outras ligações uma vez que a ligação dissulfeto é clivada in vitro, o que resulta em menos conjugados disponíveis. Sulfo-NHS, em particular, pode aumentar a estabilidade de acoplamentos via carbodiimida. Os acoplamentos via carbodiimida (tais como, EDC), quando utilizados em conjunto com sulfo-NHS, formam ésteres que são mais resistentes à hidrólise do que só a reação de acoplamento via carbodiimida.

[0245] Em algumas formas de realização, os ligantes são cliváveis. Em algumas formas de realização, os ligantes não são cliváveis. Em algumas formas de realização, dois ou mais ligantes estão presentes. Os dois ou mais ligantes são todos iguais, isto é, cliváveis ou não cliváveis, ou os dois ou mais ligantes são diferentes, isto é, pelo menos, um clivável e, pelo menos, um não clivável.

[0246] A presente divulgação utiliza vários métodos para ligar os agentes aos ABs: (a) ligação aos grupos carboidrato do AB, ou (b) ligação aos grupos sulfidrila do AB, ou (c) ligação aos grupos amina do AB, ou (d) ligação aos grupos carboxilato do AB. De acordo com a divulgação, os ABs podem ser covalentemente ligados a um agente através de um ligante intermediário que tem pelo menos dois grupos reativos, um que reage com o AB e outro que reage com o agente. O ligante, que pode incluir qualquer composto orgânico compatível, pode ser escolhido de tal modo que a reação com o AB (ou agente) não afeta negativamente a reatividade e selectividade do AB. Além disso, a ligação do ligante ao agente não pode destruir a atividade do agente. Os ligantes adequados para a reação com os anticorpos oxidados ou fragmentos de anticorpos oxidados incluem aqueles contendo uma amina selecionada a partir do grupo composto por grupos amina primária, amina secundária, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida e tiosemicarbazida. Tais grupos funcionais reativos podem existir como parte da estrutura do ligante, ou podem ser introduzidos pela modificação química adequada dos ligantes que não contêm tais grupos.

[0247] De acordo com a presente divulgação, os ligantes adequados para ligação aos ABs reduzidos incluem aqueles que possuem certos grupos reativos capazes de reagirem com um grupo sulfidrila de um anticorpo reduzido ou fragmento. Tais grupos reativos incluem, mas não se limitam a: grupos haloalquil reativos (incluindo, por exemplo, grupos haloacetila), grupos p-mercuribenzoatos e grupos capazes de realizar reações de adição do tipo Michael (incluindo, por exemplo, as maleimidas e os grupos do tipo descrito por Mitra e Lawton, 1979, J. Amer Chem Soc 101: 3097-3110).

[0248] De acordo com a presente divulgação, os ligantes adequados que não se ligam aos Abs oxidados nem reduzidos incluem aqueles que possuem certos grupos funcionais capazes de reagirem com os grupos amino primário presentes nos resíduos de lisina não modificados no Ab. Tais grupos reativos incluem, mas não se limitam a, ésteres NHS carboxílicos ou carbônicos, ésteres sulfo-NHS carboxílicos ou carbônicos, ésteres 4-nitrofenil carboxílicos ou carbônicos, ésteres pentafluorofenil carboxílicos ou carbônicos, acil imidazois, isocianatos, e isotiocianatos.

[0249] De acordo com a presente divulgação, os ligantes adequados que não se ligam aos Abs oxidados nem reduzidos incluem aqueles que possuem certos grupos funcionais capazes de reagirem com os grupos ácido carboxílicos presentes nos resíduos de aspartato ou glutamato no Ab que foram ativados com reagentes adequados. Reagentes de ativação adequados incluem EDC, com ou sem adição de NHS ou sulfo-NHS, e outros agentes de desidratação utilizados para a formação de carboxamida. Nestes casos, os grupos funcionais presentes nos ligantes adequados incluiriam as aminas primárias e secundárias, hidrazinas, hidrazidas, e hidroxilaminas.

[0250] O agente pode ser ligado ao ligante antes ou depois de o ligante ser fixado ao AB. Em certas aplicações, pode ser desejável primeiro produzir um intermediário AB-ligante, em que o ligante está livre de um agente associado. Dependendo da aplicação em particular, um agente específico pode então ser covalentemente ligado ao ligante. Em algumas formas de realização, a AB é primeiro ligado a MM, CM e ligantes associados e, em seguida, ligado ao ligante para efeitos de conjugação.

[0251] Ligantes Ramificados: Em formas de realização específicas, ligantes ramificados que possuem vários sítios de ligação de agentes são utilizados. Para ligantes de múltiplos sítios, uma única ligação covalente a um AB resultaria em um intermediário AB-ligante capaz de ligar um agente a diversos sítios. Os sítios podem ser grupos aldeído ou sulfidrila ou qualquer sítio químico ao qual os agentes podem ser ligados.

[0252] Em algumas formas de realização, a elevada atividade específica (ou proregiões maiores entre agentes e AB) pode ser obtida pela ligação de um ligante de sítio único a uma pluralidade de sítios em AB. Esta pluralidade de sítios pode ser introduzida em AB por meio de qualquer um dos dois métodos. Em primeiro lugar, podem ser gerados múltiplos grupos aldeído e/ou grupos sulfidrila no mesmo AB. Em segundo lugar, pode-se anexar a um aldeído ou sulfidrila do AB um "ligante ramificado" com múltiplos sítios funcionais para a ligação subsequente aos ligantes. Os sítios funcionais do ligante ramificado ou ligante de múltiplos sítios podem ser os grupos aldeído ou sulfidrils, ou pode ser qualquer sítio químico aos qual os ligantes podem ser ligados. Atividades específicas ainda mais elevadas podem ser obtidas pela combinação destas duas abordagens, isto é, ligar os ligantes de múltiplos sítios a vários locais no AB.

[0253] Ligantes Cliváveis: Ligantes peptídicos que são suscetíveis à clivagem por enzimas do sistema complemento, tais como, mas não se limitando a, a uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual, tripsina, plasmina ou outra enzima com atividade proteolítica pode ser utilizada em uma forma de realização da presente divulgação. De acordo com um método da presente invenção, um agente se encontra ligado através de um ligante suscetível à clivagem por complemento. O anticorpo é selecionado a partir de uma classe que pode ativar o complemento. O conjugado anticorpo-agente, assim, ativa a cascata do complemento e libera o agente no sítio alvo. De acordo com outro método da presente invenção, um agente se encontra ligado através de um ligante susceptível à clivagem pelas enzimas que possuem uma atividade proteolítica, tal como uma uroquinase, um ativador de plasminogênio tecidual, plasmina, ou tripsina. Estes ligantes cliváveis são úteis em anticorpos conjugados ativáveis que incluem uma toxina extracelular, por exemplo, como exemplo não limitante, qualquer uma das toxinas extracelulares mostradas na Tabela 3.

[0254] Exemplos não limitantes de sequências de ligante clivável são proporcionados na Tabela 4. TABELA 4: Exemplos de sequências de ligantes para conjugação

[0255] Além disso, os agentes podem ser ligados através das ligações dissulfeto (por exemplo, as ligações dissulfeto em uma molécula de cisteína) ao AB. Uma vez que muitos tumores liberam naturalmente elevados níveis de glutationa (um agente redutor), isto pode reduzir as ligações dissulfeto com a subsequente liberação do agente no sítio de entrega. Em certas formas de realização específicas, o agente redutor que modificaria uma CM, modificaria também o ligante do anticorpo conjugado ativável.

[0256] Espaçadores e Elementos Cliváveis: Em algumas formas de realização, pode ser necessário construir o ligante de modo a otimizar o espaçamento entre o agente e o AB do anticorpo ativável. Pode-se obter através da utilização de um ligante de estrutura geral: W - (CH2)n - Q em que W é --NH--CH2-- ou ou --CH2--; Q é um aminoácido, um peptídeo; e n é um número inteiro de 0 a 20.

[0257] Em algumas formas de realização, o ligante pode compreender um elemento espaçador e um elemento clivável. O elemento espaçador serve para posicionar o elemento clivável fora do núcleo do AB, de tal modo que o elemento clivável esteja mais acessível para a enzima responsável pela clivagem. Alguns dos ligantes ramificados descritos acima podem servir como elementos espaçadores.

[0258] Ao longo desta discussão, deverá ser entendido que a ligação do ligante ao agente (ou do elemento espaçador ao elemento clivável, ou elemento clivável ao agente) não precisa ser um determinado modo de ligação ou reação. Qualquer reação que produza um produto com estabilidade e compatibilidade biológicas adequadas é aceitável.

[0259] Complemento Sérico e Seleção de Ligantes: De acordo com um método da presente invenção, quando se deseja a liberação de um agente, um AB, que é um anticorpo de uma classe que pode ativar o complemento, será utilizado. O conjugado resultante mantém tanto a capacidade de se ligar ao antígeno quanto de ativar a cascata do complemento. Assim, de acordo com esta forma de realização da presente invenção, um agente está associado a uma das extremidades do ligante clivável ou elemento clivável, e a outra extremidade do grupo ligante é ligada a um sítio específico no AB. Por exemplo, se o agente tem um grupo hidroxi ou um grupo amina, ele pode ser ligado adequadamente à região carboxi terminal de um peptídeo, aminoácido ou outro ligante escolhido através de uma ligação éster ou amida, respectivamente. Por exemplo, tais agentes podem ser ligados ao peptídeo de ligação através de uma reação via carbodiimida. Se o agente contém grupos funcionais que possam interferir com a ligação ao ligante, estes grupos funcionais interferentes podem ser bloqueados antes da ligação e desbloqueados quando o produto conjugado ou intermediário for produzido. O terminal oposto ou amina do ligante é então usado diretamente ou após a modificação adicional para se ligar a um AB que é capaz de ativar o complemento.

[0260] Os ligantes (ou elementos espaçadores dos ligantes) podem possuir qualquer comprimento desejado, sendo que uma de suas extremidades pode ser ligada covalentemente aos sítios específicos no AB do anticorpo ativável. E a outra extremidade do ligante ou elemento espaçador pode ser ligada a um aminoácido ou peptídeo de ligação.

[0261] Assim, quando estes conjugados se ligam ao antígeno na presença de complemento, a ligação amida ou éster que liga o agente ao ligante vai ser clivada, resultando na liberação do agente na sua forma ativa. Estes conjugados, quando administrados a um indivíduo, realizarão a entrega e a liberação do agente no sítio alvo, e são particularmente eficazes para a entrega in vivo de agentes farmacêuticos, antibióticos, antimetabólitos, agentes antiproliferativos e similares, tais como, mas não se limitando a, os apresentados na Tabela 3.

[0262] Ligantes para Liberação sem a Ativação do Complemento: Também em outra aplicação de entrega dirigida, a liberação do agente sem a ativação do complemento é desejada, uma vez que a ativação da cascata do complemento, em última instância, irá provocar a lise da célula alvo. Assim, esta abordagem é útil quando a entrega e a liberação do agente são realizadas sem matar a célula alvo. Este é o objetivo quando a entrega de mediadores celulares, tais como hormônios, enzimas, corticosteroides, neurotransmissores, genes ou enzimas às células alvo é desejada. Estes conjugados podem ser preparados através da ligação do agente a um Ab que não é capaz de ativar o complemento através de um ligante que é ligeiramente suscetível à clivagem por proteases séricas. Quando este conjugado é administrado a um indivíduo, complexos de antígeno-anticorpo se formarão rapidamente ao passo que a clivagem do agente irá ocorrer lentamente, resultando assim na liberação do composto no sítio alvo.

[0263] Agentes Bioquímicos de Ligação Cruzada: Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável pode ser conjugado a um ou mais agentes terapêuticos que utilizam determinados agentes bioquímicos de ligação cruzada. Os reagentes de ligação cruzada formam pontes moleculares que unem grupos funcionais de duas moléculas diferentes. Para realizar a ligação de duas proteínas diferentes em etapas, podem ser utilizados agentes de ligação cruzada heterobifuncionais que eliminam a formação de homopolímero indesejada.

[0264] Ligantes peptidil cliváveis por proteases lisossômicas também são úteis, por exemplo, Val-Cit, Val-Ala ou outros dipeptídeos. Além disso, podem ser utilizados ligantes ácido-lábeis cliváveis em ambiente lisossomal de baixo pH, por exemplo: éter de bis-sialila. Outros ligantes adequados incluem substratos catepsina-lábeis, particularmente aqueles que demonstram uma função ótima em pH ácido.

[0265] Exemplos de agentes de ligação cruzada heterobifuncionais estão listados na Tabela 5. TABELA 5: Exemplos de agentes de ligação cruzada heterobifuncionais

[0266] Ligantes Não Cliváveis ou Ligação Direta: Em algumas formas de realização da divulgação, o conjugado pode ser desenhado de modo que o agente seja entregue no alvo, mas não liberado. Isto pode ser obtido por meio da ligação de um agente a um AB, quer diretamente ou por um ligante não clivável.

[0267] Estes ligantes não cliváveis podem incluir aminoácidos, peptídeos, D- aminoácidos ou outros compostos orgânicos que podem ser modificados de forma a incluir grupos funcionais que podem subsequentemente ser utilizados na ligação aos ABs pelos métodos descritos aqui. Uma fórmula geral para um ligante orgânico pode ser W - (CH2)n - Q em que W é --NH--CH2-- ou ou --CH2--; Q é um aminoácido, um peptídeo; e n é um número inteiro de 0 a 20.

[0268] Conjugados Não Cliváveis: Em algumas formas de realização, um composto pode ser ligado aos ABs que não ativam o complemento. Ao utilizar os ABs que são incapazes de ativar o complemento, esta ligação pode ser realizada utilizando-se ligantes que são suscetíveis à clivagem por complemento ativado ou utilizando-se ligantes que não são suscetíveis à clivagem por complemento ativado.

[0269] Os anticorpos divulgados aqui também podem ser formulados como imunolipossomas. Os lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos no estado da arte, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); e Patente US Nos. 4,485,045 e 4,544,545. Os lipossomas com tempo de circulação aumentado são revelados na Patente US No. 5,013,556.

[0270] Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol, e fosfatidiletanolamina derivada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudidos através de filtros com tamanho de poro definido para se obter lipossomas com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab' do anticorpo da presente divulgação podem ser conjugados com os lipossomas, conforme descrito em Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) por meio de uma reação de troca de dissulfeto.

DEFINIÇÕES:

[0271] Salvo definição em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados em conjunto com a presente divulgação devem ter os significados que são comumente entendidos pelos técnicos no asunto. O termo "um" entidade ou "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessas entidades. Por exemplo, um composto refere-se a um ou mais compostos. Como tal, os termos "um", "uma", "um/a ou mais" e "pelo menos um/a" podem ser utilizados alternadamente. Além disso, a menos que indicado pelo contexto, os termos no singular devem incluir os plurais e os termos no plural incluem o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e de tecidos, biologia molecular, e química de proteínas e oligo- ou polinucleotídeos e hibridação descritos aqui são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados no estado da arte. São utilizadas técnicas padrão para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, e cultura de tecidos e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como normalmente realizadas no estado da arte ou como descritas aqui. As técnicas e procedimentos acima são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos no estado da arte e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo. Vide, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: (2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) A Laboratory Manual. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos e as técnicas de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descrita aqui são aquelas bem conhecidas e comumente realizadas no estado da arte. São utilizadas técnicas padrão para as sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e entrega e tratamento de pacientes.

[0272] Como utilizados,de acordo com a presente divulgação, os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

[0273] Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpo" refere-se às moléculas de imunoglobulina e regiões imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente (imunorreage com) a um antígeno. Entende-se por "ligar-se especificamente" ou "imunorreagir com" ou "ligar imunoespecificamente" que o anticorpo reage com um ou mais determinantes antigênicos do antígeno desejado e não reage com outros polipetídeos ou liga-se com uma afinidade muito mais baixa (Kd > 10-6). Os anticorpos incluem, mas não se limitam a, o anticorpo policlonal, monoclonal, quimérico, de domínio, cadeia única, fragmentos Fab, F(ab')2, scFv e uma biblioteca de expressão de Fab.

[0274] A unidade estrutural básica do anticorpo é conhecida por compreender um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par possuindo uma cadeia "leve" (cerca de 25 KDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 KDa). A região amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. A região carboxi- terminal de cada cadeia define uma região constante primeiramente responsável pela função efetora. Em geral, as moléculas de anticorpo obtidas a partir de seres humanos referem-se a qualquer uma das classes IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que diferem umas das outras pela natureza da cadeia pesada presente na molécula. Algumas classes também posseum subclasses, tais como, o IgG1, IgG2, e outros. Além disso, em seres humanos, a cadeia leve pode ser uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda.

[0275] O termo "anticorpo monoclonal" (mAb) ou "composição de anticorpo monoclonal", conforme utilizado aqui, refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie molecular da molécula de anticorpo constituída por um único produto de gene de cadeia leve e um único produto do gene de cadeia pesada. Em particular, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo monoclonal são idênticas em todas as moléculas da população. O mAb contêm um sítio de ligação ao antígeno capaz de imunorreagir com um determinado epítopo do antígeno, caracterizado por uma afinidade única de ligação a ele.

[0276] O termo "região de ligação" ou "sítio de ligação ao antígeno" refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação ao antígeno. O sítio de ligação ao antígeno é formado por resíduos de aminoácido das regiões variáveis N-terminal ("V") das cadeias pesada ("H") e leve ("L"). Três extensões altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve, referida como "regiões hipervariáveis," estão interpostas entre os trechos flanqueadores mais conservados, conhecidos como "regiões estruturais/ arcabouço" ou "FR - framework regions". Assim, o termo "FR" refere-se às sequências de aminoácidos que são naturalmente encontrados entre e adjacentes às regiões hipervariáveis nas imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada estão dispostas umas em relação às outras no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno. A superfície de ligação ao antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias leve e pesada são referidas como "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". A atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).

[0277] Conforme utilizado aqui, o termo "epítopo" inclui qualquer determinante proteico capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina, um scFv, ou um receptor de células T. O termo "epítopo" inclui qualquer determinante proteico capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Os determinantes epitópicos consistem normalmente em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e geralmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Por exemplo, os anticorpos podem ser criados contra os peptídeos N-terminais ou C- terminais de um polipeptídeo. Diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação é < 1 μM; em algumas formas de realização, < 100 nM e, em algumas formas de realização, < 10 nM.

[0278] Conforme utilizado aqui, os termos "ligação específica", "ligação imunológica", e "propriedades de ligação imunológica" referem-se às interações não- covalentes do tipo que ocorrem entre uma molécula de imunoglobulina e um antígeno ao qual a imunoglobulina é específica . A força ou afinidade das interações de ligação imunológica podem ser expressas em termos da constante de dissociação (Kd) da interação, onde um menor Kd representa uma maior afinidade. As propriedades de ligação imunológica de polipetídeos selecionados podem ser quantificadas utilizando-se métodos bem conhecidos no estado da arte. Tal método envolve medir as velocidades de formação e dissociação do complexo sítio de ligação ao antígeno/antígeno, em que estas velocidades dependem das concentrações dos parceiros do complexo, da afinidade da interação, e dos parâmetros geométricos que influenciam igualmente a velocidade em ambas as direções. Deste modo, tanto a "constante de velocidade de associação" (Kon) quanto a "constante de velocidade de dissociação" (Koff) podem ser determinadas pelo cálculo das concentrações e das velocidades reais de associação e dissociação. (Vide Nature 361: 186-87 (1993)). A razão entre Koff/Kon permite o cancelamento de todos os parâmetros não relacionados à afinidade, e é igual à constante de dissociação Kd. (Vide, geralmente, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem. 59: 439-473). É relatado que um anticorpo da presente divulgação se liga especificamente ao alvo, quando a constante de equilíbrio de associação (Kd) é < 1 μM; em algumas formas de realização, < 100 nM, em algumas formas de realização, < 10 nM, e, em algumas formas de realização, < 100 pM a cerca de 1 pM, conforme medição dos ensaios, tais como ensaios de ligação de radioligantes ou ensaios similares conhecidos pelo técnicos no assunto.

[0279] Entende-se pelo termo "polinucleotídeo isolado", conforme utilizado aqui, um polinucleotídeo de origem genômica, de cDNA ou sintética, ou alguma combinação destes, que, em virtude da sua origem, o "polinucleotídeo isolado" (1) não está associado a todo ou uma região de um polinucleotídeo em que o "polinucleotídeo isolado" é encontrado naturalmente, (2) está ligado operacionalmente a um polinucleotídeo que não está ligado naturalmente, ou (3) não ocorre naturalmente como parte de uma sequência maior. Os polinucleotídeos, de acordo com a divulgação, incluem as moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada mostrada aqui, e moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de imunoglobulina da cadeia leve mostrada aqui.

[0280] O termo "proteína isolada" se refere aqui a uma proteína de cDNA, RNA recombinante, ou de origem sintética ou alguma combinação destes, que, em virtude da sua origem, ou fonte de derivação, a "proteína isolada" (1) não está associada às proteínas encontradas naturalmente, (2) isenta de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, isenta de proteínas murinas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre naturalmente .

[0281] O termo "polipeptídeo" é aqui utilizado como um termo genérico para se referir à proteína nativa, fragmentos, ou análogos de uma sequência polipeptídica. Assim, os fragmentos de proteína nativa e análogos são espécies do gênero polipeptídeo. Os polipetídeos, de acordo com a divulgação, compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada mostrada aqui, e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve mostrada no presente documento, bem como moléculas de anticorpo formadas pelas combinações que compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tais como as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve kapa, e vice-versa, bem como fragmentos e análogos das mesmas.

[0282] O termo "de ocorrência natural", conforme utilizado aqui aplicado a um objeto, refere-se ao fato de um objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência polinucleotídica, que está presente em um organismo (incluindo vírus), que pode ser isolada de uma fonte na natureza e não foi intencionalmente modificada pelo homem em laboratório ou de outra forma, é de ocorrência natural.

[0283] O termo "operacionalmente ligado", conforme utilizado aqui, refere-se às posições em que os componentes então descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar no seu modo desejado. Uma sequência de controle "operacionalmente ligada" a uma sequência codificante está ligada de tal modo que a expressão da sequência codificante é obtida sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0284] O termo "sequência de controle", conforme utilizado aqui, refere-se às sequências de polinucleotídeos que são necessárias para realizar a expressão e o processamento das sequências codificantes às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro em procariotas, tais sequências de controle incluem geralmente promotor, sítio de ligação ribossomal, e sequência de terminação da transcrição em eucariotos, geralmente, tais sequências de controle incluem promotores e sequência de terminação da transcrição. O termo "sequências de controle" pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiro de fusão. O termo "polinucleotídeo", conforme referido aqui, significa os nucleotídeos com pelo menos 10 bases de comprimento, tanto ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui as formas de DNA de cadeia simples e dupla.

[0285] O termo oligonucleotídeo, conforme referido aqui, inclui os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si por ligações oligonucleotídicas de ocorrência natural e de ocorrência não natural. Os oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeos que compreendem geralmente um comprimento de 200 bases ou menos. Em algumas realizações, os oligonucleotídeos possuem de 10 a 60 bases de comprimento e, em algumas formas de realização, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleotídeos são normalmente de cadeia simples, por exemplo, para sondas, embora os oligonucleotídeos possam ser de cadeia dupla, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Os oligonucleotídeos da presente divulgação são oligonucleotídeos senso ou antissenso.

[0286] O termo "nucleotídeos de ocorrência natural", conforme referido aqui, inclui os desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos modificados", conforme referido aqui, inclui os nucleotídeos com grupos açúcar modificados ou substituídos e similares. O termo "ligações de oligonucleotídeos", conforme referido aqui, inclui as ligações de oligonucleotídeos, tais como o fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonmidato, e similares. Vide, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotídeo and Analogs: A Pratical Approach, pp 87-108 (F. Eckstein, Ed, Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente Us No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990). Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador para a detecção, se desejado.

[0287] Conforme utilizado aqui, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Vide Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds, Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Os estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como α-, a-aminoácidos dissubstituídos, os N-alquil aminoácidos, o ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para os polipetídeos da presente divulgação. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4- hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, ε-N, N, N-trimetil-lisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfo- serina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, o-N- metilarginina e outros aminoácidos similares e iminoácidos (por exemplo, 4- hidroxiprolina). Na notação polipeptídeo utilizada aqui, a direção à esquerda é a direção amino terminal e a direção à direita é a direção carboxi terminal, de acordo com a utilização e convenções padrão.

[0288] Da mesma forma, salvo especificação em contrário, a extremidade esquerda das sequências de polinucleotídeos de cadeia única é a extremidade 5', a direção à esquerda das sequências de polinucleotídeos de cadeia dupla é referida como direção 5'. A direção de adição de 5' para 3' dos transcritos de RNA nascentes é designada como a direção de transcrição das regiões de sequência na cadeia de DNA, que possuem a mesma sequência que o RNA, e estão 5’ em relação a extremidade 5' do transcrito de RNA. Estas sequências são referidas como "sequências a montante", enquanto que as regiões de sequência na cadeia de DNA, que possuem a mesma sequência que o RNA, e estão 3' em relação à extremidade 3' do transcrito de RNA são denominadas "sequências a jusante".

[0289] Assim como foi aplicado aos polipetídeos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptidicas, quando idealmente alinhadas, como através dos programas GAP ou BESTFIT que utilizam pesos padrão de intervalo, compartilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, em algumas formas de realização, pelo menos, 90 por cento de identidade de sequência, em algumas formas de realização, pelo menos, 95 por cento de identidade de sequência, e, em algumas formas de realização, pelo menos, 99 por cento de identidade de sequência.

[0290] Em algumas formas de realização, as posições dos resíduos que não são idênticas diferem pelas substituições conservativas de aminoácidos.

[0291] Conforme discutido aqui, considera-se que pequenas variações nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina estão compreendidas pela presente divulgação, desde que as variações na sequência de aminoácido mantenham, pelo menos, 75%, em algumas formas de realização, pelo menos, 80%, 90%, 95%, e, em algumas formas de realização, 99%. Em particular, substituições conservativas de aminoácidos estão compreendidas. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que se relacionam pelas suas cadeias laterais. Os aminoácidos geneticamente codificados são geralmente divididos em famílias: (1) os aminoácidos ácidos são o aspartato, o glutamato; (2) os aminoácidos básicos são a lisina, a arginina, a histidina; (3) os aminoácidos não polares são a alanina, a valina, a leucina, a isoleucina, a prolina, a fenilalanina, a metionina e o triptofano, (4) aminoácidos polares não carregados são a glicina, a asparagina, a glutamina, a cisteína, a serina, a treonina, e a tirosina. Os aminoácidos hidrofílicos incluem a arginina, a asparagina, o aspartato, a glutamina, o glutamato, a histidina, a lisina, a serina, e a treonina. Os aminoácidos hidrofóbicos incluem a alanina, a cisteína, a isoleucina, a leucina, a metionina, a fenilalanina, a prolina, o triptofano, a tirosina e a valina. Outras famílias de aminoácidos incluem: (i) serina e treonina, que são da família hidroxi alifática; (ii) asparagina e glutamina, que são da família contendo amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que são da família alifática; e (iv) fenilalanina, triptofano, e tirosina, que são da família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado, não terá um grande efeito sobre a ligação ou as propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de uma região estrutural. Se uma alteração de aminoácidos resultar em um peptídeo funcional, pode-se facilmente determinar pelo ensaio da atividade específica do derivado de polipeptídeo. Os ensaios são descritos detalhadamente neste documento. Os fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser facilmente preparados pelos técnicos no assunto. Os terminais amino- e carboxi-adequados dos fragmentos ou análogos ocorrem perto dos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados através da comparação dos dados da sequência de nucleotídeos e/ou de aminoácidos com as bases de dados de sequências públicas ou privadas. Em algumas formas de realização, os métodos de comparação computacionais são utilizados para identificar os motivos de sequências ou domínios de conformação proteica previstos que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. Métodos para identificar sequências proteicas que se conformam em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Assim, os exemplos anteriores demonstram que os técnicos no assunto podem reconhecer motivos de sequência e conformações estruturais que podem ser utilizados para definir os domínios estruturais e funcionais de acordo com a divulgação.

[0292] As substituições de aminoácidos adequadas são aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram a afinidades de ligação, e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico- químicas ou propriedades funcionais de tais análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma sequência além da sequência de peptídeo de ocorrência natural. Por exemplo, as substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) podem ser realizadas na sequência de ocorrência natural (por exemplo, na região do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que formam contatos intermoleculares. Uma substituição conservativa de aminoácido ácido não deve alterar substancialmente as características estruturais da sequência original (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve ter a tendência de quebrar uma hélice que ocorre na sequência original, ou interromper outro tipo de estrutura secundária, que caracteriza a sequência original). Exemplos de estruturas polipeptídicas secundárias e terciárias reconhecidas no estado da arte são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed, WH Freeman and Company, New York (1984).); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, NY (1991)), e Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).

[0293] O termo "fragmento de polipeptídeo", conforme utilizado aqui, refere- se a um polipeptídeo que tem uma deleção amino-terminal e/ou carboxi-terminal e/ou uma ou mais deleções internas, exceto onde o restante da sequência de aminoácidos é idêntico às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de cDNA completo. Os fragmentos possuem tipicamente, pelo menos, 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, em algumas formas de realização, pelo menos, 14 aminoácidos de comprimento, em algumas formas de realização, pelo menos, 20 aminoácidos de comprimento, normalmente, pelo menos, 50 aminoácidos de comprimento, e, em algumas formas de realização, pelo menos 70 aminoácidos de comprimento. O termo "análogo", conforme utilizado aqui, refere-se aos polipetídeos que são compostos por um segmento de, pelo menos, 25 aminoácidos que tem uma identidade substancial com uma região de uma sequência de aminoácidos deduzida e que possui ligação específica ao alvo sob condições de ligação adequadas. Tipicamente, os análogos polipeptídicos compreendem uma substituição conservativa de aminoácidos (ou adição ou deleção) em relação à sequência de ocorrência natural. Os análogos possuem tipicamente, pelo menos, 20 aminoácidos de comprimento, em algumas formas de realização, pelo menos, 50 aminoácidos de comprimento ou mais e podem muitas vezes ser tão longos quanto o polipeptídeo de ocorrência natural completo.

[0294] O termo "agente" é aqui utilizado para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato feito de materiais biológicos.

[0295] Conforme utilizado aqui, os termos "marcador" ou "marcado" refere- se à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, pela incorporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação de regiões de biotinila a um polipeptídeo que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por meios óticos ou métodos calorimétricos). Em certas situações, a etiqueta/ marcador ou marcador também pode ser terapêutico. Vários métodos de marcação de polipetídeos e de glicoproteinas são conhecidos no estado da arte e podem ser utilizados. Exemplos de marcadores para polipetídeos incluem, mas não se limitam a, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescentes, grupos biotinila, epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, tags de epítopo). Em algumas formas de realização, os marcadores estão ligados por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento espacial. O termo "agente farmacêutico ou fármaco", conforme utilizado aqui, refere-se a um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando adequadamente administrado a um paciente.

[0296] Outros termos químicos descritos aqui são utilizados de acordo com o uso convencional no estado da arte, como exemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

[0297] Conforme utilizado aqui, "substancialmente puro" significa que uma espécie objeto é a espécie predominante presente (ou seja, em relação a uma base molar, é mais abundante que qualquer outra espécie individual na composição), e, em algumas formas de realização, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objeto compreende, pelo menos, cerca de 50 por cento (em relação a uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes.

[0298] De um modo geral, uma composição substancialmente pura compreenderá mais do que cerca de 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, em algumas formas de realização, mais do que cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Em algumas formas de realização, a espécie objeto é purificada até à homogeneidade efetiva (as espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente de uma única espécie macromolecular.

[0299] O termo paciente inclui indivíduos humanos e animais.

[0300] Os anticorpos ativáveis da divulgação se ligam especificamente a um determinado alvo, por exemplo, a uma proteína alvo humana. Também estão incluídos na divulgação os anticorpos ativáveis que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos ativáveis descritos aqui.

[0301] Os técnicos no assunto reconhecerão que é possível determinar, sem experimentação indevida, se um anticorpo monoclonal (por exemplo, um anticorpo monoclonal murino ou um anticorpo humanizado) tem a mesma especificidade que um anticorpo monoclonal utilizado nos métodos descritos aqui ao determinar se o primeiro impede que o último se ligue ao alvo. Se o anticorpo monoclonal sendo testado compete com o anticorpo monoclonal da divulgação, mostrado pela diminuição na ligação pelo anticorpo monoclonal da divulgação, então, os dois anticorpos monoclonais se ligam ao mesmo epítopo, ou estão intimamente relacionados. Um método para determinar se um anticorpo monoclonal tem a especificidade de um anticorpo monoclonal da divulgação é pré-incubar o anticorpo monoclonal da divulgação com o alvo e, em seguida, adicionar o anticorpo monoclonal sendo testado para determinar se o anticorpo monoclonal sendo testado é inibido em sua capacidade de se ligar ao alvo. Se o anticorpo monoclonal sendo testado é inibido, então, com toda a probabilidade, tem a mesma especificidade epitópica, ou é funcionalmente equivalente ao anticorpo monoclonal da divulgação.

Anticorpos Multiespecíficos Ativáveis

[0302] A divulgação também proporciona anticorpos multiespecíficos ativáveis. Os anticorpos multiespecíficos ativáveis proporcionados aqui são anticorpos multiespecíficos que reconhecem dois ou mais antígenos ou epítopos diferentes e que incluem, pelo menos, uma região de mascaramento (MM) ligada a pelo menos um domínio de ligação ao antígeno ou epítopo do anticorpo multiespecífico, de tal modo que o acoplamento de MM reduz a capacidade do domínio de ligação ao antígeno ou epítopo de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização, a MM é acoplada ao domínio de ligação ao antígeno ou epítopo do anticorpo multiespecífico através de uma região clivável (CM) que funciona como um substrato para, pelo menos, uma protease MMP. Os anticorpos multiespecíficos ativáveis fornecidos aqui são estáveis na circulação, ativados em locais pretendidos de terapia e/ou diagnóstico, mas não em tecido saudável normal, e, quando ativados, se ligam ao alvo que é pelo menos comparável ao anticorpo não modificado correspondente.

[0303] Em algumas formas de realização, os anticorpos multiespecíficos ativáveis são concebidos para se ligarem a células imuness efetoras, referidos aqui também como anticorpos multiespecíficos ativáveis que se ligam a células imuness efetoras. Em algumas formas de realização, os anticorpos multiespecíficos ativáveis são concebidos para se ligarem a leucócitos, referidos também aqui como multiespecíficos ativáveis que se ligam a leucócitos. Em algumas formas de realização, os anticorpos multiespecíficos ativáveis são concebidos para se ligarem a células T, também referido aqui como anticorpos multiespecíficos ativáveis que se ligam a células T. Em algumas formas de realização, os anticorpos ativáveis multiespecíficos se ligam a um antígeno de superfície em um leucócito, tal como em uma célula T, em uma célula natural killer (NK), em células mononucleares mielóides, em um macrófago, e/ou em outra célula imune efetora. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é um leucócito. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é uma célula T. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é uma célula NK. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é uma célula mononuclear, tal como uma célula mononuclear mielóide. Em algumas formas de realização, os anticorpos multiespecíficos ativáveis são concebidos para se ligar, ou de outra forma interagir com, a mais de um alvo e/ou mais do que um epítopo, também referido aqui como anticorpos ativáveis direcionados a múltiplos antígenos. Conforme utilizado aqui, os termos "alvo" e "antígeno" são utilizados de forma alternada.

[0304] Em algumas formas de realização, os anticorpos ativáveis multiespecíficos que se ligam à célula imune efetora dA divulgação incluem um anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo que se liga à célula imune efetora ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um dos anticorpos direcionados ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos e/ou a um anticorpo que se liga à célula imune efetora ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à célula imune efetora ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula imune efetora, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à célula imune efetora ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula imune efetora, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo, e o anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga a uma célula não imune efetora é um anticorpo direcionado ao câncer. Em algumas formas de realização, o anticorpo efetor de células não imune é uma IgG. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à células imunes efetoras é um scFv. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado (por exemplo, anticorpo efetor de células não-imunes) é uma IgG e a anticorpo que se liga à célula imune efetora é um scFv. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é um leucócito. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é uma célula T. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é uma célula NK. Em algumas formas de realização, a célula imune efetora é uma célula mononuclear mielóide.

[0305] Em algumas formas de realização, os anticorpos multiespecíficos ativáveis que se ligam a células T da divulgação incluem um anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo que se liga à célula T ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um do anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou anticorpo que se liga à células T ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à células T ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula imune efetora, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à células T ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula T, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo, e o anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo.

[0306] Em algumas formas de realização, os anticorpos multiespecíficos ativáveis que se ligam a célula T incluem um anticorpo direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um anticorpo que se liga à célula T ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um anticorpo direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou o anticorpo que se liga à célula T ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à células T ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula imune efetora, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado ao câncer ou fragmento de ligação antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à células T ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula T, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo, e o anticorpo direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer.

[0307] Em algumas formas de realização, os anticorpos multiespecíficos ativáveis que se ligam a célula T incluem um anticorpo IgG direcionado ao câncer ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um scFv que se liga à célula T, onde pelo menos um do anticorpo IgG direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou o anticorpo que se liga a células T ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à células T ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula T, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo IgG direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (AB2), que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, onde AB2 está ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga à células T ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a um primeiro alvo ligado a célula T, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao primeiro alvo, e o anticorpo IgG direcionado ao câncer ou fragmento inclui mesmo um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer.

[0308] Em algumas formas de realização de um anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula imune efetora, um antígeno é tipicamente um antígeno presente na superfície de uma célula tumoral ou de outro tipo de célula associado à doença, tal como, mas não limitado a, quaisquer alvos listados na Tabela 1, tais como, mas não limitado a, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, ou CD71 (receptor de transferrina), e um outro antígeno é normalmente um receptor estimulador ou inibitório presente na superfície de uma célula T, células natural killer (NK), células mononucleares mielóide, macrófagos e/ou outras células imunes efetoras, tais como, mas não limitado a, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28 , CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 ou VISTA. Em algumas formas de realização, o antígeno é um receptor estimulador presente na superfície de uma célula T ou célula NK; exemplos de tais receptores estimuladores incluem, mas não se limitam a, CD3, CD27, CD28, CD137 (também referida como 4-1BB), GITR, HVEM, ICOS, NKG2D, e OX40. Em algumas formas de realização, o antígeno é um receptor inibitório presente na superfície de uma célula T; exemplos de tais receptores inibitórios incluem, mas não se limitam a, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, e KIRs expressas em NK. O domínio de anticorpo que confere especificidade ao antígeno de superfície de células T também pode ser substituído por um domínio de ligante ou um ligante que se liga a um receptor de célula T, um receptor de células NK, um receptor de macrófagos, e/ou outro receptor de células imunes efetoras, tais como, mas não limitado a, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, ou TNFSF9.

[0309] Uma forma de realização da divulgação é um anticorpo multiespecífico ativável que é ativável em um microambiente do câncer e que inclui um anticorpo, por exemplo, uma IgG ou scFv, dirigido a um alvo do tumor e um anticorpo agonista, por exemplo, uma IgG ou scFv, direcionado a um receptor coestimulador expresso na superfície de uma célula T ou célula NK ativada, em que pelo menos um do anticorpo direcionado a câncer e/ou o anticorpo agonista é mascarado. Exemplos de receptores coestimuladores incluem, mas não se limitam a, CD27, CD137, GITR, HVEM, NKG2D, e OX40. Nesta forma de realização, o anticorpo multiespecífico ativável, uma vez ativado por proteases associadas a tumores, realizaria efetivamente uma ligação cruzada e ativaria os receptores coestimuladores expressos em célula T ou células NK de uma maneira dependente de tumor de modo a aumentar a atividade das células T que respondem a qualquer antígeno tumoral através dos seus receptores de ativação de células NK ou de antígeno de células T. A natureza dependente de ativação destes receptores coestimuladores de células T ou células NK concentraria a atividade do anticorpo multiespecífico ativável ativado nas células T específicas para o tumor, sem ativar todas as células T, independentemente da sua especificidade antigênica. Em uma forma de realização, pelo menos, o anticorpo do receptor coestimulador do anticorpo multiespecífico ativável é mascarado para evitar a ativação de células T autorreativas que possam estar presentes nos tecidos que também expressam o antígeno reconhecido pelo anticorpo direcionado ao tumor no anticorpo multiespecífico ativável, contudo, esta atividade é limitada pela falta de acoplamento do coreceptor.

[0310] Uma forma de realização da divulgação é um anticorpo multiespecífico ativável que é ativável em uma doença caracterizada pela superestimulação de células T, tais como, mas não limitado a, um microambiente de doença autoimune ou doença inflamatória. O referido anticorpo multiespecífico ativável inclui um anticorpo, por exemplo, uma IgG ou scFv, direcionado a um alvo que compreende um antígeno de superfície expresso em um tecido que é alvo de uma célula T na doença autoimune ou inflamatória, e um anticorpo, por exemplo, uma IgG ou scFv, direcionado a um receptor inibitório expresso na superfície de uma célula T ou célula NK, em que pelo menos um do anticorpo direcionado ao tecido relacionado à doença e/ou anticorpo inibitório de receptor de células T é mascarado. Exemplos de receptores inibidores incluem, mas não se limitam a, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, e KIR expressas em NK. Exemplos de um antígeno tecidual que é alvo de células T na doença autoimune incluem, mas não se limitam a, um antígeno de superfície expresso em células nervosas ou mielina na esclerose múltipla ou um antígeno de superfície expresso em células pancreáticas na diabetes tipo 1. Nesta forma de realização, o anticorpo multiespecífico ativável , quando localizado nos tecidos sob ataque autoimune ou inflamação, é ativado e se liga ao receptor inibitório de célula T ou células NK para suprimir a atividade de células T autorreativas que respondem a quaisquer antígenos direcionados ao tecido relacionado à doença através do seu TCR ou receptores de ativação endógenos. Em uma forma de realização, pelo menos um ou vários anticorpos são mascarados para evitar a supressão das respostas de células T nos tecidos não envolvidos na doença onde o antígeno alvo também pode ser expresso.

[0311] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um anti-CD3 epsilon scFv (CD3ε, referido também aqui como CD3e e CD3) e um anticorpo direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um do anti-CD3ε scFv e/ou o anticorpo direcionado ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o CD3ε scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo. Em algumas formas de realização, o CD3ε scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε, e o anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo.

[0312] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um anti-CD3ε scFv e um anticorpo direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um dos anti- CD3ε scFv e/ou o anticorpo direcionado ao câncer ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o CD3ε scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer. Em algumas formas de realização, o CD3ε scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε, e o anticorpo direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer.

[0313] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um anti-CD3ε scFv e um anticorpo IgG direcionado ao câncer ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um dos anti-CD3ε scFv e/ou o anticorpo IgG direcionado ao câncer ou região de ligação do antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o CD3ε scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε. Em algumas formas de realização, o anticorpo IgG direcionado ao câncer ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer. Em algumas formas de realização, o CD3ε scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε, e o anticorpo IgG direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer.

[0314] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um anti-CD3 epsilon (CD3ε) scFv que é derivado de OKT3, onde pelo menos um do anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou a OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 é mascarado. Em algumas formas de realização, o OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo. Em algumas formas de realização, o OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε, e o anticorpo direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo.

[0315] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 e um anticorpo direcionado a câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um dos OKT3 scFv ou scFv derivados de OKT3 e/ou o anticorpo direcionado a câncer ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado a câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer. Em algumas formas de realização, o OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε, e o anticorpo direcionado a câncer ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer.

[0316] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um scFv OKT3 ou scFv derivado de OKT3 e um anticorpo IgG direcionado a câncer ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um dos OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 e/ou o anticorpo IgG direcionado a câncer ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε. Em algumas formas de realização, o anticorpo IgG direcionado a câncer ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer. Em algumas formas de realização, o OKT3 scFv ou scFv derivado de OKT3 inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CD3ε, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CD3ε, e o anticorpo IgG direcionado ao câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo relacionado a câncer, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo relacionado a câncer.

[0317] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um anticorpo anti-CTLA-4 scFv, onde pelo menos um do anticorpo direcionado a câncer ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou o anti-CTLA-4 scFv é mascarado. Em algumas formas de realização, o anti-CTLA-4 scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CTLA-4, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CTLA-4. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo. Em algumas formas de realização, o anti-CTLA-4 scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CTLA-4, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar de CTLA-4, e o anticorpo direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo.

[0318] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T inclui um anti-CTLA-4 scFv e um anticorpo IgG direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que pelo menos um dos anti- CTLA-4 scFv e/ou o anticorpo IgG direcionado ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo é mascarado. Em algumas formas de realização, o anti-CTLA-4 scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CTLA-4, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CTLA-4. Em algumas formas de realização, o anticorpo IgG direcionado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo . Em algumas formas de realização, o anti-CTLA-4 scFv inclui um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga a CTLA-4, em que o AB1 é ligado a uma região de mascaramento (MM1) de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar a CTLA-4, e o anticorpo IgG direcionado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que inclui um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo, em que o AB2 é ligado a uma região de mascaramento (MM2) de tal modo que o acoplamento de MM2 reduz a capacidade de AB2 de se ligar ao segundo alvo.

[0319] Em algumas formas de realização, os anticorpos direcionados a múltipos antígenos e/ou anticorpos ativáveis direcionados a múltipos antígenos incluem pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um primeiro alvo e/ou o primeiro epítopo e um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um segundo alvo e/ou um segundo epítopo. Em algumas formas de realização, os anticorpos direcionados a múltipos antígenos e/ou anticorpos ativáveis direcionados a múltipos antígenos ligam-se a dois ou mais alvos diferentes. Em algumas formas de realização, os anticorpos direcionados a múltipos antígenos e/ou anticorpos ativáveis direcionados a múltipos antígenos ligam-se a dois ou mais epítopos diferentes no mesmo alvo. Em algumas formas de realização, os anticorpos direcionados a múltipos antígenos e/ou anticorpos ativáveis direcionados a múltipos antígenos ligam-se a uma combinação de dois ou mais alvos diferentes e dois ou mais epítopos diferentes no mesmo alvo.

[0320] Em algumas formas de realização, um anticorpo multiespecífico ativável compreendendo uma IgG tem os domínios variáveis de IgG mascarados. Em algumas formas de realização, um anticorpo multiespecífico ativável que compreende um scFv possui os domínios de scFv mascarados. Em algumas formas de realização, um anticorpo multiespecífico ativável tem ambos os domínios variáveis de IgG e domínios de scFv, em que pelo menos um dos domínios variáveis de IgG é acoplado a uma região de mascaramento. Em algumas formas de realização, um anticorpo multiespecífico ativável tem ambos os domínios variáveis de IgG e domínios de scFv, em que pelo menos um dos domínios de scFv é acoplado a uma região de mascaramento. Em algumas formas de realização, um anticorpo multiespecífico ativável tem ambos os domínios variáveis de IgG e domínios de scFv, em que pelo menos um dos domínios variáveis de IgG é acoplado a uma região de mascaramento e, pelo menos, um dos domínios de scFv é acoplado a uma região de mascaramento. Em algumas formas de realização, um anticorpo multiespecífico ativável tem ambos os domínios variáveis de IgG e domínios de scFv, onde cada um dos domínios variáveis de IgG e os domínios de scFv é acoplado a sua própria região de mascaramento. Em algumas formas de realização, um domínio de anticorpo de um anticorpo multiespecífico ativável tem especificidade para um antígeno alvo e outro domínio de anticorpo tem especificidade para um antígeno de superfície de células T. Em algumas formas de realização, um domínio de anticorpo de um anticorpo multiespecífico ativável tem especificidade para um antígeno alvo e outro domínio de anticorpo tem especificidade para um outro antígeno alvo. Em algumas formas de realização, um domínio de anticorpo de um anticorpo multiespecífico ativável tem especificidade para um epítopo de um antígeno alvo e outro domínio de anticorpo tem especificidade para um outro epítopo do antígeno alvo.

[0321] Em um anticorpo multiespecífico ativável , um scFv pode ser fusionado ao terminal carboxila da cadeia pesada de um anticorpo IgG ativável, ao terminal carboxila da cadeia leve de um anticorpo IgG ativável, ou aos terminais carboxila tanto das cadeias pesada e leve de um anticorpo IgG ativável. Em um anticorpo multiespecífico ativável , um scFv pode ser fusionado ao terminal amino da cadeia pesada de um anticorpo IgG ativável, ao terminal amino da cadeia leve de um anticorpo IgG ativável, ou aos terminais amino de ambas as cadeias pesada e leve de um anticorpo IgG ativável. Em um anticorpo multiespecífico ativável , um scFv pode ser fusionado a qualquer combinação de um ou mais terminais carboxila e um ou mais terminais amino de um anticorpo IgG ativável. Em algumas formas de realização, uma região de mascaramento (MM), ligada a uma região clivável (CM), liga-se a um domínio de ligação ao antígeno da IgG e o encobre/ mascara. Em algumas formas de realização, uma região de mascaramento (MM), ligada a uma região clivável (CM), liga-se a um um domínio de ligação ao antígeno de, pelo menos, um scFv, e o encobre. Em algumas formas de realização, uma região de mascaramento (MM), ligada a uma região clivável (CM), e liga-se a um um domínio de ligação ao antígeno de uma IgG e o encobre, e uma região de mascaramento (MM), ligada a uma região clivável (CM), liga-se a um domínio de ligação ao antígeno de, pelo menos, um scFv e o encobre.

[0322] A divulgação proporciona exemplos de estruturas de anticorpos multiespecíficos ativáveis, que incluem, mas não se limitam a, o seguinte: (VL CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2: (VH-CH1-CH2- CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2: (VH-CH1-CH2-CH3- L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2: (VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2: (MM-L1- CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2: (VL*-L3-VH*- L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2- CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4- VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4- VL-CL)2: (VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2: (VH-CH1- CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*- L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2- VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM- L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1- MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM- L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1- CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM- L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*- L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3- VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; ou (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3- VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, em que: VL e VH representam os domínios variáveis leve e pesados da primeira especificidade contido na IgG; VL* e VH* representam os domínios variáveis da segunda especificidade contido no scFv; L1 é um peptídeo de ligação que liga a região de mascaramento (MM) e a região clivável (CM); L2 é um peptídeo de ligação que liga a região clivável (CM), e o anticorpo; L3 é um peptídeo de ligação que liga os domínios variáveis de scFv; L4 é um peptídeo de ligação que liga o anticorpo da primeira especificidade ao anticorpo da segunda especificidade; CL é o domínio constante da cadeia leve; e CH1, CH2, CH3 são os domínios constantes da cadeia pesada. As primeira e segunda especificidades podem para qualquer antígeno ou epítopo.

[0323] Em algumas formas de realização de um anticorpo multiespecífico ativável que se liga à célula T, um antígeno é tipicamente um antígeno presente na superfície de uma célula tumoral ou de outro tipo de célula associada à doença, tal como, mas não limitado a, qualquer alvo listado na Tabela 1, tais como, mas não limitado a, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, ou CD71 (receptor de transferrina), e um outro antígeno é tipicamente um receptor estimulador (referido aqui também como ativador) ou inibitório presente na superfície de uma célula T, células natural killer (NK), células mononucleares mielóides, macrófagos e/ou outras célula imune efetora, tais como, mas não limitado a, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8 , CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137 (também referido como TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 ou VISTA. O domínio de anticorpo que confere especificidade ao antígeno de superfície de células T também pode ser substituído por um domínio de ligante ou um ligante que se liga a um receptor de célula T, um receptor de células NK, um receptor de macrófagos, e/ou outro receptor de células imunes efetoras, tais como, mas não limitado a, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, ou TNFSF9. Em algumas formas de realização de um anticorpo ativável direcionado a múltipos antígenos, um antígeno é selecionado a partir do grupo de alvos listados na Tabela 1, e um outro antígeno é selecionado a partir do grupo de alvos listados na Tabela 1.

[0324] Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é um anticorpo anti-EGFR. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é C225v5, que é específico para ligação a EGFR. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é C225, que é específico para ligação a EGFR. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é C225v4, que é específico para ligação a EGFR. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é C225v6, que é específico para ligação a EGFR. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é um anticorpo anti-Jagged. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é 4D11, que é específico para ligação a Jagged 1 e 2 humano e murino. Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado é 4D11v2, que é específico para ligação a Jagged 1 e 2 humano e murino.

[0325] Em algumas formas de realização, o anticorpo direcionado pode estar na forma de um anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, o scFv (s) pode estar na forma de um Pro-scFv (vide, por exemplo, WO 2009/025846, WO 2010/081173).

[0326] Em algumas formas de realização, o scFv é específico para ligação a CD3ε, e é, ou é derivado de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a CD3ε, por exemplo, CH2527, FN18, H2C, OKT3, 2C11, UCHT1, ou V9. Em algumas formas de realização, o scFv é específico para ligação a CTLA-4 (também aqui referida como CTLA e CTLA4).

[0327] Em algumas formas de realização, o anti-CTLA-4 de scFv inclui a sequência de aminoácidos: GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS QSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED FAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGG GVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSA S (SEQ ID NO: 510)

[0328] Em algumas formas de realização, o anti-CTLA-4 scFv inclui a sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 510.

[0329] Em algumas formas de realização, o anti-CD3ε scFv inclui a sequência de aminoácidos: GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKA SGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKdKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGG SQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLAS GVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 511)

[0330] Em algumas formas de realização, o anti-CD3ε scFv inclui a sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 511.

[0331] Em algumas formas de realização, o scFv é específico para ligação a uma ou mais células T, uma ou mais células NK e/ou um ou mais macrófagos. Em algumas formas de realização, o scFv é específico para ligação a um alvo selecionado a partir do grupo composto por B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD 137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3 ou VISTA.

[0332] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável também inclui um agente conjugado ao AB. Em algumas formas de realização, o agente é um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, o agente é um agente antineoplásico. Em algumas formas de realização, o agente é uma toxina ou um fragmento da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao anticorpo multiespecífico ativável através de um ligante. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante que inclui, pelo menos, uma sequência substrato clivável por MMP. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante não clivável. Em algumas formas de realização, o agente é um inibidor de microtúbulos. Em algumas formas de realização, o agente é um agente causador de dano a ácido nucleico, tal como um agente alquilante de DNA ou agente intercalante de DNA, ou outro agente de dano ao DNA. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o agente é um agente selecionado a partir do grupo listado na Tabela 4. Em algumas formas de realização, o agente é uma dolastatina. Em algumas formas de realização, o agente é uma auristatina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é auristatina E ou um derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina E (MMAE). Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina D (MMAD). Em algumas formas de realização, o agente é um derivado de maitansinóide ou maitansinóide. Em algumas formas de realização, o agente é DM1 ou DM4. Em algumas formas de realização, o agente é uma duocarmicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma caliqueamicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma pirrolbenzodiazepina.

[0333] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável inclui também uma região detectável. Em algumas formas de realização, a região detectável é um agente de diagnóstico.

[0334] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável contém, naturalmente, uma ou mais ligações dissulfeto. Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável pode ser modificado de modo a incluir uma ou mais ligações dissulfeto.

[0335] A divulgação também proporciona uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo multiespecífico ativável descrito aqui, assim como vetores que incluem estas sequências de ácidos nucleicos isolados. A divulgação proporciona métodos para produzir um anticorpo multiespecífico ativável por cultura de células sob condições que conduzem à expressão do anticorpo ativável, em que a célula compreende a referida molécula de ácido nucleico. Em algumas formas de realização, a célula compreende o eferido vetor.

[0336] A divulgação também proporciona um método para produzir anticorpos ativáveis multiespecíficos da divulgação através (a) da cultura de células compreendendo um construto de ácido nucleico que codifica o anticorpo multiespecífico ativável sob condições que levam à expressão do anticorpo multiespecífico ativável , e (b) da recuperação do anticorpo multiespecífico ativável .

[0337] A divulgação também proporciona anticorpos multiespecíficos ativáveis e/ou composições de anticorpos ativáveis multiespecíficos que incluem pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um primeiro alvo ou um primeiro epítopo e um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga a um segundo alvo ou um segundo epítopo, em que, pelo menos, AB1 é acoplado ou de outra forma ligado a uma região de mascaramento (MM1), de tal modo que o acoplamento de MM1 reduz a capacidade de AB1 de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização, a MM1 é acoplada a AB1 através de uma sequência da primeira região clivável (CM1) que inclui um substrato para uma protease, por exemplo, uma protease que está colocalizada com o alvo do AB1 em um local de tratamento ou local de diagnóstico em um indivíduo. Os anticorpos ativáveis multiespecíficos proporcionados aqui são estáveis na circulação, ativados em locais pretendidos de terapia e/ou diagnóstico, mas não em tecido saudável normal, e, quando ativados, se ligam ao alvo do AB1 que é pelo menos comparável ao anticorpo multiespecífico não modificado correspondente.

[0338] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável compreende um peptídeo de ligação entre a MM1 e a CM1.

[0339] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável compreende um peptídeo de ligação entre a CM1 e o AB1.

[0340] Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e, pelo menos uma região do anticorpo multiespecífico ativável apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma no estado não clivado: MM1-LP1-CM1-LP2-AB1 ou AB1-LP2-CM1-LP1-MM1. Em algumas formas de realização, os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos uns aos outros.

[0341] Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização, pelo menos um de LP1 ou LP2 inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), e GSSSG (SEQ ID NO: 8).

[0342] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB1) do mesmo que se liga especificamente a um primeiro alvo ou primeiro epítopo, e um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (AB2) do mesmo, que se liga especificamente a um segundo alvo ou segundo epítopo. Em algumas formas de realização, cada um dos AB no anticorpo multiespecífico ativável é selecionado independentemente a partir do grupo composto por um anticorpo monoclonal, um anticorpo de domínio, de cadeia simples, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um scFv, um scAb, um dAb, um anticorpo de cadeia pesada de domínio único, ou um anticorpo de cadeia leve de domínio único. Em algumas formas de realização, cada um dos AB no anticorpo multiespecífico ativável é um anticorpo monoclonal humanizado ou inteiramente humano, quimérico, de um roedor (por exemplo, camundongo ou rato).

[0343] Em algumas formas de realização, cada um dos AB no anticorpo multiespecífico ativável tem uma constante de equilíbrio de dissociação de cerca de 100 nM ou menos, para se ligar ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0344] Em algumas formas de realização, MM1 tem uma constante de equilíbrio de dissociação para a ligação ao seu AB correspondente que é maior do que a constante de equilíbrio de dissociação do AB ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0345] Em algumas formas de realização, MM1 tem uma constante de equilíbrio de dissociação para a ligação ao seu AB correspondente que não é mais do que a constante de equilíbrio de dissociação do AB ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0346] Em algumas formas de realização, MM1 não interfere ou compete com o seu AB correspondente para se ligar ao alvo ou epítopo correspondente, quando o anticorpo multiespecífico ativável está em estado clivado.

[0347] Em algumas formas de realização, MM1 é um polipeptídeo de cerca de 2 a 40 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, cada um dos MM no anticorpo multiespecífico ativável é um polipeptídeo de não mais do que 40 aminoácidos de comprimento.

[0348] Em algumas formas de realização, MM1 tem uma sequência polipeptídica que é diferente daquela do alvo do AB correspondente.

[0349] Em algumas formas de realização, MM1 tem uma sequência polipeptídica que não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB correspondente. Em algumas formas de realização, MM1 tem uma sequência polipeptídica que não é mais do que 25% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB correspondente. Em algumas formas de realização, MM1 tem uma sequência polipeptídica que não é mais do que 10% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB correspondente.

[0350] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM1 reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao seu alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente, é pelo menos 20 vezes maior do que o Kd do AB quando não acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0351] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM1 reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 40 vezes maior do que o Kd do AB quando não acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0352] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM1 reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 100 vezes maior do que o (Kd) do AB quando não acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0353] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM1 reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 1.000 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0354] Em algumas formas de realização, o acoplamento de MM1 reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 10.000 vezes maior do que a Kd do AB quando não acoplado à MM1 em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0355] Em algumas formas de realização, a MM1 é uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma MM divulgada aqui.

[0356] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável inclui, pelo menos, uma segunda região de mascaramento (MM2) que inibe a ligação do AB2 ao seu alvo quando o anticorpo multiespecífico ativável encontra-se em um estado não clivado, e uma segunda região clivável (CM2) acoplado a AB2, em que a CM2 é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma segunda protease. Em algumas formas de realização, CM2 é um polipeptídeo de não mais do que 15 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, a segunda protease está colocalizada com o segundo alvo ou epítopo em um tecido, em que a segunda protease cliva a CM2 no anticorpo multiespecífico ativável quando o anticorpo multiespecífico ativável é exposto à segunda protease. Em algumas formas de realização, a primeira protease e a segunda protease estão colocalizadas com o primeiro alvo ou epítopo e o segundo alvo ou epítopo em um tecido. Em algumas formas de realização, a primeira protease e a segunda protease são a mesma protease. Em algumas formas de realização, CM1 e CM2 são diferentes substratos para a mesma protease. Em algumas formas de realização, a protease é selecionada a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7. Em algumas formas de realização, a primeira protease e a segunda protease são proteases diferentes. Em algumas formas de realização, a primeira protease e a segunda protease são proteases diferentes selecionadas a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7.

[0357] Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável , por exemplo, MM1 e, pelo menos, MM2, tem uma constante de equilíbrio de dissociação para se ligar ao seu AB correspondente que é maior do que a constante de equilíbrio de dissociação do AB ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0358] Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável tem uma constante de equilíbrio de dissociação para se ligar ao seu AB correspondente que é não maior do que a constante de equilíbrio de dissociação do AB ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0359] Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável não interfere ou compete com o seu AB correspondente para se ligar ao alvo ou epítopo correspondente, quando o anticorpo multiespecífico ativável encontra-se em um estado clivado.

[0360] Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável é um polipeptídeo de cerca de 2 a 40 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável é um polipeptídeo de não mais do que 40 aminoácidos de comprimento.

[0361] Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável tem uma sequência polipeptídica que é diferente daquela do alvo do AB correspondente.

[0362] Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável tem uma sequência polipeptídica que não é mais do que 50% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB correspondente. Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável tem uma sequência polipeptídica que não é mais do que 25% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB correspondente. Em algumas formas de realização, cada MM no anticorpo multiespecífico ativável tem uma sequência polipeptídica que não é mais do que 10% idêntica a qualquer parceiro de ligação natural do AB correspondente.

[0363] Em algumas formas de realização, o acoplamento de cada MM reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 20 vezes maior do que a Kd do AB quando não está acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0364] Em algumas formas de realização, o acoplamento de cada MM reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 40 vezes maior do que a Kd do AB quando não está acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0365] Em algumas formas de realização, o acoplamento de cada MM reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 100 vezes maior do que a Kd do AB quando não está acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0366] Em algumas formas de realização, o acoplamento de cada MM reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 1.000 vezes maior do que a Kd do AB quando não está acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0367] Em algumas formas de realização, o acoplamento de cada MM reduz a capacidade do AB correspondente de se ligar ao alvo ou epítopo, de tal modo que a constante de dissociação (Kd) do AB quando acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente é pelo menos 10.000 vezes maior do que a Kd do AB quando não está acoplado à MM em relação ao seu alvo ou epítopo correspondente.

[0368] Em algumas formas de realização, cada MM é uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de uma MM divulgada aqui.

[0369] Em algumas formas de realização, pelo menos um de CM1 e/ou CM2 é clivado por pelo menos uma protease MMP. Em algumas formas de realização, pelo menos um de CM1 e/ou CM2 inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14); QNQALRMA (SEQ ID NO: 15); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 16); STFPFGMF (SEQ ID NO: 17); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 18); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 19); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 20); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21); WATPRPMR (SEQ ID NO: 22); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 23); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 24); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 25); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 26); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 27); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 28); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 29); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 30); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 31); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 32); PAGLWLDP (SEQ ID NO: 33); e ISSGLSS (SEQ ID NO: 159).

[0370] Em algumas formas de realização, pelo menos um de CM1 e/ou CM2 inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 364-370, 379-393, 402-409, 420-424, 434, 435 , 450-452, 457, 470472, 474 e 483.

[0371] Em algumas formas de realização, pelo menos um de CM1 e/ou CM2 inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 328, 336-339, e 348-351.

[0372] Em algumas formas de realização, a protease que cliva a primeira sequência da região clivável (CM1) está colocalizada com o alvo do AB1 no anticorpo multiespecífico ativável em um tecido, e a protease cliva a CM1 no anticorpo multiespecífico ativável quando o anticorpo multiespecífico ativável é exposto à protease.

[0373] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável inclui mais do que uma sequência da região clivável, e a protease que cliva pelo menos uma sequência da região clivável está colocalizada com o alvo de pelo menos uma das regiões AB no anticorpo multiespecífico ativável em um tecido, e a protease cliva a CM no anticorpo multiespecífico ativável quando o anticorpo multiespecífico ativável é exposto à protease.

[0374] Em algumas formas de realização, cada CM, por exemplo, CM1 e, pelo menos, CM2, é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é, pelo menos, duas vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0375] Em algumas formas de realização, cada CM, por exemplo, CM1 e, pelo menos, CM2, é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos três vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0376] Em algumas formas de realização, cada CM, por exemplo, CM1 e, pelo menos, CM2, é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos quatro vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0377] Em algumas formas de realização, cada CM, por exemplo, CM1 e, pelo menos, CM2, é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos cinco vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0378] Em algumas formas de realização, cada CM, por exemplo, CM1 e, pelo menos, CM2, é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos dez vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0379] Em algumas formas de realização, cada CM, por exemplo, CM1 e, pelo menos, CM2, é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos 20 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0380] Em algumas formas de realização, cada CM é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos 40 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0381] Em algumas formas de realização, cada CM é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos 50 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0382] Em algumas formas de realização, cada CM é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos 100 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0383] Em algumas formas de realização, cada CM é posicionada no anticorpo multiespecífico ativável de tal modo que, no estado não clivado, reduz a ocorrência da ligação do anticorpo multiespecífico ativável ao alvo de uma das regiões AB com uma constante de equilíbrio de dissociação que é pelo menos 200 vezes maior do que a constante de equilíbrio de dissociação de um AB não modificado que se liga ao seu alvo, enquanto que, no estado clivado, o AB se liga ao seu alvo.

[0384] Em algumas formas de realização, cada CM no anticorpo multiespecífico ativável é um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento.

[0385] Em algumas formas de realização, pelo menos uma CM no anticorpo multiespecífico ativável inclui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por SEQ ID NOs: 14-33 e 159 e a outra CM inclui a sequência de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO : 26). Em algumas formas de realização, pelo menos uma CM inclui a sequência de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26). Em algumas formas de realização, pelo menos uma região clivável é selecionada para ser utilizada com uma protease específica, por exemplo, uma protease que é conhecida por estar colocalizada com, pelo menos, um alvo do anticorpo multiespecífico ativável . Por exemplo, as regiões de clivagem adequadas para utilização nos anticorpos multiespecíficos ativáveis da divulgação são clivadas por, pelo menos, uma protease, tal como uroquinase, legumaína, e/ou matriptase (referida também aqui como TA-SP1 ou MTSP1). Em algumas formas de realização, uma região clivável adequada inclui, pelo menos, uma das seguintes sequências: TGRGPSWV (SEQ ID NO: 34); SARGPSRW (SEQ ID NO: 35); TARGPSFK (SEQ ID NO: 36); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 37); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 38); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 39); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 40); AARGPAIH (SEQ ID NO: 41); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 42); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 43); RGPATPIM (SEQ ID NO: 44); RGPA (SEQ ID NO: 45); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 46); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 47); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 48); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 49); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 126); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 50); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 51); e/ou PLGL (SEQ ID NO: 52).

[0386] Em algumas formas de realização, uma CM é um substrato para, pelo menos, uma protease MMP e a outra CM no anticorpo multiespecífico ativável é um substrato para uma protease selecionada a partir do grupo constituído por aquelas apresentadas na Tabela 7. Em algumas formas de realização, a protease é selecionada a partir do grupo composto por uPA, legumaína, matriptase, ADAM 17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, elastase neutrofílica, MMP-7, MMP-9, MMP-12, MMP-13, e MMP-14. Em algumas formas de realização, a protease é uma catepsina, tal como, mas não limitada a, a catepsina S. Em algumas formas de realização, cada CM no anticorpo multiespecífico ativável é um substrato para uma protease selecionada a partir do grupo composto por uPA (ativador de plasminogênio tipo uroquinase), legumaína e matriptase. Em algumas formas de realização, a protease compreende uPA. Em algumas formas de realização, a protease compreende legumaína. Em algumas formas de realização, a protease compreende matriptase. Em algumas formas de realização, a protease compreende uma metaloproteinase de matriz (MMP).

[0387] Em algumas formas de realização, pelo menos uma CM no anticorpo multiespecífico ativável é um substrato para, pelo menos, duas proteases. Em algumas formas de realização, cada protease é selecionada a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7. Em algumas formas de realização, pelo menos uma CM no anticorpo multiespecífico ativável é um substrato para, pelo menos, duas proteases, em que uma das proteases é selecionada a partir do grupo composto por uPA, matriptase, legumaína, e a outra protease é selecionada a partiro do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7. Em algumas formas de realização, pelo menos uma CM no o anticorpo multiespecífico ativável é um substrato para, pelo menos, duas proteases selecionadas a partir do grupo composto por uPA, legumaína e matriptase.

[0388] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável inclui, pelo menos, uma primeira CM (CM1) e uma segunda CM (CM2). Em algumas formas de realização, CM1 e CM2 fazem parte de um único ligante clivável que liga uma MM a um AB. Em algumas formas de realização, CM1 é parte de um ligante clivável que liga MM1 a AB1, e CM2 é parte de um ligante clivável separado que une uma MM2 a AB2. Em algumas formas de realização, um anticorpo multiespecífico ativável compreende mais do que duas CMs. Em algumas formas de realização, o referido anticorpo multiespecífico ativável compreende mais do que duas CMS e mais do que duas MMS. Em algumas formas de realização, cada CM1 e CM2 é polipetídeo de não mais do que 15 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização, pelo menos uma da primeira CM e da segunda CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease selecionada a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7. Em algumas formas de realização, pelo menos uma da primeira CM e da segunda CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para uma protease selecionada a partir do grupo composto por uPA, legumaína, e matriptase. Em algumas formas de realização, o primeira CM é clivada por um primeiro agente de clivagem selecionado a partir do grupo composto por uPA, legumaína, e matriptase em um tecido alvo e a segunda CM é clivada por um segundo agente de clivagem em um tecido alvo. Em algumas formas de realização, a outra protease é selecionada a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são a mesma protease selecionada a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7, e a primeira CM e a segunda CM são diferentes substratos para a enzima. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem de são a mesma protease selecionada a partir do grupo composto por uPA, legumaína, e matriptase, e a primeira CM e a segunda CM são diferentes substratos para a enzima. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem de protease são o mesmo selecionado a partir do grupo listado na Tabela 7, e a primeira CM e a segunda CM são o mesmo substrato. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são diferentes proteases. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem são diferentes proteases selecionadas a partir do grupo composto por aquelas apresentadas na Tabela 7. Em algumas formas de realização, o primeiro agente de clivagem e o segundo agente de clivagem estão colocalizados no tecido alvo. Em algumas formas de realização, a primeira CM e a segunda CM são clivados por, pelo menos, um agente de clivagem no tecido alvo.

[0389] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável é exposto a e clivado por uma protease tal que, no estado ativado ou clivado, o anticorpo multiespecífico ativável ativado inclui uma sequência de aminoácidos de cadeia leve que inclui, pelo menos, uma região da sequência de LP2 e/ou CM após a protease ter clivado a CM.

[0390] A divulgação também proporciona composições e métodos que incluem um anticorpo multiespecífico ativável que inclui pelo menos um primeiro anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB1) que se liga especificamente a um alvo e um segundo anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB2), em que pelo menos o primeiro AB no anticorpo multiespecífico ativável é acoplado a uma região de mascaramento (MM1) que diminui a capacidade de AB1 de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização, cada AB é acoplado a uma MM que diminui a capacidade de seu AB correspondente a cada alvo. Por exemplo, nas formas de realização de anticorpos ativáveis biespecíficos, AB1 é acoplado a uma primeira região de mascaramento (MM1) que diminui a capacidade de AB1 de se ligar ao seu alvo, e AB2 é acoplado a uma segunda região de mascaramento (MM2) que diminui a capacidade de AB2 de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável compreende mais do que duas regiões AB; em tais formas de realização, AB1 é acoplado a uma primeira região de mascaramento (MM1) que diminui a capacidade de AB1 de se ligar ao seu alvo, AB2 é acoplado a uma segunda região de mascaramento (MM2) que diminui a capacidade de AB2 de se ligar ao seu alvo, AB3 é acoplado a uma terceira região de mascaramento (MM3) que diminui a capacidade de AB3 de se ligar ao seu alvo, e assim por diante para cada AB no anticorpo multiespecífico ativável .

[0391] Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável inclui ainda, pelo menos, uma região clivável (CM) que é um substrato para uma protease, onde a CM liga uma MM a um AB. Por exemplo, em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável inclui, pelo menos, um primeiro anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB1) que se liga especificamente a um alvo, e um segundo anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB2), onde pelo menos o primeiro AB no anticorpo multiespecífico ativável é acoplado através de uma primeira região clivável (CM1) a uma região de mascaramento (MM1) que diminui a capacidade de AB1 de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização de anticorpos ativáveis biespecíficos, AB1 é acoplado via CM1 à MM1, e AB2 é acoplado via uma segunda região clivável (CM2) a uma segunda região de mascaramento (MM2) que diminui a capacidade de AB2 de se ligar ao seu alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo multiespecífico ativável compreende mais do que duas regiões AB; em algumas destas formas de realização, AB1 é acoplado via CM1 à MM1, AB2 é acoplado via CM2 à MM2, e AB3 é acoplado por via uma terceira região clivável (CM3) a uma terceira região de mascaramento (MM3) que diminui a capacidade de AB3 de se ligar ao seu alvo, e assim por diante para cada AB no anticorpo multiespecífico ativável .

Anticorpos Ativáveis com Regiões Estéricas Não Ligantes ou Parceiros de Ligação para as Regiões Estéricas Não Ligantes

[0392] A divulgação também fornece anticorpos ativáveis que incluem regiões estéricas não ligantes (NB) ou parceiros de ligação (BP) para regiões estéricas não ligantes, onde os BP recrutam ou, de alguma forma, atraem a NB ao anticorpo ativável. Os anticorpos ativáveis proporcionados aqui incluem, por exemplo, um anticorpo ativável que inclui uma região estérica não ligante (NB), um ligante clivável (CL) e anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB) que se liga a um alvo; um anticorpo ativável que inclui um parceiro de ligação para uma região estérica não ligante (BP), um CL e um AB; e um anticorpo ativável que inclui um BP para o qual uma NB foi recrutada, um CL e um AB que se ligam ao alvo. Os anticorpos ativáveis nos quais a NB é ligada covalentemente ao CL e AB do anticorpo ativável ou é associada pela interação com um BP que está covalentemente ligado ao CL e AB do anticorpo ativável, são referidos aqui como "anticorpos ativáveis contendo NB". Entende-se por ativável ou alternável o anticorpo ativável que apresenta um primeiro nível de ligação a um alvo, quando o anticorpo ativável encontra-se em um estado inibido, mascarado/ encoberto ou não clivado (isto é, uma primeira conformação), e um segundo nível de ligação ao alvo quando o anticorpo ativável encontra-se em um estado não inibido, desmascarado/ descoberto e/ou clivado (isto é, uma segunda conformação, isto é, o anticorpo ativado), em que o segundo nível de ligação ao alvo é maior do que o primeiro nível de de ligação ao alvo. As composições de anticorpos ativáveis podem apresentar maior biodisponibilidade e uma biodistribuição mais favorável em comparação com o tratamento com anticorpos convencionais.

[0393] Em algumas formas de realização, os anticorpos ativáveis proporcionam toxicidade e/ou efeitos colaterais adversos reduzidos que, de alguma maneira, poderiam resultar da ligação nos locais não relacionados ao tratamento e/ou locais não relacionados ao diagnóstico, se não houvesse o mascaramento ou, de algum modo, a inibição de AB de se ligar ao referido local.

[0394] Em uma forma de realização, o anticorpo ativável inclui uma região estérica não ligante (NB); um ligante clivável (CL); e um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB), que se liga especificamente ao alvo, em que a NB é um polipeptídeo que não se liga especificamente ao AB; CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) para uma enzima; CL é posicionado de tal modo que, em um estado não clivado, a NB interfere com a ligação do AB ao alvo e, em um estado clivado, a NB não interfere com a ligação do AB ao alvo; e a NB não inibe a clivagem do CL pela enzima. Conforme utilizado aqui e ao longo do documento, o termo polipeptídeo refere-se a qualquer polipeptídeo que inclui pelo menos dois resíduos de aminoácidos, incluindo polipetídeos maiores, as proteínas completas e seus fragmentos, e o termo polipeptídeo não está limitado aos polipetídeos de cadeia simples e pode incluir polipetídeos de múltiplas unidades, por exemplo, múltiplas cadeias. Nos casos em que o polipeptídeo tem um comprimento mais curto, por exemplo, menos de 50 aminoácidos no total, os termos peptídeo e polipeptídeo são utilizados aqui alternadamente, e nos casos em que o polipeptídeo é de um comprimento mais longo, por exemplo, 50 aminoácidos ou mais, os termos polipeptídeo e proteína são utilizados aqui alternadamente.

[0395] Em uma forma de realização, o anticorpo ativável inclui uma região estérica não ligante (NB); um ligante clivável (CL); e um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que (i) a NB inclui um polipeptídeo que não se liga especificamente a AB; (ii) CL é um polipeptídeo de até 50 aminoácidos de comprimento, que inclui um substrato (S) para uma enzima; (iii) o CL é posicionado de tal modo que, em um estado não clivado, a NB interfere com a ligação do AB ao alvo e, em um estado clivado, a NB não interfere com a ligação do AB ao alvo; e (iv) a NB não inibe a clivagem do CL pela enzima. Por exemplo, o CL tem um comprimento de até 15 aminoácidos, um comprimento de até 20 faixa de 15 a 50 aminoácidos, um comprimento na faixa de 20 a 50 aminoácidos, um comprimento na faixa de 25 a 50 aminoácidos, um comprimento na faixa de 30 a 50 aminoácidos, um comprimento na faixa de 35 a 50 aminoácidos, um comprimento na faixa de 40 a 50 aminoácidos, um comprimento na faixa de 45 a 50 aminoácidos, um comprimento na faixa de 10 a 40 aminoácidos, um comprimento na faixa de 15 a 40 aminoácidos, um comprimento na faixa de 20 a 40 aminoácidos, um comprimento no intervalo de 25 a 40 aminoácidos, um comprimento na faixa de 30 a 40 aminoácidos, um comprimento na faixa de 35 a 40 aminoácidos, um comprimento na faixa de 10 a 30 aminoácidos, um comprimento na faixa de 15 a 30 aminoácidos, um comprimento na faixa de 20 a 30 aminoácidos, um comprimento na faixa de 25 a 30 aminoácidos, um comprimento na faixa de 10 a 20 aminoácidos, ou um comprimento na faixa de 10 a 15 aminoácidos.

[0396] Em uma forma de realização, o anticorpo ativável inclui uma região estérica não ligante (NB); um ligante clivável (CL); e um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que (i) a NB inclui um polipeptídeo que não se liga especificamente a AB; (ii) o CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) para uma enzima; (iii) o CL é posicionado de tal modo que, em um estado não clivado, a NB interfere com a ligação do AB ao alvo e, em um estado clivado, a NB não interfere com a ligação do AB ao alvo; (iv) a NB não inibe a clivagem do CL pela enzima; e (v) o anticorpo ativável apresenta o arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma no estado não clivado: NB-CL-AB ou AB-CL-NB.

[0397] Em uma forma de realização, o anticorpo ativável inclui uma região estérica não ligante (NB); um ligante clivável (CL); e um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que (i) a NB inclui um polipeptídeo que não se liga especificamente a AB; (ii) o CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) para uma enzima; (iii) o CL é posicionado de tal modo que, em um estado não clivado, a NB interfere com a ligação do AB ao alvo e, em um estado clivado, a NB não interfere com a ligação do AB ao alvo, e em que a NB no anticorpo ativável clivado reduz a capacidade de AB de se ligar ao alvo em pelo menos 50%, por exemplo, em pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, por pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, em pelo menos 100%, em comparação com a capacidade do AB clivado de se ligar ao alvo; e (iv) a NB não inibe a clivagem do CL pela enzima. A redução da capacidade de AB de se ligar ao alvo é determinada, por exemplo, utilizando-se um teste, tal como aqui descrito, ou um teste de deslocamento de alvo in vitro, tal como, por exemplo, o teste descrito nas Publicações PCT Nos. WO 2009/025846 e WO 2010/081173.

[0398] Em uma forma de realização, o anticorpo ativável inclui um parceiro de ligação (BP) para uma região estérica não ligante (NB); um ligante clivável (CL); e um anticorpo ou fragmento de anticorpo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o BP é um polipeptídeo que se liga à NB quando exposta ao mesmo; a NB não se liga especificamente a AB; CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) para uma enzima; CL é posicionado de tal modo que, em um estado não clivado na presença de NB, a NB interfere com a ligação do AB ao alvo e, em um estado clivado, a NB não interfere com a ligação do AB ao alvo e o BP não interfere com a ligação do AB ao alvo; e a NB e o BP não inibem a clivagem do CL pela enzima. Em alguns exemplos desta forma de realização, o BP do anticorpo ativável é opcionalmente ligado à NB. Em uma forma de realização, a NB é recrutada pelo BP do anticorpo ativável in vivo.

[0399] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável é formulado como uma composição. Em algumas dessas formas de realização, a composição também inclui a NB, em que a NB é coproduzida com o anticorpo ativável que inclui o BP, o CL, e o AB. Em alguns exemplos desta forma de realização, o BP é selecionado a partir do grupo composto por um peptídeo de ligação a albumina, um peptídeo de ligação a fibrinogênio, um peptídeo de ligação a fibronectina, um peptídeo de ligação a hemoglobina, um peptídeo de ligação a transferrina, um peptídeo de ligação a domínio de imunoglobulina, e a outra peptídeos de ligação a proteínas de soro.

[0400] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, a NB é uma proteína globular solúvel. Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, a NB é uma proteína que circula na corrente sanguínea. Em alguns exemplos de qualquer destas formas de realização de anticorpo ativável, a NB é selecionada a partir do grupo composto por albumina, fibrinogênio, fibronectina, hemoglobina, transferrina, um domínio de imunoglobulina, e outras proteínas de soro.

[0401] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) para uma protease. Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, a protease está colocalizada com este em um tecido, e a protease cliva o CL no anticorpo ativável quando o anticorpo ativável é exposto à protease. Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o CL é um polipeptídeo de até 50 aminoácidos de comprimento. Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) que tem um comprimento de até 15 aminoácidos, por exemplo, 3 aminoácidos de comprimento, 4 aminoácidos de comprimento, 5 aminoácidos de comprimento, 6 aminoácidos de comprimento, 7 aminoácidos de comprimento, 8 aminoácidos de comprimento, 9 aminoácidos de comprimento, 10 aminoácidos de comprimento, 11 aminoácidos de comprimento, 12 aminoácidos de comprimento, 13 aminoácidos de comprimento, 14 aminoácidos de comprimento, ou 15 aminoácidos de comprimento.

[0402] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável apresenta o arranjo estrutural, da região N- terminal a região C-terminal, da seguinte forma no estado não clivado: NB-CL-AB, AB-CL-NB, BP-CL-AB ou AB-CL-BP. Em formas de realização onde o anticorpo ativável inclui um BP e o anticorpo ativável está na presença da NB correspondente, o anticorpo ativável tem um arranjo estrutural da região N-terminal a região C- terminal, da seguinte forma no estado não clivado: NB: BP-CM-AB ou AB-CM-BP: NB, em que “:” representa uma interação, por exemplo, uma ligação, entre a NB e BP.

[0403] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável inclui um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um determinado alvo e é um anticorpo monoclonal, um anticorpo de domínio, de cadeia simples, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um scFv, um scAb, um dAb, um anticorpo de cadeia pesada de domínio único, ou um anticorpo de cadeia leve de domínio único. Em algumas formas de realização, o referido anticorpo ou um fragmento imunologicamente ativo do mesmo que se liga ao alvo é um anticorpo monoclonal humanizado ou inteiramente humano, quimérico, murino, ou de outro roedor.

[0404] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável inclui uma combinação de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos aqui apresentada e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos aqui apresentada. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável inclui uma combinação de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos aqui apresentada, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos aqui apresentada.

[0405] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável também inclui um agente conjugado ao AB. Em algumas formas de realização, o agente é um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, o agente é um agente antineoplásico. Em algumas formas de realização, o agente é uma toxina ou um fragmento da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante não clivável. Em algumas formas de realização, o agente é um agente selecionado a partir do grupo apresentado na Tabela 3. Em algumas formas de realização, o agente é um inibidor de microtúbulos. Em algumas formas de realização, o agente é um agente de dano ao ácido nucleico, tal como um agente alquilante de DNA ou agente intercalante de DNA, ou outro agente de dano ao DNA. Em algumas formas de realização, o agente é uma dolastatina. Em algumas formas de realização, o agente é uma auristatina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é a auristatina E ou um derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina E (MMAE). Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina D (MMAD). Em algumas formas de realização, o agente é um derivado de maitansinóide ou maitansinóide. Em algumas formas de realização, o agente é DM1 ou DM4. Em algumas formas de realização, o agente é uma duocarmicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma caliqueamicina ou derivada da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma pirrolbenzodiazepina.

[0406] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável inclui também uma região detectável. Em algumas formas de realização, a região detectável é um agente de diagnóstico.

[0407] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável também inclui um espaçador. Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável também inclui um peptídeo sinal. Em algumas formas de realização, o peptídeo sinal é conjugado com o anticorpo ativável através de um espaçador. Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o espaçador é ligado diretamente à MM do anticorpo ativável.

[0408] Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é maior do que a do anticorpo correspondente; por exemplo, a pK do anticorpo ativável é maior do que a do anticorpo correspondente. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é semelhante à do anticorpo correspondente. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 15 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 12 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 11 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 10 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 9 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 8 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 7 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 6 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 5 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia- vida sérica do anticorpo ativável é pelo menos 4 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 3 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 2 dias, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 24 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 20 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 18 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 16 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 14 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia- vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 12 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 10 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 8 horas, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 6 horas quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é, pelo menos, 4 horas, quando administrado a um organismo. Em algumas formas de realização, a meia-vida sérica do anticorpo ativável é de pelo menos 3 horas quando administrado a um organismo.

[0409] A divulgação também proporciona uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica qualquer um destes anticorpos ativáveis, bem como os vetores que incluem estas sequências de ácidos nucleicos isolados. A divulgação proporciona métodos para produzir um anticorpo ativável por cultura de células sob condições que conduzem à expressão do anticorpo ativável, em que a célula compreende a referida sequência de ácido nucleico. Em algumas formas de realização, a célula compreende o referido vetor.

[0410] A constante de dissociação (Kd) do anticorpo ativável contendo NB em relação ao alvo é maior do que a Kd do AB em relação ao alvo, quando este não está associado a NB ou NB: BP. A constante de dissociação (Kd) do anticorpo ativável contendo NB em relação ao alvo é maior do que a Kd do AB original em relação ao alvo. Por exemplo, a Kd do anticorpo ativável contendo NB em relação ao alvo é, pelo menos, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou maior, ou entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 1010.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1,000-100.000, 1,000-1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, ou 100.000-10.000.000 vezes maior do que a Kd do AB, quando este não está associado a NB ou NB: BP ou a Kd do AB original em relação ao alvo. Por outro lado, a afinidade de ligação do anticorpo ativável contendo NB ao alvo é menor do que a afinidade de ligação do AB, quando este não está associado a NB ou NB: BP ou menor do que a afinidade de ligação do AB original ao alvo. Por exemplo, a afinidade de ligação do anticorpo ativável contendo NB ao alvo é, pelo menos, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ou maior, ou entre 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 101.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1,000-100.000, 1,000-1.000.000, 1.000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000, ou 100.000-10.000.000 vezes menor do que a afinidade de ligação do AB, quando este não está associado a NB ou NB: BP ou menor do que a afinidade de ligação de AB original ao alvo.

[0411] Quando o anticorpo ativável contendo NB está na presença do alvo, a ligação específica do AB ao alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB, quando este não está associado a NB ou NB : BP. Quando o anticorpo é ativável contendo NB na presença do alvo, a ligação específica do AB ao alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB original ao alvo. Quando comparada com a ligação do AB não associado a uma NB ou NB: BP ou a ligação do AB original ao alvo, a capacidade do anticorpo ativável contendo NB de se ligar ao alvo é reduzida, por exemplo, em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mesmo 100% por, pelo menos, 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ou 96 horas, ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 180 dias, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou mais, quando medida in vitro e/ou in vivo.

[0412] Quando o anticorpo ativável contendo NB está na presença do alvo, mas não na presença de um agente modificador (por exemplo, uma protease ou outra enzima), a ligação específica do AB ao alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB quando este não está associado a NB ou NB: BP. Quando o anticorpo ativável contendo NB está na presença do alvo, mas não na presença de um agente modificador (por exemplo uma protease, outra enzima, agente redutor, ou luz), a ligação específica do AB ao alvo é reduzida ou inibida, em comparação com a ligação específica do AB original ao alvo. Quando comparada com a ligação do AB não associado a uma NB ou NB: BP ou a ligação do AB original ao alvo, a capacidade do anticorpo ativável contendo NB de se ligar ao alvo é reduzida, por exemplo, em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mesmo 100% por, pelo menos, 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ou 96 horas, ou 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ou 180 dias, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou mais, quando medida in vitro e/ou in vivo.

[0413] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, o anticorpo ativável inclui um agente conjugado ao AB para produzir um conjugado do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização do conjugado do anticorpo ativável, o agente é um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, o agente é um agente de diagnóstico. Em algumas formas de realização, o agente é um marcador detectável. Em algumas formas de realização do conjugado do anticorpo ativável, o agente é um agente antineoplásico. Em algumas formas de realização do conjugado do anticorpo ativável, o agente é uma toxina ou um fragmento da mesma. Em algumas formas de realização do conjugado do anticorpo ativável, o agente é conjugado ao AB através de um ligante. Em algumas formas de realização do conjugado do anticorpo ativável, o ligante é um ligante clivável. Em algumas formas de realização, o agente é conjugado ao AB através de um ligante não clivável. Em algumas formas de realização, o agente é um inibidor de microtúbulos. Em algumas formas de realização, o agente é um agente de dano ao ácido nucleico, tal como um agente alquilante de DNA ou agente intercalante de DNA, ou outro agente de dano ao DNA. Em algumas formas de realização, o agente é um agente selecionado a partir do grupo apresentado na Tabela 3. Em algumas formas de realização, o agente é uma dolastatina. Em algumas formas de realização, o agente é uma auristatina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é a auristatina E ou um derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina E (MMAE). Em algumas formas de realização, o agente é o monometil auristatina D (MMAD). Em algumas formas de realização, o agente é um derivado de maitansinóide ou maitansinóide. Em algumas formas de realização, o agente é DM1 ou DM4. Em algumas formas de realização, o agente é uma duocarmicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma caliqueamicina ou derivado da mesma. Em algumas formas de realização, o agente é uma pirrolbenzodiazepina.

[0414] Em alguns exemplos de quaisquer destas formas de realização de anticorpo ativável, os anticorpos ativáveis são anticorpos ativáveis de ligação a duplo alvo. Os referidos anticorpos ativáveis de ligação a duplo alvo contêm dois Abs que podem se ligar a alvos iguais ou diferentes. Em formas de realização específicas, anticorpos ativáveis de ligação a duplo alvo contém anticorpos ou fragmentos de anticorpos biespecíficos.

[0415] Os anticorpos ativáveis de ligação a duplo alvo são concebidos de modo a ter um CL clivável por um agente de clivagem que está colocalizado em um tecido alvo com um ou ambos os alvos, capazes de se ligarem ao ABs dos anticorpos ativáveis. Os anticorpos ativáveis de ligação a duplo alvo com mais de um AB para alvos iguais ou diferentes podem ser concebidos de modo a ter mais de um CL, em que o primeiro CL é clivável por um agente de clivagem em um primeiro tecido alvo e, onde o segundo CL é clivável por um agente de clivagem em um segundo tecido alvo, com um ou mais dos alvos se ligando aos ABs dos anticorpos ativáveis. Em uma forma de realização, os primeiro e segundo tecidos alvo estão espacialmente separados, por exemplo, em locais diferentes no organismo. Em uma forma de realização, os primeiro e segundo tecidos alvo são o mesmo tecido temporalmente separados, por exemplo, o mesmo tecido em dois pontos no tempo diferentes, por exemplo, o primeiro ponto no tempo é quando o tecido é um tumor de fase inicial, e o segundo ponto no tempo é quando o tecido é um tumor de fase tardia.

[0416] A divulgação também proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos ativáveis descritos aqui. A divulgação também proporciona vetores que incluem estes ácidos nucleicos. Os anticorpos descritos aqui ativáveis são produzidos por cultura de células sob condições que conduzem à expressão do anticorpo ativável, em que a célula inclui estas moléculas de ácido nucleico ou vetores.

[0417] A divulgação também proporciona métodos para produzir anticorpos ativáveis. Em uma forma de realização, o método inclui as etapas de (a) cultura de células compreendendo um construto de ácido nucleico que codifica o anticorpo ativável sob condições que levam à expressão do anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui (i) uma região estérica não ligante (NB); (ii) um ligante clivável (CL); e (iii) um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (AB), que se liga especificamente a um alvo, em que (1) a NB não se liga especificamente a AB; (2) o CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) para uma enzima; (3) o CL é posicionado de tal modo que, em um estado não clivado, a NB interfere com a ligação do AB ao alvo e, em um estado clivado, a NB não interfere com a ligação do AB ao alvo; e (4) a NB não inibe a clivagem do CL pela enzima; e (b) recuperação do anticorpo ativável.

[0418] Em algumas formas de realização, o método inclui as etapas de (a) cultura de células compreendendo um construto de ácido nucleico que codifica o anticorpo ativável sob condições que levam à expressão do anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui (i) um parceiro de ligação (BP) para uma região estérica não ligante (NB); (ii) um ligante clivável (CL); e (iii) um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (AB) que se liga especificamente a um alvo, em que (1) a NB não se liga especificamente a AB; (2) o CL é um polipeptídeo que inclui um substrato (S) para uma enzima; (3) o CL é posicionado de tal modo que, em um estado não clivado, a NB interfere com a ligação do AB ao alvo e, em um estado clivado, a NB não interfere com a ligação do AB ao alvo e o BP não interfere com a ligação do AB ao alvo; e (4) a NB e o BP não inibem a clivagem do CL pela enzima; e (b) recuperação do anticorpo ativável. Em alguns exemplos desta forma de realização, o BP do anticorpo ativável é ligado a NB.

Uso de Anticorpos Ativáveis e Anticorpos Conjugados Ativáveis

[0419] Será compreendido que a administração de entidades terapêuticas, de acordo com a divulgação, será realizada com carreadores adequados, excipientes, e outros agentes que são incorporados em formulações de modo a proporcionar uma melhor transferência, entrega, tolerância, e similares. Uma pluralidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente o Capítulo 87 por Blaug, Seymour, no mesmo. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, unguentos, ceras, óleos, lipídeos, lipídeos (aniônicos ou catiônicos) contendo vesículas (tais como Lipofectin™), conjugados de DNA, pastas anidras de absorção, emulsões óleo-em-água e emulsões água-em- óleo, emulsões de carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos, e misturas semissólidos contendo carbowax. Qualquer uma das misturas anteriores pode ser adequada em tratamentos e terapias de acordo com a presente divulgação, desde que o ingrediente ativo na formulação não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e aceitável com a via de administração. Vide também Baldrick P. " Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance" Regul. Toxicol Pharmacol. 32 (2): 210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals" Int. J. Pharm. 203 (1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts" J Pharm Sci.89 (8): 967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 (1998) e as citações nele para informações adicionais relacionadas a formulações, excipientes e carreadores bem conhecidos químicos farmacêuticos.

[0420] As formulações terapêuticas da presente divulgaçao, que incluem um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável, são utilizados para prevenir, tratar ou de outra forma melhorar uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou à atividade aberrante do alvo. Por exemplo, as formulações terapêuticas da presente divulgação que incluem um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável, são utilizadas para tratar ou de outra forma melhorar a inflamação, um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune e/ou um câncer ou outra condição neoplásica. Em algumas formas de realização, o câncer é um tumor sólido ou uma malignidade hematológica onde o alvo é expresso. Em algumas formas de realização, o câncer é um tumor sólido onde o alvo é expresso. Em algumas formas de realização, o câncer é uma doença maligna hematológica onde o alvo é expresso. Em algumas formas de realização, o alvo é expresso no parênquima (por exemplo, em câncer, a parte de um órgão ou tecido que muitas vezes realiza a(s) função (ões) do órgão ou do tecido). Em algumas formas de realização, o alvo é expresso em uma célula, tecido ou órgão. Em algumas formas de realização, o alvo é expresso no estroma (isto é, o tecido conjuntivo de sustentação de uma célula, tecido ou órgão). Em algumas formas de realização, o alvo é expresso em um osteoblasto. Em algumas formas de realização, o alvo é expresso sobre o endotélio (vasculatura). Em algumas formas de realização, o alvo é expresso em uma célula tronco cancerosa. Em algumas formas de realização, o agente ao qual o anticorpo ativável é conjugado é um inibidor de microtúbulos. Em algumas formas de realização, o agente ao qual o anticorpo ativável é conjugado é um agente causador de dano a ácido nucleico.

[0421] A eficácia da prevenção, da melhora ou do tratamento é determinada em associação com qualquer método conhecido para diagnosticar ou tratar a doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade do alvo, tal como, por exemplo, expressão e/ou atividade aberrante do alvo. O prolongamento da sobrevida de um indivíduo ou o retardo da progressão da doença ou do distúrbio associado à expressão e/ou a atividade do alvo, por exemplo, expressão e/ou atividade aberrante do alvo, em um indivíduo, indica que o anticorpo conjugado, anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado confere um benefício clínico.

[0422] Um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável pode ser administrado sob a forma de composições farmacêuticas. Os princípios e considerações envolvidas na preparação de tais composições, bem como a orientação na escolha dos componentes são obtidos, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa, 1994; e Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4) de 1991, M. Dekker, New York.

[0423] Em algumas formas de realização, onde os fragmentos de anticorpos são utilizados, o fragmento menor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo é selecionado. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, as moléculas peptídicas podem ser concebidas para manterem a capacidade de se ligarem à sequência da proteína alvo. Tais peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de DNA recombinante. (Vide, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90: 7889-7893 (1993)). A formulação pode conter também mais do que um composto ativo, se necessário, para a indicação particular a ser tratada, por exemplo, em algumas formas de realização, as que têm atividades complementares que não afetam negativamente umas as outras. Em algumas formas de realização, ou em adição, a composição pode compreender um agente que potencializa a sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterápico ou agente inibidor do crescimento. As referidas moléculas estão adequadamente presentes em combinação e em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

[0424] Os ingredientes ativos podem ser também envolvidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas coloidais de entrega de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões.

[0425] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado pela filtração através de membranas de filtração estéreis.

[0426] As preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes estas que estão sob a forma de artigos conformados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem os poliésteres, hidrogeis (por exemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato), ou poli (álcool vinílico)), polilactídeos (Pat. US 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e Y etil-L-glutamato, etileno acetato de vinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido glicólico-ácido láctico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto os polímeros, tais como o etileno acetato de vinila e ácido láctico-ácido glicólico permitem a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogeis liberam proteínas durante períodos de tempo mais curtos.

[0427] Em algumas formas de realização, o anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável contém um marcador detectável. Um anticorpo intacto, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Fab, scFv ou F(ab)2) é usado. O termo "marcado", no que diz respeito à sonda ou anticorpo, destina-se a abranger a marcação direta da sonda ou do anticorpo por acoplamento (isto é, ligando fisicamente) de uma substância detectável à sonda ou anticorpo, assim como, a marcação indireta da sonda ou anticorpo por meio da reatividade com outro reagente que é marcado diretamente. Exemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário, utilizando um anticorpo secundário marcado com fluorescência e a marcação final de uma sonda de DNA com biotina, de tal modo que pode ser detectada com estreptavidina marcada fluorescentemente. O termo "amostra biológica" pretende incluir tecidos, células e fluidos biológicos isolados de um indivíduo, bem como tecidos, células e fluidos presentes em um indivíduo. Incluem-se no uso do termo "amostra biológica", por conseguinte, o sangue e uma fração ou componente de sangue, incluindo soro sanguíneo, plasma sanguíneo ou linfático. Isto é, o método de detecção da divulgação pode ser utilizado para detectar um analito de RNAm, proteína, ou o DNA genômico em uma amostra biológica in vitro, bem como in vivo. Por exemplo, as técnicas in vitro para a detecção de um analito de RNAm incluem as hibridações Northern e hibridações in situ. As técnicas in vitro para a detecção de um analito de proteína incluem os ensaios de imunossorbância ligado à enzima (ELISAs), Western blots, imunoprecipitações, coloração imunoquímica e imunofluorescência. As técnicas in vitro para a detecção de uma analito genômico de DNA incluem as hibridações Southern. Os procedimentos para a condução dos imunoensaios estão descritos, por exemplo, em “ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay", E. Diamandis e T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; e “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Além disso, técnicas in vivo para a detecção de um analito de proteínas incluem a introdução em um indivíduo de um anticorpo proteico anti-analito marcado. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radioativo cuja presença e localização em um indivíduo pode ser detectada por técnicas de imagem convencionais.

[0428] Os conjugados de anticorpos, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados da presente divulgação são também úteis em uma variedade de formulações profiláticas e diagnósticas. Em uma forma de realização, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável é administrado aos pacientes que estão em risco de desenvolver um ou mais dos distúrbios acima mencionados. Uma predisposição do paciente ou do órgão para desenvolver um ou mais distúrbios mencionados acima pode ser determinada utilizando-se marcadores bioquímicos, genéticos, ou sorológicos.

[0429] Em algumas formas de realização, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável é administrado aos indivíduos humanos diagnosticados com uma indicação clínica associada a um ou mais distúrbios acima mencionados. Após o diagnóstico, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável é administrado de modo a mitigar ou reverter os efeitos da indicação clínica.

[0430] Um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável da divulgação também é útil na detecção de um alvo em amostras de pacientes e, consequentemente, são úteis como agentes de diagnóstico. Por exemplo, os anticorpos e/ou anticorpos ativáveis, e versões conjugadas dos mesmos, da divulgação são utilizados nos ensaios in vitro, por exemplo, ELISA, para detectar os níveis do alvo em uma amostra do paciente.

[0431] Em uma forma de realização, um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável da divulgação é imobilizado sobre um suporte sólido (por exemplo, o(s) poço(s) de uma placa de microtitulação). O anticorpo conjugado, anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável imobilizado serve como um anticorpo de captura para qualquer alvo que possa estar presente em uma amostra de teste. Antes de colocar em contato o anticorpo imobilizado com uma amostra do paciente, o suporte sólido é lavado e tratado com um agente de bloqueio, como as proteínas do leite ou de albumina para evitar a adsorção não específica da substância a ser analisada.

[0432] A seguir, os poços são tratados com uma amostra de teste suspeita de conter o antígeno, ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno. A referida amostra é, por exemplo, uma amostra de soro de um indivíduo suspeito de ter os níveis de antígeno circulantes considerados como diagnóstico de uma patologia. Após a lavagem da amostra de teste ou padrão, o suporte sólido é tratado com um segundo anticorpo que é marcado de forma detectável. O segundo anticorpo marcado serve como um anticorpo de detecção. O nível de marcador detectável é medido, e a concentração de antígeno alvo na amostra de teste é determinada através da comparação com uma curva padrão desenvolvida a partir das amostras padrão.

[0433] Será compreendido que, com base nos resultados obtidos utilizando- se os anticorpos da presente divulgação, e as versões conjugadas dos mesmos, em um teste de diagnóstico in vitro, é possível realizar o estadiamento de uma doença em um indivíduo com base nos níveis de expressão do antígeno alvo. Para uma determinada doença, as amostras de sangue são coletadas de indivíduos diagnosticados como estando em vários estágios na progressão da doença, e/ou em vários pontos no tratamento terapêutico da doença. Usando uma população de amostras que fornece resultados estatisticamente significativos para cada fase de progressão ou terapia, uma faixa de concentrações de antígeno que podem ser consideradas características de cada fase é designada.

[0434] Um anticorpo conjugado, um anticorpo ativável e/ou um anticorpo conjugado ativável também pode ser utilizado em métodos de diagnóstico e/ou de imagem. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos in vitro. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos in vivo. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos in situ. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos ex vivo. Por exemplo, os anticorpos ativáveis tendo uma CM clivável enzimaticamente podem ser utilizados para detectar a presença ou ausência de uma enzima que é capaz de clivar a CM. Os referidos anticorpos ativáveis podem ser utilizados em diagnósticos, os quais podem incluir a detecção in vivo (por exemplo, qualitativa ou quantitativa) da atividade enzimática (ou, em algumas formas de realização, um ambiente de maior potencial de redução, tal como aquele que pode propiciar a redução de uma ligação dissulfeto) através da acumulação medida de anticorpos ativados (ou seja, os anticorpos resultantes da clivagem de um anticorpo ativável) em uma determinada célula ou tecido de um determinado organismo hospedeiro. A referida acumulação de anticorpos ativados indica não apenas que o tecido expressa a atividade enzimática (ou um maior potencial de redução em função da natureza da CM), mas também que o tecido expressa o alvo ao qual se liga o anticorpo ativado.

[0435] Por exemplo, a CM pode ser selecionada para ser um substrato para uma metaloproteinase de matriz (MMP) encontrada no local de um tumor, no local de uma infecção viral ou bacteriana em um local biologicamente limitado (como, por exemplo, em um abcesso, em um órgão, e similares), e similar. O AB pode ser um que se liga a um antígeno alvo. Utilizando-se os métodos divulgados aqui, ou quando apropriado, métodos estes familiares aos técnicos no assunto, um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente ou um marcador radioativo ou radiotraçador) pode ser conjugado a um AB ou outra região de um anticorpo e/ou anticorpo ativável. Os marcadores detectáveis adequados são discutidos dentro do contexto dos métodos de ratreamento acima, e exemplos específicos adicionais são proporcionados abaixo. Utilizando-se um AB específico a uma proteína ou peptídeo do estado da doença, juntamente com uma MMP, cuja atividade é maior no tecido relacionado à doença de interesse, os anticorpos ativáveis apresentam uma maior velocidade de ligação ao tecido relacionado à doença em relação aos tecidos onde a enzima específica para CM não está presente em um nível detectável ou está presente em um nível menor do que no tecido relacionado à doença ou está inativo (por exemplo, na forma de zimogênio ou em complexo com um inibidor). Uma vez que pequenas proteínas e peptídeos são rapidamente eliminados do sangue pelo sistema de filtração renal, e devido à enzima específica para CM não estar presente em um nível detectável (ou está presente em níveis baixos em tecidos não relacionados à doença ou está presente na conformação inativa), a acumulação de anticorpos ativados no tecido do paciente é aumentada em relação aos tecidos não relacionados à doença.

[0436] Em outro exemplo, os anticorpos ativáveis podem ser utilizados para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em uma amostra. Por exemplo, onde os anticorpos ativáveis contêm uma CM susceptível à clivagem por uma enzima, os anticorpos ativáveis podem ser utilizados para detectar (qualitativamente ou quantitativamente) a presença de uma enzima na amostra. Em outro exemplo, onde os anticorpos ativáveis contêm uma CM susceptível à clivagem por um agente redutor, os anticorpos ativáveis podem ser utilizados para detectar (qualitativamente ou quantitativamente) a presença de condições redutoras em uma amostra. Para facilitar a análise nestes métodos, os anticorpos ativáveis podem ser marcados de forma detectável, e podem ser ligados a um suporte (por exemplo, um suporte sólido, tal como uma lâmina ou bead/ esfera). O marcador detectável pode ser posicionado em uma parte do anticorpo ativável que não é liberada após a clivagem, por exemplo, o marcador detectável pode ser um marcador inibidor de fluorescência (quenched fluorescent label) ou outro marcador que não é detectável até que tenha ocorrido a clivagem. O ensaio pode ser realizado, por exemplo, pelo contato dos anticorpos ativáveis imobilizados e marcados de forma detectável com uma amostra suspeita de conter uma enzima e/ou agente redutor durante um tempo suficiente para que a clivagem ocorra, em seguida, lava-se para remover o excesso de amostra e contaminantes. A presença ou ausência do agente de clivagem (por exemplo, a enzima ou agente redutor) presente na amostra é, em seguida, avaliada através da alteração do sinal detectável dos anticorpos ativáveis antes do contato com a amostra, por exemplo, a presença de e/ou um aumento nos sinais detectáveis devido à clivagem do anticorpo ativável pelo agente de clivagem na amostra.

[0437] Os referidos métodos de detecção podem ser também adaptados de modo a assegurar a detecção da presença ou ausência de um alvo que é capaz de se ligar ao AB dos anticorpos ativáveis quando clivados. Assim, os ensaios podem ser adaptados para avaliar a presença ou ausência de um agente de clivagem e a presença ou ausência de um alvo de interesse. A presença ou ausência do agente de clivagem pode ser detectada pela presença e/ou pelo aumento do marcador detectável dos anticorpos ativáveis como descrito acima, e a presença ou ausência do alvo pode ser detectada através da detecção de um complexo alvo-AB, por exemplo, pela utilização de um anticorpo anti-alvo com marcação detectável.

[0438] Os anticorpos ativáveis também são úteis em imagens in situ para a validação da ativação do anticorpo ativável, por exemplo, pela clivagem pou Protease, e da ligação a um determinado alvo. A técnica de imagem in situ permite a localização da atividade proteolítica e do alvo em amostras biológicas, tais como as culturas de células ou secções de tecido. Utilizando esta técnica, é possível confirmar tanto a ligação a um determinado alvo quanto a atividade proteolítica com base na presença de um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente).

[0439] Estas técnicas são úteis com quaisquer células congeladas ou tecidos derivados de um local da doença (por exemplo, do tecido tumoral) ou de tecidos saudáveis. Estas técnicas também são úteis com amostras de células ou de tecidos frescos.

[0440] Nestas técnicas, um anticorpo ativável é marcado com um marcador detectável. O marcador detectável pode ser um corante fluorescente, (por exemplo, um fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina isotiocianato (TRITC), um marcador Alexa Fluor®), um corante para região do infravermelho próximo (NIR) (por exemplo, nanocristais Qdot®), um metal coloidal, um hapteno, um marcador radioativo, biotina e um reagente de amplificação, tal como a estreptavidina, ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina).

[0441] A detecção do marcador em uma amostra que foi incubada com o anticorpo ativável marcado, indica que a amostra contém o alvo e contém uma metaloproteinase de matriz (MMP) que é específica para a CM do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, a presença para MMP pode ser confirmada utilizando-se inibidores de amplo espectro da protease, de acordo com descritos os aqui, e/ou utilizando-se um agente que é específico para a protease, por exemplo, um anticorpo, tal como A11, que é específico para a protease matriptase (MT-SP1) e inibe a atividade proteolítica da matriptase; vide, por exemplo, a Publicação Internacional No. WO 2010/129609, publicada em 11 de Novembro de 2010. A mesma abordagem de utilização de inibidores da protease de amplo espectro, de acordo com descritos os aqui, e/ou utilização de um agente inibidor mais seletivo pode ser empregado para identificar uma MMP específica para a CM do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, a presença do alvo pode ser confirmada utilizando-se um agente que é específico para o alvo, por exemplo, um outro anticorpo, ou o marcador detectável pode ser competitivo com o alvo não marcado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não marcado poderia ser utilizado na detecção por um anticorpo secundário marcado, ou um sistema de detecção mais complexo.

[0442] Técnicas similares também são úteis para a técnica de imagem in vivo, em que a detecção do sinal de fluorescência em um indivíduo, por exemplo, um mamífero, incluindo um humano, indica que o local da doença contém o alvo e contém uma MMP que é específica para a CM do anticorpo ativável.

[0443] Estas técnicas também são úteis em kits e/ou como reagentes para detecção, identificação ou caracterização da atividade da protease em uma variedade de células, tecidos e organismos com base na CM específica para a protease no anticorpo ativável.

[0444] A divulgação proporciona métodos de utilização dos anticorpos e/ou anticorpos ativáveis em uma variedade de indicações profiláticas e/ou diagnósticas. Por exemplo, A divulgação proporciona métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e um alvo de interesse em um indivíduo ou em uma amostra através: (i) do contato de um indivíduo ou amostra com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável compreende uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno ou fragmento do mesmo (AB), que se liga especificamente ao alvo de interesse, em que o anticorpo ativável, em um estado não clivado e não ativado, compreende um arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; e (b) em que, em um estado não clivado e não ativado, a MM interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e, em um estado clivado e ativado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (ii) da medição de um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra, em que nenhum nível detectável do anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem, o alvo ou ambos o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou amostra. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado em AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0445] A divulgação também proporciona métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou em uma amostra através: (i) do contato de um indivíduo ou amostra com um anticorpo ativável na presença de um alvo de interesse, por exemplo, o alvo, em que o anticorpo ativável compreende uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno ou fragmento do mesmo (AB), que se liga especificamente ao alvo de interesse, em que o anticorpo ativável, em um estado não clivado e não ativado, compreende um arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; e (b) em que, em um estado não clivado e não ativado, a MM interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e, em um estado clivado e ativado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (ii) da medição de um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra, em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado em AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0446] A divulgação também proporciona kits para utilização em métodos de detecção de presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou em uma amostra, em que os kits incluem, pelo menos, um anticorpo ativável compreendendo uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno ou fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo de interesse, em que o anticorpo ativável, em um estado não clivado e não ativado, compreende um arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM- CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; e (b) em que, em um estado não clivado e não ativado, a MM interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e, em um estado clivado e ativado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e (ii) da medição de um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra e que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado em AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0447] A divulgação também proporciona métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou em uma amostra através: (i) do contato de um indivíduo ou amostra com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável compreende uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, um domínio de ligação ao antígeno (AB) que se liga especificamente ao alvo, e um marcador detectável, em que o anticorpo ativável, em um estado não clivado e não ativado, compreende um arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM- CM-AB ou AB-CM-MM; em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB e não é uma forma modificada de um parceiro de ligação natural do AB; em que, em um estado não clivado e não ativado, a MM interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e, em um estado clivado e ativado, a MM não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo; e em que o marcador detectável é posicionado em uma parte do anticorpo ativável que é liberada após a clivagem da CM; e (ii) da medição de um nível de marcador detectável no indivíduo ou amostra, em que um nível detectável de marcador detectável no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra, em que nenhum nível detectável do marcador detectável no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado em AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0448] A divulgação também proporciona kits para utilização em métodos de detecção de presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou em uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável (por exemplo, um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado) descrito aqui, para ser utilizado em contato com uma amostra biológica ou indivíduo, e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo conjugado ativável no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra biológica e em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo ou ambos o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou amostra biológica, de tal modo que a ligação ao alvo e/ou clivagem pela protease do anticorpo ativável não pode ser detectada no indivíduo ou amostra biológica.

[0449] A divulgação também proporciona métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou em uma amostra através: (i) do contato de um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável na presença do alvo, e (ii) da medição de uma nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra biológica, em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra biológica em um nível detectável, de tal modo que a clivagem do anticorpo ativável pela protease não pode ser detectada no indivíduo ou amostra biológica. O referido anticorpo ativável inclui uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável, em um estado não clivado (isto é, não ativado) compreende um arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável, em um estado não clivado, interfere com a ligação específica do AB ao alvo, em que a MM de um anticorpo ativável, em um estado clivado (isto é, ativado), não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é ligado à região de mascaramento. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é ligado a uma região clivável N-terminal ao sítio de clivagem da protease. Em algumas formas de realização, um único sítio de ligação ao antígeno do AB é mascarado. Em algumas formas de realização, em que um anticorpo da divulgação tem pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno, pelo menos, um sítio de ligação ao antígeno é mascarado e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno não é mascarado. Em algumas formas de realização, todos os sítios de ligação ao antígeno são mascarados. Em algumas formas de realização, a etapa de medição inclui a utilização de um reagente secundário compreendendo um marcador detectável.

[0450] A divulgação também proporciona kits para utilização em métodos de detecção de presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou em uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável descrito aqui para ser utilizado no contato de um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável na presença do alvo, e a medição de um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que a agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra biológica, em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra biológica em um nível detectável, tal que a clivagem do anticorpo ativável pela protease não pode ser detectada na indivíduo ou amostra biológica. O referido anticorpo ativável inclui uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável, em um estado clivado (ou seja, não ativado) compreende um arranjo estrutural, da região N- terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável, em um estado não clivado interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e em que a MM de um anticorpo ativável em um estado clivado (isto é, ativado) não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é ligado à região de mascaramento. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é ligado a uma região clivável N-terminal ao sítio de clivagem da protease. Em algumas formas de realização, um único sítio de ligação ao antígeno do AB é mascarado. Em algumas formas de realização, em que um anticorpo da divulgação tem pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno, pelo menos um sítio de ligação ao antígeno é mascarado e pelo menos um sítio de ligação ao antígeno não é mascarado. Em algumas formas de realização, todos os sítios de ligação ao antígeno são mascarados. Em algumas formas de realização, a etapa de medição inclui a utilização de um reagente secundário compreendendo um marcador detectável.

[0451] A divulgação também proporciona kits para utilização em métodos de detecção de presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou em uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo ativável conjugado descrito aqui para ser utilizado em contato com um indivíduo ou amostra biológica, e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo conjugado ativável no indivíduo ou amostra biológica, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que é posicionado em uma parte do anticorpo ativável que é liberada após a clivagem da CM, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra biológica, tal que a ligação ao alvo e/ou clivagem do anticorpo ativável pela protease não pode ser detectada no indivíduo ou amostra biológica, em que nenhum nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra biológica em um nível detectável.

[0452] A divulgação proporciona métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou em uma amostra através: (i) do contato de um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que é posicionado em uma parte do anticorpo ativável que é liberada após a clivagem do CM e (ii) da medição de um nível de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo ou ambos o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou amostra biológica, de tal forma que a ligação ao alvo e/ou clivagem do anticorpo ativável pela protease não pode ser detectada no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível reduzido de anticorpo detectável ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%. O referido anticorpo ativável inclui uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável, em um estado clivado (ou seja, não ativado) compreende um arranjo estrutural, da região N-terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-mm; (a) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável, em um estado não clivado, interfere com a ligação específica do AB ao alvo, e em que a MM de um anticorpo ativável, em um estado clivado (isto é, ativado) não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado em AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0453] A divulgação também proporciona kits para utilização em métodos de detecção de presença ou ausência de um agente de clivagem e o alvo em um indivíduo ou em uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável descrito aqui para ser utilizado em contato com um indivíduo ou amostra biológica e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo conjugado ativável no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo ou ambos o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou amostra biológica, de tal forma que a ligação ao alvo e/ou clivagem do anticorpo ativável pela protease não pode ser detectada no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível reduzido de anticorpo detectável ativável ativado no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%.

[0454] A divulgação também proporciona métodos para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em um indivíduo ou em uma amostra através: (i) do contato de um indivíduo ou amostra biológica com um anticorpo ativável, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que é posicionado em uma parte do anticorpo ativável que é liberada após a clivagem da CM; e (ii) da medição de um nível de marcador detectável no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável de marcador detectável no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está ausente e/ou não está suficientemente presente no indivíduo ou amostra biológica em um nível detectável, de tal modo que a clivagem do anticorpo ativável pela protease não pode ser detectada no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável reduzido do marcador detectável no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem está presente no indivíduo ou amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%. O referido anticorpo ativável inclui uma região de mascaramento (MM), uma região clivável (CM) que é clivada pelo agente de clivagem, e um domínio de ligação ao antígeno ou um fragmento do mesmo (AB) que se liga especificamente ao alvo, em que o anticorpo ativável, em um estado clivado (ou seja, não ativado) compreende um arranjo estrutural, da região N- terminal a região C-terminal, da seguinte forma: MM-CM-AB ou AB-CM-MM; (A) em que a MM é um peptídeo que inibe a ligação do AB ao alvo, sendo que a MM não tem uma sequência de aminoácidos de um parceiro de ligação de ocorrência natural do AB; e (b) em que a MM do anticorpo ativável em um estado não clivado interfere com a ligação específica do AB ao alvo, em que a MM de um anticorpo ativável em um estado clivado (isto é, ativado) não interfere ou compete com a ligação específica do AB ao alvo. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado em AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0455] A divulgação também proporciona kits para utilização em métodos de detecção de presença ou ausência de um agente de clivagem de interesse em um indivíduo ou em uma amostra, em que os kits incluem pelo menos um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável descrito aqui para ser utilizado em contato com um indivíduo ou amostra biológica, e meios para detectar o nível de anticorpo ativável ativado e/ou anticorpo conjugado ativável no indivíduo ou amostra biológica, em que o anticorpo ativável inclui um marcador detectável que é posicionado em uma parte do anticorpo ativável que é liberada após a clivagem da CM, em que um nível detectável de marcador detectável no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem, o alvo, ou ambos o agente de clivagem e o alvo estão ausentes e/ou não estão suficientemente presentes no indivíduo ou amostra biológica, de tal modo que a ligação ao alvo e/ou clivagem do anticorpo ativável pela protease não pode ser detectada no indivíduo ou amostra biológica, em que um nível detectável reduzido do marcador detectável no indivíduo ou amostra biológica indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes no indivíduo ou amostra biológica. Um nível reduzido de marcador detectável é, por exemplo, uma redução de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e/ou cerca de 100%.

[0456] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o anticorpo ativável inclui um marcador detectável. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador detectável inclui um agente de imagem, um agente de contraste, uma enzima, um marcador fluorescente, um cromóforo, um corante, um ou mais íons metálicos, ou um marcador que utiliza ligante. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o agente de imagem compreende um radioisótopo. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o radioisótopo é índio ou tecnécio. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o agente de contraste compreende iodo, gadolínio ou óxido de ferro. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, a enzima compreende a peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou β-galactosidase. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador fluorescente compreende proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha modificada (MRFP), proteína tdimer2 fluorescente vermelha (RFP tdimer2), HCRED, ou um derivado de európio. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador luminescente compreende um derivado de N-metilacridio. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador compreende um marcador Alexa Fluor®, tais como Alex Fluor® 680 ou Alexa Fluor® 750. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o marcador que utiliza ligante compreende a biotina, avidina, estreptavidina ou um ou mais haptenos.

[0457] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o indivíduo é um mamífero. Em algumas formas de realização destes métodos, o indivíduo é um humano. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero não humano, tal como um primata não humano, animal doméstico (por exemplo, gato, cão, cavalo), animal de criação, animal de trabalho, ou animal de zoológico. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um roedor.

[0458] Em algumas formas de realização destes métodos, o método é um método in vivo. Em algumas formas de realização destes métodos, o método é um método in situ. Em algumas formas de realização destes métodos, o método é um método ex vivo. Em algumas formas de realização destes métodos, o método é um método in vitro.

[0459] Em algumas formas de realização, imagens in situ e/ou imagens in vivo são úteis nos métodos para identificar quais os pacientes serão tratados. Por exemplo, na imagem in situ, os anticorpos ativáveis são utilizados para rastrear as amostras de pacientes para identificar aqueles pacientes que têm a(s) protease(s) e alvo(s) apropriados no local apropriado, por exemplo, em um sítio tumoral.

[0460] Em algumas formas de realização, a imagem in situ é utilizada para identificar ou, de outra forma, refinar uma população de pacientes adequados para o tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, os pacientes com resultado positivo tanto para o alvo (por exemplo, o alvo) e uma protease que cliva o substrato na região clivável (CM) do anticorpo ativável sendo testado (por exemplo, anticorpos ativados acumulados no local da doença) são identificados como candidatos adequados para o tratamento com o referido anticorpo ativável que compreende uma referida CM. Do mesmo modo, os pacientes com resultado negativo para um ou ambos o alvo (por exemplo, o alvo) e a protease que cliva o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado pelo uso destes métodos, podem ser identificados como candidatos adequados para uma outra forma de terapia. Em algumas formas de realização, tais pacientes com resultado negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo diferentes CMs até que um anticorpo ativável adequado para o tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas formas de realização, administra-se, então, ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo conjugado ativável para o qual o paciente teve resultado positivo.

[0461] Em algumas formas de realização, a imagem in vivo é utilizada para identificar ou, de outra forma, refinar uma população de pacientes adequados para o tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, os pacientes com resultado positivo tanto para o alvo (por exemplo, o alvo) e uma protease que cliva o substrato na região clivável (CM) do anticorpo ativável sendo testado (por exemplo, anticorpos ativados acumulados no local da doença) são identificados como candidatos adequados para o tratamento com o referido anticorpo ativável que compreende a referida CM. Da mesma forma, os pacientes com resultado negativo podem ser identificados como candidatos adequados para uma outra forma de terapia. Em algumas formas de realização, tais pacientes com resultado negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo diferentes CMs até que um anticorpo ativável adequado para o tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivadapelo paciente no local da doença). Em algumas formas de realização, administra-se, então, ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo conjugado ativável para o qual o paciente teve resultado positivo.

[0462] Em algumas formas de realização dos métodos e kits, o método ou kit é utilizado para identificar ou, de outra forma, refinar uma população de pacientes adequados para o tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, os pacientes com resultado positivo tanto para o alvo (por exemplo, o alvo) e uma protease que cliva o substrato na região clivável (CM) do anticorpo ativável sendo testado, nestes métodos, são identificados como candidatos adequados para o tratamento com um o referido anticorpo ativável compreendendo a referida CM. Do mesmo modo, os pacientes com resultado negativo para ambos os alvos (por exemplo, o alvo) e a protease que cliva o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado pelo uso destes métodos, podem ser identificados como candidatos adequados para uma outra forma de terapia. Em algumas formas de realização, tais pacientes podem ser testados com outros anticorpos ativáveis até que um anticorpo ativável adequado para o tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável que compreende uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas formas de realização, os pacientes com resultado negativo para um dos alvos (por exemplo, o alvo) são identificados como candidatos adequados para o tratamento com o referido anticorpo ativável que compreende a referida CM. Em algumas formas de realização, os pacientes com resultado negativo para um dos alvos (por exemplo, o alvo) são identificados como não sendo candidatos adequados para o tratamento com o referido anticorpo ativável que compreende a referida CM. Em algumas formas de realização, tais pacientes podem ser testados com outros anticorpos ativáveis até que um anticorpo ativável adequado para o tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável que compreende uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença). Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável é um anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não é conjugado a um agente. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o marcador detectável é posicionado em AB. Em algumas formas de realização, a medição do nível de anticorpo ativável no indivíduo ou amostra é realizada utilizando-se um reagente secundário que se liga especificamente ao anticorpo ativado, em que o reagente compreende um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o reagente secundário é um anticorpo que compreende um marcador detectável.

[0463] Em algumas formas de realização, um método ou kit é utilizado para identificar ou, de outra forma, refinar uma população de pacientes adequados para o tratamento com um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável antialvo (por exemplo, anticorpo ativável ao qual o agente terapêutico é conjugado) da divulgação, seguido pelo tratamento através da administração do anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável a um indivíduo que precise do mesmo. Por exemplo, os pacientes com resultado positivo para ambos os alvos (por exemplo, o alvo) e uma protease que cliva o substrato na região clivável (CM) do anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável sendo testado, nestes métodos, são identificados como sendo candidatos adequados para o tratamento com os referidos anticorpos e/ou o referido anticorpo conjugado ativável que compreende a referida CM, e administra-se, então, ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável que foi testado. Do mesmo modo, os pacientes com resultado negativo para um ou ambos o alvo (por exemplo, o alvo) e a protease que cliva o substrato na CM no anticorpo ativável sendo testado pelo uso destes métodos, podem ser identificados como candidatos adequados para uma outra forma de terapia. Em algumas formas de realização, tais pacientes podem ser testados com outros anticorpos e/ou anticorpo conjugado ativável até que um anticorpo adequado e/ou anticorpo conjugado ativável para o tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável compreendendo uma CM que é clivada pela paciente no local da doença). Em algumas formas de realização, administra-se, então, ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ativável e/ou conjugado para o qual o paciente teve resultado positivo.

[0464] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, a MM é um peptídeo que tem um comprimento de cerca de 4 a 40 aminoácidos. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o anticorpo ativável compreende um peptídeo de ligação, em que o peptídeo de ligação é posicionado entre a MM e a CM. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o anticorpo ativável compreende um peptídeo de ligação, em que o peptídeo de ligação é posicionado entre o AB e a CM. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o anticorpo ativável compreende um primeiro peptídeo de ligação (L1) e um segundo peptídeo de ligação (L2), em que o primeiro peptídeo de ligação é posicionado entre a MM e a CM e o segundo peptídeo de ligação é posicionado entre o AB e a CM. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, cada um de L1 e L2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento, em que cada L1 e L2 não precisam ser o mesmo ligante. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, um ou ambos L1 e L2 compreendem um polímero de glicina-serina. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, pelo menos um de L1 e L2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto por (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) e (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), em que n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, pelo menos, um de L1 e L2 compreende uma sequência de aminoácidos possuindo a fórmula (GGS)n, onde n é um número inteiro de pelo menos um. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, pelo menos um de L1 e L2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto pou Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 3), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 5), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 7), e Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 8).

[0465] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, AB compreende uma sequência de anticorpo ou fragmento de anticorpo selecionado a partir das sequências de anticorpos de reação cruzada apresentadas aqui. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, AB compreende um fragmento Fab, um scFv ou um anticorpo de cadeia simples (scAb).

[0466] Em algumas formas de realização destes métodos e kits, o agente de clivagem é uma protease que está colocalizada no indivíduo ou amostra com o alvo e a CM é um polipeptídeo que funciona como um substrato para a protease, em que a protease cliva a CM no anticorpo ativável quando o anticorpo ativável é exposto à protease. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, a CM é um polipeptídeo de até 15 aminoácidos de comprimento. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, a CM é acoplada à região N-terminal do AB. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, a CM é acoplada à região C- terminal do AB. Em algumas formas de realização destes métodos e kits, a CM é acoplada à região N-terminal de uma cadeia VL do AB.

[0467] Os anticorpos ativáveis e/ou anticorpos ativáveis conjugados da presente descrição são utilizados em formulações profiláticas e diagnósticas. Em uma forma de realização, um anticorpo ativável é administrado aos pacientes que estão em risco de desenvolver um ou mais de inflamação, doenças inflamatórias, câncer ou outras doenças mencionadas acima.

[0468] Uma predisposição do paciente ou do órgão para um ou mais distúrbios mencionados acima pode ser determinada utilizando-se marcadores bioquímicos, genéticos, ou sorológicos.

[0469] Em algumas formas de realização, um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável é administrado aos indivíduos humanos diagnosticados com uma indicação clínica associada a um ou mais distúrbios mencionados acima. Após o diagnóstico, um anticorpo ativável e/ou anticorpo conjugado ativável é administrado de modo a mitigar ou reverter os efeitos da indicação clínica.

[0470] O anticorpo ativável e/ou anticorpos conjugados ativáveis da presente divulgação também são úteis na detecção do alvo em amostras de pacientes e, consequentemente, são úteis como agentes de diagnóstico. Por exemplo, os anticorpos ativáveis e/ou anticorpos conjugados ativáveis da presente divulgação são utilizados em ensaios in vitro, por exemplo, ELISA, para se detectar os níveis do alvo em uma amostra do paciente.

[0471] Em uma forma de realização, um anticorpo ativável da divulgação é imobilizado sobre um suporte sólido (por exemplo, o(s) poço (s) de uma placa de microtitulação). O anticorpo imobilizado ativável serve como um anticorpo de captura para qualquer alvo que possa estar presente em uma amostra de teste. Antes de colocar em contato o anticorpo imobilizado com uma amostra do paciente, o suporte sólido é lavado e tratado com um agente de bloqueio, tais como as proteínas do leite ou de albumina para evitar a adsorção não específica da substância a ser analisada.

[0472] A seguir, os poços são tratados com uma amostra de teste suspeita de conter o antígeno, ou com uma solução contendo uma quantidade padrão do antígeno. A referida amostra é, por exemplo, uma amostra de soro de um indivíduo suspeito de ter os níveis de antígeno circulantes considerados como diagnóstico de uma patologia. Após a lavagem da amostra de teste ou padrão, o suporte sólido é tratado com um segundo anticorpo que é marcado de forma detectável. O segundo anticorpo marcado serve como um anticorpo de detecção. O nível de marcador detectável é medido, e a concentração de antígeno alvo na amostra de teste é determinada através da comparação com uma curva padrão desenvolvida a partir das amostras padrão.

[0473] Será compreendido que, com base nos resultados obtidos utilizando- se os anticorpos da presente descrição em um ensaio diagnóstico in vitro, é possível realizar o estadiamento de uma doença em um indivíduo com base nos níveis de expressão do antígeno alvo. Para uma determinada doença, as amostras de sangue são coletadas de indivíduos diagnosticados como estando em vários estágios na progressão da doença, e/ou em vários pontos no tratamento terapêutico da doença. Utilizando-se uma população de amostras que fornece resultados estatisticamente significativos para cada fase da progressão ou terapia, é designada uma faixa de concentrações de antígeno que podem ser consideradas características de cada fase.

[0474] O anticorpo ativável e/ou anticorpos ativáveis conjugados também podem ser utilizados em métodos de diagnóstico e/ou de imagem. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos in vitro. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos in vivo. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos in situ. Em algumas formas de realização, tais métodos são métodos ex vivo. Por exemplo, os anticorpos ativáveis tendo uma CM clivável enzimaticamente podem ser utilizados para detectar a presença ou ausência de uma enzima que é capaz de clivar a CM. Os referidos anticorpos ativáveis podem ser utilizados em diagnósticos, os quais podem incluir a detecção in vivo (por exemplo, qualitativa ou quantitativa) da atividade enzimática (ou, em algumas formas de realização, um ambiente de maior potencial de redução, tal como aquele que pode propiciar a redução de uma ligação dissulfeto) através da acumulação medida de anticorpos ativados (ou seja, os anticorpos resultantes da clivagem de um anticorpo ativável) em uma determinada célula ou tecido de um determinado organismo hospedeiro. A referida acumulação de anticorpos ativados indica não apenas que o tecido expressa a atividade enzimática (ou um maior potencial de redução em função da natureza da CM), mas também que o tecido expressa o alvo ao qual se liga o anticorpo ativado.

[0475] Por exemplo, a CM pode ser selecionada para ser um substrato para protease encontrada no local de um tumor, no local de uma infecção viral ou bacteriana em um local biologicamente limitado (como, por exemplo, em um abcesso, em um órgão, e similares), e similar. O AB pode ser um que se liga a um antígeno alvo. Utilizando-se os métodos familiares aos técnicos no assunto, um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente ou um marcador radioativo ou radiotraçador) pode ser conjugado a um AB ou outra região de um anticorpo ativável. Os marcadores detectáveis adequados são discutidos dentro do contexto dos métodos de ratreamento acima, e exemplos específicos adicionais são proporcionados abaixo. Utilizando-se um AB específico a uma proteína ou peptídeo do estado da doença, juntamente com uma protease, cuja atividade é maior no tecido relacionado à doença de interesse, os anticorpos ativáveis apresentam uma maior velocidade de ligação ao tecido relacionado à doença em relação aos tecidos onde a enzima específica para CM não está presente em um nível detectável ou está presente em um nível menor do que no tecido relacionado à doença ou está inativo (por exemplo, na forma de zimogênio ou em complexo com um inibidor). Uma vez que pequenas proteínas e peptídeos são rapidamente eliminados do sangue pelo sistema de filtração renal, e devido à enzima específica para CM não estar presente em um nível detectável (ou está presente em níveis baixos em tecidos não relacionados à doença ou está presente na conformação inativa), a acumulação de anticorpos ativados no tecido do paciente é aumentada em relação aos tecidos não relacionados à doença.

[0476] Em outro exemplo, os anticorpos ativáveis podem ser utilizados para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem em uma amostra. Por exemplo, onde os anticorpos ativáveis contêm uma CM susceptível à clivagem por uma enzima, os anticorpos ativáveis podem ser utilizados para detectar (qualitativamente ou quantitativamente) a presença de uma enzima na amostra. Em outro exemplo, onde os anticorpos ativáveis contêm uma CM susceptível à clivagem por um agente redutor, os anticorpos ativáveis podem ser utilizados para detectar (qualitativamente ou quantitativamente) a presença de condições redutoras em uma amostra. Para facilitar a análise nestes métodos, os anticorpos ativáveis podem ser marcados de forma detectável, e podem ser ligados a um suporte (por exemplo, um suporte sólido, tal como uma lâmina ou bead/ esfera). O marcador detectável pode ser posicionado em uma parte do anticorpo ativável que não é liberada após a clivagem, por exemplo, o marcador detectável pode ser marcador inibidor de fluorescência ou outro marcador que não é detectável até que tenha ocorrido a clivagem. O ensaio pode ser realizado, por exemplo, pelo contato dos anticorpos ativáveis imobilizados e marcados de forma detectável com uma amostra suspeita de conter uma enzima e/ou agente redutor por um tempo suficiente para que a clivagem ocorra, em seguida, lava-se para remover o excesso de amostra e contaminantes. A presença ou ausência do agente de clivagem (por exemplo, a enzima ou agente redutor) presente na amostra é, em seguida, avaliada através da alteração do sinal detectável dos anticorpos ativáveis antes do contato com a amostra, por exemplo, a presença de e/ou um aumento nos sinais detectáveis devido à clivagem do anticorpo ativável pelo agente de clivagem na amostra.

[0477] Os referidos métodos de detecção podem ser também adaptados de modo a assegurar a detecção da presença ou ausência de um alvo que é capaz de se ligar ao AB dos anticorpos ativáveis quando clivados. Assim, os ensaios podem ser adaptados para avaliar a presença ou ausência de um agente de clivagem e a presença ou ausência de um alvo de interesse. A presença ou ausência do agente de clivagem pode ser detectada pela presença e/ou pelo aumento do marcador detectável dos anticorpos ativáveis como descrito acima, e a presença ou ausência do alvo pode ser detectada através da detecção de um complexo alvo-AB, por exemplo, pela utilização de um anticorpo anti-alvo com marcação detectável.

[0478] Os anticorpos ativáveis também são úteis em imagens in situ para a validação da ativação do anticorpo ativável, por exemplo, pela clivagem pou Protease, e da ligação a um determinado alvo. A técnica de imagem in situ permite a localização da atividade proteolítica e do alvo em amostras biológicas, tais como as culturas de células ou secções de tecido. Utilizando esta técnica, é possível confirmar tanto a ligação a um determinado alvo quanto a atividade proteolítica com base na presença de um marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente).

[0479] Estas técnicas são úteis com quaisquer células congeladas ou tecidos derivados de um local da doença (por exemplo, do tecido tumoral) ou de tecidos saudáveis. Estas técnicas também são úteis com amostras de células ou de tecidos frescos.

[0480] Nestas técnicas, um anticorpo ativável é marcado com um marcador detectável. O marcador detectável pode ser um corante fluorescente, (por exemplo, um fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina isotiocianato (TRITC), um corante para região do infravermelho próximo (NIR) (por exemplo, nanocristais Qdot®)), um metal coloidal, um hapteno, um marcador radioativo, biotina e um reagente de amplificação, tal como a estreptavidina, ou uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina).

[0481] A detecção do marcador em uma amostra que foi incubada com o anticorpo ativável marcado, indica que a amostra contém o alvo e contém uma protease que é específica para a CM do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, a presença da protease pode ser confirmada utilizando-se inibidores de amplo espectro da protease, de acordo com descritos os aqui, e/ou utilizando-se um agente que é específico para a protease, por exemplo, um anticorpo, tal como A11, que é específico para a protease matriptase (MT-SP1) e inibe a atividade proteolítica da matriptase; vide, por exemplo, a Publicação Internacional No. WO 2010/129609, publicada em 11 de Novembro de 2010. A mesma abordagem de utilização de inibidores da protease de amplo espectro, de acordo com descritos os aqui, e/ou utilização de um agente inibidor mais seletivo pode ser empregada para identificar uma MMP específica para a CM do anticorpo ativável. Em algumas formas de realização, a presença do alvo pode ser confirmada utilizando-se um agente que é específico para o alvo, por exemplo, um outro anticorpo, ou o marcador detectável pode ser competitivo com o alvo não marcado. Em algumas formas de realização, o anticorpo ativável não marcado poderia ser utilizado na detecção por um anticorpo secundário marcado, ou um sistema de detecção mais complexo.

[0482] Técnicas similares também são úteis para a técnica de imagem in vivo, em que a detecção do sinal de fluorescência em um indivíduo, por exemplo, um mamífero, incluindo um humano, indica que o local da doença contém o alvo e contém uma protease que é específica para a CM do anticorpo ativável.

[0483] Estas técnicas também são úteis em kits e/ou como reagentes para detecção, identificação ou caracterização da atividade da protease em uma variedade de células, tecidos e organismos com base na CM específica para a protease no anticorpo ativável.

[0484] Em algumas formas de realização, imagens in situ e/ou imagens in vivo são úteis nos métodos para identificar quais os pacientes serão tratados. Por exemplo, na imagem in situ, os anticorpos ativáveis são utilizados para rastrear as amostras de pacientes para identificar aqueles pacientes que têm a(s) protease(s) e alvo(s) apropriados no local apropriado, por exemplo, em um sítio tumoral.

[0485] Em algumas formas de realização, imagens in situ são utilizadas para identificar ou, de outra forma, refinar uma população de pacientes adequada para o tratamento com um anticorpo ativável da divulgação. Por exemplo, os pacientes com resultado positivo para ambos o alvo ou uma protease que cliva o substrato na região clivável (CM) do anticorpo ativável sendo testado (por exemplo, anticorpos ativados acumulados no local da doença) são identificados como candidatos adequados para o tratamento com o referido anticorpo ativável que compreende a referida CM. Da mesma forma, os pacientes com resultado negativo para um ou ambos o alvo e uma protease que cliva o substrato na CM do anticorpo ativável sendo testado nestes métodos, podem ser identificados como candidatos adequados para uma outra forma de terapia (ou seja, não são adequados para o tratamento com o anticorpo sendo testado) . Em algumas formas de realização, tais pacientes com resultado negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo diferentes CMs até que um anticorpo ativável adequado para o tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença).

[0486] Em algumas formas de realização, imagens in vivo são utilizadas para identificar ou, de outra forma, refinar uma população de pacientes adequados para o tratamento com um anticorpo do ativável da divulgação. Por exemplo, os pacientes com resultado positivo para ambos o alvo e uma protease que cliva o substrato na região clivável (CM) do anticorpo ativável sendo testado (por exemplo, anticorpos ativados acumulados no local da doença) são identificados como candidatos adequados para o tratamento com o referido anticorpo ativável que compreende a referida CM. Da mesma forma, os pacientes com resultado negativo são identificados como candidatos adequados para uma outra forma de terapia (ou seja, não são adequados para o tratamento com o anticorpo ativável sendo testado). Em algumas formas de realização, tais pacientes com resultado negativo em relação a um primeiro anticorpo ativável podem ser testados com outros anticorpos ativáveis compreendendo diferentes CMs até que um anticorpo ativável apropriado para o tratamento seja identificado (por exemplo, um anticorpo ativável compreendendo uma CM que é clivada pelo paciente no local da doença).

Composições Farmacêuticas

[0487] Os anticorpos conjugados, anticorpos ativáveis e/ou anticorpos conjugados ativáveis da divulgação (referidos aqui também como "compostos ativos"), e derivados, fragmentos, análogos e homólogos dos mesmos, podem ser incorporados nas composições farmacêuticas adequadas para administração. As referidas composições compreendem, geralmente, o anticorpo conjugado, o anticorpo ativável e/ou o anticorpo conjugado ativável e um carreador farmaceuticamente aceitável. Conforme utilizado aqui, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" pretende incluir todos e quaisquer solventes, meios dispersantes, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento da absorção e isotônicos, e outros similares, compatíveis com a administração farmacêutica. Os carreadores adequados são descritos na edição mais recente de Remington’s Pharmaceutical Sciences, um texto de referência padrão neste campo, que é incorporado aqui por referência. Os exemplos adequados de tais transportadores ou diluentes incluem, mas não se limitam a, água, solução salina, soluções de Ringer, solução de dextrose, e albumina de soro humano a 5%. Também podem ser utilizados lipossomas e carreadores não aquosos, tais como os óleos fixados. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida no estado da arte. A sua utilização nas composições é contemplada exceto quando qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[0488] Uma composição farmacêutica da presente divulgação é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração parentérica incluem, por exemplo, a intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, por inalação), transdérmica (por exemplo, tópica), transmucosa, e retal. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica, ou subcutânea pode incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA); tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como o ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser colocada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plástico.

[0489] As composições farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem as soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para a administração intravenosa, carreadores adequados incluem o soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ou tampão fosfato salino (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista uma fácil seringabilidade. Deve ser estável sob as condições de produção e armazenamento e deve ser conservada contra a ação de microorganismos contaminantes, tais como bactérias e fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso da dispersão e pela utilização de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e outros similares. Em algumas formas de realização, faz-se necessário incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo, na composição, um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0490] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incluindo o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido pela esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da inclusão do composto ativo em um carreador estéril que contém um meio dispersante básico e os outros ingredientes necessários provenientes dos enumerados acima. No caso de pós estéreis, para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são a secagem a vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado proveniente de uma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo.

[0491] As composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um carreador comestível. Eles podem ser contidos em pastilhas de gelatina ou comprimidas em comprimidos. Para a finalidade da administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incluído com excipientes e utilizado sob a forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas. As composições orais podem também ser preparadas utilizando-se um transportador fluido para utilização como um enxaguante bucal, em que o composto no transportador fluido é aplicado oralmente, bochechado e expelido ou engolido. Agentes de ligação e/ou materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, pílulas, pastilhas e similares podem conter qualquer um dos ingredientes seguintes, ou compostos de natureza semelhante: um ligante, tal como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente, tal como amido ou lactose, um agente desintegrante, tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante, tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante, tal como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante, tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, salicilato de metila, ou aroma de laranja.

[0492] Para administração por inalação, os compostos são administrados na forma de um spray aerossol de um recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás, tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador.

[0493] A administração sistêmica também pode ser transmucosa ou por meios transdérmicos. Para a administração transmucosa ou transdérmica, os penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Os referidos penetrantes são geralmente conhecidos no estado da arte, e incluem, por exemplo, para administração transmucosa, os detergentes, sais biliares, e derivados do ácido fusídico. A administração transmucosa pode ser conseguida através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em unguentos, pomadas, geis, ou cremes, como geralmente conhecidos no estado da arte.

[0494] Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases convencionais para supositórios, tais como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para liberação retal.

[0495] Em uma forma de realização, os compostos ativos são preparados com carreadores que irão proteger o composto contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser utilizados, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para os técnicos no assunto. Os materiais podem também ser obtidos comercialmente a partir de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões de lipossomas (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) também podem ser utilizadas como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, como descrito na Patente US No. 4,522,811.

[0496] É especialmente vantajoso formular composições orais ou parenterais em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformizar a dosagem. A forma de unidade de dosagem, como aqui utilizada, refere-se às unidades discretas fisicamente adequadas como dosagens únicas para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo que foi calculada de forma a produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da divulgação são definidas e diretamente dependentes das características particulares do composto ativo e do efeito terapêutico a ser conseguido, e das limitações inerentes no estado da arte de compor o referido composto ativo para o tratamento de indivíduos.

[0497] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem, ou dispensador juntamente com as instruções para administração.

[0498] A invenção será descrita ainda nos exemplos seguintes, os quais não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.

EXEMPLOS Exemplo 1. Capacidade do Fluido Sinovial de Ativar Sondas Supressoras que Compreendem os Substratos da Divulgação

[0499] Este exemplo demonstra a capacidade de as amostras de fluido sinovial de clivar sequências substrato para MMP da presente divulgação. Particularmente, as sequências cliváveis por MMP foram testadas no contexto de um construto de anticorpo ativável que compreende uma região de mascaramento ligada a uma sequência de anticorpo anti-IL-6R através de uma região ligante que inclui a sequência clivável por MMP a ser avaliada.

[0500] Os seguintes anticorpos ativáveis cliváveis por MMP foram incubadas com fluido sinovial: Aminoácido 479210419AV1 QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDCGSSGGSGGSGGSGISSGLSSGGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 115) Nucleotídeo 479210419AV1 caaggccagtctggccagtatgggtcctgcagttggaactatgtacacatattcatggattgcggctcgagc ggtggcagcggtggctctggtggctcaggtattagtagtggtcttagcagtggcggttctgacatccagatgactcagtct cctagctccctgtccgcctctgtgggggaccgagtcaccatcacatgcagagccagccaggatatttctagttacctga actggtatcagcagaagcccggaaaagcacctaagctgctgatctactatacctccaggctgcactctggcgtgccc agtcggttcagtggctcagggagcggaaccgacttcacttttaccatctcaagcctgcagccagaggatattgccacat actattgtcagcagggcaatacactgccctacacttttggccaggggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggct gcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataactt 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cggtggcagcggtggctctggtggctcaagtacatttccattcggtatgttcggcggttctgacatccagatgactcagtc tcctagctccctgtccgcctctgtgggggaccgagtcaccatcacatgcagagccagccaggatatttctagttacctga actggtatcagcagaagcccggaaaagcacctaagctgctgatctactatacctccaggctgcactctggcgtgccc agtcggttcagtggctcagggagcggaaccgacttcacttttaccatctcaagcctgcagccagaggatattgccacat actattgtcagcagggcaatacactgccctacacttttggccaggggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggct gcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataactt c tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcaca gagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaa cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagag tgt (SEQ ID NO: 122) Aminoácido 47923458AV1 QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDCGSSGGSGGSGGSPVGYTSSLGGSDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSR FSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKdSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 123) Nucleotídeo 47923458AV1 caaggccagtctggccagtatgggtcctgcagttggaactatgtacacatattcatggattgcggctcgagc ggtggcagcggtggctctggtggctcacctgttggatatacgagtagtctgggcggttctgacatccagatgactcagtc tcctagctccctgtccgcctctgtgggggaccgagtcaccatcacatgcagagccagccaggatatttctagttacctga actggtatcagcagaagcccggaaaagcacctaagctgctgatctactatacctccaggctgcactctggcgtgccc agtcggttcagtggctcagggagcggaaccgacttcacttttaccatctcaagcctgcagccagaggatattgccacat actattgtcagcagggcaatacactgccctacacttttggccaggggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggct gcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataactt ctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcac agagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaa acacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggaga gtgt (SEQ ID NO: 124) Aminoácido 47923463AV1 QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDCGSSGGSGGSGGSDWLYWPGIGGSDIQM TQSPSSLSASVGD RVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFT ISSL QPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKdSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQG LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 125) Nucleotídeo 47923463AV1 caaggccagtctggccagtatgggtcctgcagttggaactatgtacacatattcatggatt gcggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggctcagactggttatactggcctggtat tggcggttctgacatccagatgactcagtctcctagctccctgtccgcctctgtgggggac cgagtcaccatcacatgcagagccagccaggatatttctagttacctgaactggtatcagc agaagcccggaaaagcacctaagctgctgatctactatacctccaggctgcactctggcgt gcccagtcggttcagtggctcagggagcggaaccgacttcacttttaccatctcaagcctg cagccagaggatattgccacatactattgtcagcagggcaatacactgccctacacttttg gccaggggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttccc gccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccc aggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgac gctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 66)

[0501] A extensão da ativação do anticorpo ativável foi determinada por sob a forma de ELISA, o qual mediu a capacidade do anticorpo ativável, após a à incubação em fluido sinovial, de se ligar ao IL6R humano, em comparação com a ligação do anticorpo anti-IL6R original ao IL6R. Resumidamente, placas Maxisorp Nunc foram revestidas durante a noite a 4°C com 100 μL/poço (microlitros/poço) de uma solução de IL6R humano a 500 ng/mL (R & D Systems, Cat No. 227-SR/CF) em PBS, pH 7,4. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST (PBS, pH 7,4, 0,05% de Tween-20). Os poços foram então bloqueados com 200 μL/poço, 2% de NFDM (leite em pó desnatado) em PBST por 2 horas à temperatura ambiente. As placas revestidas de IL6R foram lavadas 3 vezes com PBST (PBS, pH 7,4, 0,05% de Tween-20). Uma diluição em série de cada mistura reacional de anticorpo ativável - líquido sinovial, bem como uma diluição em série do anticorpo anti-IL6R original, foi adicionada aos determinados poços da placa de ELISA revestida de IL6R. As placas foram incubadas 1 hora à temperatura ambiente, e depois lavadas 3 vezes com PBST (PBS, pH 7,4, 0,05% de Tween-20). Cem μL/ poço de diluição a 1: 3000 de IgG de cabra anti-humano (Fab específico, Sigma Cat No. A0293) em 2% de NFDM- PBST foram adicionados, e a placa foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 6 vezes com PBST (PBS, pH 7,4, 0,05% de Tween-20) e, em seguida, reveladas com TMB e 1 N de HCl.

[0502] A Tabela 6 apresenta os resultados deste experimento. Os dados indicam que os anticorpos ativáveis anti-IL6R, que compreendem os substratos apresentados na Tabela 6, são clivados por, pelo menos, algumas amostras de fluido sinovial (SyF) obtidas de pacientes com AR. TABELA 6. Ativação do Anticorpo Ativável

Exemplo 2. Anticorpo Ativável anti-EGFR com Substrato Clivável por MMP para inibir o crescimento tumoral.

[0503] Este exemplo demonstra a capacidade de um anticorpo ativável anti- EGFR, que contém uma região de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 160), uma região de clivagem compreendendo o substrato 520 para MMP14 (referido aqui também como MN520) ISSGLLSS (SEQ ID NO: 14), e a cadeia pesada (SEQ ID NO: 56) e a cadeia leve (SEQ ID NO: 59) do anticorpo anti-EGFR C225v5, onde todo o construto do anticorpo ativável é referido aqui como Pb-MN520, de inibir o crescimento tumoral no modelo de xenoenxerto de câncer do pulmão H292. A configuração da cadeia leve do anticorpo ativável foi região de mascaramento - substrato para MMP - cadeia leve de C225v5.

[0504] A Figura 1A é um gráfico que descreve os efeitos observados em camundongo portadores do tumor de xenoenxerto H292 que foram tratados com Pb- 520 (12,5 mg/kg, linha azul sólida) e IVIG (12,5 mg/kg, linha tracejada verde) dosados em tempos diferentes. Os dados são apresentados como volume médio de tumor ± SEM. A Figura 1B é um gráfico que ilustra a estabilidade sistêmica do anticorpo ativável Pb-520 em camundongos portadores de tumores H292. As amostras de sangue foram coletadas através da hemorragia retro-orbital no dia 7 e a estabilidade em circulação do substrato 520 foi determinado pela análise de pulldown de IgG com eletroforese capilar (GXII; Caliper Life Sciences). As concentrações de cadeia leve clivada e não clivada foram determinadas utilizando o software LabChip GX (Caliper Life Sciences).

Exemplo 3. Materiais e Métodos

[0505] Reagentes e Cepas: Ficoeritrina conjugada com estreptavidina (SA- PE) (Invitrogen, Life Technologies) foi utilizada sem modificações. MMP9 humana (Research & Diagnostics Systems, Inc.) foi ativada, seguindo o protocolo fornecido e utilizada sem modificações. MMP14 humana (Research & Diagnostics Systems, Inc.) foi ativada, seguindo o protocolo fornecido e utilizada sem modificações. A plasmina humana (Haematologic Technologies Inc.) foi utilizada sem modificações. tPA humano (Innovations Molecular) foi utilizado sem modificações. YPet fusionado com o domínio SH3 de Mona (proteína adaptadora monocítica) foi produzido em CytomX Therapeutics e utilizado sem modificações. Tampão para MMP14, HCM (50 mM de HEPES (pH 6,8), 10 mM de CaCl2, 0,5 mM de MgCl2), foi utilizado. Tampão TCNB para MMP9 (50mM de Tris-HCl, 10 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl, 0,05% (p/v) de Brij-35, pH 7,5) foi utilizado. O tampão da plasmina (50 mM de Tris-Cl pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,01% de Tween 20 e 1 mM de EDTA foi utilizado. TBST (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) foi utilizado. E. coli MC1061 (Casadaban et al., JMB 138 (2): 179-207 (1980)) foi utilizado. Todo o crescimento bacteriano foi realizado a 37°C com agitação vigorosa em meio Luria-Bertani (LB) suplementado com 34 μg/mL de cloranfenicol, a menos que outro antibiótico seja especificado.

[0506] Substrato para Clivagem e Análise de Estabilidade do Scaffold: Para a análise de rastreamento e clonal, as culturas overnight foram subcultivadas pela diluição em meio fresco (1:50) e crescidas por 1,5 a 2 horas. A subcultura foi, em seguida, induzida com 0,04% de arabinose e incubada com agitação a 37°C por 45 minutos a 1 hora. Para interromper a continuação do crescimento, as células foram incubadas em gelo por 15 minutos a 1 hora. As alíquotas de células foram coletadas e lavadas com PBS (pH 7,4). As células foram sedimentadas por centrifugação, o sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em tampão de reação contendo a enzima; a mistura reacional foi incubada parada a 37°C. Para parar a reação, as células foram removidas e diluídas 10 vezes em PBS, sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em PBS contendo tanto (CLiPS) SA-PE (20 μg/mL) ou YPet-MONA (50 nM). Após a incubação em gelo (30 minutos), as células foram lavadas com PBS e analisadas utilizando um separador de células FACSAria™.

[0507] Para os ensaios de clivagem pela protease MMP9, as culturas foram induzidas por 45 minutos a 1 hora. O tampão de reação para MMP9 foi o TCNB. Os ensaios de hidrólise por MMP9 foram realizados após as células frescas terem sido incubadas com 5 nM - 25 nM para MMP9 por 1 h. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o sítio do substrato (usando a plataforma eCLiPS3.0- NSUB_SP, descrito no pedido de patente PCT PCT/US13/ 54378, depositado em 09 de agosto de 2013, que foi publicado como Publicação Internacional No. WO 2014/026136, em 13 de fevereiro, 2014 , cujos conteúdos são incorporados aqui na sua totalidade por referência) foi medido em cada condição reacional de modo a garantir que a hidrólise ocorreu na região de substrato parasignada.

[0508] Para os ensaios de clivagem da protease MMP14, as culturas foram induzidas por 45 minutos a 1 hora. O tampão de reação para MMP14 foi o HCM. Os ensaios de hidrólise por MMP14 foram realizados após a reação com 3 nM - 250 nM para MMP14 ou 1 h. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando a plataforma eCLiPS3.0-NSUB_SP descrita aqui) foi medido em cada condição reacional de modo a garantir que a hidrólise ocorreu na região de substrato parasignada.

[0509] Para os ensaios de estabilidade da plasmina humana, a plataforma eCLiPS3.0-NSUB_SP é utilizada; culturas são induzidas por 45 minutos a 1 hora. O tampão de reação para a plasmina é 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, suplementado com NaCl a 100 mM, 0,01% de Tween20 e 1 mM de EDTA. Os ensaios de hidrólise da plasmina são realizados após as reações com plasmina por 1 h.

[0510] Para os ensaios de estabilidade de tPA humano, a plataforma eCLiPS3.0-NSUB_SP é utilizada; as culturas são induzidas por 45 minutos a 1 hora. O tampão de reação para o tPA é o TBST. Os ensaios de hidrólise por tPA são realizadas após as reações com tPA por 1 h.

[0511] Condições de Marcação dos Terminais Amino e Carboxi: A estreptavidina conjugada com ficoeritrina (SAPE) foi utilizada para marcar o ligante com afinidade de ligação à estreptavidina na região N-terminal de CPX. A proteína fluorescente YPet, fusionada com o domínio SH3 de MONA, foi utilizada para marcar o ligante com afinidade de ligação a MONA na região C-terminal de CPX. Para a marcação ótima das células sem reação da protease, as células foram incubadas por 30 min a 4°C com SAPE (20 μg/mL) ou YPet-MONA (50 nM). Para o exemplo descrito abaixo, uma incubação de 30 min foi utilizada.

[0512] Análise dos Dados da Cinética: A extensão da conversão dos substratos peptídicos apresentados na superfície celular foi mensurada diretamente utilizando-se a citometria de fluxo para medir as alterações na fluorescência média de populações de células clonais sob tratamento com protease. Especificamente, para cada amostra, a conversão foi determinada pelas análises de citometria de fluxo utilizando-se a relação onde (FL-) é a fluorescência após a incubação sem enzima, (FL+) é a fluorescência após a incubação com a enzima, e (FL0) é a fluorescência das células não marcadas. Dado que as concentrações esperadas de substrato que foram utilizadas estão significativamente abaixo da KM esperada do substrato para a protease alvo, o modelo de Michaelis-Menten simplifica a: o que permite que a conversão do substrato seja expressa como onde [S] é a concentração do substrato, [E] é a concentração da enzima e t é o tempo. Para determinar a constante de velocidade de reação de segunda ordem (kcat/KM), a equação [3] foi simplificada para: onde C é a conversão do produto, t é o tempo e P é a concentração da protease.

[0513] Análise dos Dados de Sequência - Famílias Dirigidas: os substratos foram submetidos ao sequenciamento Ion Torrent™ (ver, por exemplo, Rothenberg, JM, Nature 475, 348-352). As leituras brutas do Ion Torrent foram cortadas pelas sequências de vetor invariáveis para obter apenas o inserto de peptídeo variável. As sequências do inserto foram traduzidas, e as sequências com códons de parada foram excluídas das análises posteriores. A frequência de cada sequência foi obtida pelo número de vezes em que foi observada sobre todas as leituras de peptídeos viáveis observadas. O enriquecimento das sequências foi obtido pela comparação da frequência observada de cada sequência pós-seleção com a frequência de cada sequência pré-seleção. As sequências individuais foram identificadas e isoladas a partir desses dados, e as sequências foram alinhadas na plataforma CLC (CLC Main Workbench 6.6.2, disponível on-line). O arquivo de alinhamento foi importado para Jalview (vide, por exemplo, Waterhouse, AM, et al., 2009, Bioinformatics 9, 11891191), e uma árvore de distância média foi gerada utilizando-se o algoritmo BLOSUM62 (HeniKoff S S et al., 1992 , Proc Natl Acad Sci EUA. 89, 10915-10919). O grupo restrito de sequências inclui membros do cluster mais próximo da sequência de interesse. O grupo estendido de sequências inclui o grupo restrito de sequências mais os membros do ramo que compartilha o ancestral comum mais próximo (quando aplicável).

Exemplo 4. Seleção e Caracterização de Pools de Substrato em um Scaffold da Plataforma

[0514] O uso da visualização do substrato multicópia em todas as células permitiu a seleção de populações de substratos clivadas por MMP9. As seleções foram realizadas conforme descrito na Patente US No. 7,666,817 B2, emitida em 23 de fevereiro de 2010, utilizando MMP9 humana recombinante. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando a plataforma eCLiPS3.0-NSUB_SP descrita aqui) foi medido em cada condição reacional de modo a garantir que a hidrólise ocorreu na região de substrato parasignada. Pools selecionados foram testados com MMP9 e MMP14. As Figuras 2A e 2B mostram a clivagem do pool SMP87 por MMP9 a 5 nM em tampão TCNB.

Exemplo 5. Caracterização da Cinética de Clivagem no Scaffold da Plataforma

[0515] O uso da visualização do substrato multicópia em todas as células permitiu a caracterização quantitativa simples e direta da cinética de clivagem. Consequentemente, a citometria de fluxo foi utilizada para classificar os clones individuais isolados com base na conversão do substrato, e os clones foram identificados por sequenciamento de DNA. Desta forma, o grau de conversão para cada clone pode ser determinado em várias concentrações diferentes de protease e ajustado para um modelo de Michaelis-Menten (Seção Análise dos Dados da Cinética). A constante de velocidade de reação de segunda ordem observada (kcat/KM) foi determinada para cada substrato versus MMP9. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando a plataforma eCLiPS3.0-NSUB_SP descrita aqui) foi medido em cada condição reacional de modo a garantir que a hidrólise ocorreu na região de substrato parasignada. Por exemplo, as Figuras 3A e 3B mostram a clivagem de um substrato compreendendo a sequência de aminoácidos VAGRSMRP (SEQ ID NO: 484) por MMP9 a 5 nM em TBST.

Exemplo 6. Correlação da Frequência de sequenciamento de Nova Geração e Cinética de Clivagem do Substrato no Scaffold da Plataforma

[0516] Os pools finais de substratos enriquecidos foram Sequênciados utilizando-se o sequenciamento de nova geração Ion Torrent. As leituras brutas do Ion Torrent foram cortadas pelas sequências de vetor invariáveis para obter apenas o inserto de peptídeo variável. As sequências do inserto foram traduzidas, e as sequências com códons de parada foram excluídas das análises posteriores. Uma seleção de clones (que indica uma faixa de frequências) foi selecionada para análise funcional. Os clones selecionados foram clivados com MMP9 humano, e uma kcat/KM foi determinada para cada um. O logaritmo do número de cópias do clone no pool foi então representado graficamente versus o log da kcat/KM. A Figura 4 mostra a correlação entre a frequência de determinadas regiões de clivagem (Número de Cópias) e suas capacidades de serem clivadas por MMP9 (MMP9 kcat/KM M-1s-1).

Exemplo 7. Seleção e Caracterização de Pools de Substrato para um Scaffold da Plataforma

[0517] O uso da visualização do substrato multicópia em todas as células permitiu a seleção de populações de substratos clivadas por MMP14. As seleções foram realizadas conforme descrito na Patente US No. 7,666,817 B2, utilizando a MMP14 humana recombinante. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando a plataforma eCLiPS3.0-NSUB_SP descrita aqui) foi medido em cada condição reacional de modo a garantir que a hidrólise ocorreu na região de substrato parasignada. Os pools selecionados foram testados com MMP9 e MMP14. As Figuras 5A e 5B mostram a clivagem do pool SMP39 por MMP14 a 60 nM em tampão HCM.

Exemplo 8. Caracterização da Cinética de Clivagem de Substratos no Scaffold da Plataforma

[0518] O uso da visualização do substrato multicópia em todas as células permitiu a caracterização quantitativa simples e direta da cinética de clivagem. Consequentemente, a citometria de fluxo foi utilizada para classificar os clones individuais isolados com base na conversão do substrato, e os clones foram identificados por sequenciamento de DNA. Desta forma, o grau de conversão para cada clone pode ser determinado em várias concentrações diferentes de protease e ajustado para um modelo de Michaelis-Menten (Seção Análise dos Dados da Cinética). A constante de velocidade de reação de segunda ordem observada (kcat/KM) foi determinada para cada substrato versus MMP14. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando a plataforma eCLiPS3.0-NSUB_SP descrita aqui) foi medido em cada condição reacional de modo a garantir que a hidrólise ocorreu na região de substrato parasignada. Por exemplo, as Figuras 6A e 6B mostram a clivagem de um substrato compreendendo a sequência de aminoácidos QNQALRMA (SEQ ID NO: 15) por MMP14 a 30 nM em tampão CMH.

Exemplo 9. Atividade in vitro do Substrato nos Anticorpos Ativáveis

[0519] Este Exemplo demonstra a atividade in vitro dos substratos da divulgação quando estes são incorporados nos anticorpos ativáveis.

[0520] Vários substratos identificados nestes estudos foram inseridos nos anticorpos ativáveis tendo a máscara 3954 e a variante C225v5 de cetuximab, que é descrita na Publicação PCT No. WO 2013/163631, e que é incorporada aqui na sua totalidade por referência.

[0521] A capacidade dos substratos nos anticorpos ativáveis resultantes de serem clivados por MMP9 ou MMP14 foi determinada conforme a seguir. As digestões pela protease MMP9 foram realizadas em TCNB, 50mM de Tris-HCl, 10 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl, 0,05% (p/v) de Brij-35, pH 7,5. As digestões pela protease foram realizadas em 50 mM de HEPES (pH 6,8), 10 mM de CaCl2, 0,5 mM de MgCl2. Concentrações variadas para MMP9 ou MMP14 tituladas do sítio ativo foram combinadas com uma concentração de anticorpo ativável fixa para manter uma proregião entre substrato e a protease de, pelo menos, 50. As amostras que compreendem os substratos para MMP9 foram incubadas a 37°C por até 24 h. As amostras que compreendem os substratos para MMP14 foram incubadas a 37°C por 4 h. Para parar a reação, 5 μL do produto da digestão foram adicionados a 7 μL do tampão de amostra HT Protein Express (Caliper Life Sciences) contendo 20 mM de 2-mercaptoetanol por 10 minutos a 95°C. Após a desnaturação pelo calor, 32 μL de ddH20 foram adicionados e as amostras analisadas em um LabChip GXII de acordo com as instruções do fabricante. O software LabChip GXII foi utilizado para quantificar a área de pico da cadeia leve. A conversão do produto foi calculada ao ligar as áreas dos picos da cadeia leve à seguinte equação: LC clivada/(LC clivada + LC não clivada), LC = cadeia leve. Os valores de kcat/KM foram determinados pela seguinte equação onde C é a conversão do produto, t é o tempo (s), e p é a concentração de protease (M), que assume que a concentração do substrato está abaixo de KM e em excesso da concentração da protease.

[0522] Os anticorpos ativáveis resultantes que compreendem os substratos selecionados para a clivagem por MMP14, testados para a clivagem por MMP14, tinham valores de kcat/KM que variam de cerca de 400 a 60.000 M-1s-1 para MMP14. Os anticorpos ativáveis resultantes que compreendem os substratos selecionados para a clivagem por MMP9, testados para a clivagem por MMP9, foram clivados por MMP9.

Exemplo 10. Estabilidade do Substrato dos Anticorpos Ativáveis In vivo

[0523] Este Exemplo demonstra a estabilidade in vivo dos substratos da divulgação quando estes são incorporados nos anticorpos ativáveis e injetados em camundongos.

[0524] Três camundongos nude (CRL: NU-Foxn1nu) receberam uma dose única IP de cada anticorpo ativável a 12,5 mg/kg no dia 0. Os camundongos foram sacrificados no dia 4 (~ 96 h após a dose) por asfixia com CO2, e o sangue foi coletado imediatamente como plasma-EDTA e armazenado a -80°C.

[0525] Os anticorpos ativáveis foram purificados do plasma por imunoprecipitacão com anti-IgG humana utilizando beads magnéticas. Os anticorpos ativáveis eluídos foram preparados para análise por eletroforese capilar, tal como descrito na seção de kcat/KM. Resumidamente, 5 μL de IgG eluida foram adicionados a 7 μL do tampão de amostra Protein Express com 2-mercaptoetanol. A quantificação da estabilidade em circulação foi idêntica à quantificação da conversão do produto.

[0526] Dos dez anticorpos ativáveis que compreendem os substratos da divulgação selecionados para a clivagem por MMP14, sete demonstraram menos de 20% de clivagem em amostras de plasma coletadas. De sete anticorpos ativáveis que compreendem os substratos da divulgação selecionados para a clivagem por MMP9, quatro demonstraram não mais do que 20% de clivagem nas amostras de plasma coletadas.

Exemplo 11. Materiais e Métodos

[0527] Reagentes e Cepas: MMP9 Humano (no. de catálogo: 911-MP, Research & Diagnostics Systems, Inc.) foi ativado seguindo o protocolo fornecido e usado sem modificações. MMP14 humano (no. de catálogo: 918-M), Research & Diagnostics Systems, Inc.) foi ativado seguindo o protocolo fornecido e usado sem modificações. A plasmina humana (no. de catálogo: HCPM-0140, Haematologic Technologies Inc.) foi utilizada sem modificações. O anticorpo monoclonal anti-EE (Covance, Princeton, NJ) foi marcado com Alexa 647 (Life Sciences) e utilizado sem outras modificações (chamado EE647). As cepas (DHlOp) derivadas de E. coli MCI061 ou MCI061 foram utilizadas em todas os experimentos (Casadaban et al., JMB 138 (2): 179-207 (1980)). Todo o crescimento bacteriano foi realizado a 37°C com agitação vigorosa em meio Luria-Bertani (LB) suplementado com 34 μg/mL de cloranfenicol (cm), a menos que outro antibiótico seja especificado.

[0528] Plataformas de apresentação: As plataformas de apresentação, cada uma modificada de modo a conter um substrato para 8 aminoácidos das formas de realização, foram produzidas e utilizadas conforme descrito na Publicação Internacional No. WO 2014/026136, publicada em 13 de fevereiro de 2014, cujo conteúdo é incorporado aqui na sua totalidade por referência. A sequência de aminoácidos da plataforma de apresentação CYTX-DP-XXXXXXXX madura (por exemplo, sem um peptídeo sinal) (SEQ ID NO: 512) é mostrada na Figura 7A. XXXXXXXX (SEQ ID NO: 514) indica o local em que é inserido cada substrato. A sequência de aminoácidos da plataforma de apresentação DP-CYTX-XXXXXXXX (SEQ ID NO: 512) inclui também o seu peptídeo sinal, isto é, a plataforma de apresentação SP-CYTX-DP-XXXXXXXX (SEQ ID NO: 513) é mostrada na Figura 7B. Plataforma de apresentação CYTX-DP-XXXXXXXX: GQSGQEYMMPEGGSGQXXXXXXXXSGGQGGSGGSGGSGGSGGSAYYG ITAGPAYRINDWASIYGWGVGYGSGPGGSYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQS RIRSVDVGTWILSVGYRFGSKSRRATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYE EDNSPLGVIGSFTYTGGSGGSSGQAAAGHHHHHHHH (SEQ ID NO: 512) Plataforma de apresentação SP-CYTX-DP-XXXXXXXX: MKKIACLSALAAVLAFTAGTSVAGQSGQEYMMPEGGSGQXXXXXXXXSGG QGGSGGSGGSGGSGGSAYYGITAGPAYRINDWASIYGWGVGYGSGPGGSYGFSY GAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWILSVGYRFGSKSRRATSTVTGGYA QSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTGGSGGSSGQAAAGHHHHH HHH (SEQ ID NO: 513)

[0529] Clivagem do Substrato e Análise da Cinética de Clivagem: Para a análise clonal, as culturas overnight foram subcultivadas pela diluição em meio fresco (1:40) e crescidas por 1,5 a 2 horas. A subcultura foi, em seguida, induzida com 0,04% de arabinose e incubada com agitação a 37°C por 40 minutos a 1 hora. Para interromper a continuação do crescimento, as células foram então incubadas em gelo por 15 minutos a 1 hora. As alíquotas de células foram coletadas e lavadas com PBS (pH 7,4). As células foram sedimentadas por centrifugação, o sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em tampão de reação contendo a enzima; a mistura reacional foi incubada parada a 37°C. Para parar a reação, as células foram removidas e diluídas 10 vezes em PBS, sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em PBS contendo EE647 (20 microgramas por mL (referido aqui também como μg/mL ou ug/mL)). Após a incubação em gelo (1 hora), as células foram lavadas com PBS e analisadas utilizando um separador de células Accuri C6.

[0530] Para os ensaios de clivagem pela protease MMP9, as culturas foram induzidas durante 45 minutos. O tampão de reação para MMP9 foi 50 mM de Tris- HCl, pH 7,4, suplementado com 150 mM de NaCL, 10 mM de CaCl2 e 0,05% (p/v) de Brij-35. Os ensaios de hidrólise por MMP9 foram realizados após a clivagem com 5 nM a 150 nM para MMP9 por 1 hora. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando, por exemplo, CYTX-DP-NSUB, uma plataforma de apresentação em que o "Substrato" é o ligante não clivável GGGSGGGS (SEQ ID NO: 515)) foi medido em cada condição reacional para assegurar que a hidrólise ocorreu na região do substrato parasignada.

[0531] Para os ensaios de clivagem pela protease MMP14, as culturas foram induzidas durante 45 minutos. O tampão de reação para MMP14 foi 50 mM de HEPES, pH 6,8, suplementado com 10 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2. Os ensaios de hidrólise por MMP14 foram realizados após clivagem com 5 nM a 150 nM para MMP14 por 1 hora. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando, por exemplo, CYTX-DP-NSUB) foi medido em cada condição reacional para assegurar que a hidrólise ocorreu na região do substrato parasignada.

[0532] Para os ensaios de estabilidade da plasmina humana, as culturas foram induzidas durante 45 minutos. O tampão de reação para a plasmina foi 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 100mM de NaCl, 0,01% de Tween 20 e 1 mM de EDTA. Os ensaios de hidrólise por plasmina foram realizados após a clivagem com 500 pM de plasmina por 1 hora. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando, por exemplo, CYTX-DP-NSUB) foi medido em cada condição reacional para assegurar que a hidrólise ocorreu na região do substrato parasignada.

[0533] Condições de Marcação dos Terminais Amino e Carboxi: o Alexa-647 conjugado ao anticorpo anti-EE (EE647) foi utilizado para marcar o ligante com afinidade de ligação à EE na região N-terminal da plataforma de apresentação CYTX-DP. O Alexa-647 conjugado ao anticorpo anti-His (His647) foi utilizado para marcar o ligante com afinidade de ligação à 8His na região C-terminal da plataforma de apresentação CYTX-DP. Para a marcação ótima das células sem reação da protease, as células foram incubadas por 1 hora a 4°C com EE647 (20 μg/mL) ou His647 (2 μg/mL). Para o exemplo descrito abaixo, foi utilizado um período de incubação de 1 hora.

[0534] Análise dos Dados da Cinética: A extensão da conversão dos substratos peptídicos apresentados na superfície celular foi mensurada diretamente utilizando-se a citometria de fluxo para medir as alterações na fluorescência média de populações de células clonais sob tratamento com protease. Especificamente, para cada amostra, a conversão foi determinada pelas análises de citometria de fluxo utilizando-se a relação onde (FL-) é a fluorescência após a incubação sem enzima, (FL+) é a fluorescência após a incubação com a enzima, e (FL0) é a fluorescência das células não marcadas. Dado que as concentrações esperadas de substrato que foram utilizadas estão significativamente abaixo da KM esperada do substrato para a protease alvo, o modelo de Michaelis-Menten simplifica a: o que permite que a conversão do substrato seja expressa como onde [S] é a concentração do substrato, [E] é a concentração da enzima e t é o tempo. Para determinar a constante de velocidade de reação de segunda ordem (kcat/KM), a conversão dependente do tempo para cada substrato foi ajustada para a equação [3].

Exemplo 12. Caracterização da Clivabilidade do Substrato na Plataforma de apresentação CYTX-DP

[0535] Este exemplo demonstra a capacidade dos substratos das formas de realização de serem clivados por MMP, e não por plasmina.

[0536] O uso da visualização do substrato multicópia em todas as células permitiu a caracterização quantitativa simples e direta da cinética de clivagem. Os clones que codificam os substratos foram identificados pelo sequenciamento de DNA e subclonado na plataforma de apresentação CYTX-PD, de tal modo que a plataforma de apresentação expressa continha o substrato para 8 aminoácidos em vez de XXXXXXXX (SEQ ID NO: 514). Os clones que apresentam substratos individuais (127 plataformas de apresentação independentes contendo substrato no total) foram avaliados quanto à clivagem tanto por MMP9 quanto por MMP14 (proteases alvo, isto é, as proteases utilizadas para selecionar o substrato) e plasmina (protease não relacionada ao alvo); o turnover foi determinado por citometria de fluxo. Trinta e um dos substratos selecionados para MMP9 foram selecionados do mesmo pool que foi a fonte de substratos compreendendo as sequências de aminoácidos SEQ ID NOS: 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 (substratos para MMP9 do pool). Nove dos substratos selecionados para MMP9 compreendem sequências de aminoácidos consenso SEQ ID NOs: 328, 336, 337, 338, 339, 348, 349, 350 ou 351 (sequências consenso) para MMP9. Trinta e oito dos substratos selecionados para MMP14 foram selecionados a partir do mesmo pool que foi a fonte de substratos compreendendo sequências de aminoácidos SEQ ID NOS: 14, 15, 16, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 33 (substratos para MMP14 do primeiro pool). Dez dos substratos selecionados para MMP14 foram selecionados a partir do mesmo pool que foi a fonte de substratos compreendendo sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 31 ou 32 (substratos para MMP14 do segundo pool). Trinta e nove dos substratos selecionados para MMP14 foram selecionados a partir das sequências de aminoácidos consenso SEQ ID NO: 364-370, 379-393, 402-409, 420-424, 434-435, 450-452, 457, 470-472, 474, ou 483 (sequências consenso para MMP14).

[0537] Desta forma, o grau de clivagem para cada clone pode ser determinado e os dados agregados para determinar uma percentagem de clones que são clivados pela protease alvo e não pela protease não relacionada ao alvo. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando, por exemplo, CYTX-DP-NSUB) foi medido em cada condição reacional para assegurar que a hidrólise ocorreu na região do substrato parasignada. Os resultados são apresentados na Tabela 9. TABELA 9. Resumo Estatístico da Clivabilidade do Substrato

[0538] A Tabela 9 representa (a) a percentagem de substratos selecionados para MMP9, testados na plataforma de apresentação CYTX-DP, que apresentaram pelo menos 20% de clivagem quando incubados com 50 nM para MMP9 humano (no. de catálogo: 911-MP, Research & Diagnostics Systems, Inc., ativada, seguindo o protocolo fornecido e utilizado sem modificações) por 1 hora a 37°C em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2, e 0,05% (p/v) de Brij-35 (> 20% clivagem com 50 nM para MMP9); (b) a percentagem de substratos selecionados para MMP14, testados na plataforma de apresentação CYTX-DP, que apresentaram pelo menos 20% de clivagem quando incubados com 50 nM para MMP14 humano (no. de catálogo: 918-MP, Research & Diagnostics Systems, Inc., ativada, seguindo o protocolo fornecido e utilizado sem modificações) por 1 hora a 37°C em 50 mM de HEPES, pH 6,8, suplementado com 10 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2 (> 20% clivagem com 50 nM para MMP14); e (c) a percentagem de substratos selecionados para MMP-14 ou selecionados para MMP9 testados na plataforma de apresentação CYTX-PD que apresentaram menos de 20% de clivagem quando incubados com 500 pM de plasmina humana (no. de catálogo: HCPM-0140, Haematologic Technologies, Inc., utilizado sem modificações) por 1 hora a 37°C em 50mM de Tris-HCl, pH 7,4, suplementado com 100 mM de NaCL, 0,01% de Tween 20 e 1 mM de EDTA (<2 0% de clivagem com 500 pM de plasmina).

Exemplo 13. Caracterização da Cinética de Clivagem do Substrato na Plataforma de Exibição CYTX-DP

[0539] Este Exemplo demonstra a cinética de clivagem de vários substratos.

[0540] O uso da visualização do substrato multicópia em todas as células permitiu a caracterização quantitativa simples e direta da cinética de clivagem. Os clones foram identificados por sequenciamento de DNA e subclonado na plataforma de apresentação CYTX-DP-XXXXXXXX (SEQ ID NO: 512), conforme descrito no exemplo anterior. Setenta e dois clones que apresentam substratos foram avaliados quanto à clivagem e um subconjunto foi escolhido para avaliar a cinética de clivagem pela protease alvo. A extensão da conversão de cada clone pode ser determinada em várias concentrações diferentes da protease e ajustadas ao modelo de Michaelis-Menten descrito aqui. Os valores de kcat/KM observados foram então plotados em função da frequência do clone dentro do pool de substratos e uma correlação entre a frequência e kcat/KM foi observada. O background de hidrólise das regiões que flanqueiam o local do substrato (usando, por exemplo, CYTX-DP- NSUB) foi medido em cada condição reacional para assegurar que a hidrólise ocorreu na região do substrato parasignada. Os resultados são apresentados na Tabela 10. TABELA 10. Resumo Estatístico da Cinética do Substrato

Exemplo 14. Eficácia in vivo e ativação in situ do anticorpo ativável compreendendo um substrato para MMP

[0541] Este Exemplo demonstra que os anticorpos ativáveis que compreendem os substratos para MMP das formas de realização são eficazes in vivo. Este exemplo também demonstra que os referidos anticorpos ativáveis são ativáveis em um ensaio de imagem in situ, tal como o descrito na Publicação Internacional No. WO 2014/107559, publicado em 10 de Julho de 2014, cujos conteúdos são incorporados aqui na sua totalidade por referência. Seis anticorpos ativáveis que compreendem diferentes substratos para MMP (um para MMP9 selecionado e cinco para MMP14 selecionados) das formas de realização foram administrados a 10mg/kg ou 12,5 mg/kg em camundongos portadores do tumor de xenoenxerto H292 (câncer de pulmão). Todos os seis anticorpos ativáveis também compreendiam a região de mascaramento compreendendo a sequência de aminoácidos CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 160) e o anticorpo C225v5 anticorpo anti-EGFR compreendendo uma cadeia leve (SEQ ID NO: 59) e uma cadeia pesada (SEQ ID NO: 56). A configuração da cadeia leve do anticorpo ativável era região de mascaramento - substrato para MMP - cadeia leve de C225v5. Todos os seis anticorpos ativáveis mostraram inibição do crescimento tumoral, variando de 22% a 81%, conforme medido por média % Δ inibição. Média % Δ inibição é calculada como (média (C) - média (C0)) - (média (T) - média (T0))/(média (C) - média (C0)) * 100%, em que T é o valor do grupo de teste atual, T0 é o valor inicial do grupo de teste atual, C é o valor do grupo controle, e C0 é o valor inicial do grupo de controle. O anticorpo EGFR cetuximab apresentou inibição de 96 a 98% neste estudo.

[0542] Os mesmos seis anticorpos ativáveis foram submetidos a ensaios de imagem in situ de tecido de tumor H292, utilizando as condições descritas nos exemplos do documento WO 2014/107559. Todos os seis anticorpos ativáveis foram ativados, o que demonstra que todos os seis substratos para MMP foram clivados e os anticorpos ligados ao EGFR liberados no tecido tumoral. Os sinais de marcação variaram de 15% a 65% de intensidade de sinal da IHC de cetuximab. Em geral, a percentagem de ativação de cada anticorpo ativável demonstrou uma correlação positiva com a eficácia que o anticorpo ativável apresentou no modelo murino H292.

[0543] Tecidos de dez pacientes com câncer da mama triplo negativo foram submetidos ao ensaio de imagem in situ utilizando um anticorpo ativável anti-Jagged (por exemplo, um anticorpo ativável anti-Jagged já referido na Publicação Internacional No. WO 2013/192550, publicado em 27 de Dezembro de 2013, cujos conteúdos são incorporados aqui na sua totalidade por referência), que compreende um substrato selecionado para MMP14 sob as condições descritas nos exemplos do documento WO 2014/107559. Nove das dez amostras de tecidos apresentaram níveis de marcação de ativação do anticorpo ativáveis que variaram de 15% a 100%, em comparação com a intensidade de sinal da IHC de cetuximab: Oito das dez amostras de tecido apresentou níveis de marcação de ativação de anticorpo ativável que variaram de 30% a 100%, em comparação com a intensidade de sinal da IHC de cetuximab.

OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

[0544] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição anterior destina-se a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims (14)

1. Polipeptídeo isolado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região clivável (CM) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 460-463 e 465-469, em que a região clivável está operacionalmente ligada a uma sequência de aminoácidos heteróloga.

2. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a CM compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31.

3. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a CM compreende uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 470-472.

4. Polipetídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo compreende um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (AB), que se liga a um alvo, opcionalmente em que o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado do grupo consistindo em: um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um scFv, um scAb, um dAb, um anticorpo de domínio único de cadeia pesada, e um anticorpo de domínio único de cadeia leve.

5. Polipetídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que quando o polipeptídeo compreende um AB, o AB está ligado a CM, opcionalmente em que quando o polipeptídeo compreende um AB, o AB está ligado diretamente a CM, opcionalmente em que quando o polipeptídeo compreende um AB, o AB está ligado a CM via um peptídeo de ligação.

6. Polipetídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende uma região de mascaramento (MM).

7. Polipetídeo isolado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a MM é um polipeptídeo de, não mais do que, 40 aminoácidos de comprimento.

8. Polipetídeo isolado, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a MM está ligada a CM de tal modo que o poli- peptídeo isolado em um estado não clivado compreende o seguinte arranjo estrutural, de N-terminal até C-terminal: MM-CM-AB ou AB-CM-MM.

9. Polipetídeo isolado, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende um peptídeo de ligação entre a MM e a CM, e/ou em que o polipeptídeo isolado compreende um peptídeo de ligação entre a CM e o AB.

10. Polipetídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo isolado compreende um primeiro peptídeo de ligação (LP1) e um segundo peptídeo de ligação (LP2), e em que o polipeptídeo isolado em um estado não clivado tem o seguinte arranjo estrutural, de N-terminal até C-terminal: MM-LP1-CM-LP2-AB ou AB-LP2-CM-LP1-MM, opcionalmente em que os dois peptídeos de ligação não precisam ser idênticos um ao outro.

11. Polipetídeo isolado, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que cada um de LP1 e LP2 é um peptídeo de cerca de 1 a 20 aminoácidos de comprimento.

12. Uso de um polipeptídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para prevenção, atraso da progressão, tratamento, alívio de um sintoma ou de outra forma a melhorar uma doença em um indivíduo.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença é um câncer, um distúrbio inflamatório, ou associado com expressão aberrante de alvo e/ou atividade.

14. Método para detectar a presença ou ausência de um agente de clivagem e um alvo de interesse em uma amostra, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: (a) colocar a amostra em contato com um polipeptídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 11, (b) medir um nível de polipeptídeo isolado ativado em uma amostra, em que o nível detectável do anticorpo ativável ativado no indivíduo ou amostra indica que o agente de clivagem e o alvo estão presentes na amostra e em que nenhum nível detectável do anticorpo ativável ativado na amostra indica que o agente de clivagem, o alvo ou ambos o agente de clivagem e o alvo estão ausentes na amostra, opcionalmente em que o polipeptídeo isolado compreende um marcador detectável, opcionalmente em que o marcador detectável compreende uma agente de imagem, um agente de contraste, uma enzima, um marcador fluorescente, um cromóforo, um corante, um ou mais íons metálicos, um marcador à base de ligante, ou um radioisótopo.