JP7266532B2 - リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子 - Google Patents
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Description
(1)リガンドに結合可能な分子であって、当該分子は切断サイトを少なくとも一つ有するポリペプチドであり、且つ当該分子が少なくとも一つの切断サイトで切断された状態でリガンドとの結合が減弱される、リガンド結合分子。
(2)前記切断サイトが切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、(1)に記載のリガンド結合分子。
(3)前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、(1)または(2)に記載のリガンド結合分子。
(4)前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、(3)に記載のリガンド結合分子。
(5)前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、(4)記載のリガンド結合分子。
(6)前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、(4)記載のリガンド結合分子。
(7)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(3)から(6)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(8)前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:3、34、66、70、71、72、73、35、75、76、335~345、1161~1180、1392~1411で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を含む配列である、(3)に記載のリガンド結合分子。
(9)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(3)から(8)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(10)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(9)に記載のリガンド結合分子。
(11)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(9)に記載のリガンド結合分子。
(12)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(10)に記載のリガンド結合分子。
(13)前記リガンド結合分子は抗体VHと、抗体VLと、抗体定常領域を含む、(1)から(12)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(14)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域内に位置する、(13)に記載のリガンド結合分子。
(15)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体重鎖定常領域118番アミノ酸(EUナンバリング)から抗体重鎖定常領域140番アミノ酸(EUナンバリング)までの配列中の任意の位置に挿入される、(14)に記載のリガンド結合分子。
(16)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体軽鎖定常領域108番アミノ酸(EUナンバリング)(Kabatナンバリング108番)から抗体軽鎖定常領域131番アミノ酸(EUナンバリング)(Kabatナンバリング131番)までの配列中の任意の位置に挿入される、(14)に記載のリガンド結合分子。
(17)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体VH内もしくは前記抗体VL内に位置する、(13)に記載のリガンド結合分子。
(18)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から16番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、および101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までからなる群より選択される配列中の任意位置に挿入される、(17)に記載のリガンド結合分子。
(19)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、および96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までからなる群より選択される配列中の任意位置に挿入される、(17)に記載のリガンド結合分子。
(20)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域と前記抗体VHの境界付近、または/および前記抗体定常領域と前記抗体VLとの境界付近に位置する、(13)に記載のリガンド結合分子。
(21)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH109番のアミノ酸(Kabatナンバリング)から抗体重鎖定常領域122番のアミノ酸(EUナンバリング)までの配列中の任意位置に挿入される、(20)に記載のリガンド結合分子。
(22)前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL104番のアミノ酸(Kabatナンバリング)から抗体軽鎖定常領域113番のアミノ酸(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113位)までの配列中の任意位置に挿入される、(20)に記載のリガンド結合分子。
(23)前記リガンド結合分子中の前記抗体VLと前記抗体VHは会合しており、当該会合は前記切断サイトが切断されることにより解消される、または前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消される、(13)から(22)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(24)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記リガンド結合分子は前記リガンドとの結合で前記リガンドの生物活性を阻害する、(1)から(23)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(25)前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、(1)から(24)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(26)前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、(1)から(24)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(27)前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、またはIL-6Rである、(1)から(24)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(28)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:374となるH-CDR1、配列番号:375となるH-CDR2、配列番号:376となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:377となるL-CDR1、配列番号:378となるL-CDR2、配列番号:379となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) 配列番号:380となるH-CDR1、配列番号:381となるH-CDR2、配列番号:382となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:383となるL-CDR1、配列番号:384となるL-CDR2、配列番号:385となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(c) (a)または(b)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(d) (a)または(b)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(27)に記載のリガンド結合分子。
(29)前記リガンド結合分子は、配列番号:4~14、23~27、33、59、60、および346~367で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号:15~22、1146~1160、1282~1380、および1386~1389で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、(28)に記載のリガンド結合分子。
(30)前記リガンドはIL-12であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:386となるH-CDR1、配列番号:387となるH-CDR2、配列番号:388となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:389となるL-CDR1、配列番号:390となるL-CDR2、配列番号:391となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) (a)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(c) (a)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(27)に記載のリガンド結合分子。
(31)前記リガンド結合分子は、配列番号:146で示す抗体重鎖を含む抗体である、(30)に記載のリガンド結合分子。
(32)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:392となるH-CDR1、配列番号:393となるH-CDR2、配列番号:394となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:395となるL-CDR1、配列番号:396となるL-CDR2、配列番号:397となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) (a)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(c) (a)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(27)に記載のリガンド結合分子。
(33)前記リガンド結合分子は、配列番号:304および305で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号:306~315、および322で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、(32)に記載のリガンド結合分子。
(34)前記リガンドはIL-6R(IL-6受容体)であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:398となるH-CDR1、配列番号:399となるH-CDR2、配列番号:400となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:401となるL-CDR1、配列番号:402となるL-CDR2、配列番号:403となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) (a)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(c) (a)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(27)に記載のリガンド結合分子。
(35)前記リガンド結合分子は、配列番号:153~156、157~159、および404~470で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号:471~535で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、(34)に記載のリガンド結合分子。
(36)前記リガンド結合分子はIgG抗体である、(1)から(35)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(37)前記リガンドと結合している(1)から(36)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(38)前記リガンドと融合されている(1)から(36)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(39)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では更に別のリガンドと結合しない、(38)に記載のリガンド結合分子。
(40)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(38)または(39)に記載のリガンド結合分子。
(41)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(40)に記載のリガンド結合分子。
(42)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(38)から(41)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(43)前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(42)に記載のリガンド結合分子。
(44)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、前記リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:374となるH-CDR1、配列番号:375となるH-CDR2、配列番号:376となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:377となるL-CDR1、配列番号:378となるL-CDR2、配列番号:379となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する;または
(b) 配列番号:380となるH-CDR1、配列番号:381となるH-CDR2、配列番号:382となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:383となるL-CDR1、配列番号:384となるL-CDR2、配列番号:385となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する、
(42)または(43)に記載のリガンド結合分子。
(45)前記リガンドは配列番号:370で示されるCXCL10改変体である、(42)から(44)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(46)前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、CXCL10と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:372で示す配列を含む、(42)から(45)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(47)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(38)から(41)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(48)前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(47)に記載のリガンド結合分子。
(49)前記リガンドはPD-1であり、前記抗体軽鎖は配列番号:395となるL-CDR1、配列番号:396となるL-CDR2、配列番号:397となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:392となるH-CDR1、配列番号:393となるH-CDR2、配列番号:394となるH-CDR3を有する、(47)または(48)に記載のリガンド結合分子。
(50)前記リガンドは配列番号:320で示されるPD-1である、(47)から(49)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(51)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体重鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体重鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:323および324で示す配列から選ばれる配列を含む、(47)から(50)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(52)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:325~334で示す配列から選ばれる配列を含む、(47)から(50)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(53)前記リガンドはIL-12であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(38)から(41)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(54)前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(53)に記載のリガンド結合分子。
(55)前記リガンドはIL-12であり、前記抗体軽鎖は配列番号:389となるL-CDR1、配列番号:390となるL-CDR2、配列番号:391となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:386となるH-CDR1、配列番号:387となるH-CDR2、配列番号:388となるH-CDR3を有する、(53)または(54)に記載のリガンド結合分子。
(56)前記リガンドはIL-6Rであり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(38)から(41)のいずれかに記載のリガンド結合分子。
(57)前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(56)に記載のリガンド結合分子。
(58)前記リガンドはIL-6Rであり、前記抗体軽鎖は配列番号:401となるL-CDR1、配列番号:402となるL-CDR2、配列番号:403となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:398となるH-CDR1、配列番号:399となるH-CDR2、配列番号:400となるH-CDR3を有する、(56)または(57)に記載のリガンド結合分子。
(59)前記リガンドと、前記リガンドと結合している(1)から(36)のいずれかに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
(60)前記リガンドと(1)から(36)のいずれかに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
(61)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では更に別のリガンドと結合しない、(60)に記載の融合タンパク質。
(62)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(60)または(61)に記載の融合タンパク質。
(63)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(62)に記載の融合タンパク質。
(64)前記リンカーは、グリシン‐セリンポリマーからなるリンカーである、(62)または(63)に記載の融合タンパク質。
(65)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(60)から(64)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(66)前記切断サイトは前記リガンド結合分子の前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(65)に記載の融合タンパク質。
(67)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、前記リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:374となるH-CDR1、配列番号:375となるH-CDR2、配列番号:376となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:377となるL-CDR1、配列番号:378となるL-CDR2、配列番号:379となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する;または
(b) 配列番号:380となるH-CDR1、配列番号:381となるH-CDR2、配列番号:382となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:383となるL-CDR1、配列番号:384となるL-CDR2、配列番号:385となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する、
(65)または(66)に記載の融合タンパク質。
(68)前記リガンドは配列番号:370で示されるCXCL10改変体である、(65)から(67)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(69)前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、CXCL10と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:372で示す配列を含む、(65)から(68)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(70)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(60)から(64)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(71)前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(70)に記載のリガンド結合分子。
(72)前記リガンドはPD-1であり、前記抗体軽鎖は配列番号:395となるL-CDR1、配列番号:396となるL-CDR2、配列番号:397となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:392となるH-CDR1、配列番号:393となるH-CDR2、配列番号:394となるH-CDR3を有する、(70)または(71)に記載の融合タンパク質。
(73)前記リガンドは配列番号:320で示されるPD-1である、(70)から(72)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(74)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体重鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体重鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:323および324で示す配列から選ばれる配列を含む、(70)から(73)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(75)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:325~334で示す配列から選ばれる配列を含む、(70)から(73)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(76)前記リガンドはIL-12であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(60)から(64)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(77)前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(76)に記載の融合タンパク質。
(78)前記リガンドはIL-12であり、前記抗体軽鎖は配列番号:389となるL-CDR1、配列番号:390となるL-CDR2、配列番号:391となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:386となるH-CDR1、配列番号:387となるH-CDR2、配列番号:388となるH-CDR3を有する、(76)または(77)に記載の融合タンパク質。
(79)前記リガンドはIL-6Rであり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(60)から(64)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(80)前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(79)に記載の融合タンパク質。
(81)前記リガンドはIL-6Rであり、前記抗体軽鎖は配列番号:401となるL-CDR1、配列番号:402となるL-CDR2、配列番号:403となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:398となるH-CDR1、配列番号:399となるH-CDR2、配列番号:400となるH-CDR3を有する、(79)または(80)に記載の融合タンパク質。
(82)(1)から(58)のいずれかに記載のリガンド結合分子を含む、医薬組成物。
(83)(1)から(37)のいずれかに記載のリガンド結合分子とリガンドを含む、医薬組成物。
(84)(59)に記載の複合体を含む、医薬組成物。
(85)(60)から(81)のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
(86)(1)から(58)のいずれかに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
(87)リガンドに結合可能な分子中に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含む、(86)に記載の製造方法。
(88)プロテアーゼ切断配列を有するリガンド結合分子とそのリガンドを融合させることを含む、(60)から(81)のいずれかに記載の融合タンパク質の製造方法。
(89)(1)から(58)のいずれかに記載のリガンド結合分子をコードするポリヌクレオチド。
(90)(89)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(91)(89)に記載のポリヌクレオチドもしくは(90)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(92)(91)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(1)から(58)のいずれかに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
(93)(60)から(81)のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(94)(93)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(95)(93)に記載のポリヌクレオチドもしくは(94)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(96)(95)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(60)から(81)のいずれかに記載の融合タンパク質を製造する方法。
(97)配列番号: 1161~1180、1392~1411で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を含む、プロテアーゼ基質。
(98)前記プロテアーゼはマトリプターゼまたはウロキナーゼである、(97)に記載のプロテアーゼ基質。
(99)前記プロテアーゼはMT-SP1またはuPAである、(97)または(98)に記載のプロテアーゼ基質。
(100)配列番号:1161~1180、1392~1411で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む、ポリペプチド。
(B1)リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子はリガンドに結合可能であり、当該分子は配列番号:1161~1180、1392~1411で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含むプロテアーゼ切断配列を少なくとも一つ含むポリペプチドであり、前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態における当該リガンド結合分子のリガンドに対する結合が、前記プロテアーゼ切断配列が未切断の状態における当該リガンド結合分子のリガンドに対する結合より弱い、リガンド結合分子。
(B2)前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、(B1)に記載のリガンド結合分子。
(B3)前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、(B1)または(B2)に記載のリガンド結合分子。
(B4)前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、(B3)記載のリガンド結合分子。
(B5)前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、(B3)記載のリガンド結合分子。
(B6)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(B1)から(B5)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B7)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(B1)から(B6)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B8)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(B7)に記載のリガンド結合分子。
(B9)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(B7)または(B8)に記載のリガンド結合分子。
(B10)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(B9)に記載のリガンド結合分子。
(B11)前記リガンド結合分子は抗体VHと、抗体VLと、抗体定常領域を含む、(B1)から(B10)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B12)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域内に位置する、(B11)に記載のリガンド結合分子。
(B13)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体重鎖定常領域118番アミノ酸(EUナンバリング)から抗体重鎖定常領域140番アミノ酸(EUナンバリング)までの配列中の任意の位置に導入される、(B12)に記載のリガンド結合分子。
(B14)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体軽鎖定常領域108番アミノ酸(EUナンバリング)(Kabatナンバリング108番)から抗体軽鎖定常領域131番アミノ酸(EUナンバリング)(Kabatナンバリング131番)までの配列中の任意の位置に導入される、(B12)に記載のリガンド結合分子。
(B15)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体VH内もしくは前記抗体VL内に位置する、(B11)に記載のリガンド結合分子。
(B16)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から16番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、および101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までからなる群より選択される配列中の任意位置に導入される、(B15)に記載のリガンド結合分子。
(B17)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、および96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までからなる群より選択される配列中の任意位置に導入される、(B15)に記載のリガンド結合分子。
(B18)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域と前記抗体VHの境界付近、または/および前記抗体定常領域と前記抗体VLとの境界付近に位置する、(B11)に記載のリガンド結合分子。
(B19)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH109番のアミノ酸(Kabatナンバリング)から抗体重鎖定常領域122番のアミノ酸(EUナンバリング)までの配列中の任意位置に導入される、(B18)に記載のリガンド結合分子。
(B20)前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL104番のアミノ酸(Kabatナンバリング)から抗体軽鎖定常領域113番のアミノ酸(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113位)までの配列中の任意位置に導入される、(B18)に記載のリガンド結合分子。
(B21)前記リガンド結合分子中の前記抗体VLと前記抗体VHは会合しており、当該会合は前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消される、(B11)から(B20)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B22)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記リガンド結合分子は前記リガンドとの結合で前記リガンドの生物活性を阻害する、(B1)から(B21)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B23)前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、(B1)から(B22)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B24)前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、(B1)から(B22)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B25)前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、IL-6R、またはIL-1Raである、(B1)から(B22)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B26)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:374となるH-CDR1、配列番号:375となるH-CDR2、配列番号:376となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:377となるL-CDR1、配列番号:378となるL-CDR2、配列番号:379となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) 配列番号:380となるH-CDR1、配列番号:381となるH-CDR2、配列番号:382となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:383となるL-CDR1、配列番号:384となるL-CDR2、配列番号:385となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(c) (a)または(b)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(d) (a)または(b)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(B25)に記載のリガンド結合分子。
(B27)前記リガンド結合分子は、配列番号:4~14、23~27、33、59、60、および346~367で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号:15~22、1146~1160、1282~1380、および1386~1389で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、(B26)に記載のリガンド結合分子。
(B28)前記リガンドはIL-12であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:386となるH-CDR1、配列番号:387となるH-CDR2、配列番号:388となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:389となるL-CDR1、配列番号:390となるL-CDR2、配列番号:391となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) (a)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(c) (a)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(B25)に記載のリガンド結合分子。
(B29)前記リガンド結合分子は、配列番号:146で示す抗体重鎖を含む抗体である、(B28)に記載のリガンド結合分子。
(B30)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:392となるH-CDR1、配列番号:393となるH-CDR2、配列番号:394となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:395となるL-CDR1、配列番号:396となるL-CDR2、配列番号:397となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) (a)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(c) (a)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(B25)に記載のリガンド結合分子。
(B31)前記リガンド結合分子は、配列番号:304および305で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号:306~315、および322で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、(B30)に記載のリガンド結合分子。
(B32)前記リガンドはIL-6R(IL-6受容体)であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:398となるH-CDR1、配列番号:399となるH-CDR2、配列番号:400となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号:401となるL-CDR1、配列番号:402となるL-CDR2、配列番号:403となるL-CDR3を含む抗体VL有する;または
(b) (a)と競合する抗体VHと抗体VLを有する;または
(c) (a)と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、(B25)に記載のリガンド結合分子。
(B33)前記リガンド結合分子は、配列番号:153~156、157~159、および404~470で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号:471~535で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、(B32)に記載のリガンド結合分子。
(B34)前記リガンド結合分子はIgG抗体である、(B1)から(B33)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B35)前記リガンドと結合している(B1)から(B34)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B36)前記リガンドと融合されている(B1)から(B34)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B37)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では更に別のリガンドと結合しない、(B36)に記載のリガンド結合分子。
(B38)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(B36)または(B37)に記載のリガンド結合分子。
(B39)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(B38)に記載のリガンド結合分子。
(B40)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B36)から(B39)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B41)前記プロテアーゼ切断配列は前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B40)に記載のリガンド結合分子。
(B42)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、前記リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:374となるH-CDR1、配列番号:375となるH-CDR2、配列番号:376となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:377となるL-CDR1、配列番号:378となるL-CDR2、配列番号:379となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する;または
(b) 配列番号:380となるH-CDR1、配列番号:381となるH-CDR2、配列番号:382となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:383となるL-CDR1、配列番号:384となるL-CDR2、配列番号:385となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する、
(B40)または(B41)に記載のリガンド結合分子。
(B43)前記リガンドは配列番号:370で示されるCXCL10改変体である、(B40)から(B42)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B44)前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、CXCL10と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:372で示す配列を含む、(B40)から(B43)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B45)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B36)から(B39)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B46)前記プロテアーゼ切断配列は前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B45)に記載のリガンド結合分子。
(B47)前記リガンドはPD-1であり、前記抗体軽鎖は配列番号:395となるL-CDR1、配列番号:396となるL-CDR2、配列番号:397となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:392となるH-CDR1、配列番号:393となるH-CDR2、配列番号:394となるH-CDR3を有する、(B45)または(B46)に記載のリガンド結合分子。
(B48)前記リガンドは配列番号:320で示されるPD-1である、(B45)から(B47)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B49)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体重鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体重鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:323および324で示す配列から選ばれる配列を含む、(B45)から(B48)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B50)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:325~334で示す配列から選ばれる配列を含む、(B45)から(B48)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B51)前記リガンドはIL-12であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B36)から(B39)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B52)前記プロテアーゼ切断配列は前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B51)に記載のリガンド結合分子。
(B53)前記リガンドはIL-12であり、前記抗体軽鎖は配列番号:389となるL-CDR1、配列番号:390となるL-CDR2、配列番号:391となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:386となるH-CDR1、配列番号:387となるH-CDR2、配列番号:388となるH-CDR3を有する、(B51)または(B52)に記載のリガンド結合分子。
(B54)前記リガンドはIL-6Rであり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B36)から(B39)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B55)前記プロテアーゼ切断配列は前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B54)に記載のリガンド結合分子。
(B56)前記リガンドはIL-6Rであり、前記抗体軽鎖は配列番号:401となるL-CDR1、配列番号:402となるL-CDR2、配列番号:403となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:398となるH-CDR1、配列番号:399となるH-CDR2、配列番号:400となるH-CDR3を有する、(B54)または(B55)に記載のリガンド結合分子。
(B57)前記リガンドと、前記リガンドと結合している(B1)から(B34)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
(B58)前記リガンドと(B1)から(B34)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
(B59)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では更に別のリガンドと結合しない、(B58)に記載の融合タンパク質。
(B60)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(B58)または(B59)に記載の融合タンパク質。
(B61)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(B60)に記載の融合タンパク質。
(B62)前記リンカーは、グリシン‐セリンポリマーからなるリンカーである、(B60)または(B61)に記載の融合タンパク質。
(B63)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B58)から(B62)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B64)前記プロテアーゼ切断配列は前記リガンド結合分子の前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B63)に記載の融合タンパク質。
(B65)前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、前記リガンド結合分子は:
(a) 配列番号:374となるH-CDR1、配列番号:375となるH-CDR2、配列番号:376となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:377となるL-CDR1、配列番号:378となるL-CDR2、配列番号:379となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する;または
(b) 配列番号:380となるH-CDR1、配列番号:381となるH-CDR2、配列番号:382となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号:383となるL-CDR1、配列番号:384となるL-CDR2、配列番号:385となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する、
(B63)または(B64)に記載の融合タンパク質。
(B66)前記リガンドは配列番号:370で示されるCXCL10改変体である、(B63)から(B65)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B67)前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、CXCL10と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:372で示す配列を含む、(B63)から(B66)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B68)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B58)から(B62)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B69)前記プロテアーゼ切断配列は前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B68)に記載のリガンド結合分子。
(B70)前記リガンドはPD-1であり、前記抗体軽鎖は配列番号:395となるL-CDR1、配列番号:396となるL-CDR2、配列番号:397となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:392となるH-CDR1、配列番号:393となるH-CDR2、配列番号:394となるH-CDR3を有する、(B68)または(B69)に記載の融合タンパク質。
(B71)前記リガンドは配列番号:320で示されるPD-1である、(B68)から(B70)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B72)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体重鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体重鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:323および324で示す配列から選ばれる配列を含む、(B68)から(B71)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B73)前記リガンドはPD-1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、PD-1と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号:325~334で示す配列から選ばれる配列を含む、(B68)から(B71)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B74)前記リガンドはIL-12であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B58)から(B62)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B75)前記プロテアーゼ切断配列は前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B74)に記載の融合タンパク質。
(B76)前記リガンドはIL-12であり、前記抗体軽鎖は配列番号:389となるL-CDR1、配列番号:390となるL-CDR2、配列番号:391となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:386となるH-CDR1、配列番号:387となるH-CDR2、配列番号:388となるH-CDR3を有する、(B74)または(B75)に記載の融合タンパク質。
(B78)前記リガンドはIL-6Rであり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、(B58)から(B62)のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
(B78)前記プロテアーゼ切断配列は前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、(B77)に記載の融合タンパク質。
(B79)前記リガンドはIL-6Rであり、前記抗体軽鎖は配列番号:401となるL-CDR1、配列番号:402となるL-CDR2、配列番号:403となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号:398となるH-CDR1、配列番号:399となるH-CDR2、配列番号:400となるH-CDR3を有する、(B77)または(B78)に記載の融合タンパク質。
(B80)(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を含む、医薬組成物。
(B81)(B1)から(B35)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とリガンドを含む、医薬組成物。
(B82)(B57)に記載の複合体を含む、医薬組成物。
(B83)(B58)から(B79)のいずれか一つに記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
(B84)(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
(B85)リガンドに結合可能な分子中に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含む、(B84)に記載の製造方法。
(B86)プロテアーゼ切断配列を有するリガンド結合分子とそのリガンドを融合させることを含む、(B58)から(B79)のいずれか一つに記載の融合タンパク質の製造方法。
(B87)(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子をコードするポリヌクレオチド。
(B88)(B87)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(B89)(B87)に記載のポリヌクレオチドもしくは(B88)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(B90)(B89)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
(B92)(B58)から(B79)のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(B92)(B91)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(B93)(B91)に記載のポリヌクレオチドもしくは(B92)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(B94)(B93)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(B58)から(B79)のいずれか一つに記載の融合タンパク質を製造する方法。
(a) 37番、(b)45番、(c)47番、(d) 37番および45番、(e) 37番および47番、(f) 45番および47番、(g) 37番および45番および47番。
-IL-6Rのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
-免疫抗原を精製する必要が無い
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、センダイウイルス(HVJ)等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
-グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
-AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をIL-6R発現細胞に接触させる工程、
(2)IL-6R発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)IL-6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
別段示さない限り、CDR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプタービーズに結合した分子と相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナービーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
対照のリガンド結合分子としては、例えば、未切断型のリガンド結合分子が挙げられる。
例えば、Octetを用いてリガンドの遊離を検出する場合、リガンドを認識するリガンド検出用抗体をビオチン化し、バイオセンサーと接触させたのちに、サンプル中のリガンドに対する結合を測定することで、リガンドの遊離を検出することができる。具体的には、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないでリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。リガンド結合分子がリガンドと融合され融合タンパク質を形成している場合、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼと融合タンパク質が含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないで融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。
(1)標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(2)標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(3)標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(4)標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。より具体的な実施態様において、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼが使用される。
・関節リウマチや変形性関節症における関節
・気管支喘息やCOPDにおける肺(肺胞)
・炎症性腸疾患やクローン病や潰瘍性大腸炎における消化器官
・肝臓、腎臓、肺における線維化症における線維化組織
・臓器移植における拒絶反応が起こっている組織
・動脈硬化や心不全における血管、心臓(心筋)
・メタボリック症候群における内臓脂肪
・アトピー性皮膚炎その他皮膚炎における皮膚組織
・椎間板ヘルニアや慢性腰痛における脊髄神経
活性型プロテアーゼの測定方法は、活性化型のプロテアーゼを認識する抗体を用いる方法(PNAS 2013 Jan 2; 110(1): 93-98.)やプロテアーゼが認識するペプチドを蛍光標識し、切断前は消光(クエンチ)しているが、切断後に発光する方法(Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep;9(9):690-701. doi: 10.1038/nrd3053.)を用いて測定されうる。
(i) 標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
また、癌組織特異的プロテアーゼは、癌細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。癌組織特異的プロテアーゼが癌細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が癌細胞に特異的であるためには、癌組織特異的プロテアーゼは癌組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「癌組織の近傍」とは、癌組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
別の視点から、癌組織特異的プロテアーゼは、
(i) 癌組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 癌組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 癌細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 癌細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
癌組織特異的プロテアーゼは、1種単独でもよく、2種以上が組み合せられてもよい。癌組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の癌種を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。炎症組織特異的プロテアーゼが炎症細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が炎症細胞に特異的であるためには、炎症組織特異的プロテアーゼは炎症組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「炎症組織の近傍」とは、炎症組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
別の視点から、炎症組織特異的プロテアーゼは、
(i) 炎症組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 炎症組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 炎症細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 炎症細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
炎症組織特異的プロテアーゼは、1種単独でもよく、2種以上が組み合せられてもよい。炎症組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の病状を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
プロテアーゼ切断配列は、副作用低減の点から、治療対象の標的組織/細胞においてより特異的に発現している、もしくは治療対象の標的組織/細胞においてより特異的に活性化されている標的組織特異的プロテアーゼにより、高い特異性で加水分解されるアミノ酸配列であることが好ましい。
具体的なプロテアーゼ切断配列としては、例えば、国際公開WO2013/128194号、国際公開WO2010/081173号、国際公開WO2009/025846号等で開示されている上記で例示した癌組織に特異的に発現するプロテアーゼ、炎症組織特異的プロテアーゼ等によって特異的に加水分解される標的配列が挙げられる。既知のプロテアーゼによって特異的に加水分解される標的配列に、適宜アミノ酸変異を導入する等、人工的に改変した配列も使用できる。また、プロテアーゼ切断配列は、Nature Biotechnology 19, 661 - 667 (2001)に記載のような当業者公知の方法で同定したものを用いてもよい。
更に、天然に存在するプロテアーゼ切断配列を用いても良い。例えば、TGFβがプロテアーゼの切断を受けることで潜在型に変化するような、プロテアーゼの切断を受けることで分子形が変わるタンパク質中のプロテアーゼ切断を受ける配列を使用することもできる。
プロテアーゼ切断配列は、上述のように、好適な標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列であることがより好ましい。標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列の中でも、以下のアミノ酸配列が好ましい。
LSGRSDNH(配列番号:3、MT-SP1、uPAにより切断可能)
PLGLAG(配列番号:34、MMP-2、MMP-9により切断可能)
VPLSLTMG(配列番号:35、MMP-7により切断可能)
プロテアーゼ切断配列として、以下の配列を用いることもできる。
TSTSGRSANPRG(配列番号:66、MT-SP1、uPAにより切断可能)
ISSGLLSGRSDNH(配列番号:67、MT-SP1、uPAにより切断可能)
AVGLLAPPGGLSGRSDNH(配列番号:68、MT-SP1、uPAにより切断可能)
GAGVPMSMRGGAG(配列番号:69、MMP-1により切断可能)
GAGIPVSLRSGAG(配列番号:70、MMP-2により切断可能)
GPLGIAGQ(配列番号:71、MMP-2により切断可能)
GGPLGMLSQS(配列番号:72、MMP-2により切断可能)
PLGLWA(配列番号:73、MMP-2により切断可能)
GAGRPFSMIMGAG(配列番号:74、MMP-3により切断可能)
GAGVPLSLTMGAG(配列番号:75、MMP-7により切断可能)
GAGVPLSLYSGAG(配列番号:76、MMP-9により切断可能)
AANLRN(配列番号:77、MMP-11により切断可能)
AQAYVK(配列番号:78、MMP-11により切断可能)
AANYMR(配列番号:79、MMP-11により切断可能)
AAALTR(配列番号:80、MMP-11により切断可能)
AQNLMR(配列番号:81、MMP-11により切断可能)
AANYTK(配列番号:82、MMP-11により切断可能)
GAGPQGLAGQRGIVAG(配列番号:83、MMP-13により切断可能)
PRFKIIGG(配列番号:84、pro-ウロキナーゼにより切断可能)
PRFRIIGG(配列番号:85、pro-ウロキナーゼにより切断可能)
GAGSGRSAG(配列番号:86、uPAにより切断可能)
SGRSA(配列番号:87、uPAにより切断可能)
GSGRSA(配列番号:88、uPAにより切断可能)
SGKSA(配列番号:89、uPAにより切断可能)
SGRSS(配列番号:90、uPAにより切断可能)
SGRRA(配列番号:91、uPAにより切断可能)
SGRNA(配列番号:92、uPAにより切断可能)
SGRKA(配列番号:93、uPAにより切断可能)
QRGRSA(配列番号:94、tPAにより切断可能)
GAGSLLKSRMVPNFNAG(配列番号:95、カテプシンBにより切断可能)
TQGAAA(配列番号:96、カテプシンBにより切断可能)
GAAAAA(配列番号:97、カテプシンBにより切断可能)
GAGAAG(配列番号:98、カテプシンBにより切断可能)
AAAAAG(配列番号:99、カテプシンBにより切断可能)
LCGAAI(配列番号:100、カテプシンBにより切断可能)
FAQALG(配列番号:101、カテプシンBにより切断可能)
LLQANP(配列番号:102、カテプシンBにより切断可能)
LAAANP(配列番号:103、カテプシンBにより切断可能)
LYGAQF(配列番号:104、カテプシンBにより切断可能)
LSQAQG(配列番号:105、カテプシンBにより切断可能)
ASAASG(配列番号:106、カテプシンBにより切断可能)
FLGASL(配列番号:107、カテプシンBにより切断可能)
AYGATG(配列番号:108、カテプシンBにより切断可能)
LAQATG(配列番号:109、カテプシンBにより切断可能)
GAGSGVVIATVIVITAG(配列番号:110、カテプシンLにより切断可能)
APMAEGGG(配列番号:111、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
EAQGDKII(配列番号:112、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
LAFSDAGP(配列番号:113、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
YVADAPK(配列番号:114、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
RRRRR(配列番号:115、フーリンにより切断可能)
RRRRRR(配列番号:116、フーリンにより切断可能)
GQSSRHRRAL(配列番号:117、フーリンにより切断可能)
SSRHRRALD(配列番号:118)
RKSSIIIRMRDVVL(配列番号:119、プラスミノーゲン(Plasminogen)により切断可能)
SSSFDKGKYKKGDDA(配列番号:120、Staphylokinaseにより切断可能)
SSSFDKGKYKRGDDA(配列番号:121、Staphylokinaseにより切断可能)
IEGR(配列番号:122、FactorIXaにより切断可能)
IDGR(配列番号:123、FactorIXaにより切断可能)
GGSIDGR(配列番号:124、FactorIXaにより切断可能)
GPQGIAGQ(配列番号:125、Collagenaseにより切断可能)
GPQGLLGA(配列番号:126、Collagenaseにより切断可能)
GIAGQ(配列番号:127、Collagenaseにより切断可能)
GPLGIAG(配列番号:128、Collagenaseにより切断可能)
GPEGLRVG(配列番号:129、Collagenaseにより切断可能)
YGAGLGVV(配列番号:130、Collagenaseにより切断可能)
AGLGVVER(配列番号:131、Collagenaseにより切断可能)
AGLGISST(配列番号:132、Collagenaseにより切断可能)
EPQALAMS(配列番号:133、Collagenaseにより切断可能)
QALAMSAI(配列番号:134、Collagenaseにより切断可能)
AAYHLVSQ(配列番号:135、Collagenaseにより切断可能)
MDAFLESS(配列番号:136、Collagenaseにより切断可能)
ESLPVVAV(配列番号:137、Collagenaseにより切断可能)
SAPAVESE(配列番号:138、Collagenaseにより切断可能)
DVAQFVLT(配列番号:139、Collagenaseにより切断可能)
VAQFVLTE(配列番号:140、Collagenaseにより切断可能)
AQFVLTEG(配列番号:141、Collagenaseにより切断可能)
PVQPIGPQ(配列番号:142、Collagenaseにより切断可能)
LVPRGS(配列番号:143、Thrombinにより切断可能)
TSGSGRSANARG(配列番号:335)
TSQSGRSANQRG(配列番号:336)
TSPSGRSAYPRG(配列番号:337)
TSGSGRSATPRG(配列番号:338)
TSQSGRSATPRG(配列番号:339)
TSASGRSATPRG(配列番号:340)
TSYSGRSAVPRG(配列番号:341)
TSYSGRSANFRG(配列番号:342)
TSSSGRSATPRG(配列番号:343)
TSTTGRSASPRG(配列番号:344)
TSTSGRSANPRG(配列番号:345)
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1161)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1162)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1163)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1164)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1165)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1166)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1167)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1168)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1169)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1170)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1171)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1172)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸をである;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1173)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1174)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1175)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1176)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1177)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1178)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1179)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1180)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1392)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1393)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1394)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1395)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1396)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1397)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1398)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1399)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1400)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1401)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1402)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1403)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸をである;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1404)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1405)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1406)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1407)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1408)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1409)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1410)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1411)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
プロテアーゼ切断配列とプロテアーゼの相互作用を確認する方法として、in vitroもしくはin vivoでのプロテアーゼ切断を確認することにより行うことができる。
あるいは、プロテアーゼ切断配列を組み込まれたリガンド結合分子は、プロテアーゼによる酵素的な作用のみならず、pHの変化、温度、酸化還元ストレス等の様々な環境負荷を経て病巣に到達する。このような外部要因に対しても、各プロテアーゼ基質の耐性を比較した情報に基づいて、目的に応じた望ましい性状を備えたプロテアーゼ切断配列を選択することもできる。
(プロテアーゼ切断配列)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)
(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
本実施態様における可動リンカーはペプチドリンカーが好ましい。第一可動リンカーと第二可動リンカーは、それぞれ独立かつ任意的に存在し、少なくとも1つのフレキシブルアミノ酸(Glyなど)を含む同一または異なる可動リンカーである。例えば、プロテアーゼ切断配列が所望のプロテアーゼアクセス性を得られるほどの十分な数の残基(Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Alaなどから任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、Ala、ことさらGlyおよびSer、特にGlyなど)が含まれる。
このうちグリシンおよびグリシン-セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。
グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、
Ser
Gly・Ser(GS)
Ser・Gly(SG)
Gly・Gly・Ser(GGS)
Gly・Ser・Gly(GSG)
Ser・Gly・Gly(SGG)
Gly・Ser・Ser(GSS)
Ser・Ser・Gly(SSG)
Ser・Gly・Ser(SGS)
Gly・Gly・Gly・Ser(GGGS、配列番号:36)
Gly・Gly・Ser・Gly(GGSG、配列番号:37)
Gly・Ser・Gly・Gly(GSGG、配列番号:38)
Ser・Gly・Gly・Gly(SGGG、配列番号:39)
Gly・Ser・Ser・Gly(GSSG、配列番号:40)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:41)
Gly・Gly・Gly・Ser・Gly(GGGSG、配列番号:42)
Gly・Gly・Ser・Gly・Gly(GGSGG、配列番号:43)
Gly・Ser・Gly・Gly・Gly(GSGGG、配列番号:44)
Gly・Ser・Gly・Gly・Ser(GSGGS、配列番号:45)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:46)
Gly・Ser・Ser・Gly・Gly(GSSGG、配列番号:47)
Gly・Ser・Gly・Ser・Gly(GSGSG、配列番号:48)
Ser・Gly・Gly・Ser・Gly(SGGSG、配列番号:49)
Gly・Ser・Ser・Ser・Gly(GSSSG、配列番号:50)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGS、配列番号:51)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGG、配列番号:52)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGGS、配列番号:53)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGGG、配列番号:54)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:41))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:46))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
本発明のリガンド結合分子には、リガンド結合分子中の抗体VLもしくはその一部と抗体VHもしくはその一部との会合が、切断サイトが切断されることにより解消される、またはプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消されるリガンド結合分子が包含される。
抗体のVHとVL、CHとCLは、Rothlisbergerら(J Mol Biol. 2005 Apr 8;347(4):773-89.)により述べられているようにドメイン間で多くのアミノ酸側鎖を介して相互作用していることが知られている。VH-CH1とVL-CLはFabドメインとして安定した構造を形成することが出来ることが知られているが、報告されている通りVHとVLの間のアミノ酸側鎖は一般的には10-5Mから10-8M範囲の解離定数で相互作用しており、VHドメインとVLドメインのみが存在する場合では会合状態を形成している割合は少ないと考えられる。
いくつかのより具体的な実施態様において、切断サイト/プロテアーゼ切断配列は抗体VHまたは抗体VL中のループ構造を形成している残基及びループ構造に近い残基の位置に導入される。抗体VHまたは抗体VL中のループ構造とは、抗体VHまたは抗体VLの中で、α-へリックス、β-シート等の二次的構造を形成しない部分を言う。ループ構造を形成している残基及びループ構造に近い残基の位置は、具体的に:抗体VH7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から16番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、抗体VL7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの範囲を指すことができる。
いくつかのより具体的な実施態様において、切断サイト/プロテアーゼ切断配列は、抗体VH7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から16番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列中の任意位置に導入される。
いくつかのより具体的な実施態様において、切断サイト/プロテアーゼ切断配列は、抗体VL7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)まで、96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列中の任意位置に導入される。
本発明のリガンドは、その結合パートナーに10μM、1μM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM、150pM、100pM、50pM、25pM、10pM、5pM、1pM、0.5pM、または0.1pM以下の解離定数(KD)で特異的に結合することができる。
さらに、CXC又はアルファのサブファミリーは、第1のシステインに先行するELRモチーフ(Glu-Leu-Arg)の存在によって2つの群:ELR-CXCケモカイン及び非ELR-CXCケモカインに分類されている(たとえば、Clark-Lewis, 上記、 及びBelperio et al., "CXC Chemokines in Angiogenesis(脈管形成におけるCXCケモカイン)," J. Leukoc. Biol. 68:1-8, 2000を参照)。
CXCL10の生理活性を測定する方法として、CXCL10の細胞遊走活性を測定する方法、CXCR3安定発現細胞株を用いたReporter assay(PLoS One. 2010 Sep 13;5(9):e12700.参照)、GPCRシグナル伝達初期に誘導されるB-Arrestin recruitmentを利用したPathHunterTM β-Arrestin recruitment assay等が挙げられる。
サイトカインは、免疫調節性および炎症性の過程に関与する分泌型細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーであり、これは神経システムのグリア細胞によっておよび免疫システムの多数の細胞によって分泌される。サイトカインは、タンパク質、ペプチドまたは糖タンパク質に分類することができ、大きくて多様な調節因子ファミリーを包含する。サイトカインは細胞表面受容体に結合して細胞内シグナル伝達を誘発し、これによって酵素の活性調節、いくつかの遺伝子およびその転写因子の上方制御もしくは下方制御、またはフィードバック阻害等が起こりうる。
いくつかの実施態様において、本発明のサイトカインは、インターロイキン(IL)およびインターフェロン(IFN)などの免疫調節因子を含む。適したサイトカインは以下のタイプの1つまたは複数由来のタンパク質を含むことができる:4つのα-ヘリックスバンドルファミリー(これはIL-2サブファミリー、IFNサブファミリーおよびIL-10サブファミリーを含む); IL-1ファミリー(これはIL-1およびIL-8を含む)、ならびにIL-17ファミリー。サイトカインは、細胞免疫反応を増強する1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TGF-βなど)、または抗体反応に有利に働く2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-10、IL-13など)に分類されるものを含むこともできる。
あるいは、本発明によって、リガンドの生物活性を中和する方法が提供される。本発明の方法は、生物活性を中和すべきリガンドと本発明のリガンド結合性分子を接触させ、両者の結合生成物を回収する工程を含む。回収された結合生成物のリガンド結合性分子の切断によって、それによって中和されたリガンドの生物活性を復元することができる。つまり本発明のリガンドの生物活性の中和方法は、さらに付加的に、リガンド-リガンド結合性分子からなる結合生成物のリガンド結合性分子を切断してリガンドの生物活性を復元(すなわちリガンド結合性分子の中和作用を解除)する工程を含むことができる。
本発明の好ましい一実施態様においては、リガンド結合分子とリガンドをリンカーを介して融合させる。リガンド結合分子とリガンドを融合させるとき用いられるリンカーとして、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー(例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996参照)に開示されるリンカー等を用いることができるが、本実施態様においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。例として、それだけに限定されないが、例えば、ペプチドリンカーの場合:
Ser
Gly・Ser(GS)
Ser・Gly(SG)
Gly・Gly・Ser(GGS)
Gly・Ser・Gly(GSG)
Ser・Gly・Gly(SGG)
Gly・Ser・Ser(GSS)
Ser・Ser・Gly(SSG)
Ser・Gly・Ser(SGS)
Gly・Gly・Gly・Ser(GGGS、配列番号:36)
Gly・Gly・Ser・Gly(GGSG、配列番号:37)
Gly・Ser・Gly・Gly(GSGG、配列番号:38)
Ser・Gly・Gly・Gly(SGGG、配列番号:39)
Gly・Ser・Ser・Gly(GSSG、配列番号:40)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:41)
Gly・Gly・Gly・Ser・Gly(GGGSG、配列番号:42)
Gly・Gly・Ser・Gly・Gly(GGSGG、配列番号:43)
Gly・Ser・Gly・Gly・Gly(GSGGG、配列番号:44)
Gly・Ser・Gly・Gly・Ser(GSGGS、配列番号:45)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:46)
Gly・Ser・Ser・Gly・Gly(GSSGG、配列番号:47)
Gly・Ser・Gly・Ser・Gly(GSGSG、配列番号:48)
Ser・Gly・Gly・Ser・Gly(SGGSG、配列番号:49)
Gly・Ser・Ser・Ser・Gly(GSSSG、配列番号:50)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGS、配列番号:51)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGG、配列番号:52)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGGS、配列番号:53)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGGG、配列番号:54)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:41))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:46))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
また、本発明において、「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。
「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子とリガンドを治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。
「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語は、「融合タンパク質を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造における融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するための融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。
すなわち本発明は、リガンド結合性分子とリガンドを接触させる工程と、リガンド結合性分子とリガンドからなる複合体を回収する工程を含む、リガンド複合体の製造方法も提供する。本発明の複合体は、例えば薬学的に許容される担体と配合することによって、医薬組成物とすることができる。
したがって、本発明に基づいて、次の工程を含む、リガンドの投与を必要とする対象にリガンドを投与する方法が提供される;
[1] リガンドと本発明のリガンド結合体を接触させて、両者からなる結合生成物を得る工程;および
[2] [1]の結合生成物を、リガンドの投与を必要とする対象に投与する工程。
該作製方法により得られた抗体は、そのままリガンド結合領域に用いてもよく、得られた抗体のうちFv領域のみを用いてもよく、該Fv領域が一本鎖(「sc」とも称する。)で抗原を認識し得る場合には、該一本鎖のみを用いてもよい。また、Fv領域を含むFab領域を用いてもよい。
癌組織に発現する抗原を標的としたイムノサイトカインは一般にターゲッティングさせるIgGやscFvの末端に目的のサイトカインを融合させることで作製されてきた(Expert Opin Investig Drugs. 2009 Jul;18(7):991-1000.、Curr Opin Immunol. 2016 Jun;40:96-102.)。IL-2やIL-12やTNFをはじめとするサイトカインは毒性が強いため、これらのサイトカインを癌局所で働かせるために抗体によって癌局所にデリバリーすることで副作用を軽減しつつ、効果を強めることが期待されているが(非特許文献4、5、6)、これらはいずれも全身投与では臨床で十分な効果を示さない、therapeutic windowが狭い、毒性が強く全身投与ができない、などの課題がある。この大きな原因として、イムノサイトカインであっても全身投与したサイトカインは全身に暴露されてしまうため、全身で作用して毒性を発揮しうる、あるいは毒性を回避するために極めて低い用量でしか投与できない、ことが挙げられる。また、癌抗原に結合するイムノサイトカインは、腫瘍中で癌細胞に内在化されて消失してしまうため、場合によっては腫瘍局所にサイトカインを暴露することが困難となる。癌抗原に結合する抗体にIL2を融合したイムノサイトカインと癌抗原に結合しない抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインで抗腫瘍効果は変わらなかったという報告もある(非特許文献7)。
この原因として、サイトカインとサイトカインレセプターの親和性が強くないため、プロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまうこと、あるいは、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプターはサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまうことの2点が挙げられる。
また、これらの報告されているプロテアーゼ活性化サイトカインは上述のIgG-IL-2 fusionと異なりFc領域を有さないため半減期が短いと予想され、高い暴露を維持することが難しい。プロテアーゼ切断により活性化される前後のサイトカインの薬物動態に大きな差が無く(共に半減期が短い)、therapeutic windowを広げることが難しい。
ケモカイン(Nature Immunology 9, 949 - 952 (2008))は、Gタンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タンパク質であり、サイトカインの一群である。受容体を発現する特定の白血球に作用し,その物質の濃度勾配の方向に白血球を遊走させる活性(走化性)を持つ(Nat Cell Biol. 2016 Jan;18(1):43-53.)。ケモカインは炎症部で大量に産生され,血管内から炎症組織内への白血球の遊走をもたらすことが知られている。
ケモカインを制御することで、白血球の遊走をコントロールできることから、癌免疫療法に活用することが可能であると考えられる。固形癌の局所にT細胞や抗原提示細胞やM1マクロファージなどを遊走させることができれば、抗腫瘍効果を引き起こすことが可能であると考えられる。サイトカインは全身投与によっても作用を発揮することができるが、ケモカインは濃度勾配によって濃度の高い組織に細胞を遊走させるため、ケモカインを全身投与しても期待する効果は得られない。そのため、ケモカインの全身投与による癌免疫療法(ケモカイン療法)は現実的ではないと考えられる。
実施例1、2に示したように既報のサイトカイン・ケモカイン療法には以下の課題がある。
1.イムノサイトカインにおいては、抗体によりサイトカインを固形癌にターゲッティングしたとしても、サイトカインは全身で作用するため副作用が生じる、あるいは、副作用を回避するため低用量でしか投与できないため、腫瘍中に高い暴露をすることができない。
2.サイトカインレセプター(あるいは抗体)とサイトカインをプロテアーゼで切断出来るリンカーで繋ぐプロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、サイトカイン活性の中和が不十分でありプロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまう。
3.プロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプター(あるいは抗体)がサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまう。
4.プロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、不活性型サイトカインの半減期が短く、血中滞留時間が短いため、必要とする投与量が多い。
1.全身においては、サイトカインあるいはケモカインなどのリガンドがリガンド結合分子によって十分に阻害されている(生物活性が最小化されている)
2.プロテアーゼによる切断によりリガンドの生物活性が回復する(活性型リガンドとなる)
3.プロテアーゼによる切断によりリガンド結合分子がリガンド結合活性を失う
4.プロテアーゼによる切断を受ける前のリガンド結合分子に結合したリガンドと比較して、プロテアーゼによる切断を受けて活性型となったリガンドが短い半減期を有する
図1、2、3ではリガンドへ結合する分子として抗体を用いた分子の例を示している。これらの例では、まずリガンドに対する中和抗体を取得する。続いて、抗リガンド中和抗体の可変領域(VHあるいはVL)と定常領域(CH1あるいはCL)の境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する。当該抗リガンド抗体がプロテアーゼ切断配列導入後においてもリガンド結合活性が保持されていることを確認する。リガンドが抗リガンド中和抗体に結合した状態で、プロテアーゼで切断することにより、リガンドが解離することを確認する。解離したリガンドが生物活性を発揮することを確認する。
図1において、リガンドのC末端と抗リガンド抗体のVHのN末端がリンカーを介して結合されており、VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が導入されている。抗リガンド抗体のリガンドに対する親和性が十分に強ければ、リガンドの生物活性は十分に阻害されている。このリガンド-抗リガンド抗体融合体を全身投与してもリガンドは中和されているためその生物活性を発揮することは無く、またリガンド-抗リガンド抗体融合体はFc領域を有するため長い半減期を有する。全身投与されたリガンド-抗リガンド抗体融合体は、腫瘍組織で高発現するプロテアーゼによってVHとCH1の境界付近のプロテアーゼ切断配列が切断されると、リガンド-リンカー-抗リガンド抗体のVH分子が遊離する。VHあるいはVL単独ではリガンドに結合することができないため(リガンドへ結合するためにはVHとVL両方が必要)、リガンドの中和は解除され、腫瘍組織において生物学的作用を発揮することが可能である。また、このリリースされたリガンド-リンカー-抗リガンド抗体のVH分子は、Fc領域を有さず、分子量が小さいため、非常に短い半減期を有し、速やかに全身から消失するため、リガンドによる全身性の副作用を最小化することが可能である。
図2においては、リガンドと抗リガンド抗体は図1のようにリンカーで結合されておらず、VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が導入された抗リガンド抗体とリガンドが混合して投与される。抗リガンド抗体のリガンドに対する親和性が十分に強く、リガンド濃度に対して抗リガンド抗体が十分あれば、リガンドの生物活性は十分に阻害されている。このリガンド-抗リガンド抗体複合体を全身投与してもリガンドは中和されているためその生物活性を発揮することは無く、またリガンド-抗リガンド抗体複合体はFc領域を有するため長い半減期を有する。全身投与されたリガンド‐抗リガンド抗体複合体は、腫瘍組織で高発現するプロテアーゼによってVHとCH1の境界付近のプロテアーゼ切断配列が切断されると、抗リガンド抗体のVH分子が遊離する。VHあるいはVL単独ではリガンドに結合することができないため(リガンドへ結合するためにはVHとVL両方が必要)、リガンドの中和は解除され、腫瘍組織において生物学的作用を発揮することが可能である。また、このリリースされたリガンド分子は、Fc領域を有さず、分子量が小さいため、非常に短い半減期を有し、速やかに全身から消失するため、リガンドによる全身性の副作用を最小化することが可能である。
図3において、VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が導入された抗リガンド抗体が全身投与される。投与された抗体は体内に元々存在するリガンドに結合し、以降は図2の上記記載と同様である。
このようにVHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が導入された抗リガンド抗体を用いることで、リガンドをプロテアーゼが発現する組織で選択的にリリースし、その生物学的作用を発揮させることが可能となる。リガンドがサイトカインであれば、サイトカインをプロテアーゼが発現する組織で選択的に作用させることができる。リガンドがケモカインであれば、プロテアーゼが発現する組織でケモカインが高濃度で存在し、末梢血でケモカイン濃度が低くなるため、ケモカイン受容体を発現する細胞をプロテアーゼが発現する組織に遊走させることができる。
5-1.抗CXCL10中和抗体へのプロテアーゼ切断配列の導入
CXCL10はエフェクターT細胞に対する遊走作用を持つケモカインの一つである。ヒトCXCL10に対する中和抗体であるMabCXCL10(重鎖:EEIVH(配列番号:1)、軽鎖:EEIVL(配列番号:2))の発現ベクターを当業者公知の方法で調製し、FreeStyle 293(Life Technology)を用いて当業者公知の方法で発現、精製を行った。MabCXCL10に含まれるCDR配列は以下である:H-CDR1(NNGMH、配列番号:380)、H-CDR2(VIWFDGMNKFYVDSVKG、配列番号:381)、H-CDR3(EGDGSGIYYYYGMDV、配列番号:382)、L-CDR1(RASQSVSSSYLA、配列番号:383)、L-CDR2(GASSRAT、配列番号:384)、L-CDR3(QQYGSSPIFT、配列番号:385)。
MabCXCL10とヒトCXCL10( 266-IP-010/CF , R&D Systems )の相互作用をBiacoreを用いて評価した。具体的には、CM3センサーチップ ( BR100536, GE Healthcare )にR PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, GE Healthcare ) をNHS・EDCを用いたアミンカップリング法によって固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, 200mM NaCl, pH 7.4 を用い、抗体をキャプチャーした状態で1.563 nM のヒトCXCL10をアナライトとして流し、37℃における抗体の抗原に対する結合を評価した。ランニングバッファーのみをアナライトとしたブランクとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図4に示す。アナライトを流し始める時間を横軸の開始点としている。アナライトを流し始めた時間におけるレスポンスを0としたときの各時間におけるレスポンス(結合量)が縦軸である。図4のセンサーグラムに示すように、MabCXCL10のヒトCXCL10に対する結合が確認された。
MabCXCL10の重鎖あるいは軽鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入する検討を行った。癌特異的に発現しているウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ( MT-SP1 )で切断されることが報告されている配列であるペプチド配列A(配列番号:3)を重鎖または軽鎖の可変領域と定常領域の境界付近の7か所に挿入した図5に示す重鎖および軽鎖を設計した。切断配列挿入に伴う糖鎖付加が起こらないような改変体も設計した。重鎖改変体であるEEIVHA(配列番号:4)、EEIVHB(配列番号:5)、EEIVHC(配列番号:6)、EEIVHD(配列番号:7)、EEIVHE(配列番号:8)、EEIVHF(配列番号:9)、EEIVHG(配列番号:10)、EEIVHBG(配列番号:11)、EEIVHCG(配列番号:12)、EEIVHDG(配列番号:13)、EEIVHEG(配列番号:14)、および軽鎖改変体であるEEIVLA(配列番号:15)、EEIVLB(配列番号:16)、EEIVLC(配列番号:17)、EEIVLD(配列番号:18)、EEIVLE(配列番号:19)、EEIVLF(配列番号:20)、EEIVLG(配列番号:21)、EEIVLEG(配列番号:22)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
これらの重鎖改変体と天然型軽鎖を組み合わせて、あるいは、天然型重鎖と軽鎖改変体を組み合わせて、重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した以下のIgG1抗体:EEIVHA/EEIVL(重鎖配列番号:4、軽鎖配列番号:2)、EEIVHB/EEIVL(重鎖配列番号:5、軽鎖配列番号:2)、EEIVHC/EEIVL(重鎖配列番号:6、軽鎖配列番号:2)、EEIVHD/EEIVL(重鎖配列番号:7、軽鎖配列番号:2)、EEIVHE/EEIVL(重鎖配列番号:8、軽鎖配列番号:2)、EEIVHF/EEIVL(重鎖配列番号:9、軽鎖配列番号:2)、EEIVHG/EEIVL(重鎖配列番号:10、軽鎖配列番号:2)、EEIVHBG/EEIVL(重鎖配列番号:11、軽鎖配列番号:2)、EEIVHCG/EEIVL(重鎖配列番号:12、軽鎖配列番号:2)、EEIVHDG/EEIVL(重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:2)、EEIVHEG/EEIVL(重鎖配列番号:14、軽鎖配列番号:2)、および、軽鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した以下のIgG1抗体:EEIVH/EEIVLA(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:15)、EEIVH/EEIVLB(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:16)、EEIVH/EEIVLC(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:17)、EEIVH/EEIVLD(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:18)、EEIVH/EEIVLE(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:19)、EEIVH/EEIVLF(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:20)、EEIVH/EEIVLG(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:21)、EEIVH/EEIVLEG(重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:22)を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
5-1で調製した抗体とヒトCXCL10(266-IP-010/CF , R&D Systems)の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を図6に示す。具体的には、CM3センサーチップ ( BR100536, GE Healthcare )にR PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, GE Healthcare ) をNHS・EDCを用いたアミンカップリング法によって固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, 150mM NaCl, pH 7.4 を用い、抗体をキャプチャーした状態で3.125, 1.563, 0.781 nM のヒトCXCL10をアナライトとして流し、25℃における抗体の抗原に対する結合を評価した。ランニングバッファーのみをアナライトとしたブランクとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図6に示す。アナライトを流し始める時間を横軸の開始点としている。アナライトを流し始めた時間におけるレスポンスを0としたときの各時間におけるレスポンス(結合量)が縦軸である。図6のセンサーグラムに示すように、いずれの抗体もヒトCXCL10に結合した。すなわち、抗原への結合活性を失わせることなく抗体可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入することが出来た。
5-1で調製した抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 20nM、抗体 60または100μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図7に示す。その結果、EEIVHA/EEIVL、EEIVHE/EEIVL、EEIVHF/EEIVL、EEIVHG/EEIVL、EEIVHEG/EEIVL、EEIVHBG/EEIVLは、プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた。さらに、EEIVH/EEIVLEG、EEIVH/EEIVLF、EEIVH/EEIVLGは、プロテアーゼ処理によって25kDa以下にバンドが生じた。 したがって、EEIVHA/EEIVL、EEIVHE/EEIVL、EEIVHF/EEIVL、EEIVHG/EEIVL、EEIVHEG/EEIVL、EEIVHBG/EEIVL、EEIVH/EEIVLEG、EEIVH/EEIVLF、EEIVH/EEIVLGにおいて、抗体がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
5-3でリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14(MT-SP1) 触媒ドメイン ( R&D Systems, 3946-SE-010 )による切断を受けなかったEEIVHC/EEIVLのプロテアーゼ切断配列の近傍に、グリシン-セリンポリマーからなるリンカーを含む配列を挿入する検討を行った。図8に示す5種類の重鎖を設計した。重鎖改変体であるEEIVHC002(配列番号:23)、EEIVHC003(配列番号:24)、EEIVHC004(配列番号:25)、EEIVHC005(配列番号:26)、EEIVHC006(配列番号:27)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
これらの重鎖改変体と天然型軽鎖を組み合わせて、重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した以下のIgG1抗体:EEIVHC002/EEIVL(重鎖配列番号:23、軽鎖配列番号:2)、EEIVHC003/EEIVL(重鎖配列番号:24、軽鎖配列番号:2)、EEIVHC004/EEIVL(重鎖配列番号:25、軽鎖配列番号:2)、EEIVHC005/EEIVL(重鎖配列番号:26、軽鎖配列番号:2)、EEIVHC006/EEIVL(重鎖配列番号:27、軽鎖配列番号:2)を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
5-4で調製した抗体とヒトCXCL10(266-IP-010/CF , R&D Systems)の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を図9に示す。具体的には、CM3センサーチップ ( BR100536, GE Healthcare ) にR PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, GE Healthcare ) をNHS・EDCを用いたアミンカップリング法によって固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, 300mM NaCl, pH 7.4 を用い、抗体をキャプチャーした状態で6.25, 3.125, 1.563, 0.781 nM のヒトCXCL10をアナライトとして流し、25℃における抗体の抗原に対する結合を評価した。ランニングバッファーのみをアナライトとしたブランクとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図9に示す。アナライトを流し始める時間を横軸の開始点としている。アナライトを流し始めた時間におけるレスポンスを0としたときの各時間におけるレスポンス(結合量)が縦軸である。図9のセンサーグラムに示すように、いずれの抗体もヒトCXCL10に結合した。すなわち、抗原への結合活性を失わせることなく抗体可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を挿入することが出来た。
5-5で調製した抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてヒトウロキナーゼ( uPA )( R&D Systems, 1310-SE-010 )、リコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ12.5nM、抗体 133μg/mL、PBS、37℃の条件下で2、20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図10に示す。その結果、EEIVHC002/EEIVL、EEIVHC003/EEIVL、EEIVHC004/EEIVL、EEIVHC005/EEIVL、EEIVHEC006/EEIVLは、プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた。したがって、EEIVHC002/EEIVL、EEIVHC003/EEIVL、EEIVHC004/EEIVL、EEIVHC005/EEIVL、EEIVHEC006/EEIVLにおいて、抗体がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
これらの結果から、EEIVHC/EEIVLのようにプロテアーゼ切断サイトのみを可変領域と定常領域の境界付近に導入した場合にはプロテアーゼによる切断を受けない抗体であっても、切断配列近傍に可動リンカー配列を導入することでプロテアーゼによる切断が可能な分子を作成できることが示された。したがって、プロテアーゼ切断配列と可動リンカーを任意に組み合わせることによっても、プロテアーゼによる切断を受ける抗体が作製可能であることが示された。
次に、5-5で調製した抗体に結合したヒトCXCL10がプロテアーゼ処理によって遊離するかどうかをBiacoreを用いて評価した。具体的には、5-5で調製した抗体EEIVHC006a/EEIVL(重鎖配列番号:33、軽鎖配列番号:2)を用いて、抗原あり/プロテアーゼありのアナライト、抗原なし/プロテアーゼありのアナライト、抗原あり/プロテアーゼなしのアナライトをそれぞれ用意した。抗原あり/プロテアーゼありのアナライトは、抗体とヒトCXCL10を結合させたのちに20nM のリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1)( R&D Systems, 3946-SE-010)で20時間処置したものを用いた。抗原なし/プロテアーゼありのアナライトは、抗体のみを20nM のリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1)( R&D Systems, 3946-SE-010)で20時間処置したものを用いた。抗原あり/プロテアーゼなしのアナライトは、抗体とヒトCXCL10を結合させたものを用いた。また、CXCL10の結合によるレスポンスであることを確認する系のコントロールとして、CXCL10を抗原のみのアナライトとして用意した。CM5センサーチップ ( BR100530, GE Healthcare ) に抗CXCL10抗体を当業者公知の方法で固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, pH 7.4 を用い、抗原あり/プロテアーゼありのアナライト、抗原なし/プロテアーゼありのアナライト、抗原あり/プロテアーゼなしのアナライト、抗原のみアナライトの4種類をそれぞれ流し、25℃におけるセンサーチップ上の抗CXCL10抗体とヒトCXCL10の結合を評価した。
また、プロテアーゼ切断配列を持っていない抗体MabCXCL10と同様のFab領域を持つMabCXCL10a(重鎖:EEIVHa(配列番号:65)、軽鎖:EEIVL(配列番号:2))を用いて、抗体EEIVHC006a/EEIVLと同様に抗原あり/プロテアーゼありのアナライト、抗原なし/プロテアーゼありのアナライト、抗原あり/プロテアーゼなしのアナライトを用意した。同様に、CM5センサーチップ ( BR100530, GE Healthcare ) に抗CXCL10抗体を当業者公知の方法で固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, pH 7.4 を用い、抗原あり/プロテアーゼありのアナライト、抗原なし/プロテアーゼありのアナライト、抗原あり/プロテアーゼなしのアナライト、抗原のみアナライト(CXCL10)の4種類をそれぞれ流し、25℃におけるセンサーチップ上の抗CXCL10抗体とヒトCXCL10の結合を評価した。
抗CXCL10抗体を固相化していないフローセルとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図11に示す。アナライトを流し始める時間を縦軸の開始点としている。縦軸はアナライトを流し始めたときのレスポンスを100とした際の各時間のレスポンスを表す。その結果、図11(A)に示すように切断配列が導入されていないMabCXCL10aをプロテアーゼ処理してもCXCL10は遊離されないが、図11(B)に示すようにEEIVHC006a/EEIVLをプロテアーゼ処理することでCXCL10が遊離されることが確認された。
MabCXCL10の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近のアミノ酸配列の一部をプロテアーゼ切断配列と可動リンカーの配列の一部で置換する検討を行った。癌特異的に発現しているウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ( MT-SP1 )で切断されることが報告されている配列であるペプチド配列A(配列番号:3)を重鎖の一部のアミノ酸に置換した図12に示す重鎖を設計した。重鎖改変体であるEESVHA009(配列番号:59)、EESVHA012(配列番号:60)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
これらの重鎖改変体と天然型軽鎖を組み合わせて、以下のIgG1抗体:EESVHA009/EEIVL(重鎖配列番号:59、軽鎖配列番号:2)、EESVHA012/EEIVL(重鎖配列番号:60、軽鎖配列番号:2)を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
EESVHA009/EEIVL、EESVHA012/EEIVLがプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてヒトウロキナーゼ( uPA )( R&D Systems, 1310-SE-010 )、リコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ12.5nM、抗体 100μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図13に示す。その結果、EESVHA009/EEIVL、EESVHA012/EEIVLは、プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた。したがって、EESVHA009/EEIVL、EESVHA012/EEIVLにおいて、抗体がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
ヒトIgG1抗体の重鎖216番アスパラギン酸の直前にプロテアーゼ切断配列を挿入した抗体の作成及びインビトロでの機能評価に関する報告がなされている(国際公開WO2004/021861A2)。実験データは未記載であるが、この抗体と抗原を混合した後に対応するプロテアーゼが含まれる培地を処置すると、抗原抗体複合体から抗原が遊離されると主張している。
当該報告でプロテアーゼ切断配列を挿入したと主張されたヒトIgG1抗体の重鎖216番目のアミノ酸は、Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th editionに記載されているKabatナンバリング、EUナンバリング、OUナンバリングのいずれかのナンバリングシステムにおいてもアスパラギン酸ではない。一方で異なる文献を参照すると、ヒトIgG1抗体の重鎖216番アミノ酸は重鎖と軽鎖の間にジスルフィド結合が形成されるシステインの直後のアスパラギン酸であると考えられる(Nature 344, 667 - 670 (12 April 1990), Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th edition)。この216番のアスパラギン酸の直前にプロテアーゼ切断配列を挿入した場合、プロテアーゼによる切断を受けた抗体からはパパインによって抗体のヒンジ領域が切断を受けた場合と同様のFab領域が形成されると考えられる。パパインによる抗体のヒンジ領域の切断によって抗原結合能が失われることは考えにくいと一般的に認識されているため、この216番のアスパラギン酸の直前にプロテアーゼ切断配列を挿入した抗体を対応するプロテアーゼで切断しても、抗原結合能が失われることはないと考えられる。
仮にKabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th editionに記載されているKabatナンバリングにおけるヒトIgG1抗体の重鎖216番目のアミノ酸(Kabatナンバリング)の直前にプロテアーゼ切断配列が挿入された場合も検討してみる。この部位は重鎖と軽鎖の間にジスルフィド結合が形成される220番目のシステイン(Kabatナンバリング)よりも数アミノ酸N末端側に存在する。そのため、この部位で起こるプロテアーゼによる重鎖の切断がもたらす影響は、重鎖と軽鎖の間に形成されるジスルフィド結合が失われた際にもたらされる影響と同様であると想定される。過去の文献より、重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合を形成できないFab領域であっても抗原結合が失われることは考えにくい(MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):204-18.)。そのため、Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th editionに記載されているKabatナンバリングにおけるヒトIgG1抗体の重鎖216番目のアミノ酸(Kabatナンバリング)の直前にプロテアーゼ切断配列が挿入された場合であっても、プロテアーゼ切断によって抗原結合能が失われることはないと考えられる。
実施例5で作製されたプロテアーゼ切断配列を導入したCXCL10中和抗体とCXCL10が形成する複合体がプロテアーゼ切断によってCXCL10を遊離させ、CXCL10が細胞遊走活性を発揮するかを評価した。
CXCL10の細胞遊走活性は、マウスCXCR3(mCXCR3)を発現するBa/F3トランスフェクタント細胞を作製し(以下BaF3/mCXCR3)、この細胞とHTS TranswellTM-96 Permeable Support with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane (Cat. 3387、Corning) を用いて評価された。アナライトとして、CXCL10+プロテアーゼ、EEIVHC006a/EEIVL+CXCL10、EEIVHC006a/EEIVL+CXCL10+プロテアーゼ、EEIVHC006a/EEIVL+プロテアーゼ、MabCXCL10+CXCL10+プロテアーゼの5種類を準備した。プロテオセーブSS 1.5mLマイクロチューブ(Cat. MS-4265M、住友ベークライト)中で終濃度10 μg/mLの抗体(MabCXCL10かEEIVHC006a/EEIVL)、終濃度100 ng/mL のhCXCL10 (Cat. 300-12、Peprotech)、もしくは抗体とhCXCL10両方を入れ、30分間常温で放置し、プロテアーゼありのアナライトについては前記反応後にmouse MT-SP1 (mMT-SP1 、Cat. 4735-SE-010、R&D Systems)を終濃度12.5 nMになるように、更に加えた。
各アナライト235 μLをLower chamberに移し、Upper chamberにBaF3/mCXCR3細胞を2.0×105 cells/wellとなるように75 μL/wellで播き、6時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。6時間の反応後、Lower chamber中の溶液100 μLをフルオレッセンスルミネッセンス96ウェルプレート(Cat. 3912、Corning)に移し、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay溶液(Cat. G7571、Promega)を100 μL加えた。室温で10分反応させた後、SpectraMax M3 マルチモードマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発光値を測定し、Lower chamberへの細胞の遊走度を評価した。その結果を図14に示す。
CXCL10+プロテアーゼのアナライトと比較して、EEIVHC006a/EEIVL+CXCL10のアナライトを添加した場合では発光強度が減少した。発光強度は遊走した細胞の量を反映することから、EEIVHC006a/EEIVLはCXCL10と複合体を形成し、CXCL10の作用を中和していることが分かった。一方で、EEIVHC006a/EEIVL+CXCL10+プロテアーゼのアナライトを添加した場合、EEIVHC006a/EEIVL+CXCL10のアナライトを添加した場合と比較して発光強度が回復し、CXCL10+プロテアーゼのアナライト添加の場合と同様に細胞を遊走させることが示された。切断配列を有していないMabCXCL10抗体を用いたMabCXCL10+CXCL10+プロテアーゼのアナライト添加の場合、発光強度の回復は見られなかった。この結果から、EEIVHC006a/EEIVLはプロテアーゼによる抗体切断に伴い、CXCL10の中和能が低下することが示された。
8-1 プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質の作製及びプロテアーゼ切断評価
ヒトCXCL10に対する中和抗体であるMabCXCL10_G7(重鎖:G7H-G1T4(配列番号:368)、軽鎖:G7L-LT0(配列番号:369))の軽鎖を用いて、当該軽鎖のN末端にグリシン-セリンポリマーからなるリンカー配列を介して、プロテアーゼに耐性になるように変異させたヒトCXCL10変異体hCXCL10R75A (配列番号:370)を連結させて、リガンド融合軽鎖hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0(配列番号:371)を設計した。また、癌特異的に発現しているウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ( MT-SP1 )で切断される配列(配列番号:338)をhCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0中の抗体可変領域と抗体定常領域の境界付近に挿入したリガンド融合軽鎖hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0(配列番号:372)を設計した。これらのリガンド融合軽鎖とMabCXCL10_G7重鎖のG7H-G1T4を組み合わせて、融合タンパク質:G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0(重鎖配列番号:368、リガンド融合軽鎖配列番号:371)および、G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0(重鎖配列番号:368、リガンド融合軽鎖配列番号:372)を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。MabCXCL10_G7のCDR配列は下記通り:H-CDR1(SFSIT、配列番号:374)、H-CDR2(EITPMFGIANYAQKFQG、配列番号:375)、H-CDR3(DGRFDVSDLLTDKPKVTINYNGMDV、配列番号:376)、L-CDR1(SGSSSNIGSNTVN、配列番号:377)、L-CDR2(NNDQRPS、配列番号:378)、L-CDR3(ASWDDSLNGRV、配列番号:379)。
これらの融合タンパク質がプロテアーゼにより切断されるかを検証した。プロテアーゼとしてヒトに由来するウロキナーゼ(human uPA, huPA)(R&D Systems, 1310-SE-010)を用いた。プロテアーゼによる融合タンパク質の切断は還元SDS-PAGEによって評価した。融合タンパク質0.1 mg/mlに対し30 nM huPAを37℃で1時間反応させた後、還元SDS-PAGEによって融合タンパク質の切断を評価した。その結果、G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0はプロテアーゼ処理により切断されなかったのに対して、プロテアーゼ切断配列を挿入したG7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0はプロテアーゼ処理によって15kDa から 25kDaの間に新たなバンドを生じ (図15)、プロテアーゼ処理による切断が確認された。
プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体とCXCL10が融合された抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質がプロテアーゼ切断によってCXCL10を遊離させ、細胞遊走を引き起こすかを評価した。
融合タンパク質から遊離したhCXCL10R75Aの活性比較対象として、hCXCL10R75Aのみの活性を表すhCXCL10R75A-His (配列番号:373)を以下の方法で作製・精製した。プロテアーゼに耐性になるように変異させたヒトCXCL10変異体hCXCL10R75A(配列番号:370)のC末端にヒスチジンタグを付加し、ヒスチジンタグ付加ヒトCXCL10変異体 hCXCL10R75A-His (配列番号:373)を作製した。hCXCL10R75A-His(配列番号:373)を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、ニッケルセファロースを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
細胞遊走活性は、マウスCXCR3(mCXCR3)を発現するBa/F3トランスフェクタント細胞を作製し(以下BaF3/mCXCR3)、この細胞とHTS TranswellTM-96 Permeable Support with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane (Cat. 3387、Corning) を用いて評価された。
uPA(+)のアナライトとして、2.0mL 96ウェルディープウェルプレート(Cat. P-DW-20-C-S、Axygen)中でhCXCL10R75A-His 0.15 μg/mL、プロテアーゼ切断配列を有さない融合タンパク質G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 μg/mL、またはプロテアーゼ切断配列を有する融合タンパク質G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0 1.5 μg/mLに対してリコンビナントhuPA (Cat. 1310-SE、R&D systems)を終濃度30 nMになるように加えて準備した。G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0、G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0 1.5 μg/mLは0.15 μg/mL相当量のhCXCL10R75Aを含む。uPA(-)のアナライトは、hCXCL10R75A-His 0.15 μg/mL、プロテアーゼ切断配列を有さない融合タンパク質G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 μg/mL、またはプロテアーゼ切断配列を有する融合タンパク質G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0 1.5 μg/mLを使用した。
分析対象となる各溶液それぞれ235 μLをLower chamberに移し、Upper chamberにBaF3/mCXCR3細胞を2.0×105 cells/wellとなるように75 μL/wellで播き、6時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。6時間の反応後、Lower chamber中の溶液100 μLをOptiPlate-96(Cat. 6005299、PerkinElmer)に移し、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay溶液(Cat. G7571、Promega)を100 μL加えた。室温で10分反応させた後、SpectraMax M3 マルチモードマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発光値を測定し、Lower chamberへの細胞の遊走度を評価した。その結果を図16に示す。CXCL10R75A-Hisを添加した場合と比較して、プロテアーゼ未処理のG7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0融合タンパク質を添加した場合の発光強度が減少した。発光強度は遊走した細胞の量を反映することから、G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0中のCXCL10R75Aの生理活性は中和されていること分かった。一方で、プロテアーゼ処理のG7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0を添加した場合には、プロテアーゼ未処理のG7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0を添加した場合と比較して発光強度が回復し、CXCL10R75A-Hisと同等に細胞を遊走させることが示された。切断配列を有していないG7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0ではプロテアーゼ処理を行った場合でも発光強度の回復がみられなかった。この結果から、G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G7L.12aa0054-LT0はプロテアーゼによる切断に伴い、融合タンパク中の抗体部分のCXCL10R75Aに対する中和能が低下することが示された。
9-1. プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体の作製
IL-12は免疫活性化作用を持つサイトカインの一つである。IL-12は免疫細胞を活性化させることで抗腫瘍効果を発揮するが、同時に全身の暴露によって重篤な副作用を引き起こすことも報告されている(Nat Immunol. 2012 Jul 19;13(8):722-8.)。
ヒトIL-12に対する中和抗体であるUstekinumabと同じ可変領域を有する抗IL-12抗体の重鎖 (UstkH-G1T4, 重鎖配列番号:144)の可変領域と定常領域の境界付近に、ウロキナーゼ(uPA)およびマトリプターゼ(MT-SP1)で切断されることが報告されているペプチド配列A(配列番号:3)及びグリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含む配列を挿入し、Ustekinumabの重鎖の改変体UstkH-G1T4CYTM1inP1(配列番号:146)を設計し、Ustekinumabの軽鎖 (UstkL-kT0、配列番号:145)と組み合わせて、Ustekinumabの改変体であるUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0(重鎖配列番号:146、軽鎖配列番号:145)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。このUstekinumabの改変体UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。本実施例中の抗IL-12抗体及びその改変体に含まれるCDR配列は下記通りである:H-CDR1(TYWLG、配列番号:386)、H-CDR2(IMSPVDSDIRYSPSFQG、配列番号:387)、H-CDR3(RRPGQGYFDF、配列番号:388)、L-CDR1(RASQGISSWLA、配列番号:389)、L-CDR2(AASSLQS、配列番号:390)、L-CDR3(QQYNIYPYT、配列番号:391)。
前記9-1で調製された抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてヒトに由来するリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン(human MT-SP1, hMT-SP1) (R&D Systems, 3946-SE-010)、マウスに由来するリコンビナントマウスマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン(mouse MT-SP1, mMT-SP1) (R&D Systems, 4735-SE-010)、および、ヒトに由来するウロキナーゼ(human uPA, huPA)(R&D Systems, 1310-SE-010)を用いた。プロテアーゼ処理は、Ustekinumab(UstkH-G1T4/ UstkL-kT0)、またはUstekinumabの改変体UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0に対してhMT-SP1、mMT-SP1、あるいは、huPAを最終濃度10.1, 16.9, 9.17 μMとなるようにそれぞれ加え、37℃で一晩反応させることで行った。
プロテアーゼによる抗体の切断は還元SDS-PAGEによって評価した。その結果、UstkH-G1T4/ UstkL-kT0は各プロテアーゼによる切断を受けなかったのに対して、プロテアーゼ切断配列及び可動リンカーを挿入したUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0は各プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた (図17)。したがって、プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体(UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0)がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
つぎに、プロテアーゼにより抗体が切断されたとき、IL-12が抗体との複合体から遊離して生理活性を発揮するかについて評価した。IL-12の生理活性をNK92ヒト細胞株のIFN-γ(インターフェロンガンマ、IFN-gとも記載する)産生に基づき評価した。96ウェル細胞培養プレートにNK92細胞を1×105 cells/wellで播種した。10 ng/mLのIL-12とプロテアーゼ処理を行った抗体(UstkH-G1T4/ UstkL-kT0またはUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0、それぞれ20、4、0.8、0.16、0.032、0.0054、0.0013 μg/mLの各濃度)を添加し、48時間後のIFN-γ産生量をELISAで測定した。抗体のIL-12活性に対する影響を評価するために、抗体を添加せずに、プロテアーゼ処理済みのIL-12のみを添加した実験(No Ab)も行われた。図18はインターフェロンガンマの濃度を測定した結果である。各種プロテアーゼで処理したUstkH-G1T4/ UstkL-kT0(プロテアーゼ切断配列を持たない)はIL-12によるインターフェロンガンマの産生を抑制し(中和という)、抗体が0.8μg/mLの場合にIL-12を入れなかった場合(No IL-12)と同程度になった。一方で、各種プロテアーゼで処理したUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0(プロテアーゼ切断配列を含む)はいずれの抗体濃度においても、プロテアーゼ切断配列を持たないUstkH-G1T4/ UstkL-kT0を添加した場合に比べてインターフェロンガンマが産生されていた。この結果から、UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0はプロテアーゼによる切断に伴いIL-12に対する中和能が減弱されることで、IL-12を細胞に作用させることが確認された。
10-1.抗ヒトCXCL10中和抗体へのプロテアーゼ切断配列の導入
CXCL10を中和する抗体であるMabCXCL10(重鎖:EEIVH(配列番号:1)、軽鎖:EEIVL(配列番号:2))とMabCXCL10_G7(重鎖:G7H-G1T4(配列番号:368)、軽鎖:G7L-LT0(配列番号:369))の発現ベクターを当業者公知の方法で調製し、FreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いて当業者公知の方法で発現、精製を行った。
MabCXCL10あるいはMabCXCL10_G7の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近に表2中に示す切断配列をそれぞれ挿入し、MabCXCL10改変重鎖を作製した。プロテアーゼ切断配列が挿入されたMabCXCL10重鎖改変体の配列を表3に示す。
10-1で調製した抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( human MT-SP1, hMT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。結果は図19A、19Bに示す。表4で示すMabCXCL10改変体とMabCXCL10_G7改変体のいずれも、hMT-SP1処理によって37kDa付近に新たなバンドが生じた。即ち、表2で示すプロテアーゼ切断配列はhMT-SP1によって切断されることが確認された。また、類似の方法で、表2で示すプロテアーゼ切断配列はhuman uPA, mouse uPAにも切断されることが確認された。
11-1 多様なプロテアーゼの認識配列が導入されたポリペプチドの作製
ヒトIL-6Rに対する中和抗体であるMRA(重鎖:MRAH-G1T4(配列番号:147)、軽鎖:MRAL-k0(配列番号:148))の発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。MRAのCDR配列は以下である:H-CDR1(SDHAWS、配列番号:398)、H-CDR2(YISYSGITTYNPSLKS、配列番号:399)、H-CDR3(SLARTTAMDY、配列番号:400)、L-CDR1(RASQDISSYLN、配列番号:401)、L-CDR2(YTSRLHS、配列番号:402)、L-CDR3(QQGNTLPYT、配列番号:403)。
MMP-2、MMP-7、MMP-9で切断されることが知られているペプチド配列およびそれらの配列の近傍にグリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含むペプチド配列を表5に示す。
これらの改変重鎖とMRA軽鎖を組み合わせて、表6に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
11-1で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトMMP-2( R&D Systems, 902-MP-010 )、リコンビナントヒトMMP-7( R&D Systems, 907-MP-010 )、リコンビナントヒトMMP-9( R&D Systems, 911-MP-010 )を用いた。なお、プロテアーゼは1 mM p-aminophenylmercuric acetate (APMA; abcam, ab112146 ) と混ぜ、37℃でそれぞれ1、24時間活性化させてから使用した。プロテアーゼ 50 nM、100 nM、または 500 nM、抗体50μg/mL、assay buffer(MMP Activity Assay Kit(Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer)または 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7.2 (以下、Tris)、37℃の条件下で20時間反応させた後に、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図20A、20B、図21に示す。MRA改変体抗体は、それぞれ表6に示すプロテアーゼと反応させている。MMP-2ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4/MRAL-k0,MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4/MRAL-k0, MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-7ではMEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-9ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4/MRAL-k0の切断が観察された。
12-1 重鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列を導入した抗体の作製
ウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ( MT-SP1 )で切断されることが報告されているペプチド配列B(配列番号:160)をMRA重鎖可変領域(MRAH、配列番号:161)内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表7で示すMRA重鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA重鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA重鎖定常領域(G1T4、配列番号:162)と連結させMRA重鎖改変体の作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、ペプチド配列B(配列番号:160)をMRA重鎖定常領域(G1T4、配列番号:162)内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表8に示すMRA重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA重鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA重鎖可変領域(MRAH、配列番号:161)と連結させMRA重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。作製されたMRA重鎖可変領域の改変体およびMRA重鎖定常領域の改変体におけるプロテアーゼ切断配列挿入位置も表7、8に示す。表7における挿入箇所とは、抗体重鎖可変領域中の記載ポジション(Kabatナンバリング)の定常領域側隣を指し、表8における挿入箇所とは、抗体重鎖定常領域中の記載ポジション(EUナンバリング)の可変領域側隣を指す。
12-1で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( human MT-SP1, hMT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。結果は図22A、22B、22C、22D、22E、22F、22G、22H、22I、図23A、23B、23Cに示す。プロテアーゼ処理後のMRA改変体は、重鎖が切断され、プロテアーゼ処理を受けていないMRA改変体の重鎖(図中のMT-SP1(-) laneの50kDa付近に出現するバンド)と比べて、より分子量の小さい位置に重鎖バンドが出現している。この結果から、12-1で調製したMRA改変体は、hMT-SP1によって切断されることが確認された。
13-1 軽鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列を導入した抗体の作製
ウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ( MT-SP1 )で切断されることが報告されているペプチド配列B(配列番号:160)をMRA軽鎖可変領域(MRAL、配列番号:230)内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表10で示すMRA軽鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA軽鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA軽鎖定常領域(k0、配列番号:231)と連結させMRA軽鎖改変体の作製し、対応する遺伝子コードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、ペプチド配列B(配列番号:160)をMRA軽鎖定常領域(k0、配列番号:231)内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表11に示すMRA軽鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA軽鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA軽鎖可変領域(MRAL、配列番号:230)と連結させMRA軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。作製されたMRA軽鎖可変領域の改変体およびMRA軽鎖定常領域の改変体におけるプロテアーゼ切断配列挿入位置も表10、11に示す。表10における挿入箇所とは、抗体軽鎖可変領域中の記載アミノ酸(Kabatナンバリング)の定常領域側隣を指し、表11における挿入箇所とは、抗体軽鎖定常領域中の記載アミノ酸(EUナンバリング)の可変領域側隣を指す。
13-1で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。結果は図24A、24B、24C、24D、24E、図25A、25Bに示す。プロテアーゼ処理後切断されたMRA改変体は、プロテアーゼ処理を受けていないMRA改変体の軽鎖(図中MT-SP1(-)laneの25kDa付近に出願するバンド)と比べて、より分子量の小さい位置に軽鎖バンドが出現している。
14-1.抗ヒトPD-1中和抗体へのプロテアーゼ切断配列の導入
ヒトPD-1に対する中和抗体5C4H-G1T4/5C4L-KT0(重鎖5C4H-G1T4、配列番号:297;重鎖可変領域5C4H、配列番号:300;重鎖定常領域G1T4、配列番号:301;軽鎖5C4L-KT0、配列番号:298;軽鎖可変領域5C4L、配列番号:302;軽鎖定常領域KT0、配列番号:303; H-CDR1(NSGMH、配列番号:392)、H-CDR2(VIWYDGSKRYYADSVKG、配列番号:393)、H-CDR3(NDDY、配列番号:394)、L-CDR1(RASQSVSSYLA、配列番号:395)、L-CDR2(DASNRAT、配列番号:396)、L-CDR3(QQSSNWPRT、配列番号:397))の重鎖または軽鎖にプロテアーゼ切断配列を挿入し、プロテアーゼ切断配列が導入された抗体を作製した
まず、癌特異的に発現しているマトリプターゼ(MT-SP1)で切断されることが報告されているペプチド配列(配列番号:299)を前述抗体の重鎖5C4H-G1T4または軽鎖5C4L-KT0に挿入し、表13に示す重鎖改変体と表14に示す軽鎖改変体を作製し、当業者公知の方法で発現させた。
14-2-1 プロテアーゼ処理
プロテアーゼ処理抗体は14-1で調製された抗体(終濃度0.111mg/mL)にPBSで1.8μg/mLに調製したRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systems 3946-SE-010) を10μL加えた。プロテアーゼ未処理抗体は14-1で調製された抗体(終濃度0.111mg/mL)にPBSのみを10μL加えた。反応時のサンプル体積は90μLであり、プロテアーゼの終濃度は0.2μg/mLであった。各サンプルを37℃で12時間保温した。
5C4H-G1T4/5C4L-KT0と同じ可変領域の配列を有しているビオチン化抗ヒトPD-1中和抗体を調製した。具体的には、重鎖可変領域5C4H(配列番号:300)に抗体の重鎖定常領域とビオチン(AviTag配列、配列番号:316)を付加した5C4VH-G1dGSBAP(配列番号:317)をコードする遺伝子断片を作製し、当業者公知の方法で動物細胞発現用ベクターに導入した。構築された発現ベクターと軽鎖5C4L-KT0B(配列番号:298)を発現するベクターを293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入した。このときEBNA1(配列番号:318)を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:319)を発現する遺伝子を同時に導入し、ビオチン標識する目的でビオチンを添加した。遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のビオチン化抗ヒトPD-1中和抗体(5C4-bio)を培養上清中に分泌させた。培養上清から当業者公知の方法で5C4-bioを精製した。
14-2-1で調製されたプロテアーゼ処理抗体/プロテアーゼ未処理抗体80μLに、終濃度0.67μMとなるようにヒトPD-1を添加し、30分間室温で結合させ、結合評価用サンプルを調製した。抗体と結合しなかったPD-1の量を評価することで、抗体のプロテアーゼ処理/未処理時のPD-1に対する結合を評価した。
具体的に、抗体と結合しなかったPD-1の量を、実施例14-2-2で調製したビオチン化抗ヒトPD-1中和抗体 (5C4-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法(BLI法)で評価した。
結合評価用サンプル、5C4-bio、PBSをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates(ForteBio、18-5076)の異なるウェルに分注した。Streptavidinバイオセンサー(ForteBio, 18-0009)をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間5C4-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後結合評価用サンプルが入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図26に示す。図26に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された抗体の場合、プロテアーゼ未処理抗体を含む結合評価用サンプルに比べて、プロテアーゼ処理抗体を含む結合評価用サンプルで測定するときの5C4-bioに結合するヒトPD-1の量が多かった。即ち、プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体は、プロテアーゼ処理によってPD-1に対する結合活性が減弱し、PD-1が遊離し、5C4-bioに結合した。
14-2-3で用いられた抗体がプロテアーゼ処理で切断されているかSDS-PAGEで確認した。14-2-3で調製されたプロテアーゼ切断抗体/プロテアーゼ未処理抗体のうち、10μLを3.3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃5分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図27に示す。図27に示すように、プロテアーゼ切断配列を導入した各抗体はプロテアーゼ処理で切断された。
プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体のプロテアーゼ処理前後のPD-1に対する結合活性を別の方法でも測定した。
14-2-1で調製したプロテアーゼ処理抗体またはプロテアーゼ未処理抗体10μLをPBS 70μLと混合し、PD-1結合測定サンプルとした。サンプルのPD-1結合評価はバイオレイヤー干渉法(BLI法)で評価した。14-2-1で調製したプロテアーゼ処理抗体/プロテアーゼ未処理抗体とヒトPD-1 (250nM) をそれぞれTilted bottom (TW384) Microplates(ForteBio、18-5076)の異なるウェルに分注した。Protein Gセンサー(ForteBio, 18-0022)をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間抗体をProtein Gセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後ヒトPD-1が入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図28に示す。図28に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体を使用する場合、プロテアーゼ未処理抗体に比べて、プロテアーゼ処理抗体のヒトPD-1結合量が減少した。
14-3-1 リガンド存在下のプロテアーゼ処理
14-1で調製された抗体(終濃度0.100mg/mL)にPBSで6.67μMに調製したヒトPD-1を10μL添加し、抗体-PD-1複合体液を調製した。プロテアーゼ処理サンプルは、抗体-PD-1複合体液にPBSで5.28μg/mLに調製したRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systems 3946-SE-010) を10μL加え、プロテアーゼ非処理サンプルはPBSのみを10μL加えた。反応時のプロテアーゼの終濃度は0.528μg/mLであった。各サンプルを37℃で12時間保温した。
抗体と複合体を形成していないPD-1の量を実施例14-2-2で調製したビオチン化抗ヒトPD-1中和抗体 (5C4-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法(BLI法)で評価した。
14-3-1で調製された各サンプル、5C4-bio、PBSをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates(ForteBio、18-5076)の異なるウェルに分注した。Streptavidinバイオセンサー(ForteBio, 18-0009)をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間5C4-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、プロテアーゼ処理サンプルまたはプロテアーゼ未処理サンプルが入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図29に示す。図29に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体の場合、プロテアーゼ未処理サンプルに比べ、プロテアーゼ処理サンプルの方では5C4-bioに結合するヒトPD-1の量が増加した。即ち、プロテアーゼ処理により各抗体のPD-1に対する結合活性が減弱し、抗体-PD-1複合体からPD-1が遊離し、リリースされた。
15-1.抗ヒトPD-1中和抗体とヒトPD-1の融合タンパク質の作製
実施例14-1で作製された抗体の重鎖または重鎖改変体のN末端に、グリシン-セリンポリマー(配列番号:321)からなる可動リンカーを介してヒトPD-1配列(配列番号:320)を接続し、PD-1融合重鎖を作製した(表16)。
hPD15C4HA12aa-G1T4/5C4L-KT0(PD-1融合重鎖配列番号:323、軽鎖配列番号:298)
hPD15C4HE12aa-G1T4E/5C4L-KT0(PD-1融合重鎖配列番号:324、軽鎖配列番号:298)
5C4H-G1T4/hPD15C4LH12aa-KT0(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:325)
5C4H-G1T4/hPD15C4LI12aa-KT0(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:326)
5C4H-G1T4/hPD15C4LC12aa-KT0(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:327)
5C4H-G1T4/hPD15C4LD12aa-KT0(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:328)
5C4H-G1T4/hPD15C4LE12aa-KT0E(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:329)
5C4H-G1T4/hPD15C4LB12aa-KT0B(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:330)
5C4H-G1T4/hPD15C4LF12aa-KT0F(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:331)
5C4H-G1T4/hPD15C4LG12aa-KT0G(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:332)
5C4H-G1T4/hPD15C4LJ12aa-KT0J(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:333)
5C4H-G1T4/hPD15C4LK12aa-KT0K(重鎖配列番号:297、PD-1融合軽鎖配列番号:334)
を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。なおプロテアーゼ切断配列を含まない対照抗体として5C4H-G1T4/5C4L-KT0(重鎖配列番号:297、軽鎖配列番号:298))を同様に発現および精製した。
15-2-1 プロテアーゼ処理
プロテアーゼ処理融合タンパク質は15-1で調製された融合タンパク質30μgにPBSで16.7μg/mLに調製したRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systems 3946-SE-010) を4.9μL加えた。プロテアーゼ未処理融合タンパク質は15-1で調製された融合タンパク質30μgにPBSのみを4.9μL加えた。プロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質を37℃で12時間保温した。
プロテアーゼ処理によるPD-1遊離を実施例14-2-2で調製したビオチン化抗ヒトPD-1中和抗体 (5C4-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法(BLI法)で評価した。
15-2-1で調製したプロテアーゼ処理融合タンパク質、プロテアーゼ未処理融合タンパク質、5C4-bio、PBSをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates(ForteBio、18-5076)の異なるウェルに分注した。Streptavidinバイオセンサー(ForteBio, 18-0009)をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間5C4-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施しその後プロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質が入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図30に示す。図30に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された抗体を含む抗体-PD-1融合タンパク質の場合、プロテアーゼ未処理サンプルに比べて、プロテアーゼ処理サンプルの方では5C4-bioに結合するヒトPD-1の量が増加した。即ち、プロテアーゼ処理により融合タンパク質中の抗体のPD-1に対する結合活性が減弱し、PD-1が融合タンパク質から遊離した。
15-2-1で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質がプロテアーゼ処理で切断されているかSDS-PAGEで確認した。15-2-1で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質のうち、10μLを3.3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃5分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel(4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain(novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図31に示す。図31に示すように、プロテアーゼ切断配列を導入した抗体を含む融合タンパク質はプロテアーゼ処理で切断された。
16-1 各種プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体の作成
ヒトCXCL10を中和する抗体であるMabCXCL10_G7(重鎖:G7H-G1T4(配列番号:368)、軽鎖:G7L-LT0(配列番号:369))の軽鎖可変領域と定常領域の境界付近に表18中に示すプロテアーゼ切断配列を挿入し、異なるプロテーゼ切断配列を有するMabCXCL10_G7の軽鎖改変体を作製した(表19)。
上記で作成したプロテアーゼ切断配列を有する軽鎖改変体と重鎖を組み合わせて、表20)に示すMabCXCL10_G7改変体を当業者公知の方法でExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
16-1で調製した抗体改変体がプロテアーゼ処理により切断されるかSDS-PAGEで検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトu-Plasminogen Activator/Urokinase(human uPA, huPA) ( R&D Systems, 1310-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 40 nM、抗体改変体 100μg/mL、PBS、37℃の条件下で1時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。その結果、プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体改変体はいずれもプロテアーゼ処理で切断されることを確認した。即ち、表18中のプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼにより切断可能であることが示された。また、G7L.106a.12aa以外の抗体改変体のいずれも、G7L.106a.12aaより効率よく切断された。
17-1 プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体の作製
実施例16で見出したプロテアーゼ切断配列に加えて、切断効率の向上とプロテアーゼに対する選択性向上を目的に更なるプロテアーゼ切断配列の検討を実施した。ヒトCXCL10を中和する抗体であるMabCXCL10_G7(重鎖:G7H-G1T4(配列番号:1181)、軽鎖:G7L-LT0(配列番号:1182))の軽鎖可変領域と定常領域の境界付近に表GT1中に示すプロテアーゼ切断配列を挿入し、異なるプロテーゼ切断配列を有するMabCXCL10_G7の軽鎖改変体を作製した(表22)。
上記で作製したプロテアーゼ切断配列を有する軽鎖改変体と重鎖を組み合わせて、表23に示すMabCXCL10_G7改変体を実施例16に記載した同様の方法により作製した。
17-1で調製した抗体改変体がプロテアーゼ処理により切断されるかどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトu-Plasminogen Activator/Urokinase(human uPA, huPA)(R&D Systems;1310-SE-010)もしくはリコンビナントヒトMatriptase/ST14 Catalytic Domain (human MT-SP1, hMT-SP1) (R&D Systems; 3946-SE-010)を用い、huPA 40 nMもしくはhMT-SP1 3 nM、抗体改変体 100μg/mL、PBS、37℃の条件下で1時間反応させたのちに、キャピラリー電気泳動イムノアッセイに供した。キャピラリー電気泳動イムノアッセイにはWes (Protein Simple) を使用し、切断前後の軽鎖の検出には抗ヒトlambda鎖HRP標識抗体 (abcam; ab9007) を使用した。その結果、プロテアーゼ処理前に確認された36kDa付近のピークが消失し、20kDa付近に新たにピークが出現した。即ち、36kDa付近のピークが抗体改変体の未切断軽鎖であり、20kDa付近のピークが切断軽鎖と考えられた。プロテアーゼ処理後に得られた各ピークの面積をWes専用のソフトウェア (Compass for SW; Protein Simple) を用いて出力し、抗体改変体の切断率 (%) は(切断軽鎖ピーク面積)*100/(切断軽鎖ピーク面積+未切断軽鎖ピーク面積)の式により算出した。huPA処理による抗体改変体の切断率 (%) を表24、hMT-SP1処理による抗体改変体の切断率 (%) を表25に示した。前記表24および表25に示した抗体改変体の中で、G7L.106a.12aa(重鎖:G7H-G1T4(配列番号:1181)、軽鎖:G7L.106a.12aa-LT0(配列番号:1282))と比較してhuPAによる切断率が高くhMT-SP1における切断率が低い、即ちhuPAへより選択性の高い抗体改変体を表26に示した。
18-1 プロテアーゼ切断配列を導入した二重特異性抗体の作製
ヒトCXCL10を中和する抗体であるMabCXCL10_G7p(重鎖:G7H-F760mnP17(配列番号:1381)、軽鎖:G7L-LT0(配列番号:1182))の軽鎖可変領域と定常領域の境界付近に表27中に示すプロテアーゼ切断配列を挿入し、異なるプロテーゼ切断配列を有するMabCXCL10_G7pの軽鎖改変体を作製した(表28)。
MabCXCL10_G7pの軽鎖や上記で作製したプロテアーゼ切断配列を有する軽鎖改変体と重鎖を組み合わせて、表29に示すMabCXCL10_G7pおよびMabCXCL10_G7p改変体を当業者公知の方法でExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
また、キーホールリンペットヘモシアニン (KLH) に対する抗体であるMabKLHn(重鎖:IC17HdK-F760mnN17(配列番号:1390)、軽鎖:IC17L-k0(配列番号:1391))も当業者公知の方法でExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
上記のMabCXCL10_G7p改変体とMabKLHnを混合し、WO2015046467に記載の方法で表30に示すヒトCXCL10とKLHに対する二重特異性抗体を作製した。
マウスに移植するプロテアーゼ安定発現細胞株としてB16F10/chGPC3/muPA細胞を用いた。この細胞株は、マウスメラノーマ株B16F10細胞に、改変したマウスの chimeric Glypican 3(chGPC3)遺伝子と、mouse uPA(muPA: NM_008873)遺伝子を導入し、安定発現株を樹立後にクローン化した細胞株である。B16F10/chGPC3/muPA細胞は10% FBS(SIGMA社製)、0.5 mg/mL Geneticin(gibco社製)、および1.5 μg/mL Puromycin(gibco社製)を含むRPMI1640培地(ナカライテスク社製)にて培養した。
移植動物としてチャールズリバー社から購入したC57BL/6NCrlマウス(6週齢、♀)を用いた。C57BL/6NCrlマウスの皮下にB16F10/chGPC3/muPA細胞を移植(一匹あたり1E6細胞数)し、移植腫瘍体積の平均がおよそ200 mm3から300 mm3になったマウスを改変抗体投与モデルマウスとして用いた。
移植腫瘍体積は以下の式にて算出した。
腫瘍体積=長径×短径×短径/2
B16F10/chGPC3/muPA細胞移植モデルマウスへの投与薬剤は、実施例18-1で作製された表29に示す各種プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体を用いた。投与薬剤は 改変抗体濃度が0.1 mg/mLになるようにPBST-buffer(PBS+0.05% Tween20 buffer)を用いて調製した。
B16F10/chGPC3/muPA細胞移植マウスに、移植後11日目に各種プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体5検体をそれぞれ投与量1 mg/kg(マウス体重1kgあたりの投与抗体量 mg)にて尾静脈より投与した。投与試験における抗体改変体名、投与量、また投与方法等の詳細を表31に示した。
抗体改変体投与後1日目および3日目に、B16F10/chGPC3/muPA細胞移植モデルマウスから眼窩採血により血液を採取した。採血はイソフルラン麻酔下で実施した。採取した血液を1,900×g、4℃で10分遠心した後、遠心後の上清を血漿成分として取得し、-30℃で保管した。
実施例18-6で回収した血漿からDynabeads Protein A (Thermo; 10001D) を用いて当業者公知の方法で抗体を精製し、抗体改変体のプロテアーゼ切断効率を評価するためキャピラリー電気泳動イムノアッセイに供した。キャピラリー電気泳動イムノアッセイにはWes (Protein Simple) を使用し、抗体軽鎖の検出には抗ヒトlambda鎖HRP標識抗体 (abcam; ab9007)を使用し、抗体重鎖の検出には抗ヒト重鎖HRP標識抗体 (Protein Simple; 043-491)を使用した。その結果、抗ヒトlambda鎖抗体では36kDa付近に未切断の全長軽鎖のピークが検出され、抗ヒト重鎖抗体では56kDa付近に全長重鎖のピークが検出された。なお、MabKLHnの軽鎖はkappa鎖であるため抗ヒトlambda鎖抗体では検出されないため、抗ヒトlambda鎖抗体を用いることでプロテアーゼ切断配列を導入した軽鎖の切断効率の評価が可能である。キャピラリー電気泳動イムノアッセイにより得られた各ピークの面積をWes専用のソフトウェア (Compass for SW; Protein Simple) で出力し、軽鎖残存比として(軽鎖ピーク面積)/(重鎖ピーク面積)を計算することで、マウス体内で切断されずに残った全長軽鎖の割合を求めた。マウス投与後1日後および3日後に回収した抗体の軽鎖残存比を図32に示した。その結果、腫瘍移植マウスの体内において、プロテアーゼ切断配列を導入したMabCXCL10_G7p改変体はMabCXCL10_G7pよりも軽鎖残存比が低下していることが確認された。即ち、プロテアーゼ切断配列を導入した軽鎖が腫瘍移植マウス体内で効率良く切断されたことが示された。
Claims (15)
- 抗体VHと抗体VLとを含むリガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子はリガンドに結合可能であり、当該分子は配列番号:335-345、538-1145、1183-1281、1382-1385で示す配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含むプロテアーゼ切断配列を少なくとも一つ含み、前記リガンド結合分子中の前記抗体VLと前記抗体VHは会合しており、当該会合は前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消され、前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態における当該リガンド結合分子のリガンドに対する結合が、前記プロテアーゼ切断配列が未切断の状態における当該リガンド結合分子のリガンドに対する結合より弱い、リガンド結合分子。
- 前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、請求項1に記載のリガンド結合分子。
- 前記プロテアーゼ切断配列は、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼにより切断される、請求項1または請求項2に記載のリガンド結合分子。
- 前記リガンド結合分子は、抗体定常領域をさらに含む、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗体定常領域と前記抗体VHの境界付近、および/または前記抗体定常領域と前記抗体VLとの境界付近に位置する、請求項4に記載のリガンド結合分子。
- 前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記リガンド結合分子は前記リガンドとの結合で前記リガンドの生物活性を阻害する、請求項1から請求項5のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、請求項1から請求項6のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記リガンド結合分子はIgG抗体である、請求項1から請求項7のいずれか一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記リガンドと、請求項1から請求項7のいずれか一項に記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体であって、前記リガンドが前記リガンド結合分子に結合している、複合体。
- 前記リガンドと、請求項1から請求項7のいずれか一項に記載のリガンド結合分子とで形成されている融合タンパク質であって、前記リガンドが前記リガンド結合分子と融合されている融合タンパク質。
- 前記リガンドがリンカーを介して前記リガンド結合分子と融合されている、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載のリガンド結合分子、請求項9に記載の複合体、または請求項10もしくは11に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
- 請求項1から請求項8のいずれか一項に記載のリガンド結合分子、請求項9に記載の複合体、または請求項10もしくは11に記載の融合タンパク質の製造方法。
- 配列番号:335で示す配列を含む、プロテアーゼ基質。
- 配列番号:335で示す配列を含む、ポリペプチド。
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