BR112020010450A2 - polipeptídeo que inclui domínio de ligação a antígeno e seção transportadora - Google Patents

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Hiroyuki Ishikawa
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Abstract

A presente invenção refere-se a polipeptídeos que contêm um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora que tem um domínio inibidor que inibe a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno e que tem uma meia-vida mais longa do que aquela do domínio de ligação a antígeno que existe individualmente; métodos para produção e rastreio dos polipeptídeos; composições farmacêuticas que compreendem o polipeptídeo, métodos para produção e rastreio para um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular; e bibliotecas de polipeptídeo de fusão que incluem um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLI- PEPTÍDEO QUE INCLUI DOMÍNIO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO E SE- ÇÃO TRANSPORTADORA". Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se-se a polipeptídeos que com- preendem um domínio de ligação a antígeno e uma porção transporta- dora que tem um domínio inibidor que inibe a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno, e que tem uma meia-vida mais longa do que a meia-vida do domínio de ligação a antígeno que existe individualmente, métodos para produção e rastreio dos polipeptí- deos, composições farmacêuticas que compreendem o polipeptídeo, métodos para produção e rastreio quanto a um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida por sua associação com VL, VH ou VHH particulares e uma biblioteca de poli- peptídeos de fusão, cada um compreendendo um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida por sua associação com VL, VH ou VHH particulares. Técnica Antecedente
[0002] Anticorpos têm recebido atenção como fármacos por serem altamente estáveis no plasma e causar poucos efeitos colaterais. Dentre eles, muitos fármacos de anticorpo de tipo IgG foram lançados, e um grande número de fármacos de anticorpo estão atualmente em desen- volvimento (Literaturas Não Patente 1 e 2).
[0003] O Rituxan contra CD20, cetuximabe contra EGFR, Hercep- tina contra HER2 e assim por diante foram aprovados até agora como medicamentos terapêuticos para o câncer usando fármacos de anti- corpo (NPL 3). Estas moléculas de anticorpo se ligam aos seus antíge- nos expressos em células cancerosas e, deste modo, exercem atividade citotóxica contra as células cancerosas através da atividade de ADCC, etc. Sabe-se que tal atividade citotóxica com base na atividade de
ADCC, etc., depende do número de antígenos expressos em células alvo de anticorpos terapêuticos (NPL 4). Portanto, níveis elevados de expressão de antígenos alvo são preferidos do ponto de vista dos efei- tos de anticorpos terapêuticos. Entretanto, se um antígeno, embora tendo um nível de expressão elevado, é expresso em tecidos normais, a atividade citotóxica com base na atividade de ADCC, etc., é exercida contra as células normais. Consequentemente, os efeitos colaterais se tornam um sério problema. Portanto, é preferido que antígenos que são alvo de anticorpos terapêuticos como fármacos terapêuticos para o cân- cer sejam expressos especificamente em células cancerosas. Por exemplo, uma molécula de anticorpo contra EDCAM conhecida como um antígeno canceroso foi considerada promissora como um fármaco terapêutico para o câncer. Entretanto, sabe-se que a EBPCAM também é expressa no pâncreas. Na realidade, foi relatado em ensaios clínicos que a administração de um anticorpo anti-EpCAM causa pancreatite como um efeito colateral em virtude da atividade citotóxica contra o pân- creas (NPL 5).
[0004] Na esteira do sucesso de fármacos de anticorpo que exer- cem atividade citotóxica com base na atividade de ADCC, moléculas de anticorpo aprimoradas de segunda geração que exercem forte atividade citotóxica foram reportadas como um resultado, por exemplo, de au- mento da atividade de ADCC pela remoção de fucose do oligossacarí- deo N-ligado de uma região Fc de IgG1 humana natural (NPL 6) ou au- mento da atividade de ADCC ao aumentar a ligação ao FcyRllla através da substituição de aminoácido de uma região Fc de IgG1 humana nativa (NPL 7). Moléculas de anticorpo aprimoradas que exercem atividade ci- totóxica mais forte, tal como um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) que contém um anticorpo conjugado com um fármaco que tem forte ati- vidade citotóxica (NPL 8) e um anticorpo de baixo peso molecular que exerce atividade citotóxica contra células cancerosas através de recru- tamento de células T para as células cancerosas (NPL 9) também foram reportadas como fármacos de anticorpo que exercem atividade citotó- xica contra células cancerosas sob um mecanismo diferente da ativi- dade de ADCC mediada por células NK, conforme mencionado acima.
[0005] Tais moléculas de anticorpo que exercem atividade citotó- xica mais forte podem exercer atividade citotóxica mesmo contra células cancerosas que expressam um antígeno em um nível que não é ele- vado, mas também exercer atividade citotóxica contra tecidos normais que expressam o antígeno em um baixo nível, similarmente às células cancerosas. Na realidade, EGFR-BiTE, um anticorpo biespecífico con- tra CD3 e EGFR, pode exercer forte atividade citotóxica contra células Cancerosas e exercer um efeito antitumor ao recrutar células T para as células cancerosas quando comparado com o cetuximabe, uma IgG1 humana nativa contra o EGFR. Por outro lado, descobriu-se também que graves efeitos colaterais aparecem pela administração de EGFR- BiTE a macacos cinomolgos, uma vez que o EGFR também é expresso em tecidos normais (NPL 10). Também, foi clinicamente constatado que o ADC bivatuzumabe mertansina, o qual contém mertansina conjugada com um anticorpo contra CD44v6 altamente expressa em células can- cerosas, causa toxicidades dérmicas e hepatoxicidade grave, uma vez que a CD44v6 também é expressa em tecidos normais (NPL 11).
[0006] Conforme mencionado acima, o uso de um anticorpo que pode exercer forte atividade citotóxica mesmo contra células cancero- sas que expressam um antígeno em baixos níveis requer que antígeno alvo seja expresso de uma maneira extremamente específica para o câncer. Entretanto, considerando que um antígeno HER?2 alvo da Her- ceptina ou um antígeno EGFR alvo do cetuximabe também é expresso em tecidos normais, apenas um número limitado de antígenos cancero- Sos pode ser expresso de uma maneira extremamente específica para o câncer. Portanto, efeitos colaterais atribuíveis a um efeito citotóxico sobre os tecidos normais podem se tornar um problema, embora a ati- vidade citotóxica contra o câncer possa ser aumentada.
[0007] Recentemente, foi mostrado que o ipilimumabe, o qual au- menta a imunidade tumoral ao inibir a CTLA4 que contribui para imu- nossupressão em câncer, prolonga a sobrevida global em melanoma metastático (NPL 12). Entretanto, o ipilimumabe inibe sistemicamente a CTLAA4 e, portanto, causa efeitos colaterais graves similares à doença autoimune em virtude da ativação sistêmica de imunidade, embora au- mente a imunidade tumoral (NPL 13).
[0008] Entretanto, fármacos de anticorpos que exercem um efeito terapêutico através de inibição de citocinas inflamatórias em doenças inflamatórias ou autoimunes são conhecidos como fármacos de anti- corpo contra doenças diferentes de câncer (NPL 14). Sabe-se, por exemplo, que o Remicade ou Humira que tem como alvo o INF, e o Actenra, que tem como alvo o IL-6R, exercem um efeito terapêutico ele- vado em artrite reumatoide, enquanto que a doença infecciosa é consi- derada como um efeito colateral em virtude da neutralização sistêmica destas citocinas (NPL 15).
[0009] Várias técnicas foram desenvolvidas como técnicas aplicá- veis a fármacos de anticorpo de segunda geração. Por exemplo, foram reportadas técnicas de melhora de funções efetoras, capacidade de |li- gação a antígeno, farmacocinética ou estabilidade ou redução de um risco de imunogenicidade (NPL 16). Entretanto, ainda há uns poucos relatos sobre técnicas que permitam que os fármacos de anticorpo atuem especificamente em um tecido alvo a fim de resolver os efeitos colaterais, conforme descrito acima. As técnicas reportadas incluem um método o qual envolve: conectar um anticorpo a um peptídeo de mas- caramento através de um ligante que é clivado pela protease expressa no local de uma lesão, tal como um tecido canceroso ou um tecido in- flamatório, deste modo, mascarando o sítio de ligação a antígeno do anticorpo com o peptídeo de mascaramento e inibindo a atividade de ligação a antígeno do anticorpo; e dissociar o peptídeo de mascara- mento do mesmo através da clivagem pela protease deste ligante, de modo que o anticorpo restaure sua atividade de ligação a antígeno e se torne capaz de ligação ao antígeno em um tecido patológico alvo (NPLs 17e 18ePTL1). Lista de Citações Literatura de Patente
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Sumário da Invenção Problema Técnico
[0030] Os presentes inventores imaginaram que as técnicas de dis- sociação, através de clivagem pela protease, de um peptídeo de mas- caramento que inibe a atividade de ligação a antígeno de um anticorpo de modo que o anticorpo restaure sua atividade de ligação a antígeno conforme descrito acima, poderiam causar efeitos colaterais, uma vez que o anticorpo clivado no local de uma lesão pode se distribuir para tecidos normais através do fluxo sanguíneo, visto que a clivagem pela protease é irreversível.
[0031] A presente invenção foi feita com base em tal ideia. Um ob- jetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica útil no tratamento de doenças com menos efeitos colaterais e um ingre- diente ativo da mesma. Outro objetivo da presente invenção é fornecer métodos para rastreio e produção da composição farmacêutica e do in- grediente ativo.
[0032] Solução para o Problema
[0033] Os presentes inventores conduziram estudos diligentes e, consequentemente, desenvolveram polipeptídeos que compreendem um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora que tem um domínio inibidor que inibe a atividade de ligação do domínio de liga- ção a antígeno e que tem uma meia-vida mais longa do que a meia-vida do domínio de ligação a antígeno que existe individualmente. Consi- dera-se que o uso do polipeptídeo pode permitir que o domínio de liga- ção a antígeno restaure sua atividade de ligação a antígeno em um te- cido adoecido e exerça a atividade de ligação a antígeno em tecido(s) doente(s) e exerçam a atividade de ligação a antígeno no(s) tecido(s) doente(s). Além disso, a distribuição sistêmica de uma forma ativada do domínio de ligação a antígeno pode ser suprimida em virtude da dife- rença nas meias-vidas entre o polipeptídeo que compreende o domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é inibida e um polipeptídeo que compreende o domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é restaurada. Além disso, os presentes inventores descobriram que os polipeptídeos ou composições farma- cêuticas que compreendem o polipeptídeo são úteis no tratamento de uma doença e também descobriram que os polipeptídeos ou as compo-
sições farmacêuticos são uteis no tratamento de uma doença o qual en- volve administrar o polipeptídeo; e que os polipeptídeos são uteis na produção de um fármaco para o tratamento de doenças. Os presentes inventores desenvolveram ainda métodos para rastreio e produção do polipeptídeo, métodos para produção e rastreio de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida através de sua associação com VL, VH ou VHH particulares e bibliote- cas que incluem um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida através de sua associação com VL, VH ou VHH particulares e concluíram a presente invenção.
[0034] A presente invenção se baseia nestas descobertas e abrange especialmente as modalidades exemplificativas descritas abaixo.
[0035] (1) Um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora, a porção transportadora tendo um domínio inibidor que inibe a atividade de ligação a antígeno do do- mínio de ligação a antígeno e o domínio de ligação a antígeno tendo uma meia-vida mais curta no sangue do que aquela da porção transpor- tadora.
[0036] (2) O polipeptídeo de acordo com o item (1), em que o peso molecular do domínio de ligação a antígeno é menor do que aquele da porção transportadora.
[0037] (3) O polipeptídeo de acordo com o item (1) ou (2), em que o peso molecular do domínio de ligação a antígeno é de 60 kDa ou me- nor.
[0038] (4) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (3), em que a porção transportadora tem atividade de ligação ao FcRn e o domínio de ligação a antígeno não tem atividade de ligação ao FcRn ou tem atividade de ligação ao FcRn mais fraca do que aquela da porção transportadora.
[0039] (5) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (4), em que o domínio de ligação a antígeno é capaz de ser liberado do polipeptídeo e o domínio de ligação a antígeno liberado do polipeptí- deo tem atividade de ligação a antígeno maior do que aquela antes da liberação.
[0040] (6) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (5), em que o domínio inibidor da porção transportadora está associ- ado com o domínio de ligação a antígeno e, deste modo, inibe a ativi- dade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno.
[0041] (7) O polipeptídeo de acordo com o item (5), em que o poli- peptídeo compreende um sítio de clivagem, em que o sítio de clivagem é clivado de modo que o domínio de ligação a antígeno se torne capaz de ser liberado do polipeptídeo.
[0042] (8) O polipeptídeo de acordo com o item (6), em que o poli- peptídeo compreende um sítio de clivagem, em que o sítio de clivagem é clivado de modo que a associação do domínio inibidor da porção transportadora com o domínio de ligação a antígeno seja cancelada.
[0043] (9) O polipeptídeo de acordo com o item (7) ou (8), em que o sítio de clivagem compreende uma sequência de clivagem pela pro- tease.
[0044] (10) O polipeptídeo de acordo com o item (9), em que a pro- tease é uma protease específica para um tecido alvo.
[0045] (11) O polipeptídeo de acordo com (10), em que o tecido alvo é um tecido canceroso ou um tecido inflamatório.
[0046] (12) O polipeptídeo de acordo com o item (9), em que a pro- tease é pelo menos uma protease selecionada a partir de matriptase, uroquinase (UPA) e metaloproteinase.
[0047] (13) O polipeptídeo de acordo com o item (12), em que a protease é pelo menos uma protease selecionada a partir de MT-SP1, uPA, MMP-2, MMP-9, ADAMTS5, MMP-7 e MMP-13.
[0048] (14) O polipeptídeo de acordo com o item (9), em que a se- quência de clivagem pela protease compreende uma ou uma plurali- dade de sequências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 12, 25, 34, 35, 70 a 73, 75, 76, 91, 168 a 178, 193 a 195, 833 a 852 e 1062 a 1081 e das sequências mostradas na Tabela 1.
[0049] (15) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (9) a (14), em que um primeiro ligante flexível é ainda ligado a uma extre- midade da sequência de clivagem pela protease.
[0050] (16) O polipeptídeo de acordo com o item (15), em que um segundo ligante flexível é ainda ligado à outra extremidade da sequên- cia de clivagem pela protease.
[0051] (17) O polipeptídeo de acordo com o item (15), em que o primeiro ligante flexível é um ligante flexível que consiste em um polí- mero de glicina-serina.
[0052] (18) O polipeptídeo de acordo com o item (16), em que o segundo ligante flexível é um ligante flexível que consiste em um polí- mero de glicina-serina.
[0053] (19) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (18), em que o domínio de ligação a antígeno compreende um anti- corpo com um único domínio ou é um anticorpo com um único domínio, em que o domínio inibidor da porção transportadora inibe a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio.
[0054] (20) O polipeptídeo de acordo com o item (19), em que o anticorpo com um único domínio é VHH, VH que tem atividade de liga- ção a antígeno por si só ou VL que tem atividade de ligação a antígeno por si só.
[0055] (21) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (20), em que o domínio de ligação a antígeno compreende um anti- corpo com um único domínio e o domínio inibidor da porção transporta- dora é VHH, VH de anticorpo ou VL de anticorpo, em que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio é inibida pela VHH, pela VH de anticorpo ou pela VL de anticorpo.
[0056] (22) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (21), em que o domínio de ligação a antígeno compreende um anti- corpo com um único domínio e o domínio inibidor da porção transporta- dora é VHH, VH de anticorpo ou VL de anticorpo, em que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio é inibida através de sua associação com a VHH, a VH de anticorpo ou a VL de anticorpo.
[0057] (23) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (22), em que o anticorpo com um único domínio é VHH ou VH que tem atividade de ligação a antígeno por si só e o domínio inibidor da porção transportadora é VL de anticorpo, em que a atividade de liga- ção a antígeno da VHH ou da VH que tem atividade de ligação a antí- geno por si só é inibida através de sua associação com a VL de anti- corpo.
[0058] (24) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (23), em que o anticorpo com um único domínio é VHH, em que a VHH tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma posi- ção selecionada a partir das posições de aminoácido 37, 44, 45 e 47 (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0059] (25) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (23), em que o anticorpo com um único domínio é VHH, em que a VHH contém pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos ami- noácidos 37V, 44G, 45L e 47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0060] (26) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (23), em que o anticorpo com um único domínio é VHH, em que a VHH contém pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada a partir de substituições de aminoácido F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, LA47W, T47W, e S47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0061] (27) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (23), em que o anticorpo com um único domínio é VHH, em que a VHH tem substituições de aminoácido em pelo menos um conjunto de posições selecionadas a partir de posições 37/44, posições 37/45, posi- ções 37/47, posições 44/45, posições 44/47, posições 45/47, posições 37/44/45, posições 37/44/47, posições 37/45/47, posições 44/45/47, e posições 37/44/45/47 (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0062] (28) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (23), em que o anticorpo com um único domínio é VHH, em que a VHH contém pelo menos um conjunto de aminoácidos selecionado a partir de 37V/44G, 37V/45L, 37V/A47W, 44G/45L, 44G/47W, 45L/47W, 37V/44G/45L, 37V/44G/ATW, 37V/45L/A7W, A44G/45L/A7W, Ee 37 VI44G/45L/47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0063] (29) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (23), em que o anticorpo com um único domínio é VHH, em que a VHH contém pelo menos um conjunto de substituições de aminoácido selecionado a partir de F37V/R45L, F37V/G47W, R45L/G47W e F37V/IR45L/G47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0064] (30) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (19) a (22), em que o anticorpo com um único domínio é VL que tem atividade de ligação a antígeno por si só e o domínio inibidor da porção transportadora é VH de anticorpo, em que a atividade de ligação a antí- geno da VL que tem atividade de ligação a antígeno por si só é inibida através de sua associação com a VH de anticorpo.
[0065] (31) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (30), em que a porção transportadora tem uma região de ligação ao FecRn.
[0066] (32) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1)
a (31), em que a porção transportadora compreende uma região cons- tante de anticorpo.
[0067] (33) O polipeptídeo de acordo com (32), em que a região constante de anticorpo da porção transportadora e o domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante.
[0068] (34) O polipeptídeo de acordo com (32), em que a porção transportadora compreende uma região constante de cadeia pesada de anticorpo, em que a região constante de cadeia pesada de anticorpo e o domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante.
[0069] (35) O polipeptídeo de acordo com (32), em que a porção transportadora compreende uma região constante de cadeia leve de an- ticorpo, em que a região constante de cadeia leve de anticorpo e o do- mínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante.
[0070] (36) O polipeptídeo de acordo com o item (34) em que, no polipeptídeo, o N-término da região constante de cadeia pesada de an- ticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante e o po- lipeptídeo tem ainda uma sequência de clivagem pela protease, em que a sequência de clivagem pela protease está localizada dentro da se- quência do domínio de ligação a antígeno ou na região constante de cadeia pesada de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 122 (numeração EU).
[0071] (37) O polipeptídeo de acordo com o item (35) em que, no polipeptídeo, o N-término da região constante de cadeia leve de anti- corpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante e o po- lipeptídeo tem ainda uma sequência de clivagem pela protease, em que a sequência de clivagem pela protease está localizada dentro da se- quência do domínio de ligação a antígeno ou na região constante de cadeia leve de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 113 (numeração EU).
[0072] (38) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (33) a (35) em que, no polipeptídeo, o N-término da região constante do anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante, o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VH, ou VHH, e o polipeptídeo tem ainda uma se- quência de clivagem pela protease, em que a sequência de clivagem pela protease está localizada dentro da sequência da região constante de anticorpo ou no anticorpo com um único domínio do domínio de liga- ção a antígeno no lado mais próximo da região constante do anticorpo depois da posição de aminoácido 109 (numeração de Kabat).
[0073] (39) O polipeptídeo de acordo com o item (33) em que, no polipeptídeo, o N-término da região constante de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fun- didos através de um ligante ou sem um ligante e o polipeptídeo tem ainda uma sequência de clivagem pela protease, em que a sequência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite entre o do- mínio de ligação a antígeno e a região constante de anticorpo.
[0074] (40) O polipeptídeo de acordo com o item (34) em que, no polipeptídeo, o N-término da região constante de cadeia pesada de an- ticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante e o po- lipeptídeo tem ainda uma sequência de clivagem pela protease, em que a sequência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a região constante de cadeia pesada de anticorpo.
[0075] (41) O polipeptídeo de acordo com o item (35), em que no polipeptídeo, o N-término da região constante de cadeia leve de anti- corpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante e o po- lipeptídeo tem ainda uma sequência de clivagem pela protease, em que a sequência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a região constante de cadeia leve de anticorpo.
[0076] (42) O polipeptídeo de acordo com o item (40), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VH, ou VHH, e a sequência de clivagem pela pro- tease está localizada em qualquer posição entre a posição de aminoá- cido 109 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio do domínio de ligação a antígeno e a posição de aminoácido 122 (numera- ção EU) da região constante de cadeia pesada de anticorpo.
[0077] (43) O polipeptídeo de acordo com o item (41), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VH, ou VHH, e a sequência de clivagem pela pro- tease está localizada em qualquer posição entre a posição de aminoá- cido 109 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio do domínio de ligação a antígeno e a posição de aminoácido 113 (numera- ção EU) (posição 113 na numeração de Kabat) da região constante de cadeia leve de anticorpo.
[0078] (44) O polipeptídeo de acordo com o item (40), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VL, e a sequência de clivagem pela protease está localizada em qualquer posição entre a posição de aminoácido 104 (nu- meração de Kabat) do anticorpo com um único domínio do domínio de ligação a antígeno e a posição de aminoácido 122 (numeração EU) da região constante de cadeia pesada de anticorpo.
[0079] (45) O polipeptídeo de acordo com o item (41), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VL e a sequência de clivagem pela protease está localizada em qualquer posição entre a posição de aminoácido 109 (nu- meração de Kabat) do anticorpo com um único domínio do domínio de ligação a antígeno e a posição de aminoácido 113 (numeração EU) (po- sição 113 na numeração de Kabat) da região constante de cadeia leve de anticorpo.
[0080] (46) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (32) a (45), em que a região constante de anticorpo do polipeptídeo é uma região constante de anticorpo IgG.
[0081] (47) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (46), em que o polipeptídeo é uma molécula similar ao anticorpo IgG.
[0082] (48) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (47) em que, quando o domínio de ligação a antígeno é ensaiado em um estado não liberado pelo uso de BL! (interferometria de biocamada) (Octet), ligação do domínio de ligação a antígeno ao antígeno não é observada.
[0083] (49) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (48), em que um segundo domínio de ligação a antígeno está ainda ligado ao domínio de ligação a antígeno.
[0084] (50) O polipeptídeo de acordo com o item (49), em que o segundo domínio de ligação a antígeno tem especificidade de ligação a antígeno diferente daquela do domínio de ligação a antígeno.
[0085] (51) O polipeptídeo de acordo com os itens (49) ou (50), em que o segundo domínio de ligação a antígeno compreende um segundo anticorpo com um único domínio.
[0086] (52) O polipeptídeo de acordo com o item (51), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio, o segundo domínio de ligação a antígeno é um segundo anticorpo com um único domínio e o domínio de ligação a antígeno e o segundo domí- nio de ligação a antígeno são capazes de ser liberados do polipeptídeo, em que o anticorpo com um único domínio e o segundo anticorpo com um único domínio formam uma molécula de ligação a antígeno biespe- cífica nos estados liberados do domínio de ligação a antígeno e o se- gundo domínio de ligação a antígeno.
[0087] (53) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (49) a (52), em que o segundo domínio de ligação a antígeno está dire- cionado ao HER2 ou GPC3 como um antígeno alvo.
[0088] (54) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (53), em que o polipeptídeo tem ainda um domínio de ligação a antí- geno adicional diferente do domínio de ligação a antígeno, em que a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno adici- onal também é inibida através de sua ligação à porção transportadora do polipeptídeo.
[0089] (55) O polipeptídeo de acordo com o item (54), em que o domínio de ligação a antígeno adicional e o domínio de ligação a antí- geno diferem quanto à especificidade de ligação a antígeno.
[0090] (56) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (55), em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno direcionado à Plexina A1, IL-6R ou CD3 como um antígeno alvo.
[0091] (57) Uma composição farmacêutica que compreende o poli- peptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (56).
[0092] (58) Um método para a produção do polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (56).
[0093] (59) O método de produção de acordo com o item (58) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo;
(b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção transportadora para formar um precursor polipeptídico; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor polipeptídico.
[0094] (60) O método de produção de acordo com o item (58) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção transportadora para formar um precursor polipeptídico; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo ao li- mite entre o anticorpo com um único domínio e a porção transportadora.
[0095] (61) O método de produção de acordo com o item (58) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora através de uma sequência de clivagem pela pro- tease, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção trans- portadora para formar um polipeptídeo.
[0096] (62) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (59) a (61) que compreende ainda a seguinte etapa: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio incorporado no polipeptídeo ou no precursor polipeptídico contra o antígeno alvo é enfraquecida ou perdida.
[0097] (63) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (59) a (62) que compreende ainda a seguinte etapa: (e) liberar o anticorpo com um único domínio através da clivagem pela protease de uma sequência de clivagem pela protease e confirmar se o anticorpo com um único domínio liberado se liga ao antígeno.
[0098] (64) O método de produção de acordo com o item (58), em que o polipeptídeo é uma molécula similar ao anticorpo IgG.
[0099] (65) O método de produção de acordo com o item (64) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com uma VL como um substituto para a VH de um anti- corpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja asso- ciado com uma VH como um substituto para a VL de um anticorpo IgG, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida para formar um precursor de molécula similar ao anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor de molécula similar ao anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio.
[0100] (66) O método de produção de acordo com o item (64) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com uma VL como um substituto para a VH de um anti- corpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja asso- ciado com a VH como um substituto para a VL de um anticorpo IgG, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida para formar um precursor de molécula similar ao anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio e uma região constante de anticorpo no precursor de molécula similar ao anticorpo IgG.
[0101] (67) O método de produção de acordo com o item (64) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) como um substituto para a VH ou VL de anticorpo IgG a uma região constante de cadeia leve ou região constante de cadeia pesada de anticorpo IgG atra- vés de uma sequência de clivagem pela protease, de modo que a ativi- dade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida para formar uma molécula similar ao anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio.
[0102] (68) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (65) a (67) que compreende ainda a seguinte etapa: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio presente na molécula similar ao anticorpo IgG ou no precursor de molécula similar ao anticorpo IgG contra o antígeno alvo é enfraquecida ou perdida.
[0103] (69) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (65) a (68) que compreende ainda a seguinte etapa: (e) liberar o anticorpo com um único domínio através da clivagem pela protease de uma sequência de clivagem pela protease e confirmar se o anticorpo com um único domínio liberado se liga ao antígeno alvo.
[0104] (70) O método de produção de acordo com o item (64) que compreende as seguintes etapas: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação do anticorpo com um único domínio com a VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associa- ção do anticorpo com um único domínio com a VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VH de anticorpo ou permitir que o anticorpo com um único domínio variante seja associado com a VL de anticorpo, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar um precursor de molécula similar ao anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor de molécula similar ao anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante.
[0105] (71) O método de produção de acordo com o item (64) que compreende as seguintes etapas: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VH de anticorpo ou permitir que o anticorpo com um único domínio variante seja associado com VL de an- ticorpo, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar um precursor de mo- lécula similar ao anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domí- nio variante; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio variante e uma região constante no precursor de molécula similar ao anticorpo IgG.
[0106] (72) O método de produção de acordo com o item (64) que compreende as seguintes etapas: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) a uma região constante de cadeia pesada de anticorpo IgG através de uma sequência de clivagem pela protease ou ligar o anticorpo com um único domínio variante a uma região constante de cadeia leve de anticorpo IgG através de uma sequência de clivagem pela protease, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar uma molécula similar ao anti- corpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante.
[0107] (73) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (70) a (72) que compreende ainda a seguinte etapa: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio variante presente na molécula similar ao anticorpo IgG ou a ativi- dade de ligação do anticorpo com um único domínio variante presente no precursor de molécula similar ao anticorpo IgG contra o antígeno alvo é enfraquecida ou perdida.
[0108] (74) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (70) a (73) que compreende ainda a seguinte etapa: (e) liberar o anticorpo com um único domínio variante através de cliva- gem da sequência de clivagem pela protease com uma protease e con- firmar se o anticorpo com um único domínio variante liberado se liga ao antígeno alvo.
[0109] (75) Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (56).
[0110] (76) Um vetor que compreende o polinucleotídeo de acordo com o item (75).
[0111] (77) Uma célula hospedeira que compreende o polinucleotí- deo de acordo com o item (75) ou o vetor de acordo com o item (76).
[0112] (78) Um método para a produção do polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (1) a (56) que compreende a etapa de cultura da célula hospedeira de acordo com o item (77).
[0113] (79) Um método para rastreio de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida através de Sua associação com uma VL particular, através de sua associação com uma VH particular ou através de sua associação com uma VHH particu- lar.
[0114] (80) O método de rastreio de acordo com o item (79), em que o método é um método para rastreio quanto a um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida atra- vés de sua associação com uma VL particular.
[0115] (81) O método de rastreio de acordo com o item (80) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que tem atividade de liga- ção a antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com a VL particular; e
(c) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio associado com a VL particular na etapa (b) contra o antígeno é enfraquecida quando comparado com aquela antes da associação ou perdida.
[0116] (82) O método de rastreio de acordo com o item (80) que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que um anticorpo com um único domínio seja associado com uma VL particular; (b) selecionar (um) produto(s) da associação da VL e do anticorpo com um único domínio com base no fato de que o anticorpo com um único domínio associado com a VL particular na etapa (a) não tem atividade de ligação ou tem atividade de ligação de um valor predeterminado ou menor contra o antígeno; e (c) confirmar se o anticorpo com um único domínio no(s) produto(s) da associação selecionado na etapa (b) tem atividade de ligação mais forte contra o antígeno em um estado não associado com a VL particular do que aquela em um estado associado com a mesma.
[0117] (83) O método de rastreio de acordo com o item (79), em que o método é um método para rastreio quanto a um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida atra- vés de sua associação com uma VH particular.
[0118] (84) O método de rastreio de acordo com o item (83) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que tem atividade de liga- ção a antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com a VH particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio associado com a VH particular na etapa (b) contra o antígeno é enfraquecida quando comparado com aquela antes da associação ou perdida.
[0119] (85) O método de rastreio de acordo com o item (83) que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que um anticorpo com um único domínio seja associado com uma VH particular; (b) selecionar (um) produto(s) da associação da VH e do anticorpo com um único domínio com base no fato de que o anticorpo com um único domínio associado com a VH particular na etapa (a) não tem atividade de ligação ou tem atividade de ligação de um valor predeterminado ou menor contra o antígeno; e (c) confirmar se o anticorpo com um único domínio no(s) produto(s) da associação selecionado na etapa (b) tem atividade de ligação mais forte contra o antígeno em um estado não associado com a VH particular do que aquela em um estado associado com a mesma.
[0120] (86) O método de rastreio de acordo com o item (79), em que o método é um método para rastreio quanto a um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida atra- vés de sua associação com uma VHH particular.
[0121] (87) O método de rastreio de acordo com o item (86) que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que tem atividade de liga- ção a antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com uma VHH particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio associado com a VHH particular na etapa (b) contra o antígeno é enfraquecida quando comparado com aquela antes da associação ou perdida.
[0122] (88) O método de rastreio de acordo com o item (86) que compreende as seguintes etapas:
(a) permitir que um anticorpo com um único domínio seja associado com uma VHH particular; (b) selecionar (um) produto(s) da associação formado da VHH e do an- ticorpo com um único domínio com base no fato de que o anticorpo com um único domínio associado com a VHH particular na etapa (a) não tem atividade de ligação ou tem atividade de ligação de um valor predeter- minado ou menor contra o antígeno; e (c) confirmar se o anticorpo com um único domínio no(s) produto(s) da associação selecionado(s) na etapa (b) tem atividade de ligação mais forte contra o antígeno em um estado não associado com a VHH parti- cular do que aquela em um estado associado com a mesma.
[0123] (89) Um método para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida atra- vés de sua associação com uma VL particular, através de sua associa- ção com uma VH particular ou através de sua associação com uma VHH particular.
[0124] (90) O método de produção de acordo com o item (89), em que o método é um método para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida atra- vés de sua associação com uma VL particular.
[0125] (91) O método de produção de acordo com o item (90) que compreende a seguinte etapa: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo.
[0126] (92) O método de produção de acordo com o item (91) que compreende ainda as seguintes etapas: (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VL; e (c) confirmar se a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante associado com a VL é enfraquecida quando comparado com aquela antes da associação ou perdida.
[0127] (93) O método de produção de acordo com o item (89), em que o método é um método para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida atra- vés de sua associação com uma VH particular.
[0128] (94) O método de produção de acordo com o item (93) que compreende a seguinte etapa: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VH de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo.
[0129] (95) O método de produção de acordo com o item (94) que compreende ainda as seguintes etapas: (b) permitir que do anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VM; e (c) confirmar se a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante associado com a VH é enfraquecida quando comparado com aquela antes da associação ou perdida.
[0130] (96) O método de produção de acordo com o item (89), em que o método é um método para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida atra- vés de sua associação com uma VHH particular.
[0131] (97) O método de produção de acordo com o item (96) que compreende a seguinte etapa: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VHH para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a atividade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo.
[0132] (98) O método de produção de acordo com (97) que compre- ende ainda as seguintes etapas: (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VHH; e (c) confirmar se a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante associado com a VHH é enfraquecida quando comparado com aquela antes da associação ou perdida.
[0133] (99) Uma biblioteca que compreende uma pluralidade de po- lipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um li- gado a um primeiro domínio de sustentação de associação, em que os anticorpos com um único domínio incluem um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de sua associação com uma VL particular, um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de sua associação com uma VH particular ou um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de sua associação com uma VHH particular.
[0134] (100) A biblioteca de acordo com o item (99), em que a por- ção de anticorpo com um único domínio em cada polipeptídeo de fusão na biblioteca inclui um anticorpo com um único domínio obtido a partir de um animal da família Camelidae ou um animal transgênico que traz um gene capaz de suscitar ao anticorpo com um único domínio ou um anticorpo humanizado do mesmo, um anticorpo com um único domínio obtido pela imunização de um animal da família Camelidae ou um ani- mal transgênico que traz um gene capaz de suscitar ao anticorpo com um único domínio ou um anticorpo humanizado do mesmo ou um anti- corpo com um único domínio artificialmente preparado que se origina de uma VH ou VL de anticorpo humano.
[0135] (101) A biblioteca de acordo com os itens (99) ou (100) a qual é uma biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um pri- meiro domínio de sustentação de associação, em que os anticorpos com um único domínio incluem um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de Sua associação com uma VL particular.
[0136] (102) A biblioteca de acordo com os itens (99) ou (100) a qual é uma biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um pri- meiro domínio de sustentação de associação, em que os anticorpos com um único domínio incluem um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de sua associação com uma VH particular.
[0137] (103) A biblioteca de acordo com os itens (99) ou (100) a qual é uma biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um pri- meiro domínio de sustentação de associação, em que os anticorpos com um único domínio incluem um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de sua associação com uma VHH particular.
[0138] (104) Um método para rastreio de uma biblioteca de acordo com os itens (99) ou (100) quanto a um polipeptídeo de fusão que com- preende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua asso- ciação com uma VL particular, um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de sua associação com uma VH particular ou um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou perdida através de sua associação com uma VHH particular.
[0139] (105) Um método para rastreio de uma biblioteca de acordo com o item (101) quanto a um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com uma VL particular.
[0140] (106) O método de rastreio de acordo com o item (105) que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca sejam visualiza- dos in vitro; (b) fornecer um parceiro de associação de um segundo domínio de sus- tentação de associação fundido com uma VL particular; (c) permitir que cada um dos polipeptídeos de fusão visualizados na etapa (a) seja associado com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar (um) polipeptídeo(s) de fusão que não se liga(m) ao antígeno ou tem/têm atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domínio está associado com a VL; e (d) selecionar, a partir do(s) polipeptídeo(s) de fusão assim selecio- nado(s) na etapa (c), um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado onde o anticorpo com um único domínio contido no mesmo não está associado com a VL.
[0141] (107) O método de rastreio de acordo com o item (106), em que o parceiro de associação fornecido na etapa (b) compreende ainda uma sequência de clivagem pela protease e a etapa (d) compreende clivagem do parceiro de associação por meio de tratamento com pro- tease, de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VL seja cancelada.
[0142] (108) O método de rastreio de acordo com o item (107), em que a sequência de clivagem pela protease do parceiro de associação fornecido na etapa (b) está localizada próximo do limite entre a VL par- ticular e o segundo domínio de sustentação de associação.
[0143] (109) O método de rastreio de acordo com o item (106), em que os polipeptídeos de fusão da biblioteca compreendem ainda uma sequência de clivagem pela protease e a etapa (d) compreende cliva- gem do(s) polipeptídeo(s) de fusão por meio de tratamento com pro- tease, de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VL seja cancelada.
[0144] (110) O método de rastreio de acordo com o item (109), em que a sequência de clivagem pela protease contida em cada polipeptí- deo de fusão está localizada próximo do limite entre o anticorpo com um único domínio e o primeiro domínio de sustentação de associação.
[0145] (111) O método de rastreio de acordo com o item (106), em que a etapa (d) compreende permitir que o comprimento completo do(s) polipeptídeo(s) de fusão selecionado(s) na etapa (c) ou suas porções que compreendem os anticorpos com um único domínio seja visualizado novamente in vitro.
[0146] (112) O método de rastreio de acordo com o item (106), em que a etapa (d) compreende permitir que o comprimento completo do(s) polipeptídeo(s) de fusão selecionado(s) na etapa (c) seja visualizado novamente in vitro e selecionar um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeter- minado ou maior em um estado associado apenas com o segundo do- mínio de sustentação de associação.
[0147] (113) Um método para rastreio de uma biblioteca de acordo com o item (102) quanto a um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com uma VH particular.
[0148] (114) O método de rastreio de acordo com o item (113) que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca sejam visualiza- dos in vitro; (b) fornecer um parceiro de associação de um segundo domínio de sus- tentação de associação fundido com a VH particular; (c) permitir que cada um dos polipeptídeos de fusão visualizados na etapa (a) seja associado com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar (um) polipeptídeo(s) de fusão que não se liga(m) ao antígeno ou tem/têm atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domínio está associado com a VH; e (d) selecionar, a partir do(s) polipeptídeo(s) de fusão assim selecio- nado(s) na etapa (c), um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado onde o anticorpo com um único domínio contido no mesmo não está associado com a VH.
[0149] (115) O método de rastreio de acordo com o item (114), em que o parceiro de associação fornecido na etapa (b) compreende ainda uma sequência de clivagem pela protease e a etapa (d) compreende clivagem do parceiro de associação por meio de tratamento com pro- tease, de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VH seja cancelada.
[0150] (116) O método de rastreio de acordo com o item (115), em que a sequência de clivagem pela protease do parceiro de associação fornecido na etapa (b) está localizada próximo do limite entre a VH par- ticular e o segundo domínio de sustentação de associação.
[0151] (117) O método de rastreio de acordo com o item (114), em que os polipeptídeos de fusão da biblioteca compreendem ainda uma sequência de clivagem pela protease e a etapa (d) compreende cliva- gem do(s) polipeptídeo(s) de fusão por meio de tratamento com pro- tease, de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VH seja cancelada.
[0152] (118) O método de rastreio de acordo com o item (117), em que a sequência de clivagem pela protease contida em cada polipeptí- deo de fusão está localizada próximo do limite entre o anticorpo com um único domínio e o primeiro domínio de sustentação de associação.
[0153] (119) O método de rastreio de acordo com o item (114), em que a etapa (d) compreende permitir que os comprimentos completos do(s) polipeptídeo(s) de fusão selecionado(s) na etapa (c) sejam visua- lizados novamente in vitro ou suas porções que compreendem os anti- corpos com um único domínio.
[0154] (120) O método de rastreio de acordo com o item (114), em que a etapa (d) compreende permitir que os comprimentos completos do(s) polipeptídeo(s) de fusão selecionado(s) na etapa (c) sejam visua- lizados novamente in vitro e selecionar um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado associado apenas com o se- gundo domínio de sustentação de associação.
[0155] (121) Um método para rastreio de uma biblioteca de acordo com o item (103) quanto a um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com uma VHH particular.
[0156] (122) O método de rastreio de acordo com o item (121) que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca sejam visualiza- dos in vitro;
(b) fornecer um parceiro de associação de um segundo domínio de sus- tentação de associação fundido com a VHH particular; (c) permitir que cada um dos polipeptídeos de fusão visualizados na etapa (a) seja associado com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar um polipeptídeo de fusão que não se liga ao an- tígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predetermi- nado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domínio está associado com a VHH particular; e (d) selecionar, a partir do(s) polipeptídeo(s) de fusão assim selecio- nado(s) na etapa (c), um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado onde o anticorpo com um único domínio contido neste não está associado com a VHH.
[0157] (123) O método de rastreio de acordo com o item (122), em que o parceiro de associação fornecido na etapa (b) compreende ainda uma sequência de clivagem pela protease e a etapa (d) compreende clivagem do parceiro de associação por meio de tratamento com pro- tease, de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VHH seja cancelada.
[0158] (124) O método de rastreio de acordo com o item (123), em que a sequência de clivagem pela protease do parceiro de associação fornecido na etapa (b) está localizada próximo do limite entre a VHH particular e o segundo domínio de sustentação de associação.
[0159] (125) O método de rastreio de acordo com o item (122), em que os polipeptídeos de fusão da biblioteca compreendem ainda uma sequência de clivagem pela protease e a etapa (d) compreende cliva- gem do(s) polipeptídeo(s) de fusão por meio de tratamento com pro- tease, de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VHH seja cancelada.
[0160] (126) O método de rastreio de acordo com o item (125), em que a sequência de clivagem pela protease contida em cada polipeptí- deo de fusão está localizada próximo do limite entre o anticorpo com um único domínio e o primeiro domínio de sustentação de associação.
[0161] (127) O método de rastreio de acordo com o item (122), em que a etapa (d) compreende permitir que os comprimentos completos do(s) polipeptídeo(s) de fusão selecionado(s) na etapa (c) sejam visua- lizados novamente in vitro ou suas porções que compreendem os anti- corpos com um único domínio.
[0162] (128) O método de rastreio de acordo com o item (122), em que a etapa (d) compreende permitir que os comprimentos completos do(s) polipeptídeo(s) de fusão selecionado(s) na etapa (c) sejam visua- lizados novamente in vitro e selecionar um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado associado apenas com o se- gundo domínio de sustentação de associação.
[0163] (129) O método de rastreio de acordo com qualquer um dos itens (106) a (112), (114) a (120) e (122) a (128), em que a etapa de fornecimento de um parceiro de associação na etapa (b) é a etapa de permitir que o parceiro de associação e os polipeptídeos de fusão sejam visualizados juntos.
[0164] (130) A biblioteca de acordo com qualquer um dos itens (99) a (103), em que o primeiro domínio de sustentação de associação com- preende um domínio CH1 de anticorpo IgG ou uma região constante de cadeia leve de anticorpo.
[0165] (131) O método de rastreio de acordo com qualquer um dos itens (106) a (112), (114) a (120) e (122) a (128), em que o primeiro domínio de sustentação de associação compreende um domínio CH1 de anticorpo IgG e o segundo domínio de sustentação de associação compreende uma região constante de cadeia leve de anticorpo.
[0166] (132) O método de rastreio de acordo com qualquer um dos itens (106) a (112), (114) a (120) e (122) a (128), em que o primeiro domínio de sustentação de associação compreende uma região cons- tante de cadeia leve de anticorpo e o segundo domínio de sustentação de associação compreende um domínio CH1 de anticorpo IgG.
[0167] (133) O método de rastreio de acordo com o item (105) que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca sejam visualiza- dos in vitro; (b) fornecer um parceiro de associação de um segundo domínio de sus- tentação de associação fundido com uma VL particular; (c) selecionar (um) polipeptídeo(s) de fusão que compreende(m) um an- ticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior; e (d) permitir que o(s) polipeptídeo(s) de fusão assim selecionado(s) na etapa (c) seja(m) associado(s) com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar um polipeptídeo de fusão que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeter- minado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domí- nio está associado com a VL.
[0168] (134) O método de rastreio de acordo com o item (129), em que a etapa (d) compreende permitir que os polipeptídeos de fusão se- lecionados na etapa (c) sejam visualizados novamente in vitro.
[0169] (135) O método de rastreio de acordo com o item (133), em que a etapa (c) compreende permitir que o(s) polipeptídeo(s) de fusão seja(m) associado(s) apenas com o segundo domínio de sustentação de associação ou confirmar a ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio contido no polipeptídeo de fusão associado apenas com o segundo domínio de sustentação de associação.
[0170] (136) O método de rastreio de acordo com o item (113) que compreende as seguintes etapas:
(a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca sejam visualiza- dos in vitro; (b) fornecer um parceiro de associação de um segundo domínio de sus- tentação de associação fundido com uma VH particular; (c) selecionar (um) polipeptídeo(s) de fusão que compreende(m) um an- ticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior; e (d) permitir que o(s) polipeptídeo(s)s de fusão assim selecionado(s) na etapa (c) seja(m) associado(s) com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar um polipeptídeo de fusão que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeter- minado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domí- nio está associado com a VH.
[0171] (137) O método de rastreio de acordo com o item (136), em que a etapa (d) compreende permitir que os polipeptídeos de fusão se- lecionados na etapa (c) sejam visualizados novamente in vitro.
[0172] (138) O método de rastreio de acordo com o item (136), em que a etapa (c) compreende permitir que o polipeptídeo de fusão seja associado apenas com o segundo domínio de sustentação de associa- ção ou confirmar a ligação a antígeno do anticorpo com um único domí- nio contido no polipeptídeo de fusão associado apenas com o segundo domínio de sustentação de associação.
[0173] (139) O método de rastreio de acordo com o item (121) que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca sejam visualiza- dos in vitro; (b) fornecer um parceiro de associação de um segundo domínio de sus- tentação de associação fundido com a VHH particular; (c) selecionar (um) polipeptídeo(s) de fusão que compreende(m) um an- ticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior; e (d) permitir que o(s) polipeptídeo(s) de fusão assim selecionado(s) na etapa (c) seja(m) associado(s) com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar um polipeptídeo de fusão que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeter- minado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domí- nio está associado com a VHH.
[0174] (140) O método de rastreio de acordo com o item (139), em que a etapa (d) compreende permitir que os polipeptídeos de fusão se- lecionados na etapa (c) sejam visualizados novamente in vitro.
[0175] (141) O método de rastreio de acordo com o item (139), em que a etapa (c) compreende permitir que o(s) polipeptídeo(s) de fusão seja(m) associado(s) apenas com o segundo domínio de sustentação de associação ou confirmar a ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio contido no polipeptídeo de fusão associado apenas com o segundo domínio de sustentação de associação.
[0176] (142) O método de rastreio de acordo com qualquer um dos itens (133) a (141), em que a etapa de permitir que o(s) polipeptídeo(s) de fusão seja(m) associado(s) com o parceiro de associação na etapa (d) é a etapa de permitir que o parceiro de associação e os polipeptídeos de fusão sejam visualizados juntos.
[0177] (143) O método de rastreio de acordo com qualquer um dos itens (133) a (142), em que o primeiro domínio de sustentação de asso- ciação compreende um domínio CH1 de anticorpo IgG e o segundo do- mínio de sustentação de associação compreende uma região constante de cadeia leve de anticorpo.
[0178] (144) O método de rastreio de acordo com qualquer um dos itens (133) a (142), em que o primeiro domínio de sustentação de asso- ciação compreende uma região constante de cadeia leve de anticorpo e o segundo domínio de sustentação de associação compreende um domínio CH1 de anticorpo IgG.
[0179] Especificamente, a presente invenção também pode abran- ger as seguintes modalidades exemplificativas.
[0180] (B1) Um polipeptídeo que compreende um domínio de liga- ção a antígeno e uma porção transportadora, em que a porção trans- portadora tem um domínio inibidor que inibe a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno e em que o polipeptídeo tem uma sequência de clivagem pela protease que compreende uma ou uma pluralidade de sequências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela 1.
[0181] (B2) O polipeptídeo de acordo com o item (B1), em que a inibição da atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a an- tígeno pelo domínio inibidor em um estado onde a sequência de cliva- gem pela protease foi clivada por uma protease é mais fraca do que a inibição da atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a an- tígeno pelo domínio inibidor sob uma condição onde a sequência de cli- vagem pela protease não é clivada.
[0182] (B3) O polipeptídeo de acordo com os itens (B1) ou (B2), em que o domínio de ligação a antígeno tem uma meia-vida mais curta no sangue do que a porção transportadora.
[0183] (B4) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B3), em que o peso molecular do domínio de ligação a antígeno é menor do que aquele da porção transportadora.
[0184] (B5) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B4), em que o peso molecular do domínio de ligação a antígeno é de 60 kDa ou menos.
[0185] (B6) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B5), em que a porção transportadora tem atividade de ligação ao FcRn e o domínio de ligação a antígeno não tem atividade de ligação ao FcRn ou tem atividade de ligação ao FcRn mais fraca do que a por- ção transportadora.
[0186] (B7) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B6), em que o domínio de ligação a antígeno é capaz de ser liberado do polipeptídeo e o domínio de ligação a antígeno tem maior atividade de ligação a antígeno em um estado onde ele está liberado do polipeptídeo do que a atividade de ligação a antígeno em um estado onde ele não está liberado do polipeptídeo.
[0187] (B8) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B7), em que a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno é inibida pela associação do domínio inibidor da por- ção transportadora com o domínio de ligação a antígeno.
[0188] (B9) O polipeptídeo de acordo com o item (B7), em que a sequência de clivagem pela protease é clivada por uma protease, de modo que o domínio de ligação a antígeno se torne capaz de ser libe- rado do polipeptídeo.
[0189] (B10) O polipeptídeo de acordo com o item (B8), em que a sequência de clivagem pela protease é clivada por uma protease, de modo que a associação do domínio inibidor da porção transportadora com o domínio de ligação a antígeno seja cancelada.
[0190] (B11) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B10), em que a protease é uma protease específica para o tecido alvo.
[0191] (B12) O polipeptídeo de acordo com o item (B11), em que o tecido alvo é um tecido canceroso ou um tecido inflamatório e a protease é uma protease específica para o tecido canceroso ou uma protease específica para o tecido inflamatório.
[0192] (B13) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B12), em que a protease é pelo menos uma protease selecio- nada a partir de matriptase, uroquinase (uPA) e metaloproteinase.
[0193] (B14) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B12), em que a protease é pelo menos uma protease selecio- nada a partir de MT-SP1, uPA, MMP-2, MMP-9, ADAMTS5, MMP-7 e MMP- 13.
[0194] (B15) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B14), em que um primeiro ligante flexível é ainda ligado a uma extremidade da sequência de clivagem pela protease.
[0195] (B16) O polipeptídeo de acordo com o item (B15), em que o primeiro ligante flexível é um ligante flexível que consiste em um polí- mero de glicina-serina.
[0196] (B17) O polipeptídeo de acordo com o item (B15) ou (B16), em que um segundo ligante flexível é ainda ligado à outra extremidade da sequência de clivagem pela protease.
[0197] (B18) O polipeptídeo de acordo com o item (B17), em que o segundo ligante flexível é um ligante flexível que consiste em um polí- mero de glicina-serina.
[0198] (B19) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B18), em que o domínio de ligação a antígeno compreende um anticorpo com um único domínio ou é um anticorpo com um único do- mínio em que o domínio inibidor da porção transportadora inibe a ativi- dade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio.
[0199] (B20) O polipeptídeo de acordo com o item (B19), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH, uma VH com atividade de ligação a antígeno por si só ou uma VL que tem atividade de ligação a antígeno por si só.
[0200] (B21) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B20), em que o domínio de ligação a antígeno compreende um anticorpo com um único domínio, em que o domínio inibidor da porção transportadora é uma VHH, uma VH de anticorpo ou uma VL de anti- corpo e em que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio é inibida pela VHH, pela VH de anticorpo ou pela VL de anticorpo.
[0201] (B22) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B21), em que o domínio de ligação a antígeno compreende um anticorpo com um único domínio, em que o domínio inibidor da porção transportadora é uma VHH, uma VH de anticorpo ou uma VL de anti- corpo e em que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio é inibida através de sua associação com a VHH, a VH de anticorpo ou a VL de anticorpo.
[0202] (B23) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B22), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH ou uma VH que tem atividade de ligação a antígeno por si só, em que o domínio inibidor da porção transportadora é uma VL de anticorpo e em que a atividade de ligação a antígeno da VHH ou da VH com atividade de ligação a antígeno por si só é inibida através de sua associação com a VL de anticorpo.
[0203] (B24) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B23), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH e em que a VHH tem uma substituição de aminoácidos em pelo menos uma posição selecionada a partir dos aminoácidos nas posições 37, 44 , 45 e 47 (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0204] (B25) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B23), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH e em que a VHH compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos 37V, 44G, 45L e 47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0205] (B26) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B23), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH e em que a VHH compreende pelo menos uma substituição de aminoáci- dos selecionada a partir de substituições de aminoácidos F37V, Y37V,
E44G, Q44G , R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W e S47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0206] (B27) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B23), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH e em que a VHH tem substituições de aminoácidos em pelo menos um conjunto de posições selecionadas a partir das posições 37/44, posi- ções 37/45, posições 37/47, posições 44/45, posições 44/47, posições 45/47, posições 37/44/45, posições 37/44/47, posições 37/45/47, posi- ções 44/45/47 e posições 37/44/45/47 (todos de acordo com a numera- ção de Kabat).
[0207] (B28) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B23), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH e em que a VHH compreende pelo menos um conjunto de aminoácidos selecionados a partir de 37V/44G, 37V/45L, 37V/47W, 44G/45L, 44G/A7W, 45L/47W, 37V/44G/45L, 37V/44G/47W, 37V/45L/47W, 44G/45L/47W e 37 V/I44G/45L/47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0208] (B29) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B23), em que o anticorpo com um único domínio é uma VHH e em que a VHH compreende pelo menos um conjunto de substituições de aminoácidos selecionadas a partir de F37V/R45L, F37V/G47W , R45L/G47W e F37 V/IR45L/G47W (todos de acordo com a numeração de Kabat).
[0209] (B30) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B19) a (B22), em que o anticorpo com um único domínio é uma VL que tem atividade de ligação a antígeno por si só, em que o domínio inibidor da porção transportadora é uma VH de anticorpo e em que a atividade de ligação a antígeno da VL que tem atividade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com a VH de anticorpo.
[0210] (B31) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens
(B1) a (B30), em que a porção transportadora tem uma região de ligação ao FcRn.
[0211] (B32) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B31), em que a porção transportadora compreende uma região constante de anticorpo.
[0212] (B33) O polipeptídeo de acordo com o item (B32), em que a região constante de anticorpo da porção transportadora e o domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um |i- gante.
[0213] (B34) O polipeptídeo de acordo com o item (B32), em que a porção transportadora compreende uma região constante de cadeia pe- sada de anticorpo e em que a região constante de cadeia pesada de anticorpo e o domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante.
[0214] (B35) O polipeptídeo de acordo com o item (B32), em que a porção transportadora compreende uma região constante de cadeia leve de anticorpo e em que a região constante de cadeia leve de anti- corpo e o domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante.
[0215] (B36) O polipeptídeo de acordo com o item (B34), em que o N-término da região constante de cadeia pesada de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fun- didos através de um ligante ou sem um ligante e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada dentro da sequência do do- mínio de ligação a antígeno ou na região constante de cadeia pesada de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 122 (numeração EU).
[0216] (B37) O polipeptídeo de acordo com o item (B35), em que o N-término da região constante de cadeia leve de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fun- didos através de um ligante ou sem um ligante e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada dentro da sequência do do- mínio de ligação a antígeno ou na região constante de cadeia leve de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 113 (numeração EU) (posição 113 na nume- ração de Kabat).
[0217] (B38) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B33) a (B36), em que o N-término da região constante de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante, em que o domí- nio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio prepa- rado a partir de uma VH ou é uma VHH e em que a sequência de cliva- gem pela protease está localizada dentro da sequência da região cons- tante de anticorpo ou no anticorpo com um único domínio do domínio de ligação a antígeno no lado mais próximo da região constante de an- ticorpo depois do aminoácido na posição 109 (numeração de Kabat).
[0218] (B39) O polipeptídeo de acordo com o item (B33), em que o N-término da região constante de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a região constante de anticorpo.
[0219] (B40) O polipeptídeo de acordo com o item (B34), em que o N-término da região constante de cadeia pesada de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fun- didos através de um ligante ou sem um ligante e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite entre o do- mínio de ligação a antígeno e a região constante de cadeia pesada de anticorpo.
[0220] (B41) O polipeptídeo de acordo com o item (B35), em que o N-término da região constante de cadeia leve de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fun- didos através de um ligante ou sem um ligante e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite entre o do- mínio de ligação a antígeno e a região constante de cadeia leve de an- ticorpo.
[0221] (B42) O polipeptídeo de acordo com o item (B40), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de uma VH ou é uma VHH e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada entre o aminoácido na posição 109 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio do do- mínio de ligação a antígeno e o aminoácido na posição 122 (numeração EU) da região constante de cadeia pesada de anticorpo.
[0222] (B43) O polipeptídeo de acordo com o item (B41), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de uma VH ou é uma VHH e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada entre o aminoácido na posição 109 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio do do- mínio de ligação a antígeno e o aminoácido na posição 113 (numeração EU) (posição 113 na numeração de Kabat) da região constante de ca- deia leve de anticorpo.
[0223] (B44) O polipeptídeo de acordo com o item (B40), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de uma VL e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada entre o aminoácido na posição 104 (numera- ção de Kabat) do anticorpo com um único domínio do domínio de ligação a antígeno e o aminoácido na posição 122 (numeração EU) da região constante de cadeia pesada de anticorpo.
[0224] (B45) O polipeptídeo de acordo com o item (B41), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de uma VL e em que a sequência de clivagem pela protease está localizada entre o aminoácido na posição 109 (numera- ção de Kabat) do anticorpo com um único domínio do domínio de ligação a antígeno e o aminoácido na posição 113 (numeração EU) (posição 113 na numeração de Kabat) da região constante de cadeia leve de an- ticorpo.
[0225] (B46) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B32) a (B45), em que a região constante de anticorpo do polipeptídeo é uma região constante de anticorpo IgG.
[0226] (B47) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B46), em que o polipeptídeo é uma molécula de anticorpo de tipo IgG.
[0227] (B48) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B47) em que, quando o domínio de ligação a antígeno é ensai- ado em um estado não liberado usando interferometria de biocamada (BLI) (Octet), ligação do domínio de ligação a antígeno ao antígeno não é observada.
[0228] (B49) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B48), em que um segundo domínio de ligação a antígeno está ainda ligado ao domínio de ligação a antígeno.
[0229] (B50) O polipeptídeo de acordo com o item (B49), em que o segundo domínio de ligação a antígeno tem especificidade de ligação a antígeno diferente daquela do domínio de ligação a antígeno.
[0230] (B51) O polipeptídeo de acordo com os itens (B49) ou (B50), em que o segundo domínio de ligação a antígeno compreende um se- gundo anticorpo com um único domínio.
[0231] (B52) O polipeptídeo de acordo com o item (B51), em que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio,
em que o segundo domínio de ligação a antígeno é um segundo anti- corpo com um único domínio, em que o domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno são capazes de ser libera- dos do polipeptídeo e em que o anticorpo com um único domínio e o segundo anticorpo com um único domínio formam uma molécula de li- gação a antígeno biespecífica em um estado onde o domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno são liberados.
[0232] (B53) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B49) a (B52), em que o segundo domínio de ligação a antígeno é dire- cionado para HER2 ou GPC3 como um antígeno alvo.
[0233] (B54) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B53), em que o polipeptídeo tem ainda um domínio de ligação a antígeno adicional diferente do domínio de ligação a antígeno e em que a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno adi- cional também é inibida através de sua ligação à porção transportadora do polipeptídeo.
[0234] (B55) O polipeptídeo de acordo com o item (B54), em que o domínio de ligação a antígeno adicional e o domínio de ligação a antí- geno têm diferentes especificidades de ligação a antígeno.
[0235] (B56) O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B55), em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno direcionado à Plexina A1, IL-6R ou CD3 como antí- geno alvo.
[0236] (B57) Uma composição farmacêutica que compreende o po- lipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B56).
[0237] (B58) Um método para produzir o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B56).
[0238] (B59) O método de produção de acordo com o item (B58) que compreende as etapas de: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção transportadora para formar um precursor polipeptídico; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor polipeptídico.
[0239] (B60) O método de produção de acordo com o item (B58) que compreende as etapas de: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção transportadora para formar um precursor polipeptídico; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio e a porção transportadora, em que a sequência de clivagem pela protease compreende uma ou várias sequências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela 1.
[0240] (B61) O método de produção de acordo com o item (B58) que compreende as etapas de: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora através de uma sequência de clivagem pela pro- tease, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção trans- portadora para formar um polipeptídeo, em que a sequência de clivagem pela protease compreende uma ou várias sequências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela 1.
[0241] (B62) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (B59) a (B61) que compreende ainda a etapa de: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio que traz o polipeptídeo ou o precursor polipeptídico contra o antí- geno alvo é enfraquecida ou perdida.
[0242] (B63) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (B59) a (B62) que compreende ainda a etapa de: (e) liberar o anticorpo com um único domínio ao clivar a sequência de clivagem pela protease com uma protease e confirmar se o anticorpo com um único domínio liberado se liga ao antígeno.
[0243] (B64) O método de produção de acordo com o item (B58), em que o polipeptídeo é uma molécula de anticorpo de tipo IgG.
[0244] (B65) O método de produção de acordo com o item (B64) que compreende as etapas de: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado a uma VL como um substituto para uma VH de um anti- corpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja asso- ciado a uma VH como um substituto para uma VL de um anticorpo IgG, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida para formar um precursor da molécula de an- ticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor da molécula de anticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio, em que a sequência de clivagem pela protease compreende uma ou uma pluralidade de sequências selecionadas a partir das se- quências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela 1.
[0245] (B66) O método de produção de acordo com o item (B64) que compreende as etapas de: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado a uma VL como um substituto para uma VH de um anti- corpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja asso- ciado a uma VH como um substituto para uma VL de um anticorpo IgG, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida para formar um precursor da molécula de an- ticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio e uma região constante de anticorpo no precursor da molécula de anticorpo de tipo IgG, em que a sequência de clivagem pela protease compreende uma ou várias se- quências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela
1.
[0246] (B67) O método de produção de acordo com o item (B64) que compreende as etapas de: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) como um substituto para uma VH ou VL de anticorpo IgG a uma região constante de cadeia pesada de anticorpo IgG ou região constante de cadeia leve através de uma sequência de clivagem pela protease, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida para formar uma molécula de anticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio, em que a sequência de clivagem pela protease compreende uma ou várias sequências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela 1.
[0247] (B68) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (B65) a (B67) que compreende ainda a etapa de: (d) confirmar se que a atividade de ligação do anticorpo com um único domínio introduzido na molécula de anticorpo de tipo IgG ou no precur- sor da molécula de anticorpo de tipo IgG contra o antígeno alvo é enfra- quecida ou perdida.
[0248] (B69) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (B65) a (B68) que compreende ainda a etapa de: (e) liberar o anticorpo com um único domínio ao clivar a sequência de clivagem pela protease com uma protease e confirmar se o anticorpo com um único domínio liberado se liga ao antígeno alvo.
[0249] (B70) O método de produção de acordo com o item (B64) que compreende as etapas de: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com uma VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com uma VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a atividade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antí- geno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado a uma VH de anticorpo ou permitir que o anticorpo com um único domínio variante seja associado a uma VL de anticorpo, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar um precursor da molécula de anticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor da molécula de anticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante, em que a sequência de clivagem pela protease com- preende uma ou várias sequências selecionadas a partir das sequên- cias de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as se- quências descritas na Tabela 1.
[0250] (B71) O método de produção de acordo com o item (B64) que compreende as etapas de: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com uma VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com uma VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a atividade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antí- geno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado a uma VH de anticorpo ou permitir que o anticorpo com um único domínio variante seja associado a uma VL de anticorpo, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar um precursor da molécula de anticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio variante e uma região constante no precursor da molécula de anticorpo de tipo IgG, em que a sequência de clivagem pela protease compreende uma ou várias se- quências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela
1.
[0251] (B72) O método de produção de acordo com o item (B64) que compreende as etapas de: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com uma VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com uma VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio con- tra o antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) a uma região constante de cadeia pesada de anticorpo IgG através de uma sequência de clivagem pela protease ou ligar o anticorpo com um único domínio variante a uma região constante de cadeia leve de anticorpo IgG através de uma sequência de clivagem pela protease, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar uma molécula de anticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante, em que a sequência de clivagem pela protease compreende uma ou várias se- quências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela
1.
[0252] (B73) O método de produção e acordo com qualquer um dos itens (B70) a (B72) que compreende ainda a etapa de: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio variante introduzido na molécula de anticorpo de tipo IgG ou no precursor da molécula de anticorpo de tipo IgG contra o antígeno alvo é enfraquecida ou perdida.
[0253] (B74) O método de produção de acordo com qualquer um dos itens (B70) a (B73) que compreende ainda a etapa de:
(e) liberar o anticorpo com um único domínio variante ao clivar a se- quência de clivagem pela protease com uma protease e confirmar se o anticorpo com um único domínio variante liberado se liga ao antígeno alvo.
[0254] (B75) Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B56).
[0255] (B76) Um vetor que compreende o polinucleotídeo de acordo com o item (B75).
[0256] (B77) Uma célula hospedeira que compreende o polinucleo- tídeo de acordo com o item (B75) ou o vetor de acordo com o item (B76).
[0257] (B78) Um método para produzir o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens (B1) a (B56) que compreende a etapa de cultivar a célula hospedeira de acordo com o item (B77). Breve Descrição dos Desenhos
[0258] A Figura 1 é um diagrama que mostra o conceito da tecnolo- gia Probody. Probody é uma molécula de anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é inibida através da ligação de um anticorpo a um peptídeo que mascara o sítio de ligação a antígeno do anticorpo por meio de um ligante que é clivado pela protease expressa no local de uma lesão.
[0259] A Figura 2 é um diagrama que mostra uma causa de efeitos colaterais que poderiam ser exibidos pelo Probody. O Probody ativado acumulado no sangue poderia exibir efeitos colaterais através de liga- ção a um antígeno expresso em um tecido normal.
[0260] A Figura 3 é um diagrama que mostra uma causa de efeitos colaterais que poderiam ser exibidos pelo Probody. O Probody está em equilíbrio entre um estado onde o peptídeo de mascaramento ligado através do ligante está ligado com o sítio de ligação a antígeno e um estado onde o peptídeo de mascaramento esta dissociado. Uma molé- cula no estado dissociado pode se ligar ao antígeno.
[0261] A Figura 4 é um diagrama que mostra uma causa de efeitos colaterais que poderiam ser exibidos pelo Probody. Um anticorpo anti- fármaco contra o peptídeo de mascaramento (anticorpo antipeptídeo de mascaramento) pode se ligar ao peptídeo de mascaramento da Probody antes da ativação e, deste modo, ativar o Probody sem clivagem pela protease.
[0262] A Figura 5 é um diagrama que mostra o conceito de um po- lipeptídeo que compreende um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora. (A) O polipeptídeo com o domínio de ligação a antígeno ligado à porção transportadora tem uma meia-vida longa e não se liga ao antígeno. (B) O domínio de ligação a antígeno é liberado, por exemplo, através de clivagem em um sítio de clivagem para se ligar ao antígeno e o domínio de ligação a antígeno assim liberado tem uma meia-vida curta.
[0263] A Figura 6 é um diagrama que mostra uma modalidade de um método para a produção do polipeptídeo da presente invenção. Na presente modalidade, o polipeptídeo de interesse é uma molécula de anticorpo de tipo IgG. (A) Um anticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno alvo é obtido. (B) É permitido que o anticorpo com um único domínio seja associado com uma VL como um substituto para a VH de um anticorpo IgG, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida. (C) Uma sequência de clivagem pela protease é introduzida em um precursor de molécula de anticorpo de tipo IgG que traz o anticorpo com um único domínio.
[0264] A Figura 7 é um diagrama que mostra uma modalidade do polipeptídeo da presente invenção. Na presente modalidade, o polipep- tídeo é uma molécula de anticorpo de tipo IgG e domínios de ligação a antígeno são, respectivamente, estabelecidos em porções que corres- pondem às duas regiões variáveis do anticorpo IgG. Os dois domínios de ligação a antígeno podem ter a mesma especificidade de ligação a antígeno ou podem diferir quanto à especificidade de ligação a antígeno.
[0265] A Figura 8 é um diagrama que mostra uma modalidade em que um segundo domínio de ligação a antígeno também está ligado ao domínio de ligação a antígeno da presente invenção. Nesta modalidade, o domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antí- geno formam uma molécula de ligação a antígeno biespecífica após |li- beração. A Figura 8(A) é um diagrama que mostra o polipeptídeo em um estado não liberado. A atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno é inibida. A Figura 8(B) é um diagrama que mostra a liberação da molécula de ligação a antígeno específica formada pelo domínio de ligação a antígeno e pelo segundo domínio de ligação a an- tígeno. A Figura 8(C) é um diagrama que mostra uma molécula de liga- ção a antígeno biespecífica contra, por exemplo, um antígeno na super- fície de células T e um antígeno na superfície de uma célula cancerosa como um exemplo da molécula de ligação a antígeno biespecífica após liberação.
[0266] A Figura 9A é um diagrama que mostra um exemplo de um método para rastreio de um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com um domínio inibidor particular, a partir de uma biblioteca que compre- ende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de associação. A Figura 9A(1) é um diagrama que mostra a biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticor- pos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de associação. A Figura 9A(2) é um diagrama que mostra que a atividade de ligação a antígeno de cada anticorpo com um único domínio é confirmada em um estado onde o polipeptídeo de fusão está associado com um parceiro de associação. Um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que não se liga ao antígeno alvo ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor neste estado de associação é selecionado. À Figura 9A(3) é um diagrama que mostra que a associação do anticorpo com um único domínio no polipeptídeo de fusão selecionado em (2) com o domínio inibidor no parceiro de associação é cancelada e a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio é confirmada. Um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno alvo ou tem atividade de ligação a an- tígeno de um valor predeterminado ou maior neste estado de não asso- ciação é selecionado. A Figura 9A(2') é um diagrama que mostra que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio em cada polipeptídeo de fusão é confirmada. Um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que se liga ao antí- geno alvo ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeter- minado ou maior neste estado do polipeptídeo de fusão que existe indi- vidualmente é selecionado. A Figura 9A(3') é um diagrama que mostra que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domí- nio é confirmada em um estado onde o polipeptídeo de fusão selecio- nado em (2') está associado com um parceiro de associação. Um poli- peptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que não se liga ao antígeno alvo ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor neste estado de associação é selecionado.
[0267] A Figura 9B é um diagrama que mostra um exemplo mais específico do método para rastreio quanto a um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com um domínio inibidor particular, a partir de uma bi- blioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domí- nio de sustentação de associação. (1) Os polipeptídeos de fusão, cada um compreendendo um anticorpo com um único domínio e um primeiro domínio de sustentação de associação e um parceiro de associação que traz uma sequência de clivagem pela protease entre um domínio inibidor e um segundo domínio de sustentação de associação, são visualizados juntos para formar uma estrutura similar a Fab; (2) dentre as estruturas similares a Fab assim visualizadas, uma estrutura que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeter- minado ou menor é selecionada; e (3) o parceiro de associação é cli- vado pela protease e um fragmento que compreende um anticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior é selecionado.
[0268] A Figura 9C é um diagrama que mostra outro exemplo mais específico do método para rastreio de um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de liga- ção a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com um domínio inibidor particular, a partir de uma biblio- teca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de an- ticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de associação. (1) Os polipeptídeos de fusão, cada um trazendo uma sequência de clivagem pela protease entre um anticorpo com um único domínio e um primeiro domínio de sustentação de asso- ciação e um parceiro de associação de um domínio inibidor ligado a um segundo domínio de sustentação de associação, são visualizados jun- tos para formar uma estrutura similar a Fab; (2) dentre as estruturas similares a Fab assim visualizadas, uma estrutura que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeter- minado ou menor é selecionada; e (3) o polipeptídeo de fusão é clivado pela protease e um fragmento que compreende um anticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior é selecionado.
[0269] A Figura 9D é um diagrama que mostra um exemplo alterna- tivo do método para rastreio quanto a um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de liga- ção a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com um domínio inibidor particular, a partir de uma biblio- teca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de an- ticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de associação. (1) Os polipeptídeos de fusão, cada um compreendendo um anticorpo com um único domínio e um primeiro do- mínio de sustentação de associação e um parceiro de associação de um domínio inibidor ligado a um segundo domínio de sustentação de associação são visualizados juntos para formar uma estrutura similar a Fab e, dentre as estruturas similares a Fab assim visualizadas, uma es- trutura que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antí- geno de um valor predeterminado ou menor é selecionada; e (2) por- ções que compreendem os anticorpos com um único domínio nas es- truturas similares a Fab assim selecionadas em (1) são visualizadas no- vamente de modo a não expressar o domínio inibidor ao mesmo tempo com as mesmas e um fragmento que se liga ao antígeno ou tem ativi- dade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior é se- lecionado. Cada uma das Figuras 9D(2') e 9D(2") é um diagrama que mostra uma modalidade alternativa, em que as porções que compreen- dem os anticorpos com um único domínio em (2) são visualizadas no- vamente de modo a não expressar o domínio inibidor juntamente com as mesmas. A ordem de (1) e (2), (2!) ou (2") pode ser (2), (2') ou (2") precedendo (1). Especificamente, as porções que compreendem os an- ticorpos com um único domínio são exibidas de modo a não expressar o domínio inibidor juntamente com as mesmas e um fragmento que tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior é selecionado. Em seguida, polipeptídeos de fusão, cada um compreen- dendo um anticorpo com um único domínio que compreende o frag- mento que tem ligação predeterminada ou maior e um primeiro domínio de sustentação de associação e um parceiro de associação de um do- mínio inibidor ligado a um segundo domínio de sustentação de associa- ção, são visualizados juntos para formar uma estrutura similar a Fab e, dentre as estruturas similares a Fab assim visualizadas, uma estrutura que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor é selecionada.
[0270] A Figura 10 é um diagrama que mostra resultados de avali- ação da ligação de IL-6R de moléculas similares a anticorpo preparadas ao permitir que várias cadeias leves sejam associadas com IL-6R90- G1m que contém VHH anti-IL-6R humano (IL-6R90) fundidas com uma região constante de IgG1 humana (CH1-dobradiça-CH2-CH3). O tempo de início da ação das moléculas similares a anticorpo em sensores imo- bilizados com antígeno é um ponto de partida na abscissa.
[0271] A Figura 11(A) é um diagrama que mostra um modelo de molécula similar a anticorpo preparado por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre aVHHe a região constante em IL-6R90-G1m. A Figura 11(B) é um diagrama que mostra o nome de cada cadeia pesada de anticorpo preparada, o sítio de inserção da sequência de aminoácidos e a sequência de aminoáci- dos inserida. O sítio de inserção é indicado por [inserto].
[0272] A Figura 12-1 é um diagrama que mostra os resultados de avaliação do grau de clivagem por redução de SDS-PAGE após trata- mento com protease (MT-SP1) de IL-6R90-G1m ou moléculas similares a anticorpo preparadas por meio de inserção de uma sequência de cli- vagem pela protease próximo do limite entre a VHH e a região constante em IL-6R90-G1m. Das duas novas bandas que resultam de um trata- mento com protease, a banda que aparece a 25 kDa ou menos é uma banda derivada da VHH e a banda que aparece em uma posição de 25 a 50 kDa é uma banda derivada da região constante.
[0273] A Figura 12-2 é um diagrama continuado da Figura 12-1.
[0274] A Figura 13 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação da ligação de IL-6R humano de IL-6R90-G1m ou moléculas simi- lares a anticorpo preparadas por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre a VHH e a região constante em IL-B6R90-G1im ou estas amostras após tratamento com protease (MT-SP1). Protease- representa sensorgramas de avaliação da ligação a antígeno das moléculas similares a anticorpo não tratadas com protease e Protease+ representa sensorgramas de avaliação da ligação a antígeno das moléculas similares a anticorpo tratadas com protease. 30 segundos antes do início da ação das moléculas similares a anticorpo em sensores imobilizados com antígeno são um ponto de partida na abscissa.
[0275] A Figura 14 é um diagrama que mostra resultados de avali- ação da ligação de IL-6R de moléculas similares a anticorpo preparadas ao permitir que várias cadeias leves sejam associadas com 20A11-G1m que contêm VHH anti-IL-6R humano (20A11) fundidas com uma região constante de IgG1 humana (CH1-dobradiça-CH2-CH3). 30 segundos antes do tempo de início da ação das moléculas similares a anticorpo em sensores imobilizados com antígeno são um ponto de partida na abscissa.
[0276] A Figura 15 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação da ligação de IL-68R humano de 20A11-G1m ou moléculas simila- res a anticorpo preparadas ao introduzir mutações nos aminoácidos pre- sentes na interface entre 20A11 e VL e permitir que várias cadeias leves sejam associadas com 20A11hu-G1im que contém o 20A11hu assim preparado fundido com uma região constante de I9gG1 humana (CH1- dobradiça-CH2-CH3). 60 segundos antes do tempo de início da ação das moléculas similares a anticorpo em sensores imobilizados com an- tígeno são um ponto de partida na abscissa.
[0277] A Figura 16 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação do grau de clivagem por redução de SDS-PAGE após tratamento com protease (MT-SP1) de 20A11-G1m ou 4 tipos de moléculas simila- res a anticorpo preparadas por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre 20A11hu e a região constante em 20A11hu-G1im. De duas novas bandas que resultam de um tratamento com protease, a banda que aparece a 25 kDa ou menos é uma banda derivada da VHH e a banda que aparece em uma posição de 25 a 50 kDa é uma banda derivada da região constante.
[0278] A Figura 17 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação da ligação de IL-6R humano de 20A11-G1m ou moléculas simila- res a anticorpo preparadas por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre a VHH e a região cons- tante em 20A11hu-G1im ou estas amostras após tratamento com pro- tease (MT-SP1). Protease- representa sensorgramas de avaliação da ligação a antígeno das moléculas similares a anticorpo não tratadas com protease e Protease+ representa sensorgramas de avaliação da ligação a antígeno das moléculas similares a anticorpo tratadas com protease. 60 segundos antes do início da ação dos anticorpos em sensores imo- bilizados com antígeno são um ponto de partida na abscissa. A amostra com o termo "não testada" significa que a amostra não foi ensaiada.
[0279] A Figura 18 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação do grau de clivagem ao submeter à eletroforese em redução de SDS-PAGE e detecção com CBB após tratamento com protease (MT- SP1) de moléculas similares a anticorpo que tinham VHH anti-CD3 hu- mana em suas regiões variáveis de cadeia pesada e foram preparadas por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease pró- ximo do limite entre a VHH e a região constante de cadeia pesada. De duas novas bandas que resultam de um tratamento com protease, a banda que aparece em torno de 10 a 15 kDa é uma banda derivada da VHH e a banda que aparece em torno de 37 kDa é uma banda derivada da região constante de cadeia pesada.
[0280] A Figura 19 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação da ligação de CD3ed-Fc humano de amostras após tratamento com protease (MT-SP1) de moléculas similares a anticorpo que tinham VHH anti-CD3 humana em suas regiões variáveis de cadeia pesada e foram preparadas por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre a VHH e a região constante de cadeia pesada. Protease- representa sensorgramas de avaliação da li- gação a antígeno das moléculas similares a anticorpo não tratadas com protease e Protease+ representa sensorgramas de avaliação da ligação a antígeno das moléculas similares a anticorpo tratadas com protease. segundos antes do início da ação das moléculas similares a anti- corpo em sensores imobilizados com antígeno são um ponto de partida na abscissa. A ligação é mostrada quando uma resposta antes de liga- ção a antígeno foi definida como O e uma resposta antes da ação dos anticorpos foi definida como 100. É mostrado o tempo que começa em 30 segundos antes da ação dos anticorpos.
[0281] A Figura 20 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação do grau de clivagem ao submeter à eletroforese em redução de SDS-PAGE e detecção com CBB após tratamento com protease (MT- SP1) de uma molécula que tem IL-B6R90-G1m como uma cadeia pesada e Vk1-39-kK0MT como uma cadeia leve ou moléculas similares a anti- corpo preparadas por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre a região variável de cadeia leve e a região constante de cadeia leve da molécula que tem IL-6R90-G1m como uma cadeia pesada e VKk1-39-k0MT como uma cadeia leve. Duas bandas derivadas da cadeia leve resultaram de um tratamento com pro- tease e a cadeia leve foi clivada pela protease.
[0282] A Figura 21 é um diagrama que mostra os resultados de ava- liação da ligação de IL-68R humano de amostras após tratamento com protease (MT-SP1) de uma molécula que tem IL-68R90-G1m como uma cadeia pesada e VKk1-39-k0MT como uma cadeia leve ou moléculas si- milares a anticorpo preparadas por meio de inserção de uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre a região variável de cadeia leve e a região constante de cadeia leve da molécula que tem IL-6R90-G1m como uma cadeia pesada e Vk1-39-k0MT como uma ca- deia leve. Protease- representa sensorgramas de avaliação da ligação a antígeno das moléculas similares a anticorpo não tratadas com pro- tease e Protease+ representa sensorgramas de avaliação da ligação a antígeno das moléculas similares a anticorpo tratadas com protease. Um anticorpo (MRA) com ligação confirmada ao IL-6R foi usado como um controle positivo. O tempo de início da ação das moléculas similares a anticorpo em sensores imobilizados com antígeno é um ponto de par- tida na abscissa.
[0283] A Figura 22 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE de avaliação da clivagem pela protease de moléculas de anticorpo de tipo IgG com ligação de VHH incorporada à Plexina A1 hu- mana. A linha Protease(+) representa as amostras tratadas através de clivagem pela protease e a linha Protease(-) representa amostras de controle negativo sem um tratamento de clivagem pela protease.
[0284] A Figura 23 é um diagrama que mostra sensorgramas Octet de avaliação da ligação à Plexina A1 humana de VHH liberada através de clivagem pela protease de moléculas de anticorpo de tipo IgG com ligação de VHH incorporada à Plexina Al humana. Protease+ repre- senta amostras tratadas através de clivagem pela protease e Protease-
representa amostras sem um tratamento de clivagem pela protease. As concentrações das moléculas de anticorpo de tipo IgG usadas são des- critas ao lado esquerdo do diagrama.
[0285] A Figura 24 é um diagrama que mostra os resultados de SDS-PAGE de avaliação da clivagem pela protease de polipeptídeos que contêm VHH-VHH biespecífica.
[0286] A Figura 25 é um diagrama que mostra a atividade de lucife- rase antes de depois da clivagem pela protease. A linha quebrada re- presenta amostras sem tratamento com protease e a linha sólida repre- senta amostras com tratamento com protease.
[0287] A Figura 26 é um diagrama que mostra a atividade de lucife- rase antes e depois de clivagem pela protease. A linha tracejada repre- senta amostras sem tratamento com protease e a linha sólida repre- senta amostras com tratamento com protease.
[0288] A Figura 27 é um diagrama que mostra a avaliação de SDS- PAGE da clivagem pela protease de uma molécula de anticorpo de tipo IgG que contém VHH anti-IL-6R humano.
[0289] A Figura 28 é um diagrama que mostra a avaliação da cliva- gem pela protease de moléculas de anticorpo de tipo IgG que trazem uma sequência de clivagem pela protease em suas cadeias leves.
[0290] A Figura 29 é um diagrama que mostra a avaliação do grau de ativação com base na presença ou ausência de um tratamento com protease de moléculas de anticorpo de tipo IgG que trazem uma se- quência de clivagem pela protease em suas cadeias leves.
[0291] A Figura 30A é um diagrama que mostra a avaliação da cli- vagem pela protease de moléculas de anticorpo de tipo IgG que trazem uma sequência de clivagem pela protease em suas cadeias pesadas.
[0292] A Figura 30B é um diagrama que mostra a avaliação da cli- vagem pela protease de moléculas de anticorpo de tipo IgG que trazem uma sequência de clivagem pela protease em suas cadeias pesadas. A clivagem pela protease foi realizada usando um tampão de ensaio (Kit MMP Activity Assay (Fluorometric - Green) (ab112146), Componente C: Tampão de Ensaio).
[0293] A Figura 31 é um diagrama que mostra a avaliação da efici- ência de clivagem in vivo quando uma molécula de anticorpo na qual uma sequência de clivagem pela protease foi inserida foi administrada a camundongos. Descrição de Modalidades
[0294] O polipeptídeo de acordo com a presente invenção refere- se, em geral, a um peptídeo que tem um comprimento na ordem de 4 aminoácidos ou mais longo e uma proteína. Além disso, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é, em geral, um polipeptídeo que consiste em uma sequência artificialmente concebida, porém não está particularmente limitada à mesma. Por exemplo, um polipeptídeo deri- vado de organismo pode ser usado. Alternativamente, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode ser qualquer um de um polipep- tídeo natural, um polipeptídeo sintético, um polipeptídeo recombinante e assim por diante. Além disso, fragmentos destes polipeptídeos tam- bém estão incluídos no polipeptídeo da presente invenção.
[0295] No presente relatório descritivo, cada aminoácido é indicado pelo código de uma letra ou o código de três letras, ou ambos, conforme representado, por exemplo, por Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, GIn/Q, Ser/S, GluW/E, Thr/T, GIy/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, lle/l ou Val/V. Para expressão de um aminoácido localizado em uma posição particular, uma expressão que usa um nú- mero que representa a posição particular em combinação com o código de uma letra ou o código de três letras do aminoácido pode ser apropri- adamente empregada. Por exemplo, um aminoácido 37V, o qual é um aminoácido contido em um anticorpo com um único domínio, representa Val localizada na posição 37 definida pela numeração de Kabat.
[0296] Para a alteração de um aminoácido na sequência de amino- ácidos de um polipeptídeo, um método conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) ou PCR de extensão por sobreposição, pode ser apropriadamente adotada. Uma pluralidade de métodos conhecidos na técnica também podem ser adotados como métodos de alteração para substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente de um ami- noácido natural (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225- 249; e Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução isento de células que contém tRNA (Clover Direct (Protein Express)) que tem um aminoácido não natural ligado com tRNA supressor âmbar complementar ao códon UAG (códon âmbar), o qual é um códon terminal também é, de preferência, usado. No presente relatório descritivo, exemplos da alteração incluem, porém sem limitações, substituição.
[0297] No presente relatório descritivo, o termo "e/ou" usado para representar sítios de alteração de aminoácidos se destina a incluir cada combinação apropriadamente representada por "e" e "ou". Especifica- mente, por exemplo, a frase "aminoácidos nas posições 37, 45, e/ou 47 são substituídos" inclui as seguintes variações de alteração de aminoá- cido: (a) posição 37, (b) posição 45, (c) posição 47, (d) posições 37 e 45, (e) posições 37 e 47, (f) posições 45 e 47 e (g) posições 37, 45 e 47.
[0298] No presente relatório descritivo, a expressão na qual os có- digos de uma letra ou códigos de três letras de aminoácidos antes e após alteração são usados antes e após um número que representa uma posição particular pode ser apropriadamente usada para represen- tar uma alteração de aminoácido. Por exemplo, uma alteração F37V ou Phe37Val usada para substituição de um aminoácido contido em uma região variável de anticorpo ou um anticorpo com um único domínio re- presenta a substituição de Phe na posição 37 definida pela numeração de Kabat por Val. Especificamente, o número representa uma posição de aminoácido definida pela numeração de Kabat; o código de uma letra ou código de três letras do aminoácido antes do número representa o aminoácido antes da substituição; e o código de uma letra ou código de três letras do aminoácido depois do número representa o aminoácido após a substituição. Igualmente, uma alteração P238A ou Pro238Ala usada para substituição de um aminoácido em uma região Fc contida em uma região constante de um anticorpo representa a substituição de Pro na posição 238 definida pela numeração EU por Ala. Especifica- mente, o número representa uma posição de aminoácido definida pela numeração EU; o código de uma letra ou código de três letras do ami- noácido antes do número representa o aminoácido antes da substitui ção; e o código de uma letra ou código de três letras do aminoácido depois do número representa o aminoácido após a substituição.
[0299] No presente relatório descritivo, o termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo inclu- indo, porém sem limitações, um anticorpo monoclonal, um anticorpo po- licional, um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo bies- pecífico), um anticorpo com um único domínio e um fragmento de anti- corpo, contanto que o anticorpo exiba a atividade de ligação a antígeno desejada.
[0300] O "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula dife- rente de um anticorpo intacto que compreende uma porção do anticorpo intacto e que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos dos fragmento de anticorpo incluem, porém sem limitações, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacorpos, anticorpos lineares, molécu- las de anticorpo com uma única cadeia (por exemplo, scFv) e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0301] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo in-
tacto" e "anticorpo inteiro" são usados alternadamente aqui para se re- ferir a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente similar à estrutura de um anticorpo nativo ou tem cadeias pesadas que contêm uma região de Fc, conforme definido aqui.
[0302] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se a uma região ou um domínio de uma cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo envolvida na ligação do anticorpo ao seu antígeno. Em geral, domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo (VH e VL, respectivamente) são estruturalmente similares e cada um contêm 4 regiões estruturais conservadas (FRs) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (consulte, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6º ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007)). Um domí- nio de VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de li- gação a antígeno.
[0303] O termo "região determinante de complementaridade" ou "CDR" usado no presente relatório descritivo é hipervariável quanto à sequência e/ou forma uma alça estruturalmente determinada ("alça hi- pervariável") e/ou refere-se aos resíduos de contato com o antígeno ("contatos antigênicos") ou cada região de um domínio variável de anti- corpo. Em geral, um anticorpo contém 6 CDRs: três na VH (H1, H2 e H3) e três na VL (L1, L2 e L3). No presente relatório descritivo, CDRs exemplificativas incluem as seguintes: (a) alças hipervariáveis que ocorrem em resíduos de aminoácido 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 à 101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem em resíduos de aminoácido 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2), 89 a 97 (L3), 31 a 35b (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos antigênicos que ocorrem em resíduos de aminoácido 27c a
36 (L1), 46 a 55 (L2), 89 a 96 (L3), 30 a 35b (H1), 47 a 58 (H2) e 93 a 101 (H3) (MacCallum et al, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) uma combinação de (a), (b), e/ou (c) que contém resíduos de ami- noácidos de HVR 46 a 56 (L2), 47 a 56 (L2), 48 a 56 (L2), 49 a 56 (L2), 26 a 35 (H1), 26 a 35b (H1), 49 a 65 (H2), 93 a 102 (H3) e 94 a 102 (H3).
[0304] Em geral, um anticorpo com um único domínio compreende três CDRs: CDR1, CDR2 e CDR3. Quando um anticorpo com um único domínio é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de uma VHH ou uma VH de anticorpo, as CDRs de anticorpos com um único domínio incluem exemplificativamente o seguinte: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26 a 32 (CDR1), 53 a 55 (CDR2) e 96 a 101 (CDR3) (Chothia e Lesk, J. Mol.
Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31 a 35b (CDR1), 50 a 65 (CDR2) e 95 a 102 (CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institu- tes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos antigênicos que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 30 a 35b (CDR1), 47 a 58 (CDR2) e 93 a 101 (CDR3) (MacCallum et al., J.
Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) uma combinação de (a), (b) e/ou (c), incluindo os resíduos de ami- noácidos das CDRs 26 a 35 (CDR1), 26 a 35b (CDR1), 49 a 65 (CDR2), 93 a 102 (CDR3) ou 94 a 102 (CDR3).
[0305] Quando o anticorpo com um único domínio é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de uma VL de anticorpo, as CDRs de anticorpo com um único domínio incluem exemplificativamente o seguinte: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26 a 32 (CDR1), 50 a 52 (CDR2) e 91 a 96 (CDR3) (Chothia e Lesk, J. Mol.
Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), 50 a 56 (CDR2) e 89 a 97 (CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institu- tes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos antigênicos que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c a 36 (CDR1), 46 a 55 (CDR2) e 89 a 96 (CDR3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) uma combinação de (a), (b) e/ou (c), incluindo os resíduos de ami- noácidos de CDRs 46 a 56 (CDR2), 47 a 56 (CDR2), 48 a 56 (CDR2) ou 49 a 56 (CDR2).
[0306] No presente relatório descritivo, resíduos de CDR e outros resíduos (por exemplo, resíduos de FR) em um domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al. (supra), a menos que de outro modo especificado.
[0307] O termo "região estrutural" ou "FR" refere-se a resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região determinante de complementaridade (CDR). FRs em um domínio variável geralmente consistem em 4 domínios de FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequente- mente, as sequências de CDRs e FRs usualmente aparecem em VH (ou VL) na seguinte ordem: FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)- FR4. Em um anticorpo com um único domínio, as sequências de CDRs e FRs em geral aparecem na seguinte ordem: FRI-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FRA4.
[0308] Em geral, um anticorpo com um único domínio da presente invenção pode ser definido como um polipeptídeo que compreende o seguinte: a) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 11 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a partir do grupo que consiste em L, M, S, Ve W e é, de preferência, L); e/ou b) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 37 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a partir do grupo que consiste em F, Y, Hd l Le V e é, de preferência, F ou Y); e/ou c) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 44 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a partir do grupo que consiste em G, E, A, D, Q, R, S e L, de preferência G ou Q e é, mais preferivelmente, G ou E); e/ou d) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 45 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a partir do grupo que consiste em L, R, C, I, L, P, Qe V e é, de preferência, L ou R); e/ou e) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 47 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a partir do grupo que consiste em W, L, F, A, G, LL M, R, S, Ve Y e é, de prefe- rência, W, L, F ou R); e/ou f) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 83 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a partir do grupo que consiste em R, K, N, E, G, |, M, Qe T, de preferência K ou R e é, mais preferivelmente, K); e/ou g) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 84 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a partir do grupo que consiste em P, A, L RS, T, De V e é, de preferência, P); e/ou h) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 103 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a par- tir do grupo que consiste em W, P, Re S e é, de preferência, W); e/ou i) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 104 de acordo com a numeração de Kabat é G ou D e é, de preferência, G); e/ou j) uma sequência de aminoácidos que consiste em quatro regiões/se- quências estruturais que têm três regiões/sequências determinantes de complementaridade inseridas entre elas (o resíduo de aminoácido na posição 108 de acordo com a numeração de Kabat é selecionado a par- tir do grupo que consiste em Q, Le R e é, de preferência, Q ou L).
[0309] Mais especificamente, mas não exclusivamente, um anti- corpo com um único domínio da presente invenção pode ser definido como um polipeptídeo que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos que consistem em quatro regiões/sequências estrutu- rais que têm três regiões/sequências determinantes de complementari- dade inseridas entre elas: k) uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 43 a 46 de acordo com a numeração de Kabat são KERE ou KQRE; |) uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 44 a 47 de acordo com a numeração de Kabat são GLEW; e m) uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 83 a 84 de acordo com a numeração de Kabat são KP ou EP.
[0310] No presente relatório descritivo, o termo "região constante" ou "domínio constante" refere-se a uma região ou um domínio diferente das regiões variáveis em um anticorpo. Por exemplo, um anticorpo IgG é uma glicoproteína heterotetramérica de aproximadamente 150.000 Da constituída por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas conectadas através de ligações de dissulfeto. Cada cadeia pe- sada tem uma região variável (VH) também denominada domínio de ca- deia pesada variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por uma região de cadeia pesada (CH) que contém um domínio CH1, uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, do N-término para o C-término. Igualmente, cada cadeia leve tem uma região variável (VL) também denominada domínio de cadeia leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio de cadeia leve cons- tante (CL), do N-término para o C-término. As cadeias leves de anticor- pos nativos podem ser atribuídas a um de dois tipos denominados capa (x) e lambda (4) com base na sequência de aminoácidos de seus domí- nios constantes.
[0311] No presente relatório descritivo, o termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imu- noglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc de I9gG1 humana se estende a partir de Cys226 ou a partir de Pro230 até o terminal carboxila da cadeia pe- sada. Entretanto, a lisina C-terminal (Lys447) ou glicina-lisina (Gly446- Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que de outro modo especificado aqui, a numeração de resíduos de aminoácido na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991.
[0312] A "classe" de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Há cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias delas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, I9G1, I9G2, I9G3, I9G4, IgA: e I9gA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulina são denominados a, ô, e, y e u, respectivamente.
[0313] No presente relatório descritivo, o "domínio de ligação a an- tígeno" está limitado apenas pela ligação ao antígeno de interesse. O domínio de ligação a antígeno pode ser um domínio que tem qualquer estrutura, contanto que o domínio usado se ligue ao antígeno de inte- resse. Exemplos de tal domínio incluem, porém sem limitações, uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um anticorpo com um único domínio (sdAb), um modulo denominado domínio A de aproximadamente 35 aminoácidos contido em um avímero de proteína da membrana celular in vivo (documentos WO2004/044011 e WO2005/040229), adnectina que contém um domínio 10Fn3 que serve como um domínio de ligação à proteína derivado de uma fibronectina de glicoproteína expressa em membranas celulares (documento WO2002/032925), Affibody que con- tém um andaime de domínio de ligação de IgG que constitui um feixe de três hélices composto de 58 aminoácidos de proteína A (documento
WO1995/001937), DARPIins (designadas proteínas de repetição de an- quirina), as quais são regiões expostas na superfície molecular de repe- tições de anquirina (AR), cada uma tendo uma estrutura de 33 resíduos de aminoácidos dobrada em uma subunidade de uma volta, duas héli- ces antiparalelas e uma alça (documento WO2002/020565), anticalina que tem quatro regiões de alça que conectam oito fitas antiparalelas dobradas em direção ao eixo central em uma extremidade de uma es- trutura de barril altamente conservada em moléculas de lipocalina, tal como lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL) (docu- mento WO2003/029462) e uma região deprimida na estrutura de folha paralela interna de uma dobra em forma de ferradura composta de mó- dulos de repetição ricos em leucina repetidos (LRR) de um receptor de linfócitos variável isento de estrutura de imunoglobulina (VLR), con- forme observado nos sistemas imunes adquiridos de vertebrados sem maxilas, tais como lampreia ou peixe-bruxa (documento WOZ2008/016854).
[0314] Exemplos preferidos do domínio de ligação a antígeno da presente invenção incluem um domínio de ligação a antígeno que pode exercer uma função de ligação a antígeno através de uma molécula constituída apenas pelo domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a antígeno que pode exercer uma função de ligação a antígeno por si só após ser liberado de um peptídeo adicional ligado ao mesmo. Exemplos de tal domínio de ligação a antígeno incluem, porém sem |i- mitações, anticorpos com um único domínio, scFv, Fv, Fab, Fab' e F(ab')2.
[0315] Um exemplo preferido do domínio de ligação a antígeno da presente invenção inclui um domínio de ligação a antígeno que tem um peso molecular de 60 kDa ou menos. Exemplos de tal domínio de liga- ção a antígeno incluem, porém sem limitações, anticorpos com um único domínio, scFv, Fab e Fab". Em geral, é provável que o domínio de liga- ção a antígeno que tem um peso molecular de 60 kDa ou menos seja eliminado pelos rins quando existe como um monômero no sangue (con- sulte J Biol. Chem., 15 de Outubro de 1988; 263 (29): 15064-70).
[0316] A partir de outro ponto de vista, um exemplo preferido do do- mínio de ligação a antígeno da presente invenção inclui um domínio de ligação a antígeno que tem uma meia-vida sanguínea de 12 horas ou menos. Exemplos de tal domínio de ligação a antígeno incluem, porém sem limitações, anticorpos com um único domínio, scFv, Fab e Fab".
[0317] Um exemplo preferido do domínio de ligação a antígeno da presente invenção inclui um anticorpo com um único domínio (sdAb).
[0318] No presente relatório descritivo, o termo "anticorpo com um único domínio" não está limitado quanto à sua estrutura, contanto que o domínio possa exercer a atividade de ligação a antígeno por si só. Sabe- se que um anticorpo genérico, por exemplo, um anticorpo IgG, exibe sua atividade de ligação a antígeno em um estado onde uma região va- riável é formada pelo pareamento de VH e VL, embora a própria estru- tura de domínio do anticorpo com um único domínio possa exercer ati- vidade de ligação a antígeno por si só sem pareamento com outro do- mínio. Em geral, o anticorpo com um único domínio tem um peso mole- cular relativamente baixo e existe na forma de um monômero.
[0319] Exemplos do anticorpo com um único domínio incluem, po- rém sem limitações, moléculas de ligação a antígeno congenitamente sem uma cadeia leve, tal coma VHH de um animal da família Camelidae e Vnar de tubarão e fragmentos de anticorpo que contêm todo ou uma parte de um domínio VH de anticorpo ou todo ou uma parte de um do- mínio VL de anticorpo. Exemplos do anticorpo com um único domínio o qual é um fragmento de anticorpo que contém todo ou uma parte de um domínio VH ou VL de anticorpo incluem, porém sem limitações, anticor- pos com um único domínio artificialmente preparados que se originam de uma VH de anticorpo humano ou VL de anticorpo humano, conforme descrito na Patente Norte-Americana Nº 6.248.516 B1, etc. Em algumas modalidades da presente invenção, um anticorpo com um único domínio tem três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3).
[0320] O anticorpo com um único domínio pode ser obtido a partir de um animal capaz de produzir o anticorpo com um único domínio ou através da imunização do animal capaz de produzir o anticorpo com um único domínio. Exemplos do animal capaz de produzir o anticorpo com um único domínio incluem, porém sem limitações, animais da família Camelidae e animais transgênicos que trazem um gene capaz de incitar ao anticorpo com um único domínio. Os animais da família Camelidae incluem camelos, lhamas, alpacas, dromedários e guanacos, etc. Exem- plos dos animais transgênicos que trazem um gene capaz de incitar ao anticorpo com um único domínio incluem, porém sem limitações, ani- mais transgênicos descritos no documento WO2015/143414 e Publica- ção de Patente Norte-Americana Nº US2011/0123527 A1. As sequên- cias das regiões estruturais do anticorpo com um único domínio obtido a partir do animal podem ser convertidas em sequências de linhagem germinativa humana ou sequências similares às mesmas para obter um anticorpo humanizado com um único domínio. O anticorpo humanizado com um único domínio (por exemplo, VHH humanizada) também é uma modalidade do anticorpo com um único domínio da presente invenção. Um "anticorpo humanizado com um único domínio" refere-se a um anti- corpo quimérico com um único domínio que compreende resíduos de aminoácidos de CDRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em determinadas modalidades, em um anticorpo humani- zado com um único domínio, todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem àquelas de um anticorpo não humano e todas ou subs- tancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo hu-
mano. Em um anticorpo humanizado, mesmo quando uma parte dos re- síduos na FR não corresponde àqueles de um anticorpo humano, subs- tancialmente todas as FRs são consideradas como um exemplo que corresponde àquelas de um anticorpo humano. Por exemplo, ao huma- nizar a VHH, a qual é uma modalidade do anticorpo com um único do- mínio, uma parte dos resíduos na FR precisa ser resíduos que não cor- respondam àqueles de um anticorpo humano (C. Vincke et al., The Jour- nal of Biological Chemistry 284, 3273- 3284).
[0321] Alternativamente, o anticorpo com um único domínio pode ser obtido por meio de ELISA, panning ou similar a partir de uma biblio- teca de polipeptídeos que contém anticorpos com um único domínio. Exemplos da biblioteca de polipeptídeos que contém anticorpos com um único domínio incluem, porém sem limitações, bibliotecas de anticorpos naive obtidas a partir de vários animais ou seres humanos (por exemplo, Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78); e Biochimica et Bi- ophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764: 8 (1307-1319)), bibliotecas de anticorpos obtidas por meio da imunização de vários ani- mais (por exemplo, Journal of Applied Microbiology 2014 117: 2 (528- 536)) e bibliotecas de anticorpos preparadas a partir de genes de anti- corpo de vários animais ou seres humanos (por exemplo, Journal of Bi- omolecular Screening 2016 21: 1 (35-43); Journal of Biological Chemis- try 2016 291:24 (12641-12657); e AIDS 2016 30: 11 (1691-1701)).
[0322] No presente relatório descritivo, o "antígeno" é limitado ape- nas por conter um epítopo ao qual o domínio de ligação a antígeno se liga. Exemplos preferidos do antígeno incluem, porém sem limitações, peptídeos derivados de animal ou ser humano, polipeptídeos e proteí- nas. Exemplos preferidos do antígeno para uso no tratamento de uma doença causada por um tecido alvo incluem, porém sem limitações, mo- léculas expressas na superfície de células alvo (por exemplo, células cancerosas e células inflamatórias), moléculas expressas na superfície de outras células em tecidos que contêm as células alvo, moléculas ex- pressas na superfície de células que têm um papel imunológico contra células alvo e tecidos que contêm células alvo e grandes moléculas pre- sentes no estroma de tecidos que contêm as células alvo.
[0323] Exemplos do antígeno podem incluir as seguintes moléculas: 17-1A, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-0x0-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, acti- vina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-A4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM1O0, ADAM12, ADAM1S5, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTSA4, ADAMTSS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, anta- gonista de alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-ld, ASPARTIC, fator natriurético atrial, in- tegrina av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, estimulador de linfócitos B (BIyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL- CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, fator neutrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, CAMP, antígeno carcinoembriô- nico (CEA), antígenos associados ao câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL1I5, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1I, COCRIO, CCRIO, CCR2, CCR3, CCRA4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E,
CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD8O0 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15?2, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina botulínica, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG3, TIM3, galectina-9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL?2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA4, CXCR5, CXCRS6, antígenos associ- ados ao tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator de aceleração de declínio, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA- A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, fator Ila, fator VII, fator Villc, fator IX, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), Fas, FCR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, FIt-3, Flt-4, hormônio estimulante de folículo, fractalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZDA4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP- 12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa 1, GFR-alfa 2, GFR-alfa 3, GITR, glu- cagon, Glut4, glicoproteína Ilb/Illa (GPIIb/Illa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, fator de liberação de hormônio de crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína gB do envelope de HCMV,
glicoproteína gH do envelope de HCMV, HOCMV UL, fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB do vírus do herpes simplex (HSV), glicoproteína gD de HSV, HGFA, antígeno asso- ciado a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA), gp120 de HIV, alça V3 de gp 120 de HIV IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, PEM de HMFG, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio de crescimento humano (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, lg, receptor de IgA, IgE, IGF, proteína de ligação ao IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, I1L-5, IL-SR, I1L-6, IL-6R, I1L-8, I1L-9, 11-10, 11-12, IL-13, I1L-15, I1L-18, IL-18R, 11-21, 11-23, 11-27, interferon (INF)-alfa, INF- beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A de insulina, cadeia B de insu- lina, fator de crescimento similar à insulina 1, integrina alfa 2, integrina alfa 3, integrina alfa 4, integrina alfa 4/beta 1, integrina alfa 4/beta 7, integrina alfa 5 (alfa V), integrina alfa 5/beta 1, integrina alfa 5/beta 3, integrina alfa 6, integrina beta 1, integrina beta 2, interferon gama, IP- 10, |-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, cali- creína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, cali- creína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinóci- tos (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, bp1 de TGF-1 latente, LBP, LDGF, LECT?2, lefty, antígeno de Lewis-Y, antígeno relacionado a Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor de linfotoxina beta, Mac-1, MADdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, metaloproteinases, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP- 7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18,
substância inibidora de muleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, ade- rina de N-C, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 ou - 6, neuturina, fator de crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio da paratireoide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PONA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA?, fosfatase al- calina placentária (PLAP), PIGF, PLP, PP14, proinsulina, prorrelaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno na membrana específico para próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RAN- TES, RANTES, cadeia A de relaxina, cadeia B de relaxina, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, albumina sérica, sSFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína 72 associ- ada a tumor), TARC, TCA-3, receptor de células T (por exemplo, recep- tor alfa/beta de células T), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEMB, TERT, fosfatase alcalina similar ao PLAP testicular, TR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específica, T]GF-beta RI (ALK-5), T]GF-beta RIl, T]GF-beta RIlb, T]GF-beta RIIl, T]GF-beta 1, T]GF-beta 2, TGF-beta 3, T]GF-beta 4, TGF-beta 5, trombina, Ck-1 de timo, hormônio estimu- lante da tiroide, Tie, TIMP, TIQ, fator tecidual, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS?2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa/beta, TNF-beta 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF1OD (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TINFRSF1I1A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11IB (OPG OCIF, TRI), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF1I3B (TACI), TNFRSF1I3C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF1I8 (GITR AITR),
TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSFIA (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1IB (TNF RIl CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo- 1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), INFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF1O (ligante TRAIL Apo-2, TL2) TNFSF1I1I (ligante TRANCE/RANK ODF, ligante OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TLIA/VEGI), TNFSF18 (ligante AITR, ligante GITR, TL6), TNFSF1A (Conectina de TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (gp34 de ligante OX40, TXGP1), TNFSF5 (CD154, ligante de CD40, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Apo-1, ligante Fas, ligante APT1), TNFSF7 (CD70, ligante CD27), TNFSF8 (CD153, ligante CD30), TNFSF9 (ligante CD137, ligante 4-1BB), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TLR (receptor toll-like) 1, TLR2, TLR3, TLRA4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, antígeno CA125 associado a tumor, carboi- drato relacionado a Lewis-Y que expressa antígeno associado a tumor, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, uroquinase, VCAM, VCAM-1, VE- CAD, VE-caderina, VE-caderina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígenos virais, VLA, VLA-1, VLAA, inte- grina VNR, fator de von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD,
HMGB1, IgA, AB, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp290, IL- 17/IL-17R, I1L-20/1L-20R, LDL oxidado, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, cromogranina A, cromogranina B, tau, VAP1, qui- ninogênio de elevado peso molecular, I1L-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1qg, C1r, C1is, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator tecidual, fator V, fator Va, fator VII, fator Vila, fator VIII, fator Villa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator Xla, fator XII, fator Xlla, fator XIII, fator Xllla, TFPI, antitrombina Ill, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, sindecana-1, sindecana-2, sindecana-3, sindecana-4, LPA, S1P e receptores para hormônios ou fatores de cres- cimento.
[0324] Embora os exemplos do antígeno listados acima também in- cluam receptores, estes receptores, mesmo existindo em uma forma so- lúvel em um fluido corporal, podem ser usados como o antígeno ao qual o domínio de ligação a antígeno da presente invenção se liga. Um exem- plo não limitativo da forma solúvel de tal receptor pode incluir a proteína representada por SEQ ID NO: 35, a qual é IL-6R solúvel, conforme des- crito por Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968).
[0325] Os exemplos do antígeno listados acima incluem moléculas na membrana expressas em membranas celulares e moléculas solúveis secretadas para o exterior das células. Quando o domínio de ligação a antígeno da presente invenção se liga a uma molécula solúvel secretada a partir das células, o domínio de ligação a antígeno tem, de preferência, atividade neutralizante.
[0326] A solução que contém a molécula solúvel não está limitada e tal molécula solúvel pode existir em um fluido corporal, isto é, todo líquido vascular ou todo material líquido entre os tecidos ou células em corpos vivos. Em um aspecto não limitativo, a molécula solúvel à qual o domínio de ligação a antígeno da presente invenção se liga pode existir em um fluido extracelular. Fluido extracelular refere-se a um nome ge- nérico para plasma, fluido intercelular, linfa, tecidos conjuntivos estrei- tos, fluido cefalorraquidiano, fluido espinhal, aspirados, líquido sinovial ou tais componentes nos ossos e cartilagens, líquido alveolar (lavado broncoalveolar), líquido ascítico, derrame pleural, efusão cardíaca, flu- ido de cisto, humor aquoso (hidratoide) ou tais fluidos transcelulares (vá- rios fluidos nas cavidades glandulares resultantes do transporte ativo ou atividade secretora das células e fluidos no lúmen do intestino e outras cavidades corporais) em vertebrados.
[0327] O epitopo, o qual significa um determinante antigênico, pre- sente no antígeno significa um sítio no antígeno ao qual o domínio de ligação a antígeno descrito no presente relatório descritivo se liga. Con- sequentemente, por exemplo, o epitopo pode ser definido por sua es- trutura. Alternativamente, o epitopo pode ser definido pela atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno que reconhece o epitopo. Quando o antígeno é um peptídeo ou um polipeptídeo, o epi- topo pode ser identificado pelos resíduos de aminoácidos que consti- tuem o epitopo. Quando o epitopo é uma cadeia de açúcar, o epitopo pode ser identificado por uma estrutura de cadeia de açúcar particular.
[0328] Um epitopo linear refere-se a um epitopo que compreende um epitopo que é reconhecido por sua sequência primária de aminoáci- dos. O epitopo linear contém, tipicamente, pelo menos 3 e, mais comu- mente, pelo menos 5, por exemplo, aproximadamente 8 a aproximada- mente 10 ou 6 a 20 aminoácidos, em sua sequência única.
[0329] Ao contrário do epitopo linear, um epitopo conformacional re- fere-se a um epitopo que está contido em uma sequência de aminoáci- dos primária que contém um componente diferente do componente in- dividual definido do epitopo a ser reconhecido (por exemplo, um epitopo cuja sequência de aminoácidos primária pode não ser reconhecida por um anticorpo que determina o epitopo). O epitopo conformacional pode conter um número aumentado de aminoácidos quando comparado com o epitopo linear. Quanto ao reconhecimento do epitopo conformacional, o domínio de ligação a antígeno reconhece a estrutura tridimensional do peptídeo ou a proteína. Por exemplo, quando uma molécula proteica é dobrada para formar uma estrutura tridimensional, determinados amino- ácidos e/ou cadeias polipeptídicas primárias que constituem o epitopo conformacional são arranjadas em paralelo para permitir que o anticorpo reconheça o epitopo. Exemplos do método para determinação da con- formação do epitopo incluem, porém sem limitações, cristalografia de raios X, espectroscopia de ressonância magnética nuclear bidimensio- nal e marcação por rotação dirigida ao local e espectroscopia de resso- nância paramagnética eletrônica. Consulte, por exemplo, Epitope Map- ping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris ed.
[0330] A estrutura do domínio de ligação a antígeno que se liga ao epitopo é denominada paratopo. O paratopo se liga estavelmente ao epitopo através de uma ligação de hidrogênio, força eletrostática, forças de van der Waals, uma ligação hidrofóbica ou similar que atua entre o epitopo e o paratopo. Esta força de ligação entre o epitopo e o paratopo é denominada afinidade. A força de ligação total quando uma plurali- dade de domínios de ligação a antígeno se liga a uma pluralidade de antígenos é denominada atividade. A afinidade funciona sinergicamente quando, por exemplo, um anticorpo que compreende uma pluralidade de domínios de ligação a antígeno (isto é, um anticorpo polivalente) se liga a uma pluralidade de epitopos. Portanto, a avidez é maior do que a afinidade.
[0331] Em uma modalidade particular, o domínio de ligação a antí- geno fornecido no presente relatório descritivo tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1 uM, < 100 nM, < 10 NM, < 1 nM, <0,1 nM, <0,01 NM ou < 0,001 nM (por exemplo, 108 M ou menos, por exemplo, 10º M a 103 M, por exemplo, 10º M a 10º M).
[0332] Daqui em diante, serão mostrados métodos exemplificativos para confirmação da ligação de um domínio de ligação a antígeno dire- cionado ao IL-6R ou um polipeptídeo que compreende o domínio de li- gação a antígeno ao epitopo. Entretanto, um método para confirmação da ligação de um domínio de ligação a antígeno direcionado a um antí- geno diferente de IL-6R ou um polipeptídeo que compreende o domínio de ligação a antígeno ao epitopo também pode ser apropriadamente realizado de acordo com o exemplo fornecido abaixo.
[0333] Por exemplo, pode ser confirmado se o domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R reconhece um epitopo linear presente na molécula de IL-6R, por exemplo, como segue: um peptídeo linear que compreende uma sequência de aminoácidos que constitui o domínio ex- tracelular de IL-6R é sintetizado para a finalidade descrita acima. O pep- tídeo pode ser quimicamente sintetizado. Alternativamente, o peptídeo é obtido por meio de um método de engenharia genética que usa uma região que codifica uma sequência de aminoácidos que corresponde ao domínio extracelular no cDNA de IL-6R. Em seguida, o domínio de liga- ção a antígeno direcionado ao IL-6R é avaliado quanto a sua capaci- dade de ligação contra o peptídeo linear que compreende uma sequên- cia de aminoácidos que constitui o domínio extracelular. Por exemplo, a atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno contra o peptídeo pode ser avaliada por meio de um ELISA usando um peptídeo linear imobilizado como um antígeno. Alternativamente, a atividade de ligação contra o peptídeo linear pode ser determinada com base em um nível no qual o peptídeo linear inibe a ligação do domínio de ligação a antí- geno a células que expressam IL-6R. Estes ensaios podem determinar a atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno contra o peptí- deo linear.
[0334] Além disso, pode ser confirmado se o domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R reconhece o epitopo conformacional como segue: células que expressam IL-6R são preparadas para a fina- lidade descrita acima. O reconhecimento do epitopo conformacional pelo domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R é confirmado, por exemplo, quando o domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R se liga fortemente a células que expressam IL-6R quando de con- tato com as células, enquanto que o domínio de ligação a antígeno não se liga substancialmente a um peptídeo linear imobilizado que compre- ende uma sequência de aminoácidos que constitui o domínio extracelu- lar de IL-6R ou um peptídeo linear desnaturado (usando um desnatu- rante genérico, tal como guanidina) que compreende uma sequência de aminoácidos que constitui o domínio extracelular de IL-6R. Neste con- texto, o termo "não se liga substancialmente" significa que a atividade de ligação é de 80 % ou menos, em geral 50 % ou menos, de preferência % ou menos, de modo particularmente preferido 15 % ou menos da atividade de ligação contra células que expressam IL-6R humano.
[0335] Os métodos para confirmação da atividade de ligação a an- tígeno do domínio de ligação a antígeno também incluem métodos de medição de um valor Kd, por exemplo, através de um ensaio de ligação a antígeno radiomarcado (RIA). Em uma modalidade, o RIA é realizado usando o domínio de ligação a antígeno de interesse e seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação ao antígeno em uma solução do domínio de ligação a antígeno é medida ao equilibrar o domínio de liga- ção a antígeno com uma concentração mínima de um antígeno marcado com (*?*I) na presença de uma série de titulações de um antígeno não marcado e, subsequentemente, capturar o antígeno ligado através de uma placa revestida com o domínio de ligação a antígeno (consulte, por exemplo, Chen et a/., J. Mol. Biol. 293: 865-881(1999)).
[0336] De acordo com uma modalidade alternativa, a Kd é medida por meio de um método de ressonância de plasmônio em superfície usando BIACORE (marca registrada). Por exemplo, o ensaio que usa BIACORE(marca registrada)-2000 ou BIACORE(marca registrada)- 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25 ºC usando um chip CM5 com aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) do an- tígeno imobilizado sobre o mesmo. Em uma modalidade, um chip bios- sensor de dextrana carboximetilada (CM5, BlAcore, Inc.) é ativado usando cloridrato de N-etil-N'i-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído para 5 ug/ml (aproximadamente 0,2 uM) com acetato de sódio a 10 mM (pH de 4,8) e, em seguida, injetado ao mesmo em uma vazão de 5 ul/min de modo a obter ligação de pro- teina em aproximadamente 10 unidades de resposta (RU). Após injeção de antígeno, etanolamina a 1 M é injetada ao mesmo a fim de bloquear os grupos não reagidos. Para medição cinética, diluições de 2 vezes (0,78 nM a 500 nM) do domínio de ligação a antígeno em PBS que con- tém Polissorbato 20 a 0,05 % (TWEEN-20(marca comercial)) como um tensoativo (PBST) são injetadas ao mesmo em uma vazão de aproxi- madamente 25 ul/min a 25 ºC. Uma taxa de associação (kon) e uma taxa de dissociação (koff) são calculadas ao ajustar os sensorgramas de associação e dissociação ao mesmo tempo usando um modelo de ligação de Langmuir a 1:1 simples (software de avaliação BIA- CORE(marca registrada) versão 3.2). Uma constante de dissociação em equilíbrio (Kd) é calculada como uma proporção Koti/Kon. Além disso, uma constante de dissociação aparente (Kd) pode ser determinada usando análise de equilíbrio. Para estes procedimentos, consulte o pro- tocolo em anexo ao BIACORE(marca registrada). Consulte, por exem- plo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999) e Methods Enzymol.
2000; 323: 325-40. No ensaio de ressonância de plasmônio em superfí- cie, a quantidade da proteína imobilizada, a quantidade da proteína usada na reação, temperatura e composição da solução podem ser al- teradas variavelmente por aqueles versados na técnica. Quando a kKon no ensaio de ressonância de plasmônio em superfície descrito acima excede 10º Ms!, a kn pode ser determinada usando uma técnica de extinção de fluorescência que emprega um espectrômetro (por exem- plo, um espectrômetro de fluxo interrompido (Aviv Instruments, Inc.) ou espectrofotômetro SLM-AMINCO(marca comercial) da série 8000 (Thermo Spectronic/Thermo Fisher Scientific Inc.) usando uma cubeta de agitação) para medir o aumento ou redução na intensidade de fluo- rescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, percurso de banda: 16 nm) a 25 ºC para domínio de ligação a antígeno a 20 nM em PBS (pH de 7,2) na presença de concentrações gradualmente crescentes do antígeno.
[0337] Além disso, a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno também pode ser medida por meio de um método conhecido de medição de interações molécula-molécula, tal como qui- mioluminescência eletrogerada.
[0338] Exemplos do método para medição da atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R contra as células que expressam IL-6R incluem os métodos descritos em Antibodies: À Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Labo- ratory (1988) 359-420). Especificamente, a atividade de ligação pode ser avaliada com base nos princípios de ELISA ou FACS (separação de células ativada por fluorescência) usando as células que expressam IL- 6R como um antígeno.
[0339] No formato ELISA, a atividade de ligação do domínio de liga- ção a antígeno direcionado ao IL-6R contra as células que expressam
IL-6R é quantitativamente avaliada ao comparar os níveis de sinais ge- rados através de reação enzimática. Especificamente, um domínio de ligação a antígeno de teste é adicionado a uma placa para ELISA com as células que expressam IL-6R imobilizadas sobre a mesma. Em se- guida, o domínio de ligação a antígeno de teste ligado com as células é detectado usando um anticorpo enzimaticamente marcado que reco- nhece o domínio de ligação a antígeno de teste. Alternativamente, no FACS, uma série de diluições de um domínio de ligação a antígeno de teste é preparada e a titulação de ligação de anticorpo para as células que expressam IL-6R pode ser determinada para comparar a atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno de teste contra as células que expressam IL-6R.
[0340] A ligação do domínio de ligação a antígeno de teste ao antí- geno expresso na superfície de células suspensas em uma solução tam- pão ou similar pode ser detectada usando um citômetro de fluxo. Por exemplo, os aparelhos a seguir são conhecidos como o citômetro de fluxo: FACSCanto(TM) Il FACSAria(TM) FACSArray(TM) FACSVantage(TM) SE FACSCAalibur(TM) (todos são marcas comerciais da BD Biosciences) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são marcas comerciais da Beckman Coulter, Inc.)
[0341] Um exemplo preferido do método para medição da atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R inclui o método a seguir: primeiro, células que expressam IL-6R reagidas com um domínio de ligação a antígeno de teste são coradas com um anticorpo secundário marcado por FITC que reconhece o do- mínio de ligação a antígeno de teste. O domínio de ligação a antígeno de teste é apropriadamente diluído com uma solução tampão adequada para preparar o domínio de ligação a antígeno na concentração dese- jada para uso. O domínio de ligação a antígeno pode ser usado, por exemplo, em qualquer concentração a partir de 10 ug/ml a 10 ng/ml. Em seguida, a intensidade de fluorescência e o número de células são me- didos usando FACSCAalibur (Becton, Dickinson and Company). A quan- tidade do domínio de ligação a antígeno ligado às células é refletida na intensidade de fluorescência obtida por meio de análise usando o Sof- tware CELL QUEST (Becton, Dickinson and Company), isto é, um valor da média geométrica. Em suma, a atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno de teste indicada pela quantidade do domínio de li- gação a antígeno de teste ligado pode ser determinada ao obter o valor da média geométrica.
[0342] Pode ser confirmado se o domínio de ligação a antígeno di- recionado ao IL-6R compartilha um epitopo com um determinado domí- nio de ligação a antígeno pela competição entre estes domínios de liga- ção a antígeno pelo mesmo epitopo. A competição entre os domínios de ligação a antígeno é detectada através de um ensaio de bloqueio cruzado ou similar. O ensaio de bloqueio cruzado é, de preferência, por exemplo, um ensaio ELISA competitivo.
[0343] Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, cavidades revestidas com proteína IL-6R de uma placa de microtitulação são pré- incubadas na presença ou ausência de um domínio de ligação a antí- geno competitivo candidato. Em seguida, um domínio de ligação a antí- geno de teste é adicionado à mesma. A quantidade do domínio de liga- ção a antígeno de teste ligado com a proteína IL-6R nas cavidades se correlaciona indiretamente com a capacidade de ligação do domínio de ligação a antígeno competitivo candidato que compete quanto à ligação ao mesmo epitopo. Em suma, uma maior afinidade do domínio de liga- ção a antígeno competitivo pelo mesmo epitopo significa uma menor atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno de teste contra as cavidades revestidas com proteína IL-6R.
[0344] A quantidade do domínio de ligação a antígeno de teste |i- gado com as cavidades através da proteína IL-6R pode ser facilmente medida por meio de marcação do domínio de ligação a antígeno anteci- padamente. Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno marcado com biotina é ensaiado usando um conjugado de avidina-peroxidase e um substrato apropriado. Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores enzimáticos, tal como peroxidase, é denominado de ensaio ELISA competitivo. O domínio de ligação a antígeno pode ser marcado com um material de marcação detectável ou mensurável alter- nativo. Especificamente, radiomarcadores, marcadores fluorescentes e assim por diante são conhecidos na técnica.
[0345] Contanto que o domínio de ligação a antígeno competitivo possa bloquear a ligação do domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R em pelo menos 20 %, de preferência pelo menos 20 a 50 %, mais preferivelmente pelo menos 50 % quando comparado com ativi- dade de ligação obtida em um teste de controle realizado na ausência do domínio de ligação a antígeno competitivo candidato, o domínio de ligação a antígeno de teste é determinado como um domínio de ligação a antígeno que se liga substancialmente ao mesmo epitopo que aquele para o domínio de ligação a antígeno competitivo ou que compete quanto à ligação ao mesmo epitopo.
[0346] Quando o epitopo ao qual o domínio de ligação a antígeno direcionado ao IL-6R se liga tem uma estrutura identificada, pode ser avaliado se um domínio de ligação a antígeno de teste e um domínio de ligação a antígeno de controle compartilham um epitopo ao comparar a atividade de ligação destes domínios de ligação a antígeno contra um peptídeo ou um polipeptídeo preparado ao introduzir uma mutação de aminoácido em um peptídeo que constitui o epitopo.
[0347] Em tal método para medição da atividade de ligação, por exemplo, a atividade de ligação de um domínio de ligação a antígeno de teste e um domínio de ligação a antígeno de controle contra um pep- tídeo linear que contém uma mutação introduzida pode ser comparada no formato ELISA descrito acima. Em um método diferente de ELISA, a atividade de ligação contra o peptídeo mutante ligado com uma coluna pode ser medida ao fluir o domínio de ligação a antígeno de teste e o domínio de ligação a antígeno de controle na coluna e, então, quantificar o domínio de ligação a antígeno eluído no eluato. Um método para ad- sorção de um peptídeo mutante, por exemplo, como um peptídeo de fusão com GST, a uma coluna é conhecido na técnica.
[0348] Quando o eptítopo identificado é um epitopo conformacional, pode ser avaliado se um domínio de ligação a antígeno de teste e um domínio de ligação a antígeno de controle compartilham um epitopo através do seguinte método: primeiro, células que expressam IL-6R e células que expressam IL-6R com uma mutação introduzida no epitopo são preparadas. O domínio de ligação a antígeno de teste e o domínio de ligação a antígeno de controle são adicionados às suspensões celu- lares que contém estas células suspensas em uma solução tampão apropriada, tal como PBS. Subsequentemente, as suspensões celula- res são apropriadamente lavadas com uma solução tampão e um anti- corpo marcado com FITC capaz de reconhecer o domínio de ligação a antígeno de teste e o domínio de ligação a antígeno de controle é, então, adicionado às mesmas. A intensidade de fluorescência e o número de células coradas com o anticorpo marcado são medidos usando um ins- trumento FACSCAalibur (Becton, Dickinson and Company). O domínio de ligação a antígeno de teste e o domínio de ligação a antígeno de con- trole são apropriadamente diluídos com uma solução tampão adequada e usados em concentrações assim ajustadas para aquelas desejadas. Estes domínios de ligação a antígeno são usados, por exemplo, em qualquer concentração a partir de 10 ug/ml a 10 ng/ml. A quantidade do anticorpo marcado ligado às células é refletida na intensidade de fluo- rescência obtida através de análise usando o Software CELL QUEST (Becton, Dickinson and Company), isto é, um valor da média geomé- trica. Em suma, a atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno de teste e do domínio de ligação a antígeno de controle indicado pela quantidade do anticorpo marcado ligado pode ser determinada ao obter o valor da média geométrica.
[0349] A competição do domínio de ligação a antígeno com outro domínio de ligação a antígeno pelo mesmo epitopo também pode ser confirmada usando um ensaio de ligação a antígeno radiomarcado (RIA), um ensaio de ressonância de plasmônio em superfície BIA- CORE(marca registrada), quimioluminescência eletrogerada ou similar, além de ELISA ou FACS descritos acima.
[0350] No presente método, pode ser determinado se "não se liga substancialmente a células que expressam IL-6R mutante", por exem- plo, por meio do método a seguir: primeiro, um domínio de ligação a antígeno de teste e um domínio de ligação a antígeno de controle ligado com as células que expressam IL-6R mutante são corados com um an- ticorpo marcado. Subsequentemente, a intensidade de fluorescência das células é detectada. No caso de uso do instrumento FACSCalibur na detecção de fluorescência através de citometria de fluxo, a intensi- dade de fluorescência obtida pode ser analisada usando o Software CELL QUEST. A partir dos valores médios geométricos obtidos na pre- sença e ausência do produto da associação, seu valor comparado
(AGeo-Mean) pode ser calculado de acordo com a Expressão 1 forne- cida abaixo para determinar a taxa de aumento na intensidade de fluo- rescência causado pela ligação do domínio de ligação a antígeno. Expressão 1 AGeo-Média = Geo-Média (na presença do produto da associação) / Geo-Média (na ausência do produto da associação)
[0351] O valor comparado da média geométrica (valor AGeo-Média para a molécula de IL-S6SR mutante) assim obtido através de análise, o qual reflete a quantidade do domínio de ligação a antígeno de teste li- gado com as células que expressam IL-6R mutante, é em comparação com o valor comparado de AGeo-Média que reflete a quantidade do do- mínio de ligação a antígeno de teste ligado a células que expressam IL- 6R. Neste caso, as concentrações do domínio de ligação a antígeno de teste usado para determinar os valores comparados de AGeo-Média para as células que expressam IL-6R mutante e as células que expres- sam IL-6R são particularmente ajustadas, de preferência para concen- trações iguais ou substancialmente iguais. Um domínio de ligação a an- tígeno já confirmado como reconhecendo um epitopo no IL-6R é usado como o domínio de ligação a antígeno de controle.
[0352] Contanto que o valor comparado de AGeo-Média do domínio de ligação a antígeno de teste para as células que expressam IL-6R mutante seja menor do que pelo menos 80 %, de preferência 50 %, mais preferivelmente 30 %, particularmente de preferência 15 % do valor comparado AGeo-Média do domínio de ligação a antígeno de teste para as células que expressam IL-6R, o domínio de ligação a antígeno de teste "não se liga substancialmente a células que expressam IL-6R mu- tante". A expressão de cálculo para determinação do valor Geo-Média (média geométrica) é descrita no Guia do Usuário do Software CELL QUEST (BD biosciences). O epitopo para o domínio de ligação a antí- geno de teste e aquele para o domínio de ligação a antígeno de controle podem ser avaliados como sendo iguais quando seus valores compara- dos podem ser considerados como sendo substancialmente equivalen- tes como um resultado de comparação.
[0353] No presente relatório descritivo, o termo "porção transporta- dora" refere-se a uma porção diferente de um domínio de ligação a an- tígeno em um polipeptídeo. A porção transportadora da presente inven- ção é, em geral, um peptídeo ou um polipeptídeo constituído por amino- ácidos. Em uma modalidade específica, a porção transportadora no po- lipeptídeo é ligada ao domínio de ligação a antígeno por meio de um sítio de clivagem. A porção transportadora da presente invenção pode ser uma série de peptídeos ou polipeptídeos conectados através de li- gações de amida ou pode ser um complexo formado de uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos através de ligações covalentes, tal como uma ligação de dissulfeto, ou uma ligação não covalente, tal como uma ligação de hidrogênio ou interação hidrofóbica.
[0354] A porção transportadora da presente invenção tem um domí- nio inibidor que inibe a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno. No presente relatório descritivo, o termo "domínio inibidor" é limitado apenas pela inibição da atividade de ligação a antí- geno do domínio de ligação a antígeno. O domínio inibidor pode ser um domínio que tem qualquer estrutura, contanto que o domínio usado possa inibir a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno. Exemplos de tal domínio inibidor incluem, porém sem limita- ções, regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo (VH), regiões va- riáveis de cadeia leve de anticorpo (VL), receptores de célula pré-B e anticorpos com um único domínio. O domínio inibidor pode constituir toda a porção transportadora ou pode constituir uma parte da porção transportadora.
[0355] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de ligação a antígeno liberado do polipeptídeo tem atividade de ligação a antígeno maior do que aquela antes da liberação. Em outras palavras, a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno é inibida pelo domínio inibidor em um estado onde o domínio de ligação a antígeno é não liberado do polipeptídeo. É confirmado se a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno é inibida pelo do- mínio inibidor por meio de um método tal como FACS (separação de células ativada por fluorescência), ELISA (ensaio imunoabsorvente |i- gado à enzima), ECL (quimioluminescência eletrogerada), um método de SPR (ressonância de plasmônio em superfície) (Biacore), BLI (inter- ferometria de biocamda) (Octet). Em algumas modalidades da presente invenção, a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno liberado do polipeptídeo é um valor igual a ou maior do que 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000 vezes ou 3000 vezes a atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno não liberado do polipeptídeo. Em algumas modalidades mais específicas da presente invenção, a ligação do domínio de ligação a antígeno antes da liberação para o antígeno não é observada quando a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno é me- dida por meio de um método selecionado dentre os métodos descritos acima.
[0356] Em alguns aspectos da presente invenção, o sítio de cliva- gem é clivado de modo que o domínio de ligação a antígeno se torne capaz de ser liberado do polipeptídeo. Em tais aspectos, portanto, a ati- vidade de ligação a antígeno pode ser comparada entre antes e após clivagem do polipeptídeo. Especificamente, a atividade de ligação a an- tígeno medida usando o polipeptídeo clivado é um valor igual a ou maior do que 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 ve- zes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 ve- zes, 2000 vezes ou 3000 vezes a atividade de ligação a antígeno me- dida usando o polipeptídeo não clivado. Em algumas modalidades mais específicas, a ligação do domínio de ligação a antígeno do polipeptídeo não clivado ao antígeno não é observada quando a atividade de ligação a antígeno é medida por meio de um método selecionado dentre os mé- todos descritos acima.
[0357] Em alguns aspectos da presente invenção, o sítio de cliva- gem é clivado pela protease. Em tais aspectos, portanto, a atividade de ligação a antígeno pode ser comparada entre antes e após um trata- mento com protease do polipeptídeo. Especificamente, a atividade de ligação a antígeno medida usando o polipeptídeo após um tratamento com protease é um valor igual a ou maior do que 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, 2000 vezes ou 3000 ve- zes a atividade de ligação a antígeno medida usando o polipeptídeo sem um tratamento com protease. Em algumas modalidades mais especifi- cas, a ligação do domínio de ligação a antígeno do polipeptídeo não tratado com protease ao antígeno não é observada quando a atividade de ligação a antígeno é medida por meio de um método selecionado dentre os métodos descritos acima.
[0358] Na presente invenção, o polipeptídeo que compreende um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora tem uma meia-vida mais longa no sangue do que aquela do domínio de ligação a antígeno que existe individualmente. Em algumas modalidades da pre- sente invenção, para a meia-vida mais longa do polipeptídeo, a porção transportadora é designada a fim de ter uma meia-vida mais longa no sangue. Em tais modalidades, exemplos do método para prolongar a meia-vida da porção transportadora no sangue incluem, porém sem |i- mitações, um maior peso molecular da porção transportadora, atividade de ligação ao FcRn possuída pela porção transportadora, atividade de ligação à albumina possuída pela porção transportadora e PEGilação da porção transportadora. Em algumas modalidades da presente inven- ção, a porção transportadora tem uma meia-vida mais longa no sangue do que aquela do domínio de ligação a antígeno (em outras palavras, o domínio de ligação a antígeno tem uma meia-vida mais curta no sangue do que aquela da porção transportadora).
[0359] Na presente invenção, as meias-vidas do domínio de ligação a antígeno individualmente e do polipeptídeo ou as meias-vidas do do- mínio de ligação a antígeno e da porção transportadora no sangue são, de preferência, comparadas em termos de suas meias-vidas no sangue em seres humanos. Se as meias-vidas no sangue são difíceis de medir em seres humanos, as meias-vidas no sangue em seres humanos po- dem ser previstas com base em suas meias-vidas no sangue em ca- mundongos (por exemplo, camundongos normais, camundongos trans- gênicos que expressam um antígeno humano e camundongos transgê- nicos que expressam FcRn humano) ou macacos (por exemplo, maca- cos cinomolgos).
[0360] Em uma modalidade, o método para prolongar a meia-vida no sangue da porção transportadora inclui um grande peso molecular da porção transportadora. Em uma modalidade, o método para tornar a meia-vida no sangue da porção transportadora mais longa do que aquela do domínio de ligação a antígeno inclui tornar o peso molecular da porção transportadora maior do que aquele do domínio de ligação a antígeno.
[0361] Em uma modalidade, a abordagem para prolongar a meia-
vida no sangue da porção transportadora inclui atividade de ligação ao FcRn possuída pela porção transportadora. A porção transportadora pode, em geral, possuir atividade de ligação ao FcRn por meio de um método para estabelecer uma região de ligação ao FcRn na porção transportadora. Região de ligação ao FcRn refere-se a uma região que tem atividade de ligação contra FCcRn e pode ter qualquer estrutura, con- tanto que a região usada tenha atividade de ligação contra FcRn.
[0362] A porção transportadora que contém uma região de ligação ao FcRn é capaz de ser absorvida pelas células e, então, trazida de volta para o plasma através da via de salvamento de FcRn. Por exem- plo, uma molécula de IgG tem um tempo de circulação plasmática rela- tivamente longo (desaparecimento lento) em virtude do fato de que o FcRn é conhecido como um receptor de salvamento das funções de molécula de IgG. Uma molécula de IgG absorvida pelo endossoma atra- vés de pinocitose se liga ao FcRn expresso no endossoma sob condi- ções ácidas intraendossômicas. Uma molécula de IgG que não se liga ao FcRn é movida para o lisossoma e degradada no mesmo, enquanto que a molécula de IgG ligada com o FcRn é transferida para a superfície celular, então, dissociada do FCcRn sob condições neutras no plasma e, deste modo, trazida de volta para o plasma.
[0363] A região de ligação ao FcRn é, de preferência, uma região que se liga diretamente ao FcRn. Exemplos preferidos da região de li- gação ao FcRn podem incluir regiões Fc de anticorpo. Entretanto, uma região capaz de se ligar a um polipeptídeo, tal como albumina ou IgG que tem capacidade de ligação ao FcRn, é capaz de se ligar indireta- mente ao FcRn por meio de albumina, IgG ou similar. Portanto, a região de ligação ao FcRn de acordo com a presente invenção pode ser uma região que se liga a tal polipeptídeo que tem capacidade de ligação ao FecRn.
[0364] A atividade de ligação da região de ligação ao FcRn de acordo com a presente invenção contra o FcRn, particularmente FcRn humano, pode ser medida por meio de um método conhecido por aque- les versados na técnica, conforme mencionado na seção acima sobre a atividade de ligação. As condições para isto podem ser apropriada- mente determinadas por aqueles versados na técnica. A atividade de ligação contra o FcRn humano pode ser avaliada como KD (constante de dissociação), KD aparente (constante de dissociação aparente), kd (taxa de dissociação) ou kd aparente (taxa de dissociação aparente), etc. Estes valores podem ser medidos por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, Biacore (GE Healthcare Japan Corp.), Scatchard plot, citômetros de fluxo e assim por diante po- dem ser usados.
[0365] As condições para medir a atividade de ligação da região de ligação ao FcRn contra o FcRn não estão particularmente limitadas e podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na téc- nica. A atividade de ligação pode ser medida sob condições que envol- vem, por exemplo, um tampão de MES e a 37 ºC, conforme descrito no documento WO2009/125825. Além disso, a atividade de ligação da re- gião de ligação ao FcRn da presente invenção contra o FcRn pode ser medida por meio de um método conhecido por aqueles versados na téc- nica e pode ser medida usando, por exemplo, Biacore (GE Healthcare Japan Corp.). Na medição da atividade de ligação da região de ligação ao FcRn contra o FcRn, o FcRn e a região de ligação ao FcRn ou a porção transportadora que contém a região de ligação ao FcRn podem ser injetados como analitos em chips sobre os quais a região de ligação ao FcRn ou a porção transportadora que contém a região de ligação ao FcRn e o FcRn, respectivamente, são imobilizados, seguido por avalia- ção.
[0366] Quanto ao pH para uso nas condições de medição, a afini-
dade de ligação da região de ligação ao FcRn pelo FcRn pode ser ava- liada em qualquer pH a partir de 4,0 a 6,5. De preferência, um pH de 5,8 a 6,0, o qual está próximo do pH no endossoma inicial in vivo, é usado para determinação da afinidade de ligação da região de ligação ao FcRn pelo FcRn humano. Quanto à temperatura para uso nas condições de medição, a afinidade de ligação da região de ligação ao FcRn pelo FcRn pode ser avaliada em qualquer temperatura a partir de 10ºC a 50ºC. De preferência, uma temperatura de 15ºC a 40ºC é usada para determina- ção da afinidade de ligação da região de ligação ao FcRn pelo FcRn humano. Mais preferivelmente, qualquer temperatura a partir de 20ºC a 35ºC, por exemplo, qualquer um de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35ºC, também é usada para determinação da afinidade de ligação da região de ligação ao FcRn pelo FcRn. A tempe- ratura de 25ºC é um exemplo não limitativo de modalidades da presente invenção.
[0367] Um exemplo da região de ligação ao FcRn inclui, porém sem limitações, uma região Fc de anticorpo IgG. No caso do uso de uma região Fc de anticorpo IgG, seu tipo não está limitado e, por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 pode ser usada. Por exem- plo, uma região Fc que contém uma sequência selecionada a partir das sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOs: 21, 22, 23 e 24 pode ser usada.
[0368] Uma região Fc de anticorpo IgG nativa, bem como uma vari- ante de região Fc que tem uma ou mais substituições de aminoácidos pode ser usada, contanto que a região Fc tenha atividade de ligação ao FecRn.
[0369] Por exemplo, uma variante de região Fc que contém uma sequência de aminoácidos derivada de uma região Fc de anticorpo IgG pela substituição de pelo menos um aminoácido selecionado a partir de posições com numeração EU 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255,
256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 por outro aminoácido pode ser usada.
[0370] Mais especificamente, uma variante de região Fc que con- tém pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada a partir de: uma substituição de aminoácido para substituir Gly na posição 237 por Met, uma substituição de aminoácido para substituir Pro na posição 238 por Ala, uma substituição de aminoácido para substituir Ser na posição 239 por Lys, uma substituição de aminoácido para substituir Lys na posição 248 por le, uma substituição de aminoácido para substituir Thr na posição 250 por Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr, uma substituição de aminoácido para substituir Met na posição 252 por Phe, Trp ou Tyr, uma substituição de aminoácido para substituir Ser na posição 254 por Thr, uma substituição de aminoácido para substituir Arg na posição 255 por Glu, uma substituição de aminoácido para substituir Thr na posição 256 por Asp, Glu ou Gln, uma substituição de aminoácido para substituir Pro na posição 257 por Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val, uma substituição de aminoácido para substituir Glu na posição 258 por His, uma substituição de aminoácido para substituir Asp na posição 265 por
Ala, uma substituição de aminoácido para substituir Asp na posição 270 por Phe, uma substituição de aminoácido para substituir Asn na posição 286 por Ala ou Glu, uma substituição de aminoácido para substituir Thr na posição 289 por His, uma substituição de aminoácido para substituir Asn na posição 297 por Ala, uma substituição de aminoácido para substituir Ser na posição 298 por Gly, uma substituição de aminoácido para substituir Val na posição 303 por Ala, uma substituição de aminoácido para substituir Val na posição 305 por Ala, uma substituição de aminoácido para substituir Thr na posição 307 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr, uma substituição de aminoácido para substituir Val na posição 308 por Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, GIh ou Thr, uma substituição de aminoácido para substituir Leu ou Val na posição 309 por Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg, uma substituição de aminoácido para substituir Glh na posição 311 por Ala, His ou lle, uma substituição de aminoácido para substituir Asp na posição 312 por Ala ou His, uma substituição de aminoácido para substituir Leu na posição 314 por Lys ou Arg, uma substituição de aminoácido para substituir Asn na posição 315 por Ala ou His,
uma substituição de aminoácido para substituir Lys na posição 317 por
Ala,
uma substituição de aminoácido para substituir Ash na posição 325 por
Sly,
uma substituição de aminoácido para substituir Ile na posição 332 por
Val,
uma substituição de aminoácido para substituir Lys na posição 334 por
Leu,
uma substituição de aminoácido para substituir Lys na posição 360 por
His,
uma substituição de aminoácido para substituir Asp na posição 376 por
Ala,
uma substituição de aminoácido para substituir Glu na posição 380 por
Ala,
uma substituição de aminoácido para substituir Glu na posição 382 por
Ala,
uma substituição de aminoácido para substituir Asn ou Ser na posição
384 por Ala,
uma substituição de aminoácido para substituir Gly na posição 385 por
Asp ou His,
uma substituição de aminoácido para substituir Glh na posição 386 por
Pro,
uma substituição de aminoácido para substituir Pro na posição 387 por
Glu,
uma substituição de aminoácido para substituir Asn na posição 389 por
Ala ou Ser,
uma substituição de aminoácido para substituir Ser na posição 424 por
Ala,
uma substituição de aminoácido para substituir Met na posição 428 por
Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr, uma substituição de aminoácido para substituir His na posição 433 por Lys, uma substituição de aminoácido para substituir Asn na posição 434 por Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr, e uma substituição de aminoácido para substituir Tyr ou Phe na posição 436 por His (todos de acordo com a numeração EU), em uma região Fc de anticorpo IgG pode ser usada.
[0371] A partir de outro ponto de vista, uma região Fc que contém pelo menos um aminoácido selecionado a partir de: Met como o aminoácido na posição 237, Ala como o aminoácido na posição 238, Lys como o aminoácido na posição 239, lle como o aminoácido na posição 248, Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr como o aminoácido na posi- ção 250, Phe, Trp ou Tyr como o aminoácido na posição 252, Thr como o aminoácido na posição 254, Glu como o aminoácido na posição 255, Asp, Glu ou Glh como o aminoácido na posição 256, Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val como o aminoácido na po- sição 257, His como o aminoácido na posição 258, Ala como o aminoácido na posição 265, Phe como o aminoácido na posição 270, Ala ou Glu como o aminoácido na posição 286, His como o aminoácido na posição 289, Ala como o aminoácido na posição 297, Gly como o aminoácido na posição 298, Ala como o aminoácido na posição 303,
Ala como o aminoácido na posição 305, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr como o aminoácido na posição 307, Ala, Phe, lle, Leu, Met, Pro, Glh ou Thr como o aminoácido na posição 308, Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg como o aminoácido na posição 309, Ala, His ou Ile como o aminoácido na posição 311, Ala ou His como o aminoácido na posição 312, Lys ou Arg como o aminoácido na posição 314, Ala ou His como o aminoácido na posição 315, Ala como o aminoácido na posição 317, Gly como o aminoácido na posição 325, Val como o aminoácido na posição 332, Leu como o aminoácido na posição 334, His como o aminoácido na posição 360, Ala como o aminoácido na posição 376, Ala como o aminoácido na posição 380, Ala como o aminoácido na posição 382, Ala como o aminoácido na posição 384, Asp ou His como o aminoácido na posição 385, Pro como o aminoácido na posição 386, Glu como o aminoácido na posição 387, Ala ou Ser como o aminoácido na posição 389, Ala como o aminoácido na posição 424, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr como o aminoácido na posição 428, Lys como o aminoácido na posição 433, Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr como o aminoácido na posição 434, e His como o aminoácido na posição 436 (todos de acordo com a nume- ração EU),
em uma região Fc de anticorpo IgG pode ser usada.
[0372] A atividade de ligação ao FcRn possuída pela porção trans- portadora não significa que o domínio de ligação a antígeno não tenha atividade de ligação de FcRn. Nas modalidades nas quais a porção transportadora tem uma meia-vida mais longa no sangue do que aquela do domínio de ligação a antígeno, o domínio de ligação a antígeno pode não ter nenhuma atividade de ligação ao FcRn por rotina ou o domínio de ligação a antígeno pode ter atividade de ligação ao FcRn, contanto que a atividade de ligação ao FcRn seja mais fraca do que aquela da porção transportadora.
[0373] Em uma modalidade, o método para prolongar a meia-vida no sangue da porção transportadora envolve ligação da porção trans- portadora à albumina. Visto que a albumina não sofre excreção renal e tem capacidade de ligação ao FcRn, sua meia-vida no sangue é tão longa quanto 17 a 19 dias (J Clin Invest. Agosto de 1953; 32 (8): 746- 768). Portanto, foi reportado que uma proteína ligada à albumina se torna volumosa e capaz de se ligar indiretamente ao FcRn e, portanto, tem uma meia-vida aumentada no sangue (Antibodies 2015, 4 (3), 141- 156).
[0374] Em uma modalidade, o método alternativo para prolongar a meia-vida no sangue da porção transportadora envolve PEGilação da porção transportadora. Considera-se que a PEGilação de uma proteína torne a proteína volumosa e também suprime sua degradação pela pro- tease no sangue, deste modo, prolongando a meia-vida no sangue da proteína (J Pharm Sci. Outubro de 2008; 97 (10): 4167-83).
[0375] Em algumas modalidades da presente invenção, a porção transportadora contém uma região Fc de anticorpo. Em uma modalidade específica, a porção transportadora contém um domínio CH2 e um do- mínio CH3 de um anticorpo IgG humano. Em uma modalidade especií-
fica, a porção transportadora contém uma porção que se estende a par- tir de Cys226 ou Pro230 da cadeia pesada de anticorpo I9G1 humano até o terminal carboxila da cadeia pesada. Entretanto, a lisina C-terminal (Lys447) ou glicina-lisina (Gly446-Lys447) da região Fc pode ou não es- tar presente.
[0376] Em algumas modalidades da presente invenção, a porção transportadora contém uma região constante de anticorpo. Em uma mo- dalidade mais preferida, a porção transportadora contém uma região constante de anticorpo IgG. Em uma modalidade mais preferida, a por- ção transportadora contém uma região constante de anticorpo IgG hu- mano.
[0377] Em algumas modalidades da presente invenção, a porção transportadora contém: uma região substancialmente similar, quanto à estrutura, a uma região constante de cadeia pesada de anticorpo; e uma região substancialmente similar, quanto à estrutura, a uma cadeia leve de anticorpo, conectadas à região por meio de uma ligação covalente, tal como uma ligação de dissulfeto, ou uma ligação não covalente, tal como uma ligação de hidrogênio ou interação hidrofóbica.
[0378] No presente relatório descritivo, o "polipeptídeo que compre- ende um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora" é, em geral, uma série polipeptídeos conectados através de ligações de amida ou uma proteína que contém uma pluralidade de polipeptídeos conectados através de ligações de amida.
[0379] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de ligação a antígeno é capaz de ser liberado do polipeptídeo e o domí- nio de ligação a antígeno liberado do polipeptídeo tem maior atividade de ligação a antígeno. No presente relatório descritivo, o termo "libera- ção" refere-se à separação mútua de duas porções do polipeptídeo. À liberação do domínio de ligação a antígeno do polipeptídeo pode ser atribuída ao cancelamento da interação entre o domínio de ligação a antígeno e a porção transportadora. A atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno incorporado no polipeptídeo é inibida. Consequentemente, o domínio de ligação a antígeno liberado do poli- peptídeo pode ser confirmado ao medir a atividade de ligação a antí- geno de um indivíduo e compará-la com a atividade de ligação a antí- geno do domínio de ligação a antígeno incorporado no polipeptídeo.
[0380] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um sítio de clivagem e o sítio de clivagem é clivado de modo que o domínio de ligação a antígeno seja liberado do polipeptídeo. O sítio de clivagem pode ser clivado, por exemplo, por uma enzima, pode ser reduzido com um agente de redução ou pode ser fotodegradado. O sítio de clivagem pode ser colocado em qualquer posição no polipeptídeo, contanto que o domínio de ligação a antígeno possa ser liberado e não perca sua atividade de ligação a antígeno após liberação. O polipeptídeo também pode conter um sítio de clivagem adicional diferente do sítio de clivagem para liberação do domínio de ligação a antígeno. Em uma modalidade da presente invenção, o sítio de clivagem compreende uma sequência de clivagem pela protease e pode ser clivado por (uma) protease(s).
[0381] No presente relatório descritivo, o termo "clivado" refere-se a um estado onde o domínio de ligação a antígeno e a porção transporta- dora são separados um do outro após alteração do sítio de clivagem pela protease, redução de uma ligação de dissulfeto de cisteína-cisteína no sítio de clivagem e/ou fotoativação. No presente relatório descritivo, o termo "não clivado" refere-se a um estado onde o domínio de ligação a antígeno é ligado à porção transportadora na ausência da clivagem do sítio de clivagem pela protease, na ausência da redução de uma li- gação de dissulfeto de cisteína-cisteína no sítio de clivagem e/ou na au- sência de luz.
[0382] A clivagem do sítio de clivagem pode ser detectada ao sub-
meter uma solução que contém o polipeptídeo que contém sítio de cli- vagem a SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida) e medir os pesos moleculares dos fragmentos ou detectar uma variação no peso molecular entre antes e após a clivagem.
[0383] O sítio de clivagem pode ser especificamente modificado (cli- vado, reduzido ou fotodegradado) por um agente (isto é, protease, um agente de redução ou luz) em uma taxa de aproximadamente 0,001 a 1500 x 10º MS ou pelo menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 ou 1500 x 10º MS.
[0384] A clivagem específica pela protease é realizada pelo contato entre a protease e o sítio de clivagem ou uma molécula que contém o sítio de clivagem. O sítio de clivagem pode ser clivado na presença de atividade enzimática suficiente. Atividade enzimática suficiente pode se referir à capacidade da enzima de realizar a clivagem em contato com o sítio de clivagem.
[0385] No presente relatório descritivo, o termo "protease" refere-se a uma enzima, tal como endopeptidase ou exopeptidase, a qual hidro- lisa uma ligação peptídica, tipicamente endopeptidase. A protease usada na presente invenção está limitada apenas por ser capaz de clivar uma sequência de clivagem pela protease e não está particularmente limitada por seu tipo. Em algumas modalidades, uma protease especí- fica para o tecido alvo é usada. Protease específica para tecido alvo pode se referir, por exemplo, qualquer uma de: (1) uma protease que é expressa em um nível maior no tecido alvo do que em um tecido normal, (2) uma protease que tem atividade maior no tecido alvo do que em um tecido normal, (3) uma protease que é expressa em um nível maior nas células alvo do que em uma célula normal e
(4) uma protease que tem atividade maior nas células alvo do que em uma célula normal.
[0386] Em uma modalidade mais específica, uma protease especí- fica para tecido canceroso ou uma protease específica para tecido infla- matório é usada.
[0387] No presente relatório descritivo, o termo "tecido alvo" signi- fica um tecido que contém pelo menos uma célula alvo. Em algumas modalidades da presente invenção, o tecido alvo é um tecido canceroso. Em algumas modalidades da presente invenção, o tecido alvo é um te- cido inflamatório.
[0388] O termo "tecido canceroso" significa um tecido que contém pelo menos uma célula cancerosa. Deste modo, considerando que, por exemplo, o tecido canceroso contém células cancerosas e vasos vas- culares, cada tipo de célula que contribui para a formação de massa tumoral que contém células cancerosas e células endoteliais está inclu- ido no escopo da presente invenção. No presente relatório descritivo, massa tumoral refere-se aos focos de tecido tumoral. O termo "tumor" é, em geral, usado para significar neoplasma benigno ou neoplasma maligno.
[0389] No presente relatório descritivo, exemplos do "tecido infla- matório" incluem os seguintes: um tecido de articulação em artrite reumatoide ou osteoartrite, um tecido pulmonar (alvéolo) em asma brônquica ou DPOC, um tecido de órgão digestivo em doença inflamatória do intestino, do- ença de Crohn ou colite ulcerativa, um tecido fibrótico em fibrose hepática, renal ou pulmonar, um tecido sob rejeição de transplante de órgãos, um vaso vascular ou tecido cardíaco (músculo cardíaco) em arterioscle- rose ou insuficiência cardíaca, um tecido adiposo visceral em síndrome metabólica,
um tecido cutâneo em dermatite atópica e outras dermatites, e um tecido do nervo espinhal em hérnia de disco ou lombalgia crônica.
[0390] Protease especificamente expressa ou especificamente ati- vada ou protease considerada como estando relacionada a uma condi- ção patológica de um tecido alvo (protease específica para tecido alvo) é conhecida por alguns tecidos alvo. Por exemplo, os documentos WO?2013/128194, WO2010/081173 e WOZ2009/025846 descrevem pro- tease especificamente expressa em um tecido canceroso. Além disso, J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45, Nat Rev Immunol. Julho de 2006; 6 (7): 541-50, Nat Rev Drug Discov. Dezembro de 2014; 13 (12): 904-27, Res- pir Res. 4 de Março de 2016; 17: 23, Dis Model Mech. Fevereiro de 2014; 7 (2): 193-203 e Biochim Biophys Acta. Janeiro de 2012; 1824 (1): 133-45 descrevem uma protease considerada como estando relacio- nada à inflamação.
[0391] Além da protease especificamente expressa em um tecido alvo, também há a protease especificamente ativada em um tecido alvo. Por exemplo, a protease pode ser expressa em uma forma inativa e, então, convertida em uma forma ativa. Muitos tecidos contêm uma subs- tância que inibe a protease ativa e controlam a atividade por meio do processo de ativação e a presença do inibidor (Nat Rev Cancer. Julho de 2003; 3 (7): 489-501). Em um tecido alvo, a protease ativa pode ser especificamente ativada ao escapar da inibição.
[0392] A protease ativa pode ser medida usando um método que emprega um anticorpo que reconhece a protease ativa (PNAS, 2 de Ja- neiro de 2013; 110 (1): 93-98) ou um método de marcação fluorescente de um peptídeo reconhecível por protease, de modo que a fluorescência seja extinta antes de clivagem, porém, emitida após a clivagem (Nat Rev Drug Discov. Setembro de 2010; 9 (9): 690-701. doi: 10.1038/nrd3053).
[0393] De um ponto de vista, o termo "protease específica para te- cido alvo" pode se referir a qualquer uma de:
(i) uma protease que é expressa em um nível mais elevado no tecido alvo do que em um tecido normal, (ii) uma protease que tem maior atividade no tecido alvo do que em um tecido normal, (ili) uma protease que é expressa em um nível mais elevado nas células alvo do que em uma célula normal, e (iv) uma protease que tem maior atividade nas células alvo do que em uma célula normal.
[0394] Exemplos específicos de uma protease incluem, porém sem limitações, cisteína protease (incluindo famílias de catepsina B, L, S, etc.), aspartil protease (catepsinas D, E, K, O, etc.), serina protease (in- cluindo matriptase (incluindo MT-SP1), catepsinas A e G, trombina, plasmina, uroquinase (uPA), ativador de plasminogênio tecidual (tPA), elastase, proteinase 3, trombina, calicreína, triptase e quimase), meta- loproteinases (metaloproteinases (MMP 1-28), incluindo tanto formas li- gadas à membrana (MMP14-17 e MMP 24-25) como formas secretadas (MMP 1-13, MMP 18-23 e MMP26-28), disintegrina A e metaloproteina- ses (ADAMs), disintegrina A e metaloproteinase com motivos de trom- bospondina (ADAMTS), meprina (meprina alfa e meprina beta), CD10 (CALLA), antígeno específico para próstata (PSA), legumaína, TMPRSS3, TMPRSSA, elastase de neutrófilos (HNE), beta secretase (BACE), proteína alfa de ativação de fibroblastos (FAP), granzima B, guanidinobenzoatase (GB), hepsina, neprilisina, NS3/4A, HCV-NS3/4, calpaína, ADAMDEC1, renina, catepsina C, catepsina V/L2, catepsina X/IZIP, cruzipaína, otubaína 2, peptidases relacionadas à calicreína (KLKs (KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13 e KLK14)), proteína 1 morfogenética óssea (BMP-1), proteína C ativada, proteases relacionadas à coagulação sanguínea (Fator Villa, Fator IXa, Fator Xa, Fator Xla e Fator Xlla), HtrA1, lactoferrina, marapsina, PACEA,
DESC1, dipeptidil peptidase 4 (DPP-4), TMPRSS?, catepsina F, catep- sina H, catepsina L2, catepsina O, catepsina S, granzima A, Gepsina, calpaína 2, glutamato carboxipeptidase 2, proteases similares a AMSH, AMSH, gama secretase, enzima de clivagem antiplasmina (APCE), de- cisina 1, dipeptidase-like 1 ácida alfa ligada N-acetilada (NAALADL1) e furina.
[0395] A partir de outro ponto de vista, a protease específica para tecido alvo pode se referir a uma protease específica para tecido can- ceroso ou uma protease específica para tecido inflamatório.
[0396] Exemplos de protease específica para tecido canceroso in- cluem protease especificamente expressa em um tecido canceroso des- crita nos documentos WOZ2013/128194, WOZ2010/081173 e WO2009/025846.
[0397] Quando ao tipo de protease específica para tecido cance- roso, uma protease que tem maior especificidade de expressão no te- cido canceroso a ser tratado é mais eficaz para reduzir os efeitos cola- terais. Uma protease específica para tecido canceroso preferível tem uma concentração no tecido canceroso de pelo menos 5 vezes ou maior, mais preferivelmente 10 vezes ou maior, mais preferivelmente 100 vezes ou maior, particularmente de preferência 500 vezes ou maior, mais preferivelmente 1000 vezes maior do que sua concentração em tecidos normais. Além disso, uma protease específica para tecido can- ceroso preferível tem uma atividade no tecido canceroso de 2 vezes ou maior, mais preferivelmente 3 vezes ou maior, 4 vezes ou maior, 5 vezes ou maior ou 10 vezes ou maior, mais preferivelmente 100 vezes ou maior, particularmente de preferência 500 vezes ou maior, mais preferi- velmente 1000 vezes maior do que sua atividade em tecidos normais.
[0398] A protease específica para tecido canceroso pode estar em uma forma ligada a uma membrana de célula cancerosa ou pode estar em uma forma extracelularmente secretada sem estar ligada a uma membrana celular. Quando a protease específica para tecido canceroso não está ligada a uma membrana de célula cancerosa, é preferível que a citotoxicidade mediada por imunócitos seja específica para células cancerosas, de modo que a protease específica para tecido canceroso possa existir dentro de ou nas proximidades do tecido canceroso. No presente relatório descritivo, "proximidade do tecido canceroso" se des- tina a cair no escopo da localização onde uma sequência de clivagem pela protease específica para o tecido canceroso é clivada, de modo que o domínio de ligação a antígeno exerça atividade de ligação a antí- geno. Entretanto, é preferível que o dano em células normais seja mini- mizado neste escopo de localização.
[0399] De um ponto de vista, o termo "protease específica para te- cido canceroso" é qualquer uma de: (i) uma protease que é expressa em um nível mais elevado no tecido canceroso do que em um tecido normal, (ii) uma protease que tem maior atividade no tecido canceroso do que em um tecido normal, (ili) uma protease que é expressa em um nível mais elevado nas células cancerosas do que em uma célula normal, e (iv) uma protease que tem maior atividade nas células cancerosas do que em uma célula normal.
[0400] Um tipo de protease específica para tecido canceroso pode ser usado individualmente ou dois ou mais tipos de protease específica para tecido canceroso podem ser combinados. O número de tipos de protease específica para tecido canceroso pode ser apropriadamente estabelecido por aqueles versados na técnica levando em conta o tipo de câncer a ser tratado.
[0401] A partir destes pontos de vista, a protease específica para tecido canceroso é, de preferência, serina protease ou metaloproteina- ses, mais preferivelmente matriptases (incluindo MT-SP1), uroquinase
(UPA) ou metaloproteinases e ainda de preferência MT-SP1, uPA, MMP- 2 ou MMP-9, dentre as outras proteases listadas acima.
[0402] Quanto ao tipo de protease específica para tecido inflamató- rio, uma protease que tem maior especificidade de expressão no tecido inflamatório a ser tratado é mais eficaz para reduzir os efeitos colaterais. Uma protease específica para tecido inflamatório preferível tem uma concentração no tecido inflamatório de 5 vezes ou maior, mais preferi- velmente 10 vezes ou maior, mais preferivelmente 100 vezes ou maior, particularmente de preferência 500 vezes ou maior, mais preferivel- mente 1000 vezes maior do que sua concentração em tecidos normais. Além disso, uma protease específica para tecido inflamatório preferível tem atividade em tecidos inflamatórios de 2 vezes ou maior, mais prefe- rivelmente 3 vezes ou maior, 4 vezes ou maior, 5 vezes ou maior ou 10 vezes ou maior, mais preferivelmente 100 vezes ou maior, particular- mente de preferência 500 vezes ou maior, ainda mais preferivelmente 1000 vezes maior do que sua atividade em um tecido normal.
[0403] A protease específica para tecido inflamatório pode estar em uma forma ligada a uma membrana celular inflamatória ou pode estar em uma forma extracelularmente secretada sem estar ligada a uma membrana celular. Quando a protease específica para tecido inflamató- rio não está ligada a uma membrana celular inflamatória, é preferido que a citoxicidade mediada por imunócitos seja específica para células infla- matórias, de modo que a protease específica para tecido inflamatório possa existir dentro de ou na proximidade do tecido inflamatório. No pre- sente relatório descritivo, "proximidade do tecido inflamatório" se destina a cair no escopo da localização onde uma sequência de clivagem pela protease específica para tecido inflamatório é clivada, de modo que o domínio de ligação a antígeno exerça a atividade de ligação a antígeno. Entretanto, é preferível que o dano em células normais seja minimizado neste escopo de localização.
[0404] De um ponto de vista alternativo, a protease específica para tecido inflamatório é qualquer uma de: (i) uma protease que é expressa em um nível mais elevado no tecido inflamatório do que em um tecido normal, (ii) uma protease que tem maior atividade no tecido inflamatório do que em um tecido normal, (ili) uma protease que é expressa em um nível mais elevado nas células inflamatórias do que em uma célula normal, e (iv) uma protease que tem maior atividade nas células inflamatórias do que em uma célula normal.
[0405] Um tipo de protease específica para tecido inflamatório pode ser usado individualmente ou dois ou mais tipos de protease específica para tecido inflamatório podem ser combinados. O número de tipos de protease específica para tecido inflamatório pode ser apropriadamente estabelecido por aqueles versados na técnica levando em conta a con- dição patológica a ser tratada.
[0406] A partir destes pontos de vista, a protease específica para tecido inflamatório é, de preferência, uma metaloproteinase dentre as proteases listadas acima. A metaloproteinase é, mais preferivelmente, ADAMTSS5, MMP-2, MMP-7, MMP-9 ou MMP-13.
[0407] A sequência de clivagem pela protease é uma sequência de aminoácidos particular que é especificamente reconhecida por uma pro- tease específica para tecido alvo quando o polipeptídeo é hidrolisado pela protease específica para tecido alvo em uma solução aquosa.
[0408] A sequência de clivagem pela protease é, de preferência, uma sequência de aminoácidos que é hidrolisada com especificidade elevada pela protease específica para tecido alvo mais especificamente expressa no tecido alvo ou células a serem tratadas ou mais especifica- mente ativada no tecido/células alvo a serem tratados do ponto de vista de redução nos efeitos colaterais.
[0409] Exemplos específicos de uma sequência de clivagem pela protease incluem sequências alvo que são especificamente hidrolisadas pelas proteases listadas acima especificamente expressas em um te- cido —canceroso descrita nos documentos WO2013/128194, WO?2010/081173 e WO2009/025846, uma protease específica para um tecido inflamatório e assim por diante. Uma sequência artificialmente al- terada, por exemplo, ao introduzir uma mutação de aminoácido apropri- ada em uma sequência alvo que é especificamente hidrolisada por uma protease conhecida também pode ser usada. Alternativamente, uma se- quência de clivagem pela protease identificada por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica, conforme descrito em Na- ture Biotechnology 19, 661-667 (2001), pode ser usada.
[0410] Além disso, uma sequência de clivagem pela protease de ocorrência natural pode ser usada. Por exemplo, TGFB é convertido em uma forma latente através de clivagem pela protease. Igualmente, uma sequência de clivagem pela protease em uma proteína que muda sua forma molecular através de clivagem pela protease também pode ser usada.
[0411] Exemplos de uma sequência de clivagem pela protease que podem ser usadas incluem, porém sem limitações, as sequências des- critas nos documentos WOZ2Z015/116933, WOZ2015/048329, WO2016/118629, WO?2016/179257, WO?2016/179285, WO2016/179335, WO?2016/179003, WO2016/046778, WO?2016/014974, Publicação de Patente Norte-Americana Nº US2016/0289324, Publicação de Patente Norte-Americana Nº US2016/0311903, PNAS (2000) 97: 7754-7759, Biochemical Journal (2010) 426: 219-228 e Beilstein J Nanotechnol. (2016) 7: 364-373.
[0412] A sequência de clivagem pela protease é, mais preferivel- mente, uma sequência de aminoácidos que é especificamente hidroli- sada por uma protease específica para tecido alvo adequada, conforme mencionado acima. A sequência de aminoácidos que é especificamente hidrolisada pela protease específica para tecido alvo é, de preferência, uma sequência que compreende qualquer uma das seguintes sequên- cias de aminoácidos: LSGRSDNH (SEQ ID NO: 12, clivável por MT-SP1 ou uPA), PLALAG (SEQ |D NO: 25, clivável por MMP-2 ou MMP-9), e VPLSLTMG (SEQ ID NO: 26, clivável por MMP-7).
[0413] Qualquer uma das sequências a seguir também pode ser usada como uma sequência de clivagem pela protease: TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 74, clivável por MT-SP1 ou uPA), ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 75, clivável por MT-SP1 ou uPA), AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76, clivável por MT-SP1 ou uPA), GAGVPMSMRGGAG (SEQ ID NO: 77, clivável por MMP-1), GAGIPVSLRSGAG (SEQ ID NO: 78, clivável por MMP-2), GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 79, clivável por MMP-2), GGPLGMLSOQS (SEQ ID NO: 80, clivável por MMP-2), PLGLWA (SEQ ID NO: 81, clivável por MMP-2), GAGRPFSMIMGAG (SEQ ID NO: 82, clivável por MMP-3), GAGVPLSLTMGAG (SEQ ID NO: 83, clivável por MMP-7), GAGVPLSLYSGAG (SEQ ID NO: 84, clivável por MMP-9), AANLRN (SEQ ID NO: 85, clivável por MMP-11), AQAYVK (SEQ ID NO: 86, clivável por MMP-11), AANYMR (SEQ ID NO: 87, clivável por MMP-11), AAALTR (SEQ ID NO: 88, clivável por MMP-11), AQNLMR (SEQ ID NO: 89, clivável por MMP-11), AANYTK (SEQ ID NO: 90, clivável por MMP-11), GAGPQGLAGQRGIVAG (SEQ ID NO: 91, clivável por MMP-13), PRFKIIGG (SEQ ID NO: 92, clivável por pro-uroquinase), PRFRIIGG (SEQ ID NO: 93, clivável por pro-uroquinase),
GAGSGRSAG (SEQ ID NO: 94, clivável por uPA), SGRSA (SEQ ID NO: 95, clivável por uPA), GSGRSA (SEQ ID NO: 96, clivável por uPA), SGKSA (SEQ ID NO: 97, clivável por uPA), SGRSS (SEQ ID NO: 98, clivável por uPA), SGRRA (SEQ ID NO: 99, clivável por uPA), SGRNA (SEQ ID NO: 100, clivável por uPA), SGRKA (SEQ ID NO: 101, clivável por uPA), QRGRSA (SEQ ID NO: 102, clivável por tPA), GAGSLLKSRMVPNFNAG (SEQ ID NO: 103, clivável por catepsina B) TQGAAA (SEQ ID NO: 104, clivável por catepsina B), GAAAAA (SEQ ID NO: 105, clivável por catepsina B), GAGAAG (SEQ ID NO: 106, clivável por catepsina B), AAAAAG (SEQ ID NO: 107, clivável por catepsina B), LCGAAI (SEQ ID NO: 108, clivável por catepsina B), FAQALG (SEQ ID NO: 109, clivável por catepsina B), LLQANP (SEQ ID NO: 110, clivável por catepsina B), LAAANP (SEQ ID NO: 111, clivável por catepsina B), LYGAQF (SEQ ID NO: 112, clivável por catepsina B), LSQAQG (SEQ ID NO: 113, clivável por catepsina B), ASAASG (SEQ ID NO: 114, clivável por catepsina B), FLGASL (SEQ ID NO: 115, clivável por catepsina B), AYGATG (SEQ ID NO: 116, clivável por catepsina B), LAQATG (SEQ ID NO: 117, clivável por catepsina B), GAGSGVVIATVIVITAG (SEQ ID NO: 118, clivável por catepsina L), APMAEGGG (SEQ ID NO: 119, clivável por meprina alfa ou meprina beta), EAQGDKII (SEQ ID NO: 120, clivável por meprina alfa ou meprina beta), LAFSDAGP (SEQ ID NO: 121, clivável por meprina alfa ou meprina beta),
YVADAPK (SEQ ID NO: 122, clivável por meprina alfa ou meprina beta), RRRRR (SEQ ID NO: 123, clivável por furina), RRRRRR (SEQ ID NO: 124, clivável por furina), GQSSRHRRAL (SEQ ID NO: 125, clivável por furina), SSRHRRALD (SEQ ID NO: 126), RKSSIIIRMRDVVL (SEQ ID NO: 127, clivável por ptasminogênio), SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 128, clivável por estafiloquinase), SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 129, clivável por estafiloquinase), IEGR (SEQ ID NO: 130, clivável por Fator Xa), IDGR (SEQ ID NO: 131, clivável por Fator Xa), GGSIDGR (SEQ ID NO: 132, clivável por Fator Xa), GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 133, clivável pela colagenase), GPQGLLGA (SEQ ID NO: 134, clivável pela colagenase), GIAGQ (SEQ ID NO: 135, clivável pela colagenase), GPLGIAG (SEQ ID NO: 136, clivável pela colagenase), GPEGLRVG (SEQ ID NO: 137, clivável pela colagenase), YGAGLGVV (SEQ ID NO: 138, clivável pela colagenase), AGLGVVER (SEQ ID NO: 139, clivável pela colagenase), AGLGISST (SEQ ID NO: 140, clivável pela colagenase), EPQALAMS (SEQ ID NO: 141, clivável pela colagenase), QALAMSAI (SEQ ID NO: 142, clivável pela colagenase), AAYHLVSOQ (SEQ ID NO: 143, clivável pela colagenase), MDAFLESS (SEQ ID NO: 144, clivável pela colagenase), ESLPVVAV (SEQ ID NO: 145, clivável pela colagenase), SAPAVESE (SEQ ID NO: 146, clivável pela colagenase), DVAQFVLT (SEQ ID NO: 147, clivável pela colagenase), VAQFVLTE (SEQ ID NO: 148, clivável pela colagenase), AQFVLTEG (SEQ ID NO: 149, clivável pela colagenase), PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 150, clivável pela colagenase), LVPRGS (SEQ ID NO: 151, clivável por trombina),
TSGSGRSANARG (SEQ ID NO: 168, clivável por uPA e MT-SP1), TSQSGRSANQRG (SEQ ID NO: 169, clivável por uPA e MT-SP1), TSPSGRSAYPRG (SEQ ID NO: 170, clivável por uPA e MT-SP1), TSGSGRSATPRG (SEQ ID NO: 171, clivável por uPA e MT-SP1), TSQSGRSATPRG (SEQ ID NO: 172, clivável por uPA e MT-SP1), TSASGRSATPRG (SEQ ID NO: 173, clivável por uPA e MT-SP1), TSYSGRSAVPRG (SEQ ID NO: 174, clivável por uPA e MT-SP1), TSYSGRSANFRG (SEQ |D NO: 175, clivável por uPA e MT-SP1), TSSSGRSATPRG (SEQ ID NO: 176, clivável por uPA e MT-SP1), TSTTGRSASPRG (SEQ ID NO: 177, clivável por uPA e MT-SP1), e TSTSGRSANPRG (SEQ |D NO: 178, clivável por uPA e MT-SP1).
[0414] As sequências mostradas na Tabela 1 também podem ser usadas como sequências de clivagem pela protease. Tabela 1 Sequências cliváveis pela protease (cliváveis por uPA e MT-SP1)
[ER stsarenmo e soa |
[FR ses assar | LIFE OR IA ee [E se esa |
[ssa esses |
[FR seo eso | LR ssa o sv | [E ese sro | [E ess A ses | [see es | RR seas o ses | LIFE O5GA E eee [FR gras ese |
[0415] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: XK1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 833) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG HI, KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH L K L, MÓ N, P, O, R, S, T, V, We Y; X4 representa R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K L, M, N,P, Q, R, S, T, V, We Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, HH L K, L, M N, P, OQ, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K L MÓ. N, P, Q,R,S,T,V, W eY;eX8é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, H, LKL MN P,Q,RS,T,V,WeYVY.
[0416] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 834) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, E, E, G, HK MN,P, QWeY; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/E, E, HH K L,M,P, Q, S,T,V, We Y;X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, DE, F, GC, HI, K LM N,P,Q,R,S,T,V,WeY; X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K L MÓ.N,P, Q,R,S,T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K L MÓ. N, P, Q, RS, TT VWeY;eX8é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, H LL K L MÓ. N,P, Q,R,S,T,V,WeYV.
[0417] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: XK1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 835) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG HILL KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, L M, P, Q, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/E, F, G, H,I, KLM,N,P,Q,R,S,T,V,WeY;X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L MÓ, N, PR, Q, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K L MÓ. N, P, Q, R,S, TV WeY;eX8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MÓ. N,P, Q,RS,T,V,WeYV.
[0418] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: XK1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 836) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG H L K MN,P,Q,S, T, We Y;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A,E, FE, H LKL, MN, P, Q,R,T, V, We Y; X4 é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH L K L MÓ.N,P, Q,R,S,T,V, W e Y;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH | K L MÓ. N, P, , RS, T, VV WeY;eXB é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH L K L MÓ. N,P, Q,RS,T,V,WeYV.
[0419] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 837) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HI, KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH IL K, L MÓ N, P, Q, RS, T, V, We Y; X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, G, HH L K L MN, Q,R,T, V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, |, K, L, M, N, P, Q, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K L MÓ. N, P, Q, R,S, TT VWeY;eX8é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L, K L MÓ. N,P, Q,R,S,T,V,WeYV.
[0420] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 838) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG HI, KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HI, K L, MÓ N, P, 0, RS, T, V, We Y; XAé R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K LM. N,P,Q, R,S,T,V,WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de E, F, K, M, N, P, OQ, RS e W; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, G, HI K, L, M, N, P, O, R, S, T, V, We Y; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K L MÓ.N,P, Q,R,S,T,V, Werv.
[0421] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 839) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG HL KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K, L MÓ N, PR, Q, RS, T, V We Y; X4é R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LK L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, K L M,N,P,Q,R,S,T,V, WeY; X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, F, G, L, M, P, Q, Ve W; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L MÓ, N, PR, Q, RS, T,V, Werv.
[0422] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: XK1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 840) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, G, HL KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HA LIL K, L, MÓ N, P, Q, RS, T, V We Y; X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH L K L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, KL,M,N,P, Q,R,S,T,V, WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K L MÓ N, P, QR,S,T,V,WeY; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, FE, G, L K N,Te W.
[0423] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 841) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, 1, P, 0, Se Y; X2 é um amino- ácido selecionado a partir de K ou T; X38 é G; X4é R X5 é S; XGéÉ A;
X7 é um aminoácido selecionado a partir de H, | e V; e X8 é um amino- ácido selecionado a partir de H, Ve Y.
[0424] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 842) em que X1 a X8 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de Se T; X8 é G; X4é RX5 é S; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A e E; X7 é um amino- ácido selecionado a partir de N e V; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de H, P, Ve Y.
[0425] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 843) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG, HI, KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HA L K L, MÓ. N, P, Q, R,S,T, V We Y; X4é6 R Xb5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH L K L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, KLM,N,P,Q,R,S,T,V,WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, E, FE, G, H |, K L MÓ N, P, Q,R,S,T,V,WeY; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, G, H L K L, M, N,P, Q,R,S,T,V, We Y; e X9 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, LeR.
[0426] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 844) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, E, E, G, H K MN,P, QWeY;
X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/E, E, H K L,M,P, Q, S,T,V, WeY;X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, GC, H,L | KLMN,P,Q,R,S,T,V,WeY; X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K, L MÓ. N,P, Q, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, FE, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K, L MÓ. N, P, O, RS, T, V, We Y; Xb é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HLKL M.N,P,Q, R,S,T,V,WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0427] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 845) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG, HI, KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, L M, P, Q, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, DE, F, G, HI, KL M,N,P,Q,RS,T,V,WeY;X4é R;X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L MÓ, N, PR, OQ, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, H L K, L MÓ. N, P, Q,R,S,T,V, We Y; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LK L MN,P,Q, R,S,T,V,WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0428] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 846) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, GG HI, KM,N,P,Q,S,
T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A,E, FE, H L KL,M,N,P, O, R,T,V, WeY;X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH L K L MÓ. N, P, Q,R,S,T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, FE, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K, L MÓ. N, P, O, RS, T, V, We Y; XbB é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LKL M.N,P,Q, R,S,T,V,WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0429] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 847) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G HI, K M.N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HA IL K L, MÓ N, P, Q, RS, T, V We Y; X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, G, HH | K L, MÓ, N, Q, R,T, V, We Y;X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, F, H, |, K, L, M, N, P, O, R, S, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K, L MÓ. N, P, Q, RS, T,V We Y; Xb é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MN,P,Q, R,S,T,V,WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0430] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 848) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, GG HI, KM,N,P,Q,S,
T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, H , K L MÓ N, P, 0, RS, T,V, We Y; XAÉ R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de E, F, K, M, N, P, O, R, S e W; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, G, HI, KLM,N,P, Q,R,S,T,V, WeY; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L M, N, PR, OQ, RS, T,V, WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, Le R.
[0431] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 849) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG HI, KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, G, HH LIL K, L MÓ, N, PR, Q, RS, T,V WeY; X4é R Xb é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LK L M.N,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, K LM,N,P,Q,R,S,T,V, We Y; X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, F, G, L, M, P, Q, Ve W; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L MÓ, N, PR, Q, RS, T,V, WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, Le R.
[0432] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 850) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, GG HI, KM,N,P,Q,S, T, WeY;X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de
A, D, E, FE, G, HH IL K, L MÓ N, PR, Q, RS, T, V We Y; X4é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K, LM, N,P, Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, KL M,N,P,Q,R,S,T,V, WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D,/ E, E, G, HH , K,, L MÓ. N,P, Q,R,S,T,V,WeY; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, , K N,Te W; e X9 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, Le R.
[0433] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 851) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, |, P, Q, Se Y; X2 é um amino- ácido selecionado a partir de K ou T; X3 é G; X4é R X5é S; XGéÉ A; X7 é um aminoácido selecionado a partir de H, | e V; X8 é um aminoá- cido selecionado a partir de H, Ve Y; e X9 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, Le R.
[0434] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 852) em que X1 a X9 representam, cada um, um único aminoácido, X1 é Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de Se T; X8 é G; X4é RX5 é S; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A e E; X8 é um amino- ácido selecionado a partir de H, P, Ve Y; e X9 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, G, H, l, Le R.
[0435] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1062) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de Il, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH IL, K MÓ.N,P,Q, S,T,
W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH | K L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; XAÉé R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, KL,M,N,P, Q,R,S,T,V, WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, E, E, G, HH , K, L MÓ.N,P, Q,R,S,T,V,WeY; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, H LI K,L, M, NP, Q,R,S,T,V, WeY.
[0436] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1063) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, E, FE, G, H K M N, P, Q, We Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H K L MP, Q,S, T,V, WeY;X3é um aminoácido selecionado a partir de A, D/E, F, G, HI, K LM,N,P,Q,R S,T,V,WeY;X4é R;X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L MÓ, N, PR, OQ, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, HI, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH | K L MÓ N, P, Q,R,S,T, V WeY;eX8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH L K L M.N,P, Q,R,S,T,V,WeYV.
[0437] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1064) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH , K MÓ.N,P,Q, S,T,
W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, DD FE, L MP, Q, V, WeY;X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, G, H, IL KL MN P ARS TV,WeY; X4éR X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH L K L MÓ. N,P, Q,R,S,T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, FE, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MÓ. N,P, Q, R,S, TV WeY;eX8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, H L K L MÓ. N,P, Q,RS,T,V,WeYV.
[0438] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1065) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de Il, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH IL, K M. N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, E, F, HI, K L,M,N,P, Q, RT, V, We Y; X4 é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L MÓ, N, PR, OQ, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, HI, K, L, M N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH | K L MÓ. N,P, Q,R,S, TV WeY;eX8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH L K L M.N,P, Q,R,S,T,V,WeYV.
[0439] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1066) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de Il, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH , K M.N,P, Q, S,T,
W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH | K L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; XAé R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, G, HH L K L MN, Q,R,T, V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, |, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, H L K L MÓ, N, P, Q, RS, TV WeY;eX8é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH L K, L MÓ. N,P, Q,R,S,T,V,WeYV.
[0440] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1067) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH IL, K M. N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH IL K L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X4Aé R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K LM N,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de E, F, K, M, N, P, O, R, Se W; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, 6, HH | K L, M N, P, O, RS, T, V, We Y; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH LL K,, L MÓ.N,P, Q,R,S,T,V, Werv.
[0441] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1068) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH , K MÓ.N,P,Q, S,T,
W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH | K L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X4Aé R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, K L,M,N,P, Q,R,S,T,V, WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, F, G, L, M, P, Q, Ve W; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L M, N, PR, OQ, RS, T,V, Werv.
[0442] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1069) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH L K MN, P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH IL K L, MÓ N, P, Q, RS, T, V, We Y; X4é R Xb é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH LK L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, KL,M,N,P, Q,R,S,T,V, WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MÓM.N,P, Q,R,S,T,V,WeY; e X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, FE, G, L K N,Te W.
[0443] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1070) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, G, |, P, Q, Se Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de Kou T; X38 é G; X46 R X5 é S; XGé A; KT é um aminoácido selecionado a partir de H, l e V; e X8 é um aminoácido se- lecionado a partir de H, Ve Y.
[0444] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1071) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de / Te Y XIT é ss; XT é Y; X2é um aminoácido selecionado a partir de S e T; X8é G; X4é R X5éS; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A e E; X7 é um aminoácido selecionado a partir de N e V; e X8 é um aminoácido selecionado a partir deH,P,VeY.
[0445] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1072) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de Il, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH |, K M N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, H | K L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; XAÉé R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, HH L K L M.N,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, K L,M,N,P, Q,R,S,T,V, WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, E, E, G, HH , K L MÓ.N,P, Q,R,S,T,V,WeY; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HA L K, L, M, N,P, Q,R,S,T,V, WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, LeR.
[0446] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1073) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, E, FE, G, H K M N, P, Q, We Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, DE FF HK L M,P,Q,S, T,V, WeY;X3é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, F, G, H,I, K LM,N,P,Q,R,S,T,V,WeY;X4é R;X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L M, N, PR, OQ, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D/ E, E, H, 1, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, H L K, L MÓ N, P, Q, RS, T,V, We Y; Xb é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MÓ. N,P,Q, R,S,T,V,WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0447] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1074) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de l,/ Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH LIL K M.N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, DP E, L MP, Q, V, WeY;X3é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, H, LKL MN PQ RSTVWeY; X4éR X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L M, N, PR, OQ, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H, 1 K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, H LL K, L MÓ. N, P, Q, RS, T,V WeY;X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K L MN,P,Q, R,S,T,V,WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0448] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1075) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de Il, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HI, K MÓ. N,P,Q,S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, E, F, HI, KL,M,N,P, Q,R,T,V, We Y; X4 é R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, L MÓ, N, PR, OQ, RS, T,V, W e Y; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, HI, K, L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH L K, L MÓ. N, P, Q, RS, T,V We Y; Xb é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LK L MN,P,Q, R,S,T,V,WeY;eX9Ié um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0449] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1076) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH Il, K M.N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HI, K L, MÓ N, P, O, RS, T, V We Y; X4Aé R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, G, HH L K L MN, Q,R,T, V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, H, |, K, L, M, N, P, Q, RS, T, V, We Y; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, H L K, L MÓ. N, P, Q, RS, T,V, We Y; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HLKL M.N,P,Q,
R,S,T,V,WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H,I,LeR.
[0450] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1077) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de l,/ Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH IL, K MÓ. N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH Il K L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; XAÉé R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LK L M.N,P,Q, R,S,T,V,WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de E, F, K, M, N, P, OQ, RS e W; X7 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, G, 6 |, K L, MÓ N, P, O, RS, T, V, We Y; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH , K, LL MÓ, N, PR, OQ, RS, T,V, WeY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, Le R.
[0451] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1078) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH Il, K M N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, H | K L, MÓ N, P, Q, RS, T, V, We Y; X4Aé R X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LK L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, K L,M,N,P, Q,R,S,T,V, WeY; X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, F, G, L, M, P, Q, Ve W; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, FE, G, HH L K L MÓ. N,P, Q,R,S,T,V, W eY;eX9é um aminoácido selecionado a partir de A, G, Hs |, Le R.
[0452] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1079) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de |, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HI, K MÓ. N,P, Q, S,T, W e Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, H K,L, M, P, Q, S, T, V, We Y; X3 é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, E, G, HH LIL K L, MÓ N, P, O, RS, T, V We Y; XAé R; X5 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, E, G, HH LK L MN,P,Q, R,S,T,V, WeY;X6é um aminoácido selecionado a partir de A, D, E, F, HI, K LM,N,P,Q,R,S,T,V, WeY;X7 é um aminoácido seleci- onado a partir de A, D, E, FE, G, H , K L MÓ N, P, Q,R,S, T,V,WeY; X8 é um aminoácido selecionado a partir de A, D,/ E, FE, G, L K N, Te W; e X9 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H |, Le R.
[0453] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1080) em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de Il, Te Y; X11 é S; X1 é um ami- noácido selecionado a partir de A, G, |, P, Q, Se Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de Kou T; X3 é G; X46 R X5é S; XGé A; XT é um aminoácido selecionado a partir de H, | e V; X8 é um aminoácido sele- cionado a partir de H, Ve Y; e X9 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, HI, LeR.
[0454] A sequência a seguir também pode ser usada como uma se- quência de clivagem pela protease: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 1081)
em que X1 a X 11 representam, cada um, um único aminoácido, X10 é um aminoácido selecionado a partir de / Te Y, XIT é ss XT é Y; X2 é um aminoácido selecionado a partir de S e T; X8 é G; X4é R X5éS; X6 é um aminoácido selecionado a partir de A e E; X7 é um aminoácido selecionado a partir de N e V; X8 é um aminoácido selecionado a partir de H, P, Ve Y; e X9 é um aminoácido selecionado a partir de A, G, H, |, LeR.
[0455] Além de usar as sequências de clivagem pela protease su- pracitadas, novas sequências de clivagem pela protease também po- dem ser obtidas por meio de triagem. Por exemplo, com base no resul- tado da análise da estrutura cristalina de uma sequência de clivagem pela protease conhecida, novas sequências de clivagem pela protease podem ser exploradas ao alterar a interação de resíduos ativos/resíduos de reconhecimento da sequência de clivagem e enzimática. Novas se- quências de clivagem pela protease também podem ser exploradas ao alterar aminoácidos em uma sequência de clivagem pela protease co- nhecida e examinar a interação entre a sequência alterada e a pro- tease. Como outro exemplo, as sequências de clivagem pela protease podem ser exploradas ao examinar a interação da protease com uma biblioteca de peptídeos visualizados usando um método de visualização in vitro, tal como visualização em fagos e visualização em ribossomos ou com uma matriz de peptídeos imobilizados em um chip ou esferas.
[0456] A interação entre uma sequência de clivagem pela protease e uma protease pode ser examinada ao testar a clivagem da sequência pela protease in vitro ou in vivo.
[0457] Os fragmentos clivados após o tratamento com protease po- dem ser separados por meio de eletroforese, tal como SDS-PAGE, e quantificados para avaliar a sequência de clivagem pela protease, a ati- vidade da protease e a proporção de clivagem de uma molécula na qual a sequência de clivagem pela protease foi introduzida. Uma modalidade não limitativa do método de avaliação da taxa de clivagem de uma mo- lécula na qual uma sequência de clivagem pela protease foi introduzida inclui o método a seguir: por exemplo, quando a taxa de clivagem de uma variante de anticorpo na qual uma sequência de clivagem pela pro- tease foi introduzida é avaliada usando o ativador recombinante de u- plasminogênio humano/uroquinase (UPA humano, huPA) (R&D Sys- tems; 1310-SE-010) ou o domínio catalítico recombinante humano de Matriptase/ST14 humano (MT-SP1 humano, hMT-SP1) (R&D Systems; 3946-SE-010), 100 ug/mL da variante de anticorpo são reagidos com huPA a 40 nM ou hMT-SP1 a 3 nM em PBS a 37 ºC durante uma hora e depois submetidos a um imunoensaio de eletroforese capilar. O imu- noensaio de eletroforese capilar pode ser realizado usando Wes (Pro- tein Simple), porém, o presente método não está limitado ao mesmo. Como uma alternativa ao imunoensaio de eletroforese capilar, SDS-PAGE e outros podem ser realizados para separação, seguido pela detecção com transferência de Western. O presente método não está limitado a estes métodos. Antes e após a clivagem, a cadeia leve pode ser detectada usando o anticorpo marcado com HRP anti-cadeia lambda humana (abcam; ab9007), mas qualquer anticorpo que possa detectar fragmentos de clivagem pode ser usado. A área de cada pico obtido após o tratamento com protease é produzida usando o software Wes (Compass for SW; Protein Simple) e a taxa de clivagem (%) da variante de anticorpo pode ser determinada com a seguinte fórmula: (Área de pico da cadeia leve clivada) x 100/(Área de pico da cadeia leve clivada + Área de pico da cadeia leve não clivada)
[0458] As proporções de clivagem podem ser determinadas se fra- gmentos de proteína forem detectáveis antes e após o tratamento com protease. As proporções de clivagem podem ser determinadas não ape- nas para variantes de anticorpos, mas também para várias moléculas de proteína nas quais uma sequência de clivagem pela protease foi in- troduzida.
[0459] A proporção de clivagem in vivo de uma molécula na qual uma sequência de clivagem pela protease foi introduzida pode ser de- terminada ao administrar a molécula em animais e detectar a molécula administrada em amostras de sangue. Por exemplo, uma variante de anticorpo na qual foi introduzida uma sequência de clivagem pela pro- tease é administrada a camundongos e o plasma é coletado de suas amostras de sangue. O anticorpo é purificado do plasma de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica usando Dyna- beads Protein A (Thermo; 10001D) e, em seguida, submetido a um imu- noensaio de eletroforese capilar para avaliar a proporção de clivagem pela protease da variante de anticorpo. O imunoensaio de eletroforese capilar pode ser realizado usando Wes (Protein Simple), porém, o pre- sente método não está limitado ao mesmo. Como uma alternativa ao imunoensaio de eletroforese capilar, SDS-PAGE e outros podem ser re- alizados para a separação, seguido pela detecção com transferência de Western. O presente método não está limitado a estes métodos. A ca- deia leve da variante de anticorpo coletada de camundongos pode ser detectada usando o anticorpo marcado com HRP anti-cadeia lambda humana (abcam; ab9007), mas qualquer anticorpo que possa detectar fragmentos de clivagem pode ser usado. Uma vez que a área de cada pico obtido pelo imunoensaio de eletroforese capilar é gerada usando o software Wes (Compass for SW; Protein Simple), a proporção da cadeia leve restante pode ser calculada como [Área de pico da cadeia level/fÁrea de pico de cadeia pesada] para determinar a proporção de cadeia leve completa que permanece não clivada no corpo de camun- dongo. A eficiência in vivo da clivagem pode ser determinada se frag- mentos de proteínas coletados de um organismo vivo forem detectá- veis. As proporções de clivagem podem ser determinadas não apenas para variantes de anticorpos, mas também para várias moléculas de proteína nas quais uma sequência de clivagem pela protease foi intro- duzida. O cálculo das proporções de clivagem por meio dos métodos supracitados permite, por exemplo, a comparação das proporções de clivagem in vivo de variantes de anticorpo nas quais diferentes sequên- cias de clivagem foram introduzidas e comparação da proporção de cli- vagem de uma única variante de anticorpo entre diferentes modelos ani- mais, tal como um modelo de camundongo normal e um modelo de ca- mundongo com tumor enxertado.
[0460] Por exemplo, as sequências de clivagem pela protease mos- tradas na Tabela 1 foram todas recentemente descobertas pelos pre- sentes inventores. Os polipeptídeos que contêm estas sequências de clivagem pela protease são todos úteis como substratos de protease que são hidrolisados pela ação das proteases. Assim, a presente inven- ção fornece substratos de protease que compreendem uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 833-852 e 1062-1081 e as sequên- cias listadas na Tabela 1. Os substratos de protease da presente inven- ção podem ser usados, por exemplo, como uma biblioteca a partir da qual um que tem propriedades que atendem ao objetivo pode ser sele- cionado para ser incorporado em um polipeptídeo da presente inven- ção. Especificamente, para clivar o polipeptídeo da presente invenção seletivamente por uma protease localizada na lesão, os substratos po- dem ser avaliados quanto à sensibilidade a esta protease. Quando um polipeptídeo da presente invenção é administrado in vivo, a molécula pode contatar várias proteases antes de atingir a lesão. Portanto, a mo- lécula deve, de preferência, ter sensibilidade à protease localizada na lesão e também a maior resistência possível a outras proteases. Para selecionar uma sequência de clivagem pela protease desejada, depen- dendo da finalidade, cada substrato de protease pode ser analisado an- tecipadamente quanto à sensibilidade a várias proteases de maneira abrangente para descobrir sua resistência à protease. Com base nos espectros de resistência à protease obtidos, é possível encontrar uma sequência de clivagem pela protease com sensibilidade e resistência necessárias.
[0461] Alternativamente, um polipeptídeo no qual uma sequência de clivagem pela protease foi incorporada sofre não apenas ações enzimá- ticas pelas proteases, mas também vários estresses ambientais, tais como alterações de pH, temperatura e estresse oxidativo/redutor, antes de atingir a lesão. Com base nas informações comparativas sobre re- sistência a estes fatores externos entre os substratos da protease, a sequência de clivagem pela protease com propriedades desejadas pode ser selecionada.
[0462] Em uma modalidade da presente invenção, um ligante flexi- vel também está ligado a uma extremidade ou ambas as extremidades de uma sequência de clivagem pela protease. O ligante flexível em uma extremidade de uma sequência de clivagem pela protease pode ser de- nominado como um primeiro ligante flexível e o ligante flexível na outra extremidade pode ser denominado como um segundo ligante flexível. Em uma modalidade particular, uma sequência de clivagem pela pro- tease e o ligante flexível têm qualquer uma das fórmulas a seguir: (sequência de clivagem pela protease), (primeiro ligante flexível)-(sequência de clivagem pela protease) (sequência de clivagem pela protease)-(segundo ligante flexível), e (primeiro ligante flexível)-(sequência de clivagem pela protease)-(se- gundo ligante flexível).
[0463] O ligante flexível de acordo com a presente modalidade é, de preferência, um ligante peptídico. O primeiro ligante flexível e o se- gundo ligante flexível existem, cada um, independente e arbitrariamente e são ligantes flexíveis idênticos ou diferentes, cada um contendo pelo menos um aminoácido flexível (Gly, etc.). O ligante flexível contém, por exemplo, um número suficiente de resíduos (aminoácidos arbitraria- mente selecionados a partir de Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys, Gly, Ser, Asp, Asn, Ala, etc., particularmente Gly, Ser, Asp, Asn e Ala, em particular Gly e Ser, especialmente Gly, etc.) para uma sequência de clivagem pela protease para obter a aces- sibilidade de protease desejada.
[0464] O ligante flexível adequado para uso em ambas as extremi- dades de uma sequência de clivagem pela protease é, em geral, um ligante flexível que melhora o acesso da protease a uma sequência de clivagem pela protease e eleva a eficiência de clivagem da protease. Um ligante flexível adequado pode ser facilmente selecionado e pode, de preferência, ser selecionado dentro de diferentes comprimentos, tais como 1 aminoácido (Gly, etc.) a 20 aminoácidos, 2 aminoácidos a 15 aminoácidos ou 3 aminoácidos a 12 aminoácidos incluindo 4 aminoáci- dos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos. Em algumas mo- dalidades da presente invenção, o ligante flexível é um ligante peptídico de 1 a 7 aminoácidos.
[0465] Exemplos do ligante flexível incluem, porém sem limitações, polímeros de glicerina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS: SEQ ID NO: 27)n e (GGGS: SEQ ID NO: 28)n, em que n é um número inteiro de pelo menos 1), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina e outros ligantes flexíveis bem conhecidos em técnicas convencionais.
[0466] Dentre eles, polímeros de glicina e glicina-serina estão rece- bendo atenção, uma vez que estes aminoácidos são relativamente não estruturados e funcionam facilmente como amarras neutras entre os componentes.
[0467] Exemplos do ligante flexível que consiste no polímero de gli- cina-serina incluem, porém sem limitações:
Ser
Gly-Ser (GS)
Ser-Gly (SG)
Gly-Gly-Ser (GGS)
Gly-Ser-Gly (GSG)
Ser-Gly-Gly (SGG)
Gly-Ser-Ser (GSS)
Ser-Ser-Gly (SSG)
Ser-Gly-Ser (SGS)
Gly-Gly-Gly-Ser (GGGS, SEQ ID NO: 28)
Gly-Gly-Ser-Gly (GGSG, SEQ ID NO: 29)
Gly-Ser-Gly-Gly (GSGG, SEQ ID NO: 46)
Ser-Gly-Gly-Gly (SGGG, SEQ ID NO: 47)
Gly-Ser-Ser-Gly (GSSG, SEQ ID NO: 48)
Gly-Gly-GIy-GlIy-Ser (GGGGS, SEQ ID NO: 49)
Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (GGGSG, SEQ ID NO: 33)
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (GGSGG, SEQ ID NO: 30)
Gly-Ser-Gly-Gly-GIly (GSGGG, SEQ ID NO: 32)
Gly-Ser-Gly-Gly-Ser (G&SGGS, SEQ ID NO: 27)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SGGGG, SEQ ID NO: 51)
Gly-Ser-Ser-Gly-Gly (GSSGG, SEQ ID NO: 52)
Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (GSGSG, SEQ ID NO: 31)
Ser-Gly-Gly-Ser-Gly (SGGSG, SEQ ID NO: 53)
Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (GSSSG, SEQ ID NO: 34)
Gly-Gly-Gly-Gly.Gly-Ser (GGGGGS, SEQ ID NO: 50)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-GIly (SGGGGG, SEQ ID NO: 54)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGGGS, SEQ ID NO: 55)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SSGGGGG, SEQ ID NO: 56)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS, SEQ ID NO: 49))n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SGGGG, SEQ ID NO: 51))n.
[0468] No presente relatório descritivo, a "associação" pode se re- ferir, por exemplo, a um estado onde duas ou mais regiões polipeptídi- cas interagem entre si. Em geral, uma ligação hidrofóbica, uma ligação de hidrogênio, uma ligação iônica ou similar é formada entre as regiões polipeptídicas pretendidas para formar um produto da associação. Como um exemplo de produto da associação comum, sabe-se que um anticorpo tipificado por um anticorpo nativo retém uma estrutura pare- ada de uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL) através de uma ligação não covalente ou similar entre elas.
[0469] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio inibidor da porção transportadora está associado com o domínio de li- gação a antígeno. O domínio inibidor pode constituir uma parte da por- ção transportadora ou pode constituir a totalidade da porção transporta- dora. A partir de outro ponto de vista, o domínio inibidor também pode ser definido como uma porção que está associada com o domínio de ligação a antígeno na porção transportadora.
[0470] Em uma modalidade mais específica, o domínio de ligação a antígeno que é um anticorpo com um único domínio e o domínio de li- gação que é umaa VL, VH ou VHH formam uma associação, conforme encontrado entre a VH de anticorpo e a VL de anticorpo. Em uma outra modalidade específica, o domínio de ligação a antígeno que é um anti- corpo com um único domínio e o domínio inibidor que é uma VL, VH ou VHH formam uma associação conforme encontrado entre a VH de anti- corpo e a VL de anticorpo e, em um estado da associação assim for- mado, o domínio inibidor inibe conformacionalmente a ligação do domí- nio de ligação a antígeno ao antígeno ou muda conformacionalmente o sítio de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domí- nio seja inibida pela VL, pela VH ou pela VHH. Em uma modalidade que usa a VHH como o anticorpo com um único domínio, considera-se que a ligação da VHH ao antígeno é conformacionalmente inibida pelo do- mínio inibidor quando CDR3, um importante sítio de ligação a antígeno da VHH ou seu sítio próximo existe na interface de associação com o domínio inibidor.
[0471] A associação do domínio de ligação a antígeno com o domí- nio inibidor pode ser cancelada, por exemplo, pela clivagem do sítio de clivagem. O cancelamento da associação pode ser usado alternada- mente, por exemplo, com o cancelamento do estado onde duas ou mais regiões polipeptídicas interagem entre si. A interação entre as duas ou mais regiões polipeptídicas pode ser totalmente cancelada ou a intera- ção entre as duas ou mais regiões polipeptídicas pode ser parcialmente cancelada.
[0472] No presente relatório descritivo, "interface" refere-se, em ge- ral, à face na qual duas regiões se associam ou interagem entre si. Re- síduos de aminoácido que formam a interface são, em geral, um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos contidos em cada região poli- peptídica sujeita à associação e, mais preferivelmente, refere-se aos re- síduos de aminoácido que se aproximam uns dos outros na associação e participam na interação. Especificamente, a interação inclui ligações não covalentes tal como uma ligação de hidrogênio, interação eletros- tática ou formação em ponte de sal entre os resíduos de aminoácidos que se aproximam uns dos outros na associação.
[0473] No presente relatório descritivo, "resíduos de aminoácido que formam a interface" refere-se especificamente aos resíduos de ami- noácido contidos nas regiões polipeptídicas que constituem a interface. Como um exemplo, as regiões polipeptídicas que constituem a interface refere-se às regiões polipeptídicas responsáveis pela inibição seletiva intramolecular ou intermolecular em anticorpos, ligantes, receptores, substratos, etc. Exemplos específicos de tais regiões polipeptídicas em anticorpos podem incluir regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve. Em algumas modalidades da presente inven- ção, exemplos de tais regiões polipeptídicas podem incluir domínios de ligação a antígeno e domínios inibidores.
[0474] Exemplos dos resíduos de aminoácidos que formam a inter- face incluem, porém sem limitações, resíduos de aminoácidos que se aproximam uns dos outros na associação. Os resíduos de aminoácidos que se aproximam uns dos outros na associação podem ser encontra- dos, por exemplo, ao analisar as conformações de polipeptídeos e exa- minar as sequências de aminoácidos de regiões polipeptídicas que for- mam a interface quando de associação dos polipeptídeos.
[0475] Em algumas modalidades da presente invenção, (um) resí- duo(s) de aminoácido envolvido(s) na associação no domínio de ligação a antígeno ou (um) resíduo(s) de aminoácido envolvido(s) na associa- ção no domínio de ligação pode(m) ser alterado(s) a fim de promover a associação do domínio de ligação a antígeno com o domínio inibidor. Em uma outra modalidade específica, (um) resíduo(s) de aminoácido que forma(m) a interface com o domínio inibidor no domínio de ligação a antígeno ou (um) resíduo(s) de aminoácido que forma(m) a interface com o domínio de ligação a antígeno no domínio de ligação pode(m) ser alterado(s). Em uma modalidade preferida, o(s) resíduo(s) de aminoá- cido que forma(m) a interface pode(m) ser alterado(s) por meio de um método de introdução de (uma) mutação(ões) na interface de resíduo de aminoácido, de modo que dois ou mais resíduos de aminoácido que formam a interface tenham diferentes cargas. A alteração do(s) resí- duo(s) de aminoácido para resultar em diferentes cargas inclui a altera- ção de (um) resíduo(s) de aminoácido positivamente carregado(s) por
(um) resíduo(s) de aminoácido negativamente carregado(s) ou (um) re- síduo(s) de aminoácido não carregado(s), a alteração de (um) resí- duo(s) de aminoácido negativamente carregado(s) por (um) resíduo(s) de aminoácido positivamente carregado(s) ou (um) resíduo(s) de ami- noácido não carregado(s) e a alteração de (um) resíduo(s) de aminoá- cido não carregado(s) por (um) resíduo(s) de aminoácido positiva ou negativamente carregado(s). Tal alteração de aminoácido é realizada com a finalidade de promover a associação e não está limitada pela po- sição da alteração de aminoácido ou o tipo do aminoácido, contanto que a finalidade de promoção da associação possa ser obtida. Exemplos da alteração incluem, porém sem limitações, substituição.
[0476] Em algumas modalidades da presente invenção, a VÓHH que serve como o domínio de ligação a antígeno está associada com a VL que serve como o domínio de ligação. O resíduo de aminoácido envol- vido na associação com a VL na VHH pode se referir, por exemplo, a um resíduo de aminoácido que forma a interface entre a VHH e a VL. Exemplos do resíduo de aminoácido envolvido na associação com a VL na VHH incluem, porém sem limitações, resíduos de aminoácido nas posições 37, 44, 45 e 47 (J. Mol. Biol. (2005) 350, 112-125). A atividade da VHH é inibida ao promover a associação entre a VHH e a VL. Igual- mente, o resíduo de aminoácido envolvido na associação com a VHH na VL pode se referir, por exemplo, a um resíduo de aminoácido que forma a interface entre a VHH e a VL.
[0477] Um resíduo de aminoácido envolvido na associação com a VL na VHH pode ser alterado a fim de promover a associação entre a VHH e a VL. Exemplos de tal substituição de aminoácido incluem, po- rém sem limitações, F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, LA7W, T47W e/ou S47W. Ao invés de alterar cada resíduo na VHH, a VHH que tem originalmente um resíduo de aminoácido 37V, 44G, 45L e/ou 47W também pode ser usada.
[0478] Ao invés do aminoácido da VHH, um resíduo de aminoácido envolvido na associação com a VHH na VL pode ser alterado e a alte- ração de aminoácido também pode ser introduzida tanto na VHH quanto na VL, contanto que a finalidade de promover a associação entre a VHH e a VL possa ser obtida.
[0479] Em algumas modalidades alternativas da presente invenção, o domínio de ligação a antígeno e o domínio inibidor podem ser associ- ados entre si usando a VHH como o domínio de ligação a antígeno e usando a VH ou a VHH como o domínio inibidor. Um resíduo de amino- ácido envolvido na associação com a VH ou a VHH que serve como o domínio inibidor na VHH que serve como o domínio de ligação a antí- geno pode ser identificado e alterado a fim de promover a associação na VHH com domínio de ligação a antígeno com a VH ou VHH com domínio inibidor. Além disso, resíduos de aminoácidos envolvidos na associação com a VHH que serve como o domínio de ligação a antígeno na VH ou a VHH que serve como o domínio inibidor podem ser identifi- cados e alterados.
[0480] No caso do uso de um anticorpo com um único domínio dife- rente da VHH como o domínio de ligação a antígeno, resíduos de ami- noácidos envolvidos na associação no domínio de ligação a antígeno ou o domínio inibidor também podem ser identificados e alterados do mesmo modo conforme acima.
[0481] Em algumas modalidades da presente invenção, a porção transportadora e o domínio de ligação a antígeno são fundidos por meio de um ligante. Em uma modalidade mais específica, a porção transpor- tadora e o domínio de ligação a antígeno são fundidos por meio de um ligante que contém um sítio de clivagem. Em uma modalidade especí- fica alternativa, a porção transportadora e o domínio de ligação a antí- geno são fundidos por meio de um ligante e a proteína de fusão assim formada contém um sítio de clivagem.
[0482] Em outra modalidade da presente invenção, a porção trans- portadora e o domínio de ligação a antígeno são fundidos sem um |i- gante. Em uma modalidade mais específica, uma ligação amino é for- mada entre o aminoácido N-terminal da porção transportadora e o ami- noácido C-terminal do domínio de ligação a antígeno para formar uma proteína de fusão. A proteína de fusão formada contém um sítio de cli- vagem. Em uma modalidade particular, um a diversos aminoácidos N- terminais da porção transportadora e/ou um a diversos aminoácidos C- terminais do domínio de ligação a antígeno são alterados e o N-término da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antí- geno são fundidos para formar um sítio de clivagem próximo à posição de fusão. Mais especificamente, o sítio de clivagem pode ser formado, por exemplo, ao converter quatro aminoácidos C-terminais do domínio de ligação a antígeno em uma sequência LSGR e converter quatro ami- noácidos N-terminais da porção transportadora em uma sequência SDNH.
[0483] Em algumas modalidades da presente invenção, o sítio de clivagem do polipeptídeo que compreende uma porção transportadora e um domínio de ligação a antígeno compreende uma sequência de cli- vagem pela protease. Uma sequência de clivagem pela protease pode ser colocada em qualquer posição no polipeptídeo, contanto que o do- mínio de ligação a antígeno seja liberado através de clivagem pela pro- tease e não perca sua atividade de ligação a antígeno após a liberação.
[0484] Em algumas modalidades da presente invenção, a porção transportadora compreende uma região constante de anticorpo e o N- término da região constante de anticorpo e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos por meio de um ligante ou sem um li- gante.
[0485] Em uma modalidade particular, uma sequência de clivagem pela protease está localizada dentro da região constante de anticorpo contida na porção transportadora. Neste caso, uma sequência de cliva- gem pela protease pode estar localizada dentro da região constante de anticorpo de modo que o domínio de ligação a antígeno seja liberado através de clivagem pela protease. Em uma modalidade específica, uma sequência de clivagem pela protease está localizada dentro de uma re- gião constante de cadeia pesada de anticorpo contida na porção trans- portadora e, mais especificamente, localizado na região constante da cadeia pesada de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 140 (numeração EU), de preferência na região constante de cadeia pesada de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 122 (numeração EU). Em uma modalidade específica alter- nativa, uma sequência de clivagem pela protease está localizada dentro de uma região constante de cadeia leve de anticorpo contida na porção transportadora e, mais especificamente, localizada na região constante de cadeia leve de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 130 (numeração EU) (po- sição 130 na numeração de Kabat), de preferência na região constante de cadeia leve de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na posição 113 (numeração EU) (po- sição 113 na numeração de Kabat).
[0486] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio e o C-tér- mino do anticorpo com um único domínio e o N-término da porção trans- portadora são fundidos por meio de um ligante ou sem um ligante.
[0487] Em uma modalidade particular, uma sequência de clivagem pela protease está localizada dentro do anticorpo com um único domí- nio. Em uma modalidade mais específica, o anticorpo com um único do- mínio é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VH ou VHH e uma sequência de clivagem pela protease está localizada no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da porção trans- portadora, depois do aminoácido na posição 35b (numeração de Kabat), de preferência no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da porção transportadora depois do aminoácido na posição 95 (nume- ração de Kabat), mais preferivelmente no anticorpo com um único do- mínio no lado mais próximo da porção transportadora depois do amino- ácido na posição 109 (numeração de Kabat). Em uma modalidade es- pecífica alternativa, o anticorpo com um único domínio é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VL e uma sequência de clivagem pela protease está localizada no anticorpo com um único do- mínio no lado mais próximo da porção transportadora depois do amino- ácido na posição 32 (numeração de Kabat), de preferência no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da porção transportadora depois do aminoácido na posição 91 (numeração de Kabat), mais pre- ferivelmente no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da porção transportadora depois do aminoácido na posição 104 (nume- ração de Kabat).
[0488] Em algumas modalidades da presente invenção, a porção transportadora compreende uma região constante de anticorpo, o domí- nio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio e a região constante de anticorpo e o anticorpo com um único domínio são fundidos por meio de um ligante ou sem um ligante. Em uma modalidade mais específica, o N-término da região constante de anticorpo e o C- término do anticorpo com um único domínio são fundidos por meio de um ligante ou sem um ligante. Em uma modalidade específica alterna- tiva, o C-término da região constante de anticorpo e o N-término do an- ticorpo com um único domínio são fundidos por meio de um ligante ou sem um ligante.
[0489] Em uma modalidade particular, uma sequência de clivagem pela protease está localizada dentro da região constante de anticorpo contida na porção transportadora. Em uma modalidade mais específica, uma sequência de clivagem pela protease está localizada em uma re- gião constante de cadeia pesada de anticorpo no lado mais próximo do domínio depois do aminoácido na posição 140 (numeração EU), de pre- ferência em uma região constante de cadeia pesada de anticorpo no lado mais próximo do anticorpo com um único domínio depois do ami- noácido na posição 122 (numeração EU). Em uma modalidade especií- fica alternativa, uma sequência de clivagem pela protease está locali- zada em uma região constante de cadeia leve de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoácido na po- sição 130 (numeração EU) (posição 130 na numeração de Kabat), de preferência em uma região constante de cadeia leve de anticorpo no lado mais próximo do domínio de ligação a antígeno depois do aminoá- cido na posição 113 (numeração EU) (posição 113 na numeração de Kabat).
[0490] Em uma modalidade particular, uma sequência de clivagem pela protease está localizada dentro do anticorpo com um único domí- nio. Em uma modalidade mais específica, o anticorpo com um único do- mínio é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VM ou a partir de VHH e a sequência de clivagem pela protease está loca- lizada no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da re- gião constante do anticorpo depois do aminoácido na posição 35b (nu- meração de Kabat), de preferência no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da região constante do anticorpo depois do ami- noácido na posição 95 (numeração de Kabat), mais preferivelmente no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da região cons- tante do anticorpo depois do aminoácido na posição 109 (numeração de Kabat). Em uma modalidade específica alternativa, o anticorpo com um único domínio é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VL e uma sequência de clivagem pela protease está localizada no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da região cons- tante do anticorpo depois do aminoácido na posição 32 (numeração de Kabat), de preferência no anticorpo com um único domínio no lado mais próximo da região constante do anticorpo depois do aminoácido na po- sição 91 (numeração de Kabat), mais preferivelmente ao lado da região constante do anticorpo depois do aminoácido na posição 104 (numera- ção de Kabat).
[0491] Em uma modalidade particular, uma sequência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite entre o domínio de liga- ção a antígeno e a porção transportadora. A frase "próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a porção transportadora" refere- se a uma porção que reside a jusante ou a montante do sítio de ligação entre o domínio de ligação a antígeno e a porção transportadora e não influencia grandemente a estrutura secundária do domínio de ligação a antígeno.
[0492] Em uma modalidade mais específica, o domínio de ligação a antígeno é ligado à região constante de anticorpo contida na porção transportadora e uma sequência de clivagem pela protease está locali- zada próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a região constante de anticorpo. A frase "próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a região constante de anticorpo" pode se referir a próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e uma região constante de cadeia pesada de anticorpo ou próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e uma região constante de cadeia leve de anticorpo. Quando o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VH ou VHH e está conec- tado a uma região constante de cadeia pesada de anticorpo, a frase "próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a região cons- tante de anticorpo" pode se referir a entre o aminoácido na posição 101
(numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio e o aminoá- cido na posição 140 (numeração EU) da região constante de cadeia pe- sada de anticorpo e pode, de preferência, se referir a entre o aminoácido na posição 109 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único do- mínio e o aminoácido na posição 122 (numeração EU) da região cons- tante de cadeia pesada de anticorpo. Quando o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VH ou VHH e está conectado a uma região constante de cadeia leve de anticorpo, a frase "próximo do limite entre o domínio de ligação a antí- geno e a região constante de cadeia leve de anticorpo" pode se referir a entre o aminoácido na posição 101 (numeração de Kabat) do anti- corpo com um único domínio e o aminoácido na posição 130 (numera- ção EU) (posição 130 de numeração de Kabat) da região constante de cadeia leve de anticorpo e pode, de preferência, se referir a entre o ami- noácido na posição 109 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio e o aminoácido na posição 113 (numeração EU) (posição 113 na numeração de Kabat) da região constante de cadeia leve de an- ticorpo. Quando o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo com um único domínio preparado a partir de VL, a frase "próximo do limite entre o domínio de ligação a antígeno e a região constante de anticorpo" refere-se a entre o aminoácido na posição 96 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio e a posição prescrita da região cons- tante de anticorpo, de preferência entre o aminoácido na posição 104 (numeração de Kabat) do anticorpo com um único domínio e a posição prescrita da região constante de anticorpo.
[0493] Em algumas modalidades da presente invenção, o polipeptí- deo é uma molécula similar a anticorpo IgG. Exemplos de tais modali- dades incluem, porém sem limitações: uma modalidade na qual a por- ção transportadora compreende uma região constante de anticorpo IgG,
um anticorpo com um único domínio que serve como o domínio de liga- ção a antígeno que toma o lugar da VH de um anticorpo IgG e a ativi- dade de ligação a antígeno é inibida pela VL; uma modalidade na qual a porção transportadora compreende uma região constante de anti- corpo IgG, um anticorpo com um único domínio que serve como o do- mínio de ligação a antígeno toma o lugar da VL de um anticorpo IgG e a atividade de ligação a antígeno é inibida pela VH; e uma modalidade na qual a porção transportadora compreende uma região constante de anticorpo IgG, um anticorpo com um único domínio que serve como o domínio de ligação a antígeno toma o lugar da VH e da VL de um anti- corpo IgG e um anticorpo adicional com um único domínio inibe a ativi- dade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno que toma o lugar do outro domínio do anticorpo IgG.
[0494] O termo "molécula similar a anticorpo IgG" usado no pre- sente relatório descritivo é usado para definir uma molécula que tem porções substancialmente similares, quanto à estrutura, aos domínios constantes ou regiões constantes conforme em um anticorpo IgG e por- ções substancialmente similares, quanto à estrutura, aos domínios vari- áveis ou regiões variáveis conforme no anticorpo IgG e que tem uma conformação substancialmente similar àquela do anticorpo IgG. Na mo- lécula similar a anticorpo IgG, o domínio CH1 similar a anticorpo e o domínio CL similar a podem ser usados de forma alternada; isto é, con- tanto que uma interação similar à interação entre CH1 e CL de um anti- corpo IgG esteja presente entre os domínios, os domínios ligados à por- ção similar à região de dobradiça do anticorpo podem ser um domínio CH1 de anticorpo ou um domínio CL de anticorpo. Entretanto, no pre- sente relatório descritivo, a "molécula similar a anticorpo IgG" pode ou não exercer atividade de ligação a antígeno, ao mesmo tempo em que retém as estruturas similares àquelas do anticorpo IgG.
[0495] O polipeptídeo pode compreender um ou uma pluralidade domínios de ligação a antígeno. Um ou uma pluralidade domínios de inibição pode inibir a atividade de ligação a antígeno de uma pluralidade de domínios de ligação a antígeno. Uma pluralidade de domínios de li- gação a antígeno pode, cada uma, ser associada com o domínio inibi- dor. Uma pluralidade de domínios de ligação a antígeno pode, cada uma, ser fundida com a porção transportadora. Uma pluralidade de do- mínios de ligação a antígeno pode, cada uma, ser capaz de ser liberada do polipeptídeo. O(s) sítio(s) de clivagem para liberação de uma plurali- dade de domínios de ligação a antígeno pode(m) ser uma pluralidade de sítios de clivagem que correspondem a diversos domínios de ligação a antígeno.
[0496] Quando o polipeptídeo é uma molécula similar a anticorpo IgG, domínios de ligação a antígeno podem, respectivamente, ser esta- belecidos em porções que correspondem a duas regiões variáveis do anticorpo IgG, conforme mostrado na Figura 7. Tal modalidade será compreensível por aqueles versados na técnica com referência à pre- sente invenção. Os domínios de ligação a antígeno incorporados em ambos os braços podem ter a mesma especificidade de ligação a antí- geno ou podem diferir quanto às especificidades de ligação a antígeno. Tal modalidade será compreensível por aqueles versados na técnica com referência à presente invenção. É óbvio que estas modalidades são incluídas no escopo da presente invenção.
[0497] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de ligação a antígeno também está ligado a um segundo domínio de ligação a antígeno. Exemplos do segundo domínio de ligação a antígeno incluem, porém sem limitações, anticorpos com um único domínio, fra- gmentos de anticorpo, um modulo denominado um domínio de aproxi- madamente 35 aminoácidos contido em um avímero de proteína da membrana celular in vivo (documentos WOZ2004/044011 e WOZ2005/040229), adnectina que contém um domínio 10Fn3 que serve como um domínio de ligação à proteína derivado de uma fibronectina de glicoproteíina expresso em membranas celulares (documento WO2002/032925), Affibody que contém um andaime de domínio de li- gação de IgG que constitui um feixe de três hélices composto de 58 aminoácidos de proteína A (documento WO1995/001937), DARPins (proteínas de repetição de anquirina) que são regiões expostas na su- perfície molecular de repetições de anquirina (AR), cada uma tendo uma estrutura de 33 resíduos de aminoácidos dobrada em uma subunidade de uma volta, duas hélices antiparalelas e uma alça (documento WO?2002/020565), anticalina que tem quatro regiões alça que conectam oito fitas antiparalelas dobradas em direção ao eixo central em uma ex- tremidade de uma estrutura de barril altamente conservada em molécu- las de lipocalina, tal como lipocalina associada à neutrófilo gelatinase (NGAL) (documento WO2003/029462) e uma região deprimida na es- trutura de folha paralela interna de uma dobra em forma de ferradura composta de módulos de repetição ricos em leucina repetidos (LRR) de um receptor de linfócitos variável isento de estrutura de imunoglobulina (VLR), conforme observado nos sistemas imunes adquiridos de verte- brados sem maxilas, tais como lampreia ou peixe-bruxa (documento WOZ2008/016854). Em uma modalidade preferida, o segundo domínio de ligação a antígeno tem uma especificidade de ligação a antígeno di- ferente daquela do domínio de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, o peso molecular do domínio de ligação a antígeno e do se- gundo domínio de ligação a antígeno ligado é de 60 kDa ou menos.
[0498] Em algumas modalidades mais específicas, o domínio de |i- gação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno são anti- corpos com um único domínio que diferem quanto às especificidades de ligação a antígeno, o domínio de ligação a antígeno e o segundo domí- nio de ligação a antígeno ligado são capazes de ser liberados do poli- peptídeo e o domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno formam uma molécula de ligação a antígeno biespe- cífica após liberação. Exemplos de tal molécula de ligação a antígeno incluem, porém sem limitações, uma molécula de ligação a antígeno bi- específica que tem um domínio de ligação a antígeno que se liga espe- cificamente ao antígeno na superfície de célula alvo e um segundo do- mínio de ligação a antígeno que se liga especificamente a um antígeno na superfície de imunócitos, uma molécula de ligação a antígeno bies- pecífica que tem um domínio de ligação a antígeno e um segundo do- mínio de ligação a antígeno que se ligam a diferentes subunidades do mesmo antígeno e uma molécula de ligação a antígeno biespecífica que tem um domínio de ligação a antígeno e um segundo domínio de ligação a antígeno que se ligam a diferentes epítopos no mesmo antígeno. Tal molécula de ligação a antígeno biespecífica pode recrutar imunócitos para a proximidade de células alvo e, assim, é considerada útil no trata- mento de uma doença causada pelas células alvo.
[0499] A atividade de ligação a antígeno do segundo domínio de ligação a antígeno pode ou não ser inibida pela porção transportadora. O segundo domínio de ligação a antígeno pode ou não estar associado com uma estrutura parcial da porção transportadora. Particularmente, quando o domínio de ligação a antígeno e o segundo domínio de ligação a antígeno diferem quanto às especificidades de ligação a antígeno, o domínio de ligação a antígeno em um estado não liberado não pode exercer atividade de ligação a antígeno conforme mostrado, por exem- plo, na Figura 8, mesmo se a atividade de ligação a antígeno do se- gundo domínio de ligação a antígeno não for inibida e mesmo se o se- gundo domínio de ligação a antígeno não estiver associado com uma estrutura parcial da porção transportadora. Esta molécula de ligação a antígeno biespecífica que compreende o domínio de ligação a antígeno ligado ao segundo domínio de ligação a antígeno não pode exercer uma função de se ligar biespecificamente a dois tipos de antígenos.
[0500] A Figura 8 mostra uma forma exemplificativa na qual o domí- nio de ligação a antígeno também está ligado ao segundo domínio de ligação a antígeno.
[0501] No presente relatório descritivo, o termo "especificidade" re- fere-se a uma propriedade pela qual uma das moléculas de ligação es- pecífica não se liga substancialmente a uma molécula diferente de uma ou mais de suas moléculas parceiras de ligação. Este termo também é usado quando o domínio de ligação a antígeno tem especificidade por um epitopo contido em um antígeno particular. O termo também é usado quando o domínio de ligação a antígeno tem especificidade por um epi- topo particular dentre uma pluralidade de epítopos contida em um antí- geno. Neste contexto, o termo "não se liga substancialmente" é deter- minado de acordo com o método descrito na seção sobre atividade de ligação e significa que a atividade de ligação de uma molécula de liga- ção específica a uma molécula diferente do(s) parceiro(s) de ligação é de 80 % ou menos, em geral 50 % ou menos, de preferência 30 % ou menos, particularmente de preferência 15 % ou menos, de sua atividade de ligação a molécula(s) parceira(s) de ligação.
[0502] A presente invenção também refere-se a composições far- macêuticas (fármacos) que compreende o polipeptídeo da presente in- venção e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0503] O "tratamento" (e suas palavras gramaticamente derivadas, por exemplo, "tratar" e "tratando") usado no presente relatório descritivo significa intervenção clínica que se destina a alterar o curso natural de um indivíduo a ser tratado e pode ser realizado tanto para prevenção quanto durante o curso de uma condição patológica clínica. O efeito de- sejável do tratamento inclui, porém sem limitações, prevenção do de- senvolvimento ou recorrência de uma doença, o alívio de sintomas, a atenuação de qualquer influência patológica direta ou indireta da do- ença, a prevenção de metástase, redução na taxa de progressão da doença, recuperação ou alívio de uma condição patológica e prognós- tico melhorado ou atenuado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo da presente invenção é usado para retardar o início de (uma) doença(s) ou retardar a progressão da(s) doença(s).
[0504] Na presente invenção, a composição farmacêutica refere-se, em geral, a um fármaco para o tratamento ou prevenção de uma doença ou para exame ou diagnóstico. Na presente invenção, o termo "compo- sição farmacêutica que compreende o polipeptídeo" pode ser usado al- ternadamente com um "método para o tratamento de uma doença que compreende administrar o polipeptídeo a um indivíduo a ser tratado" e pode ser usado alternadamente com "uso do polipeptídeo para a produ- ção de um fármaco para o tratamento de uma doença". Além disso, o termo "composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo" pode ser usado alternadamente com "uso do polipeptídeo para o tratamento de uma doença".
[0505] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas mediante uso de um método conhecido por aqueles ver- sados na técnica. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser usadas de forma parentérica em uma forma de injeção de uma so- lução ou suspensão estéril com água ou qualquer um de outros líquidos farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas podem ser formuladas, por exemplo, ao combinar apropriadamente o polipeptí- deo com um carreador ou meio farmacologicamente aceitável, especifi- camente água estéril ou solução salina fisiológica, um óleo vegetal, um emulsificante, um agente de suspensão, um tensoativo, um estabili- zante, um agente flavorizante, um excipiente, um veículo, um antissép- tico, um aglutinante, etc. e misturá-los em uma forma de dosagem uni- tária requerida para a prática farmacêutica usualmente aceita. A quan- tidade do ingrediente ativo nestas formulações é estabelecida de modo a fornecer um volume apropriado em uma faixa prescrita.
[0506] Uma composição estéril para injeção pode ser formulada de acordo com prática farmacêutica usual empregando um veículo tal como água destilada injetável. Exemplos da solução aquosa injetável incluem soluções isotônicas que contêm solução salina fisiológica, glicose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e clo- reto de sódio). A solução aquosa pode ser usada em combinação com um solubilizante apropriado, por exemplo, um álcool (etanol, etc.), um poliálcoo! (propileno glicol, polietileno glicol, etc.) ou um tensoativo não iônico (Polissorbato 80(TM), HCO-B50, etc.).
[0507] Exemplos da solução oleosa incluem óleo de gergelim e óleo de soja. A solução oleosa também pode ser usada em combinação com benzoato de benzila e/ou álcool benzílico como um solubilizante. A so- lução oleosa pode ser suplementada com um tampão (por exemplo, uma solução tampão de fosfato e uma solução tampão de acetato de sódio), um agente tranquilizante (por exemplo, cloridrato de procaína), um estabilizante (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e um antioxi- dante. A solução de injeção preparada é, em geral, enchida em uma ampola apropriada.
[0508] A composição farmacêutica da presente invenção é, de pre- ferência, administrada através de uma via parentérica. Por exemplo, a composição que tem uma forma de dosagem para injeção, transnasal, transpulmonar ou percutânea é administrada. A composição farmacêu- tica pode ser administrada sistêmica ou localmente, por exemplo, atra- vés de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperito- neal ou injeção subcutânea.
[0509] O método de administração pode ser apropriadamente sele- cionado de acordo com a idade e sintomas de um paciente. A dose da composição farmacêutica que contém o polipeptídeo pode ser estabe- lecida para a faixa, por exemplo, de 0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por dose. Alternativamente, a dose da composição farma- cêutica que contém o polipeptídeo pode ser estabelecida para uma dose, por exemplo, de 0,001 mg a 100000 mg por paciente. Entretanto, a presente invenção não está necessariamente limitada por estes valo- res numéricos. Embora a dose e o método de administração variem de- pendendo do peso corporal, idade, sintomas, etc. de um paciente, aque- les versados na técnica podem definir uma dose apropriada e o método de administração levando em conta estas condições.
[0510] A presente invenção também se refere a métodos para a pro- dução de um polipeptídeo que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno.
[0511] Um método para a produção do polipeptídeo da presente in- venção é um método que compreende: obter um domínio de ligação a antígeno que tem atividade de ligação a antígeno; ligar o domínio de ligação a antígeno a uma porção transportadora de modo que a ativi- dade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno seja inibida por um domínio inibidor para formar um precursor polipeptídico; e ainda inserir um sítio de clivagem no precursor polipeptídico ou alterar uma porção do precursor polipeptídico para um sítio de clivagem. O método para introdução do sítio de clivagem pode ser qualquer um de inserção do sítio de clivagem e alteração de uma parte do precursor polipeptídico, contanto que o sítio de clivagem possa ser introduzido no precursor po- lipeptídico. Alternativamente, um sítio de alteração pode ser introduzido no precursor polipeptídico ao combinar ambos os métodos. Tal modali- dade será óbvia para aqueles versados na técnica com referência ao presente relatório descritivo e está incluída no escopo da presente in- venção.
[0512] Outro método para a produção do polipeptídeo da presente invenção é um método que compreende: obter um domínio de ligação a antígeno que tem atividade de ligação a antígeno; e ligar o domínio de ligação a antígeno a uma porção transportadora por meio de um sítio de clivagem de modo que a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno seja inibida por um domínio inibidor para formar um polipeptídeo. Quando o domínio de ligação a antígeno é ligado à porção transportadora por meio de um sítio de clivagem, o sítio de clivagem pode ser intercalado entre o domínio de ligação a antígeno e a porção transportadora ou uma porção do domínio de ligação a antígeno e/ou uma parte da porção transportadora pode ser alterada e usada como uma parte do sítio de clivagem.
[0513] "Inserir" a sequência de aminoácidos A na sequência de ami- noácidos B refere-se a dividir a sequência de aminoácidos B em duas partes sem eliminações e ligar as duas partes à sequência de aminoá- cidos A (isto é, produzir uma sequência de aminoácidos como a "pri- meira metade da sequência de aminoácidos B - sequência de aminoá- cidos A - segunda metade da sequência de aminoácidos B "). "Introdu- zir" a sequência de aminoácidos A na sequência de aminoácidos B re- fere-se a dividir a sequência de aminoácidos B em duas partes e ligar as duas partes à sequência de aminoácidos A. Isto abrange não apenas "inserir" a sequência de aminoácidos A na sequência de aminoácidos B conforme mencionado acima, mas também ligar as duas partes à se- quência de aminoácidos A após eliminar um ou vários resíduos de ami- noácidos da sequência de aminoácidos B, incluindo aqueles adjacentes à sequência de aminoácidos A (isto é, substituir uma parte da sequência de aminoácidos B pela sequência de aminoácidos A).
[0514] Em uma modalidade, usando um anticorpo com um único domínio como o domínio de ligação a antígeno e usando uma sequência de clivagem pela protease como o sítio de clivagem, métodos para pro- dução do polipeptídeo serão descritos abaixo.
[0515] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que compreende uma porção transporta- dora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção transportadora para formar um precursor polipeptídico; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor polipeptídico.
[0516] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que compreende uma porção transporta- dora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) a uma porção transportadora, de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção transportadora para formar um precursor polipeptídico; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio e a porção transportadora.
[0517] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que compreende uma porção transporta- dora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) à porção transportadora por meio de uma sequência de clivagem pela protease de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida por um domínio inibidor da porção transpor- tadora para formar um polipeptídeo.
[0518] Em uma modalidade particular, o método para a produção de um polipeptídeo que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é o método de produção compreende ainda a seguinte etapa: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio incorporado no polipeptídeo ou no precursor polipeptídico contra o antígeno alvo é enfraquecida ou perdida.
[0519] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com aquela antes da ligação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0520] Em uma modalidade particular, o método para a produção de um polipeptídeo que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é o método de produção compreende ainda a seguinte etapa: (e) liberar o anticorpo com um único domínio através de clivagem de uma sequência de clivagem pela protease e confirmar se o anticorpo com um único domínio liberado se liga ao antígeno.
[0521] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar ao anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a)
seja associado a uma VL como um substituto para a VH de um anticorpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja associado a uma VH como um substituto para a VL de um anticorpo IgG de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domí- nio seja inibida para formar um precursor da molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor da molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único do- mínio.
[0522] Em uma modalidade da presente invenção, o método para produzir um polipeptídeo que é uma molécula similar a anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibi- dor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado a uma VL como um substituto para a VH de um anticorpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja associado a uma VH como um substituto para a VL de um anticorpo IgG de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domí- nio seja inibida para formar um precursor da molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio e uma região constante de anticorpo no precursor da molécula similar a anticorpo IgG.
[0523] Em uma modalidade da presente invenção, o método para produzir um polipeptídeo que é uma molécula similar a anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibi- dor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado a uma VL como um substituto para a VH de um anticorpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja associado a uma VH como um substituto para a VL de um anticorpo IgG de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domí- nio seja inibida para formar um precursor de molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor da molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único do- mínio.
[0524] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar a anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas:
[0525] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar a anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado a uma VL como um substituto para a VH de um anticorpo IgG ou permitir que o anticorpo com um único domínio seja associado a uma VH como um substituto para a VL de um anticorpo IgG de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domí- nio seja inibida para formar um precursor de molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio e uma região constante de anticorpo no precursor da molécula similar a anticorpo IgG.
[0526] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar a anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que se liga a um antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) como um substituto para a VH ou a VL de anticorpo IgG a uma região constante de cadeia leve ou região constante de cadeia pesada de anticorpo IgG através de uma sequência de clivagem pela protease de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio seja inibida para formar uma molécula similar a anticorpo IgG que traz o an- ticorpo com um único domínio.
[0527] Em uma modalidade particular, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar ao anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é o método de produção que compre- ende ainda a seguinte etapa: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio introduzido na molécula similar a anticorpo IgG ou no precursor de molécula similar a anticorpo IgG contra o antígeno alvo é enfraque- cida ou perdida.
[0528] Na presente invenção, a frase "atividade de ligação é enfra- quecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com àquela antes da associação ou da ligação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0529] Em uma modalidade particular, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar ao anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é o método de produção que compre- ende ainda a seguinte etapa: (e) liberar o anticorpo com um único domínio através de clivagem pela protease de uma sequência de clivagem pela protease e confirmar se o anticorpo com um único domínio liberado se liga ao antígeno alvo.
[0530] No caso do uso de VH, VL ou VHH como o domínio inibidor, o método para inibição da atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio pelo domínio inibidor da porção transportadora inclui um método de permitir que o anticorpo com um único domínio seja associado com a VH, VL ou VHH. A VH, a VL ou a VHH que inibe a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio for- necido pode ser rastreada quanto a permitir que uma VH, VL ou VHH conhecida seja associada com o anticorpo com um único domínio e comparar a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio entre antes e após a associação.
[0531] Em outro método para inibição da atividade de ligação a an- tígeno do anticorpo com um único domínio por uma VH, VL ou VHH particular, um resíduo de aminoácido envolvido na associação com a VH, VL ou VHH no anticorpo com um único domínio pode ser substituído para promover a associação ou um par de anticorpo com um único do- mínio/domínio inibidor que tem o nível de diferença desejado na ativi- dade de ligação a antígeno entre antes e após a associação também ser fornecido ao usar um anticorpo com um único domínio que tem ori- ginalmente tal resíduo de aminoácido, o qual é um aminoácido que pode promover a associação.
[0532] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar ao anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VH de anticorpo ou permitir que o anticorpo com um único domínio variante seja associado com a VL de anticorpo de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo variante seja inibida para formar um precursor da molécula similar a an- ticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease no precursor da molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único do- mínio variante.
[0533] Em uma modalidade da presente invenção, o método para produzir um polipeptídeo que é uma molécula similar a anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibi- dor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VL de anticorpo para preparar uma variante anticorpo de domínio que retém a atividade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VH de anticorpo ou permitir que o anticorpo com um único domínio variante seja associado com a VL de anticorpo de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar um precursor da molécula similar a anticorpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante; e (c) introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre o anticorpo com um único domínio variante e uma região constante no precursor da molécula similar a anticorpo IgG.
[0534] Em uma modalidade da presente invenção, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar a anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é um método de produção que compreende as seguintes etapas: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VH de anticorpo ou substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo; e (b) ligar o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) a uma região constante de cadeia pesada de anticorpo IgG através de uma sequência de clivagem pela protease ou ligar o anticorpo com um único domínio variante a uma região constante de cadeia leve do anticorpo IgG através de uma sequência de clivagem pela protease de modo que a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante seja inibida para formar uma molécula similar a anti- corpo IgG que traz o anticorpo com um único domínio variante.
[0535] Em uma modalidade particular, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar ao anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é o método de produção que compre- ende ainda a seguinte etapa: (d) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio variante presente na molécula similar a anticorpo IgG ou no pre- cursor de molécula similar a anticorpo IgG contra o antígeno alvo é en- fraquecida ou perdida.
[0536] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com àquela antes da associação ou da ligação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0537] Em uma modalidade particular, o método para a produção de um polipeptídeo que é uma molécula similar ao anticorpo IgG que compreende uma porção transportadora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno é o método de produção que compre- ende ainda a seguinte etapa: (e) liberar o anticorpo com um único domínio variante através de cliva- gem pela protease de uma sequência de clivagem pela protease e con- firmar se o anticorpo com um único domínio variante liberado se liga ao antígeno alvo.
[0538] A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo que compreende uma porção transporta- dora que tem um domínio inibidor e um domínio de ligação a antígeno.
[0539] O polinucleotídeo de acordo com a presente invenção é, em geral, transportado por (ou inserido em) um vetor apropriado e transfec- tado em células hospedeiras. O vetor não está particularmente limitado, contanto que o vetor possa reter estavelmente um ácido nucleico inse- rido. Por exemplo, quando E. coli é usada como o hospdeiro, um vetor pBluescript (fabricado pela Stratagene Corp.) ou similar é preferido como um vetor para clonagem. Vários vetores comercialmente disponí- veis podem ser usados. No caso de uso do vetor com a finalidade de produção do polipeptídeo da presente invenção, um vetor de expressão é particularmente útil. O vetor de expressão não está particularmente limitado, contanto que o vetor permita a expressão do polipeptídeo in vitro, em E. coli, em células cultivadas ou em organismos individuais. O vetor de expressão é, de preferência, por exemplo, um vetor pBEST (fa- bricado pela Promega Corp.) para expressão in vitro, um vetor pET (fa- bricado pela Invitrogen Corp.) para E. coli, um vetor pME18S-FL3 (Nº de Acesso GenBank ABOO9864) para células e um vetor pME18S (Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)) para organismos individuais. A inserção do DNA da presente invenção no vetor pode ser realizada por meio de um método de rotina, por exemplo, reação de ligase usando sítios de restri- ção (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
[0540] As células hospedeiras não estão particularmente limitadas e várias células hospedeiras são usadas de acordo com a finalidade. Exemplos das células para expressão do polipeptídeo podem incluir cé- lulas bacterianas (por exemplo, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces e Bacillus subtilis), células fúngicas (por exemplo, levedu- ras e Aspergillus), células de inseto (por exemplo, Drosophila S2 e Spodoptera SF9), células de animal (por exemplo, CHO, COS, HeLa, C127, 313, BHK, HEK293 e células de melanoma de Bowes) e células vegetais. A transfecção do vetor para as células hospedeiras pode ser realizada por meio de um método conhecido na técnica, por exemplo, um método de precipitação de fosfato de cálcio, um método de eletro- poração (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wiley & Sons. Seção 9.1-9.9), um método de Lipo- fectamina (fabricado pela GIBCO-BRL) ou um método de microinjeção.
[0541] Um sinal secretório apropriado pode ser incorporado no po- lipeptídeo de interesse a fim de secretar o polipeptídeo expresso nas células hospedeiras para o lúmen do retículo endoplasmático, espaço periplásmico ou um ambiente extracelular. O sinal pode ser endógeno ao polipeptídeo de interesse ou pode ser um sinal estranho.
[0542] Quando o polipeptídeo da presente invenção é secretado em um meio, a recuperação do polipeptídeo no método de produção é rea- lizado pela recuperação do meio. Quando o polipeptídeo da presente invenção é produzido nas células, as células são primeiro lisadas, se- guido pela recuperação do polipeptídeo.
[0543] Métodos conhecidos na técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração de ácido, cromatografia de per- muta aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatogra- fia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxiapatita e cromatografia de lectina, podem ser usados para re- cuperar e purificar o polipeptídeo da presente invenção a partir da cul- tura de células recombinantes.
[0544] Exemplos do domínio de ligação a antígeno usado em algu- mas modalidades da presente invenção incluem um anticorpo com um único domínio. Nestas modalidades, a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio pode ser inibida através de sua as- sociação com uma VL particular, através de sua associação com uma VH particular ou através de sua associação com uma VHH particular. À presente invenção também se refere a métodos para rastreio de tais anticorpos com um único domínio.
[0545] Uma VL, VH ou VHH que tem uma sequência conhecida, por exemplo, VL, VH ou VHH que tem uma sequência registrada no banco de dados IMGT ou Kabat, pode ser usada como a VL, a VH ou a VHH que inibe a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio. Além disso, a sequência da VL, VH ou VHH recém identificada a partir de de uma biblioteca de anticorpos humanos ou similar pode ser usada. A VL, a VH ou a VHH que inibe a atividade de ligação do anti- corpo com um único domínio pode ser selecionada ao preparar uma proteína pela combinação destas sequências e medir a atividade de li- gação usando o método descrito acima.
[0546] Em algumas modalidades da presente invenção, uma VL, VH ou VHH que tem uma sequência de linhagem germinativa de anti- corpo humano pode ser usada como a VL, a VH ou a VHH que inibe a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio. No caso de uso, por exemplo, da VL como o domínio inibidor, uma VL que tem sequências estruturais de cadeia capa ou uma VL que tem sequên- cias estruturais de cadeia lambda pode ser usada. Além disso, uma VL que tem sequências estruturais modificadas, tais como sequências de regiões estruturais combinadas de sequências de regiões estruturais de cadeia capa e cadeia lambda, pode ser usada.
[0547] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para rastreio quanto a um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida através de sua associ- ação com uma VL particular que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que tem atividade de liga- ção a antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com uma VL particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio associado com a VL particular na etapa (b) contra o antígeno é enfraquecida ou perdida.
[0548] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com aquela antes da associação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0549] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para rastreio quanto a um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida através de sua associ- ação com uma VH particular que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que tem atividade de liga- ção a antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com a VH particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio associado com a VH particular na etapa (b) contra o antígeno é enfraquecida ou perdida.
[0550] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com aquela antes da associação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0551] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para rastreio quanto a um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida através de sua associ- ação com uma VHH particular que compreende as seguintes etapas: (a) obter um anticorpo com um único domínio que tem atividade de liga- ção a antígeno alvo; (b) permitir que o anticorpo com um único domínio obtido na etapa (a) seja associado com a VHH particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação do anticorpo com um único do- mínio associado com a VHH particular na etapa (b) contra o antígeno é enfraquecida ou perdida.
[0552] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com aquela antes da associação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0553] Exemplos do método para permitir que o anticorpo com um único domínio seja associado com a VL, VH ou VHH particular incluem um método de concepção de uma molécula que tem a sequência do anticorpo com um único domínio como um substituto para a sequência de uma da VH e VL em um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que compreende tanto a VH quanto a VL, tal como um anticorpo intacto, Fab, Fab' ou (Fab), e que expressa um polipeptídeo que tem a sequência.
[0554] A presente invenção também se refere a um método para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de liga- ção a antígeno é inibida através de promoção da associação do anti- corpo com um único domínio com a VL particular ao promover a asso- ciação do anticorpo com um único domínio com uma VH particular ou ao promover a associação do anticorpo com um único domínio com uma VHH particular, além de rastrear um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com a VL particular, através de sua associação com a VH particular ou através de sua associação com a VHH particular.
[0555] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja ativi- dade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com uma VL particular que compreende a seguinte etapa: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VL de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo.
[0556] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece o método para produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com uma VL particular que compreende ainda as seguintes etapas: (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VL particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante associado com a VL é enfraquecida ou perdida.
[0557] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com aquela antes da associação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0558] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja ativi- dade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com uma VH particular que compreende a seguinte etapa: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VH de anticorpo para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a ati- vidade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo.
[0559] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece o método para produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com a VH particular que compreende ainda as seguintes etapas: (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VH particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante associado com a VH é enfraquecida ou perdida.
[0560] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com aquela antes da associação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0561] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um mé- todo para a produção de um anticorpo com um único domínio cuja ativi- dade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com uma VHH particular que compreende a seguinte etapa: (a) substituir um resíduo de aminoácido em um anticorpo com um único domínio que está envolvido na associação com a VHH para preparar um anticorpo com um único domínio variante que retém a atividade de ligação do anticorpo com um único domínio contra o antígeno alvo.
[0562] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece o método para produção de um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida através de sua associação com uma VHH particular que compreende ainda as seguintes etapas: (b) permitir que o anticorpo com um único domínio variante preparado na etapa (a) seja associado com a VHH particular; e (c) confirmar se a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio variante associado com a VHH é enfraquecida ou per- dida.
[0563] Na presente invenção, a frase "a atividade de ligação é en- fraquecida" significa que a atividade de ligação contra o antígeno alvo é diminuída quando comparado com aquela antes da associação e o grau desta diminuição não está limitado.
[0564] A etapa permitir a associação do anticorpo com um único do- mínio com a VL, VH ou VHH particular é realizada por meio de um mé- todo de concepção de uma molécula que tem a sequência do anticorpo com um único domínio como um substituto para a sequência de uma da
VH e da VL em um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que com- preende tanto uma VH quanto uma VL, tal como um anticorpo intacto, Fab, Fab' ou (Fab)2, e que expressa um polipeptídeo que tem a sequên- cia.
[0565] De acordo com uma determinada modalidade da presente invenção, o anticorpo com um único domínio da presente invenção cuja atividade de ligação a antígeno é inibida ou perdida através de sua as- sociação com uma VL, VH ou VHH particular pode ser obtido a partir de uma biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um pri- meiro domínio de sustentação de associação.
[0566] No presente relatório descritivo, uma modalidade da "biblio- teca" pode fornecer uma biblioteca que permite obter de forma eficiente um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida ou perdida através de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular.
[0567] No presente relatório descritivo, a "biblioteca" refere-se a um conjunto de uma pluralidade de polipeptídeos de fusão que têm diferen- tes sequências ou um conjunto de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos de fusão. Uma pluralidade de poli- peptídeos de fusão contidos na biblioteca são polipeptídeos de fusão que diferem quanto à sequência uns dos outros, não tendo uma sequên- cia individual.
[0568] No presente relatório descritivo, o termo "diferem quanto à sequência uns dos outros" em uma pluralidade de polipeptídeos de fu- são que diferem quanto à sequência uns dos outros significa que os polipeptídeos de fusão individuais na biblioteca têm sequências distin- tas. Mais preferivelmente, o termo significa que as porções de anticorpo com um único domínio dos polipeptídeos de fusão individuais na biblio-
teca têm sequências distintas. Especificamente, o número das sequên- cias distintas na biblioteca reflete o número de clones independentes que diferem quanto às sequências na biblioteca e é também denomi- nado como um "tamanho de biblioteca". O tamanho de biblioteca de uma biblioteca de visualização em fagos usual é de 10º a 10"? e pode ser expandida para 10º pela aplicação de um método conhecido na técnica, tal como um método de visualização em ribossomos. Entre- tanto, o número de partículas de fago para uso em seleção de panning para a biblioteca de fagos é, em geral, 10 a 10.000 vezes maior do que um tamanho de biblioteca. Este múltiplo excessivo, também denomi- nado o "número de equivalente da biblioteca", representa que 10 a
10.000 clones individuais podem ter a mesma sequência de aminoáci- dos. Consequentemente, o termo "que diferem quanto à sequência uns dos outros" de acordo com a presente invenção significa que os poli- peptídeos individuais na biblioteca, excluindo o número de equivalentes da biblioteca, têm sequências distintas e, mais especificamente, signi- fica que a biblioteca tem 10º a 10** moléculas, de preferência 107 a 10"? moléculas de polipeptídeos que diferem quanto à sequência uns dos outros.
[0569] O termo "pluralidade de" na biblioteca que consiste essenci- almente em uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de acordo com a presente invenção refere-se, em geral, a um conjunto de dois ou mais tipos de substâncias tais como, por exemplo, o polipeptídeo, molécula de polinucleotídeo, vetor ou vírus da presente invenção. Contanto que, por exemplo, duas ou mais substâncias difiram quanto a um traço parti- cular entre si, isto significa que as substâncias são de dois ou mais tipos. Exemplos das mesmas podem incluir um aminoácido mutante obser- vado em uma posição de aminoácido particular em uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, dois ou mais polipeptídeos da presente in- venção que têm sequências substancialmente iguais, de preferência idênticas, exceto quanto a aminoácidos mutantes particulares em posi- ções de aminoácido altamente diversas expostas na superfície, são con- siderados como uma pluralidade de polipeptídeos da presente inven- ção. Em outro exemplo, duas ou mais moléculas de polinucleotídeo da presente invenção que têm sequências substancialmente iguais, de pre- ferência idênticas, exceto quanto a bases que codificam aminoácidos mutantes particulares em posições de aminoácido altamente diversas expostas na superfície, são consideradas como uma pluralidade de mo- léculas de polinucleotídeo da presente invenção.
[0570] Métodos de panning que usam vetores de fago também são, de preferência, usados como um método para rastreio dos polipeptídeos de fusão com atividade de ligação como um índice. Um gene que codi- fica cada anticorpo com um único domínio e um gene que codifica um domínio CH1 de anticorpo IgG ou uma região constante de cadeia leve pode ser ligada em uma forma apropriada para formar um polipeptídeo de fusão. Genes que codificam os polipeptídeos de fusão assim forma- dos podem ser inseridos nos vetores de fago para obter fagos que ex- pressam os polipeptídeos de fusão na superfície. Após contato dos fa- gos com o antígeno desejado, os fagos ligados com o antígeno podem ser recuperados para recuperar os DNAs que codificam polipeptídeos de fusão que têm a atividade de ligação de interesse. Esta operação pode ser repetida, se necessário, para enriquecer polipeptídeos de fu- são que têm a atividade de ligação desejada.
[0571] Além do método de visualização em fagos, uma técnica que usa um sistema de tradução isento de células, uma técnica de apresen- tação de polipeptídeos de fusão na superfície celular ou viral, uma téc- nica de uso de uma emulsão e assim por diante são conhecidas como técnicas para obtenção de polipeptídeos de fusão por meio de panning usando uma biblioteca. Por exemplo, um método de visualização em ribossomos de formação de um complexo de mRNA e uma proteína tra- duzida através de ribossomos pela remoção de um códon terminal, etc., um método de visualização em cDNA ou mRNA para ligar covalente- mente uma sequência gênica a uma proteína traduzida usando um com- posto tal como puromicina ou um método de visualização em CIS de formação de um complexo de um gene e uma proteína traduzida usando uma proteína de ligação a ácido nucleico pode ser usado como a técnica que usa um sistema de tradução isento de células. Por exemplo, o mé- todo de visualização em fagos, bem como um método de visualização em E. coli, um método de visualização em bactérias Gram-positivas, um método de visualização em levedura, um método de visualização em células de mamífero ou um método de visualização em vírus pode ser usado como a técnica de apresentação de polipeptídeos de fusão na superfície celular ou viral. Por exemplo, um método de visualização em vírus in vitro que usa uma emulsão que contém um gene e uma molé- cula relacionada à tradução pode ser usado como a técnica que usa uma emulsão. Estes métodos já são conhecidos na técnica (Nat Bio- technol. Dezembro de 2000; 18(12): 1287-92, Nucleic Acids Res. 2006; 34(19): e127, Proc Natl Acad Sci US A. 2 de Março de 2004; 101(9): 2806-10, Proc Nat! Acad Sci U S A. 22 de Julho de 2004; 101(25): 9193- 8, Protein Eng Des Sel. Abril de 2008; 21(4): 247-55, Proc Natl Acad Sci US A. 26 de Setembro de 2000; 97(20): 10701-5, MAbs. Set-Out de 2010; 2(5): 508-18, Methods Mol Biol. 2012; 911: 183-98).
[0572] Um parceiro de associação de um domínio inibidor ligado a um segundo domínio de sustentação de associação pode ser usado em um método para obtenção do anticorpo com um único domínio de inte- resse a partir da biblioteca que compreende uma pluralidade de polipep- tídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de associação.
[0573] No presente relatório descritivo, "primeiro domínio de susten- tação de associação" e "segundo domínio de sustentação de associa- ção" refere-sem aos domínios que interagem entre si através de uma ligação, tal como uma ligação hidrofóbica, uma ligação de hidrogênio ou uma ligação iônica, para formar um produto da associação. Exemplos preferidos do primeiro domínio de sustentação de associação e do se- gundo domínio de sustentação de associação incluem, porém sem limi- tações, regiões constantes de cadeia leve de anticorpo (CL) e domínios CH1 de regiões de cadeia pesada.
[0574] O primeiro domínio de sustentação de associação e o se- gundo domínio de sustentação de associação podem interagir entre si e formar a associação do polipeptídeo de fusão com o parceiro de as- sociação, independentemente do grau de associatividade entre o anti- corpo com um único domínio e o domínio inibidor.
[0575] Em uma modalidade alternativa, a presente invenção for- nece uma biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio ligados a uma região constante de cadeia leve de anticorpo IgG, em que os anticorpos com um único domínio incluem um anticorpo com um único domínio cuja ati- vidade de ligação a antígeno é inibida ou perdida através de sua asso- ciação com uma VL, VH ou VHH particular e um método para rastreio da biblioteca quanto a um anticorpo com um único domínio cuja ativi- dade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida atra- vés de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular.
[0576] Em uma modalidade específica, conforme mostrado nas Fi- guras 9A(1), 9A(2), 9A(3), 9B e 9C: (1) polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de associação, são visualizados na superfície de fagos ou similar por meio do método de visualização, tal como visualização de fago.
(2) Um parceiro de associação de um domínio inibidor ligado a um se- gundo domínio de sustentação de associação é fornecido e os polipep- tídeos de fusão são associados com o parceiro de associação. Um po- lipeptídeo de fusão que não se liga ao antígeno alvo ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor neste es- tado do polipeptídeo de fusão associado com o parceiro de associação é selecionado.
(3) A associação do anticorpo com um único domínio no polipeptídeo de fusão selecionado em (2) com o domínio inibidor no parceiro de associ- ação é cancelada. Um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno alvo ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado onde o anticorpo com um único domínio não está associado com o domínio inibidor é selecionado.
[0577] Neste contexto, por exemplo, um método de clivagem do parceiro de associação próximo do limite entre o domínio inibidor e o segundo domínio de sustentação de associação conforme mostrado na Figura 9B ou um método de clivagem do polipeptídeo de fusão próximo do limite entre o anticorpo com um único domínio e o primeiro domínio de sustentação de associação conforme mostrado na Figura 9C pode ser usado como um método para cancelamento da associação do anti- corpo com um único domínio com o domínio inibidor.
[0578] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método que compreende, conforme mostrado na Figura 9D, comparar a diferença na atividade de ligação do anticorpo com um único domínio entre quando o anticorpo com um único domínio e o domínio inibidor são expressos juntos e quando o anticorpo com um único domínio é expresso de modo a não expressar o domínio inibidor juntamente com o mesmo, ao invés de comparar a diferença na atividade de ligação do anticorpo com um único domínio entre a associação cancelada e asso-
ciação não cancelada do anticorpo com um único domínio com o domí- nio inibidor, conforme mostrado nas Figuras 9A a 9C.
[0579] Conforme mostrado na Figura 9D(1), o anticorpo com um único domínio e o domínio inibidor são expressos juntos para formar uma associação. Um polipeptídeo de fusão que compreende um anti- corpo com um único domínio que não se liga ao antígeno ou tem ativi- dade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor neste estado é selecionado. Conforme mostrado nas Figuras 9D(2), 9D(2') e 9D(2"), o anticorpo com um único domínio é expresso de modo a não expressar o domínio inibidor juntamente com o mesmo. Um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior neste estado é selecionado. Como um resul- tado, o anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a an- tígeno é inibida ou perdida através de sua associação com um domínio inibidor particular, por exemplo, VH, VL ou VHH, pode ser rastreado a partir da biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de associação. Alternativamente, o an- ticorpo com um único domínio é expresso a fim de não expressar o do- mínio inibidor juntamente com o mesmo. Um polipeptídeo que compre- ende um anticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior neste estado é selecionado. Em seguida, o anticorpo com um único domínio e o domínio inibidor são expressos juntos para formar a associação. Um polipeptídeo que compreende um anticorpo com um único domínio que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor neste estado é sele- cionado. Também através deste método, o anticorpo com um único do- mínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida ou perdida através de sua associação com um domínio inibidor particular, por exemplo, VH, VL ou VHH, pode ser rastreado a partir da biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domínio de sustentação de as- sociação. Alternativamente, conforme mostrado nas Figuras 9D(2), 9D(2') e 9D(2"), o anticorpo com um único domínio é expresso de modo a não expressar o domínio inibidor juntamente com o mesmo (apenas o anticorpo com um único domínio é expresso; apenas o polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio e um pri- meiro domínio de sustentação de associação é expresso; ou o polipep- tídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio e um primeiro domínio de sustentação de associação é associado com o segundo domínio de sustentação de associação) e um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor prede- terminado ou maior neste estado é selecionado. Em seguida, conforme mostrado na Figura 9D(1), o anticorpo com um único domínio no poli- peptídeo de fusão selecionado e o domínio inibidor são expressos juntos para formar a associação. Um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que não se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor neste estado é selecionado. Como um resultado, o anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida ou perdida através de sua associação com um domínio inibidor particular, por exemplo, VH, VL ou VHH, também pode ser rastreado a partir da bibli- oteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um primeiro domí- nio de sustentação de associação.
[0580] A “atividade de ligação a antígeno de um valor predetermi- nado ou menor" pode se referir, por exemplo, à atividade de ligação a antígeno que cai abaixo de uma referência predeterminada quando a atividade de ligação a antígeno é medida por meio do método listado no presente relatório descritivo. Igualmente, a "atividade de ligação a antí- geno de um valor predeterminado ou maior" pode se referir, por exem- plo, à atividade de ligação a antígeno que excede uma referência pre- determinada quando a atividade de ligação a antígeno é medida por meio do método listado no presente relatório descritivo. Um polipeptídeo de fusão que tem a atividade de ligação a antígeno de um valor prede- terminado ou maior se liga mais fortemente ao antígeno do que um po- lipeptídeo de fusão que tem a atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor.
[0581] O polipeptídeo de fusão selecionado em (3) descrito acima compreende um anticorpo com um único domínio que não tem ou tem uma atividade de ligação a antígeno fraca em um estado de associação com o domínio inibidor e tem uma (forte) atividade de ligação a antígeno em um estado de não associação com o domínio inibidor. A sequência do polipeptídeo de fusão selecionada por meio de tal método pode ser analisada também para elucidar a sequência do anticorpo com um único domínio contido na mesma. Assim, o anticorpo com um único domínio pode ser produzido.
[0582] Quanto aos métodos para rastreio de um polipeptídeo de fu- são que compreende o anticorpo com um único domínio de interesse usando polipeptídeos de fusão e um parceiro de associação, é impor- tante comparar a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio entre os estados de associação e não associação com o domínio inibidor. Conforme mostrado nas Figuras 9A(2') e 9A(3'), a ati- vidade de ligação a antígeno do polipeptídeos de fusão visualizados é primeiro confirmada e polipeptídeos de fusão que se ligam ao antígeno ou têm atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior são selecionados. Então, é permitido que os polipeptídeos de fu- são assim selecionados sejam associados com o parceiro de associa- ção. Polipeptídeos de fusão que não se ligam ao antígeno ou têm ativi- dade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou menor neste estado de associação são selecionados. Também por meio deste mé- todo, polipeptídeos de fusão que compreendem o anticorpo com um único domínio de interesse podem ser obtidos.
[0583] Daqui em diante, algumas modalidades que usam um domí- nio CH1 de anticorpo IgG como o primeiro domínio de sustentação de associação e que usam CL de anticorpo IgG como o segundo domínio de sustentação de associação serão descritas.
[0584] Um polipeptídeo de fusão que compreende o anticorpo com um único domínio de interesse pode ser rastreado a partir de uma bibli- oteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada ligado a um domínio CH1 de anticorpo IgG.
[0585] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma biblioteca que compreende uma pluralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um domínio CH1 de anticorpo IgG, em que os anticorpos com um único domínio incluem um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno é inibida ou perdida através de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular e um método para rastreio da biblioteca quanto a um polipep- tídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser per- dida através de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular.
[0586] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um método para a análise de um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com uma VL particular a partir de uma biblioteca que compreende uma plu- ralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a um domínio CH1 de anticorpo IgG. Especificamente, a presente invenção fornece um método para rastreio quanto a um an- ticorpo com um único domínio que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca de acordo com a presente invenção sejam visualizados in vitro; (b) fornecer um parceiro de associação de uma região constante de ca- deia leve de anticorpo IgG fundida com a VL particular; (c) permitir que cada um dos polipeptídeos de fusão visualizados na etapa (a) seja associado com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar um polipeptídeo de fusão que não se liga ao an- tígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predetermi- nado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domínio está associado com a VL; e (d) selecionar, a partir do(s) polipeptídeo(s) de fusão assim selecio- nado(s) na etapa (c), um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado onde o anticorpo com um único domínio contido no mesmo não está associado com a VL.
[0587] O parceiro de associação fornecido na etapa (b) compreende ainda uma sequência de clivagem pela protease. Neste caso, na etapa (d), a associação do anticorpo com um único domínio com a VL é can- celada por meio de tratamento com protease e a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio pode ser confirmada em um estado onde o anticorpo com um único domínio não está associado com a VL. Uma sequência de clivagem pela protease no parceiro de associação não está limitada quanto à sua posição, contanto que a as- sociação do anticorpo com um único domínio com a VL seja cancelada por clivagem. Como um exemplo da posição, uma sequência de cliva- gem pela protease pode estar localizada, por exemplo, próximo do limite entre a VL e a região constante de cadeia leve de anticorpo IgG no par- ceiro de associação, de preferência em qualquer posição entre a posi- ção de aminoácido 96 (numeração de Kabat) da VL e a posição de ami- noácido 130 (numeração EU) (posição 130 na numeração de Kabat) da região constante de cadeia leve de anticorpo, mais preferivelmente em qualquer posição entre a posição de aminoácido 104 (numeração de Kabat) da VL e a posição de aminoácido 113 (numeração EU) (posição 113 na numeração de Kabat) da região constante de cadeia leve de an- ticorpo.
[0588] Ao invés de usar o parceiro de associação que compreende uma sequência de clivagem pela protease, uma sequência de clivagem pela protease pode ser introduzida nos polipeptídeos de fusão na bibli- oteca e os polipeptídeos de fusão podem ser clivados pela protease de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VL seja cancelada. Uma sequência de clivagem pela protease em cada po- lipeptídeo de fusão não está limitada quanto à sua posição, contanto que a associação do anticorpo com um único domínio com a VL seja cancelada por clivagem e o anticorpo com um único domínio retenha sua atividade de ligação a antígeno mesmo após a clivagem. Como um exemplo da posição, uma sequência de clivagem pela protease pode estar localizada, por exemplo, próximo do limite entre o anticorpo com um único domínio e o domínio CH1 de anticorpo IgG no polipeptídeo de fusão.
[0589] Na etapa (d), o comprimento completo do(s) polipeptídeo(s) de fusão selecionado(s) na etapa (c) ou suas porções que compreen- dem os anticorpos com um único domínio podem ser visualizados no- vamente e a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio pode ser confirmada em um estado onde o anticorpo com um único domínio não está associado com a VL.
[0590] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um método para rastreio de um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a antígeno pode ser inibida ou poderia ser perdida através de sua associação com uma VH particular a partir de uma biblioteca que compreende uma plu- ralidade de polipeptídeos de fusão de anticorpos com um único domínio, cada um ligado a uma região constante de cadeia leve de anticorpo IgG. Especificamente, a presente invenção fornece um método para rastreio de um polipeptídeo de fusão que compreende um anticorpo com um único domínio que compreende as seguintes etapas: (a) permitir que os polipeptídeos de fusão da biblioteca de acordo com a presente invenção sejam visualizados in vitro; (b) fornecer um parceiro de associação de uma região constante de ca- deia leve de anticorpo IgG fundida com a VH particular; (c) permitir que cada um dos polipeptídeos de fusão visualizados na etapa (a) seja associado com o parceiro de associação fornecido na etapa (b) e selecionar um polipeptídeo de fusão que não se liga ao an- tígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predetermi- nado ou menor em um estado onde o anticorpo com um único domínio está associado com a VH; e (d) selecionar, a partir do(s) polipeptídeo(s) de fusão assim selecio- nado(s) na etapa (c), um polipeptídeo de fusão que se liga ao antígeno ou tem atividade de ligação a antígeno de um valor predeterminado ou maior em um estado onde o anticorpo com um único domínio contido no mesmo não está associado com a VH.
[0591] O parceiro de associação fornecido na etapa (b) compreende ainda uma sequência de clivagem pela protease. Neste caso, na etapa (d), a associação do anticorpo com um único domínio com a VH é can- celada por meio de tratamento com protease e a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio pode ser confirmada em um estado onde o anticorpo com um único domínio não está associado com a VH. Uma sequência de clivagem pela protease no parceiro de associação não está limitada quanto à sua posição, contanto que a as- sociação do anticorpo com um único domínio com a VH seja cancelada por clivagem. Como um exemplo da posição, uma sequência de cliva- gem pela protease pode estar localizada, por exemplo, próximo do limite entre a VH e a região constante de cadeia leve de anticorpo IgG no parceiro de associação, de preferência em qualquer posição entre a po- sição de aminoácido 101 (numeração de Kabat) da VH e a posição de aminoácido 140 (numeração EU) da região constante de cadeia leve de anticorpo, mais preferivelmente em qualquer posição entre a posição de aminoácido 109 (numeração de Kabat) da VH e a posição de aminoá- cido 122 (numeração EU) da região constante de cadeia leve de anti- corpo.
[0592] Ao invés de usar o parceiro de associação que compreende uma sequência de clivagem pela protease, uma sequência de clivagem pela protease pode ser introduzida nos polipeptídeos de fusão na bibli- oteca e os polipeptídeos de fusão podem ser clivados pela protease de modo que a associação do anticorpo com um único domínio com a VH seja cancelada. Uma sequência de clivagem pela protease em cada po- lipeptídeo de fusão não está limitada quanto à sua posição, contanto que a associação do anticorpo com um único domínio com a VH seja cancelada por clivagem e o anticorpo com um único domínio retenha sua atividade de ligação a antígeno mesmo após a clivagem. Como um exemplo da posição, uma sequência de clivagem pela protease pode estar localizada, por exemplo, próximo do limite entre o anticorpo com um único domínio e a região constante de cadeia leve de anticorpo IgG no polipeptídeo de fusão.
[0593] Na etapa (d), o comprimento completo do(s) polipeptídeo(s)
de fusão selecionado(s) na etapa (c) ou suas porções que compreen- dem os anticorpos com um único domínio podem ser visualizados no- vamente e a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio pode ser confirmada em um estado onde o anticorpo com um único domínio não está associado com a VH.
[0594] Aminoácidos contidos em cada sequência de aminoácidos descrita na presente invenção podem ser pós-traducionalmente modifi- cados (por exemplo, a modificação da glutamina N-terminal em ácido piroglutâmico através de piroglutamilação é uma modificação bem co- nhecida por aqueles versados na técnica). Tal sequência de aminoáci- dos que contém o aminoácido pós-traducionalmente modificado tam- bém está incluída na sequência de aminoácidos descrita na presente invenção, por rotina.
[0595] Será entendido por aqueles versados na técnica que combi- nações arbitrárias de uma ou mais modalidades descritas no presente relatório descritivo também estão incluídas na presente invenção, a me- nos que exista contradição técnica com base no senso técnico em co- mum daqueles versados na técnica. Exemplos
[0596] Daqui em diante, Exemplos do método e da composição da presente invenção serão descritos. Será entendido que várias outras modalidades podem ser realizadas à luz da descrição geral supracitada. Exemplo 1 - Problema de existência de anticorpos ativados por pro- tease
[0597] Foi reportado um método para preparação de um anticorpo que exerce atividade de ligação a antígeno apenas através de clivagem por protease expressa no local de uma lesão, tal como um tecido can- ceroso ou um tecido inflamatório. Este anticorpo, denominado Probody, é uma molécula de anticorpo conforme mostrado na Figura 1, cuja ativi- dade de ligação a antígeno é inibida ao conectar um anticorpo a um peptídeo que mascara o sítio de ligação a antígeno do anticorpo por meio de um ligante que é clivado por protease expresso no local de uma lesão (NPL 18). O peptídeo de mascaramento é dissociado do Probody através de clivagem do ligante constituinte pela protease expressa no local patológico alvo de modo que a molécula de anticorpo resultante restaure sua atividade de ligação a antígeno e se torne capaz de se ligar ao antígeno no tecido patológico alvo.
[0598] Acredita-se que o Probody possa se ligar ao antígeno seleti- vamente no local patológico alvo sob o mecanismo conforme supraci- tado e, deste modo, expanda a janela terapêutica. Entretanto, uma vez que a clivagem do anticorpo por protease é irreversível no caso do Pro- body, pode haver a possibilidade de que o anticorpo clivado no local patológico seja capaz de ser trazido no sangue a partir do local patoló- gico e se ligue ao antígeno expresso em tecido normal como um resul- tado da distribuição do anticorpo aos tecidos normais através do fluxo sanguíneo. O Probody ativado por protease retém uma mesma região Fc conforme no Probody antes de ativação e, portanto, tem um longo tempo de retenção sanguínea. Portanto, o anticorpo ativado por pro- tease expresso em um local patológico pode circular por muito tempo no sangue. A mesma protease expressa em um nível elevado em um local patológico também é expressa em um baixo nível em tecidos nor- mais e a protease livre produzida em um local patológico pode vazar para o sangue (The Chinese-German Journal of Clinical Oncology Ju- nho de 2004, Vol. 3, Nº 2 P78-P80). Portanto, o Probody pode ser ati- vado por tal protease livre. Consequentemente, pode existir a possibili- dade de que o Probody seja ativado em um local diferente de um local patológico. O Probody assim ativado também circula por muito tempo no sangue. Assim, há a possibilidade de que o Probody seja continua- mente ativado em um local patológico, em tecidos normais e no sangue e o Probody ativado, se tem uma longa retenção sanguínea, se acumula no sangue. O Probody ativado acumulado no sangue pode exibir efeitos colaterais através de ligação ao antígeno expresso em tecidos normais (Figura 2).
[0599] A atividade de ligação a antígeno do Probody é inibida por um peptídeo de mascaramento ligado a um anticorpo por meio de um ligante, porém, a atividade de ligação a antígeno não é completamente inibida. O Probody está em equilíbrio entre um estado onde o peptídeo de mascaramento ligado por meio do ligante está ligado com o sítio de ligação a antígeno e um estado onde o peptídeo de mascaramento está dissociado do mesmo. Uma molécula no estado dissociado pode se ligar ao antígeno (Figura 3). Na realidade, o Probody anti-EGFR descrito na NPL 17 tem atividade de ligação contra o EGFR mesmo antes de cliva- gem do ligante pela protease. Embora a atividade de ligação a antígeno aumente 30 a 100 vezes através da clivagem pela protease do ligante, o Probody presente em uma concentração elevada antes da ativação pode exibir efeitos colaterais através de ligação ao antígeno expresso em tecidos normais uma vez que o Probody, antes de ativação, tem 1/30 a 1/100 da atividade de ligação do Probody ativado.
[0600] O Probody emprega um peptídeo artificial para mascarar o sítio de ligação a antígeno do anticorpo. O peptídeo artificial tem uma sequência ausente em proteínas humanas nativas e pode, portanto, ter imunogenicidade em seres humanos. Sabe-se que tal imunogenicidade diminui os efeitos de fármacos de anticorpo ao induzir a anticorpos an- tifármaco (Blood. 31 de Marco de 2016; 127 (13): 1633-441).
[0601] Possíveis anticorpos antifármaco contra o Probody são um anticorpo antifármaco contra um complexo do anticorpo e o peptídeo de mascaramento (Probody antes de ativação), um anticorpo antifármaco contra o anticorpo dissociado do peptídeo de mascaramento (Probody ativado), um anticorpo antifármaco contra o peptídeo de mascaramento (peptídeo de mascaramento dissociado do Probody ativado) e assim por diante. Dentre eles, o anticorpo antifármaco contra o peptídeo de mas- caramento (anticorpo antipeptídeo de mascaramento) pode se ligar ao peptídeo de mascaramento do Probody antes de ativação e, deste modo, ativar o Probody mesmo sem a clivagem pela protease (Figura 4). O Probody ativado pelo anticorpo antipeptídeo de mascaramento pode exibir efeitos colaterais através de ligação ao antígeno expresso em tecidos normais.
Exemplo 2 — Conceito de polipeptídeo ativado por protease que compreende o anticorpo com um único domínio
[0602] Conforme mostrado no Exemplo 1, a tecnologia Probody apresenta os seguintes problemas:
1. O Probody ativado através de clivagem pela protease tem um longo tempo de retenção sanguínea.
2. Mesmo o Probody antes de clivagem pela protease tem atividade de ligação contra o antígeno.
3. O peptídeo de mascaramento é uma sequência não humana artificial e pode induzir a um anticorpo antipeptídeo de mascaramento.
[0603] Os presentes inventores acreditam que uma maneira útil para resolver estes problemas e fornecer um fármaco de anticorpo que exerce atividade em locais patológicos é satisfazer as seguintes condi- ções:
1. Um domínio de ligação a antígeno ativado através de clivagem pela protease tem uma meia-vida curta no sangue.
2. A atividade de ligação a antígeno de uma molécula antes de clivagem pela protease é minimizada.
3. O peptídeo de mascaramento que tem uma sequência não humana artificial não é usado.
[0604] Os presentes inventores conceberam uma molécula mos- trada na Figura 5 como um exemplo de um polipeptídeo que satisfaz as condições descritas acima. O polipeptídeo com um domínio de ligação a antígeno ligado a uma porção transportadora tem uma meia-vida longa e não se liga ao antígeno, uma vez que a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno é inibida (A). O domínio de ligação a antígeno é liberado e o domínio de ligação a antígeno assim liberado restaura sua atividade de ligação a antígeno e também tem uma meia-vida curta (B).
[0605] O polipeptídeo mostrado na Figura 5 tem diversas variações. No caso de uso de uma molécula similar a anticorpo IgG, o polipeptídeo pode ser produzido por meio de um método de produção conforme ilus- trado na Figura 6. Primeiro, um anticorpo com um único domínio (por exemplo, VH ou VHH) que se liga ao antígeno alvo é obtido (A). É per- mitido que o anticorpo com um único domínio obtido seja associado, como um substituto para uma de uma VH e VL de um anticorpo lgG que tem uma sequência de linhagem germinativa, com a outra (VL ou VH) para formar uma molécula similar a anticorpo IgG (B). Uma sequência de clivagem pela protease é introduzida na molécula similar a anticorpo IgG (C). Exemplos da posição de introdução incluem a posição próximo do limite entre o anticorpo com um único domínio presente (VH ou VHH) e a região constante (CH1 ou CL).
[0606] O anticorpo com um único domínio tem atividade de ligação a antígeno quando que existe individualmente, porém, perde sua ativi- dade de ligação a antígeno quando de formação de uma região variável com uma VL, VH, VHH ou similar. VL ou VH é uma sequência de anti- corpo humano nativo que tem uma sequência de linhagem germinativa e, portanto, tem um baixo risco de imunogenicidade e é improvável que venha a induzir a um anticorpo antifármaco que reconhece sua VL ou VH. No caso de formação de uma região variável do anticorpo com um único domínio sem o anticorpo com um único domínio com VHH, a hu- manização da VHH reduz o risco de imunogenicidade e reduz a proba- bilidade de induzir a um anticorpo antifármaco que reconhece esta VHH humanizada. Uma sequência de clivagem pela protease inserida na mo- lécula similar a anticorpo IgG é clivada por protease de modo que o an- ticorpo com um único domínio seja liberado. O anticorpo com um único domínio liberado tem atividade de ligação a antígeno. A molécula similar a anticorpo IgG antes da clivagem por protease é estruturalmente similar às moléculas de IgG em geral e, portanto, tem um longo tempo de re- tenção sanguínea, enquanto que o anticorpo com um único domínio |i- berado através de clivagem pela protease tem um peso molecular de aproximadamente 13 kDa sem manter uma região Fc e, portanto, desa- parece rapidamente por meio de excreção renal. Na realidade, a meia- vida da IgG de tamanho natural está na ordem de 2 a 3 semanas (Blood. 31 de Março de 2016; 127 (13): 1633-41), enquanto que a meia-vida do anticorpo com um único domínio é de aproximadamente 2 horas (Anti- bodies 2015, 4 (3), 141-156). Consequentemente, a molécula de ligação a antígeno ativada por protease tem uma meia-vida curta no sangue e é improvável que se ligue aos antígenos em tecidos normais.
[0607] Quando o anticorpo com um único domínio é VL, o mesmo conceito conforme acima pode ser obtido, por exemplo, ao introduzir uma sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre a VL eacCL. Exemplo 3 — Preparação de polipeptídeo ativado por protease usando uma VHH que se liga ao IL-6R 3-1 Preparação de polipeptídeo com ligação de VHH incorporada ao IL-6R
[0608] Um vetor de expressão que codifica IL-6R90-G1m (SEQ ID NO: 2) que contém IL-6R90 (SEQ ID NO: 1), VHH que tem atividades de ligação e neutralizantes contra o IL-68R humano conforme descrito no documento WOZ2010/115998, fundido com uma região constante de IgG1 humana (CH1-dobradiça-CH2-CH3) foi preparado por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
[0609] Vetores de expressão que codificam VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14- lamL (SEQ ID NO: 8), VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9), kO0 (SEQ ID NO: 10) e lamL (SEQ ID NO: 11) como cadeias leves (região constante de região variável) de várias subclasses que têm uma sequência de linha- gem germinativa humana foram preparados por meio de um método co- nhecido por aqueles versados na técnica.
[0610] Moléculas de IgG similares a anticorpo IL-B8R90-G1m/VK1- 39-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), IL-B6R90-G1m/VK2-28-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 4), IL-B6R90-G1m/VK3-20-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: ;2, cadeia leve: SEQ ID NO: 5), IL-6R90-G1m/VL1-40-lamL (ca- deia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 6), IL-6R90- G1m/VL1-44-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 7), IL-BR90-G1m/VL2-14-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, ca- deia leve: SEQ ID NO: 8), IL-B6R90-G1m/VL3-21-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 9), IL-BR290-G1m/k0 (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 10) e IL-6R90- G1m/lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 11) foram expressas através de expressão transitória usando células Fre- eStyle 293 (Invitrogen Corp.) por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificadas por meio de um método co- nhecido por aqueles versados na técnica usando proteína A. 3-2 Avaliação de ligação ao IL-6R de polipeptídeo com ligação de VHH incorporada ao IL-6R humano
[0611] IL-6R90-G1m/VK1-39-k0MT, IL-6R90-G1m/VK2-28-k0MT, IL-6R90-G1m/VK3-20-k0MT, —IL-6R90-G1m/VL1-40-laml, IL-6R90- G1m/VL1-44-lamL, IL-6R90-G1m/VL2-14-lamL, IL-G6R90-G1m/VL3-21- lamL, IL-6R90-G1m/k0 e IL-6R90-G1m/lamL foram avaliados quanto à sua atividade de ligação contra o IL-6R humano por meio do método a seguir.
[0612] IL-6R humano recombinante usado como um antígeno foi preparado como segue: uma linhagem CHO que expressa estavelmente IL-6R humano solúvel (daqui em diante também denominado como hsIL-6R, IL-6R ou IL-6R) que consiste em uma sequência de aminoáci- dos a partir das posições 1 a 357 contadas a partir do N-término, con- forme reportado em J. Immunol. 152, 4958-4968 (1994), foi construída por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica, cultivada e deixada expressar hsI!L-6R. A partir do sobrenadante de cul- tura obtido, hsIL-6R foi purificado por 2 etapas de cromatografia em co- luna Blue Sepharose 6 FF e cromatografia em coluna de filtragem de gel. Uma fração eluída como um pico principal na etapa final foi usada como um produto purificado final.
[0613] A avaliação de ligação ao hslL-6R de cada molécula foi con- duzida usando Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Especificamente, cada molécula foi deixada se ligar ao Biossensor/Proteína A (ProA) (Pall For- teBio Corp., 18-5013) e o hs|L-6R foi deixado atuar sobre o mesmo, se- guido por avaliação de ligação a 30 ºC. Sensorgramas que representam as respostas de ligação em tempo real medidas usando o Octet HTX são mostrados na Figura 10. Foi mostrado que IL-68R90-G1m/k0 e IL- 6R90-G1m/lamL sem VL se ligaram ao hsIL-6R, enquanto que IL-6R90- G1m/VK1-39-k0MT, IL-6R90-G1m/VK2-28-k0MT, IL-6R90-G1m/VK3- 20-kOMT, IL-68R90-G1m/VL1-40-lamL, IL-6R90-G1m/VL1-44-lamL e IL- 6R90-G1m/VL2-14-laml. que contêm uma região variável formada a com VL são incapazes de se ligar ao hsIL-6R. A partir disto, descobriu- se que uma VHH que tem atividade de ligação contra o IL-6R humano pode perder sua atividade de ligação ao IL-6R ao formar uma região variável através da associação com a VL.
[0614] 3-3 Introdução de sequência de clivagem pela protease no polipeptídeo com ligação de VHH incorporada ao IL-6R
[0615] O estudo foi conduzido para inserir uma sequência de cliva- gem pela protease próximo do limite entre a VHH anti-IL-6R humana IL- 6R90 e CH1. Seis tipos de cadeias pesadas mostradas na Figura 11 foram concebidos, de modo que sequência peptídica A (SEQ ID NO: 12), uma sequência reportada clivável especificamente pela uroquinase expressa em câncer (uPA) e MT-SP1, foi inserida em 3 sítios próximos do limite entre IL-6R90 e CH1 com ou sem um ligante de glicina-serina. Vetores de expressão que codificam IL-6R90H1001 (SEQ ID NO: 13), IL-6R90H1002 (SEQ ID NO: 14), IL-6R90H1003 (SEQ ID NO: 15), IL- 6R90H1004 (SEQ ID NO: 16), IL-B6R90H1005 (SEQ ID NO: 17) e IL- 6R90H1006 (SEQ ID NO: 18) foram preparados por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
[0616] Moléculas de IgG similares a anticorpo IL-6R90H1001/VK1- 39-kO0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 13, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), IL-6R90H1002/VK1-39-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 14, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), IL-G6R90H1003/VK1-39-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 15, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), IL-BWBR90H1004/VK1-39- KOMT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 16, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), IL- 6R90H1005/VK1-39-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 17, cadeia leve: SEQ ID NO: 3) e IL-6R90H1006/VK1-39-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, cadeia leve: SEQ ID NO: 3) foram expressas através de expressão transitória usando estas cadeias pesadas e VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) como cadeia leve e usando células FreeStyle 293 (Invi- trogen Corp.) por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificadas por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica usando proteína A.
[0617] 3-4 Ativação de polipeptídeo que traz sequência de cli- vagem pela protease através de clivagem pela protease
[0618] Foi verificado se IL-6R90H1001/VK1-39-k0MT, IL-
6R90H1002/VK1-39-kOMT, IL-6R90H1003/VK1-39-kO0MT, IL- 6R90H1004/VK1-39-k0MT, — IL-6R90H1005/VK1-39-kK0OMT e IL 6R90H1006/VK1-39-k0MT podem liberar uma VHH que tem atividade de ligação contra o IL-6R através de clivagem pela protease.
[0619] IL-6R humano solúvel foi preparado por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica. O IL-68R humano solúvel preparado foi biotinilado por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
[0620] Para a finalidade de ligação de biotina ao C-término do IL-68R humano solúvel (também denominado como hsIL-6R ou IL-6R humano solúvel; SEQ ID NO: 35), um fragmento gênico que codifica uma se- quência específica (sequência AviTag; SEQ ID NO: 36) a ser biotinilada pela biotina ligase foi ligado através de um fragmento gênico que codi- fica um ligante a jusante de um fragmento gênico que codifica hsIL-6R. Um fragmento gênico que codifica uma proteína que contém hsIL-6R ligado à sequência AviTag (hsIL-6R-Avitag; SEQ ID NO: 37) foi inserido em um vetor para expressão em células de animal. O vetor de plasmí- deo construído foi transfectado em células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) usando 293Fectina (Invitrogen Corp.). Nesta operação, as célu- las foram cotransfectadas com um gene para expressão de EBNA1 (SEQ ID NO: 57) e um gene para expressão de biotina ligase (BirA; SEQ ID NO: 58) e biotina também foi adicionada ao mesmo com a finalidade de marcação por biotina de hsIL-6R-Avitag. As células transfectadas de acordo com os procedimentos supracitados foram cultivadas a 37 ºC sob CO, a 8 % e a secreção da proteína de interesse (hslL-6R-BAP1) foi permitida no sobrenadante de cultura. Esta solução de cultura de cé- lulas foi filtrada através de um filtro de topo de garrafa de 0,22 um para obter um sobrenadante de cultura.
[0621] Um anticorpo anti-IL-6R humano foi imobilizado sobre HiTrap
NHS-ativado HP (GE Healthcare Japan Corp.) de acordo com o proto- colo do fabricante para preparar uma coluna (coluna de anticorpo anti- IL-6R humano). O sobrenadante de cultura foi aplicado à coluna de an- ticorpo anti-|L-68R humano equilibrada com TBS, seguido pela eluição do hsIL-6R ligado com arginina a 2 M (pH de 4,0). Em seguida, o eluato da coluna de anticorpo anti-IL-6R humano foi diluído com TBS e, então, aplicado à coluna SoftLink Avidin (Promega Corp.) equilibrada com TBS, seguido pela eluição de hsIL-6R-BAP1 com biotina a 5 MM, Tris-HCIl a 50 mM (pH de 8,0) e arginina a 2 M (pH de 4,0). A partir deste eluato, agregados de hsIL-6R-BAP1 foram removidos por meio de cromatogra- fia de filtragem em gel usando Superdex 200 (GE Healthcare Japan Corp.) para obter hslL-6R-BAP1 purificado com o tampão trocado por D-PBS e CHAPS a 0,05 %.
[0622] O Domínio Catalítico de Matriptase/ST14 Humana Recombi- nante (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) foi usado como a protease. Protease a 12,5 nM e 100 ug/mL de cada molécula similar a anticorpo IgG foram incubados em PBS sob uma condição de 37 ºC durante 20 horas. Em seguida, a clivagem pela protease foi avaliada através de SDS-PAGE redutivo. Os resultados são mostrados na Figura 12. Como um resultado, uma clivagem pela protease de uma sequência de cliva- gem pela protease próximo do limite entre a VHH e a região constante de cadeia pesada foi confirmada em IL-6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL- 6R90H1004/VK1-39-k0MT, — IL-BGR90H1005/VK1-39-k0OMT e |Ll- 6R90H1006/VK1-39-kO0MT.
[0623] Em seguida, a avaliação de ligação ao IL-6R da VHH libe- rada através de tratamento com protease foi conduzida usando Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Especificamente, hslL-6R-BAP1 deixado se ligar a um sensor de estreptavidina (Pall ForteBio Corp., 18-5021) e cada molécula similar a anticorpo IgG clivada foi deixada atuar sobre o mesmo, seguido por avaliação da ligação a 30 ºC. Sensorgramas que representam as respostas de ligação em tempo real medidas usando o Octet HTX são mostrados na Figura 13. Como um resultado, a ligação foi confirmada em IL-6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL-B8R90H1004/VK1- 39-kO0MT, IL-6R90H1005/VK1-39-k0MT e IL-6R90H1006/VK1-39-k0MT. IL-6R90-G1m/k0 e IL-6R90-G1m/lamL se ligam de forma divalente com avidez, enquanto que a VHH liberada se liga com afinidade. Portanto, IL-6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL-6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL- 6R90H1005/VK1-39-k0MT e IL-BR90H1006/VK1-39-kK0MT tratados com protease exibiram uma taxa de dissociação mais rápida de IL-6R do que aquela de IL-6R90-G1m/k0 e IL-B6R90-G1m/lamL. Além disso, a VHH tem um peso molecular menor do que aquele de IL-6R90-G1m/k0 e IL-BR90-G1m/lamL. Portanto, sua resposta, a quantidade de ligação, foi menor.
[0624] Estes resultados demonstraram que IL-6R90H1002/VK1-39- KkOMT, IL-6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL-BR90H1005/VK1-39-k0MT ou IL-6R90H1006/VK1-39-k0MT não exibe atividade de ligação contra o IL- 6R em si, enquanto que a sequência peptídica A inserida próximo do limite entre a VHH e a região constante de cadeia pesada é clivada atra- vés de tratamento com protease, de modo que o domínio de VHH seja liberado e a VHH liberada possa se ligar ao IL-6R. A partir disto, conclui- se que a molécula de acordo com o conceito descrito no Exemplo 2 foi realmente capaz de ser preparada. Exemplo 4 — Preparação de polipeptídeo ativado por protease atra- vés de alteração usando VHH que se liga ao IL-6R 4-1 Avaliação de ligação ao IL-6R de polipeptídeo com ligação de VHH incorporada ao IL-6R
[0625] Um vetor de expressão que codifica 20A11-G1m (SEQ ID NO: 38) que contém a VHH 20A11 (SEQ ID NO: 19) que tem atividades de ligação e neutralização contra IL-6R conforme descrito no documento WOZ2010/115998 fundida com uma região constante de IgG1 humana
(CH1-dobradiça-CH2-CH3) do mesmo modo conforme no Exemplo 3 foi preparado por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
[0626] Os polipeptíidecos 20A11-G1m/VK1-39-k0MT, —20A11- G1m/VK2-28-k0MT, 20A11-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11-G1m/VL1-40- lamL, 20A11-G1m/VL1-44-laml, 20A11-G1m/VL2-14-laml e 20A11- G1m/VL3-21-lamL foram expressos e purificados do mesmo modo con- forme no Exemplo 3 usando sua cadeia pesada e VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-kO0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14- lamL (SEQ ID NO: 8) e VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) como cadeias le- ves.
[0627] 20A11-G1m/VK1-39-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 38, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), 20A11-G1m/VK2-28-kO0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 38, cadeia leve: SEQ ID NO: 4), 20A11-G1m/VK3-20-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 38, cadeia leve: SEQ ID NO: 5), 20A11- G1m/VL1-40-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 38, cadeia leve: SEQ ID NO: 6), 20A11-G1m/VL1-44-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 38, cadeia leve: SEQ ID NO: 7), 20A11-G1m/VL2-14-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 38, cadeia leve: SEQ ID NO: 8) e 20A11-G1m/VL3-21-laml (cadeia pesada: SEQ ID NO: 38, cadeia leve: SEQ ID NO: 9) obtidos foram avaliados quanto à sua ligação ao IL-6R do mesmo modo con- forme no Exemplo 3. Os resultados são mostrados na Figura 14. Como um resultado, nenhuma das cadeias leves usadas neste Exemplo inibiu a atividade de ligação de 20A11 ao IL-6R através da associação com a cadeia leve que contém a 20A11 fundida com a região constante de I9G1 de linhagem germinativa humana (CH1-dobradiça-CH2-CH3).
[0628] Isto é provavelmente em virtude do fato de que a 20411 não formou uma região variável estável com a VL usada neste Exemplo.
4-2 Introdução de alteração de aminoácido no local de interface en- tre a VHH e VL no polipeptídeo com VHH incorporada sem perder a ligação a antígeno
[0629] A fim de formar uma região variável estável entre a 20411 e a VL, mutações foram introduzidas nos aminoácidos presentes na inter- face entre a 20411 e a VL. Um vetor de expressão que codifica 20A11hu-G1m (SEQ ID NO: 39) que contém 20A11hu (derivado de 20A11 pela introdução de mutações para substituir F na posição 37 por V (F37V), R na posição 45 por L e G na posição 47 por W (todos de acordo com a numeração de Kabat)) (SEQ ID NO: 20) fundido com uma região constante de IgG1 humana (CH1-dobradiça-CH2-CH3) do mesmo modo conforme no Exemplo 3 foi preparado por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
[0630] Os polipeptídeos 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT (cadeia pe- sada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), 20A11hu-G1m/VK2- 28-kOMT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 4), 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 5), 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 6), 20A11hu-G1m/VL1-44-laml (cadeia pesada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 7), 20A11hu- G1m/VL2-14-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 8) e 20A11hu-G1m/VL3-21-lamL (cadeia pesada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 9) foram expressos e purificados do mesmo modo conforme no Exemplo 3 usando esta cadeia pesada e VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20- KOMT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8) e VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) como cadeias leves.
4-3 Avaliação de ligação de IL-6R de polipeptídeo com VHH incor- porada que contém alteração de aminoácido no local de interface entre a VHH e VL
[0631] 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-kO0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-laml, 20A11hu- G1m/VL1-44-lamL, 20A11hu-G1m/VL2-14-laml e 20A11hu-G1m/VL3- 21-lamL obtidos foram avaliados quanto à sua ligação ao IL-6R a 30 ºC ou 25 ºC do mesmo modo conforme no Exemplo 3. Os resultados são mostrados na Figura 15.
[0632] Como um resultado, foi mostrado que 20A11hu-G1m/VK1- 39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-laml, 20A11hu-G1m/VL1-44-laml. e 20A11hu- G1m/VL2-14-lamL são incapazes de se ligar ao IL-6R.
[0633] Estes resultados demonstraram que a VHH 20A11, a qual não perdeu sua atividade de ligação ao IL-6R através da associação com a VL usada no Exemplo 3, pode formar uma região variável estável com a VL e pode perder atividade de ligação ao IL-6R ao converter os aminoácidos presentes no local de interface entre a VHH e a VL para 37V, 45L e 47W (numeração de Kabat) e, deste modo, alterar a 20A11 para 20A11hu. 4-4 Introdução de sequência de clivagem pela protease no polipep- tídeo com VHH incorporada que contém alteração de aminoácido no local de interface entre a VHH e VL
[0634] 20A11huH1001 (SEQ ID NO: 40), 20A11huH1002 (SEQ ID NO: 41), 20A11huH1004 (SEQ ID NO: 42) e 20A411huH1006 (SEQ ID NO: 43) de cadeias pesadas foram preparados do mesmo modo con- forme no Exemplo 3 de forma que uma sequência de clivagem pela pro- tease (SEQ ID NO: 12) ou uma sequência de clivagem pela protease ligada a um ligante flexível (SEQ ID NO: 44) fosse inserida próximo do limite entre a 20A11hu e CH1.
[0635] Polipeptídeos 20A11huH1001/VK1-39-k0MT (cadeia pe- sada: SEQ ID NO: 40, cadeia leve: SEQ ID NO: 3), 20A11huH1002/VK1-
39-kO0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 41, cadeia leve: SEQID NO: 3), 20A11huH1004/VK1-39-kO0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 42, cadeia leve: SEQ ID NO: 3) e 20A11huH1006/VK1-39-kO0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 43, cadeia leve: SEQ ID NO: 3) foram expressos e purifica- dos do mesmo modo conforme no Exemplo 3 usando estas cadeias pe- sadas e VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) como uma cadeia leve. 4-5 Ativação de polipeptídeo que traz a sequência de clivagem pela protease através de clivagem pela protease
[0636] 20A11huH1001/VK1-39-k0MT, 20A11huH1002/VK1-39- KkOMT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT e 20A11huH1006/VK1-39-k0MT foram clivados pela protease do mesmo modo conforme no Exemplo 3 e o grau da clivagem foi avaliado através de SDS-PAGE redutivo. Os resultados são mostrados na Figura 16.
[0637] Como um resultado, foi confirmado que 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT e 20A11huH1006/VK1-39-k0MT sofrem clivagem pela protease próximo do limite entre a VHH e CH1.
[0638] Em seguida, a avaliação de ligação da VHH ao IL-6R libe- rada através de tratamento com protease foi conduzida a 30 ºC ou 25 ºC do mesmo modo conforme no Exemplo 3. Sensorgramas pelo Octet são mostrados na Figura 17.
[0639] Como um resultado, a ligação ao IL-6R foi confirmada em 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT e foi con- firmado que 20A11huH1006/VK1-39-k0MT sofre clivagem próximo do limite entre a VHH e CH1 através de tratamento com protease.
[0640] Estes resultados demonstraram que, mesmo se a VHH in- corporada em um polipeptídeo não perder sua atividade de ligação a antígeno imediatamente após associação com uma VL particular, a ati- vidade de ligação a antígeno pode ser perdida ao introduzir uma muta- ção que promove a associação em um aminoácido presente na interface entre a VHH e a VL.
[0641] A partir destes resultados, concluiu-se que a molécula de acordo com o conceito descrito no Exemplo 2 também pode ser prepa- rada por meio de um método de combinar uma cadeia leve com uma VHH que contém um aminoácido substituído envolvido na associação com a cadeia leve, além do método de combinar uma cadeia leve com a VHH obtida antecipadamente conforme no Exemplo 3. Exemplo 5 — Preparação de polipeptídeo ativado por protease usando VHH derivada de alpaca imunizada 5-1 Obtenção de VHH derivada de alpaca imunizada
[0642] Alpacas foram imunizadas com IL-6R, CD3 ou Plexina A1 por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica. 4 e 8 semanas depois, PBMCs foram coletadas. A partir das PBMCs co- letadas, o gene de VHH foi ampliado com referência a um método des- crito em J. Immunol. Methods (2007) 324, 13. O fragmento gênico de VHH ampliado foi conectado com o gene 3 e inserido em um vetor de fagemídeo. O vetor de fagemídeo que tem a inserção do fragmento de VHH foi transfectado em E. coli através do método de eletroporação e fagos que apresentam a VHH foram obtidos por meio de um método já conhecido por aqueles versados na técnica. Os fagos obtidos foram avaliados quanto à sua ligação ao IL-6R, CD3 ou Plexina A1 através de ELISA. A sequência do clone ligado foi analisada por meio de um mé- todo conhecido por aqueles versados na técnica para identificar a VÓHH que se liga ao antígeno. 5-2 Enriquecimento de VHH que se liga à CD3
[0643] VHH que se liga à CD3 humana foi identificada a partir da biblioteca de VHH construída no Exemplo 5-1. Clones de VHH que tem capacidade de ligação contra a CD3 humana foram enriquecidos usando uma proteína marcada com biotina que contém CD3e humana e CD35 humana ligada a uma região constante de anticorpo humano
(CD3ed-Fc humano) como um antígeno. CD3ed-Fc humano foi prepa- rado como segue: um vetor de expressão para células de animal que tem um gene que codifica a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 59, um gene que codifica a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 60 e um gene que codifica BirA (SEQ ID NO: 58) foi transfectado em células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.). Após a transfecção, L-biotina foi adicionada ao mesmo e a biotinilação foi realizada em uma solução de cultura. A cultura de células foi reali- zada ao agitar a cultura a 37 ºC de acordo com o protocolo. 4 a 5 dias depois, o sobrenadante foi coletado. A partir do sobrenadante, uma pro- teína fundida com região constante de anticorpo foi obtida usando uma coluna de proteína A (Eshmuno A (Merck KGaA)). Com a finalidade tam- bém de obter apenas um heterodímero de CD3eô, uma fração do hete- rodímero de CD3:8 fundida com a região constante de anticorpo (deno- minado como CD3ed-Fc humano) foi separada usando coluna Anti- FLAG M2. Subsequentemente, cromatografia de filtragem em gel (Su- perdex 200, GE Healthcare Japan Corp.) foi realizada para obter a fra- ção do heterodímero de CD3eô de interesse (denominado como CD3ed- Fc humano).
[0644] A produção de fago foi realizada a partir de E. coli que retém os fagemídeos construídos para visualização em fagos. Uma população de fagos foi precipitada mediante adição de NaCl a 2,5 M/PEG a 10 % à solução de cultura de E. coli após a produção de fagos e, em seguida, diluída com TBS para obter uma solução de biblioteca de fagos. Em seguida, BSA foi adicionado à solução de biblioteca de fagos a fim de obter uma concentração final de BSA de 4 %. Panning foi realizado com referência a um método de panning geral usando um antígeno imobili- zado sobre esferas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Imnmunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog.
(2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As es- feras magnéticas usadas foram esferas revestidas com NeutrAvidina (FG Beads NeutrAvidin) ou esferas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads MyOne Streptavidin T1).
[0645] Especificamente, 100 pmol do antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fagos preparada e a solu- ção de biblioteca de fagos foi contatada com o antígeno em temperatura ambiente durante 60 minutos. As esferas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à mesma e os complexos do antígeno e dos fagos foram deixados se ligar às esferas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As esferas foram lavadas duas vezes com 0,5 mL de TBST (TBS que contém Tween 20 a 0,1 %; TBS foi fabricado pela Takara Bio Inc.) e, então, também lavadas uma vez com 0,5 mL de TBS. Em seguida, 0,5 mL de tripsina a 1 mg/mL foram adicionados à mesma e as esferas foram suspensas em temperatura ambiente du- rante 15 minutos e, imediatamente depois disso, separadas usando um suporte magnético para recuperar uma solução de fagos. A solução de fagos recuperada foi adicionada a 20 mL de uma cepa de E. coli ER2738 em um estágio exponencial de crescimento (OD600: 0,4-0,5). A E. coli foi cultivada com agitação branda a 37 ºC durante 1 hora e, deste modo, infectada pelos fagos. A E. coli infectada foi inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram recuperados da solução de cultura da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fagos. Este ciclo, denominado panning, foi repetido duas vezes. No segundo ciclo de panning, as esferas foram lavadas três vezes com TBST e subsequentemente duas vezes com TBS. Além disso, 4 nmol de Fc humano foram adicionados no caso de panning contra o CD3ed- Fc humano. 5-3 Preparação de molécula similar a anticorpo IgG ativada pela protease com ligação de VHH incorporada à CD3
[0646] Uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de VHH (Tabela 2) de cada clone de ligação para CD3 humana obtido no Exemplo 5-1 ou 5-2 foi conectada a uma sequência de nucleotídeos que codifica o sítio de clivagem pela protease e uma região constante por meio do método descrito no Exemplo 3 e inserida em um vetor de ex- pressão para células de animal. O resultante foi usado como a cadeia pesada de uma molécula similar a anticorpo IgG. Tabela 2 Ligação de VHH a CD3 humana [FORRO
[0647] Moléculas similares a anticorpo IgG ativadas pela protease mostradas na Tabela 3 abaixo foram expressas através de expressão transitória usando células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificadas por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica usando proteína A. Tabela 3 Moléculas similares a anticorpo IgG ativadas por protease com uma VHH incorporada que se liga a VCD3 | resort | ão | ess | = 5-4 Ativação de molécula similar a anticorpo IgG ativada pela pro- tease através de clivagem pela protease
[0648] As moléculas similares a anticorpo IgG preparadas no Exem- plo 5-3 foram clivadas pela protease do mesmo modo conforme no Exemplo 3 e o grau da clivagem foi avaliado através de SDS-PAGE re- dutivo. Os resultados são mostrados na Figura 18. A concentração de protease foi definida para 25 nM e Octet RED (Pall ForteBio Corp.) foi usado no ensaio.
[0649] Como um resultado, foi confirmado que as moléculas simila- res a anticorpo IgG sofrem clivagem pela protease em uma sequência de clivagem pela protease.
[0650] Em seguida, a avaliação de ligação à CD3 da VHH liberada através de tratamento com protease foi conduzida do mesmo modo con- forme no Exemplo 3. Sensorgramas Octet são mostrados na Figura 19.
[0651] Como um resultado, as moléculas similares a anticorpo IgG bC3edL1IRIN160H01-G1mMISHIO1/VK1-39-k0MT, bC3edL1IRIN161H01-G1mISHIO1/VK1-39-k0MT e bC3edL1RIN164H01-G1ImISHIO1/VK1-39-k0MT não exibiram ligação a antígeno antes de um tratamento com protease, enquanto que a ligação a antígeno foi confirmada após um tratamento com protease. A plurali- dade de VHHs que se ligam às moléculas de CD3, obtidas do mesmo modo conforme na VHH descrita na Tabela 2, também foi usada para preparar uma molécula similar à IgG que contém o mesmo sítio de cli- vagem pela protease conforme nas moléculas similares a anticorpo IgG descritas na Tabela 3. Como um resultado, a ligação a antígeno foi con- firmada através de tratamento com protease. Estes resultados demons- traram que, além dos polipeptídeos mostrados nos Exemplos 3 e 4, uma molécula similar a anticorpo IgG que traz uma sequência de clivagem pela protease pode sofrer clivagem em uma sequência de clivagem pela protease através de tratamento com protease e, deste modo, liberar o domínio de ligação a antígeno e o domínio de ligação a antígeno libe- rado pode se ligar ao antígeno.
Exemplo 6 - Polipeptídeo que traz sequência de clivagem pela pro- tease em sua cadeia leve
[0652] Cadeias leves VK1-39P-2-PKOMT (SEQ ID NO: 67), VK1- 39P-1-PKOMT (SEQ ID NO: 68), VK1-39P-PKOMT (SEQ ID NO: 69), VK1-39P+2-PKOMT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3-PkOMT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-PKkOMT (SEQ ID NO: 72) e VK1-39P+5-PkKkOMT (SEQ ID NO: 73) que trazem uma sequência de clivagem pela protease em cada posição foram preparadas do mesmo modo conforme no Exemplo
3.
[0653] Moléculas similares a anticorpo IgG foram expressas e puri- ficadas do mesmo modo conforme no Exemplo 3 usando estas cadeias leves e IL-6R90-G1m (SEQ ID NO: 2) como uma cadeia pesada. A con- centração de protease foi definida para 25 nM. IL-6R90-G1m/VK1-39- KOMT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 3) foi usado como uma molécula similar a anticorpo IgG não que traz ne- nhuma sequência de clivagem.
[0654] Subsequentemente, as moléculas similares a anticorpo IgG preparadas foram clivadas pela protease do mesmo modo conforme no Exemplo 3 e o grau da clivagem foi avaliado através de SDS-PAGE re- dutivo. Os resultados são mostrados na Figura 20. Como um resultado, foi confirmado que VK1-39P+2-PkKkOMT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3- PKOMT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-PKOMT (SEQ ID NO: 72) e VK1- 39P+5-PKOMT (SEQ ID NO: 73) sofrem clivagem pela protease em uma sequência de clivagem pela protease. A avaliação de ligação ao IL-6R da VHH exposta através de tratamento com protease também foi con- duzida do mesmo modo conforme no Exemplo 3. Sensorgramas Octet são mostrados na Figura 21. Como um resultado, a ligação também foi confirmada através de um tratamento com protease de uma sequência de clivagem introduzida na cadeia leve, demonstrando que um polipep- tídeo ativado pela protease que traz uma sequência de clivagem pela protease em sua cadeia leve pode ser obtido, de modo que o domínio de ligação a antígeno seja exposto para exibir a capacidade de ligação a antígeno através de clivagem da cadeia leve pela protease.
Exemplo 7 — Biblioteca que contém cadeia pesada que tem domínio de ligação a antígeno e cadeia leve que traz sequência de clivagem pela protease e obtenção de polipeptídeo ativado pela protease por meio de um método de visualização em fagos a partir da biblioteca
[0655] Como confirmado no Exemplo 6, mesmo quando uma se- quência de clivagem pela protease é introduzida na cadeia leve de um polipeptídeo ativado pela protease, o domínio de ligação a antígeno é exposto após clivagem da cadeia leve para se ligar ao antígeno.
[0656] Consequentemente, uma cadeia pesada que contém um do- mínio de ligação a antígeno, tal como um anticorpo com um único do- mínio, e uma cadeia leve que traz uma sequência de clivagem pela pro- tease são incorporadas em um fagemídeo e deixadas se apresentadas por um fago. Uma pluralidade de fagemídeos para visualização em fa- gos que contém diferentes tipos de domínios de ligação a antígeno é construída, seguido por produção de fagos a partir de E. coli que retém estes fagemídeos. Uma população de fagos é precipitada mediante adi- ção de NaCl a 2,5 M/PEG a 10 % à solução de cultura de E. coli após produção de fagos e, então, diluída com TBS para obter uma solução de biblioteca de fagos. BSA é adicionado à solução de biblioteca de fa- gos de modo a obter uma concentração final de BSA de 4 %.
[0657] O polipeptídeo ativado pela protease é obtido por meio de panning da biblioteca de fagos assim preparada. O panning é realizado com referência a um método de panning genérico usando um antígeno imobilizado em esferas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Inmunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). Fagos não ligados às esferas magnéticas imobilizadas no antígeno são recuperados antes da adição de protease e fagos ligados às esferas magnéticas imobilizadas no antígeno são recuperados após adição de protease. As esferas magnéticas usadas são esferas revestidas com NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated, FG beads NeutrAvidin) ou esferas revestidas com estreptavidina (Dynabeads M- 280 Streptavidin). Um clone de ligação a antígeno pode ser selecionado a partir dos fagos recuperados através de ELISA de fagos descrito na seção anterior ou o gene de anticorpo é subclonado em um vetor para expressão em animais e expresso usando células de animal e a ativi- dade de ligação é comparada entre antes e após o tratamento com pro- tease para selecionar clones de ligação. Exemplo 8 — Biblioteca que contém cadeia pesada que tem domínio de ligação a antígeno e cadeia leve e obtenção de cadeia pesada cuja capacidade de ligação a antígeno é controlada pela cadeia pe- sada por meio de um método de visualização em fagos a partir da biblioteca
[0658] Como confirmado no Exemplo 3, a capacidade de ligação a antígeno de uma cadeia leve que contém um domínio de ligação a antí- geno é controlada pela associação de uma cadeia leve. Consequente- mente, uma cadeia leve que perde sua capacidade de ligação a antí- geno quando associada com uma cadeia leve e exibe capacidade de ligação a antígeno quando apresentada individualmente ou em combi- nação com uma região constante de cadeia leve é obtida por meio do método de visualização em fagos.
[0659] Uma cadeia pesada que contém um domínio de ligação a antígeno, tal como um anticorpo com um único domínio, é incorporada em um fagemídeo e apresentada por um fago. Uma pluralidade de fa- gemídeos para visualização em fagos que contêm diferentes tipos de domínios de ligação a antígeno é construída, seguido por produção de fagos a partir de E. coli que retém estes fagemídeos. Uma população de fagos é precipitada mediante adição de NaCl a 2,5 M/PEG a 10% à solução de cultura de E. coli após a produção de fagos e, então, diluída com TBS para obter uma solução de biblioteca de fagos. BSA é adicio- nado à solução de biblioteca de fagos de modo a obter uma concentra- ção final de BSA de 4%.
[0660] A cadeia pesada que exibe capacidade de ligação a antígeno quando apresentada individualmente ou em combinação com uma re- gião constante de cadeia leve e perde sua capacidade de ligação a an- tígeno quando associada com a região variável de cadeia leve é obtida por meio de panning da biblioteca de fagos assim preparada. O panning é realizado com referência ao método de panning usando um antígeno imobilizado em esferas magnéticas descritas no Exemplo 5. Os fagos ligados às esferas magnéticas imobilizadas no antígeno são recupera- dos da biblioteca de fagos que apresenta cadeias pesadas ou cadeias pesadas com regiões constantes de cadeia leve. Os fagos recuperados são deixados infectar a E. coli e fagos que apresentam cadeias pesadas e leves são produzidos usando um fago auxiliar que expressa uma ca- deia leve. Fagos que apresentam uma cadeia pesada que contém um domínio de ligação a antígeno e uma cadeia leve são obtidos por meio do método supracitado da solução de cultura de E. coli após a produção de fagos. Fagos não ligados às esferas magnéticas imobilizadas no an- tígeno são recuperados da população de fagos que apresenta cadeias pesadas e leves.
[0661] Conforme mostrado na Figura 9D, panning pode ser reali- zado ao mudar a ordem da recuperação de uma população de fagos que apresenta uma cadeia pesada individualmente ou em combinação com uma região constante de cadeia leve que se liga às esferas mag- néticas imobilizadas no antígeno e recuperar uma população de fagos que apresenta cadeias pesadas e leves sem se ligar às esferas magné- ticas imobilizadas no antígeno. Além do método de expressão de uma cadeia leve usando um fago auxiliar, uma região que codifica uma ca- deia leve e uma região que codifica uma cadeia pesada podem ser in- corporadas ao mesmo fagemídeo conforme usual e um gene que codi- fica apenas uma região constante de cadeia leve ou uma cadeia leve de tamanho natural pode ser incorporado em cada ciclo de panning e usado.
[0662] Um clone de ligação a antígeno pode ser selecionado a partir dos fagos recuperados através de ELISA de fagos descrito na seção anterior ou o gene de anticorpo é subclonado em um vetor para expres- são de animal e expresso usando células de animal e a atividade de ligação é comparada entre antes e após o tratamento com protease para selecionar clones de ligação. Exemplo 9 — Obtenção de VHH cuja capacidade de ligação a antí- geno é controlada pela cadeia leve usando um método de visuali- zação em fagos e preparação de molécula similar a anticorpo IgG que contém a VHH
[0663] No Exemplo 3, foi confirmado que a capacidade de ligação a antígeno da VHH contida como um substituto para a VH em uma cadeia pesada é controlada pela associação com uma cadeia leve. Consequen- temente, uma VHH que perdeu sua capacidade de ligação a antígeno quando associada com uma cadeia leve particular e exibiu capacidade de ligação a antígeno quando a cadeia pesada foi apresentada individu- almente ou em combinação com uma região constante de cadeia leve, isto é, quando não associada com uma região variável de cadeia leve, foi obtida a partir de uma biblioteca de fagos que apresentam CH1 ligado à VHH derivada de PBMCs de alpacas imunizadas. Uma molécula simi- lar a anticorpo IgG que contém a VHH foi preparada. 9-1 Construção de fagos auxiliares que expressam cadeia leve com unidade de expressão de cadeia leve integrada
[0664] Com base em um método descrito no documento.
WO?2015/046554, um promotor, uma sequência sinalizadora, genes de região variável de cadeia leve de anticorpo e região constante de cadeia leve ou um gene de região constante de cadeia leve, etc. foram integra- dos no genoma de um fago auxiliar para construir um gene auxiliar que expressa cadeia leve. E. coli infectada com este fago auxiliar é capaz de expressar a região variável de cadeia leve e a região constante de cadeia leve de anticorpo ou apenas a região constante de cadeia leve.
[0665] Especificamente, o genoma foi extraído de um fago auxiliar M13KO7TC construído por meio do método descrito no documento WOZ2015/046554 e uma unidade de expressão de cadeia leve foi intro- duzida no genoma. Um gene que codifica uma região variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve (VK1-39-k0MTdC; SEQ ID NO: 152) ou um gene que codifica uma região constante de cadeia leve (KOMTdC; SEQ ID NO: 153) foi usado como o gene de cadeia leve a ser introduzido. O gene de cadeia leve-sequência sinalizadora pelB-promo- tor lac foi inserido em M13KO7TC/Sacl por meio do método descrito acima e transfectado em uma cepa de E. coli ER2738 através do mé- todo de eletroporação.
[0666] A E. coli obtida foi cultivada e NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionado ao sobrenadante de cultura para purificar os fagos auxiliares por meio do método de precipitação de PEG. As titulações dos fagos auxiliares M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC e M1I3KO7TC-kOMTdC obtidos foram confirmadas através do método de formação de placas genérico. 9-2 Preparação de biblioteca que contém uma pluralidade de molé- culas de VEH-CH1
[0667] As alpacas foram imunizadas por meio de um método conhe- cido por aqueles versados na técnica usando 4 tipos de imunogênios: um domínio extracelular humano de IL-6R, um heterodímero de CD3ey humana, um heterodímero de CD3ey de macaco e um domínio celular de Plexina A1 humana. 4 semanas depois, PBMCs foram coletadas. Os heterodímeros de CD3ey foram preparados com referência a Journal of Molecular Biology (2000) 302: 899-916. A partir das PBMCs coletadas, o gene de VHH foi ampliado com referência a um método descrito em J. Immunol. Methods (2007) 324, 13. O fragmento gênico de VHH am- pliado foi conectado o gene 3 de CH1 e inserido em vetores de fagemí- deo para preparar uma biblioteca que contém uma pluralidade de molé- culas de VHH-CH1 que contêm VHH ligada ao CH1. 9-3 Método para preparação de população de fagos que apresenta- VHH-CH1/cadeia leve de tamanho natural ou VHH-CH1/região cons- tante de cadeia leve
[0668] Um vetor de fagemídeo que tem uma inserção de um gene que codifica VHH-CH1 é transfectado em E. coli através do método de eletroporação. A E. coli obtida pode ser cultivada e infectada pelo fago auxiliar MI3KO7TC-Vk1-39-k0MTdC preparado no Exemplo 9-1, de modo que VHH-CH1 expressa a partir do vetor de fagemídeo e a cadeia leve de tamanho natural expressa a partir do fago auxiliar formem uma estrutura de Fab para preparar uma população de fagos que apresenta VHH-CH1/cadeia leve de tamanho natural (VHH-CH1/VKk1-39-k0MTdC) na superfície de fagemídeos que contêm o gene que codifica VHH-CH1. Além disso, a E. coli que traz o vetor de fagemídeo que tem uma inser- ção de um gene que codifica VHH-CH1 pode ser cultivada e infectada pelo fago auxiliar MI3KO7TC-kOMTdC preparado no Exemplo 9-1, de modo que VHH-CH1 expressa a partir do vetor de fagemídeo e a região constante de cadeia leve expressa a partir do fago auxiliar formem uma estrutura de VHH-CH1 e associada com a CL para preparar uma popu- lação de fagos que apresenta VHH-CH1/região constante de cadeia leve (VHH-CH1/kK0MTdC). NaCl a 2,5 M/PEG a 10% pode ser adicio- nado ao sobrenadante de cultura para purificar os fagos através do mé- todo de precipitação de PEG. As titulações dos fagos obtidos podem ser confirmadas através do método de formação de placas genérico.
9-4 Obtenção de VHH-CH1 que contêm VHH de Plexina A1 cuja li- gação a antígeno é inibida pela associação com região variável de cadeia leve e que exibe capacidade de ligação a antígeno na ausên- cia de região variável de cadeia leve a partir da biblioteca de fagos de VHH-CH1
[0669] VHH-CH1 que contêm VHH cuja ligação a antígeno foi ini- bida pela associação com uma região variável de cadeia leve e que exi- biu a capacidade de ligação a antígeno na ausência da região variável de cadeia leve foi obtida por meio de panning da biblioteca de VHH-CH1 preparada no Exemplo 9-2.
[0670] O antígeno usado foi Plexina Atl humana marcada com bio- tina preparada no Exemplo de Referência.
[0671] O método de panning foi realizado de acordo com as seguin- tes etapas: (1) Uma população de fagos que apresenta VHH-CH1/região constante de cadeia leve (VHH-CH1/k0MTdC) é produzida através do método do Exemplo 9-3 a partir da biblioteca de fagos de VÓHH-CH1 preparada no Exemplo 9-2 e fagos ligados às esferas magnéticas imobilizadas no an- tígeno são recuperados da população.
(2) Uma população de fagos que apresenta VHH-CH1/cadeia leve de tamanho natural (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC) é produzida através do método do Exemplo 9-3 a partir dos fagos recuperados e fagos não |li- gados às esferas magnéticas imobilizadas no antígeno são recuperados da população.
(3) Os fagos recuperados são repetidamente submetidos às etapas (1) e (2) para recuperar o fago desejado.
[0672] Como um resultado de panning, foi possível selecionar uma pluralidade de moléculas de VHH-CH1 cuja ligação à Plexina A1 foi ini- bida pela associação com Vk1-39-k0MTdC de cadeia leve e que exibiam capacidade de ligação contra a Plexina A1 na ausência da região variá- vel de cadeia leve.
[0673] Outro método de panning foi realizado de acordo com as se- guintes etapas: (1) Uma população de fagos que apresenta VHH-CH1/região constante de cadeia leve (VHH-CH1/kK0OMTdC) é produzida através do método do Exemplo 9-3 a partir da biblioteca de fagos de VHH-CH1 preparada no Exemplo 9-2 e fagos ligados às esferas magnéticas imobilizadas no an- tígeno são recuperados da população. (2) Uma população de fagos que apresenta VHH-CH1/cadeia leve de tamanho natural (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC) é produzida através do método do Exemplo 9-3 a partir dos fagos recuperados e fagos não |li- gados às esferas magnéticas imobilizadas no antígeno são recuperados da população. Fagos que se ligam às esferas magnéticas imobilizadas em anticorpo anti-cadeia leve (EY Laboratories, Inc., Cat. BAT-2107-2) também são recuperados dos fagos recuperados. (3) Os fagos recuperados são, respectivamente, submetidos às etapas (1) e (2) para recuperar o fago desejado.
[0674] Como um resultado de panning, foi possível selecionar uma pluralidade de moléculas de VHH-CH1 cuja inibição à Plexina A1 foi ini- bida pela associação com Vk1-39-kO0MTdC de cadeia leve e que exibiam capacidade de ligação contra a Plexina A1 na ausência da região variá- vel de cadeia leve.
[0675] A VHH na VHH-CH1 assim selecionada através de panning pode ser usada na preparação de moléculas similares a anticorpo IgG. 9-5 Preparação de moléculas similares a anticorpo IgG ativadas com protease com VHH incorporada que se liga à Plexina A1
[0676] Uma sequência de nucleotídeos que codifica a VHH contida em cada molécula de VHH-CH1 selecionada no Exemplo 9-4 foi conec- tada a uma sequência de nucleotídeos que codifica o sítio de clivagem pela protease e uma região de cadeia pesada através do método des- crito no Exemplo 3. O resultante foi usado como a cadeia pesada de uma molécula similar a anticorpo IgG e combinado com a cadeia leve de tamanho natural VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3). Moléculas similares a anticorpo IgG foram expressas através de expressão transitória usando células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificadas por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica usando proteína A.
[0677] As moléculas similares a anticorpo IgG preparadas são mos- tradas na Tabela 4. Tabela 4 Moléculas similares a anticorpo IgG que contêm uma VHH que se liga à Plexina A1 humana asas ar ET De PX02-R2 001-G1mISHIO1 PX02-R2 001- 154 VK1-39- 3 IVK1-39-kOMT G1ImISHIO1 kOMT PX02-R4 004-G1mISHI01/VK1-39- PX02-R4 004- 185 kOMT G1ImISHIO1 PX02-R4 017-G1ImISHIO1 PX02-R4 017- 156 IVK1-39-kOMT GImISHIO1 PX03-R2 006-G1mISHIO1 PX03-R2 006- 17 IVK1-39-kOMT G1ImISHIO1 PX03-R4 009-G1mISHI01/VK1-39- PX03-R4 009- 158 kOMT G1ImISHIO1 9-6 Ativação de molécula similar a anticorpo IgG ativada pela pro- tease através de clivagem pela protease
[0678] As moléculas similares a anticorpo IgG preparadas no Exem- plo 94 foram clivadas pela protease do mesmo modo conforme no Exemplo 3 e o grau da clivagem foi avaliado através de SDS-PAGE re- dutivo. Os resultados são mostrados na Figura 22. A concentração de protease foi definida para 25 nM.
[0679] Como um resultado, foi confirmado que as moléculas simila- res a anticorpo IgG preparadas, cada uma, sofrem clivagem pela pro- tease em uma sequência de clivagem pela protease.
[0680] Em seguida, a avaliação de ligação à Plexina A1 humana da VHH liberada através de tratamento com protease foi conduzida do mesmo modo conforme no Exemplo 3. Sensorgramas Octet são mos- trados na Figura 23.
[0681] Como um resultado, cada molécula similar a anticorpo IgG preparada não exibiu ligação a antígeno antes de um tratamento com protease, enquanto que a ligação a antígeno da VHH liberada foi confir- mada após um tratamento com protease. Exemplo 10 - Polipeptídeo que contém VHH-VHH biespecífica 10-1 VHH-VHH biespecífica que se liga ao antígeno canceroso e CD3 e preparação de polipeptídeo que contém a VHH-VHH biespe- cífica
[0682] Conforme mostrado na Figura 8, o domínio de ligação a an- tígeno ativado pela protease pode formar uma molécula de ligação a antígeno biespecífica com um segundo domínio de ligação a antígeno.
[0683] VHH HN3 (SEQ ID NO: 159) que reconhece glipicana 3 hu- mana e VHH GO03 (SEQ ID NO: 160) que reconhece CD3 foram conec- tadas por meio de um ligante constituído por glicina e serina para pre- parar HN3GO03 de VHH-VHH biespecífica. Uma região constante de ca- deia pesada de anticorpo mostrada em SEQ ID NO: 161 também foi conectada à mesma por meio de uma sequência de clivagem pela pro- tease e HN3G03-cF760mnHIF de cadeia pesada resultante (SEQ ID NO: 162) que contém a VHH-VHH biespeciífica foi inserida em um vetor para expressão em animais.
[0684] VHH HerF07 (SEQ ID NO: 163) que reconhece Her2 e VAHH GO03 (SEQ ID NO: 160) que reconhece CD3 foram conectadas por meio de um ligante constituído por glicerina e serina para preparar a VHH-
VHH biespecífica HerF07GO03. Uma região constante de cadeia pesada de anticorpo mostrada em SEQ ID NO: 161 também foi conectada à mesma por meio de uma sequência de clivagem pela protease e HerFO07GO03-cF760mnHIF de cadeia pesada resultante (SEQ ID NO: 164) que contém a VHH-VHH biespecífica foi inserida um vetor para expressão em animais.
[0685] Células Expi293 (Life Technologies Corp.) foram cotransfec- tadas com cada cadeia pesada que contém a VHH-VHH biespeciífica e vetores para expressão de animais, respectivamente, que têm inser- ções de uma cadeia leve VK1.39-k0MT (SEQ ID NO: 3) e uma sequên- cia de região constante humana VHn-Kn010dGK (SEQ ID NO: 166) da região dobradiça até o C-término para expressar um polipeptídeo que contém a VHH-VHH biespecífica. Em seguida, o polipeptídeo que con- tém a VHH-VHH biespecífica foi purificado por meio de um método co- nhecido por aqueles versados na técnica usando um tipo de placa com 96 cavidades MonoSpin ProA (GL Sciences Inc., Cat. Nº: 7510-11312). O polipeptídeo que contém a VHH-VHH biespecífica HN3GO03 é HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT e o polipeptídeo que contém a VHH-VHH biespecífica HerFO07G03 é HerFO07G03- cF760mnHIF/VHn-Kn0 10dGK/VK1.39-k0MT.
[0686] Para tratamento com protease, uPA (Ativador de u-Plasmi- nogênio Humano, R&D Systems, Inc.) (concentração final: 25 nM) foi adicionado a 40 ug de cada polipeptídeo purificado que contém a VHH- VHH biespecífica e incubado a 37ºC durante 20 horas ou mais. Amos- tras não tratadas com protease foram incubadas após adição de PBS em vez de protease na mesma quantidade que a protease. Foi confir- mado se o polipeptídeo clivado pela protease que contém a VAH-VHH biespecífica sofreu clivagem conforme pretendido através de SDS- PAGE redutivo. Os resultados são mostrados na Figura 24. Conforme mostrado na Figura 24, foi sugerido que a VHH-VHH biespecífica foi separada da molécula completa através de clivagem pela protease. 10-2 Avaliação de ativação de CD3 de polipeptídeo que contém VHH-VHH biespecífica contra GPC3 e CD3 através de clivagem pela protease
[0687] A atividade agonística contra CD3 foi avaliada usando célu- las repórter Jurkat-NFAT (célula NFAT luc2 jurkat). As células repórter Jurkat-NFAT são uma linhagem de células derivadas de leucemia de células T aguda humana que expressa CD3 fundida com um elemento de resposta NFAT e luciferase (luc2P) e expressam luciferase pela ati- vação de sinal a jusante de CD3. As células alvo usadas para anticorpos com base em GPC3 foram uma linhagem de células SK-pca60 estabe- lecida ao forçar uma linhagem de células derivada de câncer de fígado humano SK-HEP-1 a expressar GPC3 humano. As células alvo e as células efetoras foram adicionadas a 1,25E+04 células/cavidade e 7,50E+04 células/cavidade, respectivamente, a cada cavidade da placa de ensaio com 96 cavidades de base redonda (Costar, 3917). HN3G03- cF760mnHIF/VHn-Kn0 10dGK/VK1.39-k0MT com ou sem tratamento com protease foi adicionado em uma concentração final de 1 nM, 10 nM ou 100 nM às cavidades. Após incubação de 24 horas a 37ºC na pre- sença de CO> a 5%, a atividade enzimática de luciferase foi medida como a intensidade de luminescência usando um sistema de ensaio de luciferase Bio-Glo (Promega Corp., G7940) de acordo com o protocolo anexo. 2104 EnVision foi usado na detecção. Os resultados são mos- trados na Figura 25. Nenhuma elevação na atividade de luciferase foi observada na amostra sem tratamento com protease, enquanto que uma elevação na atividade de luciferase foi mostrada em HN3GO03- cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT tratado com protease. Es- pecificamente, foi possível confirmar que HN3G03-cF760mnHIF/VHn- Kn010dGK/VK1.39-k0MT tratado com protease tem atividade agonís- tica contra CD3, enquanto que a VHH-VHH biespeciífica contra GPC3 e
CD3 foi liberada de HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39- KOMT através de clivagem pela protease e exerceu a atividade de liga- ção à CD3 inibida sem clivagem.
10-3 Avaliação de ativação de CD3 de polipeptídeo que contém VHH-VHH biespecífica contra Her2 e CD3 através de clivagem pela protease
[0688] A atividade agonística contra CD3 foi avaliada usando célu- las repórter Jurkat-NFAT (célula NFAT luc2 jurkat). As células repórter Jurkat-NFAT (células efetoras) são uma linhagem de células derivada de leucemia de células T aguda humana que expressa CD3 fundida com um elemento de resposta NFAT e luciferase (luc2P) e expressam luci- ferase pela ativação de um sinal a jusante de CD3. As células alvo usada foram uma linhagem de células LS1034. As células alvo e as cé- lulas efetoras foram adicionadas a 2,50E+04 células/cavidade e 7,50E+04 células/cavidade, respectivamente, a cada célula da placa de ensaio com 96 cavidades de fundo branco (Costar, 3917). HerF07G03- cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT com ou sem tratamento com protease foi adicionado em uma concentração final de 0,01 nM, 0,1 nM e 1 nM às cavidades. Após incubação de 24 horas a 37ºC na pre- sença de CO> a 5%, a atividade enzimática de luciferase foi medida como a intensidade de luminescência usando um sistema de ensaio de luciferase Bio-Glo (Promega Corp., G7940) de acordo com o protocolo anexo. 2104 EnVision foi usado na detecção. Os resultados são mos- trados na Figura 26. Nenhuma elevação na atividade de luciferase foi observada na amostra sem tratamento com protease, enquanto que uma elevação na atividade de luciferase foi mostrada em HerFO07GO03- cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT tratado com protease. Es- pecificamente, foi possível confirmar que HerF07GO03- cF760OmnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT tratado com protease tem atividade agonística contra CD3, enquanto que a VHH-VHH biespecífica contra Her2 e CD3 foi liberada de HerFO7G03-cF760mnHIF/VHn- Kn010dGK/VK1.39-k0MT através de clivagem pela protease e exerceu a atividade de ligação à CD3 inibida sem clivagem. Exemplo 11 - Introdução de vários sítios de clivagem pela protease no polipeptídeo com VHH incorporada 11-1 Introdução de várias sequências de clivagem pela protease no polipeptídeo com VHH incorporada que se liga ao IL-6R
[0689] Um vetor de expressão que codifica IL-B6R90-G1T4 (SEQ ID NO: 167) que contém IL-6R90 (SEQ ID NO: 1), VHH que tem atividades de ligação e neutralização contra IL-6R humano conforme descrito no documento WOZ2010/115998 fundida com uma região constante de I9gG1 humana (CH1-dobradiça-CH2-CH3) foi preparada por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica. Uma molécula si- milar a anticorpo IgG IL-6R90-G1T4/VK1-39-k0MT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 167, cadeia leve: SEQ ID NO: 3) foi expressa através de expressão transitória usando células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) ou células Expi293 (Life Technologies Corp.) por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificada por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica usando proteína A.
[0690] Várias sequências de clivagem pela protease foram inseri- das próximo do limite entre VHH e CH1 na cadeia pesada de IL-6R90- G1T4/VK1-39-k0MT. Vetores de expressão nos quais uma sequência de clivagem pela protease mostrada na Tabela 5 foi inserida próximo do limite entre a VHH e CH1 foram preparadas por meio de métodos co- nhecidos por aqueles versados na técnica. Sequências de cadeias pe- sadas que contêm VHH que trazem a sequência de clivagem pela pro- tease são mostradas na Tabela 6.
[0691] Estas cadeias pesadas foram combinadas com uma cadeia leve. Moléculas similares a anticorpo IIG1 mostradas na Tabela 7 que trazem a sequência de clivagem pela protease próximo do limite entre a
VHH e CH1 foram expressas de forma transitória usando células Fre- eStyle 293 (Invitrogen Corp.) ou células Expi293 (Life Technologies Corp.) de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificadas de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica usando proteína A.
Tabela 5 Sequências de clivagem pela protease Tabela 6 Cadeias pesadas que contêm VHH que trazem uma sequência de cliva- gem pela protease ELLE ERES — ELLE TEmEST Tabela 7 Moléculas similares a anticorpos IgG || Meme ce menta smart O ns | acameme | Nome da molécula similar a anticorpo IgG B : de cadeia pesada de cadeia leve ELLER Rg
11-2 Avaliação de clivagem pela protease de uma pluralidade de moléculas similares a anticorpo IgG que contêm VHH anti-IL-6R hu- mano e que traz sequência de clivagem pela protease na região de cadeia pesada
[0692] Foi verificado se as moléculas similares a anticorpo IgG pre- paradas no Exemplo 11-1 seriam clivadas pela protease. O Domínio Ca- talítico de Matriptase/ST14 Humana Recombinante (MT-SP1) (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) foi usado como a protease. Protease a 10 nM e anticorpo a 50 ug/mL foram reagidos em PBS sob uma condição de 37ºC durante 20 horas. Em seguida, a clivagem pela protease foi avaliada através de SDS-PAGE redutivo. Os resultados são mostrados na Figura 27. Como um resultado, tratamento com protease das molé- culas similares a anticorpo IgG que trazem qualquer uma das sequên- cias de clivagem pela protease gerou uma nova banda em torno de 37 kDa. Deste modo, foi confirmado que moléculas similares a anticorpo IgG sofrem clivagem pela protease nas sequências de clivagem pela protease (SEQ ID NO: 178) mostradas na Tabela 5 inseridas próximo do limite entre a VHH e CH1. Além disso, usando um método similar, foi confirmado que as sequências de clivagem pela protease mostradas na Tabela 5 são clivadas por uPA humano e uPA de camundongo quando elas são incorporadas em um anticorpo IgG. Exemplo 12 - Avaliação de grau de ativação através de clivagem pela protease de molécula similar a anticorpo IgG que traz sequên- cia de clivagem pela protease em sua cadeia leve
[0693] Um vetor de expressão que codifica IL-6R75-G1m (SEQ ID NO: 191) que contém IL-6R75 (SEQ ID NO: 190), VHH que tem ativida- des de ligação e neutralização contra IL-6R humano conforme descrito no documento WO2010/115998, fundida com uma região constante de I9G1 humana (CH1-dobradiça-CH2-CH3) foi preparado por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica. IL-6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) foi preparado introduzindo a alteração de aminoáci- dos no sítio de interface entre a VHH e VL do mesmo modo conforme no Exemplo 4-2. Moléculas similares a anticorpanticorpo IgG IL-6R90- G1m/VK1-39P+4-PKOMT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 2, cadeia leve: SEQ ID NO: 72), 20A11hu-G1m/ VK1-39P+4-PKOMT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 39, cadeia leve: SEQ ID NO: 72) e IL-BR75hu-G1m/VK1- 39P+4-PKOMT (cadeia pesada: SEQ ID NO: 192, cadeia leve: SEQ ID NO: 72) foram expressos e purificados do mesmo modo conforme no Exemplo 3 usando uma sequência VK1-39P+4-PKOMT de cadeia leve incorporada através de clivagem pela protease (SEQ ID NO: 72) e IL- 6R90-G1m (SEQ ID NO: 2), 20A11hu-Gim (SEQ ID NO: 39) e |IL- 6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) como cadeias pesadas.
[0694] IL-6R90-G1m/VK1-39P+4-PkOMT, 20A11hu-G1m/VK1- 39P+4-PKOMT e IL-6GR75hu-G1m/VK1-39P+4-PKkOMT foram clivados pela protease do mesmo modo conforme no Exemplo 3 e o grau da cli- vagem foi avaliado. Os resultados são mostrados na Figura 28. Especi- ficamente, o Domínio Catalítico de Matriptase/ST14 Humana recombi- nante (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) foi usado como a protease. Protease a 50 nM e 50 ug/mL de cada molécula similar a anticorpo IgG foram reagidos em PBS sob uma condição de 37 ºC durante 20 horas. Em seguida, a clivagem pela protease foi avaliada através de SDS- PAGE redutivo. Como um resultado, foi confirmado que IL-6R90- G1m/VK1-39P+4-PKOMT, 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-PKOMT e |IL-
6R75hu-G1m/VK1-39P+4-PKkOMT sofrem clivagem pela protease pró- ximo do limite entre a VL e a CL.
[0695] Em seguida, a ligação ao IL-6R da VHH exposta através de tratamento com protease foi avaliada através de ELISA. Especifica- mente, hslL-6R-BAP1 usado no Exemplo 3 foi imobilizado em uma placa com 384 cavidades revestidas com estreptavidina (Greiner Bio-One GmbH, 781990) e cada molécula similar a anticorpo IgG clivada foi dei- xada se ligar à mesma em temperatura ambiente. Após reação durante minutos, um anticorpo anti-lgG humano marcado com HRP (Sigma- Aldrich Co. LLC, SAB3701362-2MG) foi deixado atuar sobre as mesmas em temperatura ambiente durante 10 minutos e Solução Cromogênica TMB (Life Technologies Corp., 002023) foi reagida com as mesmas. Após reação em temperatura ambiente durante 30 minutos, a reação foi terminada com ácido sulfúrico, seguido pela avaliação de absorbância a 450 nm usando um leitor de múltiplos modos Synergy HTX (BioTek Instruments, Inc.). A proporção de absorbância de cavidades imobiliza- das com antígeno para cavidades não imobilizadas foi calculada e usada como uma proporção S/N. A proporção S/N (média) de ELISA foi representada na ordenada contra a concentração de cada molécula si- milar a anticorpo IgG na abscissa. Os resultados são mostrados na Fi- gura 29. Estes resultados mostraram que a molécula similar a anticorpo IgG tratada com protease 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-PKOMT que traz a sequência de clivagem em sua cadeia leve tinha 10 ou mais vezes a atividade de ligação ao IL-6R da molécula similar a anticorpo IgG não tratada com protease e a molécula similar a anticorpo IgG tratada com protease IL-6R90-G1m/VK1-39P+4-PKOMT tinha 1000 ou mais vezes a atividade de ligação ao IL-6R daquela não tratada com protease. Exemplo 13 — Preparação e avaliação de moléculas similares a an- ticorpo IgG que trazem diversas sequências de clivagem pela pro- tease
13-1 Preparação de polipeptídeos que trazem diversas sequências de clivagem pela protease
[0696] Moléculas de similares a anticorpo IgG foram preparadas do mesmo modo conforme no Exemplo 3 usando sequências de reconhe- cimento de proteases diferentes de uroquinase ou matriptase. Várias sequências peptídicas conhecidas por serem clivada por MMP-2, MMP- 7, MMP-9 ou MMP-13 foram, cada uma, inseridas próximo do limite en- tre as regiões variáveis e constantes de IL-68R90-G1m e uma sequência peptídica que contém um ligante flexível que consiste em um polímero de glicina-serina foi inserida na proximidade destas sequências de cli- vagem. As sequências inseridas são mostradas na Tabela 8. Tabela 8 Várias sequências inseridas es ae PLGLAG 34 MMP-9
RR GAGVALSIVSGAS Loaees | esses | sm GGGGSPLGLAGGGGGS 193 MMP-9 Comes eecescravrsivsenedess ss
[0697] As cadeias pesadas foram concebidas de modo que estas sequências fossem inseridas próximo do limite entre as regiões cons- tantes e variáveis de IL-6R90-G1m. Vetores de expressão que codificam as variantes de cadeia pesada G6R90EIVHEMP?2.1-6R90ElI- CHEMP2.1G1m (SEQ ID NO: 165), 6R90EIVHEMP2.2-6R90ElI- CHEMP2.2G1m (SEQ ID NO: 202), 6R90EIVHEMP?2.3-6R90El-
CHEMP2.3G1m (SEQ ID NO: 203), 6R90EIVHEMP2.4-6R90EI- CHEMP2.4G1m (SEQ ID NO: 204), 6R90EIVHEMP7.1-6R90El- CHEMP7.1G1m (SEQ ID NO: 205), 6R90EIVHEMP7.2-6R90El- CHEMP7.2G1m (SEQ ID NO: 206), 6R90EIVHEMP13-6R90ElI- CHEMP13G1m (SEQ ID NO: 207), 68R90EIVHEG4SMP2MP9GA4S- 6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m (SEQ ID NO: 196), 6R90EI- VHEGA4SMP2.2G4S-6R90EIVHEG4SMP2.2G4SG1m (SEQ ID NO: 197) e 8R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EIVHEG4SMP9G4SG1m (SEQ ID NO: 198) foram preparados por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
[0698] A Tabela 9 mostra as moléculas similares a anticorpo IgG que combinam estas variantes de cadeia pesada com uma cadeia leve e que trazem uma sequência de clivagem pela protease próximo do li- mite entre as regiões variáveis e constantes de cadeia pesada. Estas moléculas similares a anticorpo IgG foram expressas através de expres- são transitória usando células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) ou célu- las Expi293 (Life Technologies Corp.) por meio de um método conhe- cido por aqueles versados na técnica e purificadas por meio de um mé- todo conhecido por aqueles versados na técnica usando proteína A. Tabela 9 Moléculas similares a anticorpo IgG Protease Molécula similar a anticorpo IgG Ú de cadeia pesada deia leve is ssa e a MMP-2 165 3 IVK1-39-kOMT ss es a MMP-7 205 3 VK1-39-kOM
E RN MMP-7 206 3 IVK1-39-kOMT MMP-2 6R90EIVHEG4SMP2MP9GA4S-6R90EI- 3 Lines | cmssenocsem venta | | | sus | 13-2 Avaliação de clivagem pela protease de moléculas similares a anticorpo IgG que trazem diversas sequências de clivagem pela protease
[0699] Foi verificado se as moléculas similares a anticorpo IgG pre- paradas no Exemplo 13-1 podem ser clivadas pela protease. MMP-2 recombinante humana (R&D Systems, Inc., 902-MP-010), MMP-7 re- combinante humana (R&D Systems, Inc., 907-MP-010), MMP-9 recom- binante humana (R&D Systems, Inc., 911-MP-010) ou MMP-13 recom- binante humana (R&D Systems, Inc., 511-MM-010) foi usada como a protease. MMP-2, MMP-7, MMP-9 e MMP-13 foram usadas após serem, cada uma, misturadas com acetato aminofenilmercúrico a 1 MM (APMA; Abcam PLC, ab112146) e ativadas a 37ºC durante 1 hora ou 24 horas. Protease a 50 nM, 100 nM ou 500 nM e 50 ug/mL ou 100 ug/mL de cada molécula similar a anticorpo IgG foram reagidos em PBS ou Tris-HCl a mM, NaCl a 150 mM e CaClz a 5 mM (pH de 7,2) (daqui em diante denominado como Tris) sob uma condição de 37ºC durante 20 horas. Em seguida, a clivagem pela protease foi avaliada através de SDS- PAGE redutivo. Os resultados são mostrados nas Figuras 30A e 30B. Na Figura 30B, a clivagem pela protease foi realizada usando um tam- pão de ensaio (Kit MMP Activity Assay (Fluorometric - Green) (ab112146), Componente C: Tampão de ensaio).
[0700] Como um resultado, foi confirmado que 8R90EIVHEMP?2.1- 6R90EICHEMP?2.1G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.2-6R90E]- CHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.3-6R90E!- CHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.4-6R90El- CHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT, 8GBR90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90E!-
CHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT e 6R90EI- VHEGA4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k0MT fo- ram confirmados ser clivados por MMP-2. 6R90EIVHEMP7.1-6R90EI- CHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT e 6R90EIVHEMP7.2-6R90El- CHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MT são clivados pela MMP-7. Foi confir- mado que 6R90EIVHEG4SMP2MP9GA4S-6R90EI- CHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT e 6R90EIVHEG4SMP9GAS- 6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MT são clivados pela MMP-9. Foi confirmado que 6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39- KkOMT é clivado pela MMP-13.
Exemplo 14 - Avaliação de várias sequências de clivagem pela pro- tease 14-1 Preparação de variantes de anticorpos que contêm várias se- quências de clivagem pela protease
[0701] As sequências de clivagem pela protease mostradas na Ta- bela 10 foram inseridas próximo do limite entre a região variável de ca- deia leve e a região constante de anticorpo que tem a cadeia pesada de SEQ ID NO: 831 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 832 para preparar variantes de cadeia leve que trazem diferentes sequências de clivagem pela protease (Tabela 11).
[0702] As variantes de cadeia leve que trazem a sequência de cli- vagem pela protease preparada conforme descrito acima foram combi- nadas com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 831 e as variantes de anti- corpo mostradas na Tabela 12 foram expressas transitoriamente usando células Expi293 (Life Technologies) de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificadas de acordo com um método conhecido pelos versados na técnica usando a proteína A.
Tabela 10 Sequências de clivagem pela protease Tabela 11 Variantes de cadeia leve Tabela 12 Variantes de anticorpo
[0703] 14-2 Avaliação da clivagem pela protease de variantes de anticorpo que trazem uma sequência de clivagem pela protease
[0704] As variantes de anticorpo preparadas em 14-1 foram testa- das para verificar se seriam clivadas pelo tratamento com protease. À protease usada foi Ativador de Plasminogênio humano recombi- nante/Uroquinase (UPA humano, huPA) (R&D Systems; 1310-SE- 010). Os anticorpos foram deixados reagir durante uma hora sob as con- dições de protease a de 40 nM, variante de anticorpo a 100 ug/mL, PBS e 37ºC e depois submetidos a SDS-PAGE redutivo. Os resultados con- firmaram que todas as variantes de anticorpos que trazem a sequência de clivagem pela protease foram clivadas através de tratamento com protease. Em outras palavras, foi mostrado que as sequências de cliva- gem pela protease na Tabela 10 podem ser clivadas pela pro- tease. Além disso, as variantes de anticorpos que não G7L.106a.12aa foram todas clivadas com mais eficiência do que G7L.106a.12aa. Exemplo 15 - Avaliação de várias sequências de clivagem pela pro- tease 15-1 Preparação de variantes de anticorpos que contêm sequên- cias de clivagem pela protease
[0705] Além das sequências de clivagem pela protease descobertas no Exemplo 14, a exploração de sequências de clivagem pela protease foi ainda realizada para melhorar a eficiência da clivagem e a seletivi- dade da protease. As sequências de clivagem pela protease mostradas na Tabela 13 foram inseridas próximo do limite entre a região variável de cadeia leve e a região constante de anticorpo com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 831 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 832 para preparar variantes da cadeia leve que trazem diferentes sequências de clivagem pela protease (Tabelas 14 e 15). Tabela 13 Sequências de clivagem pela protease
FL AS — LAB CI OOOSSSAAS — ELE GAS
ELE OSS LL sessao — LA sean —
ELE OSS
EEE II OSS LL ses — Ls sao
PE gs
LA IAH PE sms — Ls es Tabela 14 Variantes de cadeia leve LLLLOE IgumanTAR LL uma LL amam LLLLOE GumaTAR LL Ioga
LL orar — EL E OOGRaTAA — LL eram — ELLE OO Farm — ELE oOAOETITA Ls out —
Tabela 15 Variantes de anticorpo LEE Tt
Lo [O oa [O era a oe Tg [ora a Og ee RR O
15-2 Avaliação da clivagem pela protease de variantes de anticorpo que trazem uma sequência de clivagem pela protease
[0706] As variantes de anticorpo preparadas em 15-1 foram testa- das para verificar se seriam clivadas através de tratamento com pro- tease. A protease usada foi o Ativador Plasminogênio humano recombi- nante /Uroquinase (uPA humano, huPA) (R&D Systems; 1310-SE-010) ou domínio catalítico humano recombinante de Matriptase/ST14 hu- mano (MT-SP1 humano, hMT-SP1) (R&D Systems; 3946-SE-010). As variantes de anticorpo foram deixadas reagir durante uma hora sob as condições de huPA a 40 nM ou hMT-SP1 a 3 nM, variante de anticorpo a 100 ug/mL, PBS e 37 “ºC e depois submetidas a um imunoensaio por eletroforese capilar. Wes (Protein Simple) foi usado para o imunoensaio de eletroforese capilar e um anticorpo marcado com HRP anti-cadeia lambda humana (abcam; ab9007) foi usado para detectar cadeias leves antes e após a clivagem. Como um resultado, um pico de aproximada- mente 36 kDa encontrado antes do tratamento com protease desapare- ceu e um novo pico apareceu a aproximadamente 20 kDa. Isto sugere que o pico de aproximadamente 36 kDa era a cadeia leve não clivada da variante de anticorpo e o pico de aproximadamente 20 kDa era a cadeia leve clivada. A área de cada pico obtido após o tratamento com protease foi produzida usando o software fornecido pela Wes (Compass for SW; Protein Simple) e a proporção de clivagem (%) da variante de anticorpo foi determinada com a seguinte fórmula: (Área de pico da cadeia leve clivada) x 100 / (Área de pico da cadeia leve clivada + Área de pico da cadeia leve não clivada)
[0707] As proporções de clivagem (%) das variantes de anticorpos tratadas com huPA são mostradas na Tabela 16 e as proporções de clivagem das variantes de anticorpos tratadas com hMT-SP1 são mos- tradas na Tabela 17. Dentre as variantes de anticorpos mostradas nas Tabelas 16 e 17 supracitadas, aquelas com uma proporção de clivagem mais alta com huPA, mas com uma proporção de clivagem mais baixa com hMT-SP1, em outras palavras, maior seletividade em relação a huPA do que G7L.106a.12aa (cadeia pesada: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 831), cadeia leve: G7L.106a.12aa-LTO (SEQ ID NO: 952)), são mostra- das na Tabela 18. Tabela 16 Proporções de clivagem de variantes de anticorpo (huPA)
Tabela 17 Proporções de clivagem de variantes de anticorpo (hnMT-SPI)
Tabela 18 Variantes de anticorpo
SEQIDNO SEQIDNO LL ERR JD E gr LL ER o ar
LL ERR ER LL RE Da ar LL ERR RR e OO FOR Emo EXEMPLO 16 - Avaliação de clivagem in vivo de variantes de anti- corpo que contêm várias sequências de clivagem pela protease 16-1 Preparação de anticorpos biespecíficos que contêm sequên- cias de clivagem pela protease
[0708] As sequências de clivagem pela protease mostradas na Ta- bela 19 foram inseridas próximo do limite entre a região variável de ca- deia leve e a região constante de anticorpos (anticorpos precursores) com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 1051 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 832 para preparar variantes de cadeia leve que contêm diferentes sequências de clivagem pela protease (Tabela 20).
[0709] As variantes de cadeia leve que trazem a sequência de cli- vagem pela protease preparada conforme descrito acima e a cadeia leve de SEQ ID NO: 832 foram combinadas com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 1051 e as variantes de anticorpos mostradas na Tabela 21 foram expressas transitoriamente usando células Expi293 (Life Techno- logies) de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica purificadas de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica usando a proteína A.
[0710] Além disso, um anticorpo contra hemocianina de lapa, MabKLHn (cadeia pesada: IC17HdK-F760mnN17 (SEQ ID NO: 1390), cadeia leve: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1391)) também foi expresso transi- toriamente usando células Expi293 (Life tecnologias) de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica e purificado usando a proteína A de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica .
[0711] MabKLHpn foi misturado com as variantes de anticorpos mos- tradas na Tabela 21 ou com o anticorpo precursor com a cadeia pesada de SEQ ID NO: 1051 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 832 para preparar os anticorpos biespecíficos mostrados na Tabela 22 por meio do método descrito no documento WO 2015046467. Tabela 19 Sequências de clivagem pela protease Tabela 20 Variantes de cadeia leve Tabela 21 Variantes de anticorpo Tabela 22 Anticorpos biespecíficos [E To ga RREO AEE Nome do anticorpo biespecí- | SEQ ID NO de cadeia | SEQ ID NO de cadeia | SEQ ID NO de cadeia | SEQ ID NO de cadeia fico pesada leve pesada leve
16-2 Produção de uma linhagem de células que expressa protease de forma estável
[0712] B16F10/chGPC3/mMUuPA foi usado como uma linhagem de células que expressa de forma estável a protease a ser transplantada em camundongos. Esta linhagem de células foi produzida ao introduzir um gene de Glipicana 3 quimérico de camundongo modificado (chGPC3) e um gene de uPA (muPA: NM 008873) de camundongo em uma linhagem de células de melanoma de camundongo, B16F10 e es- tabelecer e depois clonar uma linhagem de células de expressão está- vel. As células B16F10/chGPC3/mMuPA foram cultivadas em meio RPMIN640 (Nacalai Tesque) que contém FBS a 10 % (SIGMA), Geneti- cina a 0,5 mg/mL (Gibco) e Puromicina a 1,5 ug/mL (Gibco). 16-3 Produção de um modelo de camundongo transplantado com linhagem tumoral singeneica
[0713] Os animais usados para o transplante foram camundongos C57BL/6NCrI (seis semanas de idade, do sexo feminino) adquiridos a partir de Charles River Laboratories. Células B16F10/chGPC3/muPA fo- ram transplantadas por via subcutânea para camundongos C57BL/G6NCrI (166 células por animal). Quando o volume médio do tu- mor transplantado atingiu cerca de 200 mm? a 300 mm3?, os camundon- gos foram usados como modelo de camundongos aos quais um anti- corpo variante foi administrado.
[0714] O volume do enxerto tumoral foi calculado com a seguinte fórmula: Volume tumoral = diâmetro longo x diâmetro curto x diâmetro curto/2 16-4 Preparação dos agentes a serem administrados
[0715] As variantes de anticorpo que trazem as sequências de cli- vagem pela protease mostradas na Tabela 22 produzidas no Exemplo 16-1 foram usadas como agentes a serem administrados aos camun- dongos modelo transplantados com células B16F10/chGPC3/MuPA. Os agentes a serem administrados foram preparados usando tampão PBST (PBS + tampão Tween20 a 0,05 %), de modo que a concentração do anticorpo variante fosse de 0,1 mg/mL. 16-5 Teste de administração de variantes de anticorpos para avaliar a clivagem pela protease
[0716] Após 11 dias de transplante, os camundongos transplanta- dos com células B16F10/chGPC3/muPA receberam cinco amostras de variantes de anticorpos que contêm diferentes sequências de clivagem pela protease através da veia da cauda na dose de 1 mg/kg (mg de an- ticorpo administrado por kg de peso corporal do camundongo). Os no- mes das variantes de anticorpos, doses, métodos de administração e outros detalhes no teste de administração são mostrados na Tabela 23 Tabela 23 Sumário dos testes de administração ao camundongo EIA RA ram mr 16-6 Coleta de sangue orbital de camundongos modelo transplan- tados com células B16F10/chGPC3/muPA
[0717] Nos dias 1 e 3 após a administração da variante do anticorpo, foi coletado sangue da cavidade ocular dos camundongos modelo trans- plantados com células B16F10/chGPC3/mMUuPA. A coleta de sangue foi realizada sob anestesia com isoflurano. O sangue coletado foi centrifu- gado a 1.900 x g, 4ºC durante dez minutos. Após a centrifugação, o so- brenadante foi obtido como componente plasmático e armazenado a - 30ºC 16-7 Avaliação da clivagem de anticorpos administrados coletados de camundongo
[0718] Os anticorpos foram purificados a partir do plasma coletado no Exemplo 16-6 usando Dynabeads Protein A (Thermo; 10001D) de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica e submetidos a um imunoensaio de eletroforese capilar a fim de avaliar a eficiência da clivagem pela protease das variantes de anticorpos.
Wes (Protein Simple) foi usado para o imunoensaio de eletroforese capi- lar.
Para detectar a cadeia leve de anticorpo, foi usado um anticorpo marcado com HRP anti-cadeia lambda humana (abcam; ab9007). Para detectar a cadeia pesada de anticorpo, foi usado um anticorpo marcado com HRP anti-cadeia pesada humana (Protein Simple; 043-491). Como um resultado, um pico da cadeia leve de comprimento total não clivada foi detectado a aproximadamente 36 kDa com o anticorpo anti-cadeia lambda humana e um pico da cadeia pesada de comprimento total foi detectado a aproximadamente 56 kDa com o anticorpo anti-cadeia pe- sada humana.
A cadeia leve MabKLHn é uma cadeia capa, a qual não é detectada com o anticorpo anti-cadeia lambda humana.
Portanto, o anticorpo anti-cadeia lambda humana pode ser usado para avaliar a efi- ciência de clivagem da cadeia leve que traz uma sequência de clivagem pela protease.
A área de cada pico obtido pelo imunoensaio de eletro- forese capilar foi obtida usando o software fornecido pela Wes (Com- pass for SW; Protein Simple) e a proporção de cadeia leve restante foi calculada como [Área de pico de cadeia level/[Área de pico de cadeia pesada] para determinar a proporção de cadeia leve de comprimento completo que permaneceu não clivada no corpo do camundongo.
As proporções de cadeia leve restante dos anticorpos coletados um dia e três dias após serem administrados aos camundongos são mostradas na Figura 31. Como um resultado, variantes de anticorpo que trazem a sequência de clivagem pela protease mostrada na Tabela 21 apresen- taram uma menor proporção de cadeia leve restante do que o anticorpo precursor que tem a cadeia pesada de SEQ ID NO: 1051 e a cadeia leve de SEQ ID NO: 832 no corpo dos camundongos transplantados com o tumor. Isto é, foi mostrado que as cadeias leves que trazem uma se- quência de clivagem pela protease foram eficientemente clivadas in vivo nos camundongos transplantados com o tumor Exemplo de Referência 1 — Preparação de Plexina A1 Biotinilada
[0719] Plexina A1 biotinilada (também denominada como Plexina A1 humana marcada com biotina) foi preparada por meio de um método conhecido por aqueles versados na técnica. Especificamente, um frag- mento gênico que codifica uma sequência específica (sequência Avi- Tag; SEQ ID NO: 36) a ser biotinilada pela biotina ligase e um fragmento gênico que codifica uma sequência FLAG tag (SEQ ID NO: 199; DYK- DDDDK) foram ligados por meio de um fragmento gênico que codifica um ligante constituído por glicina e serina a jusante de um fragmento gênico que codifica a região extracelular de Plexina A1. Um fragmento gênico que codifica uma proteína que contém Plexina A1 ligada à se- quência AviTag e a sequência FLAG tag (SEQ ID NO: 200) foi integrada a um vetor para expressão em células de animal. O vetor de plasmídeo construído foi transfectado em células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) usando 293Fectina (Invitrogen Corp.). Nesta operação, as células foram cotransfectadas com um gene para expressão de EBNA1 (SEQ ID NO: 57) e um gene para expressão de biotina ligase (BirA; SEQ ID NO: 58) e biotina também foi adicionada às mesmas com a finalidade de marca- ção da Plexina A1 com biotina. As células transfectadas de acordo com os procedimentos supracitados foram cultivadas a 37ºC sob CO; a 8 % e deixadas secretar a proteína de interesse (Plexina A1 biotinilada) no sobrenadante de cultura. Esta solução de cultura de células foi filtrada através de um filtro de topo de garrafa de 0,22 um para obter um sobre- nadante de cultura
[0720] Uma coluna foi empacotada com Anti FLAG M2 agarose (Sigma-Aldrich Co. LLC, tA2220) para preparar uma coluna FLAG. À coluna FLAG foi equilibrada antecipadamente com D-PBS(-). O sobre- nadante de cultura foi aplicado à mesma para ligar a Plexina A1 biotini- lada à coluna. Subsequentemente, a Plexina A1 biotinilada foi eluída usando peptídeo FLAG dissolvido em D-PBS(-). Os agregados foram removidos deste eluato por meio de cromatografia de filtragem em gel usando HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, 320 mL (GE Healthcare Japan Corp., 28-9893-36) para obter Plexina A1 biotinilada purificada.
[0721] As modalidades da invenção supracitadas são descritas em detalhes com referência a exemplos reais e exemplos ilustrados com o objetivo de auxiliar no claro entendimento. Entretanto, a descrição e ilus- tração no presente relatório descritivo não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da presente invenção. A descrição de todas as Literaturas de Patente e literaturas citadas aqui é explicitamente in- corporada aqui por referência na íntegra. Aplicabilidade Industrial
[0722] Os polipeptídeos da presente invenção que compreendem um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora que tem uma meia-vida mais longa no sangue do que aquela do domínio de li- gação a antígeno e que tem um domínio inibidor que inibe a atividade de ligação do domínio de ligação a antígeno e composições farmacêu- ticas que compreendem o polipeptídeo podem transportar o domínio de ligação a antígeno no sangue, ao mesmo tempo em que inibem a ativi- dade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno. Além disso, o uso do polipeptídeo da presente invenção pode permitir que o domínio de ligação a antígeno exerça sua atividade de ligação a antí- geno especificamente em locais de uma doença. Além disso, uma vez que o domínio de ligação a antígeno tem uma meia-vida mais curta no momento de exercer sua atividade de ligação a antígeno do que no mo- mento de transporte, o risco de atuar sistemicamente é diminuído. As-
sim, os polipeptídeos e as composições farmacêuticas da presente in- venção são muito úteis no tratamento de doenças.
[0723] Um anticorpo com um único domínio cuja atividade de liga- ção a antígeno é inibida através de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular pode ser rastreado ou produzido como um exemplo do domínio de ligação a antígeno para, deste modo, produzir eficazmente o polipeptídeo da presente invenção. Além disso, domínios de ligação a antígeno necessários podem ser eficientemente obtidos quando o poli- peptídeo da presente invenção é preparado usando uma biblioteca que inclui o anticorpo com um único domínio cuja atividade de ligação a an- tígeno é inibida através de sua associação com uma VL, VH ou VHH particular como um exemplo do domínio de ligação a antígeno que pode ser usado nos polipeptídeos da presente invenção.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo que compreende um domínio de ligação a antígeno e uma porção transportadora, caracterizado pelo fato de que a porção transportadora tem um domínio inibidor que inibe a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno e em que o poli- peptídeo tem uma sequência de clivagem pela protease que compre- ende uma ou uma pluralidade de sequências selecionadas a partir das sequências de SEQ ID NOs: 833 a 852 e SEQ ID NOs: 1062 a 1081 e as sequências descritas na Tabela 1.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a inibição da atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno pelo domínio inibidor em um estado onde a sequência de clivagem pela protease foi clivada por uma protease é mais fraca do que a inibição da atividade de ligação a antígeno do do- mínio de ligação a antígeno pelo domínio inibidor em um estado onde a sequência de clivagem pela protease não é clivada.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizado pelo fato de que o domínio de ligação a antígeno tem uma meia-vida mais curta no sangue do que a porção transportadora.
4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a antí- geno é capaz de ser liberado do polipeptídeo e o domínio de ligação a antígeno tem uma atividade de ligação a antígeno maior em um estado onde ele é liberado do polipeptídeo do que a atividade de ligação a an- tígeno em um estado onde ele não está liberado do polipeptídeo.
5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação a antí- geno do domínio de ligação a antígeno é inibida através da associação do domínio inibidor da porção transportadora com o domínio de ligação a antígeno.
6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, ca- racterizado pelo fato de que a sequência de clivagem pela protease é clivada por uma protease, de modo que o domínio de ligação a antígeno se torne capaz de ser liberado do polipeptídeo e/ou de modo que a as- sociação do domínio inibidor da porção transportadora com o domínio de ligação a antígeno seja cancelada.
7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a protease é uma protease específica para tecido canceroso ou uma protease específica para te- cido inflamatório.
8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a antí- geno compreende um anticorpo com um único domínio ou é um anti- corpo com um único domínio, e em que o domínio inibidor da porção transportadora inibe a atividade de ligação a antígeno do anticorpo com um único domínio.
9. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a antí- geno compreende um anticorpo com um único domínio, em que o do- mínio inibidor da porção transportadora é uma VHH, uma VH de anti- corpo ou uma VL de anticorpo, e em que a atividade de ligação a antí- geno do anticorpo com um único domínio é inibida pela VHH, pela VH de anticorpo ou pela VL de anticorpo.
10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a porção transportadora compreende uma região constante de anticorpo.
11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracte- rizado pelo fato de que o N-término da região constante de anticorpo da porção transportadora e o C-término do domínio de ligação a antígeno são fundidos através de um ligante ou sem um ligante, e em que a se- quência de clivagem pela protease está localizada próximo do limite en- tre o domínio de ligação a antígeno e a região constante de anticorpo.
12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a região constante de anticorpo do poli- peptídeo é uma região constante de anticorpo IgG.
13. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma mo- lécula similar a anticorpo IgG.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 13.
15.Método, caracterizado pelo fato de ser para a produção do polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
13.
BR112020010450-7A 2017-11-28 2018-11-28 polipeptídeo que inclui domínio de ligação a antígeno e seção transportadora BR112020010450A2 (pt)

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