KR20240035556A - 융합 폴리펩타이드를 이용하는 프로테아제 매개성의 표적 특이적 사이토카인 송달 - Google Patents
융합 폴리펩타이드를 이용하는 프로테아제 매개성의 표적 특이적 사이토카인 송달 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 리간드 결합 도메인, 프로테아제 절단 사이트, 및 리간드 부분을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은, 리간드 결합 도메인, 리간드 부분, 및 프로테아제 절단 사이트를 포함하고, 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되었을 경우에, 리간드의 생물학적 활성을 복원한다. 본 발명은 또한, 융합 단백질을 제조하는 방법, 그들의 사용, 및 해당 융합 단백질을 포함하는 의약 조성물에도 관한 것이다. 본 발명은 또한, 서로로부터의 해리를 촉진하는, 리간드 결합 도메인 내의 중쇄 가변 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL) 사이의 회합을 저감시키는 방법에도 관한 것이다. 본 개시는, 리간드가 정상 영역의 C말단, 또는 리간드 결합 도메인의 N말단에 융합하고 있는, 융합 단백질을 제공한다.
Description
본 발명은, 리간드 결합 도메인 및 프로테아제 절단 사이트를 갖는 리간드 결합 부분을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이고, 이것은, 프로테아제에 의한 절단에 의해 활성화되었을 경우에, 리간드의 생물학적 활성을 복원한다. 본 발명은 또한, 융합 단백질을 제조하는 방법, 그들의 사용, 및 해당 융합 단백질을 포함하는 의약 조성물에도 관한 것이다. 본 발명은 또한, 서로로부터의 해리를 촉진하는, 리간드 결합 도메인 내의 중쇄 가변 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL) 사이의 회합을 저감시키는 방법에도 관한 것이다.
우리의 면역계의 생래의 능력은, 그 효력, 특이성, 및 기억을 자랑한다. 이들 특징에 의해 동기 부여되어, 면역 요법이, 감염증, 자기면역, 알레르기, 이식거절반응, 이식편대숙주병, 및 암을 포함하는, 다양한 영역에 있어서 개발되고 있다. 염증 및 면역 공격에 대한 신체의 면역 응답에 있어서의 그 역할이 주지인 작은 단백질인 사이토카인 및 케모카인이, 면역 요법의 개발의 중심 단계에 있다.
그러나, 오늘까지, 사이토카인 매개성 면역 요법에는, 높은 전신 독성 및 낮은 내지 무시할 수 있을 정도의 유효성에 관한 공통의 염려가 남아 있다. 사이토카인은, 투여되면 전신에 폭로되고, 따라서, 전신 작용에 의해 독성을 야기하기 때문에, 많은 경우, 사이토카인은, 그와 같은 독성을 회피하기 위해서 매우 낮은 용량으로만 투여될 수 있다. 이것을 극복하기 위한 매력적인 전략은, 사이토카인을 항체에 연결하여, 종양 부위에서 사이토카인 농도를 국소적으로 증가시키는 것을 포함한다. 이뮤노사이토카인에 의해 고형 암에 송달된 사이토카인은, 면역을 활성화하고, 그에 따라 항종양 효과를 발휘한다. IL-2, IL-12, 및 TNF를 포함하는 사이토카인은, 강한 독성을 갖기 때문에, 암에 대한 이들 사이토카인의 국한성 작용이, 국한성 송달에 있어서 항체에 의해 송달되었을 경우에, 유해 반응을 경감하면서 강화될 수 있을 것이 기대된다(비특허문헌 1 내지 비특허문헌 3). 그러나, 그와 같은 이뮤노사이토카인은, 체내에 확산하고, 따라서, 특이적인 고어피니티 사이토카인 수용체가 존재하는 한, 혈액 또는 조직 중의 임의의 세포에 결합할 수 있어, 부당한 부작용을 가져옴이 보고되어 있다. 특정의 예에 있어서, 암 항원에 결합하는 항체에 융합한 IL-2는, 암 항원에 결합하지 않는 항체에 융합한 IL-2와 동일한 항종양 효과를 나타냄이 보고되어 있고, 이것은, 항체 성분은 아닌 IL-2 부분이, 그 생체내 분포를 방향 지었음을 암시한다(비특허문헌 4).
다른 대체 어프로치는, 프로테아제 절단 가능 링커를 개재시켜 사이토카인을 그 수용체에 융합시키는 것을 포함한다. 프로테아제 발현이 높은, 암 환경 등의 환경에 있어서는, 링커가 절단되어, 사이토카인이 그 수용체로부터 유리(release)된다. 그와 같은 형식으로 구성되는 이뮤노사이토카인에는, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA)에 의해 절단 가능한 링커를 개재시켜 접속된 TNF-α 및 TNF 수용체(비특허문헌 5), 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)에 의해 절단 가능한 IL-2 및 IL-2 수용체(비특허문헌 6)가 포함된다. 그러나, 이들 분자에 있어서의 사이토카인은, 그 수용체에 융합하고 있는 동안에도 활성을 갖고 있어, 프로테아제 절단 시에 활성화되었을 경우에, 활성의 개선은 한정되고, 즉 대략 10배이다.
보다 최근, 예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)에 의해 절단 가능한 IL-2 및 IL-12에 융합한 단쇄 단편 가변(scFv)(비특허문헌 6, 비특허문헌 7, 특허문헌 2, 특허문헌 5) 및 특허문헌 1, 특허문헌 3, 특허문헌 4, 특허문헌 6, 특허문헌 7, 및 특허문헌 8에 보고되어 있는 바와 같은 프로테아제 절단 가능 영역을 포함하는 다른 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 프로테아제 절단 시에 유리되는 사이토카인을 포함하는 다양한 융합 폴리펩타이드가 보고되어 있다.
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사이토카인은, 많은 병변 부위에 있는 중요한 면역 메디에이터이며, 이용되는 경우에 그 효과가 면역 응답을 유의하게 개선할 수 있음이 주지되어 있다. 많은 사이토카인 매개성 면역 요법이 개발되고 있지만, 높은 독성 및 낮은 유효성의 문제가, 여전히 염려되는 채로 있다.
본 발명자들은, 부위 특이적으로 활성화되는 사이토카인 또는 케모카인을 고용량으로 송달하는 능력에 의해, 전신 독성 및 낮은 유효성의 문제가 극복된다고 생각했다.
이 목적으로, 본 발명자들은, 리간드 결합 도메인 및 프로테아제 절단 가능 사이트를 포함하는 리간드 결합 부분을 포함하는 융합 단백질로서, 제1 상태에서, 리간드가 리간드 결합 도메인에 결합하고, 또한 결합 파트너에 결합하는 그 능력이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드가 리간드 결합 도메인에 결합하지 않고, 또한 결합 파트너에 결합하는 그 능력이, 복원되어, 그 결합 시에 그 생물학적 활성을 발휘할 수 있는, 융합 단백질을 개발했다. 하나의 비배타적인 국면에 있어서, 리간드는, 비절단 가능 펩타이드 링커에 의해 융합 단백질의 리간드 결합 부분의 정상 영역의 C말단 영역에 결합하고 있고, 프로테아제 절단에 관계없이 결합한 그대로이며, 그 결합 파트너와 상호작용할 수 있어, 그 생물학적 활성을 발휘한다.
하나의 비배타적인 국면에 있어서, 융합 단백질은, IgG 항체양 분자를 포함하고, 각각이 프로테아제 절단 사이트를 갖는 리간드 결합 도메인 및 리간드 결합 도메인에 결합한 1개의 리간드를 포함하는, 2개의 리간드 결합 부분을 포함하는, 2가 호모이량체, 리간드 결합 융합 단백질이다. 그와 같은 융합 단백질 및 그 융합 단백질을 포함하는 의약 조성물은, 리간드에 의해 매개되는 질환의 치료에 있어서 유용하다. 하나의 비배타적인 국면에 있어서, 융합 단백질 및 그 융합 단백질을 포함하는 의약 조성물을, 상기 리간드에 의해 매개되는 질환의 치료를 위해서 투여하는 방법, 또는 융합 단백질의 제조의 방법도 또한, 포함된다. 본 발명자들은, 융합 단백질의 활성화형이, 질환 부위에 고농도로 축적될 수 있어, 천연의 리간드와 비교했을 경우에 부위로부터의 빠른 클리어런스를 나타냄을 발견했다. 이것은, 천연의 리간드, 및 천연의 리간드를 그 활성화형으로 송달하는 선행 기술에 있어서 기재되어 있는 다른 분자 형식과 비교했을 경우에, 융합 단백질을, 보다 높은 용량으로, 보다 적은 부작용을 수반하여 투여하는 이점을 제공한다.
예시적인 태양
본 발명은, 그와 같은 지견에 기초하여, 이하에 기재되는 예시적인 태양을 구체적으로 포함한다.
[A-1] 각각이 N말단으로부터 C말단을 향해, 일반식(I):
[리간드 결합 도메인]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[리간드 부분] (I)
에 의해 표시되는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
식 중,
Lx가, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 펩타이드 링커를 나타내고,
Cx가, 제2 펩타이드 링커, 및 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 정상 영역을 나타내고;
Ly가, 제3 펩타이드 링커를 나타내고,
(a) 제1 상태에서, 리간드 부분이 리간드 결합 도메인에 결합하고, 또한 리간드 부분의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드 부분의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 해당 프로테아제 절단 사이트를 촉매하는 프로테아제의 존재에 의해 매개되는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질.
[A-2] 상기 리간드 결합 도메인이, 항체 가변 영역을 포함하는, [A-1]의 융합 단백질.
[A-3] 상기 항체 가변 영역이, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, [A-2]의 융합 단백질.
[A-4] 상기 리간드 결합 도메인의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)이, 서로 회합하는, [A-3]의 융합 단백질.
[A-5] Cx가, 중쇄의 CH1 영역 및 경쇄의 CL 영역을 포함하는, [A-4]의 융합 단백질.
[A-6] 중쇄의 220위의 Cys(C220)와 경쇄의 214위의 Cys(C214)(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성이 촉진되도록, 상기 제2 펩타이드 링커가, 힌지 영역에 위치되는, [A-1] 내지 [A-5] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-7] Cx가, 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 여기에서, 중쇄의 220위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이에 어떠한 다이설파이드 결합도 형성되지 않도록, 중쇄 및 경쇄에 있어서의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [A-1] 내지 [A-5] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-8] 상기 경쇄가, C214S 개변을 포함하고, 또한 상기 중쇄가, C220S 개변을 포함하는(EU 넘버링에 따른다), [A-7]의 융합 단백질.
[A-9] 상기 중쇄가, 중쇄의 131위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성을 가능하게 하도록 개변되어 있는, [A-1] 내지 [A-5] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-10] 상기 중쇄가, S131C 및 C220S 개변(EU 넘버링에 따른다)을 포함하는, [A-9]의 융합 단백질.
[A-11] Cx가, 서열 번호: 901(C1), 서열 번호: 905(C2), 서열 번호: 908(C3), 서열 번호: 910(C4), 및 서열 번호: 932(C5)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [A-1] 내지 [A-10] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-12] Cx가, 서열 번호: 910(C4)의 서열을 포함하는, [A-11]의 융합 단백질.
[A-13] Ly가, 글리신-세린 폴리머를 포함하는, [A-1] 내지 [A-12] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-14] 상기 글리신-세린 폴리머가, (a) 내지 (ee)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [A-13]의 융합 단백질:
(a) Ser;
(b) Gly Ser(GS);
(c) Ser Gly(SG);
(d) Gly Gly Ser(GGS);
(e) Gly Ser Gly(GSG);
(f) Ser Gly Gly(SGG);
(g) Gly Ser Ser(GSS);
(h) Ser Ser Gly(SSG);
(i) Ser Gly Ser(SGS);
(j) Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136);
(k) Gly Gly Ser Gly(GGSG, 서열 번호: 137);
(l) Gly Ser Gly Gly(GSGG, 서열 번호: 138);
(m) Ser Gly Gly Gly(SGGG, 서열 번호: 139);
(n) Gly Ser Ser Gly(GSSG, 서열 번호: 140);
(o) Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141);
(p) Gly Gly Gly Ser Gly(GGGSG, 서열 번호: 142);
(q) Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143);
(r) Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG, 서열 번호: 144);
(s) Gly Ser Gly Gly Ser(GSGGS, 서열 번호: 145);
(t) Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146);
(u) Gly Ser Ser Gly Gly(GSSGG, 서열 번호: 147);
(v) Gly Ser Gly Ser Gly(GSGSG, 서열 번호: 148);
(w) Ser Gly Gly Ser Gly(SGGSG, 서열 번호: 149);
(x) Gly Ser Ser Ser Gly(GSSSG, 서열 번호: 150);
(y) Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGS, 서열 번호: 151);
(z) Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGG, 서열 번호: 152);
(aa) Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGGS, 서열 번호: 153);
(bb) Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGGG, 서열 번호: 154);
(cc) (Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141))n;
(dd) (Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146))n; 및
(ee) (Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143))n;
여기에서, n은 1 이상의 정수이다.
[A-15] Ly가, GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열 번호: 903)의 서열을 포함하는, [A-14]의 융합 단백질.
[A-16] 상기 리간드 부분이, 사이토카인 또는 케모카인을 포함하는, [A-1] 내지 [A-15] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-17] 상기 리간드 부분이, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIG, I-TAC, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [A-16]의 융합 단백질.
[A-18] 상기 리간드 부분이, IL-12 또는 IL-22인, [A-17]의 융합 단백질.
[A-19] 상기 IL-12가, 프로테아제에 폭로되었을 경우의 단백질 분해를 방해하는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [A-18]의 융합 단백질.
[A-20] 상기 IL-12가, KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않는, [A-19]의 융합 단백질.
[A-21] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, IL-12와 리간드 결합 도메인의 경계면(interface)에서 행해지는, [A-19] 또는 [A-20]의 융합 단백질.
[A-22] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변을 행한 후에, IL-12가, (a) 내지 (p)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 개변된 서열을 포함하는, [A-21]의 융합 단백질:
(a) KSHRE(서열 번호: 1052);
(b) KSHHE(서열 번호: 1053);
(c) KSHKE(서열 번호: 1054);
(d) KSHSE(서열 번호: 1055);
(e) KSKHRE(서열 번호: 1056);
(f) KSKQRE(서열 번호: 1057);
(g) KSKERE(서열 번호: 1058);
(h) KSKPRE(서열 번호: 1059);
(i) KHKE(서열 번호: 1060);
(j) KHHE(서열 번호: 1061);
(k) KHRE(서열 번호: 1062);
(l) KKHE(서열 번호: 1063);
(m) KRHE(서열 번호: 1064);
(n) KRE(서열 번호: 1065);
(o) KHE(서열 번호: 1066); 및
(p) KKE(서열 번호: 1067).
[A-23] 상기 IL-12가, (i) 내지 (xvi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [A-19] 내지 [A-22] 중 어느 하나의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열.
[A-24] 상기 IL-12가, (i) 내지 (xvi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [A-23]의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 동일한 아미노산 서열.
[A-25] 상기 IL-12가, 서열 번호: 1068, 또는 서열 번호: 1069, 또는 서열 번호: 1076, 또는 서열 번호: 1077, 또는 서열 번호: 1078, 또는 서열 번호: 1079, 또는 서열 번호: 1080으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [A-24]의 융합 단백질.
[A-26] 상기 융합 단백질이, 2개의 프로테아제 절단 사이트를 포함하고, 각 프로테아제 절단 사이트가, 표적 조직에 특이적인 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [A-1] 내지 [A-25] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-27] 상기 표적 조직이, 암 조직 또는 염증성 조직인, [A-26]의 융합 단백질.
[A-28] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제에 의해 절단 가능한, [A-1] 내지 [A-27] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-29] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제 절단 서열을 포함하는, [A-28]의 융합 단백질.
[A-30] 각 프로테아제 절단 사이트가, 마트립타제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [A-1] 내지 [A-29] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-31] Lx가, VH 영역과 CH1 영역의 경계 부근 또는 VL 영역과 CL 영역의 경계 부근에 위치하는 프로테아제 절단 사이트를 포함하는, [A-1] 내지 [A-30] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-32] 상기 리간드 결합 도메인이, 제1 상태보다도 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [A-1] 내지 [A-31] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-33] 상기 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, [A-32]의 융합 단백질.
[A-34] 상기 치환이, VH 상의 포지션 37, 45, 91, 혹은 103, 및/또는 VL 상의 포지션 43, 46, 49, 혹은 87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [A-33]의 융합 단백질.
[A-34a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, L45, H91, 혹은 Y91, 혹은 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 A43, L46, Y49, 혹은 Y87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [A-33]의 융합 단백질.
[A-35] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [A-34] 또는 [A-34a]의 융합 단백질.
[A-36] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [A-35]의 융합 단백질:
VH 상의 V37S,
L45Q,
Y91M, 혹은 H91A,
W103I, W103L, 혹은 W103M, 및/또는
VL 상의 A43Q,
L46Q,
Y49A, 혹은
Y87L.
[A-37] 상기 치환이, 리간드 결합 도메인과 리간드 부분의 경계면에 존재하는 아미노산에 있어서의 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 상보성 결정 영역(CDR) 중에 있는, [A-34] 내지 [A-36] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-38] 상기 리간드 부분이 IL-12이며, 상기 치환이, VL 상의 포지션 30 및/또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하는, [A-37]의 융합 단백질.
[A-39] 상기 개변이, S30V 및/또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [A-38]의 융합 단백질.
[A-40] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (z)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [A-34] 내지 [A-39] 중 어느 하나의 융합 단백질:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(c) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(e) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(h) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(j) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(l) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(o) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(p) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(q) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(t) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(u) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(v) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(y) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(z) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[A-41] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (g)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [A-40]의 융합 단백질:
(a) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(c) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(d) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(g) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[A-42] 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량보다도 작은, [A-1] 내지 [A-41] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-43] 리간드 결합 도메인의 일부분이 융합 단백질로부터 유리되도록, 절단 사이트가 절단되는, [A-1] 내지 [A-42] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-44] 융합 단백질로부터 유리되는 리간드 결합 도메인의 일부분의 분자량이, 26kDa, 또는 13kDa, 또는 그것보다도 작은, [A-43]의 융합 단백질.
[A-45] 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 비가, 10:9인, [A-42] 내지 [A-44] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-46] 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 9/10인, [A-42] 내지 [A-44]의 융합 단백질.
[A-47] 제1 상태에서의 융합 단백질과 비교한 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 저감 퍼센티지가, 10%인, [A-42] 내지 [A-44] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-48] 융합 단백질로부터 유리되는 리간드 결합 도메인의 일부분이, VL 혹은 VH를 포함하고, 또는 바람직하게는 VL 혹은 VH인, [A-43] 내지 [A-47] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-49] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [A-32] 내지 [A-48] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-50] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [A-32] 내지 [A-49] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-51] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [A-32] 내지 [A-48] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-52] SPR 조건이, 30분의 지속 시간에 걸치는, 제1 상태에서의 융합 단백질과 400nM의 uPA의 접촉 지속 시간을 포함하는, [A-49] 내지 [A-51] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-53] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/D (II)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하고, 식 중, D는, 0.01×각각 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 비교한 VH 또는 VL의 분자량의 퍼센티지에 대응하는, [A-49] 내지 [A-51] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-54] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-1):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/10 (II-1)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [A-53]의 융합 단백질.
[A-55] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-2):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/15.8 (II-2)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [A-53]의 융합 단백질.
[A-56] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상인, [A-53] 내지 [A-55] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[A-57] 제1 상태 및 제2 상태에서의 리간드 부분이, 제3 펩타이드 링커를 개재시켜 정상 영역에 결합한 채로 있는, [A-1] 내지 [A-56] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-1] 각각이,
(i) 리간드 결합 도메인 및 정상 영역을 포함하는, 리간드 결합 부분;
(ii) 프로테아제 절단 사이트를 포함하고, 또한 리간드 결합 도메인을 정상 영역에 접속하는, 제1 펩타이드 링커;
(iii) 제2 펩타이드 링커, 및 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 해당 정상 영역; 및
(iv) 제3 펩타이드 링커에 의해 정상 영역의 C말단 영역에 접속되어 있는, 리간드 부분
을 포함하는, 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
(a) 제1 상태에서, 리간드 부분이 리간드 결합 도메인에 결합하고, 또한 리간드 부분의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드 부분의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 해당 프로테아제 절단 사이트를 촉매하는 프로테아제의 존재에 의해 매개되는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질.
[B-2] 상기 리간드 결합 도메인이, 항체 가변 영역을 포함하는, [B-1]의 융합 단백질.
[B-3] 상기 항체 가변 영역이, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, [B-2]의 융합 단백질.
[B-4] 상기 리간드 결합 도메인의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)이, 서로 회합하는, [B-3]의 융합 단백질.
[B-5] 상기 리간드 결합 부분의 정상 영역이, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 해당 중쇄가 CH1 영역을 포함하고, 또한 해당 경쇄가 CL 영역을 포함하는, [B-4]의 융합 단백질.
[B-6] 중쇄의 220위의 Cys(C220)와 경쇄의 214위의 Cys(C214)(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성이 촉진되도록, 상기 제2 펩타이드 링커가, 힌지 영역에 위치되는, [B-1] 내지 [B-5] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-7] 상기 정상 영역이, 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 여기에서, 중쇄의 220위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이에 어떠한 다이설파이드 결합도 형성되지 않도록, 중쇄 및 경쇄에 있어서의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [B-1] 내지 [B-5] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-8] 상기 경쇄가, C214S 개변을 포함하고, 또한 상기 중쇄가, C220S 개변을 포함하는(EU 넘버링에 따른다), [B-7]의 융합 단백질.
[B-9] 상기 중쇄가, 중쇄의 131위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성을 가능하게 하도록 개변되어 있는, [B-1] 내지 [B-5] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-10] 상기 중쇄가, S131C 및 C220S 개변(EU 넘버링에 따른다)을 포함하는, [B-10]의 융합 단백질.
[B-11] 상기 정상 영역이, 서열 번호: 901(C1), 서열 번호: 905(C2), 서열 번호: 908(C3), 서열 번호: 910(C4), 및 서열 번호: 932(C5)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [B-1] 내지 [B-10] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-12] 상기 정상 영역이, 서열 번호: 910(C4)의 서열을 포함하는, [B-11]의 융합 단백질.
[B-13] 상기 제3 펩타이드 링커가, 글리신-세린 폴리머를 포함하는, [B-1] 내지 [B-12] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-14] 상기 글리신-세린 폴리머가, (a) 내지 (ee)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [B-13]의 융합 단백질:
(a) Ser;
(b) Gly Ser(GS);
(c) Ser Gly(SG);
(d) Gly Gly Ser(GGS);
(e) Gly Ser Gly(GSG);
(f) Ser Gly Gly(SGG);
(g) Gly Ser Ser(GSS);
(h) Ser Ser Gly(SSG);
(i) Ser Gly Ser(SGS);
(j) Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136);
(k) Gly Gly Ser Gly(GGSG, 서열 번호: 137);
(l) Gly Ser Gly Gly(GSGG, 서열 번호: 138);
(m) Ser Gly Gly Gly(SGGG, 서열 번호: 139);
(n) Gly Ser Ser Gly(GSSG, 서열 번호: 140);
(o) Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141);
(p) Gly Gly Gly Ser Gly(GGGSG, 서열 번호: 142);
(q) Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143);
(r) Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG, 서열 번호: 144);
(s) Gly Ser Gly Gly Ser(GSGGS, 서열 번호: 145);
(t) Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146);
(u) Gly Ser Ser Gly Gly(GSSGG, 서열 번호: 147);
(v) Gly Ser Gly Ser Gly(GSGSG, 서열 번호: 148);
(w) Ser Gly Gly Ser Gly(SGGSG, 서열 번호: 149);
(x) Gly Ser Ser Ser Gly(GSSSG, 서열 번호: 150);
(y) Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGS, 서열 번호: 151);
(z) Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGG, 서열 번호: 152);
(aa) Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGGS, 서열 번호: 153);
(bb) Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGGG, 서열 번호: 154);
(cc) (Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141))n;
(dd) (Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146))n; 및
(ee) (Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143))n;
여기에서, n은 1 이상의 정수이다.
[B-15] 상기 제3 펩타이드 링커가, GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열 번호: 903)의 서열을 포함하는, [B-14]의 융합 단백질.
[B-16] 상기 리간드 부분이, 사이토카인 또는 케모카인을 포함하는, [B-1] 내지 [B-15] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-17] 상기 리간드 부분이, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIG, I-TAC, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [B-16]의 융합 단백질.
[B-18] 상기 리간드 부분이, IL-12 또는 IL-22인, [B-17]의 융합 단백질.
[B-19] 상기 IL-12가, 프로테아제에 폭로되었을 경우의 단백질 분해를 방해하는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [B-18]의 융합 단백질.
[B-20] 상기 IL-12가, KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않는, [B-19]의 융합 단백질.
[B-21] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, IL-12와 리간드 결합 도메인의 경계면에서 행해지는, [B-19] 또는 [B-20]의 융합 단백질.
[B-22] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변을 행한 후에, IL-12가, (a) 내지 (p)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 개변된 서열을 포함하는, [B-21]의 융합 단백질:
(a) KSHRE(서열 번호: 1052);
(b) KSHHE(서열 번호: 1053);
(c) KSHKE(서열 번호: 1054);
(d) KSHSE(서열 번호: 1055);
(e) KSKHRE(서열 번호: 1056);
(f) KSKQRE(서열 번호: 1057);
(g) KSKERE(서열 번호: 1058);
(h) KSKPRE(서열 번호: 1059);
(i) KHKE(서열 번호: 1060);
(j) KHHE(서열 번호: 1061);
(k) KHRE(서열 번호: 1062);
(l) KKHE(서열 번호: 1063);
(m) KRHE(서열 번호: 1064);
(n) KRE(서열 번호: 1065);
(o) KHE(서열 번호: 1066); 및
(p) KKE(서열 번호: 1067).
[B-23] 상기 IL-12가, (i) 내지 (xvi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [B-19] 내지 [B-22] 중 어느 하나의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열.
[B-24] 상기 IL-12가, (i) 내지 (xvi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [B-23]의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 동일한 아미노산 서열.
[B-25] 상기 IL-12가, 서열 번호: 1068, 또는 서열 번호: 1069, 또는 서열 번호: 1076, 또는 서열 번호: 1077, 또는 서열 번호: 1078, 또는 서열 번호: 1079, 또는 서열 번호: 1080으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [B-24]의 융합 단백질.
[B-26] 상기 융합 단백질이, 2개의 프로테아제 절단 사이트를 포함하고, 각 프로테아제 절단 사이트가, 표적 조직에 특이적인 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [B-1] 내지 [B-25] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-27] 상기 표적 조직이, 암 조직 또는 염증성 조직인, [B-26]의 융합 단백질.
[B-28] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제에 의해 절단 가능한, [B-1] 내지 [B-27] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-29] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제 절단 서열을 포함하는, [B-28]의 융합 단백질.
[B-30] 각 프로테아제 절단 사이트가, 마트립타제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [B-1] 내지 [B-29] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-31] 상기 제1 펩타이드 링커가, VH 영역과 CH1 영역의 경계 부근 또는 VL 영역과 CL 영역의 경계 부근에 위치하는 프로테아제 절단 사이트를 포함하는, [B-1] 내지 [B-30] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-32] 상기 리간드 결합 도메인이, 제1 상태보다도 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [B-1] 내지 [B-31] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-33] 상기 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, [B-32]의 융합 단백질.
[B-34] 상기 치환이, VH 상의 포지션 37, 45, 91, 혹은 103, 및/또는 VL 상의 포지션 43, 46, 49, 혹은 87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [B-33]의 융합 단백질.
[B-34a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, L45, H91, 혹은 Y91, 혹은 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 A43, L46, Y49, 혹은 Y87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [B-33]의 융합 단백질.
[B-35] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [B-34] 또는 [B-34a]의 융합 단백질.
[B-36] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [B-35]의 융합 단백질:
VH 상의 V37S,
L45Q,
Y91M, 혹은 H91A,
W103I, W103L, 혹은 W103M, 및/또는
VL 상의 A43Q,
L46Q,
Y49A, 혹은
Y87L.
[B-37] 상기 치환이, 리간드 결합 도메인과 리간드 부분의 경계면에 존재하는 아미노산에 있어서의 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 상보성 결정 영역(CDR) 중에 있는, [B-34] 내지 [B-36] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-38] 상기 리간드 부분이 IL-12이며, 상기 치환이, VL 상의 포지션 30 및/또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하는, [B-37]의 융합 단백질.
[B-39] 상기 개변이, S30V 및/또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [B-38]의 융합 단백질.
[B-40] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (z)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [B-34] 내지 [B-39]의 융합 단백질:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(c) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(e) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(h) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(j) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(l) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(o) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(p) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(q) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(t) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(u) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(v) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(y) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(z) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[B-41] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (g)의 어느 1개로 이루어지는 이하의 군으로부터 선택되는, [B-40]의 융합 단백질:
(a) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(c) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(d) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(g) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[B-42] 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량보다도 작은, [B-1] 내지 [B-41] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-43] 리간드 결합 도메인의 일부분이 융합 단백질로부터 유리되도록, 절단 사이트가 절단되는, [B-1] 내지 [B-42] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-44] 융합 단백질로부터 유리되는 리간드 결합 도메인의 일부분의 분자량이, 26kDa, 또는 13kDa, 또는 그것보다도 작은, [B-43]의 융합 단백질.
[B-45] 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 비가, 10:9인, [B-42] 내지 [B-44] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-46] 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 9/10인, [B-42] 내지 [B-44] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-47] 제1 상태에서의 융합 단백질과 비교한 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 저감 퍼센티지가, 10%인, [B-42] 내지 [B-44] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-48] 융합 단백질로부터 유리되는 리간드 결합 도메인의 일부분이, VL 혹은 VH를 포함하고, 또는 바람직하게는 VL 혹은 VH인, [B-43] 내지 [B-47] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-49] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [B-32] 내지 [B-48] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-50] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 RU를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하인, 반응 단위의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [B-32] 내지 [B-49] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-51] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [B-32] 내지 [B-48] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-52] SPR 조건이, 30분의 지속 시간에 걸치는, 제1 상태에서의 융합 단백질과 400nM의 uPA의 접촉 지속 시간을 포함하는, [B-49] 내지 [B-51] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-53] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/D (II)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하고, 식 중, D는, 0.01×각각 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 비교한 VH 또는 VL의 분자량의 퍼센티지에 대응하는, [B-49] 내지 [B-51] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-54] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-1):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/10 (II-1)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [B-53]의 융합 단백질.
[B-55] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-2):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/15.8 (II-2)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [B-53]의 융합 단백질.
[B-56] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상인, [B-53] 내지 [B-55] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[B-57] 제1 상태 및 제2 상태에서의 리간드 부분이, 제3 펩타이드 링커를 개재시켜 정상 영역에 결합한 채로 있는, [B-1] 내지 [B-56] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-1] 리간드 부분에 융합한 IgG 항체양 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
(i) (ia) VH 영역과 CH1 영역, 또는 (ib) VL 영역과 CL 영역의 경계의 사이의, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는, 제1 펩타이드 링커;
(ii) 항체의 CH1 영역을 Fc 영역에 접속하고, 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 힌지 영역에 도입된 제2 펩타이드 링커; 및
(iii) 리간드 부분을 항체의 Fc 영역의 C말단에 접속하는, 제3 펩타이드 링커
를 포함하고,
(a) 제1 상태에서, 리간드 부분이 항체 가변 영역에 결합하고, 또한 리간드 부분의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드 부분의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 해당 프로테아제 절단 사이트를 촉매하는 프로테아제의 존재에 의해 매개되는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질.
[C-2] 중쇄의 220위의 Cys(C220)와 경쇄의 214위의 Cys(C214)(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성이 촉진되도록, 상기 제2 펩타이드 링커가, 힌지 영역에 위치되는, [C-1]의 융합 단백질.
[C-3] 상기 정상 영역이, 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 여기에서, 중쇄의 220위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이에 어떠한 다이설파이드 결합도 형성되지 않도록, 중쇄 및 경쇄에 있어서의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [C-1]의 융합 단백질.
[C-4] 상기 경쇄가, C214S 개변을 포함하고, 또한 상기 중쇄가, C220S 개변을 포함하는(EU 넘버링에 따른다), [C-3]의 융합 단백질.
[C-5] 상기 중쇄가, 중쇄의 131위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성을 가능하게 하도록 개변되어 있는, [C-1]의 융합 단백질.
[C-6] 상기 중쇄가, S131C 및 C220S 개변(EU 넘버링에 따른다)을 포함하는, [C-5]의 융합 단백질.
[C-7] 상기 정상 영역이, 서열 번호: 901(C1), 서열 번호: 905(C2), 서열 번호: 908(C3), 서열 번호: 910(C4), 및 서열 번호: 932(C5)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [C-1] 내지 [C-6] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-8] 상기 정상 영역이, 서열 번호: 910(C4)의 서열을 포함하는, [C-7]의 융합 단백질.
[C-9] 상기 제3 펩타이드 링커가, 글리신-세린 폴리머를 포함하는, [C-1] 내지 [C-8] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-10] 상기 글리신-세린 폴리머가, (a) 내지 (ee)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [C-9]의 융합 단백질:
(a) Ser;
(b) Gly Ser(GS);
(c) Ser Gly(SG);
(d) Gly Gly Ser(GGS);
(e) Gly Ser Gly(GSG);
(f) Ser Gly Gly(SGG);
(g) Gly Ser Ser(GSS);
(h) Ser Ser Gly(SSG);
(i) Ser Gly Ser(SGS);
(j) Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136);
(k) Gly Gly Ser Gly(GGSG, 서열 번호: 137);
(l) Gly Ser Gly Gly(GSGG, 서열 번호: 138);
(m) Ser Gly Gly Gly(SGGG, 서열 번호: 139);
(n) Gly Ser Ser Gly(GSSG, 서열 번호: 140);
(o) Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141);
(p) Gly Gly Gly Ser Gly(GGGSG, 서열 번호: 142);
(q) Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143);
(r) Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG, 서열 번호: 144);
(s) Gly Ser Gly Gly Ser(GSGGS, 서열 번호: 145);
(t) Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146);
(u) Gly Ser Ser Gly Gly(GSSGG, 서열 번호: 147);
(v) Gly Ser Gly Ser Gly(GSGSG, 서열 번호: 148);
(w) Ser Gly Gly Ser Gly(SGGSG, 서열 번호: 149);
(x) Gly Ser Ser Ser Gly(GSSSG, 서열 번호: 150);
(y) Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGS, 서열 번호: 151);
(z) Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGG, 서열 번호: 152);
(aa) Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGGS, 서열 번호: 153);
(bb) Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGGG, 서열 번호: 154);
(cc) (Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141))n;
(dd) (Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146))n; 및
(ee) (Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143))n;
여기에서, n은 1 이상의 정수이다.
[C-11] 상기 제3 펩타이드 링커가, GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열 번호: 903)의 서열을 포함하는, [C-10]의 융합 단백질.
[C-12] 상기 리간드 부분이, 사이토카인 또는 케모카인을 포함하는, [C-1] 내지 [C-11] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-13] 상기 리간드 부분이, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIG, I-TAC, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [C-12]의 융합 단백질.
[C-14] 상기 리간드 부분이, IL-12 또는 IL-22인, [C-13]의 융합 단백질.
[C-15] 상기 IL-12가, 프로테아제에 폭로되었을 경우의 단백질 분해를 방해하는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [C-14]의 융합 단백질.
[C-16] 상기 IL-12가, KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않는, [C-15]의 융합 단백질.
[C-17] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, IL-12와 항체 가변 영역의 경계면에서 행해지는, [C-15] 또는 [C-16]의 융합 단백질.
[C-18] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변을 행한 후에, IL-12가, (a) 내지 (p)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 개변된 서열을 포함하는, [C-17]의 융합 단백질:
(a) KSHRE(서열 번호: 1052);
(b) KSHHE(서열 번호: 1053);
(c) KSHKE(서열 번호: 1054);
(d) KSHSE(서열 번호: 1055);
(e) KSKHRE(서열 번호: 1056);
(f) KSKQRE(서열 번호: 1057);
(g) KSKERE(서열 번호: 1058);
(h) KSKPRE(서열 번호: 1059);
(i) KHKE(서열 번호: 1060);
(j) KHHE(서열 번호: 1061);
(k) KHRE(서열 번호: 1062);
(l) KKHE(서열 번호: 1063);
(m) KRHE(서열 번호: 1064);
(n) KRE(서열 번호: 1065);
(o) KHE(서열 번호: 1066); 및
(p) KKE(서열 번호: 1067).
[C-19] 상기 IL-12가, 이하의 (i) 내지 (xvi)의 어느 것을 포함하는, [C-15] 내지 [C-18] 중 어느 하나의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열.
[C-20] 상기 IL-12가, (i) 내지 (xvi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [C-19]의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 동일한 아미노산 서열.
[C-21] 상기 IL-12가, 서열 번호: 1068, 또는 서열 번호: 1069, 또는 서열 번호: 1076, 또는 서열 번호: 1077, 또는 서열 번호: 1078, 또는 서열 번호: 1079, 또는 서열 번호: 1080으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [C-20]의 융합 단백질.
[C-22] 상기 융합 단백질이, 2개의 프로테아제 절단 사이트를 포함하고, 각 프로테아제 절단 사이트가, 표적 조직에 특이적인 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [C-1] 내지 [C-21] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-23] 상기 표적 조직이, 암 조직 또는 염증성 조직인, [C-22]의 융합 단백질.
[C-24] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제에 의해 절단 가능한, [C-1] 내지 [C-23] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-25] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제 절단 서열을 포함하는, [C-24]의 융합 단백질.
[C-26] 각 프로테아제사이트가, 마트립타제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [C-1] 내지 [C-25] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-27] 상기 항체 가변 영역이, 제1 상태보다도 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [C-1] 내지 [C-26] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-28] 상기 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, [C-27]의 융합 단백질.
[C-29] 상기 치환이, VH 상의 포지션 37, 45, 91, 혹은 103, 및/또는 VL 상의 포지션 43, 46, 49, 혹은 87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [C-28]의 융합 단백질.
[C-29a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, L45, H91, Y91, 혹은 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 A43, L46, Y49, 혹은 Y87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [C-28]의 융합 단백질.
[C-30] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [C-29] 또는 [C-29a]의 융합 단백질.
[C-31] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [C-30]의 융합 단백질:
VH 상의 V37S,
L45Q,
Y91M, 혹은 H91A,
W103I, W103L, 혹은 W103M, 및/또는
VL 상의 A43Q,
L46Q,
Y49A, 혹은
Y87L.
[C-32] 상기 치환이, 리간드 결합 도메인과 리간드 부분의 경계면에 존재하는 아미노산에 있어서의 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 상보성 결정 영역(CDR) 중에 있는, [C-29] 내지 [C-31] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-33] 상기 리간드 부분이 IL-12이며, 상기 치환이, VL 상의 포지션 30 및/또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하는, [C-32]의 융합 단백질.
[C-34] 상기 개변이, S30V 및/또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [C-33]의 융합 단백질.
[C-35] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (z)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [C-29] 내지 [C-34]의 융합 단백질:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(c) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(e) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(h) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(j) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(l) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(o) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(p) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(q) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(t) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(u) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(v) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(y) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(z) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[C-36] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (g)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [C-35]의 융합 단백질:
(a) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(c) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(d) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(g) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[C-37] 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량보다도 작은, [C-1] 내지 [C-36] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-38] 폴리펩타이드의 일부분이 융합 단백질로부터 유리되도록, 절단 사이트가 절단되는, [C-1] 내지 [C-37] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-39] 융합 단백질로부터 유리되는 일부분의 분자량이, 26kDa, 또는 13kDa, 또는 그것보다도 작은, [C-38]의 융합 단백질.
[C-40] 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 비가, 10:9인, [C-37] 내지 [C-39] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-41] 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 9/10인, [C-37] 내지 [C-39]의 융합 단백질.
[C-42] 제1 상태에서의 융합 단백질과 비교한 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 저감 퍼센티지가, 10%인, [C-37] 내지 [C-39] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-43] 융합 단백질로부터 유리되는 일부분이, VL 혹은 VH를 포함하고, 또는 바람직하게는 VL 혹은 VH인, [C-38] 내지 [C-42] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-44] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [C-27] 내지 [C-43] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-45] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 RU를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하인, 반응 단위의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [C-27] 내지 [C-44] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-46] 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [C-27] 내지 [C-43] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-47] SPR 조건이, 30분의 지속 시간에 걸치는, 제1 상태에서의 융합 단백질과 400nM의 uPA의 접촉 지속 시간을 포함하는, [C-27] 내지 [C-46] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-48] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/D (II)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하고, 식 중, D는, 0.01×각각 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 비교한 VH 또는 VL의 분자량의 퍼센티지에 대응하는, [C-27] 내지 [A-47] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-49] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-1):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/10 (II-1)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [C-48]의 융합 단백질.
[C-50] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-2):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/15.8 (II-2)
에 따라, 제1 상태와 비교한 제2 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [C-48]의 융합 단백질.
[C-51] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상인, [C-48] 내지 [C-50] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[C-52] 제1 상태 및 제2 상태에서의 리간드 부분이, 제3 펩타이드 링커를 개재시켜 정상 영역에 결합한 채로 있는, [C-1] 내지 [C-51] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[D-1] 이하의 서열(i) 내지 (v)의 어느 1개를 포함하는, IL-12를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1084와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1085와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(ii) 서열 번호: 1084와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1086과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(iii) 서열 번호: 1084와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1085와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(iv) 서열 번호: 1084와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1086과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL); 및
(v) (i) 또는 (iv)에 기재되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인과 경합하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인.
[D-2] 이하의 서열(i) 내지 (x)의 어느 1개를 포함하는, IL-12를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ii) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iii) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iv) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vi) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vii) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(viii) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ix) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(x) (i) 내지 (ix)의 어느 것에 기재되는 중쇄 및 경쇄와 경합하는, 중쇄 가변 및 경쇄.
[D-3] 이하의 서열(i) 내지 (x)의 어느 1개를 포함하는, IL-12를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ii) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iii) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iv) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vi) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vii) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(viii) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ix) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(x) (i) 내지 (ix)의 어느 것에 기재되는 중쇄 및 경쇄와 경합하는, 중쇄 및 경쇄.
[D-4] 이하의 서열(i) 내지 (iv)의 어느 1개를 포함하는, IL-22를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1095와 적어도 70%, 80%, 혹은 90% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1096과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ii) 서열 번호: 1097과 적어도 70%, 80%, 혹은 90% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1098과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iii) 서열 번호: 1099와 적어도 70%, 80%, 혹은 90% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1100과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(iv) (i) 내지 (iii)의 어느 것에 기재되는 중쇄 및 경쇄와 경합하는, 중쇄 및 경쇄.
[D-5] 이하의 서열(i) 내지 (iii)의 어느 1개를 포함하는, IL-22를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1091과 적어도 70%, 80%, 혹은 90% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1092와 적어도 70%, 80%, 혹은 90% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(ii) 서열 번호: 1093과 적어도 70%, 80%, 혹은 90% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1094와 적어도 70%, 80%, 혹은 90% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL); 및
(iii) (i) 또는 (ii)에 기재되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인과 경합하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인.
[E-1] 이하의 서열(i) 내지 (ix)의 어느 1개를 포함하는, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], 및 [C-1] 내지 [C-52] 중 어느 하나의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1084와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1085와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(ii) 서열 번호: 1084와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1086과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(iii) 서열 번호: 1084와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1085와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(iv) 서열 번호: 1084와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1086과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(v) 서열 번호: 1091과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1092와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(vi) 서열 번호: 1093과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1094와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(vii) 서열 번호: 1091과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1092와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(viii) 서열 번호: 1093과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1094와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL); 및
(ix) (i) 내지 (viii)의 어느 것에 기재되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인과 경합하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인.
[E-2] 이하의 서열(i) 내지 (xiii)의 어느 1개를 포함하는, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], 및 [C-1] 내지 [C-52] 중 어느 하나의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ii) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iii) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iv) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vi) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vii) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(viii) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ix) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(x) 서열 번호: 1095와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1096과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xi) 서열 번호: 1097과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1098과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xii) 서열 번호: 1099와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1100과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xiii) (i) 내지 (xii)의 어느 것에 기재되는 중쇄 및 경쇄와 경합하는, 중쇄 및 경쇄.
[E-3] 이하의 서열(i) 내지 (xiii)의 어느 1개를 포함하는, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], 및 [C-1] 내지 [C-52] 중 어느 하나의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ii) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iii) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(iv) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vi) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vii) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(viii) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ix) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(x) 서열 번호: 1095와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1096과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xi) 서열 번호: 1097과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1098과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xii) 서열 번호: 1099와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1100과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(xiii) (i) 내지 (xii)의 어느 것에 기재되는 중쇄 및 경쇄와 경합하는, 중쇄 및 경쇄.
[E-4] [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질과, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
[E-5] 의약품으로서의 사용을 위한, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물.
[E-6] IL-12 매개성 질환 또는 장애에 있어서의 사용을 위한, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-3] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물.
[E-7] IL-22 매개성 질환 또는 장애에 있어서의 사용을 위한, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-4] 혹은 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-47] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물.
[E-8] 암 치료에 있어서의 사용을 위한, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-3] 내지 [E-4], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물.
[E-9] 염증성 질환 또는 장애의 치료에 있어서의 사용을 위한, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물.
[E-10] IL-12 매개성 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-3] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 사용.
[E-11] IL-22 매개성 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-4] 혹은 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-47] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 사용.
[E-12] 암 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 사용.
[E-13] 염증성 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 사용.
[E-14] IL-12 매개성 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-3] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[E-15] IL-22 매개성 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-4] 혹은 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-47] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[E-16] 암을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[E-17] 염증성 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질, 또는 [E-4]의 의약 조성물의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[E-18] [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
[E-19] [E-18]의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
[E-20] [E-18]의 폴리뉴클레오타이드 또는 [E-19]의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
[E-21] [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57] 및 [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5] 및 [E-1] 내지 [E-3], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, 융합 단백질이 제조되도록 [E-20]의 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[E-22] VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산에 치환을 도입하여, 제1 상태와 비교하여 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 공정을 포함하고, 해당 치환을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, [E-21]에 기재된 방법.
[E-23] 상기 치환을 위한 아미노산 포지션이, VH 상의 포지션 37, 45, 91, 혹은 103, 및/또는 VL 상의 포지션 43, 46, 49, 혹은 87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [E-22]에 기재된 방법.
[E-23a] 상기 치환을 위한 아미노산 포지션이, VH 상의 포지션 V37, L45, H91, Y91, 혹은 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 A43, L46, Y49, 혹은 Y87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [E-22]에 기재된 방법.
[E-24] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [E-23] 또는 [E-23a]에 기재된 방법.
[E-25] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [E-24]에 기재된 방법:
VH 상의 V37S,
L45Q,
Y91M, 혹은 H91A,
W103I, W103L, 혹은 W103M, 및/또는
VL 상의 A43Q,
L46Q,
Y49A, 혹은
Y87L.
[E-26] 상기 치환이, 리간드 결합 도메인과 리간드 부분의 경계면에 존재하는 아미노산에 있어서의 적어도 1개의 치환을 추가로 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 상보성 결정 영역(CDR) 중에 있는, [E-23] 내지 [E-25] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[E-27] 상기 리간드 부분이 IL-12이며, 상기 치환이, VL 상의 포지션 30 및/또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 치환을 추가로 포함하는, [E-26]에 기재된 방법.
[E-28] 상기 치환이, S30V 및/또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [E-27]에 기재된 방법.
[E-29] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (bb)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [E-23] 내지 [E-28] 중 어느 하나에 기재된 방법:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(c) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(e) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(h) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(j) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(l) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(m) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(o) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(q) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(r) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(v) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(w) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(y) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(z) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(aa) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(bb) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[E-30] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (g)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [E-29]에 기재된 방법:
(a) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(c) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(d) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(g) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[E-31] 숙주 세포로부터 융합 단백질을 회수하는 공정을 추가로 포함하는, [E-30]에 기재된 방법.
[E-32] 이하의 공정을 포함하는, [E-21]에 기재된 방법:
(a) 융합 단백질로부터의 VH 또는 VL의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, 상기 융합 단백질에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 변이를, 리간드와 리간드 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정,
(b) 공정(a)가, VH 및 VL에 대한 리간드의 결합을 파괴하지 않는 것을 확인하는 공정,
(c) 공정(a)가, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에 VH와 VL의 회합을 저감시킨 것을 확인하는 공정, 및
(d) 공정(a)의 VH 또는 VL을, 프로테아제 절단 서열을 개재시켜 IgG 중쇄 정상 영역과 연결하는 공정,
(e) 공정(e)의 해당 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 얻는 공정,
(f) 공정(e)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 공정, 및
(g) 공정(f)에 있어서의 숙주 세포로부터 융합 단백질을 제조하여, 회수하는 공정.
[F-1] 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 해당 프로테아제 절단 사이트에서의 절단 시에, 해당 프로테아제 절단 사이트에 인접한 항체 도메인이 해리되고, 해당 해리가, 해당 항체 도메인과 대응하는 상호작용하는 도메인의 경계면에서 행해지는 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진되는, 상기 폴리펩타이드.
[F-2] 항체 또는 항체 단편인, [F-1]에 기재된 폴리펩타이드
[F-3] 상기 항체가, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG-IgG, IgG-Fab, 또는 CrossMab 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 IgG 항체인, [F-2]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-4] 상기 항체가, 1가 또는 2가인, [F-3]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-5] 상기 항체가, 단일 특이성 또는 이중 특이성인, [F-4]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-6] 상기 항체 단편이, 항원 결합 도메인을 포함하는, [F-5]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-7] 상기 항체 단편이, scFv, scFv-Fc, 탠덤 scFv, Fab, 탠덤 Fab, F(ab')2, Fab2, Fab-scFv-Fc, F(ab')2-scFv2, 이중 특이성 Fab2, 삼중 특이성 Fab2, 이중 특이성 다이아보디, 삼중 특이성 다이아보디, 탠덤 다이아보디, 트라이아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), 미니보디(minibody), 바이보디(bibody), 또는 트라이보디(tribody)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [F-6]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-8] 상기 항원 결합 도메인이, 항체 가변 영역을 포함하는, [F-7]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-9] 상기 항체 가변 영역이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 임의로, 해당 VH가 CH1 영역과 회합하고, 또한/또는 해당 VL이 CL 영역과 회합하는, [F-8]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-10] 상기 프로테아제 절단 사이트가, VH 영역과 CH1 영역의 경계, 또는 VL 영역과 CL 영역의 경계, 또는 VH와 VL의 경계에 위치하는, [F-9]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-11] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, VH와 VL의 경계면에서 행해지고, 해당 아미노산 개변이, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는, [F-10]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-12] 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변이, VH와 VL의 경계면에서 행해지고, 해당 아미노산 개변이, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는, [F-11]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-13] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며, 해당 치환을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, [F-11]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-14] 상기 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산 페어의 치환인, [F-12]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-15] 상기 적어도 1개의 아미노산 치환이, VH와 VL의 경계면의 대응하는 상호작용하는 아미노산과 동일한 전하 또는 중성의 전하를 달성하기 위한 아미노산의 치환을 포함하는, [F-13]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-16] 상기 페어의 아미노산 치환이, 동일한 전하 또는 중성의 전하를 갖기 위한 양쪽의 아미노산의 치환을 포함하는, [F-14]에 기재된 폴리펩타이드.
[F-17] 상기 치환이, VH 상의 포지션 37, 39, 44, 45, 47, 91, 및 103, 및/또는 VL 상의 포지션 38, 43, 44, 46, 49, 87, 및 98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [F-11] 내지 [F-16] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드.
[F-17a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, Q39, G44, L45, W47, H91, Y91, 및 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 R38, A43, P44, L46, Y49, Y87, 및 F98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [F-11] 내지 [F-16] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드.
[F-18] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [F-17] 또는 [F-17a]에 기재된 방법.
[F-19] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [F-18]에 기재된 폴리펩타이드:
VH 상의 Q39D,
W47A, W47L, 혹은 W47M,
Y91A, Y91L, Y91M, 혹은 H91A,
W103A, W103I, W103L, 혹은 W103M,
V37S, 혹은 V37Q,
G44Q,
L45A, 혹은 L45Q, 및/또는
VL 상의 R38E,
Y49A,
Y87A, Y87L, 혹은 Y87M,
F98A, F98L, 혹은 F98M,
A43Q,
P44A, P44S, 혹은 P44Q,
L46E, 혹은 L46Q.
[F-20] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (pp)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [F-19]에 기재된 폴리펩타이드:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 Q39D, 및 VL 상의 R38E;
(c) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(f) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(h) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(j) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(l) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(o) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(q) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(v) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(y) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(z) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(aa) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(bb) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(cc) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(dd) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(ee) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(ff) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(gg) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 F98M;
(hh) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, P44A, 및 Y49A;
(ii) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(jj) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(kk) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(ll) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(mm) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(nn) VH 상의 V37S 및 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(oo) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(pp) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87M.
[F-21] [F-1] 내지 [F-20] 중 어느 하나의 폴리펩타이드와, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
[F-22] 의약품으로서의 사용을 위한, [F-21]에 기재된 의약 조성물 또는 [F-1] 내지 [F-20] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드.
[F-23] 질환 또는 장애에 있어서의 사용을 위한, [F-21]에 기재된 의약 조성물 또는 [F-1] 내지 [F-20] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드.
[F-24] 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의, [F-21]에 기재된 의약 조성물 또는 [F-1] 내지 [F-20] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드의 사용.
[F-25] 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, [F-21]에 기재된 의약 조성물 또는 [F-1] 내지 [F-20] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[F-26] [F-1] 내지 [F-20] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
[F-27] [F-26]의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
[F-28] [F-26]의 폴리뉴클레오타이드 또는 [F-27]의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
[F-29] [F-1] 내지 [F-20] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 폴리펩타이드가 제조되도록 [F-28]의 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[F-30] 이하의 공정을 포함하는, [F-29]에 기재된 방법:
(a) 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 펩타이드 링커를 도입하는 공정으로서, 해당 프로테아제 절단 가능 펩타이드 링커가, VH 영역을 CH1 영역에, 또는 VL 영역을 CL 영역에, 또는 VH를 VL에 접속하는, 공정,
(b) VL로부터의 VH의 해리, 또는 VH로부터의 VL의 해리를 촉진하기 위해서, VH와 VL의 경계면에 존재하는 적어도 1개의 아미노산 중에 적어도 1개의 치환 변이를 도입하는 공정,
(c) 공정(b)가, VH 및 VL에 대한 항원의 결합을 파괴하지 않는 것을 확인하는 공정, 및
(d) 공정(b)가, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에 VH와 VL의 회합을 저감시키는 것을 확인하는 공정,
(e) 공정(d)의 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 얻는 공정,
(f) 공정(e)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 공정, 및
(g) 공정(f)에 있어서의 숙주 세포로부터 융합 단백질을 제조하여, 회수하는 공정.
[F-31] 상기 치환이, VH 상의 포지션 37, 39, 44, 45, 47, 91, 및 103, 및/또는 VL 상의 포지션 38, 43, 44, 46, 49, 87, 및 98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [F-30]에 기재된 방법.
[F-31a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, Q39, G44, L45, W47, H91, Y91, 및 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 R38, A43, P44, L46, Y49, Y87, 및 F98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [F-30]에 기재된 방법.
[F-32] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [F-31] 또는 [F-31a]에 기재된 방법.
[F-33] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [F-32]에 기재된 방법:
VH 상의 Q39D,
W47A, W47L, 혹은 W47M,
Y91A, Y91L, Y91M, 혹은 H91A,
W103A, W103I, W103L, 혹은 W103M,
V37S, 혹은 V37Q,
G44Q,
L45A, 혹은 L45Q, 및/또는
VL 상의 R38E,
Y49A,
Y87A, Y87L, 혹은 Y87M,
F98A, F98L, 혹은 F98M,
A43Q,
P44A, P44S, 혹은 P44Q,
L46E, 혹은 L46Q.
[F-34] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (pp)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [F-33]에 기재된 방법:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 Q39D, 및 VL 상의 R38E;
(c) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(f) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(h) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(j) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(l) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(o) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(q) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(v) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(y) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(z) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(aa) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(bb) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(cc) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(dd) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(ee) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(ff) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(gg) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 F98M;
(hh) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, P44A, 및 Y49A;
(ii) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(jj) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(kk) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(ll) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(mm) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(nn) VH 상의 V37S 및 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(oo) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(pp) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87M.
[F-35] 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 회수하는 공정을 추가로 포함하는, [F-28] 내지 [F-34] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[G-1] 항원 결합 도메인을 포함하는 전장 IgG 항체를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질로서, 해당 항원 결합 도메인이, 가변 영역을 포함하고, 해당 가변 영역이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 또한 (a) 그 가변 영역의 VH 영역과 CH1 영역의 경계 또는 VL 영역과 CL 영역의 경계의 프로테아제 절단 사이트, 및 (b) 해당 가변 영역에 결합하는 리간드를 포함하고, 프로테아제 절단 시에, (i) VH 또는 VL 중 한쪽이 융합 단백질로부터 해리되고, 또한 (ii) 리간드가 가변 영역으로부터 해리되고, (i)에 기재되는 해리가, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는, VH와 VL의 경계면에서 행해지는 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진되는, 상기 2가 호모이량체 융합 단백질.
[G-2] 상기 전장 IgG 항체가, IgG 항체양 폴리펩타이드인, [G-1]의 융합 단백질.
[G-3] 상기 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환인, [G-2]의 융합 단백질.
[G-4] 적어도 1개의 페어의 아미노산 치환이, VH와 VL의 경계면에서 행해지고, 해당 치환을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, [G-3]의 융합 단백질.
[G-5] 상기 페어의 아미노산 치환이, 동일한 전하 또는 중성의 전하를 갖기 위한 양쪽의 아미노산의 치환을 포함하는, [G-4]의 융합 단백질.
[G-6] 상기 치환이, VH 상의 포지션 37, 39, 44, 45, 47, 91, 및 103, 및/또는 VL 상의 포지션 38, 43, 44, 46, 49, 87, 및 98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [G-3] 내지 [G-5]의 융합 단백질.
[G-6a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, Q39, G44, L45, W47, H91, Y91, 및 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 R38, A43, P44, L46, Y49, Y87, 및 F98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [G-3] 내지 [G-5]의 융합 단백질.
[G-7] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [G-6] 또는 [G-6a]의 융합 단백질.
[G-8] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [G-7]의 융합 단백질:
VH 상의 Q39D,
W47A, W47L, 혹은 W47M,
Y91A, Y91L, Y91M, 혹은 H91A,
W103A, W103I, W103L, 혹은 W103M,
V37S, 혹은 V37Q,
G44Q,
L45A, 혹은 L45Q, 및/또는
VL 상의 R38E,
Y49A,
Y87A, Y87L, 혹은 Y87M,
F98A, F98L, 혹은 F98M,
A43Q,
P44A, P44S, 혹은 P44Q,
L46E, 혹은 L46Q.
[G-9] 상기 치환이, 가변 영역과 리간드의 경계면에 존재하는 아미노산에 있어서의 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 상보성 결정 영역(CDR) 중에 있는, [G-6] 내지 [G-8] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[G-10] 상기 리간드가 IL-12이며, 상기 치환이, VL 상의 포지션 30 및/또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하는, [G-9]의 융합 단백질.
[G-11] 상기 개변이, S30V 및/또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [G-10]의 융합 단백질.
[G-12] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (hhh)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [G-11]의 융합 단백질:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 Q39D, 및 VL 상의 R38E;
(c) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(f) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(h) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(j) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(l) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(o) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(q) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(v) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(y) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(z) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(aa) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(bb) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(cc) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(dd) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(ee) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(ff) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(gg) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 F98M;
(hh) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(ii) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(jj) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(kk) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(ll) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(mm) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, P44A, 및 Y49A;
(nn) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(oo) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(pp) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(qq) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(rr) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(ss) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(tt) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(uu) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(vv) VH 상의 V37S 및 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(ww) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(xx) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(yy) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87M;
(zz) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(aaa) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(bbb) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(ccc) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(ddd) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(eee) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(fff) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(ggg) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(hhh) VH 상의 V37S, F100aI, W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[G-13] 융합 단백질의 분자량이, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에, 해당 절단 전과 비교하여 작은, [G-1] 내지 [G-12] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[G-14] 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [G-1] 내지 [G-13] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[G-15] 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [G-1] 내지 [G-13] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[G-16] SPR 조건이, 30분의 지속 시간에 걸치는, 미절단 상태에서의 융합 단백질과 400nM의 uPA의 접촉 지속 시간을 포함하는, [G-14] 또는 [G-15] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[G-17] 유리된 VH-리간드 또는 VL-리간드의 퍼센티지가, 식(II):
VH-리간드 또는 VL-리간드의 유리%=RU의 저감%×100/D (II)
에 따라, 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하고, 식 중, D는, 0.01×각각 미절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 비교한 VH-리간드 또는 VL-리간드의 분자량의 퍼센티지에 대응하는, [G-14] 내지 [G-16] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[G-18] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상인, [G-17]의 융합 단백질.
[G-19] [G-1] 내지 [G-18] 중 어느 하나의 융합 단백질과, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물.
[G-20] 의약품으로서의 사용을 위한, [G-19]에 기재된 의약 조성물 또는 [G-1] 내지 [G-18] 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질.
[G-21] 질환 또는 장애에 있어서의 사용을 위한, [G-19]에 기재된 의약 조성물 또는 [G-1] 내지 [G-18] 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질.
[G-22] 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의, [G-19]에 기재된 의약 조성물 또는 [G-1] 내지 [G-18] 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질의 사용.
[G-23] 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, [G-19]에 기재된 의약 조성물 또는 [G-1] 내지 [G-18] 중 어느 하나에 기재된 융합 단백질의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[G-24] [G-1] 내지 [G-18] 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
[G-25] [G-24]의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
[G-26] [G-24]의 폴리뉴클레오타이드 또는 [G-25]의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
[G-27] [G-1] 내지 [G-24] 중 어느 하나의 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, [G-26]의 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[G-28] 이하의 공정을 포함하는, [G-27]에 기재된 방법:
(a) 융합 단백질로부터의 VH 또는 VL의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, 상기 융합 단백질에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 개변을, 리간드와 가변 영역의 경계면에 도입하는 공정,
(b) 공정(a)가, VH 및 VL에 대한 리간드의 결합을 파괴하지 않는 것을 확인하는 공정,
(c) 공정(a)가, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에 VH와 VL의 회합을 저감시킨 것을 확인하는 공정, 및
(d) 공정(a)의 VH 또는 VL을, 프로테아제 절단 서열을 개재시켜 IgG 중쇄 정상 영역과 연결하는 공정,
(e) 공정(e)의 해당 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 얻는 공정,
(f) 공정(e)의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 공정, 및
(g) 공정(f)에 있어서의 숙주 세포로부터 융합 단백질을 제조하여, 회수하는 공정.
[G-29] 상기 개변이, 치환이며, 또한 해당 치환이, VH 상의 포지션 37, 39, 44, 45, 47, 91, 및 103, 및/또는 VL 상의 포지션 38, 43, 44, 46, 49, 87, 및 98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [G-28]에 기재된 방법.
[G-29a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, Q39, G44, L45, W47, H91, Y91, 및 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 R38, A43, P44, L46, Y49, Y87, 및 F98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [G-28]의 융합 단백질.
[G-30] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [G-29] 또는 [G-29a]의 융합 단백질.
[G-31] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [G-30]에 기재된 방법:
VH 상의 Q39D,
W47A, W47L, 혹은 W47M,
Y91A, Y91L, Y91M, 혹은 H91A,
W103A, W103I, W103L, 혹은 W103M,
V37S, 혹은 V37Q,
G44Q,
L45A, 혹은 L45Q, 및/또는
VL 상의 R38E,
Y49A,
Y87A, Y87L, 혹은 Y87M,
F98A, F98L, 혹은 F98M,
A43Q,
P44A, P44S, 혹은 P44Q,
L46E, 혹은 L46Q.
[G-32] 상기 치환이, 가변 영역과 리간드의 경계면에 존재하는 아미노산에 있어서의 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 상보성 결정 영역(CDR) 중에 있는, [G-28] 내지 [G-31]에 기재된 방법.
[G-33] 상기 리간드가 IL-12이며, 상기 치환이, VL 상의 포지션 30 및/또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하는, [G-32]에 기재된 방법.
[G-34] 상기 개변이, S30V 및/또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [G-33]에 기재된 방법.
[G-35] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (hhh)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [G-34]에 기재된 방법:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 Q39D, 및 VL 상의 R38E;
(c) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(f) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(h) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(j) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(l) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(o) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(q) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(v) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(y) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(z) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(aa) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(bb) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(cc) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(dd) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(ee) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(ff) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(gg) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 F98M;
(hh) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(ii) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(jj) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(kk) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(ll) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(mm) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, P44A, 및 Y49A;
(nn) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(oo) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(pp) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(qq) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(rr) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(ss) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(tt) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(uu) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(vv) VH 상의 V37S 및 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(ww) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(xx) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(yy) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87M;
(zz) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(aaa) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(bbb) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(ccc) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(ddd) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(eee) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(fff) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(ggg) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(hhh) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[G-36] 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 회수하는 공정을 추가로 포함하는, [G-27] 내지 [G-35] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[H-1] 미절단 상태 또는 제1 상태와 비교하여 절단 상태 또는 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 변이를 갖는, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], [G-1] 내지 [G-18], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 스크리닝하기 위한 방법으로서, 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서, 프로테아제 절단의 전 및 후에 [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], 및 [G-1] 내지 [G-18] 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 대해 기록된 최대 반응 단위를 비교하는 공정, 및, 프로테아제 절단의 전 및 후에, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하, 또는 11% 이하, 또는 12% 이하, 또는 13% 이하, 또는 14% 이하, 또는 15% 이하, 또는 16% 이하, 또는 17% 이하, 또는 18% 이하, 또는 19% 이하, 또는 20% 이하, 또는 21% 이하, 또는 22% 이하, 또는 23% 이하, 또는 24% 이하, 또는 25% 이하, 또는 26% 이하, 또는 27% 이하, 또는 28% 이하, 또는 29% 이하, 또는 30% 이하, 또는 31% 이하, 또는 32% 이하, 또는 33% 이하, 또는 34% 이하, 또는 35% 이하, 또는 36% 이하, 또는 37% 이하, 또는 38% 이하, 또는 39% 이하, 또는 40% 이하의 반응 단위의 저감을 결과로서 가져오는 변이를 선택하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[H-2] 이하의 공정을 포함하는, 미절단 상태 또는 제1 상태와 비교하여 절단 상태 또는 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 변이를 갖는, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], [G-1] 내지 [G-18], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 스크리닝하기 위한 방법:
(a) 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 도메인 또는 VL 도메인의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 변이 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 변이를, 해당 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 변이를, 리간드 또는 항원과 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 프로테아제의 비존재하에서의 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제1 반응 단위(RU1)를 측정하는 공정;
(c) 프로테아제의 존재하에서의 동일한 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제2 반응 단위(RU2)를 측정하는 공정;
(d) 프로테아제 절단의 전 및 후에, RU1과 RU2 사이의 차의 퍼센티지가, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인 경우에는, 공정(a)에 있어서의 변이를 선택하는 공정.
[H-3] 반응 단위의 저감 퍼센티지가, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 유리에 기인하는 분자량의 저감 퍼센티지에 대응하는, [H-1] 또는 [H-2]의 방법.
[H-4] 이하의 공정을 포함하는, 미절단 상태 또는 제1 상태와 비교하여 절단 상태 또는 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 변이를 갖는, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], [G-1] 내지 [G-18], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 스크리닝하기 위한 방법:
(a) 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 도메인 또는 VL 도메인의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 변이 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 변이를, 해당 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 변이를, 리간드 또는 항원과 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 프로테아제 절단 전의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제1 세트를, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)에 제공하여, 피크 A1(제1 피크)를 포함하는 제1 크로마토그래프를 얻는 공정;
(c) 프로테아제 절단 후의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제2 세트를, SEC에 제공하여, 피크 A2(제2 피크) 및 추가적인 피크 A2'(제3 피크)(A2'는, A2의 숄더 피크이다)를 포함하는 제2 크로마토그래프를 얻는 공정;
(d) 피크 A2'(제3 피크)의 곡선하 면적(AUC) 나누기 피크 A1(제1 피크)의 AUC로부터 결과로서 생긴 퍼센티지를 결정하는 공정;
(e) 공정(d)에 있어서 얻어진 퍼센티지가, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인 경우에는, 공정(a)에 있어서의 변이를 선택하는 공정.
[H-5] (d)에 있어서 결정된 퍼센티지가, 프로테아제 절단 후에 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 해리된 VH 또는 VL의 퍼센티지에 대응하는, [H-4]의 방법.
[H-6] [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], [G-1] 내지 [G-18], 또는 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질을 스크리닝했을 경우에, 상기 퍼센티지가, 10% 이하인, [H-1] 내지 [H-5] 중 어느 하나의 방법.
[H-7] [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], [G-1] 내지 [G-18], 또는 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 스크리닝했을 경우에, 상기 퍼센티지가, 10% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 37% 이하인, [H-1] 내지 [H-5] 중 어느 하나의 방법.
[H-8] 이하의 공정을 추가로 포함하는, [H-1] 내지 [H-6] 중 어느 하나의 방법:
i. 프로테아제 절단 전에, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], [G-1] 내지 [G-18], [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정;
ii. 프로테아제 절단 후에, 공정(i)의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정;
iii. 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, 공정(i)에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 개변을, 리간드 또는 항원과 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정으로서, 해당 아미노산 개변이, 프로테아제의 존재하에서의 프로테아제 절단 시에, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 해리를 촉진하는, 공정;
iv. 프로테아제 절단 전에, 공정(iii)에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정;
v. 프로테아제 절단 후에, 공정(iii)에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정; 및
vi. 공정(v)에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성이, 공정(iv)에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성보다도 큰, 아미노산 개변을 선택하는 공정.
[H-9] 이하의 공정을 추가로 포함하는, [H-8]의 방법:
(a) (i)와 (ii) 사이의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성의 차인 "V1", 및 (iv)과 (v) 사이의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성의 차인 "V2"를 결정하는 공정; 및
(b) V2의 값이 V1보다도 큰, 아미노산 개변을 선택하는 공정.
[H-10] [H-1] 내지 [H-9]에 있어서 선택된 변이를 포함하는, [A-1] 내지 [A-57], [B-1] 내지 [B-57], [C-1] 내지 [C-52], [D-1] 내지 [D-5], [E-1] 내지 [E-3], [F-1] 내지 [F-20], [G-1] 내지 [G-18], 및 [J-1] 내지 [J-55] 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는, 아미노산 변이의 라이브러리.
[H-11] 상기 변이가, VH 상의 포지션 37, 39, 44, 45, 47, 91, 및 103, 및/또는 VL 상의 포지션 38, 43, 44, 46, 49, 87, 및 98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [H-10]에 기재된 라이브러리.
[H-11a] 상기 변이가, VH 상의 포지션 V37, Q39, G44, L45, W47, H91, Y91, 및 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 R38, A43, P44, L46, Y49, Y87, 및 F98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [H-10]에 기재된 라이브러리.
[H-12] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [H-11] 또는 [H-11a]에 기재된 라이브러리.
[H-13] 상기 변이가, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는 치환인, [H-12]에 기재된 라이브러리:
VH 상의 Q39D,
W47A, W47L, 혹은 W47M,
Y91A, Y91L, Y91M, 혹은 H91A,
W103A, W103L, 혹은 W103M,
V37S, 혹은 V37Q,
G44Q,
L45A, 혹은 L45Q, 및/또는
VL 상의 R38E,
Y49A,
Y87A, Y87L, 혹은 Y87M,
F98A, F98L, 혹은 F98M,
A43Q,
P44A, P44S, 혹은 P44Q,
L46E, 혹은 L46Q.
[H-14] 상기 변이가, VL 상의 포지션 30 또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 추가적으로 선택되는, [H-13]에 기재된 라이브러리.
[H-15] 상기 변이가, S30V 또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [H-14]에 기재된 라이브러리.
[H-16] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (hhh)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [H-15]에 기재된 라이브러리:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 Q39D, 및 VL 상의 R38E;
(c) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(f) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(h) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(j) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(l) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(o) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(q) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(v) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(y) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(z) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(aa) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(bb) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(cc) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(dd) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(ee) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(ff) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(gg) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 F98M;
(hh) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(ii) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(jj) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(kk) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(ll) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(mm) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, P44A, 및 Y49A;
(nn) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(oo) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(pp) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(qq) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(rr) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(ss) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(tt) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(uu) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(vv) VH 상의 V37S 및 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(ww) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(xx) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(yy) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87M;
(zz) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(aaa) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(bbb) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(ccc) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(ddd) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(eee) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(fff) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(ggg) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(hhh) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[I-1] 단리된 프로테아제 내성 인터류킨-12(IL-12).
[I-2] 상기 프로테아제가, 마트립타제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [I-1]의 프로테아제 내성 IL-12.
[I-3] 상기 프로테아제가, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA)인, [I-2]의 프로테아제 내성 IL-12.
[I-4] 프로테아제에 폭로되었을 경우의 IL-12의 단백질 분해를 방해하는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [I-1] 내지 [I-3] 중 어느 하나의 프로테아제 내성 IL-12.
[I-5] KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않는, [I-4]의 프로테아제 내성 IL-12.
[I-6] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, IL-12와 IL-12의 헤파린 결합 부위의 경계면에서 행해지는, [I-5]의 프로테아제 내성 IL-12.
[I-7] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변을 행한 후에, IL-12가, (a) 내지 (p)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 개변된 서열을 포함하는, [I-6]의 프로테아제 내성 IL-12:
(a) KSHRE(서열 번호: 1052);
(b) KSHHE(서열 번호: 1053);
(c) KSHKE(서열 번호: 1054);
(d) KSHSE(서열 번호: 1055);
(e) KSKHRE(서열 번호: 1056);
(f) KSKQRE(서열 번호: 1057);
(g) KSKERE(서열 번호: 1058);
(h) KSKPRE(서열 번호: 1059);
(i) KHKE(서열 번호: 1060);
(j) KHHE(서열 번호: 1061);
(k) KHRE(서열 번호: 1062);
(l) KKHE(서열 번호: 1063);
(m) KRHE(서열 번호: 1064);
(n) KRE(서열 번호: 1065);
(o) KHE(서열 번호: 1066); 및
(p) KKE(서열 번호: 1067).
[I-8] 상기 IL-12가, 이하의 (i) 내지 (xvi)의 어느 것을 포함하는, [I-1] 내지 [I-7] 중 어느 하나의 프로테아제 내성 IL-12:
(i) 서열 번호: 1068과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열.
[I-9] 상기 IL-12가, 이하의 (i) 내지 (xvi)의 어느 것을 포함하는, [I-1] 내지 [I-8] 중 어느 하나의 프로테아제 내성 IL-12:
(i) 서열 번호: 1068과 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 동일한 아미노산 서열.
[J-1] 각각이 N말단으로부터 C말단을 향해, 일반식(I):
[리간드 결합 도메인]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[리간드 부분] (I)
에 의해 표시되는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
식 중,
Lx가, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 펩타이드 링커를 나타내고,
Cx가, 제2 펩타이드 링커, 및 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 정상 영역을 나타내고;
Ly가, 제3 펩타이드 링커를 나타내고,
해당 리간드 결합 도메인이, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 프로테아제 절단 사이트의 절단을 촉매하는 프로테아제의 비존재하("미절단 상태")와 비교하여 해당 프로테아제의 존재하("절단 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질.
[J-2] 상기 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, [J-1]의 융합 단백질.
[J-3] 상기 치환이, VH 상의 포지션 37, 45, 91, 혹은 103, 및/또는 VL 상의 포지션 43, 46, 49, 혹은 87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [J-2]의 융합 단백질.
[J-3a] 상기 치환이, VH 상의 포지션 V37, L45, H91, Y91, 혹은 W103, 및/또는 VL 상의 포지션 A43, L46, Y49, 혹은 Y87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, [J-2]의 융합 단백질.
[J-4] 포지션의 각각이, A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y의 어느 것으로 치환되는, [J-3] 또는 [J-3a]의 융합 단백질.
[J-5] 상기 치환이, 이하의 어느 1개 또는 복수를 포함하는 포지션(Kabat 넘버링에 따른다)으로부터 선택되는, [J-4]의 융합 단백질:
VH 상의 V37S,
L45Q,
Y91M, 혹은 H91A,
W103I, W103L, 혹은 W103M, 및/또는
VL 상의 A43Q,
L46Q,
Y49A, 혹은
Y87L.
[J-6] 상기 치환이, 리간드 결합 도메인과 리간드의 경계면에 존재하는 아미노산에 있어서의 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 상보성 결정 영역(CDR) 중에 있는, [J-5]의 융합 단백질.
[J-7] 상기 리간드 부분이 IL-12이며, 상기 치환이, VL 상의 포지션 30 및/또는 VH 상의 포지션 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 개변을 추가로 포함하는, [J-6]의 융합 단백질.
[J-8] 상기 개변이, S30V 및/또는 F100aI(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 치환인, [J-7]의 융합 단백질.
[J-9] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (z)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [J-2] 내지 [J-8]의 융합 단백질:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(c) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(e) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(h) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(j) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(l) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(o) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(p) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(q) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(t) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(u) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(v) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L; 및
(x) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(y) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(z) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[J-10] 상기 치환이, Kabat 넘버링에 따르는 이하의 조합(a) 내지 (g)의 어느 1개로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [J-9]의 융합 단백질:
(a) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(c) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(d) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(e) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(g) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
[J-11] 절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 미절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량보다도 작은, [J-1] 내지 [J-10] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-12] 절단 상태에서는, 리간드 결합 도메인의 일부분이 융합 단백질로부터 유리되도록, 절단 사이트가 절단되는, [J-1] 내지 [J-11] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-13] 융합 단백질로부터 유리되는 리간드 결합 도메인의 일부분의 분자량이, 26kDa, 또는 13kDa, 또는 그것보다도 작은, [J-12]의 융합 단백질.
[J-14] 절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 미절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 비가, 10:9인, [J-1] 내지 [J-13] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-15] 절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량이, 미절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 9/10인, [J-1] 내지 [J-14]의 융합 단백질.
[J-16] 미절단 상태에서의 융합 단백질과 비교한 절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 저감 퍼센티지가, 10%인, [J-1] 내지 [J-15] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-17] 프로테아제 절단 시에 융합 단백질로부터 유리되는 리간드 결합 도메인의 일부분이, VL 또는 VH를 포함하는, [J-1] 내지 [J-16] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-18] 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제의 비존재하 및 프로테아제의 존재하의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [J-1] 내지 [J-17] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-19] 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제의 비존재하 및 프로테아제의 존재하의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [J-1] 내지 [J-18] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-20] 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의 VH와 VL 사이의 회합의 저감이, 프로테아제의 비존재하 및 프로테아제의 존재하의 융합 단백질의 반응 단위(RU)를 비교하는 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서 측정되었을 경우에, 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인, 최대 RU의 저감 퍼센티지에 의해 나타낼 수 있는, [J-1] 내지 [J-19] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-21] SPR 조건이, 30분의 지속 시간에 걸치는, 미절단 상태에서의 융합 단백질과 400nM의 uPA 프로테아제의 접촉 지속 시간을 포함하는, [J-1] 내지 [J-20] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-22] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/D (II)
에 따라, 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하고, 식 중, D는, 0.01×각각 미절단 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 비교한 VH 또는 VL의 분자량의 퍼센티지에 대응하는, [J-19] 내지 [J-20] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-23] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-1):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/10 (II-1)
에 따라, 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [J-22]의 융합 단백질.
[J-24] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 식(II-2):
VH 또는 VL의 유리%=RU의 저감%×100/15.8 (II-2)
에 따라, 미절단 상태와 비교한 절단 상태에서의, SPR하에서 측정되는, 융합 단백질의 반응 단위(RU)의 변화의 퍼센티지와 정비례하는, [J-23]의 융합 단백질.
[J-25] 유리된 VH 또는 VL의 퍼센티지가, 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상인, [J-22] 내지 [J-24] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-26] 미절단 상태 및 절단 상태에서의 리간드 부분이, 제3 펩타이드 링커를 개재시켜 정상 영역에 결합한 채로 있는, [J-1] 내지 [J-25] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-27] 리간드 부분과 리간드 결합 도메인 사이의 결합이, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서 감약되어 있는, [J-1] 내지 [J-26] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-28] 미절단 상태에서, 리간드 부분이 리간드 결합 도메인에 결합하고, 또한 리간드 부분의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 절단 상태에서, 리간드의 생물학적 활성이 복원되는, [J-1] 내지 [J-27] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-29] Cx가, 중쇄의 CH1 영역 및 경쇄의 CL 영역을 포함하는, [J-1] 내지 [J-28] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-30] 중쇄의 220위의 Cys(C220)와 경쇄의 214위의 Cys(C214)(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성이 촉진되도록, 제2 펩타이드 링커가, 힌지 영역에 위치되는, [J-1] 내지 [J-29] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-31] Cx가, 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 여기에서, 중쇄의 220위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이에 어떠한 다이설파이드 결합도 형성되지 않도록, 중쇄 및 경쇄에 있어서의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [J-1] 내지 [J-29] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-32] 상기 경쇄가, C214S 개변을 포함하고, 또한 상기 중쇄가, C220S 개변을 포함하는(EU 넘버링에 따른다), [J-31]의 융합 단백질.
[J-33] 상기 중쇄가, 중쇄의 131위와 경쇄의 214위(EU 넘버링에 따른다) 사이의 다이설파이드 결합 형성을 가능하게 하도록 개변되어 있는, [J-1] 내지 [J-29] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-34] 상기 중쇄가, S131C 및 C220S 개변(EU 넘버링에 따른다)을 포함하는, [J-33]의 융합 단백질.
[J-35] Cx가, 서열 번호: 901(C1), 서열 번호: 905(C2), 서열 번호: 908(C3), 서열 번호: 910(C4), 및 서열 번호: 932(C5)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [J-1] 내지 [J-34] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-36] Cx가, 서열 번호: 910(C4)의 서열을 포함하는, [J-35]의 융합 단백질.
[J-37] Ly가, 글리신-세린 폴리머를 포함하는, [J-1] 내지 [J-36] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-38] 상기 글리신-세린 폴리머가, (a) 내지 (ee)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [J-37]의 융합 단백질:
(a) Ser;
(b) Gly Ser(GS);
(c) Ser Gly(SG);
(d) Gly Gly Ser(GGS);
(e) Gly Ser Gly(GSG);
(f) Ser Gly Gly(SGG);
(g) Gly Ser Ser(GSS);
(h) Ser Ser Gly(SSG);
(i) Ser Gly Ser(SGS);
(j) Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136);
(k) Gly Gly Ser Gly(GGSG, 서열 번호: 137);
(l) Gly Ser Gly Gly(GSGG, 서열 번호: 138);
(m) Ser Gly Gly Gly(SGGG, 서열 번호: 139);
(n) Gly Ser Ser Gly(GSSG, 서열 번호: 140);
(o) Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141);
(p) Gly Gly Gly Ser Gly(GGGSG, 서열 번호: 142);
(q) Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143);
(r) Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG, 서열 번호: 144);
(s) Gly Ser Gly Gly Ser(GSGGS, 서열 번호: 145);
(t) Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146);
(u) Gly Ser Ser Gly Gly(GSSGG, 서열 번호: 147);
(v) Gly Ser Gly Ser Gly(GSGSG, 서열 번호: 148);
(w) Ser Gly Gly Ser Gly(SGGSG, 서열 번호: 149);
(x) Gly Ser Ser Ser Gly(GSSSG, 서열 번호: 150);
(y) Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGS, 서열 번호: 151);
(z) Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGG, 서열 번호: 152);
(aa) Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGGS, 서열 번호: 153);
(bb) Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGGG, 서열 번호: 154);
(cc) (Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141))n;
(dd) (Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146))n; 및
(ee) (Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143))n;
여기에서, n은 1 이상의 정수이다.
[J-39] Ly가, GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열 번호: 903)의 서열을 포함하는, [J-38]의 융합 단백질.
[J-40] 상기 융합 단백질이, 2개의 프로테아제 절단 사이트를 포함하고, 각 프로테아제 절단 사이트가, 표적 조직에 특이적인 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [J-1] 내지 [J-39] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-41] 상기 표적 조직이, 암 조직 또는 염증성 조직인, [J-40]의 융합 단백질.
[J-42] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제에 의해 절단 가능한, [J-1] 내지 [J-41] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-43] 각 프로테아제 절단 사이트가, 동일한 프로테아제 절단 서열을 포함하는, [J-42]의 융합 단백질.
[J-44] 각 프로테아제 절단 사이트가, 마트립타제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 독립적으로 절단 가능한, [J-1] 내지 [J-43] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-45] Lx가, VH 영역과 CH1 영역의 경계 부근 또는 VL 영역과 CL 영역의 경계 부근에 위치하는 프로테아제 절단 사이트를 포함하는, [J-1] 내지 [J-44] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-46] 상기 리간드 부분이, 사이토카인 또는 케모카인을 포함하는, [J-1] 내지 [J-45] 중 어느 하나의 융합 단백질.
[J-47] 상기 리간드 부분이, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIG, I-TAC, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [J-46]의 융합 단백질.
[J-48] 상기 리간드 부분이, IL-12인, [J-47]의 융합 단백질.
[J-49] 상기 IL-12가, IL-12의 절단을 촉매하는 프로테아제에 폭로되었을 경우의 단백질 분해를 방해하는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, [J-48]의 융합 단백질.
[J-50] 상기 IL-12가, KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않는, [J-49]의 융합 단백질.
[J-51] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, IL-12와 리간드 결합 도메인의 경계면에서 행해지는, [J-49] 또는 [J-50]의 융합 단백질.
[J-52] 상기 적어도 1개의 아미노산 개변을 행한 후에, IL-12가, (a) 내지 (p)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 개변된 서열을 포함하는, [J-51]의 융합 단백질:
(a) KSHRE(서열 번호: 1052);
(b) KSHHE(서열 번호: 1053);
(c) KSHKE(서열 번호: 1054);
(d) KSHSE(서열 번호: 1055);
(e) KSKHRE(서열 번호: 1056);
(f) KSKQRE(서열 번호: 1057);
(g) KSKERE(서열 번호: 1058);
(h) KSKPRE(서열 번호: 1059);
(i) KHKE(서열 번호: 1060);
(j) KHHE(서열 번호: 1061);
(k) KHRE(서열 번호: 1062);
(l) KKHE(서열 번호: 1063);
(m) KRHE(서열 번호: 1064);
(n) KRE(서열 번호: 1065);
(o) KHE(서열 번호: 1066); 및
(p) KKE(서열 번호: 1067).
[J-53] 상기 IL-12가, (i) 내지 (xvi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [J-49] 내지 [J-52]의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열.
[J-54] 상기 IL-12가, (i) 내지 (xvi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [J-53]의 융합 단백질:
(i) 서열 번호: 1068과 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 동일한 아미노산 서열; 및
(xvi) 서열 번호: 1083과 동일한 아미노산 서열.
[J-55] 상기 IL-12가, 서열 번호: 1068, 또는 서열 번호: 1069, 또는 서열 번호: 1076, 또는 서열 번호: 1077, 또는 서열 번호: 1078, 또는 서열 번호: 1079, 또는 서열 번호: 1080으로부터 선택되는 서열을 포함하는, [J-54]의 융합 단백질.
[K-1] 전술한 태양의 어느 하나의 융합 단백질을 포함하는 라이브러리로서, 해당 라이브러리가, 프로테아제의 비존재하와 비교하여 프로테아제의 존재하에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 1개 또는 복수의 아미노산 개변을 포함하는, 융합 단백질을 스크리닝하는 방법에 의해 얻어지고, 해당 스크리닝하는 방법이, 전술한 태양의 어느 하나에 예시되는 바와 같은, 상기 라이브러리.
[K-2] 전술한 태양의 어느 하나의 융합 단백질을 포함하는 라이브러리로서, 해당 라이브러리가, 프로테아제의 비존재하와 비교하여 프로테아제의 존재하에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 1개 또는 복수의 아미노산 개변을 포함하는, 융합 단백질을 제조하는 방법에 의해 얻어지고, 해당 프로테아제의 비존재하와 비교하여 프로테아제의 존재하에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 1개 또는 복수의 아미노산 개변이, 전술한 태양의 어느 하나에 예시되는 바와 같은 스크리닝하는 방법에 의해 특정되는, 상기 라이브러리.
[K-3] 전술한 태양의 어느 하나의 융합 단백질, 또는 전술한 태양의 어느 하나의 폴리펩타이드로부터, VH 또는 VL을 유리하는 방법으로서, VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 VH와 VL의 경계면에 도입하는 공정을 포함하고, 해당 적어도 1개의 아미노산 개변이, 전술한 태양의 어느 하나에 예시되는 스크리닝하는 방법으로부터 선택되는, 상기 방법.
[K-4] 복수의 2가 호모이량체 융합 단백질을 포함하는 라이브러리로서, 해당 라이브러리 내의 각 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단의 전후에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, 상기 라이브러리.
[K-5] 2가 호모이량체 융합 단백질로부터 VH 또는 VL을 유리하는 방법으로서, 해당 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단의 전과 비교하여, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 해당 VH 또는 VL이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 융합 단백질로부터 유리되고, 해당 방법이, 적어도 1개의 아미노산 개변을 VH와 VL의 경계면에 도입하는 공정을 포함하고, 해당 아미노산이, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, 상기 방법.
[K-6] 2가 호모이량체 융합 단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 해당 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 전("미절단 상태")과 비교하여 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후("절단 상태")에 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 해당 VH 또는 VL이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 융합 단백질로부터 유리되고, 해당 방법이,
(a) VH 또는 VL의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 개변을, 리간드와 리간드 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 미절단 상태에서의 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질의 제1 반응 단위(RU1)를 측정하는 공정;
(c) 절단 상태에서의 동일한 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질의 제2 반응 단위(RU2)를 측정하는 공정; 및
(d) RU1과 RU2 사이의 차의 퍼센티지가, 1% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 40% 이하인 경우에는, 공정(a)에 있어서의 개변을 선택하는 공정
을 포함하고,
반응 단위의 저감 퍼센티지가, 융합 단백질로부터의 VH 또는 VL의 유리에 기인하는 분자량의 저감 퍼센티지에 대응하는,
상기 방법.
[K-7] 2가 호모이량체 융합 단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 해당 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 전("미절단 상태")과 비교하여 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후("절단 상태")에 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 해당 VH 또는 VL이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 융합 단백질로부터 유리되고, 해당 방법이,
(a) VH 또는 VL의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 개변을, 리간드와 리간드 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 미절단 상태에서의 융합 단백질의 제1 세트를, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)에 제공하여, 피크 A1(제1 피크)를 포함하는 제1 크로마토그래프를 얻는 공정;
(c) 절단 상태에서의 융합 단백질의 제2 세트를, SEC에 제공하여, 피크 A2(제2 피크) 및 추가적인 피크 A2'(제3 피크)(A2'는, A2의 숄더 피크이다)를 포함하는 제2 크로마토그래프를 얻는 공정;
(d) 피크 A2'(제3 피크)의 곡선하 면적(AUC) 나누기 피크 A1(제1 피크)의 AUC로부터 결과로서 생긴 퍼센티지를 결정하는 공정; 및
(e) 공정(d)에 있어서 얻어진 퍼센티지가, 1% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 40% 이하인, 공정(a)에 있어서의 개변을 선택하는 공정
을 포함하고,
공정(d)에 있어서 결정된 저감 퍼센티지가, 융합 단백질로부터의 VH 또는 VL의 유리에 기인하는 분자량의 저감 퍼센티지에 대응하는,
상기 방법.
[도 1] IL-12 융합 단백질의 기대되는 프로파일. 불활성 분자로서는, IL-12의 생물학적 활성이 저해되어 있어야 하고, IL-12 융합 단백질은, 긴 전신 반감기를 가져야 한다. 질환 특이적 프로테아제에 의한 절단에 의해, 활성화된 분자로서, IL-12 생물학적 활성이 복원된다. 더하여, 융합 단백질은, 질환 조직에 있어서 고농도로 보지(保持)되어야 하고, 또한 짧은 전신 반감기를 나타내야 한다.
[도 2] 도 2A는, 불활성 IL-12 융합 단백질의 약물동태에 대한 리간드 결합 도메인의 효과를 평가하기 위해서 이용한, 1가 IL-12 융합 단백질의 분자 형식을 나타낸다. 도 2B는, 종양을 갖지 않는 마우스에 있어서의 불활성 IL-12 융합 단백질의 약물동태를 나타낸다. 위의 그래프는, 종양을 갖지 않는 마우스(n=3)에 있어서의 단일 정맥내 용량 후의 1가 IL-12 유리 FP1(흑색 원), FP2(흑색 삼각), 및 FP3(X표)의 혈장 농도를 나타낸다. 아래의 표는, 각 융합 단백질의 약물동태 파라미터를 나타낸다. C0: 정맥내 주사의 직후의 후방 외삽된 농도, t1/2: 배출 반감기, AUCinf: 시간 제로로부터 무한대까지 외삽된 혈장 농도-시간 곡선하 면적, CL: 총 클리어런스, Vss: 정상 상태에서의 분포의 체적.
[도 3] IL-12 융합 단백질의 다양한 형식. 도 3A는, 절단 가능 링커가 VH 영역과 CH1 영역 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, IL-12 유리형 융합 단백질을 나타낸다. 단쇄 IL-12를, 절단 가능 링커를 개재시켜 Fc 도메인의 C말단에 부가했다. 절단 가능 링커의 소화는, 활성 IL-12의 유리를 결과로서 가져온다. 도 3B는, 절단 가능 링커가 VH 영역과 CH1 영역 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, IL-12 융합형 융합 단백질을 나타낸다. GS 링커를, 힌지 영역에 삽입하고, 단쇄 IL-12를, GS 링커를 개재시켜 Fc 도메인의 C말단에 부가했다. 절단 가능 링커의 소화는, Fc에 융합한 활성 IL-12의 유리를 결과로서 가져온다.
[도 4] 2가 IL-12 유리 FP4 및 2가 IL-12 융합 FP5를, IL-12 루시페라제 어세이에 제공했다. 개변체는 양쪽 모두, MT-SP1의 비존재하에서는 hIL-12_His 태그보다도 낮은 IL-12 생물 활성을 나타내고, IL-12 생물 활성은, MT-SP1 처리 시에 hIL-12_His 태그와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 5] 프로테아제 절단 시의 활성화된 IL-12 융합 단백질의 다양한 형식. (A) 유리 형식에 있어서, 자유롭게 해리된 IL-12 분자는, 대표적인 활성화된 분자, 즉 재조합 IL-12이다. (B) 융합 형식에 있어서, KLH 2가 융합 FP6은, 대표적인 활성화된 분자이다.
[도 6] 합계로 6회 반복된 종양내 주사 후의, 인간 T 세포를 주사한 LS1034 종양을 가지는 마우스 모델에 있어서의 재조합 IL-12 또는 KLH-2가 IL12 융합 FP6의 종양 용해물 및 종양 간질액 중의 IL-12 농도. 유리 형식 및 융합 형식의 활성화형을 비교하는 종양 보지 레벨은, 종양 용해물 및 간질액의 양쪽에 있어서 유리 형식보다도 융합 형식에 대해서, 보다 높은 보지 농도를 나타낸다.
[도 7] 필리핀원숭이에 있어서의 정맥내 투여 후의 혈장 KLH-2가 IL-12 융합 FP6 농도의 타임 코스. KLH-2가 IL-12 융합 FP6은, 급속히 배출되어, 클리어런스는 1975mL/일/kg이며, 이것은, 문헌에 있어서 보고된 6.23mL/시간/kg(150mL/일/kg)인 재조합 IL-12의 클리어런스(Pharmacology 2010;85:319-327)보다도 대략 13배 빠르다.
[도 8] (A) KLH 2가 융합 FP7의 타임 코스 해석은, SCID 마우스에 있어서 335ml/일/kg의 클리어런스를 나타냈다. (B) IL-12 융합 단백질의 불활성형 및 활성형의 타임 코스 해석. IL-12 융합 단백질의 불활성화형과 활성형의 사이에서, 클리어런스 레벨은 유사했다.
[도 9] (A) 활성화된 및 불활성화된 IL-12 융합 단백질이, 도 8에 있어서 유사한 클리어런스를 나타낸 바와 같이, 이 현상은, VH 도메인, VL 도메인, 및 IL-12 부분이 결합력을 나타낼 가능성이 있고, 또한 프로테아제 절단 후에 완전히 해리 되지 않았기 때문에, 잠재적으로 관찰되었을 가능성이 있다. (B) IL-12 융합 단백질의 불활성화형 및 활성화형의 활성은, 활성화형이, 프로테아제 소화 후에 IL-12 수용체에 결합할 수 있는 채로 있으며, 또한 (A)에 있어서 관찰된 평균 클리어런스와는 무관계하게, 재조합 IL-12와 동일한 정도까지 IL-12 시그널 전달을 활성화함을 나타낸다.
[도 10a] 융합 단백질로부터의 VH의 해리 퍼센티지를 평가하기 위한 Biacore 어세이의 모식적 표시. IL-12에 결합하는 항IL-12 항체에 대해 실시한 어세이의 표시.
[도 10b] 융합 단백질로부터의 VH의 해리 퍼센티지를 평가하기 위한 Biacore 어세이의 모식적 표시. 2가 IL-12 융합 단백질에 대해 실시한 어세이의 표시.
[도 11a] 항IL-12 항체로부터의 VH 해리를 촉진하기 위한 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝. 단일 아미노산 개변 및 VH 해리의 퍼센티지의 평가.
[도 11b] 항IL-12 항체로부터의 VH 해리를 촉진하기 위한 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝. 아미노산 개변의 조합 및 VH 해리의 퍼센티지의 평가.
[도 12a] 2가 IL-12 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하는 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝 및 평가.
[도 12b] 2가 IL-12 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하는 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝 및 평가.
[도 13] SCID 마우스에 있어서의 VH 유리 개변을 갖는 IL-12 융합 단백질의 혈장 농도의 타임 코스. VH/VL 경계면의 개변을 포함하는 것에 의해, IL-12 융합 단백질의 소화 산물로부터의 IL-12의 보다 큰 해리가 초래되고, 또한 VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-12 융합 단백질의 소화 산물과 비교하여, 보다 빠른 클리어런스가 초래되었다.
[도 14a] CXCL10 융합 단백질의 프로파일. 불활성 분자로서는, CXCL10의 생물학적 활성이 저해되어 있어야 하고, CXCL10 융합 단백질은, 긴 전신 반감기를 가져야 한다. 질환 특이적 프로테아제에 의한 절단에 의해, 활성화된 분자로서 CXCL10 생물학적 활성이 복원된다. 더하여, 융합 단백질은, 질환 조직에 있어서 고농도로 보지되어야 하고, 또한 짧은 전신 반감기를 나타내야 한다.
[도 14b] 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하기 위한 아미노산 개변의 평가.
[도 15] 2가 IL-22 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하는 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝 및 평가.
[도 16] MT-SP1 소화를 수반하는 및 수반하지 않는 KLH 2가 융합 FP7의 타임 코스 해석. MT-SP1에서의 소화는, 예상외로, KLH 2가 융합 FP7의 보다 느린 클리어런스를 가져왔다. 이것은, 활성화된 IL12 분자의 프로파일에 영향을 미칠 수 있었다.
[도 17] p40의 헤파린 결합 영역에 있어서의 프로테아제 내성 개변을 갖는 KLH 2가 융합 개변체를 이용한 MT-SP1 매개성 소화를 나타내는, SDS-PAGE 해석. 위의 패널은, 미소화의 샘플 및 MT-SP1과의 1시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다. 아래의 패널은, MT-SP1과의 4시간 인큐베이션 및 24시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다.
[도 18] p40의 헤파린 결합 영역에 있어서의 프로테아제 내성 개변을 갖는 KLH 2가 융합 개변체를 이용한 MT-SP1 매개성 소화를 나타내는, SDS-PAGE 해석. 위의 패널은, 미소화의 샘플 및 MT-SP1과의 1시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다. 아래의 패널은, MT-SP1과의 4시간 인큐베이션 및 24시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다.
[도 19] 프로테아제 내성 IL-12 개변체의 IL-12 활성을, 루시페라제 어세이를 이용하여 평가했다. 프로테아제 내성 IL-12 개변체는 모두, 프로테아제 처리에 관계없이 hIL12_His 태그에 유사한 활성을 나타냈다.
[도 20] SCID 마우스에 있어서의 KLH-2가 융합물로서의 프로테아제 내성 IL-12 개변체의 혈장 농도의 타임 코스. 프로테아제 내성 개변체는 모두, 대조(KLH-2가 IL12006v1)보다도 느린 배출을 나타냈다.
[도 21] 2가 IL-12 융합 단백질 FP8, FP11, 및 FP12를, IL-12 루시페라제 어세이에 제공했다. 3개의 융합 단백질은 모두, MT-SP1의 비존재하에서 hIL-12_His 태그보다도 낮은 IL-12 생물 활성을 나타내고, IL-12 생물 활성은, MT-SP1 처리 시에 hIL-12_His 태그와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 22a] VH-IL-22가 유리되는 융합 단백질 "FP14"로부터의 IL-22 유리의 모식도.
[도 22b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22b는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22c는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22d] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22d는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22e] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22e는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22f] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22f는, 플레이트 3의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23a] VL-IL-22가 유리되는 융합 단백질 "FP15"로부터의 IL-22 유리의 모식도.
[도 23b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23b는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23c는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23d] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23d는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23e] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23e는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24a] VH가 유리되는 융합 단백질 "FP16"으로부터의 IL-22 유리의 모식도.
[도 24b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24b는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24c는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24d] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24d는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24e] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24e는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 25a] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성 및 재조합 IL-22의 활성의 평가. VH/VL 경계면에 변이를 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 및 FP14에 대해 선택된 IL-22 융합 단백질 개변체의 IL-22 활성을, 참조 대조로서의 재조합 IL-22와 함께, uPA 프로테아제의 존재하 또는 비존재하에서 평가했다. IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, FP14에 대해 250pg/mL의 농도에서 설정했다. 각 융합 단백질에 대한 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 나타난 양의 IL-10을 유도하는 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다. 3개의 선택된 융합 단백질 개변체는 모두, uPA의 비존재하에서 재조합 인간 IL-22보다도 낮은 IL-22 생물 활성을 나타내고, IL-22 생물 활성은, uPA의 존재하에서 재조합 인간 IL-22와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 25b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성 및 재조합 IL-22의 활성의 평가. VH/VL 경계면에 변이를 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 및 FP15에 대해 선택된 IL-22 융합 단백질 개변체의 IL-22 활성을, 참조 대조로서의 재조합 IL-22와 함께, uPA 프로테아제의 존재하 또는 비존재하에서 평가했다. IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, FP15에 대해 400pg/mL의 농도에서 설정했다. 각 융합 단백질에 대한 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 나타난 양의 IL-10을 유도하는 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다. 3개의 선택된 융합 단백질 개변체는 모두, uPA의 비존재하에서 재조합 인간 IL-22보다도 낮은 IL-22 생물 활성을 나타내고, IL-22 생물 활성은, uPA의 존재하에서 재조합 인간 IL-22와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 25c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성 및 재조합 IL-22의 활성의 평가. VH/VL 경계면에 변이를 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 및 FP16에 대해 선택된 IL-22 융합 단백질 개변체의 IL-22 활성을, 참조 대조로서의 재조합 IL-22와 함께, uPA 프로테아제의 존재하 또는 비존재하에서 평가했다. IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, FP16에 대해 400pg/mL의 농도에서 설정했다. 각 융합 단백질에 대한 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 나타난 양의 IL-10을 유도하는 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다. 3개의 선택된 융합 단백질 개변체는 모두, uPA의 비존재하에서 재조합 인간 IL-22보다도 낮은 IL-22 생물 활성을 나타내고, IL-22 생물 활성은, uPA의 존재하에서 재조합 인간 IL-22와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 2] 도 2A는, 불활성 IL-12 융합 단백질의 약물동태에 대한 리간드 결합 도메인의 효과를 평가하기 위해서 이용한, 1가 IL-12 융합 단백질의 분자 형식을 나타낸다. 도 2B는, 종양을 갖지 않는 마우스에 있어서의 불활성 IL-12 융합 단백질의 약물동태를 나타낸다. 위의 그래프는, 종양을 갖지 않는 마우스(n=3)에 있어서의 단일 정맥내 용량 후의 1가 IL-12 유리 FP1(흑색 원), FP2(흑색 삼각), 및 FP3(X표)의 혈장 농도를 나타낸다. 아래의 표는, 각 융합 단백질의 약물동태 파라미터를 나타낸다. C0: 정맥내 주사의 직후의 후방 외삽된 농도, t1/2: 배출 반감기, AUCinf: 시간 제로로부터 무한대까지 외삽된 혈장 농도-시간 곡선하 면적, CL: 총 클리어런스, Vss: 정상 상태에서의 분포의 체적.
[도 3] IL-12 융합 단백질의 다양한 형식. 도 3A는, 절단 가능 링커가 VH 영역과 CH1 영역 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, IL-12 유리형 융합 단백질을 나타낸다. 단쇄 IL-12를, 절단 가능 링커를 개재시켜 Fc 도메인의 C말단에 부가했다. 절단 가능 링커의 소화는, 활성 IL-12의 유리를 결과로서 가져온다. 도 3B는, 절단 가능 링커가 VH 영역과 CH1 영역 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, IL-12 융합형 융합 단백질을 나타낸다. GS 링커를, 힌지 영역에 삽입하고, 단쇄 IL-12를, GS 링커를 개재시켜 Fc 도메인의 C말단에 부가했다. 절단 가능 링커의 소화는, Fc에 융합한 활성 IL-12의 유리를 결과로서 가져온다.
[도 4] 2가 IL-12 유리 FP4 및 2가 IL-12 융합 FP5를, IL-12 루시페라제 어세이에 제공했다. 개변체는 양쪽 모두, MT-SP1의 비존재하에서는 hIL-12_His 태그보다도 낮은 IL-12 생물 활성을 나타내고, IL-12 생물 활성은, MT-SP1 처리 시에 hIL-12_His 태그와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 5] 프로테아제 절단 시의 활성화된 IL-12 융합 단백질의 다양한 형식. (A) 유리 형식에 있어서, 자유롭게 해리된 IL-12 분자는, 대표적인 활성화된 분자, 즉 재조합 IL-12이다. (B) 융합 형식에 있어서, KLH 2가 융합 FP6은, 대표적인 활성화된 분자이다.
[도 6] 합계로 6회 반복된 종양내 주사 후의, 인간 T 세포를 주사한 LS1034 종양을 가지는 마우스 모델에 있어서의 재조합 IL-12 또는 KLH-2가 IL12 융합 FP6의 종양 용해물 및 종양 간질액 중의 IL-12 농도. 유리 형식 및 융합 형식의 활성화형을 비교하는 종양 보지 레벨은, 종양 용해물 및 간질액의 양쪽에 있어서 유리 형식보다도 융합 형식에 대해서, 보다 높은 보지 농도를 나타낸다.
[도 7] 필리핀원숭이에 있어서의 정맥내 투여 후의 혈장 KLH-2가 IL-12 융합 FP6 농도의 타임 코스. KLH-2가 IL-12 융합 FP6은, 급속히 배출되어, 클리어런스는 1975mL/일/kg이며, 이것은, 문헌에 있어서 보고된 6.23mL/시간/kg(150mL/일/kg)인 재조합 IL-12의 클리어런스(Pharmacology 2010;85:319-327)보다도 대략 13배 빠르다.
[도 8] (A) KLH 2가 융합 FP7의 타임 코스 해석은, SCID 마우스에 있어서 335ml/일/kg의 클리어런스를 나타냈다. (B) IL-12 융합 단백질의 불활성형 및 활성형의 타임 코스 해석. IL-12 융합 단백질의 불활성화형과 활성형의 사이에서, 클리어런스 레벨은 유사했다.
[도 9] (A) 활성화된 및 불활성화된 IL-12 융합 단백질이, 도 8에 있어서 유사한 클리어런스를 나타낸 바와 같이, 이 현상은, VH 도메인, VL 도메인, 및 IL-12 부분이 결합력을 나타낼 가능성이 있고, 또한 프로테아제 절단 후에 완전히 해리 되지 않았기 때문에, 잠재적으로 관찰되었을 가능성이 있다. (B) IL-12 융합 단백질의 불활성화형 및 활성화형의 활성은, 활성화형이, 프로테아제 소화 후에 IL-12 수용체에 결합할 수 있는 채로 있으며, 또한 (A)에 있어서 관찰된 평균 클리어런스와는 무관계하게, 재조합 IL-12와 동일한 정도까지 IL-12 시그널 전달을 활성화함을 나타낸다.
[도 10a] 융합 단백질로부터의 VH의 해리 퍼센티지를 평가하기 위한 Biacore 어세이의 모식적 표시. IL-12에 결합하는 항IL-12 항체에 대해 실시한 어세이의 표시.
[도 10b] 융합 단백질로부터의 VH의 해리 퍼센티지를 평가하기 위한 Biacore 어세이의 모식적 표시. 2가 IL-12 융합 단백질에 대해 실시한 어세이의 표시.
[도 11a] 항IL-12 항체로부터의 VH 해리를 촉진하기 위한 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝. 단일 아미노산 개변 및 VH 해리의 퍼센티지의 평가.
[도 11b] 항IL-12 항체로부터의 VH 해리를 촉진하기 위한 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝. 아미노산 개변의 조합 및 VH 해리의 퍼센티지의 평가.
[도 12a] 2가 IL-12 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하는 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝 및 평가.
[도 12b] 2가 IL-12 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하는 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝 및 평가.
[도 13] SCID 마우스에 있어서의 VH 유리 개변을 갖는 IL-12 융합 단백질의 혈장 농도의 타임 코스. VH/VL 경계면의 개변을 포함하는 것에 의해, IL-12 융합 단백질의 소화 산물로부터의 IL-12의 보다 큰 해리가 초래되고, 또한 VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-12 융합 단백질의 소화 산물과 비교하여, 보다 빠른 클리어런스가 초래되었다.
[도 14a] CXCL10 융합 단백질의 프로파일. 불활성 분자로서는, CXCL10의 생물학적 활성이 저해되어 있어야 하고, CXCL10 융합 단백질은, 긴 전신 반감기를 가져야 한다. 질환 특이적 프로테아제에 의한 절단에 의해, 활성화된 분자로서 CXCL10 생물학적 활성이 복원된다. 더하여, 융합 단백질은, 질환 조직에 있어서 고농도로 보지되어야 하고, 또한 짧은 전신 반감기를 나타내야 한다.
[도 14b] 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하기 위한 아미노산 개변의 평가.
[도 15] 2가 IL-22 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진하는 VH/VL 경계면에서의 아미노산 개변의 스크리닝 및 평가.
[도 16] MT-SP1 소화를 수반하는 및 수반하지 않는 KLH 2가 융합 FP7의 타임 코스 해석. MT-SP1에서의 소화는, 예상외로, KLH 2가 융합 FP7의 보다 느린 클리어런스를 가져왔다. 이것은, 활성화된 IL12 분자의 프로파일에 영향을 미칠 수 있었다.
[도 17] p40의 헤파린 결합 영역에 있어서의 프로테아제 내성 개변을 갖는 KLH 2가 융합 개변체를 이용한 MT-SP1 매개성 소화를 나타내는, SDS-PAGE 해석. 위의 패널은, 미소화의 샘플 및 MT-SP1과의 1시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다. 아래의 패널은, MT-SP1과의 4시간 인큐베이션 및 24시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다.
[도 18] p40의 헤파린 결합 영역에 있어서의 프로테아제 내성 개변을 갖는 KLH 2가 융합 개변체를 이용한 MT-SP1 매개성 소화를 나타내는, SDS-PAGE 해석. 위의 패널은, 미소화의 샘플 및 MT-SP1과의 1시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다. 아래의 패널은, MT-SP1과의 4시간 인큐베이션 및 24시간 인큐베이션으로 소화된 샘플을 나타낸다.
[도 19] 프로테아제 내성 IL-12 개변체의 IL-12 활성을, 루시페라제 어세이를 이용하여 평가했다. 프로테아제 내성 IL-12 개변체는 모두, 프로테아제 처리에 관계없이 hIL12_His 태그에 유사한 활성을 나타냈다.
[도 20] SCID 마우스에 있어서의 KLH-2가 융합물로서의 프로테아제 내성 IL-12 개변체의 혈장 농도의 타임 코스. 프로테아제 내성 개변체는 모두, 대조(KLH-2가 IL12006v1)보다도 느린 배출을 나타냈다.
[도 21] 2가 IL-12 융합 단백질 FP8, FP11, 및 FP12를, IL-12 루시페라제 어세이에 제공했다. 3개의 융합 단백질은 모두, MT-SP1의 비존재하에서 hIL-12_His 태그보다도 낮은 IL-12 생물 활성을 나타내고, IL-12 생물 활성은, MT-SP1 처리 시에 hIL-12_His 태그와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 22a] VH-IL-22가 유리되는 융합 단백질 "FP14"로부터의 IL-22 유리의 모식도.
[도 22b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22b는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22c는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22d] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22d는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22e] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22e는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 22f] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 3개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 22f는, 플레이트 3의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab4H/Ab4L FP14")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23a] VL-IL-22가 유리되는 융합 단백질 "FP15"로부터의 IL-22 유리의 모식도.
[도 23b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23b는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23c는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23d] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23d는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 23e] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 23e는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP15")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 200pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 200pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24a] VH가 유리되는 융합 단백질 "FP16"으로부터의 IL-22 유리의 모식도.
[도 24b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24b는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24c는, 플레이트 1의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24d] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24d는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 24e] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성의 평가. VH/VL 경계면에서의 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-22 활성을, IL-22에 응답하여 세포로부터 분비되는 IL-10의 농도를 이용하여 어세이했다. 합계로 2개의 어세이 플레이트를 어세이하고, 도 24e는, 플레이트 2의 평가 결과에 대응한다. 각 어세이 플레이트에 대해, VH/VL 경계면에 어떠한 개변도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질, 즉 대조 융합 단백질("Ab5H/Ab5L FP16")을, 참조로서 포함시켰다. IL-22 융합 단백질 사이에서 IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, 300pg/mL의 농도에서 설정했다. 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 300pg/mL IL-10을 유도하는 각 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다.
[도 25a] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성 및 재조합 IL-22의 활성의 평가. VH/VL 경계면에 변이를 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 및 FP14에 대해 선택된 IL-22 융합 단백질 개변체의 IL-22 활성을, 참조 대조로서의 재조합 IL-22와 함께, uPA 프로테아제의 존재하 또는 비존재하에서 평가했다. IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, FP14에 대해 250pg/mL의 농도에서 설정했다. 각 융합 단백질에 대한 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 나타난 양의 IL-10을 유도하는 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다. 3개의 선택된 융합 단백질 개변체는 모두, uPA의 비존재하에서 재조합 인간 IL-22보다도 낮은 IL-22 생물 활성을 나타내고, IL-22 생물 활성은, uPA의 존재하에서 재조합 인간 IL-22와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 25b] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성 및 재조합 IL-22의 활성의 평가. VH/VL 경계면에 변이를 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 및 FP15에 대해 선택된 IL-22 융합 단백질 개변체의 IL-22 활성을, 참조 대조로서의 재조합 IL-22와 함께, uPA 프로테아제의 존재하 또는 비존재하에서 평가했다. IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, FP15에 대해 400pg/mL의 농도에서 설정했다. 각 융합 단백질에 대한 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 나타난 양의 IL-10을 유도하는 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다. 3개의 선택된 융합 단백질 개변체는 모두, uPA의 비존재하에서 재조합 인간 IL-22보다도 낮은 IL-22 생물 활성을 나타내고, IL-22 생물 활성은, uPA의 존재하에서 재조합 인간 IL-22와 동일한 레벨까지 복원되었다.
[도 25c] 프로테아제 소화를 수반하는/수반하지 않는 IL-22 융합 단백질의 활성 및 재조합 IL-22의 활성의 평가. VH/VL 경계면에 변이를 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 및 FP16에 대해 선택된 IL-22 융합 단백질 개변체의 IL-22 활성을, 참조 대조로서의 재조합 IL-22와 함께, uPA 프로테아제의 존재하 또는 비존재하에서 평가했다. IL-22 활성을 비교하기 위해서, IL-10 응답 곡선의 내삽을, FP16에 대해 400pg/mL의 농도에서 설정했다. 각 융합 단백질에 대한 활성 윈도를, uPA 프로테아제를 수반하는 및 수반하지 않는, 나타난 양의 IL-10을 유도하는 IL-22 융합 단백질의 농도의 비로서 계산했다. 3개의 선택된 융합 단백질 개변체는 모두, uPA의 비존재하에서 재조합 인간 IL-22보다도 낮은 IL-22 생물 활성을 나타내고, IL-22 생물 활성은, uPA의 존재하에서 재조합 인간 IL-22와 동일한 레벨까지 복원되었다.
일반적인 기술
본 발명의 실시는, 특별히 나타내지 않는 한, 당 기술 분야의 기술 내에 있는, 분자 생물학(재조합 기술을 포함한다), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 종래의 기술을 이용한다. 그와 같은 기술은, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds 1987, 및 정기 갱신); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001) 등의 문헌에 있어서 충분히 설명되어 있다.
하기의 정의 및 상세한 설명은, 본 명세서에 나타나는 본 개시의 이해를 용이하게 하기 위해서 제공된다. 본 명세서에서 언급되는 모든 참고 문헌은, 참조에 의해 구체적으로 원용된다.
I. 정의
단백질/폴리펩타이드
본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "폴리펩타이드"는, 아마이드 결합(펩타이드 결합으로서도 알려짐)에 의해 직선적으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성되는 분자를 말한다. 용어 "폴리펩타이드"는 통상, 대략 4아미노산 이상의 길이를 갖는 펩타이드를 말하고, 특정 길이의 생성물을 가리키지 않는다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 용어는 또한, 폴리펩타이드의 단편도 포함한다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄를 가리키기 위해서 이용되는 임의의 다른 용어가, "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는, 이들 용어 중 어느 것 대신에, 또는 그것과 호환적으로 이용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 기지의 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해적 절단, 또는 천연에 존재하지 않는 아미노산에 의한 개변을 비한정적으로 포함하는, 폴리펩타이드의 발현 후 수식의 생성물도 가리키도록 의도된다. 폴리펩타이드는, 천연의 생물학적 공급원에서 유래할 수 있거나, 또는 재조합 기술에 의해 산생될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지 않는다. 폴리펩타이드는, 화학 합성을 포함하는 임의의 양식으로 생성되어도 된다. 본 명세서에 기재되는 바와 같은 폴리펩타이드는, 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산의 사이즈의 것이어도 된다. 폴리펩타이드는, 정의된 삼차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 그와 같은 구조를 갖지는 않는다. 정의된 삼차원 구조를 가지는 폴리펩타이드는, 폴딩되어 있다고 칭해지고, 정의된 삼차원 구조를 가지지 않고, 오히려 다수의 상이한 형태를 취할 수 있는 폴리펩타이드는, 언폴딩되어 있다고 칭해진다.
아미노산
본 명세서에 있어서, 아미노산은, 예를 들어, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, 또는 Val/V에 의해 표시되는 바와 같이, 1문자 코드 혹은 3문자 코드, 또는 그 양쪽에 의해 기재된다. 특정의 포지션에 위치하는 아미노산을 표현하기 위해서, 특정의 포지션을 나타내는 숫자를 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드와 조합하여 이용하는 표현을, 적절히 이용할 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역에 함유되는 아미노산인 아미노산 37V는, Kabat 넘버링에 의해 정의되는 포지션 37에 위치하는 Val을 나타낸다.
아미노산 개변
본 명세서에서 호환적으로 이용되는 용어 "아미노산 개변(modification)", "아미노산 개변(alteration)", 또는 "아미노산 변이(mutation)"는, 부위 특이적 변이 도입법(Kunkel et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) 또는 오버랩 신장 PCR 등의, 적절히 채용될 수 있는 당 기술 분야에서 공지된 방법에 의한, 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산의 개변을 말한다. 천연 아미노산 이외의 아미노산에 의해 아미노산을 치환하기 위한 개변 방법으로서 당 기술 분야에서 공지된 몇몇 방법도 또한, 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; 및 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들어, 종지 코돈인 UAG 코돈(앰버 코돈)에 상보적인 앰버 서프레서 tRNA에 결합한 천연에 존재하지 않는 아미노산을 갖는 tRNA 함유 무세포 번역계(Clover Direct(Protein Express))가 또한, 바람직하게 이용된다. 본 명세서에 있어서, 지정된 포지션에서의 아미노산 개변의 예에는, 지정된 잔기의 치환 혹은 결실, 또는 지정된 잔기에 인접한 적어도 1개의 아미노산 잔기의 삽입, 또는 그들의 치환, 결실, 및 삽입의 임의의 조합이 포함된다. 지정된 잔기에 "인접한" 삽입은, 그 1 내지 2잔기 이내의 삽입을 의미한다. 삽입은, 지정된 잔기에 대해서 N말단 또는 C말단일 수 있다. 본 명세서에서 바람직한 아미노산 개변은, 치환이다.
치환
"아미노산 치환"이란, 소정의 아미노산 서열 중의 적어도 1개의 기존의 아미노산 잔기의, 별도의 상이한 "치환" 아미노산 잔기로의 치환을 말한다. 1개 또는 복수의 치환 잔기는, "천연에 존재하는 아미노산 잔기"(즉, 유전 코드에 의해 코딩된다)여도 되고, 알라닌(Ala); 아르기닌(Arg); 아스파라긴(Asn); 아스파르트산(Asp); 시스테인(Cys); 글루타민(Gln); 글루탐산(Glu); 글리신(Gly); 히스티딘(His); 아이소류신(Ile); 류신(Leu); 리신(Lys); 메티오닌(Met); 페닐알라닌(Phe); 프롤린(Pro); 세린(Ser); 트레오닌(Thr); 트립토판(Trp); 티로신(Tyr); 및 발린(Val)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 치환 잔기는, 시스테인은 아니다. 1개 또는 복수의 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기에서의 치환도 또한, 본 명세서에 있어서의 아미노산 치환의 정의에 의해 포함된다. "천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기"란, 폴리펩타이드쇄에 있어서 인접한 아미노산 잔기에 공유 결합할 수 있는, 위에 열기한 천연에 존재하는 아미노산 잔기 이외의 잔기를 말한다. 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기의 예에는, 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 및 다른 아미노산 잔기 아날로그, 예를 들어 Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)에 기재되어 있는 것이 포함된다. 그와 같은 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 생성하기 위해서, Noren et al. Science 244:182 (1989) 및 상기의 Ellman et al.의 수순을 이용할 수 있다. 간결하게 설명하면, 이들 수순은, 서프레서 tRNA를 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화하는 것, 그것에 계속되는 RNA의 인비트로 전사 및 번역을 포함한다.
삽입
"아미노산 삽입"이란, 소정의 아미노산 서열 중에의 적어도 1개의 아미노산의 짜 넣기를 말한다. 삽입은 통상, 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어지지만, 본원은, 보다 큰 "펩타이드 삽입", 예를 들어, 약 3개 내지 약 5개, 또는 더욱이 최대로 약 10개의 아미노산 잔기의 삽입을 고려한다. 삽입되는 잔기는, 상기에서 개시되는 바와 같이, 천연에 존재해도 되고, 또는 천연에 존재하지 않아도 된다.
결실
"아미노산 결실"이란, 소정의 아미노산 서열로부터의 적어도 1개의 아미노산 잔기의 제거를 말한다.
아미노산 개변의 부위를 말하는 경우에 본 명세서에서 이용되는 용어 "및/또는"은, "및/또는"에 의해 적절히 표시되는 모든 조합을 포함한다. 구체적으로는, 예를 들어, 어구 "포지션 37, 45, 및/또는 47의 아미노산이 치환되어 있는"에는, 이하의 아미노산 개변의 배리에이션이 포함된다: (a) 포지션 37, (b) 포지션 45, (c) 포지션 47, (d) 포지션 37 및 45, (e) 포지션 37 및 47, (f) 포지션 45 및 47, 및 (g) 포지션 37, 45, 및 47.
본 명세서에 있어서, 개변 전 및 개변 후의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드가, 특정의 포지션을 나타내는 숫자의 앞 및 뒤에 이용되는 표현을, 아미노산 개변을 나타내기 위해서 적절히 이용할 수 있다. 예를 들어, 항체 가변 영역에 함유되는 아미노산을 치환하기 위해서 이용되는 개변 F37V 또는 Phe37Val은, Kabat 넘버링에 의해 정의되는 37위의 Phe의 Val에 의한 치환을 나타낸다. 구체적으로는, 숫자는, Kabat 넘버링에 의해 정의되는 아미노산 포지션을 나타내고; 숫자 앞의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는, 치환 전의 아미노산을 나타내고; 또한 숫자 뒤의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는, 치환 후의 아미노산을 나타낸다. 마찬가지로, 항체 정상 영역에 함유되는 Fc 영역 중의 아미노산을 치환하기 위해서 이용되는 개변 P238A 또는 Pro238Ala는, EU 넘버링에 의해 정의되는 238위의 Pro의 Ala에 의한 치환을 나타낸다. 구체적으로는, 숫자는, EU 넘버링에 의해 정의되는 아미노산 포지션을 나타내고; 숫자 앞의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는, 치환 전의 아미노산을 나타내고; 또한 숫자 뒤의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는, 치환 후의 아미노산을 나타낸다.
퍼센트(%) 아미노산 동일성
참조 폴리펩타이드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻도록 서열을 정렬시키고 또한 필요하면 갭을 도입한 후의, 또한, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부라고 생각하지 않는다고 했을 때의, 참조 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의, 백분율비로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적하는 얼라인먼트는, 당해 기술 분야에 있어서의 기술의 범위 내에 있는 여러 가지 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 등의, 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열의 얼라인먼트를 취하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그렇지만, 본 명세서에 있어서의 목적을 위해, 아미노산 서열의 동일성의 값(%)은, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성하고 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, 제넨테크사의 저작이며, 그 원시 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559)에 사용자용 서류와 함께 제출되어, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은, 제넨테크사(Genentech, Inc., South San Francisco, California)로부터 공적으로 입수 가능하고, 원시 코드로부터 컴파일해도 된다. ALIGN-2 프로그램은, Digital UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX operating system 상에서의 사용을 위해서 컴파일된다. 모든 서열 비교 파라미터는, ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변동하지 않는다. 아미노산 서열 비교에 ALIGN-2가 이용되는 상황에서는, 소여의 아미노산 서열 A의, 소여의 아미노산 서열 B에의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한 %아미노산 서열 동일성(혹은, 소여의 아미노산 서열 B에의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한, 어느 %아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소여의 아미노산 서열 A라고 할 수도 있다)은, 다음과 같이 계산된다: 분율 X/Y의 100배. 여기에서, X는 서열 얼라인먼트 프로그램 ALIGN-2에 의해, 당해 프로그램의 A 및 B의 얼라인먼트에 있어서 동일한 일치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 전수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에의 %아미노산 서열 동일성은, B의 A에의 %아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것이, 이해될 것이다. 별달리 특별히 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 %아미노산 서열 동일성치는, 직전의 단락에서 기술한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻어지는 것이다.
리간드 결합 부분/분자
몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, 리간드 결합 도메인을 추가로 포함하는, 리간드 결합 부분 또는 리간드 결합 분자를 포함하는 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "리간드 결합 부분" 또는 "리간드 결합 분자"는, 리간드에 결합할 수 있는 부분 또는 분자를 말하고, 특히, 부분 또는 분자가 미절단 상태에 있는 경우에 리간드에 결합하는, 부분 또는 분자를 말한다. 이 문맥에 있어서, "결합"이란 통상, 정전력, 반데르발스힘, 또는 수소 결합 등의 비공유 결합에 주로 기초하는 상호작용을 통한 결합을 말한다. 리간드 결합 부분 또는 분자의 결합 모드의 바람직한 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 항원 결합 도메인, 항원 결합 분자, 항체, 항체 단편 등이 그것을 통해 항원에 결합하는, 항원 항체 반응을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 리간드 결합 부분 또는 분자는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 항체 단편, 항체, 및 항체 단편으로부터 형성되는 분자(예를 들어, 다이아보디, 키메라 항원 수용체(CAR))를, 다중 특이성 결합 분자(예를 들어, 이중 특이성 다이아보디 및 이중 특이성 항체)를 포함시켜, 포함한다.
리간드 결합 도메인
본 명세서에서 이용되는 용어 "리간드 결합 도메인"은, 리간드 결합 부분/분자가 리간드에 결합하는 경우에 리간드의 일부분(에피토프)에만 결합하는, 리간드 결합 부분 또는 분자의 일부분을 말한다. 본 발명에 있어서, 리간드 결합 도메인은, 리간드 결합 부분/분자가 미절단 상태에 있는 경우에 도메인이 리간드에 결합한다고 하는 사실에 의해서만 한정되고, 리간드 결합 부분/분자가 미절단 상태에 있는 경우에 도메인이 목적하는 리간드에 결합할 수 있는 한, 임의의 구조를 가질 수 있다. 리간드 결합 도메인의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 항원 결합 도메인, 항체 중쇄 가변 영역(VH), 항체 경쇄 가변 영역(VL), 항체 Fv 영역, 싱글 도메인 항체(sdAb), 스캐폴드 펩타이드, 펩타이드 앱타머(Reverdatto S. et al., Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082-1101), IL-12 수용체, 인비보 세포막 단백질 아비머(avimer)에 함유되는 대략 35아미노산의 A 도메인으로 불리는 모듈(WO2004/044011 및 WO2005/040229), 세포막 상에 발현되는 당단백질 피브로넥틴에서 유래하는 단백질 결합 도메인으로서 작용하는 10Fn3 도메인을 함유하는 아드넥틴(adnectin)(WO2002/032925), 프로틴 A의 58 아미노산으로 구성되는 3헬릭스 번들을 구성하는 IgG 결합 도메인 스캐폴드를 함유하는 Affibody(WO1995/001937), 각각이 1개의 턴, 2개의 역평행 헬릭스, 및 1개의 루프의 서브유닛에 폴딩되는 33아미노산 잔기의 구조를 갖는, 안키린 리피트(AR)의 분자 표면 노출 영역인, DARPin(designed ankyrin repeat protein), 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL) 등의 리포칼린 분자에서 고도로 보존되어 있는 배럴 구조의 일단에 있어서, 중심축을 향해 구부러진 8개의 역평행쇄를 접속하는 4개의 루프 영역을 갖는 anticalin(WO2003/029462), 및, 칠성장어 또는 먹장어 등의 무악 척추동물의 획득 면역계에 있어서 보이는 바와 같은, 면역글로불린 구조를 갖지 않는 가변 림프구 수용체(VLR)의 반복된 류신 리치 리피트(LRR) 모듈로 구성되는 말발굽형 폴드의 내부 평행 시트 구조에 있어서의 함몰 영역(WO2008/016854)을 포함한다.
항원 결합 도메인
본 명세서에서 이용되는 용어 "항원 결합 도메인"은, 항원에 특이적으로 결합하거나, 또는 항원을 부분적으로 보완하는 영역을 말한다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 항원 결합 분자는, 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원의 분자량이 큰 경우에는, 항원 결합 도메인은, 항원의 특이적인 부분에만 결합할 수 있다. 그 특이적인 부분은, 에피토프로 불린다. 일 태양에 있어서, 항원 결합 도메인은, 특정의 항원에 결합하는 항체 단편을 포함한다. 항원 결합 도메인은, 1개 또는 복수의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 비한정적인 일 태양에 있어서, 항원 결합 도메인은, 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 그와 같은 항원 결합 도메인의 예에는, "scFv(단쇄 Fv)", "단쇄 항체(단쇄 항체)", "Fv", "scFv2(단쇄 Fv2)", "Fab", 또는 "F(ab')2" 등이 포함된다. 다른 태양에 있어서, 항원 결합 도메인은, 특정의 항원에 결합하는 비항체 단백질 또는 그 단편을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 항원 결합 도메인은 힌지 영역을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 항원은 리간드이다. 본 명세서에서 이용될 때에, 항원이 리간드인 경우, 용어 "항원 결합 도메인" 및 "리간드 결합 도메인"은, 항원으로서의 리간드에 특이적으로 또는 부분적으로 결합하는 영역을 말하기 위해서, 호환적으로 이용되어도 된다.
본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "동일한 에피토프에 결합하는"은, 2개의 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가, 적어도 부분적으로 오버랩하는 것을 의미한다. 오버랩의 정도는, 한정되지 않지만, 적어도 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 및 특히 바람직하게는 90% 이상이다. 가장 바람직하게는, 100%의 오버랩이다.
일 태양에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은, 항원, 예를 들어, 인터류킨-12(IL-12) 또는 IL-22에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함한다. 용어 "IL-12에 결합하는 융합 단백질", "IL-12에 결합하는 폴리펩타이드", 또는 "IL-12에 결합하는 항체" 혹은 "항IL-12" 항체는, 생물학적 분자를 포함하는 분자의 불균일한 집단의 존재하에서, 그 항원, 예를 들어 IL-12의 존재를 결정하는, 단백질 또는 항체와 IL-12 사이의 측정 가능한 동시에 재현 가능한 상호작용을 말한다. 동일한 것이 IL-22 등에 대해서도 적용된다. 융합 단백질 또는 항체는, 그 항원에, 다른 항원에 결합하는 것보다도, 보다 큰 어피니티, 결합력으로, 보다 용이하게, 및/또는 보다 긴 지속 시간으로 결합한다. 일 태양에 있어서, 융합 단백질 또는 항체의 무관련 항원에 대한 결합의 정도는, 예를 들어, 라디오이뮤노어세이(RIA)에 의해 측정되었을 경우에, 융합 단백질 또는 항체의 항원에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 특정의 태양에 있어서, 항원/표적에 특이적으로 결합하는 융합 단백질 또는 항체는, 1마이크로몰농도(μM) 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하, 또는 0.001nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9M 내지 10-13M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정의 태양에 있어서, 융합 단백질 또는 항체는, 상이한 종 유래의 단백질 사이에서 보존되어 있는 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 태양에 있어서, 특이적 결합은, 배타적 결합을 포함할 수 있지만, 그것을 필요로 하지는 않는다.
리간드/항원
본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "리간드"(혹은 "리간드 부분"이라고 불려도 된다) 및 "항원"은, 호환적으로 이용되어도 되고, 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프를 함유하는 것에 의해서만 한정된다. 용어 "리간드" 및 "항원"은, 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인이 특이적으로 결합할 수 있는 모든 분자를 말한다. 리간드/항원의 바람직한 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 동물 또는 인간 유래의 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질을 포함한다. 표적 조직에 의해 야기되는 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한 리간드/항원의 바람직한 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 표적 세포(예를 들어, 암 세포 및 염증성 세포)의 표면 상에 발현되는 분자, 표적 세포를 함유하는 조직에 있어서의 다른 세포의 표면 상에 발현되는 분자, 표적 세포 및 표적 세포를 함유하는 조직에 대해서 면역학적 역할을 갖는 세포의 표면 상에 발현되는 분자, 표적 세포를 함유하는 조직의 간질 중에 존재하는 거대 분자, 가용성 분자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 폴리펩타이드 호르몬, 증식 인자, 아포토시스 유도 인자, PAMPs, DAMPs, 핵산, 및 그들의 단편, 또는 면역 조절 프로세스 및 염증성 프로세스에 관여하는 다른 분자를 포함한다. 리간드 또는 항원의 예에는, 인터류킨, 인터페론, 조혈 인자, TNF 슈퍼패밀리의 멤버, 케모카인, 세포 증식 인자, TGF-β패밀리의 멤버, 마이오카인, 아디포카인, 또는 신경 영양 인자가 포함된다. 보다 구체적으로는, 예에는, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIG, I-TAC, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1R1(인터류킨-1 수용체, I형), IL-1R2(인터류킨-1 수용체, II형), IL-1RAcP(인터류킨-1 수용체 액세서리 단백질), 또는 IL-1Ra(단백질 액세션 번호 NP_776214, mRNA 액세션 번호 NM_173842.2)가 포함된다.
특이성
본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "특이성"은, 특이적으로 결합하는 분자 중 하나가, 그 1개 또는 복수의 결합 파트너 분자 이외의 분자에 실질적으로 결합하지 않는 특성을 말한다. 이 용어는 또한, 항원 결합 도메인이, 특정의 항원에 함유되는 에피토프에 대해서 특이성을 갖는 경우에도 이용된다. 용어는 또한, 항원 결합 도메인이, 항원에 함유되는 복수의 에피토프 중의 특정의 에피토프에 대해서 특이성을 갖는 경우에도 이용된다. 이 문맥에 있어서, 용어 "실질적으로 결합하지 않는"은, 결합 활성에 관한 섹션에 기재되는 방법에 따라 결정되고, 결합 파트너 이외의 분자에 대한 특이적 결합 분자의 결합 활성이, 결합 파트너 분자에 대한 그 결합 활성의 80% 이하, 통상은 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하인 것을 의미한다.
어피니티
본 명세서에서 이용되는 용어 "어피니티"는, 분자(예를 들어, 리간드 결합 분자, 리간드, 항원 결합 분자, 또는 항체)의 단일한 결합 부위와, 그 결합 파트너(예를 들어, 리간드, 리간드 수용체, 또는 항원) 사이의, 비공유 결합적인 상호작용의 합계의 강도를 말한다. 특별히 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 "결합 어피니티"는, 어느 결합 쌍의 멤버(예를 들어, 리간드 결합 분자와 리간드, 리간드와 리간드 수용체, 항원 결합 분자와 항원, 또는 항체와 항원) 사이의 1:1의 상호작용을 반영하는, 고유의 결합 어피니티를 말한다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 어피니티는, 일반적으로, 해리 속도 상수 및 결합 속도 상수(각각, Koff 및 Kon)의 비인, 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 어피니티는, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는, 당 기술 분야에서 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 결합 어피니티를 측정하기 위한 구체적인 실례가 되는 및 예시적인 태양은, 이하에 기재된다.
항체 및 항체 단편
일 태양에 있어서, 본원 특허청구범위에 기재된 융합 단백질의 리간드 결합 부분은, 항체를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 경우, 용어 "항체"는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 소망의 항원 결합 활성을 나타내는 한은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는, 여러 가지 항체 구조를 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "항체 단편"은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 말한다. 항체 단편의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및, 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
전장 항체/천연 항체
용어 "전장 항체", "완전 항체", 및 "전부 항체"는, 본 명세서에서는 서로 교환 가능하게 이용되고, 천연형 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는, 또는 본 명세서에서 정의하는 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 말한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "천연형 항체"는, 천연에 존재하는 다양한 구조를 수반하는 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 천연형 IgG 항체는, 다이설파이드 결합하고 있는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000돌턴의 헤테로사량체 당단백질이다. N말단으로부터 C말단을 향해, 각 중쇄는, 가변 중쇄 도메인 혹은 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 항체 중쇄 가변 영역(VH)이라고도 불리는 가변 영역(VH)을 갖고, 추가로 3개의 정상 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 계속된다. 마찬가지로, N말단으로부터 C말단을 향해, 각 경쇄는, 가변 경쇄 도메인(VL) 혹은 경쇄 가변 도메인(VL), 또는 항체 경쇄 가변 도메인(VH), 또는 항체 경쇄 가변 영역(VH)이라고도 불리는 가변 영역(VL)을 갖고, 추가로 정상 경쇄(CL) 도메인이 계속된다. 항체의 경쇄는, 그 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2개의 타입 중 하나에 할당되어 있어도 된다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "CL" 또는 "CL 영역" 또는 "CL 도메인"은, 호환적으로 이용되며, 동일한 것이, 다른 도메인인 "VH", "VL", "CH1", "CH2", 및 "CH3"에, 이들 용어의 각각이 언급에 있어서 "영역" 또는 "도메인"과 페어가 되는 경우에 적용 가능하다.
모노클로날 항체
본 명세서에서 말하는 용어 "모노클로날 항체"는, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 말한다. 즉, 그 집단을 구성하는 개개의 항체는, 생길 수 있는 변이 항체(예를 들어, 자연스럽게 생기는 변이를 포함하는 변이 항체, 또는 모노클로날 항체 조제물의 제조 중에 발생하는 변이 항체. 그와 같은 변이체는 통상 약간량 존재하고 있다.)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과는 대조적으로, 모노클로날 항체 조제물의 각 모노클로날 항체는, 항원 상의 단일한 결정기에 대한 것이다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 것이라고 하는 항체의 특징을 나타내고, 어떠한 특정의 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 이용되는 모노클로날 항체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 하이브리도마법, 재조합 DNA법, 파지 디스플레이법, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하는, 다양한 수법에 의해 작성되어도 되고, 모노클로날 항체를 제작하기 위한 그와 같은 방법 및 다른 예시적인 방법은, 본 명세서에 기재되어 있다.
키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체
본 명세서에서 이용되는 용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지의 부분이 다른 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 말한다.
"인간화" 항체는, 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는, 키메라 항체를 말한다. 어느 태양에서는, 인간화 항체는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 당해 가변 영역에 있어서는, 모든 혹은 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)은 비인간 항체의 것에 대응하고, 또한, 모든 혹은 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 항체에서 유래하는 항체 정상 영역의 적어도 일부분을 포함해도 된다. 항체(예를 들어, 비인간 항체)의 "인간화된 형태"는, 인간화를 거친 항체를 말한다.
"인간 항체"는, 인간 혹은 인간 세포에 의해 산생된 항체 또는 인간 항체 레퍼토리 혹은 다른 인간 항체 코드 서열을 이용하는 비인간 공급원에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 구비하는 항체이다. 이 인간 항체의 정의는, 비인간의 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를, 명확하게 제외하는 것이다.
인간 컨센서스 프레임워크
"인간 컨센서스 프레임워크"는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택군에 있어서 가장 공통되게 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 통상, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은, 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 통상, 서열의 서브그룹은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 있어서의 서브그룹이다. 일 태양에 있어서, VL에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 κI이다. 일 태양에 있어서, VH에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 III이다.
억셉터 인간 프레임워크
본 명세서의 취지에서의 "억셉터 인간 프레임워크"는, 아래에서 정의하는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 유래하는, 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는, 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 "유래하는" 억셉터 인간 프레임워크는, 그들의 동일한 아미노산 서열을 포함해도 되고, 또는 아미노산 서열의 변경을 포함하고 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 아미노산의 변경의 수는, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 몇몇 태양에 있어서, VL 억셉터 인간 프레임워크는, VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
어피니티 성숙 항체
본 명세서에서 이용되는 용어 "어피니티 성숙" 항체는, 개변을 구비하지 않은 친항체와 비교하여, 1개 또는 복수의 초가변 영역(hypervariable region: HVR) 중에 항체의 항원에 대한 어피니티의 개선을 가져오는 1개 또는 복수의 개변을 수반하는, 항체를 말한다.
항체 클래스
항체의 "클래스"는, 항체의 중쇄에 구비되는 정상 도메인 또는 정상 영역의 타입을 말한다. 항체에는 5개의 주요한 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. 그리고, 이 중 몇몇은 추가로 서브클래스(아이소타입)로 나눠져도 된다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 정상 도메인을, 각각, α, δ, ε, γ, 및 μ라고 부른다.
IgG 항체양 폴리펩타이드
본 명세서에서 이용되는 용어 "IgG 항체양 폴리펩타이드" 또는 "IgG 항체양 분자"는, IgG 항체 중과 같은 정상 도메인 또는 정상 영역과 구조가 실질적으로 유사한 부분, 및 IgG 항체 중과 같은 가변 도메인 또는 가변 영역과 구조가 실질적으로 유사한 부분을 갖고, 또한 IgG 항체의 컨포메이션(conformation)과 실질적으로 유사한 컨포메이션을 갖는, 폴리펩타이드를 정의하기 위해서 이용된다. IgG 항체양 분자에 있어서, 항체 CH1과 유사한 도메인 및 CL과 유사한 도메인은, 호환적으로 이용되어도 된다; 즉, IgG 항체의 CH1와 CL 사이의 상호작용과 유사한 상호작용이, 도메인 사이에 존재하는 한, 항체 힌지 영역과 유사한 부분에 연결된 도메인은, 항체 CH1 도메인 또는 항체 CL 도메인이어도 된다. 그러나, 본 명세서에 있어서, "IgG 항체양 분자"는, IgG 항체의 구조과 유사한 구조를 유지하면서, 항원 결합 활성을 발휘해도 되고, 또는 발휘하지 않아도 된다. 본 명세서에서 이용되는, 용어 "프로테아제 절단 사이트를 포함하는 전장 IgG 항체", 또는 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 전장 IgG 항체가 본 명세서에 있어서 언급되는 경우, 그와 같은 용어 또는 어구는, 그것이 본 융합 단백질의 타당한 기능에 대해 목적을 달성하는 한, 전술한 "IgG 항체양 폴리펩타이드" 또는 "IgG 항체양 분자"를 말하기 위해서, 호환적으로 이용된다.
실질적으로 유사한
본 명세서에서 이용되는 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은, 2개의 수치 사이(예를 들어, 본 발명의 항체에 관한 것과, 참조/비교용 항체에 관한 것 사이)의 유사성이, 당업자가 그들 2개의 수치 사이의 차가 해당 수치(예를 들어, Kd치)에 의해 측정되는 생물학적 특징의 관점에서 거의 또는 전혀 생물학적 및/또는 통계학적으로 유의성이 없다고 간주할 정도로, 충분히 높은 것을 말한다.
정상 영역 및 Fc 영역
본 명세서에서 이용되는 용어 "정상 영역" 또는 "정상 도메인"은, 항체에 있어서의 가변 영역 이외의 영역 또는 도메인을 말한다. 예를 들어, IgG 항체는, 다이설파이드 결합을 통해 접속된 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄에 의해 구성되는, 대략 150,000Da의 헤테로사량체 당단백질이다. 각 중쇄는, N말단으로부터 C말단을 향해, 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)을 갖고, 추가로 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 함유하는 중쇄 정상 영역(CH)이 계속된다. 마찬가지로, 각 경쇄는, N말단으로부터 C말단을 향해, 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)을 갖고, 추가로 정상 경쇄(CL) 도메인이 계속된다. 자연 항체의 경쇄는, 그 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2개의 타입 중 하나에 귀속되어도 된다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "CH1", "CH1 도메인", "CH1 영역"은, 호환적으로 이용된다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "CL", "CL 도메인", "CL 영역"은, 호환적으로 이용된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "Fc 영역"은, 적어도 정상 영역의 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C말단 영역을 정의하기 위해서 이용된다. 이 용어는, 천연형 서열의 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 태양에 있어서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실 말단까지 연장된다. 단, Fc 영역의 C말단의 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(Gly446-Lys447)은, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 된다. 본 명세서에서는 특별히 특정하지 않는 한, Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호 붙이기는, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 에 기재된, EU 넘버링 시스템(EU 인덱스라고도 불린다)에 따른다.
변이 Fc 영역
"변이 Fc 영역"은, 적어도 1개의 아미노산 수식, 바람직하게는 1개 또는 복수의 아미노산 치환에 의해 천연형 서열 Fc 영역의 그것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이 Fc 영역은, 천연형 서열 Fc 영역 또는 친(親)폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여, 천연형 서열 Fc 영역 중 또는 친폴리펩타이드의 Fc 영역 중에 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서의 변이 Fc 영역은, 바람직하게는, 천연형 서열 Fc 영역 및/또는 친폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 그들과 적어도 약 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 그들과 적어도 약 95%의 상동성을 구비한다.
변이 정상 영역
"변이 정상 영역"은, 적어도 1개의 아미노산 수식, 바람직하게는 1개 또는 복수의 아미노산 치환에 의해 천연형 서열 정상 영역의 그것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이 정상 영역은, 천연형 서열 정상 영역 또는 친폴리펩타이드의 정상 영역과 비교하여, 천연형 서열 정상 영역 중 또는 친폴리펩타이드의 정상 영역 중에 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서의 변이 정상 영역은, 바람직하게는, 천연형 서열 정상 영역 및/또는 친폴리펩타이드의 정상 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 그들과 적어도 약 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 그들과 적어도 약 95%의 상동성을 구비한다.
Fc 수용체
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 말한다. 몇몇 태양에 있어서, FcR은, 천연형 인간 FcR이다. 몇몇 태양에 있어서, FcR은, IgG 항체에 결합하는 것(감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를, 이들 수용체의 대립 유전자 변이체 및 선택적 스플라이싱에 의한 형태를 포함시켜, 포함한다. FcγRII 수용체는, FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그 세포질 도메인에 있어서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는, 그 세포질 도메인에 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는, 그 세포질 도메인에 면역 수용체 티로신 저해 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)를 포함한다. (예를 들어, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)를 참조.) FcR은, 예를 들어, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)에 있어서 총설되어 있다. 장래 동정되는 것을 포함하는 다른 FcR도, 본 명세서의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한, 모체의 IgG의 태아에의 이동(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성의 조절을 담당하는, 신생아형 수용체 FcRn은 포함한다. FcRn에의 결합을 측정하는 방법은 공지이다(예를 들어, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)를 참조할 것).
인비보에서의 인간 FcRn에의 결합 및 인간 FcRn 고어피니티 결합 폴리펩타이드의 혈장 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn은 발현하는 트랜스제닉 마우스 혹은 트랜스펙트된 인간 세포주에 있어서 또는 변이 Fc 영역을 수반하는 폴리펩타이드가 투여되는 영장류에 있어서 측정될 수 있다. WO2000/42072(Presta)는, FcR에 대한 결합이 증가한 또는 감소한 항체 변이체를 기재하고 있다. 예를 들어, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)도 참조할 것.
Fc 영역 함유 항체
용어 "Fc 영역 함유 항체"는, Fc 영역을 포함하는 항체를 말한다. Fc 영역의 C말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따르면 잔기 447) 또는 Fc 영역의 C말단 글리신-리신(잔기446-447)은, 예를 들어 항체의 정제 사이에 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은, G446-K447을 수반하는 항체, G446을 수반하고 K447을 수반하지 않는 항체, G446-K447이 완전히 제거된 항체, 또는 상기 3개의 타입의 항체의 혼합물을 포함할 수 있다.
기능성 Fc 영역
"기능성 Fc 영역"은, 천연형 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 구비한다. 예시적인 "이펙터 기능"은, C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 탐식 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; B cell receptor: BCR)의 하방 제어 등을 포함한다. 그와 같은 이펙터 기능은 일반적으로, Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 하고, 그리고, 예를 들어 본 명세서의 정의 중에서 개시되는 다양한 측정법을 이용하여 평가될 수 있다.
인간 이펙터 세포
"인간 이펙터 세포"는, 1개 또는 복수의 FcR을 발현하여, 이펙터 기능을 발휘하는 백혈구를 말한다. 특정의 태양에 있어서, 이 세포는, 적어도 FcγRIII을 발현하여, ADCC 이펙터 기능을 발휘한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는, 말초혈 단핵구(peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 내추럴 킬러(NK) 세포, 단구, 세포상해성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는, 천연의 공급원으로부터, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
항체 의존성 세포 개재성 세포상해
"항체 의존성 세포 개재성 세포상해" 또는 "ADCC"는, 분비된 Ig가 특정의 세포상해성 세포(예를 들어, NK 세포, 호중구 및 매크로파지) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합하고 그에 의해 이들 세포상해성 이펙터 세포가 항원을 갖는 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있고 그리고 그 후에 그 표적 세포를 세포독에 의해 살상할 수 있게 되는, 세포상해의 한 형태를 말한다. ADCC를 매개하는 프라이머리 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR의 발현은, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 제464페이지의 표 3에 정리되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 인비트로 ADCC 측정법, 예를 들어 미국 특허 제 5,500,362호 혹은 제5,821,337호 또는 미국 특허 제6,737,056호(Presta)에 기재된 것이 실시될 수 있다. 그와 같은 측정법에 유용한 이펙터 세포는, PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 혹은 또는 더하여, 목적하는 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어 Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)에 개시되는 동물 모델과 같은 동물 모델에 있어서, 인비보로 평가되어도 된다.
보체 의존성 세포상해
"보체 의존성 세포상해" 또는 "CDC"는, 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 말한다. 고전적 보체 경로의 활성화는, (적절한 서브클래스의) 항체(대응하는 항원에 결합하고 있다)에의 보체계의 제1 요소(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)에 기재된 CDC 측정법이 실시될 수 있다. 개변된 Fc 영역 아미노산 서열을 수반하는 폴리펩타이드 변이체(변이 Fc 영역을 수반하는 폴리펩타이드) 및 증가 또는 감소한 C1q 결합능은, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호 B1 및 WO1999/51642에 기재되어 있다. 예를 들어, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)도 참조할 것.
가변 영역
본 명세서에서 이용되는 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은, 항체를 항원으로 결합시키는 것에 관여하는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연형 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은, 통상, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는, 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조.) 1개의 VH 또는 VL 도메인으로, 항원 결합 특이성을 주는 데 충분할 것이다. 더욱이, 어느 특정의 항원에 결합하는 항체는, 당해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 VL 또는 VH 도메인의 상보적 라이브러리를 스크리닝하여, 단리되어도 된다. 예를 들어 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조. 본 명세서에서 이용하는 경우, "중쇄 가변 도메인(VH)"은, "항체 중쇄 가변 도메인(VH)" 또는 "항체 중쇄 가변 영역(VH)" 또는 "VH" 또는 "항체 VH" 또는 "VH 도메인"과 호환적으로 이용되고, "경쇄 가변 도메인(VL)"은, "항체 경쇄 가변 도메인(VH)" 또는 "항체 경쇄 가변 영역(VL)" 또는 "VL" 또는 "항체 VL" 또는 "VL 도메인"과 호환적으로 이용된다.
HVR 또는 CDR
본 명세서에서 이용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열에 있어서 초가변이고("상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(complementarity determining region)), 및/또는 구조적으로 정해진 루프("초가변 루프")를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기("항원 접촉")를 포함하는, 항체의 가변 도메인의 각 영역을 말한다. 통상, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)이다. 본 명세서에서의 예시적인 HVR은, 이하의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 생기는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 생기는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에서 생기는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및,
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
특별히 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는, 본 명세서에서는 상기의 Kabat 등에 따라 번호 붙이기 된다.
프레임워크
본 명세서에서 이용되는 용어 "프레임워크" 또는 "FR"은, 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의, 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은, 통상 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 그것에 따라서, HVR 및 FR의 서열은, 통상 다음의 순서로 VH(또는 VL)에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
단리된 항체
"단리된" 항체는, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 몇몇 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 분리법(isoelectric focusing: IEF), 캐필러리 전기영동) 또는 크로마토그래프(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)로 측정하여, 95% 또는 99%를 초과하는 순도까지 정제된다. 항체의 순도의 평가를 위한 방법의 총설로서, 예를 들어, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조할 것.
단리된 핵산
"단리된" 핵산은, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 그 핵산 분자를 통상 포함하는 세포 중에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 그 핵산 분자는 염색체 외에 존재하고 있거나 또는 본래의 염색체 상의 위치와는 상이한 염색체 상의 위치에 존재하고 있다.
"항IL-12 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은, 항체의 중쇄 및 경쇄(또는 그 단편)를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산 분자를 말하고, 1개의 벡터 또는 다른 벡터를 타고 있는 핵산 분자, 및, 숙주 세포 중의 1개 또는 복수의 위치에 존재하고 있는 핵산 분자를 포함한다. 동일한 것이 항IL-22 항체 등에 대해서도 적용된다.
"IL-12에 결합하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산"은, 식 I의 폴리펩타이드(또는 그 단편)를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산 분자를 말하고, 1개의 벡터 또는 다른 벡터 중의 핵산 분자, 및, 숙주 세포 중의 1개 또는 복수의 위치에 존재하고 있는 핵산 분자를 포함한다. 동일한 것이 IL-22 등에 대해서도 적용된다.
벡터 및 숙주 세포
본 명세서에서 이용되는 용어 "벡터"는, 그것이 연결된 또 1개의 핵산을 늘릴 수 있는, 핵산 분자를 말한다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜 넣어지는 벡터를 포함한다. 어느 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의, 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 명세서에서는 "발현 벡터"라고도 칭해진다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은, 서로 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 세포(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)를 말한다. 숙주 세포는 "형질 전환체" 및 "형질 전환 세포"를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 상관없이 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전히 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되었을 때 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 명세서에서는 포함된다.
개체/피험체
"개체" 또는 "피험체"는 포유동물이다. 포유동물은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 사육 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 말), 영장류(예를 들어, 인간, 및 원숭이 등의 비인간 영장류), 토끼, 및, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정의 태양에서는, 개체 또는 피험체는, 인간이다.
약학적 제제
용어 "약학적 제제"는, 그 중에 포함된 유효 성분의 생물학적 활성이 효과를 발휘할 수 있는 형태에 있는 조제물이며, 또한 제제가 투여되는 피험체에 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가의 요소를 포함하지 않는, 조제물을 말한다. "약학적 제제"는, 대체적으로 "의약 조성물"이라고 불러도 된다.
약학적으로 허용되는 담체
"약학적으로 허용되는 담체"는, 피험체에 대해서 무독인, 약학적 제제/조성물 중의 유효 성분 이외의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
유효량
어느 제(예를 들어, 약학적 제제)의 "유효량"은, 소망의 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해서 유효한, 필요한 용량에 있어서의 및 필요한 기간에 걸쳐서의, 양을 말한다.
첨부 문서
용어 "첨부 문서"는, 치료용품의 상용 패키지에 통상 포함되고, 그와 같은 치료용품의 사용에 관한, 적응증, 용법, 용량, 투여 방법, 병용 요법, 금기, 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 사용 설명서를 말하기 위해서 이용된다.
치료
본 명세서에서 이용되는 "치료"(및, 그 문법상의 파생어, 예를 들어 "치료하는", "치료하는 것" 등)는, 치료되는 개체의 자연 경과를 개변하는 것을 의도한 임상적 개입을 의미하고, 예방을 위해서도, 임상적 병태의 경과 동안에도 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환에 의한 임의의 직접적 또는 간접적인 병리적 영향의 감약, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 저감, 질환 상태의 회복 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 질환의 발증을 늦추거나, 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해서 이용된다.
암
본 명세서에서 이용되는 용어 "암" 및 "암성"은, 조절되지 않는 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특징지어지는 포유동물에 있어서의 생리학적 상태를 말하는 또는 설명하는 것이다. 암의 예는, 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비호지킨 림프종), 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 그와 같은 암의 보다 상세한 예는, 편평 상피 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평 상피암, 복막의 암, 간세포암, 소화관암, 췌암, 신경교종, 자궁경암, 난소암, 간암, 방광암, 헤파토마, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁 내막 또는 자궁 암종, 타액선암, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구 증식성 장애, 및 다양한 타입의 두경부암을 포함한다.
세포 증식성 장애
본 명세서에서 이용되는 용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는, 일정 정도의 이상한 세포 증식에 관련하는 장애를 말한다. 일 태양에 있어서, 세포 증식성 장애는, 암이다.
B 세포 신생물/호지킨병
"B 세포 신생물"은, 림프구 우위형 호지킨병(lymphocyte predominant Hodgkin's disease: LPHD)을 포함하는 호지킨병; 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 노포 중심 세포(follicular center cell: FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL); 및 헤어리 세포 백혈병을 포함한다. 비호지킨 림프종은, 저악성도/노포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(small lymphocytic: SL) NHL, 중악성도/노포성 NHL, 중악성도 미만성 NHL, 고악성도 면역아구성 NHL, 고악성도 림프아구성 NHL, 고악성도 소형 비개렬 세포성 NHL, 거대 병변 NHL, 형질 세포양 림프구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, AIDS 관련 림프종, 및 발덴스트롬스 매크로글로불린혈증을 포함한다. 이들 암의 재발의 치료도 또한 고려 내에 있다. LPHD는, 방사선 또는 화학요법 처치를 실시해도 고빈도로 재발하는 경향이 있는 타입의 호지킨병이다. CLL은, 4대 백혈병의 타입 중 하나이다. 림프구로 불리는 성숙 B 세포의 암인 CLL은, 혈액, 골수, 및 림프 조직에 있어서의 세포의 진행성 축적에 의해 발증한다. 완만성 림프종은, 평균적인 환자가 다수의 관해 및 재발의 기간 후에 6 내지 10년 생존하는, 천천히 성장하는 불치의 질환이다.
유방 종양
용어 "유방 종양" 또는 "유방암"은, 예를 들어, 침습성 또는 비침윤성 유관암, 침습성 또는 비침윤성 소엽암, 수질암, 점액암, 및 유두암 등의 선암; 및, 엽상낭 육종, 육종, 편평 상피 세포암 및 암 육종 등의 보다 일반적이지 않은 형태를 포함하는, 유방의 임의의 종양 또는 암을 말한다.
결장 종양
용어 "결장 종양" 또는 "결장암"은, 결장(맹장으로부터 직장까지의 대장)의 임의의 종양 또는 암을 말한다.
결장직장 종양
용어 "결장직장 종양" 또는 "결장직장암"은, 예를 들어 선암, 및, 림프종 및 편평 상피 세포암 등의 보다 일반적이지 않은 형태를 포함하는, 결장(맹장으로부터 직장까지의 대장) 및 직장을 포함하는 대장의 임의의 종양 또는 암을 말한다.
비호지킨 림프종
본 명세서에서 이용되는 용어 "비호지킨 림프종" 또는 "NHL" (non-Hodkin's lymphoma)은, 호지킨 림프종 이외의 림프계의 암을 말한다. 호지킨 림프종은, 일반적으로, 호지킨 림프종에 있어서의 리드-스턴버그(Reed-Sternberg) 세포의 존재 및 비호지킨 림프종에 있어서의 동 세포의 비존재에 의해, 비호지킨 림프종과 구별할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 이 용어에 포함되는 비호지킨 림프종의 예는, Color Atlas of Clinical Hematology, Third Edition; A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.)(Harcourt Publishers Limited 2000)(특히 Fig. 11.57, 11.58 및/또는 11.59를 참조할 것)에 기재되는 Revised European-American Lymphoma(REAL) 스킴 등의 당 기술 분야에서 공지된 분류 스킴에 따라 당업자(예를 들어, 종양 학자 또는 병리학자)에 의해 그와 같이 식별되는 임의의 것을 포함한다. 보다 구체적인 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 재발성 또는 난치성 NHL, 초발성 저악성도 NHL, 스테이지 III/IV NHL, 화학요법 내성 NHL, 전구 B 림프아구성 백혈병 및/또는 림프종, 소림프구성 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 전림프구성 백혈병 및/또는 소림프구성 림프종, B 세포 전림프구성 림프종, 면역세포종 및/또는 림프형질세포성 림프종, 변연대 B 세포 림프종, 비변연대 림프종, 절외성 변연대-MALT 림프종, 절성 변연대 림프종, 헤어리 세포 백혈병, 형질세포종 및/또는 형질세포성 골수종, 저악성도/노포성 림프종, 중악성도/노포성 NHL, 맨틀 세포 림프종, 노포 중심 림프종(노포성), 중악성도 미만성 NHL, 미만성 대세포형 B 세포 림프종, 어그레시브 NHL(어그레시브 초발성 NHL 및 어그레시브 재발성 NHL를 포함한다), 자기 줄기세포 이식 후에 재발하는 또는 자기 줄기세포 이식이 유효하지 않은 NHL, 원발성 종격 대세포형 B 세포 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 고악성도 면역아구성 NHL, 고악성도 림프아구성 NHL, 고악성도 소형 비개렬 세포성 NHL, 거대 병변 NHL, 버킷 림프종, 전구(말초) T 세포 림프아구성 백혈병 및/또는 림프종, 성인 T 세포 림프종 및/또는 백혈병, T 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 전림프구성 백혈병, 대과립 림프구성 백혈병, 균상육종 및/또는 세자리(Sezary) 증후군, 절외성 내추럴 킬러/T 세포(비형) 림프종, 장증형 T 세포 림프종, 간비 T 세포 림프종, 피하지방직염양 T 세포 림프종, 피부 림프종, 미분화 대세포 림프종, 혈관 중심성 림프종, 장관 T 세포성 림프종, 말초 T 세포(비특정형) 림프종, 및 혈관 면역아구성 T 세포 림프종.
난소암
"난소암"은, 난소 유래의 악성 종양의 혼성 그룹을 말한다. 악성 난소 종양의 대략 90%는, 상피 기원이고; 나머지는 배세포성 및 간질성 종양이다. 상피 난소 종양은, 이하의 조직학적 서브타입으로 분류된다: 장액성 선암(상피 난소 종양의 약 50%를 차지한다); 유내막 선암(약 20%); 점액 선암(약 10%); 명세포암(약 5 내지 10%); 브레너(이행 세포) 종양(비교적 일반적이지 않다). 여성에서 6번째로 가장 많은 암인 난소암의 예후는, 보통 불량으로, 5년 생존은 5 내지 30%의 범위이다. 난소암의 총설에 대해서는, Fox et al. (2002) “Pathology of epithelial ovarian cancer,” in Ovarian Cancer ch. 9 (Jacobs et al., eds., Oxford University Press, New York); Morin et al. (2001) “Ovarian Cancer,” in Encyclopedic Reference of Cancer, pp. 654-656 (Schwab, ed., Springer-Verlag, New York)을 참조할 것. 상기의 상피 난소 종양 서브타입 중 어느 것, 특히 장액성 선암 서브타입을 진단 또는 치료하는 방법이, 본 발명의 고려 내에 있다.
재발
"재발"은, 환자의 질병의, 그 예전의 질환 상태에의 회귀, 특히 분명한 회복 또는 부분 회복 후의 증상의 복귀를 말한다. 특별히 나타내지 않는 한, 재발 상태는, 앞서의 치료(화학요법 및 줄기세포 이식 치료를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는) 전의 질병에의 복귀 프로세스 또는 복귀를 말한다.
난치성
"난치성"은, 치료에 대한 질환 또는 상태의 저항 또는 비응답(예를 들어, 종양성 형질 세포의 수가, 치료를 했한 경우에 오히려 증가한다)을 말한다. 특별히 나타내지 않는 한, 용어 "난치성"은, 임의의 앞서의 치료(화학요법 및 줄기세포 이식 치료를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다)에 대한 저항 또는 비응답을 말한다.
위 종양
본 명세서에서 이용되는 용어 "위 종양" 또는 "위암"은, 위의 임의의 종양 또는 암(예를 들어 선암(예를 들어, 미만형 및 장형) 및 림프종, 평활근 육종, 및 편평 상피 세포암 등의 보다 일반적이지 않은 형태를 포함한다)을 말한다.
종양
본 명세서에서 이용되는 용어 "종양"은, 악성인지 양성인지에 상관 없이, 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은, 본 명세서에서 말하는 경우, 서로 배타적이지 않다.
세포 성장 또는 증식의 저해/세포 성장의 억제
"세포 성장 또는 증식의 저해" 또는 "세포 성장의 억제"는, 세포의 성장 또는 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%만큼 감소시키는 것을 의미하고, 세포사를 유도하는 것을 포함한다.
화학요법제
"화학요법제"는, 암 치료에 유용한 화학적 화합물을 말한다. 화학요법제의 예는, 이하를 포함한다: 티오테파 및 사이클로포스파마이드(CYTOXAN(등록상표)) 등의 알킬화제; 부설판, 임프로설판, 및 피포설판 등의 설폰산 알킬; 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온, 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa) 등의 아지리딘; 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌싸이오포스포르아마이드 및 트라이메틸로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸올멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 아날로그인 토포테칸(HYCAMTIN(등록상표)), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR(등록상표))), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴(scopolectin), 및 9-아미노캄프토테신을 포함한다); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신, 및 비젤레신 합성 아날로그를 포함한다); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 아날로그 KW-2189 및 CB1-TM1을 포함한다); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드(chlorophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드 등의, 나이트로젠 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴 등의, 나이트로소유레아; 엔디인 항생 물질(예를 들어, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마 1I 및 칼리케아마이신 오메가I1(예를 들어, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)을 참조할 것); 경구 알파-4 인테그린 저해제인, CDP323; 디네마이신 A를 포함하는 디네마이신; 에스페라마이신; 및 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련 색소 단백질 엔디인 항생 물질 크로모포어), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카루비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(ADRIAMYCIN(등록상표)), 모폴리노-독소루비신, 사이아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사용(DOXIL(등록상표)), 리포솜 독소루비신 TCL D-99(MYOCET(등록상표)), 페그화 리포솜 독소루비신(CAELYX(등록상표)), 및 데옥시독소루비신을 포함한다), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 마이토마이신 C 등의 마이토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신 등의, 항생 물질; 메토트렉세이트, 겜시타빈(GEMZAR(등록상표)), 테가푸르(UFTORAL(등록상표)), 카페시타빈(XELODA(등록상표)), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실(5-FU) 등의, 대사 대항 물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트 등의, 엽산 아날로그; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌 등의, 퓨린 아날로그; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘 등의, 피리미딘 아날로그; 칼루스테론, 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤 등의, 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄 등의, 항부신 물질(anti-adrenals); 폴린산 등의, 엽산 보급 물질; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민(defofamine); 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르니틴(elfornithine); 아세트산 엘립티늄; 에포틸론; 에토글루시드; 질산 갈륨; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄신 및 안사마이토신 등의, 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라에린(nitraerine); 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK(등록상표) 다당 복합체(JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스파이로저마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2'-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센(특히 T-2 독소, 베라큐린 A(verracurin A), 로리딘 A, 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE(등록상표), FILDESIN(등록상표)); 다카르바진; 만노무틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신(gacytosine); 아라비노시드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(TAXOL(등록상표)), 파클리탁셀의 알부민 개변 나노입자 제제(ABRAXANE(상표)), 및 도세탁셀(TAXOTERE(등록상표)); 클로람부실; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴, 옥살리플라틴(예를 들어, ELOXATIN(등록상표)), 및 카보플라틴 등의, 백금제; 빈브라스틴(VELBAN(등록상표)), 빈크리스틴(ONCOVIN(등록상표)), 빈데신(ELDISINE(등록상표), FILDESIN(등록상표)), 및 비노렐빈(NAVELBINE(등록상표))을 포함하는, 튜불린 중합에 의한 미소관 형성을 방해하는 빈카류; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포아이소메라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine: DMFO); 벡사로텐(TARGRETIN(등록상표))를 포함하는 레티노산 등의, 레티노이드; 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOS(등록상표) 또는 OSTAC(등록상표)), 에티드로네이트(DIDROCAL(등록상표)), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(ZOMETA(등록상표)), 알렌드로네이트(FOSAMAX(등록상표)), 파미드로네이트(AREDIA(등록상표)), 틸루드로네이트(SKELID(등록상표)), 또는 리세드로네이트(ACTONEL(등록상표)) 등의, 비스포스포네이트; 트록사시타빈(1,3-다이옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 아날로그); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히, 이상한 세포 증식에 관련하는 시그널 전달 경로에 있어서의 유전자의 발현을 저해하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGF-R); THERATOPE(등록상표) 백신 및 유전자 요법용 백신(예를 들어, ALLOVECTIN(등록상표) 백신, LEUVECTIN(등록상표) 백신, 및 VAXID(등록상표) 백신) 등의, 백신; 토포아이소메라제 1 저해제(예를 들어, LURTOTECAN(등록상표)); rmRH(예를 들어, ABARELIX(등록상표)); BAY439006(소라페니브; Bayer); SU-11248(수니티니브, SUTENT(등록상표), Pfizer); 페리포신, COX-2 저해제(예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 저해제(예를 들어, PS341); 보르테조미브(VELCADE(등록상표)); CCI-779; 티피파르니브(R11577); 소라페니브, ABT510; 오블리메르센 나트륨(GENASENSE(등록상표)) 등의, Bcl-2 저해제; 픽산트론; EGFR 저해제(후술의 정의를 참조); 티로신 키나제 저해제(후술의 정의를 참조); 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE(등록상표)) 등의, 세린-트레오닌 키나제 저해제; 로나파르니브(SCH 6636, SARASAR(상표)) 등의, 파르네실트랜스페라제 저해제; 및 상기의 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체; 및 상기의 2개 또는 그 이상의 조합, 예를 들어 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니졸론의 병용 요법의 약칭인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합한 옥살리플라틴(ELOXANTIN(상표))에 의한 처치 레지멘의 약칭인 FOLFOX.
본 명세서에서 정의되는 화학요법제는, 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 작용을 조절, 감소, 저지, 또는 저해하도록 작용하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 그들은, 호르몬 그 자체여도 되고, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함한다: 타목시펜(NOLVADEX(등록상표)), 4-하이드록시타목시펜, 토레미펜(FARESTON(등록상표)), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜(EVISTA(등록상표)), 트라이옥시펜, 케옥시펜, 및 SERM3 등의 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(selective estrogen receptor modulator: SERM)를 포함하는, 아고니스트/안타고니스트 혼합 프로필을 갖는 항에스트로겐; 풀베스트란트(FASLODEX(등록상표)), 및 EM800 등의, 아고니스트 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐(그와 같은 약제는 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER)의 이량체화를 저지할 수 있고, DNA의 결합을 저해할 수 있고, ER의 턴오버를 증가시킬 수 있고, 및/또는 ER 레벨을 억제할 수 있다); 포르메스탄 및 엑세메스탄(AROMASIN(등록상표)) 등의 스테로이드 아로마타제 저해제, 및, 아나스트라졸(ARIMIDEX(등록상표)), 레트로졸(FEMARA(등록상표)), 및 아미노글루테티미드 등의 비스테로이드 아로마타제 저해제, 및, 보로졸(RIVISOR(등록상표)), 아세트산 메게스트롤(MEGASE(등록상표)), 파드로졸, 및 4(5)-이미다졸을 포함하는 다른 아로마타제 저해제를 포함하는, 아로마타제 저해제; 류프롤라이드(LUPRON(등록상표) 및 ELIGARD(등록상표)), 고세렐린, 부세렐린, 및 트립토렐린을 포함하는, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 아고니스트; 아세트산 메게스트롤 및 아세트산 메드록프로게스테론 등의 프로게스틴, 다이에틸스틸베스트롤 및 프레마린 등의 에스트로겐, 및, 플루옥시메스테론, 전 트랜스형 레티노산, 및 펜레티니드 등의 안드로겐/레티노이드를 포함하는, 성 스테로이드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하방 제어제(estrogen receptor down-regulator: ERD); 플루타미드, 닐루타미드, 및 비칼루타미드 등의, 항안드로겐; 및 상기의 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체; 및 상기의 2개 또는 그 이상의 조합.
세포 증식 억제제/세포 증식을 억제하는 제
본 명세서에서 이용되는 용어 "세포 증식 억제제" 또는 "세포 증식을 억제하는 제"는 호환적으로, 인비트로 또는 인비보의 어느 것으로 세포의 증식을 정지시키는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 세포 증식 억제제는, S기에 있는 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 세포 증식 억제제의 추가적인 예는, G0/G1 정지 또는 M기 정지를 유도하는 것에 의해 세포 주기의 진행을 저지하는 제를 포함한다. 인간화 항 Her2 항체 트라스투주마브(HERCEPTIN(등록상표))는, G0/G1 정지를 유도하는 세포 증식 억제제의 예이다. 고전적인 M기 저지제는, 빈카류(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신 등의 토포아이소메라제 II 저해제를 포함한다. G1을 정지하는 특정의 제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니존, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C 등의 DNA 알킬화제는, S기 정지에도 파급된다. 추가적인 정보는, Murakami 등에 의한 Mendelsohn and Israel편, The Molecular Basis of Cancer (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), 제1장, 표제 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", 예를 들어, 제13페이지에 있어서 발견할 수 있다. 탁산(파클리탁셀 및 도세탁셀)은, 양쪽 모두 주목(yew tree)로부터 얻어지는 항암약이다. 유럽 주목으로부터 얻어지는 도세탁셀(TAXOTERE(등록상표), Rhone-Poulenc Rorer)은, 파클리탁셀(TAXOL(등록상표), Bristol-Myers Squibb)의 반합성 아날로그이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은, 튜불린 이량체로부터의 미소관의 구축을 촉진하여, 탈중합을 방지하는 것에 의해 미소관을 안정화시켜, 그에 따라 세포에 있어서 유사분열을 저해한다.
자기면역 질환
"자기면역 질환"은, 그 개체 자신의 조직으로부터 생기고 또한 그 개체 자신의 조직에 대해서 향해지는 비악성 질환 또는 장애를 말한다. 본 명세서에서, 자기면역 질환은, 악성 또는 암성의 질환 또는 상태를 명확하게 제외하는 것이고, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), 헤어리 세포 백혈병, 및 만성 골수아구성 백혈병을 제외한다. 자기면역 질환 또는 장애의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 건선 및 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염)을 포함하는 염증성 피부 질환 등의 염증성 반응; 전신성 강피증 및 경화증; 염증성 장 질환에 관련되는 반응(예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염); 호흡 궁박 증후군(성인 호흡 궁박 증후군; adult respiratory distress syndrome: ARDS를 포함한다); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 예를 들어 습진 및 천식, 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 다른 상태 등의 알레르기성 상태; 아테롬 경화; 백혈구 접착 부전증; 관절 류머티즘; 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus: SLE)(루푸스 신장염, 피부 루푸스를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다); 당뇨병(예를 들어, I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자기면역성 갑상선염; 하시모토 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 청년 발증 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사르코이도시스, 다발성 근육염증, 육아종증, 및 혈관염에 있어서 보이는 사이토카인 및 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증에 관련되는 면역 반응; 악성 빈혈(애디슨병); 백혈구의 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계(central nervous system: CNS) 염증성 장애; 다장기 손상 증후군; 용혈성 빈혈(크리오글로불린혈증 또는 쿰스 양성 빈혈을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 개재성 질환; 항사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자기면역성 다선성 내분비 장애; 라이터병; 스티프-맨 증후군; 베쳇증; 거대 세포성 동맥염; 면역 복합체성 신염; IgA 신증; IgM 다발성 뉴로파시; 면역성 혈소판 감소성 자반병(immune thrombocytopenic purpura: ITP) 또는 자기면역성 혈소판 감소증.
면역 억제제/항염증제
본 명세서에서 보조 요법에 관해서 이용되는 용어 "면역 억제제"는, 치료되는 포유동물의 면역계를 억제 또는 차폐하는 작용을 하는 물질을 말한다. 이것은, 사이토카인의 산생을 억제하는, 자기 항원의 발현을 하방 제어 혹은 억제하는, 또는 MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함한다. 그와 같은 약제의 예는, 이하를 포함한다: 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘(미국 특허 제4,665,077호를 참조); 비스테로이드 항염증약(non-steroidal anti-inflammatory drug: NSAID); 간시클로비르, 타크롤리무스, 글루코코르티코이드(예를 들어 코르티졸 또는 알도스테론), 항염증제(예를 들어 사이클로옥시제나제 저해제, 5-리폭시제나제 저해제, 또는 류코트라이엔 수용체 안타고니스트); 아자싸이오프린 또는 미코페놀산 모페틸(MMF) 등의, 퓨린 안타고니스트; 사이클로포스파마이드 등의 알킬화제; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데하이드(미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이 MHC 항원을 차폐한다); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항이디오타이프 항체; 사이클로스포린 A; 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 아날로그(예를 들어, 프레드니존, SOLU-MEDROL(등록상표) 석신산 메틸프레드니졸론 나트륨을 포함하는 메틸프레드니졸론, 및 덱사메타존) 등의, 스테로이드; 메토트렉세이트(경구 또는 피하) 등의, 다이하이드로엽산 리덕타제 저해제; 클로로킨 및 하이드록시클로로킨 등의, 항말라리아제; 설파살라진; 레플루노미드; 항인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체, 항종양괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF)-알파 항체(인플릭시마브(REMICADE(등록상표)) 혹은 아달리무마브), 항TNF-알파 이뮤노어드헤신(에타네르셉트), 항TNF-베타 항체, 항인터류킨-2(IL-2) 항체 및 항IL-2 수용체 항체, 및 항인터류킨-6(IL-6) 수용체 항체 및 안타고니스트(예를 들어, ACTEMRA(상표)(토실리주마브))를 포함하는, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 항체; 항CD11a 및 항CD18 항체를 포함하는 항LFA-1 항체; 항L3T4 항체; 이종 항림프구 글로불린; 범T 항체(pan-T antibody), 바람직하게는 항CD3 또는 항CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 포함하는 가용성 펩타이드(1990년 7월 26일 공개의 WO90/08187); 스트렙토키나제; 형질전환 성장 인자 베타(transforming growth factor-beta: TGF-베타); 스트렙토도르나제; 숙주 유래의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 클로람부실; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T 세포 수용체(Cohen et al., 미국 특허 제5,114,721호); T 세포 수용체 단편(Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); 및 WO91/01133); BAFF 항체 및 BR3 항체 및 zTNF4 안타고니스트 등의, BAFF 안타고니스트(총설에 대해서는 Mackay and Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)를 참조할 것, 또한 후술하는 정의도 참조할 것); CD40-CD40 리간드에 대한 저지 항체(예를 들어, Durie et al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)) 및 CTLA4-Ig(Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994))를 포함하는, 항CD40 수용체 또는 항CD40 리간드(CD154) 등의, T 세포의 헬퍼 시그널과 간섭하는 생물제; 및, T10B9 등의, T 세포 수용체 항체(EP340, 109). 본 명세서의 몇몇 바람직한 면역 억제제는, 사이클로포스파마이드, 클로람부실, 아자티오프린, 레플루노미드, MMF, 또는 메토트렉세이트를 포함한다.
II. 본 발명의 예시적인 태양
일 태양에 있어서, 본 발명은, 항체 가변 영역을 포함하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 적어도 1개의 리간드 결합 부분, 프로테아제 절단 사이트, 및 비절단 가능 펩타이드 링커에 의해 리간드 결합 부분의 C말단 영역에 접속되어 있는 적어도 1개의 리간드를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 단백질로서, (a) 제1 상태에서, 리간드가 리간드 결합 도메인에 결합하고, 또한 리간드의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 프로테아제의 존재에 의해 매개되는, 상기 융합 단백질에 관한 것이다.
"제1 상태"와 "제2 상태" 사이의 차이는, 프로테아제 절단의 비존재/존재일 수 있다. 어구 "제1 상태에서"는, "프로테아제 절단 사이트가 프로테아제에 의해 절단되기 전", 또는 "프로테아제 절단 사이트가 프로테아제에 의해 미절단일 때", 또는 "미절단 상태"라고 바꾸어 말할 수 있다. 어구 "제2 상태에서"는, "프로테아제 절단 사이트가 프로테아제에 의해 절단된 후", 또는 "프로테아제 절단 사이트가 프로테아제에 의해 절단될 때", 또는 "절단 상태"라고 바꾸어 말할 수 있다. 동일한 것이, 본 명세서에 기재되는 다른 태양에도 적용된다.
일 태양에 있어서, 본 발명은, 각각이,
(i) 리간드 결합 도메인 및 정상 영역을 포함하는, 리간드 결합 부분,
(ii) 프로테아제 절단 사이트를 포함하고, 또한 리간드 결합 도메인을 정상 영역에 접속하는, 제1 펩타이드 링커,
(iii) 제2 펩타이드 링커, 및 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 해당 정상 영역,
(iv) 제3 펩타이드 링커에 의해 정상 영역의 C말단 영역에 접속되어 있는, 리간드 부분
을 포함하는, 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
(a) 제1 상태에서, 리간드 부분이 리간드 결합 도메인에 결합하고, 또한 리간드의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 프로테아제의 존재에 의해 매개되는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질에 관한 것이다.
일 태양에 있어서, 본 발명은, 리간드 부분에 융합한 IgG 항체양 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
(i) (ia) VH와 CH1, 또는 (ib) VL과 CL의 경계의 사이의, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는, 제1 펩타이드 링커,
(ii) 항체의 CH1 영역을 Fc 영역에 접속하고, 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 힌지 영역에 도입된 제2 펩타이드 링커, 및
(iii) 리간드 부분을 항체의 Fc 영역의 C말단에 접속하는, 제3 펩타이드 링커
를 포함하고,
(a) 제1 상태에서, 리간드 부분이 항체 가변 영역에 결합하고, 또한 리간드의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 프로테아제의 존재에 의해 매개되는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질에 관한 것이다.
일 태양에 있어서, 본 발명은, 각각이 N말단으로부터 C말단을 향해, 일반식(I):
[리간드 결합 도메인]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[리간드 부분] (I)
에 의해 표시되는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
식 중,
Lx가, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 펩타이드 링커를 나타내고,
Cx가, 제2 펩타이드 링커, 및 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 정상 영역을 나타내고;
Ly가, 제3 펩타이드 링커를 나타내고,
(a) 제1 상태에서, 리간드 부분이 리간드 결합 도메인에 결합하고, 또한 리간드 부분의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 프로테아제의 존재에 의해 매개되는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질에 관한 것이다.
일 태양에 있어서, 본 발명은, 항원 결합 도메인을 포함하는 전장 IgG 항체를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질로서, 해당 항원 결합 도메인이, 가변 영역을 포함하고, 해당 가변 영역이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 또한 (a) 가변 영역의 VH와 CH1의 경계 또는 VL과 CL의 경계의 프로테아제 절단 사이트, 및 (b) 가변 영역에 결합하는 리간드 부분을 포함하고, (a) 제1 상태에서, 리간드 부분이 가변 영역에 결합하고, 또한 리간드 부분의 생물학적 활성이 감약되어 있고, 제2 상태에서, 리간드 부분의 생물학적 활성이 복원되고, 또한 (b) 제1 상태에서의 융합 단백질이, 제2 상태보다도 긴 혈중 반감기를 갖고, 또한 (c) 제1 상태로부터 제2 상태로의 전환이, 프로테아제의 존재에 의해 매개되는, 상기 2가 호모이량체 융합 단백질에 관한 것이다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 전장 IgG 항체는, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 IgG 항체양 폴리펩타이드를 포함한다.
일 태양에 있어서, 본 발명은, 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체양 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질로서, 해당 항원 결합 도메인이, 가변 영역을 포함하고, 해당 가변 영역이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 또한 (a) 가변 영역의 VH와 CH1의 경계 또는 VL과 CL의 경계의 프로테아제 절단 사이트, 및 (b) 해당 가변 영역에 결합하는 리간드를 포함하고, 프로테아제 절단 시에, (i) VH 또는 VL 중 한쪽이 융합 단백질로부터 해리되고, 또한 (ii) 리간드가 가변 영역으로부터 해리되고, (i)에 기재되는 해리가, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는, VH와 VL의 경계면에서 행해지는 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진되고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, 상기 2가 호모이량체 융합 단백질에 관한 것이다.
일 태양에 있어서, 본 발명은, 각각이 N말단으로부터 C말단을 향해, 일반식(I):
[리간드 결합 도메인]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[리간드 부분] (I)
에 의해 표시되는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
식 중,
Lx가, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 펩타이드 링커를 나타내고,
Cx가, 제2 펩타이드 링커, 및 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 정상 영역을 나타내고;
Ly가, 제3 펩타이드 링커를 나타내고,
해당 리간드 결합 도메인이, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 프로테아제 절단 사이트의 절단을 촉매하는 프로테아제의 비존재하("미절단 상태")와 비교하여 해당 프로테아제의 존재하("절단 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질에 관한 것이다.
일 태양에 있어서, 본 발명은, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 항체로서, 해당 프로테아제 절단 사이트에서의 절단 시에, 해당 프로테아제 절단 사이트에 인접한 항체 도메인이 해리되는, 상기 폴리펩타이드 또는 항체에 관한 것이다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "항체 도메인"은, 완전 항체 이외의 분자, 즉, 이들로 한정되는 것은 아니지만, VH, VL, VHH, CH1, CH2, CH3, CL, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, scFv 등과 같은 항체 단편을 포함하는, 항체의 일부분을 말한다.
일 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에, 폴리펩타이드 혹은 항체의 일부분 또는 그 항체 도메인은, 폴리펩타이드 또는 항체의 나머지의 부분으로부터 해리된다. 해리는, 해당 일부분 또는 도메인과 대응하는 상호작용하는 일부분 또는 도메인의 경계면에서 행해진 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진된다. 예를 들어, 항체 도메인이 VH인 경우, 그 대응하는 상호작용하는 도메인은 VL이고, 항체 도메인이 VL인 경우, 그 대응하는 상호작용하는 도메인은 VH이다.
본 명세서에 있어서, 몇몇 분자 형식이 포함된다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "리간드" 및 "항원"은, 호환적으로 이용되고, 넓게, 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인이 특이적으로 결합할 수 있는 모든 분자를 말한다. 용어 "리간드 결합 도메인" 및 "항원 결합 도메인"은, 각각 리간드 또는 항원에 결합할 수 있는 분자를 말한다. 리간드 결합 도메인이, 리간드에 결합하여, 리간드의 생물학적 활성을 중화할 수 있는 그 항체 단편을 포함하는 경우에는, 리간드 결합 도메인은, 항원 결합 도메인과 호환적으로 이용될 수 있다.
프로테아제 절단 사이트
본 발명에 있어서, 리간드 결합 도메인/부분/분자는, 적어도 1개의 프로테아제 절단 사이트를 포함한다. 프로테아제 절단 사이트는, 프로테아제 절단 시에, 리간드가 리간드 결합 도메인으로부터 유리되거나, 결합하지 않게 되어, 그 결합 파트너에게 결합하는 리간드의 생물학적 활성이 복원되는 한, 리간드 결합 도메인/부분/분자 내의 임의의 장소에 배치될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 어구 "리간드 부분/분자를 유리하는/유리하는 것" 또는 "리간드 부분/분자가 유리되는"은, 리간드 부분/분자가, 미절단의 리간드 결합 도메인/부분/분자와 결합한 리간드 부분/분자의 생물학적 활성과 비교하여, 그 결합 파트너와 상호작용하는 것을 통해, 그 생물학적 활성을 발휘 및/또는 증가시킬 수 있게 되는 것을 의미하지만, 유리의 임의의 특정의 레벨 또는 리간드 부분/분자가 유리되는 작용의 임의의 특정의 모드를 말하지 않고, 또는 그것에 대해 제한을 제기하지 않는다.
예를 들어, 프로테아제 절단 사이트는, 리간드 결합 부분/분자에 있어서의 리간드 결합 도메인 부근에, 또는 심지어 리간드 결합 도메인 내에 배치될 수 있다. 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단은, 부분/분자가 결합할 수 있는 리간드의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있고, 예를 들어, 그것을 복원할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 예를 들어, 어구 "생물학적 활성이 복원되는"은, 리간드가, 미절단 상태에서 리간드 결합 부분/분자에 결합하여, 결합 파트너와 상호작용할 수가 없을 때인(제1) 상태(즉, 상호작용의 비존재 때문에 생물학적 활성이 감약되어 있다)로부터, 절단 상태에서 리간드 결합 도메인에 결합하지 않고, 결합 파트너와 상호작용하여, 그 생물학적 활성을 발휘할 수 있을 때인(제2) 상태로 이행하는 상태를 말한다. 그 결합 파트너에 결합하는 리간드의 생리 활성은, 리간드 결합 도메인이 결합하고 있을 때인 제1 상태에서 감약되어 있고, 프로테아제의 존재하에서 리간드 결합 도메인이 결합하고 있지 않을 때인 제2 상태에서 복원된다.
몇몇 태양에 있어서, 프로테아제의 존재하에서, 리간드 결합 부분/분자에 연결되었거나 또는 그것이 결합한 리간드 부분/분자는, 리간드 결합 부분/분자에 있어서의 리간드 결합 도메인 내에 또는 그 부근에 배치된 프로테아제 절단 사이트에서의 절단 때문에, 리간드 결합 부분/분자에 있어서의 리간드 결합 도메인으로부터 유리될 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 절단 후에조차도, 리간드 부분/분자는, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 영역(예를 들어, Fc 영역/도메인)에 여전히 연결될 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 프로테아제의 존재하에서, 리간드 부분/분자는, 리간드 부분/분자와 리간드 결합 부분/분자의 C말단 영역(예를 들어, Fc 영역/도메인) 사이에 배치된 프로테아제 절단 사이트에서의 절단 때문에, 리간드 결합 부분/분자로부터 완전히 유리될 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 절단 후에, 리간드 부분/분자는, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 영역(예를 들어, Fc 영역/도메인)에 더 이상 연결되지 않는다.
일 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자는, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서, 리간드 부분/분자에 보다 약하게 결합한다(즉, 리간드 결합이 감약된다). 다른 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자는, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서, 리간드 또는 리간드 부분에 결합하지 않는다(즉, 리간드 결합이 무효로 된다). 리간드 결합 부분/분자가 항원 항체 반응에 의해 리간드 부분/분자에 결합하는 태양에 있어서, 리간드 결합의 감약 또는 그 결여는, 리간드 결합 부분/분자의 생물학적 활성에 기초하여 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, 항원 결합 도메인은, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서, 리간드 부분/분자에 의해 약하게 결합한다(즉, 리간드 결합이 감약된다). 다른 태양에 있어서, 항원 결합 도메인은, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서, 리간드 또는 리간드 부분에 결합하지 않는다(즉, 리간드 결합이 무효로 된다). 이 경우에, 항원 결합 도메인은, 항원 항체 반응에 의해 리간드 부분/분자에 결합하고, 리간드 결합의 감약 또는 그 결여는, 리간드 결합 부분/분자의 생물학적 활성에 기초하여 평가할 수 있다.
어구 "리간드 결합이 감약되는"은, 리간드에 결합한 피험 리간드 결합 분자의 양이, 상기의 측정법에 기초하여, 리간드에 결합한 대조 리간드 결합 분자의 양의, 예를 들어, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하인 것을 의미한다. 결합 활성에 대한 지표로서 소망의 지표가 적절히 이용되어도 된다. 예를 들어, 해리 상수(KD)가 이용되어도 된다. 결합 활성을 평가하기 위한 지표로서 해리 상수(KD)를 이용하는 경우, 대조 리간드 결합 분자의 리간드에 대한 것보다도 큰, 피험 리간드 결합 분자의 리간드에 대한 해리 상수(KD)는, 피험 리간드 결합 분자가, 대조 리간드 결합 분자의 것보다도 약한, 리간드에 대한 결합 활성을 갖는 것을 의미한다. 어구 "리간드 결합 기능이 감약되는"은, 피험 리간드 결합 분자의 리간드에 대한 해리 상수(KD)가, 대조 리간드 결합 분자의 리간드에 대한 해리 상수(KD)의, 예를 들어, 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배 또는 적어도 10배, 특히 바람직하게는 적어도 100배인 것을 의미한다. 대조 리간드 결합 분자의 예에는, 미절단형의 리간드 결합 부분/분자 또는 미절단형의 항체 혹은 항체 단편이 포함된다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 부분/분자의 생물학적 활성은, 미절단의 리간드 결합 부분/분자의 리간드 결합 도메인에 결합하는 것에 의해 감약된다. 리간드의 생물학적 활성이 감약되는 태양의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 미절단의 리간드 결합 부분/분자의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드 부분/분자의 결합이, 그 결합 파트너에 대한 리간드의 결합을 실질적으로 또는 유의하게 간섭하거나, 또는 그것과 경합하는 태양을 포함한다. 리간드 결합 부분/분자로서 리간드 중화 활성을 갖는 항체 또는 그 단편을 이용하는 경우에는, 리간드와 결합한 리간드 결합 부분/분자는, 그 중화 활성을 발휘하는 것에 의해, 리간드의 생물학적 활성을 감약시킬 수 있고 및 보다 큰 정도까지 감약시킬 수 있고, 즉 저해할 수 있다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 부분/분자의 생물학적 활성은, 항체의 항원 결합 도메인에 결합하는 것에 의해 감약된다. 리간드의 생물학적 활성이 감약되는 태양의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 미절단의 항체의 항원 결합 도메인에 대한 리간드의 결합이, 그 결합 파트너에 대한 리간드의 결합을 실질적으로 또는 유의하게 간섭하거나, 또는 그것과 경합하는 태양을 포함한다. 항원 결합 도메인에 대한 리간드의 결합은, 항원 항체 결합 상호작용을 개재시켜 중화 활성을 발휘하는 것에 의해, 리간드의 생물학적 활성을 감약시키거나 또는 저해한다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 바람직하게는, 미절단의 리간드 결합 부분/분자는, 리간드 부분에 결합하는 것에 의해, 리간드 부분의 생물학적 활성을 충분히 중화할 수 있다. 구체적으로는, 미절단의 리간드 결합 부분/분자와 결합했을 경우의 리간드 부분/분자의 생물학적 활성은, 바람직하게는, 미절단의 리간드 결합 부분/분자와 결합하고 있지 않는 경우의 리간드 부분/분자의 것보다도 낮다. 미절단의 리간드 결합 분자와 결합했을 경우의 리간드의 생물학적 활성은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 미절단의 리간드 결합 분자와 결합하고 있지 않는 경우의 리간드의 생물학적 활성의, 예를 들어, 90% 이하, 바람직하게는 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 또는 30% 이하, 특히 바람직하게는 20% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하일 수 있다. 리간드의 생물학적 활성을 충분히 중화하는 리간드 결합 부분/분자의 투여는, 리간드가 표적 조직에 도착하기 전에 그 생물학적 활성을 발휘하는 것을 저지할 것이 기대될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 있어서, 바람직하게는, 미절단의 항원 결합 도메인은, 리간드 부분에 결합하는 것에 의해, 리간드 부분의 생물학적 활성을 충분히 중화할 수 있다. 구체적으로는, 미절단의 항원 결합 도메인과 결합했을 경우의 리간드 부분/분자의 생물학적 활성은, 바람직하게는, 미절단의 항원 결합 도메인과 결합하고 있지 않는 경우의 리간드 부분/분자의 것보다도 낮다. 미절단의 항원 결합 도메인과 결합했을 경우의 리간드의 생물학적 활성은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 미절단의 항원 결합 도메인과 결합하고 있지 않는 경우의 리간드의 생물학적 활성의, 예를 들어, 90% 이하, 바람직하게는 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 또는 30% 이하, 특히 바람직하게는 20% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하일 수 있다. 리간드의 생물학적 활성을 충분히 중화하는 항원 결합 도메인의 투여는, 리간드가 표적 조직에 도착하기 전에 그 생물학적 활성을 발휘하는 것을 저지할 것이 기대될 수 있다.
혹은, 본 발명은, 리간드의 생물 활성을 중화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 본 발명의 리간드 결합 분자를, 그 생물 활성이 중화되어야 할 리간드와 접촉시키는 공정, 및 2개의 분자의 결합의 산물을 수집하는 공정을 포함한다. 수집된 결합 산물에 있어서의 리간드 결합 분자의 절단에 의해, 중화된 리간드의 생물 활성을 복원할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 리간드의 생물 활성을 중화하는 방법은, 리간드 및 리간드 결합 분자로 이루어지는 결합 산물에 있어서의 리간드 결합 분자를 절단하는 것(환언하면, 리간드 결합 분자의 중화 활성을 해소하는 것)에 의해, 리간드의 생물 활성을 복원하는 공정을 추가로 포함해도 된다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 절단된 리간드 결합 부분 또는 분자의 리간드 부분 또는 분자에 대한 결합 활성은, 바람직하게는, 인비보에서의 천연의 리간드 결합 파트너(예를 들어, 리간드에 대한 천연의 수용체)의 리간드에 대한 결합 활성보다도 낮다. 절단된 리간드 결합 부분/분자의 리간드 부분/분자에 대한 결합 활성은, 이것으로 한정되지 않지만, 인비보에서의 천연의 결합 파트너에 결합한 리간드의 양(단위 결합 파트너 근처)의, 예를 들어, 90% 이하, 바람직하게는 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 또는 30% 이하, 특히 바람직하게는 20% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하를 나타낸다. 결합 활성에 대한 지표로서 소망의 지표가 적절히 이용되어도 된다. 예를 들어, 해리 상수(KD)가 이용되어도 된다. 결합 활성을 평가하기 위한 지표로서 해리 상수(KD)를 이용하는 경우, 인비보에서의 천연의 리간드 결합 파트너의 리간드에 대한 것보다도 큰, 절단된 리간드 결합 부분/분자의 리간드에 대한 해리 상수(KD)는, 절단된 리간드 결합 분자가, 인비보에서의 천연의 결합 파트너의 것보다도 약한, 리간드에 대한 결합 활성을 갖는 것을 의미한다. 절단된 리간드 결합 분자의 리간드에 대한 해리 상수(KD)는, 인비보에서의 천연의 리간드 결합 파트너의 리간드에 대한 해리 상수(KD)의, 예를 들어, 적어도 1.1배, 바람직하게는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 특히 바람직하게는 적어도 100배이다. 절단 후에 리간드에 대해서 낮은 결합 활성 밖에 갖지 않는, 또는 리간드에 대해서 결합 활성을 거의 갖지 않는 리간드 결합 분자에 의해, 리간드 결합 분자의 절단에 의해 리간드가 유리되는 것이 보증되고, 또한 다른 리간드 분자에 다시 결합하는 것이 저지될 것이 기대될 수 있다.
리간드는, 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 절단 후에, 억제된 생물 활성을 복원한다. 바람직하게는, 절단된 리간드 결합 분자의 리간드 결합은, 리간드 결합 분자의 리간드 생물 활성 저해 기능도 감약되도록, 감약된다. 당업자는, 공지된 방법, 예를 들어, 본 명세서에 개시하는 바와 같은 리간드의 그 결합 파트너에 대한 결합을 검출하는 방법에 따라, 리간드의 생물 활성을 확인할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 리간드의 그 결합 파트너에 대한 결합 활성을 언급하는 경우에 본 명세서에서 이용되는 어구 "감약된 결합 활성"은, 융합 폴리펩타이드의 미절단 상태에서의 리간드의 결합 활성과 비교했을 경우에 저감 또는 감소한 결합 활성을 말하고, 저감 또는 감소의 정도는, 한정되지 않고, 활성의 완전한 무효화를 포함한다. 마찬가지로, 어구 "억제된 생물학적 활성" 및 "리간드의 생물학적 활성을 중화하는 것"은, 프로테아제 절단 전에 리간드가 융합 폴리펩타이드의 리간드 결합 도메인에 결합하고 있을 때의 리간드의 그 결합 파트너에 대한 결합 활성의 저감을, 완전한 배제를 포함시켜, 또한 이것으로 한정되지 않고 나타내도록, 본 명세서에 있어서 호환적으로 이용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 어구 "생물학적 활성이 복원되는"은, 리간드가, 미절단 상태에서 리간드 결합 부분에 결합하여, 결합 파트너와 상호작용할 수 없을 때인(제1) 상태로부터, 절단 상태에서 리간드 결합 부분에 결합하지 않고, 결합 파트너와 상호작용하여, 그 생물학적 활성을 발휘할 수 있을 때인(제2) 상태로 이행하는 상태를 말한다. 용어 "복원되는"은, 결합 파트너와 상호작용하여, 그 생물학적 활성을 발휘하는 리간드의 능력의 복귀를 말하고, 이 능력은, 미절단 상태에서 리간드가 리간드 결합 도메인에 결합하고 있었을 때에는 저해되어 있었다. 그것은, 결합 시에 그 생물학적 활성을 발휘하는 데 충분한, 결합 파트너와의 임의의 정도의 상호작용 또는 증가한 상호작용을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자는, 리간드 결합 부분에 있어서의 리간드 결합 도메인 내에 또는 그 부근에 배치된 프로테아제 절단 사이트를 포함한다. 프로테아제의 존재하에서, 리간드는, 리간드 결합 부분에 결합하지 않게 되고, 자유롭게 결합 파트너와 상호작용하여, 그 생물학적 활성을 발휘한다. 몇몇 태양에 있어서, 리간드의 그 생물학적 활성을 발휘하기 위한 결합 파트너에 대한 상호작용은, 리간드가, 비절단 가능 펩타이드 링커에 의해 리간드 결합 부분의 Fc 영역의 C말단에 결합한 채로 있는 동안에 생긴다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "생물학적 활성"은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 리간드의 생리 활성(예를 들어, 리간드 수용체 등의 그 천연의 결합 파트너와의 리간드 상호작용)을 포함한다.
그 리간드 결합 파트너에 결합하는 리간드의 생물 활성은, FACS, ELISA, ALPHA(ALPHA(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이) 스크린 혹은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE, 또는 BLI(바이오 레이어 간섭법)(Octet) 등의 주지의 방법에 의해 확인할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010). ALPHA 스크린은, 도너 및 억셉터의 2개의 비즈를 이용하여 ALPHA 테크놀로지에 따라, 이하의 원리에 기초하여 실시된다. 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자 사이의 상호작용을 통해, 이들 2개의 비즈가 근접하여 위치할 때에만, 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비즈 중의 포토센서타이저는, 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소가, 도너 비즈 주위에 확산하고, 근접하여 위치하는 억셉터 비즈에 도달하고, 그것에 의해 비즈에 있어서의 화학 발광 반응을 일으켜, 이것이 최종적으로 광을 방출한다. 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자 사이의 상호작용의 비존재하에서는, 도너 비즈에 의해 산생되는 일중항 산소가 억셉터 비즈에 도달하지 않기 때문에, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들어, 비오틴 표지된 리간드 결합 파트너를, 도너 비즈에 결합시키고, 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)로 태그 붙이기된 리간드를, 억셉터 비즈에 결합시킨다. 태그 붙이기 되어 있지 않은 경합 리간드 결합 파트너의 비존재하에서는, 리간드 결합 파트너는 리간드와 상호작용하여, 520 내지 620nm의 시그널을 생성한다. 태그 붙이기 되어 있지 않은 리간드 결합 파트너는, 리간드와의 상호작용에 대해, 태그 붙이기 된 리간드 결합 파트너와 경합한다. 경합으로부터 결과로서 생기는 형광의 감소를 정량하여, 상대적인 결합 어피니티를 결정할 수 있다. 설포-NHS-비오틴 등을 이용한 항체 등의 리간드 결합 파트너의 비오틴화는, 당 기술 분야에서 공지이다. 리간드에 GST를 태그 붙이기 하는 방법으로서, 예를 들어, 리간드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 GST를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 인프레임으로 융합시키는 공정; 결과로서 생긴 융합 유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터를 보지하는 세포 등으로부터, GST 융합 리간드를 발현시키는 공정; 및 글루타티온 칼럼을 이용하여 GST 융합 리간드를 정제하는 공정을 포함하는 방법을, 적절히 채용할 수 있다. 얻어진 시그널은, 바람직하게는, 예를 들어, 소프트웨어 GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software, Inc., San Diego)을 이용하여, 비선형 회귀 해석에 기초하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시켜 해석된다.
그 사이의 상호작용을 관찰하게 되는 물질의 한쪽(리간드)을, 센서 칩의 금 박막 상에 고정화한다. 금 박막과 유리의 경계면에서 전반사가 일어나도록, 센서 칩의 이측(裏側)으로부터 광을 쪼인다. 결과로서, 반사 강도가 저하된 부위(SPR 시그널)가, 반사광의 일부분에 형성된다. 그 사이의 상호작용을 관찰하게 되는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을, 센서 칩의 표면에 흘려, 리간드에 결합시키면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여, 센서 칩 표면 상의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화에 의해, SPR 시그널의 위치가 시프트한다(반대로, 결합한 분자의 해리에 의해, 시그널은 원래의 위치로 돌아간다). Biacore 시스템은, 시프트의 양, 즉, 센서 칩 표면 상의 질량의 변화를 세로축에 플롯하여, 질량의 경시 변화를 어세이 데이터로서 표시한다(센서그램). 카이네틱스: 결합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)는, 센서 그램의 커브로부터 결정되고, 해리 상수(KD)는, 이들 상수 사이의 비로부터 결정된다. 저해 어세이 또는 평형 해석도 또한, BIACORE법에 있어서 바람직하게 이용된다. 저해 어세이의 예는, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되고, 평형 해석의 예는, Methods Enzymol. 2000; 323: 325-40에 기재되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 어구 "생물학적 활성이 복원되는"은, 결합에 기인하는 생물학적 활성이, 상기의 것 등의 임의의 측정법에 있어서 관찰되는 한, 리간드의 그 결합 파트너에 대한 결합의 정도에 제한을 부과하지 않는다. 그것은, 절단 상태 및 미절단 상태에서 리간드를 비교했을 경우에, 리간드와 그 결합 파트너 사이의 상호작용에 있어서의 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 증가를 포함할 수 있다. 결합 활성에 대한 지표로서, 소망의 지표가 적절히 이용되어도 된다. 예를 들어, 결합 속도 상수(Kon)가 이용되어도 된다. 결합 상수(Kon)를 이용하는 경우, 대조 리간드(즉, 미절단 상태의 리간드)의 것보다도 큰, 피험 리간드(즉, 절단 상태가 복원된 리간드)에 대한 리간드 결합 파트너의 결합 상수는, 대조 리간드의 것보다도 강한, 리간드 결합 파트너에 대한 피험 리간드의 리간드 결합 활성을 의미한다. 몇몇 태양에 있어서, 결합 상수는, 리간드 결합 파트너에 대한 대조 리간드의 것의, 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 특히 바람직하게는 적어도 100배이다.
예를 들어, Octet를 이용하여 리간드의 생물학적 활성을 검출하는 경우에는, 리간드를 인식하는 리간드 검출용 항체를 비오틴화하여, 바이오센서와 접촉시킨다. 그 다음에, 샘플 중의 리간드에 대한 결합을 측정하여, 리간드 결합 활성의 복원을 검출할 수 있다. 구체적으로는, 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플 중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 혹은, 리간드의 양을, 프로테아제와 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플 중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제의 유무의 사이에서 비교하여, 리간드 부분의 리간드 결합 능력의 복원을 판정할 수 있다. 리간드 결합 분자가 리간드와 융합하여 융합 단백질을 형성하고 있는 경우는, 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플 중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 리간드의 리간드 결합 능력의 복원을 판정할 수 있다. 혹은, 리간드의 양을, 프로테아제와 융합 단백질을 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플 중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제의 유무의 사이에서 비교하여, 리간드의 리간드 결합 능력의 복원을 판정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본원의 실시예에 기재되는 방법에 의해, 리간드의 리간드 결합 활성의 복원을 검출할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 리간드의 생리 활성(즉, 리간드 수용체 등의 그 천연의 결합 파트너와의 리간드 상호작용)은, 리간드 결합 도메인에 대한 결합 시에 감약되어 있고, 이 리간드의 생리 활성의 복원은, 샘플 중의 리간드의 생리 활성을 측정하는 방법에 의해 검출할 수 있다. 구체적으로는, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 그 결합 능력의 복원을 검출할 수 있다. 혹은, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제와 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 이들 샘플의 사이에서 비교하여, 리간드의 결합 능력의 복원을 검출할 수 있다. 리간드 결합 분자가 리간드와 융합하여 융합 단백질을 형성하고 있는 경우는, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 그 결합 능력의 복원을 검출할 수 있다. 혹은, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제와 융합 단백질을 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 이들 샘플의 사이에서 비교하여, 그 결합 능력의 복원을 검출할 수 있다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 미절단의 리간드 결합 분자는, 항원 항체 결합을 통해 리간드와 복합체를 형성한다. 보다 구체적인 태양에 있어서, 리간드 결합 분자와 리간드의 복합체는, 비공유 결합, 예를 들어, 리간드 결합 분자와 리간드 사이의 항원 항체 결합을 통해 형성된다.
몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질을 형성하도록, 미절단의 리간드 결합 분자를 리간드 분자와 융합시킨다. 융합 단백질 중의 리간드 결합 부분의 리간드 결합 도메인과 리간드 부분은, 항원 항체 결합을 통해 추가로 서로 상호작용한다. 리간드 결합 분자와 리간드는, 펩타이드 링커를 개재시켜 융합시킬 수 있다. 융합 단백질 중의 리간드 결합 분자와 리간드가, 펩타이드 링커를 개재시켜 융합하고 있는 경우여도, 리간드 결합 부분의 리간드 결합 도메인과 리간드 부분 사이에는, 비공유 결합이 여전히 존재한다. 환언하면, 리간드 결합 분자가 리간드와 융합하고 있는 태양에 있어서도, 리간드 결합 부분의 리간드 결합 도메인과 리간드 부분 사이의 비공유 결합은, 리간드 결합 분자가 리간드와 융합하고 있지 않는 경우와 유사하다. 비공유 결합은, 리간드 결합 부분/분자의 절단에 의해 감약된다. 요컨대, 리간드 결합 부분/분자의 리간드 결합이 감약된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 리간드 부분 또는 분자는, 펩타이드 링커를 개재시켜 리간드 결합 부분 또는 분자의 C말단 영역에 접속되어 있다. 본 명세서에서 이용되는 경우, 용어 "C말단 영역"은, 폴리펩타이드 중의 내부 아미노산 잔기로부터 폴리펩타이드의 C말단 아미노산 잔기까지 연장되는, 폴리펩타이드의 영역을 말한다. 리간드 결합 부분/분자가, 예를 들어, 항체의 형태에 있거나 또는 Fc 영역을 함유하는 항체 단편의 형태에 있는, 어느 특정의 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 영역은, 전형적으로는, 해당 리간드 결합 부분/분자의 C말단으로부터 1 내지 250번째의 아미노산 잔기의 영역을 말한다. 바람직한 태양에 있어서, 리간드 부분/분자는, 펩타이드 링커를 개재시켜 리간드 결합 부분/분자의 C말단 아미노산 잔기에 접속되어 있다. 펩타이드 링커는, 펩타이드 결합 등의 임의의 공유 결합에 의해, 리간드 부분/분자에, 및 리간드 결합 부분/분자의 C말단 영역에 부가되어 있어도 된다. 펩타이드 링커의 길이는, 리간드 부분/분자를 리간드 결합 부분/분자 중의 리간드 결합 도메인에 결합시키는 한, 특별히 한정되지 않는다. 전술한 펩타이드 링커는, 프로테아제 절단 사이트를 함유해도 되고, 또는 함유하지 않아도 되다. 바람직한 태양에 있어서, 전술한 펩타이드 링커는 프로테아제 절단 사이트를 함유하지 않는다.
몇몇 국면에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-12이다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-12이고, 해당 IL-12는, IL-12의 p35 서브유닛 또는 IL-12의 p40 서브유닛에 부가된 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 아미노산 잔기에 접속되어 있다.
일 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-12이고, 해당 IL-12는, IL-12의 p35 서브유닛 또는 IL-12의 p40 서브유닛의 N말단에 부가된 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 아미노산 잔기에 접속되어 있다. 몇몇 국면에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-22이다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-22이고, 해당 IL-22는, IL-22에 부가된 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 아미노산 잔기에 접속되어 있다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-22이고, 해당 IL-22는, IL-22의 N말단에 부가된 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 아미노산 잔기에 접속되어 있다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 결합 도메인은, 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분에 포함되는 힌지 영역에 접속되어 있다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 결합 부분은, 펩타이드 링커를 개재시켜 힌지 영역에 접속되어 있는 CH1 영역을 추가로 포함해도 된다. 펩타이드 링커는, 링커의 양측에서 CH1과 힌지 사이에 삽입할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 융합 단백질(또는 리간드 결합 부분)은, 펩타이드 링커를 포함하는 정상 영역을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 정상 영역은, 펩타이드 링커를 포함하는 힌지 영역을 포함한다. 펩타이드 링커는, 힌지 영역 전/내의 임의의 위치에 포함되어도 된다. 펩타이드 링커는, CH1과 힌지 영역 사이, 즉, 힌지 영역 중의 아미노산 서열 EPKSC(서열 번호: 936)의 전에 포함되어도 된다(주기: 최초의 잔기(E)는 216위(EU 넘버링)이다). 펩타이드 링커는, 힌지 영역 중의 아미노산 서열 EPKSC(서열 번호: 936)의 후에 포함되어도 된다. 펩타이드 링커의 위치의 예에는, 이하가 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다:
[펩타이드 링커]EPKSCDKTHTCPPCP(서열 번호: 901 참조; 예는 "C1" 타입을 포함한다);
EPKSC[펩타이드 링커]DKTHTCPPCP(서열 번호: 905 참조; 예는 "C2" 타입을 포함한다); 및
[펩타이드 링커]EPKSSDKTHTCPPCP(서열 번호: 908 및 910 참조; 예는 "C3" 및 "C4" 타입을 포함한다); 및
EPKSCDKTHT[펩타이드 링커]CPPCP(서열 번호: 932 참조; 예는 "C5" 타입을 포함한다).
몇몇 태양에 있어서, 펩타이드 링커(상기에서 나타나는 [펩타이드 링커])는, 본 명세서에서 기술되는 GS 링커, 예를 들어, (GS)2, (GGGGS: 서열 번호: 141)2이다.
상기의 호적한 펩타이드 링커는, 용이하게 선택될 수 있고, 바람직하게는, 4아미노산 내지 100아미노산, 5아미노산 내지 100아미노산, 5아미노산 내지 50아미노산, 5아미노산 내지 30아미노산, 5아미노산 내지 25아미노산, 혹은 5아미노산 내지 20아미노산을 포함하는, 1아미노산(Gly 등) 내지 300아미노산, 2아미노산 내지 200아미노산, 또는 3아미노산 내지 100아미노산 등의 다양한 길이 중에서 선택할 수 있다.
펩타이드 링커의 예에는, 글리신 폴리머(G)n, 글리신-세린 폴리머(예를 들어, (GS)n, (GGGGS: 서열 번호: 141)n, 및 (GGGS: 서열 번호: 136)n을 포함하고, n은 적어도 1의 정수이다), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 종래의 기법에 있어서 주지인 다른 가동 링커가 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다.
펩타이드 링커의 예에는,
Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141)
(Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141))n
Gly Gly Gly Gly Ala(GGGGA, 서열 번호: 893)
Gly Gly Gly Gly Glu(GGGGE, 서열 번호: 894)
Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136)
(Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136))n
Gly Gly Gly Ala(GGGA, 서열 번호: 895)
Gly Gly Gly Glu(GGGE, 서열 번호: 896)
Gln Gln Gln Gly(QQQG, 서열 번호: 897)
Gln Gln Gln Gln Gly(QQQQG, 서열 번호: 898)
Ser Ser Ser Gly(SSSG, 서열 번호: 899)
Ser Ser Ser Ser Gly(SSSSG, 서열 번호: 900)
(n은 1 이상의 정수이다)
이 포함될 수 있지만, 그들로 한정되지 않는다.
그러나, 펩타이드 링커의 길이 및 서열은, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. Fab와 Fc 사이의 힌지 영역 중의 링커(GS 링커 등)의 존재는, HC(중쇄 정상 영역)와 LC(경쇄 정상 영역) 사이의 다이설파이드 결합 형성에 있어서 헤테로제니티를 결과로서 가져올 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은, 경쇄와 중쇄의 호모이량체이다. 중쇄는, 중쇄 가변 영역과 정상 영역 1("C1", 예를 들어, 서열 번호: 901) 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, 절단 가능 링커 등의 링커("L1", 예를 들어, 서열 번호: 873)를 포함한다. 단쇄 리간드(IL-12 또는 IL-22 등)가, GS 링커 등의 링커("L4", 예를 들어, 서열 번호: 903)를 개재시켜, Fc 도메인의 C말단에 부가되어도 되고; 혹은, 링커는, 절단 가능 링커("L3", 예를 들어, 서열 번호: 879)여도 된다.
이 타입의 융합 단백질은, "C1" 개변체라고 불릴 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 개변체는, 서열 번호: 876의 경쇄 및 서열 번호: 885의 중쇄를 포함하는 호모이량체인, Ab1-L1-C1-L4-IL12(2가 IL-12 융합 Ab1)이다. 호모제니티를 촉진하기 위해서, 개선된 형태(추가적인 개변체)가, 이하와 같이 생성될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, "C2" 개변체가 이용된다. 이 개변체의 중쇄는, 중쇄 가변 영역과 정상 영역 2("C2", 예를 들어, 서열 번호: 905) 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, 절단 가능 링커 등의 링커("L1", 예를 들어, 서열 번호: 873)를 포함해도 된다. 정상 영역 2에 있어서, 링커(예를 들어, 힌지 영역 중에 존재하는 GS 링커(GGGGSGGGGS(서열 번호: 141)2))의 위치 시프트의 비한정적인 예를, 이하에 나타낸다:
[GGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP](서열 번호: 937)로부터
[EPKSCGGGGSGGGGSDKTHTCPPCP](서열 번호: 935)로 (최초의 잔기(E)는 216위(EU 넘버링)이다).
링커의 시프트한 위치는, 목적에 따라, 즉, 호모제니티를 촉진하기 위해서, 당업자가 적절히 선택 또는 설계할 수 있다. 링커의 위치 시프트는, 중쇄의 220위의 Cys(C220)(EU 넘버링)와 경쇄의 214위의 Cys(C214)(EU 넘버링) 사이의 다이설파이드(시스테인-시스테인(Cys-Cys)) 결합 형성을 촉진 또는 조장할 수 있다. 단쇄 리간드(IL-12 또는 IL-22 등)가, GS 링커 등의 링커("L4", 예를 들어, 서열 번호: 903)를 개재시켜, Fc 도메인의 C말단에 부가되어도 되고; 혹은, 링커는, 절단 가능 링커("L3", 예를 들어, 서열 번호: 879)여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 개변체는, 서열 번호: 876의 경쇄 및 서열 번호: 904의 중쇄를 포함하는 호모이량체인, Ab1-L1-C2-L4-IL12이다.
몇몇 태양에 있어서, "C3" 개변체가 이용된다. 이 개변체에 있어서, 경쇄는 C214S(EU 넘버링) 개변을 포함해도 되고, 중쇄는 C220S(EU 넘버링) 개변을 포함해도 되고, 이것은, 중쇄와 경쇄 사이, 즉, 중쇄의 220위(EU 넘버링)와 경쇄의 214위(EU 넘버링) 사이에 어떠한 다이설파이드 결합 형성도 결과로서 가져오지 않는다. 이 개변체의 중쇄는, 중쇄 가변 영역과 정상 영역 3("C3", 예를 들어, 서열 번호: 908) 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, 절단 가능 링커 등의 링커("L1", 예를 들어, 서열 번호: 873)를 포함해도 된다. 단쇄 리간드(IL-12 및 IL-22 등)가, GS 링커 등의 링커("L4", 예를 들어, 서열 번호: 903)를 개재시켜, Fc 도메인의 C말단에 부가되어도 되고; 혹은, 링커는, 절단 가능 링커("L3", 예를 들어, 서열 번호: 879)여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 개변체는, 서열 번호: 906의 경쇄 및 서열 번호: 907의 중쇄를 포함하는 호모이량체인, Ab1-L1-C3-L4-IL12이다.
몇몇 태양에 있어서, "C4" 개변체가 이용된다. 이 개변체에 있어서, 경쇄는 전술한 개변을 포함하지 않아도 되고, 다른 한편, 중쇄는 S131C(EU 넘버링) 및 C220S(EU 넘버링) 개변을 포함해도 되고, 이것은, 중쇄와 경쇄 사이, 즉, 중쇄의 131위의 Cys(C131)(EU 넘버링)와 경쇄의 214위의 Cys(C214)(EU 넘버링) 사이의 다이설파이드 결합 형성을 결과로서 가져온다. 이 개변체의 중쇄는, 중쇄 가변 영역과 정상 영역 4("C4", 예를 들어, 서열 번호: 910) 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, 절단 가능 링커 등의 링커("L1", 예를 들어, 서열 번호: 873)를 포함해도 된다. 단쇄 리간드(IL-12 또는 IL-22 등)가, GS 링커 등의 링커(L4, 예를 들어, 서열 번호: 903)를 개재시켜, Fc 도메인의 C말단에 부가되어도 되고; 혹은, 링커는, 절단 가능 링커("L3", 예를 들어, 서열 번호: 879)여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 개변체는, 서열 번호: 876의 경쇄 및 서열 번호: 909의 중쇄를 포함하는 호모이량체인, Ab1-L1-C4-L4-IL12이다.
몇몇 태양에 있어서, "C5" 개변체가 이용된다. 이 개변체의 중쇄는, 중쇄 가변 영역과 정상 영역 5("C5", 예를 들어, 서열 번호: 932) 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입된, 절단 가능 링커 등의 링커("L1", 예를 들어, 서열 번호: 873)를 포함해도 된다. 정상 영역 5에 있어서, 링커(예를 들어, 힌지 영역 중에 존재하는 GS 링커(GGGGSGGGGS(서열 번호: 141)2))의 위치 시프트의 비한정적인 예를, 이하에 나타낸다:
[GGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP](서열 번호: 937)로부터
[EPKSCDKTHTGGGGSGGGGSCPPCP](서열 번호: 938)로 (최초의 잔기(E)는 216위(EU 넘버링)이다). 링커의 시프트한 위치는, 목적에 따라, 즉, 호모제니티를 촉진하기 위해서, 당업자가 적절히 선택 또는 설계할 수 있다. 링커의 위치 시프트는, 중쇄의 220위의 Cys(C220)(EU 넘버링)와 경쇄의 214위의 Cys(C214)(EU 넘버링) 사이의 다이설파이드(시스테인시스테인(Cys-Cys)) 결합 형성을 촉진 또는 조장할 수 있다. 단쇄 리간드(IL-12 또는 IL-22 등)가, GS 링커 등의 링커("L5", 예를 들어, 서열 번호: 927)를 개재시켜, Fc 도메인의 C말단에 부가되어도 된다.
일 태양에 있어서, 융합 단백질은, 2세트(예를 들어, 2개의 동일한 세트)의 리간드 결합 도메인, 리간드 부분, 절단 가능 펩타이드 링커, 정상(또는 Fc) 영역, 및 비절단 가능 펩타이드 링커를 포함하는, 2가 리간드 결합 융합 단백질이다. 융합 단백질이 2개의 Fc 영역을 포함하는 경우, 영역은 서로와 이량체화하여 리간드 결합 부분을 형성한다. 이 경우에, 몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, IgG형 단백질, 예를 들어, 이량체화하는 2개의 Fc 영역을 포함하는 IgG형 항체여도 된다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 리간드 부분은, 융합 단백질의 프로테아제 절단에 의해, 리간드 결합 부분의 리간드 결합 도메인으로부터 유리된다. 이 문맥에 있어서, 리간드 부분이, 프로테아제 절단 사이트를 갖는 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분의 C말단 또는 N말단 영역에 접속되어 있는 경우, 리간드 부분은, 융합 단백질로부터 완전히 유리될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 이 타입의 융합 단백질을 "유리형"이라고 한다(예를 들어, 도 3A 참조). 다른 한편, 리간드 부분이, 어떠한 프로테아제 절단 사이트도 갖지 않는 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분의 C말단 영역에 접속되어 있는 경우, 리간드 부분은, 펩타이드 링커를 개재시켜 리간드 결합 부분의 C말단 영역에 융합한 채로 있으면서, 리간드 결합 도메인으로부터 유리될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 이 타입의 융합 단백질을 "융합형"이라고 한다(예를 들어, 도 3B 참조).
프로테아제 절단 사이트의 절단에 의한 리간드 결합 도메인으로부터의 리간드 부분 또는 분자의 유리를 검출하는 방법에는, 예를 들어, 리간드를 인식하는 리간드 검출용 항체를 이용하여, 리간드를 검출하는 방법이 포함된다. 리간드 결합 부분/분자가 항체 단편인 경우, 리간드 검출용 항체는, 바람직하게는, 리간드 결합 도메인용과 동일한 에피토프에 결합한다. 리간드 검출용 항체를 이용하여 검출되는 리간드는, FACS, ELISA 포맷, ALPHA(증폭 발광 근접 호모지니어스 어세이) 스크린 혹은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법, 또는 BLI(바이오 레이어 간섭법)(Octet) 등의 주지된 방법에 의해 확인할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
예를 들어, Octet를 이용하여 리간드의 유리를 검출하는 경우에는, 리간드를 인식하는 리간드 검출용 항체를 비오틴화하여, 바이오센서와 접촉시킨다. 그 다음에, 샘플 중의 리간드에 대한 결합을 측정하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 구체적으로는, 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 혹은, 리간드의 양을, 프로테아제와 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제의 유무의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본원의 실시예에 기재되는 방법에 의해, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 리간드 결합 분자가 리간드와 융합하여 융합 단백질을 형성하고 있는 경우는, 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플 중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 혹은, 리간드의 양을, 프로테아제와 융합 단백질을 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서, 리간드 검출용 항체를 이용하여 측정한다. 샘플 중에 검출된 리간드의 양을, 프로테아제의 유무의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본원의 실시예에 기재되는 방법에 의해, 리간드의 유리를 검출할 수 있다.
리간드 결합 도메인에 대한 결합 시에 리간드의 생리 활성이 감약되는 태양에 있어서, 리간드 결합 분자로부터의 유리는, 샘플 중의 리간드의 생리 활성을 측정하는 방법에 의해 검출할 수 있다. 구체적으로는, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 혹은, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제와 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 리간드 결합 분자와 리간드를 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 이들 샘플의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 리간드 결합 분자가 리간드와 융합하여 융합 단백질을 형성하고 있는 경우는, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제 처리 전 또는 프로테아제 처리 후의 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 프로테아제 처리 전과 프로테아제 처리 후의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다. 혹은, 리간드의 생리 활성을, 프로테아제와 융합 단백질을 함유하는 샘플, 및 프로테아제를 함유하지 않고 융합 단백질을 함유하는 샘플에 있어서 측정하고, 이들 샘플의 사이에서 비교하여, 리간드의 유리를 검출할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, 프로테아제 절단 서열을 포함하는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 본 발명의 융합 단백질이 복수의 프로테아제 절단 사이트를 갖는 어느 특정의 태양에 있어서, 그들 프로테아제 절단 사이트는, 동일한 프로테아제 절단 서열을 가져도 되고, 또는 상이한 프로테아제 절단 서열을 가져도 된다. 프로테아제 절단 사이트가 상이한 프로테아제 절단 서열을 갖는 경우, 그들 상이한 프로테아제 서열은, 동일한 프로테아제에 의해 절단되어도 되고, 또는 상이한 프로테아제에 의해 절단되어도 된다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트는 또한, 프로테아제 절단 서열의 일단 또는 양단에 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기를, 그들 잔기가 프로테아제에 의한 프로테아제 절단 서열의 인식 및 절단을 저해하지 않는 한 포함해도 된다.
프로테아제
본 명세서에 있어서, 용어 "프로테아제"는, 펩타이드 결합을 가수분해하는 엔도펩티다제 또는 엑소펩티다제 등의 효소를 말하고, 전형적으로는, 엔도펩티다제를 말한다. 본 발명에 이용되는 프로테아제는, 프로테아제 절단 서열을 절단할 수 있는 것에만 의해 제한되고, 임의의 특정의 타입의 프로테아제로 한정되지 않는다. 몇몇 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 프로테아제가 이용된다. 표적 조직 특이적 프로테아제는, 예를 들어,
(1) 표적 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제,
(2) 표적 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 활성을 갖는 프로테아제,
(3) 표적 세포에 있어서 정상 세포보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제,
(4) 표적 세포에 있어서 정상 세포보다도 높은 활성을 갖는 프로테아제
의 어느 것을 가리킬 수 있다.
보다 구체적인 태양에 있어서, 암 조직 특이적 프로테아제 또는 염증 조직 특이적 프로테아제가 이용된다.
본 명세서에 있어서, 용어 "표적 조직"은, 적어도 1개의 표적 세포를 함유하는 조직을 의미한다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 표적 조직은 암 조직이다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 표적 조직은 염증 조직이다.
용어 "암 조직"은, 적어도 1개의 암세포를 함유하는 조직을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 암 조직이 암 세포 및 혈관을 함유하고 있는 것을 고려하면, 암세포 및 내피 세포를 함유하는 종류(腫瘤; tumour mass)의 형성에 기여하는 모든 세포형이, 본 발명의 범위에 포함된다. 본 명세서에 있어서, 종류란, 종양 조직소(foci of tumour tissue)를 말한다. 용어 "종양"은, 일반적으로, 양성 신생물 또는 악성 신생물을 의미하기 위해서 이용된다.
본 명세서에 있어서, "염증 조직"의 예에는, 이하가 포함된다:
관절 류머티즘 또는 변형성 관절증에 있어서의 관절 조직,
기관지 천식 또는 만성 폐색성 폐질환(COPD)에 있어서의 폐(폐포) 조직,
염증성 장 질환, 크론병, 또는 궤양성 대장염에 있어서의 소화기관 조직,
간장, 신장, 또는 폐에 있어서의 섬유증의 섬유성 조직,
장기 이식의 거절반응이 일어나고 있는 조직,
동맥 경화 또는 심부전에 있어서의 혈관 또는 심장(심근) 조직,
메타볼릭 증후군에 있어서의 내장 지방 조직,
아토피성 피부염 및 다른 피부염에 있어서의 피부 조직,
추간판 헤르니아 또는 만성 요통에 있어서의 척수 신경 조직, 및
면역 세포가 침윤하고 있는 임의의 조직.
특이적으로 발현하거나 혹은 특이적으로 활성화되는 프로테아제, 또는 표적 조직의 질환 상태에 관련된다고 생각되는 프로테아제(표적 조직 특이적 프로테아제)가, 몇몇 타입의 표적 조직에 대해 공지이다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO2013/128194, WO2010/081173, 및 WO2009/025846은, 암 조직에 있어서 특이적으로 발현하는 프로테아제를 개시하고 있다. 또한, J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45, Nat Rev Immunol. 2006 Jul; 6 (7): 541-50, Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec; 13 (12): 904-27, Respir Res. 2016 Mar 4; 17: 23, Dis Model Mech. 2014 Feb; 7 (2): 193-203, 및 Biochim Biophys Acta. 2012 Jan; 1824 (1): 133-45는, 염증에 관련된다고 생각되는 프로테아제를 개시하고 있다.
표적 조직에 있어서 특이적으로 발현하는 프로테아제에 더하여, 표적 조직에 있어서 특이적으로 활성화되는 프로테아제도 존재한다. 예를 들어, 프로테아제는, 불활성형으로 발현하고, 그 다음에 활성형으로 변환되는 경우가 있다. 많은 조직은, 활성 프로테아제를 저해하는 물질을 함유하여, 활성화의 프로세스 및 저해제의 존재에 의해 활성을 제어한다(Nat Rev Cancer. 2003 Jul; 3 (7): 489-501). 표적 조직에 있어서, 활성 프로테아제는, 저해로부터 피하는 것에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 활성 프로테아제는, 활성 프로테아제를 인식하는 항체를 이용하는 방법(PNAS 2013 Jan 2; 110 (1): 93-98), 또는 프로테아제가 인식 가능한 펩타이드를 형광 표지하여, 형광이 절단 전에는 소광하고 있지만, 절단 후에 방출되도록 하는 방법(Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep; 9 (9): 690-701. doi: 10.1038/nrd3053)의 사용에 의해 측정할 수 있다.
하나의 관점에서, 용어 "표적 조직 특이적 프로테아제"는,
(i) 표적 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제,
(ii) 표적 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 활성을 갖는 프로테아제,
(iii) 표적 세포에 있어서 정상 세포보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제, 및
(iv) 표적 세포에 있어서 정상 세포보다도 높은 활성을 갖는 프로테아제,
의 어느 것을 가리킬 수 있다.
프로테아제의 구체예에는, 시스테인 프로테아제(카텝신 패밀리 B, L, S 등을 포함한다), 아스파르틸 프로테아제(카텝신 D, E, K, O 등), 세린 프로테아제(마트립타제(MT-SP1을 포함한다), 카텝신 A 및 G, 트롬빈, 플라스민, 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tPA), 엘라스타제, 프로테이나제 3, 트롬빈, 칼리크레인, 트립타제, 및 키마제를 포함한다), 메탈로프로테이나제(막결합형(MMP14-17 및 MMP24-25) 및 분비형(MMP1-13, MMP18-23, 및 MMP26-28)의 양쪽 모두를 포함하는 메탈로프로테이나제(MMP1-28), 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(A disintegrin and metalloproteinase)(ADAM), 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS), 메프린(메프린 α 및 메프린 β), CD10(CALLA), 전립선 특이적 항원(PSA), 레구마인, TMPRSS3, TMPRSS4, 인간 호중구 엘라스타제(HNE), 베타 세크레타제(BACE), 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP), 그란자임 B, 구아니디노벤조아타제(GB), 헵신, 네프리라이신, NS3/4A, HCV-NS3/4, 칼파인, ADAMDEC1, 레닌, 카텝신 C, 카텝신 V/L2, 카텝신 X/Z/P, 크루지파인, 오투바인 2, 칼리크레인 관련 펩티다제(KLKs(KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13, 및 KLK14)), 골 형성 단백질 1(BMP-1), 활성화 프로틴 C, 혈액 응고 관련 프로테아제(제VIIa 인자, 제IXa 인자, 제Xa인자, 제XIa 인자, 및 제XIIa 인자), HtrA1, 락토페린, 마랍신, PACE4, DESC1, 다이펩티딜 펩티다제 4(DPP-4), TMPRSS2, 카텝신 F, 카텝신 H, 카텝신 L2, 카텝신 O, 카텝신 S, 그란자임 A, Gepsin 칼파인 2, 글루탐산 카복시펩티다제 2, AMSH양 프로테아제, AMSH, 감마 세크레타제, 항플라스민 절단 효소(APCE), 데사이신(decysin) 1, N-아세틸화 알파-결합 산성 다이펩티다제양 1(NAALADL1), 및 푸린(furin)이 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다.
다른 관점에서, 표적 조직 특이적 프로테아제는, 암 조직 특이적 프로테아제 또는 염증 조직 특이적 프로테아제를 가리킬 수 있다.
암 조직 특이적 프로테아제의 예에는, 국제 공개 번호 WO2013/128194, WO2010/081173, 및 WO2009/025846에 개시되어 있는, 암 조직에 있어서 특이적으로 발현하는 프로테아제가 포함된다.
암 조직 특이적 프로테아제의 타입에 대해, 치료되어야 할 암 조직에 있어서보다 높은 발현 특이성을 갖는 프로테아제는, 유해 반응을 저감시키는 데 보다 유효하다. 바람직한 암 조직 특이적 프로테아제는, 정상 조직에 있어서의 그 농도보다도 적어도 5배, 보다 바람직하게는 적어도 10배, 더 바람직하게는 적어도 100배, 특히 바람직하게는 적어도 500배, 가장 바람직하게는 적어도 1000배 높은, 암 조직에 있어서의 농도를 갖는다. 또한, 바람직한 암 조직 특이적 프로테아제는, 정상 조직에 있어서의 그 활성보다도 적어도 2배, 보다 바람직하게는 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 더 바람직하게는 적어도 100배, 특히 바람직하게는 적어도 500배, 가장 바람직하게는 적어도 1000배 높은, 암 조직에 있어서의 활성을 갖는다.
암 조직 특이적 프로테아제는, 암 세포막에 결합한 형태여도 되고, 또는 세포막에 결합하지 않고 세포 외에 분비되는 형태여도 된다. 암 조직 특이적 프로테아제가 암 세포막에 결합하고 있지 않는 경우, 암 조직 특이적 프로테아제는, 암 조직 내 또는 암 조직의 근방에 존재하는 것인 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, "암 조직의 근방"이란, 리간드 결합 활성을 저감시키는 효과가 발휘되도록, 암 조직에 특이적인 프로테아제 절단 서열이 절단되는 장소의 범위 내인 것을 의미한다.
대체적인 관점에서, 암 조직 특이적 프로테아제는,
(i) 암 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제,
(ii) 암 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 활성을 갖는 프로테아제,
(iii) 암 세포에 있어서 정상 세포보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제, 및
(iv) 암 세포에 있어서 정상 세포보다도 높은 활성을 갖는 프로테아제,
의 어느 것이다.
1타입의 암 조직 특이적 프로테아제가 단독으로 이용되어도 되고, 또는 2타입 이상의 암 조직 특이적 프로테아제가 조합되어도 된다. 암 조직 특이적 프로테아제의 타입수는, 치료되어야 할 암의 타입을 고려하여, 당업자가 적절히 설정할 수 있다.
이들 관점에서, 암 조직 특이적 프로테아제는, 바람직하게는, 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 보다 바람직하게는, 마트립타제(MT-SP1을 포함한다), 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA), 또는 메탈로프로테아제, 더 바람직하게는, 위에 열기한 프로테아제 중에서도 MT-SP1, uPA, MMP-2, 또는 MMP-9, 특히 바람직하게는, 위에 열기한 프로테아제 중에서도 MMP-2 또는 MMP-9이다.
염증 조직 특이적 프로테아제의 타입에 대해, 치료되어야 할 염증 조직에 있어서 보다 높은 발현 특이성을 갖는 프로테아제는, 유해 반응을 저감시키는 데 보다 유효하다. 바람직한 염증 조직 특이적 프로테아제는, 정상 조직에 있어서의 그 농도보다도 적어도 5배, 보다 바람직하게는 적어도 10배, 더 바람직하게는 적어도 100배, 특히 바람직하게는 적어도 500배, 가장 바람직하게는 적어도 1000배 높은, 염증 조직에 있어서의 농도를 갖는다. 또한, 바람직한 염증 조직 특이적 프로테아제는, 정상 조직에 있어서의 그 활성보다 적어도 2배, 보다 바람직하게는 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 더 바람직하게는 적어도 100배, 특히 바람직하게는 적어도 500배, 가장 바람직하게는 적어도 1000배 높은, 염증 조직에 있어서의 활성을 갖는다.
염증 조직 특이적 프로테아제는, 염증 세포막에 결합한 형태여도 되고, 또는 세포막에 결합하지 않고 세포 외에 분비되는 형태여도 된다. 염증 조직 특이적 프로테아제가 염증 세포막에 결합하고 있지 않는 경우, 염증 조직 특이적 프로테아제는, 염증 조직 내 또는 염증 조직의 근방에 존재하는 것인 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, "염증 조직의 근방"이란, 리간드 결합 활성을 저감시키는 효과가 발휘되도록, 염증 조직에 특이적인 프로테아제 절단 서열이 절단되는 장소의 범위 내인 것을 의미한다.
대체적인 관점에서, 염증 조직 특이적 프로테아제는,
(i) 염증 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제,
(ii) 염증 조직에 있어서 정상 조직보다도 높은 활성을 갖는 프로테아제,
(iii) 염증 세포에 있어서 정상 세포보다도 높은 레벨로 발현하고 있는 프로테아제, 및
(iv) 염증 세포에 있어서 정상 세포보다 높은 활성을 갖는 프로테아제,
의 어느 것이다.
1타입의 염증 조직 특이적 프로테아제가 단독으로 이용되어도 되고, 또는 2타입 이상의 염증 조직 특이적 프로테아제가 조합되어도 된다. 염증 조직 특이적 프로테아제의 타입수는, 치료되어야 할 병태를 고려하여, 당업자가 적절히 설정할 수 있다.
이들 관점에서, 염증 조직 특이적 프로테아제는, 바람직하게는, 위에 열기한 프로테아제 중에서도 메탈로프로테아제이다. 메탈로프로테아제는, 보다 바람직하게는, ADAMTS5, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP11, 또는 MMP-13이다.
프로테아제 절단 서열
프로테아제 절단 서열은, 폴리펩타이드가 수용액 중에서 표적 조직 특이적 프로테아제에 의해 가수분해될 때에, 표적 조직 특이적 프로테아제에 의해 특이적으로 인식되는 특정의 아미노산 서열이다. 프로테아제 절단 서열은, 유해 반응의 저감의 관점에서, 바람직하게는, 치료되어야 할 표적 조직 혹은 세포에 있어서 보다 특이적으로 발현하는, 또는 치료되어야 할 표적 조직/세포에 있어서 보다 특이적으로 활성화되는 표적 조직 특이적 프로테아제에 의해, 높은 특이성으로 가수분해되는 아미노산 서열이다.
프로테아제 절단 서열의 구체예에는, 국제 공개 번호 WO2013/128194, WO2010/081173, 및 WO2009/025846에 개시되어 있는, 암 조직에 있어서 특이적으로 발현할 뿐만 아니라 열기한 프로테아제, 염증 조직 특이적 프로테아제 등에 의해 특이적으로 가수분해되는 표적 서열이 포함된다. 예를 들어, 공지된 프로테아제에 의해 특이적으로 가수분해되는 표적 서열에 아미노산 변이를 적절히 도입하는 것에 의해 인공적으로 개변된 서열도 또한, 이용할 수 있다. 혹은, Nature Biotechnology 19, 661-667 (2001)에 기재되어 있는 바와 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 특정된 프로테아제 절단 서열이, 이용되어도 된다.
더욱이, 천연에 존재하는 프로테아제 절단 서열이 이용되어도 된다. 예를 들어, TGFβ는, 프로테아제 절단에 의해 잠재형으로 변환된다. 마찬가지로, 프로테아제 절단에 의해 그 분자 형태를 변화시키는 단백질 중의 프로테아제 절단 서열도 또한, 이용할 수 있다.
이용할 수 있는 프로테아제 절단 서열의 예에는, WO2015/116933, WO2015/048329, WO2016/118629, WO2016/179257, WO2016/179285, WO2016/179335, WO2016/179003, WO2016/046778, WO2016/014974, 미국 특허출원공개 제2016/0289324호, 미국 특허출원공개 제2016/0311903호, PNAS (2000) 97: 7754-7759, Biochemical Journal (2010) 426: 219-228, 및 Beilstein J Nanotechnol. (2016) 7: 364-373에 개시되어 있는 서열이 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다.
프로테아제 절단 서열은, 보다 바람직하게는, 전술과 같은 적합한 표적 조직 특이적 프로테아제에 의해 특이적으로 가수분해되는 아미노산 서열이다. 표적 조직 특이적 프로테아제에 의해 특이적으로 가수분해되는 아미노산 서열은, 바람직하게는, 이하의 아미노산 서열의 어느 것이다:
LSGRSDNH(서열 번호: 2, MT-SP1 또는 uPA에 의해 절단 가능),
PLGLAG(서열 번호: 3, MMP-2 또는 MMP-9에 의해 절단 가능), 및
VPLSLTMG(서열 번호: 4, MMP-7에 의해 절단 가능).
이하의 서열의 어느 것도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용할 수 있다.
TSTSGRSANPRG(서열 번호: 5, MT-SP1 또는 uPA에 의해 절단 가능),
ISSGLLSGRSDNH(서열 번호: 6, MT-SP1 또는 uPA에 의해 절단 가능),
AVGLLAPPGGLSGRSDNH(서열 번호: 7, MT-SP1 또는 uPA에 의해 절단 가능),
GAGVPMSMRGGAG(서열 번호: 8, MMP-1에 의해 절단 가능),
GAGIPVSLRSGAG(서열 번호: 9, MMP-2에 의해 절단 가능),
GPLGIAGQ(서열 번호: 10, MMP-2에 의해 절단 가능),
GGPLGMLSQS(서열 번호: 11, MMP-2에 의해 절단 가능),
PLGLWA(서열 번호: 12, MMP-2에 의해 절단 가능),
GAGRPFSMIMGAG(서열 번호: 13, MMP-3에 의해 절단 가능),
GAGVPLSLTMGAG(서열 번호: 14, MMP-7에 의해 절단 가능),
GAGVPLSLYSGAG(서열 번호: 15, MMP-9에 의해 절단 가능),
AANLRN(서열 번호: 16, MMP-11에 의해 절단 가능),
AQAYVK(서열 번호: 17, MMP-11에 의해 절단 가능),
AANYMR(서열 번호: 18, MMP-11에 의해 절단 가능),
AAALTR(서열 번호: 19, MMP-11에 의해 절단 가능),
AQNLMR(서열 번호: 20, MMP-11에 의해 절단 가능),
AANYTK(서열 번호: 21, MMP-11에 의해 절단 가능),
GAGPQGLAGQRGIVAG(서열 번호: 22, MMP-13에 의해 절단 가능),
PRFKIIGG(서열 번호: 23, 프로-유로키나제에 의해 절단 가능),
PRFRIIGG(서열 번호: 24, 프로-유로키나제에 의해 절단 가능),
GAGSGRSAG(서열 번호: 25, uPA에 의해 절단 가능),
SGRSA(서열 번호: 26, uPA에 의해 절단 가능),
GSGRSA(서열 번호: 27, uPA에 의해 절단 가능),
SGKSA(서열 번호: 28, uPA에 의해 절단 가능),
SGRSS(서열 번호: 29, uPA에 의해 절단 가능),
SGRRA(서열 번호: 30, uPA에 의해 절단 가능),
SGRNA(서열 번호: 31, uPA에 의해 절단 가능),
SGRKA(서열 번호: 32, uPA에 의해 절단 가능),
QRGRSA(서열 번호: 33, tPA에 의해 절단 가능),
GAGSLLKSRMVPNFNAG(서열 번호: 34, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
TQGAAA(서열 번호: 35, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
GAAAAA(서열 번호: 36, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
GAGAAG(서열 번호: 37, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
AAAAAG(서열 번호: 38, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
LCGAAI(서열 번호: 39, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
FAQALG(서열 번호: 40, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
LLQANP(서열 번호: 41, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
LAAANP(서열 번호: 42, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
LYGAQF(서열 번호: 43, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
LSQAQG(서열 번호: 44, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
ASAASG(서열 번호: 45, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
FLGASL(서열 번호: 46, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
AYGATG(서열 번호: 47, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
LAQATG(서열 번호: 48, 카텝신 B에 의해 절단 가능),
GAGSGVVIATVIVITAG(서열 번호: 49, 카텝신 L에 의해 절단 가능),
APMAEGGG(서열 번호: 50, 메프린 α 또는 메프린 β에 의해 절단 가능),
EAQGDKII(서열 번호: 51, 메프린 α 또는 메프린 β에 의해 절단 가능),
LAFSDAGP(서열 번호: 52, 메프린 α 또는 메프린 β에 의해 절단 가능),
YVADAPK(서열 번호: 53, 메프린 α 또는 메프린 β에 의해 절단 가능),
RRRRR(서열 번호: 54, 푸린에 의해 절단 가능),
RRRRRR(서열 번호: 55, 푸린에 의해 절단 가능),
GQSSRHRRAL(서열 번호: 56, 푸린에 의해 절단 가능),
SSRHRRALD(서열 번호: 57),
RKSSIIIRMRDVVL(서열 번호: 58, 플라스미노겐에 의해 절단 가능),
SSSFDKGKYKKGDDA(서열 번호: 59, 스타필로키나제에 의해 절단 가능),
SSSFDKGKYKRGDDA(서열 번호: 60, 스타필로키나제에 의해 절단 가능),
IEGR(서열 번호: 61, 제IXa 인자에 의해 절단 가능),
IDGR(서열 번호: 62, 제IXa 인자에 의해 절단 가능),
GGSIDGR(서열 번호: 63, 제IXa 인자에 의해 절단 가능),
GPQGIAGQ(서열 번호: 64, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
GPQGLLGA(서열 번호: 65, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
GIAGQ(서열 번호: 66, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
GPLGIAG(서열 번호: 67, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
GPEGLRVG(서열 번호: 68, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
YGAGLGVV(서열 번호: 69, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
AGLGVVER(서열 번호: 70, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
AGLGISST(서열 번호: 71, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
EPQALAMS(서열 번호: 72, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
QALAMSAI(서열 번호: 73, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
AAYHLVSQ(서열 번호: 74, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
MDAFLESS(서열 번호: 75, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
ESLPVVAV(서열 번호: 76, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
SAPAVESE(서열 번호: 77, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
DVAQFVLT(서열 번호: 78, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
VAQFVLTE(서열 번호: 79, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
AQFVLTEG(서열 번호: 80, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
PVQPIGPQ(서열 번호: 81, 콜라게나제에 의해 절단 가능),
LVPRGS(서열 번호: 82, 트롬빈에 의해 절단 가능),
TSTSGRSANPRG(서열 번호: 83),
TSTSGRSANPRG(서열 번호: 84),
TSGSGRSANARG(서열 번호: 85),
TSQSGRSANQRG(서열 번호: 86),
TSPSGRSAYPRG(서열 번호: 87),
TSGSGRSATPRG(서열 번호: 88),
TSQSGRSATPRG(서열 번호: 89),
TSASGRSATPRG(서열 번호: 90),
TSYSGRSAVPRG(서열 번호: 91),
TSYSGRSANFRG(서열 번호: 92),
TSSSGRSATPRG(서열 번호: 93),
TSTTGRSASPRG(서열 번호: 94),
TSTSGRSANPRG(서열 번호: 95).
표 1에 나타내는 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다.
[표 1]
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 96)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; 또한 X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 97)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 98)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, F, L, M, P, Q, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 99)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 100)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 101)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, E, F, K, M, N, P, Q, R, S, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 102)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, F, G, L, M, P, Q, V, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 103)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, I, K, N, T, 및 W로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 104)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, G, I, P, Q, S, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, K 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은 A이고; X7은, H, I, 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 105)
서열 중, X1 내지 X8은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은 Y이고; X2는, S 및 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은, A 및 E로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, N 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, P, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 106)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 107)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 108)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, F, L, M, P, Q, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 109)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 110)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 111)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, E, F, K, M, N, P, Q, R, S, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 112)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, F, G, L, M, P, Q, V, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 113)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, I, K, N, T, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 114)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은, A, G, I, P, Q, S, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, K 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은 A이고; X7은, H, I, 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 115)
서열 중, X1 내지 X9는 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X1은 Y이고; X2는, S 및 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은, A 및 E로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, N 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, P, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 116)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 117)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 118)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, F, L, M, P, Q, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 119)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 120)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 121)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, E, F, K, M, N, P, Q, R, S, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 122)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, F, G, L, M, P, Q, V, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 123)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, I, K, N, T, 및 W로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 124)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, G, I, P, Q, S, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, K 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은 A이고; X7은, H, I, 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(서열 번호: 125)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은 Y이고; X2는, S 및 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은, A 및 E로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, N 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, P, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 126)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 127)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 128)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, F, L, M, P, Q, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 129)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 130)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 131)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, E, F, K, M, N, P, Q, R, S, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 132)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, F, G, L, M, P, Q, V, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 133)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X3은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X4는 R이고; X5는, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X6은, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, A, D, E, F, G, I, K, N, T, 및 W로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 134)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은, A, G, I, P, Q, S, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X2는, K 또는 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은 A이고; X7은, H, I, 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
이하의 서열도 또한, 프로테아제 절단 서열로서 이용되어도 된다:
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(서열 번호: 135)
서열 중, X1 내지 X11은 각각, 단일한 아미노산을 나타내고, X10은, I, T, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X11은 S이고; X1은 Y이고; X2는, S 및 T로부터 선택되는 아미노산이고; X3은 G이고; X4는 R이고; X5는 S이고; X6은, A 및 E로부터 선택되는 아미노산이고; X7은, N 및 V로부터 선택되는 아미노산이고; X8은, H, P, V, 및 Y로부터 선택되는 아미노산이고; X9는, A, G, H, I, L, 및 R로부터 선택되는 아미노산이다.
전술한 프로테아제 절단 서열을 이용하는 것에 더하여, 신규한 프로테아제 절단 서열은 스크리닝에 의해 취득해도 된다. 예를 들어, 공지된 프로테아제 절단 서열의 결정 구조 해석의 결과에 기초하여, 절단 서열과 효소의 활성 잔기/인식 잔기의 상호작용을 변화시키는 것에 의해, 신규한 프로테아제 절단 서열을 탐색할 수 있다. 신규한 프로테아제 절단 해렬은 또한, 공지된 프로테아제 절단 서열 중의 아미노산을 개변하는 것, 및 개변된 서열과 프로테아제 사이의 상호작용을 조사하는 것에 의해서도 탐색할 수 있다. 다른 예로서, 프로테아제와 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이 등의 인비트로 디스플레이법을 이용하여 디스플레이된 펩타이드의 라이브러리, 또는 칩 혹은 비즈 상에 고정화된 펩타이드의 어레이와의 상호작용을 조사하는 것에 의해, 프로테아제 절단 서열을 탐색할 수 있다. 프로테아제 절단 서열과 프로테아제 사이의 상호작용은, 인비트로 또는 인비보로 프로테아제에 의한 서열의 절단을 시험하는 것에 의해 조사할 수 있다.
프로테아제 절단 서열, 프로테아제의 활성, 및 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 분자의 절단율을 평가하기 위해서, 프로테아제 처리 후의 절단 단편을, SDS-PAGE 등의 전기영동에 의해 분리하여, 정량할 수 있다. 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 분자의 절단율을 평가하는 방법의 비한정적인 태양에는, 이하의 방법이 포함된다. 예를 들어, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 항체 개변체의 절단율을, 재조합 인간 u-플라스미노겐 활성화 인자/유로키나제(인간 uPA, huPA)(R&D Systems; 1310-SE-010) 또는 재조합 인간 마트립타제/ST14 촉매 도메인(인간 MT-SP1, hMT-SP1)(R&D Systems; 3946-SE-010)을 이용하여 평가하는 경우는, 100마이크로그램/mL의 항체 개변체를, 40nM의 huPA 또는 3nM의 hMT-SP1과 PBS에 있어서 37℃에서 1시간 반응시키고, 그 다음에, 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 제공한다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이는, Wes(Protein Simple)를 이용하여 행할 수 있지만, 본 방법은, 그것에 한정되지 않는다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 대한 대체로서, 분리를 위해서 SDS-PAGE 등을 행하고, 계속해서 웨스턴 블로팅으로의 검출을 행해도 된다. 본 방법은, 이들 방법으로 한정되지 않는다. 절단 전후에, 항인간 λ쇄 HRP 표지 항체(abcam; ab9007)를 이용하여 경쇄를 검출할 수 있지만, 절단 단편을 검출할 수 있는 임의의 항체를 이용해도 된다. 프로테아제 처리 후에 얻어진 각 피크의 면적을, Wes용의 소프트웨어(Compass for SW; Protein Simple)를 이용하여 출력하고, 항체 개변체의 절단율(%)을, 이하의 식으로 결정할 수 있다: (절단된 경쇄의 피크 면적)×100/(절단된 경쇄의 피크 면적＋미절단의 경쇄의 피크 면적) 절단율은, 프로테아제 처리의 전후에 단백질 단편이 검출 가능하면, 결정할 수 있다. 절단율은, 항체 개변체에 관해서뿐만 아니라, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 여러 가지 단백질 분자에 대해서도 결정할 수 있다.
프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 분자의 인비보 절단율은, 분자를 동물에게 투여하는 것, 및 혈액 샘플 중의 투여된 분자를 검출하는 것에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 항체 개변체를, 마우스에게 투여하고, 그들의 혈액 샘플로부터 혈장을 수집한다. Dynabeads Protein A(Thermo; 10001D)를 이용하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 혈장으로부터 항체를 정제하고, 그 다음에, 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 제공하여, 항체 개변체의 프로테아제 절단율을 평가한다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이는, Wes(Protein Simple)를 이용하여 행할 수 있지만, 본 방법은, 그것에 한정되지 않는다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 대한 대체로서, 분리를 위해서 SDS-PAGE 등을 행하고, 계속해서 웨스턴 블로팅으로의 검출을 행해도 된다. 본 방법은, 이들 방법으로 한정되지 않는다. 항인간 λ쇄 HRP 표지 항체(abcam; ab9007)를 이용하여, 마우스로부터 수집된 항체 개변체의 경쇄를 검출할 수 있지만, 절단 단편을 검출할 수 있는 임의의 항체를 이용해도 된다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 의해 얻어진 각 피크의 면적을, 일단 Wes용의 소프트웨어(Compass for SW; Protein Simple)를 이용하여 출력하면, 남은 경쇄의 비율을 [경쇄의 피크 면적]/[중쇄의 피크 면적]으로서 산출하여, 마우스의 신체에 있어서 절단되지 않은 채로 있는 전장 경쇄의 비율을 결정할 수 있다. 인비보 절단 효율은, 생체로부터 수집된 단백질 단편이 검출 가능하면, 결정할 수 있다. 절단율은, 항체 개변체에 관해서뿐만 아니라, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 여러 가지 단백질 분자에 대해서도 결정할 수 있다. 전술한 방법에 의한 절단율의 산출에 의해, 예를 들어, 상이한 절단 서열이 도입되어 있는 항체 개변체의 인비보 절단율의 비교, 및 정상 마우스 모델과 종양 이식 마우스 모델 등의 상이한 동물 모델 사이에서의 단일 항체 개변체의 절단율의 비교가 가능하다.
예를 들어, 표 1에 나타내는 프로테아제 절단 서열은 모두, WO2019/107384에 개시되어 있다. 이들 프로테아제 절단 서열을 함유하는 폴리펩타이드는 모두, 프로테아제의 작용에 의해 가수분해되는 프로테아제 기질로서 유용하다. 따라서, 본 발명은, 상기의 서열 번호: 96 내지 135 등 본 명세서에 기재하는 서열로부터 선택되는 서열, 및 표 1에 열기하는 서열을 포함하는 프로테아제 기질을 제공한다. 본 발명의 프로테아제 기질은, 예를 들어, 리간드 결합 부분 또는 분자 중에 짜 넣기 위해서, 목적에 적합한 성상을 갖는 것을 그것으로부터 선택할 수 있는 라이브러리로서 활용할 수 있다. 구체적으로는, 병소에 국재하는 프로테아제에 의해 리간드 결합 부분/분자를 선택적으로 절단하기 위해서, 그 프로테아제에 대한 감수성에 대해 기질을 평가할 수 있다. 리간드 부분/분자에 접속된 리간드 결합 부분/분자가 인비보 투여되었을 때에, 분자는, 병소에 도달하기 전에 여러 가지 프로테아제와 접촉하는 경우가 있다. 따라서, 분자는, 바람직하게는, 병소에 국재하는 프로테아제에 대해서 감수성을 갖고, 또한 다른 프로테아제에 대해 가능한 한 높은 내성을 갖는다. 목적에 따라서 바람직한 프로테아제 절단 서열을 선택하기 위해서, 미리 여러 가지 프로테아제에 대한 감수성에 대해 망라적으로 각 프로테아제 기질을 해석하여, 그 프로테아제 내성을 찾아낼 수 있다. 얻어진 프로테아제 내성 스펙트럼에 기초하여, 필요한 감수성 및 내성을 갖는 프로테아제 절단 서열을 찾아내는 것이 가능하다. 혹은, 프로테아제 절단 서열이 짜 넣어져 있는 리간드 결합 분자는, 병소에 송달하기 전에, 프로테아제에 의한 효소 작용뿐만 아니라, pH의 변화, 온도, 및 산화/환원 스트레스 등의 여러 가지 환경 스트레스를 받는다. 이들 외부 요인에 대한 내성도 또한, 프로테아제 기질의 사이에서 비교할 수 있고, 이 비교 정보를 이용하여, 목적에 따른 바람직한 성상을 갖는 프로테아제 절단 서열을 선택할 수 있다.
펩타이드 링커
본 발명의 일 태양에 있어서, 각 프로테아제 절단 사이트의 일단 또는 양단에, 가동 링커가 추가로 부가되어 있다. 제1 프로테아제 절단 사이트의 일단에 부가된 가동 링커를, "제1 가동 링커"라고 하고, 타단에 부가된 가동 링커를, "제2 가동 링커"라고 한다. 본 발명의 융합 단백질이, 2개 이상의 프로테아제 절단 사이트를 함유하는 경우는, 마찬가지로, 제2 프로테아제 절단 사이트에 부가된 가동 링커를, "제3 가동 링커" 및 "제4 가동 링커"라고 하고, 제3 프로테아제 절단 사이트에 부가된 가동 링커를, "제5 가동 링커" 및 "제6 가동 링커"라고 하는 등등이다. 하기의 설명은, 제1 프로테아제 절단 사이트에 부가된 제1 및 제2 가동 링커를 설명하기 위해서 제공되지만, 또한 마찬가지로, 제2 및 후속의 프로테아제 절단 사이트에 부가된 제3 및 후속의 가동 링커에도 적용된다.
특정의 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트 및 가동 링커는, 이하의 식의 어느 것을 포함한다:
(프로테아제 절단 서열),
(제1 가동 링커)-(프로테아제 절단 사이트),
(프로테아제 절단 사이트)-(제2 가동 링커), 및
(제1 가동 링커)-(프로테아제 절단 사이트)-(제2 가동 링커).
본 태양에 의한 가동 링커는, 바람직하게는 펩타이드 링커이다. 제1 가동 링커 및 제2 가동 링커는 각각, 독립적 또한 임의적으로 존재하고, 적어도 1개의 플렉시블 아미노산(Gly 등)을 각각이 함유하는 동일한 또는 상이한 가동 링커이다. 가동 링커는, 예를 들어, 프로테아제 절단 서열이 소망의 프로테아제 액세스성을 얻는 데 충분한 수의 잔기(Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys, Gly, Ser, Asp, Asn, Ala 등으로부터 임의로 선택되는 아미노산, 특히 Gly, Ser, Asp, Asn, 및 Ala, 특히 Gly 및 Ser, 특히 Gly 등)를 함유한다.
프로테아제 절단 서열의 양단에서의 사용에 적합한 가동 링커는, 통상, 프로테아제 절단 서열에 대한 프로테아제의 액세스를 개선하여, 프로테아제의 절단 효율을 상승시키는 가동 링커이다. 호적한 가동 링커는, 용이하게 선택될 수 있고, 바람직하게는, 1아미노산(Gly 등) 내지 20아미노산, 2아미노산 내지 15아미노산, 또는, 4아미노산 내지 10아미노산, 5아미노산 내지 9아미노산, 6아미노산 내지 8아미노산, 혹은 7아미노산 내지 8아미노산을 포함하는 3아미노산 내지 12아미노산 등의 다양한 길이 중에서 선택할 수 있다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 가동 링커는, 1 내지 7아미노산의 펩타이드 링커이다.
가동 링커의 예에는, 글리신 폴리머(G)n, 글리신-세린 폴리머(예를 들어, (GS)n, (GSGGS: 서열 번호: 145)n, 및 (GGGS: 서열 번호: 136)n을 포함하고, n은 적어도 1의 정수이다), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 종래의 기법에 있어서 주지인 다른 가동 링커가 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다.
그들 중에서, 글리신 폴리머 및 글리신-세린 폴리머가 주목받고 있고, 그것은, 이들 아미노산이, 비교적 구조화되어 있지 않아, 성분간의 중성 테더(tether)로서 용이하게 기능하기 때문이다.
글리신-세린 폴리머로 이루어지는 가동 링커의 예에는,
Ser
Gly Ser(GS)
Ser Gly(SG)
Gly Ser(GGS)
Gly Ser Gly(GSG)
Ser Gly Gly(SGG)
Gly Ser Ser(GSS)
Ser Ser Gly(SSG)
Ser Gly Ser(SGS)
Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136)
Gly Gly Ser Gly(GGSG, 서열 번호: 137)
Gly Ser Gly Gly(GSGG, 서열 번호: 138)
Ser Gly Gly Gly(SGGG, 서열 번호: 139)
Gly Ser Ser Gly(GSSG, 서열 번호: 140)
Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141)
Gly Gly Gly Ser Gly(GGGSG, 서열 번호: 142)
Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143)
Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG, 서열 번호: 144)
Gly Ser Gly Gly Ser(GSGGS, 서열 번호: 145)
Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146)
Gly Ser Ser Gly Gly(GSSGG, 서열 번호: 147)
Gly Ser Gly Ser Gly(GSGSG, 서열 번호: 148)
Ser Gly Gly Ser Gly(SGGSG, 서열 번호: 149)
Gly Ser Ser Ser Gly(GSSSG, 서열 번호: 150)
Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGS, 서열 번호: 151)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGG, 서열 번호: 152)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGGS, 서열 번호: 153)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGGG, 서열 번호: 154)
(Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141))n
(Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146))n
(Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143))n
(n은 1 이상의 정수이다)
이 포함될 수 있지만, 그들로 한정되지 않는다.
그러나, 펩타이드 링커의 길이 및 서열은, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분 또는 분자는, 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 리간드 결합 도메인 포함한다. VH 및 VL을 포함하는 리간드 결합 부분/분자의 예에는, Fv, scFv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 및 전장 항체가 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분 또는 분자는, Fc 영역을 함유한다. IgG 항체의 Fc 영역을 이용하는 경우, 그 타입은 한정되지 않고, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역을 이용해도 된다. 예를 들어, 서열 번호: 155, 156, 157, 및 158에 의해 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 1개의 서열을 함유하는 Fc 영역, 또는 Fc 영역에 개변을 가하는 것에 의해 조제된 Fc 영역 변이체를 이용해도 된다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자는, 항체 정상 영역을 포함한다. 예로서, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 및 인간 IgG4의 중쇄 정상 영역은, 각각, 서열 번호: 155 내지 158에 나타난다. 예로서, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 및 인간 IgG4의 Fc 영역은, 서열 번호: 155 내지 158의 부분 서열로서 나타난다.
본 발명의 몇몇의 보다 구체적인 태양에 있어서, 리간드 결합 부분 또는 분자는, 항체이다. 리간드 결합 부분/분자로서 항체를 이용하는 경우, 리간드에 대한 결합은, 가변 영역에 의해 달성된다. 몇몇의 더 구체적인 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자는, IgG 항체이다. 리간드 결합 부분/분자로서 IgG 항체를 이용하는 경우, 그 타입은 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등을 이용할 수 있다. 리간드 결합 부분/분자로서 IgG 항체를 이용하는 경우, 리간드에 대한 결합은 또한, 가변 영역에 의해 달성된다. IgG 항체의 2개의 가변 영역의 한쪽 또는 양쪽이, 리간드에 대한 결합을 달성할 수 있다. 전술한 태양에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은, 바람직하게는, 1개 또는 2개의 펩타이드 링커를 개재시켜 항체 부분의 C말단 영역에 접속되어 있는, 1개의 리간드 부분(1가) 또는 2개의 리간드 부분(2가)을 포함한다. 항체가, 2개의 가변 영역 중 1개만이 목적하는 리간드에 결합하는 이중 특이성 항체인 몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, 바람직하게는, 1개의 리간드 부분만을 포함한다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자 중의 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해, 리간드 결합 활성을 갖는 도메인이 리간드 결합 부분/분자로부터 분리되고, 그 때문에 리간드에 대한 결합이 감약 또는 무효로 된다. 리간드 결합 부분/분자로서 IgG 항체를 이용하는 태양에 있어서, 예를 들어, 항체의 가변 영역 중 1개는, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열을 수반하여 제공되고, 그 때문에 절단 상태에서는 항체가 전장 항체 가변 영역을 형성할 수 없어, 그것에 의해 리간드에 대한 결합이 감약 또는 무효로 된다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열이, 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 리간드 결합 부분 또는 분자에 있어서 제공되고, Fab 구조 중의 2개의 펩타이드가, 절단 전에 서로와의 완전한 중쇄-경쇄 상호작용을 갖는 데 반해, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열의 절단이, VH(또는 VH의 일부분)를 함유하는 펩타이드와 VL(또는 VL의 일부분)을 함유하는 펩타이드 사이의 상호작용의 감약 또는 무효화를 결과로서 가져와, VH와 VL 사이의 결합을 저감하거나 또는 무효로 하도록, 설계된다.
VH 및 VL 도메인
본 명세서에 있어서, 본 명세서에서 이용하는 용어 "회합" 또는 "상호작용"이란, 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩타이드 영역이 서로 회합 또는 상호작용하는 상태를 가리킬 수 있다. 일반적으로, 소수 결합, 수소결합, 이온 결합 등이, 의도된 폴리펩타이드 영역 사이에 형성되어, 회합체를 형성한다. 일반적인 회합의 일례로서, 천연형 항체로 대표되는 항체는, 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)의 페어 구조를, 그들 사이의 비공유 결합 등을 통해 유지하고 있음이 공지되어 있다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 도메인에 함유되는 VH와 VL은, 서로 회합한다. 항체 VH와 항체 VL 사이의 회합은, 예를 들어, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열에서의 절단에 의해 무효로 될 수 있다. 회합의 무효화는, 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩타이드 영역이 서로 상호작용하는 상태의 전체적인 또는 부분적인 무효화와 호환적으로 이용할 수 있다. VH와 VL 사이의 회합의 무효화에 대해서는, VH와 VL 사이의 상호작용이, 완전히 무효로 되어도 되고, 또는 VH와 VL 사이의 상호작용이, 부분적으로 무효로 되어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 도메인은, 항체 VL 또는 그 일부분과 항체 VH 또는 그 일부분 사이의 회합이, 프로테아제 절단 사이트에서의 절단에 의해 무효로 되거나, 또는 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해 무효로 되는 리간드 결합 부분 또는 분자를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후의("제2 상태에서의") 융합 단백질의 분자량은, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 전의("제1 상태에서의") 융합 단백질의 분자량보다도 작다. 몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 절단 서열에서의 절단 시에 유리된 리간드 결합 도메인의 VH, VL, 또는 일부분의 분자량은, 대략 26kDa, 또는 13kDa, 또는 그것보다도 작다. 몇몇 태양에 있어서, VH 또는 VL은, 프로테아제 절단 사이트에서의 절단 시에 유리되고, 유리된 VH 또는 VL의 분자량은, 대략 26kDa, 즉 전장 VH 및 VL이다. 몇몇 태양에 있어서, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량과 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 비는, 10:9이고, 또는 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량은, 제1 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 9/10이거나, 또는 제1 상태에서의 융합 단백질과 비교한 제2 상태에서의 융합 단백질의 분자량의 저감 퍼센티지는, 10%이다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "해리"는, 전술한 상호작용의 전체적인 또는 부분적인 무효화를 말할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 용어 "저감된 VH와 VL 사이의 회합" 또는 "저감된 VH와 VL 사이의 상호작용"은 또한, VH(또는 VH의 일부분)를 함유하는 펩타이드와 VL(또는 VL의 일부분)를 함유하는 펩타이드 사이의 회합의 전체적인 또는 부분적인 무효화 또는 감약을 말하기 위해서, 호환적으로 이용될 수 있다. 추가적인 태양에 있어서, 회합 또는 상호작용을 저감시키는 것이 완료되어, VH와 VL 사이의 임의의 회합 또는 상호작용의 무효화를 가져온다. 그와 같은 경우에는, VH 또는 VL은, 서로로부터 완전히 해리되고, 이것은 또한, 본 명세서에서 "VH 유리" 또는 "VL 유리"라고 칭해진다. 본 명세서에서 이용되는 경우, "VH 유리" 및 "VL 유리"란, 각각, 항체 VH, 또는 그 단편, 또는 VH 혹은 그 단편을 포함하는 절단된 단백질의 단편의 유리, 및 항체 VL, 또는 그 단편, 또는 VL 혹은 그 단편을 포함하는 절단된 단백질의 단편의 유리를 말한다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분/분자는, 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 리간드 결합 도메인을 포함하고, 리간드 결합 부분/분자에 있어서의 항체 VH 및 항체 VL은, 리간드 결합 부분/분자의 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열이 미절단인 상태에서는, 서로 회합하고 있는 데 반해, 리간드 결합 부분/분자에 있어서의 항체 VH와 항체 VL 사이의 회합은, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열에서의 절단에 의해 무효로 된다. 리간드 결합 부분/분자에 있어서의 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 리간드 결합 부분/분자의 리간드 결합 능력이, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해 감약되거나 또는 무효로 될 수 있는 한, 리간드 결합 부분/분자 중의 임의의 포지션에 배치될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 리간드는, 항체 VH에 융합하고 있고, 이 융합은, 프로테아제 절단 시에 유리된다("VH-리간드 유리"). 몇몇 태양에 있어서, 리간드는, 항체 VL에 융합하고 있고, 이 융합은, 프로테아제 절단 시에 유리된다("VL-리간드 유리").
몇몇 태양에 있어서, 본 발명은 또한, 그 가변 영역의 VH와 CH1의 경계 또는 VL와 CL의 경계에 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 전장 IgG 항체, 및 해당 가변 영역에 결합하는 리간드를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질도 포함한다. 프로테아제 절단 시에, VH 또는 VL의 어느 것은, 융합 단백질로부터 해리되고, 리간드는, 가변 영역으로부터 해리된다. VH 또는 VL은, 융합 단백질로부터 해리되고, VL 또는 그 일부분과 VH 또는 그 일부분 사이의 회합은, 프로테아제 절단 사이트에서의 절단에 의해 무효로 되거나, 또는 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해 무효로 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명은 또한, 그 가변 영역의 VH와 CH1의 경계 또는 VL와 CL의 경계에 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 IgG 항체양 폴리펩타이드, 및 해당 가변 영역에 결합하는 리간드를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질도 포함한다. 프로테아제 절단 시에, VH 또는 VL의 어느 것은, 융합 단백질로부터 해리되고, 리간드는, 가변 영역으로부터 해리된다. VH 또는 VL은, 융합 단백질로부터 해리되고, VL 또는 그 일부분과 VH 또는 그 일부분 사이의 회합은, 프로테아제 절단 사이트에서의 절단에 의해 무효로 되거나, 또는 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해 무효로 된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은 또한, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하고, 해당 프로테아제 절단 사이트에서의 절단 시에, 해당 프로테아제 절단 사이트에 인접한 도메인이 해리되고, 또한 해당 해리가, 해당 도메인과 대응하는 상호작용하는 도메인의 경계면에서 행해진 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진된다. 몇몇 태양에 있어서, 폴리펩타이드는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG-IgG, IgG-Fab, 또는 CrossMab 항체 등의 항체이다. 추가적인 태양에 있어서, 폴리펩타이드는, 1가 또는 2가여도 되고, 또한 단일 특이성 또는 이중 특이성이어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 폴리펩타이드는, 항체 단편, 예를 들어, scFv, scFv-Fc, 탠덤 scFv, Fab, 탠덤 Fab, F(ab')2, Fab2, Fab-scFv-Fc, F(ab')2-scFv2, 이중 특이성 Fab2, 삼중 특이성 Fab2, 이중 특이성 다이아보디, 삼중 특이성 다이아보디, 탠덤 다이아보디, 트리아보디, 테트라보디, 미니보디, 바이보디, 혹은 트라이보디, 또는 VL 도메인과 회합 한 VH 도메인을 포함하는 임의의 다른 단편이다. 일 태양에 있어서, 항체 단편은, 항체 중쇄 가변 영역 VH, 또는 항체 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는, 항원 결합 도메인을 포함한다.
일 태양에 있어서, 폴리펩타이드는, 서로 회합하는 항체 중쇄 가변 영역 VH 및 항체 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는 항원 결합 도메인, 및, 예를 들어, scFv, scFv-Fc, 미니보디, 다이아보디, 트리아보디에 있어서의 항체 VH와 항체 VL의 경계 부근에 위치하는 프로테아제 절단 사이트, 또는, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fab2에 있어서의 항체 VH와 인접하는 CH1의 경계 부근 혹은 항체 VL과 인접하는 CL의 경계 부근에 위치하는 프로테아제 절단 사이트를 갖는, 항체 단편을 포함한다. 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에, VH 또는 VL은, 서로로부터 해리되고, 항체 VH 또는 그 일부분과 항체 VL 또는 그 일부분 사이의 회합은, 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해 무효로 된다.
일 태양에 있어서, 폴리펩타이드는, 서로 회합하는 항체 중쇄 가변 영역 VH 및 항체 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는 항원 결합 도메인, 및, 항체 VH와 인접하는 항체 CH1의 경계 부근 또는 항체 VL과 인접하는 항체 CL의 경계 부근에 위치하는 프로테아제 절단 사이트를 갖는, 항체를 포함한다. 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에, VH 또는 VL은, 폴리펩타이드로부터 해리되고, 항체 VL 또는 그 일부분과 항체 VH 또는 그 일부분 사이의 회합은, 프로테아제 절단 사이트에서의 절단에 의해 무효로 되거나, 또는 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해 무효로 된다.
일 태양에 있어서, 폴리펩타이드는, 서로 회합하는 항체 중쇄 가변 영역 VH 및 항체 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는 항원 결합 도메인, 및, 항체 VH와 인접하는 항체 CH1의 경계 부근 또는 항체 VL과 인접하는 항체 CL의 경계 부근에 위치하는 프로테아제 절단 사이트를 갖는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG-IgG, IgG-Fab, 또는 CrossMab 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 IgG 항체를 포함한다. 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에, VH 또는 VL은, 폴리펩타이드로부터 해리되고, 항체 VL 또는 그 일부분과 항체 VH 또는 그 일부분 사이의 회합은, 프로테아제 절단 사이트에서의 절단에 의해 무효로 되거나, 또는 프로테아제 절단 서열의 절단에 의해 무효로 된다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분 또는 분자는, 항체 VH, 항체 VL, 및 항체 정상 영역을 포함하는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 부분 또는 분자의 가변 영역은, 항체 VH, 항체 VL, 및 항체 정상 영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 항체는, 항체 VH, 항체 VL, 및 항체 정상 영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 다른 태양에 있어서, 항체 단편은, 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다. Rothlisberger 등(J Mol Biol. 2005 Apr 8; 347 (4): 773-89)에 의해 기술되어 있는 바와 같이, 항체의 VH 도메인과 VL 도메인, 또는 CH 도메인과 CL 도메인은, 많은 아미노산 측쇄를 개재시켜 서로 상호작용하고 있음이 공지되어 있다. VH-CH1과 VL-CL은, Fab 도메인으로서 안정된 구조를 형성할 수 있음이 공지되어 있다. 이전에 보고되어 있는 바와 같이, VH와 VL 사이에서, 아미노산 측쇄는 일반적으로 상호작용하고, 해리 상수는 10-5M 내지 10-8M의 범위이다. VH 도메인과 VL 도메인만이 존재하는 경우에는, 적은 비율로밖에 회합 상태를 형성할 수 없다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 정상 영역 내에 위치한다. 보다 구체적인 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 중쇄 정상 영역 중의 아미노산 140위(EU 넘버링)에 대해서 가변 영역 측에, 바람직하게는, 항체 중쇄 정상 영역 중의 아미노산 122위(EU 넘버링)에 대해서 가변 영역 측에 위치한다. 몇몇 구체적인 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 118위(EU 넘버링)로부터 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 140위(EU 넘버링)까지의 서열 중의 임의의 위치에 도입된다. 다른 보다 구체적인 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 경쇄 정상 영역 중의 아미노산 130위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 130위)에 대해서 가변 영역 측에, 바람직하게는, 항체 경쇄 정상 영역 중의 아미노산 113위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 113위)에 대해서 가변 영역 측에, 또는 항체 경쇄 정상 영역 중의 아미노산 112위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 112위)에 대해서 가변 영역 측에 위치한다. 몇몇 구체적인 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 108위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 108위)로부터 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 131위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 131위)까지의 서열 중의 임의의 위치에 도입된다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VH 내 또는 항체 VL 내에 위치한다. 보다 구체적인 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VH의 아미노산 7위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 바람직하게는, 항체 VH의 아미노산 40위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 보다 바람직하게는, 항체 VH의 아미노산 101위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 더 바람직하게는, 항체 VH의 아미노산 109위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 또는 항체 VH의 아미노산 111위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에 위치한다. 보다 구체적인 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VL의 아미노산 7위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 바람직하게는, 항체 VL의 아미노산 39위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 보다 바람직하게는, 항체 VL의 아미노산 96위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 더 바람직하게는, 항체 VL의 아미노산 104위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에, 또는 항체 VL의 아미노산 105위(Kabat 넘버링)에 대해서 항체 정상 영역 측에 위치한다. 몇몇의 보다 구체적인 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VH 또는 항체 VL 중의 루프 구조를 구성하는 잔기, 및 루프 구조에 가까운 잔기의 위치에 도입된다. 항체 VH 또는 항체 VL 중의 루프 구조란, 항체 VH 또는 항체 VL에 있어서의, α-헬릭스 또는 β-시트 등의 2차 구조를 형성하지 않는 부분을 말한다. 구체적으로는, 루프 구조를 구성하는 잔기 및 루프 구조에 가까운 잔기의 위치란, 항체 VH의 아미노산 7위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 16위(Kabat 넘버링), 아미노산 40위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 47위(Kabat 넘버링), 아미노산 55위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 69위(Kabat 넘버링), 아미노산 73위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 79위(Kabat 넘버링), 아미노산 83위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 89위(Kabat 넘버링), 아미노산 95위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 99위(Kabat 넘버링), 혹은 아미노산 101위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 113위(Kabat 넘버링), 또는 항체 VL의 아미노산 7위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 19위(Kabat 넘버링), 아미노산 39위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 46위(Kabat 넘버링), 아미노산 49위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 62위(Kabat 넘버링), 혹은 아미노산 96위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 107위(Kabat 넘버링)의 범위를 가리킬 수 있다.
몇몇의 보다 구체적인 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VH의 아미노산 7위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 16위(Kabat 넘버링), 아미노산 40위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 47위(Kabat 넘버링), 아미노산 55위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 69위(Kabat 넘버링), 아미노산 73위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 79위(Kabat 넘버링), 아미노산 83위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 89위(Kabat 넘버링), 아미노산 95위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 99위(Kabat 넘버링), 또는 아미노산 101위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 113위(Kabat 넘버링)의 서열 중의 임의의 위치에 도입된다.
몇몇의 보다 구체적인 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VL의 아미노산 7위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 19위(Kabat 넘버링), 아미노산 39위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 46위(Kabat 넘버링), 아미노산 49위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 62위(Kabat 넘버링), 또는 아미노산 96위(Kabat 넘버링) 내지 아미노산 107위(Kabat 넘버링)의 서열 중의 임의의 위치에 도입된다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VH와 항체 정상 영역의 경계 부근에 위치한다. 어구 "항체 VH와 항체 중쇄 정상 영역의 경계 부근"은, 항체 VH의 아미노산 101위(Kabat 넘버링)와 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 140위(EU 넘버링) 사이를 가리킬 수 있고, 바람직하게는, 항체 VH의 아미노산 109위(Kabat 넘버링)와 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 122위(EU 넘버링) 사이, 또는 항체 VH의 아미노산 111위(Kabat 넘버링)와 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 122위(EU 넘버링) 사이를 가리킬 수 있다. 항체 VH가 항체 경쇄 정상 영역과 융합하고 있는 경우, 어구 "항체 VH와 항체 경쇄 정상 영역의 경계 부근"은, 항체 VH의 아미노산 101위(Kabat 넘버링)와 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 130위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 130위) 사이를 가리킬 수 있고, 바람직하게는, 항체 VH의 아미노산 109위(Kabat 넘버링)와 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 113위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 113위) 사이, 또는 항체 VH의 아미노산 111위(Kabat 넘버링)와 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 112위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 112위) 사이를 가리킬 수 있다.
일 태양에 있어서, 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열은, 항체 VL과 항체 정상 영역의 경계 부근에 위치한다. 어구 "항체 VL과 항체 경쇄 정상 영역의 경계 부근"은, 항체 VL의 아미노산 96위(Kabat 넘버링)와 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 130위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 130위) 사이를 가리킬 수 있고, 바람직하게는, 항체 VL의 아미노산 104위(Kabat 넘버링)와 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 113위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 113위) 사이, 또는 항체 VL의 아미노산 105위(Kabat 넘버링)와 항체 경쇄 정상 영역의 아미노산 112위(EU 넘버링)(Kabat 넘버링 112위) 사이를 가리킬 수 있다. 항체 VL가 항체 중쇄 정상 영역과 융합하고 있는 경우, 어구 "항체 VL과 항체 중쇄 정상 영역의 경계 부근"은, 항체 VL의 아미노산 96위(Kabat 넘버링)와 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 140위(EU 넘버링) 사이를 가리킬 수 있고, 바람직하게는, 항체 VL의 아미노산 104위(Kabat 넘버링)와 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 122위(EU 넘버링) 사이, 또는 항체 VL의 아미노산 105위(Kabat 넘버링)와 항체 중쇄 정상 영역의 아미노산 122위(EU 넘버링) 사이를 가리킬 수 있다.
융합 단백질 등의 본 발명의 리간드 결합 부분/분자는, 예를 들어, 항체 정상 영역 내, 항체 VH 내, 항체 VL 내, 항체 VH와 항체 정상 영역의 경계 부근, 항체 VL과 항체 정상 영역의 경계 부근, 및 항체 VH와 항체 VL 사이의 경계 부근으로부터 선택되는 복수의 포지션에 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열을 수반하여 제공될 수 있다. 다른 태양에 있어서, 융합 단백질 등의 본 발명의 리간드 결합 부분/분자의 항체 가변 영역 또는 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 항체 정상 영역 내, 항체 VH 내, 항체 VL 내, 항체 VH와 항체 정상 영역의 경계 부근, 항체 VL과 항체 정상 영역의 경계 부근, 및 항체 VH와 항체 VL의 경계 부근으로부터 선택되는 복수의 포지션에 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열을 수반하여 제공될 수 있다. 다른 태양에 있어서, 항체의 항체 가변 영역 또는 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 항체 정상 영역 내, 항체 VH 내, 항체 VL 내, 항체 VH와 항체 정상 영역의 경계 부근, 항체 VL과 항체 정상 영역의 경계 부근, 및 항체 VH와 항체 VL의 경계 부근으로부터 선택되는 복수의 포지션에 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열을 수반하여 제공될 수 있다. 다른 태양에 있어서, 항체 단편의 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 항체 정상 영역내, 항체 VH내, 또는 항체 VL내로부터 선택되는 복수의 포지션에 프로테아제 절단 사이트 또는 프로테아제 절단 서열을 수반하여 제공될 수 있다. 본 발명에 관련되는 당업자는, 예를 들어, 항체 VH와 항체 VL을 스위칭하는 것에 의해, 항체 VH, 항체 VL, 및 항체 정상 영역을 포함하는 분자의 형태를 변경할 수 있다. 그와 같은 분자 형태도 또한, 본 발명의 범위에 포함된다.
몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질 등의 본 발명의 리간드 결합 부분/분자는, 미절단 상태("제1 상태")보다도 절단 상태("제2 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 특히 VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 개변을 추가로 포함하는, 리간드 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서의 다른 태양에 있어서, 융합 단백질 등의 부분/분자는, 미절단 상태("제1 상태")보다도 절단 상태("제2 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 특히 VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 개변을 추가로 포함하는, 리간드에 결합하는 항원 결합 도메인을 갖는 IgG 항체를 포함한다. 본 명세서의 다른 태양에 있어서, 폴리펩타이드 또는 항체는, 미절단 상태("제1 상태")보다도 절단 상태("제2 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 특히 VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 개변을 추가로 포함하는, 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서의 다른 태양에 있어서, 항체 단편은, 미절단 상태("제1 상태")보다도 절단 상태("제2 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 특히 VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 개변을 추가로 포함하는, 항원 결합 도메인을 포함한다.
전술한 태양의 각각에 있어서, 융합 단백질 혹은 폴리펩타이드로부터의 VH 및 VL의 해리, 또는 해당 융합 단백질 혹은 폴리펩타이드 내에 포함되는 VH 혹은 그 일부분과 VL 혹은 그 일부분 사이의 회합의 저감은, 미절단 상태("제1 상태")보다도 절단 상태("제2 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키거나, 또는 VH와 VL의 상호작용을 저감시키는, VH와 VL의 경계면에서 행해진 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진된다. 더욱이 다른 전술한 태양에 관해서, 항체 혹은 항체 단편으로부터의 VH 및 VL의 해리, 또는 해당 항체 혹은 그 항체 단편 내에 포함되는 VH 혹은 그 일부분과 VL 혹은 그 일부분 사이의 회합의 저감은, 미절단 상태("제1 상태")보다도 절단 상태("제2 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키거나, 또는 VH와 VL의 상호작용을 저감시키는, VH와 VL의 경계면에서 행해진 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진된다. 전술한 태양의 몇몇에 있어서, VH-리간드 및 VL-리간드는, 미절단 상태("제1 상태")보다도 절단 상태("제2 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키거나, 또는 VH와 VL의 상호작용을 저감시키는 아미노산 개변이, VH와 VL의 경계면에서 행해졌을 경우의 융합 단백질로부터의 해리 시에, 융합 단백질로부터 유리된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "경계면"은, (아미노산 잔기의) 2개의 영역이 서로 회합하하거나 또는 상호작용하는 면을 말한다. 경계면을 형성하는 아미노산 잔기는, 통상, 회합 및 해리에 제공되는 각 폴리펩타이드 영역에 함유되는 아미노산 잔기 중 하나 또는 복수이며, 보다 바람직하게는, 회합 시에 서로 접근하거나 또는 해리 중에 서로로부터 멀어져, 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 말한다. 구체적으로는, 상호작용에는, 회합 시에 서로 접근하거나 또는 해리 중에 서로로부터 멀어지는 아미노산 잔기의 사이의, 수소 결합, 정전 상호작용, 또는 염 가교 형성 등의 비공유 결합이 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 어구 "경계면을 형성하는 아미노산 잔기"는, 구체적으로는, 경계면을 구성하는 폴리펩타이드 영역 중에 함유되는 아미노산 잔기를 말한다. 일례로서, 경계면을 구성하는 폴리펩타이드 영역이란, 항체, 리간드, 수용체, 기질 등에 있어서 분자내 또는 분자간의 선택적 결합을 담당하는 폴리펩타이드 영역을 말한다. 항체에 있어서의 그와 같은 폴리펩타이드 영역의 구체예는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 그와 같은 폴리펩타이드 영역의 예에는, VH 및 VL 영역, 특히, VH 및 VL 영역 내의 프레임워크 영역(FR)이 포함된다. 경계면을 형성하는 아미노산 잔기의 예에는, 회합 시에 서로 접근하거나 또는 해리 중에 서로로부터 멀어지는 아미노산 잔기가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 그와 같은 아미노산 잔기는, 예를 들어, 폴리펩타이드의 컨포메이션을 해석하는 것, 및 폴리펩타이드의 회합 혹은 해리 시에 경계면을 형성하는 폴리펩타이드 영역의 아미노산 서열을 조사하는 것에 의해, 특정할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 해리를 촉진하기 위해서, 또는 그 사이의 상호작용 혹은 회합을 저감시키기 위해서, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변할 수 있다. 추가적인 구체적인 태양에 있어서, 융합 단백질의 리간드 결합 도메인 또는 항체 혹은 항체 단편의 항원 결합 도메인 내의 중쇄 가변 영역 상의 VH와 경쇄 가변 영역 상의 VL 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를, 개변할 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 경계면을 형성하는 2개 이상의 아미노산 잔기가 동일한 전하를 갖도록, 경계면 아미노산 잔기에 변이를 도입하는 방법에 의해, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변할 수 있다. 동일한 전하를 결과로서 가져오는 아미노산 잔기의 개변에는, 양으로 하전된 아미노산 잔기의 음으로 하전된 아미노산 잔기 또는 하전되어 있지 않는 아미노산 잔기로의 개변, 음으로 하전된 아미노산 잔기의 양으로 하전된 아미노산 잔기 또는 하전되어 있지 않은 아미노산 잔기로의 개변, 및 하전되어 있지 않은 아미노산 잔기의 양 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기로의 개변이 포함된다. 그와 같은 아미노산 개변은, 해리를 촉진하거나 또는 상호작용 혹은 회합을 저감시킬 목적으로 행해지고, 해리를 촉진하거나 또는 상호작용을 저감시키는 목적이 달성될 수 있는 한, 아미노산 개변의 포지션 또는 아미노산의 타입에 의해 한정되지 않는다. 개변의 예에는, 치환이 포함되지만, 이것으로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 상기와 같은 VH와 VL의 해리를 촉진하기 위해서, 또는 그 사이의 상호작용 혹은 회합을 저감시키기 위해서 개변될 수 있는 아미노산 잔기 포지션은, VH와 VL 사이의 회합에 매우 중요한 1개 또는 복수의 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 가변 도메인, VH 및 VL은, 2개의 β 시트로 이루어지는 보존된 β 배럴 프레임워크를 포함하고, 1개는 4개의 쇄(A, B, D, E)를 갖고, 다른 1개는 6개의 쇄(A', G, F, C, C', C'')를 갖고 있으며, 쇄 GFC'C가, VH와 VL의 경계면("VH/VL 경계면")을 형성한다. VH/VL 패킹 지오메트리의 연구에 의해, 경계면 잔기의 75%는 프레임워크 β 시트에 의해, 및 25%는 CDR에 의해 구성되어 있음이 분명하다(각각, GF, BC, 및 C'C''의 사이의 쇄간 연결). 따라서, VH 및 VL의 VH/VL 복합체, 즉 Fv에의 타당한 회합에 매우 중요한 아미노산 잔기의 대다수는, 프레임워크 β 시트 내에 있다. 인간, 마우스, 소, 낙타, 라마, 마카크, 및 닭 등의 다양한 종의 2000보다도 많은 V 클래스 서열을 포함하는, 모든 가능한 포지션의 잔기 사이의 공변동을 조사하는 복수 서열 얼라인먼트에 의해, 가장 강하게 보존된 아미노산의 대다수는, VH/VL 경계면에 위치됨이 밝혀졌다. 고도로 보존된 잔기는, VL에 대해, 아미노산 포지션 Y36, Q37, P44, A43, L46, Y49, Y87, 및 F98, 및 VH에 대해, 아미노산 V37, R38, G44, L45, E46, W47, Y91, H91, 및 W103을 포함한다. 특정된 포지션은, VH/VL 경계면 내에 존재하여, 주로 VH와 VL 사이의 회합을 개변한다. 보존된 아미노산 포지션의 하나 또는 복수에서 행해진 변이는, VH/VL 복합체의 안정성에 영향을 미치고, 더욱이 VH/VL 복합체의 항원 결합능에 영향을 미쳤음이 실증되어 있다(Sci Reports. (2017) 7, 12276). VH 및 VL의 Fv에의 회합에 중대하게 관여하는 아미노산 포지션은, 주로 프레임워크 β 시트 내에 있고, 또한 이들의 동일한 포지션은, 항체의 V 영역에 걸쳐서 고도로 보존되어 있기 때문에, 이들 선택된 아미노산 포지션에서의 개변은, 리간드 또는 항원의 동일성에 관계없이, 현재 기재하고 있는 융합 단백질 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드의 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인에 있어서 VH와 VL 사이의 어피니티를 바꿀 것이 기대된다. VH와 VL 사이의 회합을 저감시키려고 하는 당업자는, 특정된 아미노산 포지션에 있어서 용이하게 개변을 개시하여, VH 유리, VH-리간드 유리, VL 유리, 또는 VL-리간드 유리를 촉진하는 성공을 합리적으로 기대할 것이다. 그것으로 한정되는 것을 바라지 않고, 예로서, 다양한 표적에 결합하는 이하의 항체는, VL 상의 Y36, Q37, P44, A43, L46, Y49, Y87, 및 F98의 특정된 포지션, 및/또는 VH 상의 V37, R38, G44, L45, E46, W47, Y91, H91, 및 W103의 아미노산 포지션에서 고도로 보존된 아미노산을 실증하고, 해당 항체에는, 리툭시마브, 트라스투주마브, 알렘투주마브, 세툭시마브, 베바시주마브, 파니투무마브, 오파투무마브, 이필리무마브, 페르투주마브, 오비누투주마브, 라무시루마브, 펨브롤리주마브, 니볼루마브, 디노툭시마브(dinotuximab), 다라투무마브, 네시투무마브, 엘로투주마브, 아테졸리주마브, 올라라투마브, 아벨루마브, 및 듀라블루마브(duravlumab)가 포함된다(Frontiers in Immunology. (2018) 8, 1751).
VH와 VL 사이의 회합을 저감시켜, 본 명세서의 융합 단백질 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드로부터의 VH 유리, VH-리간드 유리, VL 유리, 또는 VL-리간드 유리를 촉진하기 위해서, 당업자는, VH와 VL의 경계면의 전술한 아미노산 포지션의 하나 또는 복수에서 용이하게 개변을 행할 것이다. 본 명세서에 있어서, VH와 VL의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기에는, 포지션 36, 37, 38, 44, 45, 46, 47, 49, 87, 91, 98, 및 103의 아미노산 잔기가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다(J. Mol. Biol. (2005) 350, 112-125, Sci Reports. (2017) 7, 12276). VH와 VL의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 바꾸는 것, 특히, 아미노산 잔기의 치환은, VH와 VL의 해리를 촉진하거나, 또는 그 사이의 상호작용 혹은 회합을 저감시킬 수 있다. 치환에 대해 개변 가능한 아미노산 포지션의 예에는, VH 상의 37, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 91, 및 103, 및 VL 상의 36, 37, 38, 43, 44, 46, 49, 87, 및 98(Kabat 넘버링에 따른다)이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 그와 같은 아미노산 치환의 예에는, VH 상의 V37, R38, Q39, G44, L45, E46, W47, H91, Y91, 및 W103, 및 VL 상의 Y36, Q37, R38, A43, P44, L46, Y49, Y87, 및 F98(Kabat 넘버링에 따른다)이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 그와 같은 아미노산 치환의 예에는, VH 상의 Q39D, W47A, W47L, W47M, Y91A, Y91L, Y91M, H91A, W103A, W103I, W103L, W103M, V37S, V37Q, G44Q, L45A, 및 L45Q, 또는 VL 상의 R38E, Y49A, Y87A, Y87L, Y87M, F98A, F98L, F98M, A43Q, P44A, P44S, P44Q, L46E, 및 L46Q(Kabat 넘버링에 따른다)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 각각의 개변 가능한 아미노산 포지션에 대해, 당업자는, 해당 아미노산 포지션을, VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 목적을 달성하는, 결과적인 아미노산으로 바꾸게 되고, 예를 들어, 그것으로 한정되는 것은 아니지만, 포지션 W47이 선택되는 경우, 당업자는, A, L, 또는 M의 어느 것을 선택할 수 있다. 아미노산 잔기의 개변은, VH 또는 VL의 다른 한쪽으로부터의 해리를 촉진하는 목적이 달성될 수 있는 한, VH 또는 VL에만 한정되지 않고, VH 및 VL의 양쪽 상의 개변도 또한 포함한다. 아미노산 잔기의 개변은, 그것이, 융합 폴리펩타이드의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합, 또는 폴리펩타이드, 항체, 혹은 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 항원의 결합을 파괴하지 않는 한, VH와 VL의 경계면을 형성하는 임의의 포지션에서 행할 수 있다. 더욱이, 아미노산 잔기의 개변은, 개변이, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 리간드 또는 항원의 결합 활성을 파괴하지 않고, VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 한, 페어로 행해지지 않아도 된다. 즉, 아미노산 잔기의 개변은, 반드시 페어로의 개변으로 한정되지 않고, 아미노산 개변의 임의의 조합, 예를 들어, VL 상의 2개의 아미노산 개변과 조합된 VH 상의 1개만의 아미노산 개변, 또는 VL 상의 3개의 아미노산 개변과 조합된 VH 상의 2개의 아미노산 개변을 포함한다. 아미노산 잔기의 개변은 또한, 개변이, VH와 VL 사이의 회합을 저감시킬 수 있을 뿐이지만, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 리간드 또는 항원의 결합 활성을 파괴하지 않는 한, VH 또는 VL 상의 단일한 아미노산 개변일 수도 있다. 혐의의 회피를 위해서 말하면, 아미노산 개변이 적어도 페어로 VH 및 VL의 양쪽 상에서 행해지는 경우, VH 상에서 행해지는 아미노산 개변 및 VL 상에서 행해지는 아미노산 개변은, 개변이, VH와 VL 사이의 회합을 저감시킬 수 있지만, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 리간드 또는 항원의 결합 활성을 파괴하지 않는 한, 반드시 동일하지는 않고, 또한 반드시 상이하지는 않다. VH와 VL의 경계면 내의 선택된 포지션에 도입되는 아미노산 개변이, 융합 폴리펩타이드의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합, 또는 폴리펩타이드 혹은 항체의 항원 결합 도메인에 대한 항원의 결합을 파괴하지 않는다고 하는 확인은, 본 명세서에 기재되는 일반적인 방법의 어느 것에 의해, 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 실시될 수 있다.
일 태양에 있어서, 아미노산 개변은, FR 영역 내의 VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환의 조합이다. 바람직한 태양에 있어서, 조합의 치환은, 이하의 군(a) 내지 (pp)로부터 선택된다:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 Q39D, 및 VL 상의 R38E;
(c) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(e) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(f) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(h) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(j) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(l) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(m) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(o) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(q) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(r) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(s) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(v) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(w) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(y) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(z) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(aa) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(bb) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 Y49A 및 F98L;
(cc) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(dd) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 P44A 및 Y49A;
(ee) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(ff) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(gg) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 F98M;
(hh) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, P44A, 및 Y49A;
(ii) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(jj) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(kk) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q, Y49A, 및 Y87M;
(ll) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(mm) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(nn) VH 상의 V37S 및 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(oo) VH 상의 V37S 및 Y91M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(pp) VH 상의 V37S 및 L45Q, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87M.
일 태양에 있어서, 아미노산 개변은, FR 영역 내의 VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이다. 바람직한 태양에 있어서, 치환은, VH 상의 포지션 37, 45, 91, 및 103, 및 VL 상의 포지션 43, 46, 49, 및 87로부터 선택되고, 특히, 치환은, VH 상의 V37S, L45Q, Y91M, Y91A, H91A, W103L, W103I, 및 W103M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, Y49A, 및 Y87L(Kabat 넘버링에 따른다)이다.
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 주로 프레임워크 영역(FR) 중에 있는 VH와 VL의 회합에 관여하는 아미노산 잔기 포지션은, 당 기술 분야에서 공지이며, 예를 들어, IgG 클래스의 항체 내 등, 항체에 걸쳐서 상대적으로 보존되고 있다고 생각된다. 이들 영역에 있어서의 개변은, VH와 VL의 회합을 바꿀 것이, 당업자에 의해 합리적으로 기대된다. 당업자는, 예를 들어, VH와 VL의 회합을 저감시키기 위해서 등에, 이들 선택된 잔기 포지션에서 1개 또는 복수의 아미노산 개변을 행하는 것에 의해, VH와 VL의 회합을 용이하게 증가 또는 감소시킬 수 있고, 당업자는, 소수성 잔기를 친수성 영역 중에 도입하거나, 또는 친수성 잔기를 소수성 포켓 중에 도입하거나, 또는 소수성/친수성 잔기를 중성인 잔기로 개변할 수 있다. 이들 포지션의 아미노산 잔기는, 고도로 보존되어 있기 때문에, 선택된 포지션에서의 개변체 아미노산의 도입은, 대체로, 그 표적 항원에 관계없이, 상기 FR을 포함하는 항체에 있어서의 VH/VL 회합에 영향을 미친다.
일 태양에 있어서, VH와 VL 사이의 회합을 유지하는 데 매우 중요한 아미노산 잔기의 대략 25%가, CDR 내에 있기 때문에, 리간드 결합 도메인과 리간드의 경계면, 또는 항원 결합 도메인과 항원의 경계면에 있다, 즉, CDR 내에 있는 아미노산 잔기가, VH와 VL의 해리를 촉진하기 위해서, 또는 그 사이의 상호작용 혹은 회합을 저감시키기 위해서, 추가적으로 바뀐다. 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인에 대한 리간드 또는 항원의 결합을 보존하기 위해서, 개변용으로 선택되는 아미노산 포지션은, 리간드 또는 항원의 생물학적 활성이 감약되도록, 즉, 프로테아제의 비존재하에서는 그 생물학적 활성을 발휘할 수 없도록, 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인에 대한 리간드 또는 항원의 결합을 파괴해서는 안 된다. 상기와 같은 개변을 위한 CDR 내의 호적한 아미노산 포지션의 스크리닝은, 본 명세서에 기재되는 일반적인 방법의 어느 것에 의해, 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 실시할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 아미노산 개변은, 리간드 결합 도메인과 리간드의 경계면 또는 항원 결합 도메인과 항원의 경계면에 존재하는 적어도 1개의 아미노산의 치환을 포함한다. 바람직한 태양에 있어서, 적어도 1개의 치환은, 포지션 30 및 100a를 포함하고, 특히, 치환은, S30V 및 F100aI로부터 선택된다.
일 태양에 있어서, 아미노산 개변은, FR 영역 내, 및 임의로 CDR 영역 내의 VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환의 조합이다. 바람직한 태양에 있어서, 조합의 치환은, 이하의 군(a) 내지 (cc)로부터 선택된다:
(a) VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(b) VH 상의 Y91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(c) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(d) VH 상의 Y91M, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(e) VH 상의 H91A, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(f) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(g) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(h) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(i) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(j) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(k) VH 상의 V37S, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(l) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(m) VH 상의 L45Q, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(n) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q 및 Y49A;
(o) VH 상의 F100aI, 및 VL 상의 A43Q, L46Q, 및 Y49A;
(p) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(q) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(r) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, A43Q, 및 Y49A;
(s) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, L46Q, 및 Y49A;
(t) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(u) VH 상의 W103I, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(v) VH 상의 W103M, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(w) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(x) VH 상의 W103L, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(y) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A;
(z) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 Y49A 및 Y87L;
(aa) VH 상의 V37S 및 F100aI, 및 VL 상의 S30V, Y49A, 및 Y87L;
(bb) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103M, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A; 및
(cc) VH 상의 V37S, F100aI, 및 W103L, 및 VL 상의 L46Q 및 Y49A.
본 명세서에 있어서, 상기에서 특정된 바와 같은, VH와 VL의 경계면에서 행해지는, 또는 임의로, 리간드 결합 도메인과 리간드의 경계면 또는 항원 결합 도메인과 항원의 경계면에서 행해지는 개변을 포함하는, 1개 또는 복수의 아미노산 개변은, VH와 VL 사이의 회합을 저감시킬 수 있고, 또한 VH 혹은 VL, 또는 VH-리간드 혹은 VL-리간드의, 본 명세서의 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체양 폴리펩타이드로부터의 해리를 촉진하며, 여기에서, 해당 융합 단백질 또는 IgG양 폴리펩타이드는, 프로테아제의 존재하에서 절단 가능한 프로테아제 절단 사이트를 포함한다. 본 명세서는, 본 명세서에 있어서의 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 IL-12 및 IL-222가 융합 단백질, 및 또한, 이하의 특허 출원: WO2018097307, WO2018097308, WO2019107380, WO2019107384, WO2019230866, WO2019230867, WO2019230868, WO2020116498, 및 WO2021149697에 기재되어 있는 바와 같은 다른 2가 융합 단백질도 포함한다. 이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 아미노산 개변은, 특히, IgG 항체양 폴리펩타이드 또는 융합 단백질이, 본 명세서의 IgG 항체양 폴리펩타이드 또는 융합 단백질과 동일하거나 또는 유사한 프레임워크 영역을 포함하는 경우에, 주로 FR에 존재하는 특정된 아미노산 포지션의 고도로 보존된 성질 때문에, 항원 또는 리간드의 동일성과는 관계 없이, 본 명세서의 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체양 폴리펩타이드 또는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질에 있어서의 VH/VL 회합에 영향을 미칠 것이다. VH와 VL의 경계면의 1개 또는 복수의 아미노산 개변, 및 추가적으로, 리간드 결합 도메인과 리간드의 경계면 또는 항원 결합 도메인과 항원의 경계면에서 행해진 개변이, 서로로부터의 해리를 촉진하고, 또한 그 표적 항원 또는 리간드에 대한 결합을 아직 유지할 수 있는 데 충분한지 여부를 식별하기 위해서, 당업자는, 당 기술 분야에서 공지된, 또는 본 명세서에 기재되는 바와 같은 임의의 방법을 이용해도 된다.
VH와 VL의 경계면 내의 선택된 포지션에 도입된 아미노산 개변은, VH와 VL 사이의 회합을, 서로로부터의 해리를 촉진하는 데 충분한 레벨까지 저감시키는 것을, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 검증할 수 있다. 융합 단백질 또는 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 또는 VL의 유리를 검출하는 방법은, SDS-PAGE, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 또는 SPR을 이용한 BIACORE 등의 주지의 방법을 이용하여, 프로테아제 절단의 전 및 후의 융합 단백질, 항체, 또는 항체 단편의 분자량을 비교하는 것에 의해, VH 또는 VL의 방출을 검출하는 방법을 포함한다. BIACORE를 이용하는 어세이에 있어서는, 융합 단백질, 항체, 또는 항체 단편을, 공급원의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화되는 바이오센서 칩인, R-프로틴 A 결합 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM4-ProA/G, BIACORE, Inc.) 상에 고정화한다. 400nM의 농도의 유로키나제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA) 등의 프로테아제를, 어세이 완충액(HBS-EP+, Cytiva)에 있어서 2마이크로 리터/분의 유속, 37℃에서, 1800초의 결합 시간 및 10초의 해리 시간에 걸쳐서 주입한다. 프로테아제 주입전 및 후에 포착된 반응 단위(RU)를 비교한다. 프로테아제 절단의 전 및 후의, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하, 또는 11% 이하, 또는 12% 이하, 또는 13% 이하, 또는 14% 이하, 또는 15% 이하, 또는 16% 이하, 또는 17% 이하, 또는 18% 이하, 또는 19% 이하, 또는 20% 이하, 또는 21% 이하, 또는 22% 이하, 또는 23% 이하, 또는 24% 이하, 또는 25% 이하, 또는 26% 이하, 또는 27% 이하, 또는 28% 이하, 또는 29% 이하, 또는 30% 이하, 또는 31% 이하, 또는 32% 이하, 또는 33% 이하, 또는 34% 이하, 또는 35% 이하, 또는 36% 이하, 또는 37% 이하, 또는 38% 이하, 또는 39% 이하, 또는 40% 이하의 반응 단위의 저감 퍼센티지는, 융합 단백질, 항체, 또는 항체 단편으로부터의 단편의 해리를 나타낸다. 바람직한 태양에 있어서, 10% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 20% 이하의 해리는, 본 발명의 IgG양 항체 분자 또는 IgG 항체로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 15.8% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 36.8% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH-리간드 또는 VL-리간드의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 30% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH-리간드 또는 VL-리간드의 완전한 해리를 나타낸다.
이론에 속박되는 것을 바라지 않지만, 전술한 VH와 VL의 경계면의 아미노산 개변은, VL과 회합하는 VH를 포함하는 임의의 분자 형태에 있어서, VL로부터의 VH의 해리, 또는 그 역을 촉진할 것이 기대된다. 이 목적으로, 기재되는 VH와 VL의 경계면의 아미노산 개변은, 상기의 리간드 결합 도메인을 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질, 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체양 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질, 항원 결합 도메인을 포함하는 전장 IgG 항체를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질, 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, 및 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편에 적용 가능하다.
리간드 결합 도메인을 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질의 예에 있어서, 프로테아제 절단 시에, VH의 유리는, 리간드 결합 부분/분자의 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합을 파괴하여, 리간드가 자유롭게 해리되어 그 수용체에 결합하는 것을 가능하게 하고, 그에 따라 수용체 시그널 전달을 활성화한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체양 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질의 예에 있어서, 프로테아제 절단 시에, VH의 유리는, 항원 가변 영역의 항원 결합 도메인에 대한 리간드의 결합을 파괴하여, 리간드가 자유롭게 해리되어 그 수용체에 결합하는 것을 가능하게 하고, 그에 따라 수용체 시그널 전달을 활성화한다. 상기의 예의 몇몇 태양에 있어서, 리간드는, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 Fc 영역 또는 항체 정상 영역에 결합하면서, 자유롭게 수용체에 결합한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 전장 IgG 항체를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질, 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체의 예에 있어서, 프로테아제 절단 시에, VH의 유리는, 가변 영역에 대한 리간드의 결합을 파괴하여, 리간드가 자유롭게 해리되어 그 수용체에 결합하는 것을 가능하게 하고, 그에 따라 수용체 시그널 전달을 활성화한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편의 예에 있어서, 프로테아제 절단 시에, VH의 일부분과 VL의 일부분 사이의 회합의 저감이 있어, VH와 VL의 완전한 해리를 결과로서 가져온다. 이 해리는, 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 리간드의 결합을 파괴하여, 리간드가 자유롭게 해리되어 그 수용체에 결합하는 것을 가능하게 하고, 그에 따라 수용체 시그널 전달을 활성화한다. 몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 절단 시에, 리간드는, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역으로부터 해리되고, N말단 가변 도메인, VH 또는 VL의 어느 것에 결합하면서, 자유롭게 그 수용체에 결합한다. 몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 절단 시에, 리간드는, 리간드 결합 도메인으로부터 해리되고, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 Fc 영역 또는 정상 영역에 결합하면서, 자유롭게 그 수용체에 결합한다. 항체 단편을 포함하는 임의의 분자 형태에 있어서의, 상기의 VH와 VL의 경계 사이의 아미노산 개변은, 해당 분자 형태가, 서로 회합하는 VH 및 VL을 포함하는 한, 한쪽의 다른 쪽으로부터의 해리를 촉진하는 것이, 추가로 고려된다. 따라서, 본 발명은, 그와 같은 아미노산 개변을 포함하는 분자 형태를 제조하는 방법, 및 그 VH와 VL의 해리를 촉진하는 방법에 있어서의 전술한 분자 형태의 어느 것의 사용을 포함한다. 더욱이, 본 발명에 관련되는 당업자는, 예를 들어, 항체 VH와 항체 VL을 스위칭하는 것에 의해, 항체 VH, 항체 VL, 및 임의로 항체 정상 영역을 포함하는 분자의 형태를 변경할 수 있다. 그와 같은 분자 형태는, 본 발명의 범위로부터 일탈하지 않는다.
스크리닝하는 방법
본 발명은 또한, 리간드 결합 도메인을 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질, 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체양 폴리펩타이드를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질, 항원 결합 도메인을 포함하는 전장 IgG 항체를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질, 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편을 포함하는, 상기의 분자 형태에 있어서의 아미노산 개변을 특정하기 위해서 스크리닝하는 방법을 포함하고, 본 방법은 이하의 공정:
(a) 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 도메인 또는 VL 도메인의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 변이 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 변이를, 해당 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 변이를, 리간드 또는 항원과 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 프로테아제의 비존재하에서의 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제1 반응 단위(RU1)를 측정하는 공정;
(b) 프로테아제의 존재하에서의 동일한 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제2 반응 단위(RU2)를 측정하는 공정;
(c) 프로테아제 절단의 전 및 후에, RU1과 RU2 사이의 차의 퍼센티지가, 1% 이하이거나, 또는 2% 이하이거나, 또는 3% 이하이거나, 또는 4% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 6% 이하이거나, 또는 7% 이하이거나, 또는 8% 이하이거나, 또는 9% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 11% 이하이거나, 또는 12% 이하이거나, 또는 13% 이하이거나, 또는 14% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 16% 이하이거나, 또는 17% 이하이거나, 또는 18% 이하이거나, 또는 19% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 21% 이하이거나, 또는 22% 이하이거나, 또는 23% 이하이거나, 또는 24% 이하이거나, 또는 25% 이하이거나, 또는 26% 이하이거나, 또는 27% 이하이거나, 또는 28% 이하이거나, 또는 29% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 31% 이하이거나, 또는 32% 이하이거나, 또는 33% 이하이거나, 또는 34% 이하이거나, 또는 35% 이하이거나, 또는 36% 이하이거나, 또는 37% 이하이거나, 또는 38% 이하이거나, 또는 39% 이하이거나, 또는 40% 이하인 경우에는, 공정(a)에 있어서의 변이를 선택하는 공정
을 포함하고,
반응 단위(RU)의 저감 퍼센티지가, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 유리에 기인하는 분자량의 저감 퍼센티지에 대응한다.
본 발명은 또한, VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 변이를 갖는, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 융합 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편을 스크리닝하는 방법도 포함하고, 본 방법은, 표면 플라즈마 공명(SPR)하에서, 프로테아제 절단의 전 및 후에 상기 융합 단백질의 어느 것에 대해 기록된 최대 반응 단위를 비교하는 공정, 및, 프로테아제 절단의 전 및 후에, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하, 또는 11% 이하, 또는 12% 이하, 또는 13% 이하, 또는 14% 이하, 또는 15% 이하, 또는 16% 이하, 또는 17% 이하, 또는 18% 이하, 또는 19% 이하, 또는 20% 이하, 또는 21% 이하, 또는 22% 이하, 또는 23% 이하, 또는 24% 이하, 또는 25% 이하, 또는 26% 이하, 또는 27% 이하, 또는 28% 이하, 또는 29% 이하, 또는 30% 이하, 또는 31% 이하, 또는 32% 이하, 또는 33% 이하, 또는 34% 이하, 또는 35% 이하, 또는 36% 이하, 또는 37% 이하, 또는 38% 이하, 또는 39% 이하, 또는 40% 이하의 반응 단위의 저감을 결과로서 가져오는 변이를 선택하는 공정을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하에 대응하는 반응 단위의 저감 퍼센티지는, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 융합 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편으로부터의 VH 또는 VL의 해리에 대응한다. 몇몇 태양에 있어서, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하, 또는 11% 이하, 또는 12% 이하, 또는 13% 이하, 또는 14% 이하, 또는 15% 이하, 또는 16% 이하, 또는 17% 이하, 또는 18% 이하, 또는 19% 이하, 또는 20% 이하에 대응하는 반응 단위의 저감 퍼센티지는, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 융합 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편으로부터의 VH 또는 VL의 해리에 대응한다. 바람직한 태양에 있어서, 10% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 20% 이하의 해리는, 본 발명의 IgG양 항체 분자 또는 IgG 항체로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체에 있어서, 15.8% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 36.8% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH-리간드 또는 VL-리간드의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 30% 이하의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH-리간드 또는 VL-리간드의 완전한 해리를 나타낸다.
본 발명은 또한, VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 변이를 갖는, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 융합 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편을 스크리닝하는 방법도 포함하고, 본 방법은, 이하의 공정:
(a) 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 도메인 또는 VL 도메인의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 변이 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 변이를, 해당 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 변이를, 리간드 또는 항원과 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 프로테아제 절단 전의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제1 세트를, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)에 제공하여, 피크 A1(제1 피크)을 포함하는 제1 크로마토그래프를 얻는 공정;
(c) 프로테아제 절단 후의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 제2 세트를, SEC에 제공하여, 피크 A2(제2 피크) 및 추가적인 피크 A2'(제3 피크)(A2'는, A2의 숄더 피크이다)를 포함하는 제2 크로마토그래프를 얻는 공정;
(d) 피크 A2'(제3 피크)의 곡선하 면적(AUC) 나누기 피크 A1(제1 피크)의 AUC로부터 결과로서 생긴 퍼센티지를 결정하는 공정;
(e) 공정(d)에 있어서 얻어진 퍼센티지가, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하, 또는 11% 이하, 또는 12% 이하, 또는 13% 이하, 또는 14% 이하, 또는 15% 이하, 또는 16% 이하, 또는 17% 이하, 또는 18% 이하, 또는 19% 이하, 또는 20% 이하, 또는 21% 이하, 또는 22% 이하, 또는 23% 이하, 또는 24% 이하, 또는 25% 이하, 또는 26% 이하, 또는 27% 이하, 또는 28% 이하, 또는 29% 이하, 또는 30% 이하, 또는 31% 이하, 또는 32% 이하, 또는 33% 이하, 또는 34% 이하, 또는 35% 이하, 또는 36% 이하, 또는 37% 이하, 또는 38% 이하, 또는 39% 이하, 또는 40% 이하에 대응하는, 공정(a)에 있어서의 변이를 선택하는 공정
을 포함하고,
(d)에 있어서 결정된 퍼센티지가, 프로테아제 절단 후에 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 해리된 VH 도메인 또는 VL 도메인의 퍼센티지에 대응한다.
몇몇 태양에 있어서, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하에 대응하는, 공정(d)에 있어서 결정된 반응 단위의 퍼센티지는, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 융합 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편으로부터의 VH 또는 VL의 해리에 대응한다. 몇몇 태양에 있어서, 1% 이하, 또는 2% 이하, 또는 3% 이하, 또는 4% 이하, 또는 5% 이하, 또는 6% 이하, 또는 7% 이하, 또는 8% 이하, 또는 9% 이하, 또는 10% 이하, 또는 11% 이하, 또는 12% 이하, 또는 13% 이하, 또는 14% 이하, 또는 15% 이하, 또는 16% 이하, 또는 17% 이하, 또는 18% 이하, 또는 19% 이하, 또는 20% 이하, 또는 21% 이하, 또는 22% 이하, 또는 23% 이하, 또는 24% 이하, 또는 25% 이하, 또는 26% 이하, 또는 27% 이하, 또는 28% 이하, 또는 29% 이하, 또는 30% 이하, 또는 31% 이하, 또는 32% 이하, 또는 33% 이하, 또는 34% 이하, 또는 35% 이하에 대응하는, 공정(d)에 있어서 결정된 반응 단위의 퍼센티지는, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 융합 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편으로부터의 VH 또는 VL의 해리에 대응한다. 바람직한 태양에 있어서, 10% 이하 또는 약 10%의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 20% 이하 또는 약 20%의 해리는, 본 발명의 IgG양 항체 분자 또는 IgG 항체로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 15.8% 이하 또는 약 15.8%의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH 또는 VL의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 36.8% 이하 또는 약 36.8%의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH-리간드 또는 VL-리간드의 완전한 해리를 나타낸다. 대체의 태양에 있어서, 30% 이하 또는 약 30%의 해리는, 본 발명의 2가 융합 폴리펩타이드로부터의 VH-리간드 또는 VL-리간드의 완전한 해리를 나타낸다.
본 명세서에 기재되는 스크리닝하는 방법은, 제1 상태 및 제2 상태에서의, 즉, 프로테아제 절단의 전 및 후에서의, 본 명세서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성의 검증의 공정을 추가로 포함한다. 생물학적 활성의 검증의 공정은, 프로테아제 절단의 전 및 후에서 리간드 또는 항원의 생물학적 활성을 평가하기 위한, 본 명세서에 기재되거나, 또는 실시예에 상술되거나, 또는 당업자에 의해 호적하게 이용되는 생물학적 어세이를 포함한다.
본 명세서에 기재되는 스크리닝하는 방법은, 이하의 공정을 추가로 포함한다:
리간드 또는 항원의 소여의 농도, 및 리간드 또는 항원의 해당 농도에 대응하는 본 명세서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 농도에 대해;
I. 프로테아제 절단 전에, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정;
II. 프로테아제 절단 후에, 공정 I에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정;
III. 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, 공정 I에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 개변을, 리간드 또는 항원과 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정으로서, 해당 아미노산 개변이, 프로테아제의 존재하에서의 프로테아제 절단 시에, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 도메인 또는 VL 도메인의 해리를 촉진하는, 공정;
IV. 프로테아제 절단 전에, 공정 III에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정;
V. 프로테아제 절단 후에, 공정 III에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 공정;
VI. 공정(IV)의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성이, 공정(V)의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성보다도 낮은, 아미노산 개변을 선택하는 공정;
VII. 공정(V)에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성이, 공정(IV)에 있어서의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성보다도 높은, 아미노산 개변을 선택하는 공정, 및/혹은
VIII. (I)과 (II) 사이의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성의 생물학적 활성차인 "V1", 및 (IV)와 (V) 사이의 융합 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성의 생물학적 활성차인 "V2"를 결정하는 공정; 및
IX. V2의 값이 V1보다도 높은, 아미노산 개변을 선택하는 공정.
혐의의 회피를 위해서 말하면, 공정 III에 있어서 도입될 수 있는 아미노산 개변은, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은, 또는 상기에 나타나는 공정(a), 및/혹은 (b), 및/혹은 (c), 및/혹은 (d), 및/혹은 (e)에 따라 파생되는, 융합 단백질, IgG 항체양 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편에 있어서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 개변의 어느 것을 포함한다. 더욱이, 리간드 또는 항원의 소여의 농도, 및 본 명세서의 융합 단백질 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드의 농도가, 그 대응하는 리간드 또는 항원의 것과 동일한 농도에 대응하는지 여부의 판정은, 실시예에 상술되는 바와 같이 또는 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같이, 융합 단백질 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 평가하는 호적한 생물학적 어세이를 행하는 것에 의해, 용이하게 판정할 수 있다.
본 발명은, VH와 VL의 경계면의 아미노산 개변을 포함하는, 상기 태양의 어느 것에 기재되는 바와 같은 융합 단백질, 폴리펩타이드, 항체, 또는 항체 단편에 있어서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는, 아미노산 개변의 라이브러리를 추가로 포함한다. 라이브러리는, VH 상의 포지션 Q39D, W47A, W47L, W47M, Y91A, Y91L, Y91M, H91A, W103A, W103L, W103M, V37S, V37Q, G44Q, L45A, 및 L45Q, 또는 VL 상의 포지션 R38E, Y49A, Y87A, Y87L, Y87M, F98A, F98L, F98M, A43Q, P44A, P44S, P44Q, L46E, 및 L46Q(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 아미노산 치환의 어느 것을 포함한다. 라이브러리는, VH 상의 포지션 Q39D, W47A, W47L, W47M, Y91A, Y91L, Y91M, H91A, W103A, W103L, W103M, V37S, V37Q, G44Q, L45A, 및 L45Q로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 등의 아미노산 치환, 및/또는 VL 상의 포지션 R38E, Y49A, Y87A, Y87L, Y87M, F98A, F98L, F98M, A43Q, P44A, P44S, P44Q, L46E, 및 L46Q(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 대응하는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 등의 아미노산 치환의 선택군을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가적인 국면에 있어서, 라이브러리는, 포지션 30 및 100a(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함한다. 추가적인 국면에 있어서, 치환은, S30V 및 F100aI로부터 선택된다. 라이브러리는, 전술한 치환으로 한정되지 않지만, 본 명세서에, 예를 들어, 본 명세서의 이 "스크리닝하는 방법"의 섹션에 기재되는 스크리닝하는 방법에 있어서 나타나는 공정에 따라 파생될 수 있는 임의의 치환을, 비한정적으로 포함하는 것이 주목되어야 한다.
리간드
본 명세서에 있어서, 용어 "리간드 부분" 또는 "리간드 분자"는, 생물 활성을 갖는 부분 또는 분자를 말한다. 본 명세서에 있어서, "리간드 부분" 및 "리간드 분자"는, 간단히 "리간드"라고 해도 된다. 생물 활성을 갖는 분자는, 통상, 세포 표면 상의 수용체와 상호작용하여, 그것에 의해 생물학적인 자극, 저해, 또는 다른 양식으로의 조절을 행하는 것에 의해 기능한다. 이들 기능은, 통상, 수용체를 보지하는 세포의 세포내 시그널 전달 경로에 관여한다고 생각된다.
본 명세서에 있어서, 리간드에는, 본 명세서에 있어서 "결합 파트너"라고도 칭해지는 생체 분자와의 상호작용을 통해 생물 활성을 발휘하는 소망의 분자가 포함된다. 예를 들어, 리간드는, 수용체와 상호작용하는 분자를 의미할 뿐만 아니라, 분자와의 상호작용을 통해 생물 활성을 발휘하는 분자, 예를 들어, 분자와 상호작용하는 수용체, 또는 그 결합 단편도 포함한다. 예를 들어, 수용체로서 공지된 단백질의 리간드 결합 부위, 및 수용체의 다른 분자와의 상호작용 부위를 함유하는 단백질은, 본 발명에 의한 리간드에 포함된다. 구체적으로는, 예를 들어, 가용성 수용체, 수용체의 가용성 단편, 막관통 수용체의 세포외 도메인, 및 그들을 함유하는 폴리펩타이드는, 본 발명에 의한 리간드에 포함된다.
본 발명의 리간드는, 통상, 1개 또는 복수의 결합 파트너에 대한 결합에 의해, 바람직한 생물 활성을 발휘할 수 있다. 리간드의 결합 파트너는, 세포외, 세포내, 또는 막관통 단백질일 수 있다. 일 태양에 있어서, 리간드의 결합 파트너는, 세포외 단백질, 예를 들어, 가용성 수용체이다. 다른 태양에 있어서, 리간드의 결합 파트너는, 막결합형 수용체이다. 본 발명의 리간드는, 10마이크로몰 농도(μM), 1마이크로몰 농도, 100nM, 50nM, 10nM, 5nM, 1nM, 500pM, 400pM, 350pM, 300pM, 250pM, 200pM, 150pM, 100pM, 50pM, 25pM, 10pM, 5pM, 1pM, 0.5pM, 혹은 0.1pM, 또는 그보다도 작은 해리 상수(KD)로, 결합 파트너에 특이적으로 결합할 수 있다.
생물 활성을 갖는 분자의 예에는, 사이토카인, 케모카인, 폴리펩타이드 호르몬, 성장 인자, 아포토시스 유도 인자, PAMPs, DAMPs, 핵산, 및 그 단편이 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다. 구체적인 태양에 있어서, 인터류킨, 인터페론, 조혈 인자, TNF 슈퍼패밀리의 멤버, 케모카인, 세포 증식 인자, TGF-β 패밀리의 멤버, 마이오카인, 아디포카인, 또는 신경 영양 인자를, 리간드로서 이용할 수 있다. 보다 구체적인 태양에 있어서, CXCL9, CXCL10, CXCL11, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IFN-α, IFN-β, IFN-g, MIG, I-TAC, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1R1(인터류킨-1 수용체, I형), IL-1R2(인터류킨-1 수용체, II형), IL-1RAcP(인터류킨-1 수용체 액세서리 단백질), 또는 IL-1Ra(단백질 액세션 번호 NP_776214, mRNA 액세션 번호 NM_173842.2)를, 리간드로서 이용할 수 있다. 본 개시에 있어서 이용되는 리간드에 대해, 제한은 없다. 몇몇 태양에 있어서, 리간드는, 야생형(또는 천연에 존재하는) 리간드여도 되고, 또는 임의의 변이를 갖는 변이체 리간드여도 된다. 헤테로이량체 사이토카인인 IL-12 또는 IL-22의 경우에는, 몇몇 태양에 있어서, 리간드 IL-12는, 야생형(또는 천연에 존재하는) IL-12 혹은 IL-22여도 되고, 또는 임의의 변이를 갖는 변이체 IL-12 혹은 IL-22여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, IL-12는, p35와 p40이 연결되어 단쇄에 포함되어 있는, 단쇄 IL-12여도 된다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드는, 사이토카인이다.
사이토카인은, 면역 조절 프로세스 및 염증 프로세스에 관여하는 분비형 세포 시그널 전달 단백질의 패밀리이다. 이들 사이토카인은, 신경계의 신경교 세포에 의해, 및 면역계가 많은 세포에 의해 분비된다. 사이토카인은, 단백질, 펩타이드, 및 당단백질로 분류할 수 있고, 큰 다양한 조절 인자 패밀리를 포함한다.
사이토카인은, 그 세포 표면 수용체에 대한 결합을 통해 세포내 시그널 전달을 유도하고, 그것에 의해, 효소 활성의 조절, 몇몇 유전자 및 그 전사 인자의 상방 제어 혹은 하방 제어, 또는 피드백 저해 등을 야기할 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 사이토카인에게는, 인터류킨(IL) 및 인터페론(IFN) 등의 면역 조절 인자가 포함된다. 적합한 사이토카인에는, 이하의 타입의 하나 또는 복수에서 유래하는 단백질이 함유될 수 있다: 4개의 α-헬릭스 번들 패밀리(IL-2 서브패밀리, IFN 서브패밀리, 및 IL-10 서브패밀리를 포함한다); IL-1 패밀리(IL-1 및 IL-8을 포함한다); 및 IL-17 패밀리. 사이토카인에는 또한, 세포성 면역 응답을 증강하는 1형 사이토카인(예를 들어, IFN-γ 및 TGF-β), 또는 항체 반응에 유리하게 작용하는 2형 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-10, 및 IL-13)으로 분류되는 것이 포함될 수 있다.
인터류킨 12(IL-12)는, 다이설파이드 결합된 30kD와 40kD의 글리코실화 폴리펩타이드쇄로 이루어지는 헤테로이량체의 사이토카인이다(액세션 번호 NP_000873.2, P29459, 및 액세션 번호 NP_002178.2, P29460). 사이토카인은, 수상 세포, 단구, 매크로파지, B 세포, 랑게르한스 세포, 및 각화 세포, 및 내추럴 킬러(NK) 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 의해 합성되고, 그 다음에 분비된다. IL-12는, 여러 가지 생물학적 프로세스를 매개하여, NK 세포 자극 인자(NKSF), T 세포 자극 인자, 세포상해성 T 림프구 성숙 인자, 및 EBV에 의해 형질 전환된 B 세포주 인자로서 기술되어 왔다.
인터류킨 12는, 세포(예를 들어, T 세포 및 NK 세포)의 세포질막 상에 발현한 IL-12 수용체에 결합하여, 그것에 의해 생물학적 프로세스를 변경할(예를 들어, 개시하거나 또는 차단할) 수 있다. 예를 들어, IL-12 수용체에 대한 IL-12의 결합은, 미리 활성화된 T 세포 및 NK 세포의 증식을 자극하고, 세포상해성 T 세포(CTL), NK 세포, 및 LAK(림포카인 활성화 킬러) 세포의 세포 용해 활성을 촉진하고, T 세포 및 NK 세포에 의한 γ 인터페론(IFNγ)의 산생을 유도하고, 또한 나이브한 Th0 세포의 Th1 세포에의 분화를 유도하여 IFNγ 및 IL-2를 산생한다. 특히, IL-12는, 세포 용해 세포(예를 들어, NK 및 CTL)의 산생 및 세포성 면역 응답(예를 들어, Th1 세포 매개성 면역 응답)을 설정하는 데 절대적으로 필요하다. 따라서, IL-12는, 방어 면역(예를 들어, 감염증의 근절) 및 병리학적 면역 응답(예를 들어, 자기면역)의 양쪽 모두를 생성하는 데, 및 조절하는 데 절대적으로 필요하다.
IL-12의 생리 활성을 측정하는 방법의 예에는, IL-12의 세포 증식 활성을 측정하는 방법, STAT4 리포터 어세이, IL-12에 의한 세포 활성화(세포 표면 마커 발현, 사이토카인 산생 등)를 측정하는 방법, 및 IL-12에 의한 세포 분화의 촉진을 측정하는 방법이 포함된다.
인터류킨 22(IL-22)(액세션 번호 NP_065386.1, Q9GZX6)는, 사이토카인의 IL-10 패밀리의 멤버이다. 이것은, T 세포, NKT 세포, 3형 자연 림프구(ILC3) 등의 면역 세포에 의해, 및 보다 적은 정도이지만 호중구 및 매크로파지에 의해 분비된다. IL-22는, IL-22R1 및 IL-10R2로 구성되는 헤테로이량체인, 그 수용체 IL-22R에 결합한다. IL-22R은 주로, 상피 세포 및 간질 세포 등의 비조혈 세포 상에 발현하고 있다. IL-22 활성은, IL-22R1에 대해서 높은 구조적 상동성을 갖는 분비 단백질인 IL-22 결합 단백질(IL-22BP; IL-22RA2로서도 알려져 있다)에 의해 조절된다. IL-22BP는, 높은 어피니티로 IL-22에 결합하여, IL-22가 IL-22R1과 상호작용하는 것을 차단한다.
IL-22 수용체에 대한 IL-22의 결합은, JAK1 및 TYK2 키나제의 활성화를 가져오고, 이것은 다음에, STAT3 시그널 전달의 활성화를 가져온다. IL-22는, 상피 세포 기능에 있어서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 장관에 있어서, IL-22는, 장관 상피 세포의 증식, 점액 분비, 및 항미생물 펩타이드 분비를 자극하는 것에 의해, 장의 배리어의 완전성을 촉진한다. 간장에 있어서, IL-22는, 간 손상 중의 간 세포에 대해서 생존 인자로서 작용하고, 또한, 간 재생을 위해서 증식하도록 간 세포를 자극한다.
IL-22의 생리 활성을 측정하는 방법의 예에는, IL-22의 세포 증식 활성을 측정하는 방법, STAT3 리포터 어세이, 및 IL-22에 의한 세포 활성화(세포 표면 마커 발현, 사이토카인 산생 등)를 측정하는 방법이 포함된다.
인터류킨 2(IL-2)는, 단량체 사이토카인이며, 주로, 활성화된 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포에 의해 분비된다. IL-2는, α, β, 및 γ의 3개의 서브유닛으로 이루어지는, 그 수용체(IL-2R)에 결합한다. IL-2R β 및 γ는, 시그널 전달에 관여하고, IL-2R α 및 β는, 결합에 관여한다. 3개의 서브유닛 모두가, 고어피니티의 사이토카인-수용체 복합체에 중요하다. IL-2는, 이펙터 T 세포 및 제어성 T 세포의 양쪽 모두에 결합하여 활성화하기 때문에, 면역 응답의 촉진 및 조절의 양쪽 모두를 위해서 불가결하다.
IL-2의 생리 활성을 측정하는 방법의 예에는, IL-2의 세포 증식 활성을 측정하는 방법, IL-2에 의한 세포 활성화(세포 표면 마커 발현, 사이토카인 산생 등)를 측정하는 방법, 및 IL-2에 의한 세포 분화의 촉진을 측정하는 방법이 포함된다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드는, 케모카인이다. 케모카인은 일반적으로, 면역 이펙터 세포를 케모카인 발현 부위에 동원하는 화학 유인 물질로서 작용한다. 이것은, 다른 면역계 성분을 치료 부위에 동원할 목적으로, 특정의 케모카인 유전자를, 예를 들어, 사이토카인 유전자와 함께 발현시키기 위해서 유익하다고 생각된다. 그와 같은 케모카인에는, CXCL10, RANTES, MCAF, MIP1-α, 및 MIP1-β가 포함된다. 당업자는, 어느 특정의 사이토카인도 또한, 화학 유인 작용을 가짐을 알고 있고, 그와 같은 사이토카인이, "케모카인"이라고 하는 용어에 의해 분류될 수 있음을 인정할 것이다.
케모카인은, 백혈구의 유주(migration)를 유도하는 그 능력을 원래 특징으로 하는, 7 내지 16kDa의 균질한 혈청 단백질의 패밀리이다. 케모카인의 대부분은, 4개의 특징적인 시스테인(Cys)을 갖고, 최초의 2개의 시스테인에 의해 형성되는 모티프에 따라, CXC 또는 알파, CC 또는 베타, C 또는 감마, 및 CX3C 또는 델타의 케모카인 클래스로 분류된다. 2개의 다이설파이드 결합이, 제1과 제3 시스테인 사이, 및 제2와 제4 시스테인 사이에 형성된다. 일반적으로, 다이설파이드 가교는, 필요하다고 생각되고 있다. Clark-Lewis 및 공동 연구자 등은, 적어도 CXCL10의 케모카인 활성에 대해, 다이설파이드 결합이 매우 중요함을 보고하고 있다(Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem. 269: 16075-16081, 1994). 4개의 시스테인을 갖는 것에 대한 유일한 예외는, 2개의 시스테인 잔기만을 갖는 림포택틴이다. 따라서, 림포택틴은, 유일한 다이설파이드 결합에 의해, 그 기능적 구조를 어떻게든 유지하고 있다. CXC 또는 알파의 서브패밀리는, 제1 시스테인에 선행하는 ELR 모티프(Glu-Leu-Arg)의 존재에 따라, 2개의 군: ELR-CXC 케모카인 및 비ELR-CXC 케모카인으로 추가로 분류된다(예를 들어, Clark-Lewis, 상기; 및 Belperio et al., "CXC Chemokines in Angiogenesis", J. Leukoc. Biol. 68: 1-8, 2000 참조).
인터페론 유도성 단백질-10(IP-10 또는 CXCL10)(액세션 번호 NP_001556.2, P02778)은, 인터페론-γ 및 TNF-α에 의해 유도되어, 각화 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 및 단구에 의해 산생된다. IP-10은, 조직의 염증 부위에의 활성화 T 세포의 동원에 있어서 역할을 한다고 생각되고 있다(Dufour, et al., "IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10) -deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking", J Immunol., 168: 3195-204, 2002). 더욱이, IP-10은, 과민 반응에 있어서 역할을 할 가능성이 있다. IP-10은 또한, 염증성 탈골수성 뉴로파시의 발생에 있어서도 역할을 할 가능성이 있다(Kieseier, et al., "Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10", Brain 125: 823-34, 2002).
연구에 의해, IP-10이, 이식에 계속되는 줄기세포의 생착(Nagasawa, T., Int. J. Hematol. 72: 408-11, 2000), 줄기세포의 동원(Gazitt, Y., J. Hematother Stem Cell Res 10: 229-36, 2001; 및 Hattori et al., Blood 97: 3354-59, 2001) 및 항종양 초면역성(hyperimmunity)(Nomura et al., Int. J. Cancer 91: 597-606, 2001; 및 Mach and Dranoff, Curr. Opin. Immunol. 12:571-75, 2000)에 있어서 유용할 가능성이 나타나 있다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 이전의 보고에서는, 케모카인의 생물 활성이 논의되어 있다(Bruce, L. et al., "Radiolabeled Chemokine binding assays", Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp. 129-134; Raphaele, B. et al. "Calcium Mobilization", Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp. 143-148; 및 Paul D. Ponath et al., "Transwell Chemotaxis", Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp. 113-120 Humana Press. Totowa, New Jersey).
CXCL10의 생물 활성의 예에는, CXCL10 수용체(CXCR3)에 대한 결합, CXCL10에 의해 유도되는 칼슘류, CXCL10에 의해 유도되는 세포 주화성, 글리코사미노글리칸에 대한 CXCL10의 결합, 및 CXCL10 올리고머화가 포함된다. CXCL10의 생리 활성을 측정하는 방법의 예에는, CXCL10의 세포 주화 활성을 측정하는 방법, CXCR3을 안정적으로 발현하는 세포주를 이용한 리포터 어세이(PLoS One. 2010 Sep 13; 5(9): e12700 참조), 및 GPCR 시그널 전달의 초기에 유도되는 B-아레스틴 점증을 이용한 PathHunter(상표) β-아레스틴 점증 어세이가 포함된다.
프로그램 세포사 1(PD-1) 단백질은, CD28 패밀리의 수용체의 억제성 멤버이다. CD28 패밀리에는, CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA도 또한 포함된다. PD-1은, 활성화된 B 세포, T 세포, 및 골수 세포 상에서 발현한다(Okazaki et al., (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; 및 Bennett et al., (2003) J Immunol 170: 711-8). 패밀리의 최초의 멤버인 CD28 및 ICOS는, 모노클로날 항체 첨가 후의 T 세포 증식의 상승에 대한 기능적 영향에 기초하여 발견되었다(Hutloff et al., (1999) Nature 397: 263-266; 및 Hansen et al., (1980) Immunogenics 10: 247-260). PD-1은, 아포토시스 세포에 있어서의 축차적 발현의 스크리닝에 의해 발견되었다(Ishida et al., (1992) EMBO J 11: 3887-95). 패밀리의 다른 멤버인 CTLA-4 및 BTLA는, 각각, 세포상해성 T 림프구 및 TH1 세포에 있어서의 축차적 발현의 스크리닝에 의해 발견되었다. CD28, ICOS, 및 CTLA-4는 모두, 호모이량체화를 가능하게 하는, 짝을 이루고 있지 않은 시스테인 잔기를 갖는다. 대조적으로, PD-1은, 단량체로서 존재한다고 생각되고 있고, CD28 패밀리의 다른 멤버에 특징적인 짝을 이루고 있지 않은 시스테인 잔기가 결여되어 있다.
PD-1 유전자는, Ig 슈퍼패밀리의 일부인 55kDa의 I형 막 관통 단백질을 코딩한다. PD-1은, 막 근위 면역 수용체 티로신 억제 모티프(ITIM) 및 막 원위 티로신 베이스 스위치 모티프(ITSM)를 함유한다. PD-1은, 구조적으로 CTLA-4와 유사하지만, B7-1 및 B7-2 결합에 중요한 MYPPPY 모티프(서열 번호: 159)가 결여되어 있다. PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2가 동정되어 있고, PD-1에 대한 결합 시에 T 세포 활성화를 음으로 조절함이 나타나 있다(Freeman et al., (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al., (2001) Nat Immunol 2: 261-8; 및 Carter et al., (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). PD-L1 및 PD-L2는 둘 다, PD-1에 결합하지만, CD28 패밀리의 다른 멤버에는 결합하지 않는 B7 호몰로그이다. PD-1 리간드의 하나인 PD-L1은, 여러 가지 인간 암에 있어서 풍부하다(Dong et al., (2002) Nat. Med. 8: 787-9). PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용은, 종양 침윤 림프구의 감소, T 세포 수용체 매개성 증식의 저감, 및 암성 세포에 의한 면역 회피를 결과로서 가져온다(Dong et al., (2003) J. Mol. Med. 81: 281-7; Blank et al., (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314; 및 Konishi et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10: 5094-100). 면역 억제는, PD-1과 PD-L1의 국소적 상호작용의 저해에 의해 역전시킬 수 있고, 이 효과는, PD-2와 PD-L2의 상호작용도 또한 저해될 때에 상가적(相加的)이다(Iwai et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 12293-7; 및 Brown et al., (2003) J. Immunol. 170: 1257-66).
PD-1은, 활성화된 B 세포, T 세포, 및 골수 세포 상에서 발현하는 CD28 패밀리의 억제성 멤버이다. PD-1이 결손된 동물은, 자기면역성 심근증, 및 관절염 및 신장염을 수반하는 루푸스양 증후군을 포함하는, 여러 가지 자기면역성 표현형을 발증한다(Nishimura et al., (1999) Immunity 11: 141-51; 및 Nishimura et al., (2001) Science 291: 319-22). PD-1은, 더욱이, 자기면역성 뇌척수염, 전신성 에리테마토데스, 이식편대숙주병(GVHD), I형 진성 당뇨병, 및 관절 류머티즘에 있어서 중요한 역할을 함이 발견되어 있다(Salama et al., (2003) J Exp Med 198: 71-78; Prokunia and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13: R143; 및 Nielsen et al., (2004) Lupus 13: 510). 마우스 B 세포 종양주에 있어서, PD-1의 ITSM은, BCR 매개성의 Ca2+류 및 하류 이펙터 분자의 티로신 인산화를 저해하는 데 불가결함이 나타나 있다(Okazaki et al., (2001) PNAS 98: 13866-71).
몇몇 태양에 있어서, 리간드는, 야생형(또는 천연에 존재하는) 리간드여도 되고, 또는 임의의 변이를 갖는 변이체 리간드여도 된다. 헤테로이량체 사이토카인인 IL-12의 경우에는, 몇몇 태양에 있어서, 리간드 IL-12는, 야생형(또는 천연에 존재하는) IL-12여도 되고, 또는 임의의 변이를 갖는 변이체 IL-12여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, IL-12는, p35와 p40이 연결되어 단쇄에 포함되어 있는, 단쇄 IL-12여도 된다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-12이며, IL-12는, IL-12의 p35 서브유닛 또는 IL-12의 p40 서브유닛에 부가된 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 아미노산 잔기와 접속되어 있다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 부분/분자는 IL-12이며, IL-12는, IL-12의 p35 서브유닛 또는 IL-12의 p40 서브유닛의 N말단에 부가된 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 결합 부분/분자의 C말단 아미노산 잔기와 접속되어 있다. 동일한 것이, IL-22 등을 포함하는, 일반적인 또는 본 명세서에 기재되는 바와 같은 임의의 리간드에 적용된다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 사이토카인 개변체, 케모카인 개변체 등(예를 들어, Annu Rev Immunol. 2015; 33: 139-67), 또는 개변체를 함유하는 융합 단백질(예를 들어, Stem Cells Transl Med. 2015 Jan; 4 (1): 66-73)을, 리간드로서 이용할 수 있다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드는, CXCL9, CXCL10, CXCL11, PD-1, IL-2, IL-12, IL-22, IL-6R, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra로부터 선택된다. CXCL10, PD-1, IL-2, IL-12, IL-22, IL-6R, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra는, 각각, 천연에 존재하는 CXCL10, PD-1, IL-2, IL-12, IL-22, IL-6R, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra와 동일한 서열을 갖고 있어도 되고, 또는, 천연에 존재하는 CXCL9, CXCL10, CXCL11, PD-1, IL-2, IL-12, IL-22, IL-6R, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, 및 IL-1Ra와는 서열이 상이하지만, 대응하는 천연 리간드의 생리 활성을 유지하고 있는 리간드 개변체여도 된다. 리간드 개변체를 얻기 위해서, 여러 가지 목적으로 리간드 서열에 개변을 인공적으로 가해도 된다. 바람직하게는, 리간드 개변체를 얻기 위해서, 프로테아제 절단에 내성을 나타내는 개변(프로테아제 내성 개변)을 가한다.
몇몇 태양에 있어서, 리간드 결합 부분 또는 분자와 리간드 부분 또는 분자를, 펩타이드 링커를 개재시켜 융합시킨다. 몇몇 태양에 있어서, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역의 VH 또는 VL과 리간드 부분 또는 분자를, 펩타이드 링커를 개재시켜 융합시킨다. 예를 들어, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩타이드 링커, 또는 합성 화합물 링커로서 개시되는 링커(예를 들어, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 참조)를, 리간드 결합 분자와 리간드의 융합에 있어서의 링커로서 이용할 수 있다. 펩타이드 링커의 길이는, 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택해도 된다. 펩타이드 링커의 예에는,
Ser
Gly Ser(GS)
Ser Gly(SG)
Gly Gly Ser(GGS)
Gly Ser Gly(GSG)
Ser Gly Gly(SGG)
Gly Ser Ser(GSS)
Ser Ser Gly(SSG)
Ser Gly Ser(SGS)
Gly Gly Gly Ser(GGGS, 서열 번호: 136)
Gly Gly Ser Gly(GGSG, 서열 번호: 137)
Gly Ser Gly Gly(GSGG, 서열 번호: 138)
Ser Gly Gly Gly(SGGG, 서열 번호: 139)
Gly Ser Ser Gly(GSSG, 서열 번호: 140)
Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141)
Gly Gly Gly Ser Gly(GGGSG, 서열 번호: 142)
Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143)
Gly Ser Gly Gly Gly(GSGGG, 서열 번호: 144)
Gly Ser Gly Gly Ser(GSGGS, 서열 번호: 145)
Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146)
Gly Ser Ser Gly Gly(GSSGG, 서열 번호: 147)
Gly Ser Gly Ser Gly(GSGSG, 서열 번호: 148)
Ser Gly Gly Ser Gly(SGGSG, 서열 번호: 149)
Gly Ser Ser Ser Gly(GSSSG, 서열 번호: 150)
Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGS, 서열 번호: 151)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGG, 서열 번호: 152)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGGGS, 서열 번호: 153)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SGGGGGG, 서열 번호: 154)
(Gly Gly Gly Gly Ser(GGGGS, 서열 번호: 141))n
(Ser Gly Gly Gly Gly(SGGGG, 서열 번호: 146))n
(Gly Gly Ser Gly Gly(GGSGG, 서열 번호: 143))n
(n은 1 이상의 정수이다)
이 포함될 수 있지만, 그들로 한정되지 않는다.
그러나, 펩타이드 링커의 길이 및 서열은, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 화합물 링커(화학 가교제)는, 펩타이드 가교에 통상 이용되는 가교제, 예를 들어, N-하이드록시석신이미드(NHS), 다이석신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(설포석신이미딜) 수베레이트(BS3), 다이싸이오비스(석신이미딜 프로피오네이트)(DSP), 다이싸이오비스(설포석신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌 글라이콜 비스(석신이미딜 석시네이트)(EGS), 에틸렌 글라이콜 비스(설포석신이미딜 석시네이트)(설포-EGS), 다이석신이미딜 타르트레이트(DST), 다이설포석신이미딜 타르트레이트(설포-DST), 비스[2-(석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 또는 비스[2-(설포석신이미드옥시카보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES)이다.
이들 가교제는, 시판되고 있다.
리간드 결합 부분/분자
본 발명의 추가적인 국면에 있어서, 융합 단백질 등의 리간드 결합 부분/분자는, 그 중화 활성을 발휘하는 것에 의해 리간드 부분/분자의 생물학적 활성을 저해할 수 있는 리간드 중화 활성을 갖는, 항체 또는 그 단편을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 융합 폴리펩타이드는, 리간드 부분/분자에 결합할 수 있는 항체 또는 그 단편(즉, 항리간드 항체)을 포함한다. 상기 태양의 어느 것에 의한항체 또는 그 단편은, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 포함하는, 모노클로날 항체이다. 일 태양에 있어서, 항체는, 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아보디, 또는 F(ab')2 단편이다. 다른 태양에 있어서, 항체는, 전장 항체, 예를 들어, 완전 IgG1 항체, 또는 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 다른 항체 클래스 혹은 아이소타입이다. 일 태양에 있어서, 항체 또는 그 단편은, IgG 항체 중에 있어서의 정상 도메인 또는 정상 영역과 구조가 실질적으로 유사한 부분, 및 IgG 항체 중에 있어서의 가변 도메인 또는 가변 영역과 구조가 실질적으로 유사한 부분을 갖고, 또한 IgG 항체의 컨포메이션과 실질적으로 유사한 컨포메이션을 갖는, IgG 항체양 폴리펩타이드이다.
추가적인 국면에 있어서, 상기 태양의 어느 것에 의한 융합 단백질 또는 항체 또는 항체양 폴리펩타이드 또는 그 항체 단편 등의 리간드 결합 부분/분자는, 이하의 섹션에 기재되는 바와 같은 특징의 어느 것을, 단독으로 또는 조합으로 편입시킬 수 있다.
본 명세서에 있어서의 개시, 예를 들어, 이하의 절은, 일부, "항체"를 언급하거나, 또는 그것에 초점을 맞출 수 있다. 그러나, 리간드/항원 결합 활성 등의 본 명세서에 기재되는 항체(양)의 기능 또는 특징이, 구비되거나 또는 보지되는 한, 본 개시는, 본 명세서에 기재되는 태양의 어느 것에 의한, 임의의 융합 단백질/폴리펩타이드 또는 항체 또는 항체양 폴리펩타이드 또는 그 항체 단편 등의, 리간드/항원 결합 부분/분자의 임의의 타입 또는 형식에 호적하게 적용 가능하다.
항체의 어피니티
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하 또는 0.001nM 이하(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어 10-9M 내지 10-13M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
일 태양에 있어서, Kd는, 방사성 표지 항원 결합 측정법(radiolabeled antigen binding assay: RIA)에 의해 측정된다. 일 태양에 있어서, RIA는, 목적하는 항체, 예를 들어 항리간드 항체의 Fab 버전 및 그 리간드를 이용하여 실시된다. 예를 들어, 리간드에 대한 Fab의 용액중 결합 어피니티는, 비표지 리간드의 점증량 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I) 표지 리간드에 의해 Fab를 평형화시키고, 그 다음에 결합한 리간드를 항Fab 항체로 코팅된 플레이트에 의해 포착하는 것에 의해 측정된다. (예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)을 참조). 측정 조건을 구축하기 위해서, MICROTITER(등록상표) 멀티웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50mM 탄산 나트륨(pH 9.6) 중 5μg/ml의 포착용 항Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 코팅하고, 그 후에 실온(대략 23℃)에서 2 내지 5시간, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 블록한다. 비흡착 플레이트(Nunc #269620)에 있어서, 100pM 또는 26pM의 [125I]-항원을, (예를 들어, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에 있어서의 항VEGF 항체, Fab-12의 평가와 동일하게) 목적하는 Fab의 단계 희석물과 혼합한다. 그 다음에, 목적하는 Fab를 하룻밤 인큐베이트하지만, 이 인큐베이션은, 평형이 확실히 달성되도록, 보다 장시간(예를 들어, 약 65시간) 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을, 실온에서의 인큐베이션(예를 들어, 1시간)을 위해서 포착 플레이트로 옮긴다. 그 다음에 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1%의 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(등록상표))으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조하면, 150μl/웰의 신틸런트(MICROSCINT-20(상표), Packard)를 첨가하고, TOPCOUNT(상표) 감마 카운터(Packard)에 있어서 플레이트를 10분간 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 주는 각 Fab의 농도를, 경합 결합 어세이에 있어서 사용하기 위해서 선택한다.
다른 태양에 의하면, Kd는, BIACORE(등록상표) 표면 플라즈몬 공명(SPR) 어세이를 이용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE(등록상표)-2000 또는 BIACORE(등록상표)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하는 측정법이, 대략 10반응 단위(response unit: RU)의 항원이 고정된 CM5 칩을 이용하여 25℃에서 실시된다. 일 태양에 있어서, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은, 공급원의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하여 활성화된다. 리간드는, 대략 10반응 단위(RU)의 단백질의 결합을 달성하도록, 5μl/분의 유속으로 주입되기 전에, 10mM 아세트산 나트륨, pH 4.8을 이용하여 5μg/ml(대략 0.2μM)로 희석된다. 리간드의 주입 후, 미반응기를 블록하기 위해서 1M 에탄올아민이 주입된다. 카이네틱스의 측정을 위해서, 25℃, 대략 25μl/분의 유속으로, 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(상표)) 계면활성제 함유 PBS(PBST) 중의 Fab의 2배 단계 희석물(0.78nM 내지 500nM)이 주입된다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 단순한 1대 1 랭뮤어 결합 모델(BIACORE(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여, 결합 및 해리의 센서그램을 동시에 피팅하는 것에 의해 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는, koff/kon비로서 계산된다. 예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)을 참조할 것. 상기의 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 온 속도가 106M-1s-1을 초과하는 경우, 온 속도는, 분광계(예를 들어 스톱 플로식 분광 광도계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 이용하는 8000 시리즈의 SLM-AMINCO(상표) 분광 광도계(ThermoSpectronic))에 있어서 측정되는, 점증 농도의 리간드의 존재하에서의 PBS, pH 7.2 중 20nM의 항리간드 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 발광 강도(여기=295nm; 발광=340nm, 밴드 패스 16nm)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하는 것에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 당업자는, 다른 리간드 결합 분자, 항원 결합 분자, 또는 항체에 대해, 다양한 종류의 리간드, 리간드 수용체, 및 항원에 대한 친화성을 측정하는 다른 일반적인 방법을 이용하여, 친화성 측정을 실시할 수 있다.
항체 단편
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체 단편이다. 항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및, 후술하는 다른 단편을 포함한다. 특정의 항체 단편에 대한 총설로서, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)를 참조할 것. scFv 단편의 총설로서, 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 더하여, WO93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조할 것. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 인비보(in vivo)에 있어서의 반감기가 길어진 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논설로서, 미국 특허 제5,869,046호를 참조할 것.
다이아보디는, 2가 또는 이중 특이적이어도 되고, 항원 결합 부위를 2개 갖는 항체 단편이다. 본 명세서에 있어서, 다이아보디는 또한, 2가 또는 이중 특이성이어도 되는 2개의 리간드 결합 도메인을 갖는 항체 단편을 가리킨다. 예를 들어, EP404,097호; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 참조. 트리아보디(triabody)나 테트라보디(tetrabody)도, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
싱글 도메인 항체는, 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분, 또는 경쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분을 포함하는, 항체 단편이다. 특정의 태양에 있어서, 싱글 도메인 항체는, 인간 싱글 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1 참조).
항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된, 완전 항체의 단백질 분해적 소화, 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균(E. coli) 또는 파지)에 의한 산생을 포함하는, 여러 가지 수법에 의해 만들 수 있다.
키메라 및 인간화 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 키메라 항체이다. 특정의 키메라 항체가, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)에 기재되어 있다. 일례에서는, 키메라 항체는, 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이 등의 비인간 영장류에서 유래하는 가변 영역) 및 인간 정상 영역을 포함한다. 추가적인 예에 있어서, 키메라 항체는, 친항체의 것으로부터 클래스 또는 서브클래스가 변경된 "클래스 스위치" 항체이다. 키메라 항체는, 그 항원 결합 단편도 포함한다.
특정의 태양에 있어서, 키메라 항체는, 인간화 항체이다. 전형적으로는, 비인간 항체는, 친비인간 항체의 특이성 및 어피니티를 유지한 채로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해서, 인간화된다. 통상, 인간화 항체는 1개 또는 복수의 가변 도메인을 포함하고, 당해 가변 도메인 중, HVR(예를 들어 CDR(또는 그 부분))은 비인간 항체에서 유래하고, FR(또는 그 부분)은 인간 항체 서열에서 유래한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 정상 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 인간화 항체 중의 몇몇 FR 잔기는, 예를 들어, 항체의 특이성 또는 어피니티를 회복 또는 개선하기 위해서, 비인간 항체(예를 들어, HVR 잔기의 유래가 된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환되어 있다.
인간화 항체 및 그 제작 방법은, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 있어서 총설되어 있고, 또한, 예를 들어, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역(specificity determining region: SDR) 그래프팅을 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("리서페이싱"을 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 기재); 및, Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링을 위한 "가이드 셀렉션" 어프로치를 기재)에 있어서, 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, 이들로 한정되는 것은 아니지만: "베스트 피트"법(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993) 참조)을 이용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정의 서브그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래하는 프레임워크 영역(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 참조); 인간 성숙(체세포 변이) 프레임워크 영역 또는 인간 생식 세포계 프레임워크 영역(예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 및, FR 라이브러리의 스크리닝에서 유래하는 프레임워크 영역(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참조)을 포함한다.
인간 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 인간 항체이다. 인간 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 여러 가지 수법에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 개설되어 있다.
인간 항체는, 항원 챌린지(부하)에 응답하여 완전 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 수반하는 완전 항체를 산생하도록 개변된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여하는 것에 의해, 조제되어도 된다. 그와 같은 동물은, 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분을 포함하고, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분은, 내인성의 면역글로불린 유전자자리를 치환하거나, 또는, 염색체 외에 혹은 당해 동물의 염색체 내에 랜덤하게 흡수된 상태로 존재한다. 그와 같은 트랜스제닉 마우스에 있어서, 내인성의 면역글로불린 유전자자리는, 통상 불활성화되어 있다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법의 총설로서, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조할 것. 또한, 예를 들어, XENOMOUSE(상표) 기술을 기재한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HUMAB(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제7,041,870호; 및, VELOCIMOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 출원 공개 제2007/0061900호를, 아울러 참조할 것. 이와 같은 동물에 의해 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 다른 인간 정상 영역과 조합 등을 하여, 추가로 수식되어도 된다.
인간 항체는, 하이브리도마에 기초한 방법으로도 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한, 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주는, 이미 기술되어 있다. (예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 참조.) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 개재시켜 생성된 인간 항체도, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 기술되어 있다. 추가적인 방법으로서는, 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재), 및, Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마 기술)도, Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는, 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써도 생성할 수 있다. 이와 같은 가변 도메인 서열은, 다음에 소망의 인간 정상 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 수법을, 이하에 기술한다.
라이브러리 유래 항체
본 발명의 항체는, 소망의 1개 또는 복수의 활성을 수반하는 항체에 대해 콤비나토리얼 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 단리해도 된다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리의 생성이나, 소망의 결합 특성을 구비하는 항체에 대해 그와 같은 라이브러리를 스크리닝하기 위한, 다양한 방법이 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있다. 그와 같은 방법은, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에 있어서 총설되어 있고, 더욱이 예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 기재되어 있다.
특정의 파지 디스플레이법에 있어서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는, 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 따로따로 클로닝되어, 무작위로 파지 라이브러리 중에서 재결합되고, 당해 파지 라이브러리는, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 기술되어 있는 바와 같이 하여, 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는, 전형적으로는, 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서의 어느 쪽으로, 항체 단편을 제시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는, 하이브리도마를 구축하는 것을 필요로 하지 않고서, 면역원에 대한 고어피니티 항체를 제공한다. 혹은, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재되는 바와 같이, 나이브 레퍼토리를(예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하여, 면역화하지 않고, 광범위한 비자기 및 자기 항원에의 항체의 단일한 공급원을 제공할 수도 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재되는 바와 같이, 줄기세포로부터 재구성 전의 V-유전자 세그먼트를 클로닝하여, 초가변 CDR3 영역을 코딩하고 또한 인비트로(in vitro)로 재구성을 달성하기 위한 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용하는 것에 의해, 합성적으로 만들 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재한 특허문헌은, 예를 들어: 미국 특허 제5,750,373호, 및, 미국 특허 출원 공개 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은, 본 명세서에서는 인간 항체 또는 인간 항체 단편이라고 간주한다.
다중 특이성 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체)이다. 다중 특이성 항체는, 적어도 2개의 상이한 부위에 결합 특이성을 갖는, 모노클로날 항체이다. 특정의 태양에 있어서, 결합 특이성 중 하나는, 항원에 대한 것이고, 또 하나는 다른 임의의 항원에 대한 것이다. 특정의 태양에 있어서, 이중 특이성 항체는, 항원의 상이한 2개의 에피토프에 결합해도 된다. 이중 특이성 항체는, 항원을 발현하는 세포에 세포상해제를 국재화하기 위해서 사용되어도 된다. 이중 특이성 항체는, 전장 항체로서 또는 항체 단편으로서 조제될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 이중 특이성 항체의 결합 특이성 중 하나는, 1개의 리간드에 대한 것이고, 또 하나는, 다른 임의의 리간드에 대한 것이다. 더욱이, 이중 특이성 항체는, 리간드의 상이한 2개의 에피토프에 결합해도 된다. 이중 특이성 항체는, 리간드 수용체를 발현하는 세포에 세포상해제를 국재화하기 위해서 사용되어도 된다. 이중 특이성 항체는, 전장 항체로서 또는 항체 단편으로서 조제될 수 있다.
다중 특이성 항체를 제작하기 위한 수법은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 재조합 공발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 및 knob-in-hole 기술(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)을 포함한다. 다중 특이성 항체는, Fc 헤테로이량체 분자를 제작하기 위해서 정전 스티어링 효과(electrostatic steering effects)를 조작하는 것(WO2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하는 것(미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) 참조); 류신 지퍼를 이용하여 2개의 특이성을 갖는 항체를 작성하는 것(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참조); "다이아보디" 기술을 이용하여 이중 특이성 항체 단편을 제작하는 것(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 및, 단쇄 Fv(scFv) 이량체를 이용하는 것(Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 및, 예를 들어 Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재되는 바와 같이 삼중 특이성 항체를 조제하는 것에 의해 제작해도 된다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하는, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 수반하는 개변 항체도, 본 명세서에서는 포함된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2006/0025576호A1참조). 본 명세서에서 항체 또는 단편은, 항원과 별도의 상이한 항원에 결합하는 1개의 항원 결합 부위를 포함하는, "듀얼 액팅 Fab" 또는 "DAF"도 포함한다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2008/0069820호 참조). 본 명세서에 있어서, 개변 항체에는, 3개 이상의 기능적 리간드 결합 도메인을 수반하는 항체, 및 리간드와 별도의 상이한 리간드에 결합할 수 있는 리간드 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 그 단편이 포함된다.
항체 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체도, 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 어피니티 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이, 바람직한 경우도 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 수식을 도입하는 것, 또는, 펩타이드 합성에 의해, 조제되어도 된다. 그와 같은 수식은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 항체의 아미노산 서열 중에의 삽입, 및/또는 항체의 아미노산 서열 중의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 소망의 특징(예를 들어, 항원 결합성 또는 리간드 결합성)을 구비하는 것을 전제로, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이, 최종 구축물에 이르기 위해서 행해질 수 있다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정의 태양에 있어서, 1개 또는 복수의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 변이 도입의 목적 부위는, HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을, 표 2의 "바람직한 치환"의 표제하에 나타낸다. 보다 실질적인 변경을, 표 2의 "예시적인 치환"의 표제하에 제공함과 함께, 아미노산 측쇄의 클래스를 언급하면서 아래에서 상술한다. 아미노산 치환은 목적하는 항체에 도입되어도 되고, 산물은, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합성, 감소한 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC 등의, 소망의 활성에 대해 스크리닝되어도 된다.
[표 2]
아미노산은, 공통의 측쇄 특성에 의해 군으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, 메티오닌(Met), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 아이소류신(Ile);
(2) 중성의 친수성: 시스테인(Cys), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln);
(3) 산성: 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu);
(4) 염기성: 히스티딘(His), 리신(Lys), 아르기닌(Arg);
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: 글리신(Gly), 프롤린(Pro);
(6) 방향족성: 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe).
비보존적 치환은, 이들 클래스의 하나의 멤버를, 다른 클래스의 것으로 교환하는 것을 말한다.
치환 변이체의 하나의 타입은, 친항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 또는 복수의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 통상, 그 결과로서 생기고, 추가적인 연구를 위해서 선택된 변이체는, 친항체와 비교하여 특정의 생물학적 특성에 있어서의 수식(예를 들어, 개선)(예를 들어, 증가한 어피니티, 감소한 면역원성)을 갖고, 및/또는 친항체의 특정의 생물학적 특성을 실질적으로 보지하고 있을 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 어피니티 성숙 항체이며, 이것은, 예를 들어 파지 디스플레이 베이스의 어피니티 성숙 기술(예를 들어 본 명세서에 기재되는 것)을 이용하여 적절히 제작될 수 있다. 간결히 설명하면, 1개 또는 복수의 HVR 잔기를 변이시키고, 그리고 변이 항체를 파지 상에 제시시키고, 특정의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 어피니티)에 관해서 스크리닝을 행한다.
개변(예를 들어, 치환)은, 예를 들어 항체의 어피니티를 개선하기 위해서, HVR에 있어서 행해질 수 있다. 그와 같은 개변은, HVR의 "핫스폿", 즉, 체세포 성숙 프로세스 동안에 고빈도로 변이가 일어나는 코돈에 의해 코딩되는 잔기(예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)을 참조할 것) 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에 있어서 행해질 수 있고, 얻어진 변이 VH 또는 VL이 결합 어피니티에 관해서 시험될 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 어피니티 성숙이, 예를 들어, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재되어 있다. 어피니티 성숙의 몇몇 태양에 있어서, 다양성은, 임의의 다양한 방법(예를 들어, 에러-프론 PCR, 체인 셔플링 또는 올리고뉴클레오타이드 지향 변이 도입)에 따라 성숙을 위해서 선택된 가변 유전자에 도입된다. 그 다음에, 2차 라이브러리가 제작된다. 그 다음에, 이 라이브러리는, 소망의 어피니티를 갖는 임의의 항체 변이체를 동정하기 위해서 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은, 몇몇 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4 내지 6잔기)를 무작위화하는 HVR 지향 어프로치를 포함한다. 항원 결합 또는 리간드 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 변이 도입 또는 모델링을 이용하여, 구체적으로 특정될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 자주 표적화된다.
특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 그와 같은 개변이 항원 또는 리간드에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 또는 복수의 HVR 내에서 행해질 수 있다. 예를 들어, 결합 어피니티를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 개변(예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이, HVR에 있어서 행해질 수 있다. 그와 같은 개변은, 예를 들어, HVR의 항원 또는 리간드 접촉 잔기의 외측일 수 있다. 상기의 변이 VH 및 VL 서열의 특정의 태양에 있어서, 각 HVR는 개변되어 있지 않거나, 불과 1개, 2개, 혹은 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
변이 도입을 위해서 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 동정하는 데 유용한 방법은, Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 기재되는, "알라닌 스캐닝 변이 도입"이라고 불리는 것이다. 이 방법에 있어서, 1잔기 또는 일군의 표적 잔기(예를 들어, 하전 잔기, 예를 들어 아르기닌, 아스파르트산, 히스티딘, 리신, 및 글루탐산)가 동정되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 혹은 폴리알라닌)으로 치환되어, 항체와 항원 또는 리간드의 상호작용이 영향을 받을지 여부가 결정된다. 이 초기 치환에 대해서 기능적 감수성을 나타낸 아미노산 위치에, 추가적인 치환이 도입될 수 있다. 혹은 또는 더하여, 항체와 항원 사이의 접촉점을 동정하기 위해서, 항원 항체 복합체의 결정 구조를 해석해도 된다. 또한, 리간드-리간드 결합 도메인 복합체의 결정 구조를 해석하여, 리간드 결합 도메인과 리간드의 접촉점을 특정해도 됨도, 본 명세서에 포함된다. 그와 같은 접촉 잔기 및 근린의 잔기를, 치환 후보로서 표적화해도 되고, 또는 치환 후보로부터 제외해도 된다. 변이체는, 그들이 소망의 특성을 포함하는지 여부를 결정하기 위해서 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열의 삽입은, 서열 내부에의 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 삽입과 같이, 아미노 말단 및/또는 카복실 말단에 있어서의 1잔기로부터 100잔기 이상을 포함하는 폴리펩타이드의 길이의 범위에서의 융합도 포함한다. 말단의 삽입의 예는, N말단에 메티오닐 잔기를 수반하는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는, 항체의 N- 또는 C-말단에, 효소(예를 들어, ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈장 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드를 융합시킨 것을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키도록 또는 감소시키도록 개변되어 있다. 항체에의 글리코실화 부위의 추가 또는 삭제는, 1개 또는 복수의 글리코실화 부위를 만들어 내거나 또는 제거하도록 아미노산 서열을 개변하는 것에 의해, 간편하게 달성 가능하다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 거기에 부가되는 탄수화물이 개변되어도 된다. 포유동물 세포에 의해 산생되는 천연형 항체는, 전형적으로는, 분기한 2분기의 올리고당을 포함하고, 당해 올리고당은 통상 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 부가되어 있다. 예를 들어, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 올리고당은, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산 등의 여러 가지 탄수화물, 또한, 2분기의 올리고당 구조의 "스템" 중의 GlcNAc에 부가된 푸코스를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체 중의 올리고당의 수식은, 특정의 개선된 특성을 수반하는 항체 변이체를 만들어 내기 위해서 행해져도 된다.
일 태양에 있어서, Fc 영역에 (직접적 또는 간접적으로) 부가된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조체를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 그와 같은 항체에 있어서의 푸코스의 양은, 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO2008/077546에 기재되는 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정되는, Asn297에 부가된 모든 당 구조체(예를 들어, 복합, 하이브리드, 및 고만노스 구조체)의 합에 대한, Asn297에 있어서의 당쇄 내의 푸코스의 평균량을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은, Fc 영역의 297위쯤에 위치하는 아스파라긴 잔기를 나타낸다(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링). 그러나, 복수의 항체 사이의 약간의 서열의 다양성에 기인하여, Asn297은, 297위의 +/-3아미노산 상류 또는 하류, 즉 294위 내지 300위 사이에 위치하는 경우도 있을 수 있다. 그와 같은 푸코실화 변이체는, 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2003/0157108호(Presta, L.); 제2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조할 것. "탈푸코실화" 또는 "푸코스 결손" 항체 변이체에 관한 간행물의 예는, US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)를 포함한다. 탈푸코실화 항체를 산생할 수 있는 세포주의 예는, 단백질의 푸코실화를 결여하는 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 공개 제US2003/0157108호 A1, Presta, L; 및 WO2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11) 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스페라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107을 참조할 것)를 포함한다.
예를 들어 항체의 Fc 영역에 부가된 2분지형 올리고당이 GlcNAc에 의해 2분되어 있는, 2분된 올리고당을 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 감소한 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US2005/0123546(Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부가된 올리고당 중에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체는, 예를 들어, WO1997/30087(Patel et al.); WO1998/58964(Raju, S.); 및 WO1999/22764(Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 Fc 영역에 1개 또는 복수의 아미노산 수식을 도입하여, 그것에 의해 Fc 영역 변이체를 생성해도 된다. Fc 영역 변이체는, 1개 또는 복수의 아미노산 포지션의 장소에서 아미노산 수식(예를 들어, 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역)을 포함해도 된다.
특정의 태양에 있어서, 모두는 아니지만 몇몇 이펙터 기능을 구비하는 항체 변이체도, 본 발명의 고려 내에 있으며, 당해 이펙터 기능은, 항체를, 그 인비보에서의 반감기가 중요하지만, 특정의 이펙터 기능(보체 및 ADCC등)은 불요 또는 유해한 경우의 적용에 바람직한 후보로 하는 것이다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해서, 인비트로 및/또는 인비보의 세포상해 측정을 행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 측정은, 항체가 FcγR 결합성을 결여하는(따라 ADCC 활성을 결여할 개연성이 높은) 한편으로 FcRn 결합능을 유지하는 것을 확인하기 위해서 행해질 수 있다. ADCC를 매개하는 프라이머리 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 한편 단구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR의 발현은, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 제464페이지의 Table 3에 정리되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 인비트로 측정법(어세이)의 비한정적인 예는, 미국 특허 제5,500,362호(예를 들어, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 미국 특허 제5,821,337호(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조)에 기재되어 있다. 혹은, 비방사성의 측정법을 이용해도 된다(예를 들어, ACT1(상표) non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및, CytoTox 96(등록상표) non-radioactive cytotoxicity assays 법 (Promega, Madison, WI) 참조). 이와 같은 측정법에서 유용한 이펙터 세포는, 말초혈 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 및 내추럴 킬러(Natural Killer: NK) 세포를 포함한다. 혹은 또는 더하여, 목적하는 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에 기재되는 바와 같은 동물 모델에 있어서, 인비보로 평가되어도 된다. 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없는 것, 따라서 CDC 활성을 결여하는 것을 확인하기 위해서, C1q 결합 측정을 행해도 된다. 예를 들어, WO2006/029879 및 WO2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조할 것. 또한, 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 측정을 행해도 된다(예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). 더욱이, FcRn 결합성 및 인비보에서의 클리어런스/반감기의 결정도, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 방법을 이용하여 행할 수 있다(예를 들어 Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참조).
감소한 이펙터 기능을 수반하는 항체는, Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327, 및 329의 1개 또는 복수의 치환을 수반하는 것을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이와 같은 Fc 변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌에의 치환을 수반하는 이른바 "DANA" Fc 변이체(미국 특허 제7,332,581호)를 포함하는, 아미노산 포지션 265, 269, 270, 297, 및 327의 2개 이상의 치환을 수반하는 Fc 변이체를 포함한다.
FcRs에의 증가 또는 감소한 결합성을 수반하는 특정의 항체 변이체가, 기술되어 있다. (미국 특허 제6,737,056호; WO2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)를 참조할 것.)
특정의 태양에 있어서, 항체 변이체는, ADCC를 개선하는 1개 또는 복수의 아미노산 치환(예를 들어, Fc 영역의 포지션 298, 333, 및/또는 334(EU 넘버링에서의 잔기)에서의 치환)을 수반하는 Fc 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 예를 들어 미국 특허 제6,194,551호, WO99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 기재되는 바와 같이, 개변된(즉, 증가했거나 감소했거나의 어느 쪽인) C1q 결합성 및/또는 보체 의존성 세포상해(CDC)를 가져오는 개변이, Fc 영역에 있어서 이루어진다.
증가한 반감기, 및 신생아형 Fc 수용체(FcRn: 모체의 IgG류를 태아에게 이행시키는 역할을 부담한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)))에 대한 증가한 결합성을 수반하는 항체가, 미국 특허 출원 공개 제2005/0014934호 A1(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는, Fc 영역의 FcRn에의 결합성을 증가하는 1개 또는 복수의 치환을 그 중에 수반하는 Fc 영역을 포함한다. 이와 같은 Fc 변이체는, Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 또는 434의 1개 또는 복수의 장소에서의 치환(예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제7,371,826호))을 수반하는 것을 포함한다.
Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO94/29351도 참조할 것.
d) 시스테인 개변 항체 변이체
특정의 태양에 있어서, 항체의 1개 또는 복수의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 개변 항체(예를 들어, "thioMAbs")를 만들어 내는 것이 바람직할 것이다. 특정의 태양에 있어서, 치환을 받는 잔기는, 항체의, 액세스 가능한 부위에 생긴다. 그들 잔기를 시스테인으로 치환하는 것에 의해, 반응성의 싸이올기가 항체의 액세스 가능한 부위에 배치되고, 당해 반응성의 싸이올기는, 당해 항체를 다른 부분(약제 부분 또는 링커-약제 부분 등)에 컨주게이트하여 본 명세서에서 추가로 상술하는 바와 같이 이뮤노컨주게이트를 만들어 내는데 사용되어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 이하의 잔기의 임의의 1개 또는 복수가, 시스테인으로 치환되어도 된다: 경쇄의 V205(Kabat 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 개변 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재되는 바와 같이 하여 생성되어도 된다.
항체 유도체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있고 또한 용이하게 입수 가능한 추가의 비단백질 부분을 포함하도록, 추가로 수식되어도 된다. 항체의 유도체화에 호적한 부분은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 폴리머의 비한정적인 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 에틸렌 글라이콜/프로필렌 글라이콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔레인, 폴리-1,3,6-트라이옥세인, 에틸렌/무수 말레산 코폴리머, 폴리아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머의 어느 것도), 및, 덱스트란 또는 폴리(n-바이닐피롤리돈)폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올류(예를 들어 글리세롤), 폴리바이닐 알코올, 및, 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글라이콜 프로피온알데하이드는, 그 물에 대한 안정성 때문에, 제조에 있어서 유리할 것이다. 폴리머는, 어떠한 분자량이어도 되고, 분기하고 있어도 하고 있지 않아도 된다. 항체에 부가되는 폴리머의 수에는 폭이 있어도 되고, 1개 이상의 폴리머가 부가된다면 그들은 동일한 분자여도 되고, 상이한 분자여도 된다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 폴리머의 수 및/또는 타입은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 개선되어야 할 항체의 특정의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정의 조건하에서의 요법으로 사용되는지 여부 등에 대한 고려에 기초하여, 결정할 수 있다.
다른 태양에 있어서, 항체와, 방사선에 폭로하는 것에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질 부분의, 컨주게이트가 제공된다. 일 태양에 있어서, 비단백질 부분은, 카본 나노튜브이다(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 어떠한 파장이어도 되고, 또한 이들로 한정되는 것은 아니지만, 통상의 세포에는 해를 주지 않지만 항체-비단백질 부분에 근접한 세포를 사멸시키는 온도까지 비단백질 부분을 가열하는 파장을 포함한다.
재조합의 방법 및 구성
예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재되는 바와 같이, 항체는 재조합의 방법이나 구성을 이용하여 제조할 수 있다. 일 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 항리간드 항체를 코딩하는, 단리된 핵산이 제공된다. 그와 같은 핵산은, 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩해도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 1개 또는 복수의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이와 같은 태양의 하나에서는, 숙주 세포는, (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는, (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터와 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어, 형질 전환되어 있다). 일 태양에 있어서, 숙주 세포는, 진핵성(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 또는 림프계의 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포))이다. 일 태양에 있어서, 항체의 발현에 호적한 조건하에서, 전술한 바와 같이 당해 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 및 임의로, 당해 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항리간드 항체를 제작하는 방법이 제공된다.
항리간드 항체의 재조합 제조를 위해서, (예를 들어, 전술한 것 등의) 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가적인 클로닝 및/또는 숙주 세포 중에서의 발현을 위해서, 1개 또는 복수의 벡터에 삽입한다. 그와 같은 핵산은, 종래의 수순을 이용하여 용이하게 단리 및 서열 결정될 것이다(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써).
항체를 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현에 호적한 숙주 세포는, 본 명세서에 기재하는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요로 되지 않는 경우는, 세균에서 제조해도 된다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 관해서, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조할 것. (더하여, 대장균에 있어서의 항체 단편의 발현에 대해 기재한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254도 참조.) 발현 후, 항체는 세균 세포 페이스트로부터 가용성 프랙션 중에 단리되어도 되고, 또한 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 부분적인 또는 완전한 인간의 글리코실화 패턴을 수반하는 항체의 산생을 가져오는, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있는 균류 및 효모의 주를 포함하는, 사상균 또는 효모 등의 진핵성의 미생물은, 항체 코드 벡터의 호적한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)를 참조할 것.
다세포 생물(무척추 생물 및 척추 생물)에서 유래하는 것도 또한, 글리코실화된 항체의 발현을 위해서 호적한 숙주 세포이다. 무척추 생물 세포의 예는, 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와의 접합, 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질 전환에 이용되는, 수많은 바큘로바이러스주가 동정되어 있다.
식물 세포 배양물도, 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호(트랜스제닉 식물로 항체를 산생하기 위한, PLANTIBODIES(상표) 기술을 기재)를 참조할 것.
척추 동물 세포도 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 부유 상태에서 증식하도록 적응된 포유동물 세포주는, 유용할 것이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는, SV40으로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7); 인간 태아성 신주(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) 등에 기재된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 서톨리 세포(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) 등에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카녹색개구리 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); Buffalo계 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방암(MMT 060562); TRI 세포(예를 들어, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재); MRC5 세포; 및, FS4 세포 등이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0, 및 Sp2/0 등의 골수종 세포주를 포함한다. 항체 산생에 적합한 특정의 포유동물 숙주 세포주의 총설로서, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조할 것.
이뮤노컨주게이트
본 발명은 또한, 1개 또는 복수의 세포상해제(예를 들어 화학요법제 또는 화학요법약, 증식 저해제, 독소(예를 들어 세균, 진균, 식물 혹은 동물 기원의 단백질 독소, 효소적으로 활성인 독소, 혹은 그들의 단편) 또는 방사성 동위체)에 컨주게이트된 본 명세서의 항리간드 항체를 포함하는 이뮤노컨주게이트를 제공한다.
일 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 항체가, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 1개 또는 복수의 약제에 컨주게이트된, 항체-약제 컨주게이트(antibody-drug conjugate: ADC)이다: 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호, 및 유럽 특허 제0,425,235호 B1 참조); 예를 들어 모노메틸오리스타틴 약제 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조) 등의 오리스타틴; 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 그 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 참조); 다우노마이신 또는 독소루비신 등의 안트라사이클린(Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀 등의 탁산; 트리코테센; 및 CC1065.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 효소적으로 활성인 독소 또는 그 단편에 컨주게이트된, 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄(녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A쇄, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 크루신(curcin), 크로틴, 비누풀(saponaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 방사성 컨주게이트를 형성하기 위해서 방사성 원자에 컨주게이트된 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위체가 방사성 컨주게이트의 제조에 이용 가능하다. 예는, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위체를 포함한다. 방사성 컨주게이트를 검출을 위해서 사용하는 경우, 방사성 컨주게이트는, 신티그래피 검사용의 방사성 원자(예를 들어 Tc-99m 혹은 123I), 또는, 핵자기 공명(NMR) 이미징(자기 공명 이미징, MRI로서도 알려져 있다)용의 스핀 표지(예를 들어 여기에서도 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈, 또는 철)를 포함할 수 있다.
항체 및 세포상해제의 컨주게이트는, 다양한 2작용성 단백질 연결제를 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥세인-1-카복실레이트(SMCC), 이미노싸이올레인(IT), 이미도에스터의 2작용성 유도체(예를 들어, 아디프이미드산 다이메틸 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 수베르산 다이석신이미딜), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아자이도 화합물(예를 들어, 비스(p-아자이도벤조일)헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스 활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)이다. 예를 들어, 리신 면역 독소는, Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 기재되는 바와 같이 하여 조제될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-아이소싸이오사이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민오아세트산(MX-DTPA)은, 항체에의 방사성 핵종의 컨주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조할 것. 링커는, 세포 내에서의 세포상해약의 방출을 촉진하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커, 또는 다이설파이드 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본 명세서의 이뮤노컨주게이트 또는 ADC는, (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) 시판되고 있는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜(4-바이닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 가교 시약을 이용하여 조제되는 컨주게이트를 명시적으로 고려하지만, 이들로 한정되지 않는다.
측정법(어세이)
몇몇 태양에서는, 융합 폴리펩타이드는, 항체 또는 그 단편을 포함하는 리간드 결합 부분/분자를 포함하고, 여기에서, 항체는, 리간드에 결합하는 완전장 항체 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드, 즉 항리간드 항체이다. 본 명세서에서 제공되는 그와 같은 항리간드 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있는 여러 가지 측정법에 의해, 동정되거나, 스크리닝되거나, 또는 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 밝혀져도 된다.
결합 측정법 및 그 외의 측정법
일 국면에 있어서, 본 발명의 항체(즉, 항리간드 항체)는, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등의 공지된 방법에 의해, 그 리간드 결합 활성에 관해서 시험된다.
다른 국면에 있어서, 리간드에의 결합에 관해서 다른 리간드 결합 분자와 경합하는 항체를 동정하기 위해서, 경합 어세이가 사용될 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 그와 같은 경합 항체는, 리간드 결합 분자에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프(예를 들어, 선상 또는 입체 구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하는, 상세한 예시적 방법은, Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에 제공되어 있다.
예시적인 경합 어세이에 있어서, 고정화된 리간드는, 리간드에 결합하는 제1 표지된 항체(예를 들어, 항리간드 항체 또는 리간드 결합 분자) 및 리간드에의 결합에 관해서 제1 항체와 경합하는 능력에 관해서 시험되는 제2 미표지의 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이트된다. 제2 항체는, 하이브리도마 상청에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정화된 리간드가, 제1 표지된 항체를 포함하지만 제2 미표지의 항체를 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이트된다. 제1 항체의 리간드에 대한 결합을 허용하는 조건하에서의 인큐베이션 후, 여분의 미결합의 항체가 제거되고, 고정화된 리간드에 결합한 표지의 양이 측정된다. 고정화된 리간드에 결합한 표지의 양이 대조 샘플과 비교하여 시험 샘플에 있어서 실질적으로 감소하고 있는 경우, 그것은 제2 항체가 리간드에의 결합에 관해서 제1 항체와 경합하고 있음을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbour, NY)를 참조할 것.
활성 측정법
일 국면에 있어서, 생물학적 활성을 갖는 항리간드 항체의 그것을 동정하기 위한 측정법이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 리간드 수용체에의 결합 또는 리간드 시그날 전달의 활성화를 포함해도 된다. 또한, 이와 같은 생물학적 활성을 인비보 및/또는 인비트로로 갖는 항체가, 제공된다.
특정의 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 이와 같은 생물학적 활성에 대해 시험된다. 인비트로에서의 리간드 활성화는, 리간드 루시페라제 어세이를 실시하는 것에 의해, 확인할 수 있다. 간결하게 설명하면, 리간드 수용체를 발현하는 세포를 배양했다. 그 다음에, 항리간드 항체를, 세포 표면 상에 발현되는 리간드 수용체에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 인큐베이트했다. 대조로서, 리간드를, 세포 표면 상에 발현되는 리간드 수용체에 대한 결합을 위해서 피험 항리간드 항체와 동일한 조건하에서 인큐베이트 한다. 그 다음에, 루시페라제 활성을, Bio-Glo 루시페라제 어세이 시스템(Promega, G7940) 등의 적절한 어세이 시스템을 이용하여, 제조업자의 설명서에 따라 검출한다. 발광은, GloMax(등록상표) Explorer System(Promega #GM3500)를 이용하여, 제조업자의 설명서에 따라 검출할 수 있다. 항리간드 항체 및 리간드에 대해 필적하는 레벨의 활성이 검출되는 경우에는, 항리간드 항체는, 리간드 수용체에 결합하여, 그 리간드 시그날 전달을 활성화할 수 있음이 실증된다.
예시적인 IL-12 융합 폴리펩타이드
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 부분은, IL-12를 포함하고, 리간드 결합 부분/분자는, 항체 또는 그 단편을 포함하고, 여기에서, 항체는, IL-12에 결합하는 전장 항체 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드, 즉 항IL-12 항체이다.
본원의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 부분은, IL-12를 포함하고, 융합 단백질은, (i) 내지 (vi)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄의 임의의 조합을 포함한다:
(i) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ii) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iii) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(iv) 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(v) 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(vi) 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
본원의 몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, 이하의 (i) 내지 (iii)으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 조합의 어느 1개를 포함하는, IL-12 결합 부분을 포함한다:
(i) 서열 번호: 1084와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH);
(ii) 서열 번호: 1085와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL); 및
(iii) 서열 번호: 1086과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL).
다른 국면에 있어서, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 서열 번호: 1084의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은, 참조 서열에 대해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 융합 단백질의 리간드 결합 도메인은, IL-12에 결합하는 능력을 보지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개 내지 10개의 아미노산이, 서열 번호: 1084에 있어서 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 행해진다. 임의로, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 서열 번호: 1084에 있어서의 VH 서열을, 그 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 번역후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산에의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공되고, 여기에서, 항체는, 서열 번호: 1085 또는 1086의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은, 참조 서열에 대해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 융합 단백질의 리간드 결합 도메인은, IL-12에 결합하는 능력을 보지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개 내지 10개의 아미노산이, 서열 번호: 1085 또는 1086에 있어서 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 행해진다. 임의로, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 서열 번호: 1085 또는 1086에 있어서의 VL 서열을, 그 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 번역후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산에의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공되고, 여기에서, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인은, 상기에서 제공되는 태양의 어느 것에 있어서와 같은 VH, 및 상기에서 제공되는 태양의 어느 것에 있어서와 같은 VL을 포함한다. 일 태양에 있어서, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 각각, 서열 번호: 1012 또는 1050, 및 서열 번호: 1009, 1016, 또는 1017에 있어서의 VH 서열 및 VL 서열을, 그들의 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 바람직한 태양에 있어서, IL-12에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 각각, 서열 번호: 1012 및 서열 번호: 1009에 있어서의 VH 서열 및 VL 서열, 각각, 서열 번호: 1050 및 서열 번호: 1016에 있어서의 VH 서열 및 VL 서열, 각각, 서열 번호: 1050 및 서열 번호: 1017에 있어서의 VH 서열 및 VL 서열을, 그들의 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 번역후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산에의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
예시적인 IL-22 융합 폴리펩타이드
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 부분은, IL-22를 포함하고, 리간드 결합 부분/분자는, 항체 또는 그 단편을 포함하고, 여기에서, 항체는, IL-22에 결합하는 전장 항체 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드, 즉 항IL-22 항체이다.
본원의 몇몇 태양에 있어서, 리간드 부분은, IL-22를 포함하고, 융합 단백질은, 이하로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄의 임의의 조합을 포함한다:
(i) 서열 번호: 1095와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(ii) 서열 번호: 1097과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및
(iii) 서열 번호: 1099와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
본원의 몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, 이하로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 조합의 어느 1개를 포함하는, IL-22 결합 부분을 포함한다:
(i) 서열 번호: 1091과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH);
(ii) 서열 번호: 1092와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL); 및
(iii) 서열 번호: 1093과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH);
(iv) 서열 번호: 1094와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL).
다른 국면에 있어서, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 서열 번호: 1091 또는 1093의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은, 참조 서열에 대해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 융합 단백질의 리간드 결합 도메인은, IL-22에 결합하는 능력을 보지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개 내지 10개의 아미노산이, 서열 번호: 1091 또는 1093에 있어서 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 행해진다. 임의로, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 서열 번호: 1091 또는 1093에 있어서의 VH 서열을, 그 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 번역후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산에의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공되고, 여기에서, 항체는, 서열 번호: 1092 또는 1094의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은, 참조 서열에 대해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 융합 단백질의 리간드 결합 도메인은, IL-22에 결합하는 능력을 보지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개 내지 10개의 아미노산이, 서열 번호: 1092 또는 1094에 있어서 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 행해진다. 임의로, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 서열 번호: 1092 또는 1094에 있어서의 VL 서열을, 그 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 번역후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산에의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 제공되고, 여기에서, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인은, 상기에서 제공되는 태양의 어느 것에 있어서와 같은 VH, 및 상기에서 제공되는 태양의 어느 것에 있어서와 같은 VL을 포함한다. 일 태양에 있어서, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 각각, 서열 번호: 1091 또는 1093, 및 서열 번호: 1092 또는 1094에 있어서의 VH 서열 및 VL 서열을, 그들의 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 바람직한 태양에 있어서, IL-22에 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은, 각각, 서열 번호: 1091 및 서열 번호: 1092에 있어서의 VH 서열 및 VL 서열, 각각, 서열 번호: 1093 및 서열 번호: 1094에 있어서의 VH 서열 및 VL 서열을, 그들의 서열의 번역후 수식을 포함시켜, 포함한다. 번역후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산에의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 인터류킨-12(IL-12)인 리간드를 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 해당 IL-12는, 프로테아제에 폭로되었을 경우의 그 단백질 분해를 방해하도록 개변되어 있으며, 즉, 프로테아제 내성 IL-12이다. 개변은, 프로테아제의 존재하에서 단백질 분해를 방해하는, IL-12에 도입되는 아미노산 개변을 포함하고, 특히, 개변은, IL-12 융합 단백질의 가변 영역의 에피토프에 극히 근접하고 있는, 헤파린 결합 부위에서 행해진다.
IL-12는, 인간 마트립타제/ST14 촉매 도메인(MT-SP1) 등의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 헤파린 결합 부위를 포함한다. IL-12 융합 단백질의 특정의 경우에, 헤파린 결합 부위는, IL-12 융합 단백질의 가변 영역의 에피토프에 극히 근접하고 있는 경우가 있다. 헤파린 결합 부위에서의 프로테아제 절단은, 활성화된 IL-12 융합 단백질의 클리어런스에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 몇몇 태양에 있어서, 헤파린 결합 부위에서의 IL-12의 의도적이 아닌 절단을 방해하지만, IL-12 융합 단백질의 에피토프의 능력을 보존하기 위해서, 적어도 1개의 아미노산 개변이, IL-12의 헤파린 결합 부위 중에 도입되어도 된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "프로테아제 내성의" 또는 "프로테아제 내성"은, 프로테아제의 존재하에서 그 펩타이드 결합의 1개 또는 복수의 가수분해성 절단을 방해하는, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 등의 펩타이드 결합을 포함하는 분자의 능력을 말한다. 프로테아제 내성의 정도는, 가수분해성 절단이 평가되는 동일한 조건하에서 동일한 양의 프로테아제의 존재하에 제공되었을 경우에, 가수분해성 절단에 그다지 견딜 수 없는 동일한 정체(identity)의 다른 분자와의 비교에 의해, 측정될 수 있다. 프로테아제 절단은, 원래의 미절단의 친분자보다도 낮은 분자량의 절단된 단편이 얻어진 경우에, 확인할 수 있다. 친분자의 프로테아제 절단에서 유래하는 낮은 분자량의 단편의 검출이 가능한 당업자에게 공지된 임의의 방법이, 프로테아제 내성을 평가하기 위해서 이용될 수 있다. 실시예는, 프로테아제 내성 피험 개변체 및 프로테아제 내성이 보다 낮은 대조를, pH, 온도, 및 지속 시간을 포함하는, 동일한 조건하에서, 동일한 농도의 프로테아제에 제공하는 것을 포함한다. 계속해서, 단백질 분해성 절단에서 유래하는, 보다 낮은 분자량의 단편의 유무가, 처리된 피험 샘플 및 대조 샘플을 환원 SDS-PAGE에 제공하는 것에 의해 관찰될 수 있다.
바람직한 태양에 있어서, 재조합 인간 마트립타제/ST14 촉매 도메인(MT-SP1)(R&D Systems, Inc., 3926-SE-010)을, 프로테아제로서 이용했다. 75nM의 프로테아제 및 750nM의 프로테아제 내성 IL-12를 포함하는 융합 단백질을, PBS에 있어서 37℃의 조건하에서 1, 4, 및 24시간 인큐베이트했다. 계속해서, 프로테아제인큐베이션, 즉 프로테아제 절단 후의 친보다도 낮은 분자량의 단편의 존재를, 환원 SDS-PAGE에 의해 평가했다. 프로테아제 내성 개변체는, 소화된 분자가, 전술의 조건하에서 적어도 4시간, 최대로 24시간의 단백질 분해성 소화에 제공된 후에, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%보다 많아, 또는 100% 완전한 그대로인 경우에 선택된다. 완전한 그대로인 분자의 퍼센티지의 평가는, 예를 들어, 원래의 친분자와 비교한 소화 후의 친분자에서 유래하는, 보다 낮은 분자량의 단편(또는 없음)의 SDS-PAGE 농도 측정을 포함하는, 여러 가지 분자생물학 기술에 의한 방법에 있어서 평가될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 아미노산 개변은, MT-SP1을 포함하는 프로테아제에 의해 절단되기 쉬운 IL-12의 헤파린 결합 영역에 도입된다. 절단은, IL-12의 p40 서브유닛의 K260과 R261 사이의 헤파린 결합 영역에 있어서 생길 수 있다. 추가적인 태양에 있어서, 아미노산 개변은, IL-12의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 포지션의 개변을 포함한다. 본 명세서에 포함되는 개변 또는 개변의 조합은, 해당 개변 또는 개변의 조합을 포함하는 IL-12 개변체가, IL-12 시그널 전달을 활성화하거나 또는 개시하기 위해서 IL-12 결합 파트너, 예를 들어, IL-12Rb1, IL-12Rb2, 및 STAT4와의 결합 능력을 보지하는 한, 이하의 리스트로 한정되지 않는다. 바람직한 태양에 있어서, IL-12에 대해서 개변이 행해진 후에, IL-12(예를 들어, IL-12의 헤파린 결합 영역)는, 이하의 군(a) 내지 (p)로부터 선택되는 개변된 서열을 포함할 수 있다:
(a) KSHRE(서열 번호: 1052);
(b) KSHHE(서열 번호: 1053);
(c) KSHKE(서열 번호: 1054);
(d) KSHSE(서열 번호: 1055);
(e) KSKHRE(서열 번호: 1056);
(f) KSKQRE(서열 번호: 1057);
(g) KSKERE(서열 번호: 1058);
(h) KSKPRE(서열 번호: 1059);
(i) KHKE(서열 번호: 1060);
(j) KHHE(서열 번호: 1061);
(k) KHRE(서열 번호: 1062);
(l) KKHE(서열 번호: 1063);
(m) KRHE(서열 번호: 1064);
(n) KRE(서열 번호: 1065);
(o) KHE(서열 번호: 1066); 및
(p) KKE(서열 번호: 1067).
본원의 몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 내성 IL-12는, 서열 번호: 1068 내지 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 내성 IL-12는, 서열 번호: 1068 내지 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 태양에 있어서, 프로테아제 내성 IL-12는, 서열 번호: 1068, 서열 번호: 1069, 또는 서열 번호: 1076, 또는 서열 번호: 1077, 또는 서열 번호: 1078, 또는 서열 번호: 1079, 또는 서열 번호: 1080과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가로 다른 바람직한 태양에 있어서, 프로테아제 내성 IL-12는, 서열 번호: 1068, 서열 번호: 1069, 또는 서열 번호: 1076, 또는 서열 번호: 1077, 또는 서열 번호: 1078, 또는 서열 번호: 1079, 또는 서열 번호: 1080과 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 내성 IL-12는, 천연형 프로테아제 절단 서열인 KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 내성 IL-12는, (i) 서열 번호: 1068 내지 서열 번호: 1083으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또한 (ii) 서열 번호: 1052 내지 서열 번호: 1067로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 프로테아제 내성 IL-12는, (i) 서열 번호: 1068 내지 서열 번호: 1083으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또한 (ii) KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
일 국면에 있어서, 전술한 태양의 어느 하나의 융합 단백질을 포함하는 라이브러리가, 본 명세서에 포함되고, 여기에서, 해당 라이브러리는, 프로테아제의 비존재하와 비교하여 프로테아제의 존재하에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 1개 또는 복수의 아미노산 개변을 포함하는, 융합 단백질을 스크리닝하는 방법에 의해 얻어지고, 해당 스크리닝하는 방법은, 전술한 태양의 어느 하나에 예시되는 바와 같다.
일 국면에 있어서, 전술한 태양의 어느 하나의 융합 단백질을 포함하는 라이브러리가, 본 명세서에 포함되고, 여기에서, 해당 라이브러리는, 프로테아제의 비존재하와 비교하여 프로테아제의 존재하에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 1개 또는 복수의 아미노산 개변을 포함하는, 융합 단백질을 제조하는 방법에 의해 얻어지고, 해당 프로테아제의 비존재하와 비교하여 프로테아제의 존재하에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 1개 또는 복수의 아미노산 개변은, 전술한 태양의 어느 하나에 예시되는 바와 같은 스크리닝하는 방법에 의해 특정된다.
III. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
몇몇 태양에 있어서, 융합 단백질은, 항체 또는 그 단편을 포함하는 리간드 결합 부분/분자를 포함하고, 여기에서, 항체는, 리간드에 결합하는 전장 항체 또는 IgG 항체양 폴리펩타이드, 즉 항리간드 항체이다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같이, 융합 단백질 또는 항리간드 항체는, 생물학적 샘플에 있어서의 리간드 수용체 등의 리간드 결합 파트너의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "검출"은, 정량적 또는 정성적인 검출을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 생물학적 샘플은, 세포 또는 조직, 예를 들어, 리간드 수용체를 발현하는 암 세포 혹은 조직, 또는 리간드 수용체를 발현하는 염증성 세포 혹은 조직, 또는 임의의 리간드 수용체를 발현하는 세포 혹은 조직을 포함한다.
일 태양에 있어서, 진단 방법 또는 검출 방법에 있어서 사용하기 위한 융합 단백질 또는 항리간드 항체가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 생물학적 샘플에 있어서의 리간드 수용체 등의 리간드 결합 파트너의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 방법은, 리간드에 대한 융합 단백질 또는 항리간드 항체의 결합을 허용하는 조건하에서, 생물학적 샘플을, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 융합 단백질 또는 항리간드 항체와 접촉시키는 것, 및 융합 단백질 또는 항리간드 항체와 리간드 사이에서 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 그와 같은 방법은, 인비트로의 방법 또는 인비보의 방법일 수 있다. 일 태양에 있어서, 융합 단백질 또는 항리간드 항체는, 예를 들어, 리간드가 환자를 선택하기 위한 바이오마커인 경우, 항리간드 항체로의 치료에 적합한 피험체를 선택하기 위해서 사용된다.
특정의 태양에 있어서, 표지된 항리간드 항체가 제공된다. 표지는, 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어, 형광 표지, 발색 표지, 고전자 밀도 표지, 화학 발광 표지, 및 방사성 표지) 및, 예를 들어 효소 반응 또는 분자간 상호작용을 통해서 간접적으로 검출되는 부분(예를 들어 효소 또는 리간드)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 예시적인 표지는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하를 포함한다: 방사성 동위체 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 희토류 킬레이트 등의 발형광단 또는 플루오레세인 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 운베리페론, 반딧불 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 제4,737,456호) 등의 루시페라제, 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase: HRP), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 단당 옥시다제(예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-린산 데하이드로제나제), 우리카제 및 잔틴 옥시다제 등의 헤테로환 옥시다제, 과산화 수소를 이용하여 색소 전구체를 산화하는 효소(예를 들어 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제)와 연결된 것, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 프리 라디칼류 등.
IV. 의약 조성물/제제
본 발명의 의약 조성물은, 당업자에게 공지된 방법의 사용에 의해 제제화할 수 있다. 예를 들어, 의약 조성물은, 물 또는 다른 약학적으로 허용되는 액체를 수반하는 무균의 용액 또는 현탁액의 주사 형태로, 비경구적으로 사용할 수 있다. 의약 조성물은, 예를 들어, 펩타이드를, 약리학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균 물 또는 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하고, 그들을 혼합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 제형으로 하는 것에 의해, 제제화할 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분의 양은, 처방된 범위에서 적절한 체적을 가져오도록 설정된다.
주사를 위한 무균 조성물은, 주사용 증류수 등의 비히클을 이용하여, 통상의 제제 실시에 따라 제제화할 수 있다. 주사용의 수용액의 예에는, 생리 식염수, 포도당, 또는 다른 보조약(예를 들어, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화 나트륨)을 함유하는 등장액이 포함된다. 수용액은, 적절한 용해 보조제, 예를 들어, 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 등), 또는 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(상표), HCO-50 등)와 조합하여 이용할 수 있다.
유제의 예에는, 참기름 및 대두유가 포함된다. 유제는 또한, 용해 보조제로서의 벤조산 벤질 및/또는 벤질 알코올과 조합하여 이용할 수도 있다. 유제에는, 완충제(예를 들어, 인산염 완충액 및 아세트산 나트륨 완충액), 무통화제(예를 들어, 염산 프로카인), 안정제(예를 들어, 벤질 알코올 및 페놀), 및 산화 방지제를 보급할 수 있다. 조제된 주사액은, 통상, 적절한 앰풀에 충전된다.
본 발명의 의약 조성물은, 바람직하게는, 비경구 경로를 통해 투여된다. 예를 들어, 주사제형, 경비제형, 경폐제형, 또는 경피제형을 갖는 조성물이 투여된다. 의약 조성물은, 예를 들어, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 또는 피하 주사에 의해, 전신에 또는 국부적으로 투여 될 수 있다.
투여 방법은, 환자의 연령 및 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다. 리간드 결합 분자를 함유하는 의약 조성물의 투여량은, 예를 들어, 1투여량에 대해 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1000mg의 범위로 설정할 수 있다. 혹은, 폴리펩타이드를 함유하는 의약 조성물의 투여량은, 예를 들어, 환자당 0.001 내지 100000mg의 투여량으로 설정할 수 있다. 그러나, 본 발명은, 이들 수치에 의해 반드시 제한되지는 않는다. 투여량 및 투여 방법은, 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라서 변동하지만, 당업자는, 이들 조건을 고려하여 적절한 투여량 및 투여 방법을 설정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 약학적 제제/조성물은, 소망의 순도를 갖는 융합 단백질 또는 항체를, 1개 또는 복수의 임의의 약학적으로 허용되는 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하는 것에 의해, 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로, 조제된다. 약학적으로 허용되는 담체는, 대체로, 이용될 때의 용량 및 농도에서는 레시피언트에 대해서 비독성이며, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 인산염, 시트르산소금, 및 다른 유기산 등의 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는, 항산화제; 보존료(옥타데실다이메틸벤질 염화 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄; 염화 벤제토늄; 페놀, 뷰틸, 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르신올; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸 등); 저분자(약 10잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리바이닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는, 단당, 이당, 및 다른 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨 등의, 설탕류; 나트륨 등의 염 형성 짝이온류; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 등의 비이온계 표면 활성제. 본 명세서의 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는, 추가로 가용성 중성 활성형 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP)(예를 들어, rHuPH20(HYLENEX(등록상표), Baxter International, Inc.) 등의 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질) 등의 간질성 약제 분산제를 포함한다. 특정의 예시적 sHASEGP 및 그 사용 방법은(rHuPH20을 포함하여), 미국 특허 출원 공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 일 국면에 있어서, sHASEGP는, 콘드로이티나제 등의 1개 또는 복수의 추가적인 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 제제는, 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수용액 제제는, 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함하고 있다.
본 명세서의 조성물/제제는, 치료되는 특정의 적응증을 위해서 필요하면 1개보다 많은 유효 성분을 포함해도 된다. 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 수반하는 것이 바람직하다. 이와 같은 유효 성분은, 의도된 목적을 위해서 유효한 양으로, 호적하게 조합되어 존재한다.
유효 성분은, 예를 들어 액적 형성(코아세르베이션) 수법에 의해 또는 계면중합에 의해 조제된 마이크로캡슐(각각, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐, 및 폴리-(메타크릴산 메틸)마이크로캡슐)에 받아들여져도 되고, 콜로이드상 약제 송달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 소구체, 마이크로에멀션, 나노입자, 및 나노캡슐)에 받아들여져도 되고, 매크로에멀션에 받아들여져도 된다. 이와 같은 수법은, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
서방성 제제를 조제해도 된다. 서방성 제제의 호적한 예는, 융합 단백질 또는 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 당해 매트릭스는 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 등의 조형품의 형태이다.
생체내(in vivo) 투여를 위해서 사용되는 조성물/제제는, 통상 무균이다. 무균 상태는, 예를 들어 멸균 여과막을 통해 여과하는 것 등에 의해, 용이하게 달성된다.
V. 치료 방법 및 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 융합 단백질 또는 항체와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 의약 조성물에도 관한 것이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 세포 증식 억제제이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 암 또는 악성 종양의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용되는 의약 조성물이다.
어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 염증성 질환의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용되는 의약 조성물이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 장 및 간장의 염증성 질환의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용되는 의약 조성물이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 염증성 장 질환, 알코올성 지방간 질환, 또는 비알코올성 지방간 질환의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용되는 의약 조성물이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 궤양성 대장염 또는 크론병의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용되는 의약 조성물이다.
어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 자기면역 질환의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용되는 의약 조성물이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 관절 류머티즘, 1형 당뇨병, 및 SLE의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용되는 의약 조성물이다.
본 명세서에서 이용되는 "치료"(및 그 문법상의 파생어, 예를 들어, "치료하는" 및 "치료하는 것")는, 치료되는 개체의 자연 경과를 개변하는 것을 기도한 임상적 개입을 의미하고, 예방을 위해 및 임상적 병태의 경과 동안의 양쪽 모두에 실시 될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 영향의 감약, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 저감, 질환 상태로부터의 회복 또는 그 완화, 및 관해 또는 개선된 예후가 포함되지만, 그들로 한정되지 않는다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 리간드 결합 분자는, 리간드의 생물 활성을 제어할 수 있고, 질환의 발증을 늦추거나, 또는 질환의 진행을 늦추기 위해서 이용된다.
본 발명에 있어서, 의약 조성물이란, 통상, 질환의 치료 혹은 예방을 위한, 또는 검사 혹은 진단을 위한 의약품을 말한다.
본 발명에 있어서, 용어 "융합 단백질을 포함하는 의약 조성물"은, "치료되어야 할 대상에게 융합 단백질을 투여하는 공정을 포함하는, 질환을 치료하는 방법"과 호환적으로 이용되어도 되고, 또한 "질환의 치료용의 의약품의 제조를 위한 융합 단백질의 사용"과 호환적으로 이용되어도 된다. 또한, 용어 "융합 단백질을 포함하는 의약 조성물"은, "질환을 치료하기 위한 융합 단백질의 사용"과 호환적으로 이용되어도 된다.
본 발명에 있어서, 용어 "항체를 포함하는 의약 조성물"은, "치료되어야 할 대상에게 항체를 투여하는 공정을 포함하는, 질환을 치료하는 방법"과 호환적으로 이용되어도 되고, 또한 "질환의 치료용의 의약품의 제조를 위한 항체의 사용"과 호환적으로 이용되어도 된다. 또한, 용어 "항체를 포함하는 의약 조성물"은, "질환을 치료하기 위한 항체의 사용"과 호환적으로 이용되어도 된다.
본 발명의 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 융합 단백질 또는 항체를, 개체에게 투여할 수 있다. 리간드 결합 부분/분자의 리간드 결합 도메인과 리간드 부분 사이에는, 비공유 결합이 여전히 존재한다.
본 발명의 융합 단백질을 개체에게 투여했을 경우, 융합 단백질은, 인비보로 운반된다. 융합 단백질 중의 리간드 결합 부분은, 표적 조직에 있어서 절단되고, 그 때문에 리간드에 대한 리간드 결합 분자/부분의 리간드 결합 도메인의 비공유 결합이 감약되어, 리간드 및 리간드 결합 분자의 일부분을 융합 단백질로부터 유리시킨다. 유리된 리간드 및 유리된 리간드 결합 분자의 일부분은, 표적 조직에 있어서 리간드의 생물 활성을 발휘하여, 표적 조직에 의해 야기되는 질환을 치료할 수 있다. 리간드 결합 도메인이 리간드에 결합하고 있는 경우에는, 리간드 결합 부분이 리간드 부분의 생물 활성을 억제하고, 리간드 결합 부분이 표적 조직에 있어서 특이적으로 절단되는 태양에 있어서, 융합 단백질 중의 리간드는, 운반 중에는 생물 활성을 발휘하지 않고, 융합 단백질이 표적 조직에 있어서 절단되었을 때에만 생물 활성을 발휘한다.
결과로서, 전신 유해 반응이 보다 적은 상태에서, 질환을 치료할 수 있다.
일 국면에 있어서, 리간드 부분은, IL-12 또는 IL-22이며, 융합 단백질 또는 항리간드 항체는, IL-12 또는 IL-22에 결합한다. 이 국면에 있어서, 의약품으로서의 사용을 위한, IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, IL-12 또는 IL-22 매개성 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 치료 방법에 있어서의 사용을 위한, IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, IL-12 혹은 IL-22 매개성 질환, 또는 암, 또는 악성 종양, 또는 염증성 질환, 또는 자기면역 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, 해당 개체에게 IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한, IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체를 제공한다. 하나의 그와 같은 태양에 있어서, 방법은, 개체에게, 예를 들어 하기와 같은, 적어도 1개의 추가 치료제의 유효량을 투여하는 공정을, 추가로 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 발명은, 개체에 있어서의 IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 조절에 있어서의 사용을 위한, IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 개체에 있어서의 IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 조절의 방법으로서, IL-12 혹은 IL-22 매개성 질환, 또는 암, 또는 악성 종양, 또는 염증성 질환, 또는 자기면역 질환을 치료하기 위해서, 해당 개체에게 IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한, IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체를 제공한다. 상기 태양의 어느 것에 의한 "개체"는, 바람직하게는 인간이다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 의약품의 제조 또는 조제에 있어서의 IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체의 사용을 제공한다. 일 태양에 있어서, 의약품은, IL-12 혹은 IL-22 매개성 질환, 또는 암, 또는 악성 종양, 또는 염증성 질환, 또는 자기면역 질환의 치료를 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약품은, IL-12 또는 IL-22 매개성 질환을 치료하는 방법으로서, IL-12 혹은 IL-22 매개성 질환, 또는 암, 또는 악성 종양, 또는 염증성 질환, 또는 자기면역 질환을 갖는 개체에게, 의약품의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한 것이다. 하나의 그와 같은 태양에 있어서, 방법은, 개체에게, 예를 들어 하기와 같은, 적어도 1개의 추가 치료제의 유효량을 투여하는 공정을, 추가로 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 의약품은, 개체에 있어서의 IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 조절을 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약품은, 개체에 있어서의 IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 조절의 방법으로서, IL-12 혹은 IL-22 매개성 질환, 또는 암, 또는 악성 종양, 또는 염증성 질환, 또는 자기면역 질환을 치료하기 위해서, 해당 개체에게 의약품의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한 것이다. 상기 태양의 어느 것에 의한 "개체"는, 인간이어도 된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, IL-12 혹은 IL-22 매개성 질환, 또는 암, 또는 악성 종양, 또는 염증성 질환, 또는 자기면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 방법은, 그와 같은 IL-12 혹은 IL-22 매개성 질환, 또는 암, 또는 악성 종양, 또는 염증성 질환, 또는 자기면역 질환을 갖는 개체에게, IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함한다. 하나의 그와 같은 태양에 있어서, 방법은, 개체에게, 예를 들어 하기와 같은, 적어도 1개의 추가 치료제의 유효량을 투여하는 공정을, 추가로 포함한다. 상기 태양의 어느 것에 의한 "개체"는, 인간이어도 된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 개체에 있어서의 IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 조절을 위한 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 방법은, IL-12 또는 IL-22 시그널 전달을 조절하기 위해서, 개체에 IL-12 혹은 IL-22 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함한다. 일 태양에 있어서, "개체"는, 인간이다.
전술과 같이, IL-12 또는 IL-22 매개성 질환의 치료란, IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 증가 또는 증강에 의해 개선 또는 예방되기 쉬운 임의의 질환, 장애, 또는 상태의 치료를 말한다. 본 발명은, IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 증가 또는 증강에 의해 개선 또는 예방되기 쉬운 임의의 질환, 장애, 또는 상태의 치료에 있어서의 사용을 위한, 본 명세서에 기재되는 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체의 사용을 포함한다. 추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 증가 또는 증강에 의해 개선 또는 예방되기 쉬운 임의의 질환, 장애, 또는 상태의 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의, 본 명세서에 기재되는 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체의 사용을 포함한다. 또 추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 증가 또는 증강에 의해 개선 또는 예방되기 쉬운 임의의 질환, 장애, 또는 상태를 치료하는 방법에 있어서의, 본 명세서에 기재되는 융합 단백질 또는 항IL-12 혹은 항IL-22 항체를 포함한다. 추가적인 국면에 있어서, IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 조절은, IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 증가 또는 증강에 의해 개선 또는 예방되기 쉬운 질환, 장애, 또는 상태의 치료를 개선 또는 예방하는, 해당 IL-12 또는 IL-22 시그널 전달의 증가 또는 증강이다.
일 태양에 있어서, 바람직한 세포형은, 종양 미소 환경 내의 IL-12 또는 IL-22 리간드 수용체 발현 세포이다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명은, 암 또는 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하고, 본 방법은, 예를 들어, 위암, 두경부암(H＆N), 식도암, 폐암, 간장암, 난소암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 피부암, 근육 종양, 췌장암, 전립선암, 정소암, 자궁암, 담관암, 메르켈 세포암, 방광암 갑상선암, 신경초종, 부신암(부신), 항문암, 중추 신경계 종양, 신경 내분비 조직 종양, 음경암, 흉막 종양, 타액선 종양, 외음암, 흉선종, 및 소아암(윌름스 종양, 신경아종, 육종, 간아종, 및 배세포 종양)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 암을 갖는 개체에게 투여하는 공정을 포함한다. 보다 더 바람직한 암 타입에는, 위암, 두경부암(H＆N), 식도암, 폐암, 간장암, 난소암, 유방암, 결장암, 신장암, 피부암, 근육 종양, 췌장암, 전립선암, 정소암, 및 자궁암이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다(Tumori. (2012) 98, 478-484; Tumor Biol. (2015) 36, 4671-4679; Am J Clin Pathol (2008) 130, 224-230; Adv Anat Pathol (2014) 21, 450-460; Med Oncol (2012) 29, 663-669; Clinical Cancer Research (2004) 10, 6612-6621; Appl Immunohistochem Mol Morphol (2009) 17, 40-46; Eur J Pediatr Surg (2015) 25, 138-144; J Clin Pathol (2011) 64, 587-591; Am J Surg Pathol (2006) 30, 1570-1575; Oncology (2007) 73, 389-394; Diagnostic Pathology (2010) 64, 1-6; Diagnostic Pathology (2015) 34, 1-6; Am J Clin Pathol (2008) 129, 899-906; Virchows Arch (2015) 466, 67-76).
몇몇 태양에 있어서, 개체는, 상기의 융합 단백질 혹은 항체, 또는, 및/또는 어떤 종류의 항암제로의 치료를, 융합 단백질 또는 항체 및 추가 치료제를 이용하는 병용 요법에 앞서 받았던 적이 있는 환자이다. 몇몇 태양에 있어서, 환자는, 표준 요법을 받을 수 없거나, 또는 표준 요법이 무효인 환자이다. 몇몇 태양에 있어서, 환자가 갖는 암은, 조기 또는 말기이다.
본 명세서에서 이용되는 경우, "암"이란, 난소암 또는 위암 등의 상피성 악성 종양뿐만 아니라, 만성 림프성 백혈병 또는 호지킨 림프종 등의 조혈계 종양을 포함하는 비상피성 악성 종양도 말한다. 본 명세서에 있어서, 용어 "암", "암종", "종양", "신생물" 등은, 서로 구별되지 않고, 서로 교환 가능하다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 예를 들어, 상기 치료적 방법의 어느 것에 있어서의 사용을 위한, 본 명세서에서 제공되는 융합 단백질 또는 항체의 어느 것을 포함하는, 의약 조성물/제제를 제공한다. 일 태양에 있어서, 의약 조성물/제제는, 본 명세서에서 제공되는 융합 단백질 또는 항체의 어느 것과, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 태양에 있어서, 의약 조성물/제제는, 본 명세서에서 제공되는 융합 단백질 또는 항체의 어느 것과, 예를 들어, 하기와 같은, 적어도 1개의 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 또는 항체는, 요법에 있어서, 단독 또는 다른 제와의 조합의 어느 것도 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 또는 항체는, 적어도 1개의 추가 치료제와 동시 투여되어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 추가 치료제는, 세포 증식 억제제, 화학요법제, 또는 면역 억제제여도 된다. 일 태양에 있어서, 추가 치료제는, 면역 체크포인트 저해제이다.
전술한 바와 같은 병용 요법은, 병용 투여(2개 이상의 치료제가, 동일 또는 별도의 제제에 포함된다), 및 개별 투여를 포함하고, 개별 투여의 경우, 본 발명의 항체의 투여가 추가 치료제의 투여에 앞서, 그와 동시에, 및/또는, 그에 계속해서, 행해질 수 있다. 일 태양에 있어서, 융합 단백질 또는 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는, 서로, 약 1개월 이내, 또는 약 1, 2, 또는 3주간 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 행해진다. 본 발명의 융합 단백질 또는 항체는, 방사선 요법과 조합하여 사용될 수도 있다.
본 발명의 비한정적인 태양에 있어서, 본 발명의 의약 조성물(병용 요법)은, 면역 체크포인트 저해제에서의 치료에 대해서 난치성인 암을 갖는 환자를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 체크포인트 저해제의 투여가, 소망의 약물 유효성을 달성할 수 없었던, 리간드에 관련된 암을 갖는 환자를, 본 발명의 의약 조성물(병용 요법)로 치료할 수 있다. 환언하면, 면역 체크포인트 저해제를 이용한 요법으로 이미 치료되고 있는 리간드에 관련된 암을, 본 발명의 의약 조성물(병용 요법)로 치료할 수 있다. 의약 조성물에 포함되는 추가 치료제의 바람직한 예에는, 면역 체크포인트 저해제가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 비한정적인 태양에 있어서, 본 발명의 의약 조성물(병용 요법)은, 본 발명의 융합 단백질 또는 항체에서의 치료에 대해서 난치성인 암을 갖는 환자를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 그 암이, 본 발명의 융합 단백질 혹은 항체의 투여 후에 해당 단백질 혹은 항체에 대해서 저항성이 되어 있거나, 또는 본 발명의 단백질 혹은 항체의 투여가, 소망의 약물 유효성을 달성할 수 없었던, 리간드에 관련된 암을 갖는 환자를, 본 발명의 의약 조성물(병용 요법)로 치료할 수 있다. 환언하면, 본 발명의 융합 단백질 또는 항체를 이용한 요법으로 이미 치료되고 있는 리간드에 관련된 암을, 본 발명의 의약 조성물(병용 요법)로 치료할 수 있다. 의약 조성물에 포함되는 추가 치료제의 바람직한 예에는, 면역 체크포인트 저해제가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 융합 단백질 또는 항체(및, 임의의 추가 치료제)는, 비경구 투여, 폐내 투여, 및 경비 투여, 또한 국소적 처치를 위해서 요망되는 경우는 병소내 투여를 포함하는, 임의의 호적한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 투여가 단기인지 장기인지에 일부 따라서, 예를 들어, 정맥내 주사 또는 피하 주사 등의 주사에 의하는 등, 임의의 호적한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 이들로 한정되는 것은 아니지만, 단회 투여 또는 여러 가지 시점에 걸치는 반복 투여, 볼러스 투여, 및, 펄스 주입을 포함하는, 여러 가지 투약 스케줄이 본 명세서의 고려 내에 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 항체는, 우량 의료 규범(good medical practice)에 일치한 방식으로, 제제화되고, 투약되고, 또한 투여된다. 이 관점에서 고려되어야 할 인자는, 치료되고 있는 그 특정의 장애, 치료되고 있는 그 특정의 포유동물, 개개의 환자의 임상 증상, 장애의 원인, 제를 송달하는 부위, 투여 방법, 투여의 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 융합 단백질 또는 항체는, 반드시 그렇지 않아도 되지만, 임의로, 문제의 장애를 예방하기 또는 치료하기 위해서 실제로 사용되고 있는 1개 또는 복수의 제와 함께, 제제화된다. 그와 같은 다른 제의 유효량은, 제제 중에 존재하는 융합 단백질 또는 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입, 및 위에서 논한 다른 인자에 의존한다. 이들은 통상, 본 명세서에서 기술한 바와 같은 용량 및 투여 경로로, 또는 본 명세서에서 기술한 용량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험적/임상적으로 적절하다고 판단되는 임의의 용량 및 임의의 경로로, 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 융합 단백질 또는 항체의 적절한 용량(단독으로 이용될 때 또는 1개 또는 복수의 다른 추가 치료제와 함께 이용될 때)은, 치료되는 질환의 타입, 항체의 타입, 질환의 중증도 및 경과, 융합 단백질 또는 항체가 예방적 목적으로 투여되는지 치료적 목적으로 투여되는지, 약력, 환자의 임상력 및 융합 단백질 또는 항체에 대한 응답, 및, 주치의의 재량에 의존할 것이다. 융합 단백질 또는 항체는, 환자에 대해서, 1회로, 또는 일련의 처치에 걸쳐서, 호적하게 투여된다. 질환의 타입 및 중증도에 따라서, 예를 들어, 1회 또는 복수회의 별도의 투여에 의하든지 연속 주입에 의하든지, 약 1μg/kg 내지 15mg/kg(예를 들어, 0.1mg/kg 내지 10mg/kg)의 융합 단백질 또는 항체가, 환자에 대한 투여를 위한 최초의 후보 용량이 될 수 있다. 하나의 전형적인 1일 용량은, 전술한 인자에 의존하여, 약 1μg/kg으로부터 100mg/kg 이상까지, 폭이 있어도 된다. 수일 또는 보다 길게 걸친 반복의 투여의 경우, 상황에 따라, 치료는 통상 질환 증상의 소망의 억제가 일어날 때까지 유지된다. 융합 단백질 또는 항체의 하나의 예시적인 용량은, 약 0.05mg/kg으로부터 약 10mg/kg의 범위 내이다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg, 혹은 10mg/kg의 1개 또는 복수의 용량(또는 이들의 임의의 조합)이, 환자에게 투여되어도 된다. 이러한 용량은, 단속적으로, 예를 들어 1주간마다 또는 3주간마다(예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6용량의 융합 단백질 또는 항체를 받도록), 투여되어도 된다. 높은 초회 부하 용량 후에, 1회 또는 복수회의 저용량이 투여되어도 된다. 이 요법의 경과는, 종래의 수법 및 측정법에 의해, 용이하게 모니터링된다.
전술한 제제 또는 치료적 방법의 어느 것에 대해서도, 융합 단백질 또는 항체 대신에 또는 그것에 추가하여, 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 이용하여 실시해도 됨이, 이해될 것이다.
VI. 제품
본 발명의 다른 국면에 있어서, 전술한 장애의 치료, 예방, 및/또는 진단에 유용한 기재를 포함하는 제품이, 제공된다. 제품은, 용기, 및 당해 용기 상의 라벨 또는 당해 용기에 부속되는 첨부 문서를 포함한다. 바람직한 용기로서는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기류는, 유리나 플라스틱 등의, 다양한 재료로 형성되어 있어도 된다. 용기는 조성물을 단체(單體)로 보지해도 되고, 증상의 치료, 예방, 및/또는 진단을 위해서 유효한 다른 조성물과 조합하여 보지해도 되고, 또한, 무균적인 액세스 포토를 갖고 있어도 된다(예를 들어, 용기는, 피하 주사바늘에 의해 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 투여용 용액 백 또는 바이알이어도 된다). 조성물 중의 적어도 1개의 유효 성분은, 본 발명의 융합 단백질 또는 항체이다. 라벨 또는 첨부 문서는, 조성물이 선택된 증상을 치료하기 위해서 사용되는 것임을 나타낸다. 더욱이 제품은, (a) 제1 용기로서, 그 속에 담긴 본 발명의 융합 단백질 또는 항체를 포함하는 조성물을 수반하는, 제1 용기; 및, (b) 제2 용기로서, 그 속에 담긴 세포상해제 또는 그 이외에 치료적인 제를 포함하는 조성물을 수반하는, 제2 용기를 포함해도 된다. 본 발명의 이 태양에 있어서의 제품은, 추가로 조성물이 특정의 증상을 치료하기 위해서 사용될 수 있음을 나타내는, 첨부 문서를 포함해도 된다. 혹은 또는 더하여, 제품은 추가로 주사용 제균수(BWFI), 인산 완충 생리 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액 등의, 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는, 제2(또는 제3) 용기를 포함해도 된다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지 등의, 다른 상업적 관점 또는 유저의 입장에서 바람직한 기재를 추가로 포함해도 된다.
전술한 제품의 어느 것에 대해서도, 융합 단백질 또는 항체 대신에 또는 그것에 추가하여, 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 포함해도 됨이, 이해될 것이다.
VII. 본 발명을 이용하는 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일 태양에 있어서, 본 발명은, 융합 단백질을 제조하는 방법으로서,
(a) 리간드 결합 도메인 및 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 리간드 결합 부분,
(b) 리간드 분자, 및
(c) 비절단 가능 펩타이드 링커
를 제공하는 공정; 및
비절단 가능 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 분자를 리간드 결합 분자의 C말단 영역 또는 리간드 결합 도메인의 N말단 영역에 접속하는 공정
을 포함하는, 상기 방법을 제공한다.
바람직한 태양에 있어서, 본 발명은, 2개의 리간드 결합 부분을 포함하는 2가 융합 단백질을 제조하는 방법으로서,
각 리간드 결합 부분에 대해
(a) 리간드 결합 도메인 및 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 리간드 결합 분자,
(b) 리간드 분자, 및
(c) 비절단 가능 펩타이드 링커
를 제공하는 공정; 및
각 리간드 결합 부분에 있어서, 비절단 가능 펩타이드 링커를 개재시켜, 리간드 분자를 리간드 결합 분자의 C말단 영역 또는 리간드 결합 도메인의 N말단 영역에 접속하는 공정
을 포함하는, 상기 방법을 제공한다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 2개의 리간드 결합 부분을 포함하는 2가 융합 단백질을 제조하는 방법은, 이하의 공정을 포함하는 제조 방법이다:
(a) 표적 리간드에 결합하는 가변 영역을 포함하는 항체를 얻는 공정;
(b) 프로테아제 절단 서열을, VH 또는 VL과 정상 영역의 경계 부근에 도입하는 공정;
(c) 제1 가동 링커를, 가변 영역과 Fc 사이의 힌지 영역에 도입하는 공정;
(d) 융합 단백질 또는 폴리펩타이드로부터의 VH 도메인 또는 VL 도메인의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 변이 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 변이를, 해당 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 변이를, 리간드 또는 항원과 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(e) 공정(d)에 있어서 얻어진 분자를, 표적 리간드와 연결하는 공정.
본 발명의 일 태양에 있어서, 2가 융합 단백질을 제조하는 방법은, 이하의 공정을 추가로 포함한다:
(f) 융합 단백질이 미절단 상태에 있는 경우에, 융합 단백질 중에 짜 넣어진 리간드가, 그 결합 파트너에 대해서 감약된 결합 활성을 갖는 것을 확인하는 공정.
본 발명의 일 태양에 있어서, 2가 융합 단백질을 제조하는 방법은, 이하의 공정을 추가로 포함한다:
(g) 융합 단백질이 절단 상태에 있는 경우에, 융합 단백질중에 짜 넣어진 리간드가, 그 결합 파트너에 대해서 복원된 결합 활성을 갖는 것을 확인하는 공정.
본 발명의 일 태양에 있어서, 2가 융합 단백질을 제조하는 방법은, 이하의 공정을 추가로 포함한다:
(h) 공정(d)에 있어서 도입된 아미노산 개변이, 공정(a)의 가변 영역에 대한 리간드의 결합을 파괴하지 않는 것을 확인하는 공정,
(i) 공정(d)에 있어서 도입된 아미노산 개변이, 제1 상태보다도 제2 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 것을 확인하는 공정.
리간드에 결합할 수 있는 분자 중에 프로테아제 절단 서열을 도입하는 방법의 예에는, 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중에 프로테아제 절단 서열을 삽입하는 방법, 및 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 일부분을 프로테아제 절단 서열로 치환하는 방법이 포함된다.
아미노산 서열 A를 아미노산 서열 B 중에 "삽입하는" 것은, 아미노산 서열 B를, 결실을 수반하지 않는 2개의 파트로 분할하는 것, 및 해당 2개의 파트를 아미노산 서열 A로 연결하는 것(즉, "아미노산 서열 B의 전반-아미노산 서열 A-아미노산 서열 B의 후반"과 같은 아미노산 서열을 제조하는 것)을 말한다. 아미노산 서열 A를 아미노산 서열 B 중에 "도입하는" 것은, 아미노산 서열 B를 2개의 파트로 분할하는 것, 및 해당 2개의 파트 사이를 아미노산 서열 A로 연결하는 것을 말한다. 이것은, 위에서 설명한 바와 같이 아미노산 서열 A를 아미노산 서열 B 중에 "삽입하는 것"뿐만 아니라, 아미노산 서열 A에 인접하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열 B의 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기를 결실시킨 후에, 아미노산 서열 A로 2개의 파트를 연결하는 것(즉, 아미노산 서열 B의 일부분을 아미노산 서열 A로 치환하는 것)도 포함한다.
리간드에 결합할 수 있는 분자를 취득하는 방법의 예에는, 리간드에 결합하는 능력을 갖는 리간드 결합 도메인을 취득하는 방법이 포함된다. 리간드 결합 도메인은, 예를 들어, 당 기술 분야에서 공지된 항체 조제법을 이용한 방법에 의해 취득된다.
조제법에 의해 얻어진 항체는, 융합 단백질에 있어서 직접 이용되어도 되고, 또는 얻어진 항체에 있어서의 Fv 영역만이 이용되어도 된다. 단쇄("sc"라고도 한다) 형태의 Fv 영역이, 리간드를 인식할 수 있는 경우에는, 해당 단쇄가 이용되어도 된다. 혹은, Fv 영역을 함유하는 Fab 영역이 이용되어도 된다.
소망의 결합 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편을 조제하는 방법은, 당업자에게 공지이다. 이하, IL-12 또는 IL-22에 결합하는 항체(항IL-12 또는 항IL-22 항체)를 조제하는 방법을, 예로서 나타낸다. IL-12 또는 IL-22 이외의 항원에 결합하는 항체도 또한, 이하에 나타나는 예에 따라 적절히 조제할 수 있다. 따라서, 이하에 예로서 기재되는 방법을 적절히 적응시키는 것에 의해, IL-12 혹은 IL-22 또는 IL-12 혹은 IL-22 이외의 항원에 대해서 소망의 결합 활성을 갖는 IgG 항체양 폴리펩타이드 및/또는 그 항체 단편을 조제하는 것은, 당업자의 전문 기술 및 지식의 범위 내이다.
항IL-12 또는 항IL-22 항체는, 당 기술 분야에서 공지된 어프로치의 사용에 의해, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는, 하이브리도마법(Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)) 또는 재조합법(미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조되어도 된다. 혹은, 모노클로날 항체는, 파지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 단리되어도 된다(Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)). 또한, 모노클로날 항체는, 단일 B 세포 클론으로부터 단리되어도 된다(N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011)).
포유동물 유래의 모노클로날 항체를, 바람직하게는, 항IL-12 또는 항IL-22 항체로서 조제할 수 있다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체는, 예를 들어, 하이브리도마에 의해 산생되는 것, 및 유전자 공학 어프로치에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 의해 산생되는 것을 포함한다. 본원에 기재되는 항체는, "인간화 항체" 및 "키메라 항체"를 포함한다.
인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불린다. 구체적으로는, 예를 들어, 비인간 동물(예를 들어, 마우스) 항체의 CDR이 이식된 인간 항체로 이루어지는 인간화 항체가, 당 기술 분야에서 공지이다. 인간화 항체를 취득하기 위한 일반적인 유전자 재조합 어프로치도 또한, 공지이다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR을 인간 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들어, 오버랩 신장 PCR이 공지이다.
연결된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 함유하는 항체 가변 영역을 코딩하는 DNA와, 인간 항체 정상 영역을 코딩하는 DNA를, 이들 DNA가 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입하여, 인간화 항체 발현용 벡터를 조제할 수 있다. 삽입물을 갖는 벡터를, 숙주 중에 트랜스펙트하여, 재조합 세포를 수립한다. 그 다음에, 인간화 항체를 코딩하는 DNA의 발현을 위해서 재조합 세포를 배양하여, 인간화 항체를 배양 세포의 배양물 중에 산생시킨다(유럽 특허 공개 제239400호 및 국제 공개 번호 WO1996/002576 참조).
필요한 경우에는, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록, FR의 아미노산 잔기가 치환되어도 된다. 예를 들어, 마우스 CDR의 인간 FR에의 이식에 이용되는 PCR법의 응용에 의해, FR의 아미노산 서열에 변이를 도입할 수 있다.
인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물(국제 공개 번호 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, 및 WO1996/033735 참조)을 면역 동물로서 이용한 DNA 면역에 의해, 소망의 인간 항체를 취득할 수 있다.
더하여, 인간 항체 라이브러리를 이용한 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기법도 또한, 공지이다. 예를 들어, 인간 항체 Fv 영역을, 단쇄 항체("scFv"라고도 한다)로서, 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면 상에 발현시킨다. 항원 결합 scFv를 발현하는 파지를, 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하여, 항원 결합 인간 항체의 Fv 영역을 코딩하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원 결합 scFv의 DNA 서열의 결정 후에, Fv 영역 서열을, 소망의 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임으로 융합시키고, 그 다음에, 적절한 발현 벡터 중에 삽입하여, 발현 벡터를 조제할 수 있다. 인간 항체를 코딩하는 유전자의 발현을 위해서, 발현 벡터를 위에 열기한 바람직한 발현 세포 중에 트랜스펙트하여, 인간 항체를 취득한다. 이들 방법은, 당 기술 분야에서 기지이다(국제 공개 번호 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, 및 WO1995/015388 참조).
모노클로날 항체 산생 하이브리도마는, 당 기술 분야에서 공지된 기법의 사용에 의해, 예를 들어, 이하와 같이 조제할 수 있다: 통상의 면역 방법에 따라, IL-12 또는 IL-22 단백질을 감작 항원으로서 이용하여, 포유동물을 면역한다. 이와 같이 하여 얻어진 면역 세포를, 통상의 세포 융합법에 의해, 당 기술 분야에서 공지된 친세포와 융합시킨다. 다음에, 모노클로날 항체를 산생하는 세포를, 통상의 스크리닝법에 의해 스크리닝하여, 항IL-12 또는 항IL-22 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택할 수 있다.
구체적으로는, 모노클로날 항체는, 예를 들어, 이하와 같이 조제한다: 우선, IL-12 또는 IL-22 유전자를 발현시켜, 항체 취득을 위한 감작 항원으로서 이용되는 IL-12 또는 IL-22 단백질을 취득할 수 있다. 구체적으로는, IL-12 또는 IL-22를 코딩하는 유전자 서열을, 당 기술 분야에서 공지된 발현 벡터 중에 삽입하고, 그 다음에, 적절한 숙주 세포를 그것으로 형질 전환시킨다. 소망의 인간 IL-12 또는 IL-22 단백질을, 당 기술 분야에서 공지된 방법에 의해, 숙주 세포로부터 또는 그 배양 상청 중으로부터 정제한다. 배양 상청으로부터 가용형 IL-12 또는 IL-22를 취득하기 위해서는, 예를 들어, Jayanthi et al. (Protein Expr Purif. 2014 Oct; 102: 76-84)에 의해 기재되어 있는 바와 같은 가용형 IL-12 또는 IL-22를 발현시킨다. 혹은, 정제된 천연의 IL-12 또는 IL-22 단백질도 또한, 감작 항원으로서 이용할 수 있다.
정제된 IL-12 또는 IL-22 단백질을, 포유동물의 면역에 있어서의 사용을 위한 감작 항원으로서 이용할 수 있다. IL-12 또는 IL-22의 부분 펩타이드도 또한, 감작 항원으로서 이용할 수 있다. 이 부분 펩타이드는, 인간 IL-12 또는 IL-22의 아미노산 서열로부터 화학 합성에 의해 취득될 수 있다. 혹은, 부분 펩타이드는, IL-12 또는 IL-22 유전자의 일부분의 발현 벡터에의 짜 넣기, 및 그것에 계속되는 그 발현에 의해 취득될 수 있다. 더욱이, 부분 펩타이드는 또한, 단백질 분해 효소에서의 IL-12 또는 IL-22 단백질의 분해에 의해서도 취득할 수 있다. 그와 같은 부분 펩타이드로서의 사용을 위한 IL-12 또는 IL-22 펩타이드의 영역 및 사이즈는, 구체적인 태양에 의해 특별히 한정되지 않는다. 감작 항원으로서의 펩타이드를 구성하는 아미노산의 수는, 바람직하게는, 적어도 5개 이상, 예를 들어, 6개 이상 또는 7개 이상이다. 보다 구체적으로는, 8 내지 50, 바람직하게는 10 내지 30잔기의 펩타이드를, 감작 항원으로서 이용할 수 있다.
또한, 상이한 폴리펩타이드와 융합한, IL-12 또는 IL-22 단백질의 소망의 부분 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 융합 단백질을, 감작 항원으로서 이용할 수도 있다. 예를 들어, 항체 Fc 단편 또는 펩타이드 태그를, 감작 항원으로서의 사용을 위해서 융합 단백질을 제작하기 위해서 바람직하게 이용할 수 있다. 융합 단백질의 발현을 위한 벡터는, 2타입 이상의 소망의 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 유전자를 인프레임으로 융합시키는 것, 및 융합 유전자를 상기와 같이 발현 벡터 중에 삽입하는 것에 의해, 조제할 수 있다. 융합 단백질을 조제하는 방법은, Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9. 58 (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press)에 기재되어 있다. 감작 항원으로서의 사용을 위한 IL-12를 취득하는 방법 및 이 감작 항원을 이용한 면역 방법은 또한, WO2003/000883, WO2004/022754, WO2006/006693 등에도 구체적으로 기재되어 있다.
감작 항원으로 면역되는 포유동물은, 특정의 동물로 한정되지 않는다. 면역되는 포유동물은, 바람직하게는, 세포 융합에 있어서의 사용을 위한 친세포와의 적합성을 고려하여 선택된다. 일반적으로는, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 및 햄스터), 토끼, 원숭이 등이, 바람직하게 이용된다.
이들 동물은, 당 기술 분야에서 공지된 방법에 따라, 감작 항원으로 면역된다. 예를 들어, 일반적인 면역 방법은, 복강내 주사 또는 피하 주사에 의해 감작 항원을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 구체적으로는, PBS(인산 완충 식염수), 생리 식염수 등에 의해 적절한 희석률로 희석한 감작 항원을, 소망의 경우에는, 통상의 아주반트, 예를 들어, 프로인트(Freund) 완전 아주반트와 혼합하여, 유화시킨다. 그 다음에, 결과로서 생긴 감작 항원을, 4 내지 21일의 간격으로 수회, 포유동물에게 투여한다. 또한, 감작 항원에서의 면역에 있어서, 적절한 담체를 이용할 수 있다. 특히, 분자량이 작은 부분 펩타이드를 감작 항원으로서 이용하는 경우에는, 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질에 결합한 감작 항원 펩타이드로의 면역이, 경우에 따라서는 바람직할 가능성이 있다.
혹은, 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마는 또한, DNA 면역의 사용에 의해, 하기와 같이 조제할 수도 있다. DNA 면역은, 면역 동물 중에서 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 형태로 구축되어 있는 벡터 DNA를 부여한 면역 동물에 있어서 감작 항원을 인비보로 발현시키는 것에 의해, 면역 동물을 면역 자극하는 것을 포함하는, 면역 방법이다. DNA 면역은, 이하와 같이, 면역되는 동물에 대한 단백질 항원의 투여를 이용한 일반적인 면역 방법보다도 우수하다고 기대할 수 있다:
- DNA 면역은, 막단백질(예를 들어, IL-12 또는 IL-22)의 구조를 유지한 면역 자극을 제공할 수 있고; 또한
- DNA 면역은, 면역 항원을 정제할 필요를 배제한다.
DNA 면역에 의해 본 발명의 모노클로날 항체를 취득하기 위해서, 우선, IL-12 또는 IL-22 단백질 발현을 위한 DNA를, 면역되어야 할 동물에게 투여한다. IL-12 또는 IL-22를 코딩하는 DNA는, PCR 등의 당 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 합성할 수 있다. 얻어진 DNA를, 적절한 발현 벡터 중에 삽입하고, 그 다음에, 면역되어야 할 동물에게 투여한다. 예를 들어, pcDNA3.1 등의 시판되는 발현 벡터를, 발현 벡터로서 바람직하게 이용할 수 있다. 벡터는, 일반적으로 이용되고 있는 방법에 의해, 생물에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 그 위에 흡착된 금 입자를, 유전자총을 이용하여 동물 개체의 세포 중에 도입하는 것에 의해, 당해 동물 개체를 DNA 면역한다. 더욱이, IL-12 또는 IL-22를 인식하는 항체는 또한, WO2003/104453에 기재되어 있는 방법의 사용에 의해서도 조제할 수 있다.
이와 같이 하여 면역된 포유동물의 혈청에 있어서, IL-12 또는 IL-22에 결합하는 항체의 역가의 상승을 확인한다. 그 다음에, 포유동물로부터 면역 세포를 수집하여, 세포 융합에 제공한다. 특히, 비(脾) 세포를, 바람직한 면역 세포로서 이용할 수 있다.
포유동물 미엘로마 세포를, 면역 세포와의 세포 융합에 있어서 이용한다. 미엘로마 세포는, 바람직하게는, 스크리닝을 위한 적절한 선택 마커를 갖는다. 선택 마커란, 특정의 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 생존할 수 없는) 형질을 말한다. 예를 들어, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜페라제 결손(이하, HGPRT 결손이라고 한다) 또는 티미딘 키나제 결손(이하, TK 결손이라고 한다)이, 선택 마커로서 당 기술 분야에서 공지이다. HGPRT 결손 또는 TK 결손을 갖는 세포는, 하이포잔틴아미노프테린-티미진에 대해서 감수성이다(이하, HAT 감수성이라고 한다). HAT 감수성 세포는, HAT 선택 배지에 있어서, DNA를 합성할 수 없기 때문에 사멸한다. 대조적으로, 이들 세포는, 정상 세포와 융합하면, 융합 세포가 정상 세포의 샐비지 경로의 사용에 의해 DNA 합성을 계속할 수 있기 때문에, HAT 선택 배지에 있어서도 증식할 수 있게 된다.
HGPRT 결손 또는 TK 결손을 갖는 세포는, HGPRT 결손에 대해서는 6-싸이오구아닌 혹은 8-아자구아닌(이하, 8AG라고 약칭한다), 또는 TK 결손에 대해서는 5'-브로모데옥시유리딘을 함유하는 배지에 있어서 선택할 수 있다. 정상 세포는, 이들 피리미딘 아날로그를 그 DNA 중에 짜 넣는 것에 의해 사멸한다. 대조적으로, 이들의 효소를 결손한 세포는, 피리미딘 아날로그를 그 중에 짜 넣을 수 없기 때문에 선택 배지에 있어서 생존할 수 있다. 더하여, G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민 항생 물질(겐타마이신 아날로그)에 대한 내성을 준다. 세포 융합에 호적한 여러 가지 미엘로마 세포가, 당 기술 분야에서 공지이다.
예를 들어, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11(Cell (1976) 8 (3), 405-415), SP2/0(Nature (1978) 276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU. 1(J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), 및 R210(Nature (1979) 277 (5692), 131-133)을, 바람직하게는, 그와 같은 미엘로마 세포로서 이용할 수 있다.
기본적으로는, 당 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어, Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 방법에 따라, 면역 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합이 행해진다. 보다 구체적으로는, 세포 융합은, 예를 들어, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배지에 있어서 실시할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 또는 센다이 바이러스(HVJ)가, 융합 촉진제로서 이용된다. 더하여, 소망의 경우에는, 융합 효율을 높이기 위해서, 다이메틸설폭사이드 등의 보조제가, 사용을 위해서 그것에 첨가된다.
이용되는 면역 세포와 미엘로마 세포의 비율은, 임의로 설정할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포의 양은, 바람직하게는, 미엘로마 세포의 양의 1 내지 10배로 설정된다. 예를 들어, 미엘로마 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배지 또는 MEM 배지, 및 이 종의 세포 배양에 있어서의 사용을 위한 통상의 배지가, 세포 융합에 있어서 배지로서 이용된다. 바람직하게는, 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청(FCS))을 보급한 용액을, 배지에 추가로 첨가할 수 있다.
세포 융합을 위해서는, 면역 세포와 미엘로마 세포를, 미리 결정된 양으로 배지에 있어서 잘 혼합한다. 대략 37℃로 미리 가온된 PEG 용액(예를 들어, 1000 내지 6000 정도의 평균 분자량의 PEG)을, 통상, 30 내지 60%(w/v)의 농도로 그것에 첨가한다. 소망의 융합 세포(하이브리도마)가 형성되도록, 혼합 용액을 완만하게 혼합한다. 그 후, 상기에 든 적절한 배지를, 세포 배양물에 축차 첨가하고, 원심분리에 의해 상청을 제거한다. 하이브리도마의 증식에 바람직하지 않은 세포 융합제 등을 제거하기 위해서, 이 조작을 반복할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마를, 선택을 위해서, 통상의 선택 배지, 예를 들어, HAT 배지(하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 함유하는 배지) 중에서 배양할 수 있다. 소망의 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는 데 충분한 시간(통상, 충분한 시간은, 수일 내지 수주간이다), HAT 배지를 이용한 배양을 계속할 수 있다. 그 후, 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하고, 통상의 한계 희석법에 의해 싱글 셀 클로닝한다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마를, 세포 융합에 이용된 미엘로마 세포의 선택 마커에 적절한 선택 배지의 사용에 의해 선택할 수 있다. 예를 들어, HGPRT 결손 또는 TK 결손을 갖는 세포는, HAT 배지(하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 함유하는 배지) 중에서의 배양에 의해 선택할 수 있다. 구체적으로는, HAT 감수성의 미엘로마 세포를 세포 융합에 이용했을 경우, 정상 세포와의 융합에 성공한 세포만이, HAT 배지 중에서 선택적으로 증식할 수 있다. 소망의 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는 데 충분한 시간, HAT 배지를 이용한 배양을 계속한다. 구체적으로는, 소망의 하이브리도마를 선택하기 위해서, 배양을 일반적으로, 수일 내지 수주간 행할 수 있다. 그 후, 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하고, 통상의 한계 희석법에 의해 싱글 셀 클로닝할 수 있다.
소망의 항체의 스크리닝 및 싱글 셀 클로닝은, 바람직하게는, 당 기술 분야에서 공지된 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, IL-12 또는 IL-22에 결합하는 모노클로날 항체는, 세포 표면 상에 발현한 IL-12 또는 IL-22에 결합할 수 있다. 그와 같은 모노클로날 항체는, 예를 들어, FACS(형광 활성화 세포 선별)에 의해 스크리닝할 수 있다. FACS는, 형광 항체와 접촉시킨 세포를, 레이저광을 이용하여 해석하여, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정하는 것에 의해, 세포 표면에 대한 항체의 결합을 측정할 수 있는 시스템이다.
FACS에 의해 목적하는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는, 우선, IL-12 또는 IL-22 발현 세포를 조제한다. 스크리닝을 위한 바람직한 세포는, IL-12 또는 IL-22를 강제 발현시킨 포유동물 세포이다. 형질 전환되어 있지 않은 숙주 포유동물 세포를 대조로서 이용하여, 세포 표면 상의 IL-12 또는 IL-22에 대한 항체의 결합 활성을 선택적으로 검출할 수 있다. 구체적으로는, 대조 숙주 세포에는 결합하지 않지만, IL-12 또는 IL-22를 강제 발현시킨 세포에 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하여, IL-12 또는 IL-22에 대한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 취득한다.
혹은, ELISA의 원리에 기초하여, 항체를, 고정화된 IL-12 또는 IL-22 발현 세포에 대한 그 결합 활성에 대해 평가할 수 있다. IL-12 또는 IL-22 발현 세포를, 예를 들어, ELISA 플레이트의 각 웰 상에 고정화시킨다. 하이브리도마의 배양 상청을, 웰 중의 고정화 세포와 접촉시켜, 고정화 세포에 결합하는 항체를 검출한다. 모노클로날 항체가 마우스 유래인 경우는, 세포에 결합한 항체를, 항마우스 면역글로불린 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 이들 스크리닝법에 의해 선택된, 항원에 결합할 수 있는 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마는, 한계 희석법 또는 다른 방법에 의해 클로닝할 수 있다.
이와 같이 하여 조제된 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는, 통상의 배지 중에서 계대 배양할 수 있다. 하이브리도마는 또한, 액체 질소 중에서 장기간에 걸쳐서 보존할 수도 있다.
하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양 상청으로부터, 소망의 모노클로날 항체를 취득할 수 있다. 혹은, 하이브리도마를, 그것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시켜도 되고, 그 복수(腹水)로부터 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
전자의 방법은, 고순도의 항체를 취득하는 데 호적하다.
하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 클로닝된 항체 유전자에 의해 코딩되는 항체도 또한, 바람직하게 이용할 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 적절한 벡터에 짜 넣고, 그 다음에 이것을, 유전자에 의해 코딩되는 항체가 발현하도록 숙주 중에 트랜스펙트한다. 항체 유전자의 단리, 벡터에의 짜 넣기, 및 숙주 세포의 형질 전환을 위한 방법은, 예를 들어, Vandamme 등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). 하기에서 기술하는 바와 같은 재조합 항체를 제작하는 방법도 또한, 당 기술 분야에서 공지이다.
예를 들어, 항IL-12 또는 항IL-22 항체를 산생하는 하이브리도마 세포로부터, 항IL-12 또는 항IL-22 항체의 가변 영역(V 영역)을 코딩하는 cDNA를 취득한다. 이 목적으로, 통상, 우선 하이브리도마로부터 전(全)RNA를 추출한다. 예를 들어, 이하의 방법의 어느 것을 이용하여, mRNA를 세포로부터 추출할 수 있다:
- 구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299), 및
- AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159).
추출된 mRNA를, mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.제) 등을 이용하여 정제할 수 있다. 혹은, QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.제) 등의, 세포로부터 직접 전mRNA를 추출하기 위한 키트도 또한 시판되고 있다. 그와 같은 키트를 이용하여, mRNA를 하이브리도마로부터 취득할 수 있다. 얻어진 mRNA로부터, 항체 V 영역을 코딩하는 cDNA를, 역전사 효소를 이용하여 합성할 수 있다. cDNA는, 예를 들어, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(Seikagaku Corp.제)를 이용하여 합성할 수 있다. 혹은, cDNA의 합성 및 증폭을 위해서, SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech Laboratories, Inc.제) 및 PCR을 이용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002; 및 Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)을 적절히 이용할 수 있다. 그와 같은 cDNA 합성의 과정에 있어서, 후술하는 적절한 제한 효소 사이트를, cDNA의 양단에 추가로 도입할 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적하는 cDNA 단편을 정제하고, 그 후, 벡터 DNA와 라이게이션한다. 이와 같이 하여 조제된 재조합 벡터를, 대장균(E.coli) 등에 트랜스펙트한다. 콜로니 선택 후에, 해당 콜로니를 형성한 대장균으로부터 소망의 재조합 벡터를 조제할 수 있다. 그 다음에, 재조합 벡터가 목적하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 갖고 있는지 여부를, 당 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어, 다이데옥시뉴클레오타이드 체인 터미네이션법에 의해 확인한다.
가변 영역을 코딩하는 유전자를 취득하기 위해서는, 가변 영역 유전자 증폭용의 프라이머를 이용한 5'-RACE법이 편리하게 이용된다. 우선, 5'-RACE cDNA 라이브러리를, 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 한 cDNA 합성에 의해 취득한다. SMART RACE cDNA 증폭 키트 등의 시판되는 키트를, 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에 적절히 이용한다.
얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 한 PCR에 의해, 항체 유전자를 증폭시킨다. 마우스 항체 유전자 증폭용의 프라이머는, 당 기술 분야에서 공지된 항체 유전자 서열을 바탕으로 설계할 수 있다. 이들 프라이머는, 면역글로불린의 서브클래스에 따라서 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 따라서, 서브클래스를, 바람직하게는, Iso Strip 마우스 모노클로날 항체 아이소타이핑 키트(Roche Diagnostics K.K.) 등의 시판되는 키트를 이용하여 미리 결정한다.
구체적으로는, 예를 들어, 마우스 IgG를 코딩하는 유전자를 취득할 목적으로, γ1, γ2a, γ2b, 및 γ3 중쇄, 및 κ 및 λ 경쇄를 코딩하는 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를, 이용할 수 있다. IgG 가변 영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 가변 영역에 가까운 정상 영역에 대응하는 부분에 어닐링하는 프라이머를, 3'프라이머로서 일반적으로 이용한다. 한편, 5' RACE cDNA 라이브러리 조제 키트에 부속되는 프라이머를, 5'프라이머로서 이용한다.
이와 같이 하여 증폭에 의해 얻어진 PCR 산물을 이용하여, 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 면역글로불린을 재구축할 수 있다. 소망의 항체를 취득하기 위해서, 재구축된 면역글로불린을, IL-12 또는 IL-22에 대한 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 보다 바람직하게는, 예를 들어, IL-12 또는 IL-22에 대한 항체를 취득할 목적으로, IL-12 또는 IL-22에 대한 항체의 결합은 특이적이다. IL-12 또는 IL-22에 결합하는 항체는, 예를 들어, 이하의 공정에 의해 스크리닝할 수 있다:
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코딩되는 V 영역을 함유하는 항체를, IL-12 또는 IL-22 발현 세포와 접촉시키는 공정;
(2) IL-12 또는 IL-22 발현 세포에 대한 항체의 결합을 검출하는 공정; 및
(3) IL-12 또는 IL-22 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
IL-12 또는 IL-22 발현 세포에 대한 항체의 결합을 검출하는 방법은, 당 기술 분야에서 공지이다. 구체적으로는, IL-12 또는 IL-22 발현 세포에 대한 항체의 결합을, 상기에서 기술한 FACS 등의 어프로치에 의해 검출할 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해서, IL-12 또는 IL-22 발현 세포의 고정 표본을 적절히 이용할 수 있다.
파지 벡터를 이용하는 패닝법도 또한, 결합 활성을 지표로 한 항체의 스크리닝을 위한 방법으로서 바람직하게 이용된다. 항체 유전자를, 폴리클로날 항체를 발현하는 세포 집단으로부터 중쇄 및 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득했을 경우에는, 파지 벡터를 이용하는 스크리닝법이 유리하다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 유전자는, 단쇄 Fv(scFv)를 코딩하는 유전자를 형성하도록, 적절한 링커 서열을 개재시켜 연결시킬 수 있다. scFv를 코딩하는 유전자를 파지 벡터 중에 삽입하여, scFv를 그 표면 상에 발현하는 파지를 취득할 수 있다. 파지와 소망의 항원의 접촉 후에, 항원에 결합한 파지를 회수하여, 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv를 코딩하는 DNA를 회수할 수 있다. 소망의 결합 활성을 갖는 scFv를 농축하기 위해서, 필요한 경우에는, 이 조작을 반복할 수 있다.
목적하는 항IL-12 또는 항IL-22 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 후에, 이 cDNA를, cDNA의 양단에 삽입된 제한 효소 사이트를 인식하는 제한 효소로 소화한다. 제한 효소는, 바람직하게는, 항체 유전자를 구성하는 뉴클레오타이드 서열에 저빈도로 출현하는 뉴클레오타이드 서열을 인식하여 소화한다. 부착 말단을 제공하는 제한 효소의 사이트의 삽입이, 1카피의 소화 단편을 벡터 중에 바른 방향으로 삽입하기 위해서 바람직하다. 이와 같이 하여 소화된 항IL-12 또는 항IL-22 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA를, 적절한 발현 벡터 중에 삽입하여, 항체 발현 벡터를 취득할 수 있다. 이 경우에, 키메라 항체를 취득하기 위해서는, 항체 정상 영역(C 영역)을 코딩하는 유전자와 V 영역을 코딩하는 유전자를 인프레임으로 융합시킨다. 이 문맥에 있어서, "키메라 항체"는, 상이한 기원의 정상 영역 및 가변 영역을 갖는 항체를 말한다. 따라서, 이종(예를 들어, 마우스-인간) 키메라 항체에 더하여 인간-인간 동종 키메라 항체도 또한, 본 발명에 의한 키메라 항체에 포함된다. 키메라 항체 발현 벡터를 구축하기 위해서, V 영역 유전자를, 미리 정상 영역 유전자를 갖는 발현 벡터 중에 삽입할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, V 영역 유전자를 소화하는 제한 효소의 인식 서열을, 소망의 항체 정상 영역(C 영역)을 코딩하는 DNA를 보유하는 발현 벡터의 5'측에 적절히 배치할 수 있다.
C 영역 유전자 및 V 영역 유전자를 가지는 이 발현 벡터를, 동일한 조합의 제한 효소로 소화하고, 인프레임으로 융합시켜, 키메라 항체 발현 벡터를 구축한다.
항IL-12 또는 항IL-22 모노클로날 항체를 제작하기 위해서, 항체 유전자가 발현 제어 영역의 제어하에서 발현하도록, 해당 항체 유전자를 발현 벡터에 짜 넣는다. 항체 발현을 위한 발현 제어 영역에는, 예를 들어, 인핸서 및 프로모터가 포함된다. 또한, 발현한 항체가 세포 외에 분비되도록, 적절한 시그널 서열을 아미노 말단에 부가할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열 번호: 1)를 갖는 펩타이드를, 시그널 서열로서 이용할 수 있다. 다른 호적한 시그널 서열의 어느 것을, 그것에 부가해도 된다. 발현한 폴리펩타이드는, 이 서열의 카복실 말단 부분에서 절단된다. 절단된 폴리펩타이드는, 성숙 폴리펩타이드로서 세포 외에 분비될 수 있다. 그 후, 적절한 숙주 세포를 이 발현 벡터로 형질 전환하여, 항IL-12 또는 항IL-22 항체를 코딩하는 DNA를 발현하는 재조합 세포를 취득할 수 있다.
리간드에 결합할 수 있는 분자 중에 프로테아제 절단 서열을 갖는 분자는, 본 발명에 있어서의 리간드 결합 부분 또는 분자로서 작용한다. 리간드 결합 부분/분자가, 프로테아제 절단 서열에 적절한 프로테아제에서의 처리에 의해 절단되는지 여부를, 임의로 확인할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제를, 리간드에 결합할 수 있는 분자 중에 프로테아제 절단 서열을 갖는 분자와 접촉시키는 것, 및 프로테아제 처리 산물의 분자량을, SDS-PAGE 등의 전기영동법에 의해 확인하는 것에 의해, 프로테아제 절단 서열의 절단의 유무를 확인할 수 있다.
더욱이, 프로테아제의 활성, 및 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 분자의 절단율을 평가하기 위해서, 프로테아제 처리 후의 절단 단편을, SDS-PAGE 등의 전기영동에 의해 분리하여, 정량할 수 있다. 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 분자의 절단율을 평가하는 방법의 비한정적인 태양에는, 이하의 방법이 포함된다. 예를 들어, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 항체 개변체의 절단율을, 재조합 인간 u-플라스미노겐 활성화 인자/유로키나제(인간 uPA, huPA)(R&D Systems;1310-SE-010) 또는 재조합 인간 마트립타제/ST14 촉매 도메인(인간 MT-SP1, hMT-SP1)(R&D Systems; 3946-SE-010)을 이용하여 평가하는 경우는, 100마이크로그램/mL의 항체 개변체를, 40nM의 huPA 또는 3nM의 hMT-SP1과 PBS에 있어서 37℃에서 1시간 반응시키고, 그 다음에, 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 제공한다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이는, Wes(Protein Simple)를 이용하여 행할 수 있지만, 본 방법은, 그것에 한정되지 않는다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 대한 대체로서, 분리를 위해서 SDS-PAGE 등을 행하고, 계속해서 웨스턴 블로팅으로의 검출을 행해도 된다. 본 방법은, 이들 방법으로 한정되지 않는다. 절단의 전후에, 항인간 λ쇄 HRP 표지 항체(abcam; ab9007)를 이용하여 경쇄를 검출할 수 있지만, 절단 단편을 검출할 수 있는 임의의 항체를 이용해도 된다. 프로테아제 처리 후에 얻어진 각 피크의 면적을, Wes용의 소프트웨어(Compass for SW; Protein Simple)를 이용하여 출력하여, 항체 개변체의 절단율(%)을, 이하의 식으로 결정할 수 있다.
(절단된 경쇄의 피크 면적)×100/(절단된 경쇄의 피크 면적＋미절단의 경쇄의 피크 면적)
절단율은, 프로테아제 처리의 전후에 단백질 단편을 검출할 수 있으면, 결정할 수 있다. 따라서, 절단율은, 항체 개변체에 대해서뿐만 아니라, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 여러 가지 단백질 분자에 대해서도 결정할 수 있다.
프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 분자의 인비보 절단율은, 분자를 동물에게 투여하는 것, 및 혈액 샘플 중의 투여된 분자를 검출하는 것에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 항체 개변체를, 마우스에게 투여하고, 그들의 혈액 샘플로부터 혈장을 수집한다. Dynabeads Protein A(Thermo; 10001D)를 이용하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 혈장으로부터 항체를 정제하고, 그 다음에, 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 제공하여, 항체 개변체의 프로테아제 절단율을 평가한다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이는, Wes(Protein Simple)를 이용하여 행할 수 있지만, 본 방법은, 그것에 한정되지 않는다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 대한 대체로서, 분리를 위해서 SDS-PAGE 등을 행하고, 계속해서 웨스턴 블로팅으로의 검출을 행해도 된다. 본 방법은, 이들 방법으로 한정되지 않는다. 항인간 λ쇄 HRP 표지 항체(abcam; ab9007)를 이용하여, 마우스로부터 수집된 항체 개변체의 경쇄를 검출할 수 있지만, 절단 단편을 검출할 수 있는 임의의 항체를 이용해도 된다. 캐필러리 전기영동 이뮤노어세이에 의해 얻어진 각 피크의 면적을, 일단 Wes용의 소프트웨어(Compass for SW; Protein Simple)를 이용하여 출력하면, 남은 경쇄의 비율을 [경쇄의 피크 면적]/[중쇄의 피크 면적]으로서 산출하여, 마우스의 신체에 있어서 절단되지 않은 채로 있는 전장 경쇄의 비율을 결정할 수 있다. 인비보 절단 효율은, 생체로부터 수집된 단백질 단편이 검출 가능하면, 결정할 수 있다. 따라서, 절단율은, 항체 개변체에 대해서뿐만 아니라, 프로테아제 절단 서열이 도입되어 있는 여러 가지 단백질 분자에 대해서도 결정할 수 있다. 전술한 방법에 의한 절단율의 산출에 의해, 예를 들어, 상이한 절단 서열이 도입되어 있는 항체 개변체의 인비보 절단율의 비교, 및 정상 마우스 모델과 종양 이식 마우스 모델 등의 상이한 동물 모델 사이에서의 단일 항체 개변체의 절단율의 비교가 가능하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에도 관한 것이다.
본 발명에 의한 폴리뉴클레오타이드는, 통상, 적절한 벡터에 의해 보유되어(그것에 삽입되어), 숙주 세포 중에 트랜스펙트된다. 벡터는, 해당 벡터가 삽입된 핵산을 안정되게 보지할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 숙주로서 대장균이 이용되는 경우, pBluescript 벡터(Stratagene Corp.제) 등이, 클로닝용 벡터로서 바람직하다. 여러 가지 시판되고 있는 벡터를, 이용할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 제조할 목적으로 벡터를 이용하는 경우에는, 발현 벡터가 특히 유용하다. 발현 벡터는, 인비트로에서의, 대장균에 있어서의, 배양 세포에 있어서의, 또는 생물 개체에 있어서의 융합 단백질의 발현을 해당 벡터가 가능하게 하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 발현 벡터는, 바람직하게는, 예를 들어, 인비트로 발현용의 pBEST 벡터(Promega Corp.제), 대장균용의 pET 벡터(Invitrogen Corp.제), 배양 세포용의 pME18S-FL3 벡터(GenBank 액세션 번호 AB009864), 및 생물 개체용의 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988))이다. 본 발명의 DNA의 벡터 중에의 삽입은, 통상적 방법, 예를 들어, 제한 효소 사이트를 이용한 리가제 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11. 11).
숙주 세포는, 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 여러 가지 숙주 세포가 이용된다. 융합 단백질을 발현시키기 위한 세포의 예에는, 세균 세포(예를 들어, 연쇄구균속(Streptococcus), 포도상구균속(Staphylococcus), 대장균, 스트렙트마이세스속(Streptmyces), 및 고초균(Bacillus subtilis)), 진균 세포(예를 들어, 효모 및 아스페르길루스속(Aspergillus)), 곤충 세포(예를 들어, 초파리속(Drosophila) S2 및 스포돕테라속(Spodoptera) SF9), 동물 세포(예를 들어, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, 및 Bowes 멜라노마 세포), 및 식물 세포가 포함될 수 있다. 숙주 세포에의 벡터의 트랜스펙션은, 당 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어, 인산 칼슘 침전법, 일렉트로포레이션법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9. 9), Lipofectamine법(GIBCO-BRL/Thermo Fisher Scientific Inc.제), 또는 마이크로인젝션법에 의해 행해져도 된다.
숙주 세포에 있어서 발현한 융합 단백질을, 소포체의 내강, 세포 주변강, 또는 세포외 환경에 분비시키기 위해서, 적절한 분비 시그널을, 목적하는 융합 단백질 중에 짜 넣을 수 있다. 시그널은, 목적하는 융합 단백질에 대해서 내인성이어도 되고, 또는 이종 시그널이어도 된다.
본 발명의 융합 단백질이 배지 중에 분비되는 경우, 제조 방법에 있어서의 융합 단백질의 회수는, 배지의 회수에 의해 행해진다. 본 발명의 융합 단백질이 세포 중에 산생되는 경우는, 세포를 우선 용해하고, 계속해서 융합 단백질을 회수한다.
본 발명의 융합 단백질을 재조합 세포 배양물로부터 회수하고, 정제하기 위해서, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 당 기술 분야에서 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 명세서에 기재되는 1개 또는 복수의 태양의 임의의 조합도 또한, 당업자의 기술 상식에 기초하여 기술적 모순이 없는 한, 본 발명에 포함되는 것이, 당업자에 의해 이해됨이 당연하다. 또한, 본 명세서에 기재되는 1개 또는 복수의 태양의 임의의 조합을 제외한 본 발명도, 당업자의 기술 상식에 기초하여 기술적 모순이 없는 한, 본 명세서에 있어서 의도되고, 기재되는 발명으로 간주되어야 하는 것이다.
이하, 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예를 기재한다. 여러 가지 다른 태양이, 전술한 일반적인 설명에 비추어 실시될 수 있음이, 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: IL-12 융합 단백질은, 프로테아제 절단 전에 긴 전신 반감기를 가갖는다
인터류킨-12(IL-12) 등의 사이토카인을, 고용량으로, 낮거나 또는 무시할 수 있는 전신 독성을 수반하여 송달하기 위해서, 본 발명자들은, 프로테아제 절단 가능 링커를 갖는 IL-12 융합 단백질을 개발했다. IL-12 융합 단백질은, 단백질 내의 프로테아제 절단 사이트를 절단하는 것에 의해 단백질을 활성화하는, 고농도의 프로테아제를 수반하는 환경에 폭로되지 않는 한, 불활성화 상태인 채로 있다. 일단 절단되면, IL-12는, 더 이상 단백질에 결합하지 않고, 그 수용체에 결합하는 그 생리 활성을 복원하여, IL-12 수용체 시그널 전달을 활성화하는 그 생물학적 활성을 발휘할 수 있게 된다. 현재 기재하고 있는 IL-12 융합 단백질은, 특정의 환경, 예를 들어, 종양 또는 염증성 조직에 있어서의 천연에서 높은 농도의 프로테아제를 이용하는, 표적 부위 특이적 활성화를 가능하게 한다. 미절단 상태에서의(불활성의) 현재 기재하고 있는 IL-12 융합 단백질은, 재조합 IL-12 단독과 비교하여, 긴 전신 반감기를 갖는다. IL-12는, 대략 5 내지 10시간의 매우 짧은 반감기를 갖는다고 알려져 있음이, 보고되어 있다(AACR Journals. 1999 Jan; 5(1): 9-16). 그러나, 절단되었을(활성의) 경우, IL-12 융합 단백질은, 재조합 IL-12보다도 빠른 반감기를 나타내게 된다(도 1).
1-1 IL-12 융합 단백질의 조제-1가 유리형
p40(서열 번호: 939) 및 p35(서열 번호: 940) 서브유닛을 포함하는 IL-12 분자를, 프로테아제 절단 가능 링커를 개재시켜, IL-12에 결합하는 IgG양 폴리펩타이드와 융합시키는 것에 의해, 몇몇 IL-12 융합 단백질을 구축했다. 이용한 IL-12 결합 폴리펩타이드는, Ab1(WO2010017598), Ab2(WO2002012500), 및 Ab3(WO2000056772)를 짜 넣고 있다. 추가로, 특별히 주기하지 않는 한, FcγR 결합을 무효로 하는 개변을, 상기 단백질의 Fc 영역에 있어서 행하고, 이것은, EU 넘버링에 따르는 아미노산 변이 L235R/G236R을 포함하고 있었다.
3개의 IL-12 융합 단백질은, 이하와 같이, 각각이, IL-12 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드(항IL-12) 및 KLH 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드(항KLH)의 1가 헤테로이량체를 포함한다.
(a) 1가 IL-12 유리 FP1은, 경쇄 1(서열 번호: 944)/중쇄 1(서열 번호: 949) 및 경쇄 2(서열 번호: 950)/중쇄 2(서열 번호: 951)의 페어의 헤테로이량체이다. 중쇄 1(서열 번호: 949)에 있어서, 절단 가능 링커(서열 번호: 941)를, FP1 VH(서열 번호: 946)와 CH1 도메인 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입하고, 절단 가능 링커(서열 번호: 947)를, Fc와 단쇄 IL-12(서열 번호: 962) 사이에 도입했다.
(b) 1가 IL12 유리 FP2는, 경쇄 1(서열 번호: 955)/중쇄 1(서열 번호: 999) 및 경쇄 2(서열 번호: 950)/중쇄 2(서열 번호: 951)의 페어의 헤테로이량체이다. 중쇄 1(서열 번호: 999)에 있어서, 절단 가능 링커(서열 번호: 941)를, FP2 VH(서열 번호: 957)와 CH1 도메인 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입하고, 절단 가능 링커(서열 번호: 947)를, Fc와 단쇄 IL-12(서열 번호: 962) 사이에 도입했다.
(c) 1가 IL12 유리 FP3은, 경쇄 1(서열 번호: 958)/중쇄 1(서열 번호: 1000) 및 경쇄 2(서열 번호: 950)/중쇄 2(서열 번호: 951)의 페어의 헤테로이량체이다. 중쇄 1(서열 번호: 1000)에 있어서, 절단 가능 링커(서열 번호: 941)를, FP3 VH(서열 번호: 960)와 CH1 도메인 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입하고, 절단 가능 링커(서열 번호: 1051)를, Fc와 단쇄 IL-12(서열 번호: 962) 사이에 도입했다.
상기의 각각에 대해, 헤테로이량체화 및 중쇄와 경쇄의 정확한 회합을 촉진하기 위해서, 노브-인투-홀(knobs-into-holes) 변이(Nat. Biotechnol, 1998, 16, 677-681)를, 중쇄 CH3 도메인에 도입하고, 중쇄 2 및 경쇄 2에 있어서, CrossMab 기술(PNAS, 2011, 108, 11187-11192)을 이용했다. 중쇄 1 및 중쇄 2는, 각각, 노브 변이(Y349C/T366W) 및 홀 변이(E356C/T366S/L368A/Y407V)를 함유한다. 경쇄 2는, 인간 κ 정상 영역을 수반하는 항KLH의 VH 도메인으로 구성되었다. 중쇄 2는, 항KLH의 VL 도메인 및 개변된 IgG1 Fc 영역으로 구성되었다. 일단 절단 가능 링커가 프로테아제에 의해 소화되면, 활성 IL-12가, 자유롭게 융합 폴리펩타이드로부터 해리되어, 그 수용체에 결합한다(도 2a).
각 쇄의 발현 벡터를, 표 3에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 따라 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 융합 단백질의 정제는, MabSelect SuRe(카탈로그 번호: 17-5438-01, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
[표 3]
1-2 미절단의 IL-12 융합 단백질의 긴 전신 반감기
본 발명에 있어서, 본 발명자들은, 프로테아제 소화 전의 미절단(불활성) 상태에서 긴 전신 반감기를 나타내지만, 절단(활성) 상태에서는 짧은 전신 반감기를 나타내는 IL-12 융합 단백질을 얻으려고 했다. 미절단의 IL-12 융합 단백질이, 항IL-12 항체 등의 IL-12 결합 분자에 대해 통상 관찰되는 즉시의 헤파린 매개성 배출에 제공되지 않음을 확실히 하기 위해서, IL-12에 결합하는 여러 가지 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을, 이하와 같이 스크리닝했다.
5mg/kg의 상기의 표 3에 기재되는 바와 같은 1가 IL-12 유리 FP1 내지 FP3을, 6주령의 CB17/Icr-Prkdcscid/CrlCrlj 암컷 마우스(Charles River Laboratories, 일본)의 꼬리 정맥 중에 정맥내 투여하고, 그 혈장을, 이하의 시점: 투여의 5분 후, 1시간 후, 7시간 후, 1일 후, 4일 후, 및 7일 후에, 경정맥으로부터 계속해서 수집했다. 마우스 혈장 중의 융합 단백질의 총농도를, LC/ESI-MS/MS에 의해 측정했다. 교정 표준을, 마우스 혈장에 있어서의 연속 희석에 의해 조제했다. 교정 표준 농도는, 0.195, 0.391, 0.781, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 및 50마이크로그램(μg)/mL였다. 3마이크로리터(μL)의 교정 표준 및 혈장 샘플을, 50μL의 항인간 Fc 영역 항체(인하우스)로 코팅된 자기 비즈와 혼합했다. 비즈를, 0.05% Tween-20 함유 PBS로 3회, 및 PBS로 1회 세정한 후에, 샘플을, 25μL의 혼합 시약(50mmol/L 중탄산 암모늄 중, 8mmol/L 다이싸이오트레이톨, 7.5mol/L 요소, 및 99ng/mL 리소자임(닭 난백))과 혼합하고, 대략 45분간, 56℃에서 인큐베이트했다. 그 다음에, 2μL의 500mmol/L 아이오도아세트아마이드를 첨가하고, 대략 30분간, 37℃, 암소(暗所)에서 인큐베이트했다. 다음에, 160μL의 50mmol/L 중탄산 암모늄 중 0.621μg/mL 시퀀싱 그레이드 개변 트립신(카탈로그 번호: V5117, Promega)을 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트했다. 마지막으로, 5μL의 10% 트라이플루오로아세트산을 첨가하여, 임의의 잔존 트립신을 비활성화했다. 소화 샘플의 80μL의 부분표본(aliquot)을, LC/ESI-MS/MS에 의한 해석에 제공했다.
LC/ESI-MS/MS는, Acquity I-class 2D 고속 액체 크로마토그래피 시스템(Waters)을 장비한 Xevo TQ-S 트리플 사중극 기기(Waters)를 이용하여 행했다. 항체 유래의 트립신 펩타이드(TLTIQVK)를, 선택 반응 모니터링(SRM)에 의해 모니터링했다. SRM 트랜지션은, m/z 401.755>588.372였다. 항체의 교정 곡선은, 각각 농도에 대해서 플롯한 피크 면적을 이용하여, 가중(1/x2) 선형 회귀에 의해 구축했다. 마우스 혈장 중의 농도는, 해석 소프트웨어 Masslynx Ver. 4.1(Waters)을 이용하여 교정 곡선으로부터 계산했다.
각 항체의 농도를, 교정 샘플에 있어서의 모니터링된 펩타이드의 피크 면적에 기초하여, 교정 곡선에 의해 결정했다. 약물동태 파라미터를, Phoenix WinNonlin version 8.0(Certara USA inc.)을 이용하여 논-컴파트먼트 해석에 의해 계산했다. 3마리의 동물의 평균된 혈장 농도 및 파라미터를, 그 표준 편차와 함께 도 2b에 나타낸다.
1가 IL-12 유리 FP1은, 다른 2개의 융합 단백질, 즉, 동일한 1가 헤테로이량체 융합 단백질 형식의 FP2(34.1ml/일/kg) 및 FP3(35.3ml/일/kg)보다도, 대략 3배 낮은 혈장 클리어런스(9.8ml/일/kg)를 나타냈다. 상기의 결과는, 미절단의("불활성의") 1가 IL-12 유리 FP1에 있어서의 IL-12의 헤파린 결합 영역이, 헤파린 결합 매개성 배출을 방해할 만큼 충분히 마스킹되어 있었음을 시사한다.
1-3 유리 형식 및 융합 형식의 2가 IL-12 융합 단백질의 조제
2가 IL-12 유리 FP4는, 경쇄(서열 번호: 944) 및 중쇄(서열 번호: 948)의 페어의 호모이량체이다. 서열 번호: 944는, 개변을 수반하지 않는 경쇄로서 이용했다. 중쇄에 있어서, 절단 가능 링커를, FP1 VH(서열 번호: 946)와 CH1 도메인 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입했다. GS 링커(서열 번호: 1001)를, 힌지 영역에 삽입하고, 단쇄 IL-12(서열 번호: 962)를, 절단 가능 링커(서열 번호: 947)를 개재시켜 Fc 도메인의 C말단에 부가했다. 일단 이들 절단 가능 링커가 프로테아제에 의해 소화되면, 활성 IL-12 분자가 유리된다(도 3a).
2가 IL-12 융합 FP5는, 경쇄(서열 번호: 944) 및 중쇄(서열 번호: 953)의 호모이량체이다. FP1VL-k0(서열 번호: 944)은, 개변을 수반하지 않는 경쇄로서 이용했다. 중쇄에 있어서, 절단 가능 링커(서열 번호: 941)를, FP1 VH(서열 번호: 946)와 CH1 도메인 사이의 엘보 힌지 영역 중에 도입했다. GS 링커(서열 번호: 1001)를, 힌지 영역에 삽입하고, 단쇄 IL-12(서열 번호: 962)를, GS 링커(서열 번호: 963)를 개재시켜 Fc 도메인의 C말단에 부가했다. 일단 절단 가능 링커가 프로테아제에 의해 소화되면, Fc 영역의 C말단에 융합한 채로 있는 활성 IL-12 분자가, 융합 단백질의 리간드 결합 도메인으로부터 해리되어, 그 수용체에 결합한다(도 3b).
각 쇄의 발현 벡터를, 표 4에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 융합 단백질의 정제는, MabSelect SuRe(카탈로그 번호: 17-5438-01, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
[표 4]
1-4 유리 형식 및 융합 형식의 2가 IL-12 융합 단백질의 활성의 평가
C말단에 융합한 (His)6 태그가 계속되는 TEV 부위를 갖는, p40(서열 번호: 939) 및 p35(서열 번호: 940)를 발현하는 벡터의 공발현에 의해, IL-12를 정제했다. 각 쇄의 발현 벡터를, 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 단백질의 정제는, Ni Sepharose excel(카탈로그 번호: 17-3712-02, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
MT-SP1 프로테아제 처리를 수반하거나 또는 수반하지 않고서, 유리 형식 및 융합 형식의 2가 IL-12 융합 단백질의 IL-12 생물 활성을 평가하기 위해서, IL-12 루시페라제 어세이를 실시했다. 간결하게 설명하면, 2.5×104세포/웰의, 인간 IL-12Rb1, IL-12Rb2, 및 STAT4를 발현하는 IL-12 바이오어세이 세포(Promega, 카탈로그 번호 CS2018A02A)를, 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 하룻밤 인큐베이트했다. 대조로서, IL-12를 이용했다. 유리 형식 및 융합 형식 양쪽의 2가 IL-12 융합 단백질을, 배양 플레이트에 첨가하고, 18시간 인큐베이트했다. 프로테아제 처리 샘플에 대해서는, IL-12, 및 유리 형식 및 융합 형식 양쪽의 2가 IL-12 융합 단백질을, 등몰농도의 MT-SP1로 4시간 처리하여, 연속 희석물을 조제했다. 루시페라제 활성을, Bio-Glo 루시페라제 어세이 시스템(Promega, G7940)으로, 제조업자의 설명서에 따라 검출했다. 발광을, GloMax(등록상표) Explorer System(Promega #GM3500)을 이용하여 검출했다. 데이터 해석을, Microsoft(등록상표) Excel(등록상표) 2013에 의해 행하고, 해석된 데이터를, GraphPad Prism 7을 이용하여 플롯했다.
2가 IL-12 유리 FP4, 및 2가 IL-12 융합 FP5를, IL-12 루시페라제 어세이에 제공했다. 개변체는 양쪽 모두, MT-SP1의 비존재하에서 hIL-12_His 태그보다도 낮은 IL-12 생물 활성을 나타내고, IL-12 생물 활성은, MT-SP1 처리 시에 hIL-12_His 태그와 동일한 레벨까지 회복되었다(도 4a 및 4b).
상기에 기초하여, 유리 형식 및 융합 형식 양쪽의 2가 IL-12 융합 단백질은, 그 리간드 수용체, 즉 IL-12 수용체에 결합하는 그 능력을 잃는(즉, 능력이 감약되는) 것, 및 이 결합이 미절단(불활성) 상태에서 저해되었던 것이 실증되었다. 그러나, 일단 프로테아제의 존재하에서 절단되면(활성 상태), 리간드의 생물학적 활성은 복원되고, 즉, IL-12는, 그 리간드 수용체, 즉 IL-12 수용체에 결합할 수 있었다.
실시예 2: 융합 형식은, 유리 형식보다도, 종양 내에 보다 높은 농도로 축적되어, 보다 빠른 클리어런스를 나타낸다
불활성화 상태에서의 IL-12 융합 단백질은, IL-12에 결합하여, IL-12의 그 수용체에 결합하는 능력을 저해한다. 프로테아제, 예를 들어, 종양 특이적 프로테아제에 폭로되면, IL-12 융합 단백질은 활성화되어, IL-12의 그 수용체에 결합하는 능력이 복원된다. 실시예 1에 기재되는 바와 같이, 그들의 다른 프로테아제 활성화 형태에 있어서, Fc 영역과 IL-12 사이의 추가의 절단 사이트에 의해, IL-12의 완전한 유리가 가능하게 되고(유리 형식), 다른 한편, 추가의 절단 사이트가 없으면 IL-12는, Fc 영역의 C말단에 융합한 채로 있다(융합 형식). 종양 축적 및 클리어런스의 연구를, 유리 형식 IL-12 융합 단백질의 활성화형 및 융합 형식 IL-12 융합 단백질의 활성화형으로부터 생긴 재조합 IL-12를 이용하여 행했다(도 5).
2-1 유리형 및 융합형의 IL-12 융합 단백질의 활성형의 조제
각각이 TEV 프로테아제 인식 사이트(서열 번호: 1003) 및 FLAG 태그(서열 번호: 1004)를 포함하는, p40 서브유닛(서열 번호: 939) 및 p35 서브유닛(서열 번호: 1002)을 포함하는 IL-12 헤테로이량체 단백질을 조제했다. 더하여, 경쇄(서열 번호: 986) 및 중쇄(서열 번호: 1005)의 호모이량체를 포함하는, KLH 2가 IL-12 융합 FP6을 조제한다. 서열 번호: 986은, 개변을 수반하지 않는 경쇄로서 이용했다. 중쇄(서열 번호: 1005)에 있어서, KLH VH(서열 번호: 994)는 정상 영역(서열 번호: 1006)에 융합하고 있고, GS 링커(서열 번호: 963)를 개재시켜 Fc의 C말단에 부가된 단쇄 IL12(서열 번호: 962)가 그것에 계속된다.
경쇄(서열 번호: 986) 및 중쇄(서열 번호: 1007)의 호모이량체를 포함하는, KLH 2가 IL-12 융합 FP7을 조제한다. 서열 번호: 986은, 개변을 수반하지 않는 경쇄로서 이용했다. 중쇄(서열 번호: 1007)에 있어서, KLH VH(서열 번호: 994)는 정상 영역 C6(서열 번호: 1006)에 융합하고 있고, GS 링커(서열 번호: 963)를 개재시켜 Fc의 C말단에 부가된 단쇄 IL12(서열 번호: 1008)가 그것에 계속된다.
각 쇄의 발현 벡터를, 표 5에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. IL-12의 정제는, Anti-FLAG M2수지에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 융합 단백질의 정제는, MabSelect SuRe(카탈로그 번호: 17-5438-01, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
[표 5]
2-2 종양을 가지는 마우스를 이용한 인비보에서의 2가 IL-12 융합 단백질의 종양 축적의 평가
2-2-1 인간 T 세포를 주사한 종양을 갖는 마우스 모델을 이용한 인비보 시험
LS1034 인간 결장직장암 세포주를, American Type Culture Collection으로부터 입수했다. 세포를, 10% 소 태아 혈청(FBS; Nichirei Biosciences)을 포함하는 RPMI-1640 배지(SIGMA)＋0.45% D-글루코스(SIGMA), 10mM HEPES(SIGMA), 1mM 피루브산 나트륨(Gibco)에 있어서 배양했다. 6주령의 NOD/ShiJic-scidJcl 암컷 마우스를, CLEA Japan, Inc로부터 구입하고, 접종 전에 2주간 순화시켰다. 대수기 증식 중의 LS1034 세포를, 채집하여 행크스 평형 염류 용액(HBSS; SIGMA)으로 세정하고, 5×107세포/mL의 농도로 50% HBSS 및 50% Matrigel(CORNING)에 재현탁했다. 마우스에게, 200μL의 HBSS:Matrigel(1:1) 중의 1×107개의 LS1034 세포를 피하 접종했다. 평균 종양 체적이 약 100 내지 300mm3에 도달했을 때(접종의 7일 후)에, 종양 체적 및 체중에 기초하여, 마우스를 무작위로 군나누기했다. 종양 체적을, 캘리퍼로 측정하고, 1/2×l×w2, l=길이, w=폭으로서 종양 체적을 계산했다. 무작위화의 1일 후에, 마우스에게, 3×107개의 인간 T 세포를 접종했다. T 세포 접종 후에, 11.3pmol의 IL-12 또는 11.3pmol의 KLH-2가 IL-12 융합 FP6을, 2주간에 걸쳐서 1주에 3회, 종양내 투여했다. 종양을, 최초의 처치 후 12 및 13일째에 절제했다.
2-2-2 종양 용해물 및 종양 간질액의 조제
종양 절편의 4분의 1을, 메시를 갖는 튜브 상에 놓고, 400×g, 4℃에서 10분간 원심분리했다. 수집한 액체 샘플을, 10,000×g, 4℃에서 10분간, 재차 원심분리하고, 그 다음에 상청을, 종양 간질액으로서 보존했다. 중량의 9배의 용해 완충액(프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 pH 8.0의 50mM 트리스, 150mM NaCl, 0.5% 데옥시콜산 나트륨, 2% NP-40)을, 나머지의 종양 절편 중에 첨가하고, TissueLyser II(Qiagen)에 의해 동질화했다. 호모지네이트를, 14,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상청을, 10% 종양 용해물로서 보존했다.
2-2-3 전기 화학 발광(ECL)에 의한 종양 용해물 및 종양 간질액 중의 IL-12 농도의 측정
종양 용해물 및 종양 간질액 중의 IL-12의 농도를, 전기 화학 발광(ECL)에 의해 측정했다. MSD GOLD 96-well Streptavidin SECTOR Plates(Meso Scale Discovery)를, 어세이 완충액(각각 Roche 및 Sigma 유래의, PBS-T＋1% BSA)으로 1시간, 실온에서 블로킹했다. 블로킹한 플레이트 상에 비오틴화 항IL-12 폴리클로날 항체(R&D Systems)를 분배하고, 어세이 완충액 중에서 1시간, 실온에서 인큐베이트하는 것에 의해, 항IL-12 고정화 플레이트를 조제했다. IL-12 및 KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 교정 곡선 샘플, 종양 용해물 샘플, 및 종양 간질액 샘플을, 연속 희석에 의해 조제하여, 100배 이상으로 조제했다. 계속해서, 샘플을, 항IL-12 고정화 플레이트 상에 첨가하고, 실온에서 1시간 결합시키고, 그 후 세정했다. 다음에, SULFO TAG 표지 항IL-12 항체(U-CyTech biosciences, MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester를 이용하여 SULFO TAG 표지화)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이트하고, 그 후 세정했다. 리드 완충액 T(×4)(Meso Scale Discovery)를, 즉시 플레이트에 첨가하고, SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)에 의해 시그널을 검출했다. 재조합 IL-12 또는 KLH-2가 IL-12 융합 단백질의 농도는, 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 교정 곡선의 응답에 기초하여 계산했다. 이 방법에 의해 측정한 재조합 IL-12 및 KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 종양 용해물 및 종양 간질액의 농도를, 도 6에 나타낸다.
2-2-4 종양내 주사 후의 마우스에 있어서의 IL-12 및 KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 종양 보지
종양내 주사 후의 종양 보지를 평가했다. KLH-2가 IL-12 융합 FP6은, 투여 전 및 최후의 투여의 1일 후에, 종양 용해물 및 간질액의 양쪽에 있어서, 재조합 IL-12보다도 높은 농도를 나타냈다. 도 6은, 합계로 6회 반복된 종양내 주사 후의, 인간 T 세포를 주사한 LS1034 종양을 갖는 마우스 모델에 있어서의, 재조합 IL-12 또는 KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 종양 용해물 및 종양 간질액 중의 IL-12 농도를 나타낸다.
2-3 필리핀원숭이에 있어서의 2가 IL-12 융합 단백질의 약물동태의 평가
2-3-1 ELISA에 의한 필리핀원숭이 혈장 중의 KLH-2가 IL-12 융합 FP6 농도의 측정
필리핀원숭이에서 유래하는 혈장 중의 KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 농도를, IL-12 High Sensitivity Human ELISA 키트(Abcam)에 의해, 제조업자의 설명서에 따라 측정했다. KLH-2가 IL-12 융합 FP6 농도는, 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 교정 곡선의 응답에 기초하여 계산했다. 이 방법에 따라 측정한 혈장 중의 KLH-2가 IL-12 융합 FP6 농도의 타임 코스를, 도 7에 나타낸다.
2-3-2 필리핀원숭이를 이용한 인비보 시험
KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 약물동태를, 필리핀원숭이에 있어서 평가했다(도 7). KLH-2가 IL-12 융합 FP6(0.48mg/mL)을, 전완의 요측피 정맥 중에 2.5mL/kg의 단일 용량으로 투여했다. 혈액을, 투여의 5분 후, 2시간 후, 및 7시간 후에 수집했다. 수집한 혈액을, 즉시 1700×g, 4℃에서 5분간 원심분리하여, 혈장을 분리했다. 분리한 혈장을, 측정까지 -70℃ 미만에서 보관했다.
2-3-3 필리핀원숭이에 있어서의 KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 약물동태
필리핀원숭이에 있어서의 KLH-2가 IL-12 융합 FP6의 약물동태 프로파일을 평가했다. 도 7은, 필리핀원숭이에 있어서의 정맥내 투여 후의, 혈장 KLH-2가 IL-12 융합 FP6 농도의 타임 코스를 나타낸다. KLH-2가 IL-12 융합 FP6은, 급속히 배출되어, 클리어런스는 1975mL/일/kg이며, 이것은, 6.23mL/시간/kg(150mL/일/kg)인 문헌에 있어서 보고된 재조합 IL-12 클리어런스보다도 13배 빠르다(Pharmacology 2010;85:319-327).
종양을 갖는 마우스 모델에 있어서 실증된 바와 같이, 유리 형식 IL-12 융합 단백질의 재조합 IL-12와 비교했을 경우에, 보다 높은 농도의 융합 형식 IL-12 융합 단백질의 활성형이 검출되었다(도 6). 보다 높은 농도가 종양 미소 환경 내에 축적되었음에도 불구하고, 융합 형식 IL-12 융합 단백질의 활성화형은, 재조합 IL-12보다도 상당히 훨씬 빠른 클리어런스를 나타냈다(도 7). 따라서, 융합 형식 IL-12 융합 단백질은, 유리 형식 IL-12 융합 단백질과 비교하여, 보다 낮은 전신 독성을 나타낼 것이 상상된다.
실시예 3: 조작된 VH/VL 경계면은, 프로테아제 절단 시의 VH/VL 및 IL-12의 해리를 촉진한다
IL-12 리간드는, 그 불활성화형에 있어서, 융합 단백질의 리간드 결합 도메인에 결합하여, 즉, IL-12 리간드는, 융합 단백질의 가변 영역에 결합하여, 리간드의 그 리간드 수용체에 결합하는 생물학적 활성이, 저해된다. 특정의 예에 있어서, 표적 조직 환경에 있어서의 프로테아제에 의한 절단 시에, VH와 CH1의 경계 부근의 프로테아제 절단 사이트가 파괴되어, VH의 유리를 결과로서 가져온다. VH의 유리는, 다음에, IL-12와 융합 단백질의 리간드 결합 도메인 사이의 결합을 파괴하고, 따라서, IL-12를 유리한다. 필리핀원숭이에 있어서의 급속한 배출의 본 발명자들의 관찰(실시예 2)과 유사하게, KLH 2가 융합 FP7은, SCID 마우스에 있어서 335ml/일/kg의 클리어런스를 나타냈다(도 8a). 한편으로, IL-12 융합 단백질의 활성화형은, 그 불활성형에 필적하는 클리어런스를 갖고 있었음이 관찰되었다(도 8b). 잠재적으로, VH 도메인, VL 도메인, 및 IL-12 부분은, 결합력을 나타낼 수 있고, 프로테아제 절단 후에 완전히는 해리되지 않고(도 9a), 이것이, 계속해서, IL-12 융합 단백질의 약물동태에 영향을 미쳐, 보다 높은 클리어런스 레벨을 나타내지 않았기 때문에, 이 현상이 관찰되었음이 가정되었다. 헤파린 결합 영역이, 활성화된 융합 단백질의 빠른 클리어런스에 기여하기 때문에, 이것은 타당하다고 생각된다. FP2 및 FP3을 제외한 현재 기재하고 있는 융합 단백질의 가변 영역의 특정의 경우에는, 헤파린 결합 영역은, IL-12 결합 에피토프와 극히 근접하고 있고, 따라서, 불완전한 유리 때문에 IL-12가 결합한 채로 있을 때에, 단백질의 클리어런스는 그만큼 빠르지 않을 가능성이 있다. 한편으로, IL-12 융합 단백질의 활성화형의 활성은, IL-12 수용체에 결합할 수 있는 채이고, 재조합 IL-12와 동일한 정도까지 IL-12 시그널 전달을 활성화한다(도 9b).
IL-12의 유리에 영향을 미칠 수 있는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 임의의 남은 결합력을 파괴하기 위해서, VH와 VL의 경계면의 조작을, VH와 VL 사이의 회합을 저감시키도록 행했다. 주로, VH/VL 경계면을 만들어내는 FR 영역 중의 아미노산이, 프로테아제 절단 후에 VH 유리 경향을 증가시키도록 개변되어 있다. 더욱이, 본 발명자들은 또한, CDR 영역 내의 아미노산을 추가적으로 개변하는 것이, IL-12 융합 단백질의 가변 영역에 대한 IL-12 결합을 파괴하지 않고, VH의 해리를 촉진할 수 있었음도 발견했다.
융합 단백질로부터의 VH 또는 VL의 해리(그 외 VH 유리 또는 VH 해리라고도 칭해진다)를 촉진하는 아미노산 개변의 스크리닝을, 실시예 1 및 2에 기재되는, VH와 CH1의 경계 부근에 프로테아제 절단 사이트를 갖는 IgG 항체를 포함하는 2가 융합 단백질에 있어서 최초로(도 10a), 계속해서, 2가 융합 단백질 융합 형식에 있어서(도 10b) 행했다. 프로테아제 절단 후에 VH 유리를 개선하는 아미노산 개변의 효과를, 인비트로로 평가했다. 인비트로 VH 유리 어세이를, Biacore T200 기기(Cytiva)를 이용하여 실시했다(도 10a 및 10b). 포착 분자를, 최초에, 아민 커플링 키트(Cytiva)를 이용하여 센서 칩의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 다음에, 전술한 프로테아제 절단 가능 IgG 항체 또는 상기의 프로테아제 절단 가능 2가 융합 단백질의 어느 것을, 포착 단백질을 개재시켜 센서 표면의 플로 셀 상에 포착시켰다. 이것에 이어, 재조합 인간 u-플라스미노겐 활성화 인자/유로키나제(인간 uPA, huPA)(R&D Systems; 1310-SE-010) 또는 완충액을 플로 셀에 걸쳐서 주입했다. 추가로, VH 유리를 개선하기 위해서 행해진 아미노산 개변이, 항원 결합 도메인 또는 리간드 결합 도메인의 리간드를 중화하는 능력에 영향을 미치지 않았음을 확실히 하기 위해서, 리간드와 항원 결합 도메인 또는 리간드 결합 도메인의 결합 어피니티를 평가했다. 최종적으로, VH 유리를 개선하기 위한 아미노산 개변을 포함하는 프로테아제로 활성화된 2가 융합 단백질의 클리어런스 레벨을 평가했다.
3-1 VH/VL 경계면 내에 개변을 포함하는 항IL-12 항체의 조제
항IL-12 항체 Ab1(Ab101H-12aa-C8/Ab102L-SK1)은, 경쇄(서열 번호: 1009) 및 중쇄(서열 번호: 1010)로 구성되는 호모이량체이다. 중쇄(서열 번호: 1010)에 있어서, VH인 Ab101H(서열 번호: 1011)는, 절단 가능 링커 12aa(서열 번호: 941)를 개재시켜, 정상 영역 C8(서열 번호: 1087)에 융합하고 있다. VH 유리를 촉진하는 아미노산 개변을, Ab101H VH의 V37, G44, L45, W47, Y91, W103, 및 Ab102 VL의 A43, P44, L46, Y49, Y87, 및 F98의 어느 1개 또는 복수의 부위에서 행했다. 몇몇 예에 있어서, 아미노산 개변을 또한, VH/VL 경계면 내에 존재하는 CDR 부위, 예를 들어, 100a에 있어서 행했다.
각 쇄의 발현 벡터를, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켜, ProA 정제법에 의해 정제했다.
[표 6]
3-2 항IL-12 항체(Ab1) 개변체를 이용한 VH 유리 아미노산 개변의 스크리닝
3-2-1 단일 변이체에 대한 VH 유리의 평가
단일한 아미노산 개변("단일 변이체")을, 항IL-12 항체 Ab1의 VH/VL 경계면에 도입하고, VH 유리 경향을 측정했다. 단일 변이체에 대한 VH 유리를, Biacore T200 기기(Cytiva)를 이용하여 37℃에서 판정했다. 항인간 Fc 항체(Cytiva)를, 아민 커플링 키트(Cytiva)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 모든 항체를, HBS-EP+ 완충액에 있어서 조제했다. 각 항체를, 항인간 Fc 항체에 의해 센서 표면 상에 포착시켰다. 항체를, 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4에 200RU의 레벨까지 포착시키고, 그 다음에, 모든 FC에 걸쳐서 500nM의 재조합 인간 u-플라스미노겐 활성화 인자/유로키나제(인간 uPA, huPA)(R&D Systems; 1310-SE-010) 또는 완충액의 300초의 주입을 행했다. 센서 표면을, 각 사이클에 3M MgCl2로 재생시켰다. 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4 상에의 샘플 주입이 끝나기 10초 전의 RU치를, 각 항체에 대한 최종 반응으로서 채용했다. RU의 저감 퍼센티지를, 이하의 식을 이용하여 계산했다.
VH는, IgG 분자의 분자량의 20%에 대응하기 때문에, 20%의 반응의 저감은, 100%의 VH가 유리되었음을 시사한다.
VH/VL 경계면에 있어서의 많은 단일 변이는, 개변 없음과 비교하여, VH 유리 경향의 증가를 가져왔다(도 11a, 표 7).
[표 7]
3-2-2 조합 변이체에 대한 VH 유리의 평가
IL-12에 대한 단일 변이체의 결합 카이네틱스에 기초하여, 몇몇 변이를 선택하고(표 9), 선택한 변이의 조합을 행했다("조합 변이체"). 변이가, IL-12에 대한 항체의 결합 카이네틱스에 영향을 미치지 않음을 확실히 하기 위해서, 단일 변이체 및 조합 변이체의 결합 카이네틱스를 평가했다(실시예 3-3). 조합 변이체에 대한 VH 유리를, Biacore T200 기기(Cytiva)를 이용하여 37℃에서 판정했다. 프로틴 A/G(PIERCE)를, 아민 커플링 키트(Cytiva)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 모든 항체 및 애널라이트를, HBS-EP+ 완충액에 있어서 조제했다. 각 항체를, 프로틴 A/G에 의해 센서 표면 상에 포착시켰다. 항체를, 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4에 200RU의 레벨까지 포착시키고, 그 다음에, 모든 FC에 걸쳐서 1uM의 재조합 인간 uPA 또는 완충액의 300초의 주입을 행했다. 센서 표면을, 각 사이클에 10mM 글리신-HCl, pH 1.5로 재생시켰다. 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4 상에의 샘플 주입이 끝나기 5초 전의 RU치를, 각 항체에 대한 최종 반응으로서 채용했다. RU의 저감 퍼센티지를, 이하의 식을 이용하여 계산했다.
VH는, IgG 분자의 분자량의 20%에 대응하기 때문에, 20%의 반응의 저감은, 100%의 VH가 유리되었음을 시사한다.
VH-VL 경계면 변이의 많은 조합은, 개변 없음과 비교하여, VH 유리 경향의 증가를 나타냈다(도 11b, 표 8).
[표 8]
3-3 단일 변이 및 조합 변이는, 항IL-12 항체와 IL-12 사이의 결합 카이네틱스에 영향을 미치지 않는다
pH 7.4에서의 인간 IL-12에 결합하는 항IL-12 항체의 어피니티를, Biacore T200 기기(Cytiva)를 이용하여 37℃에서 결정했다. 항인간 Fc 항체(Cytiva)를, 아민 커플링 키트(Cytiva)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 모든 항체 및 애널라이트를, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES, pH 7.4에 있어서 조제했다. 각 항체를, 항인간 Fc 항체에 의해 센서 표면 상에 포착시켰다. 항체 포착 레벨은, 50반응 단위(RU)를 목표로 했다. 5nM의 인간 IL-12를, 애널라이트로서 주입하고, 계속해서 해리시켰다. 센서 표면을, 각 사이클에 3M MgCl2로 재생시켰다. Biacore T200 Evaluation software(Cytiva)를 이용하여, 데이터를 가공 처리하여 1:1 결합 모델에 피팅하는 것에 의해, 결합 어피니티를 결정했다. 표 9는, VH 해리를 촉진하기 위한 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는 단일 변이체 및 조합 변이체의, IL-12에 대한 결합 카이네틱스를 나타낸다. 표 9에 있어서의 결과에 기초하여, IL-12에 대한 항IL-12 항체 Ab1 개변체의 결합 카이네틱스는, 대조(-/-)와 비교하여 격렬하게는 변화하지 않았음이 관찰된다.
[표 9]
3-4 VH/VL 경계면 내에 개변을 포함하는 IL-12 융합 단백질의 조제
2가 IL-12 융합 단백질 FP8(Ab101H-12aa-C4-L4-IL12006/Ab102L-SK1)은, 경쇄(서열 번호: 1009) 및 중쇄(서열 번호: 1012)로 구성되는 호모이량체이다. 중쇄(서열 번호: 1012)에 있어서, VH인 Ab101H(서열 번호: 1011)는, 절단 가능 링커 12aa(서열 번호: 941)를 개재시켜, 정상 영역 C4(서열 번호: 970)의 N말단에 융합하고 있고, 단쇄 IL-12인 IL12006(서열 번호: 1008)은, GS 링커(서열 번호: 963)에 의해 정상 영역의 C말단에 융합하고 있다. VH/VL 경계면에서 적어도 1개의 아미노산 개변을 행하는 것에 의해, 및 추가적으로 CDR 영역 중의 개변을 수반하여 또는 수반하지 않고서, 중쇄(서열 번호: 1012) 및 경쇄(서열 번호: 1009)를, VH/VL 경계면에서 추가로 개변했다. 상기의 실시예 3-2 및 3-3에 나타나는, 높은 퍼센티지의 VH 유리 경향과 결합 카이네틱스의 최소의 변화가 있었거나 또는 어떠한 변화도 없었음이 실증된 개변을, 선택했다. FP8 및 VH/VL 경계면에 있어서의 개변을 포함하는 몇몇 융합 단백질("단일 변이체" 또는 "조합 변이체")을, 표 11A에 나타나는 바와 같이 검토했다.
2가 IL-12 융합 단백질 FP13(Ab101H-N0222-C4-L4-IL12v1.KHKE/Ab102L-SK1)은, 경쇄(서열 번호: 1009) 및 중쇄(서열 번호: 1088)로 구성되는 호모이량체이다. 중쇄(서열 번호: 1088)에 있어서, VH인 Ab101H(서열 번호: 1011)는, 절단 가능 링커 N0222(서열 번호: 1089)를 개재시켜, 정상 영역 C4(서열 번호: 970)의 N말단에 융합하고 있고, 단쇄 IL-12인 IL12v1.KHKE(서열 번호: 1090)는, GS 링커(서열 번호: 963)에 의해 정상 영역의 C말단에 융합하고 있다. VH/VL 경계면에서 적어도 1개의 아미노산 개변을 행하는 것에 의해, 및 추가적으로 CDR 영역 중의 개변을 수반하여 또는 수반하지 않고서, 중쇄(서열 번호: 1088) 및 경쇄(서열 번호: 1009)를, VH/VL 경계면에서 추가로 개변했다. VH/VL 경계면에 있어서의 개변을 수반하는 FP13의 몇몇 융합 단백질을, 표 11B에 나타나는 바와 같이 검토했다.
각 쇄의 발현 벡터를, 표 10에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 융합 단백질의 정제는, MabSelect SuRe(카탈로그 번호: 17-5438-01, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
[표 10]
3-5 2가 IL-12 융합 단백질(FP8) 개변체를 이용한 VH 유리 아미노산 개변의 스크리닝
2가 IL-12 융합 단백질에 대한 VH 유리를, Biacore T200 기기(Cytiva)를 이용하여 37℃에서 판정했다. 프로틴 A/G(PIERCE)를, 아민 커플링 키트(Cytiva)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 모든 단백질 및 애널라이트를, HBS-EP+ 완충액에 있어서 조제했다. 각 단백질을, 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4에 포착된 프로틴 A/G에 의해, 500RU의 레벨까지 센서 표면 상에 포착시키고, 그 다음에, 모든 FC에 걸쳐서 400nM의 재조합 인간 uPA 또는 완충액의 1800초의 주입을 행했다. 센서 표면을, 각 사이클 후에 10mM 글리신-HCl, pH 1.5로 재생시켰다. 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4 상에의 샘플 주입이 끝나기 10초 전의 RU치를, 각 항체에 대한 최종 반응으로서 채용했다. RU의 저감 퍼센티지를, 이하의 식을 이용하여 계산했다.
VH는, 2가 IL-12 융합 단백질의 분자량의 10%에 대응하기 때문에, 10%의 반응의 저감은, 100%의 VH가 유리되었음을 시사한다.
표 11A 및 11B, 및 도 12a 및 12b에 나타나는 바와 같이, 시험된 개변체는 모두, 개선된 VH 유리 경향을 나타냈다.
[표 11A]
[표 11B]
3-6 VH/VL 경계면에 아미노산 개변을 포함하는 활성화된 2가 IL-12 융합 단백질의 조제
표 11A에 기재되는 바와 같은, VH 해리를 촉진하는 VH/VL 경계면의 아미노산 개변을 포함하는 2가 IL-12 융합 단백질을, 조제하고, 추가적으로 프로테아제 처리에 제공했다. 재조합 인간 u-플라스미노겐 활성화 인자/유로키나제(uPA)(R&D Systems, Inc., 1310-SE-010)를, 프로테아제로서 이용했다. 프로테아제 및 각 2가 IL-12 융합 단백질을, PBS에 있어서 37℃의 조건하에서 4시간, 1:1의 비로 반응시켰다. Ni Sepharose excel 수지(카탈로그 번호: 17371201, Cytiva)를 이용한 풀다운에 의해, 프로테아제를, 소화 혼합물로부터 제거했다. 표 12는, 개변체, VH 및 VL의 변이, 및 서열 번호의 리스트를 나타낸다.
[표 12]
3-7 VH/VL 경계면에 아미노산 개변을 포함하는 활성화된 2가 IL-12 융합 단백질의 약물동태
3-7-1 SCID 마우스를 이용한 인비보 시험
VH 유리 개변체(표 12)의 약물동태를, SCID 마우스에 있어서 평가했다. VH 유리 개변체(0.04mg/mL)를, 10mL/kg의 단회 정맥내 투여로 투여했다. 혈액을, 투여의 5분 후, 4시간 후, 1일 후, 2일 후, 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후, 및 28일 후에 수집했다. 수집한 혈액을, 즉시 14000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리했다. 분리한 혈장을, 측정까지 -20℃ 미만에서 보관했다.
3-7-2 ELISA에 의한 SCID 마우스 혈장 중의 VH 유리 개변체의 측정
SCID 혈장 중의 VH 유리 개변체의 농도를, IL-12 High Sensitivity Human ELISA 키트(Abcam)에 의해, 제조업자의 설명서에 따라 측정했다. VH 유리 개변체의 농도는, 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 교정 곡선의 응답에 기초하여 계산했다. 이 방법에 따라 측정한 혈장 VH 유리 개변체 농도의 타임 코스를, 도 13에 나타낸다.
3-7-3 SCID 마우스에 있어서의 VH 유리 개변체의 약물동태
SCID 마우스에 있어서의 VH 유리 개변체의 약물동태 프로파일을 평가했다. 도 13은, SCID 마우스에 있어서의 정맥내 투여 후의 VH 유리 개변체의 혈장 농도의 타임 코스를 나타낸다. 미절단의 2가 IL-12 융합 단백질인 Ab101H12/Ab102L103 및 Ab101H89/Ab102L103의 클리어런스는, 각각, 26.6 및 13.9mL/일/kg이었다. 미절단의 융합 단백질과 비교하여, VH 유리 개변체는 모두, 보다 높은 클리어런스 레벨을 갖고, 특히, 소화된 Ab101H89/Ab102L69 및 소화된 Ab101H89/Ab102L103은, 이들 개변체 중에서 가장 높은 클리어런스를 가져, 각각, 599 및 615mL/일/kg이었다(표 13, 도 13). 이들의 결과에 의해, VH 유리 개변체는, 그 절단 가능 링커의 프로테아제 소화를 개재시켜 활성화되는, 융합 단백질로부터의 VH 해리를 촉진했음이 나타난다. 이것에 의해, 그렇지 않으면 융합 단백질의 리간드 결합 도메인이 결합하고 있을 때에 마스킹되어 있던, IL-12 상의 2개의 헤파린 결합 부위가 노출된다. VH 해리를 촉진하기 위해서 행해진 아미노산 개변의 결과로서, 세포외 매트릭스에의 재빠른 흡수가 있고, 이것이, 급속한 배출을 가져온다.
[표 13]
3-8 2가 CXCL10 융합 단백질의 조제
VH 유리 변이의 유효성을 또한, 다른 항체-항원의 조합인 CXCL10 및 항CXCL10 항체에서 검증했다. IL-12와 마찬가지로, 문헌에 있어서 보고되어 있는 바와 같이, CXCL10은, 매우 짧은 반감기를 갖는다(9.83h; http://www.ectrx.org/detail/current/2020/18/3/0/368/0). 상기와 같이, 미절단("불활성") 상태에서, 2가 CXCL10 융합 단백질은, CXCL10가 항CXCL10 항체의 항원 결합 도메인에 결합하고 있을 때의 GAG 결합 부위의 마스킹 때문에, 보다 긴 반감기를 가질 것이다. 프로테아제 절단에 의한 활성화 시에, CXCL10은, 항원 결합 도메인으로부터 유리되고, 절단("활성") 상태 분자는, 급속히 배출된다(도 14a).
2가 CXCL10 융합 단백질을, CXCL10 분자(hCXCL10R75A. 0041, 서열 번호: 1020)과 항CXCL10 항체를 절단 가능 링커를 개재시켜 융합시키는 것에 의해 구축했다. 특별히 주기하지 않는 한, Fc 영역은, FcγR 결합을 무효로 하기 위한 변이(EU 넘버링으로 L235R/G236R/A327G/A330S/P331S)를 함유하는 개변된 IgG1 영역이다.
2가 CXCL10 융합 단백질 FP9(hCXCL10R75A.0041-L7-HFR0039H-12aa0054-C7/L-LT0)는, 경쇄(서열 번호: 1021) 및 중쇄(서열 번호: 1022)로 구성되는 호모이량체이다. 중쇄(서열 번호: 1022)에 있어서, hCXCL10R75A.0041은, GS 링커(L7, 서열 번호: 1025)를 개재시켜 VH 영역(HFR0039H, 서열 번호: 1024)에 융합하고 있고, VH 영역은, 절단 가능 링커(서열 번호: 1027)를 개재시켜 정상 영역(C7, 서열 번호: 1026)에 융합하고 있다. 표 15에 기재되는 바와 같은 VH/VL 경계면에 있어서의 추가적인 개변을 수반하여, 서열 번호: 1023을 경쇄로서 이용하고, 서열 번호: 1028을 중쇄로서 이용했다.
각 쇄의 발현 벡터를, 표 14에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 융합 단백질의 정제는, MABSELECT SURE LX(카탈로그 번호: 17547402, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제를 이용하여 행했다.
[표 14]
3-9 2가 CXCL10 융합 단백질을 이용한 VH 유리 아미노산 개변의 스크리닝
CXCL10 융합 단백질로부터 유리된 VH의 퍼센티지를, (i) 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC) 및 (ii) 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 2개의 방법을 이용하여 평가했다.
(i) SEC법: CXCL10 융합 단백질을, TSKgel G3000SWXL 칼럼(카탈로그 번호: 000854, Tosoh)에 어플라이하고, 개변된 이동상(50mM NaPB, 750mM 아르기닌 HCl)을 이용하는 것에 의해 분리했다. 피크를, 형광(여기 280nm, 형광 330nm)에 의해 검출했다. 프로테아제 처리 샘플에 대해서는, 0.18mg/mL의 CXCL10 융합 단백질을, 70nM uPA(카탈로그 번호: 755304, Biolegend)로 1.5시간 처리했다. VH 유리의 퍼센티지를, 형광 피크 면적으로부터 계산할 수 없지만, VH/VL 경계면에 있어서의 전하 변이가, 개변 없음과 비교하여 리간드 유리의 경향을 증가시킴이 관찰되었다(도 14 B).
(ii) Biacore법: CXCL10 융합 단백질에 대한 VH 유리를, Biacore T200 기기(GE Healthcare)를 이용하여 판정했다. Sure Protein A(카탈로그 번호: 28-4018-60, GE Healthcare)를, CM3 센서 칩(카탈로그 번호: BR100536, GE Healthcare)의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 모든 단백질 및 애널라이트를, 개변된 런닝 완충액(pH 7.4/10mM HEPES/500mM NaCl/0. 005% SurfactantP20/3mM EDTA)에 있어서 조제했다. 각 단백질을, 플로 셀에 포착된 프로틴 A에 의해 센서 표면 상에 포착시켰다. 이것에 이어, 모든 FC에 걸쳐서 200nM uPA(카탈로그 번호: 755304, Biolegend) 또는 완충액을 주입했다. 센서 표면을, 각 사이클 후에 재생시켰다. 플로 셀 상에의 샘플 주입이 끝나기 5초 전의 RU치를, 각 단백질에 대한 최종 반응으로서 채용했다. RU의 저감 퍼센티지를, 이하의 식을 이용하여 계산했다.
CXCL10-VH는, IgG 분자의 분자량의 30%에 대응하기 때문에, 30%의 반응의 저감은, 100%의 CXCL10-VH 영역이 유리되었음을 시사한다.
VH/VL 경계면에 있어서의 전하 변이는, 개변 없음과 비교하여 CXCL10-VH 유리 경향의 증가를 가져왔다(표 15).
[표 15]
VH와 VL의 경계면에 있는 아미노산의 개변을 개재시켜 VH/VL 경계면에서 행해진 조작은, VH와 VL 사이의 회합을 저감시켜, 본 발명의 2가 융합 단백질로부터의 VH의 해리를 촉진했다. 예로서, 2개의 분자 형식 및 2개의 리간드/항원을 포함하는 융합 단백질, 즉, 2가 IL-12 융합 단백질 및 2가 CXCL10 융합 단백질을 평가했다. 양쪽의 예에 있어서, VH와 VL의 경계면에서의 아미노산 개변은, 분자 형식 또는 리간드/항원 동일성과는 무관계하게, 2가 융합 단백질로부터의 VH의 해리를 촉진했다. 각 경우에, VH의 유리는, 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합 또는 항원 결합 도메인에 대한 항원의 결합을 파괴하고, 그들이, 그 각각의 수용체 또는 결합 파트너에 결합하여, 그 생물학적 활성을 발휘하는 것을 가능하게 한다. 더욱이, 본 발명자들은 또한, CDR 영역 중에 있는 아미노산을 추가적으로 개변하는 것도 또한, 리간드/항원과 그 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인의 결합 카이네틱스에 대해서 어떠한 유의한 변화도 수반하지 않고서, VH 해리 및 그 후의 융합 단백질로부터의 리간드/항원의 유리를 촉진하는 데 유효했음도 발견했다. 실제로, 프레임워크 영역 및 CDR 영역에 있어서의 VH와 VL의 경계면에 있는 개변의 조합은, 프레임워크 영역만에 있어서 행해진 개변과 비교하여, 우수한 VH 유리 경향을 나타냈다(28.1%의 VH 유리를 나타낸 Ab101H17/Ab102L69 대 56%의 VH 유리를 나타낸 Ab101H89/Ab102L69).
3-10 2가 IL-22 융합 단백질의 조제
각각이 다른 분자 형식인, 3개의 IL-22 융합 단백질 FP14, FP15, 및 FP16을 설계했다(도 22a, 23a, 및 24a). 도 22a에 나타나는 바와 같이, 프로테아제 절단 시에, FP14로부터 VH-IL-22가 유리되고("VH-리간드 유리"), 도 23a에 나타나는 바와 같이, FP15로부터 VL-IL-22가 유리되고("VL-리간드 유리"), 및 도 24a에 나타나는 바와 같이, FP16으로부터 VH가 유리된다("VH-리간드 유리"). 2가 인터류킨-22(IL-22) 융합 단백질을, IL-22 분자(서열 번호: 971)와 항IL-22 항체를 절단 가능 링커를 개재시켜 융합시키는 것에 의해 구축했다. 2가 IL-22 융합 단백질 FP14(IL22-GS-Ab4H-12aa-C6/Ab4L-LT0)는, 중쇄(서열 번호: 1095) 및 경쇄(서열 번호: 1096)로 구성되는 호모이량체이다. 중쇄(서열 번호: 1095)에 있어서, IL-22(서열 번호: 971)는, GS 링커(서열 번호: 1001)를 개재시켜, VH인 Ab4H(서열 번호: 1091)의 N말단에 융합하고 있다. Ab4H(서열 번호: 1091)는, 절단 가능 링커 12aa(서열 번호: 941)를 개재시켜 정상 영역 C6(서열 번호: 1006)의 N말단에 융합하고 있다. VH/VL 경계면에서 적어도 1개의 아미노산 개변을 행하는 것에 의해, 중쇄(서열 번호: 1095) 및 경쇄(서열 번호: 1096)를, VH/VL 경계면에서 추가로 개변했다. Ab4L은, VL이다(서열 번호: 1092).
2가 IL-22 융합 단백질 FP15(Ab5H-C6/IL22-GS-Ab5L-12aa-LT0)는, 중쇄(서열 번호: 1097) 및 경쇄(서열 번호: 1098)로 구성되는 호모이량체이다. 경쇄(서열 번호: 1098)에 있어서, IL-22(서열 번호: 971)는, GS 링커(서열 번호: 1001)를 개재시켜, VL인 Ab5L(서열 번호: 1094)의 N말단에 융합하고 있다. Ab5L(서열 번호: 1094)은, 절단 가능 링커 12aa(서열 번호: 941)를 개재시켜 정상 영역 C9(서열 번호: 1101)의 N말단에 융합하고 있다. VH/VL 경계면에서 적어도 1개의 아미노산 개변을 행하는 것에 의해, 중쇄(서열 번호: 1097) 및 경쇄(서열 번호: 1098)를, VH/VL 경계면에서 추가로 개변했다.
2가 IL-22 융합 단백질 FP16(Ab5H-12aa-C4-L4-IL22/Ab5L-LT0)은, 중쇄(서열 번호: 1099) 및 경쇄(서열 번호: 1100)로 구성되는 호모이량체이다. 중쇄(서열 번호: 1099)에 있어서, VH인 Ab5H(서열 번호: 1093)는, 절단 가능 링커 12aa(서열 번호: 941)를 개재시켜 정상 영역 C4(서열 번호: 970)의 N말단에 융합하고 있다. C4는, GS 링커 L4(서열 번호: 963)를 개재시켜 IL-22(서열 번호: 971)에 접속되어 있다. VH/VL 경계면에서 적어도 1개의 아미노산 개변을 행하는 것에 의해, 중쇄(서열 번호: 1099) 및 경쇄(서열 번호: 1100)를, VH/VL 경계면에서 추가로 개변했다.
FP14, FP15, 및 FP16, 및 VH/VL 경계면에 있어서의 개변을 포함하는 몇몇 융합 단백질("단일 변이체" 또는 "조합 변이체")을, 각각, 표 17A, 17B, 및 17C에 나타나는 바와 같이 검토했다.
각 쇄의 발현 벡터를, 표 16에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 융합 단백질(FP) 14, 15, 및 16의 정제는, MabSelect SuRe(카탈로그 번호: 17-5438-01, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
[표 16]
3-11 IL-22 융합 단백질(FP14, 15, 및 16) 개변체를 이용한 VH, VH-리간드, 또는 VL-리간드 유리 아미노산 개변의 스크리닝
각각, IL-22 융합 단백질 FP14 및 FP15로부터 유리된 VH-리간드 또는 VL-리간드의 퍼센티지를 평가했다. 2가 IL-22 융합 단백질에 대한 VH-리간드 또는 VL-리간드의 유리를, Biacore T200 기기(Cytiva)를 이용하여 37℃에서 판정했다. 프로틴 A/G(PIERCE)를, 아민 커플링 키트(Cytiva)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 모든 단백질 및 애널라이트를, HBS-EP+ 완충액에 있어서 조제했다. 각 단백질을, 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4에 포착된 프로틴 A/G에 의해, 500RU의 레벨까지 센서 표면 상에 포착시키고, 그 다음에, 모든 FC에 걸쳐서 400nM의 재조합 인간 uPA 또는 완충액의 1800초의 주입을 행했다. 센서 표면을, 각 사이클 후에 10mM 글리신-HCl, pH 1.5로 재생시켰다. 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4 상에의 샘플 주입이 끝나기 10초 전의 RU치를, 각 항체에 대한 최종 반응으로서 채용했다. RU의 저감 퍼센티지를, 이하의 식을 이용하여 계산했다.
IL-22-VH("VH-리간드")는, IL22 융합 단백질의 분자량의 분자량의 36.8%에 대응하기 때문에, 36.8%의 반응의 저감은, 100%의 IL-22-VH가 유리되었음을 시사한다.
IL-22-VL("VL-리간드")은, IgG 분자의 분자량의 분자량의 36.8%에 대응하기 때문에, 36.8%의 반응의 저감은, 100%의 IL-22-VL가 유리되었음을 시사한다.
표 17A 및 17B, 및 도 15에 나타나는 바와 같이, 시험된 개변체는 모두, 개변 없음과 비교하여 개선된 VH-리간드 또는 VL-리간드의 유리 경향을 나타냈다.
[표 17A]
[표 17B]
각각, IL-22 융합 단백질 FP16으로부터 유리된 VH의 퍼센티지를 평가했다. 2가 IL-22 융합 단백질에 대한 VH 유리를, Biacore T200 기기(Cytiva)를 이용하여 37℃에서 판정했다. 프로틴 A/G(PIERCE)를, 아민 커플링 키트(Cytiva)를 이용하여 CM4 센서 칩의 모든 플로 셀(FC) 상에 고정화했다. 모든 단백질 및 애널라이트를, HBS-EP+ 완충액에 있어서 조제했다. 각 단백질을, 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4에 포착된 프로틴 A/G에 의해, 500RU의 레벨까지 센서 표면 상에 포착시키고, 그 다음에, 모든 FC에 걸쳐서 400nM의 재조합 인간 uPA 또는 완충액의 1800초의 주입을 행했다. 센서 표면을, 각 사이클 후에 10mM 글리신-HCl, pH 1.5로 재생시켰다. 플로 셀 FC2, FC3, 또는 FC4 상에의 샘플 주입이 끝나기 10초 전의 RU치를, 각 항체에 대한 최종 반응으로서 채용했다. RU의 저감 퍼센티지를, 이하의 식을 이용하여 계산했다.
VH는, 2가 IL-22 융합 단백질의 분자량의 15.8%에 대응하기 때문에, 15.8%의 반응의 저감은, 100%의 VH가 유리되었음을 시사한다.
표 17C 및 도 15에 나타나는 바와 같이, 시험된 개변체는 모두, 개선된 VH 유리 경향을 나타냈다.
[표 17C]
리간드 IL-12 및 CXCL10에 더하여, IL-222가 융합 단백질을, FP14로 예시되는 VH-IL-22 유리("VH-리간드 유리"), FP15에 있어서 예시되는 VL-IL-22 유리("VL-리간드 유리"), 및 FP16에서 예시되는 VH 유리의 3개의 상이한 분자 형식으로 생성시켰다. 이 실시예에 있어서, VH/VL 경계면에서 행해진 아미노산 개변이, 2가 융합 단백질로부터의 VH 유리를 촉진할 뿐만 아니라, VL 유리도 촉진하고, 리간드/항원 동일성과는 무관계함이 나타난다. VH 또는 VL의 유리는, 그들이, 그 각각의 수용체 또는 결합 파트너에 결합하여, 그 생물학적 활성을 발휘하는 것을 가능하게 한다.
실시예 4: 프로테아제 내성 IL-12
단쇄 IL-12(서열 번호: 962)는, GS 링커(서열 번호: 1029)에 의해 p35(서열 번호: 940)에 융합한 p40(서열 번호: 939)으로 구성되어 있다. IL-12의 p40 서브유닛은, 종양 특이적 프로테아제, 특히, 인간 마트립타제/ST14 촉매 도메인(MT-SP1)에 의한 절단을 받기 쉬운 헤파린 결합 부위를 포함함이 공지이다. 절단은, p40의 K260과 R261 사이의 헤파린 결합 영역(서열 번호: 1030)에 있어서 일어날 수 있다. 추가적으로, MT-SP1 절단은, 단쇄 IL-12(서열 번호: 962) 내의 GS 링커(서열 번호: 1029)가 그것에 계속되는 p35(서열 번호: 1031)의 N말단의 아르기닌(R) 포지션에서 일어날 수 있다. 2가 IL-12 융합 단백질 FP8의 특정의 경우에, IL-12의 헤파린 결합 부위는, IL-12 융합 단백질(서열 번호: 1012)의 가변 영역의 에피토프에 극히 근접하고 있다. 헤파린 결합 부위에서의 프로테아제 절단은, 활성화된 융합 형식의 IL-12 융합 단백질의 빠른 클리어런스에 영향을 미친다(도 16). 헤파린 결합 부위에서의 IL-12의 의도적이 아닌 절단을 막았지만, IL-12 융합 단백질의 에피토프를 보존하여, IL-12 융합 단백질의 불활성 상태에서 IL-12에 결합하는 그 능력을 유지한, 선택적 개변을 행했다. KLH 2가 IL-12 융합 FP7을 이용하여, 그와 같은 개변을 스크리닝했다.
4-1 KLH 2가 IL-12 융합 단백질의 조제
KLH 2가 IL-12 융합 FP10(KLH-2가 IL12006v1)은, 경쇄(서열 번호: 986) 및 중쇄(서열 번호: 1032)로 구성되는 호모이량체이다. 서열 번호: 986은, 개변을 수반하지 않는 경쇄로서 이용했다. 중쇄(서열 번호: 1032)에 있어서, KLH VH(서열 번호: 994)는, GS 링커(서열 번호: 963)를 개재시켜 Fc의 C말단에 부가된 단쇄 IL-12(서열 번호: 1033)가 그것에 계속되는, 정상 영역(서열 번호: 1006)에 융합하고 있다. FP10(KLH-2가 IL12006v1) 및 IL-12 개변체("IL-12 개변체")를 포함하는 몇몇 다른 융합 단백질을, 표 19에 나타나는 바와 같이 검토했다.
각 쇄의 발현 벡터를, 표 18에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 단백질의 정제는, MabSelect SuRe(카탈로그 번호: 17-5438-01, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
[표 18]
[표 19]
4-2 KLH-2가 IL-12 융합 단백질의 프로테아제 소화
재조합 인간 마트립타제/ST14 촉매 도메인(MT-SP1)(R&D Systems, Inc., 3946-SE-010)을, 프로테아제로서 이용했다. 75nM의 프로테아제 및 750nM의 각 융합 단백질을, PBS에 있어서 37℃의 조건하에서 1, 4, 및 24시간 반응시켰다. 그 다음에, 프로테아제에 의한 절단을, 환원 SDS-PAGE에 의해 평가했다. 결과를, 도 17 및 18에 나타낸다. 1시간 및 4시간의 프로테아제 소화 후에, 표 19에 열기되는 변이를 포함하는 융합 단백질의 대부분의 중쇄의 분자량에 있어서, 어떠한 변화도 없는 것이 주목받는다. 이것은, 대부분의 상기의 IL-12 개변체가, 대조(레인 1)와는 달리, 프로테아제 소화에 대해서 안정 또한 내성인 것을 의미한다. 1시간 및 4시간의 소화 후의 결과는, 본 발명의 2가 IL-12 융합 단백질의 활성화형의 기대되는 반감기를 나타낸다고 생각되지만, 최악의 경우로서, 최대로 24시간의 IL-12 개변체의 프로테아제 소화도 행했다. 나타나는 바와 같이, 이들 개변체("24시간 소화") 중 몇몇은, 여전히, 인큐베이션의 개시("미소화")에 필적하는 분자량을 나타내고, 프로테아제와의 긴 인큐베이션에 관계없이 안정된 채로 있다.
4-3 개선된 프로테아제 내성을 갖는 IL-12 개변체의 인비트로 활성의 평가
프로테아제 내성 개변이, 프로테아제 처리를 수반하는 및 수반하지 않는 IL-12 개변체의 활성에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해서, IL-12 루시페라제 어세이를 실시했다. 간결하게 설명하면, 2.5×104세포/웰의, 인간 IL-12Rb1, IL-12Rb2, 및 STAT4를 발현하는 IL-12 바이오어세이 세포(Promega, 카탈로그 번호 CS2018A02A)를, 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 하룻밤 인큐베이트했다. 그 다음에, IL-12, 또는 실시예 4-2로부터 선택된 프로테아제 내성 IL-12를 포함하는 KLH-2가 IL-12 융합 단백질("IL-12 개변체")을, 배양 플레이트에 첨가하고, 18시간 인큐베이트했다. 융합 단백질의 리스트는, 이하의 표 20에 열기되어 있다. 프로테아제 처리 샘플에 대해서는, IL-12 또는 IL-12 개변체를, 등몰농도의 MT-SP1로 4시간 처리해, 연속 희석물을 조제했다. 루시페라제 활성을, Bio-Glo 루시페라제 어세이 시스템(Promega, G7940)으로, 제조업자의 설명서에 따라 검출했다. 발광을, GloMax(등록상표) Explorer System(Promega #GM3500)을 이용하여 검출했다. 데이터 해석을, Microsoft(등록상표) Excel(등록상표) 2013에 의해 행하고, 해석된 데이터를, GraphPad Prism 8.4.3을 이용하여 플롯했다.
프로테아제 내성 IL-12 개변체의 IL-12 활성을, 루시페라제 어세이에 의해 평가했다. 프로테아제 내성 IL-12 개변체는 모두, 프로테아제 처리에 관계없이, hIL12_His 태그와 유사한 활성을 나타냈다(도 19).
[표 20]
4-4 개선된 프로테아제 내성을 갖는 IL-12 개변체의 약물동태의 평가
프로테아제 내성 개변체의 약물동태를, SCID 마우스에 있어서 평가했다(도 20). 프로테아제 내성 개변체(0.04mg/mL)를, 10mL/kg의 단회 정맥내 투여로 투여했다. 혈액을, 투여의 5분 후, 2시간 후, 4시간 후, 1일 후, 2일 후, 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후, 및 28일 후에 수집했다. 수집한 혈액을, 즉시 14000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리했다. 분리한 혈장을, 측정까지 -20℃ 미만에서 보관했다. 표 20에 나타나는 이하의 프로테아제 내성 개변체를, 시험했다.
4-4-1 ELISA에 의한 SCID 마우스 혈장 중의 프로테아제 내성 개변체의 측정
SCID 혈장 중의 프로테아제 내성 개변체의 농도를, IL-12 High Sensitivity Human ELISA 키트(Abcam)에 의해, 설명서에 따라 측정했다. 프로테아제 내성 개변체의 농도는, 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 교정 곡선의 응답에 기초하여 계산했다. 이 방법에 따라 측정한 혈장 프로테아제 내성 개변체 농도의 타임 코스를, 도 20에 나타낸다.
4-4-2 SCID 마우스에 있어서의 프로테아제 내성 개변체의 약물동태
SCID 마우스에 있어서의 프로테아제 내성 개변체의 약물동태 프로파일을 평가했다. 도 20은, SCID 마우스에 있어서의 정맥내 투여 후의 프로테아제 내성 IL-12 개변체의 혈장 농도의 타임 코스를 나타낸다. 도 20 및 표 21을 참조하면, 프로테아제 내성 개변체는 모두, 376mL/일/kg의 클리어런스 레벨을 갖는 대조(KLH-2가 IL12006v1)보다도 느린 배출을 나타냈다. 이들 중에서, 융합 단백질 개변체 KLH-2가 IL12006v1.KHKE 및 KLH-2가 IL12006v1.KRHE는, 각각, 241 및 206mL/일/kg이라고 하는 가장 높은 클리어런스 레벨을 나타냈다. 이들 개변체는, 높은 클리어런스 레벨을 보지하면서 프로테아제 내성이 있음을 양쪽 모두 실증하는, 약물동태 프로파일을 예시했다.
[표 21]
실시예 5: 프로테아제 활성화 시에 복원되는 IL-12 및 IL-22 융합 단백질의 생물학적 활성
5-1 VH/VL 경계면에서의 선택된 아미노산 개변 및 프로테아제 내성 IL-12 개변을 갖는 IL-12 융합 단백질의 조제
본 발명의 융합 단백질의 실시예 3에 있어서 얻어진 리간드 결합 도메인에 결합하는, 실시예 4에 있어서 얻어진 IL-12의 능력을 평가했다. 2가 IL-12 융합 단백질 FP8(Ab101H-12aa-C4-L4-IL12006/Ab102L-SK1)은, 경쇄(서열 번호: 1009) 및 중쇄(서열 번호: 1012)로 구성되는 호모이량체이다. 서열 번호: 1009는, VH/VL 경계면에 있어서의 개변을 갖는 경쇄로서 이용했다. 중쇄(서열 번호: 1012)에 있어서, VH인 Ab101H(서열 번호: 1011)는, 절단 가능 링커 12aa(서열 번호: 941)를 개재시켜 정상 영역 C4(서열 번호: 970)의 N말단에 융합하고 있고, 단쇄 IL-12인 IL12006(서열 번호: 1008)은, GS 링커(서열 번호: 963)에 의해 정상 영역의 C말단에 융합하고 있다. 실시예 3에 있어서 프로테아제 절단 후에 융합 단백질로부터의 개선된 VH 해리를 나타낸 리간드 결합 도메인(Ab101H89/Ab102L69 및 Ab101H89/Ab102L103)을, 선택했다. 실시예 4에 있어서 얻어진 단쇄 IL-12 개변체를, GS 링커(L4, 서열 번호: 963)를 개재시켜 Fc 도메인의 C말단에 부가했다. 실시예 4로부터 선택된 프로테아제 내성 IL-12 개변체를 갖는/갖지 않는, FP8 내지 12를 포함하는 몇몇 융합 단백질을 제조했다(표 22).
각 쇄의 발현 벡터를, 표 22에 나타나는 바와 같은 각 쇄를 조합하는 것에 의해, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하고, Expi293(Life Technologies Corp.)을 이용하여 발현시켰다. 단백질의 정제는, MabSelect SuRe(카탈로그 번호: 17-5438-01, GE Healthcare)에 의한 어피니티 정제, 그것에 계속되는 Superdex 200 겔 여과 칼럼(카탈로그 번호: 28-9893-35, GE Healthcare)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 행했다. 어피니티 크로마토그래피로부터의 용출액 중에 존재하는 임의의 응집물을, 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여 제거했다.
[표 22]
5-2 프로테아제 내성 IL-12를 가지는 IL-12 융합형 융합 단백질의 인비트로 활성의 평가
프로테아제 내성 개변이, 본 발명의 IL-12 융합 단백질에 대한 IL-12의 결합에 영향을 미칠지 어떨지를 평가하기 위해서, IL-12 루시페라제 어세이를 실시했다. 간결하게 설명하면, 2.5×104세포/웰의, 인간 IL-12Rb1, IL-12Rb2, 및 STAT4를 발현하는 IL-12 바이오어세이 세포(Promega, 카탈로그 번호 CS2018A02A)를, 96웰 플레이트(#Corning, #3917)에 플레이팅했다. 그 다음에, IL-12 융합 단백질을, 배양 플레이트에 첨가하고, 18시간 인큐베이트했다. 프로테아제 처리 샘플에 대해서는, 융합 단백질을, 등몰농도의 MT-SP1로 4시간 처리하여, 연속 희석물을 조제했다. 루시페라제 활성을, Bio-Glo 루시페라제 어세이 시스템(Promega, G7940)으로, 제조업자의 설명서에 따라 검출했다. 발광을, GloMax(등록상표) Explorer System(Promega #GM3500)을 이용하여 검출했다. 데이터 해석을, Microsoft(등록상표) Excel(등록상표) 2013에 의해 행하고, 해석된 데이터를, GraphPad Prism ver. 9.0.2를 이용하여 플롯했다.
2가 IL-12 융합 단백질 FP8, FP11, 및 FP12를, IL-12 루시페라제 어세이에 제공했다. 3개의 융합 단백질은 모두, MT-SP1의 비존재하에서, hIL-12_His 태그보다도 낮은 IL-12 생물 활성을 나타내고, IL-12 생물 활성은, MT-SP1 처리 시에, hIL-12_His 태그와 동일한 레벨까지 복원되었다(도 21).
5-3 프로테아제 소화를 수반하는 및 수반하지 않는, IL-22 융합 단백질의 인비트로 활성의 평가
VH와 VL의 경계면에 있는 아미노산의 개변이, IL-22의 유리를 촉진했는지 여부를 평가하기 위해서, IL-10을 분비하는 것에 의해 IL-22에 응답하는 COLO205 결장암 세포(카탈로그 번호: CCL-222, ATCC)를 이용하여, 활성 어세이를 실시했다(Int Immunopharmacol. 2004 May;4(5):679-91).
IL-22 융합 단백질 및 재조합 인간 uPA 프로테아제를 각각, 50μM HEPES(Gibco)를 함유하는 무혈청 RPMI 배지(Gibco)에 있어서 1400nM 농도로 희석하고, 그 다음에, 700nM 항체 및 700nM uPA 프로테아제의 최종 농도에 도달하도록 등체적으로 혼합했다. uPA 처리 없음에 대해서는, 융합 단백질 샘플을, 무혈청 RPMI 배지 및 HEPES와 혼합했다. 링커의 절단 및 IL-22의 유리를 가능하게 하도록, 샘플을, Thermocycler(2720 Applied Biosystems)에 있어서 4시간, 37℃에서 인큐베이트했다. 양성 대조로서, HEK293 유래의 재조합 인간 IL-22(카탈로그 번호: Z03081-50, Genscript)를, uPA와 인큐베이트했다.
COLO205 세포를, 0.25% 트립신(Gibco)으로의 트립신 처리에 의해 수집하고, 계속해서, 70마이크로미터 셀 스트레이너(Corning)를 통해 여과하여, 세포괴를 제거했다. Luna Dual Fluorescence Cell Counter(Logos Biosystem)를 이용하여 세포 계수를 행하고, 50μL 중의 3E4 세포를, NUNC Edge 96웰 평저 플레이트의 각 웰 중에 파종했다. 멸균 PBS를, NUNC Edge 플레이트의 주연(周緣)의 웰에 첨가하여, 가장자리를 따른 웰로부터의 증발을 저감시켰다. 세포를, 5% CO2 인큐베이터에 있어서 최저로도 4시간, 37℃에서 인큐베이트하여, 세포를 플레이트에 부착시켰다. uPA를 수반하고 및 수반하지 않고 인큐베이트한 IL-22 융합 단백질을, 최종 소망 농도의 6배까지 단계 희석하고, 60μL의 최종 어세이 체적에 대해서 10μL를, 세포에 첨가했다. 어세이 플레이트를, 추가로 5% CO2 인큐베이터에 있어서 하룻밤, 37℃에서 인큐베이트했다. 하룻밤의 인큐베이션 후에, 어세이 플레이트를, 300g로 3분간, 25℃에서 원심분리했다. 세포 상청 샘플을 수집하고, Human IL-10 DuoSet ELISA(R&D Systems)를 이용하여, COLO205 세포에 의해 산생된 IL-10의 양을 정량했다. Human IL-10 ELISA에 대한 수순은, IL-10 표준 및 샘플의 조제를 제외하고, 제조업자의 추천에 따라 행했다. 보다 감도가 높은 IL-10 검출을 위해서, 세포 상청 샘플을 희석하지 않고 어세이할 수 있도록, IL-10 표준을, 10% 소 태아 혈청(Sigma) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 RPMI1640 배지(Gibco)인 COLO205 배양 배지에 있어서 희석했다. 샘플의 흡광도를, MultiSkan GO 플레이트 리더(Thermo Scientific)를 이용하여, 450nm 및 595nm에서 측정했다. 데이터 해석을, Microsoft(등록상표) Excel(등록상표)에 의해 행하고, 해석된 데이터를, GraphPad Prism을 이용하여 플롯했다.
각 구축물에 있어서의 프로테아제 소화 후에 유리된 활성 IL-22의 상대량을 비교하기 위해서, 본 발명자들은, 그래프를 내삽하여, COLO205 세포가 고정량의 IL-10을 배양 상청에 분비하는 데 요구되는 IL-22의 몰농도를 결정했다. 특히, 프로테아제를 수반하고 및 수반하지 않고 유리된 활성 IL-22의 양의 차이를, 각 구축물 사이에서 비교했다. 이것을, 활성 윈도로서 보고한다.
도 22(b 내지 f)에 나타나는 바와 같이, 어떠한 변이도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 FP14(Ab4H/Ab4L)에 대한 활성 윈도("(-)uPA"/"(+)uPA")는, 상이한 어세이 플레이트에 걸쳐서 대략 13 내지 16의 범위였다. 그러나, 활성 윈도는, VH/VL 경계면에 있어서의 변이를 보유하는 몇몇 구축물에 대해 증가했다. 도 23(b 내지 e)에 있어서, 어떠한 변이도 갖지 않는 IL-22 융합 단백질 FP15(Ab4H/Ab4L)에 대한 활성 윈도는, 상이한 어세이 플레이트에 걸쳐서 대략 3배이며, VH/VL 경계면에 있어서의 변이를 보유하는 몇몇 구축물에 대해 증가했다. 마찬가지로, 도 24(b 내지 e)에 나타나는 바와 같이, 동일한 경향의 IL-22 융합 단백질 FP16의 활성 윈도의 증가가, VH/VL 경계면 변이가 적용되었을 경우에 보였다. 도 22 내지 24에 있어서는, 프로테아제를 수반하고 및 수반하지 않고 각 항체를 평가하는 요건과 연결한, 평가되어야 할 항체의 큰 패널 때문에, 각 항체를, 어떠한 복제도 수반하지 않고 단일한 웰에 있어서 평가했다. 재조합 IL-22와 비교하여 유리된 IL-22의 활성을 나타내기 위해서, 본 발명자들은, 각 융합 단백질로부터 1개의 VH/VL 경계면 개변체를 선택하고, 그것을, 어떠한 VH/VL 경계면 변이도 갖지 않는 친융합 단백질에 대해서, 및 재조합 IL-22에 대해서 비교하고, 여기에서는, 각 항체를 이중으로 평가했다. 도 25에 나타나는 바와 같이, 선택된 개변체에 있어서의 유리된 IL-22의 활성은, 재조합 IL-22의 활성에 가깝고, 이것은, VH/VL 경계면에서의 개변이, 유리된 리간드의 활성에 기여할 수 있음을 실증한다.
2가 IL-22 융합 단백질 FP14, FP15, 및 FP16을, 상기와 같은 활성 어세이에 제공했다. 시험된 융합 단백질의 모두는, uPA의 비존재하에서, 보다 낮은 IL-22 생물 활성을 나타내고, IL-22 생물 활성은, uPA 소화 시에 증가했다.
본 발명자들은, 불활성 시에 긴 반감기를 갖고, 또한 활성 시에 짧은 반감기를 갖는, 특이적 프로테아제 절단에 의해 활성화 가능한 2가 융합 단백질의 제조에 성공했다.
본 명세서에 개시되는 특징의 모두는, 임의의 조합으로 조합되어도 된다. 본 명세서에 개시되는 각 특징은, 동일한, 등가의, 또는 유사한 목적을 완수하는 대체의 특징에 의해 치환되어도 된다. 따라서, 특별히 명시적으로 기술하지 않는 한, 개시되는 각 특징은, 일반적인 일련의 등가 또는 유사한 특징의 예에 지나지 않는다.
상기의 설명으로부터, 당업자는, 본 개시의 본질적인 특성을 용이하게 파악할 수 있고, 그 정신 및 범위로부터 일탈하지 않고, 본 개시를 여러 가지 용법 및 조건에 적합시키기 위해서, 본 개시의 여러 가지 변경 및 개변을 행할 수 있다. 따라서, 다른 태양도 또한, 특허청구의 범위 내이다.
Claims (17)
- 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서,
해당 프로테아제 절단 사이트에서의 절단 시에, 해당 프로테아제 절단 사이트에 인접한 항체 도메인이 해리되고, 또한 해당 해리가, 해당 항체 도메인과 대응하는 상호작용하는 도메인의 경계면에서 행해지는 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진되고,
해당 폴리펩타이드가, 1가 혹은 2가, 단일 특이성 혹은 이중 특이성인 항체, 또는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG-IgG, IgG-Fab, 혹은 CrossMab 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 IgG 항체이거나; 혹은,
해당 폴리펩타이드가 항체 단편이고, 해당 항체 단편이, scFv, scFv-Fc, 탠덤 scFv, Fab, 탠덤 Fab, F(ab')2, Fab2, Fab-scFv-Fc, F(ab')2-scFv2, 이중 특이성 Fab2, 삼중 특이성 Fab2, 이중 특이성 다이아보디, 삼중 특이성 다이아보디, 탠덤 다이아보디, 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), 미니보디(minibody), 바이보디(bibody), 또는 트라이보디(tribody)로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
상기 폴리펩타이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 항원 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 가변 영역을 포함하고, 임의로, 해당 VH가 CH1 영역과 회합하고, 및/또는 해당 VL이 CL 영역과 회합하고, 상기 프로테아제 절단 사이트가, VH 영역과 CH1 영역의 경계, 또는 VL 영역과 CL 영역의 경계, 또는 VH와 VL의 경계에 위치하는, 폴리펩타이드. - 제 2 항에 있어서,
미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변이, VH와 VL의 경계면에서 행해지고, 해당 아미노산 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, 폴리펩타이드. - 항원 결합 도메인을 포함하는 전장 IgG 항체를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
해당 항원 결합 도메인이, 가변 영역을 포함하고,
해당 가변 영역이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 또한 (a) 그 가변 영역의 VH 영역과 CH1 영역의 경계 또는 VL 영역과 CL 영역의 경계의 프로테아제 절단 사이트, 및 (b) 해당 가변 영역에 결합하는 리간드를 포함하고,
프로테아제 절단 시에, (i) VH 또는 VL 중 한쪽이 융합 단백질로부터 해리되고, 또한 (ii) 리간드가 가변 영역으로부터 해리되고,
(i)에 기재되는 해리가, 미절단 상태와 비교하여 절단 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는, VH와 VL의 경계면에서 행해지는 적어도 1개의 아미노산 개변에 의해 촉진되고, 해당 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며,
해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질. - 제 4 항에 있어서,
상기 적어도 1개의 치환이, VH 상의 포지션 37, 39, 44, 45, 47, 91, 혹은 103, 및/또는 VL 상의 포지션 38, 43, 44, 46, 49, 87, 혹은 98(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, 융합 단백질. - 각각이 N말단으로부터 C말단을 향해, 일반식(I):
[리간드 결합 도메인]-[Lx]-[Cx]-[Ly]-[리간드 부분] (I)
에 의해 표시되는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는, 2가 호모이량체 융합 단백질로서,
식 중,
Lx가, 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 펩타이드 링커를 나타내고,
Cx가, 제2 펩타이드 링커와, 임의로, 시스테인으로부터 또는 시스테인으로 개변되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함하는, 정상 영역을 나타내고;
Ly가, 제3 펩타이드 링커를 나타내고,
해당 리간드 결합 도메인이, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 프로테아제 절단 사이트의 절단을 촉매하는 프로테아제의 비존재하("미절단 상태")와 비교하여 해당 프로테아제의 존재하("절단 상태")에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 해당 개변을 위한 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는,
상기 2가 호모이량체 융합 단백질. - 제 6 항에 있어서,
상기 리간드 부분이, IL-12이고, 해당 IL-12가, IL-12의 절단을 촉매하는 프로테아제에 폭로되었을 경우의 단백질 분해를 방해하는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 해당 적어도 1개의 아미노산 개변이, IL-12와 리간드 결합 도메인의 경계면에서 행해지는, 융합 단백질. - 제 7 항에 있어서,
상기 적어도 1개의 아미노산 개변을 행한 후에, IL-12가, KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않고, 그 대신에 (a) 내지 (p)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 개변된 서열을 포함하는, 융합 단백질:
(a) KSHRE(서열 번호: 1052);
(b) KSHHE(서열 번호: 1053);
(c) KSHKE(서열 번호: 1054);
(d) KSHSE(서열 번호: 1055);
(e) KSKHRE(서열 번호: 1056);
(f) KSKQRE(서열 번호: 1057);
(g) KSKERE(서열 번호: 1058);
(h) KSKPRE(서열 번호: 1059);
(i) KHKE(서열 번호: 1060);
(j) KHHE(서열 번호: 1061);
(k) KHRE(서열 번호: 1062);
(l) KKHE(서열 번호: 1063);
(m) KRHE(서열 번호: 1064);
(n) KRE(서열 번호: 1065);
(o) KHE(서열 번호: 1066); 및
(p) KKE(서열 번호: 1067). - 제 8 항에 있어서,
상기 리간드 결합 도메인이, 미절단 상태에서의 것과 비교하여 절단 상태에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 해당 개변이, VH와 VL의 경계면에 존재하는 아미노산의 치환이며, 해당 아미노산 잔기가, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는, 융합 단백질. - 제 9 항에 있어서,
상기 적어도 1개의 치환이, VH 상의 포지션 37, 45, 91, 혹은 103, 및/또는 VL 상의 포지션 43, 46, 49, 혹은 87(Kabat 넘버링에 따른다)로부터 선택되는, 융합 단백질. - 이하의 공정:
(a) 프로테아제 절단 사이트를 포함하는 펩타이드 링커를 도입하는 공정으로서, 해당 펩타이드 링커가, VH 영역을 CH1 영역에, 또는 VL 영역을 CL 영역에, 또는 VH를 VL에 접속하는, 공정,
(b) VL로부터의 VH의 해리, 또는 VH로부터의 VL의 해리를 촉진하기 위해서, VH와 VL의 경계면에 존재하는 적어도 1개의 아미노산 중에 적어도 1개의 치환 개변을 도입하는 공정,
(c) 공정(b)가, VH 및 VL에 대한 항원의 결합을 파괴하지 않는 것을 확인하는 공정,
(d) 공정(b)가, 프로테아제 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 시에 VH와 VL의 회합을 저감시키는 것을 확인하는 공정, 및
(e) 공정(b)로부터 결과로서 생긴 해당 폴리펩타이드 또는 해당 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 또한 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 숙주 세포로부터 회수하는 공정
을 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드, 또는 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 2가 호모이량체 융합 단백질을 제조하는 방법. - 2가 호모이량체 융합 단백질을 스크리닝하는 방법으로서,
해당 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고,
해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고,
해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 전("미절단 상태")과 비교하여 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후("절단 상태")에 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고,
해당 VH 또는 VL이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 융합 단백질로부터 유리되고,
해당 방법이,
(a) VH 또는 VL의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 개변을, 리간드 부분과 리간드 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 미절단 상태에서의 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질의 제1 반응 단위(RU1)를 측정하는 공정;
(c) 절단 상태에서의 동일한 BIACORE 표면 플라즈마 공명(SPR) 어세이에 있어서, 공정(a)의 고정화된 융합 단백질의 제2 반응 단위(RU2)를 측정하는 공정; 및
(d) RU1과 RU2 사이의 차의 퍼센티지가, 1% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 40% 이하인 경우에는, 공정(a)에 있어서의 개변을 선택하는 공정
을 포함하고,
반응 단위의 저감 퍼센티지가, 융합 단백질로부터의 VH 또는 VL의 유리에 기인하는 분자량의 저감 퍼센티지에 대응하는,
상기 방법. - 2가 호모이량체 융합 단백질을 스크리닝하는 방법으로서,
해당 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고,
해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고,
해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 전("미절단 상태")과 비교하여 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후("절단 상태")에 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고,
해당 VH 또는 VL이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 융합 단백질로부터 유리되고,
해당 방법이,
(a) VH 또는 VL의 해리를 촉진하는, 적어도 1개의 아미노산 개변 또는 적어도 1개의 페어의 아미노산 개변을, VH와 VL의 경계면에 도입하고, 또한 임의로, 적어도 1개의 아미노산 개변을, 리간드 부분과 리간드 결합 도메인의 경계면에 도입하는 공정;
(b) 미절단 상태에서의 융합 단백질의 제1 세트를, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)에 제공하여, 피크 A1(제1 피크)를 포함하는 제1 크로마토그래프를 얻는 공정;
(c) 절단 상태에서의 융합 단백질의 제2 세트를 SEC에 제공하여, 피크 A2(제2 피크) 및 추가적인 피크 A2'(제3 피크)를 포함하는 제2 크로마토그래프를 얻는 공정으로서, A2'가, A2의 숄더 피크인, 공정;
(d) 피크 A2'(제3 피크)의 곡선하 면적(AUC) 나누기 피크 A1(제1 피크)의 AUC로부터 결과로서 생긴 퍼센티지를 결정하는 공정; 및
(e) 공정(d)에 있어서 얻어진 퍼센티지가, 1% 이하이거나, 또는 5% 이하이거나, 또는 10% 이하이거나, 또는 15% 이하이거나, 또는 20% 이하이거나, 또는 30% 이하이거나, 또는 40% 이하인, 공정(a)에 있어서의 개변을 선택하는 공정
을 포함하고,
공정(d)에 있어서 결정된 저감 퍼센티지가, 융합 단백질로부터의 VH 또는 VL의 유리에 기인하는 분자량의 저감 퍼센티지에 대응하는,
상기 방법. - 이하의 서열:
(i) 서열 번호: 1084와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1085와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(ii) 서열 번호: 1084와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1086과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(iii) 서열 번호: 1084와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1085와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(iv) 서열 번호: 1084와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호: 1086과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
(v) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vi) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(vii) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(viii) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(ix) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(x) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xi) 서열 번호: 1009와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xii) 서열 번호: 1016과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xiii) 서열 번호: 1017과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xiv) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xv) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xvi) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1012와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xvii) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xviii) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xix) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1050과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xx) 서열 번호: 1009와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xxi) 서열 번호: 1016과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xxii) 서열 번호: 1017과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열 번호: 1088과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
(xxiii) (i) 내지 (iv)의 어느 것에 기재되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인과 경합하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인; 및
(xxiv) (v) 내지 (xxiii)의 어느 것에 기재되는 중쇄 및 경쇄와 경합하는, 중쇄 및 경쇄
의 어느 1개를 포함하는, IL-12를 포함하는 2가 호모이량체 융합 단백질. - 프로테아제 내성 IL-12로서, IL-12가, KSKREK(서열 번호: 1102)의 아미노산 서열을 포함하지 않고, 또한 이하의 서열:
(i) 서열 번호: 1068과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호: 1069와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호: 1070과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(iv) 서열 번호: 1071과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(v) 서열 번호: 1072와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vi) 서열 번호: 1073과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(vii) 서열 번호: 1074와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(viii) 서열 번호: 1075와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열 번호: 1076과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(x) 서열 번호: 1077과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xi) 서열 번호: 1078과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xii) 서열 번호: 1079와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiii) 서열 번호: 1080과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xiv) 서열 번호: 1081과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xv) 서열 번호: 1082와 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xvi) 서열 번호: 1083과 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일한 아미노산 서열;
(xvii) 서열 번호: 1068과 동일한 아미노산 서열;
(xviii) 서열 번호: 1069와 동일한 아미노산 서열;
(xix) 서열 번호: 1070과 동일한 아미노산 서열;
(xx) 서열 번호: 1071과 동일한 아미노산 서열;
(xxi) 서열 번호: 1072와 동일한 아미노산 서열;
(xxii) 서열 번호: 1073과 동일한 아미노산 서열;
(xxiii) 서열 번호: 1074와 동일한 아미노산 서열;
(xxiv) 서열 번호: 1075와 동일한 아미노산 서열;
(xxv) 서열 번호: 1076과 동일한 아미노산 서열;
(xxvi) 서열 번호: 1077과 동일한 아미노산 서열;
(xxvii) 서열 번호: 1078과 동일한 아미노산 서열;
(xxviii) 서열 번호: 1079와 동일한 아미노산 서열;
(xxix) 서열 번호: 1080과 동일한 아미노산 서열;
(xxx) 서열 번호: 1081과 동일한 아미노산 서열;
(xxxi) 서열 번호: 1082와 동일한 아미노산 서열; 및
(xxxii) 서열 번호: 1083과 동일한 아미노산 서열
의 어느 것을 포함하는, 상기 프로테아제 내성 IL-12. - 복수의 2가 호모이량체 융합 단백질을 포함하는 라이브러리로서, 해당 라이브러리 내의 각 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단의 전후에서 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하는, 상기 라이브러리.
- 2가 호모이량체 융합 단백질로부터 VH 또는 VL을 유리하는 방법으로서,
해당 융합 단백질이, 프로테아제 절단 사이트 및 리간드 결합 도메인을 포함하고,
해당 리간드 결합 도메인이, 서로 회합하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고,
해당 리간드 결합 도메인이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 전과 비교하여, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 VH와 VL 사이의 회합을 저감시키는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고,
해당 VH 또는 VL이, 해당 절단 사이트에서의 프로테아제 절단 후에 융합 단백질로부터 유리되고,
해당 방법이, 적어도 1개의 아미노산 개변을 VH와 VL의 경계면에 도입하는 공정을 포함하고,
해당 아미노산이, 프레임워크 영역(FR) 중에 있는,
상기 방법.
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