EA015338B1 - ВАРИАНТЫ ИЛ-12p40 С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ - Google Patents

ВАРИАНТЫ ИЛ-12p40 С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ Download PDF

Info

Publication number
EA015338B1
EA015338B1 EA200870131A EA200870131A EA015338B1 EA 015338 B1 EA015338 B1 EA 015338B1 EA 200870131 A EA200870131 A EA 200870131A EA 200870131 A EA200870131 A EA 200870131A EA 015338 B1 EA015338 B1 EA 015338B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
zeg
azr
variant
tht
subunit
Prior art date
Application number
EA200870131A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870131A1 (ru
Inventor
Гордон Д. Вебстер
Сьюзан П. Маккензи
Кин-Минь Ло
Паскаль Андре Стейн
Original Assignee
Мерк Патент Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерк Патент Гмбх filed Critical Мерк Патент Гмбх
Publication of EA200870131A1 publication Critical patent/EA200870131A1/ru
Publication of EA015338B1 publication Critical patent/EA015338B1/ru

Links

Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N21/00—Selective content distribution, e.g. interactive television or video on demand [VOD]
    • H04N21/40—Client devices specifically adapted for the reception of or interaction with content, e.g. set-top-box [STB]; Operations thereof
    • H04N21/43—Processing of content or additional data, e.g. demultiplexing additional data from a digital video stream; Elementary client operations, e.g. monitoring of home network or synchronising decoder's clock; Client middleware
    • H04N21/435—Processing of additional data, e.g. decrypting of additional data, reconstructing software from modules extracted from the transport stream
    • H04N21/4353—Processing of additional data, e.g. decrypting of additional data, reconstructing software from modules extracted from the transport stream involving decryption of additional data
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G06Q20/00—Payment architectures, schemes or protocols
    • G06Q20/08—Payment architectures
    • G06Q20/10—Payment architectures specially adapted for electronic funds transfer [EFT] systems; specially adapted for home banking systems
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G06Q30/00—Commerce
    • G06Q30/02—Marketing; Price estimation or determination; Fundraising
    • G06Q30/0207—Discounts or incentives, e.g. coupons or rebates
    • G06Q30/0215—Including financial accounts
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G06Q30/00—Commerce
    • G06Q30/02—Marketing; Price estimation or determination; Fundraising
    • G06Q30/0207—Discounts or incentives, e.g. coupons or rebates
    • G06Q30/0226—Incentive systems for frequent usage, e.g. frequent flyer miles programs or point systems
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G06Q30/00—Commerce
    • G06Q30/04—Billing or invoicing
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G06Q40/00—Finance; Insurance; Tax strategies; Processing of corporate or income taxes
    • G06Q40/12—Accounting
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L41/00—Arrangements for maintenance, administration or management of data switching networks, e.g. of packet switching networks
    • H04L41/32—Specific management aspects for broadband networks
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L47/00—Traffic control in data switching networks
    • H04L47/10—Flow control; Congestion control
    • H04L47/24—Traffic characterised by specific attributes, e.g. priority or QoS
    • H04L47/2491—Mapping quality of service [QoS] requirements between different networks
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N21/00—Selective content distribution, e.g. interactive television or video on demand [VOD]
    • H04N21/40—Client devices specifically adapted for the reception of or interaction with content, e.g. set-top-box [STB]; Operations thereof
    • H04N21/45—Management operations performed by the client for facilitating the reception of or the interaction with the content or administrating data related to the end-user or to the client device itself, e.g. learning user preferences for recommending movies, resolving scheduling conflicts
    • H04N21/462—Content or additional data management, e.g. creating a master electronic program guide from data received from the Internet and a Head-end, controlling the complexity of a video stream by scaling the resolution or bit-rate based on the client capabilities
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N21/00—Selective content distribution, e.g. interactive television or video on demand [VOD]
    • H04N21/60—Network structure or processes for video distribution between server and client or between remote clients; Control signalling between clients, server and network components; Transmission of management data between server and client, e.g. sending from server to client commands for recording incoming content stream; Communication details between server and client 
    • H04N21/61—Network physical structure; Signal processing
    • H04N21/6106—Network physical structure; Signal processing specially adapted to the downstream path of the transmission network
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N21/00—Selective content distribution, e.g. interactive television or video on demand [VOD]
    • H04N21/80—Generation or processing of content or additional data by content creator independently of the distribution process; Content per se
    • H04N21/85—Assembly of content; Generation of multimedia applications
    • H04N21/854—Content authoring
    • H04N21/8549—Creating video summaries, e.g. movie trailer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L41/00—Arrangements for maintenance, administration or management of data switching networks, e.g. of packet switching networks
    • H04L41/50—Network service management, e.g. ensuring proper service fulfilment according to agreements
    • H04L41/5003—Managing SLA; Interaction between SLA and QoS
    • H04L41/5019—Ensuring fulfilment of SLA

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Accounting & Taxation (AREA)
  • Finance (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Development Economics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Strategic Management (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Business, Economics & Management (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Economics (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Marketing (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

Описаны модифицированные полипептиды, представляющие собой р40-субъединицу интерлейкина-12 (ИЛ-12). Модифицированные полипептиды содержат изменения в ИЛ-12р40 субъединице, удаляющие протеазный сайт между положениями Lys260 и Arg261. Модифицированные ИЛ-12р40 полипептиды согласно настоящему изобретению обладают улучшенной стабильностью по сравнению с полипептидами р40-субъединицы зрелого ИЛ-12 человека дикого типа.

Description

Изобретение в целом относится к белкам ИЛ-12р40, включая слитые белки, содержащие ИЛ-12р40, модифицированные с целью улучшения их стабильности. Более конкретно, белки ИЛ-12р40 согласно настоящему изобретению не содержат протеолитического сайта в области Буз260 и Атд261 в р40субъединице.
Предшествующий уровень техники
Интерлейкин-12 (ИЛ-12) - это провоспалительный цитокин, который синтезируется в ответ на инфекцию различными клетками иммунной системы, включая фагоцитарные клетки, В-клетки и активированные дендритные клетки (Со1ошЬо аиб ТгшсЫсп (2002), Су!окшс & Сго\\111 Рас!от Всу1стез. 13: 155168). ИЛ-12 играет важную роль в опосредовании взаимодействия врожденной и адаптивной ветвей иммунитета, действуя на Т-клетки и клетки-натуральные киллеры (НК), усиливая пролиферацию и активность цитотоксических лимфоцитов и продукцию других провоспалительных цитокинов, в частности интерферона-γ (ИФН-γ).
ИЛ-12 представляет собой гетеродимерную молекулу, состоящую из α-цепи (р35-субъединица, ИЛ12р35) и β-цепи (р40-субъединица, ИЛ-12р40), ковалентно связанных между собой дисульфидным мостиком с образованием биологически активного гетеродимера с молекулярной массой 74 кДа. Аминокислотные последовательности ИЛ-12р35 и ИЛ-12р40 зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека изображены на фиг. 1(8Ер ГО N0:1) и 2 (8Е0 ГО N0:2), соответственно.
Интерлейкин-23 (ИЛ-23) является связанной дисульфидным мостиком гетеродимерной молекулой, близко родственной ИЛ-12, которая содержит ту же β-цепь ИЛ-12р40, что и ИЛ-12, но уникальную α-цепь (р19-субъединицу, ИЛ-23р19) (Орртапп с! а1., (2000), 1штипйу, 13: 715-725). Так же, как и ИЛ12, ИЛ-23 продуцируется фагоцитарными клетками и активированными дендритными клетками, и считается, что он участвует в рекрутинге и активации ряда воспалительных клеток (Ьаидпзй с! а1., (2004) 1тшипо1. Есу., 202: 96-105). Аминокислотная последовательность ИЛ-23р19 зрелого ИЛ-23 человека изображена на фиг. 3 (8Е0 ГО N0:3).
Для того чтобы иммунные клетки секретировали биологически активные гетеродимеры ИЛ-12 или ИЛ-23, необходима одновременная экспрессия α- и β-субъединиц в одной клетке. Секреции иммунными клетками только ИЛ-12р35 или только ИЛ-23р19 не наблюдалось, поскольку клетки, продуцирующие биологически активные ИЛ-12 или ИЛ-23 гетеродимеры, секретируют р40-субъединицу в свободной форме в 10-100-кратном избытке по сравнению с гетеродимером (О'Апбтса с! а1. (1992), 1. Ехр. Мсб., 176: 1387-98, Орртапп с! а1., (2000), 1ттипйу, 13: 715-725). Кроме того, на мышах наблюдали, что, даже в отсутствие α-субъединицы, клетки могут продуцировать биологически активный гомодимер ИЛ-12р40 (Н1катеа с! а1. (2004), №иго8С1спсс, 129: 75-83).
Было показано, что наличие эндогенного ИЛ-12 необходимо для иммунологической устойчивости к широкому спектру патогенных микроорганизмов, а также к трансплантированным и химически индуцированным опухолям (Оа!с1су с! а1. (1998), Аппи. Есу. 1ттипо1., 16: 495-521). Было продемонстрировано, что ИЛ-12 обладает высокой противоопухолевой активностью, основанной на индукции ΙΡΝ-γ (интерферона-гамма) и активации эффекторных клеток, таких как СГО8+ Т-клетки и НК-клетки (Вгипба с! а1. (1993), 1. Ехр. Мсб., 178: 1223-30). Вследствие того, что была продемонстрирована противоопухолевая активность ИЛ-12, он был испытан в клинических исследованиях на людях в качестве иммунотерапевтического средства для лечения разнообразных видов рака (А1кшз с! а1. (1997), С1ш. Сапссг Есз., 3: 409-17; Оо11оЬ с! а1. (2000), С1ш. Сапссг Есз., 6: 1678-92; и Нипсаи с! а1. (2001), 6упссо1. Опсо1., 82: 7-10), включая рак почки, рак толстого кишечника, рак яичников, меланому и Т-клеточную лимфому, а также в качестве адъюванта для противораковых вакцин (Ьсс с! а1. (2001), 1. С1ш. Опсо1. 19. 3836-47).
В случае ИЛ-12 и ИЛ-23 продукция рекомбинантного белка в правильно сложенной и биологически активной, гетеродимерной, форме требует одновременной экспрессии α-субъединицы и ИЛ-12р40 в продуцирующей клеточной линии. Тем не менее, очищенный рекомбинантный белок обнаруживает некоторую гетерогенность, обусловленную протеолитическим расщеплением в С-терминальной области ИЛ12р40. Нестабильность белков ИЛ-12 или ИЛ-23 может вызвать проблемы с их продукцией и клиническим использованием в качестве терапевтического агента. Поэтому в данной области техники существует потребность в усовершенствованных вариантах рекомбинантных ИЛ-12 или ИЛ-23, которые обеспечивали бы гомогенный белок, более устойчивый к протеолитическому расщеплению.
Сущность изобретения
Изобретение обеспечивает р40-субъединицы ИЛ-12 человека (р40-варианты), которые обладают улучшенной стабильностью по сравнению с р40-белками ИЛ-12 дикого типа. У этих р40-вариантов Стерминальная область, которая в норме чувствительна к протеолитическому расщеплению, перестроена так, чтобы она стала более устойчивой к расщеплению протеазами. Более конкретно, р40-варианты согласно настоящему изобретению включают выполненные посредством генной инженерии изменения аминокислот в 03-домене, имеющие своей целью исключение образования потенциальных Т-клеточных эпитопов, которые могли бы сделать варианты белков иммуногенными и запустить реакции образования антител у людей. В результате этого р40-варианты согласно настоящему изобретению обладают улуч
- 1 015338 шенными свойствами в качестве терапевтических средств, по сравнению с белками ИЛ12-р40 дикого типа, с точки зрения их продукции, составления композиций и фармакокинетики.
Соответственно, в одном из аспектов изобретение обеспечивает вариант 03-домена ИЛ-12р40 человека (О3-вариант), в котором Ό3-вариант по меньшей мере на 85% идентичен Б3-домену ИЛ-12р40 человека дикого типа и содержит изменение аминокислоты в одном или более положениях, соответствующих остаткам 258-266 зрелого ИЛ-12р40 человека. Некоторые формы осуществления настоящего изобретения основаны, в частности, на знании того, что изменение (или изменения) аминокислот согласно настоящему изобретению обладают особым преимуществом, состоящим в удалении протеолитического сайта между Ьук260 и Агд261.
Согласно настоящему изобретению изменения аминокислот в одном или более положениях, соответствующих остаткам 258-266, могут быть делециями, заменами или вставками. Кроме того, для создания вариантов согласно настоящему изобретению могут быть использованы замены аминокислот, при которых основные аминокислоты могут быть заменены неосновными аминокислотами.
Более конкретно, Ό3-варианты согласно настоящему изобретению могут содержать замены одной или более аминокислот в положениях, выбранных из группы, состоящей из Ьук258, 8ет259, Ьук260, Агд261, Ьук263, Ьук264, Акр265 и Агд266. Такие изменения аминокислот могут быть использованы поодиночке или в комбинации для того, чтобы вызвать структурные и/или функциональные изменения, описанные выше. Например, 03-вариант может содержать одну, две, три, четыре или более из следующих замен: Ьук258С1п, 8ет259Акр, Ьук260А1а, Бу5260А5п. Ьу8260С1п, Ьук260С1у, Агд261А1а, Агд261Акр, Атд261Тйт, Ьук263С1у, Ьук2638ег и/или Ьук264С1у.
В некоторых формах осуществления настоящего изобретения замена производится в позиции Ьук260. При замене Ьук260 может быть заменен неосновной аминокислотой, например - А1а, Акп С1п или С1у. Другие замены, в дополнение к Ьук260, могут быть проведены в положениях 8ет259 и Агд261. В частности, некоторые Б3-варианты согласно настоящему изобретению содержат замены 8ет259Акр, Ьук260Акп и Атд261Тйт. В другой форме осуществления настоящего изобретения 03-варианты согласно настоящему изобретению содержат замены 8ет259Акр, Ьук260Акп, Атд261Тйт и Ьук264С1у, наряду с делециями Ьук263, Ьук264 и Акр265.
В других формах осуществления настоящего изобретения Б3-вариант, содержащий замену в положении Ьук260, альтернативно содержит другие замены в одном или более положениях, выбранных из Ьук258, 8ет259, Агд261, Ьук263 и Ьук264. Например, в одной из форм осуществления изобретения 03вариант содержит замены Ьук258С1п, 8ет259Акр, Ьук260С1п, Агд261 Акр, и, факультативно, Ьук2638ег и Ьук264С1у.
В следующих формах осуществления настоящего изобретения, кроме замен в положениях 8ет259, Ьук260 и Агд261, удалены один или более остатков, соответствующих Ьук263, Ьук264, Акр265 и Агд266, тогда как в еще одной форме осуществления настоящего изобретения один или более остатков в положениях Ьук263, Ьук264, Акр265 и Агд266 заменены на неосновную аминокислоту. В следующей форме осуществления настоящего изобретения в положении Ьук264 произведена замена Ьук264С1у и, возможно, удалены Ьук263 и Акр265. Другие 03-варианты согласно настоящему изобретению содержат замены 8ет259Акр, Ьук260Акп, Атд261Тйт и Ьук264С1у, и, возможно, делеции остатков, соответствующих Ьук263, Акр265 и Агд 266.
Специалистам в данной области техники будет очевидно, что р40-варианты и их активные участки, содержащие Б3-вариант, описанный в данной заявке, входят в объем изобретения. Сходным образом, белки ИЛ-12 и их активные участки, содержащие р40-вариант (варианты ИЛ-12), также входят в объем изобретения. Изобретение также охватывает слитые белки, содержащие варианты ИЛ-12 согласно настоящему изобретению и часть молекулы, выбранную из группы, состоящей из части антитела, цитокина, не являющегося ИЛ-12, или их активного участка.
Сходным образом, белки ИЛ-23 и их активные участки, содержащие р40-вариант (варианты ИЛ-23), также входят в объем изобретения. Изобретение также охватывает слитые белки, содержащие варианты ИЛ-23 согласно настоящему изобретению и часть молекулы, выбранную из группы, состоящей из части антитела, цитокина, не являющегося ИЛ-23, или их активного участка.
В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей любые О3-варианты, р40-варианты, варианты ИЛ-12 и варианты ИЛ-23 согласно настоящему изобретению. Изобретение также охватывает клетку, например прокариотическую клетку, содержащую такую нуклеиновую кислоту.
Изобретение также относится к способам получения таких 03-вариантов, р40-вариантов, вариантов ИЛ-12, вариантов ИЛ-23 и слитых белков, содержащих эти части молекул.
В следующем аспекте изобретение предусматривает способы использования вариантов согласно настоящему изобретению и нуклеиновых кислот, кодирующих эти варианты. Например, изобретение охватывает способ лечения пациента, который включает в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества р40-варианта согласно настоящему изобретению или его активного участка.
Вышеуказанные и другие признаки и преимущества изобретения, а также само изобретении, будут лучше понятны из приведенных ниже рисунков, описания изобретения и формулы изобретения.
В целом, изобретение относится к
- 2 015338 варианту 03-домена ИЛ-12р40, причем вариант по меньшей мере на 85% идентичен 03-домену ИЛ12р40 дикого типа и содержит изменение аминокислоты в одном или более положениях, соответствующих остаткам в положениях 258-266 исходного зрелого ИЛ-12р40 человека;
соответствующему варианту, в котором изменение удаляет протеазный сайт между Бу8260 и Агд261;
соответствующему варианту, в котором изменение является заменой или делецией;
соответствующему варианту, в котором изменение является заменой, выбранной из группы, состоящей из Бу8258, Бу8260, Бу8263 и Бу8264;
соответствующему варианту, в котором выбрана одна или более из следующих замен аминокислот Бу825861п, Бу8260А1а, Бу8260А8И, Бу826061п, Бу826061у, Бу826361у, Бу82638ег и Бу826461у;
соответствующему варианту, в котором замена произведена по меньшей мере в положении Бу8260;
соответствующему варианту, в котором замена заменяет основную кислоту на неосновную кислоту, выбранную из группы, состоящей из А1а, А8П, С1п или С1у;
соответствующему варианту, содержащему дополнительно одну или более замен в положениях 8ег259, Агд261 или Агд 266;
соответствующему варианту, в котором замены произведены в положениях 8ег259 и Агд261; соответствующему варианту, в котором произведены замены 8ег259А8р, Бу8260А8п и Агд261Тйг; соответствующему варианту, дополнительно содержащему замену Бу8264С1у.
соответствующему варианту, в котором дополнительно делетированы один или оба остатка Бу8263 и А8р265;
соответствующему варианту, в котором делетированы один или более остатков, соответствующих Бу8263, Бу8264, А8р 265 и Агд266;
соответствующему варианту, дополнительно содержащему одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из: Бу8263, Бу8264, А8р 265 и Агд266, причем соответствующий исходный остаток аминокислоты заменен на неосновную аминокислоту;
соответствующему варианту, дополнительно содержащему одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из: Бу8258, 8ег259, Агд261, Бу8263 и Бу8264;
соответствующему варианту, в котором замены произведены в положениях Бу8258С1п. 8ег259А8р, Бу826061п и Агд261А8р;
соответствующему варианту, дополнительно содержащему замены Бу82638ег и Бу8264С1у;
соответствующему варианту, специфически содержащему (1) следующие замены: 8ег259А8р, Бу8260А8п и Агд261Тйг, и (и) следующие делеции: Бу8263, Бу8264 и А8р265, где вышеуказанные положения относятся к немодифицированной молекуле дикого типа, за счет чего формируется последовательность Бу8 - А8р - А8п - Тйг - С1и - Агд в положениях 258-263 варианта;
соответствующему варианту, специфически содержащему (1) следующие замены: 8ег259А8р, Бу8260А8п, Агд261Тйг и Бу8264С1у и (и) следующие делеции:
Бу8263 и А8р265, где вышеуказанные положения относятся к немодифицированной молекуле дикого типа, за счет чего формируется последовательность: Бу8 - А8р - А8п - Тйг - С1и - С1у - Агд в положениях 258-264 варианта;
соответствующему варианту, содержащему следующие замены: Бу825861п, 8ег259А8р, Бу8260С1п, Агд261А8р, за счет чего формируется последовательность: С1п - А8р - С1п - А8р - С1и - Бу8 - Бу8 - Агд в положениях 258-265 варианта;
соответствующему варианту, содержащему следующие замены: Бу825861п, 8ег259А8р, Бу8260С1п, Агц261А8р, Бу82638ег, Бу8264О1у, за счет чего формируется последовательность: С1п - А8р - С1п - А8р С1и - 8ег- С1у - Агд в положениях 258-265 варианта;
белку ИЛ-12 или его фрагменту, содержащему вариант, описанный выше или ниже;
белку ИЛ-2З или его фрагменту, содержащему вариант, описанный выше или ниже;
слитому белку, содержащему вариант или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, описанный выше, и антитело или его активный участок;
соответствующему слитому белку, в котором вышеуказанный вариант или вышеуказанный белок соединены с С-концом вышеуказанного антитела или участка антитела, предпочтительно - с Ес-областью вышеуказанного антитела, причем вышеуказанное антитело нацелено на опухолевые антигены, такие как К8 (ЕрСат) или 14.18, или на рецепторы, которые гиперэкспрессированы на опухолевой ткани, такие как НЕК2, ЕСЕК или УЕСЕК.
нуклеиновой кислоте или молекуле ДНК, кодирующей вариант или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, или слитый белок, описанный выше или ниже;
вектору экспрессии, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту;
клетке-хозяину, продуцирующей вариант, или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, или слитый белок, описанный в данной работе;
фармацевтической композиции, подходящей для лечения болезней, запускаемых ИЛ-12 или ИЛ-23, и содержащей фармакологически эффективное количество варианта, белка ИЛ-12 или ИЛ-23, или слитого белка, содержащего такой вариант или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, возможно совместно с фармацевтиче
- 3 015338 ски приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, или с другими фармакологически эффективными лекарственными средствами в режиме комбинированной терапии;
использованию вышеуказанной фармацевтической композиции или ее эффективных компонентов для производства медикамента для лечения рака или аутоиммунного заболевания.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 изображает зрелую последовательность аминокислот α-цепи, то есть р35-субъединицы, зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека (8ЕО ΙΌ N0:1).
Фиг. 2 изображает зрелую последовательность аминокислот β-цепи, то есть р40-субъединицы, зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека (8Е0 ΙΌ N0:2). Домен ИЗ, соответствующий положениям 211-306 (8Е0 ΙΌ N0:26), выделен курсивом, а фрагмент пептида, соответствующий положениям 258-266, подчеркнут (8Е0 ΙΌ N0:5), а Ьук260 и Агд261 выделены полужирным шрифтом.
Фиг. 3 изображает зрелую последовательность аминокислот α-цепи, то есть р 19-субъединицы, зрелого (дикого типа) ИЛ-23 человека (8Е0 ΙΌ N0:3).
Фиг. 4 А изображает результаты 8И8-РАСЕ гель-электрофореза нескольких очищенных партий ИЛ12 человека, полученных в виде слитых белков с антителами (дорожки 1-8), тогда как фиг. 4В изображает результаты 8И8-РАСЕ гель-электрофореза нескольких очищенных партий ИЛ-23 человека, полученных в виде слитых белков с антителами (дорожки 1-3). Субъединицы ИЛ-12р35 апб ИЛ-23р19 ковалентно соединены с тяжелыми цепями антител. Полоса для молекулярной массы 6 кДа указана стрелкой. Молекулярные массы (в кДа) указаны для маркеров (дорожка М).
Фиг. 5 изображает последовательность аминокислот С-терминального фрагмента пептида зрелой (дикого типа) ИЛ-12р40 субъединицы человека. Фрагмент начинается с Агд261 (8Е0 ΙΌ N0:4).
Фиг. 6 изображает последовательность аминокислот пептидного фрагмента, соответствующего положениям 258-266 зрелой (дикого типа) ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:5).
Фиг. 7.1 и 7.2 изображает сравнение последовательности аминокислот ИЛ-12р40 субъединиц различных млекопитающих, включая человека, павиана (Рарю апиЫк), макаки-резус (Масаса ши1айа), мангабея (СегсосеЬик ЮгциаЮх). собаки (Сашк ГатШапк), кошки (ЕеНк са!ик), лошади (Едиик саЬа11ик), свиньи (8ик ксгоГа), коровы (Вок Таигик), козы (Сарга Ытсик), овцы (0νί§ апек), оленя (Сегуик е1арйик), водяного буйвола (ВиЬа1ик ЬиЬайк), хомяка (МекоспсеШк аитаФк), морской свинки (Сау1а рогсе11ик), хлопкового хомяка (8щшобоп ЫкрИик), крысы (РаИик потуедюик) и мыши (Мик тикси1ик). Две аминокислоты, отмеченные полужирным шрифтом, обозначают сайт протеолитического расщепления.
Фиг. 8 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У1 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:6). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута.
Фиг. 9 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У2 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:7). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута.
Фиг. 10 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У3 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:8). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута.
Фиг. 11 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У4 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:9). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута.
Фиг. 12 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У5 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:10). Изменение подчеркнуто.
Фиг. 13 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У6 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:11). Изменения подчеркнуты.
Фиг. 14 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У7 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:12). Изменение подчеркнуто.
Фиг. 15 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У8 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:13). Изменение подчеркнуто.
Фиг. 16 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У9 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:14). Изменение подчеркнуто.
Фиг. 17 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У10 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:15). Изменение подчеркнуто.
Фиг. 18 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе как р40У11 зрелой ИЛ-12р40 субъединицы человека (8Е0 ΙΌ N0:16). Изменения подчеркнуты.
Фиг. 19 изображает последовательность оснований нуклеиновой кислоты, кодирующей полномерную (дикого типа) ИЛ-12р40 субъединицу человека (8Е0 ΙΌ N0:21).
Фиг. 20 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как У1У2 и кодирующего участки р40-вариантов р40У1 и р40У2. У1У2фрагмент включает в себя Υ1 -фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую 8Е0 ΙΌ
- 4 015338
N0:17. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - У2-фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую 8Е0 ГО N0:18.
Фиг. 21 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как У3У4 и кодирующего участки р40-вариантов р40У3 и р40У4. У3У4фрагмент включает в себя У3-фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую 8Е0 ГО N0:19. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - У4-фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую 8Е0 ГО N0:20.
Фиг. 22 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как У5У6 и кодирующего участки р40-вариантов р40У5 и р40У6. У5У6фрагмент включает в себя У5-фрагмент, содержащий замену кодона (подчеркнута), кодирующую Агд261А1а. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - У6-фрагмент, содержащий замены кодонов (подчеркнуты), кодирующие Бу5260А1а и Агд261А1а.
Фиг. 23 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как У7У8 и кодирующего участки р40-вариантов р40У7 и р40У8. У7У8фрагмент включает в себя У7-фрагмент, содержащий замену кодона (подчеркнута), кодирующую Бу5260А1а. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - У8-фрагмент, содержащий замену кодонов (подчеркнута), кодирующую Еу5260О1у.
Фиг. 24 представляет результат вестерн-блоттинга с поликлональным антителом к р40 человека (аи11-йи-р40). Супернатанты клеток, трансфицированных 1Б-12р40 дикого типа и вариантами ИЛ-12р40 (У1-У4), были собраны и обработаны посредством δΌδ-РАОЕ гель-электрофореза. Было испытано по два независимых клона (а, Ь) каждого варианта ИЛ-12р40 - р40У1, р40У2, р40У3 и р40У4. Стрелки указывают на полосу расщепленного ИЛ-12р40, не имеющего С-терминального фрагмента (дорожка р40 \\1).
Фиг. 25 демонстрирует результаты δΌδ-РАОЕ гель-электрофореза слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12, которые содержат варианты р40: р40У1, р40У2, р40У3, р40У4, р40У5, р40У6, р40У7, р40У8 и р40 дикого типа (дорожки 1-9). Верхняя главная полоса относится к слитому белку, состоящему из тяжелой цепи антитела и р35-субъединицы, а нижняя главная полоса относится к легкой цепи антитела. Полоса для 6 кД не была обнаружена ни в одной дорожке, связанной с вариантами белков, кроме дорожки 5. Молекулярные массы (кД) указаны для маркеров (дорожка М).
Фиг. 26 изображает данные относительно фармакокинетики слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12 и содержащих варианты р40, а именно - р40У1-р40У8, в сравнении со слитыми белками, содержащими антитело и ИЛ-12 (дикого типа), при внутривенном введении.
Фиг. 27А изображает данные относительно фармакокинетики слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12 и содержащих варианты р40, а именно - р40У1-р40У4, в сравнении со слитыми белками, содержащими антитело и ИЛ-12 (дикого типа) (панель А), а Фиг. 27В изображает данные относительно фармакокинетики слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12 и содержащих варианты р40, а именно - р40У5-р40У8, в сравнении со слитыми белками, содержащими антитело и ИЛ-12 (дикого типа) (панель В), при подкожном введении.
Фиг. 28 изображает вариант ИЛ-12р40, содержащий мутации за пределами 03-области белка.
Подробное описание изобретения
Изобретение описывает варианты р40-субъединицы цитокина-интерлейкина-12 (ИЛ-12), которые обладают улучшенной стабильностью по сравнению с белком дикого типа. В этих вариантах область р40-субъединицы, которая в норме не структурирована и чувствительна к протеолитическому расщеплению, мутирована для придания ей большей устойчивости к протеолитическому расщеплению. Эта область, находящаяся в домене 03, расположена вблизи С-конца р40-субъединцы и содержит полипептидный участок, соответствующий аминокислотам 258-260 в зрелой р40-субъединице человека (р40(258260)).
ИЛ-12р40 субъединица также является субъединицей, входящей в состав цитокина интерлейкина23 (ИЛ-23). ИЛ-23 состоит из двух субъединиц - α-субъединицы р19 и β -субъединицы р40. р40субъединица ИЛ-23 - такая же, как ИЛ-12р40. Поэтому варианты ИЛ-12р40 субъединицы также являются вариантами ИЛ-23р40 субъединицы.
В одном из общих классов форм осуществления изобретения в области р40, соответствующей аминокислотным остаткам 258-266, производят одну или более мутаций с целью устранения сайта расщепления, который в субъединице р40 человека соответствует сайту между Бу5260 и Агд261. В других формах осуществления настоящего изобретения в этой области осуществляют специфические мутации, которые при моделировании обеспечивают более плотную складчатую структуру. В другом аспекте изобретения осуществляют такие мутации, которые, по предварительным прогнозам, исключают появление иммуногенности у измененной посредством генной инженерии области р40-субъединицы. Например, замены аминокислот в измененной посредством генной инженерии области р40-субъединицы выбирают так, чтобы избежать образования пептидов, которые могут быть распознаны как потенциальные эпитопы для Т-клеток человека.
Мутации могут быть выполнены в области р40-субъединицы, соответствующей аминокислотным остаткам 258-266, с использованием различных механизмов. Например, в одной из форм осуществления
- 5 015338 настоящего изобретения мутацию или мутации осуществляют посредством замены одного аминокислотного остатка на другой. В другой форме осуществления настоящего изобретения мутацию или мутации осуществляют посредством делеции одного или более остатков в р40-субъединице. В следующей форме осуществления настоящего изобретения мутацию или мутации осуществляют посредством вставки одного или более аминокислотных остатков в р40-субъединицу.
В одной из форм осуществления настоящего изобретения варианты р40-субъединицы согласно настоящему изобретению содержатся в белковых композициях, таких как белки ИЛ-12, слитые белки, содержащие ИЛ-12, белки ИЛ-23, слитые белки, содержащие ИЛ-23 или гомодимеры р40-субъединицы. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения белок ИЛ-12 содержит р35субъединицу и вариант р40-субъединицы согласно настоящему изобретению. В другой форме осуществления настоящего изобретения белок ИЛ-23 содержит р 19-субъединицу и вариант р40-субъединицы согласно настоящему изобретению. В следующей форме осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит участок антитела, соединенный с ИЛ-12, содержащим вариант ИЛ-12р40. В следующей форме осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит участок антитела, соединенный с ИЛ-23, содержащим вариант ИЛ-12р40. В следующей форме осуществления настоящего изобретения часть слитого белка, представляющая собой антитело, является интактным антителом, Ес-фрагментом, зс-Εν, антигенсвязывающим участком антитела или активным фрагментом антитела. В следующей форме осуществления настоящего изобретения слитый белок согласно настоящему изобретении содержит вариант ИЛ-12р40, соединенный с цитокином, не являющимся ИЛ-12 или ИЛ-23, или с его активным участком.
В следующем аспекте настоящего изобретения белковые композиции, которые содержат один из вариантов р40-субъединицы согласно настоящему изобретению, обладают более длительным периодом полувыведения из кровотока, чем соответствующий белок дикого типа. Так, по сравнению с белками ИЛ-12 или ИЛ-23, содержащими р40-субъединицу дикого типа, варианты ИЛ-12 или варианты ИЛ-23, которые содержат измененную посредством генной инженерии р40-субъединицу согласно настоящему изобретению, обладают улучшенными свойствами в качестве терапевтических агентов, относящимися к их продукции, составлению рецептур и фармакокинетике.
В следующей форме осуществления настоящего изобретения мутации аминокислотной последовательности ИЛ-12р40 осуществляют за пределами ИЛ-12р40(258-260) области и, возможно, за пределами 03-домена ИЛ-12р40. Такие мутации могут быть осуществлены в других местах 03-домена ИЛ-12р40 или могут быть осуществлены в других доменах. Например, фиг. 28 изображает последовательность р40субъединицы ИЛ-12, которая содержит изменения в последовательности аминокислот за пределами остатков 258-266. В работе Ьеоид е! а1., (2003), Ргос. ЫаИ Асаб. 8с1 И8А, 100:1163-1168, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки, указаны различные остатки, которые могут быть мутированы в последовательности аминокислот ИЛ-12р40 за пределами области 258-266. Кроме того, поскольку известна трехмерная кристаллическая структура ИЛ-12р40 (работа Υοοη е! а1., (2000), ЕМВО 1., 19:3530-3541, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки), специалист в данной области техники может выбрать другие мутации, которые не будут нарушать функциональность р40субъединицы.
Определение продукта расщепления
Изобретение отчасти основано на наблюдении, состоящем в том, что ИЛ-12р40 субъединица чувствительна к специфическому протеолитическому расщеплению, и на новых результатах экспериментов, в ходе которых был определен сайт расщепления. Было обнаружено, что очищенный рекомбинантный белок ИЛ-12, продуцируемый N8/0 клетками, как описано в примере 2, устойчиво обнаруживает определенный уровень гетерогенности при разделении рекомбинантного белка посредством электрофореза на 8О8-РАСЕ геле в восстановительных условиях, отчетливо видимый в виде дополнительной полосы белка с молекулярной массой около 6 кД. Сходное наблюдение было сделано в случае рекомбинантного белка ИЛ-23. Это проиллюстрировано на фиг. 4, которая демонстрирует результаты 8О8-РАСЕ гельэлектрофореза нескольких очищенных партий белковых композиций, содержащих ИЛ-12 человека (панель А) и ИЛ-23 человека (панель В) и полученных в виде слитых белков, содержащих антитело.
Загрязнитель был очищен; была определена последовательность его аминокислот, как описано в примере 3, и было обнаружено, что она соответствует последовательности С-терминального фрагмента ИЛ-12р40 субъединицы, состоящего из 46 аминокислот и полученного посредством протеолитического расщепления между Ьу8260 и Атд261 (фиг. 5-8ЕС ГО N0:4). Расщепление между Ьу8260 и Атд261, повидимому, является приоритетным, несмотря на преобладание основных аминокислот в области, окружающей сайт расщепления (...К8ККЕККОК... (фиг. 6 - 8ЕС ГО N0:5), где Ьу8260 и Атд261 обозначены полужирным шрифтом). Тем не менее, С-терминальный фрагмент пептида, несмотря на то, что он отщеплен от р40-субъединицы, остается нековалентно связанным с остатком р40-субъединицы, что затрудняет устранение остаточной гетерогенности посредством дополнительной очистки рекомбинантного белка.
Белок 1Б-12Р40
Зрелая р40-субъединица человека представляет собой белок, состоящий из 306 аминокислот, напоминающий растворимый цитокиновый α-рецептор класса I, который состоит из доменов О1, 02 и 03.
- 6 015338
Сайт расщепления (между Ьуз260 и Лгд261) расположен в домене Ό3 - фибронектиновом домене типа III, состоящем из 96 аминокислот, занимающих область от 1211 до 8306. Последовательность р40субъединицы зрелого ИЛ-12 человека изображена на фиг. 2. Последовательность аминокислот в домене Ό3 изображена на фиг. 2 курсивом. В опубликованной структуре гетеродимера ИЛ-12 человека, установленной посредством рентгенокристаллографического анализа (Υοοη с1 а1. (2000), ΕΜΒΟ I., 19: 3530-41), часть петли в области р40(258-26б) Л3-домена человека не разрешена. Не желая быть связанными теорией, отметим все же, что неразрешенные области в кристаллических структурах часто являются признаком гибких, неструктурированных петель и могут быть целевыми сайтами для протеолиза.
Сопоставление первичной структуры зрелой р40-субъединицы различных видов млекопитающих приведено на фиг. 7.1 и 7.2, в том числе - человека, приматов - павиана, макаки-резус и мангабея, собаки, кошки, лошади, свиньи, жвачных животных - коровы, козы, овцы, оленя, водяного буйвола, грызунов хомяка, морской свинки, хлопкового хомяка, крысы и мыши. При сопоставлении область вокруг р40(258-266) обнаруживает вариабельность последовательности, особенно в отношении ее длины. Более конкретно, у некоторых видов, а именно жвачных животных, последовательность короче, а у других видов, например - у грызунов, последовательность в некоторых случаях может содержать дополнительную вставку. У многих видов дипептидный мотив, соответствующий К260К261 р40 человека консервирован, либо являясь идентичным, либо обнаруживая две основные аминокислоты. Эти виды включают в себя важные сельскохозяйственные и коммерческие виды, в том числе (но не ограничиваясь этим) - лошадь, корову, козу, свинью и овцу. Соответственно, внедрение одной или более мутаций в область ИЛ-12р40 животных, соответствующую остаткам 258-266 ИЛ-12р40 человека, причем аналогичных мутациям, предложенным в данной работе для ИЛ-12р40 человека, может оказаться полезным для снижения или устранения протеолитического расщепления ИЛ-12р40 животных по сайту расщепления К260К261.
В принципе, согласно настоящему изобретению можно использовать вариант ИЛ-12р40 от тех видов, у которых отсутствует положительно заряженный дипептидный мотив, соответствующий мотиву К260К.261 р40-субъединицы ИЛ-12 человека, для человека или другого гетерологичного организма. Однако важно указать, что при практическом осуществлении настоящего изобретения формы ИЛ-12р40, происходящие не от человека, при введении их человеку обычно приводят к образованию антител к р40субъединице. Если рассмотреть вопрос шире, то не оптимально вводить р40-субъединицу одного вида другому виду. Кроме того, вероятность протеолитического расщепления различных р40-субъединиц, происходящих не от человека, мало изучена. Кроме того, р40-субъединицы одних видов могут не функционировать в других видах, либо на стадии сборки с такими субъединицами, как р35 или р19, либо на стадии взаимодействия с субъединицами рецепторов.
Варианты белков ИЛ-12р40
Изобретение предусматривает варианты ИЛ-12р40 белков с мутациями в Ό3-домене, улучшающими стабильность. При использовании в контексте настоящего изобретения термин Л3-вариант относится к Л3-домену р40-субъединицы, например - субъединицы ИЛ-12 или ИЛ-23 человека, содержащему одно или более изменений аминокислот, по сравнению с Л3-доменом дикого типа. Термин вариант р40субъединицы используется в данной работе для обозначения р40-субъединицы, например - ИЛ-12 или ИЛ-23 человека, с мутациями в Л3-домене, то есть к р40-субъединице, содержащей вариант Ό3. Термин вариант ИЛ-12 используется в данной работе для обозначения белка ИЛ-12 человека, содержащего вариант р40-субъединицы. Термин вариант ИЛ-23 используется в данной работе для обозначения белка ИЛ-23 человека, содержащего вариант р40-субъединицы.
Согласно одной из форм осуществления настоящего изобретения Ό3-домен варианта р40субъединицы обладает по меньшей мере 70%-ной идентичностью последовательности Ό3 -домену ИЛ12р40 дикого типа. В другой форме осуществления настоящего изобретения Л3-домен варианта р40субъединицы обладает по меньшей мере 75%-ной или большей идентичностью последовательности Ό3домену ИЛ-12р40 дикого типа. В следующей форме осуществления изобретения Л3-домен р40-варианта обладает по меньшей мере 80%-ной или большей идентичностью последовательности Ό3-домену ИЛ12р40 дикого типа, тогда как в других формах осуществления настоящего изобретения Л3-домен р40варианта обладает по меньшей мере 81%-ной или большей, или по меньшей мере 82%-ной или большей, или по меньшей мере 83%-ной или большей, или по меньшей мере 84%-ной или большей, или по меньшей мере 85%-ной или большей, или по меньшей мере 86%-ной или большей, или по меньшей мере 87%-ной или большей, или по меньшей мере 88%-ной или большей, или по меньшей мере 89%-ной или большей, или по меньшей мере 90%-ной или большей, или по меньшей мере 91%-ной или большей, или по меньшей мере 92%-ной или большей, или по меньшей мере 93%-ной или большей, или по меньшей мере 94%-ной или большей, или по меньшей мере 95%-ной или большей, или по меньшей мере 96%-ной или большей, или по меньшей мере 97%-ной или большей, или по меньшей мере 98%-ной или большей, или по меньшей мере 99%-ной или большей идентичностью последовательности Л3-домену ИЛ-12р40 дикого типа.
Согласно следующей форме осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот р40-варианта обладает по меньшей мере 70%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р40-субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа. В следующей форме осуществления изо
- 7 015338 бретения последовательность аминокислот р40-варианта обладает по меньшей мере 75%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р40-субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа. В следующей форме осуществления изобретения последовательность аминокислот р40-варианта обладает по меньшей мере 80%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р40субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа, тогда как в других формах осуществления изобретения последовательность аминокислот р40-варианта обладает по меньшей мере 81%-ной или большей, или по меньшей мере 82%-ной или большей, или по меньшей мере 83%-ной или большей, или по меньшей мере 84%-ной или большей, или по меньшей мере 85%-ной или большей, или по меньшей мере 86%-ной или большей, или по меньшей мере 87%-ной или большей, или по меньшей мере 88%-ной или большей, или по меньшей мере 89%-ной или большей, или по меньшей мере 90%-ной или большей, или по меньшей мере 91%-ной или большей, или по меньшей мере 92%-ной или большей, или по меньшей мере 93%-ной или большей, или по меньшей мере 94%-ной или большей, или по меньшей мере 95%-ной или большей, или по меньшей мере 96%-ной или большей, или по меньшей мере 97%-ной или большей, или по меньшей мере 98%-ной или большей, или по меньшей мере 99%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р40-субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа
Для определения процента идентичности двух последовательностей аминокислот эти последовательности выравнивают для обеспечения оптимального сравнения (например, в первую последовательность аминокислот можно ввести разрывы для оптимального выравнивания со второй последовательностью аминокислот). Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положения, общих для обеих последовательностей (то есть, % идентичности = (Ν идентичных положений/Ν положений) умножить на 100). Если сравниваемые последовательности имеют неодинаковую длину, то для определения общего числа положений используется более короткая последовательность. Определение процента идентичности двух последовательностей также может быть выполнено с использованием математического алгоритма.
Не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Карлина и Альтшуля (1990), Ргос. №111. Асаб. Бс1. ИБА, 87:226468, модифицированный в работе Катйи апб А11ксйи1, (1993) Ргос. №111. Асаб. Бс1. ИБА, 90:5873-77. Этот алгоритм использован в программах №ВЬАБТ и ХВЬАБТ, опубликованных в работе А11ксйи1 е1 а1., (1990) 1. Мо1. Вю1., 215:403-10.
Поиск гомологичных нуклеотидов (ВЬАБТ-нуклеотидов) может быть выполнен с помощью программы №ВЬАБТ, оценка = 100, длина слова = 12. Поиск гомологичных белков (ВЬАБТ-белков) может быть выполнен с помощью программы ХВЬАБТ, оценка = 50, длина слова = 3. Для того чтобы получить выравнивания с разрывами для целей сравнения, можно использовать программу Оарреб ВЬАБТ, как описано в работе А11кс1ш1 е1 а1., (1997) №ис1ею Ас1бк Кекеатсй, 25(17):3389-3402. При использовании программ ВЬАБТ и Оарреб ВЬАБТ можно использовать значения параметров по умолчанию соответствующих программ (например, ХВЬАБТ и №ВЬАБТ).
В одной из форм осуществления настоящего изобретения изобретение предусматривает Ό3варианты, содержащие изменение, которое удаляет сайт протеолитического расщепления между Ьук260 и Агд261. В одной из форм осуществления настоящего изобретения осуществляется мутация аминокислоты в положении Ьук260. В более специфической форме осуществления настоящего изобретения Ьук260 заменяют неосновной аминокислотой. Неосновными аминокислотами являются, например, А1а, Акп, Акр, Сук, О1и, О1п, О1у, Не, Ьеи, Ме1, Р1е, Рго, Бет, Т1г, Тгр, Туг или Уа1. Например, Ьук 260 заменяют на А1а, Акп, Акр, Сук, О1и, О1п, О1у, 11е, Ьеи, Ме1, Р1е, Рго, Бет, Т1г, Тгр, Туг или Уа1. В альтернативной форме осуществления настоящего изобретения Ьук260 заменяют на селеноцистеин. Примеры Ό3вариантов, в которых Ьук260 был заменен на другую аминокислоту, приведены на фиг. 12, 13, 14, 15, 16 и 18.
В другой форме осуществления настоящего изобретения осуществляют мутацию Агд261. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Агд261 заменяют неосновной аминокислотой. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Агд261 заменяют на А1а, Акп, Акр, Сук, О1и, О1п, О1у, 11е, Ьеи, Ме1, Р1е, Рго, Бег, Т1г, Тгр, Туг или Уа1. В альтернативной форме осуществления настоящего изобретения Агд261 заменяют на селеноцистеин. Примеры 03-вариантов, в которых Агд261 был заменен на другую аминокислоту, приведены на фиг. 12, 13, 17 и 18. В другой форме осуществления настоящего изобретения осуществляют мутацию Ьук260 и Агд261. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Ьук260 заменяют на О1п, А1а, Акп или О1у, а Атд261 заменяют на А1а, Акр или Т1г. Примеры Ό3-вариантов, в которых и Ьук260, и Атд261 заменены на другие аминокислоты, изображены на фиг. 13 и 18.
Кроме того, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Ьук260 и Агд261 удаляют, тогда как в другой форме осуществления настоящего изобретения между Ьук260 и Агд261 вставляют аминокислоту.
В следующей форме осуществления настоящего изобретения получен 03-вариант, в котором одна или более аминокислот из Ьук258, Бег259, Ьук260, Атд261, Ьук263, Ьук264 или Атд266 заменены на другие аминокислоты. В одной из форм осуществления настоящего изобретения одна или более аминокис
- 8 015338 лот из Ьук258. 8ет259. Ьук260. Атд261. Ьук263. Ьук264 или Атд266 заменены на неосновные аминокислоты. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Ьук258 заменяют на С1п. В другой форме осуществления настоящего изобретения 8ег259 заменяют на Акр. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Ьук260 заменяют на А1а, С1у. Акп или С1п. В еще одной форме осуществления настоящего изобретения Агд261 заменяют на А1а, Т11Г или Акр. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Ьук263 заменяют на 8ет. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Ьук264 заменяют на С1у. В одной из форм осуществления настоящего изобретения Агд266 заменяют на С1п. Акр. Акп или Т11Г. В следующей форме осуществления настоящего изобретения каждую из аминокислот Ьук263 и Ьук264 заменяют на другую аминокислоту. Например. в одной из форм осуществления настоящего изобретения Ьук263 и Ьук264 заменены на 8ет и С1у. соответственно. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Ьук258. 8ет259. Ьук260. Атд261. Ьук263 и Ьук264 заменены на О1п. Акр. С1п. Акр. 8ет и О1у. соответственно.
В следующей форме осуществления настоящего изобретения получен 03-вариант. в котором одна или более из аминокислот 8ет259. Ьук260 и Агд261 заменены другими аминокислотами. В следующей форме осуществления настоящего изобретения одна или более из аминокислот 8ет259. Ьук260 и Агд261 заменены неосновными аминокислотами. Например. в одной из форм осуществления настоящего изобретения 8ет259. Ьук260 и Атд261 заменены на Акр. Акп и ТНг. соответственно.
В другой форме осуществления настоящего изобретения каждая из аминокислот Ьук258. 8ет259. Ьук260 и Агд261 заменена на другую аминокислоту. Например. в одной из форм осуществления настоящего изобретения каждая из аминокислот Ьук258. 8ет259. Ьук260 и Агд261 заменена на неосновную аминокислоту. В одной из форм осуществления настоящего изобретения Ьук258. 8ет259. Ьук260 и Атд261 заменены на С1п. Акр. С1п и Акр. соответственно. В следующей форме осуществления настоящего изобретения 8ет259. Ьук260. Атд261 и Ьук264 заменены на Акр. Акп. ТНг и О1у. соответственно. В еще одной форме осуществления настоящего изобретения 8ет259. Ьук260. Атд261 и Ьук264 заменены на Акр. Акп. ТНг и С1у. соответственно. тогда как Ьук263 и Акр265 удалены. В следующей форме осуществления настоящего изобретения 8ет259. Ьук260 и Атд261 заменены на Акр. Акп и ТНг. соответственно. тогда как Ьук263. Ьук264 и Акр265 удалены.
Не желая быть связанными теорией. все же отметим. что считается. что делеции оказывают эффект. состоящий в снижении конформационной гибкости области р40(258-266). за счет чего снижается способность мотива Ьук260-Агд261 принимать конформацию. обеспечивающую расщепление соответствующей протеазой. Поэтому в одной из форм осуществления настоящего изобретения делетируют одну или более из аминокислот Ьук258. 8ет259. Ьук260. Атд261. Ьук263. Ьук264. Акр265 или Атд266.
В следующей форме осуществления настоящего изобретения получен 03-вариант. в котором делетированы одна или более из аминокислот Ьук263. Ьук264. Акр265 или Агд266. Например. в одной из форм осуществления настоящего изобретения делетированы Ьук263 и Акр265. тогда как в другой форме осуществления настоящего изобретения делетированы Ьук263. Ьук264 и Акр265. В следующей форме осуществления делетированы Ьук263. Ьук264 и Акр265 или заменены на одну или более неосновных аминокислот. В следующей форме осуществления изобретения делетированы Ьук263. Ьук264. Акр265 и Агд266. В следующей форме осуществления настоящего изобретения делетированы одна или более из аминокислот Ьук263. Ьук264. Акр265 или Агд266. тогда как одна или более из аминокислот 8ет259. Ьук260 или Агд261 заменены другими аминокислотами. Например. в одной из форм осуществления настоящего изобретения 8ет259. Ьук260 и Атд261 заменены на Акр. Акп и ТНг. соответственно. тогда как Ьук263. Ьук264 и Акр265 делетированы. В следующей форме осуществления настоящего изобретения 8ет259. Ьук260 и Атд261 заменены на Акр. Акп и ТНг. соответственно. тогда как Ьук263. Ьук264. Акр265 и Агд266 делетированы.
В других формах осуществления настоящего изобретения замены аминокислот выбраны так. что они исключают образование новых Т-клеточных эпитопов. Способы анализа пептидных последовательностей на их способность создавать Т-клеточные эпитопы хорошо известны в данной области техники (см.. например. публикацию заявки на патент США Νο. 2003/0153043; Международную публикацию Νο. \νϋ 00/034317; и 81итшо1о е! а1. (1999). №1Шге Вю1еей.. 17: 555-61). В одной из форм осуществления настоящего изобретения последовательность ИЛ-12р40(258-266) человека была заменена последовательностью ΚΟΝΓΕΚ. (8ЕО ΙΟ N0:17). Другими словами. 8ет259. Ьук260 и Атд261 были заменены на Акр. Акп и ТНг. соответственно. тогда как Ьук263. Ьук264 и Акр265 были делетированы. так что результирующая последовательность остатков 258-263 в варианте имеет вид ΚΟΝΙΈΚ.. Результирующий ИЛ-12р40 вариант изображен на фиг. 8.
В другой форме осуществления настоящего изобретения последовательность ИЛ-12р40(258-266) человека была заменена на последовательность ΚΟΝΈΕΟΚ (8ЕО ГО N0:18). Другими словами. 8ет259. Ьук260 и Атд261 были заменены на Акр. Акп и ТЕ г. соответственно. тогда как Ьук263. Ьук264 и Акр265 были делетированы и заменены только остатком О1у. так что результирующая последовательность остатков 258-264 в данном варианте имеет вид ΚΟΝΊΈΟΚ.. ΚΟΝΓΕΚ.. Результирующий ИЛ-12р40 вариант изображен на фиг. 9.
В еще одной форме осуществления изобретения последовательность ИЛ-12р40(258-266) человека
- 9 015338 была заменена на последовательность рорОЕККОЕ (8ЕР ГО N0:19). Другими словами, Ьуз258, 8сг259, Ьуз260 и Агд261 были заменены на С1п, Азр, С1п и Азр, соответственно, так что результирующая последовательность остатков 258-266 в данном варианте имеет вид рорОЕККОЕ. Результирующий ИЛ12р40 вариант изображен на фиг. 10.
В следующей форме осуществления изобретения последовательность ИЛ-12р40(258-266) человека была заменена на последовательность рэрОЕЗСЭЕ (8ЕР ГО N0:20). Другими словами, Ьуз258, 8сг259, Ьуз260, Агд261, Ьуз263 и Ьуз264 были заменены на Р1п, Азр, Р1п, Азр, 8сг и Р1у, соответственно, так что результирующая последовательность остатков 258-266 в данном варианте имеет вид рэрОЕЗСЭЕ. Результирующий ИЛ-12р40 вариант изображен на фиг. 11.
В следующей форме осуществления изобретения 03-вариант находится в пределах ИЛ-12р40 субъединицы или ее активного участка. Под активным участком подразумевается то, что ИЛ-12р40 субъединица, содержащая О3-вариант, обладает по меньшей мере 10%-ной активностью в одной из форм осуществления изобретения, по меньшей мере 20%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 30%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 50%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 70%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 75%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 80%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 90%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 95%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 99%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 100%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 150%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 200%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 300%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 400%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 500%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, или, по меньшей мере 1000%ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по сравнению с биологической активностью ИЛ-12р40 субъединицы дикого типа.
Белки, содержащие варианты ИЛ-12р40
Варианты ИЛ-12р40 могут быть включены в белковые композиции вместо ИЛ-12р40 дикого типа. Примерами биологически активных белковых композиций, включающих ИЛ-12р40, являются гомодимеры р40, ИЛ-12 и слитые белки, содержащие ИЛ-12, и ИЛ-23 и слитые белки, содержащие ИЛ-23. В одном из аспектов настоящего изобретения гетеродимер, состоящий из ИЛ-12р35/варианта р40, состоит из раздельных полипептидных цепей. Альтернативно, гетеродимер, состоящий из ИЛ-12р35/варианта р40, может состоять из одной полипептидной цепи. В другом аспекте настоящего изобретения гетеродимер, состоящий из ИЛ-23р19/варианта р40, состоит из раздельных полипептидных цепей. Альтернативно, гетеродимер, состоящий из ИЛ-23р19/варианта р40, может состоять из одной полипептидной цепи.
В другом аспекте настоящего изобретения, будучи частью слитого белка на основе ИЛ-12, партнер ИЛ-12 по слиянию может быть молекулой антитела или частью молекулы антитела. Применимыми молекулами антител являются такие молекулы, которые доставляют слитый белок на основе ИЛ-12 в опухолевую среду, например - к самим опухолевым клеткам, или к некротическому ядру опухоли или к опорной строме. В другой форме осуществления настоящего изобретения партнером по слиянию является другой цитокин. Применимыми цитокинами являются, но не ограничиваются ими, ИЛ-2, ИЛ-7 и ИЛ15.
В следующем аспекте настоящего изобретения, будучи частью слитого белка на основе ИЛ-23, партнер ИЛ-23 по слиянию может быть молекулой антитела или частью молекулы антитела. Применимыми молекулами антител являются такие молекулы, которые доставляют слитый белок на основе ИЛ23 в опухолевую среду, например - к самим опухолевым клеткам, или к некротическому ядру опухоли или к опорной строме. В другой форме осуществления настоящего изобретения партнером по слиянию является другой цитокин. Применимыми цитокинами являются, но не ограничиваются ими, ИЛ-2, ИЛ-7 и ИЛ-15.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты р40-субъединицы
В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, содержащие варианты р40-субъединицы. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты р40-субъединицы согласно настоящему изобретению, можно сконструировать, например, с использованием способов инженерии ДНК, известных специалистам в данной области техники. Примеры процедур можно найти в примере 1.
Фиг. 19 изображает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую р40-субъединицу зрелого ИЛ-12 человека. Фиг. 20-22 изображают синтетические нуклеотидные фрагменты, кодирующие типичные мутации, обнаруживаемые в вариантах р40-субъединицы согласно настоящему изобретению.
Способы лечения с использованием вариантов р40-субъединицы
Варианты р40-субъединицы, включая слитые белки и белки ИЛ-12 или ИЛ-23, содержащие вариант р40-субъединицы согласно настоящему изобретению, можно использовать в качестве иммунотерапеви
- 10 015338 ческих средств, например, для лечения широкого спектра раковых заболеваний, на основании продемонстрированной противоопухолевой активности белков ИЛ-12. Например, варианты р40-субъединицы согласно настоящему изобретению можно использовать, предпочтительно - в виде гетеродимера с р35субъединицей, для лечения раковых заболеваний, в том числе (но не ограничиваясь этим) рака почек, рака толстого кишечника, рака яичников, меланомы и Т-клеточной лимфомы, а также в качестве адъюванта для противораковых вакцин. Варианты р40-субъединицы можно также использовать в качестве части р40/р40-гомодимера для снижения ТН 1 реакции (например, ТН 1 реакции, связанной с аутоиммунным заболеванием).
Введение
Варианты ИЛ-12, варианты ИЛ-23 и варианты р40-субъъединицы согласно настоящему изобретению можно включить в состав фармацевтической композиции, пригодной для введения. Такие композиции обычно содержат вариант ИЛ-12 или слитый белок, содержащий вариант ИЛ-12, и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в контексте настоящего изобретения термин фармацевтически приемлемый носитель охватывает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению составляют так, чтобы она была совместимой с предполагаемым путем введения. Примерами путей введения являются парентеральное, например - внутривенное, интрадермальное, подкожное, оральное (например - посредством ингаляции), трансдермальное (местное), трансмукозальное и ректальное введение Растворы или суспензии, используемые для парентерального, интрадермального или подкожного введения, могут включать в себя следующие компоненты стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или натрия бисульфит, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетатный, цитратный или фосфатный буферы, и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно отрегулировать с использованием кислот или оснований, таких как хлористо-водородная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы, содержащие несколько доз, изготовленные из стекла или пластика.
Медикаменты, содержащие варианты ИЛ-12, варианты ИЛ-23 или варианты р40-субъединицы согласно настоящему изобретению, могут иметь концентрацию от 0,01 до менее чем 100% (вес./вес.), причем концентрация варьирует в зависимости от лекарственной формы медикаментов.
Вводимая доза зависит от массы тела пациентов, степени тяжести заболевания, конкретного типа используемого варианта ИЛ-12р40 и мнения врача. Например, для варианта ИЛ-12 согласно настоящему изобретению обычно рекомендуется вводить от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг массы тела в день, от примерно 0,02 до примерно 2 мг/кг/день в случае инъекции, или примерно 0,5 мг/кг/день. Дозу можно вводить один или более раз в день в зависимости от тяжести заболевания и мнения врача. Для слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-12, или слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-23, которые содержат вариант ИЛ-12р40 согласно настоящему изобретению, обычно рекомендуется вводить от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг массы тела в день, от примерно 0,002 до примерно 0,5 мг/кг/день в случае инъекции, или примерно 0,1 мг/кг/день. Дозу можно вводить один или два раза за 2-, 3- или 4недельный период, в зависимости от природы и тяжести заболевания и мнения врача.
Различные аспекты настоящего изобретения далее будут проиллюстрированы приведенными ниже примерами.
Описание примеров осуществления изобретения
Пример 1. Клонирование вариантов р40-субъединиц ИЛ-12 человека.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты р40-субъединицы согласно настоящему изобретению, более конкретно - варианты от р40У1 до р40У8 (8ЕО ΙΌ N08:6-13), были сконструированы с использованием стандартных способов получения рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области техники. По существу, ДНК-кассета, кодирующая фрагмент, включающий в себя область, содержащую мутированные остатки аминокислот, и ограниченный стандартными сайтами рестрикции, была синтезирована бе ηονο (В1ие Негоп Вю1есбпо1оду, Во(Пс11, АА). и ею был заменен соответствующий фрагмент последовательности дикого типа, содержащийся в экспрессирующей плазмиде, несущей р40последовательность (см., например, ρΝΟ-ρ40 в патенте США № 6838260). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей р40-субъединицу зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека, приведена на фиг. 19. Таким способом были получены экспрессирующие плазмиды, кодирующие варианты р40субъединицы.
Более конкретно, нуклеиновые кислоты, кодирующие р40У1 и р40У2, были получены следующим образом. Клонирующий вектор, содержащий ДНК-кассеты р40У1 и р40У2 (рВНУ1У2) и синтезированный в виде непрерывного фрагмента, как показано на фиг. 20, был подвергнут расщеплению рестрикта
- 11 015338 зой Ври10 I и либо рестриктазами Есо К! / 8са I, либо рестриктазой ВЬ§ I, с получением ЕсоК I / Ври10 I для У1) и ВЬ§ I / Ври10 I (для У2) кассет с концами, совместимыми с ЕсоК I / Ври10 I, соответственно. Расщепление рестриктазой 8са I было включено для исключения У2-фрагмента сходного размера. Эти очищенные фрагменты клонировали в экспрессирующий вектор рNС-р40 посредством тройного лигирования с соответствующими Ври10 I / Ρνυ I и Ρνυ I / Есо КЕ фрагментами, полученными из N0^40.
Идентичный подход был использован для получения нуклеиновых кислот, кодирующих р40У5 и р40У6, начиная с синтезированной последовательности, изображенной на фиг. 21, и для получения нуклеиновых кислот, кодирующих р40У7 и р40У8, начиная с синтезированной последовательности, изображенной на фиг. 23.
Сходным образом, для получения нуклеиновых кислот, кодирующих р40У3 и р40У4 варианты, плазмиду (рВНУ3У4), содержащую синтезированную последовательность, изображенную на фиг. 22, расщепляли рестриктазами ЕсоК I / ВЬ§ I / 8са I (расщепление рестриктазой 8еа I было включено для исключения У4-фрагмента сходного размера) или только рестриктазой ВЬ§ I с получением ЕсоК I / ВЬ§ I (для У3) и ВЬ§ I (для У4) кассет, соответственно, причем каждая из кассет имела концы, совместимые с расщепленной рестриктазами ЕсоК I / ВЬ§ I экспрессирующей плазмидой рNС-р40. Отметим, что для рестрицирующего фермента ВЬ§ I распознаваемые и расщепляемые последовательности различны, и поэтому последовательности, содержащие несколько сайтов, распознаваемых рестриктазой ВЬ§ I, могут генерировать различные, специфичные для каждой последовательности тупые концы. Затем У3 и У4 кассеты очищали посредством гель-фильтрации и лигировали, соответственно, в экспрессирующую плазмиду рNС-р40 посредством тройного лигирования с использованием соответствующих ВЬ§ I / Ρνυ I и Ρνυ I / Есо КЕ фрагментов, полученных из рNС-р40.
Такой же общий подход может быть использован для получения других молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих другие варианты р40-субъединицы, предусмотренные настоящим изобретением.
Пример 2. Экспрессия вариантов р40-субъединцы и слитых белков типа антитело-ИЛ-12, содержащих варианты р40-субъединицы.
Для получения клеточных линий, экспрессирующих варианты р40-субъединицы согласно настоящему изобретению были использованы стандартные способы (см. патент США № 6838260). Экспрессирующие плазмиды рNС-р40, кодирующие варианты р40-субъединицы, вводили в клетки, например клетки N8/0, посредством электропорации. Клетки засевали на чашки Петри и трансфицированные клетки отбирали на среде, содержащей 0418. Супернатанты культур устойчивых к лекарственному препарату клонов анализировали на продукцию р40 посредством твердофазного иммуноферментного анализа ЕЫ8А, и наиболее активных продуцентов субклонировали и тестировали на предмет стабильности экспрессии.
Для получения клеточных линий, экспрессирующих слитые белки типа антитело-ИЛ-12, содержащие варианты р40-субъединицы, использовали способ последовательной трансфекции, описанный в Патенте США № 6838360. Например, слитый белок О[-НН8-[Ь12р40У 1 был получен посредством дополнительной трансфекции клеточной линии, экспрессирующей р40У1, второй плазмидой (рάН^101атЬάа^I-NН8-р35), кодирующей антитело N№76, в котором С-конец константной области тяжелой цепи соединен с ^концом р35-субъединицы ИЛ-12. Экспрессирующая плазмида рбНЬ101атЬба является производной от рбНЬ7, в которой закодированный константный домен легкой цепи представляет собой лямбда-цепь. Клетки отбирали на среде, содержащей метотрексат, и стабильные трансфектанты, экспрессирующие слитые белки, содержащие антитело, клонировали стандартными способами.
Пример 3. Очистка и определение характеристик вариантов р40-субъединииы.
Для того чтобы охарактеризовать целостность вариантов р40-субъединицы р40У1, р40У2, р40У3 и р40У4 (8Е0 ГО N0:6-9), истощенные среды для культивирования клеток после культивирования дважды кратковременно трансфицированных N8-0 клеток, экспрессирующих эти варианты, собирали и обрабатывали для вестерн-блоттинга поликлональным апН-1ш-р40 антителом, изображенным на фиг. 24. Контрольная р40-субъединица дикого типа была использована в качестве контроля (дорожка 1). Было обнаружено, что расщепленные виды, утратившие С-терминальный фрагмент массой 6 кДа, который обычно хорошо разрешается у интактных видов р40-субъединицы в этих условиях электрофореза (см. стрелку, указывающую на полосу в дорожке 1), отсутствовали во всех исследованных вариантах (дорожки 2-9), и удавалось обнаружить только интактную р40-субъединицу. Таким образом, исследованные варианты р40-субъединицы были устойчивыми к протеолитической активности, существующей во время экспрессии белка.
Слитые белки на основе антитела, содержавшие варианты р40-субъединицы ИЛ-12, выделяли из супернатанта культуры клеток с использованием стандартных способов, основанных на захвате антитела белком А (см. патент США № 6838260).
Результаты 808-РАСЕ гель-электрофореза очищенных слитых белков, полученных из стабильных клонов N8-0 клеток и содержавших варианты р40-субъединицы, представляющие собой последовательности 8Е0 ГО № 6-13 (дорожки 1 - 8), или немутированный контроль (дорожка 9), приведены на фиг. 25. Средняя из трех основных полос представляет собой нерасщепленную р40-субъединицу, при этом расположенная немного выше нечеткая полоса отображает более гликозилированные виды. Самая верхняя
- 12 015338 из основных полос представляет собой слитый белок, состоящий из тяжелой цепи антитела и р35субъединицы, а нижняя из основных полос представляет собой легкую цепь антитела. Было обнаружено, что, за исключением образца слитого белка, состоявшего из антитела и варианта р40У5 ИЛ-12, полоса с молекулярной массой 6 кДа везде отсутствовала. В случае варианта р40У5 ИЛ-12 наблюдалась остаточная полоса с молекулярной массой 6 кДа (дорожка 5).
Пример 4. Определение характеристик сайта протеолитического расщепления в р40-субъединице ИЛ-12 дикого типа.
Идентичность загрязняющего белкового фрагмента с молекулярной массой, примерно равной 6 кДа, была определена стандартными способами. Коротко говоря, очищенный белок ΌΙ-ΝΗ8-ΙΕ12 денатурировали и восстанавливали в забуференном растворе 6 М гуанидина/1 мМ ЛТТ при 55°С, после чего подвергали разделению посредством обратнофазной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке Уубас С4 с градиентом ацетонитрила от 10 до 90%. Фракцию, соответствовавшую неидентифицированному виду белка, собирали, высушивали и ресуспендировали для прогона в 8Л8-РА6Е геле, который подтвердил, что этот белок соответствовал фрагменту массой 6 кДа, и для определения последовательности аминокислот в пептиде посредством Ν-терминального секвенирования. Анализ последовательности выявил пептид с последовательностью КЕККЛКУЕТЛ, который соответствует последовательности р40-субъединицы зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека, начиная с Агд261.
Пример 5. Биологическая активность белков ИЛ-12, содержащих варианты р40-субъединицы.
Биологическая активность белков ИЛ-12, содержащих варианты р40-субъединицы, была измерена посредством индукции экспрессии интерферона-гамма (ΙΕΝγ ) мононуклеарными клетками периферической крови (РМВС) человека. Слитые белки АЬ-1Ь-12, содержавшие антитело и варианты р40субъединицы р40У1-р40У8 сравнивали со слитыми белками АЬ-1Ь-12, содержавшими р40 субъединицу дикого типа и рекомбинантный белок ИЛ-12 человека.
Анализ индукции ΙΕΝγ был выполнен, по существу, так как описано в работе Са1с1у с1 а1 (1995), Снггеп! Рго!осо1з ίη 1штипо1оду, 8есбоп 6 16 4, и КоЬауазЫ е! а1 (1989), I Ехр Меб, 170 827-845 Мононуклеарные клетки периферической крови (РМВС) культивировали с фитогемагглютинином (РНА-Р) в течение 3 дней, после чего еще на 24 ч к ним добавляли 25 МЕд/мл ИЛ-2 человека (производства компании К&Л 8уз1етз, Миннеаполис, Миннесота). Клетки промывали, ко всем клеткам добавляли 20 МЕд/мл ИЛ2, а затем - слитые белки, содержавшие ИЛ-12, в виде серии двукратных разведений, начиная с концентрации 20 нг/мл (в пересчете на относительную массовую долю ИЛ-12 в молекуле). Через 24 ч измеряли концентрацию ΙΕΝγ посредством твердофазного иммуноферментного анализа ЕЬ18А с использованием парных антител, закупленных в компании К&Л 8уз1етз.
Результаты двух раздельных экспериментов, в которых были использованы РМВС от различных доноров, суммированы в табл. 1.
Таблица 1. Биологическая активность АЬ-Ю2 вариантов, определенная в анализе индукции ΙΕΝγ
Белок ИНДУКЦИЯ ΙΕΝγ ЕО50 (нг/мл)
Среднее значение _ Стандартное отклонение
Пример 1
Ρ&ϋ И.-12 0,04 0,02
АЬ-И12 0,43 0,21
АЬ-И12 VI 1,11 0,59
АЬ-1Ы2У2 1,09 0,32
АЬ-11_12 УЗ 1,09 0,21
АМН 2 У4 1,44 0,48
Пример II
Р&О Ιί-12 0,05 0,03
АМИ2 0,53 0,42
АМН2У1 1,53 0,58
АМИ2У4 1,79* 0,80
АМН2У5 0,58 0,39
АМН2У6 1,63 1,46
АМИ2У7 0,99 1,27
АМИ2 У8 0,74 0,68
* (п=2)
- 13 015338
По сравнению с рекомбинантным ИЛ-12 человека, активность АЬ-1Ь12 с р40-субъединицей дикого типа была снижена примерно в 10 раз. Было обнаружено, что исследованные белки, состоявшие из антитела и варианта ИЛ-12, не оказывали достоверного дополнительного влияния на активность белка. Слитые белки от АЬ-1Ь12р40У1 до АЬ-1Ь12р40У8 обладали несколько сниженной активностью (примерно в 1,5-3 раза), по сравнению со слитым белком, состоявшим из соответствующего антитела и ИЛ-12 дикого типа.
Пример 6. Фармакокинетика белков ИЛ-12, содержащих варианты р40-субъединицы.
Была определена фармакокинетика слитых белков, содержавших антитело и варианты р40субъединицы. Эксперименты были выполнены с использованием стандартных способов, известных специалистам в данной области техники. Коротко говоря, мышам линии ВАБВ/с (п=3 в каждой группе, получавшей определенный препарат) инъецировали по 25 мкг слитых белков АЬ-Ю2 или вариантов АЬ1Ь12, содержавших варианты р40У1, р40У2, р40У3, р40У4, р40У5, р40У6, р40У7 и р40У8, в объеме, равном 0,2 мл, либо внутривенно в хвостовую вену, либо подкожно. В различные моменты времени в течение 24 и 96 ч, соответственно, небольшие объемы крови получали посредством ретроорбитального кровопускания и собирали в пробирки с гепариновым покрытием для предотвращения свертывания. После центрифугирования с целью удаления клеток плазму анализировали посредством связывания с Н&Ь антисывороткой к 1дС человека и обнаружения с использованием антитела к ИЛ-12 человека. Результаты нормализовали к начальной концентрации в плазме каждой мыши, полученной через 30 с после инъекции (1 = 0). Фиг. 26 представляет собой компиляцию репрезентативных экспериментов по анализу фармакокинетики внутривенно введенного белка. Было обнаружено, что по сравнению с контрольным белком дикого типа слитые белки, состоявшие из антитела и ИЛ-12 и содержавшие варианты р40У1, р40У2, р40У3, р40У4 и р40У6, обладали значительно лучшими фармакокинетическими характеристиками. Более конкретно, было обнаружено, что время полувыведения в фазе распределения (альфа-фазе) примерно удваивалось, и соответственно также удваивалась площадь под кривой концентрация-время (АИС). Однако фазы выведения (бета-фазы) у всех слитых белков АЬ-1Ь-12 оставались примерно одинаковыми. Эти результаты совпадают с данными по фармакокинетике тех же белков при подкожном введении мышам. Фиг. 27, панель А, демонстрирует сравнение АЬ-1Ь-12 дикого типа с вариантами АЬ-1Ь-12, содержащими р40 У1, р40 У2, р40 У3 и р40 У4, а панель В демонстрирует сравнение АЬ-1Ь-12 дикого типа с вариантами АЬ-1Ь-12, содержащими р40 У5, р40 У6, р40 У7 и р40 У8.
Пример 7. Лечение людей вариантами ИЛ-12р40.
Варианты ИЛ-12р40 согласно настоящему изобретению были использованы для профилактики и лечения болезней и расстройств у людей следующим образом. В целом, предпочтительным способом введения являются внутривенная инфузия или внутривенная инъекция, а также подкожная инъекция, ингаляция, хотя возможны и оральное введение и другие способы.
Пациентов с продвинутым метастатическим раком предстательной железы и со стандартной химиотерапией в анамнезе лечат слитым белком, состоящим из антитела и ИЛ-12, содержащего вариант ИЛ12р40. Доза слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-12, на цикл лечения составляет примерно 150 микрограммов на кг массы тела, и ее можно ввести за один день или за два-три последовательных дня посредством капельной инфузии. Лечение можно сочетать со стандартным лечением рака предстательной железы, которое определено лечащим врачом как подходящее для пациента. Также назначают нестероидные противовоспалительные средства, например - Иаргохеп™. Циклы лечения повторяют примерно через каждые три недели.
Пациентов с устойчивым к гормонам раком молочной железы лечат посредством капельной инфузии слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-12, содержащего вариант ИЛ-12р40. Также назначают нестероидные противовоспалительные средства, например - Иаргохеп™.
При альтернативной стратегии лечения пациентов с продвинутым гормон-резистентным раком предстательной железы или продвинутым гормон-резистентным раком молочной железы лечат слитым белком, состоящим из антитела и ИЛ-12, содержащего вариант ИЛ-12р40, примерно один раз в три недели в комбинации с содержащим ИЛ-2 иммуноцитокином, например - К8-1Б2. Эти два агента можно вводить совместно путем капельной инфузии. Перед лечением пациенты получают иммуностимулирующее количество циклофосфамида. Также назначают нестероидные противовоспалительные средства, например Иаргохеп™ .
Пациентов с ревматоидным артритом лечат слитым белком Ес-р40, в котором р40-субъединица является вариантом ИЛ-12р40, примерно один раз в две недели в дозе, примерно равной 8 мг/кг, используя введение посредством капельной инфузии. Было обнаружено, что прогрессирование деструкции сустава значительно замедляется при монотерапии, даже при сравнении с модифицирующими заболевание антиревматическими препаратами.
- 14 015338
Перечень последовательностей <110> ИекэзРег, Согбоп
МсКепгте, Зигаппе
Во, Κιη-Мшд
5Реш, Разса1 <120> 1прег1еикш-12р4 О УапапРз μιΡϊι 1тргоуес1 8РаЬ111Ьу Варианты ИЛ-12р40 с улучшенной стабильностью <130> Р05/227-Ьг/Ьз (ЬЕХ-038) <150> РСТ/ЕР2006/012301 <151> 2006-12-20 <160>44 <170> РаРепсТп νετειοη 3.3 <210> 1 <211>197 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400>1
Агд 1 Азп Веи Рго Уа1 5 А1а ТЬг Рго Азр Рго 10 <31у Мер РЬе Рго Суз 15 Веи
Н13 Наз Зег С1п Азп Ьеи Веи Агд А1а Уа1 Зег Азп Мер Ьеи С1п Вуз
20 25 30
А1а Агд С1п ТЬг Ьеи С1и РЬе Туг Рго Суз ТЬг Зег С1и С1и Не Азр
35 40 45
Н13 С1ц Азр 11е ТЬг Ьуз Азр Вуз ТЬг Зег ТЬг Уа1 С1и А1а Суз Ьеи
50 55 60
Рго Веи С1и Веи ТЬг Вуз Азп С1и Зег Суз Ьеи Азп Зег Агд С1и ТЬг
65 70 75 80
Зег РЬе Не ТЬг Азп С1у Зег Суз Веи А1а Зег Агд Вуз ТЬг Зег РЬе
85 90 95
Мер Мер А1а Веи Суз Веи Зег Зег Не Туг С1и Азр Веи Вуз Мер Туг
100 105 110
С1п Уа1 С1и РЬе Вуз ТЬг Мер Азп А1а Вуз Веи Веи МеР Азр Рго Вуз
115 120 125
Агд С1п 11е РЬе Веи Азр С1п Азп Мер Веи А1а Уа1 11е Азр С1и Ьеи
130 135 140
- 15 015338
нес 145 61п А1а Теи Азп РЬе 150 Азп Зег
Теи 61и С1и Рго Азр 165 РЬе Туг Туз
Ьей Н13 А1а РЬе 180 Агд Не Агд А1а
Туг Беи Азп 195 А1а Зег
С1и ТЬг Уа1 155 Рго 61П Туз Зег Зег 160
ТЬг Туз 11е Ьуз Теи Суз Не Ьей
170 175
Уа1 ТЬг Не Азр Агд Уа1 Мер Зег
185 190
<210> 2 <211> 306 <212> РВТ <213> Ното заррепз <400> 2
11е 1 Тгр С1и Ьей Туз 5 Туз Азр Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 61и Теи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго 61 у С1и Мер Уа1 Уа1 Теи ТЬг Суз Авр ТЬг Рго 61и
20 25 30
С1и Азр С1у Не ТЬг Тгр ТЬг Ьей Азр 61п 5ег Зег 61 и Уа1 Теи 61у
35 40 45
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьей ТЬг Не 61п Уа1 Туз 61и РЬе 61у Азр А1а 61у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Нгз Туз 61у 61у 61и Уа1 Ьей Зег Н13 Зег Теи Ьей
65 70 75 80
Ьей Ьей. Н13 Туз Ьуз 61и Азр 61у 11е Тгр Зег ТЬг Азр Не Теи Туз
85 90 95
АЗр 61П туз С1и Рго Туз Азп Ьуз ТЬг РЬе Теи Агд Суз С1и А1а Ьуз
100 105 НО
Азп Туг Зег 61 у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Теи ТЬг ТЬг 11е Зег ТЬг
115 120 125
АЗр Ьей ТЬг РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд 61 у Зег Зег Азр Рго 61П
130 135 140
- 16 015338
61у Уа1 145 ТЬг Суз 61у А1а А1а 150 ТЬг Веи Зег А1а 155 61и Агд Уа1 Агд 61 у 160
Азр Азп Ьуз 61 и Туг 61и Туг Зег Уа1 61и Суз 61п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а 61и 61и Зег Веи Рго Не 61и Уа1 МеЬ Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Н15 Ъуз Веи Ьуз Туг С1и Аз η Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Т1е Агд
195 200 205
Азр Не 11е Вуз Рго Азр Рго Рго Вуз Азп Веи 61 п Ьеи Вуз Рго Ьеи
210 215 220
Вуз Азп Зег Агд С1П Уа1 61и Уа1 Зег Тгр 61и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Н1з Зег Туг РЬе Зег Веи ТЬг РЬе Суз Уа1 61п Уа1 61п
245 250 255
С1у Ьуз Зег Вуз Агд 61и Вуз Вуз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг
260 265 270
Зег А1а ТАГ Уа1 Не Суз Агд Вуз Азп А1а Зег 11е Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
С1п АЗр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210>3 <211>169 <212> РРТ <213> Ното зархепз <400>3
А1а 1 Уа1 Рго 61у С1у 5 Зег Зег Рго А1а Тгр 10 ТЬг 61 п Суз С1п 61п 15 Ъеи
Зег 61п Ъуз Ьеи Суз ТЬг Ъеи А1а Тгр Зег А1а Н15 Рго Ъеи Уа1 61 у
20 25 30
ΗΪ3 МеЬ Азр Ьеи Агд С1и 61и 61у Азр С1и С1и ТЬг ТЬг Азп Азр Уа1
35 40 45
- 17 015338
РГО Н1з 50 11е 01п Суз 61у Азр 55 С1у Суз Азр Рго С1п 60 С1у Ьеи Агд Азр
Азп Зег 31п РЪе Суз Ьеи С1п Агд 11е Н.13 01п С1у Ьеи 11е РЛе Туг
65 70 75 80
С1и Ьуз Ьеи Ьеи С1у Зег Азр Не РНе ТЬг С1у 61и Рго Зег Ьеи Ьеи
85 90 95
Рго Азр Зег Рго ν31 С1у С1п Ьеи ΗΪ3 А1а Зег Ьеи Ьеи С1у Ьеи Зег
100 105 но
С1П Ьеи Ьеи 61п Рго С1и 01 у Н1з Н13 Тгр С1и Ткг С1п С1п 11е Рго
115 120 125
Зег Ьеи Зег Рго Зег С1п Рго Тгр С1П Агд Беи Ьеи Ьеи Агд РЬе Ьуз
130 135 140
Не Ьеи Агд Зег Ьеи 01п А1а РЬе Уа1 А1а ν^ι А1а А1а Агд Уа1 РЬе
145 150 155 160
А1а ΗΪ3 61у А1а А1а Ткг Ьеи Зег Рго
165
<210>4 <211>46 <212> ?КТ <213> Ното зархепз <400>4
Агд С1и 1 Ьуз Ьуз Азр 5 Агд Уа1 РЬе ТНг Азр 10 Ьуз ТЬг Зег А1а ТЬг 15 7а1
11е Суз Агд Ьуз Азп АХа Зег Не Зег Уа1 Агд А1а С1п Азр Агд Туг
20 25 30
Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и тгр А1а Зег Уа1 РГО Суз Зег
35 40 45
<210>5 <211>9 <212> РКТ <213> Нолю зархепз <400>5
- 18 015338
Пув Зег Ьув Агд С1и Нуз Ьуз Авр Агд 1 5 <210> 6 <211> 303 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица ΙΗ-12ρ40νΐ <400> 6
Не Тгр 1 С1и Неи Пуз 5 Пуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 10 61и Неи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго 61у <31и МеЬ Уа1 Уа1 Неи ТНг Суз Азр ТНг Рго 61и
20 25 30
С1и Азр <31у Не ТНг Тгр ТНг Неи Азр 61П Зег Зег 61и Уа1 Неи 61у
35 40 45
Зег 61у ПуЗ ТНг Неи ТНг Не 61п Уа1 Пуз С1и РНе С1у Авр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТНг Суз ΗΪ3 Ьув 61 у 61 у С1и Уа1 Неи Зег Нхз Зег Неи Неи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Ηΐ3 Ьуз ьув 61и Азр 61у Не Тгр Зег ТНг Авр Не Неи Пуз
85 90 95
Авр 61п Ьуз 61и Рго Ьуз АЗП Ьуз ТНг РНе Ьеи Агд Суз С1и А1а Нуз
100 105 но
Аэп Туг Зег 61 у Агд РНе ТНг Суз Тгр Тгр Неи ТНг ТНг Не Зег ТНг
115 120 125
Азр Неи ТНг РНе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд 61у Зег Зег Азр Рго 51п
130 135 140
31у νβΐ ТНг Суз С1у А1а А1а ТНг Неи Зег А1а 61и Агд Уа1 Агд 61у
145 150 155 160
Азр Азп Ъуз <31и Туг Й1и Туг Зег Уа1 61и Суз 61п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и С1и Зег Неи Рго Не С1и Уа1 Μθΐ Уа1 Авр А1а
190 105 190
- 19 015338
Уа1 Н15 Ъуз 195 Ъеи Ъуз Туг С1и Азп 200 Туг ТЬг Зег Зег РЬе 205 РЬе Не Агд
Азр Не Не Ъуз Рго Азр Рго Рго Ъуз Азп Ъеи С1п Ъеи Ъуз Рго Ъеи
210 215 220
Ъуз Азп Зег Агд С1п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Н1з Зег Туг РЬе Зег Ъеи ТЬг РЬе Суз Уа1 61 п Уа1 С1п
245 250 255
61 у Ъуз Азр Азп ТЬг 61и Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр ЪуЗ ТЬг Зег А1а ТЬг
2 60 265 270
Уа1 Не Суз Агд Ъуз Азп А1а Зег Не Зег Уа1 Агд А1а 61п Азр Агд
275 280 285
Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго Суз Зег
2 90 295 300
<210> 7 <211> 304 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Ъ-12р40У2 <400> 7
Не 1 Тгр 61и Ъеи Ъуз 5 Ъуз Айр Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 61и Ъеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго 61 у 61и МеЪ Уа1 Уа1 Ъеи ТЬг Суз Азр ТЫ Рго 61и
20 25 30
61и Азр С1у Не ТЬг Тгр ТЬг Ъеи Азр 61п Зег Зег 61и Уа1 Ъеи 61у
35 40 45
Зег 61у Ъуз ТЫ Ъеи ТЬг Не 61П Уа1 Ъуз С1и РЬе 61у Азр А1а 61у
50 55 60
61п Туг ТЬг Суз Н1 5 Ъуз 61у 61 у 61 и Уа1 Ъеи Зег Н1з Зег Ъеи Ъеи
65 70 75 80
Ъеи Ъеи Нгз Ъуз Ъуз 61и Азр 61у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ъеи Ъуз
85 90 95
- 20 015338
Аер 61п Ъуз 01ц 100 Рго Ъуз Азп Ъуз ТЬг 105 РЬе 1еи Агд Суз (Ли но А1а Ъуз
Азп Туг Зег 31у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ъеи ТЬг ТЬг 11е Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ъеи ТЬг РЬе Зег Уа1 Ъуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго 61п
130 135 140
С1у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а ТЬг Ъеи Зег А1а (Ли Агд Уа1 Агд С1у
145 150 155 160
Азр Азп ъуз С1и Туг (Ли Туг Зег Уа1 (Ли Суа Θ1Π 61 и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а (Ли 61ц Зег Ъеи Рго Не СЛи Уа1 Мер Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Н15 Ъуз Ъеи Ъуз Туг С1н Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе 11е Агд
195 200 205
Азр Не Не Ъуз Рго Азр Рго Рго Ъуз АЗП Ъеи С1п Ъеи Ъуз Рго Ъеи
210 215 220
Ъуз Азп Зег Агд 51п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Нгз Зег Туг РЬе Зег Ъеи ТНг РЬе Суз Уа1 С1п Уа1 С1п
245 250 255
б!у Ъуз Азр Азп ТЬг 61и Е1у Агд νβΐ РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг Зег А1а
260 265 270
ТЬг Уа1 Но Суз Агд Ъуз Азп А1а Зег 11е Зег Уа1 Агд А1а <31п Азр
275 280 285
Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег (Ли Тгр А1а Зег Уа1 Рго Суз Зег
290 295 300
<210> 8 <211> 306 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Ь-12р40УЗ
- 21 015338 <400> 8
Не Тгр С1и 1 Ьеи Ьуз 5 Ьуз Азр Уа1 Туг 7а1 10 Уа1 61и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго С1у 61и МеЬ Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго 61 и
20 25 30
С1и Азр 61у Не ТЬг Тгр ТЬг Ьеи Азр С1п Зег Зег С1и Уа1 Ьеи 61у
35 40 45
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Т1е 61п Уа1 Ьуз С1и РЬе С1у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н13 Ьуз <31у 01 у С1и Уа1 Ьеи Зег Н13 Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Н13 Ьуз Ьуз С1и Азр 61 у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз 61и Рго Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Агд Суз 61и А1а Ьуз
100 105 но
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи ТЬг РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд 01у Зег Зег Азр Рго 61п
130 135 140
С1у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а ТЬг Ьеи Зег А1а С1и Агд Уа1 Агд С1у
145 150 155 160
Азр Азп Ьуз С1и Туг С1и Туг Зег Уа1 С1и Суз С1п 61и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и С1и Зег Ьеи Рго Не С1и Уа1 МеЬ Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Н13 Ьуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Азр Не Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи <31п Ьеи Ьуз Рго Ьеи
210 215 220
Ьуз Азп Зег Агд СХп Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
- 22 015338
Зег ТЬг РГО Н1з Зег 245 Туг РЬе Зег Беи ТЬг 250 РЬе Суз 7а1 51п Уа1 255 31п
С1у Й1п Азр <31п Азр С1и Туз Буз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Буз ТЬг
260 265 270
Зег А1а ТЬг Уа1 Не Суз Агд Буз Аз η А1а Зег Не Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
С1п Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 9 <211> 306 <212> РИТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Е-12р40У4 <400> 9
Не 1 Тгр С1и Беи Буз 5 Буз Азр Уа1 Туг Уа1 10 7а1 С1и Беи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго С1у С1и Мер Уа1 Уа1 Беи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго С1и
20 25 30
Й1и Азр С1у 11е ТЬг тгр ТЬг Беи. Азр С1п Зег Зег Й1и Уа1 Беи 61у
35 40 45
Зег Й1у Буз ТЬг Беи ТЬг Не (31 η Уа1 Буз С1и РЬе Й1у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н13 Буз С1у С1у Й1и Уа1 Беи Зег Н18 Зег Беи Беи
65 70 75 80
Беи. Беи Н13 Буз Буз С1и Азр Й1у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Беи Буз
85 90 95
Азр С1п Буз С1и Рго Буз Азп Буз ТЬг РЬе Беи Агд Суз С1и А1а Вуз
100 105 НО
- 23 015338
Азп Туг Зег С1у 115 Агд РЬе ТЬг Суз 120 Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг 125 Не Зег ТЬг
Αερ Ьеи ТЬг РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго С1п
130 135 140
е1у Уа1 ТО г суз С1у А1а А1а ТЬг Ьеи Зег А1а 61 и Агд Уа1 Агд Е1у
145 150 155 160
Азр Азп Ьуз б1и туг 31 и Туг Зег Уа1 С1и Суз 61п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и 61и Зег Ьеи Рго Не С1и Уа1 Меь Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Н13 Ьуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Азр Не Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи 01п Ьеи Ьуз Рго Ьеи
210 215 220
Ьуз Азп Зег Агд С1п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр Е1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Н13 Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе Суз Уа1 61п Уа1 С1п
245 250 255
61у С1п Азр С1п Азр С1и Зег С1у Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг
260 265 270
Зег А1а ТЬг Уа1 Не Суз Агд Ьуз Азп А1а Зег 11е Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
етп Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 10 <211> 306 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Ь-12р40У5 <400> 10
- 24 015338
Не Тгр С1и 1 Ьеи Ьуз 5 Ьуз Азр Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 <31и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго С1у О1и МеЬ Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго 01и
20 25 30
31и Азр С1у Не ТЬг Тгр ТЬг Ьеи Азр 01п Зег Зег С1и Уа1 Ьеи 31у
35 40 45
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не С1п Уа1 Ьуз С1и РЬе С1у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н1з Ьуз 01 у С1у 01и Уа1 Ьеи Зег Н13 Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 Θ0
Ьеи Ьеи Н15 Ьуз Ьуз С1и Азр С1у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз О1и Рго Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Агд Суз С1и А1а Ьуз
100 105 110
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи ТЬг РЬе Зег νβΐ Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго С1п
130 135 140
<31у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а ТЬг Ьеи Зег А1а С1и Агд Уа1 Агд О1у
145 150 155 160
Азр Азп Ьуз С1и Туг 01 и Туг Зег Уа1 С1и Суз С1п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и С1и Зег Ьеи Рго Не С1и Уа1 МеЬ νβΐ Азр А1а
180 185 190
νβΐ Н13 Ьуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Азр Не Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго Ьеи
210 215 220
Ьуз Азп Зег Агд С1п Уа1 С1 и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
- 25 015338
Зег ТЬг Рго Н1е Зег Туг 245 РЬе Зег Ьеи ТЬг 250 РЬе Суз Уа1 С1п Уа1 255 С1п
С1у Ьуз Зег Ьуз А1а С1и Ьуз Ьуз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг
260 265 270
Зег А1а ТЬг Уа1 Не Суз Агд Ьуз Аз η А1а Зег Не Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
С1п Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 11 <211> 306 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Ь-12р40\76 <400> 11
Не 1 Тгр С1и Ьеи Ьуз 5 Ьуз Азр Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 С1и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго С1у С1и МеЪ Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго <31и
20 25 30
51и Азр <31у Не ТЬг Тгр ТЬг Ьеи Азр С1п Зег Зег С1и Уа1 Ьеи С1у
35 40 45
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не С1п Уа1 Ьуз С1и РЬе 61у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н1з Ьуз С1у С1у С1и Уа1 Ьеи Зег Н13 Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьуз Ьуз С1и Азр С1у 11е Тгр Зег ТЬг Азр Не Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1П Ьуз С1и РГО Ьуз АЗП Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Агд Суз 61и А1а Ьуз
100 105 110
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
- 26 015338
Азр Ъеи 130 ТЬг РЬе Зег Уа1 Ъуз 135 Зег Зег Агд С1у Зег 140 Зег Авр Рго С1п
С1у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а ТА г Ъеи Зег А1а СЪи Агд Уа1 Агд С1у
145 150 155 160
Азр Азп Ъуз Е1и Туг С1и Туг Зег Уа1 Е1и Суз С1п С1и Азр Зег- А1а
165 170 175
Суз ЕГО А1а А1а Е1и С1и Зег Ъеи Рго Не СЪи νβΐ Мер Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Нхз Ъуз Ъеи Ъуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Азр 11е Не Ъуз Рго Азр Рго Рго Ъуз Азп Ъеи С1п Ъеи Ъуз Рго Ъеи
210 215 220
Ьуз АЗП Зег Агд С1п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр СЪи Туг Рго Азр ТЪг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Н13 Зег Туг РЬе Зег Ъеи ТЬг РЬе Суз Уа1 01 п УаЪ С1П
245 250 255
Е1у Ъуз Зег А1а А1а С1и Ъуз Ъуз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Аар Ъуз ТЬг
260 265 270
Зег А1а ТЬг Уа1 Не Суз Агд Ъуз Азп А1а Зег Не Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
Е1п Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег тгр Зег СЪи тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 12 <211> 306 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Ь-12р40У7 <400> 12
Не Тгр Е1и Ъеи Ъуз Ъуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 С1и Ъеи Азр Тгр Туг
10 15
- 27 015338
Рго Азр А1а Рго 20 С1у С1и Мер Уа1 Уа1 25 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг 30 Рго С1и
С1и Азр (31у Не ТЬг Тгр ТЬг Ьеи Азр 61п Зег Зег С1и Уа1 Ьеи 61у
35 40 45
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не 61п Уа1 Ьуз С1и РЬе 61у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н1з Ьуз О1у С1у С1и Уа1 Ьеи Зег Ηιε Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Наз Ьуз Ьуз С1и Азр С1у Не Тгр Зег ТЬг Азр 11е Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз С1и Рго Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Агд Суз 61и А1а Ьуз
100 105 НО
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг 11е Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи ТЫ РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго С1п
130 135 140
С1у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а ТЬг Ьеи Зег А1а С1и Агд Уа1 Агд С1у
145 150 155 160
Азр Азп Ьуз С1и Туг С1и Туг Зег Уа1 С1и Суз С1п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и С1и Зег Ьеи Рго Не 61 и Уа1 МеЬ Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Н15 Ьуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе 11е Агд
195 200 205
Азр 11е Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго Ьеи
210 215 220
Ьуз Азп Зег Агд 61п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Н13 Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе Суз Уа1 61п Уа1 С1п
245 250 255
- 28 015338
С1у Ъуз Зег А1а 260 Агд 61и Ъуз Ъуз Азр Агд 265 Уа1 РЬе ТЬг Азр 270 Ъуз ТЬг
Зег А1а ТЬг Уа1 Не Суз Агд ъуз Аз η А1а Зег Не Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
61 η Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег 61и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 13 <211> 306 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Ъ-12р40У8 <400> 13
Не Тгр С1и 1 Ъеи Ъуз 5 Ъуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 10 61и Ъеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго 61у 61и МеЪ Уа1 Уа1 Ъеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго 61и
20 25 30
61и Азр 61у 11е ТЬг Тгр ТЬг Ъеи Азр С1п Зег Зег С1и Уа1 Ъеи С1у
35 40 45
Зег 61у Ъуз ТЬг Ъеи ТЬг Не 61п Уа1 Ъуз 61и РЬе 61 у Азр А1 а 61 у
50 55 60
61 η Туг ТЬг Суз Н13 Ьуз 61у 61у С1и Уа1 Ъеи Зег Н15 Зег Ъеи Ъеи
65 70 75 80
Ъеи Ъеи Низ Ъуз Ъуз С1и Азр 61у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ъеи Ъуз
85 90 95
Азр 61п Ъуз 61и Рго Ъуз Аз η ъуз ТЬг РЬе Ъеи Агд Суз 61и А1а Ъуз
100 105 110
АЗП Туг Зег 61у Агд РЬе ТЬг Суд Тгр Тгр Ъеи ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ъеи ТЬг РЬе Зег Уа1 Ъуз Зег Зег Агд 61у Зег Зег Азр Рго 61П
130 135 140
- 29 015338
61у 145 Уа1 ТЬг Суз С1у А1а 150 А1а ТЬг Ьеи Зег А1а 155 <31и Агд Уа1 Агд Й1у 160
Азр Аз η Ьуз С1и Туг С1и Туг Зег Уа1 С1и Суз С1п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и С1и Зег Ьеи Рго 11е С1и Уа1 МеЬ Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Н1а Ьуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе 11е Агд
195 200 205
Азр 11е 11е Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго Ьеи
210 215 220
Ьуз Азп Зег Агд С1п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр Е1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Ηί3 Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе Суз νβΐ С1п Уа1 С1п
245 250 255
С1у Ьуз Зег С1у Агд С1и Ьуз Ьуз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг
260 265 270
Зег А1а ТЬг Уа1 11е Суз Агд Ьуз Азп А1а Зег 11е Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
С1п Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег 61и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 14 <211> 306 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица ΙΧ-12ρ40ν9 <400> 14
11е Тгр (31и. Ьеи Ьуз Ьуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 61и Ьеи Азр Тгр Туг 15 10 15
- 30 015338
Рго Азр А1а Рго 20 (Ну 61и МеС Уа1 Уа1 25 Ьей ТЬг Суз Азр ТЬг 30 Рго 61 и
С1и Азр 61у 11е ТЬг Тгр ТЬг Ьей Азр 61п Зег Зег (Пи Уа1 Ьей. 61 у
35 40 45
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьей ТЬг 11е 61п Уа1 Ьуз 61и РЬе С1у Азр А1а 61у
50 55 60
61п Туг ТЬг Суз Н13 Ьуз 61 у (Пу С1и Уа1 Ьей Зег Н15 Зег Ьей Ьей
65 70 75 80
Ьей Ьей Н15 Ьуз Ьуз С1и Азр 61у 11е Тгр Зег ТЬг Азр 11е Ьей Ьуз
85 90 95
Азр 61п Ьуз 61и Рго Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Ьей Агд Суз 61и А1а Ьуз
100 105 110
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьей ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьей ТЬг РЬе Зег νβΐ Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго 61п
130 135 140
61 у Уа1 ТЬг Суз 61 у А1а А1а ТЫ Ьей Зег А1а 61и Агд Уа1 Агд 61у
145 150 155 160
Азр Азп Ьуз 61и Туг Ο1Ώ Туг Зег Уа1 61и Суз 61п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а (Ии 61и Зег Ьей Рго 11е С1и Уа1 МеЬ Уа1 Азр А1а
180 185 190
Уа1 Н15 Ьуз Ьей Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе 11е Агд
195 200 205
Азр Не Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьей 61п Ьей Ьуз Рго Ьей
210 215 220
Ьуз Азп Зег Агд 61п Уа1 61и 7а1 Зег Тгр 61и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Н1з Зег Туг РЬе Зег Ьей ТЬг РЬе Суз Уа1 61п Уа1 61п
245 250 255
- 31 015338
С1у Ъуз Зег С1п Агд 260 С1и Ъуз Ьуз Азр 265 Агд Уа1 РНе ТНг Азр 270 Нуз ТНг
Зег А1а ТНг Уа1 11е Суз Агд Ьуз Азп А1а Зег 11е Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
С1п Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 15 <211> 306 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица ΙΣ-12ρ4θνΐΟ <400> 15
11е Тгр 1 61и Ъеи Ьу® 5 Ъуз Азр Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 61и Ъеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго С1у С1и МеЬ Уа1 Уа1 Ъеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго С1и
20 25 30
С1и Азр С1у Не ТНг Тгр ТНг Ьеи Азр С1п Зег Зег С1и 7а1 Ъеи С1у
35 40 45
Зег 61у Ъуз ТНг Ьеи ТНг 11е С1п Уа1 Ьуз С1и РНе С1у Азр А1а 61у
50 55 60
<31 η Туг ТЕ г Суз Н15 Ъуз С1у С1у С1и Уа1 Ъеи Зег Ηιε Зег Ъеи Ъеи
65 70 75 80
Ьеи Ней Н13 Ъу® Ъуз С1и Азр С1у 11е Тгр Зег ТНг Азр Не Ъеи Ъуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз С1и Рго Ьуз Азп Ъуз ТЬг РНе Ьеи Агд Суз С1и А1а Ьуз
100 105 110
Азл Туг Зег С1у Агд РНе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТНг ТЬг 11е Зег ТНг
115 120 125
Азр Ъеи ТНг РНе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго 61п
130 135 14 0
- 32 015338
С1у 145 ба1 ТЫ Суз Й1у А1а 150 А1а ТЬг Ьеи Зег А1а 61и 155 Агд ба1 Агд 61 у 160
Азр Азп Ьуз 61 и Туг Й1и Туг Зег ба1 61и Суз 61п 61 и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и С1и Зег Ъеи Рго Не С1и Уа1 МеС ба1 Азр А1а
100 1Θ5 190
ба1 ΗΪ3 Ьуз Ьеи Ьуе Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Айр Не Не Ьуз Рго Азр Рго Рго ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго Ьеи
210 215 220
Ьуз Азп Зег Агд С1п 7а1 61и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго ΗΪ3 Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе Суз Уа1 61 п ба1 61п
245 250 255
С1у Ьуз Зег Ьуз Азр С1и Ьуз Ьуз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг
260 2 65 270
Зег А1а ТЬг Уа1 Не Суз Агд Ьуз Азп А1а Зег Не Зег Уа1 Агд А1а
275 280 285
С1п Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305 <210> 16 <211> 306 <212> РК.Т <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: измененная зрелая человеческая субъединица 1Ь-12р40У11 <400> 16
11е Тгр 61и Ьеи Ьуз Ьуз Азр ба1 Туг 7а1 ба1 С1и Ьеи Аэр Тгр Туг
1 5 10 15
Рго Азр А1а Рго 61 у С1и Мер ба! ба1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго 61и
20 25 30
- 33 015338
С1и Азр 61у 35 Не ТЬг Тгр ТЬг Ьеи 40 Азр 61п Зег Зег 61и 45 Уа1 Веи 61у
Зег 61у Вуз ТЬг Ъеи ТЬг 11е С1п Уа1 Ьуз 61и РЬе 61у Азр А1а 61у
50 55 60
61п Туг ТЬг Суз Н1з Ьуз 61у 61 у 61 и Уа1 Ъеи Зег Н13 Зег Ьеи Веи
65 70 75 80
Веи Ьеи Н15 Вуз Ьуз 61и Азр 61у 11е Тгр Зег ТЬг Азр 11е Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр 61п Ьуз 61и Рго Вуз Азп Вуз ТЬг РЬе Веи Агд Суз С1и А1а Вуз
100 105 110
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Веи ТЬг ТЬг 11е 5ег ТЬг
115 120 125
Азр Веи ТЬг РЬе Зег Уа1 Вуз Зег Зег Агд 61 у Зег Зег Азр Рго 61п
130 135 140
61 у Уа1 ТЬг Суз 61у А1а А1а ТЬг Веи Зег А1а 61и Агд Уа1 Агд 01у
145 150 155 160
Азр Азп Вуз С1и Туг 61и Туг Зег Уа1 61 и Суз 61п 61и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а 61и 61и Зег Веи Рго Не 61и Уа1 МеЬ νβΐ Азр А1а
190 185 190
Уа1 Н15 Ьуз Веи Ьуз Туг 61и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Азр Не Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Веи 61 п Ъеи Ьуз Рго Ъеи
210 215 220
Вуз Аз η Зег Агд 61л Уа1 61и Уа1 Зег Тгр 61и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Нхз Зег Туг РЬе Зег Веи ТЬг РЬе Суз Уа1 61п νβΐ 61п
245 250 255
61у Ьуз Зег 61 η Азр 61и Ьуз Вуз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг
260 265 270
- 34 015338
Зег
А1а ТЬг Уа1 11е Суз Агд
275
Ъуз
280
Азп А1а
Зег
Не
Зег Уа1 Агд А1а
285
61п
Азр Агд Туг Туг Зег Зег
290 295
5ег
Тгр Зег
31и
Тгр
300
А1а Зег Уа1 Рго
Суз
305
Зег <210>
<211>
<212>
<213>
РКТ
Искусственная последовательность <220>
<223>
1Ъ-12р40У1 синтетическая: фрагмент измененной зрелой человеческой субъединицы <400> 17
Ъуз Азр Азп ТЬг 61и Агд 1 <210> <211>
<212>
<213>
РКТ
Искусственная последовательность <220>
<223>
1Ь-12р40У2 синтетическая: фрагмент измененной зрелой человеческой субъединицы <<500> 10
Ъуз Азр Азп ТЬг С1и С1у Агд 1 <210>
<211>
<212>
<213>
РКТ
Искусственная последовательность <220>
<223>
1Ь-12р4ОУЗ синтетическая: фрагмент измененной зрелой человеческой субъединицы <400> 19
С1п Азр С1п Азр С1и Ъуз Ъуз Азр Агд <210> 20 <211> 9 <212> РКТ
- 35 015338 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: фрагмент измененной зрелой человеческой субъединицы 1Б-12р40У4 <400>20
С1п Азр С1п Азр С1и 8ег С1у Азр Агд <210> 21 <211>987 <212> ВЫЛ <213> Ното зар1епз <400> 21
а1:д1:дЪсасс адсадъЪддб саРсЕсбСдд С£С£ссс±дд шисссддс аъсЪссссЬс 60
дбддссаЪаР дддаасДдаа дааадабдРР баРдРсд^ад ааРРддаЫзд дРаРссддаб 120
дссссОддад аааЪддРддО ссЪсассРдР дасассссбд аадаадаОдд ЪаЪсассРдд 130
ассЬЪддасс ададсадбда дд-ЬсЪЪаддс бсГддсаааа сссЪдассаВ ссаадЕсааа 240
дадШддад аЕдс£ддсса дЕасассЬдЬ сасаааддад дсдаддЬЬсб аадссаЬбсд 300
сЬссЬдсЬдс Нсасааааа ддаадаДдда аБЬЬддТсса сРдаВаНН аааддассад 360
ааадаассса аааа^аадас сБРРсЬаада Едсдаддсса адааЬ ЬаНс Гддасд^ЕЬс 420
ассЬдсГддГ ддсСдасдас ааЪсадбасГ даШдасаЕ ЪсадЕдЪсаа аадсадсада 480
ддс^сССсбд асссссаадд ддсдасд^дс ддадсДдсСа сасссссхдс ададададрс 540
ададдддаса асааддадба СдадСасСса дбддадСдсс аддаддасад РдссРдссса 600
дсЕдсЬдадд ададЬсЬдсс саЕЪдаддРс аЬддВддаЬд ссдНсасаа дсЕсаадЬаЬ 660
даааасВаса ссадсадсЪб сНсаРсадд дасаВсаОса аассБдассс асссаадаас 720
£РдсадсГда адссаВЕааа дааЪРсЪсдд саддрддадд ЕсадсЬддда дЕасссодас 780
ассЕддадЬа сЕссасаДЬс сЬасЪЕс^сс сЪдасаНс! дсдНсаддЪ ссадддсаад 840
адсаададад аааадааада ЬададбсЕЕс асддасаада ссВсадссас ддЬсаЬс^дс 900
сдсаааааЬд ссадсаЕЬад сдЬдсдддсс саддассдс! асЕаЕадсЬс аЕсЕЕддадс 960
даабдддсас сИдЕдсссДд садРРад 987
<210> 22 <211>300 <212> 0ΝΑ <213> Искусственная последовательность
- 36 015338 <223> синтетическая: нуклеиновая кислота, кодирующая белок последовательности ЗЕф Ю N0:17, линкер и белок последовательности 5Е£> Ю
N0:18 <400> 22
даабРсДсдд саддЬддадд бсадсбддда дДасссДдас асс1ддадса сЁссасаЫс 60
с1асЬЬсбсс сЪдасаИсЬ дсдНсадд! ссадддсаад дасааРасдд адададСдЫ: 120
сасддасаад ассЪсадсЫ шгсглсм НдаадасЪс ааЪДсбсддс аддЬддаддЬ 180
садсбдддад ЬасссДдаса ссСддадС-ас ЬссасаДбсс ЬасббсРссс ЬдасаДбсЬд 240
сдЬСсаддЪс садддсаадд асааЪасдда дддЬададЬд ЬЬсасддаса адассбсадс 300
<210> 23 <211> 277 <212> ΟΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: нуклеиновая кислота, кодирующая белок последовательности ЗЕф Ю N0:19, линкер и белок последовательности ЗЕф 10 N0:20 <400> 23
дааЬбсДсдд саддДддадд £садс1:ддда дЬасссЬдас ассЬддадса сЬссасаССс 60
сбасДДсДсс сЬдасаДДсб дсдбЬсаддЬ ссадддссад дабсаддасд адаадаадда 120
СададЬсЬЬс ΐΐίϋίϊϊΐί1 даадасЮаа ЬЬсбсддсад д1ддадд£са дсДдддадДа 180
сссЬдасасс 1ддад£асДс сасаЫссЬа сЫ:с1:сссДд асаССсСдсд ДДсадд1сса 240
дддссаддаЬ саддасдад! ссддадаЬад адЬс+бс 277
<210> <211> <212> <213> 24 312 ΦΝΑ Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая: нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент 1Ь-12р40У5 линкер и фрагмент 1Ь-12р40У6 <400> 24
даабЬсЬсдд саддЪддадд ЬсадсЬддда дЪаассЪдас ассСддадса сбссасаГСс 60
сбасбЬсЬсс с^дасаНсЬ дсдЬбсадд! ссадддсаад адсааддсад аааадааада 120
ДададбсЬДс асддасаада ссДсадсНЬ ЬЬЬЫРДтда адасЪсааЫ сЪсддсаддД 180
ддаддбсад! бдддадбасс с^дасассбд дадбасбсса сабЬссЬас! ДсРсссДдас 240
аДДсДдсдЫ саддГссадд дсаададсдс адсЬдаааад ааадабадад ЬсИЛасдда 300
саадассСса дс 312
- 37 015338 <210> 25 <211> 312 <212> ЬЫА <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: нуклеиновая кислота, кодирующая фрагмент 1Ь-12р40У7, линкер и фрагмент 1Ь-12р40У8 <400> 25
дааЬЬсЬсдд саддЬддадд дФасссЬдас ассбддадса сФссасаФФс 60
сРасЬЬсЬсс сбдасаЬЬсЬ дед1Ьсадд5 ссадддсаад адсдсссддд аааадааада 120
ЬададЬсСФс асддасаада ссФсадсРФР шшьбда адасЬсааФЬ сФсддсаддг 180
ддаддЬсадФ ЬдддадЬасс сЬдасассЬд дадФасФсса саФФссФасФ ФсФсссФдас 240
аСФсФдсдФС саддбссадд дсаададсдд Фададаааад ааадаФадад Фссссасдда 300
саадассЬса дс 312
<210> 26 <211> 96 <212> РВТ <213> Ното зартепз <400> 26
11е 1 Ьуз Рго Азр Рго 5 Рго Ьуз Азп Ьеи 61п Ьеи Ьуз 10 Рго Ьеи Ьуз 15 Азп
Зег Агд С1п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг РГО Азр ТЬг Тгр Зег ТЬг
20 25 30
Рго НЬе Зег Туг РЬе Бег Ьеи ТЬг РЬе Суз Уа1 С1п Уа1 С1п С1у Ьуз
35 40 45
Зег Ьуз Агд С1и Ьуз Ьуз Азр Агд Уа1 РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг 5ег А1а
50 55 60
ТЬг Уа1 11е Суз Агд Ьуз Азп А1а Зег Не Зег Уа1 Агд А1а С1п Азр
65 70 75 80
Агд Туг Туг бег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго Суз 5ег
85 90 95
<210> 27
<211> 306
<212> РНТ
<213> РарЬо апиЫз
<400> 27
- 38 015338
Не Тгр С1и Ьеи 1 Ьуз 5 Ьуз Азр Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 31и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго 01у С1и меь Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго С1и
20 25 30
С1и Азр С1у Не ТЬг Тгр ТЬг Ьеи Азр С1П Зег С1у С1и Уа1 Ьеи С1у
35 40 45
Зег 61у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не 61п Уа1 Ьуз С1и РЬе Б1у Азр А1а 61 у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н13 Ьуз С1у 01 у С1и А1а Ьеи Зег Н13 Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 ао
Ьеи Ьеи Н1з Ьуз Ьуз С1и Азр б1у Не Тгр Зег ТЬг Азр Уа1 Ьеи Ьуз
05 90 95
Азр С1п Ьуз С1и Рго Ьуз Аз η Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Агд Суз С1и А1а Ьуз
100 105 110
Аз η Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи ТЬг РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд Б1у Зег Зег Азп Рго С1п
130 135 140
С1у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а Уа1 ТЬг Ьеи Зег А1а Б1и Агд Уа1 Агд 61у
145 150 155 160
Азр Азп Ьуз С1и Туг Б1и Туг Зег Уа1 С1и Суз С1п С1и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а С1и С1и Агд Ьеи Рго Не С1и Уа1 Меб Уа1 Азр А1а
180 185 190
11е Н13 Ьуз Ьеи Ьуз Туг (31и Аз η Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Азр Не Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз АЗП Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго Ьеи
210 215 220
Ьуз Аз η Зег Агд С1п А1а С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
- 39 015338
Зег ТЬг Рго ΗΪ3 Зег 245 Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг 250 РЬе Суз Не С1п Уа1 255 С1п
С1у Ьуз Зег Ьуз Агд С1и Ьуз Ьуз Азр Агд 11е РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг
260 265 270
Зег А1а ТЬг Уа1 11е Суз Агд Ьуз Азп А1а Зег РЬе Зег Уа1 С1п А1а
275 280 285
61П Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Рго
290 295 300
Суз Зег
305
<210> 28
<211> 306
<212> РКТ
<213> 1 Масаса гпиЬаЬЬа
<400> 28
Не Тгр С1и Ьеи Ьуз Ьуз Азр νβΐ Туг Уа1 Уа1 <31и Ьеи Азр Тгр Туг
1 5 10 15
Рго Азр А1 а Рго С1у С1и Мег Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго 31 и
20 25 30
Азр С1у Не ТЬг Тгр ТЬг Ьеи Азр С1п Зег С1у С1и Уа1 Ьеи 31у
35 40 45
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не С1п Уа1 Ьуз С1и РЬе С1у Азр А1а 61у
50 55 60
С1П Туг ТЬг Суз Н13 Ьуз С1у 61у С1и А1а Ьеи Зег Н13 Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьуз Ьуз С1и Азр С1у 11е Тгр Зег ТЬг Азр Уа1 Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз С1и Рго Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Агд Суз 61 и А1а Ьуз
100 105 НО
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи ТЬг РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азп Рго е1п
130 135 140
- 40 015338
С1у 145 Уа1 ТЬг Суз С1у А1а 150 Уа1 ТЬг
Азр Азп Ъуз СЪи Туг 165 СЪи Туг Зег
Суз Рго А1а А1а 180 С1и 01и Агд Ъеи
11е НЪз Ъуз 195 Ъеи Ъуз Туг СЪи Азп 200
Азр 11е 210 Не Ъуз Рго Азр Рго 215 Рго
Ъуз 225 Азп Зег Агд С1П УаЪ 230 СЪи УаЪ
Зег ТЬг Рго Н1з Зег 245 Туг РЬе Зег
С1у Ъуз Зег Ъуз 260 Агд СЪи Ъуз Ъуз
Зег А1а ТЬг 275 Уа1 Не Суз Агд Ъуз 280
Θ1Π Азр 290 Агд Туг Туг Зег Зег 295 Зег
Суз 305 Зег
<210> <211> <212> <213> 29 306 РЕТ СегсосеЬиз ЪогдиаЬоэ
<400> 29
Не 1 Тгр СЪи Ъеи Ъуз 5 Ъуз Азр Уа1
Рго Азр А1а Рго 20 С1у СЪи МеЬ УаЪ
Ъеи Зег А1а 155 СЪи Агд Уа1 Агд СЪу 160
Уа1 С1и 170 Суз С1п СЪи Азр Зег 175 АЪа
Рго 185 Не С1и νβΐ МеЬ Уа1 190 Азр АЪа
Туг ТЬг Зег Зег РЬе 205 РЬе 11е Агд
Ъуз Азп Ъеи СЪп 220 Ъеи Ъуз Рго Ъеи
Зег Тгр СЪи 235 Туг Рго Аяр ТЬг Тгр 240
Ъеи ТЬг 250 РЬе Сув 11е Б1П Уа1 255 С1п
Азр 265 Агд 11е РЬе ТЬг Азр 270 Ъуз ТЬг
Азп А1а Зег РЬе 5ег 285 УаЪ С1п АЪа
Тгр Зег С1и Тгр 300 А1а Зег Уа1 Рго
Туг УаЪ 7а1 СЪи Ъеи Азр Тгр Туг
10 15
УаЪ Ъеи ТЫ Суз Азр ТЬг Рго СЪи
25 30
- 41 015338
61и Азр 61у 35 Не ТЬг Тгр ТЬг Ъеи Азр 40 61п Зег С1у 61и 45 νβΐ Ъеи 61у
Зег 61у Ъуз ТЬг Ъеи ТЬг Не 61п Уа1 Ъуз С1и РЬе 61у Азр А1а 61у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н13 Ъуз 61у 61у 61и А1а Ъеи Зег Н15 Зег Ъеи Ъеи
65 70 75 80
Ъеи Рго Н13 Ъуз Ъуз С1и Азр 61у 11е Тгр Зег ТЬг Азр Не Ъеи Ъуз
85 90 95
Азр 61п Ъуз 61и Рго Ъуз Азп 61и ТЬг РЬе Ъеи Агд Суз 61и А1а Ъуз
100 105 но
Азп Туг Зег 61у Агд Не ТЬг Суз Тгр Тгр Ъеи Зег ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ъеи ТЬг РЬе Зег Не Не Зег Зег Агд 61 у Зег Зег Азп Рго 61п
130 135 140
61 у Уа1 ТЬг Суз 61у А1а А1а ТЬг Ъеи Зег А1а 61и Агд Уа1 Агд 61у
145 150 155 160
Азр Азп Ъуз С1и Туг 61и Туг Зег Уа1 С1и Суз 61п 61и Азр Зег А1а
165 170 175
Суз Рго А1а А1а 61и 61и Агд Ъеи Рго Не 61и Уа1 Ме£ νθι Азр А1а
130 185 190
Не Н13 Ъуз Ъеи Ъуз Туг 61и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд
195 200 205
Азр 11е 11е Ъуз Рго Азр Рго Рго Ъуз Азп Ъеи 61п Ъеи Ъуз Рго Ъеи
210 215 220
Ъуз Азп Зег Агд 61п Уа1 61и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Рго Н13 Зег Туг РЬе Зег Ъеи ТЬг РЬе Суз Не 61п Уа1 61п
245 250 255
61у Ъуз Зег Ъуз Агд 61и Ъуз Ъуз Азр Агд Не РЬе ТЬг Азр Ъуз ТЬг
260 265 270
- 42 015338
8ег А1а ТЬг Уа1
275
Не Сув Агд Ъуз Азп А1а Зег РЬе Зег Уа1 СЪп А1а
200 285
Суз Зег
305
<210> <211> <212> <213> 30 307 РКТ Сап1з ЕагсНЪагЪз
<400> 30
11е Тгр 1 С1и Ъеи С1и Ъуз Азр 1/а1 5 Туг Уа1 10 Уа1 С1и Ъеи Азр Тгр 15 ΗΪ3
Рго Азр А1а Рго С1у С1и МеЕ Уа1 Уа1 Ъеи ТЬг Суз Н1з ТЬг Рго <31и
20 25 30
С1и Азр Азр 11е ТЬг Тгр ТЬг Зег А1а С1п Зег Зег С1и Уа1 Ъеи С1у
35 40 45
Зег С1у Ъуз ТЬг Ъеи ТЬг 11е С1п Уа1 Ъуз С1и РЬе С1у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н13 Ъуз С1у С1у Ъуз Уа1 Ъеи Зег Агд Зег Ъеи Ъеи
65 70 75 80
Ъеи 11е Н1з Ъуз Ъуз С1и Азр С1у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ъеи Ъуз
85 90 95
61и Б1п Ъуз 61тд Зег Ъуз Азп Ъуз Не РЬе Ъеи Ъуз Суз С1и А1а Ъуз
100 105 110
Азп Туг Зег С1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ъеи ТЬг А1а Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ъеи Ъуз РЬе Зег Уа1 Ъуз Зег Зег Агд 31у РЬе Зег Азр Рго С1п
130 135 140
С1у Уа1 ТЬг Суз 61у А1а УаЪ ТЫ Ъеи Зег А1а С1и Агд Уа1 Агд Уа1
145 150 155 160
Азр Азп Агд Азр Туг Ъуз Ъуз Туг ТЬг Уа1 С1и Суз С1п С1и С1у Зег
165 170 175
- 43 015338
А1а Суз Рго Зег А1а 180 (31и С1и Зег Ьеи 185 Рго Не (31и Уа1 Уа1 190 Уа1 Азр
А1а Не Н13 Ъуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не
195 200 205
Агд Азр 11е Не Ьуз Рго Айр Рго Рго ТЬг Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго
210 215 220
Ъеи. Ьуз Азп Зег Агд Н15 Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг
225 230 235 240
Тгр Зег ТЬг Рго Нхз Зег Туг РЬе Зег Кеи ТЬг РЬе Суз Уа1 С1п А1а
245 250 255
<31п С1у Ъуз Азп Азп Агд С1и Ьуз Ьуз Азр Агд Ъеи Суз Уа1 Азр Ьуз
260 265 270
ТЬг Зег А1а Ьуз Уа1 Уа1 Суз Н13 Ъуз Азр А1а Ьуз Не Агд Уа1 С1п
275 280 285
А1а Агд Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег Азр Тгр А1а Зег Уа1
290 295 300
Зег Суе Зег
305 <210> 31 <211> 307 <212> РКТ
<21: 3> ГеИз саьиз
<400> 31
Не Тгр (31и Ьеи С1и Ъуз Азп Уа1 Туг Уа1 Уа1 С1и Ъеи Азр Тгр Нхз
1 5 10 15
Рго Азр А1а Рго <31у <31и МеЕ Уа1 νβΐ Ъеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго 61и
20 25 30
С1и Азр Азр Не ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр С1п Еег 5ег С1и Уа1 Ъеи 61у
35 40 45
Зег (31 у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не С1п Уа1 Ьуз С1и РЬе А1а Азр А1а 61у
50 55 60
- 44 015338
С1п 65 Туг ТЬг Суз Н1з Ьуз 70 СЬу 61у СХи УаХ Ьеи 75 5ег Низ Зег РЬе Ьеи 80
Ьеи Не Н13 Ьуз Ьуз С1и Азр СХу 11е Тгр Зег ТЬг Азр Не Ьеи Агд
85 90 95
<Э1и С1п Ьуз С1и Зег Ьуз Азп Ьуз Не РЬе Ьеи Ьуз Суз СХи АХа Ьуз
100 105 НО
Азп Туг Зег 61у Агд РЬе ТЫ Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг А1а Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи Ьуз РЬе ТЬг Уа1 Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго СХп
130 135 140
СХу Уа1 ТЬг Суз С1у А1а АХа ТЬг Ьеи Зег А1а С1и Ьуз Уа1 Агд Уа1
145 150 155 160
Азр Азп Агд Азр Туг Ьуз Ьуз Туг ТЬг УаХ СХи Суз С1п Б1и С1у Зег
165 170 175
АХа Суз Рго АХа АХа С1и С1и Зег Ьеи Рго Не С1и Уа1 УаХ УаХ Азр
180 185 190
А1а Не Н13 Ьуз Ьеи ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не
195 200 205
Агд Азр 11а Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго
210 215 220
Ьеи Ьуз Азп Зег Агд Низ Уа1 61и УаХ Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг
225 230 235 240
ТГР Зег ТЬг Рго Н15 Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе С1у Уа1 С1п УаХ
245 250 255
С1п СЬу Ьуз Азп Азп Агд С1и Ьуз Ьуз Азр Агд Ьеи Зег Уа1 Азр Ьуз
260 265 270
ТЬг 5ег А1а Ьуз УаХ УаХ Суз Н15 Ьуз Азр А1а Ьуз Не Агд Уа1 С1п
275 280 285
АХа Агд Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег Азп Тгр А1а Зег УаХ
290 295 300
5ег Суз Зег
305
- 45 015338 <210>32 <211>307 <212> РКТ <213> Εςιιιι® саЬа11из <400>32
11е Тгр С1и Ъеи С1и Ъуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 10 31и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
1 5
РГО Азр А1а РГО С1у С1и Мес ναΐ Уа1 Ьеи ТНг Суз Азл ТНг Рго С1и
20 25 30
С1и 31 и С1у 11е ТНг Тгр ТНг Зег А1а С1л Зег Азл С1и Уа1 Ьеи С1у
35 40 45
Зег С1у Ъуз ТНг Ъеи ТНг 11е 31л Уа1 Ьуз 31и РНе С1у Азр А1а С1у
50 55 60
Тгр Туг ТНг Суз Н13 Ьуз (31у 31у С1и Уа1 Ьеи Зег Н13 Зег Н15 Ьеи
65 70 75 80
Ъеи Ъеи Н13 Ъуз Ъуз С1и Азр С1у 11е Тгр Зег ТНг Азр 11е Ьеи Ьуз
85 90 95
АЗр С1п Ьуз С1и Зег Ьуз АЗП Ьуз ТНг РНе Ьеи Ьуз Суз С1и А1а Ьуз
100 105 но
Аз η Туг Зег 61у Агд РНе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТНг А1а 11е Зег ТНг
115 120 125
Азр Ъеи Ъуз РНе 5ег Уа1 Ъуз Зег Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго Агд
130 135 140
С1у Уа1 ТНг Суз С1у А1а А1а ТНг Ъеи Зег А1а 51и Агд Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
Азр Азр Агд С1и Туг Ъуз Ъуз Туг ТНг Уа1 С1и Суз С1п <31и С1у Зег
165 170 175
А1а Суз Рго А1а А1а С1и С1и Зег Ъеи Рго Не С1и 11е Уа1 Уа1 Азр
180 185 190
А1а Уа1 Н13 Ъуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азл Туг ТНг Зег С1у РНе РНе 11е
195 200 205
- 46 015338
Агд Азр 210 11е 11е Ьуз Рго Азр 215 Рго Рго Ьуз Азп Ьеи 220 □1п Ьеи Ьуз Рго
Ьеи Ьуз Азп Зег Агд С1п Уа1 61и Уа1 Вег Тгр 61и Туг РГО 61и ТЬг
225 230 235 240
Тгр Зег ТЬг Рго Н13 Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе Зег 11е 61п Уа1
245 250 255
61п 61у Ьуз Азп Ьуз Ьуз 61и Агд Ьуз Азр Агд Ьеи РЬе МеС Азр С1и
260 265 270
ТЬг Зег А1а ТЬг Уа1 ТЬг Суз Низ Ьуз Азр С1у 61 п 11е Агд Уа1 С1п
275 280 285
А1а Агд Азр Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег 61 и Тгр А1а Зег Уа1
290 295 300
Зег Суз Зег
305
<210> 33
<211> 302
<212> РКТ
<213> Зиз зсго£а
<400> 33
Не Тгр 61 и Ьеи С1и Ьуз АЗП Уа1 Туг Уа1 Уа1 61 и Ьеи Азр Тгр Туг
1 5 10 15
Рго Азп А1а Рго С1у 61 и МеЬ Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азп ТЬг Рго 61и
20 25 30
□111 Азр 61 у 11е ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр С1п Зег Зег С1и Уа1 Ьеи 61у
35 40 45
ТЬг С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не ΗΪ3 Уа1 Ьуз 61и РЬе С1у Азр А1а 61у
50 55 60
61п Туг ТЬг Суз Агд Ьуз С1у 61у А1а Уа1 Ьеи Зег □1п Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи ΗΪ8 Ьуз Ьуз □1и Азр 61у Не Тгр Зег ТЬг Азр 11е Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр е1п Ьуз С1и Рго Ьуз Азп Ьуз Зег РЬе Ьеи Ьуз Суз б1и А1а Ьуз
100 105 110
- 47 015338
Азп Туг Зег 115 01у Агд РЬе ТЬг Суз 120 Тгр Тгр Ьеи ТЬг А1а 125 Не 8ег ТЬг
Азр Ьеи Ьуз РЬе Зег ба1 Ьуз Зег Зег Агд 61у Зег ТЬг Азр Рго Агд
130 135 140
Й1у ба! ТЬг Суз 61 у ТЬг А1а ТЬг Ьеи Зег 61и Азр Ьеи 61у Б1и Туг
145 150 155 160
Ьуз Ьуз Туг Агд ба1 61и Суз 61п 61и Й1у Зег А1а Суз Рго А1а А1а
165 170 175
31и С1и Зег Ьеи Рго Не С1и ба1 ба1 Ьеи <31и А1а ба1 Н1з Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не Агд Азр Не Не Ьуз
195 200 205
Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи 61п Ьеи Азп Рго Ьеи Ьуз Азп Зег Агд
210 215 220
Н1з ба1 С1и 11е Зег Тгр 61и Туг Рго Азр ТЬг Тгр Зег ТЬг Рго Η1Ξ
225 230 235 240
Зег Туг РЬе Зег Ьеи Мер РЬе 61у ба1 С1п ба! 61п 61у Ьуз Азп Ьуз
245 250 255
Агд 61и Ьуз Ьуз Азр Ьуз Ьеи РЬе ТЬг Азр 61п Не Зег А1а Ьуз ба1
260 265 270
ТЬг Суз Н13 Ьуз Азр А1а Азп 11е Агд ба1 С1п А1а Агд Азр Агд Туг
275 280 285
Туг Зег Зег Зег Тгр Зег 61и Тгр А1а Зег ба! Зег Суз Азп
290 295 300
<210>34 <211>305 <212> РКТ <213> Воз Ъаигиз <400>34
Мер Тгр 61и Ьеи 61и Ьуз Азп ба1 Туг ба! ба1
1510
С1и Ьеи Азр Тгр Туг
- 48 015338
Рго Азр А1а Рго С1у 20 61и ТЬг Уа1 Уа1 25 Ьей ТЬг Суз Азр ТЬг 30 Рго С1и
С1и Азр 61у 11е ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр С1п Зег Зег 61и Уа1 Ьей 61 у
35 40 45
Зег 61 у Ьуз ТЬг Ьей ТЬг 11е 61п Уа1 Ьуз С1и РЬе 61у Азр А1а 61у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Н15 Ьуз 61 у 61у 61и А1а Ьей Зег Агд Зег Ьей Ьей
65 70 75 80
Ьей Ьей Н1з Ьуз Ьуз 61и Азр 61у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ьей Ьуз
85 90 95
Аар 61 η Ьуз 61и Рго Ьуз А1а Ьуз Зег РЬе Ьей Ьуз Суз С1и А1а Ьуз
100 105 НО
Аар Туг Зег 61у Н13 РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьей ТЬг А1а 11е Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьей Ьуз РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд □1у Зег Зег Азр Рго Агд
130 135 140
61у Уа1 ТЬг Суз 61 у А1а А1а Ъеи Ьеи Зег А1 а 61и Ьуз Уа1 Зег Ьей
145 150 155 160
С1и Н13 Агд 6111 Туг Азп Ьуз Туг ТЬг Уа1 С1и Суз 61п 61и 61у Зег
185 170 175
А1а Суз Рго А1а А1а 61и □1и Зег Ьей Ьей 11е С1и Уа1 Уа1 Уа1 6111
180 185 190
А1а 7а1 Н13 Ьуз Ьей Ьуз Туг 61и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не
195 200 205
Агд Азр Не 11е Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьей 61п Ьей Агд Рго
210 215 220
Ьей Ьуз АЗП Зег Агд 61п Уа1 61и Уа1 Зег Тгр 61и Туг Рго Азр ТЬг
225 230 235 240
Тгр Зег ТЬг Рго Н1з Зег Туг РЬе Зег Ьей ТЫ РЬе Суз Уа1 61п Уа1
245 250 255
- 49 015338
61п 61у Ьуз Азп Ьуз Агд С1и Ьуз Ьуз Ьеи РЬе МеЬ Азр <31п ТЬг Зег
260 265 270
А1а Ьуз Уа1 ТЬг Суз Нгз Ьуз Азр А1а Азп Уа1 Агд Уа1 61п А1а Агд
275 260 285
Азр Агд Туг Туг Зег Зег РЬе Тгр Зег 61и Тгр А1а Зег Уа1 Зег Суз
290 295 300
Зег
305 <210>35 <211>305 <212> РЯТ <213> ВиЬа1из ЬиЬа11з <400>35
11е 1 Тгр С1и Ьеи С1и 5 Ьуз Азп Уа1 Туг 11е 10 Уа1 61и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азр А1а Рго С1у С1и ТЬг Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго С1и
20 25 30
С1и Азр 61у Не ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр С1п Зег Зег б!и Уа1 Ьеи С1у
35 40 45
Зег 61у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не С1п Уа1 Ьуз С1и РЬе С1у Азр А1а С1у
50 55 60
61п Туг ТЬг Суз Н13 Ьуз Б1у 61у 61и А1а Ьеи Зег Агд Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Н13 Ьуз Ьуз 61и Азр 61у 11е Тгр Зег ТЬг Азр Не Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз С1и Рго Ьуз А1а Ьуз Зег РЬе Ьеи Ьуз Суз 61и А1а Ьуз
100 105 но
Азр Туг Зег С1у Н15 РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг А1а Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи Ьуз РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег Зег Агд С1у Зег А1а Азр Рго Агд
130 135 140
61у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а Зег Ьеи Зег А1а С1и Ьуз Уа1 Зег Уа1
145 150 155 160
- 50 015338
Азр Н13 Агд 61и Туг Азп 165 Ьуз Туг ТЬг Уа1 170 61и Суз 61п 61и 61у 175 Зег
ТЬг Суз Рго А1а А1а 61и 61и Зег Ьеи Ьеи Не 61и Уа1 Уа1 Уа1 С1и
180 185 190
А1а Уа1 Н13 Ьуз Ьеи Ьуз Туг 61 и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не
195 200 205
Агд Азр 11е Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго
210 215 220
Ьеи Ьуз Азп Зег Агд 61п Уа1 61и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг
225 230 235 240
Тгр Зег ТЬг Рго Н1з Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе Суз Уа1 51п Уа1
245 250 255
С1п С1у Ьуз Азп Ьуз Агд 61и Ьуз Ьуз Ьеи РЬе Меб Азр С1п ТЬг Зег
260 265 270
А1а Ьуз Уа1 ТЬг Суз Н13 Ьуз Азр А1а Азп Уа1 Агд Уа1 61п А1а Агд
275 280 285
Азр Агд Туг Туг Зег Зег РЬе тгр Зег 61и Тгр А1а Зег Уа1 Зег Суз
290 295 300
Зег
305
<210> 36
<211> 305
<212> РВТ
<213> Сарга Ь1гсиз
<400> 36
11е Тгр С1и Ьеи 61 и Ьуз Азп Уа1 Туг Уа1 Уа1 61и Ьеи Азр Тгр Туг
1 5 10 15
Рго Азп А1а Рго 61 у 61и ТЬг Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго б1и
20 25 30
Й1и Азр С1у 11е ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр 61п Зег Зег С1и Уа1 Ьеи <31у
35 40 45
- 51 015338
Зег СЪу 50 Ъуз ТЬг Ъеи ТЬг Не 55 СЪп УаЪ Ъуз СЪи РЬе 60 СЪу Азр АЪа 01 у
01 η Туг ТЬг Суз Н13 Ъуз 01 у СЪу СЪи Уа1 Ъеи Зег Агд Зег Ъеи Ъеи
65 70 75 80
Ъеи Ъеи Н13 Ъуз Ьуз СЪи Азр СЪу Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ъеи Ъуз
85 90 95
Азр СЪп Ъуз СЪи Рго Ъуз АЪа Ъуз Зег РЬе Ъеи Ъуз Суз СЪи А1а Ъуз
100 105 110
Азр Туг Зег СЪу Н13 РЬе ТЬг Суз Зег Тгр Ъеи ТЬг АЪа 11е Зег ТЬг
115 120 125
Азп Ъеи Ъуз РЬе Зег Уа1 Ъуз Зег Зег Агд 01 у Зег Зег Азр Рго Агд
130 135 140
01у УаЪ ТЬг Суз С1у АЪа АЪа Зег Ъеи Зег АЪа СЪи Ъуз УаЪ Зег МеЪ
145 150 155 160
Д ч-п Н1 з А г гт 01и Туг Азп т.уз Туг ТЬг Уа1 01 и Схлч 01п С1и 01 у Зег
- * -- Ζ? - 1 — - у — “Л “
165 170 175
АЪа Суз Рго АЪа А1а СЪи СЪи Зег Ъеи Рго Не СЪи Уа1 Уа1 МеЪ СЪи
180 185 190
АЪа УаЪ Н13 Ъуз Ъеи Ъуз Туг СЪи Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе Не
195 200 205
Агд Азр Не Не Ъуз Рго Азр Рго Рго Ъуз Азп Ъеи С1п Ъеи Агд Рго
210 215 220
Ъеи Ъуз Азп Зег Агд СЪп УаЪ СЪи УаЪ Зег Тгр СЪи Туг Рго Азр ТЬг
225 230 235 240
Тгр Зег ТЬг Рго Н13 Зег Туг РЬе Зег Ъеи ТЬг РЬе Суз УаЪ СЪп 7а1
245 250 255
С1п СЪу Ъуз Азп Ъуз Агд СЪи Ъуз Ъуз Ъеи РЬе ТЬг Азр СЪп ТЬг Зег
260 265 270
А1а Ъуз УаЪ ТЬг Суз Н13 Ъуз Азр АЪа Азп Не Агд УаЪ СЪп АЪа Агд
275 280 285
- 52 015338
Азр Агд Туг Туг Зег Зег РЬе Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Зег Суз
290 295300
Зег
305 <210>37 <211>305 <212> РВТ <213> 0νΐ3 агхез <400> 37
11е Тгр 1 <31и Ьеи С1и 5 Ьуз Азп Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 61и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
Рго Азп А1а Рго 61у 61и ТЬг УаЬ Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго О1и
20 25 30
С1и Азр С1у Не ТЬг Тгр ТЬг Бег Азр С1п Бег Зег 61и Уа1 Ьеи 61у
35 40 45
5ег 61у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг 11е 61п УаЬ Ьуз С1и РЬе С1у Азр А1а 61у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Низ Ьуз 61 у 61 у 61и Уа1 Ьеи Зег Агд Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Низ Ьуз Ьуз 61и Азр С1у Не Т-гр Зег ТЬг Азр 11е Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз С1и Рго Ьуз А1а Ьуз Зег РЬе Ьеи Ьуз Суз 61и А1а Ьуз
100 105 НО
Азр Туг Зег 61 у Низ РЬе ТЬг Суз Зег Тгр Ьеи ТЬг А1а Не Зег ТЬг
115 120 125
Азп Ьеи Ьуз РЬе Зег Уа1 Ьуз Бег Зег Агд 61у Зег Зег Азр Рго Агд
130 135 140
С1у Уа1 ТЬг Суз 61у А1а А1а Зег Ьеи Зег А1а 61и Ьуз Уа1 Зег МеЬ
145 150 155 160
Азр Низ Агд 61и Туг Азп Ьуз Туг ТЬг УаЬ 61и Суз 61п 61и 61у Бег
165 170 175
А1а Суз Рго А1а А1а 61 и 61и Зег Ьеи Рго Не 61и Уа1 Уа1 МеС 61и
180 185 190
- 53 015338
А1а Уа1 НЪз 195 Ъуз Ъеи Ъуз Туг С1и 200 Азп Туг ТЬг Зег Зег 205 РЬе РЬе Не
Агд Азр 11е 11е Ъуз Рго Азр Рго Рго Ъуз Азп Ъеи С1п Ъеи Агд Рго
210 215 220
Ъеи Ъуз Азп Зег Агд 01п УаЪ С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг
225 230 235 240
Тгр Зег ТЬг Рго НЪз Зег Туг РЬе Зег Ъеи ТЬг РЬе Суз Уа1 С1п Уа1
245 250 255
С1п 61у Ъуз Азп Ъуз Агд С1и Ъуз Ъуз Ъеи РЬе А1а Азр С1п ТЬг Зег
260 265 270
А1а Ъуз ν&1 ТЬг Суз Н13 Ъуз Азр А1а Азп 11е Агд Уа1 С1п А1а Агд
275 280 285
Азр Агд Туг Туг Зег Зег РЬе Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег Уа1 Зег Суз
290 295 300
Зег
305 <210> 38 <211> 305 <212> РКТ <213> Οβϋνυδ еЪарйиз
<400> 38
11е Тгр (Ли Ъеи (Ии Ъуз Азп Уа1 Туг Уа1 Уа1 С1и Ъеи Азр Тгр Туг
1 5 10 15
Рго Азр А1а Рго С1у С1и ТЬг Уа1 Уа1 Ъеи Агд Суз Азр ТЬг Рго (Ли
20 25 30
(Ли Азр С1у 11е ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр С1п Зег Зег (Ли Уа1 Ъеи С1у
35 40 45
Зег С1у Ъуз ТЬг Ъеи ТЬг νβΐ С1п Уа1 Ъуз С1и РЬе С1у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз НЪз Ъуз (Лу (Лу С1и Уа1 Ъеи Зег Агд Зег Ъеи Ъеи
65 70 75 80
- 54 015338
Ьеи Ьеи Нхз Ьуз Ьуз 51и Азр 85 <31у 11е Тгр 90 Зег ТЬг Азр Не Ьеи 95 Ьуз
Азр 61п Ьуз С1и Рго Ьуз А1а Ьуз Зег РЬе Ьеи Ьуз Суз С1и АЬа Ьуз
100 105 110
Азр Туг Зег С1у Н1з РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг А1а Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи Ьуз РЬе Зег 7а1 Ьуз Зег Зег Агд 51 у Зег Зег Азр Рго Агд
130 135 140
61у Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а Зег Ьеи Зег ТЬг С1и Ьуз 7а1 11е Уа1
145 150 155 160
Азр Н1з Агд С1и Туг Ьуз Ьуз Туг ТЬг Уа1 С1и Суз 51п С1и С1у Зег
165 170 175
А1а Суз Рго А1а А1а 51и С1и Зег Ьеи Рго 11е С1и Уа1 Уа1 Уа1 51и
180 185 190
А1а Уа1 Н13 Ьуз Ьеи Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе РЬе 11е
195 200 205
Агд Азр 11е 11е Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Агд Рго
210 215 220
Ьеи Ьуз Азь Зег Агд С1п УаЬ С1и Уа1 Зег Тгр 51и Туг Рго Азр ТЬг
225 230 235 240
Тгр Зег ТЬг Рго Нхз Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬх РЬе Суз Уа1 С1п Уа1
245 250 255
С1П С1у Ьуз Азп Ьуз Агд С1и Ьуз Ьуз Ьеи РЬе Мек Азр С1п ТЬг Зег
260 265 270
А1а Ьуз Уа1 ТЬг Суз Нхз Ьуз Азр А1а Зег 11е Агд Уа1 61п А1а Агд
275 280 285
Азр Агд Туг Туг Азп Зег РЬе Тгр Зег б!и Тгр А1а Зег Уа1 Зег Суз
290 295 300
Зег
305 <210> 39
- 55 015338 <211> 305 <212> РКТ <213> МезосгхсеЬиз аигаЬиз <400> 39
11е Тгр С1и Ъеи С1и Ъуз Азр Уа1 Туг Уа1 10 Уа1 61и Уа1 Азр Тгр 15 Зег
1 5
Рго Азр А1а А1а 61 у 61и Агд Уа1 Уа1 Ъеи ТЬг Суз Азр ТЬг Зег С1и
20 25 30
61 и Азр Азр 11е Не Тгр ТЬг 5ег Азр Ъуз Азп Зег 61и А1а Уа1 61 у
35 40 45
Зег 61 у Ъуз ТЬг Ъеи ТЬг Не 61п Уа1 Ъуз 61и РЬе Зег Азп А1а С1у
50 55 60
61 η Туг ТЬг Суз ΗΪ3 Ъуз С1у 61у Ъуз ТЬг Ъеи Зег Н1з Зег Агд Ъеи
65 70 75 80
Ъеи Ъеи ΗΪ3 Ъуз Ъуз 61и Азп 61 у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ъеи Ъуз
85 90 95
Азр 61п Ъуз Азр Рго Ъуз Азп Ъуз ТЬг РЬе Ъеи Ъуз Суз С1и А1а А1а
100 105 НО
Азп Туг 5ег 61у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ъеи ТЫ А1а Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ъеи Ъуз РЬе Азп Уа1 Ъуз Зег Зег Зег Зег Зег Зег Азр Зег Агд
130 135 140
А1а Уа1 ТЬг Суз 61у А1а А1а Зег Ъеи Зег А1а 61и Ъуз Уа1 ТЫ Уа1
145 150 155 160
Азр Агд Ъуз Азр Туг 61п Ъуз Туг Зег Уа1 А1а Суз С1п С1и Азр 11е
165 170 175
ТЬг Суз Рго ТЬг А1а 61и С1и ТЬг Ъеи Рго Не 61у Ъеи Уа1 МеЬ 61и
180 185 190
А1а 61п Н13 Ъуз Туг Ъуз Туг С1и Азп Туг Зег ТЬг 61 у РЬе РЬе 11е
195 200 205
Агд Азр Не Не Ъуз Рго Азр Рго Рго Ъуз Азп Ъеи 61п Ъеи Ъуз Рго
210 215 220
- 56 015338
Ьеи Агд СХу Зег С1п 225 Не С 230 С1и Ьеи Зег Тгр С1и 235 Туг Рго Азр Зег Тгр 24 0
Зег ТЬг Рго Нйз Зег Туг РЬе Зег Ьеи Ьуз РЬе НХз УаХ С1п Уа1 Н1з
245 250 255
Агд Ьуз Агд С1и Агд Ьуз Азр СХи Зег СХп РЬе Уа1 АЗр Ьуз ТЬг Зег
260 265 270
АХа ТЬг Не Агд Суз Зег Ьуз СХу АХа С1и УаХ Агд Уа1 Агд А1а СХп
275 280 235
Азр ΗΪ3 Туг Туг Азп 5ег Зег Тгр Зег Агд Тгр УаХ Зег УаХ Рго Суз
290 295 300
Зег
305
<210> 40
<211> 310
<212> РЕТ
<213> рогсе11из
<400> 40
Мек Тгр СХи Ьеи Ьуз Ьуз Азр УаХ Туг УаХ УаХ СХи Ьеи Авр Тгр ΗΪ5
1 5 10 15
ТЬг Азр А1а РГО СХу СХи ТЬг Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Суз Азп ТЬг А1а СХи
20 25 30
СХи Азр СХу Не ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр Агд Ьуз Зег Азр 1Хе Ьеи С1у
35 40 45
Зег СХу Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не СХп УаХ Ьуз СХи РЬе СХи Азр А1а С1у
50 55 60
С1у Туг ТЬг Суз низ Ьуз С1у С1у СХи УаХ Ьеи Зег Агд 5ег СХп Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Н1з Ьуз Ьуз СХи Азр СХи Не Тгр Зег ТЬг Азр 1Хе Ьеи Ьуз
85 90 95
С1и СХп Ьуз СХу Зег Азп СХу Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Ьуз Суз СХи АХа Агд
100 105 но
- 57 015338
Зег Туг Зег 115 61у Агд РНе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи 120 ТЬг А1а РНе 125 61у ТНг
Азр Уа1 Ьуз РПе Зег Уа1 Ьуз С1у Зег Агд С1у Зег Зег Азр Рго Зег
130 135 140
21 у Уа1 ТНг Суз С1у С1и А1а □1и Агд Уа1 5ег 61 у Азр Азп С1п 61и
145 150 155 160
Туг Ьуз Туг Зег Уа1 С1и Суз 21п С1и Азр Зег А1а Суз Рго ТЬг А1а
165 170 175
21и С1и Зег Ьеи Рго 11е С1и Уа1 Уа1 Уа1 Азр А1а Не Н1з Ьув РЬе
180 185 190
Ьуз Туг 21и Азп Туг ТЬг Зег Зег РЬе Туг 11е Агд Азр 11е 11е Ьуз
195 200 205
Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи 21п Ьеи Ьуз Рго Зег Уа1 Азп Зег 61п
210 215 220
С1п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1и Туг Рго Азр ТЬг Тгр Зег ТЬг Рго Н1з
225 230 235 240
Зег Туг РНе Зег Ьеи ТНг РЬе Ьеи Уа1 С1п ТЬг ΗΪ3 С1у Ьуз Азп Ьуз
245 250 255
АЗП. Агд Агд С1и Ьуз Ьуз Туг 21и ьеи РЬе ТЬг АЗр Ьуз ТЬг Зег А1а
2 60 265 270
ТНг Уа1 Зег Суз Н1з Ьуз 11е 5ег Ьуз Уа1 21и Уа1 Агд А1а Агд Азр
275 280 285
Агд Туг Туг Зег Зег Зег Тгр Зег 61и Тгр А1а Зег Уа1 Зег Суз Зег
290 295 300
21 и Уа1 Зег Уа1 Зег Агд
305 310
<210>41 <211>305 <212> РКТ <213> Згдтобоп Ызрхйиз <400>41
11е Тгр 21и Ьеи С1и Ьуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 61и Уа1 Азр Тгр 5ег
1015
- 58 015338
Его 01у А1а Его 20 С1у О1и Агд Уа1 Уа1 25 Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг 30 Зег С1и
С1и Азр Азр 11е Не Тгр ТЬг Зег Азр 01п Зег Зег О1и Уа1 Уа1 С1у
35 40 45
Зег 01 у Ьуз ТЬг Ьеи 11е Уа1 С1п 7а1 Ьуз С1и РЬе Зег Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Низ Ьуз С1у С1у С1и ТЬг Ьеи Зег Низ Зег Агд Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи Н13 Ьуз Ьуз С1и Азр С1у Не Тгр Зег ТЬг Азр Не Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр О1п Ьуз Азр Рго Ьуз Азп Ьуз ТЬг ЕЬе Ьеи Ьуз Суз С1и А1а А1а
100 105 НО
Азп Туг Зег 01 у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг А1а Уа1 Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи Ьуз РЬе Зег Ьеи Ьуз Зег Зег Зег Зег Зег Зег Азр Зег Агд
130 135 140
Зег Уа1 ТЬг Суз С1у А1а А1а Зег Ьеи Зег ТЬг С1и Ьуз Уа1 ТЬг 7а1
145 150 155 160
Азр С1п Агд Азр Туг Азп Ьуз Туг Зег Уа1 А1а Суз 01п О1и Азр Не
165 170 175
ТЬг Суз Его ТЬг А1а С1и С1и ТЬг Ьеи Его Не С1и Ьеи Уа1 Мек 01и
180 185 190
А1а 01 η Низ Ьуз Туг Ьуз Туг О1и Азп Туг Зег ТЬг (31у РЬе РЬе Не
195 200 205
Агд Азр Не Не Ьуз Его Азр Его Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго
210 215 220
Ьеи Ьуз Зег Зег С1п Уа1 01и Уа1 Зег Тгр 61и Туг Рго Азр Зег Тгр
225 230 235 240
Зег ТЬг Его Н1з Зег Туг РЬе Зег Ьеи Ьуз РЬе РЬе Уа1 01 п Уа1 Туг
245 250 255
- 59 015338
Агд Ьуз Ъуз 61и Ьуз 260 Ьуз С1у С1и Зег Ьеи 265 Ьеи Уа1 Азр Ьуз 270 Рго Зег
А1а Ьуз 11е Агд Суз Зег Ьуз С1у С1у С1и Уа1 Агд Уа1 Агд А1а 61п
275 280 285
Азр Н13 Туг Туг Азп Зег Зег Тгр Зег 61и Тгр А1а Зег Уа1 Зег Суз
290 295 300
Азп
305
<210> 42
<211> 313
<212> РКТ
<213> КаЬЬиз по^едхсиз
<400> 42
МеИ Тгр С1и Ьеи С1и Ьуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 61и Уа1 Азр Тгр Агд
1 5 10 15
Рго Азр А1а Рго О1у 61и ТЬг Уа1 ТЬг Ьеи ТЬг Суз Азр Зег Рго 61и
20 25 30
С1и Азр Азр Не ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр 61п Агд Агд С1у Уа1 Не 61у
35 40 45
Зег 61 у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не ТЬг Уа1 Агд 61 и РЬе Ьеи Азр А1а 61у
50 55 60
61п Туг ТЬг Суз Н1з Агд 01у С1у С1и ТЬг Ьеи Зег Н13 Зег Н1з Ьеи
65 70 75 80
Беп Ьеи Н13 Ьуз Ьуз С1и Азп б1у Не Тгр Зег ТЬг С1и Не Ьеи Ьуз
85 90 95
Азп РЬе Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Ьуз Суз 61и А1а Рго Азп Туг Зег
100 105 НО
(31у Агд РЬе ТЬг Суз Зег Тгр Ьеи Уа1 Н1з Агд Азп ТЬг Азр Ьеи Ьуз
115 120 125
РЬе Азп Не Ьуз Зег Зег Зег Зег Зег Рго С1и Зег Агд А1а Уа1 ТЬг
130 135 140
- 60 015338
Суз 145 С1у Агд А1а Зег Ьеи 150 Зег А1а 01 и Ьуз 57а 1 155 ТЬг Ьеи Азп С1п Агд 160
Азр Туг С1и Ьуз Туг Зег Уа1 А1а Суз С1п 61и Азр Уа1 ТЬг Суз Рго
165 170 175
ТЬг А1а 01и С1и ТЬг Ьеи Рго Не С1и Ьеи Уа1 Уа1 01и А1а С1п 61п
180 185 190
С1п Азп Ьуз Туг О1и Азп Туг Зег ТЬг Зег РЬе РЬе Не Агд Азр Не
195 200 205
Не Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Уа1 Ьуз Рго Ьеи Ьуз Азп
210 215 220
Зег С1п Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр О1и Туг Рго Азр Зег Тгр Зег ТЬг Рго
225 230 235 240
Н13 Зег Туг РЬе Зег Ьеи Ьуз РЬе РЬе Уа1 Агд Не 01п Агд Ьуз Ьуз
245 250 255
01и Ьуз ТЬг Ьуз О1и ТЬг 01и 01и С1и Суз Азп 01п Ьуз 01у А1а РЬе
260 265 270
Ьеи 7а1 01 и Ьуз ТЬг Зег А1а 01 и 7а1 О1п Суз Ьуз 01 у А1а Азп Не
275 280 285
Суз Уа1 С1п А1а С1п Азр Агд Туг туг Азп Зег Зег Суз Зег Ьуз Тгр
290 295 300
ТЬг Суз Уа1 Рго Суз Агд 01 у Агд Зег
305 310
<210> 43
<211> 313
<212> РЙТ
<213> 1 Миз тизсиЬиз
<400> 43
МеЬ Тгр С1и Ьеи С1и Ьуз Азр Уа1 Туг Уа1 Уа1 С1и Уа1 Азр Тгр ТЬг
1 5 10 15
Рго Азр А1а Рго 01 у 01 и ТЬг 7а1 Азп Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго 01 и
20 25 30
С1и Азр Азр Не ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр С1п Агд Н1з С1 у Уа1 Не 01у
35 40 45
- 61 015338
Зег С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг 11е ТЬг Уа1 55 Ьуз 61и РЬе 60 Ьеи Азр А1а 61у
50
61п Туг ТЬг Суз Нхз Ьуз 61 у 61 у 61 и ТЫ Ьеи Зег Η15 5ег Н1з Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьуз Ьуз 61и Азп 61у Не Тгр Зег ТЬг 61и Не Ьеи Ьуз
85 90 95
Азп РЬе Ьуз Азп Ьуз ТЬг РЬе Ьеи Ьуз Суз 61и А1а Рго Азп Туг Зег
100 105 110
61у Агд РЬе ТЬг Суз Зег Тгр Ьеи Уа1 61п Агд Азп Мек Азр Ьеи Ьуз
115 120 125
РЬе Азп 11е Ьуз Зег Зег Зег Зег Зег Рго Азр Зег Агд А1а Уа1 ТЬг
130 135 140
Суз 61у Меи А1а Зег Ьеи Зег А1а 61и Ьуз Уа1 ТЬг Ьеи Азр 61п Агд
145 150 155 160
Азр Туг 61и Ьуз Туг Зег Уа1 Зег Суз 61 п 61и Азр Уа1 ТЬг Суз Рго
165 170 175
ТЬг А1а 61и 61и ТЬг Ьеи Рго Не 61и Ьеи А1а Ьеи 61и А1а Агд 61п
180 185 190
61п Азп Ьуз Туг 61и Азп Туг Зег ТЬг Зег РЬе РЬе 11е Агд Азр Не
195 200 205
11е Ьуз Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи 61п МеЬ Ьуз Рго Ьеи Ьуз Азп
210 215 220
Зег 61п Уа1 31и Уа1 Зег Тгр 61и Туг Рго Азр Зег Тгр Зег ТЬг Рго
225 230 235 240
Н1з Зег Туг РЬе Зег Ьеи Ьуз РЬе РЬе Уа1 Агд 11е 61п Агд Ьуз Ьуз
245 250 255
61и Ьуз Ме-Ь Ьуз С1и ТЬг С1и 61и □1у Суз Азп 61п Ьуз 61у А1а РЬе
260 265 270
Ьеи Уа1 61 и Ьуз ТЬг Зег ТЬг 61и Уа1 61п Суз Ьуз 61у 61у Азп Уа1
275 280 285
- 62 015338
Суз ба1 С1п А1а С1п Азр Агд Туг Туг Азп Зег Зег Суз Зег Ьуз Тгр
290 295 300
А1а Суз ба! Рго Суз Агд ба1 Агд Зег
305 310
<210> 44 <211> 302 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая: зрелый 1Ь-12р40, имеющий мутации вне области ЬЗ <400 44
Не 1 Тгр О1и Ьеи Ьуз 5 Ьуз Азр ба! Туг ба1 10 ба1 С1и Ьеи Азр Тгр 15 Туг
Рго АЗП А1а Рго С1у С1и ТЬг ба! ба! Ьеи ТЬг Суз Азр ТЬг Рго Й1и
20 25 30
61и Азр С1у Не ТЬг Тгр ТЬг Зег Азр С1п Зег Зег 51и ба1 Ьеи С1у
35 40 45
ТЬг С1у Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Не Н13 ба1 ьуз С1и РЬе С1у Азр А1а С1у
50 55 60
С1п Туг ТЬг Суз Агд Ьуз С1у С1у Й1и А1а Ьеи Зег Агд Зег Ьеи Ьеи
65 70 75 00
Ьеи Ьеи Н13 Ьуз Ьуз С1и Азр С1у Не Тгр Зег ТЬг Азр 11е Ьеи Ьуз
85 90 95
Азр С1п Ьуз С1 и Рго Ьуз Азп Ьуз Зег РЬе Ьеи Ьуз Суз 61и А1а ьуз
100 105 110
Азп Туг Зег Й1у Агд РЬе ТЬг Суз Тгр Тгр Ьеи ТЬг ТЬг Не Зег ТЬг
115 120 125
Азр Ьеи Ьуз РЬе Зег ба1 Ьуз Вег Зег Агд С1у Зег ТЬг Азр Рго Агд
130 135 140
61у ба! ТЬг Суз С1у ТЬг А1а ТЬг Ьеи Зег С1и Азр Ьеи С1у С1и Туг
145 150 155 160
Ьуз ьуз туг Агд ба! С1и Суз С1п С1и 61у Зег А! а Суз Рго А! а А1а
165 170 175
- 63 015338
С31и (31и Зег Ьеи 180 Рго Не С1и Уа1 Уа1 185 Ьеи С1'д Αία Уа1 Н13 190 Ьуз Ьеи
Ьуз Туг С1и Азп Туг ТЬг Зег Бег РЬе РЬе 11е Агд Азр Не Не Ьуз
195 200 205
Рго Азр Рго Рго Ьуз Азп Ьеи С1п Ьеи Ьуз Рго Ьеи Ьуз Азп Зег Агд
210 215 220
Н13 Уа1 С1и Уа1 Зег Тгр С1у Туг Рго Авр ТЬг Тгр Бег ТЬг Рго Н1з
225 230 235 240
Зег Туг РЬе Зег Ьеи ТЬг РЬе Суз Не С51п Уа1 С1п Й1у Ьуз Бег Ьуз
245 250 255
Агд 61и Ьуз Ьуз Азр Агд Не РЬе ТЬг Азр Ьуз ТЬг Бег А1 а ТЬг Уа1
260 265 270
11е Суз Агд Ьуз Азп А1а Ьуз Не Агд Уа1 С1п А1а Агд Азр Агд Туг
275 280 285
Туг Бег Зег РЬе Тгр Зег 61и Тгр А1а Бег Уа1 Бег Суз Бег
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Вариант 03-домена р40-субъединицы ИЛ-12, который обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательности с 03-доменом р40-субъединицы человеческого ИЛ-12 дикого типа и содержит делецию или замену аминокислоты в трех или более положениях, соответствующих остаткам в положениях 258-266 исходной р40-субъединицы зрелого человеческого ИЛ-12, где этот вариант содержит замены по меньшей мере в положениях Ьуз260, 8ег 259 и Агд261.
  2. 2. Вариант по п.1, содержащий замены Бег259Азр, Ьуз260Азп и Агд261ТЬг.
  3. 3. Вариант по п.2, дополнительно содержащий замену Ьуз264О1у.
  4. 4. Вариант по п.3, где в нем дополнительно делетированы один или оба остатка Ьуз263 и Азр265.
  5. 5. Вариант по п.1 или 2, где делетированы один или более остатков, соответствующих Ьуз263, Ьуз264, Азр265 и Агд266.
  6. 6. Вариант по п.1 или 2, где он дополнительно содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из Ьуз263, Ьуз264, Азр265 и Агд266, причем соответствующие исходные остатки аминокислот заменены неосновными аминокислотами.
  7. 7. Вариант по п.1, где он дополнительно содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из Ьуз258, Ьуз263 и Ьуз264.
  8. 8. Вариант по п.7, содержащий замены Ьуз258О1п, Бег259Азр, Ьуз260О1п и Агд261Азр.
  9. 9. Вариант по п.8, где он дополнительно содержит замены Ьуз263Бег и Ьуз264О1у.
  10. 10. Вариант по п.1, содержащий:
    (ί) следующие замены: Бег259Азр, Ьуз260Азп и Агд261ТЬг, и (ίί) следующие делеции: Ьуз263, Ьуз264 и Азр265, где вышеуказанные положения относятся к немодифицированной молекуле дикого типа, за счет чего образуется отрезок последовательности Ьуз - Аар - Азп - ТЬг - 01и - Агд в положениях 258-263 этого варианта.
  11. 11. Вариант по п.1, содержащий:
    (ί) следующие замены: 8ег259Азр, Ьуз260Азп, Агд261ТЬг и Ьу8264С1у, и (ίί) следующие делеции: Ьуз263 и Азр265, где вышеуказанные положения относятся к немодифицированной молекуле дикого типа, за счет чего образуется отрезок последовательности Ьуз - Азр - Азп - ТЬг - 01и - С1у - Агд в положениях 258-264 этого варианта.
  12. 12. Вариант по п.1, где он содержит следующие замены: Ьуз258О1п, 8ег259Азр, Ьуз260С1п, Агд261Азр, за счет чего образуется отрезок последовательности 01п - Азр - 01п - Азр - 01и -Ьуз - Ьуз - Агд в положениях 258-265 этого варианта.
    - 64 015338
  13. 13. Вариант по п.1, содержащий следующие замены: Ьу8258С1п, §ег259Л§р, Ьу82б0С1п, Агд2б1А8р, Ьу82б38ег, Ьу8264С1у, за счет чего образуется отрезок последовательности: С1п - А8Р - С1п - А8Р - С1и - 8ег - С1у - Агд в положениях 258-265 этого варианта.
  14. 14. Белок ИЛ-12 или его фрагмент, содержащий вариант по любому из пп.1-13.
  15. 15. Белок ИЛ-23 или его фрагмент, содержащий вариант по любому из пп.1-13.
  16. 16. Слитый белок, содержащий вариант по любому из пп.1-13 или белок по п.14 или 15 и антитело или его активный участок.
  17. 17. Слитый белок по п.1б, где вышеуказанный вариант или вышеуказанный белок соединены с Сконцом вышеуказанного антитела или участка антитела.
  18. 18. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант по любому из пп.1-13, или белок по п.14 или 15, или слитый белок по п.1б или 17.
  19. 19. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.18.
  20. 20. Клетка-хозяин, продуцирующая вариант по любому из пп.1-13, или белок по п.14 или 15, или слитый белок по п.1б или 17, содержащая экспрессирующий вектор по п.19.
  21. 21. Фармацевтическая композиция, пригодная для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, запускаемых ИЛ-12 или ИЛ-23, и содержащая фармакологически эффективное количество белка или слитого белка по любому из пп.14-17, возможно совместно с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.
EA200870131A 2005-12-30 2006-12-20 ВАРИАНТЫ ИЛ-12p40 С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ EA015338B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75538205P 2005-12-30 2005-12-30
PCT/EP2006/012301 WO2007076933A1 (en) 2005-12-30 2006-12-20 Interleukin-12p40 variants with improved stability

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870131A1 EA200870131A1 (ru) 2008-12-30
EA015338B1 true EA015338B1 (ru) 2011-06-30

Family

ID=38049414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870131A EA015338B1 (ru) 2005-12-30 2006-12-20 ВАРИАНТЫ ИЛ-12p40 С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ

Country Status (18)

Country Link
US (3) US7872107B2 (ru)
EP (1) EP1966238B1 (ru)
JP (1) JP5175214B2 (ru)
KR (1) KR101343682B1 (ru)
CN (1) CN101351475B (ru)
AT (1) ATE555125T1 (ru)
AU (1) AU2006332138B2 (ru)
BR (1) BRPI0620648B1 (ru)
CA (1) CA2635618C (ru)
CY (1) CY1112884T1 (ru)
DK (1) DK1966238T3 (ru)
EA (1) EA015338B1 (ru)
ES (1) ES2384055T3 (ru)
PL (1) PL1966238T3 (ru)
PT (1) PT1966238E (ru)
SI (1) SI1966238T1 (ru)
WO (1) WO2007076933A1 (ru)
ZA (1) ZA200806611B (ru)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
KR20090010127A (ko) 2001-03-07 2009-01-28 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술
US6992174B2 (en) * 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
PL205352B1 (pl) 2001-05-03 2010-04-30 Merck Patent Gmbh Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu
RU2312677C9 (ru) 2001-12-04 2008-03-27 Мерк Патент Гмбх Иммуноцитокины с модулированной селективностью
AU2004309050B2 (en) 2003-12-30 2010-10-14 Merck Patent Gmbh IL-7 fusion proteins
BRPI0417916A (pt) * 2003-12-31 2007-04-10 Merck Patent Gmbh proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
ATE555125T1 (de) 2005-12-30 2012-05-15 Merck Patent Gmbh Interleukin-12p40-varianten mit verbesserter stabilität
US20100048482A1 (en) * 2008-08-15 2010-02-25 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for modulating epsilon protein kinase c-mediated cytoprotection
KR20110086101A (ko) * 2008-10-21 2011-07-27 메르크 파텐트 게엠베하 방사선 및 면역사이토카인으로의 암 치료
EA201171259A1 (ru) 2009-04-22 2012-05-30 Мерк Патент Гмбх Антительные гибридные белки с модифицированными сайтами связывания fcrn
NO2709651T3 (ru) * 2011-05-19 2018-03-03
WO2015124297A1 (en) * 2014-02-19 2015-08-27 Merck Patent Gmbh Cancer-targeted il-12 immunotherapy
JP7246930B2 (ja) 2016-05-18 2023-03-28 モデルナティエックス インコーポレイテッド インターロイキン－１２（ｉｌ１２）をコードするポリヌクレオチドおよびその使用
CN106533815B (zh) * 2017-01-13 2019-10-29 邦彦技术股份有限公司 基于能力特征的网关管控方法及装置
CN108574635B (zh) 2017-03-09 2021-06-22 华为技术有限公司 一种路由优先级配置方法、设备以及控制器
CN108623691B (zh) * 2017-03-17 2020-05-15 北京比洋生物技术有限公司 IgG样长效免疫融合蛋白及其应用
AU2018270111B2 (en) 2017-05-18 2022-07-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (IL12) polypeptides and uses thereof
EP3675892A4 (en) 2017-07-03 2021-10-06 Torque Therapeutics, Inc. IMMUNOSTIMULATORY FUSION MOLECULES AND THEIR USES
MA53822A (fr) * 2018-10-03 2021-08-11 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères d'il -12
CN110264184B (zh) * 2019-06-28 2021-07-23 Oppo（重庆）智能科技有限公司 支付控制方法及相关产品
US11851466B2 (en) 2019-10-03 2023-12-26 Xencor, Inc. Targeted IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
EP4277922A2 (en) * 2021-01-12 2023-11-22 Askgene Pharma, Inc. Chimeric molecules comprising il-12 agonist polypeptide
EP4373862A1 (en) * 2021-07-19 2024-05-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protease-mediated target specific cytokine delivery using fusion polypeptide
MX2024003275A (es) * 2021-09-17 2024-05-07 Bicara Therapeutics Inc Caix dirigido a proteínas de fusión de il-12 y métodos de uso de las mismas.
AU2022369312A1 (en) 2021-10-20 2024-05-02 Synthekine, Inc. Heterodimeric fc cytokines and uses thereof
WO2023242769A1 (en) * 2022-06-17 2023-12-21 Pfizer Inc. Il-12 variants, anti-pd1 antibodies, fusion proteins, and uses thereof
WO2024086739A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Synthekine, Inc. Methods and compositions of il12 muteins and il2 muteins
WO2024099445A1 (zh) * 2022-11-10 2024-05-16 康立泰生物医药(青岛)有限公司 聚乙二醇定点修饰异源聚体蛋白或多肽及其制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0433827B1 (en) * 1989-12-22 1998-03-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Cytotoxic lymphocyte maturation factor
WO1999029732A2 (en) * 1997-12-08 1999-06-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
WO2001018051A2 (en) * 1999-09-09 2001-03-15 Schering Corporation Mammalian interleukin-12 p40 and interleukin b30, combinations thereof, antibodies, uses in pharmaceutical compositions
WO2001040257A2 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Maxygen, Inc. Modified il-12 subunits and nucleic acids encoding them
JP2001161378A (ja) * 1999-10-01 2001-06-19 Toray Ind Inc タンパク質の高純度製造法、インターロイキン１２、インターロイキン１２の活性を阻害するタンパク質、哺乳動物の免疫疾病治療剤および免疫疾病治療方法

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US647717A (en) * 1897-12-17 1900-04-17 Guilford S Wood Rotary engine.
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ATE122238T1 (de) 1987-06-10 1995-05-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
ES2054753T3 (es) 1987-09-02 1994-08-16 Ciba Geigy Ag Conjugados de citoquinas con inmunoglobulinas.
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
CA1338518C (en) 1987-09-23 1996-08-13 Joyce M. Zarling Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells
PT88641B (pt) 1987-10-02 1993-04-30 Genentech Inc Metodo para a preparacao de uma variante de adesao
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
DE3812605A1 (de) 1988-04-15 1990-06-07 Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5196320A (en) 1989-09-20 1993-03-23 Abbott Biotech, Inc. Method of producing engineered binding proteins
CA2066612C (en) 1989-09-20 1998-12-08 Stephen D. Gillies Method of producing fusion proteins
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991013166A1 (en) 1990-03-02 1991-09-05 Abbott Biotech, Inc. Antibody constructs with enhanced binding affinity
CA2082804A1 (en) 1990-07-27 1992-01-28 Theodore Maione Methods and compositions for treatment of angiogenic diseases
EP0556328A4 (en) 1990-11-09 1994-06-08 Abbott Lab Bridging antibody fusion constructs
DK0574395T3 (da) 1990-11-09 2002-10-07 Stephen D Gillies Cytokin-immunkonjugater
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
WO1992010755A1 (en) 1990-12-05 1992-06-25 Novo Nordisk A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
US6797492B2 (en) 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1993003157A1 (en) 1991-07-29 1993-02-18 Dana Farber Cancer Institute Plasmids for the rapid preparation of modified proteins
ATE173763T1 (de) 1991-08-30 1998-12-15 Hutchinson Fred Cancer Res Hybride cytokine
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
DE69332485T2 (de) 1992-08-11 2003-11-13 The President And Fellows Of Harvard College, Cambridge Immunmodulierende peptide
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
AU6776194A (en) 1993-04-28 1994-11-21 Hybritech Incorporated Method for creating optimized regulatory regions affecting protein expression and protein trafficking
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
US5585098A (en) * 1993-11-23 1996-12-17 Ovimmune, Inc. Oral administration of chicken yolk immunoglobulins to lower somatic cell count in the milk of lactating ruminants
EP0659439B1 (en) 1993-12-24 2001-10-24 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6309636B1 (en) 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US6148321A (en) * 1995-05-05 2000-11-14 Intel Corporation Processor event recognition
AU5985996A (en) 1995-06-07 1997-01-15 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
WO1997020062A1 (en) 1995-12-01 1997-06-05 University Of Massachusetts Il-12 p40 subunit fusion polypeptides and uses thereof
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
WO1997030089A1 (en) 1996-02-13 1997-08-21 Regents Of The University Of California Novel antibody-cytokine fusion protein, and methods of making and using the same
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
JPH1187664A (ja) 1997-04-28 1999-03-30 Nippon Steel Corp 半導体装置及びその製造方法
AU736549B2 (en) 1997-05-21 2001-08-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method for the production of non-immunogenic proteins
CN1269805A (zh) 1997-07-14 2000-10-11 博尔德生物技术公司 生长激素和相关蛋白的衍生物
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
AU758860B2 (en) 1998-04-15 2003-04-03 Merck Patent Gmbh Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
BR9909677A (pt) 1998-04-17 2000-12-19 Lexigen Pharm Corp Intensificação de respostas imunológicas, mediadas por proteìna de fusão anticorpo-citocina, através de co-administração com inibidor de prostaglandinas
CA2328490A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Fused protein
ES2342239T3 (es) 1998-08-25 2010-07-02 Merck Patent Gmbh Expresion y exportacion de angiostatina y de endostatina como inmunofusinas.
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
DE69934967T2 (de) 1998-12-08 2007-12-06 Biovation Ltd. Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen
KR20020007287A (ko) 1999-01-07 2002-01-26 추후보정 Ｆｃ 융합 단백질로서 항-비만 단백질의 발현 및 이출
EP2278003B2 (en) 1999-04-09 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2372400C (en) 1999-05-19 2010-04-27 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Expression and export of interferon-alpha proteins as fc fusion proteins
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
CN1235911C (zh) 1999-08-09 2006-01-11 利思进药品公司 多细胞因子－抗体复合物
US20050202538A1 (en) 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
EP1294401B1 (en) 2000-06-29 2007-08-01 EMD Lexigen Research Center Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
CN1911965B (zh) 2001-01-17 2013-05-29 新兴产品开发西雅图有限公司 结合域-免疫球蛋白融合蛋白
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2435037A1 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Silke Schumacher Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
CN100522242C (zh) 2001-02-19 2009-08-05 默克专利有限公司 具有降低的免疫原性的人工蛋白质
ATE400030T1 (de) 2001-02-19 2008-07-15 Merck Patent Gmbh Methode zur identifizierung von t-zellepitopen und deren anwendung zur herstellung von molekülen mit reduzierter immunogenität
KR20090010127A (ko) 2001-03-07 2009-01-28 메르크 파텐트 게엠베하 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
PL205352B1 (pl) 2001-05-03 2010-04-30 Merck Patent Gmbh Rekombinowane przeciwciało specyficzne dla nowotworu
RU2312677C9 (ru) 2001-12-04 2008-03-27 Мерк Патент Гмбх Иммуноцитокины с модулированной селективностью
PL211180B1 (pl) 2002-12-17 2012-04-30 Merck Patent Gmbh Białko fuzyjne typu przeciwciało-IL2, wektor zawierający sekwencję kwasów nukleinowych kodujących takie białko, kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie białko fuzyjne oraz jego zastosowania do wytwarzania leków
US20050069521A1 (en) 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
AU2004309050B2 (en) 2003-12-30 2010-10-14 Merck Patent Gmbh IL-7 fusion proteins
BRPI0417916A (pt) 2003-12-31 2007-04-10 Merck Patent Gmbh proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada
PT1706428E (pt) 2004-01-22 2009-12-29 Merck Patent Gmbh Anticorpos anticancerígenos com fixação de complemento reduzida
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
DE602005020837D1 (de) 2004-12-09 2010-06-02 Merck Patent Gmbh Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität
ATE555125T1 (de) 2005-12-30 2012-05-15 Merck Patent Gmbh Interleukin-12p40-varianten mit verbesserter stabilität

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0433827B1 (en) * 1989-12-22 1998-03-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Cytotoxic lymphocyte maturation factor
WO1999029732A2 (en) * 1997-12-08 1999-06-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
WO2001018051A2 (en) * 1999-09-09 2001-03-15 Schering Corporation Mammalian interleukin-12 p40 and interleukin b30, combinations thereof, antibodies, uses in pharmaceutical compositions
JP2001161378A (ja) * 1999-10-01 2001-06-19 Toray Ind Inc タンパク質の高純度製造法、インターロイキン１２、インターロイキン１２の活性を阻害するタンパク質、哺乳動物の免疫疾病治療剤および免疫疾病治療方法
WO2001040257A2 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Maxygen, Inc. Modified il-12 subunits and nucleic acids encoding them

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE JPO Proteins [Online] 27 August 2002 (2002-08-27), "Process for producing highly pure protein, interleukin-12, protein inhibiting interleukin-12 activity, remedies for mammalian immunopathy and method of treating immunopathy." XP002435977 retrieved from EBI accession no. JPOP:BD507325 Database accession no. BD507325 the sequence & JP 2001 161378 A (TORAY INDUSTRIES) 19 June 2001 (2001-06-19) *
DATABASE UniProt [Online] 1 June 2003 (2003-06-01), "Interleukin-12 subunit beta precursor (IL-12B) (IL-12 subunit p40) (Cytotoxic lymphocyte maturation factor 40 kDa subunit) (CLMF p40)." XP002435979 retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q865W9 Database accession no. Q865W9 the sequence & ODBILEG R. ET AL.: "Cloning and sequence analysis of llama cytokines related to cell-mediated immunity" VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, AMSTERDAM, NL, vol. 102, no. 1-2, November 2004 (2004-11), pages 93-102, XP004586000 ISSN: 0165-2427 *
DATABASE UniProt [Online] 1 November 1999 (1999-11-01), "Interleukin-12 subunit beta precursor (IL-12B) (IL-12 subunit p40) (Cytotoxic lymphocyte maturation factor 40 kDa subunit) (CLMF p40)." XP002435978 retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q9XSQ5 Database accession no. Q9XSQ5 the sequence *
GEARING D P. ET AL.: "Homology of the p40 subunit of natural killer cell stimulatory factor (NKSF) with the extracellular domain of the interleukin-6 receptor [1]" CELL 1991 UNITED STATES, vol. 66, no. 1, 1991, pages 9-10, XP002435952 ISSN: 0092-8674 *
TRINCHIERI G. ET AL.: "NATURAL KILLER CELL STIMULATORY FACTOR (NKSF) OR INTERLEUKIN-12 IS A KEY REGULATOR OF IMMUNE RESPONSE AND INFLAMMATION" PROGRESS IN GROWTH FACTOR RESEARCH, PERGAMON PRESS, GB, vol. 4, no. 4, 1992, pages 355-368, XP000575698 ISSN: 0955-2235 *
WOLF S. F. ET AL: "CLONING OF CDNA FOR NATURAL KILLER CELL STIMULATORY FACTOR, A HETERODIMERIC CYTOKINE WITH MULTIPLE BIOLOGIC EFFECTS ON T AND NATURAL KILLER CELLS" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 146, no. 9, 1 May 1991 (1991-05-01), pages 3074-3081, XP000941940 ISSN: 0022-1767 *
YOON S. ET AL.: "Charged residues dominate a unique interlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12" EMBO JOURNAL 17 JUL 2000 UNITED KINGDOM, vol. 19, no. 14, 17 July 2000 (2000-07-17), pages 3530-3541, XP002435951 ISSN: 0261-4189 cited in the application *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0620648A2 (pt) 2011-11-22
US9029330B2 (en) 2015-05-12
KR101343682B1 (ko) 2013-12-20
BRPI0620648A8 (pt) 2019-01-15
CN101351475B (zh) 2013-05-15
SI1966238T1 (sl) 2012-08-31
DK1966238T3 (da) 2012-07-16
EP1966238A1 (en) 2008-09-10
ATE555125T1 (de) 2012-05-15
US7872107B2 (en) 2011-01-18
US20070154453A1 (en) 2007-07-05
US8188248B2 (en) 2012-05-29
CA2635618A1 (en) 2007-07-12
US20130034518A1 (en) 2013-02-07
KR20080090483A (ko) 2008-10-08
JP5175214B2 (ja) 2013-04-03
PL1966238T3 (pl) 2012-09-28
EP1966238B1 (en) 2012-04-25
PT1966238E (pt) 2012-07-31
JP2009521911A (ja) 2009-06-11
ZA200806611B (en) 2009-12-30
EA200870131A1 (ru) 2008-12-30
CA2635618C (en) 2015-10-06
CN101351475A (zh) 2009-01-21
CY1112884T1 (el) 2016-04-13
US20110097792A1 (en) 2011-04-28
ES2384055T3 (es) 2012-06-28
WO2007076933A1 (en) 2007-07-12
AU2006332138A1 (en) 2007-07-12
AU2006332138B2 (en) 2012-03-22
BRPI0620648B1 (pt) 2022-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015338B1 (ru) ВАРИАНТЫ ИЛ-12p40 С УЛУЧШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ
US20200270323A1 (en) Interleukin 15 fusion protein for tumor targeting therapy
Han et al. IL-15: IL-15 receptor alpha superagonist complex: high-level co-expression in recombinant mammalian cells, purification and characterization
US20200283498A1 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
CN101072793B (zh) 具有降低的免疫原性的il-7变体
WO2015103928A1 (zh) Il-15异源二聚体蛋白及其用途
KR20170094341A (ko) 인터류킨 15 단백질 복합체 및 그의 용도
AU2015301936A1 (en) Modified IL-2 variants that selectively activate regulatory T cells for the treatment of autoimmune diseases
JP2002515247A (ja) Ｉｌ−２の選択的アゴニスト及びアンタゴニスト
CN1745099A (zh) 修饰的可溶性t细胞受体
US20170368138A1 (en) Combination tumor treatment with an integrin-binding-fc fusion protein and immune modulator
KR19980702238A (ko) 인터루킨-15의 길항제
JP2014500868A (ja) 癌及び慢性感染の治療のための作動薬活性を有するｉｌ−２由来のポリペプチド
CN100503829C (zh) 白细胞介素-18突变体、其制品及应用
JP2002511432A (ja) 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強
US20240052016A1 (en) Human il-10 receptor alpha fusion proteins
US20240025956A1 (en) Il-2 mutant protein and medicine containing same
CN105111315A (zh) MIP3α-Fc融合蛋白及其用途
CN118063588A (zh) 一种重组融合蛋白及其应用
US20210008167A1 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
US20220089684A1 (en) Type 1 interferon neutralizing fc-fusion protein and use thereof
EP3564264B1 (en) Vaccine composition comprising a mutant of human interleukin-15
Luria-Pérez et al. Amino acid residues involved in the heparin-binding activity of murine IL-12 in the context of an antibody-cytokine fusion protein
AU2023269801A1 (en) Compositions comprising truncated interleukin-33 and interleukin-2
CN118620086A (zh) 一种治疗糖尿病的融合蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM