JP7246930B2 - インターロイキン－１２（ｉｌ１２）をコードするポリヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents

インターロイキン－１２（ｉｌ１２）をコードするポリヌクレオチドおよびその使用 Download PDF

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Description

本出願は、２０１６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，４８３号、および２０１７年１月７日に出願された第６２／４４３，６９３号に対する優先権の利益を主張し、そのそれぞれの全体が、本明細書に参考として援用される。
電子的に提出された配列表の参照
本出願とともに出願された、電子的に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表（名称：３５２９＿０３５ＰＣ０２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：３９０，２３１バイト、および作成日：２０１７年５月１６日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インターロイキン－１２（ＩＬ１２）は、自然免疫および獲得免疫において重要な役割を果たす炎症促進性サイトカインである。Ｇａｔｅｌｙ， ＭＫら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５～５２１頁（１９９８年）。ＩＬ１２は、主として、ｐ３５およびｐ４０というジスルフィド結合された２つのサブユニットからなる、７０ｋＤａのヘテロダイマータンパク質として機能する。ＩＬ１２ ｐ４０ホモダイマーが存在するが、ＩＬ１２受容体に結合するアンタゴニストとして機能する以外には、生物学的応答を媒介するとは考えられていない。（同書）。ＩＬ１２ ｐ４０サブユニット（ＮＭ＿００２１８７；Ｐ２９４６０；ＩＬ１２Ｂ、ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２とも称される）の前駆体形態は、３２８アミノ酸長であるが、その成熟形態は、３０６アミノ酸長である。ＩＬ１２ ｐ３５サブユニット（ＮＭ＿０００８８２；Ｐ２９４５９；ＩＬ１２Ａ、ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１とも称される）の前駆体形態は、２１９アミノ酸長であり、成熟形態は、１９７アミノ酸長である。（同書）。ＩＬ１２ ｐ３５およびｐ４０サブユニットの遺伝子は、異なる染色体に存在し、互いに独立して制御されている。Ｇａｔｅｌｙ， ＭＫら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５～５２１頁（１９９８年）。多数の異なる免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびＢ細胞）は、抗原刺激時にＩＬ１２を産生する。活性なＩＬ１２ヘテロダイマーは、タンパク質合成後に形成される。（同書）。
ＩＬ１２タンパク質は、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方を活性化するその能力に起因して、１９９４年以来、有望な抗がん治療薬として研究されている。Ｎａｓｔａｌａ， Ｃ． Ｌ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５３巻、１６９７～１７０６頁（１９９４年）を参照されたい。しかしながら、高い期待にもかかわらず、早期臨床研究では、満足のいく結果が得られなかった。Ｌａｓｅｋ Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、６３巻、４１９～４３５号、４２４頁（２０１４年）。ＩＬ１２の反復投与は、ほとんどの患者において、獲得応答をもたらし、ＩＬ１２により誘導されるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の血中レベルを次第に減少させた。（同書）。さらに、ＩＬ１２に誘導される抗がん活性は、大部分がＩＦＮγの二次分泌によって媒介されることが認識されていたが、ＩＬ１２によるＩＦＮ－γと他のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α）またはケモカイン（ＩＰ－１０もしくはＭＩＧ）との同時誘導は、重度の毒性を引き起こした。（同書）。
負のフィードバックおよび毒性に加えて、臨床環境におけるＩＬ１２療法のわずかな有効性は、ヒトにおける強力な免疫抑制環境によって引き起こされる可能性がある。（同書）。ＩＦＮ－γの毒性を最低限に抑え、ＩＬ１２の有効性を改善させるために、科学者たちは、様々なアプローチ、例えば、様々な用量および時間のプロトコールをＩＬ１２療法に試した。Ｓａｃｃｏ， Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、４４７３～４４７９頁（１９９７年）；Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｊ． Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、２５４１～２５４８頁（１９９７年）；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ， Ｃ． Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻、２４６０～２４６７頁（１９９７年）；Ａｓｓｅｌｉｎ－Ｐａｔｕｒｅｌ， Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、９１巻、１１３～１２２頁（２００１年）；およびＳａｕｄｅｍｏｎｔ， Ａ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１６巻、１６３７～１６４４頁（２００２年）を参照されたい。それにもかかわらず、これらのアプローチは、患者の生存に有意な影響を及ぼさなかった。Ｋａｎｇ， Ｗ． Ｋ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１２巻、６７１～６８４頁（２００１年）。
現在のところ、いくつかのＩＬ１２臨床試験が、進行中である。これらの複数の臨床試験は、１９９６年のＩＬ１２の初めてのヒト臨床試験から、２０年近くも進行中であるが、ＦＤＡに承認されたＩＬ１２製品は、依然として利用可能ではない。したがって、当技術分野において、ＩＬ１２を使用して腫瘍を処置するための改善された治療的アプローチに対する必要性が存在している。
Ｇａｔｅｌｙ， ＭＫら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５～５２１頁（１９９８年） Ｎａｓｔａｌａ， Ｃ． Ｌ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５３巻、１６９７～１７０６頁（１９９４年 Ｌａｓｅｋ Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、６３巻、４１９～４３５号、４２４頁（２０１４年） Ｓａｃｃｏ， Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、４４７３～４４７９頁（１９９７年） Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｊ． Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、２５４１～２５４８頁（１９９７年） Ｃｏｕｇｈｌｉｎ， Ｃ． Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻、２４６０～２４６７頁（１９９７年） Ａｓｓｅｌｉｎ－Ｐａｔｕｒｅｌ， Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、９１巻、１１３～１２２頁（２００１年） Ｓａｕｄｅｍｏｎｔ， Ａ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１６巻、１６３７～１６４４頁（２００２年） Ｋａｎｇ， Ｗ． Ｋ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１２巻、６７１～６８４頁（２００１年）
本開示は、がんの処置のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。本開示のｍＲＮＡ治療薬は、特に、この技術が、免疫調節性ポリペプチド（例えば、免疫腫瘍学（「ＩＯ」）において有用な免疫刺激性ポリペプチド、例えば、ＩＬ－１２など）をコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて標的細胞内、例えば、腫瘍中の標的細胞内における機能的タンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ合成を提供するため、がんの処置に極めて好適である。本開示は、（１）望ましくない免疫活性化（例えば、外来核酸のｉｎ ｖｉｖｏ導入と関連する自然免疫応答）を最低限に抑え、（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化するように修飾されたヌクレオチドを有する、治療用ｍＲＮＡを特徴とする。本開示の例示的な態様は、タンパク質の発現を増強するために、自然免疫応答を低減するヌクレオチド修飾と配列最適化との組合せを、特に、免疫調節性ポリペプチド（例えば、免疫刺激性ポリペプチド、例えば、ＩＬ－１２）をコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に有する、治療用ｍＲＮＡを特徴とする。
他の態様では、本開示のｍＲＮＡ治療薬技術は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した、免疫調節性（例えば、免疫刺激性）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの送達を特徴とする。例示的な実施形態では、本開示のｍＲＮＡ治療薬技術は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した、免疫調節性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの腫瘍への送達を特徴とする。本開示はまた、免疫調節性（例えば、免疫刺激性）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡと組み合わせて、ｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合に、改善された特性、例えば、細胞内取り込み、細胞内輸送、および／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出を有する、新規なイオン化可能脂質に基づくＬＮＰを特徴とする。本開示のＬＮＰ製剤はまた、ＬＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ投与と関連する免疫原性の低減も示す。
本開示のある特定の態様は、腫瘍のサイズの低減または腫瘍の成長の阻害をそれを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、インターロイキン１２ ｐ４０サブユニット（「ＩＬ１２Ｂ」）ポリペプチドおよびインターロイキン１２ ｐ３５サブユニット（「ＩＬ１２Ａ」）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、方法は、対象に、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、またはこれらの組合せを阻害する。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象におけるＴ細胞を活性化する。
本開示の別の態様は、Ｔ細胞の活性化をそれを必要とする対象において行う方法であって、対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞増殖を誘導することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導すること、または腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を増大させることを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、メモリーＴ細胞応答を誘導することを含む。一部の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方を含む。ある特定の実施形態では、組成物を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象における活性化ＮＫ細胞の数をさらに増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象の腫瘍における交差提示樹状細胞を増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象における遠位腫瘍のサイズを低減するか、または遠位腫瘍の成長を阻害する。
本開示の別の態様は、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比は、ＣＤ８＋Ｔ細胞：制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の比である。
本開示の別の態様は、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。
本開示の別の態様は、交差提示樹状細胞を増大させることを必要とする対象の腫瘍においてそれを行う方法であって、対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、交差提示樹状細胞は、ＣＤ１０３＋細胞である。
本開示の他の態様は、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を対象とし、ポリヌクレオチドは、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドは、直接またはリンカーをコードする核酸によって融合されている。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸２３～３２８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ｂ活性を有する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸３３６～５３２に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ａ活性を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである。
一部の実施形態では、組成物は、リンカーを介してＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む法。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、リンカー、およびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む。
一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドが、配列番号４８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、配列番号５～４４、２３６、および２３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２３６または２３７に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＯＲＦにおける化学的に修飾されたヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２結合部位である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位である。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ａａｃｇｃｃａｕｕａ ｕｃａｃａｃｕａａａ ｕａ（配列番号５１）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１２２に結合する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｕｇｇａｇｕｇｕｇａ ｃａａｕｇｇｕｇｕｕ ｕｇ（配列番号５３）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２２に結合する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｃａａａｃａｃｃａｕ ｕｇｕｃａｃａｃｕｃ ｃａ（配列番号５４）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１２２に結合する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、表３に列挙される配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、表４Ａまたは４Ｂに列挙される配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位に融合されたヌクレオチドスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’末端キャップ構造を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’ポリＡ尾部を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化ＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状である。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、送達剤とともに製剤化されている。一部の実施形態では、送達剤は、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、送達剤は、脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、
Figure 0007246930000001
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、ただし、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない。
一部の実施形態では、化合物は、式（ＩＡ）の化合物、
Figure 0007246930000002
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の化合物、
Figure 0007246930000003
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化合物は、化合物１から化合物１４７、ならびにそれらの塩および立体異性体から選択される。一部の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、
Figure 0007246930000004
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、ただし、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない。
一部の実施形態では、送達剤は、リン脂質をさらに含む。一部の実施形態では、リン脂質は、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、リン脂質は、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－０２：０ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－２０：４ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－２２：６ ＰＣ）、１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：２ ＰＣ）、１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２０：４ ＰＣ）、１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２２：６ ＰＣ）、１－オレオイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、１－オレオイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、１－オレオイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：２ ＰＥ）、１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２０：４ ＰＥ）、１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２２：６ ＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：１ ＰＥ）、１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：２ ＰＥ）、１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２０：４ ＰＥ）、１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２２：６ ＰＥ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、送達剤は、構造脂質をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む。
一部の実施形態では、送達剤は、第四級アミン化合物をさらに含む。ある特定の実施形態では、第四級アミン化合物は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（１，２－ジオレオイルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、１，２－ジステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬＴＡＰ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－テトラデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１４：１ ＥＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１６：０－１８：１ ＥＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために製剤化されている。一部の態様では、組成物は、筋肉内、皮下、腫瘍内、または皮内送達のために製剤化されている。
ある特定の態様では、投与は、がんを処置する。一部の実施形態では、がんは、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
ある特定の態様では、組成物は、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、
短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデ
バイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末／粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメ
ン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、ＲＦエネルギー、電流
を利用するデバイス、あるいはこれらの任意の組合せによって投与される。一部の態様で
は、有効量は、約０．１０ｍｇ／ｋｇ～約１，０００ｍｇ／ｋｇである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
腫瘍のサイズの低減または腫瘍の成長の阻害をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、インターロイキン１２ ｐ４０サブユニット（「ＩＬ１２Ｂ」）ポリペプチドおよびインターロイキン１２ ｐ３５サブユニット（「ＩＬ１２Ａ」）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む、方法。
（項目２）
前記対象に、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、またはこれらの組合せを阻害する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体を含む、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記抗体が、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ－１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片、およびこれらの組合せである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、トレメリムマブまたはイピリムマブである、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブまたはペンブロリズマブである、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記組成物を投与するステップが、前記対象におけるＴ細胞を活性化する、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
Ｔ細胞の活性化をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
（項目１１）
前記Ｔ細胞の活性化が、Ｔ細胞増殖を誘導することを含む、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｔ細胞の活性化が、前記腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導すること、または腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を増大させることを含む、項目９から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｔ細胞の活性化が、メモリーＴ細胞応答を誘導することを含む、項目９から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記活性化されたＴ細胞が、ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞、ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞、またはその両方を含む、項目９から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することが、前記腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させる、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
（項目１７）
前記エフェクター対サプレッサーＴ細胞比が、ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞：制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の比である、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇ比が、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記組成物を投与することが、前記対象における活性化ＮＫ細胞の数をさらに増大させる、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
（項目２１）
活性化ＮＫ細胞の数が、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増大する、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記増大した活性化ＮＫ細胞が、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、または少なくとも約１４日間維持される、項目１９から２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物を投与することが、前記対象の前記腫瘍における交差提示樹状細胞を増大させる、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
交差提示樹状細胞を増大させることを必要とする対象の腫瘍においてそれを行う方法であって、前記対象に、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、方法。
（項目２５）
前記交差提示樹状細胞が、ＣＤ１０３ ＋ 細胞である、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記組成物を投与することが、前記対象における遠位腫瘍のサイズを低減するか、または遠位腫瘍の成長を阻害する、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドおよび前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、直接またはリンカーをコードする核酸によって融合されている、項目１または２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドまたは前記リンカーの５’末端に位置する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたは前記リンカーの５’末端に位置する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸２３～３２８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ｂ活性を有する、項目２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸３３６～５３２に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ａ活性を有する、項目２７から３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記シグナルペプチドが、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記シグナルペプチドが、配列番号４８のアミノ酸１～２２に少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が、リンカーを介してＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む、項目２７から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物が、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、リンカー、およびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む、項目２７から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記リンカーが、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む、項目２７から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ を含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ を含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ＩＬ１２ポリペプチドが、配列番号４８に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１から３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５～４４、２３６、および２３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目１から４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２３６または２３７に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目１から４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含む、項目１から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、節ＸＩに列挙されているもののうちのいずれかおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ＯＲＦ中の前記ヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、項目４３から４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記ＯＲＦにおける前記化学的に修飾されたヌクレオシドが、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
ＯＲＦ中のウリジンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、項目１から４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記ＯＲＦ中のアデノシンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、項目１から４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記ＯＲＦ中のシチジンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、項目１から４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記ＯＲＦ中のグアノシンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、項目１から５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、項目１から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２結合部位である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位である、項目５２または５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ａａｃｇｃｃａｕｕａ ｕｃａｃａｃｕａａａ ｕａ（配列番号５１）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２２に結合する、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｕｇｇａｇｕｇｕｇａ ｃａａｕｇｇｕｇｕｕ ｕｇ（配列番号５３）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２２に結合する、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｃａａａｃａｃｃａｕ ｕｇｕｃａｃａｃｕｃ ｃａ（配列番号５４）に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２２に結合する、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
前記ポリヌクレオチドが、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、項目４３から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記５’ＵＴＲが、表３に列挙される配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記ポリヌクレオチドが、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、項目４３から５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記３’ＵＴＲが、表４Ａまたは４Ｂに列挙される配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ポリヌクレオチドが、３’ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡ結合部位を含む、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ポリヌクレオチドが、前記ｍｉＲＮＡ結合部位に融合されたヌクレオチドスペーサー配列を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記ヌクレオチドスペーサー配列が、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記ポリヌクレオチドが、５’末端キャップ構造を含む、項目４３から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記５’末端キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ポリヌクレオチドが、３’ポリＡ尾部を含む、項目１から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含む、項目１から６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化ＯＲＦを含む、項目１から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドである、項目１から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記ポリヌクレオチドが、環状である、項目１から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記ポリヌクレオチドが、送達剤とともに製剤化されている、項目１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記送達剤が、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記送達剤が、脂質ナノ粒子である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記脂質ナノ粒子が、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、アミノアルコール脂質、ＫＬ２２、およびこれらの組合せからなる群から選択される脂質を含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記送達剤が、式（Ｉ）を有する化合物、
Figure 0007246930000005

またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ １ は、Ｃ ５～２０ アルキル、Ｃ ５～２０ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ ２ およびＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １～１４ アルキル、Ｃ ２～１４ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ ＊ ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ ２ およびＲ ３ は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ ４ は、Ｃ ３～６ 炭素環、－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑ、－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ） ２ 、および非置換Ｃ １～６ アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ ３ 、－ＣＸ ２ Ｈ、－ＣＸＨ ２ 、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ） ２ Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、
各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ ５ は、独立して、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ ６ は、独立して、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ） ２ －、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ ７ は、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ １～１８ アルキル、Ｃ ２～１８ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ ３～１４ アルキルおよびＣ ３～１４ アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ ＊ は、独立して、Ｃ １～１２ アルキルおよびＣ ２～１２ アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ ３～６ 炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、
ただし、Ｒ ４ が、－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑ、－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ） ２ である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、－Ｎ（Ｒ） ２ ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、項目７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記化合物が、式（ＩＡ）の化合物、
Figure 0007246930000006

またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ １ は、結合またはＭ’であり、
Ｒ ４ は、非置換Ｃ １～３ アルキル、または－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ ２ およびＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １～１４ アルキル、およびＣ ２～１４ アルケニルからなる群から選択される、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
ｍが、５、７、または９である、項目７５から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物、
Figure 0007246930000007

またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ １ は、結合またはＭ’であり、
Ｒ ４ は、非置換Ｃ １～３ アルキル、または－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ ２ およびＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １～１４ アルキル、およびＣ ２～１４ アルケニルからなる群から選択される、項目７６に記載の方法。
（項目８０）
前記化合物が、化合物１から化合物１４７、ならびにそれらの塩および立体異性体から選択される、項目７５から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記化合物が、式（ＩＩａ）の化合物、
Figure 0007246930000008

またはその塩もしくは立体異性体である、項目７６に記載の方法。
（項目８２）
前記化合物が、式（ＩＩｂ）の化合物、
Figure 0007246930000009

またはその塩もしくは立体異性体である、項目７６に記載の方法。
（項目８３）
前記化合物が、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物、
Figure 0007246930000010

またはその塩もしくは立体異性体である、項目７６に記載の方法。
（項目８４）
Ｒ ４ が、－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑおよび－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＱＲから選択され、ここで、Ｑ、Ｒ、およびｎは、項目７５または７６において上記に定義される通りである、項目７６に記載の方法。
（項目８５）
前記化合物が、式（ＩＩｄ）の化合物、
Figure 0007246930000011

またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｒ ２ およびＲ ３ は、独立して、Ｃ ５～１４ アルキルおよびＣ ５～１４ アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、および４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、およびｍは、項目７５または７６に定義される通りである、項目７６に記載の方法。
（項目８６）
Ｒ ２ が、Ｃ ８ アルキルである、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
Ｒ ３ が、Ｃ ５ アルキル、Ｃ ６ アルキル、Ｃ ７ アルキル、Ｃ ８ アルキル、またはＣ ９ アルキルである、項目８５または８６に記載の方法。
（項目８８）
ｍが、５、７、または９である、項目８５から８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
各Ｒ ５ が、Ｈである、項目８５から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
各Ｒ ６ が、Ｈである、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記送達剤が、式（Ｉ）を有する化合物、
Figure 0007246930000012

またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ １ は、Ｃ ５～３０ アルキル、Ｃ ５～２０ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ ２ およびＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １～１４ アルキル、Ｃ ２～１４ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ ＊ ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ ２ およびＲ ３ は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ ４ は、Ｃ ３～６ 炭素環、－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑ、－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ） ２ 、および非置換Ｃ １～６ アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ ３ 、－ＣＸ ２ Ｈ、－ＣＸＨ ２ 、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｒ ８ 、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｃ（＝ＮＲ ９ ）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ） ２ Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ ５ は、独立して、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ ６ は、独立して、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－（Ｓ）Ｓ－、－（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ） ２ －、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ ７ は、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ ８ は、Ｃ ３～６ 炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ ９ は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ ２ 、Ｃ １～６ アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｓ（Ｏ） ２ Ｎ（Ｒ） ２、 Ｃ ２～６ アルケニル、Ｃ ３～６ 炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ １～３ アルキル、Ｃ ２～３ アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ １～１８ アルキル、Ｃ ２～１８ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ ３～１４ アルキルおよびＣ ３～１４ アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ ＊ は、独立して、Ｃ １～１２ アルキルおよびＣ ２～１２ アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ ３～６ 炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、
ただし、Ｒ ４ が、－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑ、－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ） ２ である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、－Ｎ（Ｒ） ２ ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、項目７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記送達剤が、式（ＩＡ）の化合物、
Figure 0007246930000013

またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ １ は、結合またはＭ’であり、
Ｒ ４ は、非置換Ｃ １～３ アルキル、または－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ ８ 、－ＮＨＣ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、ＭおよびＭ’は、独立して、－（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ ２ およびＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １～１４ アルキル、およびＣ ２～１４ アルケニルからなる群から選択される、項目９１に記載の組成物。
（項目９３）
ｍが、５、７、または９である、項目９１または９２に記載の組成物。
（項目９４）
前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物、
Figure 0007246930000014

またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ １ は、結合またはＭ’であり、
Ｒ ４ は、非置換Ｃ １～３ アルキル、または－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ ８ 、－ＮＨＣ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、ＭおよびＭ’は、独立して、－（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ ２ およびＲ ３ は、独立して、Ｈ、Ｃ １～１４ アルキル、およびＣ ２～１４ アルケニルからなる群から選択される、項目９２または９３に記載の組成物。
（項目９５）
Ｍ １ が、Ｍ’である、項目９２から９４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９６）
ＭおよびＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である、項目９５に記載の組成物。
（項目９７）
ｌが、１、３、または５である、項目９２から９６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９８）
前記化合物が、化合物１から化合物２３２、それらの塩および立体異性体、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目９１に記載の組成物。
（項目９９）
前記送達剤が、リン脂質をさらに含む、項目７２から９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記リン脂質が、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテルＰＣ）、
１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、
１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、
スフィンゴミエリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記リン脂質が、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－０２：０ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－２０：４ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－２２：６ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：２ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２０：４ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２２：６ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
１－オレオイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
１－オレオイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：２ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２０：４ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２２：６ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：１ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：２ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２０：４ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２２：６ ＰＥ）、
１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０２）
前記送達剤が、構造脂質をさらに含む、項目７２から１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記送達剤が、ＰＥＧ脂質をさらに含む、項目７２から１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、項目１１２に記載の方法。
（項目１０６）
前記送達剤が、
３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、
ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、
１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、
２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、
（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および
（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む、項目７２から１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記送達剤が、第四級アミン化合物をさらに含む、項目７２から１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記第四級アミン化合物が、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、
Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、
１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、
２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、
Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、
Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、
Ｎ－（１，２－ジオレオイルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、
Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＴＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、
１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬＴＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＭＴＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、
１，２－ジ－（９Ｚ－テトラデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１４：１ ＥＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１６：０－１８：１ ＥＰＣ）、
およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために製剤化されている、項目１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記組成物が、筋肉内、皮下、腫瘍内、または皮内送達のために製剤化されている、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記組成物が、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して投与される、項目１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記投与が、がんを処置する、項目１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記がんが、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記組成物が、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末／粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、ＲＦエネルギー、電流を利用するデバイス、あるいはこれらの任意の組合せによって投与される、項目１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記有効量が、約０．１０ｍｇ／ｋｇ～約１，０００ｍｇ／ｋｇである、項目１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記対象が、ヒトである、項目１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子であって、前記ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、脂質ナノ粒子。
（項目１１８）
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、ペプチドリンカーによって、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されている、項目１１７に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１１９）
前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーの５’末端に位置する、項目１１７または１１８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２０）
前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーの５’末端に位置する、項目１１７または１１８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２１）
前記ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む、項目１１７から１２０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２２）
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ を含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である、項目１２１に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２３）
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ を含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である、項目１２２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２４）
前記ＯＲＦが、シグナルペプチドをコードする、項目１１７から１２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２５）
前記シグナルペプチドが、ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである、項目１２４に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２６）
前記ヒトＩＬ１２Ｂポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸２３～３２８に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１１７から１２５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２７）
前記ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸３３６～５３２に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１１７から１２６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２８）
前記ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドが、配列番号４８のアミノ酸１～２２に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１１７から１２７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１２９）
前記ヒトＩＬ１２ポリペプチドが、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１１７から１２８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３０）
前記ポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、項目１１７から１２９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３１）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２結合部位である、項目１３０に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３２）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位である、項目１３１に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３３）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、配列番号５４に記載される配列を含むｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位である、項目１３２に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３４）
前記ポリヌクレオチドが、３’ＵＴＲを含む、項目１１７から１３３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３５）
前記３’ＵＴＲが、配列番号２４０に記載される配列を含む、項目１３４に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３６）
前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、前記３’ＵＴＲに位置する、項目１３４または１３５に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３７）
前記ポリヌクレオチドが、５’ＵＴＲを含む、項目１３６に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３８）
前記５’ＵＴＲが、配列番号３９に記載される配列を含む、項目１３７に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１３９）
前記ポリヌクレオチドが、５’末端キャップ構造を含む、項目１１７から１３８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４０）
前記５’末端キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはこれらの類似体である、項目１３９に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４１）
前記ポリヌクレオチドが、３’ポリＡ尾部を含む、項目１１７から１４０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４２）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６に記載される配列を含む、項目１１７に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４３）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２３６または２３７に記載される配列を含む、項目１１７に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４４）
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含む、項目１１７から１４３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４５）
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１４４に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４６）
前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、Ｎ１－メチルシュードウリジンである、項目１４５に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４７）
前記脂質ナノ粒子が、約２０～６０％のイオン化可能アミノ脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のステロール；および０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、項目１１７から１４６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４８）
前記脂質ナノ粒子が、約５０％のイオン化可能アミノ脂質：１０％のリン脂質：３８．５％のコレステロール；および１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、項目１１７から１４７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１４９）
前記イオン化可能アミノ脂質が、化合物１８である、項目１４８に記載の脂質ナノ粒子。
（項目１５０）
個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のための医薬の製造における、項目１１７から１４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子の使用であって、前記医薬が、前記脂質ナノ粒子および任意選択の薬学的に許容される担体を含み、前記処置が、前記医薬を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することを含む、使用。
（項目１５１）
項目１１７から１５０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を含む医薬と、任意選択の薬学的に許容される担体と、前記医薬を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示を含む添付文書とを含む、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のためのキット。
（項目１５２）
個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のために第１の医薬および第２の医薬を投与することに関する指示を含む添付文書をさらに含む、項目１５１に記載のキット。
（項目１５３）
個体におけるがんの処置またはその進行の遅延に使用するための、項目１１７から１４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、任意選択の薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、前記処置が、前記脂質ナノ粒子を第２の組成物と組み合わせて投与することを含み、前記第２の組成物が、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む、組成物。
（項目１５４）
項目１１７から１４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
（項目１５５）
前記脂質ナノ粒子が、腫瘍内投与のために製剤化されている、項目１５４に記載の医薬組成物。
（項目１５６）
項目１５４または１５５に記載の医薬組成物を含む容器と、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のための前記医薬組成物の投与に関する指示を含む添付文書とを含む、キット。
（項目１５７）
前記添付文書が、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のために、前記医薬組成物を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示をさらに含む、項目１５６に記載のキット。
図１は、（１）野生型ＩＬ１２Ｂアミノ酸配列、（２）ｗｔＩＬ１２Ｂをコードする野生型核酸、（３）野生型ＩＬ１２Ａアミノ酸配列、（４）ｗｔＩＬ１２Ａをコードする野生型核酸、（５）野生型ＩＬ１２Ｂシグナルペプチドアミノ酸配列、および（６）ｗｔＩＬ１２Ｂシグナルペプチドをコードする野生型核酸を示す。
図２Ａは、対応するＩＬ１２組換えタンパク質と比較した、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡの静脈内投与後に観察されたＩＬ１２血漿レベルに関する、より高いＡＵＣおよびＣｍａｘを示すグラフである。図２Ｂは、ＩＬ１２組換えタンパク質と比較した、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡの静脈内投与後に観察されたＩＦＮγ血漿レベルに関する、より高いＡＵＣおよびＣｍａｘを示すグラフである。
図３は、第１群（ＰＢＳ）、第２群（ＩＬ１２タンパク質）、第７群および第８群（それぞれ、対照ＮＳＴ－ＦＩＸ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ）と比較した、０．１ｍｇ／ｋｇ（第４群）および０．０５ｍｇ／ｋｇ（第５群）の用量（逆三角形を含む線で示される）での、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回静脈内（ＩＶ）用量のロバストな有効性を示すグラフである。
図４Ａ～図４Ｆは、０．１ｍｇ／ｋｇ（第４群）（図４Ｆ）および０．０５ｍｇ／ｋｇ（第５群）（図４Ｅ）の用量の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡ、ＰＢＳ（１群）（図４Ａ）、ＩＬ１２タンパク質（第２群）（図４Ｄ）、対照ＮＳＴ－ＦＩＸ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、第７群および第８群）（それぞれ、図４Ｃおよび図４Ｂ）の、単回静脈内（ＩＶ）用量の投与後に見られた平均腫瘍体積および完全奏功（ＣＲ）数を示すグラフである。完全奏功（ＣＲ）は、図４Ｅおよび図４Ｆにのみ示される。図４Ｅは、６／８のＣＲが第５群において見られた（０．０５ｍｇ／ｋｇの用量の、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡ）。図４Ｆは、５／９のＣＲが第４群において見られた（０．１ｍｇ／ｋｇの用量の、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡ）。ＩＬ１２ ｍＲＮＡ群を除いて、他の全ての群において、ＣＲは観察されなかった。 同上 同上
図５は、１μｇ（約０．０５ｍｇ／ｋｇ）のＩＬ１２タンパク質（第２群）、０．１ｍｇ／ｋｇ（第７群）もしくは０．０５ｍｇ／ｋｇ（第８群）のＮＳＴ－ＦＩＸ、またはＰＢＳ（第１群）の単回ＩＶ用量と比較した、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量（第５群）および０．１ｍｇ／ｋｇの用量（第４群）の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回静脈内（ＩＶ）用量からの腫瘍埋込み後４７日目での生存利益を示すグラフである。
図６Ａ～図６Ｂは、腺癌（ＭＣ３８）腫瘍を担持するマウスに投与された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回腫瘍内用量（４μｇ）のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである。図６Ａは、埋込み後１０日目に開始して、２４日目までの、平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。第１群（丸）は、埋込み後１０日目に４μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ ＬＮＰを投与されたマウス（ｎ＝７）を表す；第２群（四角）は、４μｇの非翻訳因子ＩＸをコードする対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ－ＦＩＸ ＬＮＰ）を投与されたマウス（ｎ＝７）を表し、第３群（三角）は、ＰＢＳを投与されたマウスの別の対照群（ｎ＝７）を表す。図６Ｂは、埋込み後１０日目に開始して、４７日目までの、各群のマウスの個々の腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。４μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ ＬＮＰ（丸）を投与された７匹の動物のうちの３匹（４４％）において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
図７Ａ～図７Ｂは、Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与されたＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡの腫瘍内用量（５μｇ）のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである。図７Ａは、５μｇの非翻訳対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）を投与されたマウス（ｎ＝１２）の個々の腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。図７Ｂは、５μｇのＩＬ１２（ｍｉＲｌｅｓｓ）ｍＲＮＡを投与されたマウス（ｎ＝１２）の個々の腫瘍体積を示す。ＩＬ１２ ｍＲＮＡを受けた１２匹の動物のうちの５匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
図７Ｃは、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍モデル（Ａ２０）中のｍｉＲ１２２結合部位を含有するＩＬ１２ ｍＲＮＡ（５μｇ）の同等のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである（図７Ｃ）。両方のＩＬ１２ ｍＲＮＡ（ｍｉＲ１２２結合部位を含む、および含まない（すなわち、ｍｉＲｌｅｓｓ））を、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。ＩＬ１２ ｍＲＮＡを、Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与した。ＩＬ１２ ｍｉＲ１２２群の１２匹のマウスのうちの６匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された（図７Ｃ）。
図８Ａ～図８Ｂは、Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与されたＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ－１２ ｍＲＮＡの単回用量のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示すグラフである。ＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓ（０．５μｇ）群（図８Ａ）の１２匹のマウスのうちの４匹において、およびＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（０．５μｇ）群（図８Ｂ）の１２匹のマウスのうちの３匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
図８Ｃは、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡの複数用量を、Ａ２０腫瘍を担持するマウスに投与することによる、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍モデル（Ａ２０）中でのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性の増強を示すグラフである。０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２の週用量を７日間で６回投与された１２匹のマウスのうちの５匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
図８Ｄは、Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに投与された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（すなわち、化合物１８）の腫瘍内週用量のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性が、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性と類似することを示すグラフである。図１４は、化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡを７日間で６回投与された１２匹のマウスに関する個々の腫瘍体積を示す。また、１２匹の動物のうちの５匹において、完全奏功（ＣＲ）が達成された。
図８Ｅ～図８Ｆは、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇの非翻訳陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）（図８Ｅ）および化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇの非翻訳陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）（図８Ｆ）の週用量（７日間で６回）を投与されたＡ２０腫瘍を担持するマウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。
図９Ａ～図９Ｂは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中の示された用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへの腫瘍内投与後、６時間および２４時間での血漿（図９Ａ）および腫瘍（図９Ｂ）中のＩＬ１２の用量依存的レベルを示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）５μｇのＮＳＴ、（ｖ）０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、および（ｘ）５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２を投与した。
図９Ｃ～図９Ｄは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のＩＬ１２ ｍＲＮＡと比較した、化合物１８に基づくＬＮＰ中のＩＬ１２ ｍＲＮＡの示された用量の投与後の血漿および腫瘍中のＩＬ１２レベルの上昇を示すグラフである。図９Ｃは、６時間および２４時間での血漿ＩＬ１２レベルを示す；図９Ｄは、６時間および２４時間での腫瘍ＩＬ１２レベルを示す。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｖ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｖｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉｉ）５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、および（ｘ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２を投与した。
図９Ｅ～図９Ｆは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへの投与後の血漿（図９Ｅ）および腫瘍（図９Ｆ）中、６時間および２４時間でのＩＦＮγレベルの増大を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２を投与した。
図９Ｇ～図９Ｈは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへの投与後の血漿（図９Ｇ）および腫瘍（図９Ｈ）中、６時間および２４時間でのＩＰ１０レベルの増大を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２を投与した。
図９Ｉ～図９Ｊは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｉ）および腫瘍（図９Ｊ）中、６時間および２４時間でのＩＬ６レベルの低下を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２を投与した。
図９Ｋ～図９Ｌは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｋ）および腫瘍（図９Ｌ）中、６時間および２４時間でのＧ－ＣＳＦレベルの低下を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２を投与した。
図９Ｍ～図９Ｎは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｍ）および腫瘍（図９Ｎ）中、６時間および２４時間でのＧＲＯαレベルの低下を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｉｖ）ＭＣ３中の５μｇのＮＳＴ、（ｖ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２、（ｖｉｉｉ）ＭＣ３中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｘ）ＭＣ３中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘ）ＭＣ３中の５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｘｉ）化合物１８中の０．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉ）化合物１８中の２．５μｇのＮＳＴ、（ｘｉｉｉ）化合物１８中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、および（ｘｉｖ）化合物１８中の２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２を投与した。
図１０Ａ～図１０Ｂは、陰性対照ｍＲＮＡ（図１０Ａ）と比較した、ＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡ（図１０Ｂ）による処置後のＡ２０腫瘍を用いる疾患誘導後３５日目までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。
図１０Ｃ～図１０Ｄは、陰性対照ｍＲＮＡ（図１０Ｃ）と比較した、ＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡ（図１０Ｄ）による処置後のＡ２０腫瘍を用いる疾患誘導後３５日目までのマウスの体重測定値を示すグラフである。
図１１Ａは、マウスにおけるルシフェラーゼにより可能になったＭＣ３８結腸がん細胞株を用いる疾患誘導後２２日目での腫瘍量の代用としての生物発光（ＢＬ）を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、処置なし、２μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓ、２μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２、２μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、４μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓ、４μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２、４μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、および１μｇのｒｍ ＩＬ１２を投与した。
図１１Ｂは、ＮＳＴ－ＯＸ４０Ｌ陰性対照と比較した、ＩＬ１２ ｍＲＮＡを担持するＬＮＰで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。このグラフは、Ａ２０腫瘍の埋込み後１５０日目までの生存を示す。
図１２Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１２Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１２Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１２Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。 図１２Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１２Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１２Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１２Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
図１３Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１３Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１３Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１３Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。 図１３Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１３Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１３Ｃは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１３Ｄは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
図１４Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１４Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１４Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１４Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。 図１４Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１４Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１４Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１４Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。
図１５Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１５Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１５Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１５Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。「Ｇ／Ｃ含量（％）」と標識された列は、％Ｇ／ＣＴＬに対応する。 図１５Ａは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するウラシル（Ｕ）指標を示す。図１５Ｂは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン（Ｇ）指標を示す。図１５Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するシトシン（Ｃ）指標を示す。図１５Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）指標を示す。「Ｇ／Ｃ含量（％）」と標識された列は、％Ｇ／ＣＴＬに対応する。
図１６Ａは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。図１６Ｂは、野生型ＩＬ１２Ｂおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ｂポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。図１６Ｃは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。図１６Ｄは、野生型ＩＬ１２Ａおよび２０の配列最適化されたＩＬ１２Ａポリヌクレオチド（ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１～ｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０）に対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成の偏り間の比較を示す。
図１７Ａは、示された用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの、腫瘍を担持するマウスへの腫瘍内投与後２４時間での血漿中のＩＬ１２の用量依存的レベルを示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）０．０５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｖ）５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｖｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉ）０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（４用量）、（ｖｉｉｉ）２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（４用量）、および（ｉｘ）５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（４用量）を投与した。
図１７Ｂは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの、腫瘍を担持するマウスへの腫瘍内投与後２４時間での血漿中のＩＦＮγレベルの増大を示すグラフである。左から右に向かって、マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｉｉｉ）０．０５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｖ）５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｖｉ）５μｇのＮＳＴ、（ｖｉｉ）０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（４用量）、（ｖｉｉｉ）２．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（４用量）、および（ｉｘ）５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（４用量）を投与した。
図１８Ａ～図１８Ｂは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの、ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスへの腹腔内投与後、２００時間の経過にわたる血漿中のＩＬ１２（図１８Ａ）および血漿中のＩＦＮγ（図１８Ｂ）のレベルの増大を示すグラフである。マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）２μｇのＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｉｉｉ）２μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）４μｇのＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｖ）４μｇのｍｉＲ１２２、（ｖｉ）１μｇのＩＬ１２タンパク質、（ｖｉｉ）２μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、または（ｖｉｉｉ）４μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２を投与した。 図１８Ａ～図１８Ｂは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡの、ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスへの腹腔内投与後、２００時間の経過にわたる血漿中のＩＬ１２（図１８Ａ）および血漿中のＩＦＮγ（図１８Ｂ）のレベルの増大を示すグラフである。マウスに、（ｉ）処置なし、（ｉｉ）２μｇのＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｉｉｉ）２μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２、（ｉｖ）４μｇのＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓ、（ｖ）４μｇのｍｉＲ１２２、（ｖｉ）１μｇのＩＬ１２タンパク質、（ｖｉｉ）２μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、または（ｖｉｉｉ）４μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２を投与した。
図１９Ａ～図１９Ｂは、陰性対照ｍＲＮＡ（図１９Ａ）と比較した、化合物１８に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇのＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡ（図１９Ｂ）を用いる処置後の、Ａ２０腫瘍を用いた疾患融合後９０日目までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。
図１９Ｃ～図１９Ｄは、ナイーブマウス（図１９Ｃ）またはＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡで予め処置され、再チャレンジした完全奏功マウス（図１９Ｄ）におけるＡ２０腫瘍を用いた疾患誘導後６０日目までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。
図２０Ａ～図２０Ｄは、ＭＣ３８－Ｓ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回腫瘍内投与後、８０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、０．０５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２０Ａ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２０Ｂ）、５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２０Ｃ）、またはＮＳＴ（図２０Ｄ）を投与した。
図２１Ａ～図２１Ｆは、ＭＣ３８－Ｓ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回用量または複数回用量の後、８０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、単回用量の０．０５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２１Ａ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２１Ｂ）、単回用量の５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２１Ｃ）、２回用量の０．０５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２１Ｄ）、２回用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２１Ｅ）、２回用量の５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２１Ｆ）を投与した。
図２２は、ＮＳＴ－ＦＩＸ陰性対照と比較した、ＩＬ１２ ｍＲＮＡを担持するＬＮＰで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。グラフは、ＭＣ３８－Ｓ腫瘍の埋込み後８０日目までの生存を示す。
図２３Ａ～図２３Ｄは、ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回用量の後７５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、０．０５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ａ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｂ）、５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｃ）、またはＮＳＴ（図２３Ｄ）を投与した。
図２３Ｅ～図２３Ｊは、ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスへのＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回用量または複数回用量の後７５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、単回用量の０．０５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｅ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｆ）、単回用量の５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｇ）、複数回用量の０．０５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｈ）、複数回用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｉ）、または複数回用量の５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２３Ｊ）を投与した。
図２４は、ＮＳＴ－ＯＸ４０Ｌ陰性対照と比較した、ＩＬ１２ ｍＲＮＡを担持するＬＮＰで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。グラフは、ＭＣ３８－Ｒ腫瘍の埋込み後、８０日目までの生存を示す。
図２５は、２８日の経過にわたるＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を示すグラフである。
図２６Ａ～図２６Ｅは、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇およびＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスへの単回用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡのその後の投与後、９０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇のための抗体対照、次いで、０．５μｇの陰性対照ｍＲＮＡ（図２６Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇のための抗体対照、次いで、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２６Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇抗体クローン２４．３、次いで、０．５μｇの陰性対照ｍＲＮＡ（図２６Ｃ）、またはＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇抗体クローン２４．３、次いで、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図２６Ｄ）を投与した。図２６Ｅは、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後にＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置したマウスと比較した、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇なしにＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置したマウスの生存率を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。グラフは、ＭＣ３８－Ｒ腫瘍の埋込み後、９０日目までの生存を示す。 同上 同上
図２７Ａ～図２７Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる腫瘍内用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの後、２４時間または７２時間のＭＣ３８－Ｒ（図２７Ａ）およびＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３（図２７Ｂ）腫瘍中でのＰＤＬ１発現について染色陽性のＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
図２８Ａ～図２８Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの後、７日間のＭＣ３８－Ｒ（図２８Ａ）およびＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３（図２８Ｂ）腫瘍中での免疫浸潤物（ＣＤ４５＋細胞）（左パネル）および腫瘍１ｍｇあたり（右パネル）の割合としての腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞を示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
図２９Ａ～図２９Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの後、７日間のＭＣ３８－Ｒ（図２９Ａ）およびＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３（図２９Ｂ）腫瘍中でのＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する比を示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
図３０Ａ～図３０Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの後、２４時間のＭＣ３８－Ｒ（図３０Ａ）およびＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３（図３０Ｂ）腫瘍中での初期活性化マーカーＣＤ６９について染色陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
図３１Ａ～図３１Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの後、２４時間または７２時間のＭＣ３８－Ｒ（図３１Ａ）およびＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３（図３１Ｂ）腫瘍中での初期活性化マーカーＣＤ６９について染色陽性のＮＫ細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
図３２Ａ～図３２Ｂは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの後、７日間のＭＣ３８－Ｒ（図３２Ａ）およびＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３（図３２Ｂ）腫瘍１ｍｇあたりのＣＤ１０３＋古典的樹状細胞の数を示すグラフである。図３２Ｃは、処置なし、ＮＳＴ陰性対照による処置、または２つの異なる用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡの後、２４時間、７２時間、または７日間のＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍の腫瘍流入領域リンパ節（ＬＮ）中のＣＤ８６について染色陽性のＣＤ８＋古典的樹状細胞のパーセントを示すグラフである。統計的有意性は、星印で示される。
図３３Ａ～図３３Ｂは、ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与後、５５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、抗体対照（図３３Ａ）または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（クローン８０）（図３３Ｂ）を投与した。図３３Ｃ～図３３Ｇは、ＩＬ１２ ｍＲＮＡのみ、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後、９０日までのＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。マウスに、（ｉ）単剤療法としての単回ｉＴｕ用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３３Ｃ）、（ｉｉ）単剤療法としての単回ｉＴｕ用量の５．０μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（図３３Ｄ）、（ｉｉｉ）複数回腹腔内用量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた単回ｉＴｕ用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（図３３Ｅ）、（ｉｖ）複数回腹腔内用量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた単回ｉＴｕ用量の５．０μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３３Ｆ）；または（ｖ）複数回腹腔内用量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（図３３Ｇ）を投与した。 同上 同上 同上
図３４Ａ～図３４Ｃは、７５日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスを、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ（図３４Ａ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡのみ（図３４Ｂ）、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡの両方（図３４Ｃ）で、埋込み１０日後に処置した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、６回用量にわたって投与した。垂直の破線は、投与日を示す。
図３５Ａ～図３５Ｄは、７０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍を担持するマウスを、陰性対照（図３５Ａ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ（図３５Ｂ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡのみ（図３５Ｃ）、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡの両方（図３５Ｄ）で、埋込みの１０日後に処置した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、６回用量にわたって投与した。垂直の破線は、投与日を示す。 図３５Ａ～図３５Ｄは、７０日までの個々の腫瘍体積を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍を担持するマウスを、陰性対照（図３５Ａ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ（図３５Ｂ）、単回用量の０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡのみ（図３５Ｃ）、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡの両方（図３５Ｄ）で、埋込みの１０日後に処置した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、６回用量にわたって投与した。垂直の破線は、投与日を示す。
図３６Ａは、腫瘍細胞を両側に埋め込まれたマウスの図面である。図３６Ｂ～図３６Ｇは、陰性対照（ＮＳＴ ｍＲＮＡ＋アイソタイプ抗体対照）（図３６Ｂ～図３６Ｃ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３６Ｄ～図３６Ｅ）、または５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３６Ｆ～図３６Ｇ）による処置後の、処置された腫瘍（図３６Ｂ、図３６Ｄ、および図３６Ｆ）ならびに遠位腫瘍（図３６Ｃ、図３６Ｅ、および図３６Ｇ）における６０日目までのＭＣ３８－Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。 図３６Ａは、腫瘍細胞を両側に埋め込まれたマウスの図面である。図３６Ｂ～図３６Ｇは、陰性対照（ＮＳＴ ｍＲＮＡ＋アイソタイプ抗体対照）（図３６Ｂ～図３６Ｃ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３６Ｄ～図３６Ｅ）、または５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３６Ｆ～図３６Ｇ）による処置後の、処置された腫瘍（図３６Ｂ、図３６Ｄ、および図３６Ｆ）ならびに遠位腫瘍（図３６Ｃ、図３６Ｅ、および図３６Ｇ）における６０日目までのＭＣ３８－Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。 図３６Ａは、腫瘍細胞を両側に埋め込まれたマウスの図面である。図３６Ｂ～図３６Ｇは、陰性対照（ＮＳＴ ｍＲＮＡ＋アイソタイプ抗体対照）（図３６Ｂ～図３６Ｃ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３６Ｄ～図３６Ｅ）、または５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３６Ｆ～図３６Ｇ）による処置後の、処置された腫瘍（図３６Ｂ、図３６Ｄ、および図３６Ｆ）ならびに遠位腫瘍（図３６Ｃ、図３６Ｅ、および図３６Ｇ）における６０日目までのＭＣ３８－Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
図３７Ａ～図３７Ｆは、アイソタイプ対照抗体（図３７Ａ、図３７Ｃ、もしくは図３７Ｅ）または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（図３７Ｂ、図３７Ｄ、もしくは図３７Ｆ）と組み合わせた、活性ｍＲＮＡなし（ＮＳＴ ｍＲＮＡ）（図３７Ａ～図３７Ｂ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３７Ｃ～図３７Ｄ）、または５μｇのＩＬ１２のｍＲＮＡ（図３７Ｅ～図３７Ｆ）による処置後、６０日までのＭＣ３８－Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。 図３７Ａ～図３７Ｆは、アイソタイプ対照抗体（図３７Ａ、図３７Ｃ、もしくは図３７Ｅ）または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（図３７Ｂ、図３７Ｄ、もしくは図３７Ｆ）と組み合わせた、活性ｍＲＮＡなし（ＮＳＴ ｍＲＮＡ）（図３７Ａ～図３７Ｂ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３７Ｃ～図３７Ｄ）、または５μｇのＩＬ１２のｍＲＮＡ（図３７Ｅ～図３７Ｆ）による処置後、６０日までのＭＣ３８－Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。 図３７Ａ～図３７Ｆは、アイソタイプ対照抗体（図３７Ａ、図３７Ｃ、もしくは図３７Ｅ）または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（図３７Ｂ、図３７Ｄ、もしくは図３７Ｆ）と組み合わせた、活性ｍＲＮＡなし（ＮＳＴ ｍＲＮＡ）（図３７Ａ～図３７Ｂ）、０．５μｇのＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３７Ｃ～図３７Ｄ）、または５μｇのＩＬ１２のｍＲＮＡ（図３７Ｅ～図３７Ｆ）による処置後、６０日までのＭＣ３８－Ｓが両側に埋め込まれたマウスにおける個々の腫瘍体積を示すグラフである。垂直の破線は、投与日を示す。
図３８は、野生型およびコドン最適化ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ構築物による、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのヒトＩＬ－１２発現を示すグラフである。
本開示は、免疫応答を刺激する物質（例えば、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡ）、すなわち、免疫療法による疾患の予防または処置を含む、がんを処置するための新規なアプローチを提供する。
一態様では、本開示は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを使用して、がんを処置する方法に関する。本明細書に開示されるＩＬ１２ポリペプチドは、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、またはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂの両方を含む。別の態様では、本開示は、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡならびに抗がん剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体を特徴とする組合せアプローチを使用してがんを処置する方法を提供する。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、抗がん免疫応答のプライミングは、例えば、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞の刺激時に、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡを、例えば腫瘍内に投与することによって、可能であると考えられる。したがって、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡの腫瘍内注射により、例えば、腫瘍環境内において免疫系に第１の刺激シグナルを提供すると考えられる。ＩＬ１２はまた、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）の産生を刺激し得る。本明細書に開示されるように、ＩＬ１２はまた、直接的またはＩＦＮ－γを通じて間接的に、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現を増大させ得、これにより、局所的腫瘍免疫が損なわれ得る。したがって、一部の態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ－Ｌ１とその受容体、すなわち、ＰＤ－１との間の相互作用を遮断する抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。他の態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を含む。さらなる態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。本開示の一部の態様はまた、追加の薬剤、例えば、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはＯＸ４０ＬをコードするｍＲＮＡを含む。他の態様では、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ポリヌクレオチドの形態で投与され得る。同様に、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ポリヌクレオチドの形態で投与され得る。例示的な態様は、脂質ナノ粒子－（ＬＮＰ－）封入型ｍＲＮＡを用いた処置を特徴とする。例示的な態様は、カチオン性脂質に基づくＬＮＰにおけるｍＲＮＡの腫瘍内投与を特徴とする。
１．がんを処置する方法
本開示のある特定の態様は、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズ、質量、および／もしくは体積を低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を予防する方法であって、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、またはポリヌクレオチドを含むベクターもしくは宿主細胞、またはポリヌクレオチドによってコードされるＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａポリペプチドを投与することを含む、方法を対象とする。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードし、ここで、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズ（質量および／もしくは体積を含む）を低減するか、または腫瘍の成長を阻害する方法は、対象に、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
一部の実施形態では、方法は、第２の薬剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、当該分野において公知または本明細書に記載される任意のチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＯＸ４０ＬをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドまたは本明細書に開示の任意の他の薬剤から選択される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む組成物は、１つより多くのチェックポイント阻害剤を含む。１つの特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、対象における腫瘍のサイズを、投与前の腫瘍のサイズと比較して、低減する。ある特定の実施形態では、腫瘍のサイズは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは約１００％だけ低減される。ある特定の実施形態では、対象は、部分奏功を呈する。ある特定の実施形態では、対象は、完全奏功を呈する。
一部の実施形態では、本開示の方法は、それを必要とする対象において、腫瘍の成長を、阻害、停止、または遅延させる。ある特定の実施形態では、腫瘍成長は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月間、少なくとも約２か月間、少なくとも約３か月間、少なくとも約４か月間、少なくとも約５か月間、少なくとも約６か月間、少なくとも約９か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１５か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約２４か月間、または少なくとも約３６か月間阻害、停止または遅延される。他の実施形態では、腫瘍の成長は、無期限に阻害される。
他の実施形態では、本開示は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独でまたはこのポリヌクレオチドを本明細書に開示される任意の薬剤と組み合わせて投与することによって、抗腫瘍効果を促進する（例えば、Ｔ細胞増殖を誘導する、腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導する、メモリーＴ細胞応答を誘導する、ＮＫ細胞の数を増大させるなど）方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてＴ細胞を活性化する、それを必要とする対象においてＴ細胞増殖を誘導する、それを必要とする対象の腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導する、および／またはそれを必要とする対象においてメモリーＴ細胞応答を誘導する方法であって、対象に、本明細書に開示される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤ポリペプチド、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチド、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に開示される任意の他の薬剤を含む組成物と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の、単独でまたは第２の薬剤と組み合わせた腫瘍内投与は、他の投与経路と比較して、抗腫瘍効果（例えば、腫瘍へのＴ細胞の浸潤）の有効性を増大させ得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することにより、対象においてＴ細胞が活性化される。Ｔ細胞の活性化は、当技術分野において公知の任意の手段で特徴付けることができる。一部の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４を発現する。一部の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ８を発現する。ある特定の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８を発現する。ある特定の実施形態では、活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含む。
一実施形態では、対象における活性化されたＴ細胞は、対象における腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害する。Ｔ細胞の活性化は、当技術分野における適用、例えば、Ｔ細胞増殖を測定すること；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によってサイトカイン産生を測定すること；またはフローサイトメトリーなどの技法によるＴ細胞活性化と関連する細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１５４、およびＣＤ１３４）の検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞増殖を誘導することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞増殖は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前のＴ細胞増殖のレベルと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
一実施形態では、対象におけるＴ細胞増殖は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるＴ細胞増殖は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。Ｔ細胞増殖は、当技術分野における適用、例えば、細胞計数、生存性染色、光学密度アッセイ、またはフローサイトメトリーなどの技法によるＴ細胞活性化と関連する細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１５４、およびＣＤ１３４）の検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、腫瘍のＴ細胞の浸潤の誘導を含む。一部の実施形態では、腫瘍におけるＴ細胞浸潤は、レベルポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前の腫瘍のＴ細胞浸潤のレベルと比較して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を増大させることを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍における腫瘍浸潤Ｔ細胞の数は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前の腫瘍における腫瘍浸潤Ｔ細胞の数と比較して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
一実施形態では、対象の腫瘍へのＴ細胞の浸潤は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象の腫瘍へのＴ細胞の浸潤は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。腫瘍へのＴ細胞の浸潤は、当技術分野における適用、例えば、組織切片化および細胞マーカーの染色、腫瘍部位における局所的サイトカイン産生の測定、またはフローサイトメトリーなどの技法によるＴ細胞表面マーカーの検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、それを必要とする対象において、メモリーＴ細胞応答を誘導することを含む。ある特定の実施形態では、メモリーＴ細胞応答は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２の投与前のメモリーＴ細胞応答と比較して少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。
一実施形態では、対象におけるメモリーＴ細胞応答は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるメモリーＴ細胞応答は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。メモリーＴ細胞応答は、当技術分野における適用、例えば、メモリーＴ細胞と関連するＴ細胞マーカーの測定、メモリー免疫応答と関連する局所的サイトカイン産生の測定、またはフローサイトメトリーなどの技法によるメモリーＴ細胞表面マーカーの検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させる。ある特定の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比は、対象における（ｉ）ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、もしくはＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の、（ｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞に対する比によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、Ｔｒｅｇ細胞の数の減少と相関する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２（単独で、または抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて）の投与後のエフェクター対サプレッサーＴ細胞比、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞比は、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約２．５：１、少なくとも約３：１、少なくとも約３．５：１、少なくとも約３．５：１、少なくとも約４：１、少なくとも約４．５：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約３５：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約４５：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約７０：１、少なくとも約８０：１、少なくとも約９０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約１１０：１、少なくとも約１２０：１、少なくとも約１３０：１、少なくとも約１４０：１、少なくとも約１５０：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約２５０：１、または少なくとも約５００：１である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＩＬ１２（単独で、または抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて）の投与後のエフェクター対サプレッサーＴ細胞比、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞比は、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、または少なくとも約５００である。
一実施形態では、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比の増大は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比は、当技術分野における適用を使用して、例えば、ＩＨＣおよび／またはフローサイトメトリーを含む当技術分野において公知の任意の方法を使用してＣＤ８＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の、Ｔｒｅｇ細胞に対する比を測定することによって、測定することができる。
ある特定の実施形態では、本方法による活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ６２＋（Ｌ－セレクチン＋）細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ４０Ｌ＋細胞、ＣＤ１３７＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ７１＋細胞、ＣＤ２６＋細胞、ＣＤ２７＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ３０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１５４＋細胞、ＣＤ１３４＋細胞、ＣＸＣＲ３＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞、ＣＣＲ６＋細胞、ＣＣＲ７＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、Ｃｒｔｈ２＋細胞、ガンマデルタＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法による活性化Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞である。他の実施形態では、本方法によって活性化されたＴ細胞は、Ｔｈ２細胞である。他の実施形態では、本開示によって活性化されるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。
一部の実施形態では、本方法による浸潤Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ６２＋（Ｌ－セレクチン＋）細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ４０Ｌ＋細胞、ＣＤ１３７＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ７１＋細胞、ＣＤ２６＋細胞、ＣＤ２７＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ３０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１５４＋細胞、ＣＤ１３４＋細胞、ＣＸＣＲ３＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞、ＣＣＲ６＋細胞、ＣＣＲ７＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、Ｃｒｔｈ２＋細胞、ガンマデルタＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法による浸潤Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞である。他の実施形態では、本方法による浸潤Ｔ細胞は、Ｔｈ２細胞である。他の実施形態では、本開示による浸潤Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。
一部の実施形態では、本方法によって誘導されるメモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ６２＋（Ｌ－セレクチン＋）細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ４０Ｌ＋細胞、ＣＤ１３７＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ７１＋細胞、ＣＤ２６＋細胞、ＣＤ２７＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ３０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１５４＋細胞、ＣＤ１３４＋細胞、ＣＸＣＲ３＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞、ＣＣＲ６＋細胞、ＣＣＲ７＋細胞、ＣＸＣＲ５＋細胞、Ｃｒｔｈ２＋細胞、ガンマデルタＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法によるメモリーＴ細胞は、Ｔｈ１細胞である。他の実施形態では、本方法によるメモリーＴ細胞は、Ｔｈ２細胞である。他の実施形態では、本開示によるメモリーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、本開示は、腫瘍に対する獲得免疫応答、自然免疫応答、または獲得免疫応答および自然免疫応答の両方を誘導する方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を含む。
本開示は、さらに、それを必要とする対象において、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増大させる方法であって、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。一態様では、対象におけるＮＫ細胞の数の増大は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるＮＫ細胞の数の増大は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。対象におけるＮＫ細胞の数の増大は、当技術分野における適用、例えば、ＮＫ細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３３５／ＮＫｐ４６；ＣＤ３３６／ＮＫｐ４４；ＣＤ３３７／ＮＰｐ３０）または細胞内ＮＫ細胞マーカー（例えば、パーフォリン、グランザイム、グラニュライシン）の検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、対象における活性化ＮＫ細胞の数を、投与前の活性化ＮＫ細胞の数と比較して、増大させる。一部の実施形態では、活性化ＮＫ細胞の数は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。一部の実施形態では、活性化ＮＫ細胞の増大は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、または少なくとも約２８日間維持される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、対象の腫瘍における交差提示樹状細胞の数を、投与前の腫瘍における交差提示樹状細胞の数と比較して、増大させる。一部の実施形態では、腫瘍中の交差提示樹状細胞の数は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍だけ増大する。一部の実施形態では、腫瘍中の交差提示樹状細胞の増大は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、または少なくとも約２８日間維持される。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、腫瘍を有する対象におけるＩＦＮγ発現を増大させる方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独であるいは第２の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を対象とする。
他の実施形態には、腫瘍を有する対象におけるＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５／１５Ｒ、ＩＬ－２７、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－１α、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、またはこれらの任意の組合せの発現を増大させる方法であって、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独でまたは本明細書に開示される別の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法も含まれる。さらに他の実施形態では、本開示の方法には、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－３、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－６、またはこれらの任意の組合せの発現を誘導する方法が含まれ得る。
ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドは、直接的または間接的にのいずれかで、腫瘍に投与するのに好適な医薬組成物として製剤化され得る。「腫瘍」という用語は、本明細書において広義に使用され、生理学的機能を有さず、通常は急速な無制御な細胞増殖により生じる、組織のあらゆる異常な新成長を指す。本明細書において使用されるとき、「腫瘍」という用語は、良性腫瘍および悪性腫瘍の両方に関する。
本開示のある特定の態様は、単回投与用量の、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、単独でまたは本明細書に開示される任意の薬剤と組み合わせて腫瘍内投与する方法を提供する。そのような実施形態では、ＩＬ１２をコードするｍＲＮＡは、１回のみ投与され得、一方で、他の薬剤は、その通常の投薬スケジュールに従って、定期的に投与され得る。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの投与の前に投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、例えば、本明細書に開示される化合物１８において、製剤化される。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、一部の態様では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドおよび／または本明細書に開示される脂質ナノ粒子製剤の腫瘍内送達は、抗腫瘍有効性を誘発し、腫瘍を処置するための投薬に十分な単回用量の投与を可能にする。ＩＬ－１２によって誘導されるＩＦＮγの潜在的毒性を考慮すると、本開示のポリヌクレオチドのこの単回投薬レジメンは、処置を必要とする対象にとって有益であり得る。
ある特定の実施形態では、本方法は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの単回用量を、第２の薬剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせて投与することを含み、この第２の薬剤は、その通常の（例えば、承認されている）スケジュールに従って同様に単回投与で提供されてもよく、または複数回投与で提供されてもよい。他の実施形態では、方法は、任意選択で、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの２回以下の投与、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの３回以下の投与、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの４回以下の投与、またはＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの５回以下の投与を含む。
他の実施形態では、本方法は、アブスコパル効果、例えば、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡによる、腫瘍の局所的な処置、例えば、腫瘍内送達が、処置された腫瘍の退縮だけでなく、局所的な処置の範囲外の腫瘍（「遠位腫瘍」）の退縮も引き起こす、腫瘍の処置をもたらし得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、遠位腫瘍のサイズを低減する。ある特定の実施形態では、投与は、第１の腫瘍に対して腫瘍内であり、この投与は、第２の遠位腫瘍のサイズを低減する。一部の実施形態では、遠位腫瘍のサイズは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％だけ低減される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、遠位腫瘍の成長を阻害する。ある特定の実施形態では、投与は、第１の腫瘍に対して腫瘍内であり、この投与は、第２の遠位腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、遠位腫瘍の成長は、少なくとも約７日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２か月間、少なくとも約３か月間、少なくとも約４か月間、少なくとも約５か月間、少なくとも約６か月間、少なくとも約７か月間、少なくとも約８か月間、少なくとも約９か月間、少なくとも約１０か月間、少なくとも約１１か月間、少なくとも約１２か月間、少なくとも約１８か月間、少なくとも約２４か月間、少なくとも約３０か月間、少なくとも約３６か月間、少なくとも約４年間、または少なくとも約５年間阻害される。
本明細書に開示される腫瘍内投与のための医薬組成物を使用した、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの腫瘍への送達により、
（ｉ）腫瘍におけるポリヌクレオチドの保持が増大され得る、
（ｉｉ）腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルが、腫瘍周囲の組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較して、増大され得る、
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織（例えば、腫瘍周囲組織、もしくは遠位位置、例えば、肝臓組織）への漏出が減少され得る、または
（ｉｖ）これらの任意の組合せが起こり得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物（例えば、式（Ｉ）の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、ＭＣ３によって置換されている、組成物）と比べたものである。
一実施形態では、漏出の減少は、非腫瘍組織、例えば、腫瘍周囲組織、または別の組織もしくは器官、例えば、肝臓組織におけるポリペプチドの発現に対する、腫瘍におけるポリペプチドの発現の比の減少として定量化することができる。
ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの腫瘍への送達は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドを含む、例えば、ナノ粒子形態の、本明細書に開示される医薬組成物を、対象に投与することを含み、ここで、医薬組成物の投与は、腫瘍を組成物と接触させることを含む。
ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである事例では、腫瘍内の細胞を、医薬組成物と接触させると、翻訳可能なｍＲＮＡが、細胞内で翻訳されて、目的のポリペプチドが産生され得る。しかしながら、実質的に翻訳可能ではないｍＲＮＡもまた、腫瘍に送達され得る。実質的に翻訳可能ではないｍＲＮＡは、ワクチンとして有用であり得る、および／または細胞の翻訳成分を封鎖して、細胞における他の種の発現を低減することができる。
本明細書に開示される医薬組成物により、特異的送達を増大させることができる。本明細書において使用されるとき、「特異的送達」という用語は、本明細書に開示される医薬組成物（例えば、ナノ粒子形態）による、目的の標的組織（例えば、腫瘍）への、標的外組織（例えば、哺乳動物の肝臓）へと比較してより多くの（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの送達を意味する。
特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、例えば、
（ｉ）組織の重量に対する、組織内の、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量、
（ｉｉ）組織の重量に対する、組織内のポリヌクレオチドの量、または
（ｉｉｉ）組織内の総タンパク質の量に対する、組織内の、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量
を比較することによって測定することができる。
腫瘍または腫瘍内の特定のクラスの細胞への特異的な送達は、医薬組成物を対象に投与したときに、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、標的到達地（例えば、標的組織）に、他の標的外到達地と比べて高い比率で送達されることを示す。
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む医薬組成物（例えば、ナノ粒子形態）を腫瘍に投与する場合に、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを腫瘍内に送達するための方法を提供する。腫瘍内投与は、
（ｉ）腫瘍におけるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの保持の増大、
（ｉｉ）腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルの、腫瘍周囲組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較した、増大、
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織（例えば、腫瘍周囲組織、または遠位位置、例えば、肝臓組織への）への漏出の減少、ならびに
（ｉｖ）これらの任意の組合せ
からなる群から選択される１つまたは複数の特性を示し得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物（例えば、式（Ｉ）の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、ＭＣ３によって置換されている、組成物）と比べたものである。
一実施形態では、漏出の減少は、非腫瘍組織、例えば、腫瘍周囲組織、または別の組織もしくは器官、例えば、肝臓組織におけるポリペプチドの発現に対する、腫瘍におけるポリペプチドの発現の比の減少として定量化することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物を使用することにより結果として生じる送達における別の特性は、他の脂質成分を使用して同じ治療剤または治療剤をコードするポリヌクレオチドを送達した場合に観察される免疫応答に対する、免疫応答の低減である。
したがって、本開示は、対象の腫瘍組織における治療剤（例えば、医薬組成物の一部として投与されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは投与の結果として発現されるポリペプチド）の保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、腫瘍組織における治療剤の保持が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の腫瘍組織における治療剤の保持と比較して増大する、方法を提供する。
対象の腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持と比較して増大する方法もまた、提供される。
対象の腫瘍組織における発現されるポリペプチドの保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に投与するステップを含み、医薬組成物が、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、腫瘍組織における発現されるポリペプチドの保持が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の腫瘍組織におけるポリペプチドの保持と比較して増大する、方法もまた、提供される。
本開示はまた、それを必要とする対象に腫瘍内投与されるポリヌクレオチドの発現漏出を減少させる方法であって、前記ポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物として腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、非腫瘍組織におけるポリペプチドの発現レベルが、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の非腫瘍組織におけるポリペプチドの発現レベルと比較して減少する、方法を提供する。
それを必要とする対象に腫瘍内投与される治療剤（例えば、医薬組成物の一部として投与されるポリペプチド）の発現漏出を減少させる方法であって、治療剤を、本明細書に開示される医薬組成物として腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、非腫瘍組織における治療剤の量が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の非腫瘍組織における治療薬の量と比較して減少する、方法もまた、提供される。
対象の腫瘍における発現されるポリペプチドの発現漏出を減少させる方法であって、腫瘍組織に、本明細書に開示される医薬組成物を投与するステップを含み、医薬組成物が、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、非腫瘍組織における発現されるポリペプチドの量が、対応する参照組成物（例えば、ＭＣ３）を投与した後の非腫瘍組織における発現されるポリペプチドの量と比較して減少する、方法もまた、提供される。
一部の実施形態では、非腫瘍組織は、腫瘍周囲組織である。他の実施形態では、非腫瘍組織は、肝臓組織である。
本開示はまた、医薬組成物、例えば、当技術分野において公知の脂質を含む医薬組成物の腫瘍内投与によって引き起こされる免疫応答を、そのような組成物中の１つまたはすべての脂質を式（Ｉ）の化合物で置き換えることによって、低減または予防するための方法を提供する。例えば、ＭＣ３（または当技術分野において公知の他の脂質）を含む医薬組成物におけるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与によって引き起こされる免疫応答は、ＭＣ３を、式（Ｉ）の化合物、例えば、化合物１８で置き換えることによって、予防（回避）または緩和することができる。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物において投与した後に観察される免疫応答は、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または別の生理学的緩衝溶液（例えば、リンガー溶液、タイロード溶液、ハンクス平衡塩類溶液など）において投与した場合に観察される免疫応答と比較して、上昇しない。
一部の実施形態では、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物において投与した後に観察される免疫応答は、ＰＢＳまたは別の生理学的緩衝溶液を単独で投与した場合に観察される免疫応答と比較して、上昇しない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物を対象に腫瘍内投与した場合に、免疫応答は観察されない。
したがって、本開示はまた、それを必要とする対象に、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達する方法であって、対象に、本明細書に開示される医薬組成物を腫瘍内投与するステップを含み、医薬組成物の投与によって引き起こされる免疫応答が、
（ｉ）ＰＢＳ単独または別の生理学的緩衝溶液（例えば、リンガー溶液、タイロード溶液、ハンクス平衡塩類溶液など）、
（ｉｉ）ＰＢＳまたは別の生理学的緩衝溶液における、治療剤、またはＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
（ｉｉｉ）対応する参照組成物、すなわち、式（Ｉ）の化合物が、別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、ＭＣ３で置換された、同じ医薬組成物
の腫瘍内投与によって引き起こされる免疫応答と比較して、上昇しない方法を提供する。
ある特定の実施形態では、投与により、がんが処置される。
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、腫瘍内、腸内、胃腸内、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳内に）、側脳室内（脳室内に）、皮膚上（皮膚の上への適用）、皮内（皮膚そのものに）、皮下（皮膚の下に）、鼻内投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、腹腔内（腹膜に）、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入もしくは注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（陰茎の基底部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、吹送（吸飲）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、または点耳を含むがこれらに限定されない、利用可能な任意の経路で投与され得る。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、非経口（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内への注射もしくは注入技法を含む）、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して、投与される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、組成物、またはポリペプチドは、皮下、静脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、皮内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して、投与される。１つの特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、腫瘍内投与される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末／粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、ＲＦエネルギー、電流を利用するデバイス、またはこれらの任意の組合せによって送達される。
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の、哺乳動物対象への移植に関する。細胞の、哺乳動物対象への投与は、当業者には公知であり、これには、局所的埋込み（例えば、局所もしくは皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば、静脈内注射もしくは吸入）、および薬学的に許容される担体における細胞の製剤化が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、約０．１０μｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇの量で投与される。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象の細胞におけるＩＬ１２の発現をもたらす。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象におけるＩＬ１２活性の増大をもたらす。例えば、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与する方法において使用され、ここで、この方法は、対象の少なくとも一部の細胞においてＩＬ１２活性の増大をもたらす。
一部の実施形態では、対象に対するＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、およびＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物又は製剤の投与は、正常対象において予測される活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％またはそれより大きなレベルまでの細胞対象におけるＩＬ１２活性の増大をもたらす。
本開示の他の実施形態はまた、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを、１つまたは複数の抗がん剤とともに投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害するために使用することができる。
一部の実施形態では、腫瘍は、疾患、障害、および／または状態と関連している。特定の実施形態では、疾患、障害、および／または状態は、がんである。したがって、一態様では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびにＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の投与により、がんが処置される。
「がん」は、身体における異常な細胞の無制御な成長により特徴付けられる様々な疾患の広範な群を指す。制御されない細胞の分裂および成長は、近傍の組織に侵入し、またリンパ系または血流を通じて身体の遠位部分に転移し得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。「がん」または「がん組織」は、様々なステージの腫瘍を含み得る。ある特定の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージ０であり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、発達の非常に初期にあり、転移はしていない。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージＩであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、比較的サイズが小さく、近傍の組織に拡がっておらず、転移していない。他の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＩまたはステージＩＩＩであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、ステージ０またはステージＩよりも大きく、成長して近傍の組織に入っているが、リンパ節への可能性を除き転移はしていない。他の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＶであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、転移している。ステージＩＶはまた、進行性がんまたは転移性がんとも称され得る。
一部の態様では、がんは、これらに限定されないが、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せを含み得る。
一部の態様では、腫瘍は、固形腫瘍である。「固形腫瘍」としては、肉腫、黒色腫、癌腫、または他の固形腫瘍がんが挙げられるが、これらに限定されない。「肉腫」は、胚結合組織のような物質からできた腫瘍を指し、通常、線維性物質または均質な物質に包埋された緊密に詰まった細胞から構成される。肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバメシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、包巣状軟部肉腫（ａｌｖｅｏｌａｒ ｓｏｆｔ ｐａｒｔ ｓａｒｃｏｍａ）、エナメル上皮肉腫、ブドウ状横紋筋肉腫、緑色肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉細胞腫肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、または末梢血管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「黒色腫」という用語は、皮膚または他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を指す。黒色腫としては、例えば、末端性黒子性黒色腫（ａｃｒａ－ｌｅｎｔｉｇｉｎｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子性黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤し、転移を生じる傾向にある上皮細胞からできた、悪性の新成長を指す。例示的な癌腫としては、例えば、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌、腺様嚢胞癌、腺腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質の癌腫、肺胞上皮癌、肺胞上皮細胞癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、脳状癌（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞癌、絨毛膜癌、膠様癌、面疱癌、体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱状癌、円柱細胞癌、管癌、緻密性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｕｒｕｍ）、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌、咽頭扁桃上皮癌、外方増殖性癌、潰瘍癌、線維性癌、ゼラチン性癌、ゼラチン状癌、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌（ｈｅｍａｔｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、副腎様癌（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、幼児型胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペッカー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ－ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、髄質様癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、紐状癌（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌、毛細血管拡張様癌、移行細胞癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌、または絨毛癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｆｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
処置することができるさらなるがんは、例えば、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、肺がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃がん、結腸がん、悪性膵臓インスリノーマ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前悪性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、乳頭様甲状腺がん、神経芽細胞腫、神経内分泌がん、食道がん、泌尿生殖器管がん、悪性高カルシウム血症、子宮頸がん、子宮内膜がん、副腎皮質がん、前立腺がん、ミュラー管がん、卵巣がん、腹膜がん、卵管がん、または子宮漿液性乳頭状癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が挙げられる。
２．組合せ療法
本開示は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするＯＲＦ（例えば、ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド、または組合せ療法としての、すなわち、任意の他の抗がん剤との組合せでのその使用をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ、または組合せ療法としての、すなわち、任意の他の抗がん剤との組合せでのその使用を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、１つもしくは複数の抗がん剤と組み合わせた、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、もしくはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド、または対象への１つもしくは複数の抗がん剤と組み合わせたポリヌクレオチドの使用を対象とする。一実施形態では、組合せ療法は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数の標準的な治療法との組合せであり得る。別の実施形態では、本開示の方法は、２つの追加の抗がん剤、３つの追加の薬剤、４つの追加の薬剤などを含む。追加の抗がん剤は、タンパク質、例えば、抗体、またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡである。他の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、腫瘍抗原でも腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡでもない。他の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、タンパク質、例えば、抗体である。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認された薬剤である。他の実施形態では、１つまたは複数の抗がん剤は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって予備承認された（ｐｒｅ－ａｐｐｒｏｖｅｄ）薬剤である。
当業者であれば、本開示の代替的な実施形態には、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質として、ＩＬ１２と、任意の他の薬剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および／もしくは抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはＯＸ４０Ｌとの組合せ療法が含まれることも認識するであろう。例えば、本開示は、（ｉ）ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）と抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むタンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）と抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む第２のタンパク質、または（ｉｖ）ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）とＯＸ４０Ｌを含む第２のタンパク質の組合せ療法を包含する。他の実施形態では、ＩＬ１２はまた、タンパク質として投与することもできる。
他の実施形態では、追加の薬剤は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡと一緒に製剤化されてもよく、または別個に製剤化されてもよい。さらに、別個に製剤化される場合であっても、追加の薬剤は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドと同時または逐次的に投与することができる。一実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドは、第２の薬剤の前に投与される。別の実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドは、第２の薬剤の後に投与される。
ある特定の実施形態では、追加の薬剤、例えば、本明細書に開示される任意の抗体またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドもまた、腫瘍内投与される。他の実施形態では、第２の薬剤、例えば、本明細書に開示される任意の抗体またはＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドは、異なる経路を介して、例えば、静脈内、皮下、腹腔内などで投与される。
一部の態様では、本方法または組成物の対象は、１つまたは複数の標準的な治癒療法による処置を受けている。別の態様では、本方法または組成物の対象は、１つまたは複数の標準的な治癒療法または抗がん療法に対して応答性ではなかった。一態様では、対象は、これまでに、ＩＬ１２タンパク質またはＩＬ１２ ＤＮＡ遺伝子療法により処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ－１アンタゴニストまたは抗ＣＴＬＡ－４アンタゴニストで処置される。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ－１に結合するモノクローナル抗体で、および／または本開示のポリヌクレオチドの前に、ＣＴＬＡ－４に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体および／または抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体療法で処置されている。
近年、治療目的での免疫チェックポイント阻害剤の導入は、がんの処置に革命を起こした。チェックポイント阻害剤と、他の共刺激または阻害性分子との組合せを特徴とする治療法に、関心が持たれている。
Ｔ細胞の制御、すなわち、活性化または阻害は、共刺激シグナルまたは共阻害性シグナルによって媒介される。この相互作用は、リガンド／受容体の相互作用を介して発生する。Ｔ細胞は、ＯＸ４０などの活性化受容体およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）などの阻害性受容体（すなわち、免疫チェックポイント）の両方を無数に保有している（Ｍｅｌｌｍａｎら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ．、４８０巻、４８０～４８９頁）。この免疫チェックポイントの活性化は、Ｔ細胞の脱活性化をもたらし、腫瘍細胞によりこれらの経路が奪われることは、腫瘍細胞の免疫脱出の成功に寄与する。
一部の実施形態では、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害する方法は、対象に、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
一部の実施形態では、方法は、第２の薬剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、当該分野において公知または本明細書に記載される任意のチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＯＸ４０ＬをコードするＯＲＦを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、本明細書に開示の任意の他の薬剤、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む組成物は、１つより多くのチェックポイント阻害剤を含む。１つの特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片であるＰＤ－１に特異的に結合する抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片であるＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片であるまたはそれらの組合せである。一実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片である。他の実施形態では、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体は、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片である。他の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体は、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片である。
プログラム死受容体１／プログラム死リガンド１（ＰＤ－１／ＰＤＬ－１）とＰＤＬ－２との間の相互作用を標的とするペンブロリズマブまたはニボルマブなどの免疫チェックポイント阻害剤は、近年、様々な悪性腫瘍の処置に関して承認されており、現在、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）を含むがんに関して臨床試験で調査が行われている。これらの試験から得られるデータは、これらの患者集団において、好ましい安全性および毒性プロファイルを伴った、実質的な活性を示す。
例えば、チェックポイント阻害剤は、黒色腫の処置に関して、臨床試験で試験されている。特に、フェーズＩＩＩの臨床試験では、それぞれ、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１免疫チェックポイントを標的とするイピリムマブおよびペンブロリズマブなどの治療法が、黒色腫を有する患者の３年生存率を、約７０％に引き上げ、全生存率（５年を上回る）を約３０％に引き上げたことが明らかとなっている。
同様に、チェックポイント阻害剤は、頭頸部がんの処置に関して、臨床試験で試験されている。前臨床研究では、ＨＮＳＣＣ腫瘍の４５～８０％が、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を発現することが示されている（Ｚａｎｄｂｅｒｇら、（２０１４年）、Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．、５０巻、６２７～６３２頁）。現在のところ、ＨＮＳＣＣにおいて単剤療法としてまたは組合せレジメンで免疫チェックポイント阻害剤の有効性および安全性を評価する臨床試験が、数十存在している。例えば、ＰＤ １、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ－４阻害剤による臨床試験が、ＨＮＳＣＣにおいて試験されている。ＰＤ－１抗体ペンブロリズマブが、転移性／再発性（Ｒ／Ｍ）ＨＮＳＣＣ患者において有効であり得るというデータが、フェーズ１ｂ、Ｋｅｙｎｏｔｅ－０１２フェーズＩ／ＩＩ試験で得られている（Ｃｈｅｎｇ． ＡＳＣＯ、２０１５年、口頭発表）。より最近では、無作為化ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－１４１フェーズＩＩＩ臨床試験のデータが、提示された（Ｇｉｌｌｉｓｏｎ． ＡＡＣＲ、２０１６年、口頭発表）。この研究では、白金－不応性Ｒ／Ｍ ＨＮＳＣＣ患者において２週間ごとに提供されるモノクローナルＰＤ－１抗体ニボルマブの有効性が調査された。この研究は、この研究のニボルマブアームの優位性に起因して、早期に終了した。
一態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ－１アンタゴニストで以前に処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ－１に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体療法で処置されている。他の態様では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体療法は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体で処置されている。他の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体療法は、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３、ＢＭＳ－９３６５５９、アテゾリズマブ（ａｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の態様では、対象は、本開示の組成物での処置の前に、ＣＴＬＡ－４アンタゴニストで処置されている。別の態様では、対象は、本開示の組成物の前に、ＣＴＬＡ－４に結合するモノクローナル抗体で以前に処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体で処置されている。他の態様では、抗ＣＴＬＡ－４抗体療法は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体と組み合わせて投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含み、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３、ＢＭＳ－９３６５５９、アテゾリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を対象とする。
ある特定の実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブとも称される；ＵＳ２０１４／０３４１９１７を参照されたい）またはＢＭＳ－９３６５５９（以前の１２Ａ４またはＭＤＸ－１１０５）（例えば、米国特許第７，９４３，７４３号、ＷＯ２０１３／１７３２２３を参照されたい）である。他の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）としても公知である）である。他の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、およびＲＧ７４４６としても公知である）（例えば、Ｈｅｒｂｓｔら、（２０１３年）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３１（付録）：３０００．要約；米国特許第８，２１７，１４９号）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブとも称される；Ｋｈｌｅｉｆ（２０１３年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ２０１３、２０１３年９月２７日～１０月１日、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓである。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ－１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と組み合わせて、投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含む、方法を対象とする。
一実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ－１抗体（またはその抗原結合性部分）は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ（「ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）」、ランブロリズマブ、およびＭＫ－３４７５としても公知である）は、ヒト細胞表面受容体ＰＤ－１（プログラム死－１またはプログラム細胞死－１）を対象とするヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体である。ペンブロリズマブは、例えば、米国特許第８，９００，５８７号に記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ？ｃｄｒｉｄ＝６９５７８９（最終アクセス：２０１４年１２月１４日）も参照されたい。ペンブロリズマブは、再発性または不応性黒色腫および進行性ＮＳＣＬＣの処置に関して、ＦＤＡによって承認されている。
別の実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブ（「ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）」としても公知であり、以前は５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、またはＯＮＯ－４５３８と表記されていた）は、ＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）との相互作用を選択的に予防し、それによって抗腫瘍Ｔ細胞機能の下方制御を遮断する、完全ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害剤抗体である（米国特許第８，００８，４４９号、Ｗａｎｇら、２０１４年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．、２巻（９号）、８４６～５６頁）。ニボルマブは、腎細胞癌（腎臓腺癌、または副腎腫）、黒色腫、および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む様々な進行性固形腫瘍において、活性を示している（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１２ａ；Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１４年；Ｄｒａｋｅら、２０１３年；ＷＯ２０１３／１７３２２３。
他の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＥＤＩ０６８０（以前のＡＭＰ－５１４）であり、これは、ＰＤ－１受容体に対するモノクローナル抗体である。ＭＥＤＩ０６８０は、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号Ｂ２またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ？ｃｄｒｉｄ＝７５６０４７（最終アクセス、２０１４年１２月１４日）に記載されている。
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＢＧＢ－Ａ３１７であり、これは、ヒト化モノクローナル抗体である。ＢＧＢ－Ａ３１７は、米国公開第２０１５／００７９１０９号に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４であり、これは、Ｂ７－ＤＣ Ｆｃ融合タンパク質である。ＡＭＰ－２２４は、米国公開第２０１３／００１７１９９号またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ／ｃａｎｃｅｒ－ｄｒｕｇ？ｃｄｒｉｄ＝７００５９５（最終アクセス２０１５年７月８日）において考察されている。
他の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と一緒に投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含み、例えば、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を含む。
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および／またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、例えば、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体と組み合わせて投与するステップ（例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に）を含み、例えば、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体は、イピリムマブもしくはトレメリムマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を対象とする。
例示的な臨床抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国特許第６，９８４，７２０号に開示されているヒトｍＡｂ １０Ｄ１（現在では、イピリムマブとして公知であり、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として販売されている）である。本方法に有用な別の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６としても公知である）である。トレメリムマブは、ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体である。トレメリムマブは、ＷＯ２０１２／１２２４４４、米国公開第２０１２／２６３６７７号、または国際公開第２００７／１１３６４８号Ａ２に記載されている。
一実施形態では、ＩＬ１２をコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、組み合わせて投与される。別の実施形態では、ＩＬ１２をコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、ＰＤ－１受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、またはＰＤ－Ｌ１受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分と組み合わせて、投与される。
一実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、またはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、投与される。
別の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分またはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、投与される。
さらに別の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）およびＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分およびＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分（またはそれらのポリヌクレオチド）と組み合わせて、投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、（ｉ）ＩＬ１２をコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、第１のｍＲＮＡ）、および（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分をコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、第２のｍＲＮＡ）を、単一の製剤に含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドおよびＯＸ４０Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、単一の製剤に含む。
ヒトＯＸ４０Ｌは、Ｔａｎａｋａらによって、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）に感染したヒトリンパ球の表面上において、初めて特定された（Ｔａｎａｋａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（１９８５年）、３６巻（５号）、５４９～５５頁）。ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）のリガンドである。ＯＸ４０Ｌは、ＣＤ２５２（分化クラスター２５２）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー４、ｔａｘ転写により活性化される糖タンパク質１、ＴＸＧＰ１、またはｇｐ３４とも表記されていた。ヒトＯＸ４０Ｌは、１８３アミノ酸長であり、アミノ酸１～２３の細胞質ドメイン、アミノ酸２４～５０の膜貫通ドメイン、およびアミノ酸５１～１８３の細胞外ドメインという３つのドメインを含有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドと組み合わせられ得るＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物のＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、哺乳動物のＯＸ４０Ｌポリペプチドは、マウスＯＸ４０Ｌポリペプチドである。一部の実施形態では、哺乳動物のＯＸ４０Ｌポリペプチドは、ヒトＯＸ４０Ｌポリペプチドである。一部の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、表１に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の各ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、すなわち、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよびＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、哺乳動物のＩＬ１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、哺乳動物のＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、マウスＩＬ１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、マウスＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＯＸ４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ヒトＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドは、表４に示されるヒトアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、表１に示されるヒトアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、表１に列挙されるアミノ酸配列または表１に列挙されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列はＯＸ４０受容体に結合することができる。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるＯＸ４０Ｌポリペプチドは、１つまたは複数の保存的置換を有する、表１に列挙されるアミノ酸配列を含み、ここで、この保存的置換は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドのその受容体への結合活性に有意に影響を及ぼさない、すなわち、ＯＸ４０Ｌポリペプチドは、置換後にＯＸ４０受容体に結合する。
他の実施形態では、ＯＸ４０Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、ｍＲＮＡ）は、表１に列挙される核酸配列に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である配列を含む。当業者であれば、配列が、本出願において、ＤＮＡの形態（チミジンを含有する）で記述されている場合、対応するＲＮＡ配列は、チミジンの代わりにウリジンを含有することを理解する。
一部の実施形態では、本方法および組成物に有用なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの膜貫通ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインおよびＯＸ４０Ｌの膜貫通をコードするオープンリーディングフレームを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインおよびＯＸ４０Ｌの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン、ＯＸ４０Ｌの膜貫通、およびＯＸ４０Ｌの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。
表１は、例えば、ＯＸ４０Ｌの前駆体および成熟配列、ならびにＯＸ４０Ｌ配列を含む構築物を提示する。さらに、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドを含み、３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲなどの構成要素をさらに含む、構築物は、ＯＸ４０Ｌをコードするポリヌクレオチドと考えられるであろう。当業者であれば、表１に開示される天然のシグナル配列およびプロペプチド配列（前駆体では存在しており、対応する成熟形態では不在である、配列）ならびに表１に開示される非天然のシグナルペプチドに加えて、その他のシグナル配列が使用され得ることを理解するであろう。したがって、表１によるＯＸ４０Ｌポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの言及は、当技術分野において公知の代替的なシグナルペプチド（またはコーディング配列）がＯＸ４０Ｌポリペプチド（またはポリヌクレオチド）に結合されているバリアントを包含する。本出願全体を通じて、表１に開示される配列への言及は、本出願が出願された時点で当技術分野において公知のそれらの配列のオルソログおよび機能的バリアント（例えば、多形体バリアント）ならびにアイソフォームにも同等に適用可能であり、それらを包含することも、理解されたい。
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３．インターロイキン－１２（ＩＬ１２）
ＩＬ１２（ＩＬ－１２とも示される）は、多面的サイトカインであり、その作用により、自然免疫と獲得免疫との間の相互接続が形成される。ＩＬ１２は、主として、ｐ３５およびｐ４０というジスルフィド結合された２つのサブユニットからなる、７０ｋＤａのヘテロダイマータンパク質として機能する。ＩＬ１２ ｐ４０サブユニット（ＮＭ＿００２１８７；Ｐ２９４６０；ＩＬ１２Ｂ、ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２とも称される）の前駆体形態は、３２８アミノ酸長であるが、その成熟形態は、３０６アミノ酸長である。ＩＬ１２ ｐ３５サブユニット（ＮＭ＿０００８８２；Ｐ２９４５９；ＩＬ１２Ａ、ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１とも称される）の前駆体形態は、２１９アミノ酸長であり、成熟形態は、１９７アミノ酸長である。（同書）。ＩＬ１２ ｐ３５およびｐ４０サブユニットの遺伝子は、異なる染色体に存在し、互いに独立して制御されている。Ｇａｔｅｌｙ， ＭＫら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻：４９５～５２１頁（１９９８年）。多数の異なる免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびＢ細胞）は、抗原刺激時にＩＬ１２を産生する。活性なＩＬ１２ヘテロダイマーは、タンパク質合成後に形成される。（同書）。
ＩＬ１２は、４つのアルファヘリックスのバンドルから構成される。これは、２つの別個の遺伝子であるＩＬ１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ１２Ｂ（ｐ４０）によってコードされるヘテロダイマーサイトカインである。活性なヘテロダイマー（「ｐ７０」と称される）およびｐ４０のホモダイマーが、タンパク質合成後に形成される。
したがって、一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２ポリペプチドは、直接またはリンカーによって融合されたＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａを含む、単一のポリペプチド鎖を含む。他の実施形態では、本開示のＩＬ１２ポリペプチドは、ＩＬ１２Ｂを含む第１のポリペプチドおよびＩＬ１２Ａを含む第２のポリペプチドという２つのポリペプチドを含む。ある特定の態様では、本開示は、ＩＬ１２ＡポリペプチドおよびＩＬ１２Ｂポリペプチドを提供し、ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂポリペプチドは、同じ鎖にあるか、または異なる鎖にある。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂポリペプチドは、野生型ＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂ配列に対する置換、ならびに挿入および／または付加、欠失および／または共有結合修飾を含有する、バリアント、ペプチド、またはポリペプチドである。一部の実施形態では、配列タグ（エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグなど）またはアミノ酸が、例えば、局在化のために、本開示のポリヌクレオチドによってコードされる配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加されてもよい。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を、任意選択で、欠失させて、断片を得てもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされるＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂ配列の置換バリアントを含み、このバリアントは、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの置換を含み得る。一部の実施形態では、置換バリアントは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。
他の実施形態では、ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂポリペプチドを融合するリンカーを含む。リンカーの非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
本開示の一部の態様は、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む脂質ナノ粒子であって、ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、脂質ナノ粒子を対象とする。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ペプチドリンカーによって、ＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ＩＬ１２Ａポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。他の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。
当業者には理解されるように、ＩＬ１２タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、および相同タンパク質（オルソログ）もまた、本開示のＩＬ１２ポリペプチドの範囲内にあると考えられる。本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定的な例は、図１～２に示されている。例えば、表２は、配列番号における相関するアミノ酸の番号付け、配列番号におけるヌクレオチド番号付け、ならびに５’ＵＴＲ、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチド、成熟ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂペプチド、ならびにリンカーを示す。
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４．ポリヌクレオチドおよびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＩＬ１２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を提供する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードし、ここで、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする単一のＯＲＦを含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、直接またはリンカーによって融合されたＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドを含む単一のＩＬ１２ポリペプチド鎖をコードし、ここで、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、
（ｉ）全長ＩＬ１２Ｂポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ｂと同じかまたは本質的に同じ長さを有する）、
（ｉｉ）全長ＩＬ１２Ｂポリペプチドの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ｂ野生型よりも短いが、ＩＬ１２Ｂ酵素活性を依然として保持している、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型ＩＬ１２Ｂタンパク質、例えば、野生型ＩＬ１２Ｂポリペプチドに対してポリペプチドのＩＬ１２Ｂ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、Ｖ３３Ｉ、Ｖ２９８Ｆ、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント））、ならびに
（ｉｖ）（ｉ）全長ＩＬ１２Ｂ野生型、その機能的断片、またはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに／または
ＩＬ１２Ａポリペプチドは、
（ｖ）全長ＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ａと同じかまたは本質的に同じ長さを有する）、
（ｖｉ）全長ＩＬ１２Ａポリペプチドの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ａ野生型よりも短いが、ＩＬ１２Ａ酵素活性を依然として保持している、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｖｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型ＩＬ１２Ａタンパク質、例えば、ｗｔＩＬ１２Ａポリペプチドに対してポリペプチドのＩＬ１２Ａ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント））、ならびに
（ｖｉｉｉ）（ｉ）全長ＩＬ１２Ａ野生型、その機能的断片、またはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチドを含む第１の鎖およびＩＬ１２Ａポリペプチドを含む第２の鎖という２つのポリペプチド鎖をコードし、ここで、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、
（ｉ）シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟ＩＬ１２Ｂポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ｂと同じかまたは実質的に同じ長さを有する）、
（ｉｉ）成熟ＩＬ１２Ｂポリペプチドのいずれかの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ｂ野生型よりも短いが、依然としてＩＬ１２Ｂ酵素活性を保持する、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている、全長、成熟、または短縮型ＩＬ１２Ｂタンパク質、例えば、野生型ＩＬ１２Ｂポリペプチドに対して、ポリペプチドのＩＬ１２Ｂ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、Ｖ３３Ｉ、Ｖ２９８Ｆ、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント））、ならびに
（ｉｖ）（ｉ）シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟ＩＬ１２Ｂ野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに／または
ＩＬ１２Ａは、
（ｖ）シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟ＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型ＩＬ１２Ａと同じかまたは実質的に同じ長さを有する）、
（ｖｉ）野生型ＩＬ１２Ａポリペプチドのいずれかの機能的断片（例えば、ＩＬ１２Ａ野生型よりも短いが、依然としてＩＬ１２Ａ酵素活性を保持する、短縮型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｖｉｉ）そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長、成熟、または短縮型ＩＬ１２Ａタンパク質、例えば、参照アイソフォームに対して、ポリペプチドのＩＬ１２Ａ活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント（例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント））、ならびに
（ｖｉｉｉ）（ｉ）シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟ＩＬ１２Ａ野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および（ｉｉ）異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、哺乳動物のＩＬ１２ポリペプチド、例えば、ヒトＩＬ１２ポリペプチド、機能的断片またはそのバリアントをコードする。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞に導入されたとき、これらの細胞においてＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａタンパク質発現レベルおよび／または検出可能なＩＬ１２酵素活性レベルを、本開示のポリヌクレオチドの投与前の細胞におけるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａタンパク質発現レベルおよび／または検出可能なＩＬ１２酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％だけ増大させる。ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａタンパク質の発現レベルならびに／またはＩＬ１２酵素活性は、当技術分野において公知の方法に従って測定することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入される。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ（図１を参照）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コドン最適化核酸配列を含み、コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は野生型ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂ配列に由来する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの全長配列（すなわち、開始メチオニンおよびシグナルペプチドを含む）を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む。成熟ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａでは、開始メチオニンおよび／またはシグナルペプチドを、除去して、それぞれ、配列番号１および配列番号３のアミノ酸残基を含む「成熟ＩＬ１２Ｂ」および／または「成熟ＩＬ１２Ａ」を得ることができる。それぞれ、配列番号１は、配列番号４８のアミノ酸２３～３２８に対応し、配列番号３は、配列番号４８のアミノ酸３３６～５３２に対応する。ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの全配列を対象とする本開示の教示は、開始メチオニンおよび／またはシグナルペプチドを欠くヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの成熟形態にも適用可能である。したがって、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａの成熟配列を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ配列において少なくとも１の点変異、少なくとも２の点変異、少なくとも３変異、少なくとも４変異、少なくとも５変異、少なくとも６変異、少なくとも７変異、少なくとも８変異、少なくとも９変異、または少なくとも１０変異を含み、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を保持するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ（すなわち、１または複数の変異がない以外は同じ）のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％であるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を変化させない変異を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。そのような変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、機能的に中立と称され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の機能的に中立な点変異を含む変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａより高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を有する。一部の実施形態では、変異体ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ（すなわち、１または複数の変異がない以外は同じＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ）の活性より少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、機能的ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、例えば、１つもしくは複数の断片は、野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を保持する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片は、対応する全長ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡのＩＬ１２活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％であるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。一部の実施形態では、機能的ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対応する全長ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａよりも高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ酵素活性を有するＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片は、対応する全長ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡのＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％高いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ活性を有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａより少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、これは、
（ｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１８またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１７のヌクレオチド６７～９８４あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド７０～９８７に対する少なくとも約８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６のヌクレオチドヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００６のヌクレオチド６７～９８４に対する１００％の配列同一性
を有する。
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、これは、
（ｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１４のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド１００６～１５９６あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド１００９～１５８９に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿１７のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００３のヌクレオチド１００６～１５９６に対する約１００％の配列同一性
を有する。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａをコードする単一のＯＲＦを含み、ＯＲＦは、
（ｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１８またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１７のヌクレオチド６７～９８４あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド７０～９８７に対する少なくとも約８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００６のヌクレオチド６７～９８４に対する約１００％の配列同一性；
を有する配列、ならびに
（ｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１４のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド１００６～１５９６あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド１００９～１５９９に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿１７のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００３のヌクレオチド１００６～１５９６に対する約１００％の配列同一性
を有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂをコードする第１のＯＲＦおよびＩＬ１２Ａをコードする第２のＯＲＦを含み、第１のＯＲＦは、
（ｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１８またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１７のヌクレオチド６７～９８４あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド７０～９８７に対する少なくとも約８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０のヌクレオチド６７～９８４に対する少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００６のヌクレオチド６７～９８４に対する約１００％の配列同一性
を有する配列を含み、かつ／または
第２のＯＲＦは、
（ｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１０のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１９のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１３のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００７またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０１４のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１２またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００５のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００９のヌクレオチド１００６～１５９６あるいはｈＩＬ１２ＡＢ＿００４のヌクレオチド１００９～１５９９に対する少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｖｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿１７のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｉｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２７のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３９またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０４０のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１６、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２５、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３５のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２４、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３３、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０３７、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２２のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｉｉ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２０、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０２６、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０３８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；
（ｘｉｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１５、ｈＩＬ１２ＡＢ＿０１１、またはｈＩＬ１２ＡＢ＿０２８のヌクレオチド１００６～１５９６に対する少なくとも約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性；または
（ｘｖ） ｈＩＬ１２ＡＢ＿００３のヌクレオチド１００６～１５９６に対する約１００％配列の配列同一性
を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２（配列番号６）またはｈＩＬ１２ＡＢ＿００２（配列番号６）として示される配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％配列同一であるヌクレオチド配列を含むＯＲＦを含む。
一実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列（例えば、第１のＯＲＦ）およびＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のＯＲＦ）は、直接的に、またはリンカーによって融合されている。他の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列（例えば、第１のＯＲＦ）およびＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列（例えば、第２のＯＲＦ）は、互いに融合されていない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂ－ＩＬ１２Ａ融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号５～４４からなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。表４を参照のこと。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂ－ＩＬ１２Ａ融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号５～４４からなる群から選択される配列に７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、７０％～９５％、８０％～９５％、７０％～８５％、７５％～９０％、８０％～９５％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、もしくは９５％～１００％の配列同一性を有する。表４を参照のこと。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、約９００～約１００，０００ヌクレオチド（例えば、９００～１，０００、９００～１，１００、９００～１，２００、９００～１，３００、９００～１，４００、９００～１，５００、１，０００～１，１００、１，０００～１，１００、１，０００～１，２００、１，０００～１，３００、１，０００～１，４００、１，０００～１，５００、１，０８３～１，２００、１，０８３～１，４００、１，０８３～１，６００、１，０８３～１，８００、１，０８３～２，０００、１，０８３～３，０００、１，０８３～５，０００、１，０８３～７，０００、１，０８３～１０，０００、１，０８３～２５，０００、１，０８３～５０，０００、１，０８３～７０，０００、または１，０８３～１００，０００）を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂ－ＩＬ１２Ａ融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも、もしくは約５００、６００、７００、８０、９００、１，０００、１，０５０、１，０８３、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００より大きい、または１００，０００を含め、これまでのヌクレオチド）である。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ノンコーディングである少なくとも１つの核酸配列、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含むＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／または、一本鎖または二本鎖であるＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはこれとして機能する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードし、翻訳されて、コードされたＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｅｘ ｖｉｖｏで産生することができる、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～１４７のうちのいずれか、または化合物１～２３２のうちのいずれかとともに、製剤化される。
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）はまた、コードされるポリペプチドの、治療上関連する部位への輸送を促進する、追加の特徴をコードするヌクレオチド配列を含む。タンパク質輸送を補助する１つのそのような特徴は、シグナル配列または標的化配列である。これらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、およびシグナルペプチドを含め、様々な名称で公知である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
一部の実施形態では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、約９～２００ヌクレオチド長（３～７０アミノ酸）であり、任意選択で、それぞれ、コーディング領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）に組み込まれた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加により、１つまたは複数の標的化経路を通じた、コードされるポリペプチドの所望される部位、例えば、小胞体またはミトコンドリアへの輸送がもたらされる。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が所望される部位に輸送された後に、例えば、シグナルペプチダーゼによって、タンパク質から切断される。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、天然のシグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、天然のシグナルペプチドをコードする核酸配列を欠く。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＯＲＦの５’末端に位置するシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
一部の実施形態では、第１のＯＲＦは、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである。
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４８のアミノ酸１～２２に少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
提供されるＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＤＮＡ配列（例えば、ウラシルからチミンへの変換）を理解するであろう。同様に、提供されるＤＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＲＮＡ配列（例えば、チミンからウラシルへの変換）を理解するであろう。
５．キメラタンパク質
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つまたは複数の目的のポリペプチドをコードする１つより多くの核酸配列（例えば、１つより多くのＯＲＦ）を含み得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする単一のＯＲＦを含む。しかしながら、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、１つより多くのヌクレオチド配列、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能的断片、もしくはバリアントをコードする第１のヌクレオチド配列、ＩＬ１２Ａポリペプチド（第２の目的のポリペプチド）、その機能的断片、もしくはバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列、および第３の目的のポリペプチド（例えば、ＩＬ１２に対して異種のポリペプチド）を発現する第３のヌクレオチド配列を含んでもよい。一実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ｂポリペプチドに融合され得る。別の実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ａポリペプチドに融合され得る。他の実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２Ａポリペプチドの両方に融合され得る。さらなる実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３つより多くのヌクレオチド配列、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能的断片、またはバリアントをコードする第１のヌクレオチド配列、ＩＬ１２Ａポリペプチド（第２の目的のポリペプチド）、その機能的断片、またはバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列、第３の目的のポリペプチドを発現する第３のヌクレオチド配列、および第４の目的のポリペプチドを発現する第４のヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態では、第３の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ａポリペプチドに融合され、第４の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、ＩＬ１２Ｂポリペプチドに融合される。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い目的のポリペプチドは、遺伝子融合され得る、すなわち、２つまたはそれよりも多いポリペプチドは、同じヌクレオチド配列によってコードされ得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多い目的のポリペプチドの間に、リンカー（例えば、Ｇ４Ｓペプチドリンカーまたは当技術分野において公知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、それぞれが目的のポリペプチドを発現する、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多いヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）、ならびに第２の目的のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）を含み得る。
６．リンカー
一態様では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａは、直接またはリンカーによって、融合され得る。他の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａは、直接またはリンカーによって、異種ポリペプチドに融合され得る。ＩＬ１２ＢをＩＬ１２Ａに、またはＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａを異種ポリペプチドに、融合するのに好適なリンカーは、ポリペプチド（もしくはペプチド）部分または非ポリペプチド部分であり得る。
本開示の一部の態様は、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ペプチドリンカーによってＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドは、ＩＬ１２Ａポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。他の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたはペプチドリンカーの５’末端に位置する。
一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸～約２００アミノ酸を含むペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、リンカーはＧＳ（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）リンカーであり得、例えば、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは１～２０の整数であり、ｍは１～２０の整数である。一部の実施形態では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、（ＧｎＳ）ｍ（配列番号２０３）を含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である。一部の実施形態では、ＧＳリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｏ（配列番号２０４）を含み得、ここで、ｏは、１～５の整数である。一部の実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号２０５）、ＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号２０６）、またはＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２０７）を含み得る。ある特定の実施形態では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である。
一部の実施形態では、本開示に好適なリンカーはＧｌｙ豊富なリンカーであり得、例えば、（Ｇｌｙ）ｐ（配列番号２０８）を含み、ここで、ｐは、１～４０の整数である。一部の実施形態では、Ｇｌｙ豊富なリンカーは、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧまたはＧＧＧＧＧＧＧＧを含み得る。
一部の実施形態では、本開示に好適なリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｑ（配列番号２０９）を含み得、ここで、ｑは、１～５の整数である。一実施形態では、本開示に好適なリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）３を含み得る。
さらなる例示的なリンカーとして、これらに限定されないが、ＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１０）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号２１１）、ＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧ（配列番号２１２）、ＧＧＳＧＧＨＭＧＳＧＧ（配列番号２１３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１４）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２１６）、ＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧ（配列番号２１７）、ＡＡＧＡＡＴＡＡ（配列番号２１８）、ＧＧＳＳＧ（配列番号２１９）、ＧＳＧＧＧＴＧＧＧＳＧ（配列番号２２０）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２２）、およびＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２２３）が挙げられる。
リンカーをコードするヌクレオチドは、本開示のヌクレオチド配列を融合するように構築され得る。提供されるＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＤＮＡ配列（例えば、ウラシルからチミンへの変換）を理解するであろう。同様に、提供されるＤＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＲＮＡ配列（例えば、チミンからウラシルへの変換）を理解するであろう。
７．ＩＬ１２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ、リンカーをコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組合せを含む。
ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする、配列最適化されたヌクレオチド配列、例えば、コドン最適化されたｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列）に対して、少なくとも１つの同義核酸塩基置換を含む、配列である。
配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照配列とは、配列が部分的または完全に異なり得る。例えば、ＴＣＴコドンによって一様にコードされるポリセリンをコードする参照配列は、ＡＧＣコドンによって一様にコードされるであろうポリセリンをコードする配列が得られるように、その核酸塩基の１００％が置換される（それぞれのコドンに関して、１位のＴがＡによって置き換えられ、２位のＣがＧによって置き換えられ、３位のＴがＣによって置き換えられる）ことによって、配列最適化され得る。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化されたポリセリン核酸配列との間のグローバルペアワイズアライメントから得られる配列同一性の百分率は、０％であろう。しかしながら、両方の配列から得られるタンパク質産物は、１００％同一である。
一部の配列最適化（コドン最適化と称されることもある）方法は、当技術分野において公知であり（以下により詳細に考察され）、１つまたは複数の所望される結果を達成するのに有用であり得る。これらの結果としては、例えば、適正なフォールディングを確保するために、ある特定の組織標的および／もしくは宿主生物におけるコドン頻度を一致させること；ｍＲＮＡの安定性を増大させるかもしくは二次構造を低減するようにＧ／Ｃ含量をバイアスすること；遺伝子の構築もしくは発現を損傷し得るタンデム反復コドンもしくは塩基の回数を最小限に抑えること；転写および翻訳調節領域をカスタマイズすること；タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること；コードされるタンパク質に翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること；タンパク質ドメインを付加、除去、もしくはその順序を入れ替えること；制限部位を挿入もしくは欠失すること；リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること；タンパク質の様々なドメインが適正にフォールディングするのを可能にするように、翻訳速度を調整すること；ならびに／またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは排除することを挙げることができる。配列最適化のツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において公知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）によるサービス、および／または専売的方法が挙げられる。
各アミノ酸のコドンの選択肢を、表３に示す。
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一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ここで、配列最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントは、改善された特性（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によってコードされるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントと比較して）、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与した後の発現有効性に関連する改善された特性を有する。そのような特性としては、核酸の安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織における翻訳有効性の増大、発現される短縮型タンパク質の数の低減、発現されるタンパク質のフォールディングの改善またはミスフォールディングの予防、発現される産物の毒性の低減、発現される産物によって引き起こされる細胞死の低減、タンパク質凝集の増大および／または減少が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列は、ヒト対象における発現のためにコドン最適化されており、当技術分野における１つまたは複数の問題を回避する構造的および／または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持しながら核酸に基づく治療薬の製剤化および送達を最適化すること、発現の閾値を克服すること、発現率を改善すること、半減期および／またはタンパク質濃度、タンパク質局在化を最適化すること、ならびに免疫応答などの有害な生体応答および／または分解経路を回避することに有用な特徴を有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、追加の目的のポリペプチド、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、マイクロＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、リンカーをコードする核酸配列、またはこれらの任意の組合せ）を含み、このヌクレオチド配列は、
（ｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１のコドンを、ウリジン修飾配列を生成するために、ウリジン含量を増大もしくは減少させるように、代替的なコドンで置換すること、
（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１のコドンを、同義コドンセットにおいてより高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換すること、
（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／もしくはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１のコドンを、Ｇ／Ｃ含量を増大させるように代替的なコドンで置換すること、または
（ｉｖ）これらの組合せ
を含む方法によって、配列最適化されている。
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも１つの改善された特性を有する。
一部の実施形態では、配列最適化方法は、多重パラメーターのものであり、本明細書に開示される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多くの方法ならびに／または当技術分野において公知の他の最適化方法を含む。
本開示の一部の実施形態において有益であると考えることができる特徴は、ポリヌクレオチドによってまたはその領域内にコードされ得、そのような領域は、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする領域の上流（５’）、下流（３’）、またはその中にあり得る。これらの領域は、タンパク質コーディング領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前および／または後に、ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。そのような特徴の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、マイクロＲＮＡ配列、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリ－Ａ尾部、および検出可能なタグが挙げられるがこれらに限定されず、ＸｂａＩ認識を有し得る多重クローニング部位が含まれ得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／またはｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含み、これらは、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、これらは、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／またはｍｉＲＮＡ結合部位の任意の部分は、すべて対象外の場合も含め、配列最適化され得、独立して、配列最適化の前および／または後に、１つまたは複数の異なる構造的または化学的修飾を含有し得る。
一部の実施形態では、最適化の後に、ポリヌクレオチドは、再構築され、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体などであるがこれらに限定されない、ベクターに形質転換される。例えば、最適化されたポリヌクレオチドは、再構築され、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ｍａｉｚｅ、ショウジョウバエなどに形質転換され得、ここで、高コピー数のプラスミド様または染色体構造体が、本明細書に記載される方法によって生じる。
８．ＩＬ１２ポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードする、配列最適化されたヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、ここで、ＯＲＦは、配列最適化されている。
ヒトＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードする例示的な配列最適化されたヌクレオチド配列を、表４Ａ～４Ｄに示す。一部の実施形態では、表４Ａ～４Ｄの配列最適化されたＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ配列、それらの断片、ならびにバリアントは、本明細書に開示される方法を実施するために使用される。一部の実施形態では、表４Ａ～４Ｄの配列最適化されたＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａ配列、それらの断片、ならびにバリアントは、図１に開示される野生型配列と組み合わされるか、またはその代替物である。提供されるＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＤＮＡ配列（例えば、ウラシルからチミンへの変換）を理解するであろう。同様に、提供されるＤＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、対応するＲＮＡ配列（例えば、チミンからウラシルへの変換）を理解するであろう。
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本明細書に開示される配列最適化されたヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列および他の公知の配列最適化されたヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化された核酸は、固有の組成特徴を有する。
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする）におけるウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率は、参照野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率に対して、修飾（例えば、低減）されている。そのような配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量の百分率は、配列中のウラシルまたはチミンの数を、ヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることによって、決定することができる。一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも低いウラシルまたはチミン含量を有する。一部の実施形態では、本開示の配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量は、参照野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも多く、参照野生型配列と比較した場合に、依然として、有益な効果、例えば、発現の増大および／またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答の低減を維持する。
一部の実施形態では、本開示の最適化された配列は、配列中に固有の範囲のウラシルまたはチミン（ＤＮＡの場合）を含有する。最適化された配列のウラシルまたはチミン含量は、様々な方式、例えば、理論上の最小値に対する最適化された配列のウラシルまたはチミンの含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）、野生型に対する含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）、および総ヌクレオチド含量に対する含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）で表すことができる。ＤＮＡについては、チミンはウラシルの代わりに存在することが認識されており、Ｕが出現するところをＴで置き換えるであろう。したがって、例えば、ＲＮＡに関する％ＵＴＭ、％ＵＷＴ、または％ＵＴＬに関連するすべての開示は、ＤＮＡに関する％ＴＴＭ、％ＴＷＴ、または％ＴＴＬに同等に適用可能である。
ウラシルまたはチミンの理論上の最小値に対するウラシルまたはチミン含量は、配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの数を、仮説上の配列におけるすべてのコドンが可能な最低のウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられた仮説上のヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略される。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９６％未満、１９５％未満、１９０％未満、１８５％未満、１８０％未満、１７５％未満、１７０％未満、１６５％未満、１６０％未満、１５５％未満、１５０％未満、１４５％未満、１４０％未満、１３９％未満、１３８％未満、１３７％未満、１３６％未満、１３５％未満、１３４％未満、１３３％未満、１３２％未満、１３１％未満、１３０％未満、１２９％未満、１２８％未満、１２７％未満、１２６％未満、１２５％未満、１２４％未満、１２３％未満、１２２％未満、１２１％未満、１２０％未満、１１９％未満、１１８％未満、１１７％未満、１１６％未満、または１１５％未満である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９６％未満かつ１００％を上回る、１０１％を上回る、１０２％を上回る、１０３％を上回る、１０４％を上回る、１０５％を上回る、１０６％を上回る、１０７％を上回る、１０８％を上回る、１０９％を上回る、１１０％を上回る、１１１％を上回る、１１２％を上回る、１１３％を上回る、１１４％を上回る、１１５％を上回る、１１６％を上回る、１１７％を上回る、１１８％を上回る、１１９％を上回る、１２０％を上回る、１２１％を上回る、１２２％を上回る、１２３％を上回る、１２４％を上回る、１２５％を上回る、１２６％を上回る、１２７％を上回る、１２８％を上回る、１２９％を上回る、または１３０％を上回る、１３５％を上回る、１３０％を上回る、１３１％を上回る、または１３２％を上回る。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１３２％～１５０％、１３３％～１５０％、１３４％～１５０％、１３５％～１５０％、１３６％～１５０％、１３７％～１５０％、１３８％～１５０％、１３９％～１５０％、１４０％～１５０％、１３２％～１５１％、１３２％～１５２％、１３２％～１５３％、１３２％～１５４％、１３２％～１５５％、１３２％～１５６％、１３２％～１５７％、１３２％～１５８％、１３２％～１５９％、１３２％～１６０％、１３３％～１５１％、１３４％～１５２％、１３５％～１５３％、１３６％～１５４％、１３７％～１５５％、１３８％～１５６％、１３８％～１５７％、１３９％～１５８％、１４０％～１５９％、もしくは１４１％～１６０％である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、約１３３％～約１５２％、例えば、１３２．３２％～１５０．５１％である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９８％未満、１９５％未満、１９０％未満、１８５％未満、１８０％未満、１７５％未満、１７０％未満、１６５％未満、１６０％未満、１５５％未満、１５０％未満、１４５％未満、１４０％未満、１３９％未満、１３８％未満、１３７％未満、１３６％未満、１３５％未満、１３４％未満、１３３％未満、１３２％未満、１３１％未満、１３０％未満、１２９％未満、１２８％未満、１２７％未満、１２６％未満、１２５％未満、１２４％未満、１２３％未満、１２２％未満、１２１％未満、１２０％未満、１１９％未満、１１８％未満、１１７％未満、１１６％未満、または１１５％未満である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１９８％未満かつ１００％を上回る、１０１％を上回る、１０２％を上回る、１０３％を上回る、１０４％を上回る、１０５％を上回る、１０６％を上回る、１０７％を上回る、１０８％を上回る、１０９％を上回る、１１０％を上回る、１１１％を上回る、１１２％を上回る、１１３％を上回る、１１４％を上回る、１１５％を上回る、１１６％を上回る、１１７％を上回る、１１８％を上回る、１１９％を上回る、１２０％を上回る、１２１％を上回る、１２２％を上回る、１２３％を上回る、１２４％を上回る、または１２５％を上回る。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、１２５％～１４３％、１２６％～１４３％、１２７％～１４３％、１２８％～１４３％、１２９％～１４３％、１３０％～１４３％、１３１％～１３２％、１３３％～１３４％、１３５％～１４３％、１２５％～１４４％、１２５％～１４５％、１２５％～１４６％、１２５％～１４７％、１２５％～１４８％、１２５％～１４９％、１２５％～１５０％、１２５％～１５１％、１２５％～１５２％、１２５％～１５３％、１２５％～１５４％、１２５％～１５５％、１２６％～１４４％、１２７％～１４５％、１２８％～１４６％、１２９％～１４７％、１３０％～１４８％、１３１％～１４９％、１３２％～１５０％、もしくは１３３％～１５１％である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の％ＵＴＭは、約１２４％～約１４５％、例えば、１２５％～１４４．４２％である。
本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列はまた、対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量に対する、そのウラシルまたはチミン含量にしたがって記載され得る（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）。
「野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量に対するウラシルまたはチミン含量」という語句は、配列最適化された核酸におけるウラシルまたはチミンの数を、対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴと略される。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、７５％を上回る、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、または９５％を上回る。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５５％～８８％、５６％～８７％、５７％～８６％、５８％～８５％、５９％～８４％、６０％～８３％、６１％～８２％、６２％～８１％、６３％～８０％、６４％～７９％、６５％～７８％、もしくは６５％～７７％である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６６％～７８％、６６％～７７％、６７％～７７％、６７％～７６％、もしくは６５％～７７％である。
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約６６％～約７７％、例えば、６７％～７６％である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、７５％を上回る、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、または９５％を上回る。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％～８５％、５１％～８４％、５２％～８３％、５３％～８２％、５４％～８１％、５５％～８０％、５６％～７９％、５７％～７８％、５８％～７７％、５９％～７６％、６０％～７５％、６１％～７４％、もしくは６２％～７３％である。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６１％～７４％、６１％～７３％、６１％～７２％、６１％～７３％、６２％～７３％、６２％～７２％、６２％～７４％、もしくは６３％～７２％である。
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約６２％～約７３％、例えば、６３％～７２％である。
総ヌクレオチド含量に対する野生型ＩＬ１２Ｂのウラシルまたはチミン含量（％）は、約２１％である。一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対するＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％）（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、２１％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、または１０％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％以上である。
一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対する本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１０％～２０％、１１％～２０％、１１．５％～１９．５％、１２％～１９％、１２％～１８％、１３％～１８％、１３％～１７％、１３％～１６％、１３％～１６％、１４％～１６％、１４％～１７％、もしくは１３％～１７％である。
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル－またはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約１３％～約１７％、例えば、１４％～１６％である。
総ヌクレオチド含量に対する野生型ＩＬ１２Ａのウラシルまたはチミン含量（％）は、約２６％である。一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対するＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％）（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、２５％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、２５％未満、２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、または１０％未満である。一部の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％以上である。
一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対する本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１０％～２５％、１１％～２５％、１２％～２５％、１３％～２５％、１４％～２５％、１５％～２５％、１６％～２５％、１０％～２４％、１０％～２３％、１１％～２２％、１１％～２１％、１１％～２０％、１１％～１９％、１１％～１８％、１２％～２４％、１２％～２３％、１３％～２２％、１４％～２１％、１３％～２０％、１５％～１９％、１５％～２０％、１６％～１９％、１６％～１８％、もしくは１３％～１７％である。
特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約１５％～約１９％、例えば、１６％～１８％である。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して、低減された数の連続したウラシルを有する。例えば、２つの連続したロイシンは、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得、これは、４ウラシルのクラスターを含む。そのような部分配列は、例えば、ＣＵＧＣＵＣで置換され得、これにより、ウラシルクラスターが除去される。
フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによってコードされ得る。したがって、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンが、ＵＵＣによって置き換えられた場合であっても、同義コドンは、依然として、ウラシルペア（ＵＵ）を含有する。したがって、配列中のフェニルアラニンの数は、コードされるポリペプチドにおけるフェニルアラニンの数を変化させずには排除することができないウラシルペア（ＵＵ）の最小の数を確立する。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列に対して、低減された数のウラシルトリプレット（ＵＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、４、３、２、１のウラシルトリプレット（ＵＵＵ）を含有するか、または全く含有しない。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の数に対して、低減された数のウラシルペア（ＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の可能な最小の数に対応する数のウラシルペア（ＵＵ）を有する。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）の数より少なく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のウラシルペア（ＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、７～１３、８～１４、９～１５、１０～１６、１１～７、１２～１８のウラシルペア（ＵＵ）を有する。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、野生型核酸配列中のウラシルペア（ＵＵ）の数より少なく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のウラシルペア（ＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、７～１３、８～１４、９～１５、１０～１６、１１～７、１２～１８のウラシルペア（ＵＵ）を有する。
「野生型核酸配列におけるウラシルペア（ＵＵ）に対するウラシルペア（ＵＵ）」という語句は、配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の数を、対応する野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルペア（ＵＵ）の総数で除し、１００を乗じることによって決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、％ＵＵｗｔと略される。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２０％未満の％ＵＵｗｔを有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、２４％～５９％の％ＵＵｗｔを有する。特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、２９％～５５％の％ＵＵｗｔを有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、１４％～５７％の％ＵＵｗｔを有する。特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、１９％～５２％の％ＵＵｗｔを有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）のうちの少なくとも９５％は、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列中のウラシルのうちの少なくとも９５％は、５－メトキシウラシルである。一部の実施形態では、ウラシル修飾された配列を含むポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、ウラシル修飾された配列を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～１４７のいずれかまたは化合物１～２３２のいずれかとともに製剤化される。
一部の実施形態では、％ＧＴＭＸと略される「ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最大グアニン含量に対する、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａをコードする配列最適化ＯＲＦのグアニン含量」は、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％である。一部の実施形態では、％ＧＴＭＸは、約７０％～約８０％、約７１％～約７９％、約７１％～約７８％、もしくは約７１％～約７７％である。
一部の実施形態では、％ＣＴＭＸと略される「ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最大シトシン含量に対するＯＲＦのシトシン含量」は、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％である。一部の実施形態では、％ＣＴＭＸは、約６０％～約８０％、約６２％～約８０％、約６３％～約７９％、もしくは約６８％～約７６％である。
一部の実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸと略される「ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の理論上の最大Ｇ／Ｃ含量に対するＯＲＦ中のグアニンおよびシトシン含量（Ｇ／Ｃ）」は、少なくとも約８１％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％である。％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９７％、もしくは約９１％～約９６％である。
一部の実施形態では、％Ｇ／ＣＷＴと略される「対応する野生型ＯＲＦ中のＧ／Ｃ含量に対するＯＲＦ中のＧ／Ｃ含量」は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、もしくは少なくとも１２０％である。
一部の実施形態では、ＯＲＦ中の３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量より少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、もしくは少なくとも３０％高い。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂおよび／またはＩＬ１２Ａポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、ここで、ＯＲＦは、配列最適化されており、％ＵＴＬ、％ＵＷＴ、％ＵＴＭ、％ＧＴＬ、％ＧＷＴ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＬ、％ＣＷＴ、％ＣＴＭＸ、％Ｇ／ＣＴＬ、％Ｇ／ＣＷＴ、または％Ｇ／ＣＴＭＸのそれぞれは、単独またはそれらの組合せで、（ｉ）パラメーターの最大値（ＭＡＸ）に、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）を加えたものに対応する最大値から、（ｉｉ）パラメーターの最小値（ＭＩＮ）から、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）を差し引いたものに対応する最小値の範囲にある。
９．配列最適化の方法
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列、例えば、ＯＲＦを含む、ポリヌクレオチド）は、配列最適化される。配列最適化されたヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書において「核酸」とも称される）は、参照配列（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする野生型配列）に対して、少なくとも１つのコドン修飾を含む。したがって、配列最適化された核酸において、少なくとも１のコドンが、参照配列（例えば、野生型配列）における対応するコドンとは異なる。
一般に、配列最適化された核酸は、参照配列におけるコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含む少なくとも１つのステップによって生成される。そのような置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化配列におけるそれぞれのアミノ酸をコードするであろうコドンを提供する表）を適用することによって、または規則のセット（例えば、グリシンが、中性アミノ酸の次にある場合、グリシンは、ある特定のコドンによってコードされるが、極性アミノ酸の次にある場合は、別のコドンによってコードされる）を適用することによって、実行され得る。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去（脱安定化モチーフ置換）など、厳密にはコドン最適化を対象とはしない追加の最適化ステップを含む。これらの配列最適化された核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物および製剤は、機能的に活性なＩＬ１２のｉｎ ｖｉｖｏ発現を促進するために、それを必要とする対象に投与され得る。
細胞培養物における大型分子の組換え発現は、多くの制限（例えば、乏しいタンパク質発現レベル、短縮された発現産物をもたらす分割された翻訳、タンパク質のミスフォールディングなど）を伴う困難な作業であり得る。これらの制限は、機能的に活性なＩＬ１２をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）またはそれを含む組成物もしくは製剤を、がんを患う患者に投与し、それによって、がんを処置するためのＩＬ１２ポリペプチドの合成および送達が内因的に生じるようにすることによって、低減または回避することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系（例えば、細胞培養物）からｉｎ ｖｉｖｏ発現へ変更するには、治療剤をコードする核酸配列の再設計が必要である。必ずしもコードされるアミノ酸配列の変化を伴うことなく、異なるコドンを選択することによって、天然に存在する遺伝子配列を再設計することにより、多くの場合、タンパク質の発現レベルに劇的な増大をもたらすことが可能である（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２巻、３４６～５３頁）。コドン適合性指標（ＣＡＩ）、ｍＲＮＡ二次構造、ｃｉｓ制御配列、ＧＣ含量などの変数、および多数の他の類似の変数は、タンパク質発現レベルといくらか相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら、２００６年、「Ｊｏｕｒｎａｌ／ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７巻、２８５頁）。しかしながら、遺伝子コードの縮重に起因して、すべてが同じ治療剤をコードする、多数の異なる核酸配列が存在する。それぞれのアミノ酸は、最大で６の同義コドンによってコードされ、これらのコドン間の選択肢が、遺伝子発現に影響を及ぼす。加えて、コドン使用頻度（すなわち、異なる生物が、ポリペプチド配列を発現するためにコドンを使用する頻度）は、生物間で異なる（例えば、ヒトまたはヒト化治療用抗体の組換え産生は、ハムスター細胞培養物において頻繁に生じる）。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、コドンマップを適用することによって配列最適化することができる。当業者であれば、以下に開示されるコドンマップにおけるＴ塩基はＤＮＡに存在し、一方で、Ｔ塩基は、対応するＲＮＡではＵ塩基によって置き換えられるであろうことを理解するであろう。例えば、ＤＮＡ形態の本明細書に開示される配列最適化された核酸、例えば、ベクターまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）鋳型は、そのＴ塩基が、その対応する転写ｍＲＮＡでは、Ｕ塩基として転写されるであろう。この点に関して、配列最適化されたＤＮＡ配列（Ｔを含む）およびそれらの対応するＲＮＡ配列（Ｕを含む）のいずれも、本開示の配列最適化された核酸と考えられる。当業者であれば、１つまたは複数の塩基を、非天然の塩基で置き換えることによって、同等のコドンマップを生成することができることも、理解するであろう。したがって、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、これは、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置き換えられているＲＮＡマップ）に対応し得る。
一実施形態では、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、またはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂの両方をコードする参照配列は、ある特定のアミノ酸をコードするすべてのコドンを、コドンマップに提供される代替的なコドンのうちの１つだけで置き換えることによって、最適化することができる。例えば、最適化された配列におけるすべてのバリンは、ＧＴＧまたはＧＴＣまたはＧＴＴによってコードされるであろう。
本開示の配列最適化されたポリヌクレオチドは、１つもしくは複数のコドン最適化方法、またはそれらの組合せを使用して、生成することができる。核酸配列を配列最適化するために使用することができる配列最適化方法は、本明細書に詳細に記載されている。この方法の一覧は、包括的でも制限的でもない。
以下において考察される配列最適化方法のそれぞれについて記載される設計の原理および規則は、多数の異なる方式で組み合わせることができ、例えば、参照核酸配列の一部の領域に関する高Ｇ／Ｃ含量配列最適化、または他の領域に関するウリジン含量配列最適化、ならびに配列全体で二次構造を最小限に抑えるためまたは有害なモチーフを排除するための標的化ヌクレオチド変異がある。
配列最適化方法の可能な組合せの選択は、例えば、合成ポリヌクレオチドを産生するために使用される特定の化学的性質に依存し得る。そのような選択肢はまた、配列最適化された核酸、例えば、ＩＬ１２を含む完全配列、機能的断片、または融合タンパク質などによってコードされるタンパク質の特徴にも依存し得る。一部の実施形態では、そのような選択肢は、配列最適化された核酸（例えば、治療用合成ｍＲＮＡ）によって標的とされる特定の組織または細胞に依存し得る。
最適化方法の適用および分析により得られる配列最適化方法または設計規則を組み合わせる機構は、単純なものも複雑なものもある。例えば、組合せは、次のものであり得る：
（ｉ）逐次的：それぞれの配列最適化方法および設計規則のセットを、全体の配列の異なる部分配列に適用し、例えば、コドン１～３０位のウリジンを低減させ、次いで、配列の残りに関して高頻度のコドンを選択する；
（ｉｉ）階層的：複数の配列最適化方法または設計規則のセットを、階層的な決定論的様式で組み合わせる。例えば、最もＧＣの豊富なコドンを使用し、それらのコドンの最も高い頻度のものを選択することによって、（共通の）つながりを破壊する。
（ｉｉｉ）多因子／多重パラメーター：機械学習または他のモデリング技法を使用して、複数の重複する要件および矛盾する可能性のある要件を最も良好に満たす単一の配列を設計する。このアプローチは、コンピュータを使用して、いくつかの数学的技法、例えば、遺伝子アルゴリズムを適用することを必要とするであろう。
最終的に、これらのアプローチのそれぞれにより、特定の規則のセットを得ることができ、これは、多くの場合に、単一のコドン表、すなわち、標的タンパク質（すなわち、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド）におけるそれぞれのアミノ酸のコドンの分類された一覧に要約され得、特定の規則または規則のセットが、それぞれのアミノ酸位について特定のコドンをどのように選択するかを示す。
ａ．ウリジン含量最適化
核酸配列における局所的に高い濃度のウリジンの存在は、特に、修飾されたウリジン類似体を合成ｍＲＮＡの産生に使用した場合に、翻訳に対して有害な影響、例えば、翻訳の遅延または早すぎる翻訳の終止を有する場合がある。例えば、高ウリジン含量はまた、ＴＬＲ活性化に起因して、合成ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を低減させ得る。
したがって、核酸配列は、少なくとも１つのウリジン含量最適化ステップを含む方法を使用して、配列最適化され得る。そのようなステップは、例えば、参照核酸における少なくとも１のコドンを、代替的なコドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成することを含み、ここで、ウリジン修飾配列は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：
（ｉ）全体的なウリジン含量の増大もしくは減少、
（ｉｉ）局所的ウリジン含量の増大もしくは減少（すなわち、特定の部分配列に限定されたウリジン含量の変化）、
（ｉｉｉ）全体的なウリジン含量を変化させない、ウリジン分布の変更、
（ｉｖ）ウリジンクラスタリング（例えば、クラスター数、クラスターの位置、もしくはクラスター間の距離）の変化、または
（ｖ）これらの組合せ。
一部の実施形態では、配列最適化プロセスは、全体的なウリジン含量を最適化すること、すなわち、配列最適化された核酸におけるウリジン核酸塩基の百分率を、参照核酸配列におけるウリジン核酸塩基の百分率に対して、最適化することを含む。例えば、参照配列では、核酸塩基の３０％がウリジンであり得、配列最適化された核酸では、核酸塩基の１０％がウリジンであり得る。
他の実施形態では、配列最適化プロセスは、参照核酸配列の特定の領域における局所的なウリジン含量を低減すること、すなわち、配列最適化された核酸の部分配列におけるウリジン核酸塩基の百分率を、参照核酸配列の対応する部分配列におけるウリジン核酸塩基の百分率に対して、低減することを含む。例えば、参照核酸配列は、局所的なウリジン含量が３０％の５’末端領域（例えば、３０コドン）を有し得、配列最適化された核酸配列では、同じ領域におけるウリジン含量が、１０％まで低減され得る。
特定の実施形態では、コドンは、参照核酸配列において、例えば、タンパク質翻訳に有害な影響を有し得るウリジンクラスターの数、サイズ、位置、または分布を低減または修飾するように、置き換えられ得る。一般則としては、参照核酸配列のウリジン含量を低減することが望ましいとはいえ、ある特定の実施形態では、参照核酸配列の一部の部分配列のウリジン含量、および特に局所的なウリジン含量を、増大させてもよい。
翻訳に対する悪影響を回避するためのウリジン含量の低減は、他の設計目標を達成するために、本明細書に開示される他の最適化方法と組み合わせて行うことができる。例えば、ウリジン含量最適化は、ランプ設計と組み合わせてもよいが、これは、ほとんどのアミノ酸について最も稀なコドンを使用することにより、一部の例外はあるが、Ｕ含量を低減することになるためである。
一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列と比較した場合に、より低いＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を誘導するように設計される。いくつかのＴＬＲは、核酸を認識し、応答する。頻繁なウイルス構成物質である二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ、４１３巻、７３２～７３８頁およびＷａｎｇら、（２００４年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１０巻、１３６６～１３７３頁を参照されたい。一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ７を活性化する。Ｄｉｅｂｏｌｄら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻、１５２９～１５３１頁を参照されたい。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８のリガンドである。Ｈｅｉｌら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻、１５２６～１５２９頁を参照されたい。細菌およびウイルスＤＮＡの特徴である非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するＤＮＡは、ＴＬＲ９を活性化する。Ｈｅｍｍｉら、（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ、４０８巻、７４０～７４５頁を参照されたい。
本明細書において使用されるとき、「ＴＬＲ応答」という用語は、ＴＬＲ７受容体による一本鎖ＲＮＡの認識と定義され、一部の実施形態では、受容体による一本鎖ＲＮＡの認識によって引き起こされるＲＮＡの分解および／または生理学的応答を包含する。ＲＮＡのＴＬＲ７への結合を判定および定量化するための方法は、当技術分野において公知である。同様に、ＲＮＡが、ＴＬＲ７に媒介される生理学的応答（例えば、サイトカイン分泌）を誘発したかどうかを判定するための方法も、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、ＴＬＲ応答は、ＴＬＲ７の代わりに、ＴＬＲ３、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９によって媒介されてもよい。
ＴＬＲ７に媒介される応答の抑制は、ヌクレオシド修飾を介して達成することができる。ＲＮＡは、本質的に、１００を上回る異なるヌクレオシド修飾を受ける（ｍｏｄｓ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕにおいて利用可能なＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい）。ヒトｒＲＮＡは、例えば、細菌ｒＲＮＡよりも１０倍多いシュードウリジン（Ψ）および２５倍多い２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを有する。細菌ｍＲＮＡは、ヌクレオシド修飾を含有しないが、一方で、哺乳動物ｍＲＮＡは、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に加えて、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン、および多数の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドを有する。
ＲＮＡの２つの決定的な特徴であるウラシルおよびリボースは、ＴＬＲ７刺激に必要かつ十分であり、短い一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、いくつかのウリジンを近傍に含有する限り、配列独立様式で、ＴＬＲ７アゴニストとして作用する。Ｄｉｅｂｏｌｄら、（２００６年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６巻、３２５６～３２６７頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される最適化方法のうちの１つまたは複数は、ウリジン含量を（局所的および／もしくは局所的に）低減すること、ならびに／またはＴＬＲ７に媒介される応答を低減もしくは抑制するように、ウリジンクラスタリングを低減もしくは修飾することを含む。
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列によって引き起こされるＴＬＲ応答（例えば、ＴＬＲ７によって媒介される応答）は、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答より少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％低い。
一部の実施形態では、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答は、ウリジン修飾された配列によって引き起こされるＴＬＲ応答より少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍高い。
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量（平均の全体的なウリジン含量）（絶対的もしくは相対的）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対的もしくは相対的）より高い。したがって、一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列は、参照核酸配列より少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％多くのウリジンを含む。
他の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量（平均の全体的なウリジン含量）（絶対的もしくは相対的）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対的もしくは相対的）より低い。したがって、一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列は、参照核酸配列より少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％少ないウリジンを含む。
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量（平均の全体的なウリジン含量）（絶対的もしくは相対的）は、ウリジン修飾された配列中の総核酸塩基のうちの５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量は、約１０％～約２０％である。一部の特定の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量は、約１２％～約１６％である。
一部の実施形態では、参照核酸配列のウリジン含量は、スライドウインドウを使用して測定することができる。一部の実施形態では、スライドウインドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０核酸塩基である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、４０を上回る核酸塩基長である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、２０核酸塩基長である。スライドウインドウで測定されるウリジン含量に基づいて、参照核酸配列および配列最適化された核酸の長さ全体のウリジン含量を表すヒストグラムを生成することが可能である。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、ある特定の百分率の値よりも高いかまたは低い、ヒストグラム内のピークを低減または排除するように修飾することができる。一部の実施形態では、参照核酸配列は、スライドウインドウ表示における６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、または３０％ウリジンよりも高いピークを排除するように修飾することができる。別の実施形態では、参照核酸配列は、２０核酸塩基のスライドウインドウを使用して測定した場合に、配列最適化された核酸に、３０％ウリジンを上回るピークがないように、修飾され得る。一部の実施形態では、参照核酸配列は、２０核酸塩基のスライドウインドウを使用して測定した場合に、配列最適化された核酸配列における所定の数を上回るかまたは下回るピークが、ある特定の閾値よりも上または下に存在しないように、修飾され得る。例えば、一部の実施形態では、参照核酸配列は、配列最適化された核酸において、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％ウリジンよりも高くにピークが存在しないか、またはそこに１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０より多くのピークが存在しないように、修飾され得る。別の実施形態では、配列最適化された核酸は、３０％またはそれよりも高いウリジン含量に、０個のピーク～２個のピークを含有する。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、連続したウリジンの発生を低減するように配列最適化され得る。例えば、２つの連続したロイシンは、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得、これは、４ウリジンのクラスターを含む。そのような部分配列は、ＣＵＧＣＵＣで置換され得、これにより、ウリジンクラスターが有効に除去されるであろう。したがって、参照核酸配列は、ウリジンペア（ＵＵ）、ウリジントリプレット（ＵＵＵ）、またはウリジンクアドロップレット（ＵＵＵＵ）を低減または排除することによって、配列最適化され得る。より高次のＵの組合せは、より低次の組合せを組み合わせたものとは考えない。したがって、例えば、ＵＵＵＵは、２つの連続したＵペアではなく、厳密にクアドロップレットと考えられるか、またはＵＵＵＵＵＵは、３つの連続したＵペアでも２つの連続したＵトリプレットでもなく、セクツプレットと考えられる、などである。
一部の実施形態では、すべてのウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）および／またはウリジンクアドロップレット（ＵＵＵＵ）が、参照核酸配列から除去され得る。他の実施形態では、ウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）および／またはウリジンクアドロップレット（ＵＵＵＵ）は、ある特定の閾値よりも下に低減され得、例えば、配列最適化された核酸における発生は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０を上回らない。特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満のウリジンペアを含有する。別の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、ウリジンペアおよび／またはトリプレットを含有しない。
フェニルアラニンコドン、すなわち、ＵＵＣまたはＵＵＵは、ウリジンペアまたはトリプルを含み、したがって、ウリジン含量を低減する配列最適化は、最大でも、フェニルアラニンのＵトリプレットをフェニルアラニンのＵペアに低減することができる。一部の実施形態では、ウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）の発生は、非フェニルアラニンＵペアまたはトリプレットのみを指す。したがって、一部の実施形態では、非フェニルアラニンウリジンペア（ＵＵ）および／またはウリジントリプレット（ＵＵＵ）は、ある特定の閾値よりも下に低減され得、配列最適化された核酸における発生は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０を上回らない。特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウリジンペアおよび／またはトリプレットを含有する。別の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、非フェニルアラニンウリジンペアおよび／またはトリプレットを含有しない。
一部の実施形態では、配列最適化された核酸におけるウリジンの組合せ（例えば、ペア、トリプレット、クアドロップレット）の低減は、参照核酸配列に存在するウリジンの組合せに対する低減の百分率として表すことができる。
一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジンペアの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジントリプレットの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジンクアドルプレットの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。
一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジンペアの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジントリプレットの総数のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、もしくは６５％を含有し得る。
一部の実施形態では、配列最適化された配列におけるウリジン含量は、この配列における理論上の最小ウリジン含量に対して表すことができる。「理論上の最小ウリジン含量」という用語は、配列中のすべてのコドンを、ウリジン含量が最も低い同義コドンで置き換えた後の、配列の長さに対する百分率としての核酸配列のうちのウリジン含量と定義される。一部の実施形態では、配列最適化された核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上の最小ウリジン含量と同一である。一部の態様では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上の最小ウリジン含量の約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％または約２００％である。
一部の実施形態では、配列最適化された核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上の最小ウリジン含量と同一である。
参照核酸配列（例えば、野生型配列）は、ウリジンクラスターを含み得、これは、それらの数、サイズ、位置、分布、またはこれらの組合せに起因して、翻訳に対して負の影響を有する。本明細書において使用されるとき、「ウリジンクラスター」という用語は、ある特定の閾値を上回るウリジン含量（通常、百分率として記載される）を含有する、参照核酸配列または配列最適化された核酸配列における部分配列を指す。したがって、ある特定の実施形態では、部分配列が、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％より大きなウリジン含量を含む場合、そのような部分配列は、ウリジンクラスターと考えられる。
ウリジンクラスターの負の影響は、例えば、ＴＬＲ７応答を誘起することであり得る。したがって、本明細書に開示される核酸配列最適化方法の一部の実施形態では、クラスターの数、クラスターのサイズ、クラスターの位置（例えば、核酸配列の５’および／もしくは３’末端の近傍）、クラスター間の距離、またはウリジンクラスターの分布（例えば、核酸配列に沿ったクラスターのある特定のパターン、発現される産物における二次構造エレメントに対するクラスターの分布、もしくはｍＲＮＡの二次構造に対するクラスターの分布）を低減することが望ましい。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、このウリジンクラスターは、参照核酸配列の部分配列であり、この部分配列中の総ウリジン核酸塩基の百分率は所定の閾値を上回る。一部の実施形態では、部分配列の長さは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００核酸塩基である。一部の実施形態では、部分配列は、１００核酸塩基より長い。一部の実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％ウリジン含量である。一部の実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
例えば、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ、およびＲを含むアミノ酸配列は、核酸配列ＧＣＵ、ＧＡＵ、ＧＧＵ、ＡＧＵ、ＣＧＵによってコードされ得る。そのような配列は、いずれのウリジンペア、トリプレット、またはクアドロップレットも含有しないが、核酸塩基のうちの３分の１は、ウリジンである。そのようなウリジンクラスターは、代替的なコドンを使用することによって、例えば、ウリジンを含有しないＧＣＣ、ＧＡＣ、ＧＧＣ、ＡＧＣ、およびＣＧＣを使用することによって、除去され得る。
他の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、ここで、前記ウリジンクラスターは、参照核酸配列の部分配列であり、スライドウインドウを使用して測定される前記部分配列のウリジン核酸塩基の百分率は、所定の閾値を上回る。一部の実施形態では、スライドウインドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０核酸塩基である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、４０核酸塩基長を上回る。一部の実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％のウリジン含量である。一部の実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも２つのウリジンクラスターを含む。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少ないウリジンリッチクラスターを含有する。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも多くのウリジンリッチクラスターを含有する。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも短い長さのウリジンリッチクラスターを含有する。他の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも長い長さのウリジンリッチクラスターを含有する。
Ｋａｒｉｋｏら、（２００５年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２３巻、１６５～１７５頁、Ｋｏｒｍａｎｎら、（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻、１５４～１５７頁、またはＳａｈｉｎら、（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｜ ＡＯＰ、２０１４年９月１９日オンライン刊行、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ４２７８を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｂ．グアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量
参照核酸配列は、参照核酸配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的または相対的）を変化させることを含む方法を使用して、配列最適化することができる。そのような最適化は、参照核酸配列の全体的なＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）を変化させる（例えば、増大もしくは減少させる）こと、参照核酸配列におけるＧ／Ｃ含量に局所的な変化を導入する（例えば、参照核酸配列中の選択された領域もしくは部分配列におけるＧ／Ｃを増大もしくは減少させる）こと、参照核酸配列におけるＧ／Ｃクラスターの頻度、サイズ、および分布を変化させること、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）と比較したＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な増大を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な増大は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量に対するＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な減少を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量絶対的もしくは相対的）の全体的な減少は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）と比較した部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾された部分配列）中のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な増大を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な増大は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対する部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾された部分配列）中のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な減少を含む。一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の局所的な減少は、参照核酸配列中の対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。
一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
一部の実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、少なくとも約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、または１００００核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
本明細書に記載されるＧおよびＣ含量（絶対的または相対的）の増大または減少は、低Ｇ／Ｃ含量を有する同義コドンを、高Ｇ／Ｃ含量を有する同義コドンで置き換えること、またはその逆によって、行うことができる。例えば、Ｌは、６の同義コドンを有するが、そのうちの２つは、２つのＧ／Ｃを有し（ＣＵＣ、ＣＵＧ）、３つは、単一のＧ／Ｃを有し（ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＡ）、１つは、Ｇ／Ｃを有さない（ＵＵＡ）。そのため、参照核酸が、ある特定の位置にＣＵＣコドンを有した場合、その位置におけるＧ／Ｃ含量は、ＣＵＣを、単一のＧ／Ｃを有するコドンまたはＧ／Ｃを有さないコドンのうちのいずれかで置き換えることによって、低減され得る。
米国公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８、同第ＵＳ２００５００３２７３０ Ａ１、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、（２０１２年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、８３巻、３７～４６頁を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｃ．コドン頻度－コドン使用頻度バイアス
当技術分野において公知の多数のコドン最適化方法は、参照核酸配列におけるコドンの、より高い頻度を有するコドンとの置換に基づく。したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、非コドン最適化配列における使用の頻度に対して、配列最適化された核酸における他の同義コドンと比べた１つまたは複数のコドンの使用の頻度の修飾の使用を含む方法を使用して最適化された配列であり得る。
本明細書において使用されるとき、「コドン頻度」という用語は、コドン使用頻度バイアス、すなわち、ＤＮＡ／ＲＮＡをコードする際の同義コドンの発生頻度における差異を指す。一般に、コドンの選好性は、翻訳最適化のために、変異バイアスと天然の選択との間のバランスを反映することが、認識されている。最適なコドンは、より早い翻訳速度および高い正確性を達成するのに役立つ。これらの因子の結果として、翻訳選択は、高度に発現される遺伝子においてはより強力であることが予測される。バイオインフォマティクスおよび計算生物学の分野において、多数の統計学的方法が、コドン使用頻度バイアスを分析するために提案され、使用されている。例えば、ＣｏｍｅｒｏｎおよびＡｇｕａｄｅ（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、４７巻、２６８～７４頁を参照されたい。「最適なコドンの頻度」（Ｆｏｐ）（Ｉｋｅｍｕｒａ（１９８１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５１巻（３号）、３８９～４０９頁）、相対的コドン適合（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）（ＦｏｘおよびＥｒｉｌ（２０１０年）ＤＮＡ Ｒｅｓ．、１７巻（３号）、１８５～９６頁）、または「コドン適合指標」（ＣＡＩ）（ＳｈａｒｐおよびＬｉ（１９８７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５巻（３号）、１２８１～９５頁）などの方法は、遺伝子発現レベルを予測するために使用され、一方で、「コドンの有効数」（Ｎｃ）および情報理論によるシャノンエントロピーなどの方法は、コドン使用頻度の均等性を測定するために使用される。多変量の統計学的方法、例えば、対応分析および主成分分析は、遺伝子間のコドン使用頻度の変動性を分析するために広く使用される（Ｓｕｚｕｋｉら、（２００８年）ＤＮＡ Ｒｅｓ．、１５巻（６号）、３５７～６５頁、Ｓａｎｄｈｕら、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌ．、２００８年、８巻（２号）、１８７～９２頁）。
本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、野生型核酸配列、変異体核酸配列、キメラ核酸配列など、例えば、ｍＲＮＡであり得る）は、参照核酸配列における少なくとも１のコドンを、同義コドンセット内のより高いまたは低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換することを含む方法を使用して、コドン最適化することができ、ここで、結果として得られる配列最適化された核酸は、参照核酸配列と比べて、少なくとも１つの最適化された特性を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは１００％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換され、参照核酸配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
一部の実施形態では、ＩＬ１２をコードする参照核酸配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、より高いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、より低いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。一部の実施形態では、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
一部の特定の実施形態では、少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。一部の特定の実施形態では、少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
コドン頻度に基づく最適化は、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列に対して、上述のように全体的に適用されてもよく、または局所的に適用されてもよい。一部の実施形態では、局所的に適用される場合、参照核酸配列の領域は、コドン頻度に基づいて、ある特定の部分配列におけるコドンのすべてまたはある特定の百分率を、それらのそれぞれの同義コドンセットにおけるより高いまたは低い頻度を有するコドンで置換することで、修飾され得る。したがって、一部の実施形態では、参照核酸配列の部分配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは１００％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換され、参照核酸配列の部分配列における少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換される、より高いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換される、より低いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換される、より低いコドン頻度を有する少なくとも１の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。一部の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換される、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
特定の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、特定の位置、例えば、配列最適化された核酸の５’末端もしくは３’末端において、またはそれらの領域から所定の距離（例えば、配列最適化された核酸の５’末端または３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００コドン）内で、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有する部分配列を含み得る。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、全体的なコドン頻度が、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い１つより多くの部分配列を含み得る。当業者であれば、全体的により高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有する部分配列が、全体的なコドン頻度がより高いまたは低いか、部分配列の長さ、部分配列間の距離、部分配列の位置などに応じて、無数のパターンで組織化され得ることを理解するであろう。
米国特許第ＵＳ５０８２７６７号、同第ＵＳ８１２６６５３号、同第ＵＳ７５６１９７３号、同第ＵＳ８４０１７９８号、米国公開第ＵＳ２００８００４６１９２号、同第ＵＳ２００８００７６１６１号、国際公開第ＷＯ２００００１８７７８号、Ｗｅｌｃｈら、（２００９年）ＰＬｏＳ ＯＮＥ、４巻（９号）、ｅ７００２頁、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、（２０１２年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、８３巻、３７～４６頁、Ｃｈｕｎｇら、（２０１２年）ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻、１３４号を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｄ．脱安定化モチーフ置換
配列最適化に影響を及ぼすことができる様々なモチーフが存在し、それらは、様々な非排他的カテゴリー、例えば、以下のものに含まれる：
（ｉ）一次配列に基づくモチーフ：単純なヌクレオチドの配列によって定義されるモチーフ。
（ｉｉ）構造的モチーフ：ある特定の二次構造を形成する傾向にあるヌクレオチドの配列によってコードされるモチーフ。
（ｉｉｉ）局所的モチーフ：１つの連続した部分配列でコードされるモチーフ。
（ｉｖ）分布型モチーフ：２つまたはそれよりも多い分離した部分配列でコードされるモチーフ。
（ｖ）利益モチーフ：ヌクレオチドの構造または機能を改善するモチーフ。
（ｖｉ）不利益モチーフ：ヌクレオチドの構造または機能に対する有害な作用を有するモチーフ。
不利益モチーフのカテゴリーに適合する多数のモチーフが存在する。一部の例としては、例えば、比較的短い正確な配列である傾向にある制限酵素モチーフ、例えば、Ｘｂａ１の制限部位モチーフ（ＴＣＴＡＧＡ（配列番号２２４））、ＥｃｏＲＩの制限部位モチーフ（ＧＡＡＴＴＣ（配列番号２２５））、ＥｃｏＲＩＩの制限部位モチーフ（ＣＣＷＧＧ（配列番号２２６）、ここで、Ｗは、ＩＵＰＡＣ不確定コードに従ってＡもしくはＴを意味する）、もしくはＨｉｎｄＩＩＩの制限部位モチーフ（ＡＡＧＣＴＴ（配列番号２２７））；長く、正確な配列ではなくコンセンサス配列に基づく傾向にある、酵素部位、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにおけるもの（ＧｎｎｎｎＷｎＣＲｎＣＴＣｎＣｎｎＷｎＤ（配列番号２２８）、ここで、ｎは、任意のヌクレオチドを意味し、Ｒは、ＡもしくはＧを意味し、Ｗは、ＡもしくはＴを意味し、Ｄは、ＡもしくはＧもしくはＴを意味するが、Ｃではない）；構造的モチーフ、例えば、ＧＧＧＧ（配列番号２２９）リピート（Ｋｉｍら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５１巻（６３２４号）、３３１～２頁）；または他のモチーフ、例えば、ＣＵＧトリプレットリピート（Ｑｕｅｒｉｄｏら、（２０１４年）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、１２４巻、１７０３～１７１４頁）が挙げられる。
したがって、本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列における少なくとも１つの脱安定化モチーフを置換すること、およびそのような不利益モチーフを除去するか、またはそれを利益モチーフで置き換えることを含む方法を使用して、配列最適化され得る。
一部の実施形態では、最適化プロセスは、参照核酸配列における利益モチーフおよび／または不利益モチーフを特定することを含み、ここで、そのようなモチーフは、例えば、最適化プロセスの前または最中に、参照核酸配列において安定性の消失を引き起こし得る特定の部分配列である。例えば、最適化中の特定の塩基の置換により、制限酵素によって認識される部分配列（モチーフ）が生成され得る。したがって、最適化プロセスの最中、不利益モチーフの出現を、配列最適化された配列と、不利益となることが公知のモチーフのライブラリーとの比較によって、モニタリングすることができる。次いで、不利益モチーフの特定を、事後フィルターとして、すなわち、参照核酸配列に導入され得る可能性を有するある特定の修飾が、実際に実施されるべきかどうかを決定するために、使用することができる。
一部の実施形態では、不利益モチーフの特定は、本明細書に開示される配列最適化方法の適用の前に使用することができる、すなわち、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列におけるモチーフの特定、ならびにそれらの代替的な核酸配列との置換えは、事前処理ステップとして、例えば、ウリジン低減の前に、使用することができる。
他の実施形態では、不利益モチーフの特定およびそれらの除去は、本明細書に開示される配列最適化方法のうちの２つまたはそれよりも多くを含む多重パラメーターの核酸最適化方法に組み込まれる、追加の配列最適化技法として使用される。この様式で使用される場合、最適化プロセス中に特定された不利益モチーフは、例えば、本来の設計原理（例えば、低いＵ、高い頻度など）に可能な限りの近似性を保つために、可能な限り低い数の核酸塩基を置換することによって、除去されるであろう。
例えば、米国公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８号、同第ＵＳ２００５００３２７３０号、または同第ＵＳ２０１４０２２８５５８号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｅ．限定的コドンセット最適化
一部の特定の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の配列最適化は、限定的コドンセット、例えば、本来の数よりも少ないコドンを使用して２０の天然のアミノ酸、２０の天然のアミノ酸のサブセット、または例えば非天然のアミノ酸を含む拡大されたアミノ酸のセットをコードするコドンセットを使用して、行われ得る。
遺伝子コードは、すべての生物で高度に類似しており、単純な６４エントリーの表で表すことができ、これにより、タンパク質翻訳に関与する２０の標準的なアミノ酸に加え、開始および終止コドンがコードされるであろう。遺伝子コードは、縮重している、すなわち、一般に、１より多くのコドンにより、それぞれのアミノ酸が指定される。例えば、アミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、またはＣＵＧコドンによって指定され、一方で、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、またはＡＧＣコドンによって指定される（第１、第２、または第３の位置における違い）。天然の遺伝子コードは、天然に存在するアミノ酸をコードする６２のコドンを含む。したがって、本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、２０のアミノ酸をコードするための６２よりも少ないコドンを含む最適化されたコドンセット（遺伝子コード）は、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、または２０のコドンを含み得る。
一部の実施形態では、限定的コドンセットは、２０未満のコドンを含む。例えば、タンパク質が２０種類未満のアミノ酸を含む場合、そのようなタンパク質は、２０未満のコドンを含むコドンセットにコードされ得る。したがって、一部の実施形態では、最適化コドンセットは、参照核酸配列にコードされるタンパク質中に存在するアミノ酸の異なる種類と同じ数のコドンを含む。一部の実施形態では、最適化コドンセットは、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２またはさらに１のコドンを含む。
一部の実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸、すなわち、天然では１より多くのコドンによってコードされるアミノ酸は、天然に存在する同義コドンの数よりも少ないコドンでコードされる。例えば、一部の実施形態では、Ａｌａは配列最適化核酸中で３、２または１のコドンにコードされ得る；Ｃｙｓは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ａｓｐは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｇｌｕは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｐｈｅは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｇｌｙは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドンまたは１のコドンにコードされ得る；Ｈｉｓは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｉｌｅは配列最適化核酸中で２のコドンまたは１のコドンにコードされ得る；Ｌｙｓは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｌｅｕは配列最適化核酸中で５のコドン、４のコドン、３のコドン、２のコドンまたは１のコドンにコードされ得る；Ａｓｎは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ｐｒｏは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｇｌｎは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る；Ａｒｇは配列最適化核酸中で５のコドン、４のコドン、３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｓｅｒは配列最適化核酸中で５のコドン、４のコドン、３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｔｈｒは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；Ｖａｌは配列最適化核酸中で３のコドン、２のコドン、または１のコドンにコードされ得る；かつＴｙｒは配列最適化核酸中で１のコドンにコードされ得る。
一部の実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸、すなわち、天然では１より多くのコドンによってコードされるアミノ酸は、限定的コドンセットにおける単一のコドンによってコードされる。
一部の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、ＤＮＡであり、限定的コドンセットは、２０のコドンからなり、ここで、それぞれのコドンは、２０のアミノ酸のうちの１つをコードする。一部の実施形態では、配列最適化核酸はＤＮＡであり、限定的コドンセットは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＴまたはＡＣＣから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＴまたはＧＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ＴＧＴまたはＴＧＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、およびＧＧＧからなる群から選択されるＣＡＴまたはＣＡＣから選択される少なくとも１のコドン；少なくとも１のコドン；ＡＴＴ、ＡＴＣ、およびＡＴＡからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、およびＣＴＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＡＴＧコドン；ＴＴＴまたはＴＴＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、およびＣＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、およびＡＧＣからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、およびＡＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＴＧＧコドン；ＴＡＴまたはＴＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ならびにＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、およびＧＴＧからなる群から選択される少なくとも１のコドンを含む。
他の実施形態では、配列最適化核酸はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり、限定的コドンセットは２０コドンからなり、各コドンは、２０のアミノ酸のうちの１つをコードする。一部の実施形態では、配列最適化核酸はＲＮＡであり、限定的コドンセットは、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＵまたはＡＣＣから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＵまたはＧＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ＵＧＵまたはＵＧＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、およびＧＧＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＣＡＵまたはＣＡＣから選択される少なくとも１のコドン；ＡＵＵ、ＡＵＣ、およびＡＵＡからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、およびＣＵＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくとも１のコドン；ＡＵＧコドン；ＵＵＵまたはＵＵＣから選択される少なくとも１のコドン；ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、およびＣＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、およびＡＧＣからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、およびＡＣＧからなる群から選択される少なくとも１のコドン；ＵＧＧコドン；ＵＡＵまたはＵＡＣから選択される少なくとも１のコドン；および、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、およびＧＵＧからなる群から選択される少なくとも１のコドンを含む。
一部の特定の実施形態では、限定的コドンセットは、ある特定の組織または細胞への投与後の配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｖｏ発現に関して最適化されている。
一部の実施形態では、最適化されたコドンセット（例えば、２０のアミノ酸をコードする２０コドンのセット）は、少なくとも以下の特性のうちの１つを満たす。
（ｉ）最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも高い平均Ｇ／Ｃ含量を有する、または
（ｉｉ）最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも低い平均Ｕ含量を有する、または
（ｉｉｉ）最適化されたコドンセットは、最も高い頻度を有するコドンから構成されている、または
（ｉｖ）最適化されたコドンセットは、最も低い頻度を有するコドンから構成されている、または
（ｖ）これらの組合せ。
一部の特定の実施形態では、最適化されたコドンセットにおける少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。一部の特定の実施形態では、最適化されたコドンにおける少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおいて２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
本明細書において使用されるとき、「天然のコドンセット」という用語は、参照核酸配列をコードするために源生物によって天然に使用される、コドンセットを指す。本明細書において使用されるとき、「元のコドンセット」という用語は、配列最適化の開始前に、参照核酸配列をコードするために使用されるコドンセット、または配列最適化が反復的または再帰的に適用される場合には、新しい最適化反復の開始時に参照核酸配列の最適化されたバリアントをコードするために使用されるコドンセットを指す。
一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最高の頻度を有するものである。他の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最低の頻度を有するものである。
一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最高のウリジン含量を有するものである。一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％は、最低のウリジン含量を有するものである。
一部の実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％高い。一部の実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低い。
一部の実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％高い。一部の実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対的もしくは相対的）は、元のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対的もしくは相対的）より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低い。
米国出願公開第２０１１／００８２０５５号および国際公開第ＷＯ２００００１８７７８号もまた参照されたく、これらのいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１０．配列最適化された核酸の特徴付け
本開示の一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化された核酸（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を試験して、少なくとも１つの核酸配列特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露した場合の安定性）または発現特性が、配列最適化されていない核酸に対して、改善されているかどうかを判定することができる。
本明細書において使用されるとき、「発現特性」は、ｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、それを必要とする対象に投与した後の合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系において試験した合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）のいずれかでの、核酸配列の特性を指す。発現特性としては、投与後にＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって産生されるタンパク質の量、ならびに産生される可溶性またはその他の機能的タンパク質の量が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示される配列最適化された核酸は、本明細書に開示されるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存性によって、評価することができる。
特定の実施形態では、最適化されていない参照核酸配列に対して、コドン置換を含有する、本明細書に開示される複数の配列最適化された核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、機能性に関して特徴付けて、目的の特性、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系での、または標的組織もしくは細胞においてｉｎ ｖｉｖｏでの発現特性を測定することができる。
ａ．核酸配列の本質的な特性の最適化
本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望される特性は、核酸配列の本質的な特性である。例えば、ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性に関して配列最適化され得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、特定の標的組織または細胞における発現に関して配列最適化され得る。一部の実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるその分解を予防することによって、その血漿半減期を増大させるように、配列最適化される。
他の実施形態では、核酸配列は、溶液中での加水分解に対するその耐性を増大させるように、例えば、配列最適化された核酸または配列最適化された核酸を含む医薬組成物を水溶性条件下において最小限の分解で保管することができる時間を延長するように、配列最適化される。
他の実施形態では、配列最適化された核酸は、乾燥状態での保管条件における加水分解に対するその耐性を増大させるように、例えば、配列最適化された核酸を凍結乾燥後に最小限の分解で保管することができる時間を延長するように、最適化され得る。
ｂ．タンパク質発現に関して最適化された核酸配列
本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望される特性は、本明細書に開示される配列最適化された配列によってコードされるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドの発現レベルである。タンパク質の発現レベルは、１つまたは複数の発現系を使用して、測定することができる。一部の実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞において、測定することができる。一部の実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球ライセートから調製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系、または精製された個々の成分のアセンブリによって調製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を使用して、測定することができる。他の実施形態では、タンパク質発現は、例えば、マウス、ウサギ、サルなど、ｉｎ ｖｉｖｏ系において測定される。
一部の実施形態では、溶液形態におけるタンパク質発現が、望ましい場合がある。したがって、一部の実施形態では、参照配列は、溶液形態におけるタンパク質発現のレベルが最適化された、配列最適化された核酸配列が得られるように、配列最適化され得る。タンパク質発現のレベルおよび他の特性、例えば、可溶性、凝集のレベル、および短縮産物の存在（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または欠損した翻訳に起因する断片）は、当技術分野において公知の方法に従って、例えば、電気泳動（例えば、天然もしくはＳＤＳ－ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使用して、測定することができる。
ｃ．標的組織または標的細胞の生存性の最適化
一部の実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織または細胞において有害な作用を有し、タンパク質収率を低減させ得るか、または発現される産物の品質を低減し得る（例えば、タンパク質断片の存在もしくは封入体における発現されたタンパク質の沈降に起因する）、または毒性を引き起こし得る。
したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列、例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列の配列最適化を使用して、配列最適化された核酸によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存性を増大させることができる。
異種タンパク質発現はまた、自家または異種移植のために核酸配列がトランスフェクトされた細胞にとって、有害であり得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化を使用して、配列最適化された核酸配列によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存性を増大させることができる。細胞または組織の生存性、毒性、および他の生理学的反応における変化は、当技術分野において公知の方法に従って測定することができる。
ｄ．免疫および／または炎症性応答の低減
一部の事例では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド、またはその機能的断片をコードする配列最適化された核酸の投与は、免疫応答を誘発し得、この免疫応答は、（ｉ）治療剤（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、または（ｉｉ）そのような治療剤の発現産物（例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂ融合ポリペプチド）、または（ｉｖ）これらの組合せによって引き起こされ得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の配列最適化を使用して、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはそのような核酸によってコードされるＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂ融合体の発現産物によって、誘発される、免疫応答または炎症応答を減少することができる。
一部の態様では、炎症応答は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、１つまたは複数の炎症性サイトカインのレベルの増大を検出することによって、測定することができる。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答の際に上昇されるサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＧＲＯαとしても公知のＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ））リガンド１、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ－誘導タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球－コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語には、当技術分野において公知の炎症応答と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１３（Ｉｌ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）なども含まれる。
１１．ＩＬ１２ポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／ＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、ここで、ｍＲＮＡは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。
本開示のある特定の態様では、５－メトキシウラシル塩基が、ポリヌクレオチド中にあるように、リボース糖に結合した場合、結果として得られる修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、５－メトキシウリジンと称される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは約１００％が５－メトキシウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチドのウラシルは、少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドのウラシルは、１００％が５－メトキシウラシルである。
ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである実施形態では、全体的なウラシル含量は、免疫応答をほとんど～全く誘導せずに好適なタンパク質発現レベルを提供するように調整され得る。一部の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量（％ＵＴＭ）は、約１０５％～約１４５％、約１０５％～約１４０％、約１１０％～約１４０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１３５％、約１０５％～約１３５％、約１１０％～約１３５％、約１１５％～約１４５％、もしくは約１１５％～約１４０％である。他の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、約１１７％～約１３４％または１１８％～１３２％の％ＵＴＭである。一部の実施形態では、％ＵＴＭは、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、もしくは約１５０％である。この文脈では、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシルおよび／または天然に存在するウラシルを指し得る。
一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約５０％、約４０％、約３０％、もしくは約２０％未満である。一部の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約１５％～約２５％である。他の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約２０％～約３０％である。一実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含量の約２０％未満である。この文脈において、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシルおよび／または天然に存在するウラシルを指し得る。
さらなる実施形態では、５－メトキシウラシルおよび調整されたウラシル含量を有するＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、増大したシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対的または相対的）を有する。一部の実施形態では、ＯＲＦのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）の全体的な増大は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対的もしくは相対的）に対して少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％である。一部の実施形態では、ＯＲＦ中のＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論上の最大Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量（％ＧＴＭＸ；％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸ）の約１００％未満、約９０％未満、約８５％未満、または約８０％未満である。他の実施形態では、ＯＲＦ中のＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸの約７０％～約８０％、約７１％～約７９％、約７１％～約７８％、もしくは約７１％～約７７％である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＧおよび／またはＣ含量の増大（絶対的または相対的）は、低Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義コドンを、高Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義コドンで置き換えることによって、行うことができる。他の実施形態では、Ｇおよび／またはＣ含量の増大（絶対的または相対的）は、Ｕで終わるコドンを、ＧまたはＣで終わる同義コドンで置き換えることによって、行われる。
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５－メトキシウラシルを含み、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも、少ないウラシルペア（ＵＵ）および／またはウラシルトリプレット（ＵＵＵ）および／またはウラシルクアドロップレット（ＵＵＵＵ）を含有する調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシルペアおよび／またはウラシルトリプレットおよび／またはウラシルクアドロップレットを含有しない。一部の実施形態では、ウラシルペアおよび／またはウラシルトリプレットおよび／またはウラシルクアドロップレットは、ある特定の閾値よりも下に低減され、例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける発生は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０を上回らない。特定の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウラシルペアおよび／またはトリプレットを含有する。別の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシルペアおよび／またはトリプレットを含有しない。
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５－メトキシウラシルを含み、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルリッチクラスターを含有する、調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列における対応するウラシルリッチクラスターよりも短い長さのウラシルリッチクラスターを含有する。
さらなる実施形態では、代替的なより低頻度のコドンが利用される。ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードする、５－メトキシウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦ中のコドンのうちの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは１００％は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドン同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する。ＯＲＦはまた、上述のように、調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
一部の実施形態では、ウラシル含量が調整された、５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、哺乳動物細胞に投与した場合に、対応する野生型ｍＲＮＡからのＩＬ１２の発現レベルよりも高いＩＬ１２の発現レベルを呈する。他の実施形態では、哺乳動物細胞に投与した場合のＩＬ１２の発現レベルは、少なくとも９５％の５－メトキシウラシルを含有し、理論上の最小値の約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％のウラシル含量を有する対応するｍＲＮＡと比べて、増大する。さらに他の実施形態では、哺乳動物細胞に投与した場合のＩＬ１２の発現レベルは、対応するｍＲＮＡと比べて増大し、ここで、ウラシルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％が、１－メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、ＩＬ１２は、ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞に投与される場合に発現される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与される。一実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１５ｍｇ／ｋｇの量で、マウスに投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または筋肉内投与される。他の実施形態では、ＩＬ１２ポリペプチドは、ｍＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に投与される場合に発現される。一部の実施形態では、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍だけ増大する。他の実施形態では、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、もしくは約１００％だけ増大する。
一部の実施形態では、ウラシル含量が調整された、５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡの安定性と比べて、細胞における安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性、および／または二次構造の安定化の増大を含む、安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡが呈する安定性の増大は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、細胞、または組織試料における）を判定すること、ならびに／またはｍＲＮＡによる経時的なタンパク質発現（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）の曲線下面積（ＡＵＣ）を判定することによって、測定される。ｍＲＮＡは、半減期および／またはＡＵＣが、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡの半減期および／またはＡＵＣを上回る場合、安定性の増大を有するとして特定される。
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘導する。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、同じ条件下におけるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするが、５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、または同じ条件下におけるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードし、５－メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比べて、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘導する。自然免疫応答は、増大した炎症促進性サイトカインの発現、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、細胞死、および／またはタンパク質翻訳の終止もしくは低減によって示すことができる。一部の実施形態では、自然免疫応答の低減は、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－ω、およびＩＦＮ－ζ）の発現もしくは活性レベルまたはインターフェロンにより制御される遺伝子、例えば、ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）の発現、ならびに／または本開示のｍＲＮＡの細胞への１回もしくは複数回の投与の後の細胞死の減少によって、測定することができる。
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡに応答した哺乳動物細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするが、５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードし、５－メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％を上回って、低減される。一部の実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ－βである。一部の実施形態では、哺乳動物細胞への本開示のｍＲＮＡの投与によって引き起こされる細胞死の頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするが、５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／もしくはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードし、５－メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡで観察される細胞死の頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％を上回って、低い。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、脾細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウスまたはラットのものである。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒトのものである。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入された哺乳動物細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであり、ここで、ｍＲＮＡにおけるウラシルは、少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上の最小ウラシル含量の約１１５％～約１３５％であり、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦにおけるウラシル含量は、そのＯＲＦにおける総核酸塩基含量の約３０％未満である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対的または相対的）が、対応する野生型ＯＲＦと比較して、少なくとも約４０％増大するようにさらに修飾される。さらに他の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦは、２０を下回る非フェニルアラニンウラシルペアおよび／またはトリプレットを含有する。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１のコドンは、さらに、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡにおけるウラシルが、少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量が、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上の最小ウラシル含量の約１１５％～約１３５％である、ＯＲＦを含むｍＲＮＡによってコードされるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡによるＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドの発現と比較した場合に、少なくとも約１０倍増大する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、オープンＯＲＦを含み、ここで、ｍＲＮＡにおけるウラシルは、少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦの理論上の最小ウラシル含量の約１１５％～約１３５％であり、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入された哺乳動物細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
１２．ポリヌクレオチドを修飾するための方法
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド）を含む、修飾されたポリヌクレオチドを含む。修飾されたポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得るおよび／または構造的に修飾され得る。本開示のポリヌクレオチドが、化学的および／または構造的に修飾された場合、ポリヌクレオチドは、「修飾されたポリヌクレオチド」と称され得る。
本開示は、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて含有する、化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾されたまたは非天然のヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法、例えば、化学的、酵素的、または組換えなどによって、合成することができる。ポリヌクレオチドは、連結したヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含み得る。そのような領域は、変動する骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
本明細書に開示される修飾されたポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含み得る。一部の実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドは、１つ、２つ、またはそれよりも多くの（任意選択で、異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。一部の実施形態では、細胞に導入された修飾されたポリヌクレオチドは、未修飾のポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数の望ましい特性、例えば、改善されたタンパク質発現、低減された免疫原性、または細胞における低減された分解を呈し得る。
ａ．構造的修飾
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造的に修飾される。本明細書において使用されるとき、「構造的」修飾は、ヌクレオチド自体に対する有意な化学的修飾を伴うことなく、２つまたはそれよりも多い連結したヌクレオシドが、ポリヌクレオチドにおいて、挿入、欠失、重複、逆転、または無作為化されているものである。化学結合は、構造的修飾を実行するために、必要に応じて破壊および再形成されることになるため、構造的修飾は、化学的性質に関するものであり、したがって、化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾は、異なる配列のヌクレオチドをもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ（配列番号２３０）」は、「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ（配列番号２３０）」から、「ＡＴＣＣＣＧ（配列番号２３１）」に構造的に修飾され得る。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドに対する構造的修飾をもたらす。
ｂ．化学的修飾
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、化学的に修飾される。本明細書においてポリヌクレオチドを参照して使用されるとき、「化学的修飾」または適宜「化学的に修飾される」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに対する、その核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組合せを含むがそれらに限定されない、それらの位置、パターン、パーセント、または集団のうちの１つまたは複数における、修飾を指す。通常、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図されない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部の一様な化学修飾、または同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部における同じ出発修飾の下方滴定によって得られる修飾の集団、またはすべてのウリジンが、ウリジン類似体、例えば、５－メトキシウリジンによって置き換えられる場合など、無作為な組込みを有するが同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部のある測定パーセントの化学的修飾を有し得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通じて同じヌクレオシド型の２つ、３つ、または４つの一様な化学的修飾を有し得る（例えば、すべてのウリジンおよび／またはすべてのシチジンなどが、同じ様式で修飾される）。
修飾されたヌクレオチド塩基の対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシンの塩基対だけでなく、非標準的もしくは修飾された塩基を含むヌクレオチド間および／または修飾されたヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターの配置は、非標準的な塩基と標準的な塩基との間、または２つの相補的な非標準的な塩基構造の間の水素結合を許容する。そのような非標準的な塩基対合の１つの例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
当業者であれば、別途示される場合を除き、本出願に記載されるポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」が指定されるが、配列がＲＮＡを表す場合には、「Ｔ」は、「Ｕ」に置き換えられるであろうことを理解するであろう。
本開示の組成物において有用なポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；Ｎ６－メチルアデノシン；Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン；１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；１－メチルアデノシン；２’－Ｏ－メチルアデノシン；２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）；２－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’－Ｏ－メチルアデノシン；２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）；イソペンテニルアデノシン；Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン；Ｎ６－アセチルアデノシン；Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン；２－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；７－デアザ－アデノシン；Ｎ１－メチル－アデノシン；Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン；Ｎ６－ｃｉｓ－ヒドロキシ－イソペンテニル－アデノシン；α－チオ－アデノシン；２（アミノ）アデニン；２（アミノプロピル）アデニン；２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン；２－（アルキル）アデニン；２－（アミノアルキル）アデニン；２－（アミノプロピル）アデニン；２－（ハロ）アデニン；２－（ハロ）アデニン；２－（プロピル）アデニン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＡＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＡＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドアデノシンＴＰ；６（アルキル）アデニン；６（メチル）アデニン；６－（アルキル）アデニン；６－（メチル）アデニン；７（デアザ）アデニン；８（アルケニル）アデニン；８（アルキニル）アデニン；８（アミノ）アデニン；８（チオアルキル）アデニン；８－（アルケニル）アデニン；８－（アルキル）アデニン；８－（アルキニル）アデニン；８－（アミノ）アデニン；８－（ハロ）アデニン；８－（ヒドロキシル）アデニン；８－（チオアルキル）アデニン；８－（チオール）アデニン；８－アジド－アデノシン；アザアデニン；デアザアデニン；Ｎ６（メチル）アデニン；Ｎ６－（イソペンチル）アデニン；７－デアザ－８－アザ－アデノシン；７－メチルアデニン；１－デアザアデノシンＴＰ；２’フルオロ－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ；２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ＡＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ；２’－ａ－エチニルアデノシンＴＰ；２－アミノアデニン；２－アミノアデノシンＴＰ；２－アミノ－ＡＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２－アジドアデノシンＴＰ；２’－ｂ－エチニルアデノシンＴＰ；２－ブロモアデノシンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２－クロロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシアデノシンＴＰ；２－フルオロアデノシンＴＰ；２－ヨードアデノシンＴＰ；２－メルカプトアデノシンＴＰ；２－メトキシ－アデニン；２－メチルチオ－アデニン；２－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－ブロモアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－クロロアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－フルオロアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－ヨードアデノシンＴＰ；３－デアザアデノシンＴＰ；４’－アジドアデノシンＴＰ；４’－炭素環式アデノシンＴＰ；４’－エチニルアデノシンＴＰ；５’－ホモ－アデノシンＴＰ；８－アザ－ＡＴＰ；８－ブロモ－アデノシンＴＰ；８－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；９－デアザアデノシンＴＰ；２－アミノプリン；７－デアザ－２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン；２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン；２－チオシチジン；３－メチルシチジン；５－ホルミルシチジン；５－ヒドロキシメチルシチジン；５－メチルシチジン；Ｎ４－アセチルシチジン；２’－Ｏ－メチルシチジン；２’－Ｏ－メチルシチジン；５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン；リシジン；Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン；Ｎ４－メチルシチジン；Ｎ４，Ｎ４－ジメチル－２’－ＯＭｅ－シチジンＴＰ；４－メチルシチジン；５－アザ－シチジン；シュード－イソ－シチジン；ピロロ－シチジン；α－チオ－シチジン；２－（チオ）シトシン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＣＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＣＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドシチジンＴＰ；３（デアザ）５（アザ）シトシン；３（メチル）シトシン；３－（アルキル）シトシン；３－（デアザ）５（アザ）シトシン；３－（メチル）シチジン；４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；５（ハロ）シトシン；５（メチル）シトシン；５（プロピニル）シトシン；５（トリフルオロメチル）シトシン；５－（アルキル）シトシン；５－（アルキニル）シトシン；５－（ハロ）シトシン；５－（プロピニル）シトシン；５－（トリフルオロメチル）シトシン；５－ブロモ－シチジン；５－ヨード－シチジン；５－プロピニルシトシン；６－（アゾ）シトシン；６－アザ－シチジン；アザシトシン；デアザシトシン；Ｎ４（アセチル）シトシン；１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン；１－メチル－シュードイソシチジン；２－メトキシ－５－メチル－シチジン；２－メトキシ－シチジン；２－チオ－５－メチル－シチジン；４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン；４－メトキシ－シュードイソシチジン；４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン；４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン；４－チオ－シュードイソシチジン；５－アザ－ゼブラリン；５－メチル－ゼブラリン；ピロロ－シュードイソシチジン；ゼブラリン；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）シチジンＴＰ；２，２’－アンヒドロ－シチジンＴＰ塩酸塩；２’フルオロ－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ；２’フルオロ－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ；２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ；２’－ａ－エチニルシチジンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’－ｂ－エチニルシチジンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシシチジンＴＰ；２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）シチジンＴＰ；３’－エチニルシチジンＴＰ；４’－アジドシチジンＴＰ；４’－炭素環式シチジンＴＰ；４’－エチニルシチジンＴＰ；５－（１－プロピニル）アラ－シチジンＴＰ；５－（２－クロロ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ；５－（４－アミノ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ；５－アミノアリル－ＣＴＰ；５－シアノシチジンＴＰ；５－エチニルアラ－シチジンＴＰ；５－エチニルシチジンＴＰ；５’－ホモ－シチジンＴＰ；５－メトキシシチジンＴＰ；５－トリフルオロメチル－シチジンＴＰ；Ｎ４－アミノ－シチジンＴＰ；Ｎ４－ベンゾイル－シチジンＴＰ；シュードイソシチジン；７－メチルグアノシン；Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン；Ｎ２－メチルグアノシン；ワイオシン；１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン；１－メチルグアノシン；２’－Ｏ－メチルグアノシン；２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）；２’－Ｏ－メチルグアノシン；２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）；７－アミノメチル－７－デアザグアノシン；７－シアノ－７－デアザグアノシン；アルカエオシン；メチルワイオシン；Ｎ２，７－ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン；Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン；６－チオ－グアノシン；７－デアザ－グアノシン；８－オキソ－グアノシン；Ｎ１－メチル－グアノシン；α－チオ－グアノシン；２（プロピル）グアニン；２－（アルキル）グアニン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＧＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＧＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドグアノシンＴＰ；６（メチル）グアニン；６－（アルキル）グアニン；６－（メチル）グアニン；６－メチル－グアノシン；７（アルキル）グアニン；７（デアザ）グアニン；７（メチル）グアニン；７－（アルキル）グアニン；７－（デアザ）グアニン；７－（メチル）グアニン；８（アルキル）グアニン；８（アルキニル）グアニン；８（ハロ）グアニン；８（チオアルキル）グアニン；８－（アルケニル）グアニン；８－（アルキル）グアニン；８－（アルキニル）グアニン；８－（アミノ）グアニン；８－（ハロ）グアニン；８－（ヒドロキシル）グアニン；８－（チオアルキル）グアニン；８－（チオール）グアニン；アザグアニン；デアザグアニン；Ｎ（メチル）グアニン；Ｎ－（メチル）グアニン；１－メチル－６－チオ－グアノシン；６－メトキシ－グアノシン；６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン；６－チオ－７－デアザ－グアノシン；６－チオ－７－メチル－グアノシン；７－デアザ－８－アザ－グアノシン；７－メチル－８－オキソ－グアノシン；Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン；Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン；１－Ｍｅ－ＧＴＰ；２’フルオロ－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；２’－ａ－エチニルグアノシンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’－ｂ－エチニルグアノシンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシグアノシンＴＰ；４

’－アジドグアノシンＴＰ；４’－炭素環式グアノシンＴＰ；４’－エチニルグアノシンＴＰ；５’－ホモ－グアノシンＴＰ；８－ブロモ－グアノシンＴＰ；９－デアザグアノシンＴＰ；Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；１－メチルイノシン；イノシン；１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン；２’－Ｏ－メチルイノシン；７－メチルイノシン；２’－Ｏ－メチルイノシン；エポキシクエオシン；ガラクトシル－クエオシン；マンノシルクエオシン；クエオシン；アリアミノ－チミジン；アザチミジン；デアザチミジン；デオキシ－チミジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２－チオウリジン；３－メチルウリジン；５－カルボキシメチルウリジン；５－ヒドロキシウリジン；５－メチルウリジン；５－タウリノメチル－２－チオウリジン；５－タウリノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；シュードウリジン；（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン；１－メチル－３－（３－アミノ－５－カルボキシプロピル）シュードウリジン；１－メチルシュードウリジン；１－メチル－シュードウリジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２’－Ｏ－メチルシュードウリジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン；３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン；３－メチル－シュード－ウリジンＴＰ；４－チオウリジン；５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン；５，６－ジヒドロ－ウリジン；５－アミノメチル－２－チオウリジン；５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－カルバモイルメチルウリジン；５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン；５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル；５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５－カルバモイルメチルウリジンＴＰ；５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン；５－メトキシカルボニルメチルウリジン；５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン；５－メチル－２－チオウリジン；５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン；５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－メチルアミノメチルウリジン；５－メチルジヒドロウリジン；５－オキシ酢酸－ウリジンＴＰ；５－オキシ酢酸－メチルエステル－ウリジンＴＰ；Ｎ１－メチル－シュード－ウリジン；ウリジン５－オキシ酢酸；ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－ウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ；５－プロピニルウラシル；α－チオ－ウリジン；１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル；１置換２（チオ）－シュードウラシル；１置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１置換４（チオ）シュードウラシル；１置換シュードウラシル；１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２－（チオ）－シュードウラシル；１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－シュード－ＵＴＰ；２（チオ）シュードウラシル；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２－（チオ）ウラシル；２，４－（ジチオ）シュードウラシル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ－グアノシン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－アジド－デオキシウリジンＴＰ；２’－Ｏ－メチルシュードウリジン；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドウリジンＴＰ；２－メチルシュードウリジン；３（３アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル；４（チオ）シュードウラシル；４－（チオ）シュードウラシル；４－（チオ）ウラシル；４－チオウラシル；５（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル；５（２－アミノプロピル）ウラシル；５（アミノアルキル）ウラシル；５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル；５（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル；５（メチル）２（チオ）ウラシル；５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチル）４（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル；５（プロピニル）ウラシル；５（トリフルオロメチル）ウラシル；５－（２－アミノプロピル）ウラシル；５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル；５－（アルキル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル；５－（アルキル）－４（チオ）シュードウラシル；５－（アルキル）シュードウラシル；５－（アルキル）ウラシル；５－（アルキニル）ウラシル；５－（アリルアミノ）ウラシル；５－（シアノアルキル）ウラシル；５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル；５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５－（ハロ）ウラシル；５－（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル；５－（メトキシ）ウラシル；５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル；５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル；５－（メチル）２（チオ）ウラシル；５－（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５－（メチル）４（チオ）ウラシル；５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル；５－（メチル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル；５－（メチル）－４（チオ）シュードウラシル；５－（メチル）シュードウラシル；５－（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル；５－（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル；５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル；５－（プロピニル）ウラシル；５－（トリフルオロメチル）ウラシル；５－アミノアリル－ウリジン；５－ブロモ－ウリジン；５－ヨード－ウリジン；５－ウラシル；６（アゾ）ウラシル；６－（アゾ）ウラシル；６－アザ－ウリジン；アリアミノ－ウラシル；アザウラシル；デアザウラシル；Ｎ３（メチル）ウラシル；シュード－ＵＴＰ－１－２－エタン酸；シュードウラシル；４－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－カルボキシメチル－シュードウリジン；１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン；１－プロピニル－ウリジン；１－タウリノメチル－１－メチル－ウリジン；１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン；１－タウリノメチル－シュードウリジン；２－メトキシ－４－チオ－シュードウリジン；２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン；２－チオ－１－メチル－シュードウリジン；２－チオ－５－アザ－ウリジン；２－チオ－ジヒドロシュードウリジン；２－チオ－ジヒドロウリジン；２－チオ－シュードウリジン；４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン；４－メトキシ－シュードウリジン；４－チオ－１－メチル－シュードウリジン；４－チオ－シュードウリジン；５－アザ－ウリジン；ジヒドロシュードウリジン；（±）１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｒ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｓ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ；（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ；（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ；１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ；１－（２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，２－ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，４，６－トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－アミノ－エチル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（２－メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（３，４－ビス－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（３，４－ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ；１－（３－アミノ－プロピル）シュード－ＵＴＰ；１－（３－シクロプロピル－プロパ－２－イニル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－ブチル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メトキシ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－メトキシ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ニトロ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１（４－ニトロ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（５－アミノ－ペンチル）シュード－ＵＴＰ；１－（６－アミノ－ヘキシル）シュード－ＵＴＰ；１，６－ジメチル－シュード－ＵＴＰ；１－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－エトキシ｝－エトキシ）－プロピオニル］シュードウリジンＴＰ；１－｛３－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ；１－アセチルシュードウリジンＴＰ；１－アルキル－６－（１－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－（２－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－アリル－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－エチニル－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－ホモアリル－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－ビニル－シュード－ＵＴＰ；１－アリルシュードウリジンＴＰ；１－アミノメチル－シュード－ＵＴＰ；１－ベンゾイルシュードウリジンＴＰ；１－ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－ベンジル－シュード－ＵＴＰ；１－ビオチニル－ＰＥＧ２－シュードウリジンＴＰ；１－ビオチニルシュードウリジンＴＰ；１－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－シアノメチルシュードウ

リジンＴＰ；１－シクロブチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロブチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘプチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘプチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘキシルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘキシル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロオクチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロオクチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロペンチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロペンチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロプロピルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロプロピル－シュード－ＵＴＰ；１－エチル－シュード－ＵＴＰ；１－ヘキシル－シュード－ＵＴＰ；１－ホモアリルシュードウリジンＴＰ；１－ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－２－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－４－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－アルファ－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ；１－メトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（置換フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－アミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－アジド－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－クロロ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－シアノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヨード－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；１－モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１－ペンチル－シュード－ＵＴＰ；１－フェニル－シュード－ＵＴＰ；１－ピバロイルシュードウリジンＴＰ；１－プロパルギルシュードウリジンＴＰ；１－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－プロピニル－シュードウリジン；１－ｐ－トリル－シュード－ＵＴＰ；１－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１－トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ；１－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；１－ビニルシュードウリジンＴＰ；２，２’－アンヒドロ－ウリジンＴＰ；２’－ブロモ－デオキシウリジンＴＰ；２’－Ｆ－５－メチル－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－ＯＭｅ－５－Ｍｅ－ＵＴＰ；２’－ＯＭｅ－シュード－ＵＴＰ；２’－ａ－エチニルウリジンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’－ｂ－エチニルウリジンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシウリジンＴＰ；２－メトキシ－４－チオ－ウリジン；２－メトキシウリジン；２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）ウリジンＴＰ；３－アルキル－シュード－ＵＴＰ；４’－アジドウリジンＴＰ；４’－炭素環式ウリジンＴＰ；４’－エチニルウリジンＴＰ；５－（１－プロピニル）アラ－ウリジンＴＰ；５－（２－フラニル）ウリジンＴＰ；５－シアノウリジンＴＰ；５－ジメチルアミノウリジンＴＰ；５’－ホモ－ウリジンＴＰ；５－ヨード－２’－フルオロ－デオキシウリジンＴＰ；５－フェニルエチニルウリジンＴＰ；５－トリジュウテロメチル－６－ジュウテロウリジンＴＰ；５－トリフルオロメチル－ウリジンＴＰ；５－ビニルアラウリジンＴＰ；６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ；６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；６－（置換－フェニル）－シュード－ＵＴＰ；６－アミノ－シュード－ＵＴＰ；６－アジド－シュード－ＵＴＰ；６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ；６－ブチル－シュード－ＵＴＰ；６－クロロ－シュード－ＵＴＰ；６－シアノ－シュード－ＵＴＰ；６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ；６－エチル－シュード－ＵＴＰ；６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ；６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ；６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ；６－ヨード－シュード－ＵＴＰ；６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－メチル－シュード－ＵＴＰ；６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；６－プロピル－シュード－ＵＴＰ；６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；アルファ－チオ－シュード－ＵＴＰ；シュードウリジン１－（４－メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ；シュードウリジン１－（４－メチル安息香酸）ＴＰ；シュードウリジンＴＰ１－［３－（２－エトキシ）］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－（２－エトキシ）－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－｛２（２－エトキシ）－エトキシ｝－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ１－メチルホスホン酸；シュードウリジンＴＰ１－メチルホスホン酸ジエチルエステル；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－３－プロピオン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－４－ブタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－５－ペンタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－６－ヘキサン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－７－ヘプタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－ｐ－安息香酸；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；イソワイオシン；ペルオキシワイブトシン；不十分修飾ヒドロキシワイブトシン；４－デメチルワイオシン；２，６－（ジアミノ）プリン；１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル：１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル；１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン；２（アミノ）プリン；２，４，５－（トリメチル）フェニル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ－シチジン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ－アデニン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルオロ－ウリジン；２’－アミノ－２’－デオキシリボース；２－アミノ－６－クロロ－プリン；２－アザ－イノシニル；２’－アジド－２’－デオキシリボース；２’フルオロ－２’－デオキシリボース；２’－フルオロ修飾塩基；２’－Ｏ－メチル－リボース；２－オキソ－７－アミノピリドピリミジン－３－イル；２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル；２－ピリジノン；３ニトロピロール；３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル；３－（メチル）イソカルボスチリリル；４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンゾイミダゾール；４－（メチル）ベンゾイミダゾール；４－（メチル）インドリル；４，６－（ジメチル）インドリル；５ニトロインドール；５置換ピリミジン；５－（メチル）イソカルボスチリリル；５－ニトロインドール；６－（アザ）ピリミジン；６－（アゾ）チミン；６－（メチル）－７－（アザ）インドリル；６－クロロ－プリン；６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（アザ）インドリル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）フェノキサジン－１－イル（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｌ－ｙｌ）；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（プロピニル）イソカルボスチリリル；７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル；７－デアザ－イノシニル；７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル；７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；９－（メチル）－イミジゾピリジニル；アミノインドリル；アントラセニル；ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ビス－オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ジフルオロトリル；ヒポキサンチン；イミジゾピリジニル；イノシニル；イソカルボスチリリル；イソグアニシン；Ｎ２－置換プリン；Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン；Ｎ６－置換プリン；Ｎ－アルキル化誘導体；ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）；ニトロベンゾイミダゾリル；ニトロイミダゾリル；ニトロインダゾリル；ニトロピラゾリル；ヌブラリン；Ｏ６－置換プリン；Ｏ－アルキル化誘導体；オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；オキソホルマイシンＴＰ；パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ペンタセニル；フェナントラセニル；フェニル；プロピニル－７－（アザ）インドリル；ピレニル；ピリドピリミジン－３－

イル；ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル；ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ピロロピリミジニル；ピロロピリジニル；スチルベンジル；置換１，２，４－トリアゾール；テトラセニル；ツベルシジン；キサンチン；キサントシン－５’－ＴＰ；２－チオ－ゼブラリン；５－アザ－２－チオ－ゼブラリン；７－デアザ－２－アミノ－プリン；ピリジン－４－オンリボヌクレオシド；２－アミノ－リボシド－ＴＰ；ホルマイシンＡ ＴＰ；ホルマイシンＢ ＴＰ；ピロロシンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－アデノシンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－シチジンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－ウリジンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－グアノシンＴＰ；５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ；およびＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン ７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、および２，６－ジアミノプリン、（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、２，８－ジメチルアデノシン、２－ゲラニルチオウリジン、２－リシジン、２－セレノウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、３－メチルシュードウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピル－デメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８－メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環状Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル－クエオシン、メチル化不十分修飾ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、ゲラニル化５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、ゲラニル化５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基、およびこれらの２つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。１つの特定の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。
（ｉ）塩基修飾
ある特定の実施形態では、化学的修飾は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の核酸塩基におけるものである。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウラシル、２－チオ－１－メチル－シュードウラシル、２－チオ－５－アザ－ウラシル、２－チオ－ジヒドロシュードウラシル、２－チオ－ジヒドロウラシル、２－チオ－シュードウラシル、４－メトキシ－２－チオ－シュードウラシル、４－メトキシ－シュードウラシル、４－チオ－１－メチル－シュードウラシル、４－チオ－シュードウラシル、５－アザ－ウラシル、ジヒドロシュードウラシル、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、２’－Ｏ－メチルウラシル、１－メチル－シュードウラシル（ｍ１ψ）、５－メトキシ－ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シトシン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアニン、α－チオ－アデニン、５－シアノウラシル、４’－チオウラシル、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデニン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）、および２，６－ジアミノプリン、（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアニン、７－シアノ－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアニン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアニン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアニン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアニン、７－メチル－８－オキソ－グアニン、およびこれらの２つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中の核酸塩基は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、化学的に修飾された核酸塩基は、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のアデニンは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のシトシンは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のグアニンは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、修飾された核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）における修飾された核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオ－グアノシン、およびα－チオ－アデノシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジンおよび５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に関しては、一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通じて修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で一様に修飾され得、これは、ｍＲＮＡ配列におけるすべてのシトシン残基が、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記に記載されるもののうちのいずれかなど、修飾された残基との置換えによって、一様に修飾され得る。
一部の実施形態では、オープンリーディングフレームにおける化学的に修飾されるヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。修飾されたシトシンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジンが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたウリジンである。修飾されたウリジンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、５－シアノウリジンまたは４’－チオウリジンが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。修飾されたアデニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）、および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。修飾されたグアニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシンが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）における核酸塩基が修飾されたヌクレオチドは、５－メトキシウリジンである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、修飾された核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組合せを含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）におけるある種類の核酸塩基（例えば、ウラシル）のうちの少なくとも９５％が、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）におけるウラシルのうちの少なくとも９５％が、５－メトキシウラシルである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシウリジン（５ｍｏ５Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に関しては、一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通じて修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メトキシウリジンで一様に修飾され得、これは、ｍＲＮＡ配列における実質的にすべてのウリジン残基が、５－メトキシウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記に記載されるもののうちのいずれかなど、修飾された残基との置換えによって、一様に修飾され得る。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたウラシルである。修飾されたウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドは、５－メトキシウラシルを含む。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中の核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの組合せは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のウリジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のアデノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のシチジンヌクレオシドは、少なくとも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のグアノシンヌクレオシドは、少なくとも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に開示されるサブユニットおよび異種ポリペプチドリンカーを含め、ヌクレオシドの間に任意の有用なリンカーを含み得る。本開示の組成物において有用なそのようなリンカーとしては、骨格修飾を含め、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：３’－アルキレンホスホネート、３’－アミノホスホロアミデート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシドおよびスルホン骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホロアミデート。
（ｉｉ）糖修飾
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込むことができる修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、構成ブロック分子）は、リボ核酸の糖に修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）が、修飾され得るか、またはいくつかの異なる置換基で置き換えられ得る。２’位における例示的な置換基としては、Ｈ、ハロ、任意に置換されるＣ１～６アルキル；任意に置換されるＣ１～６アルコキシ；任意に置換されるＣ６～１０アリールオキシ；任意に置換されるＣ３～８シクロアルキル；任意に置換されるＣ３～８シクロアルコキシ；任意に置換されるＣ６～１０アリールオキシ；任意に置換されるＣ６～１０アリール－Ｃ１～６アルコキシ；任意に置換されるＣ１～１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載される任意のもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるアルキルであり、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、および４～２０）の整数である；２’－ヒドロキシルが、Ｃ１～６アルキレンまたはＣ１～６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’－炭素に結合されている、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）、ここで、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含む；本明細書に定義されるアミノアルキル；本明細書に定義されるアミノアルコキシ；本明細書に定義されるアミノ；ならびに本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である、糖基リボースを含む。例示的で非限定的な修飾されたヌクレオチドとしては、リボースにおける酸素の置換え（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはアルキレン、例えば、メチレンまたはエチレンでの）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置き換えるため）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタン４員環を形成するため）；リボースの環拡大（例えば、ホスホロアミデート骨格も有する、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびモルホリノのための、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成するため）；多環式形態（例えば、トリシクロ；および「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ、リボースが、ホスホジエステル結合に結合したグリコール単位によって置き換えられる）、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースが、α－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置き換えられる）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ、２－アミノ－エチル－グリシン結合が、リボースおよびホスホジエステル骨格を置き換える）が挙げられる。糖基はまた、リボースにおける対応する炭素のものとは逆の立体化学構造を有する、１つまたは複数の炭素を含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含み得る。そのような糖修飾は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号および同第ＷＯ２０１４０９３９２４号に教示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（ｉｉｉ）修飾の組合せ
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ならびに／あるいはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチド、またはそれらの機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組合せを含み得る。これらの組合せは、本明細書に記載される任意の１つまたは複数の修飾を含み得る。
修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドの組合せの例は、以下の表５に提供される。修飾されたヌクレオチドの組合せを使用して、本開示のポリヌクレオチドを形成することができる。別途示されない限り、修飾されたヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの天然のヌクレオチドを、完全に置換してもよい。非限定的な例として、天然のヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例では、天然のヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示される修飾されたヌクレオシドのうちの少なくとも１つで、部分的に（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）置換され得るかまたは置き換えられ得る。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得、そのような修飾は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号および同第ＷＯ２０１４０９３９２４号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号および同第ＵＳ２０１５０３０７５４２号に教示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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１３．非翻訳領域（ＵＴＲ）
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されない、開始コドンの前（５’ＵＴＲ）および終止コドンの後（３’ＵＴＲ）のポリヌクレオチドの核酸区画である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、さらに、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらの組合せ）を含む。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドのコーディング領域に相同であっても異種であってもよい。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするＯＲＦに相同である。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＩＬ１２ポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの５’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれよりも多くの３’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せは、配列最適化される。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、制御上の役割、例えば、増大または減少した安定性、局在化、および／または翻訳効率を提供する、特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に投与することができ、１つまたは複数の制御上の特徴は、日常的な方法を使用して測定することができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ、全長５’または３’ＵＴＲの１つまたは複数の制御上の特徴を含む。
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが、多数の遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に公知である、コザック配列のようなものを特徴としている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２３２）を有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、これには、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
特定の標的器官の豊富に発現される遺伝子において典型的に見出される特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性およびタンパク質産生を増強することができる。例えば、肝臓に発現されるｍＲＮＡ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子の５’ＵＴＲの導入により、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、その組織における発現を改善するために他の組織特異的ｍＲＮＡに由来する５’ＵＴＲを使用することが、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ハーキュリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、ミエロイド細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、ならびに肺上皮細胞（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に可能である。
一部の実施形態では、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有している転写産物のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、特定の細胞、組織において、または発達中の何らかの時点で、発現される、タンパク質のファミリーに属し得る（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する）。遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じかまたは異なるタンパク質のファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して、新しいポリヌクレオチドを作製することができる。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、異種であり得る。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
共同所有の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、ＯＲＦに隣接する領域として利用することができる例示的なＵＴＲの一覧を提供する。
本出願の例示的なＵＴＲとしては、グロビン、例えば、α－またはβ－グロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５ αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（水酸化ステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ）；リボソームタンパク質大型３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、ｒｐｓ９など）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）；成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲンアルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲンアルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲンアルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボフォリン（例えば、リボフォリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタレート５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；ならびにヌクレオバインディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つまたは複数の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
他の例示的な５’および３’ＵＴＲとしては、Ｋａｒｉｋｏら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２００８年、１６巻（１１号）、１８３３～１８４０頁；Ｋａｒｉｋｏら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２０１２年、２０巻（５号）、９４８～９５３頁；Ｋａｒｉｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１１年、３９巻（２１号）：ｅ１４２頁；Ｓｔｒｏｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９７年、４巻、６２４～６２７頁；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２０１５年、２９０巻（９号）、５６６１～５６７２頁；Ｙｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００７年、２５巻（１０号）、１７０１～１７１１頁；Ｃａｆｒｉら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２０１５年、２３巻（８号）、１３９１～１４００頁；Ａｎｄｒｉｅｓら、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ．、２０１２年、９巻（８号）、２１３６～２１４５頁；Ｃｒｏｗｌｅｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１５年６月３０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１５．６８；Ｒａｍｕｎａｓら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、２０１５年、２９巻（５号）、１９３０～１９３９頁；Ｗａｎｇら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１５年、１５巻（４号）、４２８～４３５頁；Ｈｏｌｔｋａｍｐら、Ｂｌｏｏｄ、２００６年、１０８巻（１３号）、４００９～４０１７頁；Ｋｏｒｍａｎｎら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１年、２９巻（２号）、１５４～１５７頁；Ｐｏｌｅｇａｎｏｖら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ．、２０１５年、２６巻（１１号）、７５１～７６６頁；Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２０１０年、７巻（５号）、６１８～６３０頁；ＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１３年、８巻（３号）、５６８～５８２頁；ＨｏｌｃｉｋおよびＬｉｅｂｈａｂｅｒ、ＰＮＡＳ、１９９７年、９４巻（６号）、２４１０～２４１４頁；Ｆｅｒｉｚｉら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ．、２０１５年、１５巻（１７号）、３５６１～３５７１頁；Ｔｈｅｓｓら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２０１５年、２３巻（９号）、１４５６～１４６４頁；Ｂｏｒｏｓら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１５年、１０巻（６号）、ｅ０１３１１４１頁；Ｂｏｒｏｓら、Ｊ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｂ．、２０１３年、１２９巻、９３～９９頁；Ａｎｄｒｉｅｓら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１５年、２１７巻、３３７～３４４頁；Ｚｉｎｃｋｇｒａｆら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００３年、２１巻（１５号）、１６４０～９頁；Ｇａｒｎｅａｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、２００８年、８２巻（２号）、８８０～８９２頁；ＨｏｌｄｅｎおよびＨａｒｒｉｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４年、３２９巻（１号）、１１９～１３３頁；Ｃｈｉｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、２００５年、７９巻（１３号）、８３０３～８３１５頁；Ｗａｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９７年、１６巻（１３号）、４１０７～４１１６頁；Ａｌ－Ｚｏｇｈａｉｂｉら、Ｇｅｎｅ、２００７年、３９１巻（１～２号）、１３０～９頁；Ｖｉｖｉｎｕｓら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００１年、２６８巻（７号）、１９０８～１９１７頁；ＧａｎおよびＲｈｏａｄｓ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１巻（２号）、６２３～６２６頁；Ｂｏａｄｏら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９９６年、６７巻（４号）、１３３５～１３４３頁；ＫｎｉｒｓｃｈおよびＣｌｅｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２０００年、２７２巻（１号）、１６４～１６８頁；Ｃｈｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８年、３７巻（４６号）、１６２９８～１６３０６頁；ＩｚｑｕｉｅｒｄｏおよびＣｕｅｖｚａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２０００年、３４６巻、３部：８４９～８５５頁；Ｄｗｙｅｒら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９９６年、６６巻（２号）、４４９～４５８頁；Ｂｌａｃｋら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１９９７年、１７巻（５号）、２７５６～２７６３頁；ＩｚｑｕｉｅｒｄｏおよびＣｕｅｖｚａ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１９９７年、１７巻（９号）、５２５５～５２６８頁；ＵＳ８２７８０３６、ＵＳ８７４８０８９、ＵＳ８８３５１０８、ＵＳ９０１２２１９、ＵＳ２０１０／０１２９８７７、ＵＳ２０１１／００６５１０３、ＵＳ２０１１／００８６９０４、ＵＳ２０１２／０１９５９３６、ＵＳ２０１４／０２０６７５、ＵＳ２０１３／０１９５９６７、ＵＳ２０１４／０２９４９０、ＵＳ２０１４／０２０６７５３、ＷＯ２００７／０３６３６６、ＷＯ２０１１／０１５３４７、ＷＯ２０１２／０７２０９６、ＷＯ２０１３／１４３５５５、ＷＯ２０１４／０７１９６３号、ＷＯ２０１３／１８５０６７、ＷＯ２０１３／１８２６２３、ＷＯ２０１４／０８９４８６、ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＷＯ２０１４／１４４１９６、ＷＯ２０１４／１５２６５９、２０１４／１５２６７３、ＷＯ２０１４／１５２９４０、ＷＯ２０１４／１５２７７４、ＷＯ２０１４／１５３０５２、ＷＯ２０１４／１５２９６６、ＷＯ２０１４／１５２５１３、ＷＯ２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ２０１５／０６２７３８、ならびにＷＯ２０１５／０２４６６７に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されず、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、β－グロビン５’ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’ＵＴＲ；シトクロムｂ－２４５ αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；水酸化ステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造的タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ５’ＵＴＲ；これらの機能的断片およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、β－グロビン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ；アルブミン３’ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α－グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ ３’ＵＴＲ；これらの機能的断片およびこれらの組合せからなる群から選択される。
他の例示的なＵＴＲとしては、ＷＯ２０１４／１６４２５３に開示されているＵＴＲのうちの１つまたは複数（ＵＴＲの任意の組合せを含む）が挙げられるがこれらに限定されず、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国仮出願第６１／７７５，５０９号の表２１および米国仮出願第６１／８２９，３７２号の表２２には、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの開始部位および終了部位の一覧が示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。表２１では、それぞれの５’ＵＴＲ（５’－ＵＴＲ－００５から５’－ＵＴＲ ６８５１１）は、その天然または野生型（相同）転写産物と比べた、その開始部位および終了部位により特定される（ＥＮＳＴ、ＥＮＳＥＭＢＬデータベースにおいて使用される識別子）。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。一部の実施形態では、ＵＴＲは、例えば、ＯＲＦに対するＵＴＲの配向もしくは位置を変更することによって、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、野生型または天然のＵＴＲに対して変化させて、バリアントＵＴＲを産生することができる。一部の実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つもしくは複数のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されたかもしくはそこから除去されたバリアントが、利用され得る。
加えて、１つまたは複数の合成ＵＴＲを、１つまたは複数の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用してもよい。例えば、ＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ、Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１３年、８巻（３号）、５６８～８２頁（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびにｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／（最終アクセス２０１６年４月１６日）で入手可能な配列を参照されたい。ＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写産物と同じ配向で配置されてもよく、または配向もしくは位置を変化させてもよい。したがって、５’および／または３’ＵＴＲは、逆転されるか、短くされるか、延長されるか、または１つもしくは複数の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと組み合わされてもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、または四重の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、直列または実質的に直列のいずれかで、同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲを、使用することができる（ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＵＴＲのいずれかから選択される５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、
Figure 0007246930000083
Figure 0007246930000084
Figure 0007246930000085
Figure 0007246930000086
を含む。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、
Figure 0007246930000087
Figure 0007246930000088
Figure 0007246930000089
Figure 0007246930000090
Figure 0007246930000091
Figure 0007246930000092
Figure 0007246930000093
Figure 0007246930000094
Figure 0007246930000095
Figure 0007246930000096
を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ配列は、本明細書に開示の５’ＵＴＲ配列のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列および／または本明細書に開示の３’ＵＴＲ配列のいずれかを含む３’ＵＴＲ配列、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、３’ＵＴＲの機能を破壊することなく、１または複数のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位、またはその中の任意の他の異種ヌクレオチド配列を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ配列のいくつかの例を、表６に列挙する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２３８～２４０からなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２３８に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２３９に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２４０に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
Figure 0007246930000097
本開示のポリヌクレオチドは、特徴の組合せを含み得る。例えば、ＯＲＦには、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲおよび／またはポリ－Ａ尾部の鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲが、隣接していてもよい。５’ＵＴＲは、同じおよび／または異なるＵＴＲに由来する第１のポリヌクレオチド断片および第２のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
パターン型ＵＴＲを有することもまた、本開示の範囲内である。本明細書において使用されるとき、「パターン型ＵＴＲ」には、反復または交互のパターン、例えば、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、もしくは３回を上回って反復されるこれらのバリアントが含まれる。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なるＵＴＲ核酸配列を表す。
他の非ＵＴＲ配列を、本開示のポリヌクレオチド内の領域または部分領域として使用してもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分が、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列の組込みにより、タンパク質の産生ならびにポリヌクレオチドの発現レベルを増大させることができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりまたはそれに加えて、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１０年、３９４巻（１号）、１８９～１９３頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、それぞれ、非構造的タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレームを含む、ＲＶゲノムＲＮＡの５’および／または３’末端と関連する５’および／または３’配列、またはその欠失誘導体を含む（例えば、Ｐｏｇｕｅら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６７巻（１２号）、７１０６～７１１７頁を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ウイルスキャプシド配列はまた、翻訳エンハンサー、例えば、キャプシド配列の５’部分として使用され得る（例えば、Ｓｊｏｂｅｒｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）、１９９４年、１２巻（１１号）、１１２７～１１３１頁ならびにＦｒｏｌｏｖおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、７０巻（２号）、１１８２～１１９０頁に記載されるセムリキ森林ウイルスおよびシンドビスウイルスキャプシドＲＮＡ、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦおよびウイルスキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを、非合成３’ＵＴＲと組み合わせて含む。
一部の実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、１つの翻訳エンハンサーエレメント、または複数の翻訳エンハンサーエレメント（集合的に、「ＴＥＥ」、これは、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増大させる核酸配列を指す）を含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、ＵＳ２００９／０２２６４７０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるもの、および当技術分野において公知のその他のものが挙げられる。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置してもよい。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
一態様では、ＴＥＥは、核酸の翻訳活性、例えば、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳を促進し得る、ＵＴＲ内の保存されたエレメントである。これらの配列の保存は、ヒトを含め、１４種にわたって示されている。例えば、Ｐａｎｅｋら、「Ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｔｏ ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ５４８を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１つの非限定的な例では、ＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’リーダーにおけるＴＥＥ配列を含む。Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ、２００４年、１０１巻、９５９０～９５９４頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
他の非限定的な例において、ＴＥＥは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、およびＷＯ２００９／０７５８８６の配列番号１～３５；ＷＯ２０１２／００９６４４の配列番号１～５および７～６４５；ならびにＷＯ１９９９／０２４５９５、ＵＳ６３１０１９７、およびＵＳ６８４９４０５の配列番号１の配列のうちの１つもしくは複数を有するＴＥＥを含み、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＴＥＥは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ－ＩＲＥＳ、またはＩＲＥＳ要素であり、例えば、これらに限定されないが、ＵＳ７４６８２７５、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、およびＷＯ２００１／０５５３６９に記載されるもの；このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＩＲＥＳ要素として、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ ２００４ １０１：９５９０－９５９４、Ｚｈｏｕら、ＰＮＡＳ ２００５ １０２：６２７３－６２７８、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、およびＷＯ２００７／０２５００８によって記載されるようなＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９－ｎｔ、Ｇｔｘ８－ｎｔ、Ｇｔｘ７－ｎｔ）が挙げられ得るが、これらに限定されず、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」とは、本明細書において提供されるおよび／または当技術分野において公知のＴＥＥ（例えば、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＵＳ２００９／００９３０４９、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、およびＥＰ２６１０３４０Ａ１を参照のこと、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはそれらのバリアント、ホモログ、もしくは機能的誘導体のうちの１つまたは複数を含むポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＴＥＥの１つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおけるＴＥＥは、１つまたは複数の配列セグメント中に編成され得る。配列セグメントは、本明細書において提供されるＴＥＥのうちの１つまたは複数を保有してよく、それぞれのＴＥＥは、１つまたは複数のコピーで存在している。複数の配列セグメントが、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、それらは、同種であっても異種であってもよい。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおける複数の配列セグメントは、本明細書において提供される同一または異なる種類のＴＥＥ、同一または異なる数のそれぞれのＴＥＥのコピー、ならびに／またはそれぞれの配列セグメント内で同一もしくは異なる編成のＴＥＥを保有し得る。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２００９／００９３０４９、またはＵＳ２０１３／０１７７５８１に開示される少なくとも１つのＴＥＥまたはその部分を含み、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ ２００４ １０１：９５９０－９５９４、Ｚｈｏｕら、ＰＮＡＳ ２００５ １０２：６２７３－６２７８、ならびにＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋら、「Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍｃａｐ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２の補遺の表１および補遺の表２に開示されるＴＥＥに少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるＴＥＥを含み、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ ２００４ １０１：９５９０－９５９４、Ｚｈｏｕら、ＰＮＡＳ ２００５ １０２：６２７３－６２７８、ならびにＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋら、「Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍｃａｐ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２の補遺の表１および補遺の表２に開示されるＴＥＥ配列の５～３０ヌクレオチド断片、５～２５ヌクレオチド断片、５～２０ヌクレオチド断片、５～１５ヌクレオチド断片、または５～１０ヌクレオチド断片（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの断片）から選択されるＴＥＥを含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／００９３０４９、およびＷＯ２００１／０５５３７１のいずれかに記載されている転写制御エレメントであるＴＥＥを含み、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。転写制御エレメントは、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／００９３０４９、およびＷＯ２００１／０５５３７１に記載されている方法などであるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の方法によって特定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含む５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、モノシストロニック配列、例えば、限定されないが、ベクター系または核酸ベクターに組み込まれ得る。非限定的な例として、ベクター系および核酸ベクターとして、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２００９／００９３０４９、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、およびＷＯ２００１／０５５３７１に記載されるものが挙げられ得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、本明細書に記載のＴＥＥまたはその部分を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ中のＴＥＥは、５’ＵＴＲに位置するＴＥＥと同じであってもよいし、異なっていてもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０より多くのＴＥＥ配列を含み得る。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、１～６０、１～５５、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つのＴＥＥ配列を含み得る。本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおける異なるＴＥＥ配列の組合せには、異なるＴＥＥ配列のうちのいずれかの１より多くのコピーが組み込まれた組合せが含まれ得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、３回、もしくは３回を上回って反復されるこれらのバリアントなどのパターンであり得る。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なるＴＥＥヌクレオチド配列を表す。
一部の実施形態では、ＴＥＥは、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ２０１２／００９６４４に記載される方法によって特定することができ、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するためのスペーサーを含む。非限定的な例としては、スペーサーは、１５ヌクレオチドのスペーサーおよび／または当技術分野において公知のその他のスペーサーであり得る。他の非限定な例として、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲにおいて、それぞれ、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、または１０回より多く反復されるＴＥＥ配列－スペーサーモジュールを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回反復されるＴＥＥ配列－スペーサーモジュールを含む。
一部の実施形態では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、本開示のポリヌクレオチドの翻訳を制御することができる、当技術分野において公知の他の配列、例えば、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用されるそれぞれのスペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲおよび／またはＴＥＥ配列を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドへのｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組込みにより、ステムループ領域の形状を変化させることができ、これにより、翻訳を増大および／または減少させることができる。例えば、Ｋｅｄｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、１２巻（１０号）、１０１４～２０頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１４．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
センサー配列としては、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列および／もしくはモチーフ、内因性核酸結合分子の擬受容体として作用するように操作された人工的結合部位、ならびにこれらの組合せが挙げられる。センサー配列の非限定的な例は、米国公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、センサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、センサー配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位である。
ｍｉＲＮＡは、１９～２５ヌクレオチドの長さの非コーディングＲＮＡであり、ポリヌクレオチドに結合し、遺伝子発現を、安定性を低減させることまたはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することのいずれかによって、下方制御する。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域内の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８または２～７位を含み得る。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ １位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接している。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ １位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ， Ｆａｒｈ ＫＫ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ， Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ， Ｌｉｍ ＬＰ， Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ； Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．、２００７年７月６日、２７巻（１号）、９１～１０５頁を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを行って、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存在または不在を判定することができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含む。そのような配列は、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されているものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用されるとき、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用または会合または結合するのに十分な、ｍｉＲＮＡのすべてまたは領域に対する相補性を有する、ポリヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内、または５’ＵＴＲおよび／もしくは３’ＵＴＲを含めたＲＮＡ転写産物内の配列を指す。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ｍｉＲＮＡに媒介されるポリヌクレオチドの制御、例えば、ｍｉＲＮＡに媒介されるポリヌクレオチドの転写抑制または分解を促進するのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ｍｉＲＮＡに媒介されるポリヌクレオチドの分解、例えば、ｍｉＲＮＡに先導されるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に媒介されるｍＲＮＡの切断を促進するのに十分な程度の相補性を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、１９～２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分にのみ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、または４ヌクレオチド未満の一部分にのみ、相補的であってもよい。所望される制御が、ｍＲＮＡ分解である場合には、十分または完全な相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの長さのすべてまたは有意な部分にわたる、十分な相補性または完全な相補性）が、好ましい。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有するが、１つ、２つ、または３つのヌクレオチド置換、末端付加、および／または短縮を除く。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方において、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方において、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つもしくは複数を組み込むｍＲＮＡを分解すること、またはｍＲＮＡの翻訳を予防することが可能である。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含有する活性なＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位がＲＩＳＣ内の対応するｍｉＲＮＡに結合することにより、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡが分解されるか、またはｍＲＮＡが翻訳されるのが予防される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡとは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のミスマッチを有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、それぞれ、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドに対して相補的な、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドを有する。
本開示のポリヌクレオチドに１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を操作することにより、ポリヌクレオチドは、分解の標的となるか翻訳が低減され得るが、ただし、問題のｍｉＲＮＡが利用可能であることを条件とする。これにより、ポリヌクレオチドを送達したときの標的外作用が低減され得る。例えば、本開示のポリヌクレオチドが、組織または細胞に送達することを意図していなかったにもかかわらずそこに到達してしまった場合でも、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位をポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに操作しておけば、組織または細胞において豊富なｍｉＲＮＡにより、目的の遺伝子の発現を阻害することが可能である。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を増大させるために、それらが天然に存在しているポリヌクレオチド配列から除去してもよい。例えば、特定のｍｉＲＮＡの結合部位を、ポリヌクレオチドから除去して、そのｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善することができる。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、正常細胞および／またはがん性細胞などであるがこれらに限定されない特定の細胞に指向するために、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、正常細胞および／またはがん性細胞などであるがこれらに限定されない特定の細胞に指向するために、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲに、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多いｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
複数の組織における発現の制御は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去を通じて達成することができる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかまたは挿入するかの決定は、疾患におけるｍｉＲＮＡ発現パターンおよび／またはそれらのプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターンおよび生物学における役割の特定が、報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、２０１０年、１１巻、９４３～９４９頁；ＡｎａｎｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１１年、１８巻、１７１～１７６頁；ＣｏｎｔｒｅｒａｓおよびＲａｏ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０１２年、２６巻、４０４～４１３頁（２０１１年１２月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ、２００９年、１３６巻、２１５～２３３頁；Ｌａｎｄｇｒａｆら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１２９巻、１４０１～１４１４頁；ＧｅｎｔｎｅｒおよびＮａｌｄｉｎｉ、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．、２０１２年、８０巻、３９３～４０３頁およびその中のすべての参考文献；これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、および同第２００５／００５９００５号に記載されている非限定的な例を含め、任意の公知の配列に対応し得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｍｉＲＮＡが、ｍＲＮＡを制御し、それによってタンパク質の発現を制御することが公知である組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、ミエロイド細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられるがこれらに限定されない。
一部のマイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１２２は、正常組織において豊富であるが、がんまたは腫瘍組織においてははるかに低いレベルで存在する。したがって、マイクロＲＮＡ標的配列（すなわち、マイクロＲＮＡ結合部位）を、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、３’ＵＴＲなどの領域または他の領域）に操作することにより、正常組織（マイクロＲＮＡが豊富である）における分解または翻訳の低減のために有効に分子を標的とし、同時に、がんまたは腫瘍組織（マイクロＲＮＡがはるかに低いレベルで存在する）における高いレベルの翻訳を提供することができる。これにより、本開示の方法および組成物に、腫瘍標的化アプローチが提供される。
本開示に有用であり得るｍｉＲＮＡ結合部位のさらなる例として、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが挙げられ、これには、これらに限定されないが、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ，ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ，ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ，、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、およびｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられる。さらに、新規のｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびマイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）分析（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０、１１６：ｅ１１８－ｅ１２７；Ｖａｚ Ｃら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１０、１１，２８８、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）によって免疫細胞において特定することができる。
肝臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１２２８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２８－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９、ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｍｉＲ－１３０３、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－５５７、ｍｉＲ－５８１、ｍｉＲ－９３９－３ｐ、およびｍｉＲ－９３９－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
肺において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３４、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３２－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３８１－３ｐ、およびｍｉＲ－３８１－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて肺におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
心臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１８６－３ｐ、ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７４４－３ｐ、ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、およびｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて心臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
神経系において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１２４－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ，ｍｉＲ－１２７１－３ｐ、ｍｉＲ－１２７１－５ｐ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－３ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ａ、ｍｉＲ－１９０ｂ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ，ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－３６６５、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｍｉＲ－４５４－５ｐ、ｍｉＲ－４８３、ｍｉＲ－５１０、ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９２２、ｍｉＲ－９－３ｐ、およびｍｉＲ－９－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。神経系において富化されるｍｉＲＮＡとして、これらに限定されないが、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－３２０ｂ、ｍｉＲ－３２０ｅ、ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３２５、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－３２８、ｍｉＲ－９２２を含むニューロンにおいて特異的に発現されるもの、ならびにこれらに限定されないが、ｍｉＲ－１２５０、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｍｉＲ－３０６５－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－５ｐ、およびｍｉＲ－６５７を含むグリア細胞において特異的に発現されるものがさらに上げられる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて神経系におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
膵臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｍｉＲ－１０５－５ｐ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、およびｍｉＲ－９４４が挙げられるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
腎臓において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ、ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、およびｍｉＲ－５６２が挙げられるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
筋肉において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２８６、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４５－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、およびｍｉＲ－２５－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて筋肉におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
ｍｉＲＮＡは、また、異なる種類の細胞、例えば、これらに限定されないが、内皮細胞、上皮細胞、および脂肪細胞において、差示的に発現される。
内皮細胞において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２３６－３ｐ、ｍｉＲ－１２３６－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－４２４－３ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、およびｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。多数の新規なｍｉＲＮＡが、ディープシークエンシング分析から内皮細胞において発見されている（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃら、ＲＮＡ、２０１２、１８、４７２－４８４、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて内皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
上皮細胞において発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとして、呼吸線毛上皮細胞において特異的なｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－８０２およびｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４４９ａ、ｍｉＲ－４４９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４４９ｂ－５ｐ、肺上皮細胞において特異的なｌｅｔ－７ファミリー、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１２６、腎臓上皮細胞において特異的なｍｉＲ－３８２－３ｐ、ｍｉＲ－３８２－５ｐ、および角膜上皮細胞において特異的なｍｉＲ－７６２が挙げられるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて上皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
加えて、広範なｍｉＲＮＡ群が、胚性幹細胞において豊富であり、幹細胞の自己再生ならびに神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞、および筋肉細胞などの様々な細胞系統の発生および／または分化を調節している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴら、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２０１３、１３（５）、７５７－７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡおよびＶｅｎｔｕｒａ Ａ、Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２、２２（５－６）、４２８－４３６；Ｇｏｆｆ ＬＡら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００９、４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ ＲＤら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８、６１０－６２１；Ｙｏｏ ＪＫら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２、２１（１１）、２０４９－２０５７、これらのそれぞれは、その全体が参考として本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞において豊富なｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ７ｄ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１３８－１－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－３ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｅ、ｍｉＲ－３６７－３ｐ、ｍｉＲ－３６７－５ｐ、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｅ、ｍｉＲ－５４８ｆ、ｍｉＲ－５４８ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｋ、ｍｉＲ－５４８ｌ、ｍｉＲ－５４８ｍ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５４８ｏ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７６６－３ｐ、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ，ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４１，ｍｉＲ－９６－３ｐ、ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐおよびｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。多くの予測される新規なｍｉＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞においてディープシークエンシングによって発見されている（例えば、Ｍｏｒｉｎ ＲＤら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８、６１０－６２１；Ｇｏｆｆ ＬＡら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００９、４：ｅ７１９２；Ｂａｒ Ｍら、Ｓｔｅｍ細胞、２００８、２６、２４９６－２５０５、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）。
一実施形態では、胚性幹細胞の発生および／もしくは分化を調節するため、変性状態（例えば、変性疾患）における幹細胞の老化を阻害するため、または疾患状態における幹細胞（例えば、がん幹細胞）の老化およびアポトーシスを刺激するために、胚性幹細胞に特異的なｍｉＲＮＡの結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれてもよく、またはそこから除去されてもよい。
多くのｍｉＲＮＡ発現に関する研究は、様々ながん細胞／組織および他の疾患におけるｍｉＲＮＡの差次的発現をプロファイリングするために行われている。一部のｍｉＲＮＡは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、その他のものは、過少発現される。例えば、ｍｉＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓がんおよび疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息および炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺がん（ＵＳ２０１３／００５３２６４号）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺がん細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸がん細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；がん陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；上咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺がん（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣がん細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４号、同第ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において、差次的に発現される。
非限定的な例として、ある特定のがんおよび／または腫瘍細胞において過剰発現されるｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去され、がん細胞において過剰発現されるｍｉＲＮＡによって抑制されていた発現を回復させ、それによって、対応する生物学的機能、例えば、転写の刺激および／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス、ならびに細胞死を緩和することができる。ｍｉＲＮＡの発現が上方制御されていない正常な細胞および組織は、影響を受けない。
ｍｉＲＮＡはまた、血管新生など、複雑な生物学的プロセスを制御し得る（例えば、ｍｉＲ－１３２）（ＡｎａｎｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１１年、１８巻、１７１～１７６頁）。本開示のポリヌクレオチドでは、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位は、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的プロセスに合わせてポリヌクレオチドの発現を調整するために、除去または導入され得る。この文脈において、本開示のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）に対して完全に相補的であり、それによって、ｍｉＲＮＡ結合部位に融合したｍＲＮＡを分解する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡに対して完全に相補的ではない。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）と同じ長さである。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、またはその両方において、対応するマイクロＲＮＡ（例えば、２２ヌクレオチドを有するｍｉＲ－１２２）よりも１ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より２ヌクレオチド短い。なお他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より３ヌクレオチド短い。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より４ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より５ヌクレオチド短い。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端、３’末端、または両方において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より６ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より７ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より８ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より９ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より１０ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より１１ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、５’末端または３’末端において対応するマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）より１２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つもしくは複数を組み込むｍＲＮＡを分解すること、またはｍＲＮＡの翻訳を予防することが可能である。
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）を含むＲＩＳＣ複合体が、マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）に対する十分な相補性を有する。他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）を含むＲＩＳＣ複合体が、マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）を含むＲＩＳＣ複合体が、マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）から１個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから２個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから３個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから４個のミスマッチを有する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから５個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから６個のミスマッチを有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから７個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから８個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから９個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１０個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１１個のミスマッチを有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１２個のミスマッチを有する。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）の少なくとも約１０の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１０の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１１の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１１の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１２の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１２の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１３の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１３の連続したヌクレオチド、または対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１４の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１４の連続したヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１５の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１６の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１６の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１７の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１７の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１８の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１８の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１９の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９の連続したヌクレオチド、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約２０の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約２０の連続したヌクレオチド、または対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約２１の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約２１の連続したヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチド、ならびに少なくとも１のｍｉＲ－１２２結合部位、少なくとも２のｍｉＲ－１２２結合部位、少なくとも３のｍｉＲ－１２２結合部位、少なくとも４のｍｉＲ－１２２結合部位、または少なくとも５のｍｉＲ－１２２結合部位をコードするｍＲＮＡを含む。一態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２に結合するか、またはｍｉＲ－１２２に相補的である。別の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐに結合する。特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号５２または５４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ－１２２に結合する。特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号５２または５４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ここで、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２に結合する。別の特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号５４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、ここで、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２に結合する。これらの配列を、以下の表７に示す。
Figure 0007246930000098
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位）は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、３’ＵＴＲ）において、本開示のポリヌクレオチドに挿入される。ポリヌクレオチドにおける挿入部位は、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）の不在下において、機能的ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、ポリヌクレオチドのいずれの場所であってもよく、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１２２）の存在下においては、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入およびｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ポリヌクレオチドを分解することまたはポリヌクレオチドの翻訳を予防することが可能である。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに挿入される。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａ融合とのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド内の下流に挿入される。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチド、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド内の下流に挿入される。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチド、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本明細書に開示されるＩＬ１２ポリペプチドをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本明細書に開示される膜ドメインをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本明細書に開示される異種ポリペプチドをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ）において、本開示のポリヌクレオチドに挿入される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチドにおける挿入部位は、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの不在下において、機能的ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、ポリヌクレオチドのいずれの場所であってもよく、ｍｉＲＮＡの存在下においては、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入およびｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ポリヌクレオチドを分解することまたはポリヌクレオチドの翻訳を予防することが可能である。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド内の下流に挿入される。
ｍｉＲＮＡ遺伝子制御は、周囲配列の種、配列の種類（例えば、異種、相同、外因性、内因性、もしくは人工的）、周囲配列における制御エレメント、ならびに／または周囲配列における構造エレメントなどであるがこれらに限定されない、ｍｉＲＮＡの周囲の配列によって、影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲによって影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列型のヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の制御効果を増大させ得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の制御エレメントおよび／または構造エレメントは、ｍｉＲＮＡに媒介される遺伝子制御に影響を及ぼし得る。制御エレメントおよび／または構造エレメントの１つの例は、５’ＵＴＲにおける構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）であり、これは、タンパク質の翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。ＥＩＦ４Ａ２が、５’－ＵＴＲにおけるこの二次構造化エレメントに結合することが、ｍｉＲＮＡに媒介される遺伝子発現には必要である（Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３４０巻、８２～８５頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本開示のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに媒介される遺伝子制御を増強するために、構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。この文脈において、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれよりも多いｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作されてもよい。例えば、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２、または１のｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作されてもよい。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じであってもよく、または異なるｍｉＲＮＡ部位であってもよい。本開示のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組合せには、異なるｍｉＲＮＡ部位のうちのいずれかの１つより多くのコピーが組み込まれる組合せが含まれ得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内で同じ組織を標的としてもよく、または異なる組織を標的としてもよい。非限定的な例として、組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的なｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲに導入することを通じて、特定の細胞型（例えば、肝細胞、ミエロイド細胞、内皮細胞、がん細胞など）における発現の程度を低減させることができる。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのほぼ中間、ならびに／または３’ＵＴＲの３’末端付近に、操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのほぼ中間に、操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端とのほぼ中間に、操作され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近および３’ＵＴＲの３’末端付近に、操作され得る。
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、および／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補的であり得る。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、対象の異なる組織または異なる細胞型において発現される１つより多くのｍｉＲＮＡ部位を含むように操作され得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、対象の肝臓および腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御するために、ｍｉＲ－１９２およびｍｉＲ－１２２を含むように操作され得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、同じ組織に対する１つより多くのｍｉＲＮＡ部位を含むように操作されてもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと関連する治療域および／または差次的発現を、ｍｉＲＮＡ結合部位により変化させることができる。例えば、死のシグナルを提供するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、がん細胞のｍｉＲＮＡシグネチャーによって、がん細胞においてより高度に発現するように設計することができる。がん細胞が、特定のｍｉＲＮＡをより低いレベルで発現する場合には、そのｍｉＲＮＡ（または複数のｍｉＲＮＡ）の結合部位をコードするポリヌクレオチドを、より高度に発現させることになる。したがって、死のシグナルを提供するポリペプチドは、がん細胞において、細胞死を誘発または誘導する。同じｍｉＲＮＡをより高度な発現で保有する近傍の非がん細胞は、コードされる死のシグナルによって受ける影響は低いであろうが、これは、ポリヌクレオチドが、３’ＵＴＲにおいてコードされる結合部位または「センサー」へのｍｉＲＮＡの結合の作用に起因して、より低いレベルで発現されるためである。逆に、細胞生存または細胞保護のシグナルを、がんを含有する組織および非がん性細胞に送達することもでき、その場合、ｍｉＲＮＡは、がん細胞においてより高い発現を有し、その結果、がん細胞に対しては生存シグナルがより低くなり、正常な細胞に対しては生存シグナルがより高くなる。本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ結合部位の使用に基づいて、異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドを設計し、投与することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、投与のためにポリヌクレオチドを製剤化することによって、調節することができる。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込み、ポリヌクレオチドを、本明細書に記載される脂質のうちのいずれかを含め、カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化することによって、組織または細胞を標的とすることができる。
本開示のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件における発現をより標的化するように操作することができる。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を通じて、本開示のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞において、または生物学的条件の文脈で、タンパク質発現が最適となるように設計することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡシード配列に１００％よりも低い同一性を有するかのいずれかである、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計することができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＮＲＡ結合部位を組み込むように設計され得る。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を減少させ、したがってポリヌクレオチドの下方調節の低減をもたらすように、部分的に変異していてもよい。本質的には、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度は、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するためのレオスタットとして作用し得る。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異もまた、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響を及ぼし得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループに組み込まれ得る。
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列は、ステムループのループに組み込まれ得、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループの５’または３’ステムに組み込まれ得る。
一実施形態では、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）は、ステムループのステムの５’末端に組み込まれ得、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得る。別の実施形態では、ＴＥＥは、ステムループのステムの５’末端に組み込まれ得、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムの３’末端またはステムループの後の配列に組み込まれ得る。ｍｉＲＮＡシードおよびｍｉＲＮＡ結合部位は、同じおよび／または異なるｍｉＲＮＡ配列に対するものであり得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列および／またはＴＥＥ配列の組込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これにより、翻訳が増大および／または減少し得る。（例えば、Ｋｅｄｄｅら、「Ａ Ｐｕｍｉｌｉｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｐ２７－３’ＵＴＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｉＲ－２２１ ａｎｄ ｍｉＲ－２２ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．」Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．、２０１０年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’－ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、１９もしくは２２ヌクレオチド配列および／またはシードなしのｍｉＲＮＡ配列であり得るが、これらに限定されない。
一実施形態では、５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を使用して、本明細書に記載される本開示のポリヌクレオチドを安定させることができる。
別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を使用して、翻訳開始の部位、例えば、限定されないが、開始コドンのアクセス性を減少させることができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｔｓｕｄａら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．、２０１０年、１１巻（５号）：ｅ１５０５７頁を参照されたく、これは、第１の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセス性を減少させるために、開始コドンの周辺（ＡＵＧコドンのＡを＋１として、－４から＋３７）にアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドおよびエクソン－ジャンクション複合体（ＥＪＣ）を使用していた。Ｍａｔｓｕｄａは、ＬＮＡまたはＥＪＣを用いて開始コドンの周辺の配列を変化させることによって、ポリヌクレオチドの効率、長さ、および構造安定性が影響を受けることを示した。本開示のポリヌクレオチドは、翻訳開始の部位へのアクセス性を減少させるために、翻訳開始の部位の付近に、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されているＬＮＡまたはＥＪＣ配列ではなく、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始の部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後、またはその内部であってもよい。非限定的な例として、翻訳開始の部位は、シード配列または結合部位などのｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始の部位は、例えば、シード配列またはｍｉｒ－１２２結合部位などのｍｉＲ－１２２配列内に位置してもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞におけるコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、肝臓における目的のコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲ－１２２結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐシード配列、シードを有さないｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐシード配列、シードを有さないｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４６結合部位、ｍｉＲ－１４６シード配列、および／またはシード配列を有さないｍｉＲ－１４６結合部位を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、免疫細胞においてｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解して、治療薬送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制するために、３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドを、抗原提示細胞においてより不安定になるようにすることができる。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ－１２２－５ｐまたはｍｉｒ－１２２－３ｐが挙げられる。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列、ならびに本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列における１種類の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％が、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列におけるウラシルの少なくとも９５％が、５－メトキシウリジンである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～１４７のうちのいずれか、または化合物１～２３２のうちのいずれかとともに製剤化される。
１５．３’ＵＴＲおよびＡＵリッチエレメント
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、本開示のＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。
３’－ＵＴＲは、翻訳終止コドンのすぐ後にあり、転写後に遺伝子発現に影響を及ぼす制御性領域を含有することが多い、ｍＲＮＡの区画である。３’－ＵＴＲ内の制御性領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、転写効率、局在化、および安定性に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本開示に有用な３’－ＵＴＲは、制御性タンパク質またはマイクロＲＮＡの結合部位を含む。一部の実施形態では、３’－ＵＴＲは、サイレンサー領域を有し、この領域は、リプレッサータンパク質に結合し、ｍＲＮＡの発現を阻害する。他の実施形態では、３’－ＵＴＲは、ＡＵリッチエレメントを含む。タンパク質は、ＡＲＥに結合して、局在化様式で転写産物の安定性もしくは崩壊速度に影響を及ぼすか、または翻訳開始に影響を及ぼす。他の実施形態では、３’－ＵＴＲは、ポリ（Ａ）尾部と呼ばれる数百のアデニン残基のｍＲＮＡ転写産物の末端への付加を誘導する、配列ＡＡＵＡＡＡを含む。
天然または野生型の３’ＵＴＲは、そこに埋め込まれたアデノシンおよびウリジンのストレッチを有することが公知である。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い代謝回転率を有する遺伝子において、特に顕著である。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分類することができる（Ｃｈｅｎら、１９９５年）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの複数の分散されたコピーを含有する。Ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２つまたはそれよりも多い重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。この種類のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまりはっきりと定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎおよびミオゲニンが、このクラスの２つの十分に研究されている例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを脱安定化することが公知であるが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、最も注目すべきことにはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増大させることが実証されている。ＨｕＲは、３つすべてのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を、核酸分子の３’ＵＴＲに操作することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＨｕＲの結合、したがってメッセージの安定化につながるであろう。
３’ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示のポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチドを操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入して、本開示のポリヌクレオチドの安定性を低くし、それによって、結果として得られるタンパク質の翻訳を削減し、産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを特定し、除去または変異させて、細胞内の安定性を増大させ、それによって、結果として得られるタンパク質の翻訳および産生を増大させることができる。トランスフェクション実験を、関連する細胞株において行うことができ、本開示のポリヌクレオチドを使用して、タンパク質産生を、トランスフェクション後の様々な時点においてアッセイすることができる。例えば、細胞に、異なるＡＲＥ操作分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを関連するタンパク質に使用することによって、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、および７日後に、産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、本出願において示されているものから選択される３’ＵＴＲを含む。
ある特定の実施形態では、本開示に有用な３’ＵＴＲ配列は、本明細書に列挙される３’ＵＴＲ配列およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なヌクレオチド配列を含む。
１６．５’キャップを有する領域
本開示はまた、５’キャップならびに本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
天然のｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合するが、このＣＢＰは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合により成熟な環状ｍＲＮＡ種を形成することを通じて、細胞におけるｍＲＮＡの安定性および翻訳の適合性を担う。キャップは、さらに、ｍＲＮＡスプライシングの間、５’近位のイントロンの除去を補助する。
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端がキャッピングされ、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間で５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生成し得る。この５’－グアニル酸キャップは、次に、メチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成してもよい。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または末端前の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で、２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を通じた５’キャップ除去は、分解のために、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を標的としてもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ除去を予防し、したがって、ｍＲＮＡ半減期を増大させる、非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造の加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾されたヌクレオチドを、このキャッピング反応の際に使用してもよい。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手したワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の指示に従ってα－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに使用して、５’－ｐｐｐ－５’キャップにホスホロチオエート結合を作製してもよい。α－メチル－ホスホネートおよびセレノ－ホスフェートヌクレオチドなど、追加の修飾されたグアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
追加の修飾としては、糖環の２’－ヒドロキシル基におけるポリヌクレオチドの５’末端および／または５’末端前のヌクレオチドのリボース糖の２’－Ｏ－メチル化（上述）が挙げられるが、これに限定されない。複数の異なる５’キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子としての機能を果たすポリヌクレオチドなどの核酸分子の５’キャップを生成してもよい。本明細書において、合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称される、キャップ類似体は、キャップ機能は保持しているが、それらの化学構造が、天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）または酵素的に合成され得る、および／または本開示のポリヌクレオチドに連結され得る。
例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結された２つのグアニンを含有し、ここで、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基ならびに３’－Ｏ－メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ、これは、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも表記することができる））。他方の未修飾のグアニンの３’－Ｏ原子は、キャッピングされたポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドに連結されるようになる。Ｎ７－および３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャッピングされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡに類似であるが、グアノシンに２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
一部の実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、異なるリン酸位置において、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾されてもよく、例えば、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体があり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体であり、当技術分野において公知および／または本明細書に記載されるキャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。キャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１３年、２１巻、４５７０～４５７４頁に記載されている様々なキャップ類似体およびキャップ類似体を合成する方法を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本開示のキャップ類似体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体は、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時のキャッピングを可能にするが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応においては、転写産物の最大２０％が、キャッピングされないまま残り得る。これは、キャップ類似体と内因性の細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’キャップ構造との構造上の相違と同様に、翻訳の適合性の低減および細胞安定性の低減をもたらし得る。
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はまた、より真正な５’キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、製造後に（ＩＶＴまたは化学合成に関係なく）キャッピングすることもできる。本明細書において使用されるとき、「より真正な」という語句は、構造的または機能的に、内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣した特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、従来技術の合成の特徴もしくは類似体などと比較して、内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な細胞機能および／もしくは構造をより良好に表しているか、または１つもしくは複数の点に関して、対応する内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な特徴よりも性能が優れている。本開示のより真正な５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野において公知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理学的な５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の増大、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性の低減、および／または５’キャップ除去の低減を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間にカノニカル５’－５’－三リン酸結合を作製することができ、ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含有する。そのような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野において公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳の適合性および細胞の安定性、ならびに細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低減をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
非限定的な例として、キメラポリヌクレオチドを製造後にキャッピングすることが、より効率的であり得るが、これは、キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％を、キャッピングすることができるためである。これは、キャップ類似体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の過程で、キメラポリヌクレオチドに連結させた場合の約８０％とは対照的である。
本開示によると、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本開示によると、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、５’末端キャップ構造は、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体である。
１７．ポリ－Ａ尾部
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリ－Ａ尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリ－Ａ尾部の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリ－Ａ尾部は、デス－３’ヒドロキシル尾部を含む。
ＲＮＡプロセシングの間に、長いアデニンヌクレオチドの鎖（ポリ－Ａ尾部）が、安定性を増大させるために、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子に付加され得る。転写の直後に、転写産物の３’末端が切断されて、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次いで、ポリ－Ａポリメラーゼが、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と称されるこのプロセスにより、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基の長さを含め、およそ８０～およそ２５０残基の長さであり得る、ポリ－Ａ尾部が付加される。
ポリＡ尾部はまた、構築物が核外に輸送された後に付加されてもよい。
本開示によると、ポリＡ尾部の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。本開示のポリヌクレオチドは、デス－３’ヒドロキシル尾部を含み得る。これらはまた、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉらによって教示される構造的部分または２’－Ｏメチル修飾を含み得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５巻、１５０１～１５０７頁、２００５年８月２３日、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む、代替的なポリＡ尾部構造を有する転写産物をコードするように設計されてもよい。Ｎｏｒｂｕｒｙによると、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡにおいて検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害後の可能性として毒性であるヒストン蓄積の予防に重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）尾部の欠如によって区別され、その機能は、安定したステム－ループ構造およびその同族ステム－ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が代わりに担う；後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡのＰＡＢＰのものと同じ機能を行う」（Ｎｏｒｂｕｒｙ、「Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ： ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ； ＡＯＰ、２０１３年８月２９日オンライン刊行、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ユニークなポリＡ尾部の長さは、本開示のポリヌクレオチドにある特定の利点を提供する。一般に、ポリＡ尾部の長さは、存在する場合、３０ヌクレオチド長より長い。他の実施形態では、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくともまたは約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００ヌクレオチドより長い）。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、および２，５００～３，０００）を含む。
一部の実施形態では、ポリ－Ａ尾部は、全体的なポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して、設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づき得るか、またはポリヌクレオチドから発現される最終的な産物の長さに基づき得る。
この文脈において、ポリ－Ａ尾部は、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くてもよい。ポリ－Ａ尾部はまた、それが属するポリヌクレオチドの画分として設計してもよい。この文脈において、ポリ－Ａ尾部は、構築物の全長、構築物の領域、または構築物の全長からポリ－Ａ尾部を差し引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％、またはそれよりも長くてもよい。さらに、ポリ－Ａ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドの結合部位の操作およびコンジュゲーションにより、発現を増強してもよい。
加えて、ポリ－Ａ尾部の３’末端において修飾されたヌクレオチドを使用して、複数の異なるポリヌクレオチドを、ＰＡＢＰ（ポリ－Ａ結合タンパク質）を介して３’末端を通じて一緒に連結してもよい。トランスフェクション実験を、関連する細胞株において行うことができ、タンパク質産生を、ＥＬＩＳＡによって、トランスフェクションの１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、および７日後にアッセイすることができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇカルテットは、４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成することができる。この実施形態では、Ｇカルテットは、ポリ－Ａ尾部の末端に組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドを、様々な時点において、安定性、タンパク質産生、および半減期を含む他のパラメーターについてアッセイする。ポリＡ－Ｇカルテットが、１２０ヌクレオチドのポリ－Ａ尾部を単独で使用した場合に確認されるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当する、ｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが見出されている。
１８．開始コドン領域
本開示はまた、開始コドン領域ならびに本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似であるか、または同様の機能を果たす領域を有し得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどであるがこれらに限定されない代替的な開始コドンで開始され得る（Ｔｏｕｒｉｏｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、９５巻、（２００３年）、１６９～１７８頁およびＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１０年、５巻、１１頁を参照されたく、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンＡＣＧで開始される。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧで開始される。さらに別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧで開始される。
翻訳を開始するコドン、例えば、限定されないが、開始コドンまたは代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、および／または構造に影響を及ぼすことが公知である。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１０年、５巻、１１頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかのマスキングを使用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ、および／または構造を変化させることができる。
一部の実施形態では、マスキングされた開始コドンまたは代替的な開始コドンにおける翻訳開始の確率を低減するようにコドンをマスキングまたは遮蔽するために、マスキング剤が、開始コドンまたは代替的な開始コドンの付近で使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチドおよびエクソン－ジャンクション複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチドおよびＥＪＣについて記載しているＭａｔｓｕｄａおよびＭａｕｒｏ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１０年、５巻、１１号）を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態では、翻訳が、代替的な開始コドンで開始される可能性を増大させるために、マスキング剤を使用して、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングすることができる。一部の実施形態では、翻訳が、マスキングした開始コドンまたは代替的な開始コドンの下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで開始される機会を増大させるために、マスキング剤を使用して、第１の開始コドンまたは代替的な開始コドンをマスキングしてもよい。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲ結合部位の完璧な相補体内に位置し得る。ｍｉＲ結合部位の完璧な相補体は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ、および／または構造の調節を補助し得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完璧な相補体の中央に位置し得る。開始コドンまたは代替的な開始コドンは、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第６のヌクレオチド、第７のヌクレオチド、第８のヌクレオチド、第９のヌクレオチド、第１０のヌクレオチド、第１１のヌクレオチド、第１２のヌクレオチド、第１３のヌクレオチド、第１４のヌクレオチド、第１５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド、第１７のヌクレオチド、第１８のヌクレオチド、第１９のヌクレオチド、第２０のヌクレオチド、または第２１のヌクレオチドの後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳を、開始コドンではないコドンで開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンは、ポリヌクレオチド配列から除去され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの次のコドンまたは下流の開始コドンもしくは代替的な開始コドンで開始され得る。非限定的な実施例では、翻訳を、下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで開始させるために、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧが、ポリヌクレオチド配列の最初の３つのヌクレオチドとして、除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、および／またはポリヌクレオチドの構造を調節するためまたはその調節を試みるために、下流の開始コドンおよび／または代替的な開始コドンのための少なくとも１つのマスキング剤を、さらに含んでもよい。
１９．終止コドン領域
本開示はまた、終止コドン領域ならびに本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に、少なくとも２の終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＤＮＡの場合にはＴＧＡ、ＴＡＡ、およびＴＡＧから、またはＲＮＡの場合にはＵＧＡ、ＵＡＡ、およびＵＡＧから選択され得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合の終止コドンＴＧＡまたはＲＮＡの場合の終止コドンＵＧＡ、および１の追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、３の連続した終止コドン、４の終止コドン、またはそれよりも多い終止コドンを含む。
２０．挿入および置換
本開示はまた、挿入および／または置換をさらに含む、本開示のポリヌクレオチドも含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域および／またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８ヌクレオチドを含み得るがこれらに限定されず、ヌクレオチドは、天然および／または非天然であり得る。非限定的な例として、ヌクレオチドの群は、５～８のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、および／またはそれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれか、および／またはそれらの組合せなどであるがこれらに限定されない、２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。例えば、５’ＵＴＲは、５～８のアデニン塩基を挿入し、続いて、５～８のシトシン塩基を挿入することによって、置き換えることができる。別の例では、５’ＵＴＲは、５～８のシトシン塩基を挿入し、続いて、５～８のアデニン塩基を挿入することによって、置き換えることができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に、少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位のすぐ下流の領域において（例えば、＋１から＋６であるがこれらに限定されない）少なくとも１つの核酸を置換することによって、転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流におけるヌクレオチドの領域に対する変更は、開始速度に影響を及ぼし得、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数値を増大させ得、初期転写を硬化する転写複合体からの短い転写産物の解離を増大させ得る（Ｂｒｉｅｂａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２年）４１巻、５１４４～５１４９頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換、および／または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３のグアニン塩基の置換を含み得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例としては、その領域のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のアデニンヌクレオチドによって置換され得る（配列番号２３３）。別の非限定的な例では、その領域のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のシトシン塩基によって置換され得る（配列番号２３４）。別の非限定的な例では、その領域のヌクレオチドが、ＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のチミンおよび／または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る（配列番号２３５）。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流に、少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。明確さの目的で、当業者であれば、開始コドンは、タンパク質コーディング領域の最初のコドンであり、一方で、転写開始部位は、転写が開始される部位であることを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの置換および／または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流にある１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの位置で、挿入または置換され得る。挿入および／または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、すべてのＡもしくはすべてのＣもしくはすべてのＴもしくはすべてのＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴ、もしくはＣおよびＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、およびＴ、もしくはＡ、Ｃ、およびＴ）、または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドにおけるコード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチドにおけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流かつ開始コドンの前の領域に、１つのグアニン塩基が残るように設計され得る（Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０１１年）、４７２巻（７３４４号）、４９９～５０３頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、少なくとも５のヌクレオチドが、転写開始部位の下流であるが、開始コドンの上流である１つの位置に挿入され得、この少なくとも５のヌクレオチドは、同じ塩基の種類であり得る。
２１．ＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端に、
（ｉ）上記に提供される５’キャップ、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば、上記に提供される配列、
（ｉｉｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示されるＩＬ１２をコードする配列最適化された核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば、上記に提供される配列、および
（ｖｉ）上記に提供されるポリ－Ａ尾部
を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ＩＬ１２（例えば、アイソフォーム１、２、３、または４）のタンパク質配列に、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
２２．ポリヌクレオチドを作製する方法
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド）またはその相補体を作製するための方法を提供する。
一部の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して、構築することができる。他の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して、化学合成によって構築することができる。
他の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用することによって、作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当技術分野において公知の任意の他の方法の１つまたは複数の組合せによって、作製される。他の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞である。
天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはこれらの組合せは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然に存在するヌクレオシドを完全または部分的に置き換えることができ、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。結果として得られるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、次いで、タンパク質を産生するおよび／または治療的転帰をもたらすそれらの能力について、試験してもよい。
ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／酵素的合成
本明細書に開示される本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）系を使用して、転写され得る。この系は、典型的に、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、天然および非天然の（修飾された）ＮＴＰを含め、本明細書に記載されるものから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、および変異体ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。米国公開第ＵＳ２０１３０２５９９２３号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを、本開示のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸の挿入または欠失によって修飾され得る。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾のＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’－修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の増大を呈するように修飾され得る（国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０号および米国特許第８，１０１，３８５号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化させること、ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸および／もしくは核酸配列を最適化させること、ならびに／または当技術分野において公知の他の方法を使用することによって、得ることができる。非限定的な例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔら（Ｎａｔｕｒｅ、４７２巻、４９９～５０３頁（２０１１年）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって設定された連続した指向型進化系を使用して、進化させることができ、ここで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、９３位のリシンとスレオニンとの置換（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆなどあるがこれらに限定されない、少なくとも１つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、米国公開第２０１００１２００２４号および同第２００７０１１７１１２号に記載されるように、少なくとも１つの変異をコードし得、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントとしては、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、欠失バリアント、および／または共有結合誘導体を挙げることができるが、これらに限定されない。
一態様では、ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントのＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。これを行う際、ポリヌクレオチドは、野生型または親キメラポリヌクレオチドに由来する配列変化の部位または領域を含有するように修飾され得る。
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素的方法によって行うことができる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖において、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。現在公知のＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較および結晶構造分析に基づいて、様々なファミリーに分類され得る。ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）またはＡポリメラーゼのファミリーは、Ｅ．ｃｏｌｉのクレノウ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７ ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼを含め、これらのファミリーの中でも、最も研究されている。別の大きなファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌ α）またはＢポリメラーゼファミリーであり、すべての真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼならびにファージＴ４およびＲＢ６９由来のポリメラーゼを含む。類似の触媒機構を用いるが、これらのポリメラーゼファミリーは、基質特異性、基質類似体組込み効率、プライマー伸長の程度および速度、ＤＮＡ合成の様式、エクソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感度が異なる。
ＤＮＡポリメラーゼはまた、反応温度、ｐＨ、ならびに鋳型およびプライマーの濃度など、それらが必要とする最適な反応条件に基づいて、選択される。しばしば、所望されるＤＮＡ断片のサイズおよび合成効率を達成するために、１つより多くのＤＮＡポリメラーゼの組合せが、用いられる。例えば、Ｃｈｅｎｇらは、ｐＨを増大させ、グリセロールおよびジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増大させ、クローニングされたインサートおよびヒトゲノムＤＮＡから長い標的を有効に増幅するために、３’から５’のエクソヌクレアーゼ活性を有する二次熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。（Ｃｈｅｎｇら、ＰＮＡＳ、９１巻、５６９５～５６９９頁（１９９４年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、およびＳＰ６に由来するＲＮＡポリメラーゼは、生物化学研究および生物物理学研究のためのＲＮＡを調製するために、広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、およびポリ－Ａポリメラーゼは、同時係属中の国際公開第ＷＯ２０１４０２８４２９号に開示されており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、本開示のポリヌクレオチドの合成において使用することができるＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼである。（Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、近年、Ｚｈｕらによって、海洋性シアノファージＳｙｎ５から特徴付けられ、ここでは、プロモーター配列も特定された（Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、より広い範囲の温度および塩分濃度において、ＲＮＡ合成を触媒したことを見出した。加えて、プロモーターにおける開始ヌクレオチドの要件が、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼでは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して低いストリンジェンシーであることが見出され、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成に有望となった。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非限定的な例として、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、正確な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成において使用することができる。
一態様では、Ｓｙｎ５プロモーターは、ポリヌクレオチドの合成において使用することができる。非限定的な例として、Ｓｙｎ５プロモーターは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年）によって記載されている５’－ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ－３’（配列番号４７）であり得る。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野において公知である、少なくとも１つの化学的修飾を含むポリヌクレオチドの合成において使用することができる（例えば、Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年に記載されているシュード－ＵＴＰおよび５Ｍｅ－ＣＴＰの組込みを参照されたい）。
一態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年）によって記載されている修正および改善された精製手順を使用して精製されたＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成することができる。
遺伝子操作における様々なツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づいている。目的の個々の遺伝子または特定の領域の配列の研究のため、ならびに他の研究上の必要性のために、ポリヌクレオチドまたは核酸の少量の試料から、標的遺伝子の複数のコピーを生成する必要がある。そのような方法は、本開示のポリヌクレオチドの製造において適用することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的遺伝子の高速増幅、ならびにゲノムマッピングおよびシーケンシングにおいて、広範な用途を有する。ＤＮＡの合成のための重要な構成要素は、鋳型としての標的ＤＮＡ分子、標的ＤＮＡ鎖の末端に相補的なプライマー、構成ブロックとしてのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲが、変性、アニーリング、および伸長のステップを進む際、新しく産生されたＤＮＡ分子は、次の複製サークルの鋳型として作用することができ、標的ＤＮＡの指数関数的増幅が達成される。ＰＣＲは、変性およびアニーリングのための加熱および冷却のサイクルを必要とする。基本的なＰＣＲの変化形としては、非対称ＰＣＲ（Ｉｎｎｉｓら、ＰＮＡＳ、８５巻、９４３６～９４４０頁（１９８８年））、インバースＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２０巻（３号）、６２１～６２３頁（１９８８年））、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）（Ｆｒｅｅｍａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６巻（１号）、１１２～２２頁、１２４～５頁（１９９９年）、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、などである）が挙げられる。ＲＴ－ＰＣＲでは、一本鎖ＲＮＡが、所望される標的であり、逆転写酵素によって、まず二本鎖のＤＮＡに変換される。
様々な等温ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅技法が、ＰＣＲの代替法または補足法として開発されている。例えば、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、制限酵素がニックを形成する能力に基づく（Ｗａｌｋｅｒら、ＰＮＡＳ、８９巻、３９２～３９６頁（１９９２年）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。制限酵素認識配列が、アニーリングされたプライマー配列に挿入される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰによって伸長されて、二本鎖が形成される。二本鎖のうちの一方の鎖のみが、制限酵素によって切断される。それぞれの一本鎖が、次いで、後続の合成のための鋳型として利用可能となる。ＳＤＡは、ＰＣＲの複雑な温度管理サイクルを必要としない。
転写媒介増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）もまた、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ Ｈ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの組合せを利用する等温増幅法である。（Ｃｏｍｐｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ、３５０巻、９１～９２頁（１９９１年））、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。標的ＲＮＡが、鋳型として使用され、逆転写酵素が、その相補的なＤＮＡ鎖を合成する。ＲＮＡｓｅ Ｈは、ＲＮＡ鋳型を加水分解し、ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ標的に相補的な第１のＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を合成するための空間を作り、ＤＮＡ二本鎖が形成される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、このＤＮＡ二本鎖の相補的なＲＮＡ鎖を連続して生成する。これらのＲＮＡ鎖が、新しいＤＮＡ合成サイクルの鋳型として作用し、結果として、標的遺伝子の増幅が生じる。
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、一本鎖の環状ポリヌクレオチドを増幅し、多数回の等温酵素合成を伴い、ここで、Ф２９ ＤＮＡポリメラーゼが、ポリヌクレオチド環を連続して何周もすることによって、プライマーを伸長し、その配列を何度も複製する。したがって、環状鋳型の線形コピーが達成される。次いで、プライマーが、この線形コピーにアニーリングされ得、その相補的な鎖が合成され得る。Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９巻、２２５～２３２頁（１９９８年）を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一本鎖の環状ＤＮＡもまた、ＲＮＡポリメラーゼの存在下において、ＲＮＡ合成の鋳型としての機能を果たし得る。（Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋら、ＪＡＣＳ、１１７巻、７８１８～７８１９頁（１９９５年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。インバース高速ｃＤＮＡ末端増幅（ＲＡＣＥ）ＲＣＡは、Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓらによって説明されている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、ｃＤＮＡに逆転写された後、ＲＮＡｓｅ Ｈ処置によって、ｃＤＮＡが分離される。次いで、ｃＤＮＡが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅによって環状化され、環状ＤＮＡとなる。結果として得られる環状ＤＮＡの増幅は、ＲＣＡによって達成される。（Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４１巻、３５～４２頁（２００６年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
前述の方法のいずれも、本開示のポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域を製造するのに利用することができる。
リガーゼによるポリヌクレオチドまたは核酸のアセンブリも、広く使用される。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を通じて、ポリヌクレオチド鎖の５’末端および３’末端の分子間ライゲーションを促進する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、２つの隣接するポリヌクレオチドプローブが、ハイブリダイズして標的遺伝子の１本の鎖となり、リガーゼによって互いに結合されるという原理に基づく、有望な診断技法である。標的遺伝子が存在していないか、または標的遺伝子に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）などのミスマッチが存在する場合、プローブはライゲーションできない。（Ｗｉｅｄｍａｎｎら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、３巻（４号）、ｓ５１～ｓ６４頁（１９９４年）、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＣＲを、様々な増幅技法と組み合わせて、検出の感度を増大させるか、またはポリヌクレオチドおよび核酸の合成において使用する場合には産物の量を増大させることができる。
核酸のライブラリー調製キットは、現在、複数が市販されている。これらは、少量の核酸試料を、下流適用のためにインデックスされたライブラリーに変換するための酵素および緩衝液を含む。例えば、ＤＮＡ断片を、末端調製、ライゲーション、サイズ選択、クリーンアップ、ＰＣＲ増幅、および最終クリーンアップのために、ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）によるＮＥＢＮＥＸＴ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（商標）ＤＮＡライブラリー調製キットに入れてもよい。
増幅技法の改善のために、継続的な開発が続いている。例えば、Ａｓａｄａらの米国特許第８，３６７，３２８号は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の効率性を増大させるために、反応エンハンサーを利用することを教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。反応エンハンサーは、酸性物質または酸性物質のカチオン性複合体を含む。Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉらの米国特許第７，３８４，７３９号は、酵素的ＤＮＡ合成を促進するカルボン酸イオン供給物質について教示しており、ここで、カルボン酸イオン供給物質は、シュウ酸、マロン酸、シュウ酸のエステル、マロン酸のエステル、マロン酸の塩、およびマレイン酸のエステルから選択され、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｓｏｂｅｋらの米国特許第７，３７８，２６２号は、ＤＮＡ増幅の忠実性を増大させるための酵素組成物を開示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この組成物は、３’エクソヌクレアーゼ活性を有するがポリメラーゼ活性を有さない１つの酵素、およびポリメラーゼである別の酵素を含む。これらの酵素のいずれも、熱安定性であり、低温では不活性となるように可逆的に修飾される。
Ｇｅｔｔｓらの米国特許第７，５５０，２６４号は、ｃＤＮＡ分子の３’末端にオリゴデオキシヌクレオチド尾部を結合させ、ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ転写を開始することによって行われる、複数回のセンスＲＮＡ分子の合成について教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｒｏｈａｙｅｍの米国特許公開第２０１３／０１８３７１８号は、一本鎖ＤＮＡ鋳型に対してＲＮＡポリメラーゼ活性を示す、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によるＲＮＡ合成について教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非標準的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、Ｂｅｎｎｅｒの米国特許第６，６１７，１０６号に開示されているように、非標準的なヌクレオチドを含む鋳型を、鋳型のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの混合物と接触させることによる、酵素的重合を用いて合成することができ、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｂ．化学的合成
標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、例えば、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を合成することができる。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含有する単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーを、合成することができる。他の態様では、所望されるポリペプチドの部分をコードする複数の小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、それらをライゲーションしてもよい。一部の態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的アセンブリのための５’または３’オーバーハングを含有する。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当技術分野において公知の化学的合成方法および可能な核酸塩基置換を使用して、化学的に合成することができる。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０９３９２４号、同第ＷＯ２０１３０５２５２３号、同第ＷＯ２０１３０３９８５７号、同第ＷＯ２０１２１３５８０５号、同第ＷＯ２０１３１５１６７１号、米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号、または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号もしくは同第ＵＳ８７１０２００号を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｃ．ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製には、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証、および品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当技術分野において公知の方法、例えば、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）によって、行うことができる。
「精製ポリヌクレオチド」など、ポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも１つの混入物質から分離されたものを指す。本明細書において使用されるとき、「混入物質」は、別の物質を、不適合、不純、または低品質にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、それが本来見出されるものとは異なる形態もしくは環境、または処置もしくは精製方法に供される前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境で、存在する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、不純物を除去し、これにより、望ましくない免疫応答を低減または除去すること、例えば、サイトカイン活性を低減することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与の前に精製される。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して精製された本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法によって精製された同じ本開示のポリヌクレオチドにより得られる発現レベルと比較して、コードされるＩＬ１２タンパク質の発現の増大を提示する。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））により精製されたポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の点変異のうちの１つまたは複数を含む、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞においてＩＬ１２タンパク質発現レベルを、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞におけるＩＬ１２タンパク質の発現レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％だけ増大させる。
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞において機能的ＩＬ１２タンパク質発現レベルを、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞におけるＩＬ１２タンパク質の機能的発現レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％だけ増大させる。
一部の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞において検出可能なＩＬ１２活性を、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞における機能的ＩＬ１２の活性レベルに対して、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％だけ増大させる。
一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９６％の純度、少なくとも約９７％の純度、少なくとも約９８％の純度、少なくとも約９９％の純度、または約１００％の純度である。
品質保証および／または品質管理チェックは、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光、または分析的ＨＰＬＣなどであるがこれらに限定されない方法を使用して、行うことができる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲを含むがこれに限定されない方法によって、シーケンシングされ得る。
ｄ．ＩＬ１２をコードするポリヌクレオチドの発現の定量化
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現産物、ならびに分解産物および代謝産物は、当技術分野において公知の方法によって定量化することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、エクソソームにおいて、または１つもしくは複数の体液に由来する場合に、定量化することができる。本明細書において使用されるとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または射精前液、汗、排泄物、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、粥状液、乳糜液、胆汁、間質液、経血、膿汁、皮脂、嘔吐物、腟分泌物、粘膜分泌物、大便水、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸飲液、胞胚腔液、ならびに臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から採取してもよい。
エクソソーム定量化方法では、２ｍＬ以下の試料を対象から得、エクソソームを、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、差次的遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組合せによって、単離する。分析において、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、短縮、または変化であり得る。レベルを、１つもしくは複数の臨床表現型、またはヒト疾患バイオマーカーに関するアッセイと、相関させることが有利である。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組合せを使用して行うことができ、一方で、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法などの免疫組織化学法を使用して単離することができる。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、差次的遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組合せによって単離してもよい。
これらの方法は、試験者に、残っているポリヌクレオチドまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルを、リアルタイムでモニタリングする能力をもたらす。本開示のポリヌクレオチドは、構造的または化学的修飾に起因して内因性の形態とは異なるため、これが可能である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などであるがこれに限定されない方法を使用して、定量化することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。定量化されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが、適正なサイズであり得るかを判定し、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを調べるために、分析してもよい。ポリヌクレオチドの分解は、限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって、調べることができる。
２３．医薬組成物および製剤
本開示は、上述のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、医薬組成物および製剤を提供する。一部の実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化された核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列に対して有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
医薬組成物または製剤は、任意選択で、１つまたは複数の追加の活性な物質、例えば、治療的および／または予防的に活性な物質を含んでもよい。本開示の医薬組成物または製剤は、滅菌および／または発熱物質不含であり得る。医薬剤の製剤化および／または製造における一般的な検討項目は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的で、「活性成分」という語句は、概して、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載される製剤および医薬組成物は、薬理学の分野において公知であるかまたは今後開発される、任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要に応じておよび／または望ましい場合には、生成物を所望される単回または複数回投薬単位に分割、成形、および／またはパッケージングするステップを含む。
本開示による医薬組成物または製剤は、バルクで、単回の単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、調製、パッケージング、および／または販売され得る。本明細書において使用されるとき、「単位用量」とは、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および／またはそのような投薬量の便宜的な割合、例えば、そのような投薬量の半分または３分の１などに等しい。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対的な量は、処置を受ける対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて、さらには組成物を投与しようとする経路に応じて、変動し得る。例えば、組成物は、０．１％～９９％（重量／重量）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、または少なくとも８０％（重量／重量）の活性成分を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および製剤は、少なくとも１つの本開示のポリヌクレオチドを含有し得る。非限定的な例として、組成物または製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの本開示のポリヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物または製剤は、１つより多くの種類のポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、組成物または製剤は、線形形態および環状形態のポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチドおよびＩＶＴポリヌクレオチドを含み得る。さらに別の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、および環状ポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書において提供される医薬組成物および製剤の説明は、主として、ヒトへの投与に好適な医薬組成物および製剤を対象としているが、当業者であれば、そのような組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることを理解するであろう。組成物を様々な動物への投与に好適なものにするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物または製剤の修正形が、十分に理解され、通常の技能の獣医学薬理学者であれば、必要だとしても単に通常の実験によって、そのような修正形を設計および／または実行することができる。医薬組成物または製剤の投与が企図される対象としては、ヒトおよび／もしくは他の霊長類；商業関連の哺乳動物、例えば、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットを含む、哺乳動物；ならびに／または商業関連の鳥類、例えば、家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウを含む鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む、医薬製剤を提供する。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、（１）安定性を増大させるため、（２）細胞のトランスフェクションを増大させるため、（３）持続放出もしくは遅延放出を可能にするため（例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から）、（４）生体分布を変化させるため（例えば、ポリヌクレオチドの標的を特定の組織もしくは細胞型とするため）、（５）ｉｎ ｖｉｖｏでコードされるタンパク質の翻訳を増大させるため、ならびに／または（６）ｉｎ ｖｉｖｏでコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させるために、１つまたは複数の賦形剤を使用して、製剤化してもよい。一部の実施形態では、医薬製剤は、送達剤（例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～１４７のうちのいずれかまたは化合物１～２３２のうちのいずれか）をさらに含む。
薬学的に許容される賦形剤としては、本明細書において使用されるとき、所望される特定の剤形に好適な、ありとあらゆる溶媒、分散媒、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁補助剤、希釈剤、造粒剤および／もしくは分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗微生物剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝液、キレート剤、凍結保護剤（ｃｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、ならびに／または増量剤が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなど、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な造粒剤および／または分散剤としては、デンプン、アルファ化デンプン、または微晶質デンプン、アルギン酸、グアーガム、寒天、ポリ（ビニル－ピロリドン）、（ピロビドン）、架橋型ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウムなど、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な界面活性剤および／または乳化剤としては、天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８など、ならびに／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、モラセス、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然および合成のガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
酸化は、ｍＲＮＡ、特に、液体ｍＲＮＡ製剤の、潜在的な分解経路である。酸化を予防するために、酸化防止剤を製剤に添加してもよい。例示的な酸化防止剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチルヒドロキシアニソール、ｍ－クレゾール、メチオニン、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウムなど、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な抗微生物剤または抗真菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸など、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な保存剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）など、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、安定性を改善するために、ｐＨ５～ｐＨ８に維持される。ｐＨを調節するための例示的な緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（もしくはヒスチジン－ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなど、および／またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、水添植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、凍結する際に本明細書に記載されるポリヌクレオチドを安定化するための凍結保護剤（ｃｙｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含有し得る。例示的な凍結保護剤としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、「薬学的に洗練された」固形物をもたらし、長期（例えば、３６ヶ月間）の保管期間の間、凍結乾燥されたポリヌクレオチドを安定させるために、凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤中に増量剤を含有してもよい。本開示の例示的な増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、微細小胞、エクソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、およびこれらの組合せを挙げることができるが、これらに限定されない。
２４．送達剤
ａ．脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。具体的には、本出願は、
（ａ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）送達剤を含む、医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、本開示の送達剤は、２０１６年９月１６日に出願され、国際公開第ＷＯ２０１７／０４９２４５号として公開された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に開示されている任意の１つまたは複数の化合物を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、
Figure 0007246930000099
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ，および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３－６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択される。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものを含み、ここで、アルキルおよびアルケニル基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが、１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではないものを含む。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲならびにＮ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１～３アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３－６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにＮ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１～３アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２，から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、Ｑが５～１４員複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、ｎが１または２である－（ＣＨ２）ｎＱであるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、ｎが１である－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲおよび－ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５～１４員ヘテロアリールまたは８～１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３－６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、Ｑが５～１４員複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、ｎが１または２である－（ＣＨ２）ｎＱであるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、ｎが１である－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲおよび－ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは５～１４員ヘテロアリールまたは８～１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、

各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、および－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３－６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ２～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ１～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ２～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ１～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、および－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ１～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、式中、
Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、および－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、各ｎは、１、２、３、４、および５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ１～１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）のもの、
Figure 0007246930000100
を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり
Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）のもの、
Figure 0007246930000101
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中
ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
Figure 0007246930000102
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
Figure 0007246930000103
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）のもの、
Figure 0007246930000104
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）のもの、
Figure 0007246930000105
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述の通りである。
一部の実施形態では、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）の化合物は、Ｒ４を含み、これは、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され、ここで、Ｑ、Ｒ、およびｎは、上記に定義される通りである。
一部の実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ここで、Ｒは上記に定義される通りである。一部の態様では、ｎは、１または２である。一部の実施形態では、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
Figure 0007246930000106
またはその塩であり、式中、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ５～１４アルキルおよびＣ５～１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、および４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６、およびｍは、上記に定義される通りである。
式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、Ｒ３は、Ｃ５～Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、ｍは、５、７、または９である。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、各Ｒ５は、Ｈである。式（ＩＩｄ）の化合物の一部の態様では、各Ｒ６は、Ｈである。
別の態様では、本出願は、（１）式（Ｉ）を有する化合物、（２）任意選択で、補助脂質（例えば、リン脂質）、（３）任意選択で、構造脂質（例えば、ステロール）、（４）任意選択で、脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ脂質）、および（５）任意選択で、第四級アミン化合物を含む、脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する。例示的な実施形態では、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、その中に封入されたポリヌクレオチドを、さらに含む。
本明細書において使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１個または複数の炭素原子（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多い炭素原子）を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
「Ｃ１～１４アルキル」という表記法は、１～１４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２個またはそれよりも多い炭素原子（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多い炭素原子）および少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
「Ｃ２～１４アルケニル」という表記法は、２～１４個の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多い二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つまたは複数の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味する。環は、３、４、５、６，７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５員環であり得る。
「Ｃ３～６炭素環」という表記法は、３～６個の炭素原子を有する単一の環を含む、炭素環を意味する。炭素環は、１つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、アリール基）。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、および１，２－ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「複素環」または「複素環式基」という用語は、１つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味し、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２員環であり得る。複素環は、１つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、ヘテロアリール基）。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、およびイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「生体分解性基」は、対象における脂質のより迅速な代謝を促進し得る基である。生体分解性基は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基であり得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるとき、「アリール基」とは、１つまたは複数の芳香環を含む、炭素環式基である。例示的なアリール基としては、フェニルおよびナフチル基が挙げられる
本明細書において使用されるとき、「ヘテロアリール基」とは、１つまたは複数の芳香環を含む、複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、およびチアゾリルが挙げられる。アリールおよびヘテロアリール基のいずれも、任意選択で置換され得る。例えば、ＭおよびＭ’は、任意選択で置換されるフェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる非限定的な群から選択することができる。本明細書の式において、ＭおよびＭ’は、独立して、上述の生体分解性基の一覧から選択され得る。
アルキル、アルケニル、およびシクリル（例えば、カルボシクリルおよびヘテロシクリル）基は、別途指定されない限り、任意選択で置換され得る。任意選択の置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、－ＯＨ）、エステル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、代替的にはＣ＝Ｏと表される）、ハロゲン化アシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｘ、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、およびヨウ化物から選択されるハロゲン化物）、カーボネート（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、－ＯＲ）、アセタール（例えば、－Ｃ（ＯＲ）２Ｒ”“、ここで、各ＯＲは、同じであっても異なってもよいアルコキシ基であり、Ｒ”“は、アルキルまたはアルケニル基である）、ホスフェート（例えば、Ｐ（Ｏ）４ ３－）、チオール（例えば、－ＳＨ）、スルホキシド（例えば、－Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、－Ｃ（Ｓ）Ｈ）、スルフェート（例えば、Ｓ（Ｏ）４ ２－）、スルホニル（例えば、－Ｓ（Ｏ）２－）、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、－Ｎ３）、ニトロ（例えば、－ＮＯ２）、シアノ（例えば、－ＣＮ）、イソシアノ（例えば、－ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、－ＮＲ２、－ＮＲＨ、または－ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、およびシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
前述のもののいずれにおいても、Ｒは、本明細書において定義される通り、アルキルまたはアルケニル基である。一部の実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書において定義される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの置換基でさらに置換されてもよい。例えば、Ｃ１～６アルキル基は、本明細書に記載される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの置換基でさらに置換されてもよい。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、および（ＩＩｅ）のうちのいずれか１つの化合物は、適宜、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、および－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員芳香族または非芳香族の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択される。
他の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、および－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、およびＣ１～３アルキルから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは、独立に、１、２、３、４、および５から選択される。
他の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、および－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５～１４員複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立に、１、２、３、４、および５から選択され、Ｑが５～１４員複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、ｎが１または２である－（ＣＨ２）ｎＱであるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、ｎが１である－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲおよび－ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは、５～１４員ヘテロアリールまたは８～１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかである。
他の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、および－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を有する５～１４員ヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立に、１、２、３、４、および５から選択される。
別の実施形態では、Ｒ４は、非置換Ｃ１～４アルキル、例えば、非置換メチルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、ここで、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、および５から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、ここで、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、および－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、および５から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、ここで、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ２～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、および５から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｃ２～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する。
一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキルおよびＣ５～２０アルケニルからなる群から選択される。
他の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”および－ＹＲ”から選択される。一部の実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。一部の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３～１２アルキルである。例えば、Ｒ”は、Ｃ３アルキルであり得る。例えば、Ｒ”は、Ｃ４～８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８アルキル）であり得る。
一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５～２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。一部の実施形態では、Ｒ１は、リノレイルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、分岐鎖である（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イル、またはヘプタデカ－９－イル）。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、
Figure 0007246930000107
である。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換Ｃ５～２０アルキルまたはＣ５～２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ５～２０アルキルまたはＣ５～２０アルケニル（例えば、１－シクロプロピルノニルなど、Ｃ３～６炭素環で置換されたもの）である。
他の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
一部の実施形態では、Ｒ’は、－Ｒ＊ＹＲ”および－ＹＲ”から選択される。一部の実施形態では、Ｙは、Ｃ３～８シクロアルキルである。一部の実施形態では、Ｙは、Ｃ６～１０アリールである。一部の実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。一部の実施形態では、Ｙは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３～１２アルキルおよびＣ３～１２アルケニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ１アルキルである。一部の実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ４～９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８またはＣ９アルキル）である。
一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキルおよびＣ４アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキルおよびＣ５アルケニルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキルおよびＣ６アルケニルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキルおよびＣ７アルケニルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキルおよびＣ９アルケニルから選択される。
他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１１アルキルおよびＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、およびＣ１８アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、分岐鎖である（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イル、またはヘプタデカ－９－イル）。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、
Figure 0007246930000108
である。
ある特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換Ｃ１～１８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ１～１８アルキル（例えば、１－シクロプロピルノニルなど、Ｃ３～６炭素環で置換されたＣ１～１５アルキル）である。
一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルである。
一部の実施形態では、Ｍ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。一部の実施形態では、Ｍ’は、－ＯＣ（Ｏ）－である。
他の実施形態では、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる群から選択され得る。
一部の実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。一部の実施形態では、Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。一部の実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－である。一部の実施形態では、Ｍは、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－である。
他の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる群から選択され得る。
一部の実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じである。他の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
一部の実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。ある特定のそのような実施形態では、各Ｒ６も、Ｈである。
一部の実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、またはｉ－プロピル）である。
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ５～１４アルキルまたはＣ５～１４アルケニルである。
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は同じである。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ７アルキルである。
他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は異なる。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１～７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
一部の実施形態では、Ｒ７およびＲ３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
一部の実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
一部の実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
一部の実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環、および複素環からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｑは、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換５～１０員ヘテロアリールであり、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２－アミノ－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン－９－イル（もしくはグアニン－９－イル）、アデニン－９－イル、シトシン－１－イル、またはウラシル－１－イルである。ある特定の実施形態では、Ｑは、例えばオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、およびＣ１～３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基で置換された、置換５～１４員ヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４－メチルピペラジニル、４－（４－メトキシベンジル）ピペラジニル、またはイソインドリン－２－イル－１，３－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、非置換または置換Ｃ６～１０アリール（フェニルなど）またはＣ３～６シクロアルキルである。
一部の実施形態では、ｎは、１である。他の実施形態では、ｎは、２である。さらなる実施形態では、ｎは、３である。ある特定の実施形態では、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）３ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）４ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、ベンジルであり得る。例えば、Ｒ４は、４－メトキシベンジルであり得る。
一部の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環である。一部の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３～６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、例えば、ＯＨ、ハロ、Ｃ１～６アルキルなどで任意選択で置換されたシクロヘキシルであり得る。例えば、Ｒ４は、２－ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
一部の実施形態では、Ｒは、Ｈである。
一部の実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１～３アルキルまたは非置換Ｃ２～３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。
一部の実施形態では、Ｒは、置換Ｃ１～３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであり得る。
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１個または複数のヘテロ原子を有する５～１４員芳香族または非芳香族複素環を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、芳香族または非芳香族のいずれかである、任意選択で置換されるＣ３～２０炭素環（例えば、Ｃ３～１８炭素環、Ｃ３～１５炭素環、Ｃ３～１２炭素環、またはＣ３～１０炭素環）を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ３～６炭素環を形成する。他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ６炭素環、例えば、シクロヘキシルまたはフェニル基を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３～６炭素環は、１つまたは複数のアルキル基で置換される（例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接の環原子において）。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、１つまたは複数のＣ５アルキル置換を有するシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。ある特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３によって形成された複素環またはＣ３～６炭素環は、炭素環式基で置換される。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、シクロヘキシルで置換されたシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ７～１５炭素環、例えば、シクロヘプチル、シクロペンタデカニル、またはナフチル基を形成する。
一部の実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。一部の実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、およびプリンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ３～６炭素環、例えば、フェニル基を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３～６炭素環は、１つまたは複数のアルキル基で置換される（例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接の環原子において）。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、１つまたは複数のＣ５アルキル置換を有するフェニル基を形成し得る。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物、式（Ｉ）の化合物は、
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およびそれらの塩または立体異性体からなる群から選択される。
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物１～化合物１４７、またはそれらの塩もしくは立体異性体からなる群から選択される。
本明細書に開示される脂質化合物のアミン部分は、ある特定の条件下において、プロトン化され得る。例えば、式（Ｉ）による脂質の中心アミン部分は、典型的に、アミノ部分のｐＫａよりも低いｐＨではプロトン化され（すなわち、正に荷電する）、ｐＫａよりも高いｐＨでは実質的に荷電されない。そのような脂質は、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。
１つの特定の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質は、化合物１８である。
一部の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約１モル％～９９モル％の範囲である。
一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９モル％である。
一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約３０モル％～約７０モル％、約３５モル％～約６５モル％、約４０モル％～約６０モル％、および約４５モル％～約５５モル％の範囲である。
１つの特定の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約５０モル％である。
本明細書に開示されるイオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物に加えて、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、追加の成分、例えば、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、ＰＥＧ脂質、およびこれらの任意の組合せを含み得る。
他の態様では、脂質ナノ粒子は、約２０～６０％のイオン化可能アミノ脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のステロール；および０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約２０～６０％の化合物１８：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のコレステロール；および０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約５０％のイオン化可能アミノ脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約５０％の化合物１８：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約４９．８３％のイオン化可能アミノ脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約４９．８３％の化合物１８：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。
ｂ．脂質組成物中の追加の成分
（ｉ）リン脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、１つまたは複数の飽和または（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組合せを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分および１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。例えば、リン脂質は、式（ＶＩＩ）による脂質であり得、
Figure 0007246930000143
Ｒｐは、リン脂質部分を表し、Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なってもよい、不飽和ありまたはなしの脂肪酸部分を表す。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノール酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサンエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）が、膜を通過することを可能にし得、例えば、１つまたは複数の要素の標的組織（例えば、腫瘍組織）への送達を可能にし得る。
分岐化、酸化、環化、およびアルキンを含む修飾および置換を有する天然の種を含む、非天然のリン脂質の種もまた、企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能化され得るかまたはそれに架橋し得る。適切な反応条件下において、アルキン基は、アジドに曝露されると、銅に触媒される環状付加を受け得る。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を促進するためにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化すること、またはナノ粒子組成物を、有用な成分、例えば、標的化もしくは画像化部分（例えば、色素）にコンジュゲートすることに有用であり得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される腫瘍内送達のための医薬組成物は、１つより多くのリン脂質を含んでもよい。１つより多くのリン脂質が使用される場合、そのようなリン脂質は、同じリン脂質クラス（例えば、ＭＳＰＣおよびＤＳＰＣ）、または異なるクラス（例えば、ＭＳＰＣおよびＭＳＰＥ）に属し得る。
リン脂質は、対称型または非対称型のものであり得る。本明細書において使用されるとき、「対称リン脂質」という用語には、一致する脂肪酸部分を有するグリセロリン脂質、ならび変動する脂肪酸部分およびスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が、同等の数の炭素原子を含む、スフィンゴ脂質が含まれる。本明細書において使用されるとき、「非対称リン脂質」という用語には、リゾ脂質、異なる脂肪酸部分（例えば、異なる数の炭素原子および／または不飽和（例えば、二重結合）を有する脂肪酸部分）を有するグリセロリン脂質、ならびに変動する脂肪酸部分およびスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が、類似しない数の炭素原子を含む（例えば、変動する脂肪酸部分が、炭化水素鎖よりも少なくとも２個多い炭素原子を含むか、炭化水素鎖よりも少なくとも２個少ない炭素原子を含む）、スフィンゴ脂質が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも１つの対称リン脂質を含む。対称リン脂質は、
１，２－ジプロピオニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０３：０ ＰＣ）、
１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０４：０ ＰＣ）、
１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０５：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０ ＰＣ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０ ＰＣ）、
１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０ ＰＣ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０ ＰＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０ ＰＣ、ＤＵＰＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ ＰＣ、ＤＭＰＣ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０ ＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ ＰＣ、ＤＰＰＣ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（４ＭＥ １６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０ ＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ＰＣ、ＤＳＰＣ）、
１，２－ジノナデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０ ＰＣ）、
１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘンアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２１：０ ＰＣ）、
１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２３：０ ＰＣ）、
１，２－ジリグノセロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジミリステライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジパルミテライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２－ジペトロセレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ６－Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＯＰＣ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：２（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬｎＰＣ）、
１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：４（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＡＰＣ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＨＡＰＣ）、
１，２－ジネルボノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０６：０ ＰＥ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０８：０ ＰＥ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１０：０ ＰＥ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１２：０ ＰＥ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０ ＰＥ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１５：０ ＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ ＰＥ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（４ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１７：０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：１ ＰＥ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＥ、ＤＯＰＥ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：２ ＰＥ、ＤＬＰＥ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：３ ＰＥ、ＤＬｎＰＥ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２０：４ ＰＥ、ＤＡＰＥ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２２：６ ＰＥ、ＤＨＡＰＥ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテルＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ，ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択される少なくとも１つの対称リン脂質を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも１つの非対称リン脂質を含む。非対称リン脂質は、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－０２：０ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－２０：４ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－２２：６ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：２ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２０：４ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２２：６ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
１－オレオイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
１－オレオイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：２ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２０：４ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２２：６ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：１ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：２ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２０：４ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２２：６ ＰＥ）、
１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
脂質組成物において有用な非対称脂質はまた、リゾ脂質であってもよい。リゾ脂質は、
１－ヘキサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ヘプタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－オクタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ノナノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－デカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ウンデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ラウロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－トリデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ペンタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ヘプタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ノナデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－アラキドイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－リグノセロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ヘキサコサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの非対称リン脂質を含む。一部の実施形態では、非対称リン脂質は、１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）である。特定の実施形態では、非対称リン脂質は、２０１７年４月１３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／２７４９２号に開示されている１つまたは複数のリン脂質であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、１つもしくは複数の対称リン脂質、１つもしくは複数の非対称リン脂質、またはこれらの組合せを含有し得る。複数のリン脂質が存在する場合、それらは、等モル比または非等モル比で存在し得る。
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、脂質組成物中、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約２０モル％、約１０モル％～約２０モル％、約１５モル％～約２０モル％、約１モル％～約１５モル％、約５モル％～約１５モル％、約１０モル％～約１５モル％、約５モル％～約１０モル％の範囲の総量のリン脂質（例えば、ＭＳＰＣ）を含む。一実施形態では、リン脂質の量は、脂質組成物中、約８モル％～約１５モル％である。一実施形態では、リン脂質（例えば、ＭＳＰＣ）の量は、脂質組成物中、約１０モル％である。
一部の態様では、特定のリン脂質（例えば、ＭＳＰＣ）の量は、脂質組成物中、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０モル％である。
（ｉｉ）第四級アミン化合物
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）を含み得る。「第四級アミン化合物」という用語は、１つまたは複数の第四級アミン基（例えば、トリアルキルアミノ基）を有し、永続的に正の電荷を有し、塩の形態で存在する、化合物を含んで使用される。例えば、１つまたは複数の第四級アミン基は、脂質またはポリマー（例えば、ＰＥＧ）で存在し得る。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、（１）第四級アミン基、ならびに（２）（ｉ）直鎖もしくは分岐鎖で飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖、および（ｉｉ）任意選択で、第四級アミン基と炭化水素鎖との間にエーテル、エステル、カルボニル、もしくはケタール結合を含む、少なくとも１つの疎水性尾部基を含む。一部の実施形態では、第四級アミン基は、トリメチルアンモニウム基であり得る。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、２つの同一な炭化水素鎖を含む。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、２つの異なる炭化水素鎖を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも１つの第四級アミン化合物を含む。第四級アミン化合物は、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、
Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、
１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、
２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、
Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、
Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、
Ｎ－（１，２－ジオレオイルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、
Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＴＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、
１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬＴＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＭＴＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、
１，２－ジ－（９Ｚ－テトラデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１４：１ ＥＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１６：０－１８：１ ＥＰＣ）、
およびこれらの任意の組合せからなる非限定群から選択され得る。
一実施形態では、第四級アミン化合物は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）である。
第四級アミン化合物は、ＵＳ２０１３／０２４５１０７ Ａ１、ＵＳ２０１４／０３６３４９３ Ａ１、ＵＳ８，１５８，６０１、ＷＯ２０１５／１２３２６４ Ａ１、およびＷＯ２０１５／１４８２４７ Ａ１に記載されているものなど、当技術分野において公知であり、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約０．０１モル％～約２０モル％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約０．５モル％～約２０モル％、約０．５モル％～約１５モル％、約０．５モル％～約１０モル％、約１モル％～約２０モル％、約１モル％～約１５モル％、約１モル％～約１０モル％、約２モル％～約２０モル％、約２モル％～約１５モル％、約２モル％～約１０モル％、約３モル％～約２０モル％、約３モル％～約１５モル％、約３モル％～約１０モル％、約４モル％～約２０モル％、約４モル％～約１５モル％、約４モル％～約１０モル％、約５モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約５モル％～約１０モル％、約６モル％～約２０モル％、約６モル％～約１５モル％、約６モル％～約１０モル％、約７モル％～約２０モル％、約７モル％～約１５モル％、約７モル％～約１０モル％、約８モル％～約２０モル％、約８モル％～約１５モル％、約８モル％～約１０モル％、約９モル％～約２０モル％、約９モル％～約１５モル％、約９モル％～約１０モル％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約５モル％～約１０モル％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約５モル％である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約１０モル％である。
一部の実施形態では、第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、本明細書に開示の脂質組成物中の少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５または２０モル％である。
一部の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）の化合物を含む。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）対第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡ）のモル濃度比は、約１００：１～約２．５：１である。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）対第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）のモル濃度比は、約９０：１、約８０：１、約７０：１、約６０：１、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、または約２．５：１である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）対第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）のモル濃度比は、約１０：１である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、２０１７年４月１３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２号に開示されている脂質組成物を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、第四級アミン化合物を含まない。一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＤＯＴＡＰを含まない。
（ｉｉｉ）構造脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含有する脂質を指す。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。
一実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、約２０モル％～約６０モル％、約２５モル％～約５５モル％、約３０モル％～約５０モル％、もしくは約３５モル％～約４５モル％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、約２５モル％～約３０モル％、約３０モル％～約３５モル％、もしくは約３５モル％～約４０モル％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、約２３．５モル％、約２８．５モル％、約３３．５モル％、もしくは約３８．５モル％である。
一部の実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、ステロール、例えば、コレステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０モル％である。
一部の態様では、開示される腫瘍内送達のための医薬組成物の脂質組成物成分は、コレステロールを含まない。
（ｉｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書において使用されるとき、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、およびＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル（ＰＥＧ－ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分には、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧおよびＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ脂質は、米国特許第８１５８６０１号および国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４号Ａ２に記載されているものなど、当技術分野において公知であり、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０．１モル％～約５モル％、約０．５モル％～約５モル％、約１モル％～約５モル％、約１．５モル％～約５モル％、約２モル％～約５モル％モル％、約０．１モル％～約４モル％、約０．５モル％～約４モル％、約１モル％～約４モル％、約１．５モル％～約４モル％、約２モル％～約４モル％、約０．１モル％～約３モル％、約０．５モル％～約３モル％、約１モル％～約３モル％、約１．５モル％～約３モル％、約２モル％～約３モル％、約０．１モル％～約２モル％、約０．５モル％～約２モル％、約１モル％～約２モル％、約１．５モル％～約２モル％、約０．１モル％～約１．５モル％、約０．５モル％～約１．５モル％、もしくは約１モル％～約１．５モル％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約１．５モル％である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５モル％である。
一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、および非対称リン脂質を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物１８およびＭＳＰＣを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、および第四級アミン化合物を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物１８およびＤＯＴＡＰを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物、非対称リン脂質、および第四級アミン化合物を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物１８、ＭＳＰＣ、およびＤＯＴＡＰを含む。
一実施形態では、脂質組成物は、約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）、約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ、約３３．５モル％のコレステロール、約１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧ、および約５モル％のＤＯＴＡＰを含む。一実施形態では、脂質組成物は、約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）、約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ、約２８．５モル％のコレステロール、約１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧ、および約１０モル％のＤＯＴＡＰを含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２０～６０％のイオン化可能アミノ脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のステロール；および０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約２０～６０％の化合物１８：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のコレステロール；および０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約５０％のイオン化可能アミノ脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約５０％の化合物１８：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；および約１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約４９．８３％のイオン化可能アミノ脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約４９．８３％の化合物１８：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；および約２．０％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。
脂質ナノ粒子の構成成分は、所望の転帰に基づいてポリヌクレオチドの最適な送達のために適合させることができる。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０～６０モル％のイオン化可能アミノ脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物）、８～１６モル％のリン脂質、３０～４５モル％のコレステロール、１～５モル％のＰＥＧ脂質、および任意選択で１～１５モル％の第四級アミン化合物を含み得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～６５モル％のイオン化可能アミノ脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物）、５～１０モル％のリン脂質、２５～４０モル％のコレステロール、０．５～５モル％のＰＥＧ脂質、および任意選択で１～１５モル％の第四級アミン化合物を含み得る。
核酸脂質粒子の非限定的な例は、米国特許公開第２０１４０１２１２６３号に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（ｖ）他のイオン化可能アミノ脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）にしたがう脂質に加えて、１つまたは複数のイオン化可能脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「イオン化可能脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、１つまたは複数の荷電した部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、正に荷電していてもよいし、負に荷電していてもよい。イオン化可能脂質は、正に荷電してもよく、その場合、「カチオン性脂質」と称され得る。例えば、イオン化可能分子は、アミン基を含み得、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。
イオン化可能脂質は、
３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、
ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、
１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、
（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、
２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、
（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および
（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定群から選択され得る。これらに加え、イオン化可能アミノ脂質は、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
イオン化可能脂質はまた、国際公開第ＷＯ２０１５／１９９９５２号Ａ１に開示されている化合物であってもよく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、イオン化可能アミノ脂質としては、
Figure 0007246930000144
Figure 0007246930000145
およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｖｉ）他の脂質組成物成分
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、上述のものに加えて、１つまたは複数の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、１つまたは複数の透過性増強分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の成分を含み得る。例えば、透過性増強分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であってもよい。炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース）ならびに多糖類（例えば、グリコーゲン、ならびにその誘導体および類似体）を含み得る。脂質組成物は、ｐＨ７のクエン酸もしくはリン酸などであるがこれらに限定されない緩衝液、塩、および／または糖を含み得る。塩および／または糖は、等張性のために、本明細書に記載される製剤に含まれ得る。
ポリマーは、本明細書に開示される医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子の形態の医薬組成物）を封入または部分的に封入するために、含まれ得るおよび／または使用され得る。ポリマーは、生体分解性および／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比の範囲は、約１０：１～約６０：１（重量／重量）であり得る。
一部の実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（重量／重量）であり得る。一部の実施形態では、脂質組成物対治療剤をコードするポリヌクレオチドの重量／重量比は、約２０：１または約１５：１である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、１より多くのポリペプチドを含有し得る。例えば、本明細書に開示される医薬組成物は、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１または７０：１、あるいはこれらの比の範囲もしくはいずれか、例えば、これらに限定されないが、５：１～約１０：１、約５：１～約１５：１、約５：１～約２０：１、約５：１～約２５：１、約５：１～約３０：１、約５：１～約３５：１、約５：１～約４０：１、約５：１～約４５：１、約５：１～約５０：１、約５：１～約５５：１、約５：１～約６０：１、約５：１～約７０：１、約１０：１～約１５：１、約１０：１～約２０：１、約１０：１～約２５：１、約１０：１～約３０：１、約１０：１～約３５：１、約１０：１～約４０：１、約１０：１～約４５：１、約１０：１～約５０：１、約１０：１～約５５：１、約１０：１～約６０：１、約１０：１～約７０：１、約１５：１～約２０：１、約１５：１～約２５：１，約１５：１～約３０：１、約１５：１～約３５：１、約１５：１～約４０：１、約１５：１～約４５：１、約１５：１～約５０：１、約１５：１～約５５：１、約１５：１～約６０：１または約１５：１～約７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ、例えば、これらに限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌより大きな濃度のポリヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよび脂質ナノ粒子を含む製剤は、０．１５ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、製剤は、１０ｍＭのクエン酸緩衝液をさらに含んでもよく、製剤は、追加で、１０％重量／重量までのスクロース（例えば、少なくとも１％重量／重量、少なくとも２％重量／重量／、少なくとも３％重量／重量、少なくとも４％重量／重量、少なくとも５％重量／重量、少なくとも６％重量／重量、少なくとも７％重量／重量、少なくとも８％重量／重量、少なくとも９％重量／重量または１０％重量／重量）を含んでもよい。
（ｖｉｉ）ナノ粒子組成物
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。したがって、本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物などの送達剤を含む脂質組成物、ならびに（ｉｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入し得る。
ナノ粒子組成物は、典型的に、マイクロメートル単位またはそれよりも小さいサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍまたはそれよりも小さい直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
ナノ粒子組成物には、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、およびリポプレックスが含まれる。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つまたは複数の脂質二重層を含む、小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水溶性コンパートメントで分離された、２つまたはそれよりも多い同心二重層を含む。脂質二重層は、互いに官能化および／または架橋され得る。脂質二重層は、１つまたは複数のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）による少なくとも１つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物１～１４７のうちの１つもしくは複数、または化合物１～３４２のうちの１つもしくは複数を含み得る。ナノ粒子組成物はまた、様々な他の成分も含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）による脂質に加えて、１つまたは複数の他の脂質、例えば、（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの第四級アミン化合物、（ｉｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｖ）少なくとも１つのＰＥＧ脂質、または（ｖ）これらの任意の組合せを含んでもよい。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）およびリン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）、および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）を含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）およびリン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）、および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６、または４８）および第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、（１）約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）；約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ；約３３．５モル％のコレステロール；約１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）；約５モル％のＤＯＴＡＰを含む脂質組成物；および（２）ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、（１）約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）；約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ；約２８．５モル％のコレステロール；約１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）；約１０モル％のＤＯＴＡＰを含む脂質組成物；および（２）ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、（１）約５０モル％の式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）；約１０モル％のＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ；約２３．５モル％のコレステロール；約１．５モル％のＰＥＧ－ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）；約１５モル％のＤＯＴＡＰを含む脂質組成物；および（２）ポリヌクレオチドを含む。
ナノ粒子組成物は、様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡）を使用して、ナノ粒子組成物の形態学およびサイズ分布を試験することができる。動的光散乱法または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法はまた、粒子サイズを判定するためにも利用することができる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの機器もまた、ナノ粒子組成物の複数の特徴、例えば、粒子サイズ、多分散性指標、およびゼータ電位を測定するために使用され得る。
本明細書において一般に定義されるように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の特性を有する小分子を指す。脂質は、天然に存在しても合成であってもよい。脂質のクラスの例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン類、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、およびポリケチド、ならびにプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、一部の脂質の両親媒性の特性により、水性媒体中で、リポソーム、小胞、または膜の形成がもたらされる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン化可能脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「イオン化可能脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、１つまたは複数の荷電した部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、正に荷電している場合も負に荷電している場合もある。イオン化可能脂質は、正に荷電してもよく、その場合には、「カチオン性脂質」と称され得る。例えば、イオン化可能分子は、アミン基を含み得、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。本明細書において使用されるとき、「荷電した部分」は、正式な電子電荷、例えば、一価（＋１または－１）、二価（＋２または－２）、三価（＋３または－３）などを有する化学的部分である。荷電した部分は、アニオン性（すなわち、負に荷電している）またはカチオン性（すなわち、正に荷電している）であり得る。正に荷電した部分の例としては、アミン基（例えば、第一級、第二級、および／または第三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、ならびにイミジゾリウム（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｕｍ）基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電した部分は、アミン基を含む。負に荷電した基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電した部分の電荷は、変動し得、一部の事例では、環境条件、例えば、ｐＨの変化により、その部分の電荷が変化し得る、かつ／またはその部分が荷電するかもしくは非荷電になることをもたらし得る。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択され得る。
「荷電した」または「荷電した部分」という用語は、分子上の「部分的な負の電荷」または「部分的な正の電荷」を指すものではないことを理解されたい。「部分的な負の電荷」および「部分的な正の電荷」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分的な負の電荷」は、官能基が、極性を生じる結合を含み、電子密度が結合の１つの原子に引き寄せられ、その原子に部分的な負の電荷をもたらす場合に、生じ得る。当業者であれば、一般に、このようにして極性が生じる結合を認識するであろう。
一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、イオン化可能アミノ脂質であり、これは、当技術分野において、「イオン化可能カチオン性脂質」と称される場合がある。一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質は、リンカー構造体を介して接続された正に荷電した親水性の頭部および疎水性の尾部を有し得る。
ナノ粒子のサイズは、炎症などであるがこれに限定されない生物学的反応に対抗するのに役立ち得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増大させ得る。
本明細書において使用されるとき、ナノ粒子組成物の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」とは、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
一実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、および／またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａとの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約１０～約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍおよび／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化される。
一実施形態では、ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きいまたは１０００ｎｍより大きい直径を有する。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍまたはそれ未満（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、またはそれ未満）である。
ナノ粒子組成物は、比較的に均質であり得る。多分散性指標を使用して、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒子サイズ分布を示すことができる。低い多分散性指標（例えば、０．３未満）は、通常、狭い粒子サイズ分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を示し得る。正であっても負であっても比較的低い電荷を有するナノ粒子組成物が、一般的に、望ましいが、これは、より高度に荷電した種は、望ましくなく、細胞、組織、および体内の他の要素と、相互作用し得るためである。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ～約１００ｍＶ、約０ｍＶ～約９０ｍＶ、約０ｍＶ～約８０ｍＶ、約０ｍＶ～約７０ｍＶ、約０ｍＶ～約６０ｍＶ、約０ｍＶ～約５０ｍＶ、約０ｍＶ～約４０ｍＶ、約０ｍＶ～約３０ｍＶ、約０ｍＶ～約２０ｍＶ、約０ｍＶ～約１０ｍＶ、約１０ｍＶ～約１００ｍＶ、約１０ｍＶ～約９０ｍＶ、約１０ｍＶ～約８０ｍＶ、約１０ｍＶ～約７０ｍＶ、約１０ｍＶ～約６０ｍＶ、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１０ｍＶ～約４０ｍＶ、約１０ｍＶ～約３０ｍＶ、約１０ｍＶ～約２０ｍＶ、約２０ｍＶ～約１００ｍＶ、約２０ｍＶ～約９０ｍＶ、約２０ｍＶ～約８０ｍＶ、約２０ｍＶ～約７０ｍＶ、約２０ｍＶ～約６０ｍＶ、約２０ｍＶ～約５０ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約３０ｍＶ、約３０ｍＶ～約１００ｍＶ、約３０ｍＶ～約９０ｍＶ、約３０ｍＶ～約８０ｍＶ、約３０ｍＶ～約７０ｍＶ、約３０ｍＶ～約６０ｍＶ、約３０ｍＶ～約５０ｍＶ、約３０ｍＶ～約４０ｍＶ、約４０ｍＶ～約１００ｍＶ、約４０ｍＶ～約９０ｍＶ、約４０ｍＶ～約８０ｍＶ、約４０ｍＶ～約７０ｍＶ、約４０ｍＶ～約６０ｍＶ、および約４０ｍＶ～約５０ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１５ｍＶ～約４５ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、および約２５ｍＶ～約３５ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、および約１００ｍＶであり得る。
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、提供された最初の量に対して、調製後にナノ粒子組成物に封入されるかまたはそれ以外の方法で会合される、ポリヌクレオチドの量を示す。本明細書において使用されるとき、「封入」は、完全、実質的、または部分的な封止、閉じ込め、包囲、または内包を指し得る。
封入効率は、高いことが望ましい（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を、１つまたは複数の有機溶媒または界面活性剤でナノ粒子組成物を破壊する前と後で、比較することによって、測定することができる。
蛍光を使用して、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定してもよい。本明細書に記載のナノ粒子組成物について、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
本明細書に開示される医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、所望される標的および／もしくは用途、またはナノ粒子組成物の他の特性、ならびにポリヌクレオチドの特性に依存し得る。
例えば、ナノ粒子組成物において有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さ、または分子量として表される）、配列、および他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対的な量はまた、変動し得る。
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物およびポリヌクレオチドの相対的な量は、有効性および耐容性を考慮して最適化することができる。ｍＲＮＡをポリヌクレオチドとして含む組成物については、Ｎ：Ｐ比が、有用な測定法としての機能を果たし得る。
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比は、発現および耐容性の両方を調節するため、低いＮ：Ｐ比および強い発現を有するナノ粒子組成物が、望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質対ＲＮＡの比に応じて変動する。
一般に、低いＮ：Ｐ比が、好ましい。１つまたは複数のＲＮＡ、脂質、およびそれらの量は、約２：１～約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１であり得る。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、５：１～６：１である。１つの特定の態様では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示はまた、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子を産生する方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示される医薬組成物のうちのいずれかを使用し、当技術分野において公知の脂質ナノ粒子の産生方法に従って、脂質ナノ粒子を産生することを含む。例えば、Ｗａｎｇら、（２０１５年）「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．、８７巻、６８～８０頁；Ｓｉｌｖａら、（２０１５年）「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ． Ｐａｒｔ Ｉ： Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、９４０～９５４頁；Ｎａｓｅｒｉら、（２０１５年）「Ｓｏｌｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃａｒｒｉｅｒｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ａｄｖ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、５巻、３０５～１３頁；Ｓｉｌｖａら、（２０１５年）「Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」、Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、２９１～３０２頁、およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。
２５．他の送達剤
ａ．リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはこれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、ポリヌクレオチドによって誘導されるタンパク質の産生の有効性を改善することができるが、これは、これらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大させ得る、かつ／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させ得るためである。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるためにも使用することができる。
リポソームは、主として、脂質二重層から構成され得、医薬製剤の投与のための送達用ビヒクルとして使用することができる、人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのものであり得る。多ラメラ小胞（ＭＬＶ）は、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水溶性コンパートメントで分離された同心二重層系列を含有し得る。小単細胞小胞（ＳＵＶ）は、直径が５０ｎｍよりも小さくあり得、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、直径が５０～５００ｎｍであり得る。リポソーム設計は、限定されないが、非健常組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシスなどであるがこれに限定されない事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドを含み得る。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低いかまたは高いｐＨ値を含有してもよい。
リポソームの形態は、封止される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封止される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／もしくは送達中に付随する任意の追加のプロセス、意図される適用に最適な小胞のサイズ、多分散性、および保管寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチごとの再現性および拡張生成性などに依存し得る。
非限定的な例として、合成膜小胞などのリポソームは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６３８号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３７号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３６号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３５号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３４号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３３号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７５号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７３号、および同第ＵＳ２０１３０１８３３７２号に記載されている方法、装置、およびデバイスによって調製することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２０３０９０１号、同第ＷＯ２０１２００６３７８号、および同第ＷＯ２０１３０８６５２６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１８９３５１号、同第ＵＳ２０１３０１９５９６９号、および同第ＵＳ２０１３０２０２６８４号に記載されているように、リポソームに封入され得る、および／またはこれは、水溶性コアに格納され得、このコアが、次いで、リポソームに封入されてもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、カチオン性の水中油型エマルジョンにおいて製剤化されてもよく、ここで、エマルジョン粒子は、油性のコアおよびカチオン性脂質を含み、これらが、ポリヌクレオチドと相互作用し、分子をエマルジョン粒子に係留することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、親水相が分散された連続した疎水相を含む、油中水型エマルジョンにおいて製剤化され得る。例示的なエマルジョンは、国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号および同第ＷＯ２０１０８７７９１号に記載されている方法によって作製することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、脂質－ポリカチオン複合体において製剤化され得る。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０１７８７０２号に記載されている方法によって達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、および／またはポリアルギニン、ならびに国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号に記載されているカチオン性ペプチドなどであるが、これらに限定されない、カチオン性ペプチドまたはポリペプチドを含み得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号、同第ＷＯ２０１２１７０９３０号、同第ＷＯ２０１１１２７２５５号、および同第ＷＯ２００８１０３２７６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載されているものなどの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）において製剤化されてもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的に、１つまたは複数の脂質を含む。一部の実施形態では、脂質は、イオン化可能脂質（例えば、イオン化可能アミノ脂質である）。一部の実施形態では、脂質は、カチオン性脂質である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、および粒子の凝集を低減することができる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む、他の成分をさらに含む。
カチオン性脂質およびイオン化可能脂質としては、例えば、国際公開第ＷＯ２０１５１９９９５２号、同第ＷＯ２０１５１３０５８４号、同第ＷＯ２０１５０１１６３３号、および同第ＷＯ２０１２０４０１８４号、同第ＷＯ２０１３１２６８０３号、同第ＷＯ２０１１１５３１２０号、同第ＷＯ２０１１１４９７３３号、同第ＷＯ２０１１０９０９６５号、同第ＷＯ２０１１０４３９１３号、同第ＷＯ２０１１０２２４６０号、同第ＷＯ２０１２０６１２５９号、同第ＷＯ２０１２０５４３６５号、同第ＷＯ２０１２０４４６３８号、同第ＷＯ２０１００８０７２４号、同第ＷＯ２０１０２１８６５号、同第ＷＯ２００８１０３２７６号、および同第ＷＯ２０１３０８６３７３号、米国特許第７，８９３，３０２号、同第７，４０４，９６９号、同第８，２８３，３３３号、および同第８，４６６，１２２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２２４４４７号、同第ＵＳ２０１２０２９５８３２号、同第ＵＳ２０１５０３１５１１２号、同第ＵＳ２０１０００３６１１５号、同第ＵＳ２０１２０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１３００６４８９４号、同第ＵＳ２０１３０１２９７８５号、同第ＵＳ２０１３０１５０６２５号、同第ＵＳ２０１３０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３０１２３３３８号、および同第ＵＳ２０１３０２２５８３６号に記載されているものを挙げることができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、脂質組成物中のカチオン性脂質およびイオン化可能脂質の量は、約０．０１モル％～約９９モル％の範囲である。
例示的なイオン化可能脂質としては、本明細書に開示される化合物１～１４７のうちのいずれか１つ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ４－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なイオン化可能脂質としては、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル（ｄｉｍｅｍｙｌ）ヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル（ｄｉｍｅｉｈｙｌ）オクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ν，Ν－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－（ｅｐｔａｃｏｓ）－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロ（ｃｙｃＩｏ）プロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシル（ｕｎｄｅｃｙＩ）シクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ、１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メチル（ｍｅｔｏｙｌ）オクチル）オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－｛［８－（２－オクチル（ｏｃｌｙｌ）シクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、および（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミン、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含む。一部の実施形態では、リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、およびこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、およびこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、脂質組成物中のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣおよび／またはＭＳＰＣ）の量は、約１モル％～約２０モル％の範囲である。
構造脂質は、ステロールおよびステロール部分を含有する脂質を含む。一部の実施形態では、構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、およびこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。一部の実施形態では、脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０モル％～約６０モル％の範囲である。
本明細書に記載される第四級アミン化合物としては、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（１，２－ジオレオイルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、１，２－ジステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬＴＡＰ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、１，２－ジ－（９Ｚ－テトラデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１４：１ ＥＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１６：０－１８：１ ＥＰＣ）、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、脂質組成物中の第四級アミン化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ）の量は、約０．０１モル％～約２０モル％の範囲である。
ＰＥＧ修飾脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、およびＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一部の実施形態では、脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０．１モル％～約５モル％の範囲である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、透過性増強分子をさらに含み得る。非限定的な透過性増強分子は、米国公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ製剤は、ホスフェートコンジュゲートをさらに含有し得る。ホスフェートコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を増大させ得る、かつ／またはナノ粒子の標的化送達を増大させ得る。ホスフェートコンジュゲートは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載されている方法によって作製することができる。ＬＮＰ製剤はまた、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００５９３６０号、同第ＵＳ２０１３０１９６９４８号、および同第ＵＳ２０１３００７２７０９号に記載されているポリマーコンジュゲート（例えば、水溶性コンジュゲート）も含有し得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ製剤は、対象における本開示のナノ粒子の送達を増強するために、コンジュゲートを含み得る。さらに、コンジュゲートは、対象におけるファゴサイトーシスによるナノ粒子のクリアランスを阻害し得る。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計された「自己」ペプチド（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３３９巻、９７１～９７５頁によって説明されている「自己」粒子、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）であってもよい。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらによって示されているように、自己ペプチドは、マクロファージに媒介されるナノ粒子のクリアランスを遅延させ、これにより、ナノ粒子の送達が増強された。
ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含み得る。非限定的な例として、炭水化物担体としては、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型の材料、フィトグリコーゲンコハク酸オクテニル、フィトグリコーゲンベータ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ－デキストリンを挙げることができるが、これらに限定されない（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ＬＮＰ製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーでコーティングされ得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、米国公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載されているように、ＰＥＧコーティングおよび／または中性表面電荷を有するコーティングなどであるがこれらに限定されない、親水性コーティングでコーティングされ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ製剤は、米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載されているように、脂質ナノ粒子が粘膜壁を貫入することができるように、粒子の表面特性を変化させるように操作してもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
粘液を貫入するように操作されたＬＮＰは、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）および／またはポリマー－ビタミンコンジュゲートおよび／またはトリ－ブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートを挙げることができるが、これらに限定されない。
粘液を貫入するように操作されたＬＮＰはまた、表面改質剤、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例として、ジメチルジオクタデシル－アンモニウムブロミドなど）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルソリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、ならびにｒｈＤＮａｓｅを含む様々なＤＮａｓｅを含み得る。
一部の実施形態では、粘液貫入性ＬＮＰは、粘膜貫入を増強するコーティングを含む、低浸透圧製剤であり得る。製剤は、それが送達される上皮に対して、低浸透圧であり得る。低浸透圧製剤の非限定的な例は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、限定することなく、ＡＴＵＰＬＥＸＴＭ系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、ならびにＳｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）からの他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）からのＳＴＥＭＦＥＣＴＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、および核酸のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）もしくはプロタミンに基づく標的化および非標的化送達など、リポプレックスとして製剤化される（Ａｌｅｋｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００８年、６８巻、９７８８～９７９８頁；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１２年、５０巻、７６～７８頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００６年、１３巻、１２２２～１２３４頁；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００６年、１３巻、１３６０～１３７０頁；Ｇｕｔｂｉｅｒら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２０１０年、２３巻、３３４～３４４頁；Ｋａｕｆｍａｎｎら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ、２０１０年、８０巻、２８６～２９３頁、Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００９年、３２巻、４９８～５０７頁；Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００８年、３１巻、１８０～１８８頁；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ．、４巻、１２８５～１２９４頁；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋら、２０１１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３４巻、１～１５頁；Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００５年、２３巻、７０９～７１７頁；Ｐｅｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２００７年、６巻、１０４号、４０９５～４１００頁；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００８年、１９巻、１２５～１３２頁、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤化され、これは、１０～１０００ｎｍの平均直径を有する球形であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および／または乳化剤で安定化することができる、固体脂質コアマトリックスを有する。例示的なＳＬＮは、国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載されるものであり得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、調節放出および／または標的化送達のために製剤化され得る。本明細書において使用されるとき、「調節放出」は、治療的転帰を実現する特定の放出パターンに適合する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、調節放出および／または標的化送達のために、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野において公知の送達剤に封入され得る。本明細書において使用されるとき、「封入する」という用語は、封止、包囲、または内包することを意味する。これは、本開示の化合物の製剤化に関連するため、封入は、実質的か、完全か、または部分的であってもよい。「実質的に封入される」という用語は、本開示の医薬組成物または化合物のうちの少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９％よりも多く、または９９．９９９％よりも多くが、送達剤内に封止、包囲、または内包され得ることを意味する。「部分的封入」は、本開示の医薬組成物または化合物のうちの１０よりも少ない、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ未満が、送達剤内に封止、包囲、または内包され得ることを意味する。
有利なことに、封入は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を使用して、本開示の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって、判定することができる。例えば、本開示の医薬組成物または化合物のうちの少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％よりも多くが、送達剤に封入される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの調節放出製剤は、少なくとも１つの調節放出コーティング（例えば、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）、およびエチルセルロース水性分散液などのセルロース誘導体（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）およびＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標）））を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの調節放出製剤は、米国公開第ＵＳ２０１３０１３０３４８号に記載されているポリマー系、または米国特許第８，４０４，２２２号に記載されているＰＥＧおよび／もしくはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含み得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子に封入され得、本明細書において、「治療用ナノ粒子ポリヌクレオチド」と称され得る。治療用ナノ粒子は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、および同第ＷＯ２０１２０５４９２３号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、同第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、同第ＵＳ２０１２０１４０７９０号、同第ＵＳ２０１３０１２３３５１号、および同第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、および同第８，３１８，２１１号に記載されている方法によって製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、持続放出用に製剤化され得る。本明細書において使用されるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する、医薬組成物または化合物を指す。期間としては、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、および数年間が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１００７５０７２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号、および同第ＵＳ２０１３０１５０２９５号に開示されているように製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号、および同第ＷＯ２０１１０８４５１８号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号、および同第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載されているもののように、標的特異的となるように製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用して、調製することができる。例示的なマイクロ流体ミキサーとしては、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって製造されているものを含むがこれに限定されないスリット型インターデジタルマイクロミキサー、および／またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）を挙げることができるが、これらに限定されない（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔら、「Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２８巻、３６３３～４０頁（２０１２年）；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕら、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．、１巻、ｅ３７（２０１２年）；Ｃｈｅｎら、「Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１３４巻（１６号）、６９４８～５１頁（２０１２年）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例示的なマイクロミキサーとしては、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ、Ｍａｉｎｚ ＧｅｒｍａｎｙからのＳｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ－Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）またはＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）またはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ－ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＳＨＭを使用してＬＮＰを作製する方法は、少なくとも２つの入力ストリームを混合することをさらに含み、ここで、混合は、マイクロ構造に誘導されるカオス的移流（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｏｔｉｃ ａｄｖｅｃｔｉｏｎ）（ＭＩＣＡ）によって生じる。この方法によると、流体ストリームは、交互の流れを引き起こし、流体が互いにフォールディングされる、ヘリンボーンパターンに存在するチャネルを通って流れる。この方法はまた、表面の配向が、流体サイクリング中に変化する、流体混合のための表面を含み得る。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法には、米国公開第ＵＳ２００４０２６２２２３号および同第ＵＳ２０１２０２７６２０９号に開示されているものが含まれ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を使用して、脂質ナノ粒子において製剤化され得る（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．、「Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、４４２巻、３６８～３７３頁（２００６年）およびＡｂｒａｈａｍら、「Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５巻、６４７～６５１頁（２００２年）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ、ＵＫ）からのものなどであるがこれらに限定されない、マイクロミキサーチップを使用して、脂質ナノ粒子において製剤化され得る。マイクロミキサーチップは、分割および再混合の機構を用いて、２つまたはそれよりも多い流体ストリームの高速混合に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍおよび／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きいまたは１０００ｎｍより大きい直径を有し得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、より小さなＬＮＰを使用して送達することができる。そのような粒子は、０．１μｍ未満から最大１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満の直径を含み得る。
本明細書に記載されるナノ粒子およびマイクロ粒子は、マクロファージおよび／または免疫応答を調節するように、幾何形状を操作することができる。幾何形状を操作した粒子は、肺送達などであるがこれに限定されない、標的化送達のための本明細書に記載されるポリヌクレオチドを組み込むように、様々な形状、サイズ、および／または表面電荷を有し得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。幾何形状を操作した粒子の他の物理的特徴としては、穿孔、傾斜アーム、非対称性および表面の粗さ、細胞および組織との相互作用を変化させ得る電荷を挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子は、米国公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載されるものなどであるがこれに限定されない、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、２つまたはそれよりも多いポリマーを含み得るポリマーマトリックス、例えば、限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはこれらの組合せを含み得る。
ｂ．リピドイド
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、リピドイドとともに製剤化され得る。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を、調製することができ、それによって、局所的および／または全身的な投与経路を介したリピドイド製剤の注射後に、コードされるタンパク質の産生によって判断した場合に、ポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むがこれらに限定されない、様々な手段で投与され得る。
リピドイドの合成は、文献に記載されている（Ｍａｈｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、２０１０年、２１巻、１４４８～１４５４頁；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、２０１０年、２６７巻、９～２１頁；Ａｋｉｎｃら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００８年、２６巻、５６１～５６９頁；Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２０１０年、１０７巻、１８６４～１８６９頁；Ｓｉｅｇｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２０１１年、１０８巻、１２９９６～３００１頁を参照されたく、これらのすべては、その全体が本明細書に組み込まれる）。
ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニル）］－トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ；９８Ｎ１２－５としても公知である、Ｍｕｒｕｇａｉａｈら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０１巻、６１頁（２０１０年）を参照されたい）、Ｃ１２－２００（誘導体およびバリアントを含む）、ならびにＭＤ１を含むがこれらに限定されない、異なるリピドイドを用いた製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏ活性に関して試験することができる。リピドイド「９８Ｎ１２－５」は、Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、２００９年、１７巻、８７２～８７９頁によって開示されている。リピドイド「Ｃ１２－２００」は、Ｌｏｖｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２０１０年、１０７巻、１８６４～１８６９頁ならびにＬｉｕおよびＨｕａｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．、２０１０年、６６９～６７０頁によって開示されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドにおいて製剤化され得る。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法によって調製することができる。
リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、３つもしくは４つ、またはそれよりも多くの成分を含む、粒子を含み得る。リピドイドおよびリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開第ＷＯ２０１５０５１２１４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｃ．ヒアルロニダーゼ
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに注射（例えば、筋肉内または皮下注射）のためのヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質壁の構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって、組織透過性を増大させる（Ｆｒｏｓｔ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、（２００７年）４巻、４２７～４４０頁）。あるいは、ヒアルロニダーゼを使用して、筋肉内、腫瘍内、または皮下に投与されるポリヌクレオチドに曝露される細胞の数を増大させることができる。
ｄ．ナノ粒子模倣体
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ナノ粒子模倣体に封入されるおよび／または吸収される。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞などであるがこれらに限定されない送達機能を有する生物または粒子を模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非ビリオン（ｎｏｎ－ｖｉｒｏｎ）粒子に封入され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１２４１号および同第ＵＳ２０１３０１９５９６８号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｅ．ナノチューブ
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ロゼットナノチューブ、リンカーを伴うツイン塩基を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ、および／または単層カーボンナノチューブなどであるがこれらに限定されない、少なくとも１つのナノチューブに付着またはそうでなければ結合した（例えば、静電力、イオン、共有結合、および／または他の力を通じて）、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドを含むナノチューブおよびナノチューブ製剤は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｆ．自己アセンブル型ナノ粒子または自己アセンブル型巨大分子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達のための自己アセンブル型ナノ粒子または両親媒性巨大分子（ＡＭ）での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ＡＭは、アルキル化糖骨格がポリ（エチレングリコール）に共有結合した、生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液中において、ＡＭは、自己アセンブルしてミセルを形成する。核酸自己アセンブル型ナノ粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載され、ＡＭおよびＡＭを形成する方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０２１７７５３号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｇ．無機ナノ粒子、半導電性ナノ粒子および金属ナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、無機ナノ粒子、または半導電性材料もしくは金属材料を含む水分散性ナノ粒子での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。無機ナノ粒子は、限定されないが、水膨張性であるクレイ物質を含み得る。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子または親水性ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、無機、半導電性、および金属ナノ粒子は、例えば、米国特許第５，５８５，１０８号および同第８，２５７，７４５号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１２０２２８５６５号、同第ＵＳ２０１２０２６５００１号、および同第ＵＳ２０１２０２８３５０３号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｈ．外科用シーラント：ゲルおよびヒドロゲル
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、外科用シーラントでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ゲルおよびヒドロゲルなどの外科用シーラントは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｉ．懸濁液製剤
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、懸濁液での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、懸濁液は、ポリヌクレオチド、水非混和性油デポー、界面活性剤および／もしくは共界面活性剤、ならびに／または共溶媒を含む。懸濁液は、まず、ポリヌクレオチドの水溶液、および１つまたは複数の界面活性剤を含む油系相を調製し、次いで、２つの相（水相および油系相）を混合することによって、形成することができる。
懸濁液製剤のための例示的な油としては、ゴマ油およびミグリオール（飽和ココナッツ油およびパーム核油由来のカプリル酸およびカプリン脂肪酸のエステル、ならびにグリセリンまたはプロピレングリコールを含む）、トウモロコシ油、ダイズ油、ピーナツ油、ビーズワックス、ならびに／またはパームシード油が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な界面活性剤としては、クレモホール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール、ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）、ｌａｂｒａｓｏｌ、ミリスチン酸イソプロピル、および／またはＳｐａｎ ８０が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、懸濁液は、エタノール、グリセロール、および／またはプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない共溶媒を含み得る。
一部の実施形態では、懸濁液は、水非混和性デポーからの拡散による周囲環境へのポリヌクレオチドの放出を調節し、続いて、周囲環境（例えば、水性環境）への再可溶化をもたらし得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、注射するとエマルジョンが自発的に形成され（例えば、水相に送達されたときに）、それにより、油相から水相へのポリヌクレオチドの放出のための高い表面積対体積の比がもたらされ得るように、製剤化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ナノエマルジョンにおいて製剤化され、これは、液体疎水性コアが、脂質または界面活性剤の層で包囲またはコーティングされたものを含み得る。例示的なナノエマルジョンおよびそれらの調製は、例えば、米国特許第８，４９６，９４５号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｊ．カチオンおよびアニオン
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびにカチオンまたはアニオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、およびこれらの組合せを含む。例示的な製剤は、例えば、米国特許第６，２６５，３８９号および同第６，５５５，５２５号に記載されているように、金属カチオンと複合体を形成したポリマーおよびポリヌクレオチドを含み得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価および一価カチオンの組合せを含有し得る。カチオン性ナノ粒子またはカチオン性ナノ粒子を含む１つもしくは複数のデポーにおけるポリヌクレオチドの送達は、長時間作用するデポーとして作用することおよび／またはヌクレアーゼによる分解の速度を低減することによって、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを改善することができる。
ｋ．成形ナノ粒子およびマイクロ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、様々なサイズ、形状、および化学的性質の成形ナノ粒子での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例えば、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子は、ＬＩＱＵＩＤＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ）によるＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を使用して、作製することができる（例えば、国際公開第ＷＯ２００７０２４３２３号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、マイクロ粒子において製剤化される。マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドのコア、ならびにポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、およびポリ無水物を含むがこれらに限定されない生体適合性および／または生体分解性ポリマーの外皮を含有し得る。マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドを吸着するための吸着表面を有し得る。マイクロ粒子は、少なくとも１ミクロン～少なくとも１００ミクロン（例えば、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも９５ミクロン、および少なくとも１００ミクロン）の直径を有し得る。一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、マイクロ粒子およびポリヌクレオチドを含むマイクロエマルジョンである。例示的なマイクロ粒子、マイクロエマルジョン、およびそれらの調製物は、例えば、米国特許第８，４６０，７０９号、同第８，３０９，１３９号、および同第８，２０６，７４９号、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９８３０号、同第ＵＳ２０１３１９５９２３号、および同第ＵＳ２０１３０１９５８９８号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３０７５０６８号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｌ．ナノジャケットおよびナノリポソーム
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｎａｎｏ（Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）によるナノジャケットおよびナノリポソームでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸を含む体内で天然に見出される材料から作製され、少量のケイ酸もさらに含み得る。ナノジャケットは、５～５０ｎｍの範囲のサイズを有し得る。
ナノリポソームは、体内に天然に存在する脂質などであるがこれに限定されない脂質から作製される。ナノリポソームは、６０～８０ｎｍの範囲のサイズを有し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、セラミドナノリポソームなどであるがこれに限定されない、ナノリポソームにおいて製剤化される。
ｍ．細胞またはミニ細胞
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトされ、続いて対象に移植される、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。本明細書に開示されるポリヌクレオチドの細胞に基づく製剤を使用して、細胞へのトランスフェクション（例えば、細胞担体において）を確実にする、ポリヌクレオチドの生体分布を変化させる（例えば、細胞担体の標的を特定の組織もしくは細胞型に定めることによって）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させることができる。
例示的な細胞としては、赤血球、ウイロソーム、およびエレクトロポレーション細胞が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｇｏｄｆｒｉｎら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．、２０１２年、１２巻、１２７～１３３頁；Ｆａｎｇら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．、２０１２年、１２巻、３８５～３８９頁；Ｈｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２０１１年、１０８巻、１０９８０～１０９８５頁；Ｌｕｎｄら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．、２０１０年、２７巻、４００～４２０頁；Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅら、Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．、２００７年、１７巻、３９～４７頁；Ｃｕｓｉ、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ．、２００６年、２巻、１～７頁；ｄｅ Ｊｏｎｇｅら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００６年、１３巻、４００～４１１頁を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ウイルス媒介および非ウイルス媒介技法を含む様々な方法が、当技術分野において公知であり、核酸の細胞への導入に好適である。典型的な非ウイルス媒介技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介移入、マイクロインジェクション、マイクロ発射媒介移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介移入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびその他）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１１０８５２３１号および同第ＷＯ２０１３１１６６５６号、ならびに米国公開第２０１１０１７１２４８号に記載されている方法によって合成される、合成ウイルス様粒子（ＶＬＰ）において送達することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ソノポレーション、すなわち細胞超音波処理の技法は、細胞の原形質膜の透過性を修飾するために、音（例えば、超音波周波数）を使用することである。ソノポレーション法は、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸を送達することが公知である（ＹｏｏｎおよびＰａｒｋ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、２０１０年、７巻、３２１～３３０頁；ＰｏｓｔｅｍａおよびＧｉｌｊａ、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年、８巻、３５５～３６１頁；ＮｅｗｍａｎおよびＢｅｔｔｉｎｇｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００７年、１４巻、４６５～４７５頁；米国公開第ＵＳ２０１００１９６９８３号および同第ＵＳ２０１００００９４２４号、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって送達され得る。エレクトロポレーション技法は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび臨床で核酸を送達することが公知である（Ａｎｄｒｅら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１０年、１０巻、２６７～２８０頁；Ｃｈｉａｒｅｌｌａら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１０年、１０巻、２８１～２８６頁；Ｈｏｊｍａｎ、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１０年、１０巻、１２８～１３８頁、すべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。エレクトロポレーションデバイスは、これらに限定されないが、ＢＴＸ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）（例えば、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｓｙｓｔｅｍ）およびＩｎｏｖｉｏ（Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ、ＰＡ）（例えば、Ｉｎｏｖｉｏ ＳＰ－５Ｐ筋肉内送達デバイスまたはＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３０００皮内送達デバイス）を含め、世界中で多くの企業によって販売されている。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、微生物細胞、藻類細胞、および真菌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター、またはウシの細胞などであるがこれらに限定されない、哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＫＥＫ ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ－２、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ－Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ－１、Ｈｕｈ－７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ－９０、ＭＣＦ－７、Ｕ－２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むがこれらに限定されない、樹立細胞株に由来し得る。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ細胞、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞、Ｃａｎｄｉｄａ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ細胞などであるがこれらに限定されない、真菌細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は、大腸菌細胞、枯草菌細胞、またはＢＬ２１細胞などであるがこれらに限定されない、細菌細胞である。本開示の方法によってトランスフェクトされる初代細胞および二次細胞は、様々な組織から得ることができ、培養物中に維持することができるすべての細胞型を含むがこれらに限定されない。初代細胞および二次細胞としては、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、膠細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。初代細胞はまた、同じ種のドナーから、または別の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）から得ることもできる。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、細菌性ミニ細胞での本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む。非限定的な例として、細菌性ミニ細胞は、国際公開第ＷＯ２０１３０８８２５０号または米国公開第ＵＳ２０１３０１７７４９９号に記載されているものであり得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｎ．半固体組成物
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、半固体またはペースト様組成物を形成するために、疎水性マトリックスでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。非限定的な例として、半固体またはペースト様組成物は、国際公開第ＷＯ２０１３０７６０４号に記載されている方法によって作製することができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｏ．エクソソーム
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドをロードし、細胞、組織、および／または生物に送達することができる、エクソソームでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３０８４０００号に記載されているように、エクソソームにロードすることができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｐ．絹に基づく送達
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、絹に基づく送達のために製剤化された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。絹に基づく送達系は、絹フィブロイン溶液を、本明細書に記載されるポリヌクレオチドと接触させることによって、形成することができる。非限定的な例として、持続放出型絹に基づく送達系およびそのような系を作製する方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６１１号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｑ．アミノ酸脂質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質を用いた製剤である、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基および１つまたは複数の親油性尾部を含む、親油性化合物である。アミノ酸脂質およびアミノ酸脂質を作製する方法の非限定的な例は、米国特許第８，５０１，８２４号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合しそれを放出する、アミノ酸脂質を含む放出可能な形態で、ポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの放出は、例えば、米国特許第７，０９８，０３２号、同第６，８９７，１９６号、同第６，４２６，０８６号、同第７，１３８，３８２号、同第５，５６３，２５０号、および同第５，５０５，９３１号に記載されるように、酸不安定性リンカーによってもたらされ得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｒ．微細小胞
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、微細小胞製剤での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例示的な微細小胞としては、米国公開第ＵＳ２０１３０２０９５４４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。一部の実施形態では、微細小胞は、国際公開第ＷＯ２０１３１１９６０２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＡＲＲＤＣ１媒介型微細小胞（ＡＲＭＭ）である。
ｓ．多価電解質間複合体
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、多価電解質間複合体での、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。多価電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが、１つまたは複数のアニオン性分子と複合体を形成すると、形成される。電荷動的ポリマーおよび多価電解質間複合体の非限定的な例、ならびに多価電解質間複合体を作製する方法は、米国特許第８，５２４，３６８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｔ．結晶質ポリマー系
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶質ポリマー系での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。結晶質ポリマー系は、結晶質部分および／または結晶質部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第８，５２４，２５９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｕ．ポリマー、生体分解性ナノ粒子、およびコア－シェルナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに天然および／または合成のポリマーを含む。ポリマーとしては、ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生体分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐鎖ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾されたポロキサマー、弾性生体分解性ポリマー、生体分解性コポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、多重ブロックコポリマー、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生体分解性架橋型カチオン性多重ブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リシン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なポリマーとしては、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、例えば、限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）からのシクロデキストリン、デンドリマー、ならびにポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）、およびｐＨ応答性コ－ブロックポリマー、例えば、ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）が挙げられる。
ポリマー製剤により、ポリヌクレオチドの持続または遅延放出（例えば、筋肉内または皮下注射後の）が可能となる。ポリヌクレオチドの放出プロファイルの変化により、例えば、長期間にわたって、コードされるタンパク質の翻訳をもたらすことができる。また、ポリマー製剤を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を増大させることもできる。持続放出製剤としては、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、外科用シーラント、例えば、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、ＰＥＧ系シーラント、ならびにＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
非限定的な例として、修飾されたｍＲＮＡは、調整可能な放出速度（例えば、数日間および数週間）を有するＰＬＧＡマイクロスフェアを調製し、封入プロセスの間、修飾されたｍＲＮＡの完全性を維持しながら、修飾されたｍＲＮＡをＰＬＧＡマイクロスフェアに封入することによって、ＰＬＧＡマイクロスフェアにおいて製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出型インプラント適用において広く使用されている非生体分解性の生体適合性ポリマーである（例えば、延長放出製品、緑内障のためのピロカルピン眼内インサートであるＯｃｕｓｅｒｔまたは持続放出プロゲステロン子宮内避妊器具であるｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ；経皮送達系、Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、およびＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ；カテーテル）。ポロキサマーＦ－４０７ ＮＦは、５℃よりも低い温度では低粘度であり、１５℃よりも高い温度では固形ゲルを形成する、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンの親水性の非イオン性界面活性剤トリブロックコポリマーである。
非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載されているように、ＰＬＬがグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物とともに、製剤化されてもよい。別の非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号、ならびに米国特許第８，２３６，３３０号および同第８，２４６，９６８号を参照されたい）、またはＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号を参照されたい）などのブロックコポリマーとともに製剤化されてもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）、またはこれらの組合せなどであるがこれらに限定されない、少なくとも１つのアミン含有ポリマーとともに製剤化されてもよい。例示的なポリアミンポリマーおよび送達剤としてのそれらの使用は、例えば、米国特許第８，４６０，６９６号、同第８，２３６，２８０号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，６９６，０３８号、同第６，５１７，８６９号、同第６，２６７，９８７号、同第６，２１７，９１２号、同第６，６５２，８８６号、同第８，０５７，８２１号、および同第８，４４４，９９２号、米国公開第ＵＳ２００３００７３６１９号、同第ＵＳ２００４０１４２４７４号、同第ＵＳ２０１００００４３１５号、同第ＵＳ２０１２００９１４５号、および同第ＵＳ２０１３０１９５９２０号、ならびに国際公開第ＷＯ２００６０６３２４９号および同第ＷＯ２０１３０８６３２２号に記載されているように、生体分解性カチオン性リポポリマー、生体分解性ポリマー、または生体分解性コポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、生体分解性ポリエステルポリマー、線形生体分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生体分解性架橋型カチオン性多重ブロックコポリマー、またはこれらの組合せにおいて、製剤化されてもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１８４４５３号に記載されているように、少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１０６０７２号、同第ＷＯ２０１３１０６０７３号、および同第ＷＯ２０１３１０６０８６号に記載されているように、少なくとも１つの架橋型カチオン結合ポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０２３１２８７号に記載されているように、少なくともＰＥＧ化アルブミンポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、および／または他の生体分解性薬剤、例えば、限定されないが、リン酸カルシウムの組合せを使用して、ナノ粒子として製剤化され得る。成分は、送達用のナノ粒子の微調整を可能にするために、コア－シェル、ハイブリッド、および／または積層（ｌａｙｅｒ－ｂｙ－ｌａｙｅｒ）構造で、組み合わせてもよい（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．、２００６年、５巻、７９１～７９６頁；Ｆｕｌｌｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．、２００８年、２９巻、１５２６～１５３２頁；ＤｅＫｏｋｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．、２０１１年、６３巻、７４８～７６１頁；Ｅｎｄｒｅｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．、２０１１年、３２巻、７７２１～７７３１頁；Ｓｕら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．、２０１１年６月６日、８巻（３号）、７７４～８７頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、ナノ粒子は、複数のポリマー、例えば、限定されないが、親水性－疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、および／または親水性ポリマー（国際公開第ＷＯ２０１２０２２５１２９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含み得る。
コア－シェルナノ粒子の使用は、さらに、カチオン性架橋型ナノゲルコアおよび様々なシェルを合成するための高スループットのアプローチに焦点を当てている（Ｓｉｅｇｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２０１１年、１０８巻、１２９９６～１３００１頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内部移行は、ナノ粒子のコア成分およびシェル成分の両方における化学組成を変化させることによって、正確に調節することができる。例えば、コア－シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合した後、ｓｉＲＮＡをマウスの肝細胞に効率的に送達することができる。
一部の実施形態では、中間のＰＬＧＡ層および外側のＰＥＧを含有する中性脂質層を含む、中空脂質コアを、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの送達に使用することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのコア、およびコアにあるポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載されるポリマーのいずれかであってよく、当技術分野において公知であり、ポリマーシェアルを使用して、コアにあるポリヌクレオチドを保護することができる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドとともに使用するためのコア－シェルナノ粒子は、米国特許第８，３１３，７７７号または国際公開第ＷＯ２０１３１２４８６７号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｖ．ペプチドおよびタンパク質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大させるため、および／またはポリヌクレオチドの生体分布を変化させるため（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることによって）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質を用いて製剤化された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１１０６３６号および同第ＷＯ２０１３１２３２９８号）。一部の実施形態では、ペプチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９７２６号、同第ＵＳ２０１３０１３７６４４号、および同第ＵＳ２０１３０１６４２１９号に記載されているものであり得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｗ．コンジュゲート
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、担体もしくは標的化基に共有結合しているか、または一緒になって融合タンパク質を産生する２つのコード領域（例えば、標的化基および治療用タンパク質もしくはペプチドを有する）をコンジュゲートとして含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。コンジュゲートは、ナノ粒子を、組織もしくは生物におけるニューロンに選択的に指向させるか、または血液脳関門を越えるのを補助する、ペプチドであり得る。
コンジュゲートは、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を含む。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル－マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸（ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ））、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの担体としての機能を果たし得る。コンジュゲートは、カチオン性ポリマー、例えば、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）にグラフトされ得るポリアミン、ポリリシン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミンを含み得る。例示的なコンジュゲートおよびそれらの調製物は、米国特許第６，５８６，５２４号および米国公開第ＵＳ２０１３０２１１２４９号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
コンジュゲートはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、指定された細胞型、例えば、腎臓細胞に結合する抗体を含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特定の親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基はまた、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。これらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フルクトース、またはアプタマーを含み得る。リガンドは、例えば、リポポリ多糖、またはｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
標的化基は、特定の受容体を標的とすることができる任意のリガンドであり得る。例としては、限定することなく、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アパタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられる。特定の実施形態では、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、未修飾であってもよく、または本明細書に開示される修飾のうちの任意の組合せを有してもよい。非限定的な例として、標的化基は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３０２１６６１０１２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、血液－中枢神経系関門を越えた標的化送達のための、グルタチオン受容体（ＧＲ）結合性コンジュゲートであり得る。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、相乗的生体分子－ポリマーコンジュゲートであってもよく、これは、より優れた治療的有効性を提供するための長時間作用型連続放出系を含む。相乗的生体分子－ポリマーコンジュゲートは、米国公開第ＵＳ２０１３０１９５７９９号に記載されているものであり得る。一部の実施形態では、コンジュゲートは、国際特許公開第ＷＯ２０１２０４０５２４号に記載されているアプタマーコンジュゲートであってもよい。一部の実施形態では、コンジュゲートは、米国特許第８，５０７，６５３号に記載されているアミン含有ポリマーコンジュゲートであってもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）にコンジュゲートされ得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、シグナル配列または標的化配列も含み得る、細胞貫入性ポリペプチドに共有結合でコンジュゲートされる。コンジュゲートは、増大した安定性および／または増大した細胞トランスフェクション、および／または変化した生体分布（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とする）を有するように、設計され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、送達を増強する薬剤にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、薬剤は、モノマーまたはポリマー、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１０６２９６５号に記載されている、標的化モノマーまたは標的化ブロックを有するポリマーであり得る。一部の実施形態では、薬剤は、例えば、米国特許第６，８３５，３９３号および同第７，３７４，７７８号に記載されているように、ポリヌクレオチドに共有結合された輸送剤であってもよい。一部の実施形態では、薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号および同第８，００３，１２９号に記載されているものなど、膜壁輸送増強剤であってもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｘ．小器官
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、長期間持続する治療製剤において目的のコードされるポリペプチドを発現することができる小器官での本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例示的な小器官および製剤は、国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号に記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｙ．シュードビリオン
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、シュードビリオン（例えば、Ａｕｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡによって開発されたシュードビリオン）において本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを送達するために使用されるシュードビリオンは、ウイルス、例えば、限定されないが、例として、米国公開第ＵＳ２０１３００１２４５０号、同第ＵＳ２０１３００１２５６６号、同第ＵＳ２１０３００１２４２６号、および同第ＵＳ２０１２０２０７８４０号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３００９７１７号に記載されているヘルペスおよびパピローマウイルスに由来し得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
シュードビリオンは、米国公開第ＵＳ２０１２００１５８９９号および同第ＵＳ２０１３０１７７５８７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１００４７８３９号、同第ＷＯ２０１３１１６６５６号、同第ＷＯ２０１３１０６５２５号、および同第ＷＯ２０１３１２２２６２号に記載されている方法によって調製される、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得る。一態様では、ＶＬＰは、バクテリオファージＭＳ、Ｑβ、Ｒ１７、ｆｒ、ＧＡ、Ｓｐ、ＭＩ、Ｉ、ＭＸＩ、ＮＬ９５、ＡＰ２０５、ｆ２、ＰＰ７、ならびに植物ウイルスであるカブクリンクルウイルス（ＴＣＶ）、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、インゲンマメ南部モザイクウイルス（ＳＢＭＶ）、ならびにソラマメモットルウイルス、ブロムモザイクウイルス、カシア黄輪点ウイルス（Ｃａｓｓｉａ ｙｅｌｌｏｗ ｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｕｓ）、ササゲクロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）、メランドリウム黄斑点ウイルス（Ｍｅｌａｎｄｒｉｕｍ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ）、およびスプリングビューティ潜在ウイルス（ｓｐｒｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）を含むｇｅｎｕｓ Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓのメンバーであり得る。別の態様では、ＶＬＰは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７５８７号および米国特許第８，５０６，９６７号に記載されているように、インフルエンザウイルスに由来し得る。一態様では、ＶＬＰは、国際公開第ＷＯ２０１３１１６６５６号に記載されているものなど、粒子の脂質膜または外側に係留した、Ｂ７－１および／またはＢ７－２分子を含み得る。一態様では、ＶＬＰは、国際公開第ＷＯ２０１２０４９３６６号に記載されているＶＬＰなど、ノロウイルス、ロタウイルス、組換えＶＰ６タンパク質、または二重層ＶＰ２／ＶＰ６に由来し得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、シュードビリオンは、国際公開第ＷＯ２０１０１２０２６６号および米国公開第ＵＳ２０１２０１７１２９０号に記載されているヒトパピローマウイルス様粒子であり得る。一部の実施形態では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、自己アセンブル型粒子であってもよい。一態様では、シュードビリオンは、米国公開第ＵＳ２０１３０１１６４０８号および同第ＵＳ２０１３０１１５２４７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３１１９８７７号に記載されている、ビリオン由来のナノ粒子であり得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの製剤およびそれを製剤化するための方法の非限定的な例はまた、国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提供されている。
２６．使用のための組成物および製剤
本開示のある特定の態様は、上記に開示されているポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、組成物または製剤を対象とする。
一部の実施形態では、組成物または製剤は、
（ｉ）ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含み（例えば、ウラシルのうちの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、５－メトキシウラシルである）、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位）をさらに含む、ポリヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～１４７のうちのいずれか（例えば、化合物１８、２５、２６、もしくは４８）、または化合物１～２３２のうちのいずれかを含む、送達剤
を含む。
一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最小ウラシルまたはチミン含量に対する、ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％～約１５０％である。
一部の実施形態では、上述のポリヌクレオチド、組成物、または製剤は、ＩＬ１２関連疾患、障害、または状態、例えば、がんを処置および／または予防するために使用される。
２７．投与の形態
上述の本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、および製剤は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらとしては、腸内（腸に）、胃腸内、硬膜外（硬膜に）、経口（口から）、経皮、硬膜上、脳内（大脳に）、側脳室内（脳室内に）、皮膚上（皮膚の上への適用）、皮内（皮膚そのものに）、皮下（皮膚の下に）、鼻内投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入もしくは注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（病理学的腔に）、腔内（陰茎の基底部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経膣、吹送（吸飲）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、点耳、耳介（耳にもしくは耳への）、頬内（頬への）、結膜、皮膚、歯科的（１つまたは複数の歯に）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内部）、尾内（馬尾内部）、脳槽内（小脳延髄槽大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）内部）、角膜内（角膜内部）、歯冠内、冠内（冠動脈内）、陰茎海綿体内（陰茎の陰核海綿体の膨張性空隙内）、椎間板内（椎間板内部）、導管内（腺導管内部）、十二指腸内（十二指腸内部）、硬膜内（硬膜内部もしくはその下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内部）、歯肉内（歯肉内部）、回腸内（小腸遠位部分内部）、病巣内（局在化した病変部の内部もしくはそこへの直接的な導入）、管腔内（管腔内部）、リンパ管内（リンパ内部）、髄内（骨髄腔内部）、髄膜内（髄膜内部）、眼内（眼内部）、卵巣内（卵巣内部）、心膜内（心膜内部）、胸膜内（胸膜内部）、前立腺内（前立腺腺内部）、肺内（肺もしくはその気管支内部）、副鼻腔内（鼻洞または眼窩周囲洞内部）、脊髄内（脊柱内部）、滑液嚢内（関節の滑液腔内部）、腱内（腱内部）、精巣内（精巣内部）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部）、胸郭内（胸郭内部）、小管内（器官の細管内部）、腫瘍内（腫瘍内部）、鼓室内（中耳内部）、血管内（１つまたは複数の血管内部）、脳室内（脳室内部）、イオン注入（可溶性塩イオンが身体の組織に移動する電流を用いて）、灌注（開放創傷部もしくは体腔を浸漬するかもしくは洗い流すため）、喉頭（喉頭に直接的に）、鼻腔胃（鼻を通じて胃内に）、閉塞的包帯技法（後で領域を閉鎖する包帯剤によって被覆する局所投与経路）、眼部（外眼部に）、中咽頭（口および咽頭に直接的に）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所的もしくは全身的な効果のための経口もしくは経鼻吸入により気道内部へ）、眼球後（脳橋背後もしくは眼球背後）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤性（胎盤を通じてもしくはそれを越えて）、経気管（気管壁を通じて）、経鼓膜（鼓室を越えてまたはそれを通じて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、または脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を越えることを可能にする様式で、投与され得る。特定の実施形態では、ある投与経路のための製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド、またはその機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、裸で細胞に送達され得る。本明細書において使用されるとき、「裸で」とは、トランスフェクションを促進する薬剤なしで、ポリヌクレオチドを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチドは、修飾を含有しない場合がある。裸のポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して、細胞に送達することができる。
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド、またはその機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド）は、本明細書に記載される方法を使用して、製剤化することができる。製剤は、修飾されていてもよく、および／または未修飾であってもよい、ポリヌクレオチドを含有し得る。製剤は、限定されないが、細胞貫入剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体浸食性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含み得る。製剤化されたポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して、細胞に送達することができる。
組成物はまた、直接的含浸もしくは浸漬、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／または滴下薬によって、組成物をコーティングまたは含浸させた繊維材料もしくは生体分解性材料などの物質を使用して、およびその他を含むがこれらに限定されない、いくつかの手段のうちのいずれかで、器官または組織に直接的に送達するために、製剤化され得る。
本開示は、非経口および注射による投与に好適な形態での、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、ならびに／またはＩＬ１２ＢおよびＩＬ１２Ａの融合ポリペプチド、またはその機能的断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の送達を包含する。非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野において広く使用されている不活性希釈剤、例えば、例として、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（得に、綿実油、落花生油、トウモロコシ由、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、ならびに／または芳香剤などのアジュバントを含み得る。ある特定の実施形態では、非経口投与のために、組成物は、可溶化剤、例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組合せと混合される。
非経口投与のための医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。使用される不活性成分のいずれかが、ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）に認可されていてもよく、どれも認可されていなくてもよい。非経口投与のための医薬組成物において使用するための不活性成分の徹底的ではない一覧には、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および水酸化ナトリウムが含まれる。
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性懸濁液または油質懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を使用して、公知の技術によって製剤化され得る。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口で許容される希釈剤および／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、および／またはエマルジョン、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液であり得る。許容されるビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液を用いることができる。滅菌の固定油が、従来的に、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的で、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激な固定油が用いられ得る。脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射用の調製物において使用することができる。滅菌製剤はまた、局所的麻酔剤、保存剤、および緩衝剤などのアジュバントも含み得る。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって滅菌してもよく、および／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌してもよい。
注射用製剤は、組織、器官、および／または対象の領域への直接的な注射のためのものであり得る。非限定的な例として、組織、器官、および／または対象に、虚血性領域への心筋内注射によって製剤を直接的に注射してもよい。（例えば、Ｚａｎｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１３年を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
活性成分の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが望ましい場合が多い。これは、水溶性が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。そのため、薬物の吸収の速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、結晶のサイズおよび結晶質の形態に依存し得る。あるいは、非経口で投与される薬物形態の吸収の遅延は、薬物を、油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマーに、薬物のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって、作製される。薬物対ポリマーの比、および用いられる具体的なポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を調節することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤は、薬物を、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに封止することによって調製される。
２８．キットおよびデバイス
ａ．キット
本開示は、本開示の特許請求されるヌクレオチドを都合良く、および／または効率的に使用するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の処置を実施する、および／または複数の実験を実施するのを可能にするための十分な量および／または数の成分を含むであろう。
一態様では、本開示は、本開示の分子（ポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。
前記キットは、翻訳可能領域を含む第１のポリヌクレオチドを含むタンパク質産生のためのものであってもよい。キットは、製剤組成物を形成するためのパッケージングおよび指示ならびに／または送達剤をさらに含んでもよい。送達剤は、生理食塩水、緩衝化溶液、リピドイドまたは本明細書に開示される任意の送達剤を含んでもよい。
一部の実施形態では、緩衝溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩および／またはＥＤＴＡを含んでもよい。別の実施形態では、緩衝溶液としては、限定されるものではないが、生理食塩水、２ｍＭカルシウムを含む生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムおよびマンノースを含む塩化ナトリウムが挙げられる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号を参照されたい）。さらなる実施形態では、緩衝溶液を沈降させるか、または凍結乾燥させることができる。各成分の量を、一貫した、再現可能な、より高い濃度の生理食塩水または単純な緩衝液製剤を可能にするために変化させることができる。また、一定期間にわたって、および／または様々な条件下で、緩衝溶液中の修飾されたＲＮＡの安定性を増大させるために、成分を変化させてもよい。一態様では、本開示は、標的細胞中に導入された場合に翻訳可能領域によってコードされる所望の量のタンパク質を生成するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド；細胞の先天性免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害核酸を含む第２のポリヌクレオチド；ならびにパッケージングおよび指示を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を呈する、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、ならびにパッケージングおよび指示を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を呈する、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、および第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳にとって好適な哺乳動物細胞を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
ｂ．デバイス
本開示は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んでもよいデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定な製剤中に、ヒト患者などの、それを必要とする対象に即時に送達することができる製剤中でポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
投与のためのデバイスを用いて、本明細書に教示される単回、複数回または分割投薬レジメンに従って本開示のポリヌクレオチドを送達することができる。そのようなデバイスは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に教示されている。
細胞、器官および組織への複数回投与のための当技術分野で公知の方法およびデバイスは、本開示の実施形態として本明細書に開示される方法および組成物と一緒に使用するために企図される。これらのものとしては、例えば、複数の針、例えば、管腔またはカテーテルを用いるハイブリッドデバイスならびに熱、電流または放射線により駆動される機構を利用するデバイスを有する方法およびデバイスが挙げられる。
本開示によれば、これらの複数回投与デバイスを利用して、本明細書で企図される単回、複数回、または分割用量を送達することができる。そのようなデバイスは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に教示されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３つの異なる、任意選択で、隣接する部位に、同時に、または６０分間以内に、少なくとも３つの針を介して、皮下的または筋肉内的に投与される（例えば、同時に、または６０分間以内に、４、５、６、７、８、９、または１０の部位への投与）。
ｃ．カテーテルおよび／または管腔を利用する方法およびデバイス
カテーテルおよび管腔を使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割投薬スケジュールで本開示のポリヌクレオチドを投与することができる。そのような方法およびデバイスは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載されている。
ｄ．電流を利用する方法およびデバイス
電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本明細書に教示される単回、複数回、または分割投薬レジメンに従って本開示のポリヌクレオチドを送達することができる。そのような方法およびデバイスは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載されている。
２９．定義
本開示をより容易に理解することができるようにするために、ある特定の用語を最初に定義する。本出願で使用される場合、別途、本明細書に明示的に提供されない場合を除いて、以下の用語はそれぞれ、以下に記載される意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願を通して記載される。
本開示は、群の正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスの中に存在する、中で用いられる、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。本開示は、群のメンバーの１つより多く、または全部が、所与の生成物またはプロセスの中に存在する、中で用いられる、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」と「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では互換的に使用することができる。ある特定の態様では、用語「ａ」または「ａｎ」は、「単一」を意味する。他の態様では、用語「ａ」または「ａｎ」は、「２つまたはそれよりも多い（ｔｗｏ ｏｒ ｍｏｒｅ）」または「複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）」を含む。
さらに、本明細書で使用される場合、「および／または」は、他のものを含む、または含まない、２つの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示と取られるべきである。したがって、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される場合の用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」「Ａ」（のみ）、および「Ｂ」（のみ）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で使用される場合の用語「および／または」は、以下の態様：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；ならびにＣ（のみ）のそれぞれを包含することが意図される。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ、第２版、２００２年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、改訂版、２０００年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
態様が、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に本明細書に記載される場合はどこでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に関して記載される別の同様の態様も提供される。
単位、接頭辞、および記号は、そのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）に受け入れられる形態で記載される。数値範囲は、その範囲を規定する数字を包含する。値の範囲が記載される場合、その範囲の記載される上限と下限の間の、それぞれの介在する整数値、およびそのそれぞれの分数も、そのような値の間のそれぞれの部分的範囲と共に具体的に開示されると理解されるべきである。任意の範囲の上限および下限は、その範囲に独立に含まれてもよく、またはそれから除外されてもよく、いずれかの限界、いずれでもない限界、または両方の限界が含まれる場合のそれぞれの範囲も、本開示に包含される。ある値が明示的に記載される場合、記載される値とおよそ同じ数量または量である値も、本開示の範囲内にあることが理解されるべきである。組合せが開示される場合、その組合せの要素のそれぞれの部分的組合せも、具体的に開示され、本開示の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素群が個別に開示される場合、その組合せも開示される。ある開示の任意の要素が、複数の代替物を有すると開示される場合、それぞれの代替物が、単独で、または他の代替物との任意の組合せで除外されるその開示の例も、本明細書に開示される；ある開示の１つより多い要素は、そのような除外を有してもよく、そのような除外を有する要素の全ての組合せが本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、その一般的に許容される１文字コードによって記載される。別途指摘しない限り、核酸は、左から右に、５’から３’の方向に書かれる。核酸塩基は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるその一般的に公知の１文字記号によって記載される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸は、本明細書では、その一般的に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号によって記載される。別途指摘しない限り、アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの方向に書かれる。
約：本明細書および特許請求の範囲を通して数値と共に使用される用語「約」は、当業者が精通し、許容可能な、正確性の区間を指す。一般に、そのような正確性の区間は、±１０％である。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。さらに、別途指摘しない限り、または文脈および当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表現される値は、本文が別途明確に記述しない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１までの、本開示の異なる実施形態における任意の特定の値または記述される範囲内の部分範囲とみなすことができる。
組合せでの投与：本明細書で使用される場合、用語「組合せでの投与」または「組合せ投与」は、２つまたはそれよりも多い薬剤が、同時に、または患者に対する各薬剤の効果の重複が存在してもよいような間隔の中で対象に投与されることを意味する。一部の実施形態では、それらは互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。一部の実施形態では、薬剤の投与は、組合せ（例えば、相乗的）効果が達成されるように、一緒に十分に近い間隔で行われる。
アミノ酸置換：用語「アミノ酸置換」とは、親配列または参照配列（例えば、野生型ＩＬ１２配列）中に存在するアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。あるアミノ酸を、例えば、化学的ペプチド合成により、または当技術分野で公知の組換え方法により、親配列または参照配列（例えば、野生型ＩＬ１２ポリペプチド配列）中で置換することができる。したがって、「Ｘ位での置換」に対する参照は、Ｘ位に存在するアミノ酸の、代替的なアミノ酸残基による置換を指す。一部の態様では、置換パターンを、スキーマＡｎＹ（式中、Ａはｎ位に自然に、または元々存在するアミノ酸に対応する１文字コードであり、Ｙは置換アミノ酸残基である）に従って記載することができる。他の態様では、置換パターンを、スキーマＡｎ（ＹＺ）（式中、ＡはＸ位に自然に、または元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字コードであり、ＹおよびＺは、代替的な置換アミノ酸残基である）に従って記載することができる。
本開示の文脈では、置換（アミノ酸置換を指す場合であっても）は、核酸レベルで行われる、すなわち、あるアミノ酸残基の、代替的なアミノ酸残基による置換は、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」とは、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階にあるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、畜牛、霊長類、またはブタ）である。一部の実施形態では、動物としては、限定されるものではないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。
およそ：目的の１つまたは複数の値に適用される、本明細書で使用される場合、用語「およそ」とは、記述される参照値と類似する値を指す。ある特定の実施形態では、用語「およそ」は、別途記述しない限り、または別途文脈から明らかでない限り、記述される参照値のいずれかの方向（その値を超えるまたはその値未満）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内にある値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
と関連する：疾患に関して本明細書で使用される場合、用語「と関連する」は、問題の症状、測定値、特徴、または状態が、その疾患の診断、発症、存在、または進行を関連することを意味する。関連は、必須ではないが、疾患と原因として関連していてもよい。例えば、がん患者の生活の質の低下を引き起こす症状、後遺症、または任意の効果は、がんと関連すると考えられ、本開示の一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することによって処置、改善、または予防することができる。
２つまたはそれよりも多い部分に関して使用される場合、用語「と会合する」、「コンジュゲートする」、「連結する」、「付着する」、および「係留する」は、２つまたはそれよりも多い部分に関して使用される場合、その部分が、直接的に、または連結剤として働く１つもしくは複数の追加の部分を介して、互いに物理的に会合、または接続されて、構造が使用される条件下、例えば、生理的条件下で、部分が物理的に会合したままとなるように十分に安定な構造を形成する。「会合」は、厳密に直接的な共有化学結合によるものである必要はない。それはまた、「会合した」実体が物理的に会合したままであるような十分に安定な接続性に基づくイオンもしくは水素結合またはハイブリダイゼーションも示唆してもよい。
二官能性：本明細書で使用される場合、用語「二官能性」とは、少なくとも２つの機能を行うことができる、または維持する任意の物質、分子または部分を指す。この機能は、同じ転帰または異なる転帰に影響してもよい。機能をもたらす構造は、同じであっても、または異なっていてもよい。例えば、本開示の二官能性の修飾されたＲＮＡは、ＩＬ１２ペプチド（第１の機能）をコードしてもよいが、コードＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自身、ＲＮＡの半減期を延長することができる（第２の機能）。この例では、タンパク質欠損症に罹患している対象への二官能性の修飾されたＲＮＡの送達は、疾患または状態を改善または処置することができるペプチドまたはタンパク質分子を生成するだけでなく、長期間にわたって対象中に存在する修飾されたＲＮＡ集団を維持するであろう。他の態様では、二官能性の修飾されたｍＲＮＡは、例えば、ＩＬ１２ペプチド（第１の機能）および第１のタンパク質に融合されるか、または第１のタンパク質と同時発現される第２のタンパク質をコードするＲＮＡを含むキメラ分子であってもよい。
生体適合性：本明細書で使用される場合、用語「生体適合性」は、免疫系による傷害、毒性または拒絶のリスクが小さいか、またはリスクがなく、生細胞、組織、器官、または系と適合することを意味する。
生分解性：本明細書で使用される場合、用語「生分解性」は、生物の作用によって無害な生成物に破壊できることを意味する。
生物活性：本明細書で使用される語句「生物活性」とは、生物系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合、その生物に対する生物学的効果を有する物質は、生物活性であると考えられる。特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部でも生物活性であるか、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物活性であると考えることができる。
キメラ：本明細書で使用される場合、「キメラ」は、２つまたはそれよりも多い、一致しない、または異種である部分または領域を有する実体である。例えば、キメラ分子は、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａポリペプチドの両方を含む第１の部分と、第２の治療タンパク質（例えば、異なる酵素活性、抗原結合部分、またはＩＬ１２の血漿半減期を延長することができる部分、例えば、抗体のＦｃ領域を含むタンパク質）を含む第２の部分（例えば、第１の部分に遺伝的に融合される）とを含んでもよい。
配列最適化：用語「配列最適化」とは、参照核酸配列中の核酸塩基が代替的な核酸塩基と置き換えられ、特性が改善された、例えば、タンパク質発現が改善された、または免疫原性が減少した核酸配列をもたらすプロセスまたは一連のプロセスを指す。
一般に、配列最適化における目標は、参照ヌクレオチド配列によってコードされる同じポリペプチド配列をコードする同義のヌクレオチド配列を生成することである。したがって、参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに関して、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド中にはアミノ酸置換（コドン最適化の結果として）はない。
コドン置換：配列最適化の文脈における用語「コドン置換」または「コドン置き換え」とは、参照核酸配列中に存在するコドンを、別のコドンと置き換えることを指す。コドンを、参照核酸配列中で、例えば、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成により、または組換え方法により置換することができる。したがって、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）中、または核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）のある特定の領域もしくは部分配列内のある特定の位置での「置換」または「置き換え」に対する参照は、そのような位置または領域のコドンの、代替的なコドンとの置換を指す。
本明細書で使用される場合、用語「コード領域」および「コードする領域」およびその文法的なバリアントは、発現時に、ポリペプチドまたはタンパク質をもたらすポリヌクレオチド中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
化合物：本明細書で使用される場合、用語「化合物」は、記載される構造の全ての立体異性体および同位体を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、用語「立体異性体」は、化合物の任意の幾何異性体（例えば、ｃｉｓ－およびｔｒａｎｓ－異性体）、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何異性的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）および鏡像異性体と立体異性体の混合物、例えば、ラセミ体を含む、本明細書に記載の化合物の任意かつ全ての立体異性体を包含する。化合物の鏡像異性体と立体異性体の混合物およびそれらを、その成分である鏡像異性体または立体異性体に分解する手段は、周知である。「同位体」とは、同じ原子番号を有するが、核中の中性子数が異なる結果、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体としては、三重水素および重水素が挙げられる。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体を、日常的な方法により、溶媒または水分子と組み合わせて調製して、溶媒和物および水和物を形成させることができる。
接触させること：本明細書で使用される場合、用語「接触」は、２つまたはそれよりも多い実体の間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞と、ナノ粒子組成物との接触は、哺乳動物細胞とナノ粒子とに、物理的接続を共有させることを意味する。ｉｎ ｖｉｖｏとｅｘ ｖｉｖｏの両方において細胞を外部的実体と接触させる方法は、生物分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物と、哺乳動物内に配置された哺乳動物細胞との接触を、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下）により実施することができ、可変量のナノ粒子組成物を含んでもよい。さらに、１つより多い哺乳動物細胞を、ナノ粒子組成物によって接触させることができる。
保存的アミノ酸置換：「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）を含む。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸で置き換えられる場合、アミノ酸置換は保存的であると考えられる。別の態様では、一続きのアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成において異なる構造的に類似する一続きのもので保存的に置き換えることができる。
非保存的アミノ酸置換：非保存的アミノ酸置換としては、（ｉ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓもしくはＬｙｓ）が、電気陰性残基（例えば、ＧｌｕもしくはＡｓｐ）に置換される、もしくはそれにより置換される、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅもしくはＶａｌ）に置換される、もしくはそれにより置換される、（ｉｉｉ）システインもしくはプロリンが、他の任意の残基に置換される、もしくはそれにより置換される、または（ｉｖ）嵩高い疎水性もしくは芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅもしくはＴｒｐ）が、より小さい側鎖（例えば、ＡｌａもしくはＳｅｒ）を有するもの、もしくは側鎖を有さないもの（例えば、Ｇｌｙ）に置換される、もしくはそれにより置換されるものが挙げられる。
当業者であれば、他のアミノ酸置換を容易に同定することができる。例えば、アミノ酸アラニンについては、Ｄ－アラニン、グリシン、ベータ－アラニン、Ｌ－システインおよびＤ－システインのいずれか１つから置換を取ることができる。リシンについては、置き換えは、Ｄ－リシン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、ホモ－アルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチン、またはＤ－オルニチンのいずれか１つであってもよい。一般に、単離されたポリペプチドの特性の変化を誘導すると予想することができる機能的に重要な領域における置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニンに（もしくは、それらにより）置換される；（ｉｉ）システイン残基が、他の任意の残基に（もしくは、それらにより）置換される；（ｉｉｉ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸に（もしくは、それらにより）置換される；または（ｉｖ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、そのような側鎖を有さないもの、例えば、グリシンに（もしくは、それらにより）置換されるものである。前記非保存的置換の１つがタンパク質の機能的特性を変化させることができる可能性もまた、タンパク質の機能的に重要な領域に関する置換の位置と相関する：一部の非保存的置換は、したがって、生物学的特性に対する効果が小さいか、または効果がない。
保存された：本明細書で使用される場合、用語「保存された」とは、比較される２つもしくはそれよりも多い配列の同じ位置で変化しないまま存在するものである、それぞれ、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。相対的に保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列中の他の場所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連する配列間で保存されたものである。
一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存された」と言われる。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用してもよいか、またはその一部、領域もしくは特徴に適用してもよい。
調節放出：本明細書で使用される場合、用語「調節放出」とは、治療的転帰をもたらす特定の放出パターンに従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
共有誘導体：用語「共有誘導体」は、ポリペプチドを指す場合、天然または出発タンパク質の、有機タンパク質性もしくは非タンパク質性誘導体化剤による修飾、および／または翻訳後修飾を含む。共有修飾は、伝統的には、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖もしくは末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾機構を利用することによって導入される。得られる共有誘導体は、生物活性、イムノアッセイ、または組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製にとって重要な残基を同定することに向けられたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当技術分野における通常の知識の範囲内であり、過度の実験なく実施される。
環状または環化：本明細書で使用される場合、用語「環状」とは、連続ループの存在を指す。環状分子は、環状である必要はなく、サブユニットの破壊されない鎖を形成するためにただ接合されていればよい。本開示の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの環状分子は、単一ユニットもしくはマルチマーであってもよく、または複雑な、もしくはより高次の構造の１つもしくは複数の成分を含んでもよい。
細胞毒性：本明細書で使用される場合、「細胞毒性」とは、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはその組合せを死滅させること、またはそれに対する傷害、毒性、もしくは殺滅効果を引き起こすことを指す。
送達：本明細書で使用される場合、用語「送達」は、実体に目的地を提供することを意味する。例えば、対象へのポリヌクレオチドの送達は、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を対象に投与すること（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路による）を含んでもよい。哺乳動物または哺乳動物細胞へのナノ粒子組成物の投与は、１つまたは複数の細胞と、ナノ粒子組成物とを接触させることを含んでもよい。
送達剤：本明細書で使用される場合、「送達剤」とは、少なくとも部分的に、ポリヌクレオチドの標的細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの送達を容易にする任意の物質を指す。
不安定化：本明細書で使用される場合、用語「不安定」、「不安定化する」または「不安定化領域」は、出発型、野生型または天然型の同じ領域または分子よりも安定でない領域または分子を意味する。
検出可能標識：本明細書で使用される場合、「検出可能標識」とは、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などの当技術分野で公知の方法によって容易に検出される別の実体と付着した、組み込まれた、または会合した１つまたは複数のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテンなどのリガンド、量子ドットなどが挙げられる。検出可能標識を、本明細書に開示されるペプチドまたはタンパク質中の任意の位置に位置してもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質の中にあるか、またはＮもしくはＣ末端に位置してもよい。
ジアステレオマー：本明細書で使用される場合、用語「ジアステレオマー」は、互いの鏡像ではなく、互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
消化すること：本明細書で使用される場合、用語「消化する」とは、より小さい小片または成分にばらばらになることを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質を指す場合、消化はペプチドの生成をもたらす。
遠位：本明細書で使用される場合、用語「遠位」は、中心から遠くにあること、または目的の点もしくは領域から遠くにあることを意味する。
ドメイン：本明細書で使用され、ポリペプチドを指す場合、用語「ドメイン」とは、１つまたは複数の同定可能な構造的または機能的な特徴または特性（例えば、タンパク質間相互作用のための部位として働く、結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
投薬レジメン：本明細書で使用される場合、「投薬レジメン」または「投薬レジメン」は、処置、予防、または緩和ケアの投与スケジュールまたは医師により決定されたレジメンである。
有効量：本明細書で使用される場合、薬剤の用語「有効量」は、有益な、または所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、タンパク質欠損（例えば、ＩＬ１２欠損）を処置する薬剤を投与する状況では、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与なしに観察される症状の重症度と比較して、ＩＬ１２欠損と関連する症状を改善する、低減する、除去する、または予防するのに十分なＰＢＧＦを発現するｍＲＮＡの量である。用語「有効量」を、「有効用量」、「治療有効量」または「治療有効用量」と互換的に使用することができる。
鏡像異性体：本明細書で使用される場合、用語「鏡像異性体」とは、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像異性体の少なくとも９０％および他方の鏡像異性体の多くても１０％）、少なくとも９０％、または少なくとも９８％の光学純度または鏡像異性過剰（当技術分野で標準的な方法によって決定される）を有する、本開示の化合物のそれぞれ個々の光学的に活性な形態を意味する。
封入する：本明細書で使用される場合、用語「封入する」とは、封止、包囲、または内包することを意味する。
封入効率：本明細書で使用される場合、「封入効率」とは、ナノ粒子組成物の調製において使用されるポリヌクレオチドの初期総量と比較して、ナノ粒子組成物の一部になるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、組成物に最初に提供される合計１００ｍｇのポリヌクレオチドのうち、９７ｍｇのポリヌクレオチドがナノ粒子組成物中に封入される場合、封入効率は９７％として与えることができる。本明細書で使用される場合、「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な同封、閉じ込め、取り囲み、または包み込みを指してもよい。
コードタンパク質切断シグナル：本明細書で使用される場合、「コードタンパク質切断シグナル」とは、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
操作された：本明細書で使用される場合、本開示の実施形態は、それらが構造的なものであっても、化学的なものであっても、出発点、野生型または天然分子から変化する特徴または特性を有するように設計される場合、「操作される」。
増強された送達：本明細書で使用される場合、用語「増強された送達」は、目的の標的組織（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）への対照ナノ粒子によるポリヌクレオチドの送達のレベルと比較して、目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）へのナノ粒子によるより多くの（例えば、少なくとも１．５倍多くの、少なくとも２倍多くの、少なくとも３倍多くの、少なくとも４倍多くの、少なくとも５倍多くの、少なくとも６倍多くの、少なくとも７倍多くの、少なくとも８倍多くの、少なくとも９倍多くの、少なくとも１０倍多くの）ポリペプチドの送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルを、組織中で生成されるタンパク質の量を、前記組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を、前記組織の重量と比較すること、組織中で生成されるタンパク質の量を、前記組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチドの量を、前記組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較することによって測定することができる。標的組織へのナノ粒子の増強された送達は、処置される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物において決定することができることが理解されるであろう。
エキソソーム：本明細書で使用される場合、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌されるベシクルまたはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、以下の事象：（１）ＤＮＡ配列からのｍＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ｍＲＮＡ転写物のプロセッシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセッシングによる）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳；ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの１つまたは複数を指す。
ｅｘ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｅｘ ｖｉｖｏ」とは、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織）の外部で起こる事象を指す。ｅｘ ｖｉｖｏでの事象は、天然の（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）環境から最小限に変化した環境中で起こってもよい。
特徴：本明細書で使用される場合、「特徴」とは、特徴、特性、または独特の要素を指す。ポリペプチドを指す場合、「特徴」は、ある分子の異なるアミノ酸配列に基づく成分と定義される。本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴は、表面発現、部分的コンフォメーション形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端またはその任意の組合せを含む。
製剤：本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドと、担体、賦形剤、および送達剤の１つまたは複数とを含む。
断片：本明細書で使用される「断片」とは、一部を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、断片は、Ｎ末端、および／またはＣ末端、および／または内部部分配列が欠失した、全長タンパク質（例えば、ＩＬ１２）の部分配列である。本開示の一部の好ましい態様では、本開示のタンパク質の断片は、機能的断片である。
機能的：本明細書で使用される場合、「機能的」生物分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を呈する形態にある生物分子である。したがって、本開示のポリヌクレオチドの機能的断片は、機能的ＩＬ１２断片を発現することができるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、ＩＬ１２の機能的断片とは、断片が、対応する全長タンパク質の生物活性の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する、野生型ＩＬ１２の断片（すなわち、任意のその天然のアイソフォームの断片）、またはその変異体もしくはバリアントを指す。
ヘルパー脂質：本明細書で使用される場合、用語「ヘルパー脂質」とは、脂質部分（脂質層、例えば、脂質二重層への挿入のため）および極性部分（脂質層の表面での生理的溶液との相互作用のため）を含む化合物または分子を指す。典型的には、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、アミノ脂質を「補完」し、二重層の融合原性を増大させること、および／または例えば、細胞に送達される核酸の、エンドソーム脱出を容易にするのを助けることである。ヘルパー脂質はまた、ＬＮＰの表面にとって重要な構造成分であると考えられる。
相同性：本明細書で使用される場合、用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。一般に、用語「相同性」は、２つの分子間の進化的関係を意味する。したがって、相同である２つの分子は、共通の進化的祖先を有する。本開示の文脈では、相同性という用語は、同一性と類似性の両方を包含する。
一部の実施形態では、ポリマー分子は、分子中のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が同一である（正確に同じモノマー）または類似する（保存的置換）場合、互いに「相同」であると考えられる。用語「相同」は、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を必ず指す。
同一性：本明細書で使用される場合、用語「同一性」とは、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間、ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的なモノマー保存を指す。例えば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの算出を、最適比較目的で２つの配列を整列させることによって実行することができる（例えば、最適なアライメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、非同一の配列を比較目的で無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドで占められる場合、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定を、数的アルゴリズムを使用して達成することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を同等に考えることができる。
好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から入手可能であり、タンパク質とヌクレオチド配列の両方のアライメントのためのものである。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、Ｕ．Ｓ．ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ’ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用されるが、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはバイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａでＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から入手可能でもあるＭａｔｃｈｅｒである。
ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当技術分野で公知の方法を使用して、配列アライメントを行うことができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それ自身の配列同一性パーセントを有してもよい。配列同一性パーセント値は、１０分の１単位まで四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は、８０．１に四捨五入されるが、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は８０．２に四捨五入される。また、長さの値は常に整数であることにも留意されたい。
ある特定の態様では、第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の同一性百分率「％ＩＤ」は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは第１と第２の配列のアライメント（目視または特定の配列アライメントプログラムによって整列される）において同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは第２の配列中の残基の総数である）として算出される。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも高いであろう。
当業者であれば、配列同一性パーセントの算出のための配列アライメントの作成は、一次配列データによって専ら駆動されるバイナリー配列間比較に限定されないことを理解できる。また、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データなどの、異種起源に由来するデータと統合することによって、配列アライメントを作成することができることも理解される。異種データを統合して、複数の配列アライメントを作成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、あるいは、例えば、ＥＢＩから入手可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。また、配列同一性パーセントを算出するために使用される最終的なアライメントを、自動的に、または手動でキュレートすることができることも理解されるであろう。
免疫応答：用語「免疫応答」とは、例えば、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合、正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、その破壊、またはそのヒト体内からの除去をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓によって生成される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体など）の作用を指す。一部の場合、脂質成分と封入された治療剤とを含むナノ粒子の投与は、（ｉ）封入された治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）そのような封入された治療剤の発現産物（例えば、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチド）、（ｉｉｉ）ナノ粒子の脂質成分、または（ｉｖ）その組合せにより引き起こされ得る、免疫応答を誘発することができる。
炎症応答：「炎症応答」とは、特異的および非特異的防御系を含む免疫応答を指す。特異的防御系反応は、抗原に対する特異的免疫系反応である。特異的防御系反応の例としては、抗体応答が挙げられる。非特異的防御系反応は、一般的には、免疫記憶を行うことができない白血球、例えば、マクロファージ、好酸球および好中球により媒介される炎症応答である。一部の態様では、免疫応答は、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす、炎症性サイトカインの分泌を含む。
炎症性サイトカイン：用語「炎症性サイトカイン」とは、炎症応答において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＧＲＯαとしても知られるＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球－コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語は、当技術分野で公知の炎症応答と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）なども含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」とは、生物（例えば、動物、植物、または微生物）の中よりもむしろ、人工的な環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などの中で起こる事象を指す。
ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」とは、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織）の中で起こる事象を指す。
挿入および欠失バリアント：「挿入バリアント」は、ポリペプチドを指す場合、天然または出発配列中の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入される１つまたは複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接」するとは、アミノ酸のアルファ－カルボキシまたはアルファ－アミノ官能基のいずれかに接続されることを意味する。「欠失バリアント」は、ポリペプチドを言う場合、天然または出発アミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域中の１つまたは複数のアミノ酸が欠失しているであろう。
インタクト：本明細書で使用される場合、ポリペプチドの文脈では、用語「インタクト」は、例えば、野生型アミノ酸を変異させること、または置換することではなく、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持することを意味する。逆に、核酸の文脈では、用語「インタクト」は、例えば、野生型核酸塩基を変異させること、または置換することではなく、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持することを意味する。
イオン化可能アミノ脂質：用語「イオン化可能アミノ脂質」は、１、２、３、またはそれよりも多い脂肪酸または脂肪アルキル鎖と、ｐＨ滴定可能アミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質を含む。イオン化可能アミノ脂質は、典型的には、アミノ頭部基のｐＫａを下回るｐＨでプロトン化（すなわち、正に荷電）され、ｐＫａより上のｐＨでは実質的に荷電しない。そのようなイオン化可能アミノ脂質としては、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）および（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）が挙げられる。
単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、それが会合した成分の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す（自然においても、または実験設定においても）。単離された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、それらが単離された物質を参照して変化する純度レベルを有してもよい。単離された物質および／または実体を、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くのそれらが最初に会合していた他の成分から分離することができる。一部の実施形態では、単離された物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超えて、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される場合、物質が他の成分を実質的に含まない場合、それは「純粋」である。
実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が形成または検出された環境から、それが実質的に分離されることを意味する。部分的分離は、例えば、本開示の化合物中で富化された組成物を含んでもよい。実質的な分離は、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物を含んでもよい。
「単離された」ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または本明細書に開示される任意の組成物は、自然には見出されない形態にあるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、それらが最早自然に見出される形態にない程度まで精製されたものを含む。一部の態様では、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。
異性体：本明細書で使用される場合、用語「異性体」は、本開示の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本開示の化合物は、１つまたは複数のキラル中心および／または二重結合を有してもよく、従って、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）もしくは（－））またはｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体）などの、立体異性体として存在してもよい。本開示によれば、本明細書に記載の化学構造、したがって、本開示の化合物は、全ての対応する立体異性体、すなわち、立体的に純粋な形態（例えば、幾何異性的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）と、鏡像異性体と立体異性体の混合物、例えば、ラセミ体との両方を包含する。本開示の化合物の鏡像異性体と立体異性体の混合物は、典型的には、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化などの周知の方法によって、その成分である鏡像異性体または立体異性体に分解することができる。鏡像異性体と立体異性体とを、周知の非対称性合成方法により、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から取得することもできる。
リンカー：本明細書で使用される場合、「リンカー」（本明細書で呼ばれるようなサブユニットリンカーおよび異種ポリペプチドリンカーを含む）とは、原子、例えば、１０～１，０００個の原子の群を指し、限定されるものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンなどの原子または基を含んでもよい。リンカーを、第１の末端で、核酸塩基または糖部分上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドに、また、第２の末端で、ペイロード、例えば、検出可能剤または治療剤に付着させることができる。リンカーは、核酸配列への組込みを妨げないような十分な長さのものであってもよい。リンカーを、ポリヌクレオチドマルチマー（例えば、２つもしくはそれよりも多いキメラポリヌクレオチド分子もしくはＩＶＴポリヌクレオチドの連結により）またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するため、ならびに本明細書に記載のペイロードを投与するためなどの、任意の有用な目的のために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、限定されるものではないが、それぞれ、本明細書に記載のように、任意選択で置換されていてもよい、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられる。リンカーの例としては、限定されるものではないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、およびデキストランポリマーならびにその誘導体が挙げられる。他の例としては、限定されるものではないが、例えば、還元剤または光分解を使用して切断することができるジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）などのリンカー内の切断可能部分が挙げられる。選択的に切断可能な結合の非限定例としては、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは他の還元剤の使用、および／または光分解により切断することができるアミド結合、ならびに例えば、酸または塩基加水分解により切断することができるエステル結合が挙げられる。
投与方法：本明細書で使用される場合、「投与方法」は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または対象に組成物を送達する他の方法を含んでもよい。投与方法を、身体の特定の領域または系への送達を標的化する（例えば、特異的に送達する）ように選択することができる。
修飾された：本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、本開示の分子の状態または構造の変化を指す。化学的、構造的、および機能的などの多くの方法で分子を修飾することができる。一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが天然のリボヌクレオチド、Ａ、Ｕ、ＧおよびＣに関する場合、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入によって修飾される。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾された」とは考えない。
粘液：本明細書で使用される場合、「粘液」とは、粘性であり、ムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
ナノ粒子組成物：本明細書で使用される場合、「ナノ粒子組成物」は、１つまたは複数の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は、典型的には、マイクロメートル規模またはそれよりも小さいサイズであり、脂質二重層を含んでもよい。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質ベシクル）、およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍまたはそれ未満の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであってもよい。
天然に存在する：本明細書で使用される場合、「天然に存在する」とは、人工的な補助なしで自然に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用される場合、「非ヒト脊椎動物」は、野生種および家畜化された種を含む、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ以外の全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、限定されるものではないが、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、畜牛、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤクなどの哺乳動物が挙げられる。
核酸配列：用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、互換的に使用され、連続する核酸配列を指す。配列は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであってもよい。
用語「核酸」は、その最も広い意味で、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれることが多い。例示的な本開示の核酸またはポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、および２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）またはそのハイブリッドもしくは組合せが挙げられる。
語句「コードするヌクレオチド配列」とは、ポリペプチドをコードする、核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）コード配列を指す。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞中での発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルなどの制御エレメントに作動可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含んでもよい。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含んでもよい。
標的外：本明細書で使用される場合、「標的外」とは、任意の１つまたは複数の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図されない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、所与の読み枠中に終止コドンを含有しない配列を指す。
作動可能に連結された：本明細書で使用される場合、語句「作動可能に連結された」とは、２つまたはそれよりも多い分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的接続を指す。
任意選択で置換された：本明細書における語句の形態「任意選択で置換されたＸ」（例えば、任意選択で置換されたアルキル）は、「Ｘ（式中、Ｘは任意選択で置換される）」と等価であることが意図される（例えば、「アルキル（式中、前記アルキルは、任意選択で置換される）」）。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であることを意味することを意図するものではない。
部分：本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長未満であるポリヌクレオチドの任意の一部と定義される。
患者：本明細書で使用される場合、「患者」とは、処置を求めることができる、もしくは処置の必要があり得る、処置を必要とする、処置を受けている、処置を受けるであろう対象、または特定の疾患もしくは状態に関する訓練された専門家によるケアの下にある対象を指す。
薬学的に許容される：語句「薬学的に許容される」とは、適切な医学的判断の範囲内にあり、過剰の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織との接触における使用にとって好適であり、合理的な利益／リスク比と釣り合う、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
薬学的に許容される賦形剤：語句「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用される場合、患者において実質的に非毒性的および非炎症性である特性を有する、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル）を指す。賦形剤は、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（色）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはフィルムコーティング、香味料、香料、流動促進剤（流動増強剤）、潤滑剤、保存剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、および水和水を含んでもよい。例示的な賦形剤としては、限定されるものではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられる。
薬学的に許容される塩：本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、親化合物が、存在する酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより（例えば、遊離塩基を、好適な有機酸と反応させることにより）修飾された、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、限定されるものではないが、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどの、非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩を、従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、水中もしくは有機溶媒中、またはその２つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物と、化学量論量の適切な塩基もしくは酸とを反応させることにより、そのような塩を調製することができる；一般的には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が使用される。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５年、１４１８頁、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｐ．Ｈ．ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編）、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００８年、およびＢｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６巻、１～１９頁（１９７７年）に見出され、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
薬学的に許容される溶媒和物：本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される溶媒和物」は、好適な溶媒の分子が結晶格子中に組み込まれた本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投与量で生理的に許容される。例えば、有機溶媒、水、またはその混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈降化により、溶媒和物を調製することができる。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一、二、および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と呼ばれる。
薬物動態：本明細書で使用される場合、「薬物動態」とは、ある分子または化合物が生体に投与された物質の運命の決定に関わる場合の、その任意の１つまたは複数の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝および排出の程度および速度を含むいくつかの領域に分割される。これは一般的にはＡＤＭＥと呼ばれ、ここで、（Ａ）吸収は、血液循環に入る物質のプロセスであり、（Ｄ）分布は、体液および体組織を介する物質の分散または播種であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）は、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、ならびに（Ｅ）排出（または除去）とは、身体からの物質の除去を指す。稀な事例では、一部の薬物は、体組織に不可逆的に蓄積する。
生理化学的：本明細書で使用される場合、「生理化学的」とは、物理および／または化学特性を意味する、またはそれと関連する。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その類似体、またはその混合物などの、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。それは、例えば、アルキル化により、および／またはキャッピングにより修飾された形態、ならびに修飾されていない型のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」は、スプライスされていても、スプライスされていなくても、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮまたはＣ－グリコシドである他の任意の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド性（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）およびポリモルホリノポリマー、ならびにポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような、塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有するという条件で、他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。一部の態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。一部の態様では、ある特定のクラスの全核酸塩基が、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中の全てのウリジンを、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンで置き換えることができる）。一部の態様では、ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、天然核酸塩基のみ、すなわち、合成ＤＮＡの場合、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、およびＴ（チミジン）、または合成ＲＮＡの場合、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ（ウリジン）を含む。
当業者であれば、本明細書に開示されるコドンマップ中のＴ塩基はＤＮＡ中に存在するが、Ｔ塩基は対応するＲＮＡ中ではＵ塩基によって置き換えられることを理解できる。例えば、ＤＮＡ形態、例えば、ベクターまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）鋳型中の本明細書に開示されるコドンヌクレオチド配列は、対応する転写されるｍＲＮＡ中ではＵ塩基として転写されるそのＴ塩基を有するであろう。これに関して、コドン最適化されたＤＮＡ配列（Ｔを含む）と、その対応するｍＲＮＡ配列（Ｕを含む）は両方とも、本開示のコドン最適化されたヌクレオチド配列と考えられる。当業者であれば、１つまたは複数の塩基を非天然塩基で置き換えることにより、同等のコドンマップを作成することができることも理解できる。したがって、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、順に、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置き換えられたＲＮＡマップ）に対応する。
標準的なＡ－ＴおよびＧ－Ｃ塩基対は、チミジンのＮ３－ＨおよびＣ４－オキシと、アデノシンの、それぞれ、Ｎ１およびＣ６－ＮＨ２との間ならびにシチジンのＣ２－オキシ、Ｎ３およびＣ４－ＮＨ２と、グアノシンの、それぞれ、Ｃ２－ＮＨ２、Ｎ’－ＨおよびＣ６－オキシとの間の水素結合の形成を可能にする条件下で形成する。したがって、例えば、グアノシン（２－アミノ－６－オキシ－９－β－Ｄ－リボフラノシル－プリン）を修飾して、イソグアノシン（２－オキシ－６－アミノ－９－β－Ｄ－リボフラノシル－プリン）を形成させることができる。そのような修飾は、最早シトシンと標準的な塩基対を効率的に形成しないヌクレオシド塩基をもたらす。しかしながら、イソシトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－アミノ－４－オキシ－ピリミジン）を形成するシトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－オキシ－４－アミノ－ピリミジン）の修飾は、グアノシンと効率的に塩基対形成しないが、イソグアノシンとは塩基対を形成する修飾されたヌクレオチドをもたらす（Ｃｏｌｌｉｎｓらの米国特許第５，６８１，７０２号）。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から入手可能である；イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２巻：１０４８９～１０４９６頁およびそこに引用された参考文献によって記載された方法により調製することができ、２’－デオキシ－５－メチル－イソシチジンは、Ｔｏｒら、１９９３年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５巻：４４６１～４４６７頁およびそこに引用された参考文献の方法により調製することができ、ならびにイソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒら、１９９３年、上掲およびＭａｎｔｓｃｈら、１９９３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４巻：５５９３～５６０１号により記載された方法を使用して、またはＣｏｌｌｉｎｓらの米国特許第５，７８０，６１０号に記載の方法により調製することができる。２，６－ジアミノピリミジンおよびその相補体（１－メチルピラゾロ－［４，３］ピリミジン－５，７－（４Ｈ，６Ｈ）－ジオン）の合成のために、他の非天然塩基対を、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ ３４３巻：３３～３７頁に記載の方法により合成することができる。Ｌｅａｃｈら（１９９２年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４巻：３６７５～３６８３頁およびＳｗｉｔｚｅｒら、上掲に記載のものなどの、ユニークな塩基対を形成する他のそのような修飾されたヌクレオチド単位は公知である。
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。この用語はまた、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化成分とのコンジュゲーションなどの他の任意の操作もしくは修飾により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、およびクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義に含まれる。
本明細書で使用される場合、用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。ポリペプチドは、コードされたポリヌクレオチド産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルトログ、パラログ、断片ならびに前記の他の等価物、バリアント、および類似体を含む。ポリペプチドは、モノマーであってもよく、またはダイマー、トリマーもしくはテトラマーなどの多分子複合体であってもよい。それらはまた、単鎖または多鎖ポリペプチドを含んでもよい。最も一般的には、ジスルフィド連結が多鎖ポリペプチド中に見出される。ポリペプチドという用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。一部の実施形態では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長未満であるか、またはそれと等しい、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であってもよい。
ポリペプチドバリアント：本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドバリアント」とは、天然または参照配列とはそのアミノ酸配列において異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有してもよい。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を有するであろう。一部の実施形態では、それらは、天然または参照配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％同一であろう。
単位薬物あたりのポリペプチド（ＰＵＤ）：本明細書で使用される場合、ＰＵＤまたは単位薬物あたりの生成物は、体液中での測定値で除算した、通常はｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬなどの濃度で定義される、体液または組織中で測定される生成物（ポリペプチドなど）の総日用量、通常、１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇなどの細分された部分と定義される。
予防すること：本明細書で使用される場合、用語「予防すること」とは、感染、疾患、障害および／もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状、特徴、もしくは臨床兆候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状、特徴、もしくは兆候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること；感染、特定の疾患、障害および／もしくは状態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること；ならびに／または感染、疾患、障害、および／もしくは状態と関連する病状を発症するリスクを低下させることを指す。
プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載の化合物のプロドラッグも含む。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化の際に治療薬として作用する物質、分子または実体に関する述語の形式にある任意の物質、分子または実体を指す。プロドラッグは、いくつかの方法で共有結合または隔離されていてもよく、哺乳動物対象への投与前、投与時、または投与後に活性薬物部分を放出する、またはそれに変換される。日常的な操作またはｉｎ ｖｉｖｏで、修飾物が親化合物に切断されるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって、プロドラッグを調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、哺乳動物対象に投与された時、開裂して、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する任意の基に結合された化合物を含む。プロドラッグの調製および使用は、Ｔ． ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ． Ｓｔｅｌｌａ、「Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａ．Ｃ．Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓの第１４巻、ならびにＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｅｄｗａｒｄ Ｂ． Ｒｏｃｈｅ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年において考察されており、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
増殖する：本明細書で使用される場合、用語「増殖する」とは、成長する、拡張する、もしくは増大する、または急速な成長、拡張もしくは増大を引き起こすことを意味する。「増殖性」とは、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」とは、増殖特性に対抗する、または増殖特性にとって不適切な特性を有することを意味する。
予防薬：本明細書で使用される場合、「予防薬」とは、疾患の拡散を予防するために使用される治療薬または作用の経過を指す。
予防：本明細書で使用される場合、「予防」とは、健康を維持し、疾患の拡散を予防するために取られる手段を指す。「免疫予防」とは、疾患の拡散を予防するための能動または受動免疫を生成するための手段を指す。
タンパク質切断部位：本明細書で使用される場合、「タンパク質切断部位」とは、アミノ酸鎖の調節された切断を、化学的、酵素的または光化学的手段によって達成することができる部位を指す。
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用される場合、「タンパク質切断シグナル」とは、切断のためにポリペプチドに合図する、または印を付ける少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：本明細書で使用される場合、用語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」は、本明細書で提供されるものならびにその断片、変異体、バリアント、および変形を含む。
近位：本明細書で使用される場合、用語「近位」とは、中心または目的の地点もしくは領域により近い位置にあることを意味する。
シュードウリジン：本明細書で使用される場合、シュードウリジン（ψ）とは、ウリジンヌクレオシドのＣ－グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の修飾体、バリアント、アイソフォームまたは誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体としては、限定されるものではないが、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、および２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）が挙げられる。
精製された：本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製された」、「精製」は、望ましくない成分、材料汚染、混合物または不完全性から実質的に純粋にする、または清澄化することを意味する。
参照核酸配列：用語「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」とは、配列最適化することができる出発核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ配列）を指す。一部の実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、その断片またはバリアントである。一部の実施形態では、参照核酸配列は、予め配列最適化された核酸配列である。
反復トランスフェクション：本明細書で使用される場合、用語「反復トランスフェクション」とは、あるポリヌクレオチドによる同じ細胞培養物の複数回のトランスフェクションを指す。細胞培養物を、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回またはそれよりも多くトランスフェクトすることができる。
塩：一部の態様では、本明細書に開示される腫瘍内送達のための医薬組成物は、その脂質構成成分の一部の塩を含む。用語「塩」は、任意のアニオン性およびカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定例としては、無機および有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩（例えば、ヘミオキサレート）、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酸化物、カルボン酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、重クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、およびその混合物が挙げられる。
試料：本明細書で使用される場合、用語「試料」または「生物試料」とは、その組織、細胞、または構成部分のサブセット（例えば、限定されるものではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液および精液などの体液）を指す。試料は、全生物または限定されるものではないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管、および尿生殖路の外部切片、涙、唾液、ミルク、血液細胞、腫瘍、器官などの、その組織、細胞もしくは構成部分のサブセット、またはその画分もしくは一部から調製されたホモジネート、溶解物または抽出物をさらに含んでもよい。試料はさらに、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含有してもよい、栄養培地またはゲルなどの媒体を指す。
シグナル配列：本明細書で使用される語句「シグナル配列」、「シグナルペプチド」および「移行ペプチド」は、互換的に使用され、タンパク質の、ある特定の細胞小器官、細胞区画への輸送もしくは局在化、または細胞外輸送を指令することができる配列を指す。この用語は、シグナル配列ポリペプチドと、シグナル配列をコードする核酸配列との両方を包含する。したがって、核酸の文脈におけるシグナル配列に対する参照は、実際には、シグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
シグナル伝達経路：「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書で使用される語句「細胞表面受容体」は、例えば、シグナルを受信し、細胞の形質膜を横断するそのようなシグナルの伝達を行うことができる分子および分子の複合体を含む。
類似性：本明細書で使用される場合、用語「類似性」とは、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。ポリマー分子の互いとの類似性パーセントの算出を、類似性パーセントの算出が当技術分野で理解されるように保存的置換を考慮に入れることを除いて、同一性パーセントの算出と同じ様式で実行することができる。
単回単位用量：本明細書で使用される場合、「単回単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち、１回の投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。
分割用量：本明細書で使用される場合、「分割用量」は、単回単位用量または総日用量の、２つまたはそれよりも多い用量への分割である。
特異的送達：本明細書で使用される場合、用語「特異的送達」、「特異的に送達する」または「特異的に送達すること」は、標的外組織（例えば、哺乳動物脾臓）と比較して、目的の標的組織（例えば、哺乳動物肝臓）へのナノ粒子によるポリヌクレオチドのより多い（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルを、組織中で生成されるタンパク質の量を前記組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を前記組織の重量と比較すること、組織中で生成されるタンパク質の量を前記組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチドの量を前記組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較することにより測定することができる。例えば、腎血管標的については、組織１ｇあたり１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多くのポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して、腎臓に送達される場合、ポリヌクレオチドは、肝臓および脾臓と比較して哺乳動物腎臓に特異的に提供される。標的組織に特異的に送達するナノ粒子の能力は、処置される対象において決定する必要はなく、それを動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物において決定してもよいことが理解されるであろう。
安定：本明細書で使用される場合、「安定」とは、反応混合物から有用な純度までの単離を生き残るのに十分に強固であり、一部の事例では、有効な治療剤への製剤化を可能にする化合物を指す。
安定化された：本明細書で使用される場合、用語「安定化する」、「安定化された」、「安定化された領域」は、安定にすること、または安定になることを意味する。
立体異性体：本明細書で使用される場合、用語「立体異性体」とは、化合物が有し得る全ての可能な異なる異性体ならびにコンフォメーション形態（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）、特に、基本分子構造の全ての可能な立体化学的およびコンフォメーション的異性体、全てのジアステレオマー、鏡像異性体および／または配座異性体を指す。本開示の一部の化合物は、異なる互変異性形態で存在してもよく、後者は全て、本開示の範囲内に含まれる。
対象：「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または療法が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などの家庭用動物、農業用動物、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット動物；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長類；イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物；ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科動物；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ科動物；クマ、乳牛、ブタ、およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類などが挙げられる。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒト対象である。他の実施形態では、対象はヒト患者である。特定の実施形態では、対象は処置を必要とするヒト患者である。
実質的に：本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の全部の、または全部に近い範囲または程度を呈する質的状態を指す。生物分野における通常の知識を有する者であれば、生物学的および化学的特徴は稀に、あるとすれば、完了に向かう、および／または完全性に進行するか、または絶対的な結果を達成する、もしくは回避することを理解するであろう。用語「実質的に」は、したがって、多くの生物学的および化学的特徴において固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
実質的に等しい：本明細書で使用される場合、それが用量間の倍数差に関する場合、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時：本明細書で使用される場合、また、それが複数の用量に関する場合、この用語は、２秒以内を意味する。
罹患している：疾患、障害、および／または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害、および／または状態と診断されたか、またはその１つもしくは複数の症状を示す。
罹りやすい：疾患、障害、および／または状態に「罹りやすい」個体は、疾患、障害、および／または状態と診断されていない、および／またはその症状を呈していなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を持つ。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態（例えば、がん）に罹りやすい個体を、以下の１つまたは複数：（１）疾患、障害、および／または状態の発生と関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害、および／または状態の発生と関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、および／または状態と関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または減少；（４）疾患、障害、および／または状態の発生と関連する習慣および／または生活様式；（５）疾患、障害、および／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害、および／または状態の発生と関連する微生物への曝露および／または微生物による感染によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹りやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症するであろう。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹りやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症しないであろう。
持続放出：本明細書で使用される場合、用語「持続放出」とは、特定の期間にわたってある放出速度に従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成：用語「合成」とは、人の手によって生成、調製、および／または製造されることを意味する。本開示のポリヌクレオチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
標的細胞：本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、目的の任意の１つまたは複数の細胞を指す。この細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、または生物の組織もしくは器官中に見出すことができる。生物は、動物、例えば、哺乳動物、ヒト、対象または患者であってもよい。
標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」とは、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的および／または薬理学的効果をもたらす目的の任意の１つまたは複数の組織型を指す。目的の標的組織の例としては、特定の組織、器官、およびその系または群が挙げられる。特定の用途では、標的組織は、腎臓、肺、脾臓、血管中の血管内皮（例えば、冠状動脈内もしくは大腿骨内）、または腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射による）であってもよい。「標的外組織」とは、コードされたタンパク質の発現が、所望の生物学的および／または薬理学的効果をもたらさない任意の１つまたは複数の組織型を指す。特定の用途では、標的外組織は、肝臓および脾臓を含んでもよい。
標的外組織における治療剤の存在は、（ｉ）拡散による、もしくは血流を介する、末梢組織もしくは遠位標的外組織（例えば、肝臓）への投与部位からのポリヌクレオチドの漏出（例えば、ある特定の組織においてポリペプチドを発現するように意図されたポリヌクレオチドは肝臓に到達し、そのポリペプチドは肝臓中で発現されるであろう）；または（ｉｉ）拡散による、もしくは血流を介する、末梢組織もしくは遠位標的外組織（例えば、肝臓）へのそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後のポリペプチドの漏出（例えば、ポリヌクレオチドは標的組織においてポリペプチドを発現し、ポリペプチドは末梢組織に拡散するであろう）の結果であり得る。
標的化配列：本明細書で使用される語句「標的化配列」とは、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在化を指令することができる配列を指す。
末端：本明細書で使用される場合、用語「複数の末端」または「末端」は、ポリペプチドを指す場合、ペプチドまたはポリペプチドの先端を指す。そのような先端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位に限定されないだけでなく、末端領域中のさらなるアミノ酸を含んでもよい。本開示のポリペプチドに基づく分子を、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結する）と、Ｃ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終結する）との両方を有するものと特徴付けることができる。本開示のタンパク質は、一部の事例では、ジスルフィド結合または非共有力によって一緒になった複数のポリペプチド鎖（マルチマー、オリゴマー）から構成される。これらの種類のタンパク質は、複数のＮおよびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端を、それらが、場合によっては、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドに基づく部分から始まる、またはそれで終わるように修飾することができる。
治療剤：用語「治療剤」とは、対象に投与された場合、治療、診断、および／もしくは予防効果を有する、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を惹起する薬剤を指す。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、ＩＬ１２Ａポリペプチド、またはＩＬ１２ＢとＩＬ１２Ａポリペプチドの両方をコードするｍＲＮＡは、治療剤であり得る。
治療有効量：本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、および／または状態に罹患している、または罹りやすい対象に投与した場合、感染、疾患、障害、および／または状態を処置する、その症状を改善する、それを診断する、それを予防する、および／またはその発症を遅延させるのに十分なものである、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。
治療有効転帰：本明細書で使用される場合、用語「治療有効転帰」は、感染、疾患、障害、および／または状態に罹患している、または罹りやすい対象において、感染、疾患、障害、および／または状態を処置する、その症状を改善する、それを診断する、それを予防する、および／またはその発症を遅延させるのに十分なものである転帰を意味する。
総日用量：本明細書で使用される場合、「総日用量」は、２４時間以内に与えられる、または処方される量である。総日用量を、単回単位用量または分割用量として投与することができる。
転写因子：本明細書で使用される場合、用語「転写因子」とは、例えば、転写の活性化または抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。一部の転写因子は転写のみの制御を行うが、他のものは他のタンパク質と協調して作用する。一部の転写因子は、ある特定の条件下で転写を活性化することと、抑制することの両方を行うことができる。一般に、転写因子は、特定の標的配列または標的遺伝子の制御領域中の特定のコンセンサス配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子のみ、または他の分子との複合体を形成する標的遺伝子の転写を制御してもよい。
転写：本明細書で使用される場合、用語「転写」とは、外因性核酸を細胞中に導入するための方法を指す。トランスフェクションの方法としては、限定されるものではないが、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合物が挙げられる。
トランスフェクション：本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」とは、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが発現される（例えば、ｍＲＮＡ）、またはポリペプチドが細胞機能をモジュレートする（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）細胞中へのポリヌクレオチドの導入を指す。本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳および／またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。
処置すること、処置、療法：本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」または「療法」とは、疾患、例えば、急性間欠性ポルフィリン症の１つまたは複数の症状または特徴を部分的または完全に軽減する、改善する、向上させる、緩和する、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を低下させる、および／またはその発生を低減させることを指す。例えば、急性間欠性ポルフィリン症を「処置すること」は、疾患と関連する症状を軽減すること、患者の生存期間を延長すること（生存率を増大させること）、疾患の重症度を低下させること、疾患の発症を予防すること、または遅延させることなどを指す。疾患、障害、および／または状態と関連する病状を発症するリスクを低下させる目的で、疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を呈しない対象、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の初期徴候のみを呈する対象に、処置を投与することができる。
非修飾：本明細書で使用される場合、「非修飾」とは、いくつかの方法で変化される前の任意の物質、化合物または分子を指す。非修飾は、常にではないが、野生型または天然形態の生体分子を指してもよい。分子は、一連の修飾を受けてもよく、それにより、それぞれの修飾される分子は、その後の修飾のための「非修飾」出発分子として働くことができる。
ウラシル：ウラシルは、ＲＮＡの核酸中の４つの核酸塩基のうちの１つであり、文字Ｕで表される。ウラシルを、β－Ｎ１－グリコシド結合によりリボース環、またはより具体的には、リボフラノースに結合させて、ウリジンヌクレオシドを得ることができる。ウリジンヌクレオシドはまた、一般的には、その核酸塩基の１文字コードに従って、すなわち、Ｕと略される。したがって、本開示の文脈では、ポリヌクレオチド配列中のモノマーがＵである場合、そのようなＵは、「ウラシル」または「ウリジン」と互換的に指定される。
ウリジン含量：用語「ウリジン含量」または「ウラシル含量」は、互換的であり、ある特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量を、絶対値（配列中のウリジンもしくはウラシルの総数）または相対値（核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンもしくはウラシルの百分率）として表すことができる。
ウリジン修飾配列：用語「ウリジン修飾配列」とは、候補核酸配列のウリジン含量および／またはウリジンパターンに関して、異なる全体的もしくは部分的ウリジン含量（より高いか、もしくはより低いウリジン含量）を有するか、または異なるウリジンパターン（例えば、勾配分布もしくはクラスタリング）を有する配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の文脈では、用語「ウリジン修飾配列」および「ウラシル修飾配列」は、等価であり、互換的であると考えられる。
「高ウリジンコドン」は、２つまたは３つのウリジンを含むコドンと定義され、「低ウリジンコドン」は１つのウリジンを含むコドンと定義され、「無ウリジンコドン」は、ウリジンを含まないコドンである。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンによる置換、高ウリジンコドンの無ウリジンコドンによる置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンによる置換、低ウリジンコドンの無ウリジンコドンによる置換、無ウリジンコドンの低ウリジンコドンによる置換、無ウリジンコドンの高ウリジンコドンによる置換、およびその組合せを含む。一部の実施形態では、高ウリジンコドンを、別の高ウリジンコドンで置き換えることができる。一部の実施形態では、低ウリジンコドンを、別の低ウリジンコドンで置き換えることができる。一部の実施形態では、無ウリジンコドンを、別の無ウリジンコドンで置き換えることができる。ウリジン修飾配列を、ウリジン富化またはウリジン希薄化することができる。
ウリジン富化：本明細書で使用される場合、用語「ウリジン富化」およびその文法的バリアントは、対応する候補核酸配列のウリジン含量に関して、配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中のウリジン含量（絶対値または百分率値として表される）の増大を指す。ウリジン富化を、候補核酸配列中のコドンを、低ウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施することができる。ウリジン富化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または部分的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対して）であってもよい。
ウリジン希薄化：本明細書で使用される場合、用語「ウリジン希薄化」およびその文法的バリアントは、対応する候補核酸配列のウリジン含量に関して、配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中のウリジン含量（絶対値または百分率値として表される）の減少を指す。ウリジン希薄化を、候補核酸配列中のコドンを、低ウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施することができる。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または部分的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対して）であってもよい。
バリアント：本開示で使用されるバリアントという用語は、天然または出発配列（例えば、野生型配列）中の少なくとも１のアミノ酸残基が除去され、同じ位置のその場所に異なるアミノ酸が挿入された天然バリアント（例えば、多型、アイソフォームなど）と、人工バリアントの両方を指す。これらのバリアントを、「置換バリアント」と記載することができる。置換は、分子中のただ１のアミノ酸が置換されている場合、単一であってもよく、または２つもしくはそれよりも多いアミノ酸が同じ分子中で置換されている場合、それらは複数であってもよい。アミノ酸が挿入または欠失される場合、得られるバリアントは、それぞれ、「挿入バリアント」または「欠失バリアント」である。
用語「発明」および「開示」は、例えば、語句「本発明」または「本開示」を記載するか、またはそれにおいて使用される場合、互換的に使用することができる。
３０．等価物および範囲
当業者であれば、日常的な実験を超えないものを使用して、本明細書に記載の本開示による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、それとは反対に指摘されない限り、または別途文脈から明らかでない限り、１つまたは１つより多いことを意味してもよい。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、１つの、１つより多い、または全部の群のメンバーが、それとは反対に指摘されない限り、または別途文脈から明らかでない限り、所与の生成物またはプロセス中に存在する、その中で用いられる、またはさもなければそれと関連する場合に満たされると考えられる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、その中で用いられる、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。本開示は、１つより多い、または全部の群のメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、その中で使用される、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。
また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンであり、許可であることが意図されるが、追加の要素またはステップの含有を必要としないことにも注意する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用される場合、したがって、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も包含され、開示される。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。さらに、別途指摘しない限り、または別途文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、本文が別途明確に記述しない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１までの、本開示の異なる実施形態における記述される範囲内の任意の特定の値または部分範囲とみなすことができることが理解されるべきである。
さらに、先行技術の範囲内にある本開示の任意の特定の実施形態は、任意の１つまたは複数の特許請求の範囲から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者には公知であるとみなされるため、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合であっても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによりコードされるタンパク質；任意の製造方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在と関連するにしても、しないにしても、任意の理由から、任意の１つまたは複数の特許請求の範囲から除外され得る。
全ての引用された供給源、例えば、本明細書で引用される参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、および技術は、引用中に明示的に記述されていない場合であっても、参照により本出願に組み込まれる。引用された供給源と本出願の記述が矛盾する場合、本出願における記述が優先するものとする。
小節および表の見出しは限定を意図するものではない。本開示は、特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を制限しない、以下の実施例でさらに説明される。
（実施例１）
結腸腺癌（ＭＣ３８）同系モデルにおけるＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性（静脈内投与）
Ｍ３８腺癌腫瘍を担持するマウスにおける単回静脈内（ＩＶ）用量として投与された、ＩＬ１２ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を評価した。
Ａ．ＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡおよび対照の調製
野生型マウスＩＬ１２ポリペプチド（マウスＩＬ１２）およびその３’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ結合部位（ｍｉＲ－１２２）をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）を調製した（ｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２）（以下に記載される配列）。
Figure 0007246930000146
Figure 0007246930000147
ｍｉＲ－１２２結合エレメントを、肝臓からのタンパク質産生を減少させるために組み込んだ。陰性対照ｍＲＮＡ（非翻訳可能型のｍＲＮＡ）、例えば、ＮＳＴ－ＦＩＸも調製した。ｍＲＮＡを、Ｎ１－メチルシュードウリジンで完全に修飾した。両方の修飾されたｍＲＮＡを、ＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。
Ｂ．ＭＣ－３８結腸腺癌マウスモデル
ＭＣ－３８結腸腺癌腫瘍を、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３巻：１３１８～１３２１頁（１９８６年）に記載のようにマウスに皮下的に埋め込んだ。
腫瘍埋込みの１１日後、２群の動物に、単回静脈内用量のＬＮＰ製剤化ＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡを（０．１ｍｇ／ｋｇ（第４群）または０．０５ｍｇ／ｋｇ（第５群）の用量で）投与した。２群の対照動物を、等価用量の陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ－ＦＩＸ ＬＮＰ）（第７群および第８群）、ＰＢＳ（第１群）、または組換えマウスＩＬ１２タンパク質、１μｇ（第２群）で処置した。
手動のカリパスを使用して、腫瘍体積を測定した。２４日目までの平均腫瘍体積（図５）を、立方ミリメートル（ｍｍ３）で記録した。
Ｃ．結果
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの静脈内投与は、用量依存的な血漿ＩＬ１２（図２Ａ）およびＩＦＮγ（図２Ｂ）レベルならびにＩＬ１２およびＩＦＮγ ＡＵＣ（表８）の増大をもたらし、それぞれ、腹腔内注射による同等量の組換えＩＬ１２タンパク質の投与後のこれらのレベルよりも高かった（図２Ａ～２Ｂ）。
Figure 0007246930000148
図３は、第１群（ＰＢＳ）、第２群（ＩＬ１２タンパク質）、第７群および第８群（対照ＮＳＴ－ＦＩＸ、それぞれ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ）と比較した、０．１ｍｇ／ｋｇ（第４群）および０．０５ｍｇ／ｋｇ（第５群）の用量（逆三角形を有する線で示される）での、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回静脈内（ＩＶ）用量のロバストな有効性を示す。
図４Ａ～図４Ｆは、０．１ｍｇ／ｋｇ（第４群）（図４Ｆ）および０．０５ｍｇ／ｋｇ（第５群）（図４Ｅ）の用量の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ、ＰＢＳ（第１群）（図４Ａ）、ＩＬ１２タンパク質（第２群）（図４Ｄ）、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、第７群および第８群）の対照ＮＳＴ－ＦＩＸ（それぞれ、図４Ｃおよび図４Ｂ）の単回静脈内（ＩＶ）用量の投与後に見られる平均腫瘍体積および完全奏功（ＣＲ）の数を示す。完全奏功（ＣＲ）は、図４Ｅおよび図４Ｆにのみ示される。図４Ｅは、６／８のＣＲ（すなわち、７５％のＣＲ）が第５群（０．０５ｍｇ／ｋｇの用量の、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡ）において見られたことを示す。図４Ｆは、５／９のＣＲ（すなわち、５６％のＣＲ）が、第４群（０．１ｍｇ／ｋｇの用量の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のＩＬ１２ ｍＲＮＡ）において見られたことを示す。ＩＬ１２ ｍＲＮＡ群とは別に、他の群ではＣＲは観察されなかった。
図５は、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量（第５群）および０．１ｍｇ／ｋｇの用量（第４群）の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回静脈内（ＩＶ）用量に由来する腫瘍埋込み後４７日目での生存利益を示す。
注目すべきことに、図３～５は、単回ＩＶ用量を用いた場合の、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、および治療有効性の改善に関する、タンパク質を超える静脈内マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与する利点を実証する。
表９は、全身（静脈内）投与を超えるＩＬ１２ ｍＲＮＡの局所（腫瘍内）投与の忍容性の利点を示す。ＩＬ１２ ｍＲＮＡを腫瘍内に投与された１０匹のマウスのうちの９匹が、ＩＬ１２ ｍＲＮＡを静脈内投与された１２匹のマウスのうちの３匹と比較して、２０日目に生存していた。
Figure 0007246930000149
（実施例２）
結腸腺癌（ＭＣ３８）モデルにおけるマウスＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性（腫瘍内投与）
Ｍ３８腺癌腫瘍を担持するマウスに腫瘍内投与された、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を評価した。
Ａ．ＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡおよび対照の調製
実施例１に記載のｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ポリヌクレオチドを調製した。陰性対照ｍＲＮＡ、ＮＳＴ－ＦＩＸ ｍＲＮＡも調製した。両方の修飾されたｍＲＮＡを、実施例１に記載のＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。
Ｂ．ＭＣ－３８結腸腺癌マウスモデル
ＭＣ－３８結腸腺癌を、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３巻：１３１８～１３２１頁（１９８６年）に記載のようにマウスに皮下的に埋め込んだ。
腫瘍埋込みの１１日後、動物に、単回腫瘍内用量のＭＣ３ ＬＮＰ製剤化マウスＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡ（用量あたり４μｇのｍＲＮＡ）を投与した。２群の対照動物を、陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ－ＦＩＸ ＬＮＰ）またはＰＢＳの等価用量およびレジメンで処置した。
手動のカリパスを使用して、図６Ｂ中の示された時点で腫瘍体積を測定した。２４日目までの平均腫瘍体積（図６Ａ）および４７日目までの個々の腫瘍体積（図６Ｂ）を、立方ミリメートル（ｍｍ３）で記録した。試験における終点は、動物の死または１５００ｍｍ３に達する腫瘍体積であった。
Ｃ．結果
図６Ａは、ＭＣ３ ＬＮＰ製剤化マウスＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡを投与した場合、平均腫瘍体積が減少したことを示す。対照的に、マウスへの対照の修飾されたｍＲＮＡ（ＮＳＴ－ＦＩＸ）またはＰＢＳの投与は、２４日目まで評価した場合、平均腫瘍体積の減少に対する効果が小さかった。
図６Ｂは、動物１匹あたり約４μｇのＭＣ３ ＬＮＰ製剤化マウスＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡのマウスへの投与が、対照の修飾されたｍＲＮＡ（ＮＳＴ－ＦＩＸ）またはＰＢＳを投与した動物と比較して、一部の動物において個々の腫瘍体積を減少させたことを示す。完全奏功（ＣＲ）は、潰瘍のために３匹の動物を除去したが、７匹の動物のうちの３匹（４４％）において見られた。これらのデータは、ｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍内投与した場合、抗腫瘍有効性を有することを示す。
（実施例３）
Ｂ細胞リンパ腫（Ａ２０）同系モデルにおけるＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに腫瘍内投与された、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を評価した。
Ａ．ＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡおよび対照の調製
ｍｉＲＮＡ結合部位を含まない（ｍｉＲｌｅｓｓ）ＩＬ１２ポリペプチド（マウスＩＬ１２）をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（ＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓ）を調製した（以下に記載される配列）。
Figure 0007246930000150
Figure 0007246930000151
実施例１に記載のようなｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ポリヌクレオチドを調製した。陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）も調製した（非翻訳可能型の同じｍＲＮＡ）（ＮＳＴ ＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓ）。全ての修飾されたｍＲＮＡを、実施例１に記載されたＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。
Ｂ．Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍モデル
Ａ２０細胞株を使用するＢ細胞リンパ腫のマウスモデルは、腫瘍を分析するのに有用である（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２２巻：５４９～５５４頁（１９７９年）；Ｄｏｎｎｏｕら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１２：７０１７０４頁（２０１２年））。Ａ２０細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＢ細胞リンパ腫から導出され、典型的には、皮下埋込み体として同系マウス中で増殖する。５００，０００個のＡ２０細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下的に埋め込んで、皮下腫瘍を生成した。腫瘍を、サイズおよび触診可能性についてモニタリングした。
一度、腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達したら、マウスを３群にコホート化した。１つの試験群には、動物１匹あたり５μｇのｍＲＮＡの用量で、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓを腫瘍内投与した。第２の試験群には、動物１匹あたり５μｇのｍＲＮＡの用量でＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２を腫瘍内投与した。対照群には、等価用量の非翻訳対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）を投与した。動物に、埋込み後１０日目まで投与した。結果を、図７Ａ～７Ｃに示す。
この試験を、埋込み後５０日目まで実行した。試験における終点は、動物の死または予め決めておいた２０００ｍｍ３の腫瘍体積の終点であった。
Ｃ．結果
図７Ａは、５μｇの対照ＮＳＴ ｍＲＮＡで処置した全部で１２匹の動物において、腫瘍体積（ｍｍ３で測定）が時間と共に増大したことを示す。図７Ｂは、対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）を投与された動物と比較して、ｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓで処置された一部の動物において、腫瘍体積が時間と共に減少したことを示す。完全奏功（ＣＲ）は、１２匹の動物のうちの５匹（４２％）において見られた。したがって、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの腫瘍内投与は、Ａ２０腫瘍モデルにおいて有効である。
図７Ｃは、５μｇのｍＩＬ１２－ｍｉＲ１２２で処置された動物における腫瘍体積の変化を示す（図７Ｃ）。完全奏功（ＣＲ）は、ＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２群の１２匹のマウスのうちの６匹において達成された（図７Ｃ）。
図７Ａ～７Ｃ中のデータは、ｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓおよびｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍内投与した場合、同等の抗腫瘍有効性を有することを示す。
（実施例４）
修飾されたＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回および複数回用量のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
単回０．５μｇ用量および複数回用量（０．５μｇを７日間で６回）として投与された、修飾されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を、Ａ２０ Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を担持するＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて試験した。
Ａ．修飾されたＩＬ１２ ｍＲＮＡ
それぞれ、実施例１および実施例３に記載された、ｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ポリヌクレオチドおよびｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓポリヌクレオチドを調製した。一方の群のｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡを、実施例１に記載のようにＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。別の群のｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡを、化合物１８に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。
Ｂ．投薬
埋込み後１０日目に、Ａ２０腫瘍を担持する２群のマウス（各群においてｎ＝１２）に、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓまたはＩＬ１２ ｍｉＲ１２２－ｍＲＮＡの形態の単回０．５μｇ用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与した。
また、埋込み後１０日目に、Ａ２０腫瘍を担持する別の群のマウスに、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中の０．５μｇの週用量のＩＬ１２ ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡを、７日間で６回、腫瘍内投与した。
また、埋込み後１０日目に、Ａ２０腫瘍を担持する別の群のマウスに、化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇの週用量のＩＬ１２ ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡを、７日間で６回、腫瘍内投与した。
最後に、埋込みの１０日後に、Ａ２０腫瘍を担持する別の群のマウス（１群あたりｎ＝１２）に、ＭＣ３に基づくＬＮＰまたは化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇの週用量の非翻訳陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）を、７日間で６回、投与した。
Ｃ．結果
図８Ａ～８Ｂに示されるように、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍モデル（Ａ２０）におけるｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性は、Ａ２０腫瘍を担持するマウスに、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇの単回用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与した後に達成された。図８Ａは、ＩＬ１２ ｍｉＲｌｅｓｓ（０．５μｇ）を投与した一部のマウスにおける腫瘍体積の減少および４匹の完全奏功（ＣＲ）が達成されたことを示す。図８Ｂは、ＩＬ１２ ｍｉＲ１２２（０．５μｇ）を投与した一部のマウスにおける腫瘍体積の減少および３匹の完全奏功（ＣＲ）が達成されたことを示す。
図８Ｃに示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性は、単回投与と比較して、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のＩＬ１２ ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡの毎週の投薬レジメン（０．５μｇのｍＲＮＡ、７日間で６回）について増強された（図８Ｂを参照されたい）。図８Ｃは、０．５μｇの週用量のＩＬ１２ ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡを７日間で６回投与された１２匹のＡ２０担持マウスにおいて、５匹のＣＲが達成されたことを示す。
化合物１８ ＬＮＰ中のＩＬ１２ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性は、腫瘍増殖の遅延により見られるように、ＭＣ３ ＬＮＰ中のＩＬ１２ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性と比較して増強された（図８Ｄ）。図８Ｄは、化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを７日間で６回投与された１２匹のマウスに関する個々の腫瘍体積を示す。また、完全奏功（ＣＲ）は、１２匹の動物のうちの５匹において達成された。
図８Ｅ～８Ｆに示されるように、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の０．５μｇの非翻訳陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）（図８Ｅ）および化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇのＮＳＴ（図８Ｆ）の週用量（７日間で６回）を投与されたＡ２０腫瘍を担持するマウスにおいて、腫瘍増殖が観察された。
このデータは、修飾されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ（ｍｉＲ１２２とｍｉＲｌｅｓｓの両方）を含むポリヌクレオチドが、低用量（０．５μｇ）で抗腫瘍有効性を示すことを示す。それはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を、複数回投薬レジメンを用いて潜在的に増強することができることも示す。最後に、このデータは、ＭＣ３に基づく、および化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇのＩＬ１２ ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡを毎週（７日間で６回）腫瘍内投与する場合のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性を示す。対照的に、ＭＣ３に基づく脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）および化合物１８に基づくＬＮＰ中の０．５μｇの非翻訳陰性対照ｍＲＮＡ（ＮＳＴ）の週用量（７日間で６回）を投与されたＡ２０腫瘍を担持するマウスにおいて、腫瘍増殖が観察された。
（実施例５）
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後のＡ２０担持マウスの血漿および腫瘍中のＩＬ１２ ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＰ１０、ＩＬ６、ＧＣＳＦ、およびＧＲＯαのレベルの分析
埋込み後１０日目に、Ａ２０腫瘍を担持するマウス群（各群でｎ＝１２）に、ＭＣ３に基づくＬＮＰもしくは化合物１８に基づくＬＮＰ中のｍｉＲ１２２ ＩＬ１２ ｍＲＮＡの用量（５μｇ、２．５μｇ、もしくは０．５μｇ）、同じ投与量のＮＳＴもしくはＩＬ１２タンパク質、またはＰＢＳを投与した。
腫瘍および血漿ＩＬ１２ ｐ７０のレベル、ならびに他のサイトカインのレベルを、前記投与量の投与後６および２４時間で決定した。ＩＬ１２（ｐ７０）のレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡ市販キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を使用して決定した。ＩＦＮγ、ＩＰ１０、ＩＬ６、Ｇ－ＣＳＦ、およびＧＲＯαのレベルも決定した。
結果：図９Ａ～９Ｂは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中の示された用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへの投与後６時間および２４時間での血漿（図９Ａ）および腫瘍（図９Ｂ）中のＩＬ１２の用量依存的レベルを示す。
図９Ｃ～９Ｄは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと比較した、化合物１８に基づくＬＮＰ中の示された用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿および腫瘍中のＩＬ１２のレベルの上昇を示す。図９Ｃは、６時間および２４時間での血漿ＩＬ１２レベルを示す；図９Ｄは、６時間および２４時間での腫瘍ＩＬ１２レベルを示す。表１０は、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ投与後（６時間および２４時間）の血漿および腫瘍中のＩＬ１２の倍数増大を示す。
Figure 0007246930000152
図９Ｅ～９Ｆは、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｅ）および腫瘍（図９Ｆ）中の６時間および２４時間でのＩＦＮγのレベルの増大を示す。
図９Ｇ～９Ｈは、Ａ２０腫瘍を担持するマウスへのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｇ）および腫瘍（図９Ｈ）中の６時間および２４時間でのＩＰ１０のレベルの増大を示す。
図９Ｉ～９Ｊは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと比較した、化合物１８に基づくＬＮＰ中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｉ）および腫瘍（図９Ｊ）中の６時間および２４時間でのＩＬ６のレベルの低下を示す。
図９Ｋ～９Ｌは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと比較した、化合物１８に基づくＬＮＰ中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｋ）および腫瘍（図９Ｌ）中の６時間および２４時間でのＧ－ＣＳＦのレベルの低下を示す。
図９Ｍ～９Ｎは、ＭＣ３に基づくＬＮＰ中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと比較した、化合物１８に基づくＬＮＰ中のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後の血漿（図９Ｍ）および腫瘍（図９Ｎ）中の６時間および２４時間でのＧＲＯαのレベルの低下を示す。
本実施例におけるデータは、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの腫瘍内投与に関する血漿および腫瘍中でのＩＬ１２の用量依存的レベルを示す（図９Ａおよび９Ｂ）。このデータはまた、ＭＣ３に基づくＬＮＰと比較した化合物１８に基づくＬＮＰに由来する血漿および腫瘍中のＩＬ１２レベルの増大（図９Ｃおよび９Ｄ）、ならびにマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与に起因する、ＩＦＮγおよびＩＰ１０レベルの増大（図９Ｅ～９Ｈ）を示す。最後に、本実施例は、ＭＣ３で製剤化されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと比較した、化合物１８で製剤化されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡに関する血漿および腫瘍中のＩＬ６、Ｇ－ＣＳＦ、およびＧＲＯαのレベルの低下を示す（図９Ｉ～９Ｎ）。
（実施例６）
皮下Ａ２０モデルにおけるＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡの静脈内（ＩＶ）投与のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
Ａ．試験設計
５００，０００個のＡ２０細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下的に埋め込んだ。腫瘍平均がおよそ１００ｍｍ３に達した時、Ａ２０腫瘍を担持するマウスを、２つの処置群（Ｎ＝１０）にコホート化した。マウスに、ＬＮＰを含有する化合物１８ ＰＥＧ中の０．５ｍｇ／ｋｇのマウスｍＲＮＡを７日毎（Ｑ７Ｄ）にＩＶ投与した。
対照群を、ＬＮＰ中で製剤化された陰性対照ｍＲＮＡで処置したが、処置群には、３’ＵＴＲ中にｍｉＲ１２２結合エレメントを有するマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを含有するＬＮＰを投与した。化合物１８を含有するＬＮＰの使用およびｍｉＲ１２２結合エレメントの組込みは、肝臓からの潜在的なタンパク質産生を減らすことを意味していた。
腫瘍体積および体重を、週に２回測定し、２０００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されるＩＡＣＵＣプロトコールに従って、一般的な臨床観察を行った。
Ｂ．有効性データ
図１０Ａにおける適切な陰性対照と比較した、化合物１８ ＰＥＧを含有するＬＮＰ中で製剤化されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ＋ｍｉＲ１２２結合エレメントの週用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を、図１０Ｂに示す。投薬日は、垂直の赤色の破線で示され、２０００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点は水平の黒色の破線で示される。
Ｃ．副作用／毒性の評価
図１０Ｃにおける適切な陰性対照と比較した、化合物１８ ＰＥＧを含有するＬＮＰ中で製剤化されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ＋ｍｉＲ１２２結合エレメントの週用量で処置されたマウスに由来する個々の体重を、図１０Ｄに示す。
Ｄ．結論
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの静脈内投与は、適切な陰性対照（すなわち、開始「ＮＳＴ」コドンを有さないｍｉＲ１２２結合エレメントを有する同一に製剤化されたｍＲＮＡのＩＶ処置）と比較して、Ａ２０腫瘍の増殖を遅延させた。一般的な臨床観察および体重測定値によってより定量的に決定されたように、０．５ｍｇ／ｋｇ Ｑ７Ｄの有効用量が良好に許容された。
（実施例７）
ＩＰ ＭＣ３８モデルにおけるマウスＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡの腹腔内（ＩＰ）投与のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
Ａ．試験設計
腫瘍量を生きている動物においてカリパスによって評価することができない状況で増殖させる場合、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を、ＭＣ－３８結腸細胞株内に組み込んで、これらの細胞からの生物発光の測定を可能にした。これらの細胞からの光出力は、腫瘍量と相関していた。
５００，０００個のＭＣ－３８ルシフェラーゼ可能化（ＭＣ３８－ｌｕｃ）細胞を、腹腔への結腸がん転移のモデルとしてこの空間に接種した。生物発光シグナルに基づいてマウスを様々な処置群に割り当て、疾患誘導の７日後に処置を開始した。
マウスを、ＬＮＰ中で製剤化されたマウスｍＲＮＡ（５０：３８．５：１０：１．５のモル％のＭＣ３：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ－ＤＭＧ）の単回腹腔内（ＩＰ）用量で処置し、１μｇの組換えマウスＩＬ１２タンパク質の単回ＩＰ用量と比較した。２つの固定用量レベルのｍＲＮＡ（２μｇおよび４μｇ）の単回用量を、疾患誘導後７日目に投与し、ｍｉＲ１２２結合エレメントを有する、および有さないマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを、適切な陰性対照（同一に製剤化されたＬＮＰ中に封入されたｍｉＲ１２２結合エレメントを有する非開始ＮＳＴ ｍＲＮＡ）と比較して、異なる処置群において評価した。
腫瘍体積および体重を頻繁に測定し、一般的な臨床観察を、適切なＩＡＣＵＣプロトコールに従って行った。
Ｂ．有効性データ
生物発光（ＢＬ）を、腫瘍量の代用物として使用し、図１１Ａに示されるように疾患誘導後２２日目を含む数日で測定した。処置群および用量レベルは、図１１Ｂに示される。マウスに、処置なし、２μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓ、２μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２、２μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、４μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲｌｅｓｓ、４μｇのｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２、４μｇのＮＳＴ＿ＯＸ４０Ｌ＿１２２、および１μｇのｒｍＩＬ１２を投与した。全ての処置群においてマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたマウスは、陰性対照よりも低いＢＬシグナルを呈した。
Ｃ．副作用／毒性の評価：
処置は一般に良好に許容され、処置なし群は１０％を超える体重減少を呈した（図１１Ｂ）。
Ｄ．結論
図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、両方の固定用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで埋込み後１５０日まで処置されたマウスは、陰性対照と比較して、腫瘍量の尺度として低いレベルのＢＬシグナルを呈し、この抑制されたＢＬレベルは、腹腔内投与されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの見かけの生存利益と関連していた。３’ＵＴＲ内にｍｉＲ１２２結合ドメインを含有するマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡは、この制御エレメントを有さないｍＲＮＡ（ｍｉＲ－ｌｅｓｓ）と類似する有効性を呈した。用いられた有効用量は、一般に良好に許容されると考えられた。
固定用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたマウスは、陰性対照と比較して、腫瘍量の尺度として低いレベルのＢＬシグナルを呈し、この抑制されたＢＬレベルは、腹腔内投与されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの見かけの生存利益と関連していた。
（実施例８）
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後のマウスにおけるＩＬ１２およびＩＦＮγレベルの分析
ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスに、標準的な化合物１８に基づくＬＮＰ中のマウスｍｉＲ１２２ ＩＬ１２ ｍＲＮＡの１つまたは複数の用量を腫瘍内（ｉＴｕ）投与した。特に、マウスに、ＬＮＰ中のマウスｍｉＲ１２２ ＩＬ１２ ｍＲＮＡ（０．０５μｇ、０．５μｇ、もしくは５．０μｇ）の単回腫瘍内（ｉＴｕ）用量、同じレベルのマウスｍｉＲ１２２ ＩＬ１２ ｍＲＮＡの複数ｉＴｕ用量（４×）、または対照としての５．０μｇのＮＳＴを投与した。
血漿ＩＬ１２およびＩＦＮγのレベルを、投与量の投与後２４時間で決定した。ＩＬ１２およびＩＦＮγのレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づく多重パネル（ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｐａｎｅｌ １Ａ ３６ｐｌｅｘ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して決定した。
図１７Ａは、腫瘍を担持するマウスへの示された用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後２４時間での血漿中のＩＬ１２の用量依存的レベルを示す。ＩＬ１２の血漿濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、以下の表１１に示す。
Figure 0007246930000153
図１７Ｂは、腫瘍を担持するマウスへのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後２４時間での血漿中のＩＦＮγのレベルの増大を示す。この図面はしたがって、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与が、複数回用量にわたってＩＦＮγ発現を誘導することを示す。
あるいは、癌腫症のモデルとしての腹腔内にＭＣ３８結腸腺癌細胞を担持するマウスに、単回固定腹腔内（ＩＰ）用量のマウスｍｉＲ１２２ ＩＬ１２ ｍＲＮＡ（２μｇもしくは４μｇ）、マウスｍｉＲｌｅｓｓ ＩＬ１２ ｍＲＮＡ（２μｇもしくは４μｇ）、または組換えＩＬ１２タンパク質（ｒｍＩＬ１２）（１μｇ）を、ＭＣ３８細胞を播種した後７日目に投与した。血漿ＩＬ１２およびＩＦＮγのレベルを、標準的な技術を使用して投与量の投与後に決定した。
図１８Ａ～１８Ｂは、ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスへのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの腹腔内（ＩＰ）投与後の血漿中のＩＬ１２（図１８Ａ）および血漿中のＩＦＮγ（図１８Ｂ）のレベルの増大を示す。
これらのデータは、ＩＬ－１２の腫瘍内と腹腔内の両方の投与が、ＩＦＮγの血漿レベルを増大させたことを示す。さらに、ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＩＬ－１２の複数回投薬は、血漿ＩＬ－１２とＩＦＮγの両方の反復レベルを誘導する。
（実施例９）
Ａ２０モデルにおけるＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡの腫瘍内（ｉＴｕ）投与のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
Ａ２０腫瘍細胞を、マウスに皮下的に埋め込んだ。Ａ２０腫瘍を担持するマウスを、２つの処置群（Ｎ＝１２）にコホート化した。マウスに、化合物１８－ＬＮＰ中の０．５μｇのｍＲＮＡを、７日毎（Ｑ７Ｄ）にｉＴｕで投与した。
対照群を、同じＬＮＰ中で製剤化された陰性対照ｍＲＮＡで処置したが、処置群には、３’ＵＴＲ中にｍｉＲ１２２結合部位を有するマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ（ｍＩＬ１２－ｍｉＲ１２２）を含有するＬＮＰを投与した。
腫瘍体積を、Ａ２０細胞を埋め込んだ後、９０日の経過にわたって測定し、一般的な臨床観察を、２０００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されたＩＡＣＵＣプロトコールに従って行った。
化合物１８－ＬＮＰ中で製剤化されたｍＩＬ１２－ｍｉＲ１２２のｉＴｕ投薬で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を、図１９Ａにおける陰性対照と比較して図１９Ｂに示す。図１９Ｂは、４匹のマウスが９０日目までに完全奏功を達成したことを示す。
図１９Ｂに由来する見かけの完全奏功マウス（４／１２）に、Ａ２０腫瘍細胞を再チャレンジした。再チャレンジしたマウスに由来する個々の腫瘍体積を、図１９Ｃ中のＡ２０で再チャレンジしたナイーブマウスにおける腫瘍増殖と比較して図１９Ｄに示す。図１９Ｃは、新しく埋め込まれた腫瘍を担持する１０匹の対照マウスのうちの９匹が、４５日目までにその終点（２０００ｍｍ３の腫瘍体積）に達したことを示す。しかしながら、図１９Ｄは、Ａ２０腫瘍を再チャレンジした図１９Ｂに由来する４匹全部の完全奏功マウスが、６０日目までいかなる腫瘍増殖も示さなかったことを示す。これは、ｍＩＬ１２－ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡ投与が、再チャレンジの際に腫瘍増殖を予防するのに十分なものである免疫記憶応答をマウスに提供したことを示す。
（実施例１０）
ＭＣ３８－ＳモデルにおけるＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡの腫瘍内（ｉＴｕ）投与のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ＭＣ３８－Ｓ細胞を、マウスに埋め込んだ。一般に、ＭＣ３８－２とも記載されるＭＣ３８－Ｓは、療法に対してより感受性の高い細胞株である。理論によって束縛されるものではないが、この観察の１つの説明は、観察されるＣＤ４５＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、およびＤＣのレベルの増大、ならびにＭＣ３８－Ｓ腫瘍がよりゆっくり増殖し、試験したＩＭＴに対してより感受性が高いという観察である。ＭＣ３８－Ｓ腫瘍のこれらの特徴は全て、ＭＣ３８－Ｒ腫瘍（ＭＣ３８－１またはＭＣ３８－Ｍとも記載される）との比較によるものであり、両方とも有用なモデルである。
ＭＣ３８－Ｓ腫瘍を担持するマウスを、４つの処置群（Ｎ＝１５）にコホート化した。マウスに、化合物－１８ ＬＮＰ中の０．０５μｇ、０．５μｇ、または５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡをｉＴｕ投与した。陰性対照として、マウスに、ＮＳＴ－ＦＩＸ ｍＲＮＡをｉＴｕ投与したか、または処置しなかった。単回および複数回用量試験において、実験群および対照群のマウスは、同じ投薬レジメンを受けた。
ＭＣ３８－Ｓ細胞を埋め込んだ後、８０日の経過にわたって、各群において腫瘍体積および生存を測定し、１５００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されたプロトコールに従って一般的な臨床観察を行った。
０．０５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２０Ａおよび図２１Ａに示し、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２０Ｂおよび図２１Ｂに示し、５μｇの製剤化されたマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２０Ｃおよび図２１Ｃに示し、図２０Ｄ中の適切な陰性対照と比較した。１５００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図２０Ａおよび図２１Ａは、１５匹のマウスのうちの６匹が完全奏功を達成したことを示す。図２０Ｂ、図２１Ｂ、図２０Ｃ、および図２１Ｃは、１５匹のマウスのうちの１３匹が完全奏功を達成したことを示し、これは、５μｇについて見られた同様の応答を考慮すれば、０．５μｇの低用量が最大有効応答を示すのに十分なものであり得ることを示している。
０．０５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの２回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２１Ｄに示し、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの２回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２１Ｅに示し、５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの２回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２１Ｆに示す。１５００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図２１Ｄは、１５匹のマウスのうちの９匹が完全奏功を達成したことを示す。図２１Ｅおよび図２１Ｆは、１５匹のマウスのうちの１４匹が完全奏功を達成したことを示す。このデータは、一部の腫瘍型において、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回投与が、腫瘍を減少させるか、または除去するのに十分なものである抗腫瘍効果を達成することができることを示す。
用量応答の傾向は、０．０５～０．５μｇの間の用量レベルで明確であった。閾値は、０．５μｇ以下のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで達成されると考えられた。２回用量のＩＬ１２ ｍＲＮＡもまた、単回用量を超えて有益であった。任意の用量のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与された全てのマウスが、生存利益を示した（図２２）。したがって、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの腫瘍内投与は、適切な陰性対照と比較してＭＣ３８－Ｓ腫瘍の増殖またはサイズを遅延させたか、または減少させ、生存利益を提供した。
（実施例１１）
ＭＣ３８－ＲモデルにおけるＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡの腫瘍内（ｉＴｕ）投与のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ＭＣ３８－Ｒ細胞を、マウスに埋め込んだ。一般に、ＭＣ３８－１またはＭＣ３８－Ｍとも呼ばれるＭＣ３８－Ｒは、療法に対してより耐性の高い細胞株である。理論によって束縛されるものではないが、この観察の１つの説明は、観察されるＣＤ４５＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞、およびＤＣ、および「骨髄由来抑制細胞」のマーカーを担持するより多くの細胞のレベルの低下、ならびにＭＣ３８－Ｒ腫瘍がより速く増殖し、試験した免疫媒介療法に対してより感受性が低いという観察である。ＭＣ３８－Ｒ腫瘍のこれらの特徴は全て、ＭＣ３８－Ｓ腫瘍との比較によるものであり、両方とも有用なモデルである。
ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスを、４つの処置群（Ｎ＝１３）にコホート化した。マウスに、化合物－１８ ＬＮＰ中の０．０５μｇ、０．５μｇ、または５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡをｉＴｕ投与した。陰性対照として、マウスに、ＮＳＴ－ＦＩＸ ｍＲＮＡをｉＴｕ投与したか、または処置しなかった。単回および複数回用量試験において、実験群および対照群のマウスは、同じ投薬レジメンを受けた。
ＭＣ３８－Ｒ細胞を埋め込んだ後、７５日の経過にわたって、各群において腫瘍体積および生存を測定した。
０．０５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２３Ａおよび図２３Ｅに示し、ＬＮＰ中で製剤化された０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２３Ｂおよび図２３Ｆに示し、ＬＮＰ中で製剤化された５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２３Ｃおよび図２３Ｇに示し、図２３Ｄ中の適切な陰性対照と比較した。２０００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図２３Ａおよび図２３Ｅは、０．０５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後にＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスが完全奏功を達成しなかったことを示す。図２３Ｂおよび図２３Ｆは、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後にＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持する２匹のマウスが完全奏功を達成したことを示す。図２３Ｃおよび図２３Ｇは、５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後にＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持する４匹のマウスが完全奏功を達成したことを示す。
０．０５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの複数回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２３Ｈに示し、ＬＮＰ中で製剤化された０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの２回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２３Ｉに示し、ＬＮＰ中で製剤化された５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの２回ｉＴｕ用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図２３Ｊに示す。２０００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図２３Ｈ～２３Ｊは、複数回投与が単回投与と同様の有効性を有することを示す。
これらの結果は、抗ＰＤ１および抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体などの、他の免疫媒介療法に対するＭＣ３８－Ｒ腫瘍の耐性が実証されたにもかかわらず、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与されたマウスが、生存利益を示したことを示している（図２４）。生存事象は、腫瘍量の終点を含み、処置されたマウスおよび処置されていないマウスにおいて生じた潰瘍／痂皮のため動物を試験から除外した。マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの腫瘍内投与は、適切な陰性対照と比較してＭＣ３８－Ｒ腫瘍の増殖を遅延させ、生存利益を提供し、一般に、良好に許容された。
腫瘍および血漿ＩＬ１２ ｐ７０のレベル、ならびに他のサイトカインのレベルを、投与量の投与後２４時間で決定した。結果は、以前に示されたように、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの腫瘍内投与に関して、血漿中のＩＬ１２の用量依存的レベルを示す。結果はまた、複数回のマウスＩＬ１２投薬後、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５／１５Ｒ、ＩＬ－２７、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－１α、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、およびＩＬ－５の持続的な用量依存的発現も示す（データは示さない）。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＩＬ－３、ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ－６は、５μｇのマウスＩＬ１２投薬後にのみ、発現レベルが上昇した（データは示さない）。
（実施例１２）
ＩＬ１２ ｍＲＮＡ有効性に関与するＣＤ８＋Ｔ細胞
ＩＬ１２ ｍＲＮＡにより誘導される有効性を媒介する際のＣＤ８＋Ｔ細胞の役割を評価付けるために、ＭＣ３８－Ｒ細胞をマウスに埋め込み、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇クローン２４．３を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させ、血液中でＣＤ８＋Ｔ細胞レベルをモニタリングして、有効性試験の経過にわたって枯渇を確認した。２４．３クローンまたは対照抗体を、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与の２日前にマウスに投与した。枯渇または対照抗体を、３日連続で毎日０．５ｍｇにて投与し、３日休んだ後、０．２ｍｇの別の５つの抗体用量を４日毎に投与した。実験を通してフローサイトメトリーを実施して、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇を確認した。
２４．３クローンを使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、２８日の経過にわたって枯渇させたが、抗体対照はＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させなかった（図２５）。血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞数は、フローサイトメトリーにより検査された全ての時点で有意に減少し、したがって、有効な枯渇が確認された。
クローン２４．３によるＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後に０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与されたマウスは、モックＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後に０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与されたマウス（図２６Ｂ）と比較して、腫瘍体積の増大を示した（図２６Ｄ）。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後に０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与されたマウスは、モックＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後に０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡを投与されたマウスと比較して、生存不良を示した（図２６Ｅ）。図２６Ａは、モックＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後に陰性対照ｍＲＮＡで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示し、図２６Ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後に陰性対照ｍＲＮＡで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示す。マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ処置は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇を用いた場合でも腫瘍増殖のある程度の遅延をもたらすと考えられたが、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ処置およびモック枯渇を用いた場合に観察された明確な生存利益とは対照的に、細胞傷害性Ｔ細胞の不在下では完全奏功マウスはいなかった。この結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＬ１２ ｍＲＮＡ媒介性有効性において必須の役割を果たすことを示している。
（実施例１３）
ＩＬ１２ ｍＲＮＡの腫瘍内投与後のＭＣ３８－ＲおよびＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍における免疫浸潤の有意な変化
ＩＬ１２ ｍＲＮＡによる処置後、ＭＣ３８－ＲとＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍の両方において免疫細胞浸潤の有意な変化が起こった。ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を、０．０５μｇまたは０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで腫瘍内処置したが、Ｂ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍を、０．１μｇまたは０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで腫瘍内処置した。
ＭＣ３８－ＲとＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３モデルの両方において、ＰＤＬ１発現について陽性に染色する腫瘍内のＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の百分率は、ＩＬ１２ ｍＲＮＡ処置後、多くの時点で有意に増大した（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。
ＩＬ１２ ｍＲＮＡ処置は、後の時点での、ＭＣ３８－ＲとＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３マウスモデルの両方における腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の増大とさらに相関していた。特に、免疫浸潤（ＣＤ４５＋細胞）のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合および腫瘍組織１ｍｇあたりのＣＤ８＋陽性細胞の数により証明されるように、Ｔ細胞のパーセントは、両方のマウスモデルにおいて０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後７日で統計的に高かった（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。さらに、免疫浸潤（ＣＤ４５＋細胞）のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合により証明されるように、０．１μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３マウスにおける腫瘍中で、有意により多数のＴ細胞が観察された（図２８Ｂ）。ＣＤ４５陽性細胞のパーセントと、１ｍｇあたりの細胞は両方とも、有益である。７日目で、処置群における腫瘍は、特に、０．１μｇおよび０．５μｇ群について、対照よりも小さい。
ＣＤ８＋細胞の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に対する比（ＣＤ８：Ｔｒｅｇ）の増大は、ＭＣ３８－Ｒ（図２９Ａ）とＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３（図２９Ｂ）マウスモデルの両方において見られたが、これは、改善されたエフェクターと抑制因子の比を実証している。特に、０．０５μｇまたは０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたＭＣ３８－Ｒマウスは、陰性対照と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する統計的に有意な高い比を呈したが、これは、７日目での腫瘍組織中のＣＤ８＋細胞の増大とＴｒｅｇ細胞の減少の両方に起因する（図２９Ａ）。同様に、０．１μｇまたは０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３マウスは、陰性対照と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する統計的に高い比を呈したが、これは、ＣＤ８＋細胞の増大に起因する（図２９Ｂ）。
Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の活性化を示す、ＣＤ６９の発現は、ＭＣ３８－ＲとＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍の両方において、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して増大した（図３０Ａ～３０Ｂ）。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化も、ＩＬ－１２ ｍＲＮＡで処置されたＭＣ３８－ＲとＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍の両方において見られた（図３１Ａおよび図３１Ｂ）。
交差提示樹状細胞の増大は、ＭＣ３８－ＲとＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍モデルの両方において観察された。ＣＤ１０３＋ｃＤＣの増大は、７日目でＭＣ３８－Ｒ（図３２Ａ）とＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍（図３２Ｂ）の両方において観察された。さらに、より高いパーセントの活性化ＣＤ８＋ｃＤＣが、Ｂ１６Ｆ１０－ＡＰ３腫瘍における対照と比較して、それぞれ２４時間、７２時間、および７日目に、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡによる処置後に流入領域リンパ節において見出された（図３２Ｃ）。
（実施例１４）
ＭＣ３８－Ｒモデルにおける、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの投与後のＰＤ－Ｌ１の発現の増大（上記の実施例１１を参照されたい）を考慮して、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せ療法の有効性を試験した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体単剤療法の有効性を評価付けるために、ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスに、クローン８０から得られたマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与した。図３３Ａは、抗体対照の投与後のマウスの腫瘍体積の変化を示す。図３３Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与後の腫瘍体積の変化を示す。全てのマウスが終点（すなわち、２０００ｍｍ３の腫瘍）に達したが、これは、抗ＰＤ－Ｌ１処置に対するこのモデルの非感受性を実証している。
ＭＣ３８－Ｒ腫瘍を担持するマウスに、（ｉ）マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのみ、または（ｉｉ）マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡとマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せを、ｉＴｕ投与した。ｍＲＮＡの３つの投与量、すなわち、０．０５μｇ（データは示さない）、０．５μｇおよび５μｇを試験した。ＭＣ３８－Ｒ細胞を埋め込んだ後、９０日の経過にわたって、各群（ｎ＝１５）において、腫瘍体積および生存を測定し、２０００ｍｍ３の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されたプロトコールに従って一般的な臨床観察を行った。
図３３Ｃおよび図３３Ｅは、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡとの組合せ療法は、１５匹のマウスのうちの６匹において完全奏功をもたらしたが、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのみの投与後では、１５匹のマウスのうちの１匹のみが完全奏功を達成したことを示す。図３３Ｄおよび図３３Ｆは、５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡとの組合せ療法においては、１５匹のマウスのうちの１１匹が完全奏功を達成したが、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのみの投与後では、１５匹のマウスのうちの５匹のみが完全奏功を達成したことを示す。図３３Ｇは、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみでは、この試験においてＭＣ３８－Ｒを担持するマウスにおけるいかなる抗腫瘍有効性も有さなかったことを確認するデータを示す。この結果は、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せ療法が、そうでなければチェックポイント阻害剤に対して耐性である腫瘍、例えば、ＭＣ３８－Ｒにおいて相乗的な有効性を示し得ることを示す。
（実施例１５）
抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡの腫瘍内投与のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性
ＭＣ－３８結腸腺癌腫瘍を、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３巻：１３１８～１３２１頁（１９８６年）に記載されたようにマウスに皮下的に埋め込んだ。
ＭＣ３８－ＲまたはＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３マウス腫瘍を担持するマウスに、０．０５μｇ、０．５μｇ、もしくは５μｇの用量の単回腫瘍内用量のＬＮＰ製剤化マウスＩＬ１２修飾されたｍＲＮＡ（化合物１８に基づくＬＮＰと共に製剤化されたｍｉＲ１２２を含むＩＬ１２ ｍＲＮＡ）を、単独で、または腹腔内用量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（クローン８０）と組み合わせて投与した。追加用量を、以下に示されるように投与した。
Ａ．結果
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと抗ＰＤ－Ｌ１抗体（αＰＤ－Ｌ１）との組合せ処置の効果を試験するために、ＭＣ３８－Ｒマウスを、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ（図３４Ａ）、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのみ（図３４Ｂ）、またはマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体と０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの両方（図３４Ｃ）を用いて埋込みの１１日後に処置した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみを使用する処置は、腫瘍増殖に対する効果はほとんどなく（図３４Ａ）、単回用量の０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡによる処置は１匹のＣＲをもたらした（図３４Ｂ）。マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ腫瘍内処置を抗ＰＤ－Ｌ１投与と組み合わせた場合（６回用量で投与）、ＣＲ数の大きな増大が観察された。１５匹のマウスのうちの８匹（５３％）が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡの単回用量後に完全奏功を呈した（図３４Ｃ）。
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡと抗ＰＤ－Ｌ１抗体とを使用する組合せ処置の相乗効果を、免疫学的に不毛であり、また、抗ＰＤＬ１などのチェックポイント遮断療法に対して耐性であると考えられるＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３マウスにおいてさらに観察した。未処置のＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３マウス（図３５Ａ）および抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみ（図３５Ｂ）または単回用量の０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡのみ（図３５Ｃ）で処置されたＢ１６Ｆ１０－ＡＰ３はＣＲをもたらさなかったが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた単回用量の０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたマウス（１１、１４、１８、２１、２５、および２８日目に６回用量で投与）は、１５匹のマウスのうち、２匹のＣＲをもたらした（図３５Ｄ）。
（実施例１６）
遠位腫瘍内へのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ投与後の未照射部位への効果
マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ腫瘍内投与の潜在的な未照射部位への効果を調査するために、ＭＣ３８結腸腺癌腫瘍をマウスの両側に埋め込んだ（ＭＣ３８－Ｓ；図３６Ａ）。進行中の試験において、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたＭＣ３８－Ｓ腫瘍の１７／２０（図３６Ｄ）および５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたＭＣ３８－Ｓ腫瘍の１９／２０（図３６Ｆ）は、今までのところ、約５０ヶ月後も完全奏功を呈している。さらに、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおける遠位腫瘍の３／２０（図３６Ｅ）および５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおける遠位腫瘍の１６／２０が、今までのところ、約５０ヶ月後も完全奏功を呈している（図３６Ｇ）。陰性対照に関する結果を、図３６Ｂおよび図３６Ｃに示す。
これらの未照射部位への効果は、進行中の試験において、マウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ処置を抗ＰＤ－Ｌ１処置と組み合わせた場合に増幅される。両側にＭＣ３８腫瘍を埋め込んだマウスに、単剤療法（図３７Ｃおよび図３７Ｅ）として、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて（２週間にわたって週に２回、２０ｍｇ／ｋｇのＩＰ注射により投与した；図３７Ｄおよび図３７Ｆ）、０．５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３７Ｃ～３７Ｄ）または５μｇのマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡ（図３７Ｅ～３７Ｆ）のいずれかを、１つの腫瘍に腫瘍内投与した。今までのところ、０．５μｇ（図３７Ｃ）および５μｇ（図３７Ｅ）のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおいて３／２０のＣＲおよび１６／２０のＣＲが両側で観察され、抗ＰＤ－Ｌ１と、０．５μｇ（図３７Ｄ）または５μｇ（図３７Ｆ）のマウスＩＬ１２ ｍＲＮＡとの組合せで処置されたマウスにおいて８／２０のＣＲおよび２０／２０のＣＲが両側で観察された。陰性対照に関する結果を、図３７Ａおよび図３７Ｂに示す。
（実施例１７）
ヒトＩＬ１２をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡの評価付け
実施例１で生成されたｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２構築物に加えて、ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードする２０種のコドン最適化されたｍＲＮＡ（ｈＩＬ１２ＡＢ００１～０２０）を調製した。これらのｍＲＮＡはまた、３’ＵＴＲ中にｍｉＲ－１２２結合部位を有していた。
ｍＲＮＡを、Ｎ１－メチルシュードウリジンで完全に修飾した。修飾されたｍＲＮＡを、スクリーニングのためにＭＣ３脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。ＨｅＬａ細胞を、標準的なトランスフェクションプロトコールを使用してトランスフェクトし、トランスフェクションの約２２時間後に発現を決定した。発現を、野生型ｍｕＩＬ１２構築物に由来するものに対して正規化した。試験した多くの構築物は、ｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２構築物と同等か、またはそれの約２倍までの発現を有していた。
また、ＨｅＬａ細胞中で高い発現を有する構築物を、ＭＣ３８細胞、Ｈｅｂ３Ｂ細胞およびＡ２０細胞中での発現について試験して、様々な腫瘍細胞株における発現を確認した。
ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００６およびｈＩＬ１２ＡＢ＿０２１バリアントを、ｉｎ ｖｉｖｏでの試験のためにさらに選択した。Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、Ａ２０細胞を皮下的に埋め込んだ（Ａ２０腫瘍モデル）。腫瘍を増殖させた後、腫瘍に、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡを腫瘍内的に注入した。単回腫瘍内用量のｍＲＮＡの投与の６および２４時間後に、血漿、腫瘍、肝臓および脾臓を収集した（ｎ＝６匹／群）。特に、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２およびｈＩＬ１２ＡＢ＿００６バリアントは、例えば、血漿および腫瘍中で、ｍＩＬ１２＿ｍｉＲ１２２ ｍＲＮＡと比較して良好な発現を示した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの集合的スクリーニングに基づいて、ｈＩＬ１２ＡＢをコードする好ましいｍＲＮＡとして、ｈＩＬ１２ＡＢ＿００２を選択した（図３８）。
他の実施形態
使用されてきた単語は、限定よりもむしろ説明の単語であり、そのより広い態様における本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の権限の中で変更を加えることができることが理解されるべきである。
本開示は、いくつかの記載された実施形態に関してある程度の長さで、また、ある程度の特定性をもって説明されてきたが、それは、任意のそのような詳細もしくは実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の最も広い可能な解釈を提供するため、したがって、本開示の意図される範囲を有効に包含するために、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。さらに、節の見出し、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
概要および要約の節ではなく、詳細な説明の節は、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されることが理解されるべきである。概要および要約の節は、本発明者（ら）によって企図される、１つまたは複数であるが、全てではない、本開示の例示的実施形態を説明してもよく、したがって、いかなる意味でも本開示および添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
本開示を、特定の機能およびその関係の実施を例示する機能的な構成要素を援用して上記で説明してきた。これらの機能的な構成要素の境界は、説明の利便性のために本明細書で任意に定義されている。特定の機能およびその関係が適切に実行される限り、別の境界を定義することができる。
特定の実施形態の前記説明は、したがって、他者が、当技術分野の技術の範囲内にある知識を適用することによって、過度の実験なしに、本開示の一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を容易に改変する、および／または様々な用途に適合させることができる、本開示の一般的性質を完全に示すであろう。したがって、そのような適合化および改変は、本明細書に提示された教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書における表現または用語は、説明のためのものであり、限定のためのものではないことが理解されるべきであり、本明細書の用語または表現は教示および指針の観点から当業者によって解釈されるべきである。
本開示の幅および範囲は、上記の例示的実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されるべきである。

Claims (30)

  1. 腫瘍のサイズの低減または腫瘍の成長の阻害をそれを必要とする対象において行う方法における使用のための組成物であって、
    （ａ）前記組成物は、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡが、インターロイキン１２ ｐ４０サブユニット（「ＩＬ１２Ｂ」）ポリペプチドおよびインターロイキン１２ ｐ３５サブユニット（「ＩＬ１２Ａ」）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含み、
    （ｂ）前記ｍＲＮＡが、イオン化可能アミノ脂質、リン脂質、ステロールおよびＰＥＧ修飾脂質を含む脂質ナノ粒子として製剤化されており、
    （ｃ）前記方法が、前記対象に有効量の前記組成物を腫瘍内投与するステップを含む、
    使用のための組成物。
  2. 前記対象に、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む有効量の組成物、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
  3. （ａ）前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、またはこれらの組合せを阻害する、および／または
    （ｂ）前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体を含む、および／または
    （ｃ）前記組成物を投与するステップが、前記対象におけるＴ細胞を活性化する、
    請求項２に記載の使用のための組成物。
  4. 前記抗体が、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ－１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片、およびこれらの組合せである、請求項３に記載の使用のための組成物。
  5. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブであり、前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、トレメリムマブまたはイピリムマブであり、前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブまたはペンブロリズマブである、請求項４に記載の使用のための組成物。
  6. （ｉ）Ｔ細胞の活性化をそれを必要とする対象において行う、（ｉｉ）腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させることを必要とする対象においてそれを行う、（ｉｉｉ）活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数を増大させることを必要とする対象においてそれを行う、および／または（ｖｉ）交差提示樹状細胞を増大させることを必要とする対象の腫瘍においてそれを行う、方法における使用のための組成物であって、
    （ａ）前記組成物は、ＩＬ－１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡが、ＩＬ１２ＢポリペプチドおよびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、
    （ｂ）前記ｍＲＮＡが、イオン化可能アミノ脂質、リン脂質、ステロールおよびＰＥＧ修飾脂質を含む脂質ナノ粒子として製剤化されており、
    （ｃ）前記方法が、前記対象に有効量の前記組成物を腫瘍内投与するステップを含む、
    使用のための組成物。
  7. 前記Ｔ細胞の活性化が、Ｔ細胞増殖を誘導することを含む、および／または前記Ｔ細胞の活性化が、前記腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導すること、または腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を増大させることを含む、および／または前記Ｔ細胞の活性化が、メモリーＴ細胞応答を誘導することを含む、および／または前記活性化されたＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方を含む、請求項３（ｃ）または６に記載の使用のための組成物。
  8. （ａ）前記組成物を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することが、前記腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーＴ細胞比を増大させ、前記エフェクター対サプレッサーＴ細胞比が、ＣＤ８＋Ｔ細胞：制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の比であり、さらに、ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇ比が、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０である、ならびに／あるいは
    （ｂ）前記組成物を投与することが、前記対象における活性化ＮＫ細胞の数をさらに増大させ、活性化ＮＫ細胞の数が、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増大する、および／または前記増大した活性化ＮＫ細胞が、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、または少なくとも約１４日間維持される、ならびに／あるいは
    （ｃ）前記組成物を投与することが、前記対象の前記腫瘍における交差提示樹状細胞を増大させ、前記交差提示樹状細胞が、ＣＤ１０３＋細胞である、
    請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  9. （ａ）前記組成物を投与することが、前記対象における遠位腫瘍のサイズを低減するか、または遠位腫瘍の成長を阻害する、および／または
    （ｂ）前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドおよび前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、直接またはリンカーによって融合されており、
    （ｉ）前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドまたは前記リンカーのＮ末端に位置する、または
    （ｉｉ）前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたは前記リンカーのＮ末端に位置する、および／または
    （ｉｉｉ）前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸２３～３２８に少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ｂ活性を有する、および／または
    （ｉｖ）前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸３３６～５３２に少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、ＩＬ１２Ａ活性を有する、および／または
    （ｖ）前記ｍＲＮＡが、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記シグナルペプチドが、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである、および／または前記シグナルペプチドが、配列番号４８のアミノ酸１～２２に少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、および／または
    （ｖｉ）前記組成物が、リンカーを介してＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む、および／または
    （ｖｉｉ）前記組成物が、ＩＬ１２Ｂシグナルペプチド、ＩＬ１２Ｂポリペプチド、リンカー、およびＩＬ１２ＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを含む、および／または
    （ｖｉｉｉ）前記リンカーが、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含み、前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である、
    請求項１から６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
  10. 前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ を含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である、請求項９に記載の使用のための組成物。
  11. （ａ）前記ｍＲＮＡが、配列番号４８に少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む機能的に活性なＩＬ１２ポリペプチドをコードする、
    （ｂ）前記ｍＲＮＡが、配列番号５～４４、２３６、および２３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が配列番号４８のアミノ酸配列をコードする、
    （ｃ）前記ｍＲＮＡが、配列番号２３６または２３７に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が配列番号４８のアミノ酸配列をコードする、および／または
    （ｄ）前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含み、
    （ｉ）前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、
    （ｉｉ）前記ＯＲＦ中の前記ヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、および／または
    （ｉｉｉ）前記ＯＲＦにおける前記化学的に修飾されたヌクレオシドが、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  12. （ａ）ＯＲＦ中のウリジンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、
    （ｂ）前記ＯＲＦ中のアデノシンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、
    （ｃ）前記ＯＲＦ中のシチジンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、
    （ｄ）前記ＯＲＦ中のグアノシンヌクレオシドが、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％だけ化学的に修飾されている、および／または
    （ｅ）前記ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  13. （ｉ）前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２結合部位である、および／または
    （ｉｉ）前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位である、または
    （ｉｉｉ）前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ａａｃｇｃｃａｕｕａ ｕｃａｃａｃｕａａａ ｕａ（配列番号５１）に少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２２に結合する、または
    （ｉｖ）前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｕｇｇａｇｕｇｕｇａ ｃａａｕｇｇｕｇｕｕ ｕｇ（配列番号５３）に少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２２に結合する、または
    （ｖ）前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｃａａａｃａｃｃａｕ ｕｇｕｃａｃａｃｕｃ ｃａ（配列番号５４）に少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１２２に結合する、
    請求項１２に記載の使用のための組成物。
  14. 前記ｍＲＮＡが、
    （ａ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、前記５’ＵＴＲが、表３に列挙される配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む、および／または
    （ｂ）３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、前記３’ＵＴＲが、表４Ａまたは４Ｂに列挙される配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である核酸配列を含む、および／または前記ｍＲＮＡが、３’ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡ結合部位を含み、さらに、前記ｍＲＮＡが、前記ｍｉＲＮＡ結合部位に融合されたヌクレオチドスペーサー配列を含み、さらに、前記ヌクレオチドスペーサー配列が、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含む、および／または
    （ｃ）５’末端キャップ構造を含み、前記５’末端キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体である、および／または
    （ｄ）３’ポリＡ尾部を含む、および／または
    （ｅ）少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含む、および／または
    （ｆ）コドン最適化ＯＲＦを含む、および／または
    （ｇ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドである、かつ／または環状である、
    請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  15. 前記脂質ナノ粒子が、
    （ａ）ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、アミノアルコール脂質、ＫＬ２２、およびこれらの組合せからなる群から選択される脂質を含む、または
    （ｂ）式（Ｉ）を有する化合物、
    Figure 0007246930000154
    またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
    Ｒ１は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
    Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
    Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
    各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
    Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
    各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
    各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
    各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
    各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
    ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、
    ただし、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、
    請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  16. （ｉ）前記化合物が、式（ＩＡ）の化合物、
    Figure 0007246930000155
    またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
    ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
    ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
    Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
    Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
    ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
    Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される、または
    （ｉｉ）前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物、
    Figure 0007246930000156
    またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
    ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
    Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
    Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
    ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
    Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される、または
    （ｉｉｉ）前記化合物が、化合物１から化合物１４７、
    Figure 0007246930000157
    Figure 0007246930000158
    Figure 0007246930000159
    Figure 0007246930000160
    Figure 0007246930000161
    Figure 0007246930000162
    Figure 0007246930000163
    Figure 0007246930000164
    Figure 0007246930000165
    Figure 0007246930000166
    Figure 0007246930000167
    Figure 0007246930000168
    Figure 0007246930000169
    Figure 0007246930000170
    Figure 0007246930000171
    Figure 0007246930000172
    Figure 0007246930000173
    Figure 0007246930000174
    Figure 0007246930000175
    Figure 0007246930000176
    Figure 0007246930000177
    ならびにそれらの塩および立体異性体から選択される、または
    （ｉｖ）前記化合物が、式（ＩＩａ）の化合物、
    Figure 0007246930000178
    またはその塩もしくは立体異性体である、または
    （ｖ）前記化合物が、式（ＩＩｂ）の化合物、
    Figure 0007246930000179
    またはその塩もしくは立体異性体である、または
    （ｖｉ）前記化合物が、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物、
    Figure 0007246930000180
    またはその塩もしくは立体異性体である、または
    （ｖｉｉ）式IにおけるＲ４が、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され、ここで、Ｑ、Ｒ、およびｎは、請求項１５の（ｂ）において定義される通りである、または
    （ｖｉｉｉ）前記化合物が、式（ＩＩｄ）の化合物、
    Figure 0007246930000181
    またはその塩もしくは立体異性体であり、
    式中、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ５～１４アルキルおよびＣ５～１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、および４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６、およびｍは、請求項１５の（ｂ）において定義される通りである、
    請求項１５に記載の使用のための組成物。
  17. 前記脂質ナノ粒子が、式（Ｉ）を有する化合物、
    Figure 0007246930000182
    またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
    Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
    Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、および－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
    Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、および５から選択され、
    各Ｒ５は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    各Ｒ６は、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    ＭおよびＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－（Ｓ）Ｓ－、－（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
    Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
    Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
    各Ｒは、独立して、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニル、およびＨからなる群から選択され、
    各Ｒ’は、独立して、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、およびＨからなる群から選択され、
    各Ｒ”は、独立して、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から選択され、
    各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から選択され、
    各Ｙは、独立して、Ｃ３～６炭素環であり、
    各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され、
    ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択され、
    ただし、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２ではない、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるとき、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、
    請求項１から１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  18. （ａ）前記化合物が、式（ＩＡ）の化合物、
    Figure 0007246930000183
    またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
    ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
    ｍは、５、６、７、８、および９から選択され、
    Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
    Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、ＭおよびＭ’は、独立して、－（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
    Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される、および／または
    （ｂ）前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物、
    Figure 0007246930000184
    またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
    ｌは、１、２、３、４、および５から選択され、
    Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
    Ｒ４は、非置換Ｃ１～３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、もしくは－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、ＭおよびＭ’は、独立して、－（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
    Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、およびＣ２～１４アルケニルからなる群から選択される、および／または
    （ｃ）前記化合物が、上記に定義される化合物１から化合物１４７、化合物１４８から化合物２３２、
    Figure 0007246930000185
    Figure 0007246930000186
    Figure 0007246930000187
    Figure 0007246930000188
    Figure 0007246930000189
    Figure 0007246930000190
    Figure 0007246930000191
    Figure 0007246930000192
    Figure 0007246930000193
    Figure 0007246930000194
    Figure 0007246930000195
    Figure 0007246930000196
    Figure 0007246930000197
    Figure 0007246930000198
    それらの塩および立体異性体、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、
    請求項１７に記載の使用のための組成物。
  19. （ａ）前記リン脂質が、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
    １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
    １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
    １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
    １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
    １，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
    １，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテルＰＣ）、
    １－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、
    １－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
    １，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
    １，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
    １，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
    １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
    １，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
    １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
    １，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
    １，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
    １，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
    １，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
    １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、
    スフィンゴミエリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、または
    前記リン脂質が、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
    １－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－０２：０ ＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－２０：４ ＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－２２：６ ＰＣ）、
    １－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
    １－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
    １－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
    １－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：２ ＰＣ）、
    １－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２０：４ ＰＣ）、
    １－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２２：６ ＰＣ）、
    １－オレオイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
    １－オレオイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
    １－オレオイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
    １－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：２ ＰＥ）、
    １－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２０：４ ＰＥ）、
    １－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２２：６ ＰＥ）、
    １－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：１ ＰＥ）、
    １－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：２ ＰＥ）、
    １－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２０：４ ＰＥ）、
    １－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２２：６ ＰＥ）、
    １－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、および/または
    （ｂ）前記ステロールが、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、および/または
    （ｃ）前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、および/または
    （ｄ）前記脂質ナノ粒子が、
    ３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
    Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
    １４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
    １，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、
    ２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、
    ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、
    ２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、
    １，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、
    ２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、
    （２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および
    （２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む、および/または
    （ｅ）前記脂質ナノ粒子が、第四級アミン化合物をさらに含み、前記第四級アミン化合物が、
    １，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、
    Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、
    １－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、
    ２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、
    Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、
    Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、
    Ｎ－（１，２－ジオレオイルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、
    Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、
    １，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＬｅＰＣ）、
    １，２－ジステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＴＡＰ）、
    １，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、
    １，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬＴＡＰ）、
    １，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＭＴＡＰ）、
    １，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＳｅＰＣ）、
    １，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＰｅＰＣ）、
    １，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭｅＰＣ）、
    １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯｅＰＣ）、
    １，２－ジ－（９Ｚ－テトラデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１４：１ ＥＰＣ）、
    １－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１６：０－１８：１ ＥＰＣ）、
    およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、
    請求項１から１８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  20. （ａ）前記投与が、がんを処置し、および／または
    （ｂ）前記組成物が、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末／粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、ＲＦエネルギー、電流を利用するデバイス、あるいはこれらの任意の組合せによって投与される、および／または
    （ｃ）前記有効量が、約０．１０ｍｇ／ｋｇ～約１，０００ｍｇ／ｋｇである、および／または
    （ｄ）前記対象が、ヒトである、
    請求項１から１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  21. 前記がんが、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される、および／または
    前記がんが、転移性がんである、請求項２０に記載の使用のための組成物。
  22. ヒトＩＬ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延の方法における使用のための組成物であって、前記ｍＲＮＡが、ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されたヒトＩＬ１２ＢポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、前記脂質ナノ粒子が、イオン化可能アミノ脂質、リン脂質、ステロールおよびＰＥＧ修飾脂質を含む、組成物。
  23. （ａ）前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、ペプチドリンカーによって、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドに作動可能に連結されている、および／または
    （ｂ）前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ａポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーのＮ末端に位置する、または
    （ｃ）前記ＩＬ１２Ａポリペプチドが、前記ＩＬ１２Ｂポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーのＮ末端に位置する、および／または
    （ｄ）前記ペプチドリンカーが、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含み、前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（ＧｎＳ）ｍを含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０である、および／または
    （ｅ）前記ＯＲＦが、シグナルペプチドをコードし、前記シグナルペプチドが、ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドである、および／または
    （ｆ）前記ヒトＩＬ１２Ｂポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸２３～３２８に記載されるアミノ酸配列を含む、および／または
    （ｇ）前記ヒトＩＬ１２Ａポリペプチドが、配列番号４８のアミノ酸３３６～５３２に記載されるアミノ酸配列を含む、および／または
    （ｈ）前記ヒトＩＬ１２Ｂシグナルペプチドが、配列番号４８のアミノ酸１～２２に記載されるアミノ酸配列を含む、および／または
    （ｉ）前記ヒトＩＬ１２ポリペプチドが、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む、および／または
    （ｊ）前記ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１２２結合部位、さらに、ｍｉＲ－１２２－３ｐまたはｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位、さらに、配列番号５４に記載される配列を含むｍｉＲ－１２２－５ｐ結合部位である、および／または
    （ｋ）前記ｍＲＮＡが、３’ＵＴＲを含み、前記３’ＵＴＲが、配列番号２４０に記載される配列を含む、および／または、ｍｉＲＮＡ結合部位が、前記３’ＵＴＲに位置する、および／または
    （ｌ）前記ｍＲＮＡが、５’ＵＴＲを含み、前記５’ＵＴＲが、配列番号３９に記載される配列を含む、および／または
    （ｍ）前記ｍＲＮＡが、５’末端キャップ構造を含み、前記５’末端キャップ構造が、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはこれらの類似体である、および／または
    （ｎ）前記ｍＲＮＡが、３’ポリＡ尾部を含む、および／または
    （ｏ）前記ｍＲＮＡが、配列番号６または配列番号２３６または２３７に記載される配列を含む、および／または
    （ｐ）前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含むＯＲＦを含み、前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、および／または
    （ｑ）前記脂質ナノ粒子が、約２０～６０％のイオン化可能アミノ脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のステロール；および０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、および／または
    （ｒ）前記脂質ナノ粒子が、約５０％のイオン化可能アミノ脂質：１０％のリン脂質：３８．５％のコレステロール；および１．５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、および／または
    （ｓ）前記イオン化可能アミノ脂質が、上記に定義される化合物１８である、
    請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇ ｎ Ｓ） ｍ を含み、ここで、ｎは６であり、ｍは１である、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、Ｎ１－メチルシュードウリジンである、請求項２３に記載の組成物。
  26. 請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は、前記脂質ナノ粒子および任意選択の薬学的に許容される担体を含む医薬を含み、前記処置が、前記組成物を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することを含む、組成物。
  27. 請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬と、前記医薬を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示を含む添付文書とを含む、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のためのキット。
  28. 請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は薬学的に許容される担体を含み、前記処置が、前記組成物を第２の組成物と組み合わせて腫瘍内投与することを含み、前記第２の組成物が、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  29. 請求項２２から２５のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延の方法における使用のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、腫瘍内投与のために製剤化されている、医薬組成物。
  30. 請求項２９に記載の医薬組成物を含む容器と、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のための前記医薬組成物の投与に関する指示を含む添付文書とを含む、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延の方法における使用のためのキットであって、前記添付文書が、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のために、前記医薬組成物を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示をさらに含む、キット。
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