KR20150128687A - 메신저 rna의 정제 방법 - Google Patents

메신저 rna의 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150128687A
KR20150128687A KR1020157024040A KR20157024040A KR20150128687A KR 20150128687 A KR20150128687 A KR 20150128687A KR 1020157024040 A KR1020157024040 A KR 1020157024040A KR 20157024040 A KR20157024040 A KR 20157024040A KR 20150128687 A KR20150128687 A KR 20150128687A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mrna
vitro
purified
rna
concentration
Prior art date
Application number
KR1020157024040A
Other languages
English (en)
Inventor
미쉘 하트레인
프랭크 데로사
아누샤 디아스
쉬리랑 카르브
Original Assignee
샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. filed Critical 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크.
Publication of KR20150128687A publication Critical patent/KR20150128687A/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01DSEPARATION
    • B01D35/00Filtering devices having features not specifically covered by groups B01D24/00 - B01D33/00, or for applications not specifically covered by groups B01D24/00 - B01D33/00; Auxiliary devices for filtration; Filter housing constructions
    • B01D35/02Filters adapted for location in special places, e.g. pipe-lines, pumps, stop-cocks
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

[125] 본 발명은 다른 것들 중 특히, 시험관내 합성된 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 변성 조건으로 처리하는 단계, 및 접선 유동 여과에 의해 단계 (a) 유래의 불순한 제제로부터 mRNA를 정제하는 단계를 포함하는 메신저 RNA(mRNA)의 정제 방법을 제공하며, 여기서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA에는 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약이 실질적으로 없다.

Description

메신저 RNA의 정제 방법{METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 2013년 3월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/784,996호의 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
메신저 RNA 치료법은 다양한 질환의 치료를 위한, 점점 더 중요한 방법이 되고 있다. 메신저 RNA 치료법은 치료법을 필요로 하는 환자로의 메신저 RNA(mRNA)의 투여 및 환자의 체 내에서 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 생성을 수반한다. 따라서, 매우 순수하고 안전한 mRNA 생성물의 생성을 보장하는 것은 중요하다. 종래에, RNA 정제에는 전형적으로, 스핀 칼럼(spin column)이 사용되고, 가성 또는 가연성 용매, 예를 들어, 에탄올의 사용이 수반되며, 이는 치료적 투여 및 대규모 생성에 바람직하지 않다.
본 발명은 접선 유동 여과(tangential flow filtration: TFF)에 기초한 약제학적 제품으로서의 투여에 적절한 개선된 mRNA의 정제 방법을 제공한다. 본 발명 이전에, RNA 정제에는 전형적으로 스핀 칼럼이 사용되고, 가성 또는 가연성 용매, 예를 들어, 에탄올의 사용이 수반되며, 이는 치료적 투여 및 대규모 생성에 바람직하지 않다. 더욱이, 종래 기술 방법은 전형적으로 조기 중단(premature abort) 또는 "숏머(shortmer)"로 알려져 있는 불완전한 전사물의 분리를 가능하게 하지 않으며, 당해 불완전한 전사물은 고도로 면역자극성인 것으로 보고되어 있으며, 그의 존재는 활성 약제학적 성분(API)으로서의 mRNA의 독성 및 내약성 프로파일을 크게 변경시킬 수 있다. 본 발명은 부분적으로 접선 유동 여과가 놀랍게도 mRNA 생성 혼합물로부터 반응물질, 효소, 부생성물, 특히 숏머를 제거하는데 효과적이라는 발견에 기초한다. 본원에 기술된 바와 같이, 특히 변성제를 사용하는 사전처리와 병용되는 접선 유동 여과는 반응물질, 효소, 및 조기 중단 RNA 서열(즉, 숏머)을 포함하는 부생성물을 효율적으로 제거하면서, 여전히 mRNA의 완전성(integrity)을 유지할 수 있다. 더욱 놀라운 것은 본 발명자들이 접선 유동 여과가 임의의 가성 또는 인화성 용매를 사용하지 않고, 용매로서 오직 수성 완충제만을 사용하여 성공적으로 수행될 수 있는 것을 입증하였다는 것이다. 따라서, 본 발명은 치료적 응용을 위한 더욱 효율적이고, 신뢰성 있으며, 안전한, 대규모 제조 프로세스로부터의 mRNA의 정제 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 다른 것들 중 특히, (a) 시험관내 합성된 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 변성 조건으로 처리하는 단계, 및 (b) 접선 유동 여과에 의해, 단계 (a) 유래의 불순한 제제로부터 mRNA를 정제하는 단계를 포함하는 메신저 RNA(mRNA)의 정제 방법을 제공하며, 여기서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA에는 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약이 실질적으로 없다.
일부 실시형태에서, 단계 (a)는 단백질 변성제를 불순한 제제에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 불순한 제제를 실온에서 약 1 내지 10분(예를 들어, 약 2 내지 9분, 2 내지 8분, 2 내지 7분, 3 내지 10분, 3 내지 9분, 3 내지 8분, 3 내지 7분, 3 내지 6분, 4 내지 10분, 4 내지 9분, 4 내지 8분, 4 내지 7분, 4 내지 6분) 동안 첨가된 단백질 변성제와 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 불순한 제제를 실온에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10분 동안 첨가된 단백질 변성제와 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 불순한 제제를 실온에서 약 5분 동안 첨가된 단백질 변성제와 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적절한 단백질 변성제는 유레아, 구아니디늄 티오시아네이트, KCl, 나트륨 도데실 설페이트, 사르코실, 기타 세제 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 단계 (a)는 유레아를 불순한 제제에 첨가하여, 약 1M 이상의 초래된 유레아 농도를 달성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 초래된 유레아 농도는 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상, 5M 이상, 6M 이상, 7M 이상, 8M 이상, 9M 이상 또는 10M 이상이다.
일부 실시형태에서, 단계 (a)는 구아니디늄 티오시아네이트를 불순한 제제에 첨가하여, 약 1M 이상의 초래된 구아니디늄 티오시아네이트 농도를 달성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 초래된 구아니디늄 티오시아네이트 농도는 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상, 5M 이상, 6M 이상, 7M 이상, 8M 이상, 9M 이상 또는 10M 이상이다.
일부 실시형태에서, 단계 (a)는 KCl을 불순한 제제에 첨가하여, 약 1M 이상의 초래된 KCl 농도를 달성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 초래된 KCl 농도는 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상 또는 5M 이상이다.
일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 오직 수성 용매만을 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 용매로서 물을 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 대략 100 내지 200㎖/분(예를 들어, 대략 100 내지 180㎖/분, 100 내지 160㎖/분, 100 내지 140㎖/분, 110 내지 190㎖/분, 110 내지 170㎖/분 또는 110 내지 150㎖/분)의 공급 속도 및/또는 대략 10 내지 50㎖/분(예를 들어, 대략 10 내지 40㎖/분, 10 내지 30㎖/분, 20 내지 50㎖/분 또는 20 내지 40㎖/분)의 유동 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 대략 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200㎖/분의 공급 속도 및/또는 대략 10, 20, 30, 40 또는 50㎖/분의 유동 속도로 수행된다.
일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 약 5% 미만(예를 들어, 약 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)의 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 약 1% 미만(예를 들어, 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만)의, 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 0.5% 미만의 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 0.1% 미만의 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 에티듐 브로마이드 및/또는 쿠마시 염색(Coomassie staining)에 의해 결정시, 검출가능하지 않은 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다.
일부 실시형태에서, 조기 중단 RNA 서열은 15개 미만의 염기(예를 들어, 14, 13, 12, 11, 10, 9 또는 8개 미만의 염기)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조기 중단 RNA 서열은 약 8 내지 12개 염기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약은 T7 RNA 중합효소, DNAse I, 피로포스파타제(pyrophosphatase) 및/또는 RNAse 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약은 T7 RNA 중합효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 캡(cap) 및 폴리-A 테일(tail)을 시험관내 합성된 mRNA에 첨가하기 이전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 캡 및 폴리-A 테일을 시험관내 합성된 mRNA에 첨가한 이후에 수행된다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 캡 및 폴리-A 테일을 시험관내 합성된 mRNA에 첨가하기 이전과 이후에 수행된다.
일부 실시형태에서, 시험관내 합성된 mRNA는 길이가 약 1kb, 1.5kb, 2kb, 2.5kb, 3kb, 3.5kb, 4kb, 4.5kb 또는 5kb 초과이다. 일부 실시형태에서, 시험관내 합성된 mRNA는 안정성을 향상시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 변형된 뉴클레오타이드, 변형된 당 포스페이트 백본, 5' 및/또는 3' 비번역 영역으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 합성된 mRNA는 변형되지 않는다.
일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 약 95% 초과(예를 들어, 약 96%, 97%, 98%, 99% 초과)의 완전성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 98% 초과의 완전성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 99% 초과의 완전성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA는 대략 100%의 완전성을 갖는다.
또한, 본 발명은 시험관내에서 mRNA를 합성하는 단계 및 본원에 기술된 방법에 따라 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는 단계를 포함하는 메신저 RNA(mRNA)의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 따라 정제된 메신저 RNA(mRNA)를 제공한다.
본 출원에 사용되는 바와 같은 용어 "약" 및 "대략적으로"는 동등한 것으로 사용된다. 약/대략적으로와 함께 또는 이것 없이 본 출원에 사용되는 임의의 수치는 관련 분야의 숙련자에 의해 이해되는 임의의 정상적인 변동을 포함할 것이다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 명백해진다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 실시형태를 나타내면서, 제한하는 것이 아니라, 단지 예시적인 것으로 제공되는 것을 이해해야 한다. 상세한 설명으로부터 본 발명의 범주 내에서 다양하게 변화 및 변형되는 것이 당업자에게 명백해질 것이다.
하기의 도면은 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것이 아니다.
도 1은 겔 전기영동 및 쿠마시 염색에 의해 나타나는 바와 같은, 유레아에 대한 노출을 포함하는 제공된 방법에 따라 정제된 FFL mRNA 시료의 시험관내 전사에서의 예시적인 단백질 수준을 다양한 대조군과 함께 보여준다.
도 2는 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 나타나는 바와 같은, 종래의 방법에 따라 정제된 mRNA에 비한, 제공된 방법에 따라 정제된 시험관내 전사 시료에서의 예시적인 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase, FFL) mRNA 수준을 보여준다.
도 3은 겔 전기영동 및 쿠마시 염색에 의하여, 종래의 방법에 따라 정제된 mRNA에 비한, 5M 유레아에 대한 노출과 함께 또는 이것 없이, TFF를 포함하는 제공된 방법에 따라 정제된 FFL mRNA의 시험관내 전사 시료에서의 예시적인 단백질 수준을 보여준다.
도 4는 종래의 방법으로부터 제공된, 정제된 mRNA에 비한, 제공된 방법으로부터 제공되는, 번역되고 정제된 FFL mRNA로부터 수집된 예시적인 형광 데이터를 도시한 것이다.
도 5는 겔 전기영동 및 쿠마시 염색에 의하여, 종래의 방법에 따라 정제된 mRNA에 비한, 프로테이나제(proteinase) K 및/또는 5M 유레아에 대한 노출을 포함하는 제공된 방법에 따라 정제된 인자 IX(FIX) mRNA의 시험관내 전사 시료로부터의 예시적인 단백질 수준을 보여준다.
도 6은 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 나타나는 바와 같은, 제공된 방법에 따라 정제된 시험관내 전사 시료에서의 예시적인 FIX mRNA 수준을 보여준다.
도 7은 겔 전기영동 및 쿠마시 염색에 의하여, 종래 방법에 따라 정제된 mRNA에 비한, 2M KCl에 대한 노출을 포함하는 제공된 방법에 따라 정제된 낭성 섬유증 막횡단 전위 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; CFTR) mRNA의 시험관내 전사 시료에서의 예시적인 단백질 수준을 보여준다.
도 8은 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 나타나는 바와 같은, 2M KCl에 대한 노출을 포함하는 제공된 방법에 따라 정제된 시험관내 전사 시료에서의 예시적인 CFTR mRNA 수준을 보여준다.
도 9는 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 나타나는 바와 같은, 종래의 방법에 따라 정제된 mRNA에 비한, 2M KCl에 대한 노출을 포함하는 제공된 방법에 따라 정제된 시험관내 전사 시료에서의 예시적인 CFTR mRNA 수준을 보여준다.
정의
본 발명을 더욱 용이하게 이해하기 위하여, 특정 용어를 먼저 하기에 정의한다. 하기의 용어 및 기타 용어에 대한 추가의 정의는 상세한 설명에 기술된다.
동물: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "동물"은 동물 계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "동물"은 임의의 발생 단계의 인간을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "동물"은 임의의 발생 단계의 비-인간 동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 포유류(예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시형태에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 및/또는 연충류를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전자 조작된 동물 및/또는 클론일 수 있다.
대략적으로 또는 약: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 하나 이상의 대상의 값에 적용되는 경우, 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 값의 범위가 달리 언급되지 않는 한, 또는 다르게는 문맥에서 명백해지지 않는 한, (이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고) 어느 하나의 방향으로(그보다 크거나 또는 작게) 언급된 참조 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 이내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
생물학적으로 활성인: 본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "생물학적 활성인"은 생물계, 및 특히 유기체에서 활성을 가지는 임의의 작용제의 특징을 나타낸다. 예를 들어, 유기체에게 투여되는 경우, 상기 유기체에 생물학적으로 영향을 갖는 작용제가 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다.
발현: 본원에 사용되는 바와 같은, 핵산 서열의 "발현"은 폴리펩타이드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄)로의 mRNA의 번역, 무손상 단백질(예를 들어, 항체)로의 다수의 폴리펩타이드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄)의 조립 및/또는 폴리펩타이드 또는 완전히 조립된 단백질(예를 들어, 항체)의 번역후 변형을 나타낸다. 본 출원에서 용어 "발현" 및 "생성" 및 문법상 동의 어구가 상호교환가능하게 사용된다.
작용성: 본원에 사용되는 바와 같은 "작용성" 생물학적 분자는 그것이 특징으로 하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다.
개선시키다 , 증가시키다, 또는 감소시키다: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "개선시키다", "증가시키다" 또는 "감소시키다" 또는 문법상 동의 어구는 기준선 측정치, 예를 들어 본원에 기술된 치료를 개시하기 이전의 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기술된 치료의 부재하의 대조군 대상체(또는 다수의 대조군 대상체)에서의 측정치에 대해 상대적인 값을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료되는 대상체와 거의 동일한 연령인, 치료되는 대상체와 동일한 형태의 질환을 앓는 대상체이다.
불순물: 본원에 사용되는 용어 "불순물"은 표적 물질 또는 화합물의 화학적 조성과 상이한, 한정된 양의 액체, 기체 또는 고체 내측의 물질을 나타낸다. 불순물은 또한 오염물질로도 지칭된다.
시험관내: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "시험관내"는 사례가 다세포 유기체 내에서보다는 인공 환경에서, 예를 들어 시험관 또는 반응 용기에서, 세포 배양물 등에서 발생하는 것을 나타낸다.
생체내: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "생체내"는 사례가 다세포 유기체, 예를 들어 인간 및 비-인간 동물 내에서 발생하는 것을 나타낸다. 세포 기반 시스템과 관련하여, 상기 용어는 사례가(예를 들어, 시험관내 시스템과 반대로) 살아있는 세포 내에서 발생하는 것을 나타낼 수 있다.
단리된: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단리된"은 물질 및/또는 엔티티(entity)가 (1) (천연에서든 및/또는 실험 환경에서든) 처음 생성되는 경우, 그와 회합되어 있는 성분 중 적어도 일부로부터 분리되고/거나, (2) 인공으로 생성, 제조 및/또는 제작되는 것을 나타낸다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 그들이 처음에 회합되어 있는 다른 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에 사용되는 바와 같이, 물질에 실질적으로 다른 성분이 없다면, 상기 물질은 "순수한" 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 엔티티의 순도 백분율의 계산은 부형제(예를 들어, 완충제, 용매, 물 등)를 포함하지 않아야 한다.
메신저 RNA( mRNA ): 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "메신저 RNA(mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같은 mRNA는 변형된 및 비변형된 RNA 둘 모두를 포함한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비-코딩 영역을 함유할 수 있다.
mRNA 완전성: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "mRNA 완전성"은 일반적으로 mRNA의 질을 나타낸다. 일부 실시형태에서, mRNA 완전성은 정제 프로세스(예를 들어, 접선 유동 여과) 후에 분해되지 않은 mRNA의 백분율을 나타낸다. mRNA 완전성은 당업계에 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여, 예를 들어, RNA 아가로스 겔 전기영동(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology])에 의해 결정될 수 있다.
핵산: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "핵산"은 그의 가장 넓은 의미로, 폴리뉴클레오타이드 사슬 내로 혼입되거나, 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 핵산은 포스포다이에스터 결합을 통해 폴리뉴클레오타이드 사슬 내로 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 실시형태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오사이드)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 사슬을 나타낸다. 일부 실시형태에서, "핵산"은 RNA 및 단일 및/또는 이중-가닥 DNA 및/또는 cDNA를 포함한다. 더욱이, 용어 "핵산", "DNA", "RNA" 및/또는 유사 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포다이에스터 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 당업계에 알려져 있으며, 백본 내에 포스포다이에스터 결합 대신에 펩타이드 결합을 갖는 소위 "펩타이드 핵산"은 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다. 용어 "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 변성형이고/거나 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 및/또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있고, 임의로 화학적으로 정제되고 화학적으로 합성될 수 있는 등이다. 적절한 경우, 예를 들어 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 백본 변형 등을 갖는 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 나타내지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 천연 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 유리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘); 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-유리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모유리딘, C5-플루오로유리딘, C5-아이오도유리딘, C5-프로피닐-유리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예를 들어, 메틸화된 염기); 개재된 염기; 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기(예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미디트 결합)이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 구체적으로, 전달을 용이하게 하거나 또는 이를 달성하기 위해, 화학적으로 변형되지 않은 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 및 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오사이드를 포함하는 잔기)을 의미하는 "변형되지 않은 핵산"에 관한 것이다.
환자: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체"는 제공되는 조성물이 예를 들어, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료적 목적을 위해 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예를 들어, 포유류, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 및/또는 인간)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생 전과 후의 형태를 포함한다.
약제학적으로 허용되는: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는"은 합리적인 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 합당한 이익/위험 비로 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적절한 물질을 나타낸다.
조기 중단 RNA 서열: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "조기 중단 RNA 서열"은 mRNA 합성 반응(예를 들어, 시험관내 합성 반응)의 불완전한 생성물을 나타낸다. RNA 중합효소는 다양한 이유로, DNA 주형의 완전한 전사를 항상 완성하지는 않으며; 다시 말하면, RNA 합성은 조기에 종결된다. RNA 합성의 조기 종결의 가능한 원인은 DNA 주형의 질, 주형에 존재하는 특정 중합효소에 대한 중합효소 종결자 서열, 분해된 완충제, 온도, 리보뉴클레오타이드의 고갈 및 mRNA 2차 구조를 포함한다. 조기 중단 RNA 서열은 요망되는 전사 생성물의 의도되는 길이 미만의 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 조기 중단 mRNA 서열은 1000개 미만의 염기, 500개 미만의 염기, 100개 미만의 염기, 50개 미만의 염기, 40개 미만의 염기, 30개 미만의 염기, 20개 미만의 염기, 15개 미만의 염기, 10개 미만의 염기이거나 그보다 더 적을 수 있다.
: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "염"은 산과 염기 간의 중화 반응으로부터 야기되거나, 야기될 수 있는 이온성 화합물을 지칭한다.
대상체: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비-인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 나타낸다. 인간은 출생 전과 후의 형태를 포함한다. 많은 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 환자일 수 있으며, 이는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 보여지는 인간을 지칭한다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개체" 또는 "환자"와 상호교환가능하게 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애를 앓고 있을 수 있거나, 그에 걸리기 쉽지만, 질환 또는 장애의 증상을 나타내거나, 나타내지 않을 수 있다.
실질적으로: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로"는 전체 또는 거의 전체에 가까운 범위 또는 정도의 관심 특징 또는 특성을 나타내는 질적 상태를 나타낸다. 생물학적 및 화학적 현상이 설사 있다 해도 드물게 완성되고/거나, 완성될 때까지 진행되거나, 또는 절대적 결과를 달성하거나 또는 회피하는 것을 생물학 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 그러므로, 용어 "실질적으로"는 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재하는 완성도의 잠재적인 결여를 포착하는 데 사용된다.
실질적으로 없는: 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로 없는"은 제거되어야 하는 물질(예를 들어, 조기 중단 RNA 서열)의 양이 상대적으로 거의 존재하지 않거나, 존재하지 않는 상태를 나타낸다. 예를 들어, "조기 중단 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 조기 중단 RNA 서열이 대략 5%, 4%, 3%, 2%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 미만(w/w)의 불순물의 수준으로 존재하는 것을 의미한다. 대안적으로, "조기 중단 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 조기 중단 RNA 서열이 약 100ng, 90ng, 80ng, 70ng, 60ng, 50ng, 40ng, 30ng, 20ng, 10ηg, 1ηg, 500ρg, 100ρg, 50ρg, 10ρg 미만의 수준으로 존재하는 것을 의미한다.
상세한 설명
본 발명은 다른 것들 중 특히, 접선 유동 여과에 기초하여 불순한 제제(예를 들어, 시험관내 합성 반응 혼합물)로부터 mRNA를 정제하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 창의적인 방법은 (a) 시험관내 합성된 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 변성 조건으로 처리하는 단계, 및 (b) 접선 유동 여과에 의해 단계 (a) 유래의 불순한 제제로부터 mRNA를 정제하는 단계를 포함하며, 여기서, 단계 (b)로부터 정제된 mRNA에는 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약이 실질적으로 없다.
본 발명의 다양한 양태는 하기의 섹션에 상세히 기술된다. 섹션의 이용은 본 발명을 제한하는 의도가 아니다. 각각의 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 이러한 응용에서, "또는"의 사용은 다르게 언급되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다.
mRNA의 합성
mRNA는 전형적으로 DNA로부터 리보솜으로 정보를 전달하는 RNA의 유형으로 생각된다. mRNA의 존재는 전형적으로 매우 잠시 동안이며, 프로세싱 및 번역에 이어서 분해를 포함한다. 전형적으로, 진핵 유기체에서, mRNA 프로세싱은 N-말단(5') 상에 "캡" 및 C-말단(3') 상에 "테일"의 부가를 포함한다. 전형적인 캡은 7-메틸구아노신 캡이며, 이는 5'-5'-트라이포스페이트 결합을 통해 먼저 전사된 뉴클레오타이드에 연결된 구아노신이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 관찰되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는데 중요하다. 테일은 전형적으로, 폴리아데닐화 사건에 의해, 폴리아데닐릴 모이어티가 mRNA 분자의 3' 말단에 부가된 것이다. 이러한 "테일"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 메신저 RNA는 리보솜에 의해, 단백질을 구성하는 일련의 아미노산으로 번역된다.
본 발명에 따른 mRNA는 다양한 공지되어 있는 방법 중 임의의 것에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 약술하면, IVT는 전형적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형, 리보뉴클레오타이드 트라이포스페이트의 풀(pool), DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충제 시스템, 및 적절한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타제 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용에 따라 달라질 것이다. 이들 시약의 존재는 몇몇 실시형태에 따른 최종 생성물에서 바람직하지 않으며, 이에 따라, 불순물로 지칭될 수 있으며, 이들 불순물 중 하나 이상을 함유하는 제제는 불순한 제제로 지칭될 수 있다.
본 발명에 따른 mRNA는 상업적 규모로 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, mRNA는 배취(batch)당 0.1g, 0.5g, 1g, 2g, 3g, 4g, 5g, 6g, 7g, 8g, 9g, 10g, 20g, 30g, 40g, 50g, 60g, 70g, 80g, 90g, 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 600g, 700g, 800g, 900g 또는 1,000g 초과의 규모로 정제된다.
다양한 실시형태에 따르면, 본 발명은 다양한 길이의 시험관내 합성된 mRNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명을 사용하여, 길이가 약 1kb, 1.5kb, 2kb, 2.5kb, 3kb, 3.5kb, 4kb, 4.5kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14kb 또는 15kb 초과인 시험관내 합성된 mRNA를 정제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명을 사용하여, 전형적으로 안정성을 향상시키는 하나 이상의 변형을 함유하는 mRNA를 정제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 변형된 뉴클레오타이드, 변형된 당 포스페이트 백본, 5' 및/또는 3' 비번역 영역으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 본 발명을 사용하여 변형되지 않은 시험관내 합성된 mRNA를 정제할 수 있다.
전형적으로, mRNA는 안정성을 향상시키기 위해 변형된다. mRNA의 변형은 예를 들어, RNA의 뉴클레오타이드의 변형을 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 변형된 mRNA는 예를 들어, 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 인코딩 mRNA(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 인코딩 mRNA)는 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 유라실(U)), 및 퓨린 및 피리미딘의 변형된 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체로서, 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-아이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-아이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-다이아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-다이메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도유라실(5-유라실), 다이하이드로-유라실, 2-티오-유라실, 4-티오-유라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-유라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-유라실, 5-플루오로-유라실, 5-브로모-유라실, 5-카복시메틸아미노메틸-유라실, 5-메틸-2-티오-유라실, 5-메틸-유라실, N-유라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 5-메틸아미노메틸-유라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-유라실, 5'-메톡시카보닐메틸-유라실, 5-메톡시-유라실, 유라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 유라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-슈도유라실, 퀘오신, β-D-만노실-퀘오신, 와이부톡소신(wybutoxosine) 및 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 펩타이드 뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신 및 이노신을 포함하나 이들에 한정되지 않는 천연 발생 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드 유사체(변형된 뉴클레오타이드)로부터 합성될 수 있다. 이러한 유사체의 제조는 예를 들어, 미국 특허 제4,373,071호, 미국 특허 제4,401,796호, 미국 특허 제4,415,732호, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,500,707호, 미국 특허 제4,668,777호, 미국 특허 제4,973,679호, 미국 특허 제5,047,524호, 미국 특허 제5,132,418호, 미국 특허 제5,153,319호, 미국 특허 제5,262,530호 및 제5,700,642호로부터 당업자에게 공지되어 있으며, 이들의 개시내용은 그의 전체 범주가 본원에 참조로 포함된다.
전형적으로, mRNA 합성은 N-말단(5')단 상에 "캡" 및 C-말단(3') 상에 "테일"의 부가를 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 관찰되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는데 중요하다. "테일"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
따라서, 일부 실시형태에서, mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 하기와 같이 부가된다: 먼저, RNA 말단 포스파타제는 5' 뉴클레오타이드로부터 말단 포스페이트기 중 하나를 제거하여, 2개의 말단 포스페이트를 남긴 다음; 구아노신 트라이포스페이트(GTP)를 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 포스페이트에 부가하여, 5'5'5 트라이포스페이트 결합을 생성한 다음; 구아닌의 7-질소를 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화시킨다. 캡 구조의 예에는 m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 일부 실시형태에서 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 야생형 mRNA를 포함하는 다른 mRNA의 공급원이 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다.
일부 실시형태에서, mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 비번역 영역은 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어, 철 반응성 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 신호, 세포 내의 위치의 mRNA의 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 3' 비번역 영역은 길이가 50 내지 500개 뉴클레오타이드이거나, 그보다 더 길 수 있다.
본 발명을 사용하여, 다양한 단백질을 인코딩하는 mRNA를 정제할 수 있다. 반딧불이 루시퍼라제, 인자 IX 및 CFTR을 인코딩하는 mRNA의 정제의 비제한적인 예는 실시예 섹션에 상세히 기술되어 있다.
변성 조건 및 변성제
전형적으로, 분자간 힘을 파괴시킴으로써 일시적으로 또는 영구적으로 단백질 또는 핵산의 입체형태를 변화시키는 것은 변성으로 지칭된다. 변성은 구조적 변화 및 종종 활성의 소실을 야기한다. 분자의 고유 입체형태가 통상 대부분 수용성이기 때문에, 분자의 2차 및 3차 구조를 파괴시키는 것은 용해도의 변화를 유발할 수 있으며, 용액으로부터 단백질 또는 핵산의 침전을 야기할 수 있다. 놀랍게도, 본원에 기술된 바와 같이, 접선 유동 여과(TFF)와 병용되는 변성 조건을 사용하여, mRNA 정제를 용이하게 하면서, mRNA의 완전성을 유지할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "변성 조건"은 변성을 유발할 수 있는 임의의 화학적 또는 물리적 조건을 나타낸다. 예시적인 변성 조건은 화학 시약, 고온, 극도의 pH 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 변성 조건은 하나 이상의 변성제를 정제될 mRNA를 함유하는 불순한 제제에 첨가하는 것을 통해 달성된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 적절한 변성제는 단백질 및/또는 DNA 변성제이다. 일부 실시형태에서, 변성제는 1) 효소(예를 들어, 세린 프로테이나제 또는 DNase), 2) 산, 3) 용매, 4) 가교제, 5) 카오트로픽제(chaotropic agent), 6) 환원제 및/또는 7) 높은 염 농도를 통한 높은 이온 세기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 작용제가 이들 범주 중 하나 초과의 범주에 속할 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 효소를 변성제로 사용하여, mRNA 합성에 사용되는 단백질 및 DNA 주형을 분해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 효소는 세린 프로테아제, 예를 들어, 키모트립신 및 키모트립신-유사 세린 프로테아제, 트립신 및 트립신-유사 세린 프로테아제, 엘라스타제 및 엘라스타제-유사 세린 프로테아제, 서브틸리신 및 서브틸리신-유사 세린 프로테아제 및 그들의 조합, 데옥시리보뉴클레아제(DNase), 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제 I, II 및/또는 IV, 제한 효소, 예를 들어, EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, SpeI, SphI, StuI, XbaI, 및 그들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 산이 변성제로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 산은 아세트산, 포름산, 옥살산, 시트르산, 벤조산, 클로로아세트산, 다이클로로아세트산, 트라이클로로아세트산, 아스코르브산, 설포살리실산 및 그들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 용매가 변성제로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 아이소프로필 알콜, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 아이소부틸 케톤, 에탄올, 메탄올, 데나토늄 및 그들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 카오트로픽제가 변성제로 청구될 수 있다. 카오트로픽제는 비공유적 힘, 예를 들어, 수소 결합 및 반데르발스 힘을 간섭함으로써 거대분자, 예를 들어, 단백질 및 핵산의 구조를 파괴하는 물질이다. 일부 실시형태에서, 카오트로픽제는 유레아, 티오유레아, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 아이소티오시아네이트, 리튬 아세테이트, 염화마그네슘, 나트륨 도데실 설페이트, 과염소산리튬 및 그들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 정제될 mRNA를 함유하는 불순한 제제를 유레아로 처리한다. 일부 실시형태에서, 얻어지는 유레아 농도가 약 1M 이상이 되도록 하는 양의 유레아를 첨가한다. 일부 실시형태에서, 얻어지는 유레아 농도가 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상, 5M 이상, 6M 이상, 7M 이상, 8M 이상, 9M 이상, 또는 10M 이상이도록 유레아를 첨가한다. 일부 실시형태에서, 정제될 mRNA를 함유하는 불순한 제제를 구아니디늄 티오시아네이트로 처리한다. 일부 실시형태에서, 얻어지는 구아니디늄 티오시아네이트 농도가 약 1M 이상이 되도록 하는 양의구아니디늄 티오시아네이트를 첨가한다. 일부 실시형태에서, 얻어지는 구아니디늄 티오시아네이트 농도가 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상, 5M 이상, 6M 이상, 7M 이상, 8M 이상, 9M 이상, 또는 10M 이상이도록 구아니디늄 티오시아네이트를 첨가한다.
일부 실시형태에서, 환원제는 변성제로서 사용될 수 있다. 환원제는 전자를 다른 종에게 공여하여, 이에 따라 그 자체가 산화되는 화합물이다. 일부 실시형태에서, 환원제는 리튬 알루미늄 하이드라이드, 나트륨 아말감, 다이보레인, 나트륨 보로하이드라이드, 설파이트, 다이아이소부틸알루미늄 하이드라이드, 포스파이트, 일산화탄소, 2-머캅토에탄올, 다이티오트레이톨 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀 및 그들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, pH, 열 및/또는 중금속(예를 들어, 납, 수은 또는 카드뮴) 중 하나 이상도 또한 변성제로서 사용될 수 있다. 극도의 pH가 단백질이 변성되게 하는 것으로 알려져 있다. 단백질 사슬의 백본이 중성이지만, 단백질을 구성하는 아미노산 잔기는 종종 산성 및 염기성 기를 함유한다. 이들 기는 통상 하전되고, 반대 전하의 기와 염 가교를 형성할 수 있다. 따라서, 극도의 pH는 이들 산성 및 염기성 기에서 전하를 변화시켜, 염 가교를 파괴할 수 있다.
이들 실시형태에서, 덜 급격한 pH의 변화는 또한, 단백질의 활성 및 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 단백질은 개별 아미노산과 같이 음의 전하의 수가 양의 전하의 수와 동등한 등전점을 갖는다. 이것은 종종 수용해도가 최소인 시점이다. 등전 pH에서, 분자에 순 전하가 존재하지 않는다. 개별 분자는 서로 접근하고, 응집하고, 용액 밖으로 침전하는 경향을 갖는다. 등전 pH 초과 또는 미만의 pH에서, 분자는 각각 음의 또는 양의 순 전하를 갖는다. 따라서, 단백질 분자가 서로 접근하는 경우에, 그들은 동일한 전체 전하를 가지며, 서로 반발한다.
일부 실시형태에서, 열이 변성제로서 사용될 수 있다. 열은 단백질 분자에 운동 에너지를 공급하여 그들의 원자가 더욱 신속하게 진동하게 야기할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이것은 상대적으로 약한 힘, 예를 들어, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 파괴할 것이다. 또한, 열을 살균에 사용하여 박테리아 내의 효소를 변성시켜, 이에 따라 파괴한다.
일부 실시형태에서, 수은(II), 납(II) 및 은과 같은 금속 이온의 염은 이황화물 기와, 그리고 산성 아미노산의 카복실레이트 이온과 강력한 결합을 형성하는 그들의 능력으로 인하여 변성제로 사용될 수 있다. 따라서, 그들은 이황화 가교 및 염 결합을 파괴하고, 단백질이 불용성 금속-단백질 염으로서 용액 밖으로 침전되게 야기한다.
일부 실시형태에서, 고농도의 염(고 염분)도 또한 변성제로 사용될 수 있다. 고농도의 염은 단백질 및 핵산 둘 모두가 수용액으로부터 침전되게 야기하는 것으로 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 1M 내지 10M일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 2M 내지 9M일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 2M 내지 8M일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 2M 내지 5M일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 1M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 2M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 3M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 4M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 5M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 6M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 7M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 고농도의 염은 8M 초과의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일의 염이 변성제로 사용된다. 일부 실시형태에서, 1개 초과의 염이 변성제로 사용된다.
일부 실시형태에서, 변성제로 사용되는 염은 칼슘염, 철염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염 또는 그들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변성제로 사용하기에 적절한 예시적인 특정 염에는 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 염화리튬(LiCl), 염화칼슘(CaCl2), 브롬화칼륨(KBr), 브롬화나트륨(NaBr), 브롬화리튬(LiBr)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 처리하는 변성제는 염화칼륨(KCl)이다. 일부 실시형태에서, KCl은 얻어지는 KCl 농도가 약 1M 이상이도록 첨가된다. 일부 실시형태에서, KCl은 얻어지는 KCl 농도가 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상 또는 5M 이상이도록 첨가된다.
일부 실시형태에서, 불순한 제제를 소정의 기간 동안 하나 이상의 변성제와 인큐베이션시키는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 1분 미만 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 1분 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 2분 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 3분 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 4분 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 5분 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 10분 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 1시간 동안 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 2시간 동안 변성제와 인큐베이션시킨다.
일부 실시형태에서, 불순한 제제를 실온(예를 들어, 약 20 내지 25℃)에서 하나 이상의 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 실온 미만의 온도에서 하나 이상의 변성제와 인큐베이션시킨다. 일부 실시형태에서, 불순한 제제를 실온 초과의 온도에서 하나 이상의 변성제와 함께 인큐베이션시킨다.
정제
몇몇 실시형태에서, 변성 조건으로의 노출 이전 및/또는 이후에, 접선 유동 여과를 사용하여, 불순한 제제로부터 mRNA를 정제한다. 일부 실시형태에서, 캡 및 폴리-A 테일을 시험관내 합성된 mRNA에 부가하기 이전에 접선 유동 여과를 수행한다. 일부 실시형태에서, 캡 및 폴리-A 테일을 시험관내 합성된 mRNA에 부가한 이후에 접선 유동 여과를 수행한다. 일부 실시형태에서, 캡 및 폴리-A 테일을 시험관내 합성된 mRNA에 부가하기 이전과 이후에 접선 유동 여과를 수행한다.
종래의 막 여과
일반적으로, 막 여과는 하나 이상의 개재되는 투과성 막을 사용하여 유체로부터 고체를 분리하는 것을 포함한다. 또한, 막 여과를 사용하여 기체상 시료로부터 입자를 여과할 수 있다. 2가지 중요 형태의 막 여과, 오로지 용액-확산에 기인하여 진행되는 수동 여과, 및 양압 또는 음압(즉, 진공)을 사용하여, 액체 또는 기체가 막을 가로지르게 강제하는 능동 여과가 존재한다.
종래의 막 여과는 또한, "데드-엔드(dead-end)" 여과로도 알려져 있다. 이러한 형식에서, 공급물을 막으로 로딩하고, 양압 또는 음압에 의해 통과하도록 강제된다. 데드-엔드 여과는 저렴하고 간단한 경향이 있으며, 주요 단점은 비-투과성 용질 또는 느리게-투과하는 용질(잔류물로도 지칭)로 인한 막의 파울링(fouling) 또는 클로깅(clogging) 및 농도 양극화이다. 일반적으로, 막은 추진력이 증가함에 따라 더욱 신속하게 파울링 또는 클로깅되는 경향이 있다. 막이 파울링 또는 클로깅됨에 따라, 여과 속도는 감소되고, 결국에는 필터를 교환하거나 세척할 때까지 투과물은 통과할 수 없다. 농도 양극화는 비-투과성 용질이 필터의 표면상에 수집되고, 결국에는 2차 막의 유형을 형성하며, 이것이 막을 가로지르는 투과성 용질의 이송을 더욱 지연시키는 현상이다. 결과적으로 데드-엔드 여과는 전형적으로 배취식(batch type) 프로세스에 사용된다.
접선 유동 여과
교차-유동 여과로도 지칭되는 접선 유동 여과(TFF)는 여과될 물질이 필터를 통과하기 보다는 필터를 접선으로 가로질러 통과하는 유형의 여과이다. TFF에서, 요망되지 않는 투과물은 필터를 통과하는 한편, 요망되는 잔류물은 필터를 따라 통과하고 하류에 수집된다. TFF에서 요망되는 물질이 전형적으로 잔류물 내에 함유되며, 이는 종래의 데드 엔드 여과에서 보통 접하게 되는 것과 반대인 것을 주목하는 것이 중요하다.
여과될 물질에 따라, TFF는 통상 미세여과 또는 한외여과 중 어느 하나를 위해 사용된다. 미세여과는 전형적으로 필터가 0.05㎛ 내지 1.0㎛의 포어 크기를 갖는 예로 정의되는 한편, 한외여과는 전형적으로 0.05㎛ 미만의 포어 크기를 갖는 필터를 포함한다. 또한, 포어 크기는 특정 필터에 대한 분자량 컷 오프(MWCO)로도 지칭되는 공칭 분자량 한계(NMWL)를 결정하며, 미세여과 막은 전형적으로 1,000 킬로달톤(kDa) 초과의 NMWL을 가지며, 한외여과 필터는 1 kDa 내지 1,000 kDa의 NMWL을 갖는다.
접선 유동 여과의 주요 이점은 종래의 "데드-엔드" 여과 동안 필터에서 응집되고 필터를 블로킹할 수 있는 비-투과성 입자(때때로 "필터 케이크(cake)"로 지칭)가 그 대신에 필터의 표면을 따라 운반되는 점이다. 이러한 이점은 접선 유동 여과가 필터를 일반적으로 제거하고 세척할 필요가 없기 때문에, 정지 시간이 상당히 감소되므로, 연속 운영을 필요로 하는 산업 프로세스에서 광범위하게 사용되게 한다.
접선 유동 여과는 다른 것들 중 특히 농축 및 정용여과(diafiltration)를 포함하는 몇몇 목적을 위해 사용될 수 있다. 농축은 용매가 용액으로부터 제거되는 한편, 용질 분자가 잔류되는 프로세스이다. 시료를 효율적으로 농축시키기 위하여, 실질적으로 잔류되어야 하는 용질 분자의 분자량 미만인 NMWL 또는 MWCO를 갖는 막이 사용된다. 일반적으로, 당업자는 표적 분자(들)의 분자량의 3 내지 6배 미만의 NMWL 또는 MWCO를 갖는 필터를 선택할 수 있다.
정용여과는 요망되지 않는 작은 입자가 필터를 통과하는 한편, 요망되는 더 큰 분자가 용액 중에서 그들 분자의 농도를 변하게 하지 않고, 잔류물 내에 유지되는 분별 프로세스이다. 정용여과는 종종 용액으로부터 염 또는 반응 완충제를 제거하기 위해 사용된다. 정용여과는 연속 또는 불연속 중 어느 하나일 수 있다. 연속 정용여과에서, 정용여과 용액은 여과액이 생성되는 것과 동일한 속도로 시료 공급물에 첨가된다. 불연속 정용여과에서, 용액을 먼저 희석한 다음, 다시 출발 농도로 농축시킨다. 불연속 정용여과는 요망되는 농도의 용질 분자가 달성될 때까지 반복될 수 있다.
전형적인 TFF 프로세스에 중요한 적어도 3개의 프로세스 변수는 다음과 같다: 막횡단 압력, 공급 속도 및 투과물의 유동 속도. 막횡단 압력은 유체가 필터를 통과하게 하여. 그것과 함께 투과성 분자가 운반되게 하는 힘이다. 일부 실시형태에서, 막횡단 압력은 1 내지 30 파운드/제곱인치(psi)이다.
공급 속도(교차 유동 속도로도 알려져 있음)는 공급 채널을 통해 유동하고, 필터를 가로지르는 용액의 속도이다. 공급 속도는 다르게는 필터를 클로깅 또는 파울링시켜, 이에 의해 여과액 유동을 제한할 수 있는 분자를 제거하는 힘을 결정한다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 50 내지 500㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 50 내지 400㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 50 내지 300㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 50 내지 200㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 75 내지 200㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 100 내지 200㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 125 내지 175㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 130㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 60㎖/분 내지 220㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 60㎖/분 이상이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 100㎖/분 이상이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 150㎖/분 이상이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 200㎖/분 이상이다. 일부 실시형태에서, 공급 속도는 220㎖/분 이상이다.
투과물의 유동 속도는 투과물이 시스템으로부터 제거되는 속도이다. 고정된 공급 속도에 대하여, 투과물 유동 속도의 증가는 필터를 가로지르는 압력을 증가시켜, 증진된 여과 속도를 야기하면서, 또한 잠재적으로 필터 클로깅 또는 파울링의 위험을 증가시킬 수 있다. TFF를 위해 사용되는 원리, 이론 및 장치는 문헌[Michaels et al., "Tangential Flow Filtration" in Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications (W. P. Olson, ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, III. 1995)]에 기술되어 있다. 또한, TFF에 대한 개선을 나타내는 고성능 접선 유동 여과(HP-TFF)의 설명에 대해서는 미국 특허 제5,256,294호 및 제5,490,937호를 참조한다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 10 내지 100㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 10 내지 90㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 10 내지 80㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 10 내지 70㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 10 내지 60㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 10 내지 50㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 10 내지 40㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 20 내지 40㎖/분이다. 일부 실시형태에서, 유동 속도는 30㎖/분이다.
본원에 기술된 다양한 프로세스 변수의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 대략 100 내지 200㎖/분(예를 들어, 대략 100 내지 180㎖/분, 100 내지 160㎖/분, 100 내지 140㎖/분, 110 내지 190㎖/분, 110 내지 170㎖/분 또는 110 내지 150㎖/분)의 공급 속도 및/또는 대략 10 내지 50㎖/분(예를 들어, 대략 10 내지 40㎖/분, 10 내지 30㎖/분, 20 내지 50㎖/분 또는 20 또는 40㎖/분)의 유동 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 대략 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200㎖/분의 공급 속도 및/또는 대략 10, 20, 30, 40 또는 50㎖/분의 유동 속도로 수행된다.
대규모(상업적) 정제를 제공하기 위한 추가의 유동 속도는 대략 10ℓ 내지 200ℓ/분(예를 들어, 대략 10 내지 180ℓ/분, 100 내지 160ℓ/분, 100 내지 140ℓ/분, 110 내지 190ℓ/분, 110 내지 170ℓ/분 또는 110 내지 150ℓ/분)의 공급 속도 및/또는 대략 10 내지 50ℓ/분(예를 들어, 대략 10 내지 40ℓ/분, 10 내지 30ℓ/분, 20 내지 50ℓ/분 또는 20 내지 40ℓ/분)의 유동 속도로 수행되는 접선 유동 여과를 필요로 할 것이다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 대략 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200ℓ/분의 공급 속도 및/또는 대략 10, 20, 30, 40 또는 50ℓ/분의 유동 속도로 수행된다.
상기 기술된 바와 같이, TFF에 사용되는 필터는 다양한 포어 크기 중 임의의 것 및 그에 따른 NMWL을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 필터는 100kDa 내지 1,000kDa의 NMWL을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 필터는 200kDa 내지 700kDa의 NMWL을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 필터는 200kDa 내지 500kDa의 NMWL을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 필터는 300kDa의 NMWL을 갖는다. 일부 실시형태에서, 필터는 500kDa의 NMWL을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 접선 유동 여과는 오직 수성 용매만을 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 접선 유동 여과는 용매로서 물을 사용하여 수행된다.
정제된 mRNA의 특성화
다양한 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA에는 조기 중단 RNA 서열, DNA 주형 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 포함하나 이들에 한정되지 않는 mRNA 합성 프로세스로부터의 불순물이 실질적으로 없다.
본 발명에 의해 제공되는 특정 이점은 고도의 조기 중단 RNA 서열("숏머"로도 알려져 있음)을 제거하거나 없애는 능력이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과의 또는 실질적으로 모든 조기 중단 RNA 서열을 제거한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA에는 조기 중단 RNA 서열이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 5% 미만(예를 들어, 약 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)의 조기 중단 RNA 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 1% 미만(예를 들어, 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만)의 조기 중단 RNA 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 예를 들어, 에티듐 브로마이드 및/또는 쿠마시 염색에 의해 결정시, 검출가능하지 않은 조기 중단 RNA 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 조기 중단 RNA 서열은 15개 미만의 염기(예를 들어, 14, 13, 12, 11, 10, 9 또는 8개 미만의 염기)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조기 중단 RNA 서열은 약 8 내지 12개 염기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 T7 RNA 중합효소, DNAse I, 피로포스파타제 및/또는 RNAse 억제제를 포함하나 이들에 한정되지 않는 높은 정도의 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 제거하거나 없앤다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 T7 RNA 중합효소를 제거하는데 특히 효율적이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과의 또는 실질적으로 모든, 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 제거한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA에는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 5% 미만(예를 들어, 약 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만)의 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 1% 미만(예를 들어, 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만)의 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 예를 들어, 에티듐 브로마이드 및/또는 쿠마시 염색에 의해 결정시, 검출가능하지 않은 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유한다.
다양한 실시형태에서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 정제된 mRNA는 고도의 완전성을 유지한다. 본원에 사용되는 용어 "mRNA 완전성"은 일반적으로 정제 후의 mRNA의 질을 말한다. 일부 실시형태에서, mRNA 완전성은 접선 유동 여과 후에 분해되지 않은 mRNA의 백분율을 말한다. mRNA 완전성은 당업계에 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여, 예를 들어, RNA 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology]). 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 95% 초과(예를 들어, 약 96%, 97%, 98%, 99% 초과)의 완전성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 98% 초과의 완전성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 99% 초과의 완전성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 대략 100%의 완전성을 갖는다.
실시예
실시예 1. 메신저 RNA( mRNA )의 생성 및 정제
mRNA의 합성
하기의 각각의 실시예에서, mRNA의 합성을 완전히 RNAse가 없는 조건 하에서 행하였다. 명시적으로 다르게 언급되지 않는 한, 모든 튜브, 바이얼, 피펫 팁(pipette tip), 피펫, 완충제 등은 뉴클레아제가 없을 필요가 있었다.
하기의 실시예에서, 다르게 기술되지 않는 한, mRNA를 시험관내 전사를 통해 선형화된 DNA 주형으로부터 합성하였다. 요망되는 mRNA 전구체(IVT) 작제물을 생성하기 위하여, 약 100㎍의 선형화된 DNA, rNTP(3.33mM), DTT(10mM), T7 RNA 중합효소, RNAse 억제제, 피로포스파타제 및 반응 완충제(10×, 800mM Hepes(pH 8.0), 20mM 스페르미딘(Spermidine), 250mM MgCl2, pH 7.7)의 혼합물을 RNase가 없는 물을 사용하여 2.24㎖의 최종 부피로 제조하였다. 반응 혼합물을 20분 내지 120분 범위의 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨다. 완료 시에, 혼합물을 추가 15분 동안 DNase I으로 처리한 다음, 반응중지시켰다.
5' 캡 및 3' 테일의 부가
전술된 IVT 단계(및 또한 아마도 초기 TFF 여과) 유래의 정제된 mRNA 생성물을 65℃에서 10분 동안 변성시켰다. 개별적으로, 분량의 GTP(20mM), S-아데노실 메티오닌, RNAse 억제제, 2'-O-메틸트랜스퍼라제 및 구아닐릴 트랜스퍼라제를 반응 완충제(10×, 500mM Tris-HCl(pH 8.0), 60mM KCl, 12.5mM MgCl2)와 함께, 8.3㎖의 최종 농도로 혼합한다. 변성 시에, mRNA를 얼음 위에서 냉각시킨 다음, 반응 혼합물에 첨가한다. 합한 용액을 37℃에서 20 내지 90분의 범위의 시간 동안 인큐베이션시킨다. 완료 시에, ATP(20 mM), PolyA 중합효소 및 테일링(tailing) 반응 완충제(10×, 500mM Tris-HCl(pH 8.0), 2.5M NaCl, 100mM MgCl2)의 분취액을 첨가하고, 전체 반응 혼합물을 37℃에서 20 내지 45분 범위의 시간 동안 추가로 인큐베이션시킨다. 완료 시에, 최종 반응 혼합물을 반응중지시키고, 정제한다.
접선 유동 여과를 통한 정제
하기의 실시예에서, 다르게 기술되지 않는 한, 접선 유동 여과(TFF) 시스템은 여과막 및 연동 펌프(밀리포어 랩스케일 TFF 시스템(Millipore Labscale TFF system))로 이루어지며, 유체의 접선 순환은 투과물에 대하여 30㎖/분의 유동 속도와 함께, 약 130㎖/분의 공급 속도로 막을 가로지른다. 사용되는 TFF 막은 미디크로스(MidiKros) 500kDa mPES 115㎠(스펙트럼 랩스(Spectrum Labs))였다. 사용 전에, 필터 카트리지를 뉴클레아제가 없는 물로 세척하고, 추가로 0.2N NaOH로 세척하였다. 마지막으로, 투과물 및 잔류물의 pH가 약 pH 6에 도달할 때까지 시스템을 뉴클레아제가 없는 물로 세척하였다.
실시예 2. 정제된 mRNA의 분석
정제된 mRNA 내의 효소의 존재에 대한 시험
다르게 기술되지 않는 한, 표준 쿠마시-염색 단백질 겔을 수행하여, 정제 이전과 이후에 존재하는 임의의 잔류 시약 효소의 존재를 결정하였다. 일부 예에서, BCA 검정도 또한 수행하였다.
아가로스 겔 전기영동 검정을 통한 mRNA 완전성의 평가
다르게 기술되지 않는 한, 메신저 RNA 크기 및 완전성을 겔 전기영동을 통해 평가하였다. 자가-주입된 1.0% 아가로스 겔 또는 인비트로겐(Invitrogen) E-Gel 프리캐스트(precast) 1.2% 아가로스 겔 중 어느 하나를 사용하였다. 메신저 RNA를 웰마다 1.0 내지 1.5㎍의 양으로 로딩하였다. 완료 시에, 메신저 RNA 밴드를 에티듐 브로마이드를 사용하여 가시화시켰다.
시험관내 mRNA 완전성 검정
다르게 기술되지 않는 한, 반딧불이 루시퍼라제 mRNA의 시험관내 트랜스펙션을 HEK293T 세포를 사용하여 수행하였다. 1㎍의 각 mRNA 작제물(construct)의 트랜스펙션을 리포펙타민을 사용하여 개별 웰에서 수행하였다. 세포를 선택된 시점(예를 들어, 4시간, 8시간 등)에 수집하고, 각 단백질 생성을 분석하였다. FFL mRNA에 대하여, 세포 용해물을 생물발광 검정을 통해 루시퍼라제 생성에 대하여 분석하였다.
생물발광 분석
제공되는 RNA의 형광 평가를 포함하는 실시예에서, 생물발광 검정을 다르게 특정되지 않는 한, 프로메가 루시퍼라제 검정 시스템(Promega Luciferase Assay System)(물품 번호 E1500)을 사용하여 행하였다. 10㎖의 루시퍼라제 검정 완충제를 루시퍼라제 검정 기질에 첨가하고, 와류를 통해 혼합함으로써 루시퍼라제 검정 시약을 제조하였다. 대략 20㎕의 균질한 시료를 96-웰 플레이트에 로딩한 다음, 각 시료에 대한 플레이트 대조군 20㎕를 로딩하였다. 개별적으로, 120㎕의 루시퍼라제 검정 시약(상기 기술된 바와 같이 제조)을 96-웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 그 다음, 각 플레이트를 몰레큘라 디바이스 플렉스 스테이션(Molecular Device Flex Station) 기기를 사용하여 적절한 챔버 내로 삽입하고, 발광을 측정하였다(상대 광 유닛(RLU)으로 측정).
실시예 3. 반딧불이 루시퍼라제 ( FFL ) 메신저 RNA( mRNA )의 생성 및 정제
이러한 실시예는 다양한 실시형태에 따르면, 접선 유동 여과(TFF) 및 변성제의 병용이 고도로 정제된 mRNA 생성물을 생성하기 위해 제공된 방법에 따라 사용될 수 있음을 예시한다. 이러한 실시예에서, 유레아는 단백질 변성제로서 사용된다.
이러한 실시예에서, 5㎎의 배취의 반딧불이 루시퍼라제(FFL) RNA(하기 서열번호 1)를 상기 기술된 시험관내 방법을 통해 전사시켜, 캡이 없고, 폴리A 테일이 없는 전술된 중간 작제물을 생성하였다. 이러한 반응으로 총 2.24㎖의 부피를 유지하고, 완료 시에 동등 부피의 10M 유레아에 의하여 반응중지시켜, 최종 유레아 농도가 5M이 되게 하였다. 초래된 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 접선 유동 여과(TFF) 시스템 저장소로 옮겼다. 시료를 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 200㎖로 희석하고, 한번에 200㎖의 한외여과에 의해, 1200㎖의 뉴클레아제가 없는 물로 세척하였다. 이후에, 시료를 200㎖의 10mM 시트르산나트륨(pH 6.4)으로 처리한 다음, 뉴클레아제가 없는 물을 사용한 600㎖ 세척을 행하였다. 마지막으로, 시료를 약 2㎖로 농축시키고, 최종 농도를 260㎚에서의 흡광도를 통해 결정하였다(λmax).
코돈-최적화된 반딧불이 루시퍼라제 ( FFL ) mRNA (서열번호 1)
Figure pct00001
5' 및 3' UTR 서열:
Figure pct00002
대략 5㎎의 TFF-정제된 반딧불이 루시퍼라제 RNA를 상기 기술된 바와 같이, 9㎖의 최종 반응 부피에서 캡핑시키고, 테일링시켰다. 분량의 이러한 반응 혼합물(6.7㎖)을 실온(RT)에서 5분 동안 5M 유레아로 처리하고, TFF를 사용하여 정제하였다. 대략 1.5㎎의 캡/테일 반응 혼합물을 오로지 물만을 사용하여 TFF를 통해 정제하고, 단리하였다. 개별적으로, 다른 적은 분량의 캡/테일 반응 혼합물을 공개된 프로토콜에 따라 퀴아젠(Qiagen) RNeasy 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 3가지의 단리된 최종 FFL mRNA 배취를 분취하고, 후술되는 바와 같이 HEK293T 세포로 트랜스펙션시켰다. 세포 용해물을 형광 검출을 통해 FFL 단백질의 존재에 대하여 분석하였다(FFL 활성).
이러한 실시예에서, 이러한 실시예에서 반응 효소를 제거하기 위하여, 분량의 FFL mRNA IVT 반응 혼합물을 10M 유레아로 처리하여, 5M 유레아의 최종 농도를 초래하였다. 이러한 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 다음, 상기 기술된 바와 같이, TFF를 통해 정제하였다. 도 1은 쿠마시 염색된 단백질 겔을 보여주며, 이는 상술된 유레아 조건을 사용하는 TFF 후에 단리되어 얻어진 mRNA를 보여준다. 완료 시에 검출가능한 효소가 존재하지 않는다.
캡핑되고, 테일링된 FFL mRNA 생성물을 생성한 후에, TFF 방법을 추가로 사용하여, 최종 표적 mRNA를 정제하였다. 분량의 동일한 캡/테일 반응 혼합물을 따로 분취하고, 비교를 위해, 유레아를 사용하지 않는 TFF를 통해 또는 스핀-칼럼 방법(퀴아젠 RNeasy 키트)을 통해 정제하였다. TFF 또는 스핀 칼럼 중 어느 하나에 의해 단리된 최종 mRNA의 비교를 겔 전기영동을 사용하여 행하였으며, 이는 도 2에 도시되어 있다. 추가로, 잔류 효소 수준을 단백질 겔을 통해 모니터링하였다(도 3). 도 2에서, 약 1900개 뉴클레오타이드로 이동하는 각각의 "IVT" FFL mRNA 밴드와 함께, 대략 2100개 뉴클레오타이드 길이의 캡핑되고, 테일링된(C/T) 최종 mRNA를 명백하게 관찰할 수 있다. 캡/테일 단계 후에 스핀-칼럼 단리를 사용하여 전형적으로 관찰되는 "숏머" 밴드는 실제로 레인 4에서 관찰된다.
TFF-정제된 mRNA가 사용되는 경우, 숏머 밴드가 캡/테일 단계 후에 존재하지 않는 것이 명백하다. 상당한 양의 효소 시약이 어느 하나의 정제 방법을 사용하여 제거될 수 있는 한편, 숏머 불순물은 제거될 수 없다. 이는 본원에 기술된 접선 유동 여과 방법이 mRNA 전사 동안의 조기 중단 서열의 정제를 위한 성공적이며 효율적인 방법임을 입증한다.
제공된 mRNA가 요망되는 단백질로 번역될 수 있는지를 결정하기 위하여, 단리된 FFL mRNA 작제물 각각의 비교(TFF 대 스핀-칼럼)를 행하였다. 하기 열거된 3가지 작제물 각각을 HEK293T 세포로 트랜스펙션시키고, 상응하는 FFL 단백질 생성을 루시페린에 대한 노출 시의 FFL 발광 형태의, FFL 단백질 활성을 통해 평가하였다(상기 참조).
FFL 작제물:
1. TFF(유레아) 및 TFF(유레아 부재)를 통한 C/T 단계를 통해 정제되는 FFL IVT
2. TFF(유레아) 및 TFF(유레아)를 통한 C/T 단계를 통해 정제되는 FFL IVT
3. 스핀 칼럼 및 스핀 칼럼을 통한 C/T 단계를 통해 정제된 FFL IVT.
각각으로부터 생성된 FFL 단백질의 발광량의 비교가 도 4에 나타나 있다. TFF-정제된 FFL mRNA의 완전성을 기술된 조건(5M 유레아에 대한 노출) 하에서 접선 유동 여과 프로세스 내내 유지한다.
실시예 4. 인자 IX(FIX) mRNA의 생성 및 정제
이러한 실시예는 다양한 실시형태에 따라, 접선 유동 여과(TFF) 및 변성제의 병용을 제공된 방법에 따라 사용하여, 고도로 정제된 mRNA 생성물을 생성할 수 있음을 추가로 예시한다. 이러한 실시예에서, 구아니디늄 티오시아네이트는 단백질 변성제로 사용된다.
이러한 실시예에서, 이번에는 인자 IX를 코딩하는 제2 종의 mRNA(하기 서열번호 4)를 생성하고 정제하였다. 먼저, 5㎎ 배취의 인자 IX(FIX) RNA를 상기 기술된 바와 같은 시험관내 방법을 통해 전사시켜, 캡이 없고, 폴리A 테일이 없는 전술된 RNA를 생성하였다. 이러한 반응으로 총 2.24㎖의 부피를 유지하고, 완료 시에 프로테이나제 K(4㎎/㎖(IVT 반응물))의 첨가에 의해 반응중지시키고, 이를 37℃에서 5분 동안 반응 혼합물에서 인큐베이션시켰다. 완료 시에, 6M 구아니디늄 티오시아네이트(4.3㎖, 최종 약 4M)를 첨가하고, 얻어진 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시키고, TFF 시스템 저장소로 옮겼다. 시료를 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 200㎖로 희석하고, 한번에 200㎖의 한외여과에 의해, 1600㎖의 뉴클레아제가 없는 물로 세척하였다. 완료 시에, 시료를 약 2㎖로 농축시켰으며, 최종 농도를 260㎚에서의 흡광도를 통해 결정하였다(λmax).
인간 인자 IX(FIX) mRNA (서열번호 4)
Figure pct00003
5' 및 3' UTR 서열:
Figure pct00004
Figure pct00005
또한, 상기 방법을 프로테이나제 K 단계 동안 악티노마이신 D(10㎍/㎖(IVT 반응물))의 첨가와 함께, 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 또한, 프로테이나제 K(악티노마이신 D와 함께 또는 이것 없이)를 사용하여 IVT 반응을 반응중지시킴으로써, 모든 효소의 제거를 성공적으로 달성할 수 있다(도 5). 프로테이나제 K는 제거를 용이하게 할 수 있지만, mRNA 약물 물질의 대규모 제조는 이러한 효소가 대규모로 제조되는 것을 필요로 하며, 추가의 불필요한 비용을 초래하고, 이에 따라, 일부 실시형태에서, 요망되는 방법이 아닐 수 있다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 기술된 바와 같이(악티노마이신 D와 함께 또는 이것 없이) 생성된 FIX mRNA, 및 5M 유레아를 사용하여 정제된 FIX mRNA는 검출가능한 수준의 숏머를 함유하지 않으며, 이는 실시예 3에 기술된 바와 같은 FFL mRNA에 대한 결과와 유사하다.
실시예 5. 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자( CFTR ) mRNA의 생성 및 정제
이러한 실시예는 추가로 다양한 실시형태에 따라, 접선 유동 여과(TFF) 및 변성제를 제공된 방법에 따라 병용하여, 고도로 정제된 mRNA 생성물을 생성할 수 있는 것을 예시한다. 이러한 실시예에서, 염화칼륨이 단백질 변성제로 사용된다.
이러한 실시예에서, 이번에는 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR, 서열번호 7, 하기)를 코딩하는 제3 종의 mRNA를 생성하고 정제하였다. 먼저, 5㎎ 배취의 CFTR RNA를 상기 기술된 바와 같은 시험관내 방법을 통해 전사시켜, 캡이 없고, 폴리A 테일이 없는 전술된 RNA를 생성하였다. 이러한 반응으로 총 2.24㎖의 부피를 유지하고, 완료 시에 2M KCl(약 200㎖)의 첨가에 의해 반응중지시켰다. 얻어진 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시키고, TFF 시스템 저장소로 옮겼다. 시료를 3 내지 4배의 정용여과 부피에 대하여 뉴클레아제가 없는 물 중 2M KCl을 사용하여 200㎖의 고정된 부피로 정용여과하였다. 이 시간 후에, 얻어진 용액을 한번에 200㎖의 한외여과에 의해 400㎖의 뉴클레아제가 없는 물로 세척하였다. 이 후에, 시료를 200㎖의 1mM 시트르산나트륨(pH 6.4)으로 처리한 다음, 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 600㎖ 세척을 행하였다. 마지막으로, 시료를 약 2㎖로 농축시키고, 최종 농도를 260㎚에서의 흡광도를 통해 결정하였다(λmax).
코돈-최적화된 낭성 섬유중 막횡단 전도 조절자( CFTR ) mRNA (서열번호 7)
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
5' 및 3' UTR 서열:
Figure pct00009
이러한 실시예에서, 반응 효소를 제거하기 위하여, 2M KCl 정용여과를 사용하였다. 큰 부피의 2M KCl에 대한 노출에 의해, 단백질 겔 전기영동을 통해 결정시 반응 혼합물에 존재하는 모든 효소(T7 중합효소 포함)가 성공적으로 제거되었다(도 7). 아가로스 겔 전기영동을 통해 나타난 바와 같이, 표적 메신저 RNA는 이러한 조건에 대한 노출 후에 무손상으로 남아있다(도 8).
또한, CFTR IVT 작제물의 캡핑 및 테일링 시에, 2M KCl을 사용하여 TFF를 통해 최종 CFTR 전사물(캡핑 및 테일링됨)을 성공적으로 정제할 수 있다. 이러한 최종 단리된 생성물을 스핀-칼럼 방법을 통해 정제된 동일한 생성물과 비교하는 경우, 겔 전기영동을 통해 결정시 크게 감소된 "숏머" 밴드가 관찰된다(도 9).
등가물 및 범위
당업자는 통상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 구체적 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 명세서에 제한되는 것을 의도하지 않고, 첨부된 청구범위에 제시된 것과 같다:

Claims (32)

  1. 메신저 RNA(mRNA)를 정제하는 방법으로서,
    (a) 시험관내 합성된 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 변성 조건으로 처리하는 단계; 및
    (b) 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 단계 (a) 유래의 불순한 제제로부터 상기 mRNA를 정제하는 단계를 포함하되,
    단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA에는 조기 중단(prematurely aborted) RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약이 실질적으로 없는, mRNA의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 단백질 변성제를 상기 불순한 제제에 첨가하는 것을 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 (a)가 상기 불순한 제제를 실온에서 약 5분 동안 상기 첨가되는 상기 단백질 변성제와 함께 인큐베이션시키는 것을 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 단백질 변성제가 유레아, 구아니디늄 티오시아네이트, KCl, 나트륨 도데실 설페이트, 사르코실 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, mRNA의 정제 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 유레아를 상기 불순한 제제에 첨가하여, 약 1M 이상의 얻어지는 유레아 농도를 달성하는 것을 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 얻어지는 유레아 농도가 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상, 5M 이상, 6M 이상, 7M 이상, 8M 이상, 9M 이상 또는 10M 이상인, mRNA의 정제 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 구아니디늄 티오시아네이트를 상기 불순한 제제에 첨가하여, 약 4M 이상의 얻어지는 구아니디늄 티오시아네이트 농도를 달성하는 것을 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 얻어지는 구아니디늄 티오시아네이트 농도가 약 4M 이상, 5M 이상, 6M 이상, 7M 이상, 8M 이상, 9M 이상 또는 10M 이상인, mRNA의 정제 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 KCl을 상기 불순한 제제에 첨가하여, 약 1M 이상의 얻어지는 KCl 농도를 달성하는 것을 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 얻어지는 KCl 농도가 약 2M 이상, 3M 이상, 4M 이상 또는 5M 이상인, mRNA의 정제 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과가 오직 수성 용매만을 사용하여 수행되는, mRNA의 정제 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 접선 유동 여과가 용매로서 물을 사용하여 수행되는, mRNA의 정제 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA가 1% 미만의 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유하는, mRNA의 정제 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA가 0.5% 미만의 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유하는, mRNA의 정제 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA가 0.1% 미만의 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유하는, mRNA의 정제 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA가, 아가로스 겔 전기영동 또는 크로마토그래피 방법에 의한 결정 시, 검출가능하지 않은 조기 중단 RNA 서열 및/또는 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약을 함유하는, mRNA의 정제 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조기 중단 RNA 서열이 15개 미만의 염기를 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조기 중단 RNA 서열이 약 8 내지 12개 염기를 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약이 T7 RNA 중합효소, DNAse I, 피로포스파타제 및/또는 RNAse 억제제를 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 합성에 사용되는 효소 시약이 T7 RNA 중합효소를 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과는 캡 및 폴리-A 테일이 시험관내 합성된 mRNA에 부가되기 이전에 수행되는, mRNA의 정제 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과는 캡 및 폴리-A 테일이 시험관내 합성된 mRNA에 부가된 이후에 수행되는, mRNA의 정제 방법.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접선 유동 여과는 캡 및 폴리-A 테일이 시험관내 합성된 mRNA에 부가되기 이전 및 이후에 수행되는, mRNA의 정제 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 합성된 mRNA는 길이가 약 1kb, 1.5kb, 2kb, 2.5kb, 3kb, 3.5kb, 4kb, 4.5kb 또는 5kb 초과인, mRNA의 정제 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 합성된 mRNA가 안정성을 향상시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함하는, mRNA의 정제 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형이 변형된 뉴클레오타이드, 변형된 당 포스페이트 백본, 5' 및/또는 3' 비번역 영역으로부터 선택되는, mRNA의 정제 방법.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 합성된 mRNA가 변형되지 않은, mRNA의 정제 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA가 95% 초과의 완전성(integrity)을 갖는, mRNA의 정제 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA가 98% 초과의 완전성을 갖는, mRNA의 정제 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)로부터 정제된 상기 mRNA가 99% 초과의 완전성을 갖는, mRNA의 정제 방법.
  31. 메신저 RNA(mRNA)를 제조하는 방법으로서,
    시험관내에서 mRNA를 합성하는 단계; 및
    제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는 단계를 포함하는 mRNA의 제조 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 정제되는 메신저 RNA(mRNA).
KR1020157024040A 2013-03-14 2014-03-14 메신저 rna의 정제 방법 KR20150128687A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361784996P 2013-03-14 2013-03-14
US61/784,996 2013-03-14
PCT/US2014/028441 WO2014152966A1 (en) 2013-03-14 2014-03-14 Methods for purification of messenger rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150128687A true KR20150128687A (ko) 2015-11-18

Family

ID=50391557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157024040A KR20150128687A (ko) 2013-03-14 2014-03-14 메신저 rna의 정제 방법

Country Status (17)

Country Link
US (7) US9957499B2 (ko)
EP (3) EP4446413A2 (ko)
JP (4) JP6586075B2 (ko)
KR (1) KR20150128687A (ko)
CN (1) CN105051190A (ko)
AU (1) AU2014236396A1 (ko)
BR (1) BR112015022660A2 (ko)
CA (1) CA2902892A1 (ko)
DK (2) DK2970955T3 (ko)
EA (1) EA201591229A1 (ko)
ES (2) ES2708561T3 (ko)
IL (1) IL240215A0 (ko)
MX (1) MX2015012865A (ko)
PL (1) PL3467108T3 (ko)
SG (1) SG11201507425RA (ko)
TR (1) TR201901310T4 (ko)
WO (1) WO2014152966A1 (ko)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3338765T3 (pl) 2009-12-01 2019-06-28 Translate Bio, Inc. Pochodna steroidowa dla dostarczania mrna w ludzkich chorobach genetycznych
CN111671918A (zh) 2011-06-08 2020-09-18 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
EP3336082B1 (en) 2011-06-08 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
AU2014236305B2 (en) 2013-03-14 2019-01-17 Ethris Gmbh CFTR mRNA compositions and related methods and uses
ES2708561T3 (es) * 2013-03-14 2019-04-10 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
EP2971033B8 (en) * 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
ES2923018T3 (es) 2013-03-15 2022-09-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Métodos de purificación de ARN
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのmRNA療法
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
ES2750661T3 (es) 2014-04-25 2020-03-26 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
WO2016180430A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Curevac Ag Method for producing rna
EP4108769B1 (en) * 2015-05-29 2023-08-30 CureVac Manufacturing GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
WO2017031241A1 (en) * 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Rna mapping/fingerprinting
US20210206818A1 (en) 2016-01-22 2021-07-08 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
HRP20230050T1 (hr) 2016-05-18 2023-03-03 Modernatx, Inc. Polinukleotidi koji kodiraju interleukin-12 (il12) i njihova upotreba
WO2018041921A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Curevac Ag Mixing device for the production of a liquid nucleic acid composition
US11202793B2 (en) 2016-09-14 2021-12-21 Modernatx, Inc. High purity RNA compositions and methods for preparation thereof
WO2018096179A1 (en) 2016-11-28 2018-05-31 Curevac Ag Method for purifying rna
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
WO2018157154A2 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized cftr mrna
IL268857B2 (en) 2017-02-27 2024-09-01 Translate Bio Inc Methods for the purification of messenger RNA
US11560562B2 (en) 2017-02-27 2023-01-24 Translate Bio, Inc. Large-scale synthesis of messenger RNA
DK3585892T3 (da) 2017-02-27 2022-08-22 Translate Bio Inc Fremgangsmåder til oprensning af messenger-rna
EP3624824B1 (en) 2017-05-16 2024-07-10 Translate Bio, Inc. Codon-optimized mrna encoding cftr for use in treating cystic fibrosis
US20230064106A1 (en) 2017-05-17 2023-03-02 Curevac Real Estate Gmbh Method for determining at least one quality parameter of an rna sample
WO2018231990A2 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
MA49922A (fr) 2017-08-18 2021-06-02 Modernatx Inc Procédés pour analyse par clhp
US11866696B2 (en) 2017-08-18 2024-01-09 Modernatx, Inc. Analytical HPLC methods
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
CN118421617A (zh) 2018-08-24 2024-08-02 川斯勒佰尔公司 用于纯化信使rna的方法
EP3852728B1 (en) 2018-09-20 2024-09-18 ModernaTX, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
EP3877538A1 (en) * 2018-11-08 2021-09-15 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for messenger rna purification
EP3918065A4 (en) * 2019-01-29 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. PROCEDURE FOR SEPARATION OF LONG POLYNUCLEOTIDS FROM A COMPOSITION
CN113396219A (zh) 2019-02-11 2021-09-14 埃泽瑞斯公司 通过切向流过滤纯化mRNA
WO2020168466A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Stemirna Therapeutics Co., Ltd. Modified nucleoside and synthetic methods thereof
CN110133091B (zh) * 2019-04-29 2020-08-28 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种05sar-page的应用
KR20220029556A (ko) * 2019-05-15 2022-03-08 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 정제 방법
CA3146675A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Translate Bio, Inc. Stable compositions of mrna-loaded lipid nanoparticles and processes of making
AU2020329166A1 (en) 2019-08-09 2022-03-03 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof
EP4031662A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
EP4041400A1 (en) 2019-10-09 2022-08-17 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
US20210145860A1 (en) 2019-10-21 2021-05-20 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
KR20220142432A (ko) 2019-12-20 2022-10-21 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 메신저 rna의 직장 전달
CA3165388A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
US20240277830A1 (en) 2020-02-04 2024-08-22 CureVac SE Coronavirus vaccine
US20210324369A1 (en) 2020-02-10 2021-10-21 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for messenger rna purification
CN115398546A (zh) 2020-02-18 2022-11-25 翻译生物公司 用于信使rna体外转录的改进方法
JP2023515485A (ja) * 2020-02-21 2023-04-13 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 限外濾過/透析濾過を用いたオリゴヌクレオチド組成物の調製方法
WO2021173840A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Translate Bio, Inc. Improved processes of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
GB202307565D0 (en) 2020-04-22 2023-07-05 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CA3177940A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Anusha DIAS Optimized nucleotide sequences encoding sars-cov-2 antigens
EP4146342A1 (en) 2020-05-07 2023-03-15 Translate Bio, Inc. Improved compositions for cftr mrna therapy
WO2021226463A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
AU2021273502A1 (en) 2020-05-15 2023-02-02 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery
JP2023544197A (ja) 2020-10-06 2023-10-20 トランスレイト バイオ, インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子の改善された方法および製剤
AU2021361986A1 (en) 2020-10-12 2023-06-15 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
WO2022081548A1 (en) 2020-10-12 2022-04-21 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing ice-based lipid nanoparticles
WO2022099194A1 (en) 2020-11-09 2022-05-12 Translate Bio, Inc. Improved compositions for delivery of codon-optimized mrna
CA3199895A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Shrirang KARVE Stable liquid lipid nanoparticle formulations
EP4277929A1 (en) 2021-01-14 2023-11-22 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
EP4313115A1 (en) 2021-03-25 2024-02-07 Translate Bio, Inc. Optimized nucleotide sequences encoding the extracellular domain of human ace2 protein or a portion thereof
AU2022261865A1 (en) 2021-04-19 2023-11-30 Translate Bio, Inc. Improved compositions for delivery of mrna
EP4330427A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Translate Bio, Inc. Methods for measuring poly a tail length
US20240277872A1 (en) 2021-05-12 2024-08-22 The Broad Institute, Inc. Modified mrna, modified non-coding rna, and uses thereof
CN117881395A (zh) 2021-07-01 2024-04-12 翻译生物公司 用于递送mRNA的组合物
EP4429713A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
JP2023181989A (ja) 2022-06-13 2023-12-25 上海臻上医薬科技有限公司 マイクロニードル注射製剤およびその使用
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024112652A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Translate Bio, Inc. Compositions of dry powder formulations of messenger rna and methods of use thereof
WO2024126809A1 (en) 2022-12-15 2024-06-20 Sanofi Mrna encoding influenza virus-like particle
WO2024133515A1 (en) 2022-12-20 2024-06-27 Sanofi Rhinovirus mrna vaccine
WO2024133884A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Sanofi Optimized tailing of messenger rna
WO2024184489A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Sanofi Manufacture of messenger rna with kp34 polymerase

Family Cites Families (475)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2647121A (en) 1951-02-02 1953-07-28 Ruth P Jacoby Diamine-bis-acetamides
US2819718A (en) 1953-07-16 1958-01-14 Isidore H Goldman Drainage tube
US2717909A (en) 1953-09-24 1955-09-13 Monsanto Chemicals Hydroxyethyl-keryl-alkylene-ammonium compounds
US2844629A (en) 1956-04-25 1958-07-22 American Home Prod Fatty acid amides and derivatives thereof
US3096560A (en) 1958-11-21 1963-07-09 William J Liebig Process for synthetic vascular implants
FR1378382A (fr) 1962-12-01 1964-11-13 Sandoz Sa Amides de l'acide amino-propionique, utilisables en particulier pour le traitement des fibres textiles
GB1072118A (en) 1962-12-01 1967-06-14 Sandoz Ag Amides of aminopropionic acid
JPS5141663B1 (ko) 1966-03-12 1976-11-11
JPS4822365B1 (ko) 1968-10-25 1973-07-05
NL143127B (nl) 1969-02-04 1974-09-16 Rhone Poulenc Sa Versterkingsorgaan voor een defecte hartklep.
US3614955A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Standby defibrillator and method of operation
US3614954A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Electronic standby defibrillator
JPS5024216Y1 (ko) 1970-12-29 1975-07-21
JPS5024216B1 (ko) 1970-12-29 1975-08-14
US3945052A (en) 1972-05-01 1976-03-23 Meadox Medicals, Inc. Synthetic vascular graft and method for manufacturing the same
US3805301A (en) 1972-07-28 1974-04-23 Meadox Medicals Inc Tubular grafts having indicia thereon
JPS49127908A (ko) 1973-04-20 1974-12-07
JPS5624664B2 (ko) 1973-06-28 1981-06-08
US4013507A (en) 1973-09-18 1977-03-22 California Institute Of Technology Ionene polymers for selectively inhibiting the vitro growth of malignant cells
JPS5123537A (ja) 1974-04-26 1976-02-25 Adeka Argus Chemical Co Ltd Kasozaisoseibutsu
GB1527592A (en) 1974-08-05 1978-10-04 Ici Ltd Wound dressing
US3995623A (en) 1974-12-23 1976-12-07 American Hospital Supply Corporation Multipurpose flow-directed catheter
JPS5813576B2 (ja) 1974-12-27 1983-03-14 アデカ ア−ガスカガク カブシキガイシヤ 安定化された合成高分子組成物
DE2520814A1 (de) 1975-05-09 1976-11-18 Bayer Ag Lichtstabilisierung von polyurethanen
US4281669A (en) 1975-05-09 1981-08-04 Macgregor David C Pacemaker electrode with porous system
JPS5210847A (en) 1975-07-16 1977-01-27 Nippon Steel Corp Pinch roll
US4096860A (en) 1975-10-08 1978-06-27 Mclaughlin William F Dual flow encatheter
CA1069652A (en) 1976-01-09 1980-01-15 Alain F. Carpentier Supported bioprosthetic heart valve with compliant orifice ring
US4134402A (en) 1976-02-11 1979-01-16 Mahurkar Sakharam D Double lumen hemodialysis catheter
US4072146A (en) 1976-09-08 1978-02-07 Howes Randolph M Venous catheter device
US4335723A (en) 1976-11-26 1982-06-22 The Kendall Company Catheter having inflatable retention means
US4099528A (en) 1977-02-17 1978-07-11 Sorenson Research Co., Inc. Double lumen cannula
US4140126A (en) 1977-02-18 1979-02-20 Choudhury M Hasan Method for performing aneurysm repair
US4265745A (en) 1977-05-25 1981-05-05 Teijin Limited Permselective membrane
US4182833A (en) 1977-12-07 1980-01-08 Celanese Polymer Specialties Company Cationic epoxide-amine reaction products
US4180068A (en) 1978-04-13 1979-12-25 Motion Control, Incorporated Bi-directional flow catheter with retractable trocar/valve structure
EP0005035B1 (en) 1978-04-19 1981-09-23 Imperial Chemical Industries Plc A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning
US4284459A (en) 1978-07-03 1981-08-18 The Kendall Company Method for making a molded catheter
US4227533A (en) 1978-11-03 1980-10-14 Bristol-Myers Company Flushable urinary catheter
US4375817A (en) 1979-07-19 1983-03-08 Medtronic, Inc. Implantable cardioverter
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
DE3010841A1 (de) 1980-03-21 1981-10-08 Ulrich Dr.med. 6936 Haag Uthmann Katheder
US4308085A (en) 1980-07-28 1981-12-29 Jenoptik Jena Gmbh Process for the preparation of high molecular thermoplastic epoxide-amine-polyadducts
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4339369A (en) 1981-04-23 1982-07-13 Celanese Corporation Cationic epoxide-amine reaction products
US4401796A (en) 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4406656A (en) 1981-06-01 1983-09-27 Brack Gillium Hattler Venous catheter having collapsible multi-lumens
US4475972A (en) 1981-10-01 1984-10-09 Ontario Research Foundation Implantable material
US4401472A (en) 1982-02-26 1983-08-30 Martin Marietta Corporation Hydraulic cement mixes and processes for improving hydraulic cement mixes
US4568329A (en) 1982-03-08 1986-02-04 Mahurkar Sakharam D Double lumen catheter
US4546499A (en) 1982-12-13 1985-10-15 Possis Medical, Inc. Method of supplying blood to blood receiving vessels
US4530113A (en) 1983-05-20 1985-07-23 Intervascular, Inc. Vascular grafts with cross-weave patterns
US4550447A (en) 1983-08-03 1985-11-05 Shiley Incorporated Vascular graft prosthesis
US4647416A (en) 1983-08-03 1987-03-03 Shiley Incorporated Method of preparing a vascular graft prosthesis
US5104399A (en) 1986-12-10 1992-04-14 Endovascular Technologies, Inc. Artificial graft and implantation method
US4571241A (en) 1983-12-16 1986-02-18 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4710169A (en) 1983-12-16 1987-12-01 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4737518A (en) 1984-04-03 1988-04-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lipid derivatives, their production and use
US4562596A (en) 1984-04-25 1986-01-07 Elliot Kornberg Aortic graft, device and method for performing an intraluminal abdominal aortic aneurysm repair
US4782836A (en) 1984-05-24 1988-11-08 Intermedics, Inc. Rate adaptive cardiac pacemaker responsive to patient activity and temperature
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4662382A (en) 1985-01-16 1987-05-05 Intermedics, Inc. Pacemaker lead with enhanced sensitivity
US4762915A (en) 1985-01-18 1988-08-09 Liposome Technology, Inc. Protein-liposome conjugates
US4860751A (en) 1985-02-04 1989-08-29 Cordis Corporation Activity sensor for pacemaker control
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
CA1320724C (en) 1985-07-19 1993-07-27 Koichi Kanehira Terpene amino alcohols and medicinal uses thereof
US4701162A (en) 1985-09-24 1987-10-20 The Kendall Company Foley catheter assembly
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
DE3616824A1 (de) 1986-05-17 1987-11-19 Schering Ag Verwendung von haertbaren kunstharzmischungen fuer oberflaechenbeschichtungen und druckfarben und verfahren zu ihrer herstellung
DE3780374D1 (de) 1986-07-31 1992-08-20 Irnich Werner Frequenzadaptierender herzschrittmacher.
US4960409A (en) 1986-09-11 1990-10-02 Catalano Marc L Method of using bilumen peripheral venous catheter with adapter
JPH0829776B2 (ja) 1986-10-29 1996-03-27 東燃化学株式会社 合成樹脂製容器及びその製造用金型
US4720517A (en) 1986-11-24 1988-01-19 Ciba-Geigy Corporation Compositions stabilized with N-hydroxyiminodiacetic and dipropionic acids and esters thereof
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
DE3728917A1 (de) 1987-08-29 1989-03-09 Roth Hermann J Neue lipide mit unsymmetrisch substituierter disulfidbruecke
US4946683A (en) 1987-11-18 1990-08-07 Vestar, Inc. Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes
US4843155A (en) * 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US5138067A (en) 1987-12-17 1992-08-11 Shionogi & Co. Ltd. Lipid derivatives
US5047540A (en) 1987-12-17 1991-09-10 Shionogi & Co., Ltd. Lipid derivatives
JPH01257491A (ja) * 1988-04-08 1989-10-13 Tosoh Corp 不溶性融合異種蛋白質の処理方法
US4892540A (en) 1988-04-21 1990-01-09 Sorin Biomedica S.P.A. Two-leaflet prosthetic heart valve
US5176661A (en) 1988-09-06 1993-01-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Composite vascular catheter
US5024671A (en) 1988-09-19 1991-06-18 Baxter International Inc. Microporous vascular graft
US5200395A (en) 1988-10-18 1993-04-06 Ajinomoto Company, Inc. Pharmaceutical composition of BUF-5 for treating anemia
CA2001401A1 (en) 1988-10-25 1990-04-25 Claude Piantadosi Quaternary amine containing ether or ester lipid derivatives and therapeutic compositions
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
US20070053879A1 (en) * 1990-03-05 2007-03-08 Genzyme Corporation Diagnostic and treatment methods involving the cystic fibrosis transmembrane regulator
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5101824A (en) 1990-04-16 1992-04-07 Siemens-Pacesetter, Inc. Rate-responsive pacemaker with circuitry for processing multiple sensor inputs
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1992001425A1 (en) 1990-07-26 1992-02-06 Rodney James Lane Self expanding vascular endoprosthesis for aneurysms
US5693338A (en) 1994-09-29 1997-12-02 Emisphere Technologies, Inc. Diketopiperazine-based delivery systems
JPH0765267B2 (ja) 1990-08-22 1995-07-12 花王株式会社 柔軟仕上剤
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
DE9117152U1 (de) 1990-10-09 1996-07-11 Cook Inc., Bloomington, Ind. Stent
DE59008908D1 (de) 1990-12-19 1995-05-18 Osypka Peter Herzschrittmacherleitung mit einem inneren Kanal und mit einem Elektrodenkopf.
US5116360A (en) 1990-12-27 1992-05-26 Corvita Corporation Mesh composite graft
US5405363A (en) 1991-03-15 1995-04-11 Angelon Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
US5330768A (en) 1991-07-05 1994-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends
US5545449A (en) 1991-10-02 1996-08-13 Weyerhaeuser Company Polyether-reinforced fiber-based materials
US5151105A (en) 1991-10-07 1992-09-29 Kwan Gett Clifford Collapsible vessel sleeve implant
US5284491A (en) 1992-02-27 1994-02-08 Medtronic, Inc. Cardiac pacemaker with hysteresis behavior
US5352461A (en) 1992-03-11 1994-10-04 Pharmaceutical Discovery Corporation Self assembling diketopiperazine drug delivery system
SE9200951D0 (sv) 1992-03-27 1992-03-27 Kabi Pharmacia Ab Pharmaceutical composition containing a defined lipid system
EP0635019B1 (en) 1992-04-06 1999-05-26 Biosite Diagnostics Inc. Opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
WO1994003598A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 The Green Cross Corporation Antiallergic agent
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5461223A (en) 1992-10-09 1995-10-24 Eastman Kodak Company Bar code detecting circuitry
US5300022A (en) 1992-11-12 1994-04-05 Martin Klapper Urinary catheter and bladder irrigation system
US5496362A (en) 1992-11-24 1996-03-05 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable conformal coil patch electrode with multiple conductive elements for cardioversion and defibrillation
US5552155A (en) 1992-12-04 1996-09-03 The Liposome Company, Inc. Fusogenic lipsomes and methods for making and using same
US5716395A (en) 1992-12-11 1998-02-10 W.L. Gore & Associates, Inc. Prosthetic vascular graft
DE69424406T2 (de) 1993-02-19 2000-10-26 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Arzneistoffzusammensetzung, die ein nukleinsäurecopolymer enthält
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5697953A (en) 1993-03-13 1997-12-16 Angeion Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
US5624976A (en) 1994-03-25 1997-04-29 Dentsply Gmbh Dental filling composition and method
US5314430A (en) 1993-06-24 1994-05-24 Medtronic, Inc. Atrial defibrillator employing transvenous and subcutaneous electrodes and method of use
DE4325848A1 (de) 1993-07-31 1995-02-02 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin
EP0875280B1 (en) 1993-10-06 2001-08-22 The Kansai Electric Power Co., Inc. Method for removing carbon dioxide from combustion exhaust gas
US5609624A (en) 1993-10-08 1997-03-11 Impra, Inc. Reinforced vascular graft and method of making same
SE9303481L (sv) 1993-10-22 1995-04-23 Berol Nobel Ab Hygienkomposition
AU1091095A (en) 1993-11-08 1995-05-29 Harrison M. Lazarus Intraluminal vascular graft and method
NZ277614A (en) 1993-11-24 1998-05-27 Megabios Corp Piperazine-containing amphiphiles and their use in liposomes for delivering genetic material intracellularly
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5464924A (en) 1994-01-07 1995-11-07 The Dow Chemical Company Flexible poly(amino ethers) for barrier packaging
DE59511013D1 (de) * 1994-02-11 2005-09-22 Qiagen Gmbh Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen
US5844107A (en) 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
EP0758883B1 (en) 1994-04-12 2003-03-19 The Liposome Company, Inc. Fusogenic liposomes and methods of making and using same
US5840576A (en) 1994-07-20 1998-11-24 Cytotherapeutics, Inc. Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5641665A (en) 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
JP2001523215A (ja) 1995-04-17 2001-11-20 イマークス ファーマシューティカル コーポレーション ハイブリッド磁気共鳴造影剤
US20010047091A1 (en) 1998-09-09 2001-11-29 Brian Miki Cryptic regulatory elements obtained from plants
US5772694A (en) 1995-05-16 1998-06-30 Medical Carbon Research Institute L.L.C. Prosthetic heart valve with improved blood flow
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5783383A (en) 1995-05-23 1998-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of detecting cytomegalovirus (CMV)
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5609629A (en) 1995-06-07 1997-03-11 Med Institute, Inc. Coated implantable medical device
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
CA2222328C (en) 1995-06-07 2012-01-10 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5607385A (en) 1995-08-17 1997-03-04 Medtronic, Inc. Device and algorithm for a combined cardiomyostimulator and a cardiac pacer-carioverter-defibrillator
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
FR2740978B1 (fr) 1995-11-10 1998-01-02 Ela Medical Sa Dispositif medical actif du type defibrillateur/cardioverteur implantable
US5874105A (en) 1996-01-31 1999-02-23 Collaborative Laboratories, Inc. Lipid vesicles formed with alkylammonium fatty acid salts
DE69730218D1 (de) 1996-04-11 2004-09-16 Univ British Columbia Fusogene liposomen
US5935936A (en) 1996-06-03 1999-08-10 Genzyme Corporation Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5913848A (en) 1996-06-06 1999-06-22 Luther Medical Products, Inc. Hard tip over-the-needle catheter and method of manufacturing the same
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5736573A (en) 1996-07-31 1998-04-07 Galat; Alexander Lipid and water soluble derivatives of drugs
US6011148A (en) * 1996-08-01 2000-01-04 Megabios Corporation Methods for purifying nucleic acids
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
EP0941066B1 (en) 1996-08-26 2003-10-29 Transgene S.A. Cationic lipid-nucleic acid complexes
CA2271388C (en) 1996-09-13 2007-11-06 The School Of Pharmacy, University Of London Liposomes encapsulating polynucleotides operatively coding for immunogenic polypeptides
US5874268A (en) * 1996-09-23 1999-02-23 Duke University Method of introducing exogenous compounds into cells by electroporation and apparatus for same
TW520297B (en) 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
JP4175667B2 (ja) 1996-11-04 2008-11-05 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング トランスフェクションのためのカチオン試薬
US6887665B2 (en) 1996-11-14 2005-05-03 Affymetrix, Inc. Methods of array synthesis
US5985930A (en) 1996-11-21 1999-11-16 Pasinetti; Giulio M. Treatment of neurodegenerative conditions with nimesulide
US6204297B1 (en) 1996-11-26 2001-03-20 Rhodia Inc. Nonionic gemini surfactants
JPH10197978A (ja) 1997-01-09 1998-07-31 Mitsubishi Paper Mills Ltd ハロゲン化銀写真感光材料
EP0853123A1 (de) * 1997-01-10 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
FR2760193B1 (fr) 1997-02-28 1999-05-28 Transgene Sa Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US5945326A (en) 1997-03-20 1999-08-31 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease
EP1027033B1 (en) 1997-05-14 2009-07-22 The University Of British Columbia High efficiency encapsulation of nucleic acids in lipid vesicles
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
US20030104044A1 (en) 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
WO1998055512A2 (en) * 1997-06-02 1998-12-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Smad-interacting polypeptides and their use
JPH115786A (ja) 1997-06-13 1999-01-12 Pola Chem Ind Inc 新規アミノヒドロキシプロピルピペラジン誘導体
US6067471A (en) 1998-08-07 2000-05-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Atrial and ventricular implantable cardioverter-defibrillator and lead system
JPH1180142A (ja) 1997-09-05 1999-03-26 Pola Chem Ind Inc ジフェニルアルキル化合物の製造法
EP2292771A3 (en) 1997-09-19 2011-07-27 Life Technologies Corporation Sense mRNA therapy
US6165763A (en) 1997-10-30 2000-12-26 Smithkline Beecham Corporation Ornithine carbamoyltransferase
US6096075A (en) 1998-01-22 2000-08-01 Medical Carbon Research Institute, Llc Prosthetic heart valve
US6617171B2 (en) 1998-02-27 2003-09-09 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing and treating autoimmune disease
US6271209B1 (en) 1998-04-03 2001-08-07 Valentis, Inc. Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors
US6176877B1 (en) 1998-04-20 2001-01-23 St. Jude Medical, Inc. Two piece prosthetic heart valve
US6986902B1 (en) 1998-04-28 2006-01-17 Inex Pharmaceuticals Corporation Polyanionic polymers which enhance fusogenicity
DE19822602A1 (de) 1998-05-20 1999-11-25 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Polyaminosäureestern durch Veresterung von sauren Polyaminosäuren oder Umesterung von Polyaminosäureestern
NO313244B1 (no) 1998-07-08 2002-09-02 Crew Dev Corp Fremgangsmåte for isolering og produksjon av magnesitt eller magnesiumklorid
US6055454A (en) 1998-07-27 2000-04-25 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac pacemaker with automatic response optimization of a physiologic sensor based on a second sensor
AU771367B2 (en) 1998-08-20 2004-03-18 Cook Medical Technologies Llc Coated implantable medical device
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
WO2000030444A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
US6740643B2 (en) * 1999-01-21 2004-05-25 Mirus Corporation Compositions and methods for drug delivery using amphiphile binding molecules
US6248725B1 (en) 1999-02-23 2001-06-19 Amgen, Inc. Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction
US6379698B1 (en) 1999-04-06 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Fusogenic lipids and vesicles
CA2370690A1 (en) 1999-04-20 2000-10-26 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
CA2369595C (en) 1999-04-23 2010-10-05 Alza Corporation Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
US6169923B1 (en) 1999-04-23 2001-01-02 Pacesetter, Inc. Implantable cardioverter-defibrillator with automatic arrhythmia detection criteria adjustment
JP2003530070A (ja) 1999-05-19 2003-10-14 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Fc融合タンパク質としてのインターフェロン−αタンパク質の発現および搬出
US6696424B1 (en) 1999-05-28 2004-02-24 Vical Incorporated Cytofectin dimers and methods of use thereof
US6346382B1 (en) 1999-06-01 2002-02-12 Vanderbilt University Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto
WO2001005375A1 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Purdue Research Foundation Vinyl ether lipids with cleavable hydrophilic headgroups
CN1378592A (zh) * 1999-07-23 2002-11-06 杰南技术公司 在无rna酶和有机溶剂的条件下应用切向流过滤来纯化质粒dna的方法
US6358278B1 (en) 1999-09-24 2002-03-19 St. Jude Medical, Inc. Heart valve prosthesis with rotatable cuff
US6371983B1 (en) 1999-10-04 2002-04-16 Ernest Lane Bioprosthetic heart valve
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
EP1242609A2 (en) 1999-12-30 2002-09-25 Novartis AG Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
EP1261379A2 (en) 2000-02-17 2002-12-04 Genzyme Corporation Genetic modification of the lung as a portal for gene delivery
US6370434B1 (en) 2000-02-28 2002-04-09 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac lead and method for lead implantation
IL152527A0 (en) * 2000-05-12 2003-05-29 Univ Southern California Retroviral vectors comprising an enhanced 3'transcription termination structure
US6565960B2 (en) 2000-06-01 2003-05-20 Shriners Hospital Of Children Polymer composite compositions
IL138474A0 (en) 2000-09-14 2001-10-31 Epox Ltd Highly branched water-soluble polyamine oligomers, process for their preparation and applications thereof
USRE43612E1 (en) 2000-10-10 2012-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US7202226B2 (en) * 2000-10-23 2007-04-10 Detroit R & D Augmentation of wound healing by elF-4E mRNA and EGF mRNA
CA2426244A1 (en) 2000-10-25 2002-05-02 The University Of British Columbia Lipid formulations for target delivery
GB0028361D0 (en) * 2000-11-21 2001-01-03 Glaxo Group Ltd Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components
US20020094528A1 (en) 2000-11-29 2002-07-18 Salafsky Joshua S. Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interations
JP2002167368A (ja) 2000-12-01 2002-06-11 Nitto Denko Corp アルキル置換デンドリマーおよびその製造法
US20050004058A1 (en) 2000-12-07 2005-01-06 Patrick Benoit Sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses thereof
EP1366196A4 (en) 2001-02-14 2004-07-07 Baylor College Medicine METHOD AND COMPOSITIONS FOR AMPLIFICATING RNA
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
US20020192721A1 (en) 2001-03-28 2002-12-19 Engeneos, Inc. Modular molecular clasps and uses thereof
US7084303B2 (en) 2001-04-23 2006-08-01 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. Tertiary amine compounds having an ester structure and processes for preparing same
US6585410B1 (en) 2001-05-03 2003-07-01 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Radiant temperature nulling radiometer
EP2305699B1 (de) 2001-06-05 2014-08-13 CureVac GmbH Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt und optimierter Codon Usage für die Impfung gegen Schlafkrankheit, Leishmaniose und Toxoplasmose
EP2428571B1 (en) 2001-09-28 2018-07-18 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. MicroRNA molecules
AU2002211719B2 (en) * 2001-10-12 2007-06-14 Qiagen North American Holdings, Inc. Compositions and methods for using a solid support to purify RNA
AU2002340490A1 (en) 2001-11-09 2003-05-19 Bayer Healthcare Ag Isotopically coded affinity markers 3
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
AU2003220249A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Arcturus Bioscience, Inc. Improved nucleic acid amplification
DE10214983A1 (de) 2002-04-04 2004-04-08 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen
GB0208390D0 (en) 2002-04-11 2002-05-22 Univ London Adeno-associated virus producer system
US20030215395A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US7601367B2 (en) 2002-05-28 2009-10-13 Mirus Bio Llc Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
DK1519714T3 (da) 2002-06-28 2011-01-31 Protiva Biotherapeutics Inc Fremgangsmåde og apparat til fremstilling af liposomer
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US20040028804A1 (en) 2002-08-07 2004-02-12 Anderson Daniel G. Production of polymeric microarrays
CA2495535A1 (en) 2002-08-22 2004-03-04 Celltran Limited Cell culture surface
US20060160759A1 (en) * 2002-09-28 2006-07-20 Jianzhu Chen Influenza therapeutic
CA2504910A1 (en) 2002-11-04 2004-05-21 Ge Bayer Silicones Gmbh & Co. Kg Linear polyamino and/or polyammonium polysiloxane copolymers i
AU2003281978A1 (en) 2002-11-22 2004-06-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh 2,5-diketopiperazines for the treatment of obesity
US7169892B2 (en) 2003-01-10 2007-01-30 Astellas Pharma Inc. Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems
EP1586983B1 (en) 2003-01-20 2013-06-05 Asahi Kasei EMD Corporation Pointing device
NZ542665A (en) 2003-03-05 2008-05-30 Senesco Technologies Inc Use of antisense oligonucleotides or siRNA to suppress expression of eIF-5A1
US20040224912A1 (en) 2003-05-07 2004-11-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of PAI-1 mRNA-binding protein expression
US7619017B2 (en) 2003-05-19 2009-11-17 Wacker Chemical Corporation Polymer emulsions resistant to biodeterioration
US7507859B2 (en) 2003-06-16 2009-03-24 Fifth Base Llc Functional synthetic molecules and macromolecules for gene delivery
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
EP1675943A4 (en) 2003-09-15 2007-12-05 Massachusetts Inst Technology NANOLITRE SYNTHESIS OF BIOMATERIALS IN NETWORKS AND SCREENING THEREOF
US7803397B2 (en) 2003-09-15 2010-09-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
US20050069590A1 (en) 2003-09-30 2005-03-31 Buehler Gail K. Stable suspensions for medicinal dosages
MXPA06003978A (es) 2003-10-10 2006-06-27 Powderject Vaccines Inc Constructos de acidos nucleicos.
WO2005037226A2 (en) 2003-10-17 2005-04-28 Georgia Tech Research Corporation Genetically engineered enteroendocrine cells for treating glucose-related metabolic disorders
AU2004287652A1 (en) 2003-11-10 2005-05-19 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Diimonium salt compound and use thereof
US8075780B2 (en) * 2003-11-24 2011-12-13 Millipore Corporation Purification and concentration of synthetic biological molecules
EP1694692B1 (en) * 2003-12-16 2010-04-28 QIAGEN North American Holdings, Inc. Formulations and methods for denaturing proteins
US7022214B2 (en) 2004-01-21 2006-04-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Carrier ampholytes of high pH range
US7556684B2 (en) 2004-02-26 2009-07-07 Construction Research & Technology Gmbh Amine containing strength improvement admixture
US20060228404A1 (en) 2004-03-04 2006-10-12 Anderson Daniel G Compositions and methods for treatment of hypertrophic tissues
JP2006271201A (ja) * 2004-03-26 2006-10-12 Fuji Photo Film Co Ltd Rnaの選択的分離精製方法
EP1727900A4 (en) 2004-03-26 2008-05-28 Fujifilm Corp METHOD FOR SELECTIVELY SEPARATING AND CLEANING RNA, AND METHOD FOR SEPARATING AND CLEANING NUCLEIC ACID
ATE537263T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Kationische lipide und verwendungsverfahren
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
GB0418172D0 (en) 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
US7361465B2 (en) 2004-09-07 2008-04-22 Applera Corporation Methods and compositions for tailing and amplifying RNA
DE102004043342A1 (de) 2004-09-08 2006-03-09 Bayer Materialscience Ag Blockierte Polyurethan-Prepolymere als Klebstoffe
AU2005300638A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent
CA2595594C (en) * 2005-01-31 2012-05-01 Merck & Co., Inc. Upstream and a downstream purification process for large scale production of plasmid dna
GB0502482D0 (en) 2005-02-07 2005-03-16 Glaxo Group Ltd Novel compounds
JP5042863B2 (ja) 2005-02-14 2012-10-03 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 生物学的に活性な分子をデリバリーするための脂質ナノ粒子系組成物および方法
US7977452B2 (en) 2005-03-28 2011-07-12 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Janus dendrimers and dendrons
US9006487B2 (en) 2005-06-15 2015-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
RU2008104411A (ru) * 2005-08-05 2009-09-10 Пфайзер Продактс Инк. (Us) Автоматизированное серийное производство
SI3611266T1 (sl) 2005-08-23 2023-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modificirani nukleozidi, ki vsebujejo RNA, in postopki za njihovo uporabo
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US7238791B1 (en) 2005-12-16 2007-07-03 Roche Diagnostics Operations, Inc. 6-monoacetylmorphine derivatives useful in immunoassay
WO2007073489A2 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Trustees Of Boston University Molecules for gene delivery and gene therapy, and methods of use thereof
CN100569877C (zh) 2005-12-30 2009-12-16 财团法人工业技术研究院 含多uv交联反应基的分枝状结构化合物及其应用
AU2007238624B2 (en) 2006-04-14 2012-05-31 Cellscript, Llc Kits and methods for generating 5' capped RNA
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
US20070275923A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Nastech Pharmaceutical Company Inc. CATIONIC PEPTIDES FOR siRNA INTRACELLULAR DELIVERY
EP2032652A4 (en) 2006-06-05 2011-08-17 Massachusetts Inst Technology NETWORKED DEVELOPABLE POLYMERS AND ITS USE
US20080102493A1 (en) 2006-06-29 2008-05-01 Millipore Corporation Isolation of RNA and DNA from a biological sample
US20090186805A1 (en) 2006-07-06 2009-07-23 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
ES2293834B1 (es) 2006-07-20 2009-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Compuesto con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmaceuticas que lo comprenden y sus aplicaciones terapeuticas.
WO2008011561A2 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Massachusetts Institute Of Technology End-modified poly(beta-amino esters) and uses thereof
KR101129509B1 (ko) 2006-10-03 2012-04-13 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 함유 조성물
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
WO2008140615A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Novozymes, Inc. Modified messenger rna stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
EP2125030A2 (en) 2007-01-29 2009-12-02 Medipol S.A. Chitosan-based colloidal particles for rna delivery
US8859229B2 (en) 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
WO2008113364A2 (en) 2007-03-20 2008-09-25 Recepticon Aps Amino derivatives to prevent nephrotoxicity and cancer
JP5186126B2 (ja) 2007-03-29 2013-04-17 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 新規トリアジン誘導体ならびにその製法およびそのガス分離膜としての用途
PT2144609E (pt) 2007-04-18 2015-02-06 Cornerstone Pharmaceuticals Inc Formulações farmacêuticas contendo derivados de ácido lipóico
WO2008137470A1 (en) 2007-05-01 2008-11-13 Pgr-Solutions Multi-chain lipophilic polyamines
US20090163705A1 (en) 2007-05-21 2009-06-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
NZ584048A (en) 2007-10-02 2012-08-31 Marina Biotech Inc Lipopeptides for delivery of nucleic acids
CA3043911A1 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
ES2535419T3 (es) 2007-12-27 2015-05-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente
CA2710983A1 (en) 2007-12-27 2009-10-01 The Ohio State University Research Foundation Lipid nanoparticle compositions and methods of making and using the same
AU2008347250A1 (en) 2008-01-02 2009-07-16 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Screening method for selected amino lipid-containing compositions
FR2926560A1 (fr) 2008-01-21 2009-07-24 Millipore Corp Procede d'extraction et de purification d'acides nucleiques sur membrane
JP5788312B2 (ja) 2008-04-11 2015-09-30 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. 標的リガンドをエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達
HUE034483T2 (en) 2008-04-15 2018-02-28 Protiva Biotherapeutics Inc New lipid preparations for introducing a nucleic acid
US20090263407A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic Lipids and Uses Thereof
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
CA2726052A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Modulation of gene expression through endogenous small rna targeting of gene promoters
US20100012012A1 (en) 2008-07-19 2010-01-21 Mark Schaefbauer Positioning apparatus
JP5024216B2 (ja) 2008-07-23 2012-09-12 トヨタ自動車株式会社 内燃機関の点火時期制御装置及び点火時期制御方法
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
DK2331954T3 (da) 2008-08-27 2020-04-06 Life Technologies Corp Apparat og fremgangsmåde til processering af biologiske prøver
JP2010053108A (ja) * 2008-08-29 2010-03-11 Asahi Kasei Corp 荷電を有する限外濾過膜を用いた生体成分の分離方法およびモジュール、装置
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
US20100112042A1 (en) 2008-10-16 2010-05-06 Mdrna, Inc. Processes and Compositions for Liposomal and Efficient Delivery of Gene Silencing Therapeutics
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20120009222A1 (en) 2008-10-27 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Modulation of the immune response
WO2010053108A1 (ja) 2008-11-05 2010-05-14 株式会社 日立メディコ 位相シフト型インバータ回路、それを用いたx線高電圧装置、x線ct装置、および、x線撮影装置
CA2742954C (en) 2008-11-07 2018-07-10 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
SG10201901089TA (en) 2008-11-10 2019-03-28 Arbutus Biopharma Corp Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
TW201019969A (en) 2008-11-17 2010-06-01 Enzon Pharmaceuticals Inc Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system
JP2012511531A (ja) 2008-12-09 2012-05-24 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 賦形剤不含抗体溶液を得るための方法
US9023820B2 (en) 2009-01-26 2015-05-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein C-III expression
US20100222489A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Jiang Dayue D Copolymer composition, membrane article, and methods thereof
AU2010223967B2 (en) 2009-03-12 2015-07-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes
CN102334237B (zh) 2009-04-02 2015-05-13 西蒙公司 电信接线板
CN102497887A (zh) 2009-04-17 2012-06-13 Isis创新公司 递送遗传物质的组合物
EP2421563B1 (en) * 2009-04-22 2017-04-12 Massachusetts Institute of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
SG10201402054UA (en) 2009-05-05 2014-09-26 Muthiah Manoharan Lipid compositions
HUE056773T2 (hu) 2009-06-10 2022-03-28 Arbutus Biopharma Corp Továbbfejlesztett lipid készítmény
US8273869B2 (en) 2009-06-15 2012-09-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsRNA targeting the PCSK9 gene
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8236943B2 (en) 2009-07-01 2012-08-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
ES2727711T3 (es) 2009-07-30 2019-10-18 Spiral Therapeutics Inc Compuestos inhibidores de Apaf-1
EP3581197A1 (de) 2009-07-31 2019-12-18 ethris GmbH Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression
JP5769173B2 (ja) 2009-08-19 2015-08-26 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 環境ストレス下の翻訳抑制を回避する5’utrをコードする組換えdna分子
DE102009043342A1 (de) 2009-09-29 2011-03-31 Bayer Technology Services Gmbh Stoffe für selbstorganisierte Träger zur kontrollierten Freisetzung eines Wirkstoffs
JP5465331B2 (ja) * 2009-10-15 2014-04-09 クルセル ホランド ベー ヴェー 高細胞密度の培養物からのアデノウイルスの精製方法
PL3338765T3 (pl) 2009-12-01 2019-06-28 Translate Bio, Inc. Pochodna steroidowa dla dostarczania mrna w ludzkich chorobach genetycznych
SI3112467T1 (en) 2009-12-07 2018-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
BR112012015755B1 (pt) 2009-12-23 2021-06-22 Novartis Ag Lipídeo furtivo, e composição
US9315802B2 (en) 2009-12-30 2016-04-19 Quest Diagnostics Investments Incorporated RNA isolation from soluble urine fractions
US20130123338A1 (en) 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
IL300109A (en) 2010-06-03 2023-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Biodegradable lipids for the transfer of active substances
CN101863544B (zh) 2010-06-29 2011-09-28 湖南科技大学 一种氰尿酸基重金属螯合絮凝剂及其制备方法
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
WO2012026493A1 (ja) 2010-08-26 2012-03-01 アイシン精機株式会社 酵素結晶固定化電極及び酵素結晶固定化電極の製造方法、並びに酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池及びバイオセンサー
WO2012031294A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 University Of Maryland, College Park Methods for determining protein ligand binding
TWI441591B (zh) * 2010-09-07 2014-06-21 Univ Nat Central 使植物表現後天性高溫逆境耐受性狀的方法及其應用
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
US20130337528A1 (en) * 2010-12-10 2013-12-19 Tracy Thompson Compositions for separation methods
PL2691443T3 (pl) 2011-03-28 2021-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Sprzężone lipomery i ich zastosowania
WO2012133737A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 架橋性アミン化合物、該化合物を用いた高分子膜及びその製造方法
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
WO2012151503A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 The Broad Institute, Inc. Multiplexed genetic reporter assays and compositions
AU2012255913A1 (en) 2011-05-17 2013-11-21 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
EP2532649B1 (en) 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
EP3336082B1 (en) 2011-06-08 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
CN111671918A (zh) 2011-06-08 2020-09-18 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
WO2013003475A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
US8980583B2 (en) * 2011-06-30 2015-03-17 Sigma-Aldrich Co. Llc Cells deficient in CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase and/or glycoprotein alpha-1,3-galactosyltransferase
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013039857A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (en) * 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2764007A4 (en) 2011-10-05 2015-05-06 Protiva Biotherapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DISABLING ALDEHYDE DEHYDROGENASE
CA3119789A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid derivatives functionalized on the n-terminal capable of forming drug encapsulating microspheres
WO2013090186A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
US20140378538A1 (en) 2011-12-14 2014-12-25 Moderma Therapeutics, Inc. Methods of responding to a biothreat
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
AU2012358384A1 (en) 2011-12-21 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
US20140371302A1 (en) 2011-12-29 2014-12-18 Modema Therapeutics, Inc. Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
CA2862377A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect
JP6275655B2 (ja) 2012-02-24 2018-02-07 プロティバ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド トリアルキルカチオン性脂質およびその使用方法
CA2868030C (en) 2012-03-29 2021-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
AU2013237873B2 (en) 2012-03-29 2017-12-14 Translate Bio, Inc. Ionizable cationic lipids
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
AU2013243949A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
AU2013271392B2 (en) 2012-06-08 2018-02-15 Ethris Gmbh Pulmonary delivery of mRNA to non-lung target cells
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
EP2674167A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 PLS-Design GmbH Controlled activation of complement components for use as endogenous adjuvant
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
US20140093952A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 David Serway Bioreactor Tangential Flow Perfusion Filter System
US20150307542A1 (en) 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
NZ708523A (en) * 2012-11-21 2018-09-28 Serum Institute Of India Pvt Ltd Production of high yields of bacterial polysaccharides
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
WO2014089486A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivering
WO2014093574A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
CN110106229B (zh) * 2013-01-03 2023-03-28 外来体诊断公司 用于分离微囊泡的方法
WO2014113089A2 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
EP2968397A4 (en) 2013-03-12 2016-12-28 Moderna Therapeutics Inc DIAGNOSIS AND TREATMENT OF FIBROSIS
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EA201591293A1 (ru) 2013-03-14 2016-02-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки антител, кодируемых мрнк
AU2014236305B2 (en) 2013-03-14 2019-01-17 Ethris Gmbh CFTR mRNA compositions and related methods and uses
WO2014152940A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
ES2708561T3 (es) * 2013-03-14 2019-04-10 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
JP2016514970A (ja) 2013-03-14 2016-05-26 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーrnaのキャップ効率の定量的評価
ES2797974T3 (es) 2013-03-14 2020-12-04 Translate Bio Inc Acidos ribonucleicos con nucleótidos modificados con 4-tio y procedimientos relacionados
EP2971098B1 (en) 2013-03-14 2018-11-21 Translate Bio, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger rna
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
ES2923018T3 (es) * 2013-03-15 2022-09-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Métodos de purificación de ARN
EP3757570B1 (en) 2013-03-15 2023-10-11 Translate Bio, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
WO2014144711A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP4279610A3 (en) 2013-03-15 2024-01-03 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
EP2971033B8 (en) * 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
WO2014179562A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
WO2014210356A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Massachusetts Institute Of Technology Multi-tailed lipids and uses thereof
JP7019233B2 (ja) 2013-07-11 2022-02-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド CRISPR関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成sgRNAを含む組成物ならびに使用方法
CN110974981A (zh) 2013-07-23 2020-04-10 野草莓树生物制药公司 用于递送信使rna的组合物和方法
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US20160264614A1 (en) 2013-10-02 2016-09-15 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
US20160243221A1 (en) 2013-10-18 2016-08-25 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのmRNA療法
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
CN105658800A (zh) 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 Mrna的cns递送及其用途
US20170173128A1 (en) 2013-12-06 2017-06-22 Moderna TX, Inc. Targeted adaptive vaccines
US20150167017A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
US20170002060A1 (en) 2014-01-08 2017-01-05 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
SG10201912038TA (en) 2014-04-23 2020-02-27 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
ES2750661T3 (es) * 2014-04-25 2020-03-26 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
JP6347163B2 (ja) 2014-07-10 2018-06-27 株式会社リコー 定着装置及び画像形成装置
EP3201338B1 (en) 2014-10-02 2021-11-03 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
WO2016071857A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus expression
WO2016077125A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
US20170362627A1 (en) 2014-11-10 2017-12-21 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
EP3247363A4 (en) 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP3247398A4 (en) 2015-01-23 2018-09-26 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
US20180245077A1 (en) 2015-03-20 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
WO2016183366A2 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing expression of hepatitis d virus rna
EP4108769B1 (en) * 2015-05-29 2023-08-30 CureVac Manufacturing GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
EP3307305A4 (en) 2015-06-10 2019-05-22 Modernatx, Inc. TARGETED ADAPTIVE VACCINES
WO2017149139A1 (en) 2016-03-03 2017-09-08 Curevac Ag Rna analysis by total hydrolysis
IL268857B2 (en) * 2017-02-27 2024-09-01 Translate Bio Inc Methods for the purification of messenger RNA
CN113396219A (zh) 2019-02-11 2021-09-14 埃泽瑞斯公司 通过切向流过滤纯化mRNA

Also Published As

Publication number Publication date
US20180237766A1 (en) 2018-08-23
CA2902892A1 (en) 2014-09-25
EA201591229A1 (ru) 2016-01-29
US20220411781A1 (en) 2022-12-29
DK3467108T3 (da) 2024-06-10
ES2708561T3 (es) 2019-04-10
DK2970955T3 (en) 2019-02-11
US9957499B2 (en) 2018-05-01
US11692189B2 (en) 2023-07-04
EP4446413A2 (en) 2024-10-16
US20220348898A1 (en) 2022-11-03
US20220348899A1 (en) 2022-11-03
US20220389403A1 (en) 2022-12-08
WO2014152966A1 (en) 2014-09-25
BR112015022660A2 (pt) 2017-10-31
JP2018174942A (ja) 2018-11-15
JP2023012495A (ja) 2023-01-25
AU2014236396A1 (en) 2015-08-13
JP2016513973A (ja) 2016-05-19
CN105051190A (zh) 2015-11-11
US20210324368A1 (en) 2021-10-21
MX2015012865A (es) 2016-07-21
EP2970955A1 (en) 2016-01-20
US10876104B2 (en) 2020-12-29
JP6586075B2 (ja) 2019-10-02
JP7166407B2 (ja) 2022-11-07
TR201901310T4 (tr) 2019-02-21
IL240215A0 (en) 2015-09-24
ES2981185T3 (es) 2024-10-07
EP2970955B1 (en) 2018-11-14
EP3467108A1 (en) 2019-04-10
US11820977B2 (en) 2023-11-21
EP3467108B1 (en) 2024-05-22
JP6941084B2 (ja) 2021-09-29
US20160040154A1 (en) 2016-02-11
PL3467108T3 (pl) 2024-09-30
SG11201507425RA (en) 2015-10-29
JP2022001056A (ja) 2022-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11692189B2 (en) Methods for purification of messenger RNA
AU2021204521B2 (en) Methods for purification of messenger rna

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid