CN117881395A - 用于递送mRNA的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其提供了包含mRNA脂质纳米颗粒和表面活性剂的改善的组合物。

Description

用于递送mRNA的组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月1日提交的美国临时专利申请序列号63/217,633的优先权，将其出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
背景技术
信使RNA疗法(MRT)正在变成越来越重要的用于治疗多种疾病的方法。MRT涉及将信使RNA(mRNA)施用至需要疗法的患者，用于在所述患者体内产生由所述mRNA编码的蛋白质。
通常使用脂质纳米颗粒来包封mRNA，以在体内高效递送mRNA。为了有效地将脂质纳米颗粒递送至受试者的肺，典型地将它们雾化。可以雾化以将mRNA递送至肺的脂质纳米颗粒组合物描述于例如WO 2020/106946中，将其通过引用并入本文。
D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS，也称为维生素E TPGS)是天然维生素E的水溶性衍生物。它具有包含亲水性极性头部和亲脂性烷基尾部的两亲性结构。TPGS可用作疏水性药物的增溶剂、乳化剂以及渗透和生物利用度促进剂。例如，其先前已用于溶解皮质类固醇，以便形成适合于通过吸入施用的稳定胶束溶液。在一些情形下，还将TPGS掺入基于磷脂酰胆碱的脂质体中用于递送小分子药物产品。
发明内容
诸位发明人出人意料地发现，D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)可以在包含包封mRNA的脂质纳米颗粒的组合物中充当赋形剂以改善雾化。其表面活性剂特性和有效溶解疏水性药物的能力使得TPGS不太可能作为脂质纳米颗粒的赋形剂选择。例如，其他表面活性剂(诸如Tween 20、Tween 80、泊洛沙姆(诸如P188)或PEG 400)也广泛用于溶解疏水性药物，但是发现其不适合用作脂质纳米颗粒组合物中的赋形剂(例如，Tween 80、Tween20)或不改善mRNA-脂质纳米颗粒组合物(例如，PEG 400)的雾化特性。虽然不希望受任何特定理论的束缚，诸位发明人认为，由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的TPGS和类似表面活性剂提供了特定的特性组合，这使得它们特别适合作为赋形剂来改善mRNA-脂质纳米颗粒组合物的雾化输出速率。出人意料地，诸位发明人还发现使用此类表面活性剂不会导致雾化后脂质纳米颗粒的尺寸增加或包封效率损失。
因此，本发明尤其提供了一种组合物，所述组合物包含：(a)包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，和(b)一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂，其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.1％重量/体积(w/v)的浓度存在。这种组合物能够以至少10ml/h的雾化输出速率雾化。此外，雾化不导致脂质纳米颗粒的尺寸显著增加或包封效率损失。因此，根据本发明的组合物在将完整mRNA递送到肺中以诱导mRNA编码的蛋白质的表达方面是高度有效的。
在一些实施方案中，存在于本发明的组合物中的一种或多种表面活性剂中的PEG部分是未经修饰的PEG、甲氧基-PEG(mPEG)或羧酸官能化的PEG(COOH-PEG)。在一些实施方案中，所述PEG部分的平均分子量在1kDa与5kDa之间，例如1KDa、2KDa、3KDa、3.4KDa或5KDa。在优选的实施方案中，所述PEG部分的平均分子量是0.5kDa、1kDa、1.5kDa、2kDa、2.5kDa或3kDa。在一些实施方案中，所述接头部分是琥珀酸酯、草酸酯、己二酸酯、丙二酸酯、富马酸酯、苹果酸酯、戊二酸酯或马来酸酯。在特定实施方案中，所述接头部分是琥珀酸酯。在一些实施方案中，所述抗氧化剂部分是亲脂性维生素。在某些实施方案中，所述亲脂性维生素选自维生素A、D、E或K。在特定实施方案中，所述亲脂性维生素选自维生素E或D。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的表面活性剂选自：D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)；mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素E；COOH-PEG-3.4k-琥珀酸酯-维生素E；mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素D；mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素D；或COOH-PEG-3.4k-琥珀酸酯-维生素D。在特定实施方案中，所述表面活性剂是TPGS。
在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以至少0.2％、至少0.5％或至少1％w/v的浓度存在于本发明的组合物中。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以0.1％-5％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以0.1％-2％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以0.2％-1％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.75％、约1％或约1.5％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以约0.2％或约1％w/v的浓度存在。
在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包含缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、PIPES缓冲液、HePES缓冲液、马来酸盐和琥珀酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。
在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包含盐。在一些实施方案中，盐的浓度是50mM-200mM。在一些实施方案中，所述盐的浓度是至少10mM。在一些实施方案中，所述盐是氯化钠。
在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包含赋形剂。在一些实施方案中，所述赋形剂是糖。在一些实施方案中，所述糖是二糖(诸如蔗糖或海藻糖)。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是至少1％、至少2％、至少5％或至少10％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是1％-20％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是2％-10％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是2％-6％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是约2％、约4％、约6％、约8％或约10％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂是浓度为2％-10％w/v的海藻糖。
在本发明的组合物中，所述脂质纳米颗粒可以包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种经PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，所述阳离子脂质选自咪唑胆固醇酯(ICE)、GL-TES-SA-DMP-E18-2、GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、TL1-04D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr、SY-010、TL1-10D-DMA、HEP-E3-E10、HEP-E4-E10和Guan-SS-Chol。在特定实施方案中，所述阳离子脂质是SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr或SY-010。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质是DOPE、DEPE、DPPC或DOPC-。在一些实施方案中，所述经PEG修饰的脂质是DMG-PEG2K。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒进一步包含一种或多种基于胆固醇的脂质，例如胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比在分别约30-60:10-35:20-30:1-15之间。例如，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比可以在分别约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在某些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比在分别约41-70:9-18:9-48:2-6之间。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质。在一些实施方案中，所述不超过三种不同的脂质组分是阳离子脂质、非阳离子脂质和经PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，所述阳离子脂质是咪唑胆固醇酯(ICE)或Guan-SS-Chol，所述非阳离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，并且所述经PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。在一些实施方案中，ICE/Guan-SS-Chol和DOPE以>1:1的摩尔比存在。在一些实施方案中，ICE/Guan-SS-Chol和DMG-PEG-2K以>10:1的摩尔比存在。在一些实施方案中，DOPE和DMG-PEG-2K以>5:1的摩尔比存在。
在一些实施方案中，本发明组合物中的脂质纳米颗粒的尺寸小于约100nm，例如在40nm与60nm之间。
在一些实施方案中，包封在本发明的组合物中的脂质纳米颗粒中的mRNA是经密码子优化的。在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个非标准核碱基。在一些实施方案中，所述非标准核碱基是选自以下的核苷类似物：2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷和2-硫代胞苷。
本发明的组合物用于肺部递送。在一些实施方案中，所述肺部递送是经由雾化进行的。在一些实施方案中，在雾化之前和之后，所述脂质纳米颗粒的尺寸变化不超过400％。在一些实施方案中，本发明的组合物能够以至少12ml/h的雾化输出速率雾化。在一些实施方案中，本发明的组合物能够以至少15ml/h的雾化速率雾化。在一些实施方案中，用振动网雾化器进行雾化。
本发明还提供了用于通过经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物来体内递送mRNA的方法。在一些实施方案中，所述肺部递送是鼻内施用或吸入。在一些实施方案中，在吸入之前将所述组合物雾化。在一些实施方案中，所述组合物以冻干形式提供，并且在雾化之前在水溶液中重构。在一些实施方案中，所述mRNA编码蛋白质。在一些实施方案中，所述mRNA被递送至肺。在一些实施方案中，由mRNA编码的蛋白质在肺中表达。在一些实施方案中，所述蛋白质是分泌性蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗体或抗原。
本发明还提供了治疗或预防受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，所述肺部递送是经由雾化进行的。在一些实施方案中，所述疾病或障碍选自肺部疾病或障碍(例如，慢性呼吸系统疾病)、蛋白缺乏症(例如，影响肺的蛋白缺乏症)、赘生性疾病(例如，肿瘤)和感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或障碍是蛋白缺乏症。在一些实施方案中，所述mRNA编码所缺乏的蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白缺乏症是囊性纤维化。在一些实施方案中，所述mRNA编码CFTR。在一些实施方案中，所述蛋白缺乏症是原发性纤毛运动不良症。在一些实施方案中，所述mRNA编码DNAI1。在一些实施方案中，所述蛋白缺乏症是表面活性剂缺乏。在一些实施方案中，所述RNA是编码表面活性剂蛋白的mRNA。
在一些实施方案中，所述肺部疾病或障碍是慢性呼吸系统疾病。在一些实施方案中，所述慢性呼吸系统疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺动脉高压或特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述mRNA编码用于治疗肺部疾病或障碍的症状的蛋白质。在一些实施方案中，所述mRNA编码针对促炎性细胞因子的抗体。在一些实施方案中，所述疾病或障碍是赘生性疾病，例如肿瘤。在一些实施方案中，所述mRNA编码靶向在赘生性细胞表面上表达的蛋白质的抗体，所述赘生性细胞例如构成所述肿瘤的细胞。
在一些实施方案中，所述疾病或障碍是感染性疾病。在一些实施方案中，所述感染性疾病是由病毒引起的。在一些实施方案中，所述mRNA编码结合病毒的表面蛋白的可溶性诱饵受体。在一些实施方案中，所述mRNA编码针对病毒的表面蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述感染性疾病是由细菌引起的。在一些实施方案中，所述mRNA编码源自感染性疾病的病原体的抗原。在一些实施方案中，所述mRNA编码针对细菌的表面蛋白的抗体。在一些实施方案中，受试者是人。
本发明的其他特征、目的和优点在下文的具体实施方式、附图说明和权利要求中是清楚的。然而，应当理解，虽然具体实施方式、附图说明和权利要求陈述了本发明的实施方案，但它们是仅以说明而非限制的方式给出的。在本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得清楚。
附图说明
附图仅用于说明目的而非用于限制。
图1A展示了本发明的表面活性剂的结构，并且图1B示出了TPGS的结构。
图2展示了分别含有阳离子脂质SI-4-E14-DMAPR和TL1-01D-DMA的脂质纳米颗粒的雾化前特征。
图3A展示了TPGS浓度对雾化后脂质纳米颗粒的尺寸的影响，并且图3B展示了TPGS浓度对雾化(neb)流速和雾化后包封效率(EE％)的影响。条形表示雾化流速，并且三角形表示包封效率。
图4A和图4B分别展示了TPGS浓度和糖浓度对雾化流速和包封效率(EE％)的影响。
定义
为了更容易地理解本发明，下文首先定义某些术语。以下术语和其他术语的另外的定义在整个说明书中都有阐述。将本文引用的用于描述本发明的背景和提供关于本发明实践的另外的细节的出版物和其他参考材料通过引用特此并入。
大约或约：如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所陈述参考值类似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落在所陈述参考值的任一方向的5％、4％、3％、2％或1％(大于或小于；例如，±2.5％)内的值的范围，除非另外说明或从上下文中明显看出(这样的数字会超过可能值的100％的情况除外)。
递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部和全身递送两者。例如，mRNA的递送涵盖如下情况，其中将mRNA递送至靶组织并且所编码的蛋白质被表达和保留于靶组织内(也称为“局部分布”或“局部递送”)；以及如下情况，其中将mRNA递送至靶组织并且所编码的蛋白质被表达和分泌至患者的循环系统(例如，血清)中，并且全身分布且由其他组织吸收(也称为“全身分布”或“全身递送”)。在一些实施方案中，递送是肺部递送，例如包括雾化。
包封：如本文所用，术语“包封”或语法等效语是指将mRNA分子限制在脂质纳米颗粒内的过程。
表达：如本文所用，mRNA的“表达”是指将mRNA翻译为多肽、将多个多肽(例如，抗体的重链或轻链)组装为完整蛋白质(例如，抗体)和/或对多肽或完全组装的蛋白质(例如，抗体)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法等效语可互换使用。
半衰期：如本文所用，术语“半衰期”是诸如核酸或蛋白质浓度或活性等量降至一段时间开始时其测量值的一半所需的时间。
患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以被施用所提供的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防、化妆和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施方案中，患者是人。人包括出生前和出生后形式。
药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指这样的物质，其在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
稳定：如本文所用，术语“稳定”是指保留其物理稳定性和/或生物活性的组合物。在一个实施方案中，基于降解(例如，片段化)mRNA的百分比确定稳定性。在另一个实施方案中，基于不在处于悬浮液中的脂质纳米颗粒的百分比确定稳定性。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者可以是患者，所述患者是指呈现给医疗提供者以供诊断或治疗疾病或障碍的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可能受疾病或障碍折磨或者易患疾病或障碍，但是可能展示或可能不展示疾病或障碍的症状。在一些实施方案中，受试者可以是健康的，并且接受用于预防疾病或障碍的本发明的脂质纳米颗粒或组合物。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现目的特征或特性的总体或接近总体范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有过的话)完成和/或进行至完成或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉在许多生物和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。可以将治疗施用至未展现出疾病体征和/或仅展现出疾病早期体征的受试者，用于降低发生与疾病相关的病状的风险的目的。
在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。如本公开文本中所用，术语“包含(comprise)”和所述术语的变体诸如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”不旨在排除其他添加物、组分、整数或步骤。如本申请中所用，术语“约”和“大约”作为等效物而使用。这两个术语都意在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
化学定义
酰基：如本文所用，术语“酰基”是指RZ-(C＝O)-，其中RZ是例如任何烷基、烯基、炔基、杂烷基或亚杂烷基。
脂族：如本文所用，术语脂族是指C1-C40烃并且包括饱和烃和不饱和烃两者。脂族可以是直链的、支链的和/或环状的。例如，C1-C20脂族可以包括C1-C20烷基(例如，直链或支链C1-C20饱和烷基)、C2-C20烯基(例如，直链或支链C4-C20二烯基、直链或支链C6-C20三烯基等)和C2-C20炔基(例如，直链或支链C2-C20炔基)。C1-C20脂族可以包括C3-C20环状脂族(例如，C3-C20环烷基、C4-C20环烯基或C8-C20环炔基)。在某些实施方案中，脂族可以包含一个或多个环状脂族和/或一个或多个杂原子(诸如氧、氮或硫)，并且可以任选地被一个或多个取代基(诸如烷基、卤基、烷氧基、羟基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺)取代。脂族基团是未经取代的或被一个或多个如本文所述的取代基团取代。例如，脂族可以被卤素、-COR”、-CO2H、-CO2R”、-CN、-OH、-OR”、-OCOR’、-OCO2R”、-NH2、-NHR”、-N(R”)2、-SR”或-SO2R”中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个独立选择的取代基)取代，其中R”的每个例子独立地是C1-C20脂族(例如，C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的烷基(例如，未经取代的C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的C1-C3烷基。在实施方案中，脂族是未经取代的。在实施方案中，脂族不包含任何杂原子。烷基：如本文所用，术语“烷基”意指无环直链和支链烃基，例如，“C1-C30烷基”是指具有1-30个碳的烷基。烷基可以是直链的或支链的。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基己基、异己基等。术语“低级烷基”意指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基。鉴于本公开文本的益处，其他烷基对本领域技术人员来说将是清楚的。烷基可以是未经取代的或被一个或多个如本文所述的取代基团取代。例如，烷基可以被卤素、-COR”、-CO2H、-CO2R”、-CN、-OH、-OR”、-OCOR’、-OCO2R”、-NH2、-NHR”、-N(R”)2、-SR”或-SO2R”中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个独立选择的取代基)取代，其中R”的每个例子独立地是C1-C20脂族(例如，C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的烷基(例如，未经取代的C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的C1-C3烷基。在实施方案中，烷基是经取代的(例如，被1、2、3、4、5或6个如本文所述的取代基团取代)。在实施方案中，烷基被-OH基团取代并且本文中还可以称为“羟基烷基”，其中前缀表示所述-OH基团并且“烷基”是如本文所描述的。
如本文所用，“烷基”还指代具有1至50个碳原子的直链或支链饱和烃基的基团(“C1-C50烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至40个碳原子(“C1-C40烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至30个碳原子(“C1-C30烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至20个碳原子(“C1-C20烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至10个碳原子(“C1-C10烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至9个碳原子(“C1-C9烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至8个碳原子(“C1-C8烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至7个碳原子(“C1-C7烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至6个碳原子(“C1-C6烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至5个碳原子(“C1-C5烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至4个碳原子(“C1-C4烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至3个碳原子(“C1-C3烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至2个碳原子(“C1-C2烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1个碳原子(“C1烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有2至6个碳原子(“C2-C6烷基”)。C1-C6烷基的例子包括而不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)和正己基(C6)。烷基的另外的例子包括正庚基(C7)、正辛基(C8)等。除非另有说明，否则烷基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的烷基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的烷基”)。在某些实施方案中，烷基是未经取代的C1-C50烷基。在某些实施方案中，烷基是经取代的C1-C50烷基。
将后缀“-ene”附加至基团指示所述基团是二价部分，例如，亚芳基是芳基的二价部分，并且杂亚芳基是杂芳基的二价部分。
亚烷基：如本文所用，术语“亚烷基”表示饱和二价直链或支链烃基并且通过亚甲基、亚乙基、亚异丙基等例示。同样地，如本文所用的术语“亚烯基”表示具有一个或多个不饱和碳-碳双键(其可以出现在沿着链的任何稳定的点)的不饱和二价直链或支链烃基，并且本文中的术语“亚炔基”表示具有一个或多个不饱和碳-碳三键(其可以出现在沿着链的任何稳定的点)的不饱和二价直链或支链烃基。在某些实施方案中，亚烷基、亚烯基或亚炔基可以包含一个或多个环状脂族和/或一个或多个杂原子(诸如氧、氮或硫)，并且可以任选地被一个或多个取代基(诸如烷基、卤基、烷氧基、羟基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺)取代。例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基可以被卤素、-COR”、-CO2H、-CO2R”、-CN、-OH、-OR”、-OCOR”、-OCO2R”、-NH2、-NHR”、-N(R”)2、-SR”或-SO2R”中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个独立选择的取代基)取代，其中R”的每个例子独立地是C1-C20脂族(例如，C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的烷基(例如，未经取代的C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的C1-C3烷基。在某些实施方案中，亚烷基、亚烯基或亚炔基是未经取代的。在某些实施方案中，亚烷基、亚烯基或亚炔基不包括任何杂原子。烯基：如本文所用，“烯基”意指具有一个或多个不饱和碳-碳双键(其可以出现在沿着链的任何稳定的点)的任何直链或支链烃链，例如，“C2-C30烯基”是指具有2-30个碳的烯基。例如，烯基包括丙-2-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、2-甲基丙-2-烯基、己-2-烯基、己-5-烯基、2,3-二甲基丁-2-烯基等。在实施方案中，烯基包含1、2或3个碳-碳双键。在实施方案中，烯基包含单个碳-碳双键。在实施方案中，缀合多个双键(例如，2或3个)。烯基可以是未经取代的或被一个或多个如本文所述的取代基团取代。例如，烯基可以被卤素、-COR”、-CO2H、-CO2R”、-CN、-OH、-OR”、-OCOR”、-OCO2R”、-NH2、-NHR”、-N(R”)2、-SR”或-SO2R”中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个独立选择的取代基)取代，其中R”的每个例子独立地是C1-C20脂族(例如，C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的烷基(例如，未经取代的C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的C1-C3烷基。在实施方案中，烯基是未经取代的。在实施方案中，烯基是经取代的(例如，被1、2、3、4、5或6个如本文所述的取代基团取代)。在实施方案中，烯基被-OH基团取代并且本文中还可以称为“羟基烯基”，其中前缀表示所述-OH基团并且“烯基”是如本文所描述的。
如本文所用，“烯基”还指代具有2至50个碳原子和一个或多个碳-碳双键(例如，1、2、3或4个双键)的直链或支链烃基的基团(“C2-C50烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至40个碳原子(“C2-C40烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至30个碳原子(“C2-C30烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至20个碳原子(“C2-C20烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至10个碳原子(“C2-C10烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至9个碳原子(“C2-C9烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至8个碳原子(“C2-C8烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至7个碳原子(“C2-C7烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至6个碳原子(“C2-C6烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至5个碳原子(“C2-C5烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至4个碳原子(“C2-C4烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至3个碳原子(“C2-C3烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2个碳原子(“C2烯基”)。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(诸如在2-丁烯基中)或末端的(诸如在1-丁烯基中)。C2-C4烯基的例子包括而不限于乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)等。C2-C6烯基的例子包括上述的C2-C4烯基以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)等。烯基另外的例子包括庚烯基(C7)、辛烯基(C8)、辛三烯基(C8)等。除非另有说明，否则烯基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的烯基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的烯基”)。在某些实施方案中，烯基是未经取代的C2-C50烯基。在某些实施方案中，烯基是经取代的C2-C50烯基。
炔基：如本文所用，“炔基”意指具有一个或多个碳-碳三键(出现在沿着链的任何稳定的点)的任何直链或支链构型的烃链，例如，“C2-C30炔基”是指具有2-30个碳的炔基。炔基的例子包括丙-2-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、己-2-炔基、己-5-炔基等。在实施方案中，炔基包含一个碳-碳三键。炔基可以是未经取代的或被一个或多个如本文所述的取代基团取代。例如，炔基可以被卤素、-COR”、-CO2H、-CO2R”、-CN、-OH、-OR”、-OCOR”、-OCO2R”、-NH2、-NHR”、-N(R”)2、-SR”或-SO2R”中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个独立选择的取代基)取代，其中R”的每个例子独立地是C1-C20脂族(例如，C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的烷基(例如，未经取代的C1-C20烷基、C1-C15烷基、C1-C10烷基或C1-C3烷基)。在实施方案中，R”独立地是未经取代的C1-C3烷基。在实施方案中，炔基是未经取代的。在实施方案中，炔基是经取代的(例如，被1、2、3、4、5或6个如本文所述的取代基团取代)。
如本文所用，“炔基”还指代具有2至50个碳原子和一个或多个碳-碳三键(例如，1、2、3或4个三键)以及任选地一个或多个双键(例如，1、2、3或4个双键)的直链或支链烃基的基团(“C2-C50炔基”)。具有一个或多个三键和一个或多个双键的炔基还称为“烯-炔”。在一些实施方案中，炔基具有2至40个碳原子(“C2-C40炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至30个碳原子(“C2-C30炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至20个碳原子(“C2-C20炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至10个碳原子(“C2-C10炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至9个碳原子(“C2-C9炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至8个碳原子(“C2-C8炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至7个碳原子(“C2-C7炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至6个碳原子(“C2-C6炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至5个碳原子(“C2-C5炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至4个碳原子(“C2-C4炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至3个碳原子(“C2-C3炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2个碳原子(“C2炔基”)。一个或多个碳-碳三键可以是内部的(诸如在2-丁炔基中)或末端的(诸如在1-丁炔基中)。C2-C4炔基的例子包括而不限于乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)等。C2-C6烯基的例子包括上述的C2-C4炔基以及戊炔基(C5)、己炔基(C6)等。炔基的另外的例子包括庚炔基(C7)、辛炔基(C8)等。除非另有说明，否则炔基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的炔基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的炔基”)。在某些实施方案中，炔基是未经取代的C2-C50炔基。在某些实施方案中，炔基是经取代的C2-C50炔基。
芳基：单独或作为较大部分(如“芳烷基”中)的一部分使用的术语“芳基”是指具有总共六至十四个环成员的单环、双环或三环碳环系统，其中所述环系统具有与分子其余部分附接的单个点，所述系统中的至少一个环是芳族并且其中所述系统中的每个环含有4至7个环成员。在实施方案中，芳基具有6个环碳原子(“C6芳基”，例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有10个环碳原子(“C10芳基”，例如，萘基，诸如1-萘基和2-萘基)。在一些实施方案中，芳基具有14个环碳原子(“C14芳基”，例如，蒽基)。“芳基”还包括这样的环系统，其中如上文定义的芳环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中附接的基团或点在芳基环上，并且在此类情况下，碳原子的数量继续指定芳基环系统中碳原子的数量。示例性芳基包括苯基、萘基和蒽基。
如本文所用，“芳基”还指代具有在芳族环系统中提供的6-14个环碳原子和零个杂原子的单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳族环系统(例如，在环状排列中具有共享的6、10或14个π电子)的基团(“C6-C14芳基”)。在一些实施方案中，芳基具有6个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有10个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基，诸如1-萘基和2-萘基)。在一些实施方案中，芳基具有14个环碳原子(“C14芳基”；例如，蒽基)。“芳基”还包括这样的环系统，其中如上文定义的芳环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中附接的基团或点在芳基环上，并且在此类情况下，碳原子的数量继续指定芳基环系统中碳原子的数量。除非另有说明，否则芳基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的芳基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的芳基”)。在某些实施方案中，芳基是未经取代的C6-C14芳基。在某些实施方案中，芳基是经取代的C6-C14芳基。
亚芳基：如本文所用的术语“亚芳基”是指二价的芳基(也就是说，具有两个与分子附接的点)。示例性亚芳基包括亚苯基(例如，未经取代的亚苯基或经取代的亚苯基)。
碳环基：如本文所用，“碳环基”或“碳环”是指在非芳族环系统中具有3至10个环碳原子和零个杂原子的非芳族环烃基的基团(“C3-C10碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有3至8个环碳原子(“C3-C8碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有3至7个环碳原子(“C3-C7碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有3至6个环碳原子(“C3-C6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有4至6个环碳原子(“C4-C6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有5至6个环碳原子(“C5-C6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有5至10个环碳原子(“C5-C10碳环基”)。示例性C3-C6碳环基包括而不限于环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环己二烯基(C6)等。示例性C3-C8碳环基包括而不限于上述的C3-C6碳环基以及环庚基(C7)、环庚烯基(C7)、环庚二烯基(C7)、环庚三烯基(C7)、环辛基(C8)、环辛烯基(C8)、双环[2.2.1]庚基(C7)、双环[2.2.2]辛基(C8)等。示例性C3-C10碳环基包括而不限于上述的C3-C8碳环基以及环壬基(C9)、环壬烯基(C9)、环癸基(C10)、环癸烯基(C10)、八氢-1H-茚基(C9)、十氢萘基(C10)、螺[4.5]癸基(C10)等。如前述例子所说明的，在某些实施方案中，碳环基是单环的(“单环碳环基”)或多环的(例如，含有稠合的、桥接的或螺环系统，诸如双环系统(“双环碳环基”)或三环系统(“三环碳环基”))，并且可以是饱和的或者可以含有一个或多个碳-碳双键或三键。“碳环基”还包括这样的环系统，其中如上文定义的碳环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中附接点在碳环基环上，并且在此类情况下，碳的数量继续指定碳环系统中碳的数量。除非另有说明，否则碳环基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的碳环基”)或被一种或多种取代基取代(“经取代的碳环基”)。在某些实施方案中，碳环基是未经取代的C3-C10碳环基。在某些实施方案中，碳环基是经取代的C3-C10碳环基。
在一些实施方案中，“碳环基”或“碳环”称为“环烷基”，即，具有3至10个环碳原子的单环饱和碳环基(“C3-C10环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有3至8个环碳原子(“C3-C8环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有3至6个环碳原子(“C3-C6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有4至6个环碳原子(“C4-C6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有5至6个环碳原子(“C5-C6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基具有5至10个环碳原子(“C5-C10环烷基”)。C5-C6环烷基的例子包括环戊基(C5)和环己基(C5)。C3-C6环烷基的例子包括上述的C5-C6环烷基以及环丙基(C3)和环丁基(C4)。C3-C8环烷基的例子包括上述的C3-C6环烷基以及环庚基(C7)和环辛基(C8)。除非另有说明，否则环烷基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的环烷基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的环烷基”)。在某些实施方案中，环烷基是未经取代的C3-C10环烷基。在某些实施方案中，环烷基是经取代的C3-C10环烷基。
卤素：如本文所用，术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘。
杂烷基：术语“杂烷基”意指除了1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子之外，还具有1至14个碳原子的支链或非支链烷基、烯基或炔基。杂烷基包括叔胺、仲胺、醚、硫醚、酰胺、硫代酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、腙、亚胺、磷酸二脂、氨基磷酸酯、磺酰胺和二硫化物。杂烷基可以任选地包括单环、双环或三环，其中每个环理想地具有三至六个成员。杂烷基的例子包括聚醚，诸如甲氧基甲基和乙氧基乙基。
亚杂烷基：如本文所用，术语“亚杂烷基”表示如本文所述的杂烷基的二价形式。
杂芳基：如本文所用，术语“杂芳基”是完全不饱和的含杂原子的环，其中至少一个环原子是杂原子(诸如但不限于氮和氧)。
如本文所用，“杂芳基”还指代具有在芳族环系统中提供的环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个环杂原子)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的5-14元单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳族环系统(例如，在环状排列中具有共享的6、10或14个π电子)的基团(“5-14元杂芳基”)。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，如果化合价允许，附接点可以是碳或氮原子。杂芳基多环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂芳基”包括这样的环系统，其中如上文定义的杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中附接点在杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的数量继续指定杂芳基环系统中环成员的数量。“杂芳基”还包括这样的环系统，其中如上文定义的杂芳基环与一个或多个芳基稠合，其中附接点在芳基或杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的数量指定稠合的多环(芳基/杂芳基)的环系统中环成员的数量。其中一个环不含杂原子的多环杂芳基(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)，附接点可以在任一环上，即带有杂原子的环(例如，2-吲哚基)或不含杂原子的环(例如，5-吲哚基)。
在一些实施方案中，杂芳基是具有在芳族环系统中提供的环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的5-10元芳族环系统(“5-10元杂芳基”)。在一些实施方案中，杂芳基是具有在芳族环系统中提供的环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的5-8元芳族环系统(“5-8元杂芳基”)。在一些实施方案中，杂芳基是具有在芳族环系统中提供的环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的5-6元芳族环系统(“5-6元杂芳基”)。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有1个或多个(例如，1、2或3个)选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有1或2个选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂芳基具有1个选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。除非另有说明，否则杂芳基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的杂芳基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的杂芳基”)。在某些实施方案中，杂芳基是未经取代的5-14元杂芳基。在某些实施方案中，杂芳基是经取代的5-14元杂芳基。
含有1个杂原子的示例性5元杂芳基包括而不限于吡咯基、呋喃基和噻吩基。含有2个杂原子的示例性5元杂芳基包括而不限于咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。含有3个杂原子的示例性5元杂芳基包括而不限于三唑基、噁二唑基和噻二唑基。含有4个杂原子的示例性5元杂芳基包括而不限于四唑基。含有1个杂原子的示例性6元杂芳基包括而不限于吡啶基。含有2个杂原子的示例性6元杂芳基包括而不限于哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。含有3或4个杂原子的示例性6元杂芳基分别包括而不限于三嗪基和四嗪基。含有1个杂原子的示例性7元杂芳基包括而不限于氮杂卓基、氧杂卓基(oxepinyl)和硫杂卓基(thiepinyl)。示例性5,6-双环杂芳基包括而不限于吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、吲嗪基和嘌呤基。示例性6,6-双环杂芳基包括而不限于萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。示例性三环杂芳基包括而不限于菲啶基、二苯并呋喃基、咔唑基、吖啶基、吩噻嗪基、吩噁嗪基和吩嗪基。
如本文所用，“杂环基”或“杂环”是指具有环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的3至14元非芳族环系统的基团(“3-14元杂环基”)。在含有一个或多个氮原子的杂环基中，如果化合价允许，附接点可以是碳或氮原子。杂环基可以是单环的(“单环杂环基”)或多环的(例如，稠合的、桥接的或螺环系统，诸如双环系统(“双环杂环基”)或三环系统(“三环杂环基”))，并且可以是饱和的或者可以含有一个或多个碳-碳双键或三键。杂环基多环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂环基”还包括这样的环系统，其中如上文定义的杂环基环与一个或多个碳环基稠合，其中附接点在碳环基环或杂环基环上；或者这样的环系统，其中如上文定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中附接点在杂环基环上，并且在此类情况下，环成员的数量继续指定杂环基环系统中环成员的数量。除非另有说明，否则杂环基的每个例子独立地是未经取代的(“未经取代的杂环基”)或被一个或多个取代基取代(“经取代的杂环基”)。在某些实施方案中，杂环基是未经取代的3-14元杂环基。在某些实施方案中，杂环基是经取代的3-14元杂环基。
在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的5-10元非芳族环系统(“5-10元杂环基”)。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的5-8元非芳族环系统(“5-8元杂环基”)。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1个或多个(例如，1、2、3或4个)环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氧、硫、氮、硼、硅和磷)的5-6元非芳族环系统(“5-6元杂环基”)。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有1个或多个(例如，1、2或3个)选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有1或2个选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。在一些实施方案中，5-6元杂环基具有1个选自氧、硫、氮、硼、硅和磷的环杂原子。
含有1个杂原子的示例性3元杂环基包括而不限于氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基(thiorenyl)。含有1个杂原子的示例性4元杂环基包括而不限于氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。含有1个杂原子的示例性5元杂环基包括而不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。含有2个杂原子的示例性5元杂环基包括而不限于二氧戊环基、氧硫杂环戊烷基(oxathiolanyl)和二硫杂环戊烷基。含有3个杂原子的示例性5元杂环基包括而不限于三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。含有1个杂原子的示例性6元杂环基包括而不限于哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和噻烷基(thianyl)。含有2个杂原子的示例性6元杂环基包括而不限于哌嗪基、吗啉基、二噻烷基、二噁烷基。含有2个杂原子的示例性6元杂环基包括而不限于三嗪烷基(triazinanyl)。含有1个杂原子的示例性7元杂环基包括而不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。含有1个杂原子的示例性8元杂环基包括而不限于氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。示例性双环杂环基包括而不限于吲哚啉基、异吲哚啉基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、四氢苯并噻吩基、四氢苯并呋喃基、四氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、八氢色烯基(octahydrochromenyl)、八氢异色烯基、十氢萘啶基、十氢-1,8-萘啶基、八氢吡咯并[3,2-b]吡咯、吲哚啉基、邻苯二甲酰亚胺基(phthalimidyl)、萘二甲酰亚胺基(naphthalimidyl)、色烷基、色烯基、1H-苯并[e][1,4]二氮杂卓基、1,4,5,7-四氢吡喃并[3,4-b]吡咯基、5,6-二氢-4H-呋喃并[3,2-b]吡咯基、6,7-二氢-5H-呋喃并[3,2-b]吡喃基、5,7-二氢-4H-噻吩并[2,3-c]吡喃基、2,3-二氢-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、2,3-二氢呋喃并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢-1H-吡咯并-[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢呋喃并[3,2-c]吡啶基、4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-b]吡啶基、1,2,3,4-四氢-1,6-萘啶基等。
杂环烷基：如本文所用，术语“杂环烷基”是其中至少一个原子是杂原子(诸如但不限于氮、氧、硫或磷)并且其余原子是碳的非芳族环。所述杂环烷基可以是经取代的或未经取代的。
如由上文所理解的，在某些实施方案中，如本文所定义的烷基、烯基、炔基、酰基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基是任选地经取代的。任选地经取代的是指可以是经取代的或未经取代的基团(例如，“经取代的”或“未经取代的”烷基、“经取代的”或“未经取代的”烯基、“经取代的”或“未经取代的”炔基、“经取代的”或“未经取代的”杂烷基、“经取代的”或“未经取代的”杂烯基、“经取代的”或“未经取代的”杂炔基、“经取代的”或“未经取代的”碳环基、“经取代的”或“未经取代的”杂环基、“经取代的”或“未经取代的”芳基、或者“经取代的”或“未经取代的”杂芳基。通常，术语“经取代的”意指存在于基团上的至少一个氢被允许的取代基(例如，取代后产生稳定化合物(例如，不会自发地诸如通过重排、环化、消除或其他反应经历转化的化合物)的取代基)替代。除非另有指示，否则“经取代的”基团在所述基团的一个或多个可取代位置处具有取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置被取代时，所述取代基在每个位置处是相同的或不同的。设想到术语“经取代的”包括用有机化合物的所有允许的取代基、导致稳定化合物形成的本文所述的任何取代基的取代。为了得到稳定的化合物，本发明设想了任何和所有此类组合。出于本发明的目的，杂原子(诸如氮)可以具有氢取代基和/或如本文所述的满足杂原子的价态并且导致稳定部分形成的任何合适的取代基。
示例性碳原子取代基包括但不限于卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2、-SO3H、-OH、-ORaa、-ON(Rbb)2、-N(Rbb)2、-N(Rbb)3+X-、-N(ORcc)Rbb、-SeH、-SeRaa、-SH、-SRaa、-SSRcc、-C(＝O)Raa、-CO2H、-CHO、-C(ORcc)2、-CO2Raa、-OC(＝O)Raa、-OCO2Raa、-C(＝O)N(Rbb)2、-OC(＝O)N(Rbb)2、-NRbbC(＝O)Raa、-NRbbCO2Raa、-NRbbC(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRbb)ORaa、-OC(＝NRbb)Raa、-OC(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-OC(＝NRbb)N(Rbb)2、-NRbbC(＝NRbb)N(Rbb)2、-C(＝O)NRbbSO2Raa、-NRbbSO2Raa、-SO2N(Rbb)2、-SO2Raa、-SO2ORaa、-OSO2Raa、-S(＝O)Raa、-OS(＝O)Raa、-Si(Raa)3-OSi(Raa)3-C(＝S)N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝S)SRaa、-SC(＝S)SRaa、-SC(＝O)SRaa、-OC(＝O)SRaa、-SC(＝O)ORaa、-SC(＝O)Raa、-P(＝O)2Raa、-OP(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2、-OP(＝O)2N(Rbb)2、-P(＝O)(NRbb)2、-OP(＝O)(NRbb)2、-NRbbP(＝O)(ORcc)2、-NRbbP(＝O)(NRbb)2、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-OP(Rcc)2、-OP(Rcc)3、-B(Raa)2、-B(ORcc)2、-BRaa(ORcc)、C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C14碳环基、3-14元杂环基、C6-C14芳基和5-14元杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
或者碳原子上的两个偕氢被以下基团替代：＝O、＝S、＝NN(Rbb)2、＝NNRbbC(＝O)Raa、＝NNRbbC(＝O)ORaa、＝NNRbbS(＝O)2Raa、＝NRbb或＝NORcc；
Raa的每个实例独立地选自C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、3-14元杂环基、C6-C14芳基和5-14元杂芳基，或者两个Raa基团连接形成3-14元杂环基环或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
Rbb的每个实例独立地选自氢、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、3-14元杂环基、C6-C14芳基和5-14元杂芳基，或者两个Rbb基团与它们所附接的杂原子一起形成3-14元杂环基环或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
Rcc的每个实例独立地选自氢、C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、3-14元杂环基、C6-C14芳基和5-14元杂芳基，或者两个Rcc基团与它们所附接的杂原子一起形成3-14元杂环基环或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
Rdd的每个实例独立地选自卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORee、-ON(Rff)2、-N(Rff)2、-N(Rff)3+X-、-N(ORee)Rff、-SH、-SRee、-SSRee、-C(＝O)Ree、-CO2H、-CO2Ree、-OC(＝O)Ree、-OCO2Ree、-C(＝O)N(Rff)2、-OC(＝O)N(Rff)2、-NRffC(＝O)Ree、-NRffCO2Ree、-NRffC(＝O)N(Rff)2、-C(＝NRff)ORee、-OC(＝NRff)Ree、-OC(＝NRff)ORee、-C(＝NRff)N(Rff)2、-OC(＝NRff)N(Rff)2、-NRffC(＝NRff)N(Rff)2、-NRffSO2Ree、-SO2N(Rff)2、-SO2Ree、-SO2ORee、-OSO2Ree、-S(＝O)Ree、-Si(Ree)3、-OSi(Ree)3、-C(＝S)N(Rff)2、-C(＝O)SRee、-C(＝S)SRee、-SC(＝S)SRee、-P(＝O)2Ree、-P(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(ORee)2、C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、3-10元杂环基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代，或者两个偕Rdd取代基可以连接形成＝O或＝S；
Ree的每个实例独立地选自C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、C6-C10芳基、3-10元杂环基和3-10元杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代；
Rff的每个实例独立地选自氢、C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、3-10元杂环基、C6-C10芳基和5-10元杂芳基，或者两个Rff基团与它们所附接的杂原子一起形成3-14元杂环基环或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代；并且
Rgg的每个实例独立地是卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-OC1-C50烷基、-ON(C1-C50烷基)2、-N(C1-C50烷基)2、-N(C1-C50烷基)3+X-、-NH(C1-C50烷基)2+X-、-NH2(C1-C50烷基)+X-、-NH3+X-、-N(OC1-C50烷基)(C1-C50烷基)、-N(OH)(C1-C50烷基)、-NH(OH)、-SH、-SC1-C50烷基、-SS(C1-C50烷基)、-C(＝O)(C1-C50烷基)、-CO2H、-CO2(C1-C50烷基)、-OC(＝O)(C1-C50烷基)、-OCO2(C1-C50烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(C1-C50烷基)2、-OC(＝O)NH(C1-C50烷基)、-NHC(＝O)(C1-C50烷基)、-N(C1-C50烷基)C(＝O)(C1-C50烷基)、-NHCO2(C1-C50烷基)、-NHC(＝O)N(C1-C50烷基)2、-NHC(＝O)NH(C1-C50烷基)、-NHC(＝O)NH2、-C(＝NH)O(C1-C50烷基),-OC(＝NH)(C1-C50烷基)、-OC(＝NH)OC1-C50烷基、-C(＝NH)N(C1-C50烷基)2、-C(＝NH)NH(C1-C50烷基)、-C(＝NH)NH2、-OC(＝NH)N(C1-C50烷基)2、-OC(NH)NH(C1-C50烷基)、-OC(NH)NH2、-NHC(NH)N(C1-C50烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-NHSO2(C1-C50烷基)、-SO2N(C1-C50烷基)2、-SO2NH(C1-C50烷基)、-SO2NH2、-SO2(C1-C50烷基)、-SO2O(C1-C50烷基)、-OSO2(C1-C6烷基)、-SO(C1-C6烷基)、-Si(C1-C50烷基)3、-OSi(C1-C6烷基)3、-C(＝S)N(C1-C50烷基)2、C(＝S)NH(C1-C50烷基)、C(＝S)NH2、-C(＝O)S(C1-C6烷基)、-C(＝S)S(C1-C6烷基)、-SC(＝S)S(C1-C6烷基)、-P(＝O)2(C1-C50烷基)、-P(＝O)(C1-C50烷基)2、-OP(＝O)(C1-C50烷基)2、-OP(＝O)(OC1-C50烷基)2、C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、C6-C10芳基、3-10元杂环基、5-10元杂芳基；或者两个偕Rgg取代基可以连接形成＝O或＝S；其中X-是反离子。
如本文所用，术语“卤基”或“卤素”是指氟(氟代基，-F)、氯(氯代基，-Cl)、溴(溴代基，-Br)或碘(碘代基，-I)。
如本文所用，“反离子”是与带正电荷的季胺相关的带负电荷的基团，以便维持电子中性。示例性反离子包括卤素离子(例如，F-、Cl-、Br-、I-)，NO3 -，ClO4 -，OH-，H2PO4 -，HSO4 -，磺酸盐离子(例如，甲烷磺酸根、三氟甲烷磺酸根、对甲苯磺酸根、苯磺酸根、10-樟脑磺酸根、萘-2-磺酸根、萘-l-磺酸-5-磺酸根、乙-1-磺酸-2-磺酸根等)，和羧酸根(例如，醋酸根(acetate)、乙酸根(ethanoate)、丙酸根、苯甲酸根、甘油酸根、乳酸根、酒石酸根、乙醇酸根等)。
如果化合价允许，氮原子可以是经取代的或未经取代的，并且包括伯、仲、叔和季氮原子。示例性氮原子取代基包括但不限于氢、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、C1-C50烷基、C2-C50烯基、C2-C50炔基、C3-C10碳环基、3-14元杂环基、C6-C14芳基和5-14元杂芳基，或者两个Rcc基与它们所附接的N原子一起形成3-14元杂环基环或5-14元杂芳基环，其中每个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代，并且其中Raa、Rbb、Rcc和Rdd是如上文定义的。
在某些实施方案中，存在于氮原子上的取代基是氮保护基团(也称为氨基保护基团)。氮保护基团是本领域熟知的，并且包括详细描述于Protecting Groups in OrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中的那些，将所述文献通过引用并入本文。
例如，诸如酰胺基团(例如，-C(＝O)Raa)的氮保护基团包括但不限于甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯乙酰胺、3-苯丙酰胺、吡啶甲酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯乙酰胺、邻硝基苯氧乙酰胺、乙酰基乙酰胺、(N’-二硫代苄基氧基酰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺和邻(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺。
诸如氨基甲酸酯基团(例如，-C(＝O)ORaa)的氮保护基团包括但不限于氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、9-(2-磺基)芴基甲基氨基甲酸酯、9-(2,7-二溴)芴基甲基氨基甲酸酯、2,7-二叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢硫代呫吨基)]甲基氨基甲酸酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯甲酰甲基氨基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯基乙基氨基甲酸酯(hZ)、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(Adpoc)、1,1-二甲基-2-卤代乙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-t-BOC)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基氨基甲酸酯(Bpoc)、1-(3,5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙基氨基甲酸酯(t-Bumeoc)、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基氨基甲酸酯(Pyoc)、2-(N,N-二环己基甲酰氨基)乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸叔丁酯(BOC)、1-金刚烷基氨基甲酸酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯酯(Voc)、氨基甲酸烯丙酯(Alloc)、1-异丙基烯丙基氨基甲酸酯(Ipaoc)、氨基甲酸肉桂酯(Coc)、4-硝基肉桂基氨基甲酸酯(Noc)、8-喹啉基氨基甲酸酯、N-羟基哌啶基氨基甲酸酯、烷基二硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸苄酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)、对硝基苄基氨基甲酸酯、对溴苄基氨基甲酸酯、对氯苄基氨基甲酸酯、2,4-二氯苄基氨基甲酸酯、4-甲基亚磺酰基苄基氨基甲酸酯(Msz)、9-蒽基甲基氨基甲酸酯、二苯基甲基氨基甲酸酯、2-甲基硫代乙基氨基甲酸酯、2-甲基磺酰基乙基氨基甲酸酯、2-(对甲苯磺酰基)乙基氨基甲酸酯、[2-(1,3-二噻烷基)]甲基氨基甲酸酯(Dmoc)、4-甲基硫代苯基氨基甲酸酯(Mtpc)、2,4-二甲基硫代苯基氨基甲酸酯(Bmpc)、2-磷基乙基氨基甲酸酯(Peoc)、2-三苯基磷基异丙基氨基甲酸酯(Ppoc)、1,1-二甲基-2-氰基乙基氨基甲酸酯、间氯对酰基氧基苄基氨基甲酸酯、对(二羟基硼基)苄基氨基甲酸酯、5-苯并异噁唑基甲基氨基甲酸酯、2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基氨基甲酸酯(Tcroc)、间硝基苯基氨基甲酸酯、3,5-二甲氧基苄基氨基甲酸酯、邻硝基苄基氨基甲酸酯、3,4-二甲氧基-6-硝基苄基氨基甲酸酯、苯基(邻硝基苯基)甲基氨基甲酸酯、氨基甲酸叔戊酯、S-苄基硫代氨基甲酸酯、对氰基苄基氨基甲酸酯、氨基甲酸环丁酯、氨基甲酸环己酯、氨基甲酸环戊酯、环丙基甲基氨基甲酸酯、对癸基氧基苄基氨基甲酸酯、2,2-二甲氧基酰基乙烯基氨基甲酸酯、邻(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基氨基甲酸酯、1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基氨基甲酸酯、1,1-二甲基丙炔基氨基甲酸酯、二(2-吡啶基)甲基氨基甲酸酯、2-呋喃基甲基氨基甲酸酯、2-碘代乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸异冰片酯、氨基甲酸异丁酯、氨基甲酸异烟酯、p-(p’-甲氧基苯基偶氮基)苄基氨基甲酸酯、1-甲基环丁基氨基甲酸酯、1-甲基环己基氨基甲酸酯、1-甲基-l-环丙基甲基氨基甲酸酯、1-甲基-1(3,5-二甲氧基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(对苯基偶氮基苯基)乙基氨基甲酸酯、1-甲基-l-苯基乙基氨基甲酸酯、1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基氨基甲酸酯、氨基甲酸苯酯、对(苯基偶氮基)苄基氨基甲酸酯、2,4,6-三叔丁基苯基氨基甲酸酯、4-(三甲基铵)苄基氨基甲酸酯和2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯。
诸如磺酰胺基团(例如，-S(＝O)2Raa)的氮保护基团包括但不限于对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙烷磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。
其他氮保护基团包括但不限于吩噻嗪基-(10)-酰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基酰基衍生物、N’-苯基氨基硫代酰基衍生物、N-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、N-乙酰基甲硫氨酸衍生物、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二噻琥珀酰亚胺(Dts)、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己烷-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲基胺、N-烯丙胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并环庚胺、N-三苯甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲基胺、N-二茂铁基甲基胺(Fcm)、N-2-甲基吡啶基胺基N’-氧化物、N-1,1-二甲基硫代亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)均三甲苯基]亚甲基胺、N-(N’,N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N,N’-异亚丙基二胺、N-对硝基亚苄基胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、N-亚环己基胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-l-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五酰基铬-或钨)酰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝基胺、胺N-氧化物、二苯基磷酰胺(Dpp)、二甲基硫代磷酰胺(Mpt)、二苯基硫代磷酰胺(Ppt)、氨基磷酸二烷基酯、氨基磷酸二苄酯、氨基磷酸二苯酯、苯次磺酰胺、邻硝基苯次磺酰胺(Nps)、2,4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯基甲基次磺酰胺和3-硝基吡啶次磺酰胺(Npys)。
在某些实施方案中，存在于氧原子上的取代基是氧保护基团(也称为羟基保护基团)。氧保护基团是本领域熟知的，并且包括详细描述于Protecting Groups in OrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中的那些，将所述文献通过引用并入本文。
示例性氧保护基团包括但不限于甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基(MTM)、叔丁硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(对AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-甲醇苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-l-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基亚硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基(Bn)、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-甲基吡啶基、4-甲基吡啶基、3-甲基-2-甲基吡啶基N-氧负离子基、二苯基甲基、p,p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯酰氧基苯基)二苯基甲基、4,4’,4”-三(4,5-二氯苯二甲酰亚氨基苯基)甲基、4,4’,4”-三(乙酰丙酰氧基苯基)甲基、4,4’,4”-三(苯甲酰氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)双(4’,4”-二甲氧基苯基)甲基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫呋喃-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧负离子基、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基叔己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫代)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫代缩醛)、新戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(均三甲苯甲酸酯(mesitoate))、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基鏻)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2-碘苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲硫基甲氧基)乙基、4-(甲硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-双(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、邻(甲氧基酰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、N,N,N’,N’-四甲基二氨基磷酸烷基酯、N-苯基氨基甲酸烷基酯、硼酸酯、二甲基硫膦基(dimethylphosphinothioyl)、2,4-二硝基苯基次磺酸烷基酯、硫酸酯、甲基磺酸酯(methanesulfonate)(甲磺酸酯(mesylate))、苄基磺酸酯和甲苯磺酸酯(Ts)。
在某些实施方案中，存在于硫原子上的取代基是硫保护基团(也称为硫醇保护基团)。硫保护基团是本领域熟知的，并且包括详细描述于Protecting Groups in OrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中的那些，将所述文献通过引用并入本文。
示例性硫保护基团包括但不限于烷基、苄基、对甲氧基苄基、2,4,6-三甲基苄基、2,4,6-三甲氧基苄基、邻羟基苄基、对羟基苄基、邻乙酰氧基苄基、对乙酰氧基苄基、对硝基苄基、4-甲基吡啶基、2-喹啉基甲基、2-甲基吡啶基N-氧负离子基、9-蒽基甲基、9-芴基甲基、呫吨基、二茂铁基甲基、二苯基甲基、双(4-甲氧基苯基)甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、二苯基-4-吡啶基甲基、苯基、2,4-二硝基苯基、叔丁基、1-金刚烷基、甲氧基甲基(MOM)、异丁氧基甲基、苄氧基甲基、2-四氢吡喃基、苄硫基甲基、苯硫基甲基、噻唑烷基、乙酰胺基甲基、三甲基乙酰胺基甲基、苯甲酰胺基甲基、烯丙氧基羰基氨基甲基、苯基乙酰胺基甲基、苯二甲酰亚氨基甲基、乙酰基甲基、羧基甲基、氰甲基、(2-硝基-1-苯基)乙基、2-(2,4-二硝基苯基)乙基、2-氰乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2,2-双(羰基乙氧基)乙基、(1-间硝基苯基-2-苯甲酰基)乙基、2-苯基磺酰基乙基、2-(4-甲基苯基磺酰基)-2-甲基丙-2-基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、N-[[(对联苯基)异丙氧基]羰基]-N-甲基]-γ-氨基硫代丁酸酯、2,2,2-三氯乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、N-乙基、N-甲氧基甲基、磺酸酯、次磺酰基硫代碳酸酯、3-硝基-2-吡啶次磺酰基硫化物、氧硫杂环戊烯酮(oxathiolone)。
具体实施方式
本发明尤其提供了改善的组合物，所述改善的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA和一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂，其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.1％重量/体积(w/v)的浓度存在，所述表面活性剂具有较高的雾化速率并且所述脂质纳米颗粒在雾化后具有改善的特征。
表面活性剂
根据本发明的表面活性剂由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成(参见图1的说明)。所述抗氧化剂部分可以是亲脂性维生素。亲脂性维生素的例子包括维生素A、D、E或K。在一些实施方案中，所述亲脂性维生素是维生素E或D。
由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的示例性表面活性剂是D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)。TPGS已经被用于雾化疏水性小分子药物(诸如塞来昔布)(Fulzele等人2006Pharm Res.23,9,2094-2106)，并且先前已经与蛋L-a-磷脂酰胆碱和羊毛脂胆固醇组合用作脂质纳米颗粒的组分(Valle等人2018Appl.Sci.8,1291)。鉴于其作为疏水性药物的增溶剂、乳化剂以及渗透和生物利用度促进剂的用途，认为TPGS和类似的表面活性剂可能不是包含包封mRNA的脂质纳米颗粒的组合物中的合适赋形剂。诸位发明人出人意料地发现，由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂(诸如TPGS)可以用于包含脂质纳米颗粒的组合物中，并且这些组合物具有有利的雾化特征(例如，改善的雾化输出速率)。
在一些实施方案中，包含在本发明的组合物中的一种或多种表面活性剂中的接头部分可以是琥珀酸酯、草酸酯、己二酸酯、丙二酸酯、富马酸酯、苹果酸酯、戊二酸酯或马来酸酯。在特定实施方案中，包含在本发明的组合物中的一种或多种表面活性剂中的接头部分是琥珀酸酯。各种不同形式的PEG是本领域已知的并且可以用于本发明。在一些实施方案中，所述抗氧化剂部分可以是未经修饰的PEG、甲氧基-PEG(mPEG)或羧酸官能化的PEG(COOH-PEG)。PEG部分的平均分子量可以变化。在一些实施方案中，PEG部分的平均分子量在0.1kDa与10kDa之间。在一个特定实施方案中，PEG部分的平均分子量在0.5kDa与5kDa之间。在具体实施方案中，PEG部分的平均分子量是约1KDa、约2KDa、约3KDa、约3.4KDa或约5KDa。在进一步的具体实施方案中，PEG部分的平均分子量是约0.5kDa、约1kDa、约1.5kDa、约2kDa、约2.5kDa或约3kDa。
与本发明的组合物一起使用的特别合适的表面活性剂包含亲脂性维生素(例如，维生素E或维生素D)作为其抗氧化剂部分。此类表面活性剂典型地具有在0.5kDa与5kDa之间的未经修饰的PEG部分。常用的接头部分是琥珀酸酯。因此，在一些实施方案中，表面活性剂选自PEG-0.5K-琥珀酸酯-维生素E、PEG-0.75K-琥珀酸酯-维生素E、PEG-1K-琥珀酸酯-维生素E、PEG-2K-琥珀酸酯-维生素E、PEG-3K-琥珀酸酯-维生素E、PEG-3.4K-琥珀酸酯-维生素E、PEG-5K-琥珀酸酯-维生素E、PEG-0.5K-琥珀酸酯-维生素D、PEG-0.75K-琥珀酸酯-维生素D、PEG-1K-琥珀酸酯-维生素D、PEG-2K-琥珀酸酯-维生素D、PEG-3K-琥珀酸酯-维生素D、PEG-3.4K-琥珀酸酯-维生素D或PEG-5K-琥珀酸酯-维生素D。
与本发明的组合物一起使用的其他特别合适的表面活性剂包含亲脂性维生素(例如，维生素E或维生素D)作为其抗氧化剂部分和在0.5kDa与5kDa之间的经修饰的PEG部分。在一些实施方案中，经修饰的PEG部分是mPEG。在一些实施方案中，经修饰的PEG部分是COOH-PEG。
在一些实施方案中，表面活性剂选自mPEG-0.5K-琥珀酸酯-维生素E、mPEG-0.75K-琥珀酸酯-维生素E、mPEG-1K-琥珀酸酯-维生素E、mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素E、mPEG-3K-琥珀酸酯-维生素E、mPEG-3.4K-琥珀酸酯-维生素E、mPEG-5K-琥珀酸酯-维生素E、mPEG-0.5K-琥珀酸酯-维生素D、mPEG-0.75K-琥珀酸酯-维生素D、mPEG-1K-琥珀酸酯-维生素D、mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素D、mPEG-3K-琥珀酸酯-维生素D、mPEG-3.4K-琥珀酸酯-维生素D或mPEG-5K-琥珀酸酯-维生素D。
在一些实施方案中，表面活性剂选自COOH-PEG-0.5K-琥珀酸酯-维生素E、COOH-PEG-0.75K-琥珀酸酯-维生素E、COOH-PEG-1K-琥珀酸酯-维生素E、COOH-PEG-2K-琥珀酸酯-维生素E、COOH-PEG-3K-琥珀酸酯-维生素E、COOH-PEG-3.4K-琥珀酸酯-维生素E、COOH-PEG-5K-琥珀酸酯-维生素E、COOH-PEG-0.5K-琥珀酸酯-维生素D、COOH-PEG-0.75K-琥珀酸酯-维生素D、COOH-PEG-1K-琥珀酸酯-维生素D、COOH-PEG-2K-琥珀酸酯-维生素D、COOH-PEG-3K-琥珀酸酯-维生素D、COOH-PEG-3.4K-琥珀酸酯-维生素D或COOH-PEG-5K-琥珀酸酯-维生素D。
在第一具体实施方案中，表面活性剂是D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)。在第二具体实施方案中，表面活性剂是mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素E。在第三具体实施方案中，表面活性剂是COOH-PEG-3.4k-琥珀酸酯-维生素E。在第四具体实施方案中，表面活性剂是mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素D。在第五具体实施方案中，表面活性剂是mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素D。在第六具体实施方案中，表面活性剂是COOH-PEG-3.4k-琥珀酸酯-维生素D。如示例性实施方案所展示，TPGS是用于本发明组合物的特别合适的表面活性剂。
表面活性剂浓度
在一些实施方案中，由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的一种或多种表面活性剂(例如，TPGS)以在雾化后降低或防止本发明的组合物中的脂质纳米颗粒的尺寸增加的浓度存在(参见图3A)。在一些实施方案中，由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的一种或多种表面活性剂(例如，TPGS)以降低或防止雾化后本发明组合物中的脂质纳米颗粒的包封效率损失的浓度存在(参见图3B)。
因此，在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以至少0.2％、至少0.5％或至少1％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以0.1％-10％w/v(例如，0.1％-5％w/v或0.1％-2％w/v)的浓度存在。在特定实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以0.2％-1％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.25％、约1.5％、约1.75％或约2％w/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％或约0.5％w/v的浓度存在。在具体实施方案中，所述一种或多种表面活性剂以约0.5％-1％w/v的浓度存在(例如，以约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1％w/v的浓度存在)。
另外的赋形剂
除了一种或多种表面活性剂之外，本发明的组合物可以包含另外的赋形剂。例如，组合物可以进一步包含缓冲液、盐、糖或其组合。
缓冲液
在一些实施方案中，组合物进一步包含缓冲液。在一些实施方案中，组合物包含(a)包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，(b)一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂，以及(c)缓冲液，其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.1％重量/体积(w/v)的浓度存在。
可用于本发明组合物的示例性缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、咪唑缓冲液、组氨酸缓冲液、古德缓冲液(Good’s buffer)、MES、PIPES、HePES、马来酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液。在一个具体实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液。在一个特定实施方案中，本发明的组合物中使用的缓冲液是磷酸钠缓冲液。在另一个特定实施方案中，本发明的组合物中使用的缓冲液是磷酸钾缓冲液。
在一些实施方案中，缓冲液的pH在pH 5-9之间。在一些实施方案中，缓冲液的pH是5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9。在一些实施方案中，缓冲液的pH是7。例子证明pH低于7的缓冲液可以在雾化之后维持包封效率。因此，在特定实施方案中，缓冲液的pH低于7。例如，合适的缓冲液(例如，磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液)的pH可以是5-6。在一个具体实施方案中，缓冲液的pH是约5.5。
在一些实施方案中，根据本发明的组合物的pH低于7(例如，约5.5的pH)，并且包含盐(例如，NaCl)，典型地浓度在100mM与200mM之间(例如，约150mM)。如在例子中所观察到的，这种组合物能够以大于15ml/h的雾化输出速率雾化，同时在雾化之后维持高包封效率。
在一些实施方案中，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)以1mM至20mM之间的浓度存在。在具体实施方案中，缓冲液(例如，诸如磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液的磷酸盐缓冲液，典型地pH是5-6)以1mM至10mM之间的浓度存在。例如，缓冲液可以以1mM、2mM、5mM、10mM、15mM或20mM的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲液的浓度是10mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度是5mM。在一些实施方案中，缓冲液的浓度是1mM。在其他实施方案中，缓冲液(例如，Tris或咪唑缓冲液)以40mM与100mM之间的浓度存在。例如，缓冲液可以以40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度存在。
盐
在一些实施方案中，组合物进一步包含盐。在一些实施方案中，组合物包含(a)包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，(b)一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂，以及(c)盐，其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.1％重量/体积(w/v)的浓度存在。
可用于本发明的组合物的示例性盐包括氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化胍和氨基酸盐(诸如氯化精氨酸)。因此，在一些实施方案中，所述盐是氯化钠。在一些实施方案中，所述盐是氯化钾。在一些实施方案中，所述盐是氯化钙。
已经发现氯化钠可用于本发明的组合物中以维持合适的重量渗透压摩尔浓度。这是基于氯化钠的质荷比，所述氯化钠的质荷比导致特别适合于雾化期间的电离的辩证常数。血液和体液的重量渗透压摩尔浓度是大约300mOsmol/kg。有利的是维持本发明组合物的重量渗透压摩尔浓度，使得其为等渗的或高渗的。渗透压比肺中的液体低的低渗溶液可能引起肺刺激。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物的重量渗透压摩尔浓度在250-600mOsmol/kg之间，例如280-400mOsmol/kg(等渗至略微高渗)或500-600mOsmol/kg(高渗)。
在一些实施方案中，盐的浓度在50mM至200mM之间。在一些实施方案中，盐的浓度在50mM至200mM之间。在一些实施方案中，盐的浓度是至少10mM、20mM、50mM或100mM。在一些实施方案中，盐的浓度是10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、75mM、100mM、125mM或150mM。例子证明，在组合物中具有较高浓度的盐是有利的，因为这改善了雾化速率。因此，在特定实施方案中，盐的浓度是至少75mM、100mM或150mM。
在典型的实施方案中，本发明的组合物包含盐(例如，氯化钠)与缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)的组合。如例子所展示，本发明组合物中盐和缓冲液的存在改善了组合物的雾化速率。因此，在一些实施方案中，组合物包含(a)包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，(b)一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂，其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.1％重量/体积(w/v)的浓度存在，(c)盐(例如，氯化钠)，以及(d)缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
在特定实施方案中，根据本发明的组合物包含缓冲液和盐，例如以便增强组合物在储存期间的稳定性。在一些实施方案中，缓冲液和盐的总浓度选自约40mM磷酸盐缓冲液和约75-125mM NaCl、约50mM磷酸盐缓冲液和约50mM-100mM NaCl、约100mM磷酸盐缓冲液和约100mM-200mM NaCl、约40mM磷酸钠或磷酸钾和约100mM-125mM NaCl，以及约50mM磷酸钠或磷酸钾和75mM-100mM NaCl。
糖
在一些实施方案中，组合物进一步包含糖。在一些实施方案中，组合物包含(a)包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，(b)一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂，以及(c)糖，其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.1％重量/体积(w/v)的浓度存在。在一些实施方案中，所述糖是二糖(诸如蔗糖或海藻糖)。
在一些实施方案中，糖以至少1％、至少2％、至少5％或至少10％(w/v)的浓度存在。在一些实施方案中，糖的浓度是1％-20％(w/v)。在一些实施方案中，糖的浓度是2％-10％(w/v)。在特定实施方案中，糖的浓度是2％-6％(w/v)。在具体实施方案中，糖的浓度是约2％、约4％、约6％、约8％或约10％(w/v)。例子证明，包含较低浓度的糖的组合物具有较高的雾化速率。因此，已经发现约2％、约4％或约6％(w/v)的糖浓度特别适合于本发明的组合物。
已经发现二糖(诸如海藻糖)是用于mRNA-脂质纳米颗粒组合物的特别合适的赋形剂，尤其是因为它们还可以例如在冻干期间充当冻干保护剂。因此，本发明的组合物可以包含以2％-10％(w/v)(例如，3％-6％(w/v))的浓度存在的海藻糖。在特定实施方案中，海藻糖以约2％、约3％、约4％、约6％、约8％或约10％(w/v)的浓度存在。已发现约2％、约3％、约4％或约6％(w/v)的海藻糖浓度特别适合与本发明的组合物一起使用。
在一些实施方案中，海藻糖可以用相同浓度的蔗糖取代。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物包含浓度为2％-10％(w/v)的蔗糖。在特定实施方案中，蔗糖以约2％、约3％、约4％、约6％、约8％或约10％(w/v)的浓度存在。
在典型的实施方案中，本发明的组合物包含浓度(w/v)为约0.1％-1％的由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂(例如，TPGS)与浓度(w/v)为约3％-6％的糖(例如，二糖(诸如海藻糖))的组合。结合起来，实施例中的发现表明，包含浓度为0.1％-0.2％(w/v)的一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂(例如，TPGS)和浓度为4％-6％(w/v)的糖(例如，二糖，诸如海藻糖)的组合物具有特别改善的雾化速率。此类组合物可以进一步包含缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)和任选地盐(例如，氯化钠)。缓冲液可以以10mM(例如，10mM磷酸钠，pH 5.5)的浓度存在。盐可以以50mM至150mM的浓度存在。此类组合物特别适合于雾化，并且可以改善雾化速率。
其他赋形剂
在一些实施方案中，本发明的组合物还包含选自以下的赋形剂：DMSO、乙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、丙二醇及其组合。
在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是至少1％、至少2％、至少5％或至少10％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是1％-20％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是2％-10％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是2％-6％w/v。在一些实施方案中，所述赋形剂的浓度是约2％、约4％、约6％、约8％或约10％w/v。在一些实施方案中，组合物包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的赋形剂。
本发明的示例性组合物
在一些实施方案中，本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA、浓度(w/v)为约0.1％-1％的TPGS和浓度(w/v)为约3％-10％的二糖(诸如海藻糖)。在特定实施方案中，本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA、浓度(w/v)为约0.5％的TPGS和浓度(w/v)为约8％的海藻糖。在特定实施方案中，本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，浓度(w/v)为约0.1％-0.3％的TPGS与浓度(w/v)为约3％-6％的海藻糖的组合。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA、浓度(w/v)为约0.1％-1％的TPGS和氯化钠。在特定实施方案中，本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA、浓度(w/v)为约0.1％-1％的TPGS和浓度为至少75mM(例如，约75mM至200mM)的氯化钠。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA、浓度(w/v)为约0.1％-1％的TPGS、氯化钠和磷酸盐缓冲液。在特定实施方案中，本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA、浓度(w/v)为约0.1％-1％的TPGS、浓度为至少50mM(例如，约50mM至200mM)的氯化钠和pH为约5.5的磷酸盐缓冲液。
信使RNA(mRNA)
本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的任何mRNA。mRNA典型地被认为是将信息从DNA携带到核糖体的RNA类型。典型地，在真核生物体中，mRNA加工包括在5’端上添加“帽”和在3’端上添加“尾”。典型的帽是7-甲基鸟苷帽，其是经由5’-5’-三磷酸键连接至第一个转录的核苷酸的鸟苷。帽的存在对于提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性是重要的。尾的添加典型地是多腺苷酸化事件，由此将多腺苷酰部分添加至mRNA分子的3’端。该“尾”的存在用于保护mRNA免受外切核酸酶的降解。mRNA被核糖体翻译成构成蛋白质的一系列氨基酸。
在一些实施方案中，根据本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，其中所述mRNA以约0.5mg/mL至约1.0mg/mL的范围内浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，mRNA以至少0.5mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，mRNA以至少0.6mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，mRNA以至少0.7mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，mRNA以至少0.8mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，mRNA以至少0.9mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，mRNA以至少1.0mg/mL的浓度存在。在典型的实施方案中，mRNA以约0.6mg/mL至约0.8mg/mL的浓度存在。
编码治疗性蛋白质的mRNA
在某些实施方案中，包封的mRNA编码治疗性蛋白质。如本文所用，术语“治疗性蛋白质”可以是指蛋白质、多肽或肽。在典型的实施方案中，治疗性蛋白质是酶、膜蛋白、抗体或抗原。
在一些实施方案中，包封的mRNA编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、ATP结合盒亚家族A成员3蛋白、动力蛋白轴丝中链1(DNAI1)蛋白、动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)蛋白、α-1-抗胰蛋白酶蛋白、叉头框P3(FOXP3)蛋白或表面活性剂蛋白(例如，表面活性剂A蛋白、表面活性剂B蛋白、表面活性剂C蛋白和表面活性剂D蛋白)。
在某些实施方案中，包封的mRNA编码抗原。在某些实施方案中，包封的mRNA编码与受试者的癌症相关的抗原或从受试者的癌细胞中鉴定的抗原。在某些实施方案中，包封的mRNA编码从受试者自身的癌细胞确定的抗原(例如，肿瘤新抗原)，即，以提供个性化的癌症疫苗。
在某些实施方案中，包封的mRNA编码抗体。在某些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体可以是融合蛋白的一部分。在某些实施方案中，包封在此类脂质纳米颗粒中的经密码子优化的mRNA编码针对OX40的抗体。在某些实施方案中，包封在此类脂质纳米颗粒中的经密码子优化的mRNA编码针对VEGF的抗体。在某些实施方案中，包封的mRNA编码针对组织坏死因子α的抗体。在某些实施方案中，包封的mRNA编码针对CD3的抗体。在某些实施方案中，包封的mRNA编码针对CD19的抗体。
在某些实施方案中，包封的mRNA编码免疫调节剂。在某些实施方案中，包封的mRNA编码白细胞介素12。在某些实施方案中，包封的mRNA编码白细胞介素23。在某些实施方案中，包封的mRNA编码白细胞介素36γ。在某些实施方案中，包封的mRNA编码一种或多种干扰素基因刺激因子(STING)蛋白的组成型活性变体。
在某些实施方案中，包封的mRNA编码核酸内切酶。在某些实施方案中，包封的mRNA编码RNA指导的DNA核酸内切酶蛋白，诸如Cas 9蛋白。在某些实施方案中，包封的mRNA编码兆核酸酶蛋白。在某些实施方案中，包封的mRNA编码转录激活因子样效应物核酸酶蛋白。在某些实施方案中，包封的mRNA编码锌指核酸酶蛋白。
典型地，在本发明的组合物中，包封在脂质纳米颗粒中的mRNA包含多A尾。在一些实施方案中，mRNA包含长度为至少70个残基的多A尾。在一些实施方案中，mRNA包含长度为至少100个残基的多A尾。在一些实施方案中，mRNA包含长度为至少120个残基的多A尾。在一些实施方案中，mRNA包含长度为至少150个残基的多A尾。在一些实施方案中，mRNA包含长度为至少200个残基的多A尾。在一些实施方案中，mRNA包含长度为至少250个残基的多A尾。
mRNA合成
可以根据多种已知方法中的任一种合成mRNA。多种方法描述于公开的美国申请号US2018/0258423中，并且可以用于实践本发明，将所有所述申请都通过引用并入本文。例如，可以经由体外转录(IVT)合成用于本发明的mRNA。简言之，典型地用以下进行IVT：含有启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷三磷酸库、可以包括DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而变化。在一些实施方案中，可以进一步纯化mRNA以用于本发明。在一些实施方案中，可以在配制和包封之前纯化体外合成的mRNA，以去除不希望的杂质(包括在mRNA合成期间使用的各种酶和其他试剂)。
可以使用多种方法来纯化用于本发明的mRNA。例如，可以使用离心、过滤和/或色谱方法进行mRNA的纯化。在一些实施方案中，通过乙醇沉淀或过滤或色谱法或者凝胶纯化或任何其他合适的手段来纯化所合成的mRNA。在一些实施方案中，通过HPLC纯化mRNA。在一些实施方案中，在本领域技术人员熟知的标准苯酚:氯仿:异戊醇溶液中提取mRNA。
在具体实施方案中，使用切向流过滤(TFF)纯化mRNA。合适的纯化方法包括公开的美国申请号US2016/0040154、公开的美国申请号US2015/0376220、公开的美国申请号US2018/0251755、公开的美国申请号US2018/0251754、2018年11月8日提交的美国临时申请号62/757,612和2019年8月26日提交的美国临时申请号62/891,781(将所有所述申请都通过引用并入本文)中所述的方法，并且可以用于实践本发明。
在一些实施方案中，在加帽和加尾之前纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后纯化mRNA。在一些实施方案中，既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过离心纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过过滤纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过TFF纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过色谱法纯化mRNA。
多种天然存在的或经修饰的核苷可以用于产生用于本发明的mRNA。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然的核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；嵌入的碱基；经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。
在一些实施方案中，mRNA包含一个或多个非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可以包括例如5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ΨU”)和/或2-硫代尿苷(“2sU”)。关于此类残基及其掺入mRNA的讨论，参见例如美国专利号8,278,036或WO 2011/012316。mRNA可以是这样的RNA，其被定义为25％的U残基是2-硫代-尿苷并且25％的C残基是5-甲基胞苷的RNA。关于使用RNA的教导披露于美国专利公开案US20120195936和国际公开案WO 2011/012316中，将这两个公开案都通过引用以其整体特此并入。非标准核苷酸残基的存在可能使mRNA比具有相同序列但仅含有标准残基的对照mRNA更稳定和/或免疫原性更低。在其他实施方案中，mRNA可以包含一个或多个选自以下的非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶以及这些修饰和其他核碱基修饰的组合。一些实施方案可以进一步包括对呋喃糖环或核碱基的另外的修饰。另外的修饰可以包括例如糖修饰或取代(例如，2'-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)中的一种或多种)。在一些实施方案中，RNA可以与另外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA)复合或杂交。在糖修饰为2'-O-烷基修饰的一些实施方案中，这样的修饰可以包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在一些实施方案中，这些修饰中的任一种可以单独或组合存在于0-100％的核苷酸中，例如超过0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成核苷酸中。
包封的mRNA的长度可以变化。在一些实施方案中，包封的体外合成的mRNA的长度可以为或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb 6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、20kb、30kb、40kb或50kb。在一些实施方案中，包封的体外合成的mRNA的长度范围是约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb、约8-15kb或约8-50kb。
经密码子优化的mRNA
在一些实施方案中，本发明的组合物用于将经密码子优化的编码治疗性蛋白质的mRNA递送至受试者以治疗疾病。合适的经密码子优化的mRNA编码蛋白质的任何全长、片段或部分，其可以取代天然存在的蛋白质活性和/或降低与疾病相关的一种或多种症状的强度、严重程度和/或频率。
产生经优化的核苷酸序列
本发明的组合物可以包含包封的mRNA，所述包封的mRNA包含编码治疗性蛋白质的经优化的核苷酸序列。这些mRNA相对于其天然存在的对应物被修饰以(a)在体外合成期间提高全长mRNA的产量，和(b)在体内将mRNA递送至靶细胞后使编码的多肽的表达最大化。有利于靶细胞中mRNA快速降解的序列基序也已经被去除。
用于产生用于本发明的组合物的由脂质纳米颗粒包封的mRNA的经优化的核苷酸序列的示例性方法首先产生经密码子优化的序列的列表，并且然后对所述列表应用三个过滤器。具体地，其应用基序筛选过滤器、鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量分析过滤器和密码子适应指数(CAI)分析过滤器以产生经优化的核苷酸序列的更新列表。更新的列表不再包括含有预期干扰编码多肽的有效转录和/或翻译的特征的核苷酸序列。
密码子优化
遗传密码具有64个可能的密码子。每个密码子包含三个核苷酸的序列。基因组的蛋白质编码区中每个密码子的使用频率可以通过以下方法来计数：确定特定密码子出现在基因组的蛋白质编码区中的实例数，然后将获得的值除以基因组的蛋白质编码区内编码相同氨基酸的密码子的总数。
关于对于生成密码子使用表的特定生物来源，使用每个密码子来编码某种氨基酸的频率，密码子使用表含有以实验方式得到的数据。对于每个密码子，该信息表示为使用该密码子来编码某种氨基酸的频率相对于密码子编码该氨基酸的总次数的百分比(0至100％)或分数(0至1)。
密码子使用表存储在公众可获得的数据库中，诸如密码子使用数据库(Naka mura等人(2000)Nucleic Acids Research 28(1),292；可在线获取：https://www.kazusa.or.jp/codon/)和高性能集成虚拟环境-密码子使用表(High-performanceIntegrated VirtualEnvironment-Codon Usage Tables)(HIVE-CUT)数据库(Athey等人,(2017),BMC Bioinformatics 18(1),391；可在线获取：http://hive.biochemistry.gwu.edu/review/codon)。
在密码子优化的第一步骤期间，如果密码子与低于阈值频率(例如，10％)的密码子使用频率相关，则将所述密码子从第一密码子使用表中去除，所述第一密码子使用表反映了给定生物体(例如，哺乳动物或人)中每个密码子的频率。将在第一步骤中未去除的密码子的密码子使用频率标准化，以生成标准化的密码子使用表。通过基于所述标准化密码子使用表中与给定氨基酸相关的一个或多个密码子的使用频率选择氨基酸序列中每个氨基酸的密码子来生成编码目的氨基酸序列的经优化的核苷酸序列。选择给定氨基酸的某个密码子的概率等于标准化密码子使用表中涉及与该氨基酸相关的密码子的使用频率。
由脂质纳米颗粒包封的mRNA的经密码子优化的序列通过用于产生经优化的核苷酸序列的计算机执行的方法来产生。所述方法包括：(i)接收氨基酸序列，其中所述氨基酸序列编码肽、多肽或蛋白质；(ii)接收第一密码子使用表，其中所述第一密码子使用表包括氨基酸列表，其中所述表中的每个氨基酸与至少一个密码子相关，并且每个密码子与使用频率相关；(iii)从所述密码子使用表去除与低于阈值频率的使用频率相关的任何密码子；(iv)通过将步骤(iii)中未去除的密码子的使用频率标准化生成标准化密码子使用表；以及(v)通过基于所述标准化密码子使用表中与所述氨基酸序列中的每个氨基酸相关的一个或多个密码子的使用频率选择所述氨基酸的密码子来生成编码所述氨基酸序列的经优化的核苷酸序列。所述阈值频率可以在5％-30％范围，特别是5％、10％、15％、20％、25％或30％。在本发明的情况下，所述阈值频率典型地是10％。
生成标准化密码子使用表的步骤包括：(a)将与第一氨基酸相关且在步骤(iii)中去除的每个密码子的使用频率分配给与所述第一氨基酸相关的其余密码子；以及(b)对于每个氨基酸重复步骤(a)以产生标准化密码子使用表。在一些实施方案中，将所述去除的密码子的使用频率在其余密码子之间均等地分配。在一些实施方案中，将所述去除的密码子的使用频率基于每个其余密码子的使用频率在其余密码子之间按比例分配。在此情况下的“分配”可以被定义为取与某种氨基酸相关的去除的密码子的使用频率的组合量值，并且将该组合频率的一部分分摊给编码所述某种氨基酸的其余密码子中的每一个。
选择每个氨基酸的密码子的步骤包括：(a)在所述标准化密码子使用表中鉴定与所述氨基酸序列的第一氨基酸相关的一个或多个密码子；(b)选择与所述第一氨基酸相关的密码子，其中选择某一密码子的概率等于所述标准化密码子使用表中涉及与所述第一氨基酸相关的密码子的使用频率；以及(c)重复步骤(a)和(b)直到已经选择所述氨基酸序列中每个氨基酸的密码子。
通过选择所述氨基酸序列中每个氨基酸的密码子生成经优化的核苷酸序列的步骤(上述方法中的步骤(v))进行n次，以生成经优化的核苷酸序列的列表。
基序筛选
将基序筛选过滤器应用于经优化的核苷酸序列的列表。从所述列表去除编码任何已知的负顺式调控元件和负重复元件的经优化的核苷酸序列，以产生更新的列表。
对于所述列表中每个经优化的核苷酸序列，还确定它是否含有终止信号。从所述列表去除含有一个或多个终止信号的任何核苷酸序列，产生更新的列表。在一些实施方案中，终止信号具有以下核苷酸序列：5’-X1ATCTX2TX3-3’，其中X1、X2和X3独立地选自A、C、T或G。在一些实施方案中，终止信号具有以下核苷酸序列之一：TATCTGTT；和/或TTTTTT；和/或AAGCTT；和/或GAAGAGC；和/或TCTAGA。在典型的实施方案中，终止信号具有以下核苷酸序列：5’-X1AUCUX2UX3-3’，其中X1、X2和X3独立地选自A、C、U或G。在具体实施方案中，终止信号具有以下核苷酸序列之一：UAUCUGUU；和/或UUUUUU；和/或AAGCUU；和/或GAAGAGC；和/或UCUAGA。
鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量
所述方法进一步包括确定在经优化的核苷酸序列的更新列表中每个经优化的核苷酸序列的鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量。序列的GC含量是核苷酸序列中作为鸟嘌呤或胞嘧啶的碱基的百分比。通过以下方式进一步更新经优化的核苷酸序列的列表：如果任何核苷酸序列的GC含量落在预定GC含量范围以外，则从所述列表去除所述序列。
确定每个经优化的核苷酸序列的GC含量包括，对于每个核苷酸序列：确定所述核苷酸序列的一个或多个另外的部分的GC含量，其中所述另外的部分互相不重叠并且与第一部分不重叠，并且其中更新经优化的序列的列表包括：如果任何部分的GC含量落在预定的GC含量范围以外，则去除所述核苷酸序列，任选地其中在确定任何部分的GC含量在预定的GC含量范围以外时，停止确定所述核苷酸序列的GC含量。在一些实施方案中，所述核苷酸序列的第一部分和/或一个或多个另外的部分包含预定数量的核苷酸，任选地其中核苷酸的所述预定数量在如下范围内：5至300个核苷酸，或10至200个核苷酸，或15至100个核苷酸，或20至50个核苷酸。在本发明的情况下，核苷酸的所述预定数量典型地是30个核苷酸。所述预定的GC含量范围可以是15％-75％、或40％-60％、或30％-70％。在本发明的情况下，所述预定的GC含量范围典型地是30％-70％。
在本发明的情况下合适的GC含量过滤器可以首先分析经优化的核苷酸序列的前30个核苷酸，即经优化的核苷酸序列的核苷酸1至30。分析可以包括确定所述部分中作为G或C的核苷酸的数量，并且确定所述部分的GC含量可以包括将所述部分中的G或C核苷酸的数量除以所述部分中的核苷酸的总数。该分析的结果将提供描述所述部分中作为G或C的核苷酸的比例的值，并且可以是百分比，例如50％，或小数，例如0.5。如果第一部分的GC含量落在预定GC含量范围以外，则可以从经优化的核苷酸序列的列表去除经优化的核苷酸序列。
如果第一部分的GC含量落在预定GC含量范围内，则GC含量过滤器随后可以分析经优化的核苷酸序列的第二部分。在这个例子中，这可以是经优化的核苷酸序列的第二组30个核苷酸，即核苷酸31至60。可以对每个部分重复部分分析，直到发生以下中的任一情况：发现一部分的GC含量落在预定的GC含量范围以外，在这种情况下，可以从列表去除经优化的核苷酸序列；或者已经分析了整个经优化的核苷酸序列，并且没有发现这样的部分，在这种情况下，GC含量过滤器将经优化的核苷酸序列保留在列表中，并且可以移动到列表中的下一个经优化的核苷酸序列。
密码子适应指数(CAI)
所述方法进一步包括确定在经优化的核苷酸序列的最近更新的列表中每个经优化的核苷酸序列的密码子适应指数。序列的密码子适应指数是密码子使用偏倚的量度并且可以是在0与1之间的值。通过以下方式进一步更新经优化的核苷酸序列的最近更新的列表：如果任何核苷酸序列的密码子适应指数小于或等于预定的密码子适应指数阈值，则去除所述核苷酸序列。密码子适应指数阈值可以是0.7、或0.75、或0.8、或0.85、或0.9。诸位发明人已发现，密码子适应指数等于或大于0.8的经优化的核苷酸序列递送非常高的蛋白质产量。因此，在本发明的情况下，密码子适应指数阈值典型地是0.8。
对于每个经优化的核苷酸序列，可以以对本领域技术人员而言清楚的任何方式计算密码子适应指数，例如如以下文献中所述：“The codon adaptation index-a measur eof directional synonymous codon usage bias,and its potential applications”(Sharp和Li,1987.Nucleic Acids Research 15(3),第1281-1295页)；可在线获取：https://www.ncb i.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC340524/。
实现密码子适应指数计算可以包括根据或类似于以下的方法。对于序列中的每个氨基酸，序列中的每个密码子的权重可以由称为相对适应性(wi)的参数表示。相对适应性可以从参考序列集计算，计算为该氨基酸的密码子的观测频率fi与最常见的同义密码子的频率fj之间的比率。然后可以将序列的密码子适应指数计算为与序列长度(以密码子测量)中的每个密码子相关的权重的几何平均值。用于计算密码子适应指数的参考序列集可以是从中得到与本文所述的密码子优化方法一起使用的密码子使用表的相同参考序列集。
脂质纳米颗粒
本发明的组合物包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA。在本发明的上下文中，脂质纳米颗粒典型地用于将所希望的mRNA运输至靶细胞或靶组织。典型地，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、非阳离子脂质(DOPE或DSPC)和经PEG修饰的脂质(例如，DMG-PEG2K)，以及任选的基于胆固醇的脂质(例如，胆固醇、β-谷甾醇或豆甾烷醇)。例如，脂质纳米颗粒可以包含由以下组成的脂质组分：(i)阳离子脂质，(ii)非阳离子脂质，(iii)经PEG修饰的脂质，以及(iv)胆固醇或胆固醇类似物(例如，β-谷甾醇或豆甾烷醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质(例如，Guan-SS-Chol)。在一些实施方案中，不超过三种不同的脂质组分是阳离子脂质(例如，基于固醇的阳离子脂质，诸如Guan-SS-Chol)、非阳离子脂质(例如，DOPE)和经PEG修饰的脂质(例如，DMG-PEG2K)。
摩尔比
在一些实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒包含由具有以下摩尔比的以下脂质组成的脂质组分：a)30％-60％的阳离子脂质，b)25％-35％的非阳离子脂质，c)1％-15％的经PEG修饰的脂质，以及d)20％-30％的胆固醇或胆固醇类似物。
当使用的非阳离子脂质摩尔比低于经由这种施用途径递送的脂质纳米颗粒中典型地存在的摩尔比时，具有由阳离子脂质、非阳离子脂质、经PEG修饰的脂质和胆固醇或胆固醇类似物组成的脂质组分的包封mRNA的脂质纳米颗粒对于通过雾化的肺部施用可能更有效。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒包含由具有以下摩尔比的以下脂质组成的脂质组分：a)41％-70％的阳离子脂质，b)9％-18％的非阳离子脂质，c)2％-6％的经PEG修饰的脂质，以及d)9％-48％的胆固醇或胆固醇类似物。在一个具体实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的脂质的摩尔比是：a.50％-60％的阳离子脂质，b.9％-18％的非阳离子脂质，c.4％-6％的经PEG修饰的脂质，以及d.20％-35％的胆固醇或胆固醇类似物。在另一个具体实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的脂质的摩尔比是：a.50％-60％的阳离子脂质，b.9％-15％的非阳离子脂质，c.4％-6％的经PEG修饰的脂质，以及d.25％-30％的胆固醇或胆固醇类似物。
如本文所用，脂质纳米颗粒的脂质的摩尔比总和是100％。例如，对于包含脂质组分的脂质纳米颗粒，所述脂质组分由具有以下摩尔比的以下脂质组成：a)41％-70％的阳离子脂质，b)9％-18％的非阳离子脂质，c)2％-6％的经PEG修饰的脂质，以及d)9％-48％的胆固醇或胆固醇类似物，如果阳离子脂质的摩尔比是70％，非阳离子脂质的摩尔比可以是9％，并且经PEG修饰的脂质的摩尔比可以是2％，那么胆固醇或胆固醇类似物的摩尔比可以是19％(70％+9％+2％+19％＝100％)。
在一些实施方案中，当摩尔比被定义为范围(例如，2％-6％的经PEG修饰的脂质例如，经PEG修饰的脂质的摩尔比2％-6％的下限2％是2％。
阳离子脂质
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指在低于生理pH的pH(例如，约pH 5.5、约6.0或约6.5)下具有净正电荷的可电离脂质。
用于本发明的组合物和方法中的合适阳离子脂质包括如国际专利公开案WO2010/144740中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2013/149140中所述的可电离的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式中的一个的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地选自氢，任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C1-C20烷基以及任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C6-C20酰基；其中L1和L2各自独立地选自氢、任选地经取代的C1-C30烷基、任选地经取代的可变地不饱和的C1-C30烯基以及任选地经取代的C1-C30炔基；其中m和o各自独立地选自零和任何正整数(例如，其中m是三)；并且其中n是零或任何正整数(例如，其中n是一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-l-基)二十四烷-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)二十四烷-4,15,18-三烯-l-胺(“HGT5001”)，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)二十四烷-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开案WO 2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/118725中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/118724中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括具有式14,25-双十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，将所述专利各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中RL的每种实例独立地是任选地经取代的C6-C40烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2015/184256中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地是O或S；每个Y独立地是O或S；每个m独立地是0至20；每个n独立地是1至6；每个RA独立地是氢、任选地经取代的C1-50烷基、任选地经取代的C2-50烯基、任选地经取代的C2-50炔基、任选地经取代的C3-10碳环基、任选地经取代的3-14元杂环基、任选地经取代的C6-14芳基、任选地经取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个RB独立地是氢、任选地经取代的C1-50烷基、任选地经取代的C2-50烯基、任选地经取代的C2-50炔基、任选地经取代的C3-10碳环基、任选地经取代的3-14元杂环基、任选地经取代的C6-14芳基、任选地经取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“靶标23”，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/004202中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所述的阳离子脂质，将所述申请通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中每个R1和R2独立地是H或C1-C6脂肪族基团；每个m独立地是具有1至4的值的整数；每个A独立地是共价键或亚芳基；每个L1独立地是酯、硫酯、二硫化物或酸酐基团；每个L2独立地是C2-C10脂肪族基团；每个X1独立地是H或OH；并且每个R3独立地是C6-C20脂肪族基团。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和Whitehead等人,Nature Communications(2014)5:4277中所述的阳离子脂质，将所述文献通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2015/199952中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
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及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/004143中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/075531中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中L1或L2中的一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-；并且L1或L2中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；G1和G2各自独立地是未经取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；Ra是H或C1-C12烷基；R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5 C(＝O)R4；R4是C1-C12烷基；R5是H或C1-C6烷基；并且x是0、1或2。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/117528中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/049245中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括下式中的一个的化合物：
及其药学上可接受的盐。对于这四个式中的任一个，R4独立地选自-(CH2)nQ和-(CH2)nC HQR；Q选自-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n是1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，将所述专利各自通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：
及其药学上可接受的盐。
用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2012/170889中所述的可切割的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：
其中R1选自咪唑、胍鎓、氨基、亚胺、烯胺、任选地经取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，诸如二甲基氨基)和吡啶基；其中R2选自以下两个式中的一个：
并且其中R3和R4各自独立地选自任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C6-C20烷基以及任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C6-C20酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更大)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4001”，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4002”(在本文中也称为“Guan-SS-Chol”)，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4003”，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4004”，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4005”，其具有以下化合物结构：
及其药学上可接受的盐。
用于在本发明的组合物和方法中使用的其他合适的阳离子脂质包括如2018年5月16日提交的美国临时申请号62/672,194中所描述的可切割的阳离子脂质，并且将所述申请通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有美国临时申请号62/672,194中描述的通式中的任一个或结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)和(22)-(237)中的任一个的阳离子脂质。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(I')的结构的阳离子脂质，
其中：
RX独立地是-H、-L1-R1或-L5A-L5B-B’；
L1、L2和L3中的每一个独立地是共价键、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-或-C(O)NRL-；
每个L4A和L5A独立地是-C(O)-、-C(O)O-或-C(O)NRL-；
每个L4B和L5B独立地是C1-C20亚烷基；C2-C20亚烯基；或C2-C20亚炔基；
每个B和B’是NR4R5或5至10元含氮杂芳基；
每个R1、R2和R3独立地是C6-C30烷基、C6-C30烯基或C6-C30炔基；
每个R4和R5独立地是氢、C1-C10烷基；C2-C10烯基；或C2-C10炔基；并且
每个RL独立地是氢、C1-C20烷基、C2-C20烯基或C2-C20炔基。
在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括作为62/672,194的化合物(139)的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质N-[l-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，将所述专利通过引用并入本文)。适合于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括，例如5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙铵(“DOSPA”)(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989),美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)；l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“DOTAP”)。
适合于本发明的组合物和方法的另外的示例性阳离子脂质还包括：l,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；l,2-二亚麻烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-l-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-l-(顺,顺-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油酰氧基-Ν,Ν-二甲基丙胺(“DLinDAP”)；l,2-N,N'-二亚油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；l,2-二亚油酰氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊烷(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(“辛基-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(“辛基-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊烷(“DLin-K-XTC2-DMA”)；以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊烷-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见，WO 2010/042877，将其通过引用并入本文；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))。(Heyes,J.等人,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开案WO 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊烷(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯基)四氢-3aH-间二氧杂环戊烯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为TL1-04D-DMA的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为GL-TES-SA-DME-E18-2的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括具有式(IIA)的结构的阳离子脂质：
其中X是O或S；
其中R’是
其中R6是
其中m和p各自独立地是0、1、2、3、4或5；
其中R7选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)kRA或-(CH2)kCH(OR11)RA；
其中R8选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)nRB或-(CH2)nCH(OR12)RB；
其中R9选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)qRC或-(CH2)qCH(OR13)RC；
其中R10选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)rRD或-(CH2)rCH(OR14)RD；
其中k、n、q和r各自独立地是1、2、3、4或5；
或其中(i)R7和R8或(ii)R9和R10一起形成任选地经取代的5或6元杂环烷基或杂芳基，其中所述杂环烷基或杂芳基包含1至3个选自N、O和S的杂原子；
其中R11、R12、R13和R14各自独立地选自H、甲基、乙基或丙基；
其中RA、RB、RC和RD各自独立地选自任选地经取代的(C6-C20)烷基、任选地经取代的(C6-C20)烯基、任选地经取代的(C6-C20)炔基、任选地经取代的(C6-C20)酰基、任选地经取代的-OC(O)烷基、任选地经取代的-OC(O)烯基、任选地经取代的(C1-C6)单烷基氨基、任选地经取代的(C1-C6)二烷基氨基、任选地经取代的(C1-C6)烷氧基、-OH、-NH2；
其中R7、R8、R9、R10中的至少一个分别包含RA、RB、RC或RD部分，其中RA、RB、RC或RD独立地选自任选地经取代的(C6-C20)烷基、任选地经取代的(C6-C20)烯基、任选地经取代的(C6-C20)炔基、任选地经取代的(C6-C20)酰基、任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烷基或任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烯基；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括具有式(IIID)的结构的阳离子脂质：
其中X是O或S；
其中R’是
其中R6是
其中m和p各自独立地是0、1、2、3、4或5；
其中R7选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)kRA或-(CH2)kCH(OR11)RA；
其中R8选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)nRB或-(CH2)nCH(OR12)RB；
其中R9选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)qRC或-(CH2)qCH(OR13)RC；
其中R10选自H、任选地经取代的(C1-C6)烷基、任选地经取代的(C2-C6)烯基、任选地经取代的(C2-C6)炔基、任选地经取代的(C1-C6)酰基、-(CH2)rRD或-(CH2)rCH(OR14)RD；
其中k、n、q和r各自独立地是1、2、3、4或5；
或其中(i)R7和R8或(ii)R9和R10一起形成任选地经取代的5或6元杂环烷基或杂芳基，其中所述杂环烷基或杂芳基包含1至3个选自N、O和S的杂原子；
其中R11、R12、R13和R14各自独立地选自H、甲基、乙基或丙基；
其中RA、RB、RC和RD各自独立地选自任选地经取代的(C6-C20)烷基、任选地经取代的(C6-C20)烯基、任选地经取代的(C6-C20)炔基、任选地经取代的(C6-C20)酰基、任选地经取代的-OC(O)烷基、任选地经取代的-OC(O)烯基、任选地经取代的(C1-C6)单烷基氨基、任选地经取代的(C1-C6)二烷基氨基、任选地经取代的(C1-C6)烷氧基、-OH、-NH2；
其中R7、R8、R9、R10中的至少一个分别包含RA、RB、RC或RD部分，其中RA、RB、RC或RD独立地选自任选地经取代的(C6-C20)烷基、任选地经取代的(C6-C20)烯基、任选地经取代的(C6-C20)炔基、任选地经取代的(C6-C20)酰基、任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烷基或任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烯基；
或其药学上可接受的盐。
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，X是O。
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，m是1、2或3。
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，p是1、2或3。
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，R’是：
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，i)k、m和n＝1；或ii)k、m和n＝1，并且R11和R12＝H；或iii)k和n＝1，并且m＝2；或iv)k和n＝1，m＝2，并且R11和R12＝H；或v)k和n＝1，并且m＝3；或vi)k和n＝1，m＝3，并且R11和R12＝H。
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，R6是在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，R6是/>在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，R6选自：
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，R6选自：
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，R6是R’是/>m是2，并且p是2。
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，R6是R’是m是3，并且p是2。
在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB各自独立地选自任选地经取代的(C6-C20)烷基、任选地经取代的(C6-C20)烯基、任选地经取代的(C6-C20)炔基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB相同，并且选自任选地经取代的(C6-C20)烷基、任选地经取代的(C6-C20)烯基、任选地经取代的(C6-C20)炔基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB各自独立地是任选地经取代的(C6-C20)烷基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB相同，并且是任选地经取代的(C6-C20)烷基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB各自独立地是任选地经取代的(C6-C20)烯基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB相同，并且是任选地经取代的(C6-C20)烯基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB各自独立地是任选地经取代的(C6-C20)炔基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB相同，并且是任选地经取代的(C6-C20)炔基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB各自独立地是任选地经取代的(C6-C20)酰基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB相同，并且是任选地经取代的(C6-C20)酰基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB各自独立地是任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烷基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB相同，并且是任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烷基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB各自独立地是任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烯基。在式(IIA)或式(IIID)的一些实施方案中，RA和RB相同，并且是任选地经取代的-OC(O)(C6-C20)烯基。
在一些实施方案中，式(IIA)和式(IIID)中的取代基是如PCT/US21/25128中所定义的，将其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，式(IIA)和式(IIID)中的取代基的化学定义是如PCT/US21/25128的第[044]-[089]段中所定义的，将其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，式(IIA)和式(IIID)中的取代基是如US 63/176,549中所定义的，将其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，式(IIA)和式(IIID)中的取代基的化学定义是如US 63/176,549的第[0018]-[0028]段中所定义的，将其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，阳离子脂质是PCT/US21/25128(将其通过引用并入本文)中披露的阳离子脂质中的任一种，例如式(I)、(II)、(IIA)、(IIB)、(IIC)、(IID)、(IIE)、(IIF)、(IIG)、(IIH)、(IIJ)、(IIK)、(III)、(IIIA)、(IIIB)、(IIIC)、(IIID)、(IIIE)、(IIIF)、(IIIG)、(IIIH)、(IIII)、(IIIJ)、(IIIK)、(IIIL)、(IIIM)、(IV)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)和/或(X)中的任一种。
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括具有式(I)的结构的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中
B1是可电离的含氮基团；
R2、R3和R4中的每一个独立地是C6-C30烷基、C6-C30烯基或C6-C30炔基；并且L1是C1-C10亚烷基。
在式(I)的一些实施方案中，R1A是H。
在式(I)的一些实施方案中，L1是未经取代的C1-C10亚烷基。
在式(I)的一些实施方案中，L1是(CH2)2、(CH2)3、(CH2)4或(CH2)5。
在式(I)的一些实施方案中，B1独立地是NH2、胍、脒、单或二烷基胺、5至6元含氮杂环烷基或5至6元含氮杂芳基。
在式(I)的实施方案中，B1独立地是
在式(I)的实施方案中，B1独立地是
在式(I)的一些实施方案中，R2、R3和R4中的每一个独立地是未经取代的直链C6-C22烷基、未经取代的直链C6-C22烯基、未经取代的直链C6-C22炔基、未经取代的支链C6-C22烷基、未经取代的支链C6-C22烯基或未经取代的支链C6-C22炔基。
在式(I)的一些实施方案中，R2、R3和R4中的每一个是未经取代的C6-C22烷基。
在式(I)的一些实施方案中，R2、R3和R4中的每一个独立地是被-O(CO)R5或-C(O)OR5取代的C6-C12烷基，其中R5是未经取代的C6-C14烷基。
在式(I)的一些实施方案中，R2、R3和R4中的每一个是未经取代的C6-C22烯基。在式(I)的一些实施方案中，所述C6-C22烯基是单烯基、二烯基或三烯基。
在式(I)的一些实施方案中，R2、R3和R4中的每一个是
在式(I)的一些实施方案中，R2、R3和R4中的每一个是
在一些实施方案中，式(I)中的取代基是如WO 2020/257716中所定义的，将所述专利通过引用并入本文。
在一些实施方案中，式(I)中的取代基的化学定义是如WO 2020/257716的第[0105]-[0118]、[0122]和[0123]段中所定义的，将所述专利通过引用并入本文。
在一些实施方案中，阳离子脂质是WO 2020/257716(将其通过引用并入本文)中披露的阳离子脂质中的任一种，例如式(A)、(I)、(II)、(AI)、(AII)、(AIII)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(III)、(IV)、(V)和/或(VI)中的任一种。
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是SY-3-E14-DMAPr，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是TL1-01D-DMA，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是TL1-10D-DMA，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是GL-TES-SA-DMP-E18-2，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是HEP-E4-E10，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是HEP-E3-E10，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是SI-4-E14-DMAPr，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的阳离子脂质是SY-010，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，适合于本发明的脂质纳米颗粒和组合物的阳离子脂质是TL1-12D-DMA，其具有以下化合物结构：
在一些实施方案中，阳离子脂质选自咪唑胆固醇酯(ICE)、GL-TES-SA-DMP-E18-2、GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、TL1-04D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr、SY-010、HEP-E3-E10、HEP-E4-E10和Guan-SS-Chol。在特定实施方案中，阳离子脂质是TL1-01D-DMA或SY-3-E14-DMAPr。在其他特定实施方案中，阳离子脂质是SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr或SY-010。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒中的阳离子脂质是PCT/US21/25128中披露的阳离子脂质中的任一种，将所述专利通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒中的阳离子脂质是WO2020257716中披露的阳离子脂质中的任一种，将所述专利通过引用并入本文。
非阳离子/辅助脂质
如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指中性、两性离子或阴离子脂质。适用于本发明的脂质纳米颗粒中的特定非阳离子脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷酯、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1,2-二肉豆蔻反油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dimyristelaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(14:1PC)、1,2-二棕榈反油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dipalmitelaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(16:1PC)或1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒包含DOPE或DEPE作为非阳离子脂质组分。在其他实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒包含DPPC或DOPC作为非阳离子脂质组分。在又其他实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒包含DSPC作为非阳离子脂质组分。
经PEG修饰的脂质
本发明的组合物中的脂质纳米颗粒可以包含经聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。在一个实施方案中，经PEG修饰的脂质是经PEG修饰的磷脂或其他衍生脂质，诸如衍生神经酰胺(PEG-CER)，例如N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺)。
经PEG修饰的脂质典型地包含共价附接至具有一条或多条C6-C20长度的烷基链的脂质的长度长达5kDa的聚乙二醇链。特别有用的是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的经PEG修饰的可交换脂质。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质(或PEG化脂质)是PEG化胆固醇。根据本发明的脂质纳米颗粒典型地包含经PEG修饰的脂质，诸如1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2K)。可替代地，它们可以包含[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或DSPE-PEG2K-COOH。
包含此类经PEG修饰的脂质防止复合物聚集(例如，在储存和雾化期间)。一旦它们被递送到肺中，它们的存在还可以增加本发明的脂质纳米颗粒的粘液渗透能力。
在一些实施方案中，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒中的经PEG修饰的脂质的摩尔比是2％-6％(例如，3％-6％或4％-6％)。在特定实施方案中，经PEG修饰的脂质的摩尔比是3％-5％。已经发现经PEG修饰的脂质的摩尔比落在该范围内的脂质纳米颗粒在将其mRNA货物通过粘液层递送至肺的下层上皮中特别有效。因此，在一个具体实施方案中，经PEG修饰的脂质的摩尔比是约5％。在另一个具体实施方案中，经PEG修饰的脂质的摩尔比是约4％。在又进一步的具体实施方案中，经PEG修饰的脂质的摩尔比是约3％。
对于某些应用，已经发现其中经PEG修饰的脂质组分按摩尔比占总脂质的约5％的脂质纳米颗粒是特别合适的。
胆固醇和胆固醇类似物
本发明的组合物中的脂质纳米颗粒典型地包含胆固醇作为其脂质组分的四种脂质之一。在一些实施方案中，使用胆固醇类似物代替胆固醇可能是有利的。如本文所用，术语“胆固醇类似物”涵盖具有与胆固醇类似的结构但在一个或多个原子、官能团和/或亚结构上不同的化合物。在一些实施方案中，胆固醇类似物是胆固醇的功能类似物，例如，其具有与胆固醇类似的物理、化学、生物化学和/或药理学特性。胆固醇类似物的例子包括但不限于：β-谷甾醇、豆甾烷醇、菜油甾醇、岩藻甾醇、豆固醇和地塞米松。
已经发现β-谷甾醇和豆甾烷醇二者都特别适合于制备具有改善的雾化特性的脂质纳米颗粒。因此，在一个具体实施方案中，用于代替本发明的脂质纳米颗粒中的胆固醇的胆固醇类似物是β-谷甾醇。在另一个具体实施方案中，用于代替本发明的脂质纳米颗粒中的胆固醇的胆固醇类似物是豆甾烷醇。
示例性脂质纳米颗粒配制品
本发明的组合物中的脂质纳米颗粒可以包含本文所述的阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质和经PEG修饰的脂质中的任一种。
特别适合于包含在此类脂质纳米颗粒中的阳离子脂质包括GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr、SY-010、GL-TES-SA-DMP-E18-2、HEP-E4-E10、HEP-E3-E10和TL1-04D-DMA。已经发现这些阳离子脂质特别适用于通过经由雾化进行肺部递送而施用的脂质纳米颗粒。其中，TL1-01D-DMA表现得特别好。另外，SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr和SY-010也表现得特别好。
特别适合于包含在此类脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质包括DOPE、DEPE、DOPC、DSPC和DPPC。
特别适合于包含在此类脂质纳米颗粒中的经PEG修饰的脂质包括DMG-PEG2K和DSPE-PEG2K-COOH。
特别适合于包含在此类脂质纳米颗粒中的胆固醇类似物包括β-谷甾醇和豆甾烷醇。
示例性脂质纳米颗粒包含GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPR、SY-010、GL-TES-SA-DMP-E18-2、HEP-E4-E10、HEP-E3-E10和TL1-04D-DMA中的一种作为阳离子脂质组分，DOPE、DPPC或DOPC作为非阳离子脂质组分，胆固醇作为辅助脂质组分，以及DMG-PEG2K作为经PEG修饰的脂质组分。
在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SY-3-E14-DMAPr、胆固醇和DOPE。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SI-4-E14-DMAPr、胆固醇和DOPE。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SY-010、胆固醇和DOPE。在一个特定实施方案中，脂质纳米颗粒包含5％的DMG-PEG2K、40％的SY-3-E14-DMAPr、25％的胆固醇和30％的DOPE。在另一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、TL1-01D-DMA、胆固醇和DOPE。在一个特定实施方案中，脂质纳米颗粒包含3％的DMG-PEG2K、40％的TL1-01D-DMA、25％的胆固醇和32％的DOPE。
在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SY-3-E14-DMAPr、胆固醇和DPPC。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SI-4-E14-DMAPr、胆固醇和DPPC。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SY-010、胆固醇和DPPC。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SY-3-E14-DMAPr、胆固醇和DOPC。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DMG-PEG2K、SI-4-E14-DMAPr、胆固醇和DOPC。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒包含DM G-PEG2K、SY-010、胆固醇和DOPC。
在一些实施方案中，特别适合肺部递送的脂质纳米颗粒的脂质组分由HGT4002(在本文中也称为Guan-SS-Chol)、DOPE和DMG-PEG2K组成。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与经PEG修饰的脂质的摩尔比是大约60:35:5。
先前发现，当使用的非阳离子脂质摩尔比低于经由这种施用途径递送的脂质纳米颗粒中典型地存在的摩尔比时，具有由阳离子脂质、非阳离子脂质、经PEG修饰的脂质和胆固醇或胆固醇类似物组成的脂质组分的包封mRNA的脂质纳米颗粒对于通过雾化的肺部施用更有效。此类包封mRNA的脂质纳米颗粒详细描述于2021年4月19日提交的美国临时申请号63/176,549中，将其内容通过引用并入本文。因此，在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇(或胆固醇类似物)与经PEG修饰的脂质的摩尔比在约41-70:9-18:9-48:2-6之间。具有这种组成的脂质纳米颗粒是有利的，因为它能够被雾化(例如，以大于12ml/h的雾化输出速率或以大于15ml/h的雾化输出速率)。
在一些实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的阳离子脂质的摩尔比是45％-70％。在一些实施方案中，阳离子脂质的摩尔比是45％-65％。在一些实施方案中，阳离子脂质的摩尔比是50％-70％。在一些实施方案中，阳离子脂质的摩尔比是50％-65％。在特定实施方案中，阳离子脂质的摩尔比是50％-60％。在一个具体实施方案中，阳离子脂质的摩尔比是约50％。在另一个具体实施方案中，阳离子脂质的摩尔比是约55％。在又进一步的具体实施方案中，阳离子脂质的摩尔比是约60％。
在一些实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质的摩尔比是9％-15％。在特定实施方案中，非阳离子脂质的摩尔比是10％-15％。在一个具体实施方案中，非阳离子脂质的摩尔比是约15％。在另一个具体实施方案中，非阳离子脂质的摩尔比是约12.5％。在又进一步的具体实施方案中，非阳离子脂质的摩尔比是约10％。
在一些实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的经PEG修饰的脂质的摩尔比是3％-6％。在特定实施方案中，经PEG修饰的脂质的摩尔比是4％-6％。在一个具体实施方案中，经PEG修饰的脂质的摩尔比是约5％。在另一个具体实施方案中，经PEG修饰的脂质的摩尔比是约3％。
在一些实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的胆固醇或胆固醇类似物的摩尔比是10％-45％。在特定实施方案中，胆固醇或胆固醇类似物的摩尔比是10％-30％。在一个特定实施方案中，胆固醇或胆固醇类似物的摩尔比是25％-30％。在具体实施方案中，胆固醇或胆固醇类似物的摩尔比是约25％。在另一个具体实施方案中，胆固醇或胆固醇类似物的摩尔比是约30％。
在一个具体实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的脂质的摩尔比是：a.50％-60％的阳离子脂质，b.9％-18％的非阳离子脂质，c.4％-6％的经PEG修饰的脂质，以及d.20％-35％的胆固醇或胆固醇类似物。在另一个具体实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的脂质的摩尔比是：a.50％-60％的阳离子脂质，b.9％-15％的非阳离子脂质，c.4％-6％的经PEG修饰的脂质，以及d.25％-30％的胆固醇或胆固醇类似物。
在示例性实施方案中，根据本发明的脂质纳米颗粒中的脂质的摩尔比是：
1)a.约50％的阳离子脂质，b.约15％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约30％的胆固醇或胆固醇类似物。
2)a.约60％的阳离子脂质，b.约10％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约25％的胆固醇或胆固醇类似物。
3)a.约50％的阳离子脂质，b.约10％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约35％的胆固醇或胆固醇类似物。
4)a.约50％的阳离子脂质，b.约12.5％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约32.5％的胆固醇或胆固醇类似物。
5)a.约50％的阳离子脂质，b.约17.5％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约27.5％的胆固醇或胆固醇类似物。
6)a.约55％的阳离子脂质，b.约10％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约30％的胆固醇或胆固醇类似物。
7)a.约55％的阳离子脂质，b.约12.5％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约27.5％的胆固醇或胆固醇类似物。在一些实施方案中，脂质的摩尔比是：a.约55％的阳离子脂质，b.约15％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约25％的胆固醇或胆固醇类似物。
8)a.约55％的阳离子脂质，b.约17.5％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约22.5％的胆固醇或胆固醇类似物。
9)a.约60％的阳离子脂质，b.约12.5％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约22.5％的胆固醇或胆固醇类似物。
10)a.约60％的阳离子脂质，b.约15％的非阳离子脂质，c.约5％的经PEG修饰的脂质，以及d.约20％的胆固醇或胆固醇类似物。
产生脂质纳米颗粒的方法
可以使用多种方法来制备包封mRNA的脂质纳米颗粒。典型地，制备这种悬浮液的第一步是提供脂质溶液。脂质溶液含有形成脂质纳米颗粒的脂质的混合物。可以将脂质溶液与mRNA溶液混合，而不首先将脂质预先形成为脂质纳米颗粒，以包封mRNA(如在2015年7月2日提交的标题为“信使RNA的包封(Encapsulation of messenger RNA)”的美国专利申请序列号14/790,562及其2014年7月2日提交的临时美国专利申请序列号62/020,163中以及在国际专利申请WO 2016/004318中和在US2016/0038432中所述，将所述专利都通过引用以其整体特此并入)。可替代地，使用脂质溶液来制备脂质纳米颗粒。然后可以将预先形成的脂质纳米颗粒与mRNA溶液混合以将mRNA包封在预先形成的脂质纳米颗粒中，例如，如国际专利申请WO 2018/089801和US2018/0153822中所述，这两个专利都通过引用以其整体特此并入。这些示例性方法导致mRNA在脂质纳米颗粒中的有效包封。典型地，可以优化所述方法以实现至少约90％(例如，至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)的包封效率。
如本文所用，术语“包封”或语法等效语是指将mRNA分子限制在脂质纳米颗粒内的过程。如本文所用，这典型地意指所有或基本上所有的mRNA被包封在脂质纳米颗粒中。
诸位发明人已经发现，本发明的组合物中的脂质纳米颗粒的包封效率保持相对不受雾化的影响，例如当本发明的组合物中的脂质纳米颗粒通过振动网雾化器气雾化时。因此，在一些实施方案中，在雾化之前和之后，脂质纳米颗粒具有至少约90％的包封效率。在一些实施方案中，在雾化之前和之后，脂质纳米颗粒具有至少约95％的包封效率。在一些实施方案中，在雾化之前和之后，脂质纳米颗粒具有至少约96％的包封效率。在一些实施方案中，在雾化之前和之后，脂质纳米颗粒具有至少约97％的包封效率。在一些实施方案中，在雾化之前和之后，脂质纳米颗粒具有至少约98％的包封效率。在一些实施方案中，在雾化之前和之后，脂质纳米颗粒具有至少约99％的包封效率。
技术人员将理解，在本发明的组合物中雾化脂质纳米颗粒后，包封效率的小的损失是可接受的，只要本发明的组合物中的大多数脂质纳米颗粒(例如，至少80％的脂质纳米颗粒)在其雾化后有效地包封mRNA即可。因此，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的包封效率在雾化后变化小于约20％。在特定实施方案中，脂质纳米颗粒的包封效率在雾化后变化小于约15％。在一个具体实施方案中，脂质纳米颗粒的包封效率在雾化后变化小于约10％。例如，在一些实施方案中，雾化之后脂质纳米颗粒的包封效率比雾化之前脂质纳米颗粒的包封效率低不超过约20％。在特定实施方案中，雾化之后脂质纳米颗粒的包封效率比雾化之前脂质纳米颗粒的包封效率低不超过约15％。在具体实施方案中，雾化之后脂质纳米颗粒的包封效率比雾化之前脂质纳米颗粒的包封效率低不超过约10％。特别希望的是，雾化之后脂质纳米颗粒的包封效率与雾化之前脂质纳米颗粒的包封效率大致相同。
脂质纳米颗粒尺寸
用于制备上文提及的本发明的组合物中的脂质纳米颗粒的方法产生具有明确定义的粒度的组合物。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的尺寸小于约150nm(例如，雾化前)。在具体实施方案中，脂质纳米颗粒的尺寸小于约100nm(例如，雾化前)。在特定实施方案中，脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)是50-150nm，例如50-125nm、50-100nm或60-80nm。在具体实施方案中，脂质纳米颗粒雾化前的尺寸是50-100nm。诸位发明人已经发现，在该尺寸范围内的脂质纳米颗粒可以维持的雾化后尺寸是50-150nm，例如，50-125nm(参见WO 2012/170889)。在这些尺寸范围内的脂质纳米颗粒已经成功地用于经由雾化将mRNA递送至受试者的肺。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)小于约200nm。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)小于约150nm。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)小于约120nm。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)小于约110nm。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)小于约100nm。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)小于约80nm。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的尺寸(例如，雾化前)小于约60nm。
脂质纳米颗粒的尺寸可以通过如在Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-150(1981)中所述的准电光散射(QELS)来确定，将所述文献通过引用并入本文。例如，可以使用Malvern Zetasizer来测量脂质纳米颗粒的粒度。
冻干
在一些实施方案中，本发明的组合物以冻干形式提供，并且在雾化之前在水溶液中重构。申请人通过引用将其在06/08/2012提交的较早专利申请WO 2012/170889特此完全并入。冻干组合物适合于长期储存。可以它们用纯化水重构，用于向有需要的受试者施用。在某些实施方案中，在用适当的再水化介质(例如，纯化水、去离子水、5％右旋糖(w/v)、10％海藻糖(w/v)或生理盐水)重构后，重构的组合物展示出与冻干前所观察的药理或生物活性可比较的药理或生物活性。例如，在某些实施方案中，包封的mRNA的药理和生物活性等同于冻干组合物前观察到的药理和生物活性；或可替代地展示出药理和生物活性的可忽略的降低(例如，包封的多核苷酸的生物或药理活性降低小于约1％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)。
在某些实施方案中，冻干脂质纳米颗粒表征为稳定的(例如，与等同的未冻干脂质纳米颗粒一样稳定)。在冻干和/或重构之后，脂质纳米颗粒的冻干不会明显变化或改变脂质纳米颗粒的粒度。例如，本文公开了包含冻干脂质纳米颗粒的组合物，其中在重构(例如，用纯化水)后，脂质纳米颗粒不絮凝或聚集，或可替代地展示出有限的或可忽略的絮凝或聚集(例如，如通过重构的脂质纳米颗粒的粒度确定的)。
因此，在某些实施方案中，在冻干脂质纳米颗粒重构后，脂质纳米颗粒的Dv50小于约100nm(例如，小于约90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm或更小)。在一个具体实施方案中，在冻干脂质纳米颗粒重构后，脂质纳米颗粒的Dv50在90nm与50nm之间。类似地，在某些实施方案中，在冻干脂质纳米颗粒重构后，脂质纳米颗粒的Dv90小于约400nm(例如，小于约300nm、200nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或更小)。在一个具体实施方案中，在冻干脂质纳米颗粒重构后，脂质纳米颗粒的Dv90在300nm与100nm之间。
在其他实施方案中，包含冻干脂质纳米颗粒的组合物表征为多分散指数小于约1(例如，小于0.95、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.1、0.05或更小)。在一些实施方案中，包含冻干脂质纳米颗粒的组合物展示出絮凝或以其他方式聚集的趋势降低(例如，在冻干期间或在重构后)。例如，在重构后，脂质纳米颗粒(例如，雾化前)的平均粒度(Zave)可能小于200nm(例如，在PBS溶液中小于约175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或更小)。典型地，用于本发明的脂质纳米颗粒的平均粒度(Zave)在60nm与100nm之间。在具体实施方案中，用于本发明的脂质纳米颗粒的平均粒度(Zave)在50nm与100nm之间。
在一些实施方案中，冻干的冻干脂质纳米颗粒进一步包含一种或多种冻干保护剂(例如，糖和/或碳水化合物)或可替代地使用一种或多种冻干保护剂(例如，糖和/或碳水化合物)制备。在某些实施方案中，在脂质纳米颗粒中包含一种或多种冻干保护剂可以改善或以其他方式增强冻干脂质纳米颗粒的稳定性(例如，在正常储存条件下)和/或促进使用再水化介质重构冻干脂质纳米颗粒，从而制备水性配制品。例如，在某些实施方案中，制备脂质纳米颗粒，并且在冻干之前，可以用冻干保护剂(诸如蔗糖溶液)或悬浮液(例如，包含在约1％-50％(w/v)或10％-25％(w/v)之间的蔗糖的水溶液)替代(例如，经由离心)存在于脂质体配制品中的缓冲液。在一些实施方案中，冻干保护剂是海藻糖。在一些实施方案中，冻干保护剂包含10％-50％(w/v)或10％-25％(w/v)或10％-20％(w/v)或10％-15％(w/v)的海藻糖。可用于制备本文所述冻干组合物的其他冻干保护剂包括例如右旋糖酐(例如，1.5kDa、5kDa和/或40kDa)和菊粉(例如，1.8kDa和/或4kDa)。冻干脂质纳米颗粒的包封效率大于约80％。
在4℃下，包含冻干脂质纳米颗粒的组合物稳定至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年。在一些实施方案中，冻干脂质纳米颗粒可以储存在冷藏下并且在延长的时间段内保持稳定(例如，如通过其预期药物或生物活性的最小损失或无损失所证明的)(例如，在约4℃下储存后，稳定至少约1、2、3、4、5、6、9、12、18、24、36个月或更长时间)。在其他实施方案中，冻干脂质纳米颗粒可以在没有冷藏的情况下储存，并且在延长的时间段内保持稳定(例如，在约25℃下储存后，稳定至少约1、2、3、4、5、6、9、12、18、24、36个月或更长时间)。
呈冻干形式的组合物可以在冷冻条件下储存1、2、3、4、5或10年而不损失药理或生物活性。
肺部递送
本发明的组合物典型地通过肺部递送来施用。因此，本发明还提供了用于通过经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物来体内递送mRNA的方法。在一些实施方案中，经由鼻内施用或吸入进行肺部递送。鼻内施用可以通过使用产生鼻喷雾的装置来实现。鼻喷雾装置是本领域熟知的。
雾化
在典型的实施方案中，在吸入之前将本发明的组合物雾化。雾化产生可以吸入的气雾化组合物。吸入后，脂质纳米颗粒分布在整个鼻、气道和肺中并且被这些组织的上皮细胞吸收。因此，包封在脂质纳米颗粒中的mRNA被递送到细胞中，并且在例如鼻腔、气管、支气管、细支气管和/或其他肺部系统相关的细胞或组织中表达。肺部递送和雾化的另外的传授内容描述于例如WO 2018/089790和WO 2018/213476中，将所述专利各自通过引用以其整体而并入。
粒度小于8μm(例如，1-5μm)的吸入气雾剂液滴可以穿透到下气道的狭窄分支中。具有较大直径的气雾剂液滴典型地被口腔和上气道内壁的上皮细胞吸收，并且不太可能到达下气道上皮和深肺泡肺组织。因此，特别是在肺部递送至肺上皮的情况下，包括以气雾剂形式施用包封在本发明的脂质纳米颗粒中的mRNA的方法可以包括以下步骤：产生粒度小于8μm(例如，1-5μm)的液滴，典型地通过将本发明的组合物雾化(例如，通过使用适合与本发明的组合物一起使用的雾化器)。
在具体实施方案中，将本发明的组合物雾化以产生供受试者吸入的雾化颗粒。在特定实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以大于约12ml/h的雾化输出速率雾化。在特定实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以大于约15ml/h的雾化输出速率雾化。在其他特定实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以大于约30ml/h的雾化输出速率雾化。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以12-50ml/h的雾化输出速率雾化。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以12-40ml/h的雾化输出速率雾化。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以15-50ml/h的雾化输出速率雾化。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以15-40ml/h的雾化输出速率雾化。在典型的实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒能够以在12ml/h与约30ml/h(例如，15ml/h与约30ml/h)之间的雾化输出速率雾化。例如，本发明的脂质纳米颗粒能够以约12ml/h或约15ml/h的雾化输出速率雾化。在特定实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒可以以约30ml/h的雾化输出速率雾化。
典型地，在本发明的上下文中，能够以较高雾化输出速率雾化的脂质纳米颗粒在雾化之后保持有效包封mRNA的能力，使得在它们被雾化之后，本发明的组合物中的大多数脂质纳米颗粒(例如，至少80％，例如至少85％、特别是至少90％的脂质纳米颗粒)包封mRNA。因此，在一些实施方案中，在雾化后，本发明的脂质纳米颗粒的包封效率变化小于约20％。在特定实施方案中，在雾化后，本发明的脂质纳米颗粒的包封效率变化小于约15％。在具体实施方案中，在雾化后，本发明的脂质纳米颗粒的包封效率变化小于约10％。例如，在一些实施方案中，雾化之后本发明的脂质纳米颗粒的包封效率比雾化之前脂质纳米颗粒的包封效率低不超过约20％。在特定实施方案中，雾化之后本发明的脂质纳米颗粒的包封效率比雾化之前脂质纳米颗粒的包封效率低不超过约15％。在具体实施方案中，雾化之后本发明的脂质纳米颗粒的包封效率比雾化之前脂质纳米颗粒的包封效率低不超过约10％。
供受试者吸入的雾化颗粒的平均尺寸典型地小于8μm。在一些实施方案中，供受试者吸入的雾化颗粒的平均尺寸在大约1-8μm之间。在特定实施方案中，供受试者吸入的雾化颗粒的平均尺寸在大约1-5μm之间。在具体的实施方案中，本发明的雾化组合物的平均粒度在约4μm与6μm之间(例如，约4μm、约4.5μm、约5μm、约5.5μm或约6μm)。
气雾剂中的粒度通常参考质量中位空气动力学直径(MMAD)来描述。基于颗粒的重量和尺寸，MMAD连同几何标准差(GSD)一起在统计学上描述了任何气雾剂的粒度分布。计算气雾剂的MMAD的手段是本领域熟知的。
例如，使用本发明的组合物的雾化器的MMAD输出可以使用下一代冲击器(NextGeneration Impactor)来确定。描述气雾剂中粒度的另一个参数是体积中值直径(VMD)。VMD还描述了基于颗粒体积的气雾剂的粒度分布。计算气雾剂的VMD的手段是本领域熟知的。用于确定VMD的具体方法是激光衍射，其在本文中用于测量本发明组合物的VMD(参见例如，Clark,1995,Int J Pharm.115:69-78)。
因此，在一些实施方案中，进行根据本发明的雾化以产生细颗粒分数(FPF)，将其定义为气雾剂中MMAD或VMD小于指定值的颗粒的比例。在一个具体实施方案中，粒度<5μm的本发明的雾化组合物的FPF是至少约30％、更典型地至少约40％，例如至少约50％、更典型地至少约60％。在另一个具体实施方案中，以这种方式进行雾化，使得平均可呼吸发射剂量(即，粒度<5μm的FPF的百分比；例如，如通过下一代冲击器以15L/min提取所确定)是发射剂量的至少约30％，例如，发射剂量的至少约31％、至少约32％、至少约33％、至少约34％或至少约35％。在又另一个具体实施方案中，以这种方式进行雾化，使得平均可呼吸递送剂量(即，粒度<5μm的FPF的百分比；例如，如通过下一代冲击器以15L/min提取所确定)是发射剂量的至少约15％，例如发射剂量的至少16％或16.5％。
在一些实施方案中，用雾化器进行雾化。一种类型的雾化器是喷射雾化器，所述喷射雾化器包括连接至压缩器的管道，所述压缩器导致压缩空气或氧气以高速流过液体药物以将其转变为气雾剂，然后被受试者吸入。另一种类型的雾化器是超声波雾化器，所述超声波雾化器包括产生高频超声波的电子振荡器，所述高频超声波导致与液体储存器接触的压电元件的机械振动。液体的高频振动足以产生蒸气雾。示例性超声波雾化器是Omron NE-U17和Beurer雾化器IH30。第三种类型的雾化器包括振动网技术(VMT)。VMT雾化器典型地包括具有1000-7000个孔的网/膜，其在液体储存器的顶部振动并且从而通过网/膜中的孔压出非常细的气雾剂液滴。示例性VMT雾化器包括：eFlow(PARI Medical Ltd.)、i-Neb(Respironics Respiratory Drug Delivery Ltd)、Nebulizer IH50(Beurer Ltd.)、AeroNeb Go(Aerogen Ltd.)、InnoSpire Go(Respironics Respiratory Drug DeliveryLtd)、Mesh Nebulizer(Shenzhen Homed Medical Device Co,Ltd.)、Portable Nebulizer(Microbase Technology Corporation)和Airworks(Convexity Scientific LLC)。在一些实施方案中，通过压电元件使VMT雾化器的网或膜振动。在一些实施方案中，通过超声使VMT雾化器的网或膜振动。
已经发现VMT雾化器特别适合于实践本发明，因为它们不影响包封在本发明的组合物的脂质纳米颗粒内的mRNA的mRNA完整性。典型地，在雾化之后，本发明的组合物中至少约60％(例如，至少约65％或至少约70％)的mRNA维持其完整性。
在一些实施方案中，在吸入和呼出期间，雾化是连续的。更典型地，雾化是呼吸致动的。用于本发明的合适雾化器的雾化速率大于0.2mL/min。在一些实施方案中，雾化速率>0.25mL/min。在其他实施方案中，雾化速率大于0.3mL/min。在某些实施方案中，雾化速率大于0.45mL/min。在典型的实施方案中，雾化速率范围在0.2mL/min与0.5mL/min之间。在一些实施方案中，雾化速率是至少0.8mL/min、至少0.16mL/min或至少0.25mL/min。
组合物的治疗性用途
本发明提供了体内递送mRNA的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，肺部递送可以通过鼻内施用或吸入进行。在某些实施方案中，在吸入之前将组合物雾化。
本发明的组合物中的包封的mRNA编码蛋白质。在一些实施方案中，所述mRNA被递送至肺。在特定实施方案中，由mRNA编码的蛋白质在肺中表达。例如，蛋白质可以是分泌性蛋白，诸如抗体。在一些实施方案中，蛋白质可以是膜蛋白(诸如病毒表面抗原)、细胞表面受体或膜通道(例如，囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR))。由mRNA表达的蛋白质典型地具有治疗活性。例如，表达的蛋白质可以用于治疗或预防疾病或障碍。因此，本发明的脂质纳米颗粒和组合物用于治疗或预防疾病或障碍。典型地，此类用途包括脂质纳米颗粒或组合物的肺部施用(例如，经由雾化)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒和组合物用于制造用于治疗或预防疾病或障碍的药剂。在典型的实施方案中，此类制造包括在组合物中配制脂质纳米颗粒，其适合于肺部施用(例如，经由雾化)。本发明还提供了治疗或预防受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，所述肺部递送是经由雾化进行的。
本发明的方法可以用于治疗受试者中的多种疾病和障碍。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防受试者的疾病或障碍的方法，其中所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。
在特定实施方案中，所述疾病或障碍是肺部疾病或障碍，例如慢性呼吸系统疾病；蛋白缺乏症，例如影响肺的蛋白缺乏症；赘生性疾病，例如肿瘤；和感染性疾病。在特定实施方案中，所述疾病或障碍是蛋白缺乏症。在一些实施方案中，受试者是健康的，在这种情况下，治疗用于预防疾病或障碍(例如，通过用mRNA编码的抗原免疫以预防感染性疾病)。在其他实施方案中，受试者患有疾病或障碍，在这种情况下，治疗的目的可以是减轻或改善疾病或障碍的一种或多种症状和/或解决疾病的根本原因，例如通过递送编码其的mRNA提供搜所缺乏的蛋白质，或通过提供靶向患病组织的药剂(诸如干扰肿瘤生长的抗体)。在一些实施方案中，本发明提供了治疗方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。
mRNA在肺中的表达可以部分或完全恢复受试者中蛋白质的水平。例如，本发明的方法导致受试者具有与健康受试者可比较的蛋白质水平。在某些实施方案中，本发明的方法导致20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的蛋白质产生。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者的囊性纤维化的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，所述mRNA编码CFTR。在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者的原发性纤毛运动不良症的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，所述mRNA编码DNAI1。在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者的表面活性剂缺乏的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，mRNA编码表面活性剂蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者的慢性呼吸系统疾病的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。可以用本发明的方法治疗的慢性呼吸系统疾病的例子包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺动脉高压或特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述mRNA编码用于治疗肺部疾病或障碍的症状的蛋白质。在某些实施方案中，所述mRNA编码针对促炎性细胞因子的抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防受试者的赘生性疾病(例如，肿瘤)的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，所述肿瘤是肺肿瘤或肺癌(例如，非小细胞肺癌或小细胞肺癌)。在某些实施方案中，所述mRNA编码靶向构成肿瘤的细胞的表面上表达的蛋白质的抗体。在其他实施方案中，所述mRNA编码源自肿瘤的抗原(例如，肿瘤新抗原)。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用本发明的组合物。在一些实施方案中，所述感染性疾病是由病毒引起的。在一些实施方案中，所述感染性疾病是肺部感染性疾病或障碍。在一些实施方案中，所述mRNA编码结合病毒的表面蛋白的可溶性诱饵受体。在一些实施方案中，所述mRNA编码针对病毒的表面蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述感染性疾病是由细菌引起的。在特定实施方案中，所述mRNA编码针对细菌的表面蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述mRNA编码源自感染性疾病的病原体的抗原(例如，源自导致感染性疾病的病毒或细菌的表面蛋白)。例如，包封编码抗原的mRNA的本发明的脂质纳米颗粒或包含所述脂质纳米颗粒的组合物可以用于免疫受试者，以预防受试者的感染性疾病。
实施例
虽然已经根据某些实施方案具体描述了本发明的某些组合物和方法，但以下实施例仅用于说明它们并且不旨在限制它们。
实施例1.mRNA脂质纳米颗粒的配制
由质粒DNA模板通过体外转录合成编码萤火虫萤光素酶(FFL)、mCherry、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)或蛋白轴丝中链1(DNAI1)蛋白的mRNA，随后添加5'帽结构(帽1)和3’多(A)尾。编码蛋白质的mRNA还包含5’和3’非翻译区(UTR)。最终mRNA构建体具有长度为大约400至700个核苷酸的3'多(A)尾，如通过凝胶电泳所确定。
为了制备用于包封mRNA的脂质纳米颗粒，将四种脂质组分溶解在乙醇中，以提供基于乙醇的脂质溶液。第一组分是可电离的阳离子脂质(SY-3-E14-DMAPr或TL1-01D-DMA)。该组分在低pH下带正电荷，这有利于高效包封带负电荷的mRNA。它还可能在细胞表面相互作用中起关键作用，以允许细胞摄取。第二组分是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。DOPE是一种据报道具有促融合特性的两性离子脂质。第三组分是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)，一种PEG化/经PEG修饰的脂质。该PEG化脂质的添加提供了对所得脂质纳米颗粒的粒度和稳定性的控制，并且可以为肺摄取提供增强的粘液渗透特性。第四组分是胆固醇。将在柠檬酸盐缓冲液中包含编码FFL、mCherry、CFTR或DNAI1的mRNA的基于水的溶液与基于乙醇的脂质溶液组合,以形成包封mRNA的脂质纳米颗粒。
实施例2.脂质纳米颗粒的雾化
为了鉴定可以高效雾化同时保留对包封的mRNA的体内递送和表达而言重要的特征的mRNA-脂质纳米颗粒配制品，在超过300种不同条件下测试各种赋形剂的组合。测试的赋形剂包括10种不同的缓冲液、5种不同的盐、两种不同的糖、多种粘度调节剂和10种不同的表面活性剂/增溶剂。测试条件包括不同的缓冲液强度和pH范围；不同的盐浓度；不同的糖浓度；和不同的表面活性剂浓度。使用振动网雾化器(Aerogen Solo)雾化测试配制品。分析以下参数以确定配制品是否可用于雾化mRNA-脂质纳米颗粒组合物：
·质量中值空气动力学直径(MMAD)，其指示平均气雾剂粒度。1-5μm的MMAD是希望的。
·多分散性指数(PDI)。小于0.25的PDI是希望的。
·雾化输出速率。12-15ml/h的速率是希望的。
·雾化剂量。更高剂量的mRNA是希望的。
·脂质纳米颗粒雾化后的尺寸。小于150nm的粒度是希望的。
·雾化后包封效率(EE％)的损失。不大于20％的损失是希望的。
测试的表面活性剂/增溶剂包括多种PEG，诸如0.1％-5％w/v PEG 400。发现它们的存在对上述雾化参数没有明显影响。出人意料地。TPGS(一种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂)被鉴定为适合于在雾化之前和之后维持脂质纳米颗粒尺寸(参见实施例3)。在某些条件下，将这种表面活性剂与糖、缓冲液和/或盐组合可以进一步改善雾化(参见实施例5-8)。
实施例3.包含TPGS的mRNA-脂质纳米颗粒组合物的改善的雾化
引言
本实施例说明在包含包封在脂质纳米颗粒中的mRNA的组合物中，TPGS作为赋形剂的存在增加了雾化输出速率。
材料和方法
如实施例1中所述，将mRNA包封在脂质纳米颗粒中。脂质纳米颗粒组合物和雾化的组合物总结在表1中。如实施例2中所述，将组合物雾化。
表1-脂质纳米颗粒和雾化组合物的组分。
结果
如图2A和图2B所示，包含SY-3-E14-DMAPr或TL1-01D-DMA的脂质纳米颗粒的雾化前尺寸是大约60nm，mRNA包封效率超过95％。
表2展示了与相应的对照组合物相比，在测试组合物中0.2％(w/v)TPGS的存在导致雾化输出速率改善80％-140％。这种影响与脂质纳米颗粒的组成无关。
与对照相比，在组合物中0.2％(w/v)TPGS的存在导致雾化前与雾化后之间脂质纳米颗粒尺寸的差异较小。向组合物中添加0.2％(w/v)TPGS还导致mRNA剂量的提高，这在mRNA疗法中是希望的。
表2-脂质纳米颗粒的雾化速率和雾化后特征。
总之，这些数据证明，包含一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂(诸如TPGS)的组合物可以增加雾化输出速率。这种影响与脂质纳米颗粒的组成无关。
实施例4.优化TPGS浓度
引言
本实施例说明增加TPGS浓度以改善雾化输出速率可以帮助维持雾化之后脂质纳米颗粒的雾化前特征。
材料和方法
如实施例1中所述，将mRNA包封在脂质纳米颗粒中。脂质组合物是5％的DMG-PEG2K、40％的SY-3-E14-DMAPr、25％的胆固醇和30％的DOPE。如表3所示制备组合物。
结果
雾化前脂质纳米颗粒的尺寸是67nm、PDI是0.194，并且EE％是93。表3中总结了脂质纳米颗粒的雾化后特征。这些数据证明，随着组合物中TPGS浓度的增加，雾化前与雾化后之间脂质纳米颗粒尺寸的差异降低。
雾化组合物 尺寸(mm)
6％海藻糖(对照) 164.3
6％的海藻糖、1％的TPGS(w/v) 77.81
6％的海藻糖、0.5％的TPGS(w/v) 93.72
6％的海藻糖、0.1％的TPGS(w/v) 126.5
表3-不同百分比的TPGS对雾化后特征的影响
测试含有6％的海藻糖和0.2％的TPGS(w/v)的另外的组合物。图3A展示了与对照(无TPGS)相比，测试的所有四种TPGS浓度在雾化前与雾化后之间的脂质纳米颗粒的尺寸差异较小。图3B示出了与对照相比，包含0.1％-1％的TPGS(w/v)的组合物能够增加雾化流速并且降低雾化后包封效率的差异。包含0.2％的TPGS(w/v)的组合物产生最高的雾化流速。在雾化之后，所有测试的TPGS浓度的包封效率(EE％)变化大约20％，这是希望的。
预期对于实现高雾化速率的组合物，它们将需要具有较低的粘度和降低的表面张力，例如与包含盐水的组合物相比。这些特性被认为是为了更容易地使组合物气雾化所需要的。在组合物中TPGS的存在不改变粘度，并且仅导致表面张力的小的下降(例如，从65mN/m至58mN/m)，但是其存在仍然能够改善雾化速率。因此，出人意料的是，包含一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂(诸如TPGS)的组合物能够增加雾化输出速率。
总之，这些数据证明，在约0.2％至约1％w/v的浓度范围内，包含一种或多种由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成的表面活性剂(诸如TPGS)的组合物可以增加雾化输出速率，同时维持脂质纳米颗粒的重要的雾化前特征，特别是包封效率和尺寸。
实施例5.优化糖和TPGS浓度
引言
本实施例说明改变包含TPGS的组合物中的糖浓度对雾化速率和这些组合物中的脂质纳米颗粒的雾化后特征的影响。
材料和方法
如实施例1中所述，将mRNA包封在脂质纳米颗粒中。脂质组合物是5％的DMG-PEG2K、40％的SY-3-E14-DMAPr、25％的胆固醇和30％的DOPE。如表4所示制备待雾化的组合物。
表4-测试的雾化组合物
结果
当组合物含有较高浓度的海藻糖(8％-10％w/v)时，需要较高浓度的TPGS以维持高雾化流速(图4A)并且使雾化后包封效率的下降最小化(图4B)。基于这些数据，测试组合物中特别合适的组合物是B6，其包含8％(w/v)海藻糖和0.5％(w/v)TPGS。如下表5所示，B6具有希望的特征，包括高雾化速率、1-5μm之间的MMAD、小于20％的包封效率(EE％)的雾化后变化、小于150nm的脂质纳米颗粒尺寸和mRNA完整性的低变化。
雾化速率(ml/h) 13
MMAD 4.1
EE％的变化 18％
尺寸(nm) 102
PDI 0.34
mRNA完整性的变化 <5％
表5-雾化后特征
总之，如果组合物中的糖浓度增加，则这改变了表面活性剂改善雾化速率的能力，所述表面活性剂由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成。如果在组合物中使用较高浓度的糖，则需要较高浓度的表面活性剂以保持积极的雾化效果。实施例6.在低糖浓度的情况下改善的雾化
引言
本实施例说明降低糖浓度可以改善mRNA-脂质纳米颗粒组合物的雾化输出速率。
材料和方法
如实施例1中所述，将mRNA包封在脂质纳米颗粒中。表6中描述了脂质纳米颗粒的组分。表6还总结了用Aerogen Solo-振动网雾化器进行雾化的测试组合物中的组分。
表6-糖浓度对雾化后特征的影响
结果
表6中的数据证明，组合物中较低的糖浓度(例如，4％-6％)可以增加雾化速率。这种增加雾化速率的能力与组合物中的脂质纳米颗粒无关。
实施例7.盐和缓冲液对雾化速率的影响。
引言
本实施例说明盐的存在可以改善mRNA-脂质纳米颗粒组合物的雾化输出速率。
材料和方法a
如实施例1中所述，将mRNA包封在脂质纳米颗粒中。表7中描述了脂质纳米颗粒的组分，其还总结了组合物中的组分。
表7-脂质纳米颗粒和测试组合物
结果
表8中的数据证明，与不加盐的对照组合物(A1)相比，包含盐的组合物(A2和A3)具有更高的雾化速率。此外，较高浓度的盐导致较高的雾化速率。例如，与仅含有75mM盐的组合物A2相比，分别含有150mM氯化钠的组合物A3具有更高的雾化速率。
如表8所展示，组合物中缓冲液的存在不改变较高盐浓度增加雾化速率的能力。
表8-盐浓度对雾化的影响
这些数据证明，mRNA-脂质纳米颗粒组合物含有盐并且特别是含有较高浓度的盐(例如，约100nM-200nM)是有利的，因为这导致改善的雾化速率。
实施例8.pH和盐浓度对雾化输出速率的影响。
引言
本实施例说明pH对mRNA-脂质纳米颗粒组合物的雾化输出速率的影响。
材料和方法
如实施例1中所述，将mRNA包封在脂质纳米颗粒中。表9中描述了脂质纳米颗粒的组分，其还总结了组合物中的组分。
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表9-测试组合物
结果
组合物C2含有pH 5.5的磷酸盐缓冲液，而组合物C3含有pH 7的磷酸盐缓冲液。尽管这两种组合物具有类似的雾化输出速率，但是组合物C2具有比组合物C3高得多的雾化后包封效率(表10)。低pH与高盐浓度的进一步组合导致更高的雾化速率和更高的雾化后包封效率(组合物C4)。
组 雾化速率(ml/h) EE％ ％TA雾化
C1 12 -
C2 10.7 75％ 95.9
C3 12.2 47％ 98
C4 17.9 88％ 96
C5 15.1 43％ 96
表10-盐浓度对雾化的影响
这些数据证明，具有低pH(例如，约pH 5.5)的mRNA-脂质纳米颗粒组合物可以具有改善的雾化速率，特别是当与高盐浓度(100mM-200mM)组合时。
等效方案
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。本发明的范围并不旨在受限于上文说明书，而是如以下权利要求中所阐述。

Claims (91)

1.一种组合物，所述组合物包含
(a)包封在脂质纳米颗粒中的mRNA，和
(b)一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂由经由接头部分共价连接至PEG部分的抗氧化剂部分组成
其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.1％重量/体积(w/v)的浓度存在。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PEG部分是未经修饰的PEG、甲氧基-PEG(mPEG)或羧酸官能化的PEG(COOH-PEG)。
3.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述PEG部分的平均分子量在1kDa与5kDa之间，例如1KDa、2KDa、3KDa、3.4KDa或5KDa。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述PEG部分的平均分子量是0.5kDa、1kDa、1.5kDa、2kDa、2.5kDa或3kDa。
5.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述接头部分是琥珀酸酯、草酸酯、己二酸酯、丙二酸酯、富马酸酯、苹果酸酯、戊二酸酯或马来酸酯，任选地其中所述接头部分是琥珀酸酯。
6.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述抗氧化剂部分是亲脂性维生素。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述亲脂性维生素选自维生素A、D、E或K。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述亲脂性维生素选自维生素E或D。
9.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述表面活性剂选自：
(i)D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)，
(ii)mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素E，
(iii)COOH-PEG-3.4k-琥珀酸酯-维生素E，
(iv)mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素D，
(v)mPEG-2K-琥珀酸酯-维生素D，或
(vi)COOH-PEG-3.4k-琥珀酸酯-维生素D。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述表面活性剂是TPGS。
11.根据权利要求1-10所述的组合物，其中所述一种或多种表面活性剂以至少0.2％、至少0.5％或至少1％w/v的浓度存在。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述一种或多种表面活性剂以0.1％-5％w/v的浓度存在。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述一种或多种表面活性剂以0.1％-2％w/v的浓度存在。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述一种或多种表面活性剂以0.2％-1％w/v的浓度存在。
15.根据权利要求1-10所述的组合物，其中所述一种或多种表面活性剂以约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.75％、约1％或约1.5％w/v的浓度存在。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述一种或多种表面活性剂以约0.2％或约1％w/v的浓度存在。
17.根据权利要求1-16所述的组合物，其中所述组合物进一步包含缓冲液。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、PIPES缓冲液、HePES缓冲液、马来酸盐和琥珀酸盐缓冲液。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。
20.根据权利要求1-19所述的组合物，其中所述组合物进一步包含盐。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述盐的浓度是50mM-200mM。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的组合物，其中所述盐的浓度是至少10mM。
23.根据权利要求20-22所述的组合物，其中所述盐是氯化钠。
24.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物进一步包含赋形剂。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述赋形剂是糖。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述糖是二糖。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述二糖是蔗糖或海藻糖。
28.根据权利要求24-27所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度是至少1％、至少2％、至少5％或至少10％w/v。
29.根据权利要求24-27所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度是1％-20％w/v。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度是2％-10％w/v。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度是2％-6％w/v。
32.根据权利要求24-31所述的组合物，其中所述赋形剂的浓度是约2％、约4％、约6％、约8％或约10％w/v。
33.根据权利要求24-27所述的组合物，其中所述赋形剂是浓度为2％-10％w/v的海藻糖。
34.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种经PEG修饰的脂质。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述阳离子脂质选自咪唑胆固醇酯(ICE)、GL-TES-SA-DMP-E18-2、GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、TL1-04D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr、SY-010、TL1-10D-DMA、HEP-E3-E10、HEP-E4-E10和Guan-SS-Chol，任选地其中所述阳离子脂质是SY-3-E14-DMAPr、SI-4-E14-DMAPr或SY-010。
36.根据权利要求34-35所述的组合物，其中所述非阳离子脂质是DOPE、DEPE、DPPC或DOPC。
37.根据权利要求34-36所述的组合物，其中所述经PEG修饰的脂质是DMG-PEG2K。
38.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒进一步包含一种或多种基于胆固醇的脂质，例如胆固醇。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比是(a)在分别约30-60:10-35:20-30:1-15之间，例如30-60:25-35:20-30:1-15，或(b)在分别约41-70:9-18:9-48:2-6之间。
40.根据权利要求34-39所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含不超过三种不同的脂质组分。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的组合物，其中所述不超过三种不同的脂质组分是阳离子脂质、非阳离子脂质和经PEG修饰的脂质。
43.根据权利要求34-42所述的组合物，其中所述阳离子脂质是咪唑胆固醇酯(ICE)或Guan-SS-Chol，所述非阳离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，并且所述经PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中ICE/Guan-SS-Chol和DOPE以>1:1的摩尔比存在。
45.根据权利要求43所述的组合物，其中ICE/Guan-SS-Chol和DMG-PEG-2K以>10:1的摩尔比存在。
46.根据权利要求43所述的组合物，其中DOPE和DMG-PEG-2K以>5:1的摩尔比存在。
47.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒的尺寸小于约100nm，例如在40nm与60nm之间。
48.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述mRNA是经密码子优化的。
49.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述mRNA包含至少一个非标准核碱基。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述非标准核碱基是选自以下的核苷类似物：2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷和2-硫代胞苷。
51.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物用于肺部递送。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述肺部递送是经由雾化进行的。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中在雾化之前和之后，所述脂质纳米颗粒的尺寸变化不超过400％。
54.根据权利要求52或53所述的组合物，其中所述组合物能够以至少10ml/h的雾化输出速率雾化。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述雾化速率是至少12ml/h。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述雾化速率是至少15ml/h。
57.根据权利要求52-56所述的组合物，其中用振动网雾化器进行所述雾化。
58.一种用于体内递送RNA的方法，所述方法包括经由肺部递送向受试者施用根据权利要求1-57所述的组合物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述肺部递送是鼻内施用或吸入。
60.根据权利要求59所述的方法，其中在吸入之前将所述组合物雾化。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述组合物以冻干形式提供，并且在雾化之前在水溶液中重构。
62.根据权利要求58-61所述的组合物，其中所述mRNA编码蛋白质。
63.根据权利要求58-62所述的方法，其中所述mRNA被递送至肺。
64.根据权利要求63所述的方法，其中由所述mRNA编码的蛋白质在肺中表达。
65.根据权利要求62-64所述的方法，其中所述蛋白质是分泌性蛋白。
66.根据权利要求62-64所述的方法，其中所述蛋白质是抗体或抗原。
67.一种治疗或预防受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括经由肺部递送向所述受试者施用根据权利要求1-57所述的组合物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述肺部递送是经由雾化进行的。
69.根据权利要求67-68所述的方法，其中所述疾病或障碍选自：
(i)肺部疾病或障碍，例如慢性呼吸系统疾病；
(ii)蛋白缺乏症，例如影响肺的蛋白缺乏症；
(iii)赘生性疾病，例如肿瘤；以及
(iv)感染性疾病。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述疾病或障碍是蛋白缺乏症。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述mRNA编码所缺乏的蛋白质。
72.根据权利要求69-71所述的方法，其中所述蛋白缺乏症是囊性纤维化。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述mRNA编码CFTR。
74.根据权利要求69-71所述的方法，其中所述蛋白缺乏症是原发性纤毛运动不良症。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述mRNA编码DNAI1。
76.根据权利要求69-71所述的方法，其中所述蛋白缺乏症是表面活性剂缺乏。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述RNA是编码表面活性剂蛋白的mRNA。
78.根据权利要求69所述的方法，其中所述肺部疾病或障碍是慢性呼吸系统疾病。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述慢性呼吸系统疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺动脉高压或特发性肺纤维化。
80.根据权利要求67-79所述的方法，其中所述mRNA编码用于治疗疾病或障碍的症状的蛋白质。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述mRNA编码针对促炎性细胞因子的抗体。
82.根据权利要求69所述的方法，其中所述疾病或障碍是赘生性疾病，例如肿瘤。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述mRNA编码靶向在赘生性细胞表面上表达的蛋白质的抗体，所述赘生性细胞例如构成所述肿瘤的细胞。
84.根据权利要求69所述的方法，其中所述疾病或障碍是感染性疾病。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述感染性疾病由病毒引起。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述mRNA编码结合所述病毒的表面蛋白的可溶性诱饵受体。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述mRNA编码针对所述病毒的表面蛋白的抗体。
88.根据权利要求84所述的方法，所述感染性疾病是由细菌引起的。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述mRNA编码针对所述细菌的表面蛋白的抗体。
90.根据权利要求84所述的方法，其中所述mRNA编码源自所述感染性疾病的病原体的抗原。
91.根据权利要求58-90所述的方法，其中所述受试者是人。
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