EA028860B1 - Улучшенная липидная композиция - Google Patents

Улучшенная липидная композиция Download PDF

Info

Publication number
EA028860B1
EA028860B1 EA201690312A EA201690312A EA028860B1 EA 028860 B1 EA028860 B1 EA 028860B1 EA 201690312 A EA201690312 A EA 201690312A EA 201690312 A EA201690312 A EA 201690312A EA 028860 B1 EA028860 B1 EA 028860B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
lipid
peg
rna
gene
target
Prior art date
Application number
EA201690312A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201690312A1 (ru
Inventor
Акин Акинг
Джозеф Р. Доркин
Сяоцзюнь Цинь
Вильям Кентли
Мутиах Манохаран
Каллантоттатил Г. Раджив
Джаяпракаш К. Нараянаннаир
Мутусами Джаяраман
Цзяньсинь Чэнь
Стивен Энселл
Original Assignee
Арбутус Биофарма Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арбутус Биофарма Корпорэйшн filed Critical Арбутус Биофарма Корпорэйшн
Publication of EA201690312A1 publication Critical patent/EA201690312A1/ru
Publication of EA028860B1 publication Critical patent/EA028860B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/14—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from compounds containing already amino and carboxyl groups or derivatives thereof
    • C07C227/18—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from compounds containing already amino and carboxyl groups or derivatives thereof by reactions involving amino or carboxyl groups, e.g. hydrolysis of esters or amides, by formation of halides, salts or esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/38—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C227/40—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
    • C07C29/58—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by elimination of halogen, e.g. by hydrogenolysis, splitting-off
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
    • C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Изобретение относится к катионному липиду формулы (I), улучшенной липидной композиции, содержащей катионный липид формулы I, и соответствующим способам применения. Также описаны нацеливающие липиды и специфичные липидные композиции, содержащие указанные нацеливающие липиды.

Description

Изобретение относится к катионному липиду формулы (I), улучшенной липидной композиции, содержащей катионный липид формулы I, и соответствующим способам применения. Также описаны нацеливающие липиды и специфичные липидные композиции, содержащие указанные нацеливающие липиды.
028860
Притязание на приоритет
Заявка на настоящий патент претендует на приоритет заявок υδδΝ 61/185800, поданной 10 июня 2009 г., и υδδΝ 61/244834, поданной 22 сентября 2009 г., содержание каждой из которых целиком включено в настоящее описание в качестве ссылок.
Область техники
Изобретение относится к области доставки терапевтических агентов с применением липидных частиц. В частности, настоящее изобретение направлено на создание катионных липидов и липидных частиц, содержащих эти липиды, которые полезны для доставки ίη νίνο нуклеиновых кислот, а также композиций нуклеиновых кислот с липидными частицами, пригодных для терапевтического применения ίη νίνο. Кроме того, настоящее изобретение направлено на создание способов получения этих композиций, а также способов внедрения нуклеиновых кислот внутрь клеток с применением указанных композиций, например, для лечения различных болезненных состояний.
Уровень техники
Терапевтические нуклеиновые кислоты включают, например, малые интерферирующие РНК (81РНК), микроРНК (ш1РНК), антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, плазмиды и иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты. Эти нуклеиновые кислоты действуют посредством различных механизмов. В случае 81РНК или пнРНК эти нуклеиновые кислоты могут вызывать снижение внутриклеточного содержания специфичных белков посредством процесса, называемого РНК-интерференцией (РНК1). После внедрения 81РНК или т!РНК в цитоплазму клетки эти двуцепочечные РНК-конструкции могут связываться с белком, называемым ΡΙδί'.'. Смысловая цепь 81РНК или т!РНК удаляется из комплекса К4ДС, в результате чего в составе К4ДС остается матрица, которая может распознавать и связываться с мРНК, имеющей последовательность, комплементарную последовательности, связанной 81РНК или т!РНК. После связывания с комплементарной мРНК комплекс К4ДС расщепляет мРНК и высвобождает расщепленные цепи. РНК1 может обеспечивать подавление специфичных белков путем целевого специфичного разрушения соответствующих мРНК, которые служат матрицами для синтеза белка.
Терапевтическое применение РНК1 крайне обширно, так как могут быть синтезированы конструкции 81РНК и пнРНК с любой нуклеотидной последовательностью, направленные против целевого белка. К настоящему времени конструкции 81РНК продемонстрировали способность специфично подавлять целевые белки в моделях как ίη νίΐτο, так и ίη νίνο. Кроме того, конструкции 81РНК в настоящий момент проходят оценку в клинических исследованиях.
Однако в настоящее время при использовании конструкций 81РНК или пнРНК возникают две проблемы, во-первых, их чувствительность к расщеплению нуклеазами в плазме и, во-вторых, их ограниченная способность к получению доступа во внутриклеточный компартмент, где они могут связаться с К4ДС, при системном введении в виде свободной 81РНК или пнРНК. Эти двуцепочечные конструкции могут быть стабилизированы с помощью внедрения химически модифицированных нуклеотидных линкеров в пределах молекулы, например, фосфотиолатных групп. Однако эти химические модификации обеспечивают только ограниченную защиту от расщепления нуклеазами и могут снижать активность конструкции. Внутриклеточная доставка 81РНК или пнРНК может быть облегчена применением переносящих систем, таких как полимеры, катионные липосомы или путем химической модификации конструкции, например, с помощью ковалентного присоединения молекул холестерина. Однако необходимы улучшенные системы доставки для увеличения эффективности молекул 81РНК и пн РНК и снижения или отмены потребности в химической модификации.
Антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы также могут ингибировать трансляцию мРНК в белок. В случае антисмысловых конструкций эти одноцепочечные дезоксирибонуклеиновые кислоты имеют последовательность, комплементарную последовательности мРНК целевого белка и могут связываться с мРНК путем Уотсон-Криковского спаривания оснований. Это связывание предотвращает трансляцию целевой мРНК и/или запускает деградацию мРНК-транскриптов под действием РНКазы Н. Вследствие этого, антисмысловые олигонуклеотиды имеют огромный потенциал для специфичного действия (т.е. подавления специфичного связанного с заболеванием белка). В настоящее время эти соединения продемонстрировали потенциал в нескольких моделях ίη νίΐτο и ίη νίνο, включая модели воспалительного заболевания, рака и ВИЧ (обзор см. в Адга\уак Ττβηάδ ίη Вю1сск 14:376-387, 1996). Антисмысловые цепи также могут влиять на клеточную активность, специфично гибридизируясь с хромосомной ДНК. В настоящее время осуществляется более тщательная клиническая оценка с участием человека нескольких антисмысловых лекарственных препаратов. Цели этих лекарственных препаратов включают гены Ьс12 и аполипопротеина В и их мРНК-продукты.
Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты включают дезоксирибонуклеиновые кислоты и рибонуклеиновые кислоты. В случае дезоксирибонуклеиновых кислот показано, что определенные последовательности или мотивы вызывают иммуностимуляцию у млекопитающих. Эти последовательности или мотивы включают СрС мотивы, пиримидин-богатые последовательности и палиндромные последовательности. Полагают, что СрС мотив в дезоксирибонуклеиновых кислотах специфично узнается эндосомальным рецептором, Τοΐΐ-подобным рецептором 9 (ТЬК-9), который после этого запускает пути стимуляции как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Также сообщалось о некоторых иммуно- 1 028860
стимулирующих последовательностях рибонуклеиновых кислот. Считается, что эти последовательности РНК запускают активацию иммунитета путем связывания с То11-подобными рецепторами 6 и 7 (ТЬР-6 и ТЬР-7). Кроме того, также сообщалось о том, что двуцепочечные РНК являются иммуностимулирующими и, как полагают, осуществляют активацию посредством связывания с ТЬР-3. Одна хорошо известная проблема при применении терапевтических нуклеиновых кислот связана со стабильностью фосфодиэфирной межнуклеотидной связи и чувствительностью этого линкера к нуклеазам. Присутствие экзонуклеаз и эндонуклеаз в сыворотке приводит к быстрому расщеплению нуклеиновых кислот, содержащих фосфодиэфирные линкеры, и, следовательно, терапевтические нуклеиновые кислоты могут иметь очень короткие периоды полураспада в присутствии сыворотки или внутри клеток (ΖοΙρΗαΙί. О., е! а1., Аийзеизе. Рез. Эе\'. 3:323-338 (1993); и ТЫетгу, А.Р., е! а1., с. 147-161 в Оеие Реди1айои: Вю1оду οί Аийзеизе ΚΝΑ апй ΌΝΑ (Ейз. Епскзои, Р.Р. апй Паи!, 1.О.; Рауеи Ргезз, ΝΥ (1992)). При разработке в настоящее время терапевтической нуклеиновой кислоты не применяют базовую фосфодиэфирную химическую связь, обнаруженную в природных нуклеиновых кислотах, вследствие этой и других известных проблем.
Эта проблема была частично решена с помощью химических модификаций, которые снижают деградацию в сыворотке и внутри клетки. Были испытаны модификации межнуклеотидного фосфодиэфирного мостика (например, применение фосфоротиоатного, метилфосфонатного или фосфорамидатного соединения), оснований нуклеотидов (например, 5-пропинил-пиримидины) или сахара (например, 2'модифицированные сахара) (ИЫтаии Е., е! а1. Аийзеизе: Сйетюа1 МойШсайоиз. Еисус1ореЙ1а οί Сапсег, νο1. X., р. 64-81 Асайетю Ргезз 1ис. (1997)). Другими исследователями были предприняты попытки улучшить стабильность с помощью 2'-5' соединения сахаров (см., например, патент США № 5532130). Были предприняты и другие изменения. Однако ни одно из этих решений не было признано полностью удовлетворительным, и свободные ш νί\Ό терапевтические нуклеиновые кислоты до сих пор имеют очень ограниченную эффективность.
Кроме того, как указано выше для з1РНК и т1РНК, сохраняются проблемы с ограниченной способностью терапевтических нуклеиновых кислот пересекать клеточные мембраны (см., V1аззον, е! а1., ВюсЫт. Вюрйуз. Ас!а 1197:95-1082 (1994)) и проблемы, связанные с системной токсичностью, такие как опосредованные комплементом анафилаксия, измененные свойства свертываемости и цитопения (Оа1Ъгайй, е! а1., Аийзеизе №с1. Ас1Й Эгид Эез. 4:201-206, 1994).
С целью улучшения эффективности исследователи также применяли переносящие системы на основе липидов для доставки химически модифицированных или немодифицированных терапевтических нуклеиновых кислот. В Ζе1рЬай, О. аий δ/ока, Р.С., 1. Соий. Ре1 41:99-119 (1996), авторы ссылаются на применение анионных (обычных) липосом, чувствительных к рН липосом, иммунолипосом, фузогенных липосом и агрегатов катионных липидов с антисмысловыми. Сходным образом з1РНК систематически вводили в катионных липосомах, и сообщается, что эти нуклеино-липидные частицы обеспечивают улучшенное подавление целевых белков у млекопитающих, в том числе у нечеловекообразных приматов (йиптегтагт е! а1., №Циге 441: 111-114 (2006)). Несмотря на недавний прогресс, остается потребность в улучшенных композициях из липидов и терапевтических нуклеиновых кислот, пригодных для общего терапевтического применения. Предпочтительно эти композиции должны инкапсулировать нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью, иметь высокое соотношение лекарственное средство: липид, защищать инкапсулированную нуклеиновую кислоту от деградации и клиренса в сыворотке, быть пригодными для системной доставки и обеспечивать внутриклеточную доставку инкапсулированной нуклеиновой кислоты. Кроме того, эти липидные частицы нуклеиновой кислоты должны быть хорошо переносимы и обеспечивать адекватный терапевтический индекс, такой, чтобы лечение пациента при эффективной дозе нуклеиновой кислоты не было ассоциировано с существенной токсичностью и/или риском для пациента. Настоящее изобретение направлено на создание таких композиций, способов получения композиций и способов применения композиций для внедрения нуклеиновых кислот в клетки, в том числе для лечения заболеваний.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение направлено на создание новых катионных липидов, а также липидных частиц, их содержащих. Эти липидные частицы могут дополнительно содержать активный агент и быть применены в соответствии с относящимися к ним способами согласно изобретению для доставки активного агента в клетку.
Липиды по настоящему изобретению могут содержать одну или несколько изомерных форм. Все такие изомерные формы этих соединений специально включены в настоящее изобретение. Соединения по настоящему изобретению могут также включать связи (например, углерод-углеродные связи) или заместители, которые могут ограничивать вращение по связям, например, ограничение вследствие присутствия двойной связи. Соответственно, все Ыз/йаиз и Е/Ζ изомеры специально включены в настоящее изобретение.
Одной из особенностей изобретения является то, что оно направлено на создание улучшенных липидных композиций, содержащих катионный липид формулы Ι
- 2 028860
Формула I также может иметь названия ЭРт-М-СЗ-ЭМА, МС3 или М-С3. Каждое из соединений формулы I ЭРт-М-СЗ-ЭМА, МСЗ и М-СЗ имеет формулу, указанную непосредственно выше.
Липидные композиции обычно также содержат нейтральный липид, стерол и ПЭГ или ПЭГмодифицированный липид.
Одной из особенностей изобретения является то, что улучшенная липидная композиция также включает целевой липид (например, ОаЖАс и/или фолатсодержащий липид).
Одной из особенностей изобретения является то, что оно направлено на получение улучшенных липидных композиций путем экструзии или способом поточного смешивания.
Одной из особенностей изобретения является то, что оно дополнительно направлено на создание способа введения улучшенных липидных композиций, содержащих конструкции на основе РНК, животным и оценки экспрессии целевого гена.
Одной из особенностей изобретения является то, что липидная композиция согласно изобретению, такая как липидная композиция в комплексе с олигонуклеотидом, таким как двуцепочечная РНК (дцРНК), может применяться для модификации (например, снижения) экспрессии целевого гена в опухолевой клетке ίη νίνο или ίη νίΐτο. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения липидная композиция согласно изобретению может применяться для модификации экспрессии целевого гена в линии опухолевых клеток, включая в качестве неограничивающих примеров клеточные линии НеГа, НСТ116, А375, МСР7, В16Р10, НерЗЬ, НИН7, НерО2, З^З, И87 и РСЗ.
С другой стороны, настоящее изобретение направлено на создание липидной частицы, содержащей липид по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях липидная частица дополнительно содержит нейтральный липид и липид, способный снижать агрегацию частиц. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения липидная частица состоит главным образом из (ΐ) по меньшей мере одного липида по настоящему изобретению; (ΐΐ) нейтрального липида, выбранного из ДСФХ, ДПФХ, ПОФХ, ДОФЭ и СМ; (ΐΐΐ) стерола, например холестерола; и (ίν) пегилированного липида, например ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-сЭМА, в молярном соотношении примерно 20-60% катионного липида:5-25% нейтрального липида:25-55% стерола; 0,5-15% ПЭГ-липида. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения липид по настоящему изобретению является оптически чистым.
В дополнительном родственном варианте воплощения настоящее изобретение включает липидные частицы согласно изобретению, которые дополнительно содержат терапевтический агент. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения терапевтический агент является нуклеиновой кислотой. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения нуклеиновая кислота является плазмидой, иммуностимулирующим олигонуклеотидом, одноцепочечным олигонуклеотидом, например антисмысловым олигонуклеотидом, антагомиром; двуцепочечным олигонуклеотидом, например 51РНК; аптамером или рибозимом.
Еще в одном родственном варианте воплощения настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую липидную частицу по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или разбавитель.
Настоящее изобретение дополнительно включает в других родственных вариантах воплощения способ модуляции экспрессии целевого гена в клетке, способ, содержащий доставку в клетку липидной частицы или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Целевой ген может быть геном дикого типа. В другом варианте воплощения настоящего изобретения целевой ген содержит одну или несколько мутаций. В одном из вариантов воплощения изобретения способ включает специфичную модуляцию экспрессии целевого гена, содержащего одну или несколько мутаций. В определенных вариантах воплощения липидная частица содержит терапевтический агент, выбранный из иммуностимулирующих олигонуклеотидов, одноцепочечных олигонуклеотидов, например антисмысловой олигонуклеотид, антагомир; двуцепочечный олигонуклеотид, например 51РНК, аптамер, рибозим. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения нуклеиновая кислота является плазмидой, которая кодирует 51РНК, антисмысловой олигонуклеотид, аптамер или рибозим.
Одной из особенностей изобретения является то, что целевой ген выбирают из группы, включающей ген фактора VII, Е§5, РСЗК9, ТРХ2, ароВ, ЗАА, ТТК, Κδν, РЭОР β, ген ЕгЬ-В, ген Згс, ген СКК, ген ОКВ2, ген КАЗ, ген МЕКК, ген ЖК, ген КАЕ, ген Егк1/2, ген РСХА(р21), ген МУВ, ген .ΙΕΝ, ген РОЗ, ген ВСЕ-2, ген циклина Ώ, ген νΕΟΡ, ген ЕОРК, ген циклина А, ген циклина Е, ген ΑΝΤ-1, ген βкатенина, ген с-МЕТ, ген РКС, ген ΝΙ-'КВ, ген ЗТАТЗ, ген сурвивина, ген Нег2Жеи, ген топоизомеразы I, ген топоизомеразы II а, ген р73, ген р21 (ААИ/СШ), ген р27 (К№1), ген РРМ1Э, ген КАЗ, ген кавеолина I, ген МЮ I, ген МТАД ген М68, ген ЗОКТ1, ген ХВР1, мутации в генах опухолевых супрессоров, ген опухолевого супрессора р5З и их комбинации.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения нуклеиновая кислота является плазмидой, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или фрагмент таким образом, что экспрессия полипептида или его функционального варианта или фрагмента повышена.
- З 028860
Еще в одном родственном варианте воплощения настоящее изобретение включает способ лечения заболевания или нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией полипептида в организме субъекта, включающий введение субъекту липидной частицы или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, при этом терапевтический агент выбирают из 81РНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать ЙРНК. микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид, и при этом 81РНК, микроРНК или антисмысловая РНК содержит полинуклеотид, который специфично связывается с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, или с комплементарным ему полинуклеотидом.
В другом родственном варианте воплощения настоящее изобретение включает способ лечения заболевания или состояния, характеризующегося пониженной экспрессией полипептида в организме субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по настоящему изобретению, при этом терапевтический агент является плазмидой, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или фрагмент.
В дополнительном варианте воплощения настоящее изобретение включает способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по настоящему изобретению, при этом терапевтический агент является иммуностимулирующим олигонуклеотидом. В определенных вариантах воплощения фармацевтическую композицию вводят пациенту в комбинации с вакциной или антигеном.
В родственном варианте воплощения настоящее изобретение включает вакцину, содержащую липидную частицу по настоящему изобретению и антиген, ассоциированный с заболеванием или патогеном. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения липидная частица содержит иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту или олигонуклеотид. В одном из вариантов воплощения антиген является опухолевым антигеном. В другом варианте воплощения настоящего изобретения антиген является вирусным антигеном, бактериальным антигеном или паразитарным антигеном.
Настоящее изобретение дополнительно включает способы получения липидных частиц и фармацевтических композиций по настоящему изобретению, а также наборы, полезные для получения этих липидных частиц и фармацевтических композиций.
Другой особенностью настоящего изобретения является то, что оно направлено на создание способа оценки композиции, включающей агент, например терапевтический агент или диагностический агент, и липид по настоящему изобретению.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена столбчатая диаграмма, изображающая влияние липидных композиций, содержащих ΌΡίη-М-СЗ-ЭМА, на сайленсинг РУН при использовании мыши в качестве модельного организма.
На фиг. 2 представлена столбчатая диаграмма, показывающая дозозависимый эффект МСЗ у крыс для различных липосомных композиций.
На фиг. 3 представлена столбчатая диаграмма, которая демонстрирует зависимость от АроЕ эффективности композиций, содержащих МСЗ. Мыши дикого типа, но не мыши, нокаутные по гену АроЕ, демонстрировали дозозависимое снижение содержания белка РУ11. На фиг. 2 также изображен график, демонстрирующий, что зависимость от АроЕ липосомных композиций с МСЗ и отсутствие сайленсинга у нокаутных по гену АроЕ мышей при применении МСЗ могут быть эффективно нормализованы путем предварительного смешивания с АроЕ.
На фиг. 4 представлена столбчатая диаграмма, которая показывает эффекты вариаций мольного процентного содержания МСЗ в липосомной композиции, а также эффекты вариаций нейтрального липида (например, замена нейтрального липида на ДСФХ, ДМФХ и ДЛФХ).
На фиг. 5 представлена столбчатая диаграмма, демонстрирующая, что возрастающая степень ПЭГ экранирования снижает у мышей сайленсинг, опосредованный не Оа1ЫАс.
На фиг. 6 представлена столбчатая диаграмма, демонстрирующая, что возрастающая степень ПЭГ экранирования снижает у крыс сайленсинг, опосредованный не ОаШАс.
На фиг. 7 представлена столбчатая диаграмма, показывающая эффективность липосомных композиций, имеющих различное мольное процентное содержание МС3, содержащих и не содержащих Са1ЫАс.
На фиг. 8 представлена столбчатая диаграмма, показывающая, что активность несущих Оа1ЫАс липосом отсутствует у мышей, нокаутных по гену рецептора асиалогликопротеинов (А8СРК).
На фиг. 9 показана кривая зависимости доза-эффект от % остаточного РУН и дозы (мг/кг) для композиции, получение которой описано в примере 17.
На фиг. 10 представлена кривая титрования рКа для катионного липида формулы I, полученная как описано в примере 18.
- 4 028860
Подробное описание изобретения
В этом изобретении описана улучшенная липидная композиция, которая может быть применена, например, в качестве агента доставки, например агента на основе нуклеиновых кислот, такого как конструкции на основе РНК, в клетку или в организм субъекта. Также в этом документе описаны способы введения улучшенных липидных композиций, содержащих конструкцию на основе РНК, животному, и в некоторых вариантах воплощения способы оценки экспрессии целевого гена. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения улучшенная липидная композиция включает нацеливающий липид (например, нацеливающий липид, описанный в этом документе, такой как липид, содержащий Оа1ЫЛе или фолат).
Липиды
Настоящее изобретение направлено на создание улучшенных липидных композиций, содержащих катионный липид формулы I, нейтральный липид, стерол и ПЭГ или липид, модифицированный ПЭГ, где формула I
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения липид является рацемической смесью.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения липид обогащен одним диастереомером, например, липид содержит по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 70% избыток диастереомера.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения липид является хирально чистым, например одиночным изомером.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения липид обогащен одним изомером.
В одном из вариантов воплощения композиции согласно изобретению включают по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиция содержит от примерно 25 до примерно 75% в молярном выражении катионного липида формулы I, например от примерно 35 до примерно 65%, от примерно 45 до примерно 65%, примерно 60%, примерно 57,5%, примерно 50% или примерно 40% в молярном выражении.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиция содержит от примерно 0,5 до примерно 15% в молярном выражении нейтрального липида, например от примерно 3 до примерно 12%, от примерно 5 до примерно 10% или примерно 15%, примерно 10% или примерно 7,5% в молярном выражении.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиция содержит от примерно 5 до примерно 50% в молярном выражении стерола (например, от примерно 15 до примерно 45%, от примерно 20 до примерно 40%, примерно 40%, примерно 38,5%, примерно 35% или примерно 31% в молярном выражении). В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения стерол является холестеролом.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиция содержит от примерно 0,5 до примерно 20% в молярном выражении ПЭГ или липида, модифицированного ПЭГ (например, от примерно 0,5 до примерно 10%, от примерно 0,5 до примерно 5%, примерно 1,5%, примерно 0,5%, примерно 1,5%, примерно 3,5% или примерно 5% в молярном выражении).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают 25-75% катионного липида формулы I, 0,5-15% нейтрального липида, 5-50% стерола и 0,520% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают 35-65% катионного липида формулы I, 3-12% нейтрального липида, 15-45% стерола и 0,5-10% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают 45-65% катионного липида формулы I, 5-10% нейтрального липида, 25-40% стерола и 0,5-10% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 60% катионного липида формулы I, примерно 7,5% нейтрального липида, примерно 31% стерола, и примерно 1,5% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДСФХ, стерол является холестеролом и ПЭГ-липид является ПЭГ-ДМГ (также называемым в этом документе ПЭГ-С14 или С14-ПЭГ). В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид содержит молекулу ПЭГ со средней молекулярной массой 2000 Да. В другом варианте воплощения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид содержит молекулу ПЭГ со средней молекулярной массой менее 2000, например, около 1500 Да, около 1000 Да или около 500 Да. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид является соединением по следующей формуле VI:
- 5 028860
ο η
с молекулой ПЭГ со средней молекулярной массой 2000 Да. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид является ПЭГ-дистеароил-глицерином (ПЭГ-ДСГ, также называемым в этом документе как ПЭГ-С18 или С18-ПЭГ).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 50% катионного липида формулы I, примерно 10% нейтрального липида, примерно 38,5% стерола, и примерно 1,5% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДСФХ, стерол является холестеролом и ПЭГ-липид является ПЭГ - ДМГ (также называемым в этом документе ПЭГ-С14 или С14-ПЭГ). В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид является ПЭГ-дистирил-глицерином (ПЭГ-ДСГ, также называемым в этом документе как ПЭГ-С18 или С18-ПЭГ). В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид является ПЭГ-ДПГ (ПЭГдипальмитоилглицерином). В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения ПЭГ или ПЭГмодифицированный липид содержит молекулу ПЭГ со средней молекулярной массой 2000 Да.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 50% катионного липида формулы I, примерно 10% нейтрального липида, примерно 35% стерола, и примерно 4,5% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида, и примерно 0,5% нацеливающего липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДСФХ, стерол является холестеролом, ПЭГлипид является ПЭГ дистеароил-глицерином (ПЭГ-ДСГ, также называемым в этом документе как ПЭГС18 или С18-ПЭГ) и нацеливающий липид является ОаШАсЗ-ПЭГ-ДСГ.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 50% катионного липида формулы I, примерно 10% нейтрального липида, примерно 35% стерола и примерно 4,5% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида, и примерно 0,5% нацеливающего липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДСФХ, стерол является холестеролом, ПЭГлипид является ПЭГ-ДМГ (также называемым в этом документе ПЭГ-С14 или С14-ПЭГ).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 40% катионного липида формулы I, примерно 15% нейтрального липида, примерно 40% стерола и примерно 5% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДСФХ, стерол является холестеролом, ПЭГ-липид является ПЭГ-ДМГ (также называемым в этом документе ПЭГ-С14 или С14-ПЭГ).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 50% катионного липида формулы I, примерно 10% нейтрального липида, примерно 35% стерола, и примерно 5% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДСФХ, стерол является холестеролом, ПЭГ-липид является ПЭГ-ДМГ (также называемым в этом документе ПЭГ-С14 или С14-ПЭГ).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 57,2% катионного липида формулы I, примерно 7,1% нейтрального липида, примерно 34,3% стерола, и примерно 1,4% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДПФХ, стерол является холестеролом, ПЭГ-липид является ПЭГ-сЭМА (ПЭГсЭМА дополнительно обсуждается в Неуез е! а1. (I. Соп1го11еб К_е1еазе, 107, 276-287 (2005)).
СаШАсЗ-ПЭГ-ДСГ. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения ПЭГ или ПЭГмодифицированный липид является соединением формулы VI или ПЭГ-ДСГ, при этом молекула ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу 2000 Да.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению включают примерно 57,5% катионного липида формулы I, примерно 7,5% нейтрального липида, примерно 31,5% стерола и примерно 3,5% ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида в молярном отношении. В одном предпочтительном воплощении, катионный липид является соединением формулы I, нейтральный липид является ДСФХ, стерол является холестеролом и ПЭГ-липид является ПЭГ-ДМГ.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения соотношение липид :з1РНК составляет от по меньшей мере примерно 0,5:1, по меньшей мере примерно 1:1, по меньшей мере примерно 2:1, по меньшей мере примерно 3:1, по меньшей мере примерно 4:1, по меньшей мере примерно 5:1, по меньшей мере примерно 6:1, по меньшей мере примерно 7:1, по меньшей мере примерно 8:1, по меньшей мере примерно 10:1, по меньшей мере примерно 11:1, по меньшей мере примерно 12:1, до по меньшей мере примерно 15:1. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения соотношение липид :з1РНК
- 6 028860
составляет от примерно 1:1 до примерно 20:1, от примерно 3:1 до примерно 15:1, от примерно 4:1 до примерно 15:1, от примерно 5:1 до примерно 13:1. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения соотношение липид:к1РНК составляет от примерно 0,5:1 до примерно 15:1.
Одной из особенностей изобретения является то, что улучшенная липидная композиция также включает нацеливающий липид. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид содержит остаток ОаШАс (т.е. остаток Ν-галактозамина). Например, нацеливающий липид, содержащий остаток ОаВДАс, может включать таковой, описанный в υδδΝ 12/328669, поданной 12.04.2008, которая полностью включена сюда в качестве ссылок. Нацеливающий липид также может включать любой другой липид (например, нацеливающий липид), известный специалистам в данной области, например, как описано в υδδΝ 12/328669 или Международной публикации АО 2008/042973, содержание каждой из которых целиком включено сюда в качестве ссылок. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения липид направленного действия включает множество остатков ОаВДАс, например два или три остатка ОаШАс. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения липид направленного действия включает множество, например, два или три остатка Νацетилгалактозамина (ОаВДАс). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения липид в составе нацеливающего липида является 1,2-ди-О-гексадецил-ки-глицеридом (т.е. ДСГ). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид включает остаток ПЭГ (например, остаток ПЭГ, имеющий молекулярную массу не менее чем примерно 500 Да, такую как примерно 1000, 1500, 2000 Да или более), например, остаток направленного действия присоединен к липиду через остаток ПЭГ.
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид содержит остаток фолата. Например, нацеливающий липид, содержащий остаток фолата, может включать таковой, описанный в υδδΝ 12/328669, поданной 12.04.2008, которая полностью включена сюда в качестве ссылок. В другом варианте воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид, содержащий остаток фолата, может включать соединение формулы V.
Примеры липидов направленного действия представлены формулой Ь:
(группа направленного действия)п-Ь-липид
где группа направленного действия является любой группой направленного действия, которая известна специалистам в данной области и/или описана в этом документе (например, рецептор клеточной поверхности);
п является целым числом от 1 до 5 (например, 3);
Ь является линкерной группой; и
липид является липидом, таким как описан в этом документе (например, нейтральным липидом, таким как ДСГ).
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения линкерная группа содержит остаток
ПЭГ.
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид является соединением 2, 3, 4 или 5, представленным ниже:
- 7 028860
Мок «I. 2151 78
Формула II
СакХЛсЗ-ДСГ
уС,
ноА-^г~Мо
АсНИ
НО χ0Η
Ύί! „ , . , Н 5
Аснм I "Г^ГТ'"'Г~'Г
НО /;Н I
Аснм ί н н Αν ΜοΙ VII 4331
Формула III СаЩАсЗ-ПЭГ-ДСГ
(СаВДАс)з-ПЭГ-ЬСО
Формула IV
Фолат-ПЭГ-ДСФЭ
152-дистеароил-5я-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ь1-[фолат(полиэтиленгликоль)-2000]
(аммониевая соль)
Формула V
- 8 028860
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид представлен в композиции в количестве от примерно 0,001 до примерно 5% (например, примерно 0,005, 0,15, 0,3, 0,5, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 или 5%) в молярном отношении. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид представлен в композиции в количестве от примерно 0,005 до примерно 1,5%. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения нацеливающий липид включен в композицию, описанную в этом документе.
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения липидная композиция также содержит антиоксидант (например, ловушку радикалов). Антиоксидант может присутствовать в композиции, например, в количестве от примерно 0,01 до примерно 5%. Антиоксидант может быть гидрофобным или гидрофильным (например, липидорастворимым или водорастворимым). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения антиоксидант является фенольным соединением, например бутилгидрокситолуолом, ресвератролом, коэнзимом Ц10 или другим флавиноидом, или витамином, например витамином Е или витамином С. Другие примеры антиоксидантов включают липоевую кислоту, мочевую кислоту, каротин, такой как β-каротин или ретинол (витамин А), глутатион, мелатонин, селен и убихинол.
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения рецептор липида направленного действия (например, липида, содержащего ОаШЛс) является рецептором асиалогликопротеинов (т.е. ΑδΟΡΚ).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению получены с применением способа экструзии или способа поточного смешивания.
Способ экструзии (также называемый способом с предварительным формированием или способ серийного производства) является способом, при котором сперва получают пустые липосомы (т.е. без нуклеиновой кислоты), после чего добавляют нуклеиновую кислоту к пустым липосомам. Экструзия липосомных композиций через мелкопористую поликарбонатную мембрану или асимметрическую керамическую мембрану приводит к относительно четко определенному распределению по размерам. В типичном случае, суспензия циркулирует через мембрану один или несколько раз, до достижения требуемого распределения липосомных комплексов по размеру. Липосомы могут быть экструдированы через последовательные мембраны с уменьшающимся размером пор для достижения постепенного уменьшения размера липосом. В некоторых случаях формирующиеся липидонуклеиновые кислотные композиции могут быть применены без разделения по размерам. Эти способы раскрыты в патентах США 5008050; 4927637; 4737323; ВюсЫт Вюрйуз Аска. 1979 Оск 19; 557(1):9-23; ВюсЫт Вюрйуз Аска. 1980 Оск 2; 601(3):559-7; ВюсЫт Вюрйуз Аска. 1986 Ып 13; 858(1): 161-8; и ВюсЫш. Вюрйуз. Аска 1985, 812, 55-65, содержание которых целиком включено сюда в качестве ссылок.
Способ поточного смешивания является способом, при котором как липиды, так и нуклеиновая кислота добавляются в смесительную камеру параллельно. Смесительная камера может являться простым тройниковым соединителем или любой другой смесительной камерой, известной специалистам в данной области. Эти способы раскрыты в патентах США № 6534018 и 6855277; публикации США 2007/0042031 и РИагтассиОсЫз КсзсагсИ, νοί. 22, № 3, Маг. 2005, р. 362-372, которые полностью включены сюда в качестве ссылок.
При этом понимается, что композиции согласно изобретению могут быть получены любыми другими способами, известными всем специалистам в данной области.
В дополнительном варианте воплощения представительные композиции, содержащие соединение формулы I, описаны в табл. 1.
- 9 028860
Таблица 1
мсз ДСФХ Холестерол ПЭГ
60 7,5 31 1,5
50 10 38,5 1,5
40 20 38,5 1,5
50 10 38,5 1,5
50 10 38,5 1,5
40 20 38,5 1,5
60 7,5 21 1,5
50 10 38,5 1,5
50 10 20 38,5 1,5
40 (ДМФХ) 38,5 1,5
30 30 10 38,5 1,5
50 (ДМФХ) 30 38,5 1,5
30 (ДМФХ) 10 38,5 1,5
51 (ДЛФХ) 20 38,5 1,5
40 (ДЛФХ) 38,5 1,5
40 20 38,5 1,5
40 10 40 10
60 10 20 10
40 20 37 3
60 10 27 3
В одном из вариантов воплощения специфичные композиции, содержащие соединение формулы I, описаны следующим образом:
Соотношение липидов (в мол.%);
Соотношение липид :81РНК.
50/10/38,5/1,5 (МС3:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
Липид: δϊ РНК ~11.
40/15/40/5 (МС3: ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/35/4,5/0,5% (МС3:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДСГ (С18-ПЭГ):СаШАе3-ПЭГ-ДСГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/30/9,5/0,5% (МС3:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДСГ:Са1ХАе3-ПЭГ-ДСГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/35/5% (МС3:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДСГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/38,5/1,5 (МС3:ДПФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
Липид :чР11К ~11.
40/15/40/5 (МС3: ДПФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/35/4,5/0,5% (МС3:ДПФХ:холестерол:ПЭГ-ДСГ:Са1ХАе3-ПЭГ-ДСГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/30/9,5/0,5% (МС3:ДПФХ:холестерол:ПЭГ-ДСГ:Са1ХАе3-ПЭГ-ДСГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/35/5% (МС3:ДПФХ:холестерол:ПЭГ-ДСГ);
Соотношение липид:§1РНК ~11.
50/10/38,5/1,5 (МС3:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
Липид :чР11К ~7.
50/10/38,5/1,5 (МС3:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДСГ);
Липид:чР11К ~10.
50/10/38,5/1,5 (МС3:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
- 10 028860
Липид :δίΡΗΚ ~12.
50/10/35/5% (МС3: ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
Соотношение липид:81РНК ~8.
50/10/35/5% (МС3: ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ);
Соотношение липид:81РНК ~10.
В одном из вариантов воплощения композиции согласно изобретению захвачены по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения композиции согласно изобретению дополнительно содержат аполипопротеин. При использовании в этом документе термин "аполипопротеин" или "липопротеин" означает аполипопротеины, известные специалисту в данной области, и их варианты и фрагменты, и агонисты, аналоги аполипопротеинов или их фрагменты, описанные ниже.
Пригодные аполипопротеины включают, в качестве неограничивающих примеров, АроА-Ι, АроАII, ΑροΑ-ΐν, АроА-У и АроЕ и их активные полиморфные формы, изоформы, вариантные и мутантные формы, а также фрагменты или укороченные формы. В некоторых воплощениях аполипопротеин является тиолсодержащим аполипопротеином. "Тиолсодержащий аполипопротеин" означает аполипопротеин, вариант, фрагмент или изоформу, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина. Самыми обычными тиолсодержащими аполипопротеинами являются ΑροΑ-Ι Мйаио (ΑροΑ-ΙΜ) и ΑροΑ-Ι Рап8 (АроАΙρ), которые содержат один остаток цистеина (Да е! а1., 2002, ВюсНст. Βίορίινδ. Кее. Сотт. 297: 206-13; Ыейек! апФ ОФа, 2002, Вюсйет181гу 41: 2089-96). АроА-ΙΙ, АроЕ2 и АроЕ3 тоже являются тиолсодержащими аполипопротеинами. Изолированный АроЕ и/или его активные фрагменты и полипептидные аналоги, включая его рекомбинантно полученные формы, описаны в патентах США № 5672685; 5525472; 5473039; 5182364; 5177189; 5168045; 5116739; раскрытия которых включены сюда в качестве ссылок. АроЕ3 описан в ^е18дгаЬег, е! а1., "Нитап Е аρορ^ο!е^η ЬеЮгодепеПу: су81еше-агд1шпе ш!егсЬапде8 ίη Ше атию ашФ 8ециепсе οί !Ье аρο-Е ί8οΙοπη8". 1. Βίο1. СЬет. (1981), 256: 9077-9083; и Ка11, е! а1., "8!гис!ига1 Ьа818 Юг гесерЮг ЬшФшд НеЮгодепеПу οί аρο1^ρορ^ο!е^η Е Ггот !уре ΙΙΙ Ьуρе^1^ρορ^ο!е^ηет^с 8иЬ)ес!8", Ргос. Иа!. ΑсаФ. 8сГ (1982), 79: 4696-4700. См. также номер доступа К00396 в СепВапк.
В некоторых воплощениях аполипопротеин может находиться в своей зрелой форме, в форме препроаполипопротеина или в форме проаполипопротеина. Гомо- и гетеродимеры (где применимо) про- и зрелых ΑροΑ-Ι (Оиуегдег е! а1., 1996, ЛПег^Дег. ТЬготЬ. Уа8е. Βίο1. 16(12):1424-29), ΑροΑ-Ι МПагю (1<1οπ е! а1., 2000, Βίορΐιχ’8. 1. 79:(3) 1679-87; Ргапсе8сЫт е! а1., 1985, 1. Βίο1. СЬет. 260:1632-35), ΑροΑ-Ι Рап8 (Иаит е! а1., 1999, 1. Μο1. МеФ. 77:614-22), ΑροΑ-ΙΙ (§Ье1пе88 е! а1., 1985, 1., Βίο1. СЬет. 260(14):863746; §Ье1пе88 е! а1., 1984, 1. Βίο1. СЬет. 259(15):9929-35), ΑροΑ-Ιν (Эиуегдег е! а1., 1991, Еиго. 1. Βίο^κιη. 201(2):373-83) и ΑροΕ (МсЬеап е! а1., 1983, 1. Βίο1. СЬет. 258(14):8993-9000) также могут применяться в объеме изобретения.
В некоторых воплощениях аполипопротеин может являться фрагментом, вариантом или изоформой аполипопротеина. Термин "фрагмент" означает любой аполипопротеин, имеющий аминокислотную последовательность короче, чем таковая нативного аполипопротеина, при этом фрагмент сохраняет активность нативного аполипопротеина, включая липидсвязывающие свойства. Под "вариантом" подразумеваются замены или изменения в аминокислотных последовательностях аполипопротеина, при этом замены или изменения, например, добавление или делеция аминокислотных остатков, не уничтожает активность нативного аполипопротеина, включая липидсвязывающие свойства. Таким образом, вариант может включать белок или пептид, имеющий аминокислотную последовательность, в существенной мере идентичную нативному аполипопротеину, описанному в этом документе, в которой один или несколько аминокислотных остатков были консервативно заменены аминокислотами со схожими химическими свойствами. Примеры консервативных замен включают замену по меньшей мере одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой. Сходным образом, настоящее изобретение предполагает, например, замену по меньшей мере одного гидрофильного остатка, такую как, например, обмен между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, и между глицином и серином (см. патенты США № 6004925, 6037323 и 6046166). Термин "изоформа" означает белок, имеющий ту же, более широкую или частичную функцию и схожую, идентичную или частичную последовательность, который может являться или не являться продуктом того же самого гена и обычно является тканеспецифичным
- 11 028860
(см. Ае1здгаЬег 1990,1. ЫрШ Кез. 31(8): 1503-11; ккхзоп апй Рочсгз 1991,1. Σίρίά Кез. 32(9): 152935; Ьаскпег ек ак, 1985, 1. ΒίοΙ. СНет. 260(2):703-6; Ное§ ек ак, 1986, 1. ΒίοΙ. СЬет. 261(9):3911-4;
Согс1оп ек а1., 1984, ί. ΒίοΙ. СЬет. 259(1):468-74; Ро\\с11 ек а1., 1987, Се11 50(6):831-40; Ау1гат ек ак,
1998, Агкепозс1ег. ТЬготЬ. Уазе. ΒίοΙ. 18(10): 1617-24; Азиат ек а1., 1998, 1. СЬп. Ιηνεδΐ. 101(8):
1581-90; ВШеске ек ак, 2000, От§ МекаЬ. ϋίδροδ. 28(11): 1335-42; Эгадапоу ек ак, 2000, 1. ΒίοΙ.
СЬет. 275(43):33435-42; БкеттеЫ апб СЬегтапп 1985 1. ΒίοΙ. СЬет. 260(4):2258-64; АУкПег ек ак,
1980, I. ΒίοΙ. СЬет. 255(21): 10464-71; Эусг ек ак, 1995, 1. Οριά Кез. 36(1):80-8; §асге ек ак, 2003,
РЕВ8 Ьей. 540(1-3): 181-7; Аеегз, ек ак, 2003, ВюрЬуз. СЬет. 100(1-3):481-92; Сопд ек ак, 2002, к ΒίοΙ. СЬет. 277(33):29919-26; ОЫа ек ак, 1984, I ΒίοΙ. СЬет. 259(23): 14888-93 и патент США №
6 372 886).
В некоторых воплощениях способы и композиции по настоящему изобретению включают применение химерных конструкций аполипопротеина. Например, химерная конструкция аполипопротеина может быть составлена из аполипопротеинового домена с высокой липидсвязывающей активностью, ассоциированного с аполипопротеиновым доменом, обладающим свойствами защиты от реперфузии при ишемии. Химерная конструкция аполипопротеина может являться конструкцией, которая включает отдельные области в пределах аполипопротеина (т.е. гомологичной конструкцией), или же химерная конструкция может являться конструкцией, которая включает отдельные области различных аполипопротеинов (т.е. гетерологичными конструкциями). Композиции, содержащие химерную конструкцию, также могут включать сегменты, которые являются вариантами аполипопротеинов, или сегменты, созданные так, чтобы они обладали специфичным свойством (например, связывание липидов, связывание рецептора, ферментативные свойства, свойство активировать фермент, антиоксидантные или окислительновосстановительные свойства)
(зее Ае13§гаЬег 1990, 1. Ι4ρίά Кез. 31(8): 1503-11; ккхзоп апб Ро\\егз
1991,1. Πρίά Кез. 32(9): 1529-35; Ьаскпег ек ак, 1985,1. ΒίοΙ. СЬет. 260(2):703-6; Ное§ ек ак, 1986,1.
ΒίοΙ. СЬет. 261(9):3911-4; Оогбоп ек ак, 1984, 1. ΒίοΙ. СЬет. 259(1):468-74; РотееП ек ак, 1987, СеИ 50(6):831-40; Аупат ек ак, 1998, Агкепозс1ег. ТЬготЬ. Уазе. ΒίοΙ. 18(10): 1617-24; Аупат ек ак,
1998, 1. СЬп. 1пуезк. 101(8): 1581-90; ВШеске ек ак, 2000, От§ МекаЬ. ϋίδροδ. 28(11): 1335-42;
Эгадапоу ек ак, 2000, 1. ΒίοΙ. СЬет. 275(43):33435-42; Зкеттекг апб СЬегтапп 1985, 1. ΒίοΙ. СЬет. 260(4):2258-64; А1б1ег ек ак, 1980, 1. ΒίοΙ. СЬет. 255(21): 10464-71; Оуег ек ак, 1995, 1. Πρίά Кез.
36(1):80-8; Богспзоп ек ак, 1999, Агкепозс1ег. ТЬготЬ. Уазе. ΒίοΙ. 19(9):2214-25; Ра1§ипасЬап 1996, Агкепозс1ег. ТЬгоЬ. Уазе. ΒίοΙ. 16(2):328-38: ТЬигЬегд ек ак, к ΒίοΙ. СЬет. 271(11):6062-70; Оуег 1991,1. ΒίοΙ. СЬет. 266(23): 150009-15; НШ 1998,1. ΒίοΙ. СЬет. 273(47):30979-84).
Аполипопротеины, применяемые в изобретении, также включают рекомбинантные, синтетические, полусинтетические или очищенные аполипопротеины. Способы получения аполипопротеинов или им эквивалентные, применяемые в изобретении, хорошо известны специалистам в данной области. Например, аполипопротеины могут быть выделены из плазмы или природных продуктов с помощью, например, центрифугирования в градиенте плотности или иммуноаффинной хроматографии, или получены синтетически, полусинтетически или с применением методик рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области (см., например, Ми1идека ек а1., 1998, к СНготакодг. 798(1-2): 83-90; Скипу ек а1., 1980, к Ькркб Кез. 21(3):284-91; СНеипд ек а1., 1987, к ЬфИ Кез. 28(8):913-29; Ретззои, ек а1., 1998, к СНготакодг. 711:97-109; патенты США № 5059528, 5834596, 5876968 и 5721114; и РСТ публикации АО 86/04920 и АО 87/02062).
Аполипопротеины, применяемые в изобретении, дополнительно включают агонисты аполипопротеинов, такие как пептиды и пептидные аналоги, которые имитируют активность АроА-1, АроА-Ι Мбаио (АроА-1М), АроА-Ι Ралз (АроА-1Р), АроА-ΙΙ, АроА-1У и АроЕ. Например, аполипопротеин может являться любым из таковых, описанных в патентах США № 6004925, 6037323, 6046166 и 5840688, содержание которых целиком включено сюда в качестве ссылок.
Пептиды- агонисты или пептидные аналоги аполипопротеинов могут быть синтезированы или произведены с применением любой методики пептидного синтеза, известной специалистам в данной области, включая, например, методики, описанные в патентах США № 6004925, 6037323 и 6046166. Например, пептиды могут быть получены с применением методики твердофазного синтеза, первоначально описанной МеглйеЫ (1963, к Ат. СНет. 8ос. 85:2149-2154). Другие методики пептидного синтеза можно найти в Вобапз/кх ек а1., Рерцбе 8упкНез1з, ,1оНп А11еу & 8опз, 2б Еб., (1976) и других литературных источниках, свободно доступных для специалиста в данной области. Резюме по методикам синтеза полипептидов можно найти в 8киагк апб Уоипд, 8о1 ΐά РНазе РерЕбе. 8упкНез1з, Ргетсе СНетюа1 Сотрапу,
- 12 028860
Коск&гй, 111 (1984). Пептиды также могут быть синтезированы способами, использующими синтез в растворе, как описано в ТНс Рго1ешк, νοί. II, 3й Ей., ЫеигаГН с1 а1., Ейк., р. 105-237, Асайепис Ргекк, №ν Уогк, Ν.Υ. (1976). Защитные группы, пригодные для применения при различных способах пептидного синтеза, описаны в вышеупомянутых текстах, а также в МсОт1е, РгоГесГще Сгоирк ίη Огдашс СЬет1кйу, Р1епит Ргекк, Νον Υο^к, Ν.Υ. (1973). Пептиды по настоящему изобретению также могут быть получены путем химического или ферментативного расщепления из более длинной формы, например, аполипопротеина А-1.
В некоторых воплощениях аполипопротеин может являться смесью аполипопротеинов. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения аполипопротеин может являться гомогенной смесью, т. е. одним типом аполипопротеина. В другом варианте воплощения аполипопротеин может являться гетерогенной смесью аполипопротеинов, т. е. смесью двух и более различных аполипопротеинов. Воплощения гетерогенных смесей аполипопротеинов могут включать, например, смесь аполипопротеина из животного источника и аполипопротеина полусинтетического происхождения. В некоторых воплощениях гетерогенная смесь может включать, например, смесь АроА-Ι и АроА-Ι Мйапо. В некоторых воплощениях гетерогенная смесь может включать, например, смесь АроА-Ι Мйапо и АроА-Ι Рапк. Смеси, пригодные для применения в способах и композициях, согласно изобретению будут очевидны для специалиста в данной области.
Если аполипопротеин получен из природных источников, он может быть получен из растительного или животного источника. Если аполипопротеин получен из животного источника, аполипопротеин может происходить из любого биологического вида. В некоторых воплощениях аполипопротеин может быть получен из животного источника. В некоторых воплощениях аполипопротеин может быть получен из источника, полученного от человека. В предпочтительных воплощениях изобретения, аполипопротеин происходит из того же биологического вида, что и индивидуум, которому вводится аполипопротеин.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения целевой ген выбирают из группы, включающей ген фактора VII, Е§5, РС8К9, ТРХ2, ароВ, 8АА, ТТК, К8У, РЭСР β ген, ген ЕгЬ-В, ген 8гс, ген СРК, ген СКВ2, ген КА8, ген МЕКК, ген ΊΝΚ, ген КАР, ген Егк1/2, ген РСNА(р21), ген МΥВ, ген Л/У ген РО8, ген ВСЬ-2, ген циклина Ό, ген УЕСР, ген ЕСРК, ген циклина А, ген циклина Е, ген ΑΝΤ1, ген β-катенина, ген с-МЕТ, ген РКС, ген №КВ, ген 8ТАТ3, ген сурвивина, ген Ηογ2/Νοπ, ген топоизомеразы I, ген топоизомеразы II а, ген р73, ген р21 (ААИ/СШ), ген р27 (К1СР1), ген РРМШ, ген КА8, ген кавеолина I, ген МГВ I, ген МТАГ ген М68, мутации в генах опухолевых супрессоров, ген опухолевого супрессора р53 и их комбинации. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения целевой ген является геном, экспрессируемым в печени, например, геном фактора УП (РУН). Эффект на экспрессию целевого гена, например, гена РУН, оценивают измерением уровня РУН в биологической пробе, такой как сыворотка или образец ткани. Например, уровень РУН может быть определен в крови, например, согласно измерению путем количественного определения активности РУН. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения может оцениваться уровень мРНК в печени. В другом предпочтительном воплощении проводят по меньшей мере два типа оценки, например, одновременно проводят и оценку уровня белка (например, в крови), и измерение уровня мРНК (например, в печени).
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения агент является нуклеиновой кислотой, такой как двуцепочечная РНК (дцРНК).
В другом варианте воплощения настоящего изобретения нуклеиновая кислота-агент является одноцепочечной ДНК или РНК, или двуцепочечной ДНК или РНК, или гибридом ДНК-РНК. Например, двуцепочечная ДНК может быть структурным геном, геном, содержащим регуляторные и терминаторные области, или самореплицирующейся системой, такой как вирусная или плазмидная ДНК. Двуцепочечная РНК может являться, например, дцРНК или другим реагентом РНК-интерференции. Одноцепочечная нуклеиновая кислота может являться, например, антисмысловым олигонуклеотидом, рибозимом, микроРНК или триплекс-образующим олигонуклеотидом.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения в различных временных точках после введения кандидатного агента, биологическая проба, такая как проба жидкости, например, крови, плазмы или сыворотки, или образец ткани, такой как образец ткани печени, берут у испытуемого субъекта и испытывают на наличие эффекта агента на уровень экспрессии целевого белка или мРНК. В одном из особо предпочтительных воплощений, кандидатный агент является дцРНК, которая направлена против РУН, и биологическую пробу испытывают на наличие эффекта на уровни белка или мРНК фактора РУН. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения проводят количественное определение уровней содержания в плазме белка РУН, такое как с применением иммуногистохимического анализа или хромогенного анализа. В другом варианте воплощения настоящего изобретения уровни мРНК РУН в печени испытывают с применением количественного определения, такого как метод разветвленных зондов или нозерн-блоттинг или метод ОТ-ПЦР.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения агент, например, композиция, включающая улучшенную липидную композицию, оценивается на токсичность. В другом варианте воплощения настоящего изобретения может проводиться мониторинг модельного субъекта на наличие физиче- 13 028860
ских эффектов, таких как изменение массы или поведения в клетке.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения способ дополнительно включает воздействие агента, например, композиции, содержащей улучшенную липидную композицию, для дальнейшей оценки. Дальнейшая оценка может включать, например, (ί) повторение оценки, описанной выше, (ϊϊ) повторение оценки, описанной выше, с различным количеством животных или с разными дозами, или (ίίί) оценку другим способом, например, оценку на другом модельном животном, например, на нечеловекообразном примате.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения делается решение относительно того, включать или не включать агент и улучшенную липидную композицию в дальнейшие исследования, такие как клинические испытания, в зависимости от наблюдаемого эффекта кандидатного агента на уровни белка или мРНК в печени. Например, если наблюдается, что кандидатная дцРНК снижает уровни белка или мРНК по меньшей мере на 20, 30, 40, 50% или более, то агент можно рассматривать для участия в клинических испытаниях.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения делается решение относительно того, включать или не включать агент и улучшенную липидную композицию в фармацевтическую композицию, в зависимости от наблюдаемого эффекта кандидатного агента и аминолипида на уровни белка или мРНК в печени. Например, если наблюдается, что кандидатная дцРНК снижает уровни белка или мРНК по меньшей мере на 20, 30, 40, 50% или более, то агент можно рассматривать для участия в клинических испытаниях.
Другой особенностью является то, что изобретение предлагает способ оценки улучшенной липидной композиции на ее пригодность к доставке терапевтического агента в клетку. В некоторых вариантах воплощения изобретение предлагает способ оценки улучшенной липидной композиции на ее пригодность к доставке конструкции на основе РНК, например, дцРНК, направленного действия на ΡνΐΙ. Способ включает создание композиции, которая содержит дцРНК, направленного действия на ΡνΐΙ, и кандидатного аминолипида, введение композиции грызуну, например, мыши, оценку экспрессии ΡνΐΙ как функцию по меньшей мере одного показателя из уровня ΡνΐΙ в крови или уровня мРНК ΡνΐΙ в печени, что обеспечивает оценку кандидатного аминолипида. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения способ дополнительно включает сравнение экспрессии целевого гена с заранее выбранным референтным значением.
Композиции, которые включают липидсодержащие компоненты, такие как липосомы, более детально описаны ниже. Примеры агентов на основе нуклеиновых кислот включают двухцепочечную РНК, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК, иммуностимулирующие олигонуклеотиды или триплекс-образующие олигонуклеотиды. Эти агенты также более подробно описаны ниже.
"Алкил" означает имеющий линейную цепь или разветвленный, нециклический или циклический, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Примеры насыщенных, с линейной цепью, алкилов включают метил, этил, п-пропил, п-бутил, п-пентил, п-гексил и т. п.; а насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Примеры насыщенных циклических алкилов включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.; а ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и т. п.
"Алкенил" означает алкил, как определено выше, содержащий по меньшей мере одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и трансизомеры. Примеры имеющих линейную цепочку и разветвленных алкенилов включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2бутенил и т. п.
"Алкинил" означает любой алкил или алкенил, как определено выше, который дополнительно содержит по меньшей мере одну тройную связь между соседними атомами углерода. Примеры имеющих линейную цепочку и разветвленных алкинилов включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил и т.п.
"Ацил" означает любой алкил, алкенил или алкинил, где атом углерода в точке присоединения замещен оксо-группой, как определено ниже. Например, -С(=О)алкил, -С(=О)алкенил и -С(=О)алкинил являются ацильными группами.
Термин "арил" означает ароматическую моноциклическую, бициклическую или трициклическую систему колец углеводорода, где любой атом кольца может быть замещен. Примеры арильных остатков включают в качестве неограничивающих примеров фенил, нафтил, антраценил и пиренил.
"Гетероцикл" означает моноциклическое с количеством членов от 5 до 7, или бициклическое с количеством членов от 7 до 10, гетероциклическое кольцо, которое может быть насыщенным, ненасыщенным или ароматическим, и которое содержит от 1 до 2 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы могут быть необязательно окислены, и гетероатом азота может быть необязательно четвертичным, включая бициклические кольца, в которых любые из вышеуказанных гетероциклов сопряжены с бензольным кольцом. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, как определено ниже. Гете- 14 028860
роциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т.п.
Термины "необязательно замещенный алкил", "необязательно замещенный алкенил", "необязательно замещенный алкинил", "необязательно замещенный ацил" и "необязательно замещенный гетероцикл" означают, что при наличии замещения по меньшей мере один атом водорода заменен на заместитель. В случае оксо-заместителя (=0) замещены два атома водорода. В этом смысле, заместители включают оксо-группу, галоген, гетероцикл, -ΟΝ, -0КХ, -ЫКХКу, -ЫКХС(=0)Ку, -ЫКХ802Ку, -С(=0)КХ, -С(=0)0КХ, -С(=0)ЫКХКу, -80пКХ и -80пЫКХКу, где η равно 0, 1 или 2, КХ и Ку являются одинаковыми или разными и, независимо, являются атомом водорода, алкилом или гетероциклом, и каждый из названных алкильных или гетероциклических заместителей может быть дополнительно замещен одной или несколькими группами из оксо-группы, галогена, -ОН, -СК, алкила, -0КХ, гетероцикла, -ЫКХКу, -ЫКХС(=0)Ку, -ЫКХ802Ку, -С(=0)КХ, -С(=0)0КХ, -С(=0)ЫКХКу, -80пКХ и ^Ν^ΚΑ
Термин "гетероарил" означает ароматическую моноциклическую с 5-8 членами, бициклическую с 8-12 членами или трициклическую с 11-14 членами систему колец, имеющую 1-3 гетероатома, если является моноциклической, 1-6 гетероатомов, если является бициклической, или 1-9 гетероатомов, если является трициклической, при этом названные гетероатомы выбраны из О, Ν или 8 (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов Ν, О или 8, если является моноциклической, бициклической или трициклической, соответственно), при этом любой атом кольца может быть замещен. Гетероарильные группы, описанные в этом документе, также могут содержать сопряженные кольца, имеющие общую углерод-углеродную связь.
Термин "алкилгетероцикл" означает гетероарил, где по меньшей мере один из атомов кольца замещен алкилом, алкенилом или алкинилом.
Термин "замещенный" означает замену одного или нескольких радикалов водорода в данной структуре радикалом специфичного заместителя, включая в качестве неограничивающих примеров: галоген, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероциклил, тиол, алкилтио, оксо-группу, тиокси, арилтио, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, алкилсульфонил, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, алкокси, арилокси, аралкокси, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, галоалкил, амино-группу, трифторометил, циано-группу, нитро-группу, алкиламино, ариламино, алкиламиноалкил, ариламиноалкил, аминоалкиламино, гидрокси-группу, алкоксиалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил, ацил, аралкоксикарбонил, карбоновую кислоту, сульфоновую кислоту, сульфонил, фосфоновую кислоту, арил, гетероарил, гетероциклическую и алифатическую группу. При этом понимается, что заместитель может быть дополнительно замещенным.
"Галоген" означает фтор, хлор, бром и йод.
Термины "алкиламин" и "диалкиламин" означают радикалы -ЫН(алкил) и -Н(алкил)2 соответственно.
Термин "алкилфосфат" означает -0-Ρ(Ο')(Ο")-0-Κ. где ф' и ф" являются, каждый независимо, О, 8, Ν(Κ)2, необязательно замещенными алкилом или алкокси-группой; и Κ необязательно замещенный алкил, ω-аминоалкил или щ-(замещенный)аминоалкил.
Термин "алкилфосфоротиоат" означает алкилфосфат, где по меньшей мере один из ф' или ф" является 8.
Термин "алкилфосфонат" означает алкилфосфат, где по меньшей мере один из ф' или ф" является алкилом.
Термин "гидроксиалкил" означает радикал -О-алкил.
Термин "алкилгетероцикл" означает алкил, где по меньшей мере один метилен был заменен на гетероцикл.
Термин "ω-аминоалкил" означает радикал -алкил-ЫН2. И термин "щ-(замещенный)аминоалкил" означает ω-аминоалкил, где по меньшей мере один из атомов Н у Ν был заменен алкилом.
Термин "ω-фосфоалкил" означает -алкил-0-Р(Р')(Р")-0-К, где ф' и ф", каждый независимо, являются О или 8 и Κ необязательно замещенный алкил.
Термин "ω-тиофосфоалкил" означает ω-фосфоалкил, где по меньшей мере один из ф' или ф" является 8.
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения способы согласно изобретению могут требовать применения защитных групп. Методология защитных групп хорошо известна специалистам в данной области (см., например, РгоЮсИус Огоирк ίη 0тдашс 8уп1Ье515, Отееп, Т.^. с1 а1., \УПеу[ηΙαΓδοίοηοο, №ν Уогк С11у, 1999). В кратком изложении, защитные группы в контексте настоящего изобретения являются любой группой, которая снижает или избавляет от нежелательной реактивности функциональную группу. Защитная группа может быть добавлена к функциональной группе для маскирования ее реактивности во время определенных реакций, и после этого удаляется для высвобождения исходной функциональной группы. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения приме- 15 028860
няют "группу, защищающую спиртовую группу". "Группа, защищающая спиртовую группу" является любой группой, которая снижает или избавляет от нежелательной реактивности спиртовую функциональную группу. Защитные группы могут быть добавлены и удалены с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области.
Липидные частицы
Агенты и/или аминолипиды для испытания в модельном скрининге с применением клеток печени, описанном в этом документе, могут быть помещены в липидные частицы. Липидные частицы включают, в качестве неограничивающих примеров, липосомы. При использовании в этом документе липосома является структурой, имеющей липидосодержащие мембраны, заключающие водную внутреннюю область. Липосомы могут иметь одну или несколько липидных мембран. Изобретение предполагает как однослойные липосомы, которые называют одноламеллярными, так и многослойные липосомы, которые называют мультиламеллярными. При образовании комплекса с нуклеиновыми кислотами, липидные частицы могут также являться липоплексами, которые состоят из бислоев катионных липидов, размещенных как в сэндвиче между слоями ДНК, как описано, например, в Ре1дпег, δοίοηΙίΓίο Атепсап.
Липидные частицы могут дополнительно включать один или несколько дополнительных липидов и/или других компонентов, таких как холестерол. Другие липиды могут быть включены в композиции липосом с различными целями, такими как предотвращение окисления липидов или присоединение лигандов на поверхности липосомы. Любой из ряда липидов может присутствовать, включая амфипатические, нейтральные, катионные и анионные липиды. Такие липиды могут применяться поодиночке или в сочетании. Конкретные примеры дополнительных липидных компонентов, которые могут присутствовать, описаны ниже.
Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в липидной частице, включают стабилизирующие бислой компоненты, такие как полиамидные олигомеры (см., например, патент США № 6320017), пептиды, белки, детергенты, производные липидов, такие как соединенный с ПЭГ фосфатидилэтаноламин и конъюгированные с ПЭГ церамиды (см. патент США № 5885613). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения липидная частица включает агент направленного действия, такой как нацеливающий липид, описанный в этом документе.
Липидная частица может включать один или несколько из второго аминолипида или катионного липида, нейтрального липида, стерола и липид, выбранный для снижения агрегации липидных частиц во время их формирования, которое может быть результатом стерической стабилизации частиц, предотвращающей индуцируемую зарядами агрегацию при формировании.
При использовании в этом документе предполагается, что термин "катионный липид" включает липиды, которые имеют одну или две жирнокислотные или жирные алкильные цепи и аминосодержащую группу головки ( включая алкиламино или диалкиламино группу), которая может быть протонирована с образованием катионного липида при физиологическом рН. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения катионный липид называется "аминолипидом".
Другие катионные липиды могут включать липиды, имеющие другие варианты жирнокислотных групп и другие диалкиламиногруппы, включая такие, в которых заместители алкила различны (например, И-этил-И-метиламино-, Ы-пропил-Ы-этиламино- и т.п.) В целом липиды (например, катионный липид), имеющие менее насыщенные ацильные цепи, легче разделяются по размеру, в частности, когда комплексы разделяют по размеру в области менее 0,3 мкм, для целей стерилизации на фильтре. Катионные липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты с длинами углеродной цепи в диапазоне от С10 до С20, являются предпочтительными. Другие остовы могут применяться для разделения аминогруппы (например, аминогруппы катионного липида) и жирнокислотной или жирной алкильной части катионного липида. Пригодные остовы известны для специалиста в данной области.
В некоторых воплощениях катионные липиды содержат по меньшей мере одну способную к протонированию или депротонированию группу, такую, что липид положительно заряжен при рН, равном или ниже физиологического рН (например, рН 7,4), и является нейтральным при втором значении рН, предпочтительно равном или выше физиологического рН. Такие липиды также называют катионными липидами. Безусловно, понятно, что добавление или удаление протонов как функция от значения рН является равновесным процессом, и что упоминание заряженного или нейтрального липида относится к природе преобладающих видов и не требует, чтобы все липиды присутствовали в заряженной или нейтральной форме. Липиды, имеющие более одной способной к протонированию или депротонированию группы или являющиеся цвиттерионными, не исключены из применения в изобретении.
В некоторых воплощениях способные к протонированию липиды (т.е. катионные липиды) имеют рКа способной к протонированию группы в диапазоне от примерно 4 до примерно 11. Наиболее предпочтительные значения рКа составляют от примерно 4 до примерно 7, так как такие липиды будут находиться в катионной форме при более низких значениях рН на стадии получения композиции, в то же время частицы будут в основном (хотя и не полностью) иметь нейтральную поверхность при физиологическом рН примерно 7,4. Одним из преимуществ такого значения рКа является то, что, по меньшей мере, некоторые нуклеиновые кислоты, ассоциированные с внешней поверхностью частицы, будут терять электростатическое взаимодействие при физиологическом значении рН и будут удаляться под действием
- 16 028860
простого диализа; существенно уменьшая, таким образом, подверженность частиц клиренсу.
Примеры липидов, которые снижают агрегацию частиц во время формирования включают полиэтиленгликоль (ПЭГ)-модифицированные липиды, моносиалоганглиозиды СМ1 и полиамидные олигомеры ("ПАО"), как описано в патенте США № 6320017). Другие соединения с незаряженными, гидрофильными, создающими стерические барьеры остатками, которые предотвращают агрегацию во время получения композиции, такие как ПЭГ, СМ1 или АТТА, также могут быть присоединены к липидам для применения в способах и композициях согласно изобретению. АТТА-липиды описаны, например, в патенте США № 6320017, и конъюгаты ПЭГ-липидов описаны, например, в патентах США № 5820873, 5534499 и 5885613. В типичном случае, концентрация липидного компонента, выбранного для снижения агрегации, составляет примерно от 1 до 15% (в мольных процентах липида).
Примерами липидов, которые снижают агрегацию и/или пригодны для конъюгации с агентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, которые могут применяться в модельном скрининге с применением клеток печени, служат полиэтиленгликоль (ПЭГ)-модифицированные липиды, моносиалоганглиозиды СМ1, и полиамидные олигомеры ("ПАО"), такие как описаны в патенте США № 6320017. Другие соединения с незаряженными, гидрофильными, создающими стерические барьеры остатками, которые предотвращают агрегацию во время получения композиции, такие как ПЭГ, СМ1 или АТТА, также могут быть присоединены к липидам для применения в способах и композициях согласно изобретению. АТТАлипиды описаны, например, в патенте США № 6320017, и конъюгаты ПЭГ-липидов описаны, например, в патентах США № 5820873, 5534499 и 5885613. В типичном случае, концентрация липидного компонента, выбранного для снижения агрегации, составляет примерно от 1 до 15% (в мольных процентах липида).
Конкретные примеры ПЭГ-модифицированных липидов (или липидно-полиоксиэтиленовых конъюгатов), которые полезны для изобретения, могут иметь различные "заякоривающие" липидные части для размещения ПЭГ -части на поверхности липидной везикулы. Примеры пригодных ПЭГ модифицированных липидов включают ПЭГ-модифицированный фосфатидилэтаноламин и фосфатидную кислоту, конъюгаты ПЭГ с церамидами (например, ПЭГ-СегСи или ПЭГ-СегС20), которые описаны в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке υδδΝ 08/486214, включенной в этот документ в качестве ссылки, ПЭГ-модифицированные диалкиламины и ПЭГ-модифицированные 1,2диацилоксипропан-3-амины. Наиболее предпочтительными являются ПЭГ-модифицированные диацилглицерол и диалкилглицерол. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения суммарное содержание в мольных процентах ПЭГ-липидов в составе частицы составляет примерно 1,5 мольных процента. Например, когда в состав частицы входит множество ПЭГ-липидов, описанных в этом документе, таких как ПЭГ-модифицированные липиды, описанные выше, и содержащие ПЭГ липиды направленного действия суммарное количество ПЭГ-содержащих липидов, взятых вместе, составляет примерно 1,5 мольных процента.
В вариантах воплощения, где стерически объемные остатки, такие как ПЭГ или АТТА, конъюгированы с липидным якорем, выбор липидного якоря зависит от того, какой тип ассоциации с липидной частицей должен иметь конъюгат. Хорошо известно, что теПЭГ (мол. масса 2000)диастеароилфосфагидилэтаноламин (ПЭГ-ДСФЭ) остается в ассоциации с липосомой вплоть до того момента, как частица удаляется из циркуляции, возможно, в течение периода, исчисляемого днями. Другие конъюгаты, такие как ПЭГ-СегС20, имеют схожую способность сохранять ассоциацию. Однако ПЭГ СетСм быстро удаляется из композиции при воздействии сыворотки, с Т1/2 менее 60 мин, согласно ряду исследований с количественным определением. Как наглядно показано в заявке на патент США 8Ν 08/486214, по меньшей мере три параметра влияют на скорость обмена: длина ацильной цепи, степень насыщения ацильной цепи и размер создающей стерический барьер группы головки липида. Соединения, имеющие пригодные варианты этих характеристик, могут быть полезны для изобретения. Для некоторых терапевтических применений может быть предпочтительно, чтобы ПЭГ-модифицированный липид быстро удалялся из липидной частицы нуклеиновой кислоты ίη νίνο и, следовательно, ПЭГмодифицированный липид будет обладать относительно короткими заякоривающими липидными частями. В других терапевтических применениях может быть предпочтительно, чтобы липидная частица нуклеиновой кислоты обладала более длительным временем сохранения в плазме кровеносной системы и, следовательно, ПЭГ-модифицированный липид будет обладать относительно более длинными заякоривающими липидными частями. Примеры заякоривающих липидных частей включают таковые с длиной от примерно С14 до примерно С22, предпочтительно от примерно С14 до примерно С16. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения остаток ПЭГ, например, тПЭГ -ΝΗ2, имеет размер примерно 1000, 2000, 5000, 10000, 15000 или 20000 Да.
Следует отметить, что соединения, предотвращающие агрегацию, не обязательно требуют конъюгации с липидом для правильного функционирования. Присутствие свободного ПЭГ или свободного АТТА в растворе может быть достаточным для предотвращения агрегации. Если частицы стабильны после получения композиции, ПЭГ или АТТА могут быть удалены с помощью диализа перед введением субъекту.
Нейтральные липиды, если они присутствуют в липидной частице, могут являться любым из ряда
- 17 028860
типов липидов, которые существуют либо в незаряженной, либо в нейтральной цвиттерионной форме при физиологическом значении рН. Такие липиды включают, например, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, дигидросфингомиелин, кефалин и цереброзиды. Выбор нейтральных липидов для применения в частицах, описанных в этом документе, в общем случае зависит от соображений, касающихся, например, размера липосом и стабильности липосом в кровотоке. Предпочтительно компонент, представленный нейтральным липидом, является липидом, имеющим две ацильные группы (т.е. диацилфосфатидилхолином и диацилфосфатидилэтаноламином). Липиды, имеющие различные группы ацильных цепей с разной длиной цепи и степенью насыщенности, доступны или могут быть выделены или синтезированы с применением хорошо известных способов. В одной группе вариантов воплощения являются предпочтительными липиды, содержащие насыщенные жирные кислоты с длинами углеродной цепи в диапазоне от С14 до С22. В другой группе вариантов воплощения применяют липиды, содержащие моно- или диненасыщенные жирные кислоты с длинами углеродной цепи в диапазоне от С14 до С22. Дополнительно, могут применяться липиды, содержащие смеси насыщенных и ненасыщенных жирнокислотных цепей. Предпочтительно нейтральные липиды, применяемые в изобретении, являются ДОФЭ, ДСФХ, ДПФХ, ПОФХ или любым родственным фосфатидилхолином. Нейтральные липиды, применяемые в настоящем изобретении, могут также состоять из сфингомиелина, дигидросфингомиелина или фосфолипидов с другими группами головки, такими как серии и инозитол.
Стерольный компонент липидной смеси, если он присутствует, может являться любым из стеролов, стандартно применяемых в области получения липосом, липидных везикул или липидных частиц. Предпочтительным стеролом является холестерол.
Другие катионные липиды, несущие суммарный положительный заряд при близких к физиологическому значениях рН, в дополнение к таковым, специально описанным выше, также могут быть включены в липидные частицы согласно изобретению. Такие катионные липиды включают в качестве неограничивающих примеров Н'Н-диолеил-Н'Ы-диметиламмония хлорид ("ОООАС"): ^(2,3-диолеилокси)пропилΝ,Ν-Ν-триэтиламмония хлорид ("ΌΟΤΜΑ"); КН-дистеарил-КН-диметиламмония бромид ("ΌΌΑΒ"); Ν(2,3-диолеоилокси)пропил-Х^^триметиламмония хлорид ("ΌΟΤΑΡ"); 1,2-диолеилокси-3триметиламинопропана хлорид ("ΌΟΤΑΡ.С1"); 33-^-(№,№-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерол ("ОС-С1ю1"), ^(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-Н-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-Ы^-диметиламмония трифторацетат ("ΌΟδΡΑ"), диоктадециламидоглицил карбоксиспермин ("^ΟСδ"), 1,2-диолеоил-8η-3фосфоэтаноламин ("ДОФЭ"), 1,2-диолеоил-3-диметиламмония пропан ("ΌΟΌΑΡ"), ^^диметил-(2,3диолеилокси)пропиламин ("ΌΟΌΜΑ"), и ^(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-Н^-диметил-Ыгидроксиэтиламмония бромид ("ΌΜΚΙΕ"). Дополнительно, может быть применен ряд коммерчески доступных препаратов катионных липидов, таких как, например, υΡΟΡΈί','ΤΙΝ (содержащий ΌΟΤΜΑ и ДОФЭ, поставляемый ΏΒ^/ΒΚΌ) и ^IΡΟΡΕСΤΑΜINΕ (содержащий ΌΟδΡΑ и ДОФЭ, поставляемый ^Βί'.Ό/ΒΡΡ). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения катионный липид является аминолипидом.
Анионные липиды, пригодные для применения в липидных частицах, согласно изобретению включают в качестве неограничивающих примеров фосфатидилглицерин, кардиолипин, диацилфосфатидилсерин, диацилфосфатидную кислоту, Ν-додеканоил фосфатидилэтаноламин, Ν-сукцинил фосфатидилэтаноламин, Ν-глутарил фосфатидилэтаноламин, лизилфосфатидилглицерин и другие анионные модифицированные группы, соединенные с нейтральными липидами.
В большом числе вариантов воплощения в липидные частицы согласно изобретению включены амфипатические липиды. Термин "амфипатические липиды" означает любой пригодный материал, где гидрофобная часть липидного материала ориентирована внутрь гидрофобной фазы, а гидрофильная часть ориентирована в направлении водной фазы. Такие соединения включают в качестве неограничивающих примеров фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды. Примеры фосфолипидов включают сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту, пальмитоилолеоилфосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), диолеоилфосфатидилхолин (ДОФХ), дистеароилфосфатидилхолин (ДСФХ), димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ) или дилинолеоилфосфатидилхолин (ДЛФХ). Также могут применяться другие соединения, не содержащие фосфора, такие как сфинголипиды, члены семейства гликосфинголипидов, диацилглицерины и β-ацилоксикислоты. Дополнительно, такие амфипатические липиды могут быть легко смешаны с другими липидами, такими как триглицериды и стеролы.
Для включения в липидные частицы согласно изобретению также пригодны липиды, обусловливающие программируемое слияние. Такие липидные частицы имеют слабую склонность к слиянию с клеточными мембранами и высвобождению своей полезной нагрузки до наступления определенного сигнального события. Это позволяет достичь более равномерного распределения липидных частиц после инъекции в организм или пораженный участок перед тем, как они начнут сливаться с клетками. Сигнальным событием может быть, например, изменение рН, температуры, ионного окружения или время. В последнем случае компонент, задерживающий слияние, или "маскирующий" компонент, такой как конъюгат АТТА-липида или конъюгат ПЭГ-липида, может просто удаляться в результате обмена с мем- 18 028860
браны липидной частицы с течением времени. Примеры заякоривающих липидных частей включают таковые с длиной от примерно С14 до примерно С22, предпочтительно от примерно С14 до примерно С16. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения остаток ПЭГ, например, тПЭГ -Ν42, имеет размер примерно 1000, 2000, 5000, 10000, 15000 или 20000 Да.
К моменту времени, когда липидная частица должным образом распределяется в организме, она теряет существенный маскирующий агент, становясь, таким образом, фузогенной. В случае других сигнальных событий, желательно выбирать сигнал, который ассоциирован с пораженным участком или целевой клеткой, такой как повышение температуры в месте воспаления.
Липидная частица, конъюгированная с агентом, представленным нуклеиновой кислотой, может также включать остаток направленного действия, например, остаток направленного действия, специфичный к типу клеток или ткани. Осуществление направленного действия липидных частиц с применением различных остатков направленного действия, таких как лиганды, поверхностные рецепторы клеток, гликопротеины, витамины (например, рибофлавин) и моноклональные антитела, было описано ранее (см., например, патенты США № 4957773 и 4603044). Примеры остатков направленного действия включают липид направленного действия, такой как нацеливающий липид, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения липид направленного действия является Оа1NАс, содержащим липид направленное действие, таким как ОаВДАсЗ-ДСГ и ОаШАсЗ-ПЭГ-ДСГ, как описано в этом документе. Остатки направленного действия могут включать целый белок или его фрагменты. Механизмы направленного действия в общем случае требуют, чтобы агенты направленного действия были расположены на поверхности липидной частицы таким образом, чтобы остаток направленного действия был доступен для взаимодействия с целью, например, рецептором клеточной поверхности. Целый ряд различных агентов направленного действия и способов известны и доступны специалистам в данной области, включая таковые, описанные, например, в Зарга, Р. апй А11еп, Т.М., Ргод. Ыр1Й Кек. 42(5):439-62 (2003); и АЬга, К.М. е1 а1., 1. Ырокоте Кек. 12:1-3 (2002).
Было предложено применение для реализации направленного действия липидных частиц, т.е. липосом, чья поверхность покрыта гидрофильными полимерными цепями, такими как полиэтиленгликолевые (ПЭГ) цепи (А11еп, е1 а1., ВюсЫтюа е1 Вюрйукюа Ас1а 1237: 99-108 (1995); ОеРгеек, е1 а1., 1оигпа1 о£ 1йе Атепсап СйетЪйу Зоае1у 118: 6101-6104 (1996); В1ите, е1 а1., ВюсЫтса е1 Вюрйукюа Ас1а 1149: 180184 (1993); КПЬапоу. е1 а1., 1оита1 о£ Ырокоте Кекеагсй 2: 321-334 (1992); ИЗ Ра1еп1 № 5013556; 2айркку, Вюсопщда1е Сйетюйу 4: 296-299 (1993); 2айркку, РЕВЗ Ьейегк 353: 71-74 (1994); 2айркку, т З1еа11й Ырокотек Сйар1ег 9 (Ьаыс апй Магйп, Ейк) СКС Ргекк, Воса Ка1оп Р1 (1995). В одном из способов лиганд, такой как антитело, служащий для направленного действия липидной частицы, соединен с полярной группой головки липидов, образующих липидную частицу. В другом способе лиганд направленного действия присоединен к дистальным концам ПЭГ-цепочек, образующих гидрофильную полимерную оболочку (КПЬапоу, е1 а1., 1оита1 о£ Ырокоте Кекеагсй 2: 321-334 (1992); Кйройп е1 а1., РЕВЗ Ьейегк 388: 115-118 (1996)).
Могут быть применены стандартные способы присоединения целевых агентов. Например, могут применяться фосфатидилэтаноламин, который может быть активирован для присоединения целевых агентов, или производные липофильные соединения, такие как производное липида блеомицин. Липосомы направленного действия с помощью антител могут быть сконструированы с применением, например, липосом, в которые внедрен белок А (см. КеппеЫеп, е1 а1., 1. Вю. Сйет., 265:16337-16342 (1990) апй ЬеопеШ, е1 а1., Ргос. №й1. Асай. За. (ИЗА), 87:2448-2451 (1990)). Другие примеры конъюгации с антителами описаны в патенте США № 6027726, идеи которого включены сюда в качестве ссылок. Примеры остатков направленного действия также могут включать другие белки, специфичные к клеточным компонентам, в том числе к антигенам, ассоциированным с новообразованиями и опухолями. Белки, применяемые в качестве остатков направленного действия, могут быть присоединены к липосомам ковалентными связями (см. Неа1й, Сονа1еηΐ Айасйтеп! о£ Рго1етк 1о Ырокотек, 149 Ме1йойк ш Еп/уто1оду 111-119 (Асайетю Ргекк, Ыс. 1987)). Другие способы направленного действия включают биотин-авидиновую систему.
В одном из примеров воплощения настоящего изобретения липидная частица содержит смесь катионного липида по настоящему изобретению, нейтральных липидов (отличных от катионного липида), стерола (например, холестерола) и ПЭГ-модифицированного липида (например, ПЭГ-ДМГ или ПЭГсЭМА). В некоторых воплощениях липидная смесь состоит из или в существенной степени состоит из катионного липида по настоящему изобретению, нейтрального липида, холестерола и ПЭГмодифицированного липида. В дополнительных предпочтительных воплощениях, липидная частица состоит из или в существенной степени состоит из вышеуказанной липидной смеси с молярными соотношениями примерно 20-70% ПЫп-М-С3-ЭМА:5-45% нейтрального липида:20-55% холестерола:0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида.
В некоторых вариантах воплощения липидная частица состоит из или в существенной степени состоит из ПЫп-М-СЗ-ЭМА, ДСФХ, холестерола и либо ПЭГ-ДМГ, либо ПЭГ-сЭМА, например, в молярном соотношении примерно 20-60% ПЫп-М-С3-ЭМА:5-25% ДСФХ:25-55% холестерола:0,5-15% ПЭГДМГ или ПЭГ-сЭМА. В некоторых вариантах воплощения молярное соотношение липидов составляет примерно 40/10/40/10 (мол.% ПЫп-М-СЗ-ЭМА/ДСФХ/Холестерол/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-сЭМА),
- 19 028860
35/15/40/10 (мол.% ПЬш-М-С3-ПМА/ДСФХ/Холестерол/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-сЭМА) или 52/13/30/5 (мол.% Оип-М-С.'3-ОМА/ДС.ФХ/Холестерол/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-сОМА).
В другой группе вариантов воплощения нейтральный липид, ДСФХ, в этих композициях заменен на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или §М.
Композиции и составы липидных частиц, содержащих терапевтический агент
Изобретение включает композиции, содержащие липидную частицу согласно изобретению и активный агент, при этом активный агент ассоциирован с липидной частицей. В некоторых вариантах воплощения активный агент является терапевтическим агентом. В некоторых вариантах воплощения активный агент инкапсулирован внутри водной внутренней области липидной частицы. В других вариантах воплощения активный агент находится в одном или нескольких липидных слоях липидной частицы. В других вариантах воплощения активный агент связан с внешней или внутренней поверхностью липидного слоя липидной частицы.
"Полностью инкапсулированный" при использовании в этом документе означает, что нуклеиновая кислота в частицах не подвергается существенной деградации после воздействия сыворотки или в ходе анализа с применением нуклеаз, что вызвало бы существенную деградацию свободной ДНК. В полностью инкапсулированной системе, предпочтительно менее 25% нуклеиновой кислоты в частице деградирует в условиях обработки, при которых в норме было бы деградировано 100% свободной нуклеиновой кислоты, более предпочтительно - менее 10% и наиболее предпочтительно - менее 5% нуклеиновой кислоты в частице деградирует. В соответствии с другим вариантом, полное инкапсулирование может быть определено анализом с помощью ОДдгееи®. Ойдгееп® - это сверхчувствительный флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот для количественного определения олигонуклеотидов и одноцепочечной ДНК в растворе (поставляемый фирмой 1пуПгодеп Согрогайоп, Карлсбад, Калифорния, США). Полное инкапсулирование также предполагает, что частицы устойчивы к действию сыворотки, т.е. что они не претерпевают быструю разборку на компоненты после введения ΐπ νίνο.
Активные агенты, при использовании в этом документе, включают любую молекулу или соединение, способные оказывать требуемый эффект на клетку, ткань, орган или субъект. Такие эффекты могут быть, например, биологическими, физиологическими или косметическими. Активные агенты могут являться молекулой или соединением любого типа, включая, например, нуклеиновые кислоты, пептиды и полипептиды, в том числе, например, антитела, такие как, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, фрагменты антител; гуманизированные антитела, рекомбинантные антитела, рекомбинантные антитела человека и антитела РпшаО/еТ™. цитокины, факторы роста, апоптотические факторы, факторы, индуцирующие дифференцировку, поверхностные рецепторы клеток и их лиганды; гормоны; и малые молекулы, в том числе малые органические молекулы или соединения.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения активный агент является терапевтическим агентом, или его солью или производным. Производные терапевтических агентов могут быть терапевтически активными сами, или они могут являться пролекарствами, которые становятся активными после дополнительной модификации. Таким образом, в одном из вариантов воплощения производное терапевтического агента сохраняет часть или всю терапевтическую активность, по сравнению с немодифицированным агентом, а в другом варианте воплощения производное терапевтического агента не обладает терапевтической активностью.
В различных вариантах воплощения терапевтические агенты включают любой терапевтически эффективный агент или лекарственное средство, такой как противовоспалительные соединения, антидепрессанты, стимуляторы, анальгетики, антибиотики, противозачаточный препарат, жаропонижающие средства, сосудорасширяющие средства, анти-ангиогенные средства, цитоваскулярные агенты, ингибиторы передачи сигнала, кардиоваскулярные лекарственные препараты, например, антиаритмические агенты, сосудосуживающие средства, гормоны и стероиды.
В некоторых воплощениях терапевтический агент является онкологическим лекарственным препаратом, который также может называться противоопухолевым лекарственным препаратом, противораковым лекарственным препаратом, препаратом для лечения опухолей, противонеопластическим лекарственным препаратом и т.п. Примерами онкологических лекарственных препаратов, которые могут применяться в соответствии с изобретением, включают в качестве неограничивающих примеров адриамицин, алкеран, аллопуринол, алтретамин, амифостин, анастрозол, агаС, триоксид мышьяка, азатиоприн, бексаротен, ЫСЫИ, блеомицин, бусульфан внутривенно, бусульфан перорально, капецитабин (Кселода), карбоплатин, кармустин, ССЫИ, целекоксиб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклоспорин А, цитарабин, цитозина арабинозид, даунорубицин, цитоксан, даунорубицин, дексаметазон, дексразоксан, додетаксел, доксорубицин, доксорубицин, ОТ1С, эпирубицин, эстрамустин, этопозида фосфат, этопозид и ΥΡ-16, эксеместан, РК506, флударабин, фторурацил, 5-РИ, гемцитабин (Гемзар), гемтузумабозогамицин, гозерелина ацетат, гидреа, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иматиниба мезилат, интерферон, иринотекан (Камптостар, СРТ-111), летрозол, лейковорин, лейстатин, лейпролид, левамизол, литретиноин, мегастрол, мелфалан, Ь-РАМ, месну, метотрексат, метоксален, митрамицин, митомицин, митоксантрон, азотистый иприт, паклитаксел, памидронат, пегадемазу, пентостатин, натрия порфи- 20 028860
мер, преднизон, ритуксан, стрептозоцин, 8Т1-571, тамоксифен, таксотер, темозоламид, тенипозид, УМ26, топотекан (Гикамтин), торемифен, третиноин, АТРА, валрубицин, велбан, винбластин, винкристин, УР 16 и винорелбин. Другими примерами онкологических лекарственных препаратов, которые могут применяться в соответствии с изобретением, являются эллиптицин и аналоги или производные эллиптицина, эпотилоны, ингибиторы внутриклеточных киназ и камптотецины.
Липидонуклеиновые кислотные частицы
В некоторых воплощениях липидные частицы согласно изобретению ассоциированы с нуклеиновой кислотой с образованием липидонуклеиновой кислотной частицы. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота полностью инкапсулирована в липидной частице. Подразумевается, что, при использовании в этом документе, термин "нуклеиновая кислота" включает любой олигонуклеотид или полинуклеотид. Фрагменты, содержащие до 50 нуклеотидов, обычно называют олигонуклеотидами, а более длинные фрагменты называют полинуклеотидами. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды согласно изобретению имеют длину 20-50 нуклеотидов.
В контексте настоящего изобретения термины "полинуклеотид" и "олигонуклеотид" относятся к полимеру или олигомеру нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящему из природного происхождения оснований, сахаров и межсахарных (остовных) связей. Термины "полинуклеотид" и "олигонуклеотид" также включают полимеры или олигомеры, содержащие мономеры неприродного происхождения или их части, с функциональным сходством. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто имеют превосходство над нативными формами благодаря своим свойствам, таким как, например, более интенсивное поглощение клетками и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды относят к дезоксирибоолигонуклеотидам или рибоолигонуклеотидам. Дезоксирибоолигонуклеотид состоит из 5-углеродного сахара, называемого дезоксирибозой, ковалентно соединенного с фосфатом в положениях 5'- и 3'-углеродных атомов сахара с образованием чередующегося неразветвленного полимера. Рибоолигонуклеотид состоит из похожей повторяющейся структуры, где 5углеродный сахар представлен рибозой.
Нуклеиновая кислота, присутствующая в липидонуклеиновой частице в соответствии с настоящим изобретением, включает любую известную форму нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты, применяемые в этом изобретении, могут быть одноцепочечной ДНК или РНК, или двуцепочечной ДНК или РНК, или гибридом ДНК-РНК. Примеры двуцепочечной ДНК включают структурные гены, гены, содержащие контрольные и терминаторные области и самореплицирующиеся системы, такие как вирусная или плазмидная ДНК. Примеры двуцепочечной РНК включают з1РНК и другие реагенты РНК интерференции. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК и триплекс-образующие олигонуклеотиды.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут иметь различную длину, в основном в зависимости от конкретной формы нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых воплощениях, плазмиды или гены могут иметь длину от 1000 до 100000 нуклеотидных остатков. В некоторых воплощениях длина олигонуклеотидов может варьировать от примерно 10 до 100 нуклеотидов. В различных родственных вариантах воплощения олигонуклеотиды, как одноцепочечные, так и двуцепочечные и трехцепочечные, могут иметь длину в диапазоне от примерно 10 до примерно 50 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 50 нуклеотидов, от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 30 нуклеотидов в длину.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид (или его цепь) согласно изобретению специфично гибридизуется с целевым полинуклеотидом или является комплементарным ему. "Специфично гибридизуется" и "комплементарен" - это термины, которые применяются для указания на существенную степень комплементарности, такую что происходит стабильное и специфичное связывание между ДНК- или РНК-мишенью и олигонуклеотидом. При этом понимается, что олигонуклеотид не обязательно должен быть на 100% комплементарен нуклеотидной последовательности своей мишени, чтобы быть способным к специфичной гибридизации. Олигонуклеотид способен к специфичной гибридизации, когда связывание олигонуклеотида с мишенью препятствует нормальной функции целевой молекулы и вызывает потерю ее полезной функции или экспрессии, и имеется существенная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифичного связывания олигонуклеотида с нецелевыми последовательностями в условиях, в которых требуется специфичное связывание, т.е. в физиологических условиях в случае анализа ш νί\Ό или терапевтического лечения, или, в случае анализа ш νί!ΐΌ, в условиях, в которых такой анализ проводится. Таким образом, в других вариантах воплощения данный олигонуклеотид включает 1, 2 или 3 замены оснований, по сравнению с областью гена или последовательности мРНК, которая является мишенью, или с которой он специфично гибридизуется.
Нуклеиновые кислоты, участвующие в РНК-интерференции
В некоторых вариантах воплощения липидонуклеиновые частицы согласно изобретению ассоциированы с молекулами, участвующими в РНК-интерференции (РНК1). Способы, включающие РНКинтереференцию с применением молекул, участвующих в РНК1, могут применяться для нарушения экспрессии рассматриваемого гена или полинуклеотида. За последние 5 лет малые интерферирующие РНК (з1РНК) в существенной степени заместили антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды и рибозимы в
- 21 028860
качестве следующего поколения разрабатываемых лекарственных препаратов в виде олигонуклеотидов, направленного действия. 51 РНК являются РНК-дуплексами, в норме имеющими длину 21-30 нуклеотидов, которые могут ассоциировать с цитоплазматическим мультибелковым комплексом, известным как индуцируемый РНК1 комплекс сайленсинга (К18С). К18С в связи с 51РНК опосредует деградацию гомологичных транскриптов мРНК, таким образом, 51РНК может быть сконструирована так, чтобы подавлять экспрессию белка с высокой специфичностью. В отличие от других технологий, использующих антисмысловые нуклеиновые кислоты, 51РНК функционируют посредством природного механизма, вовлеченного в контроль экспрессии генов с помощью некодирующих РНК. Считается, что это является причиной того, что их активность является более сильной ίη νίΐτο и ίη νίνο, чем у антисмысловых олигодезоксирибонуклеотидов или рибозимов. Различные реагенты, участвующие в РНК1, включая 81РНК, направленные на клинически значимые мишени, находятся в настоящее время в фармацевтической разработке, как описано, например, в бе Роидего11е8, А. с1 а1., №Диге Реу1е\У5 6:443-453 (2007).
Хотя первыми описанными молекулами, участвующими в РНК1, были гибриды РНК: РНК, содержавшие РНК как в качестве смысловой цепи, так и в качестве антисмысловой цепи, к настоящему времени было показано, что гибриды смысловая ДНК:антисмысловая РНК, гибриды смысловая РНК:антисмысловая ДНК и гибриды ДНК:ДНК способны опосредовать РНК| (ЬашЪегЮп, ί.δ. апб СНгйбап, А.Т. (2003), Мо1еси1аг Вю1есЬпо1оду 24:111-119). Таким образом, изобретение включает применение молекул, участвующих в РНК1, содержащих любой из этих различных типов двуцепочечных молекул. Кроме того, при этом понимается, что молекулы, участвующие в РНК1, могут применяться и быть внедрены в клетку в различных формах. Соответственно, при использовании в этом документе, молекулы, участвующие в РНК1, включают любую и все молекулы, способные индуцировать РНКг-ответ в клетках, включая, в качестве неограничивающих примеров, двуцепочечные полинуклеотиды, содержащие две разные цепи, т.е. смысловую цепь и антисмысловую цепь, например, малая интерферирующая РНК (81РНК); полинуклеотиды, содержащие шпилечную петлю из комплементарных последовательностей, которые образуют двуцепочечную область, например, молекулы кЬРНКг, и экспрессионные векторы, которые экспрессируют один или несколько полинуклеотидов, способных формировать двуцепочечные полинуклеотиды сами по себе или в комбинации с другим полинуклеотидом.
"Соединение одноцепочечной 81РНК" при использовании в этом документе означает соединение 81РНК, состоящее из одной молекулы. Оно может включать дуплексные области, образованные внутрицепочечным спариванием, например, это может быть структура типа шпильки или "ручка сковороды", или такая структура может содержаться в соединении. Соединения одноцепочечных 51РНК могут быть антисмысловыми по отношению к целевой молекуле.
Соединение одноцепочечной 51РНК может иметь длину, достаточную для входа в Ш§С и участия в опосредованном комплексом К18С расщеплении целевой мРНК. Соединение одноцепочечной 51РНК имеет длину по меньшей мере 14, а в других вариантах воплощения по меньшей мере 15, 20, 25, 29, 35, 40 или 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах воплощения оно имеет длину менее 200, 100 или 60 нуклеотидов.
Соединения шпилечных кьРНК будут иметь дуплексный участок, равный или не менее 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 или 25 пар нуклеотидов. Дуплексный участок может быть равным или меньше по длине, чем 200, 100 или 50. В некоторых воплощениях диапазон размеров дуплексного участка составляет в длину 15-30, от 17 до 23, от 19 до 23, и от 19 до 21 пар нуклеотидов. Шпилька может иметь одноцепочечный "липкий" конец или терминальный неспаренный участок. В некоторых воплощениях "липкие" концы имеют длину 2-3 нуклеотида. В некоторых вариантах воплощения "липкий" конец находится на смысловой стороне шпильки, а в некоторых вариантах воплощения - на антисмысловой стороне шпильки.
"Соединение двуцепочечной 51 РНК" при использовании в этом документе означает соединение мРНК. которое содержит более одной, а в некоторых случаях две, цепи, в которых в результате межцепочечной гибридизации может образоваться область с дуплексной структурой.
Антисмысловая цепь соединения двуцепочечной мРНК может быть по длине равна или не менее 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 или 60 нуклеотидов. Она может быть равна или меньше по длине, чем 200, 100 или 50 нуклеотидов. Диапазон размеров может составлять от 17 до 25, от 19 до 23, и от 19 до 21 нуклеотида в длину. При использовании в этом документе, термин "антисмысловая цепь" означает цепь соединения 81РНК, которая в существенной мере комплементарна целевой молекуле, например, целевой РНК.
Смысловая цепь соединения двуцепочечной мРНК может быть по длине равна или не менее 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 или 60 нуклеотидов. Она может быть равна или меньше по длине, чем 200, 100 или 50 нуклеотидов. Диапазон размеров может составлять от 17 до 25, от 19 до 23 и от 19 до 21 нуклеотида в длину.
Двуцепочечная часть соединения двуцепочечной мРНК может быть по длине равна или не менее 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40 или 60 пар нуклеотидов. Она может быть равна или меньше по длине, чем 200, 100 или 50 пар нуклеотидов. Диапазон размеров может составлять 15-30, от 17 до 23, от 19 до 23 и от 19 до 21 пар нуклеотидов в длину.
- 22 028860
Во многих вариантах воплощения соединение 81РНК имеет существенную длину таким образом, что оно может расщепляться эндогенными молекулами, например, Э|сег. с образованием меньших соединений 81РНК, например, агентов чРНК.
Смысловая и антисмысловая цепи могут быть выбраны таким образом, что соединение двуцепочечной 81РНК будет включать одноцепочечную или неспаренную область на одном или на обоих концах молекулы. Таким образом, двуцепочечное соединение чРНК может содержать смысловую и антисмысловую цепи, спаренные таким образом, что образуется "липкий" конец, например, один или два 5' или 3' "липких" конца, или 3' "липкий" конец длиной 1-3 нуклеотида. Образование "липких" концов может быть результатом того, что одна цепь длиннее, чем другая, или результатом того, что две цепи одинаковой длины смещены друг относительно друга. В некоторых вариантах воплощения будет присутствовать по меньшей мере один 3' "липкий" конец.
В одном из вариантов воплощения оба конца молекулы 81РНК будут иметь 3' "липкий" конец. В некоторых вариантах воплощения "липкий" конец имеет длину 2 нуклеотида.
В некоторых воплощениях длина дуплексной области составляет от 15 до 30 или 18, 19, 20, 21, 22 и 23 нуклеотида в длину, например, в диапазоне соединений 881РНК, обсужденных выше. Соединения 881РНК могут напоминать по длине и структуре природные процессированные Эюсг продукты, полученные из длинных Й81РНК. Варианты воплощения, в которых две цепи соединения 881РНК соединены, например, ковалентно соединены, также включены в изобретение. Шпилька или другие одноцепочечные структуры, обеспечивающие наличие требуемой двуцепочечной области, и 3' "липкий" конец, также находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Соединения 81РНК, описанные в этом документе, включая соединения двуцепочечных 81РНК и соединения одноцепочечных 81РНК, могут опосредовать сайленсинг целевой РНК, например, мРНК, например, транскрипта гена, кодирующего белок. Для удобства такие мРНК также называются в этом документе мРНК, предназначенные для сайленсинга. Такой ген также называется целевым геном. В общем случае, РНК, предназначенная для сайленсинга, является продуктом эндогенного гена или гена патогенного организма. Кроме того, РНК, отличные от мРНК, например, тРНК и вирусные РНК, также могут являться мишенями.
При использовании в этом документе фраза "опосредует РНЮ" относится к способности вызывать сиквенс-специфичный сайленсинг целевой РНК. Не следуя какой-то определенной теории, полагают, что процесс сайленсинга использует аппарат или процесс РНК1 и дРНК, например, соединения 881РНК длиной от 21 до 23 нуклеотидов.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения соединение 81РНК "в существенной мере комплементарно" целевой РНК, например, целевой мРНК, таким образом, что соединение 81РНК вызывает сайленсинг продукции белка, кодируемого целевой мРНК. В другом варианте воплощения соединение 81РНК "строго комплементарно" целевой РНК, например, целевая РНК и соединение 81РНК отжигаются, например, с формированием гибрида, состоящего исключительно из Уотсон-Криковских пар оснований в области строгой комплементарности. "В существенной мере комплементарная" целевая РНК может содержать внутреннюю область (например, длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов), которая строго комплементарна целевой РНК. Более того, в некоторых воплощениях, соединение 81РНК специфично распознает однонуклеотидное различие. В этом случае, соединение 81РНК опосредует РНЮ только если в данной области однонуклеотидного различия обнаружена строгая комплементарность (например, в пределах 7 нуклеотидов).
РНК-интерференция (РНК1) может применяться для специфичного ингибирования экспрессии целевых полинуклеотидов. Опосредованное двуцепочечной РНК подавление экспрессии гена и нуклеиновой кислоты может достигаться согласно изобретению путем введения двуцепочечной РНК, 81РНК или 8ЙРНК в клетки или организмы. 81РНК может являться двуцепочечной РНК, или гибридной молекулой, содержащей как РНК, так и ДНК, например, одну цепь РНК и одну цепь ДНК. Было показано, что прямое введение 81РНК в клетку может запускать РНК1 в клетках млекопитающих (ЕкйаЪи, 8.М., с! а1. Να!иге 411:494-498 (2001)). Дополнительно, подавление в клетках млекопитающих происходило на уровне РНК и было специфичным к целевым генам, со строгой корреляцией между подавлением РНК и белка (Сар1еп, Ν. е! а1., Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А 98:9746-9747 (2001)). Кроме того, было показано, что большое количество клеточных линий, включая клетки НеЬа 83, С087, 293, ΝΙΗ/3Τ3, А549, НТ-29, СНО-ΚΙ и МСР-7, чувствительны к определенному уровню сайленсинга посредством 81РНК (Вготеп, Ό. е! а1. Тес1№1е5 9(1): 1-7, доступно в сети Интернет по адресу тетете.йо1.атЫоп.йо1.сот/1есН1|Ь/1п/91/912.Н1т1 (9/1/02)).
Молекулы, участвующие в РНК1 и направленные на специфичные полинуклеотиды, могут быть легко получены в соответствии с методиками, известными специалистам в данной области. Были определены структурные характеристики эффективных молекул 81РНК. ЕПйаЪи, 8.М. е! а1. (2001), №щ.1ге 411:494-498 и ЕкйаЪи, 8.М. е! а1. (2001), ЕМВО 20:6877-6888. Соответственно, специалисту в данной области будет понятно, что широкое разнообразие различных молекул 81РНК может применяться для направленного действия на специфичный ген или транскрипт. В некоторых воплощениях молекулы 81РНК согласно изобретению являются двуцепочечными и имеют длину 16-30 или 18-25 нуклеотидов,
- 23 028860
включая все целочисленные значения между указанными. В одном из вариантов воплощения 81РНК имеет длину 21 нуклеотид. В некоторых воплощениях 81РНК имеют 3' "липкие" концы длиной 0-7 нуклеотидов или 5' "липкие" концы длиной 0-4 нуклеотида. В одном из вариантов воплощения молекула 81РНК имеет 3' "липкий" конец длиной два нуклеотида. В одном из вариантов воплощения 51 РНК имеет длину 21 нуклеотид и 3' "липкие" концы длиной два нуклеотида (т.е. они содержат комплементарную область длиной 19 нуклеотидов между смысловой и антисмысловой цепями). В некоторых воплощениях "липкие" концы являются 3' "липкими" концами ИИ или άΤάΤ.
В целом молекулы 51РНК полностью комплементарны одной цепи молекулы целевой ДНК, так как было показано, что наличие даже всего одной неспаренной пары оснований снижает эффективность сайленсинга. В других вариантах воплощения 51РНК могут иметь модифицированную композицию остова, с такими, например, модификациями, как 2'-дезокси или 2'-О-метил. Однако в предпочтительных воплощениях вся цепь 81РНК не может быть целиком построена из 2'-дезокси или 2'-О-модифицированных оснований.
В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание клетки, содержащей вектор для ингибирования экспрессии гена в клетке. Вектор содержит регуляторную последовательность, функционально присоединенную к нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере одну цепь одной из двуцепочечных РНК согласно изобретению.
В одном из вариантов воплощения целевые сайты 51РНК выбирают путем сканирования последовательности целевого мРНК-транскрипта на наличие динуклеотидных последовательностей АА. Каждая динуклеотидная последовательность АА в сочетании с находящимися с 3' стороны от нее примерно 19 нуклеотидами, является потенциальным целевым сайтом для 51РНК. В одном из вариантов воплощения целевые сайты 51РНК предпочтительно не располагаются в пределах 5' и 3' нетранслируемых областей (ИТК) или областей около стартового кодона (в пределах примерно 75 оснований), так как белки, которые связываются с регуляторными областями, могут мешать связыванию комплекса 51РНК и эндонуклеазы (ЕкЬаЫг, 8. е! а1. Ыа!иге 411:494-498 (2001); ЕкЬаЫг, 8. е! а1. ЕМВО I. 20:6877-6888 (2001)). Кроме того, потенциальные целевые сайты можно сравнить с соответствующей геномной базой данных, такой как В1.А8ТХ 2.0.5, доступной на сервере NСВI по адресу №№№.псЫ1.и1ш. и отбросить потенциальные целевые последовательности, имеющие существенную гомологию с другими кодирующими последовательностями.
В некоторых вариантах воплощения короткие шпилечные РНК составляют компонент нуклеиновой кислоты липидонуклеиновых кислотных частиц согласно изобретению. Короткая шпилечная РНК (8ЙРНК) является формой шпилечной РНК, способной сиквенс-специфично снижать экспрессию целевого гена. Короткие шпилечные РНК могут иметь преимущества перед 51РНК при подавлении экспрессии гена, так как они в целом более стабильны и менее чувствительны к деградации в клеточном окружении. Было установлено, что сайленсинг генов, опосредованный такими короткими шпилечными РНК, действует в ряде нормальных и опухолевых клеточных линий, и в клетках млекопитающих, включая клетки мыши и человека. РайФкои, Р. е! а1., Оеиек Эеу. 16(8):948-58 (2002). Дополнительно, были получены линии трансгенных клеток, несущих хромосомные гены, которые кодируют созданные генноинженерными методами 8ЙРНК. Эти клетки способны конститутивно синтезировать 8ЙРНК, тем самым облегчая длительный или конститутивный сайленсинг генов, который может передаваться в поколениях в клетки потомков. РайФкои, Р. е! а1., Ргос. Να!1. Асай. 8ск И8А 99(3): 1443-1448 (2002).
8ЙРНК содержат структуру "стебель с петлей". В некоторых воплощениях они могут содержать стебли с различной длиной, в типичном случае от 19 до 29 нуклеотидов в длину, или с любым числом в этом диапазоне. В некоторых воплощениях шпильки содержат стебли длиной от 19 до 21 нуклеотида, в то время как в других вариантах воплощения шпильки содержат стебли длиной от 27 до 29 нуклеотидов. В некоторых воплощениях размер петли находится в диапазоне от 4 до 23 нуклеотидов в длину, хотя размер петли может быть более 23 нуклеотидов, при этом не оказывая существенного влияния на активность сайленсинга. Молекулы вЬРНК могут содержать пары с нарушением комплементарности, например, пара с нарушением комплементарности О-И между двумя цепями стебля 8ЙРНК, без снижения эффективности. Действительно, в некоторых воплощениях, 8ЙРНК сконструированы так, чтобы они включали один или несколько пар О-И в стебле шпильки для стабилизации шпилек, например, во время амплификации в бактериях. Однако, в типичном случае необходима комплементарность между частью стебля, которая связывается с целевой мРНК (антисмысловой цепью), и мРНК, и даже единичная основная пара с нарушением комплементарности в этой области может препятствовать сайленсингу. 5' и 3' "липкие" концы не требуются, так как они, как кажется, не являются критически важными для функционирования 8ЙРНК, хотя они могут присутствовать (РайФкои е! а1. (2002), Оеиек & Эеу. 16(8):948-58).
- 24 028860
МикроРНК
МикроРНК (ш1РНК) являются высококонсервативным классом молекул малых РНК, которые транскрибируются с геномной ДНК растений и животных, но не транслируются в белки. Процессированные Ш1РНК представляют собой одноцепочечные молекулы РНК длиной приблизительно 17-25 нуклеотидов (нт), которые вовлекаются в индуцируемый РНК комплекс сайленсинга (Р18С) и которые были идентифицированы как ключевые регуляторы развития, пролиферации клеток, апоптоза и дифференцировки. Полагают, что они играют роль в регуляции экспрессии генов, связываясь с З'-нетранслируемой областью специфичных мРНК. Р18С опосредует подавление экспрессии генов путем ингибирования трансляции, расщепления транскрипта, или с помощью обоих этих механизмов. Р18С также участвует в транскрипционном сайленсинге в ядре у широкого круга эукариот.
Число идентифицированных к настоящему моменту последовательностей ш1РНК велико и продолжает расти, наглядные примеры таких последовательностей можно найти, например, в "пиКВа8с: Ш1ογοΡΝΛ хсциспссх. 1агдс18 апб депе потспсйНигс". ОпГПб18-1опс8 8, ОгососкКТ, уаи Эопдсп 8, ВаЮтап А, Еппдй! АЕ ΝΑΡ, 2006, 34, Эа1аЬа8с 188ис, Ό140-Ό144; "Тйс тюгоКИА Кед18йу" ОпГПб18-1опс8 8. ΝΑΡ, 2004, 32, Эа1аЬа8с 188ис, Ό109-Ό111; а также в сети Интернет по адресу ιηίсгогпа.бо1.8апдсг.бо1.ас.бо1.г1к/8сс]испсс8/.
Антисмысловые олигонуклеотиды
В одном из вариантов воплощения нуклеиновая кислота является антисмысловым олигонуклеотидом, направленным на целевой полинуклеотид. Подразумевается, что термин "антисмысловой олигонуклеотид" или просто "антисмысловая последовательность" включает олигонуклеотиды, которые комплементарны последовательности целевого полинуклеотида. Антисмысловые олигонуклеотиды представлены одиночными цепями ДНК или РНК, которые комплементарны выбранной последовательности. В случае антисмысловой РНК, они предотвращают трансляцию комплементарной цепи РНК путем связывания с ней. Антисмысловая ДНК может применяться для направленного действия на специфичную, комплементарную (кодирующую или некодирующую) РНК. Если происходит связывание, этот гибрид ДНК/РНК может быть деградирован ферментом РНКазой Н. В некоторых воплощениях антисмысловые олигонуклеотиды содержат от примерно 10 до примерно 50 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов. Термин также включает антисмысловые олигонуклеотиды, которые могут быть не строго комплементарны требуемому целевому гену. Таким образом, изобретение может применяться в случаях, когда у антисмысловой последовательности были обнаружены неспецифичные к целевой молекуле активности, или когда наиболее предпочтительной для конкретного применения является антисмысловая последовательность, содержащая одну или несколько пар с нарушением комплементарности с целевой последовательностью.
Показано, что антисмысловые олигонуклеотиды являются эффективными и направленными ингибиторами белкового синтеза, и, следовательно, могут применяться для специфичного ингибирования синтеза белка целевым геном. Эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования белкового синтеза хорошо установлена. Например, синтез полигалактоуроназы и мускаринового ацетилхолинового рецептора 2 типа ингибируется антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными на соответствующие им последовательности мРНК (патент США 5739119 и патент США 5759829). Дополнительно, примеры ингибирования антисмысловыми последовательностями были показаны для ядерного белка циклина, гена множественной лекарственной устойчивости (ΜΌΟ1), 1САМ-1, Е-селектина, 8ТК-1, стриарного рецептора ГАМКа и ЭФР человека (Τΐδ1<ιι1δ1<ί с! а1., 8с1спсс. 1988 Лш 10; 240(4858):1544-6; VаδаиίЬакита^ апб АЬтсб, Сапссг Соттип. 1989; 1(4):225-32; Рсг18 с! а1., Вгаш Рс8 Мо1 Вгаш Рс8. 1998 .1ии 15; 57(2):310-20; патент США 5801154; патент США 5789573; патент США 5718709 и патент США 5610288). Дополнительно, были описаны антисмысловые конструкции, которые способны к ингибированию и могут применяться для лечения различных аномалий клеточной пролиферации, например, рака (патент США 5747470; патент США 5591317 и патент США 5783683).
Способы получения антисмысловых олигонуклеотидов известны специалистам в данной области и могут быть легко адаптированы для получения антисмыслового олигонуклеотида, направленного на любую полинуклеотидную последовательность. Выбор последовательности антисмыслового олигонуклеотида, специфичной к данной целевой последовательности, основан на анализе выбранной целевой последовательности и определении вторичной структуры, Тт, энергии связывания и относительной стабильности. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть выбраны на основе их относительной неспособности формировать димеры, шпильки или другие вторичные структуры, которые снижали бы или делали невозможным специфичное связывание с целевой мРНК в клетке-хозяине. В высокой степени предпочтительные целевые области мРНК включают области, содержащие или расположенные рядом с кодоном инициации трансляции АИО, и последовательности, которые в существенной мере комплементарны 5' областям мРНК. Эти соображения относительно анализа вторичной структуры и выбора целевого сайта могут быть реализованы, например, с помощью программного обеспечения ОЬ1ОО рптсг апа1у818, верс. 4 (Мо1сси1аг Вю1оду ПШдНй) и/или программного обеспечения на основе алгоритма В^Α8ТN 2.0.5 (А1!8сйи1 с! а1., №с1с1с Ааб8 Рс8. 1997, 25(17):3389-402).
- 25 028860
Антагомиры
Антагомиры являются РНК-подобными олигонуклеотидами, в которые включены различные модификации для защиты от РНКаз и придания фармакологических свойств, таких как повышенное поглощение тканями и клетками. Они отличаются от нормальной РНК наличием, например, полного 2'-Ометилирования сахара, фосфоротиоатного остова и, например, остатка холестерола на 3'-конце. Антагомиры могут применяться для эффективного сайленсинга эндогенных пиРНК путем формирования дуплексов, состоящих из антагомира и эндогенной тРНК, что предотвращает индуцируемый Щ1РНК сайленсинг генов. Примером опосредованного антагомиром сайленсинга Щ1РНК служит сайленсинг ιηίΡ122, описанный в работе КгЩ/Гс101 с1 а1., №Лигс. 2005, 438:685-689, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки. РНК-антагомиры могут быть синтезированы с применением стандартных протоколов твердофазного синтеза олигонуклеотидов. См. заявки на патент США сер. № 11/502158 и 11/657341 (раскрытие каждой из которых включено сюда в качестве ссылок).
Антагомир может содержать субъединицы конъюгированного с лигандом мономера и мономеры для синтеза олигонуклеотидов. Примеры мономеров описаны в заявке на патент США № 10/916185, поданной 10 августа 2004 г. Антагомир может иметь структуру ΖΧΥ, такую как описана в заявке на патент РСТ № ΡϋΤ/υδ2004/07070, поданной 8 марта 2004 г. Антагомир может находиться в комплексе с амфипатическим остатком. Примеры амфипатических остатков для применения с олигонуклеотидными агентами описаны в заявке на патент РСТ № ΡϋΤ/υδ2004/07070, поданной 8 марта 2004 г.
Аптамеры
Аптамеры являются молекулами нуклеиновой кислоты или пептидными молекулами, которые связываются с конкретной рассматриваемой молекулой с высокой аффинностью и специфичностью (Тиегк апй Οοΐά, δ^ι^ 249:505 (1990); ЕШпдЮп апй δζοκίοΕ №Лиге 346:818 (1990)). Были успешно получены ДНК- или РНК-аптамеры, которые связываются со многими различными структурами - от крупных белков до малых органических молекул. См. ЕаЮп, Сигг. Орт. СЬет. Βίο1. 1:10-16 (1997), Рати1ок, Сигг. Орт. δίπκΐ. Βίο1. 9:324-9 (1999), и Негтапп апй Ра1е1, δс^епсе 287:820-5 (2000). Аптамеры могут быть на основе РНК или ДНК и могут содержать рибопереключатель. Рибопереключатель представляет собой часть молекулы мРНК, которая непосредственно связывается с малой целевой молекулой, и чье связывание с целевой молекулой влияет на активность гена. Таким образом, мРНК, содержащая рибопереключатель, напрямую вовлечена в регуляцию собственной активности, в зависимости от присутствия или отсутствия ее целевой молекулы. В общем случае, аптамеры конструируют с помощью повторяющихся раундов отбора щ νίίΓο или, в равной степени, с помощью δΕΕΕΧ (систематической эволюции лигандов при экспоненциальном обогащении) таким образом, чтобы они связывались с различными молекулярными мишенями, такими как малые молекулы, белки, нуклеиновые кислоты и даже клетки, ткани и организмы. Аптамер может быть получен с применением любого известного способа, включая синтетические, рекомбинантные способы и способы очистки, и может применяться отдельно или в сочетании с другими аптамерами, специфичными к той же мишени. Дополнительно, как описано более полно в этом документе, термин "аптамер" определенно включает "вторичные аптамеры", которые содержат консенсусную последовательность, полученную сравнением двух или нескольких известных аптамеров с данной мишенью.
Рибозимы
В соответствии с другим вариантом воплощения настоящего изобретения липидонуклеиновые частицы ассоциированы с рибозимами. Рибозимы являются комплексами РНК и белка, имеющими специфичный каталитический домен, который обладает эндонуклеазной активностью (Кгт апй СесЬ, Ртос №И Асай δ^ ША. 1987 Оес; 84(24):8788-92; ΡογκΙογ апй δутοп5, Се11. 1987 Арг 24; 49(2):211-20). Например, большое число рибозимов ускоряют реакции переноса на фосфоэфирную группу с высокой степенью специфичности, часто расщепляя только одну из нескольких фосфоэфирных связей в олигонуклеотидном субстрате (СесЬ е1 а1., Се11. 1981 Оес; 27(3 Ρί 2):487-96; МюЬе1 апй ΑοκΛοΓ, 1. Μο1 Βίο1. 1990 Эес 5; 216(3):585-610; Вет1ю1й-Нигек апй δίκιό, №Щ.1ге. 1992 Мау 14; 357(6374):173-6). Эта специфичность была связана с требованием, чтобы субстрат связывался посредством специфичных взаимодействий спаривания оснований с внутренней адапторной последовательностью ("ΙΟδ") рибозима перед осуществлением химической реакции.
В настоящее время известны по меньшей мере шесть основных типов ферментативных РНК естественного происхождения. Каждая может катализировать гидролиз фосфодиэфирных связей в РНК щ 1гапк (и таким образом может расщеплять другие молекулы РНК) в физиологических условиях. В общем случае, ферментативные нуклеиновые кислоты действуют посредством первоначального связывания с целевой РНК. Такое связывание происходит через часть каталитической нуклеиновой кислоты, предназначенную для связывания с мишенью и расположенную в тесной близости от ферментативной части молекулы, которая осуществляет расщепление целевой РНК. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота сперва распознает и после этого связывается с целевой РНК посредством комплементарного спаривания оснований, и после связывали с правильным сайтом, осуществляет каталитическое расщепление целевой РНК. Рациональное расщепление такой целевой РНК приведет к нарушению способности осуществлять синтез кодируемого белка. После того как ферментативныя нуклеиновая кислота связала и
- 26 028860
расщепила свою РНК-мишень, она высвобождается из взаимодействия с РНК для того, чтобы найти следующую мишень и может многократно связывать и расщеплять новые мишени.
Молекула ферментативной нуклеиновой кислоты может иметь вид структуры типа "головка молотка", шпильки, РНК вируса гепатита 5, интрона I группы или РНК в составе РНКазы Р (в ассоциации с адаптерной последовательностью РНК) или мотива νδ РНК Ыеигокрога, например. Конкретные примеры мотивов типа "головка молотка" описаны в работе Ко881 е! а1. ΝιιοΚία Λοίάδ Ке8. 1992 §ер 11; 20(17):455965. Примеры шпилечных мотивов описаны в работе Натре1 е! а1. (Еиг. Ра!. Арр1. РиЫ. Νο. ЕР 0360257), Натре1 аиб Ττί!ζ, ВюсЬет18йу 1989 Ми 13; 28(12):4929-33; Натре1 е! а1., ΝιιοΚίο Ааб8 Ке8. 1990 Тт 25; 18(2):299-304 и патент США 5631359. Пример мотива вируса гепатита 5 описан в работе Реттоба апб Вееп, ВюсБет18!ту. 1992 Эес 1; 31(47): 11843-52; пример мотива РНКазы Р описан в работе ОиететТакаба е! а1., Се11. 1983 Эес; 35(3 Р! 2):849-57; мотив νδ РНК-рибозима №ига8рога описан в работе Со11ш8 (§ауШе апб СоШпв, Се11. 1990 Мау 18; 61(4):685-96; 8ауб1е апб СоШп8, Ргос Ν;·ι11 Асаб δα И8А 1991 Ос! 1; 88(19):8826-30; СоШп8 апб ОПуе. ВюсБет18!ту. 1993 Маг 23; 32(11):2795-9); и пример интрона I группы описан в патенте США 4987071. Важными особенностями молекул ферментативных нуклеиновых кислот, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, является то, что они имеют специфичный сайт связывания субстрата, который комплементарен одной или нескольким областям ДНК или РНК целевого гена, и что они имеют нуклеотидную последовательность внутри или вокруг этого сайта связывания субстрата, которая придает молекуле активность расщепления РНК. Таким образом, конструкции рибозимов не следует ограничивать специфичными мотивами, упомянутыми в этом документе.
Способы получения рибозимов, направленных на любую полинуклеотидную последовательность, известны специалистам в данной области. Рибозимы могут быть сконструированы как описано в международной публикации заявки на патент XVО 93/23569 и в международной публикации заявки на патент ХУО 94/02595, каждая из которых специально включена в этот документ в качестве ссылки, и синтезированы для проверки ш νίΙΐΌ и ш У1уо, как описано в этом документе.
Активность рибозима может быть оптимизирована путем изменения длины связывающего плеча рибозима или химического синтеза рибозимов с модификациями, которые предотвращают их деградацию рибонуклеазами сыворотки (см., например, международную публикацию заявки на патент VО 92/07065; международную публикацию заявки на патент VО 93/15187; международную публикацию заявки на патент VО 91/03162; европейскую публикацию заявки на патент № 92110298.4; патент США 5334711; и международную публикацию заявки на патент VО 94/13688, которые описывают различные химические модификации, которые могут быть осуществлены в отношении остатков сахара в молекуле ферментативной РНК), модификациями, которые усиливают их эффективность в клетках, и с удалением оснований стебля II для уменьшения времени синтеза РНК и снижения химических требований.
Дополнительные последовательности олигонуклеотидов (ΌΌΝ) специфичных нуклеиновых кислот, пригодные для применения в композициях и способах согласно изобретению, описаны в заявке на патент США 60/379343, заявке на патент США № 09/649527; международной публикации VО 02/069369; международной публикации VО 01/15726; патенте США № 6406705 и в работе Капеу е! а1., 1оитпа1 о£ РБаттасо1оду апб Ехрептеп1а1 ТБетареибсв, 298:1185-1192 (2001). В некоторых воплощениях ОЭК применяемые в композициях и способах по настоящему изобретению, имеют фосфодиэфирный ("РО") остов или фосфоротиоатный ("Р8") остов, и/или по меньшей мере один метилированный остаток цитозина в составе мотива СрО.
Модификации нуклеиновых кислот
В 1990-х гг. антисмысловые олигодеоксинуклеотиды (ΌΌΝ) на основе ДНК и рибозимы (РНК) представляли собой многообещающую новую парадигму для создания и разработки лекарственных средств, но их применению ш У1уо мешала эндо- и экзонуклеазная активность, а также отсутствие способов успешной доставки внутрь клетки. Проблема, связанная с деградацией, была эффективно решена после всестороннего исследования химических модификаций, которые предотвращают распознавание олигонуклеотидных (олиго) лекарственных препаратов ферментами нуклеазами, но не ингибируют их механизм действия. Это исследование было настолько успешным, что разрабатываемые сейчас лекарственные препараты на основе антисмысловых ОЭЦ остаются интактными щ У1уо в течение нескольких дней, по сравнению с несколькими минутами в случае немодифицированных молекул (Киггеск, I. 2003. Апбвепве !есЬпо1од1е8. ПпргоуетеШ ШтоидБ поуе1 сНеш1са1 тобШсайопв. Еиг I. ВюсНет 270:1628-44). Однако, проблемы с доставкой внутрь клетки и механизмами действия до сих пор сдерживали превращение антисмысловых ОЭЦ и рибозимов в клинические продукты.
Дуплексам РНК свойственна более высокая стабильность к действию нуклеаз, чем у одноцепочечной ДНК или РНК, и, в отличие от антисмысловых ОЭН немодифицированная 81РНК демонстрирует достаточную активность при попадании в цитоплазму. Несмотря на это, химические модификации, разработанные для стабилизации антисмысловых ОЭЦ и рибозимов, также систематически применяли к 81РНК, чтобы определить, насколько химическая модификация может быть переносима и можно ли улучшить фармакокинетическую и фармакодинамическую активность. РНК-интерференция, вызванная дуплексами 81РНК, требует наличия антисмысловой и смысловой цепи, которые выполняют разные функции. Обе цепи необходимы, чтобы 81РНК могла войти в К18С, но после загрузки две цепи разделя- 27 028860
ются и смысловая цепь деградирует, в то время как антисмысловая цепь остается, чтобы направлять К18С к целевой мРНК. Вход в состав К18С - это структурно менее строгий процесс, чем распознавание и расщепление целевой мРНК. Следовательно, возможно множество различных химических модификаций смысловой цепи, но допустимы лишь ограниченные изменения антисмысловой цепи (Ζ1κιη§ е1 а1., 2006).
Как известно специалистам в данной области, нуклеозид - это комбинация основания и сахара. Нуклеотиды - это нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно присоединенную к частице сахара в составе нуклеозида. В случае нуклеозидов, которые содержат пентофуранозный сахар, фосфатная группа может быть присоединена к любой из 2', 3' или 5' гидроксильных групп сахара. При образовании олигонуклеотидов, фосфатные группы ковалентно связывают соседние нуклеозиды друг с другом с образованием линейного полимерного соединения. В свою очередь, соответствующие концы этой линейной полимерной структуры могут дополнительно соединяться с образованием кольцевой структуры. В пределах структуры олигонуклеотида о фосфатных группах обычно говорят, что они образуют межнуклеозидный остов олигонуклеотида. Нормальное соединение или остов для РНК и ДНК - это фосфодиэфирное соединение 3'-5'.
Нуклеиновая кислота, применяемая в липидонуклеиновой кислотной частице в соответствии с настоящим изобретением, включает любую известную форму нуклеиновой кислоты. Таким образом, нуклеиновая кислота может являться модифицированной нуклеиновой кислотой типа, применявшегося ранее для повышения устойчивости к нуклеазам и стабильности в сыворотке. Примечательно, однако, что приемлемые терапевтические продукты также могут быть получены с применением способа согласно изобретению для составления смеси липидонуклеиновых кислотных частиц из нуклеиновых кислот, которые не несут модификаций в фосфодиэфирных связях природных полимеров нуклеиновых кислот, и применение нуклеиновых кислот с немодифицированными фосфодиэфирными связями (т.е. нуклеиновых кислот, в которых все межнуклеозидные связи представлены фосфодиэфирными связями) является предпочтительным воплощением настоящего изобретения.
Модификации остова
Антисмысловые РНК, 81РНК и другие олигонуклеотиды, полезные для настоящего изобретения, включают в качестве неограничивающих примеров олигонуклеотиды, содержащие модифицированные остовы или неприродные межнуклеозидные связи. Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные остовы, включают таковые с сохранением атома фосфора в остове и таковые без сохранения атома фосфора в остове. Модифицированные олигонуклеотиды, которые не содержат атом фосфора в их межнуклеозидном остове, также могут считаться олигонуклеозидами. Остовы модифицированных олигонуклеотидов содержат, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, фосфороселенат, метилфосфонат или О-алкилфосфотриэфир в качестве межнуклеозидных соединений, и боранофосфаты, содержащие нормальные соединения 3'-5', их аналоги с соединением 2'-5' и таковые с инвертированной полярностью, где соседние пары нуклеозидных единиц соединены 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Некоторые неограничивающие примеры некоторых модификаций, которые могут присутствовать в нуклеиновой кислоте согласно изобретению, показаны в табл. 2.
Включены также различные соли, смеси солей и формы свободных кислот. Примеры патентов США, которые описывают получение вышеназванных межнуклеозидных связей, включают в качестве неограничивающих примеров патенты США № 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253;5571799;5587361 и 5625050.
В некоторых воплощениях остовы модифицированных олигонуклеотидов, которые не содержат атома фосфора, имеют остовы, образованные межнуклеозидными связями из короткоцепочечных алкила или циклоалкила, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Сюда относятся, например, таковые с морфолино-связями (образованными частично с участием остатка сахара в составе нуклеозида); силоксановыми остовами; сульфидными, сульфоксидными и сульфоновыми остовами; формацетильными и тиоформацетильными остовами; метиленформацетильными и тиоформацетильными остовами; алкенсодержащими остовами; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, имеющие в качестве компонентов сочетания Ν, О, 8 и СН2. Примеры патентов США, которые описывают вышеназванные олигонуклеозиды, включают в качестве неограничивающих примеров патенты США № 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360;5677437 и 5677439.
Фосфоротиоатная модификация остова (табл. 3, № 1), где не входящий в состав мостиков атом кислорода в фосфодиэфирной связи замещен на атом серы, является самым первым и наиболее распространенным способом, применяемым для стабилизации лекарственных препаратов на основе нуклеиновых
- 28 028860
кислот против деградации нуклеазами. В общем случае полагают, что Ρδ-модификации могут широко осуществляться в обеих цепях 31РНК без существенного влияния на активность (Киггеск, I., Еиг. I. Βίοскет. 270:1628-44, 2003). Однако известно, что Ρδ-олиго ассоциируют с белками в существенной степени неспецифично, приводя к токсическим явлениям, особенно при внутривенном введении. Следовательно, Ρδ-модификации обычно ограничены одним или двумя основаниями на 3' и 5' концах. Боранофосфатная межнуклеозидная связь (табл. 3, № 2) является недавно разработанной модификацией, которая очевидно более стабильна, чем Ρδ, усиливает активность 31РНК и имеет низкую токсичность (На11 е! а1., Жс!е1с Лс1Йз Кез. 32:5991-6000, 2004).
Таблица 3
Химические модификации, применяемые к 31РНК и другим нуклеиновым кислотам
№ Аббревиатура Название Сайт модификации Структура
1 Ρδ Фосфоротиоат Остов ί . А— о И О ОК о π X
2 РВ Боранофосфат Остов ы ΓΊ т \ Зл хч И
3 Ν3-Μυ N 3 -метилурид ин Основание .· ( - в Ϊ й 1-1 ч
4 5'-ви 5'-бромоурацил Основание «, Α' АЧ
5 5'-Ш 5'-йодоурацил Основание 1 и у1* 1 ; ' кха* 4 г 4 Οί 1 ч
6 2,6-ϋΡ 2,6диаминопурин Основание \ 1 ./ \ί , ж ч
- 29 028860
7 2'-Г 2'-фторо- Сахар о ‘ \ Вз&й?
Ч σ г
8 2'-ОМЕ 2”-О-метил Сахар ί—о Ь-э-и ΓΊ ч
9 2'-О-МОЕ 2-0-(2метоксилэтил) Сахар 1 о ' ........ -о о-сажсв-о-сйз V
10 2'-ϋΝΡ 2-0-(2,4динитрофенил) Сахар ч Ч Ва»® к* · ΓΊ О "·
11 ΕΝΑ Запертая нуклеиновая кислота (метиленовый мостик, соединяющий атом 2'-кислорода с атомом 4'углерода в рибозном кольце) Сахар ί Вз.ё ΐ -р=О 1
12 2'-амино 2'-амино Сахар * Ьз-к
13 2'-дезокси 2'-дезокси Сахар О * \ Ь&Дг
14 4'-тио 4'тиорибонуклеоти Д Сахар ξ~1· к-« К ίίί V
Другие полезные производные нуклеиновых кислот включают такие молекулы нуклеиновых кислот, в которых образующие мостики атомы кислорода (таковые, образующие фосфоэфирные связи) были заменены на -δ-, -ΝΗ-, -СН2- и им подобные. В некоторых воплощениях примененные изменения антисмысловых, 81РНК, или других нуклеиновых кислот не окажут полного влияния на отрицательные заряды, ассоциированные с нуклеиновыми кислотами. Таким образом, настоящее изобретение рассматривает применение антисмысловых, 81РНК, и других нуклеиновых кислот, в которых часть межнуклеозидных связей заменены на, например, нейтральные метилфосфонатные или фосфорамидатные связи. Когда применяются нейтральные межнуклеозидные связи, как в некоторых воплощениях, менее чем 80% межнуклеозидных связей в нуклеиновой кислоте заменены таким образом, или менее чем 50% межнуклеозидных связей в нуклеиновой кислоте заменены таким образом.
- 30 028860
Модификации основания
Модификации оснований встречаются реже, чем модификации остова и сахара. Все модификации, показанные в 0.3-6, по-видимому, стабилизируют к1РНК против действия нуклеаз и оказывают незначительный эффект на активность ( Ζΐκπίβ. Η.Υ., Эи. О.. ЩаЬ1ек1еб1. С., Аапд. Ζ. 2006. Κ.ΝΛ 1п1сгГсгспсс \\ЬЬ сЬенисаПу тобЫеб к£^А. Сшт ТорМеб СЬет 6:893-900).
Соответственно, олигонуклеотиды также могут содержать модификации или замены нуклеооснований (часто называемых специалистами просто "основаниями"). При использовании в этом документе, "немодифицированные" или "природные" нуклеооснования включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (С), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (И). Модифицированные нуклеооснования включают другие синтетические и природные нуклеооснования, такие как 5метилцитозин (5-те-С или т5с), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-гало-урацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало-, 8амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие замещенные по 8 положению аденины и гуанины, 5гало-, в частности, 5-бромо-, 5-трифторметил и другие замещенные по 5 положению урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3деазагуанин и 3-деазааденин.
Определенные нуклеооснования особенно полезны для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений согласно изобретению, включая замещенные по 5 положению пиримидины, 6азапиримидины и Ν-2, Ν-6 и О-6-замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Показано, что замены на 5-метилцитозин повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (8апдЬу1, Υ. 8., Сгооке, 8.Т. апб ЬеЫеи, В., ебк., АпЬкепке КекеагсЬ апб АррЬсаЬопк 1993, СКС Ргекк, Воса РаЮп. р. 276-278). Они могут сочетаться, в некоторых воплощениях, с 2'-О-метоксиэтил-модификациями сахара. Патенты США, которые описывают получение некоторых из этих модифицированных нуклеооснований, а также других модифицированных нуклеооснований, включают в качестве неограничивающих примеров вышеназванный патент США № 3687808, а также патенты США № 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540;5587469;5594121;5596091;5614617 и 5681941.
Модификации сахара
Большинство модификаций групп сахара происходят по 2'-ОН группе кольца сахара в РНК, которая является стандартным химически реактивным сайтом (МапоЬагап, М. 2004, КNА ЬЛегГегепсе апб сЬениса11у тобШеб кта11 ЬЛегГеппд КNΛк. Сигг Орт СЬет Вю1 8:570-9; ΖЬапд, Η.Υ., Эи. О.. ЩаЬ1ек!еб!, С, Ыапд, Ζ. 2006. КNА ЬЛегГегепсе \\ЬЬ сЬетюа11у тобЫеб к£^А. Сигг Тор Меб СЬет 6:893-900). Модификации 2'-Р и 2'-ОМЕ (0.7 и 8) являются распространенными и обе повышают стабильность, модификация 2'-ОМЕ не снижает активность, если ее распространение ограничено на менее чем 4 нуклеотида на цепь (Но1еп, Т., Атаг/диют. М., ВаЬа1е, Е., Ргуб/. Η. 2003. Схожее поведение одноцепочечных и двуцепочечных 51РНК предполагает, что они действуют через стандартный путь РНКь ШсЫс АЫбк Кек 31:2401-7). Модификация 2'-О-МОЕ (0.9) наиболее эффективна для к1РНК, когда расположение модифицированных оснований ограничено центральной областью молекулы (РгакакЬ, Т.Р., А11егкоп, С.К., Эапбе. Р., Уюкегк, Т.А., 8юий, Ν., Мггек. К., Вакег, В.Р., 8\уау/е. Е.Е., СгЪГеу, К.Н., ВЬаГ, В. 2005. РокЬюпа1 еГГес1 оГ сЬетюа1 тобШсайопк оп кЬой тЮгГегепсе КNА асЙуЬу ш таттаЪап се11к. 1. Меб СЬет 48:4247-53). Другие модификации, для которых обнаружено, что они стабилизируют ыРНК без потери активности, показаны в 0.10-14.
Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или несколько замещенных остатков сахара. Например, настоящее изобретение включает олигонуклеотиды, которые содержат один из следующих остатков в положении 2': ОН; Р; О-, 8-, или Ν-алкил, О-алкил-О-алкил, О-, 8- или Ν-алкенил, или О-, 8- или Ν-алкинил, при этом алкил, алкенил, и алкинил могут быть замещенным или незамещенным С^Сю-алкилом или С2-Сю-алкенилом или алкинилом. Особенно предпочтительно, О[(СН2)пО]тСН3, О(СН2)пОСН3, О(СН2)2ОМСН3)2, О(СН2)^Н2. О(СН2)пСН3, О(С112).ОМ12 и О(СН2)пОЩ(СН2)пСН3)]2, где п и т равны от 1 до примерно 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих остатков в положении 2': С1-С10-низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, Оалкарил или О-аралкил, 8Н, 8СН3, ОСМ С1, Вг, ΟΝ, СР3, ОСР3, 8ОСН3, 8О2СН3, ОМ), ΝΟ, Ν3, Ν42. гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида и другие заместители, имеющие схожие свойства. Одна модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН2СН2ОСН3, также известную как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (МаШп е1 а1., Не1у. СЫт. АсЫ 1995, 78, 486-504), т.е. алкоксиалкоксигруппу. Другие модификации включают 2'диметиламинооксиэтокси, т.е. группу О(СН2)2ОМСН3)2, известную также как 2'-ЭМАОЕ и 2'диметиламиноэтоксиэтокси (2'-ЭМАЕОЕ).
Дополнительные модификации включают 2'-метокси (2'-О--СН3), 2'-аминопропокси (2'- 31 028860
ΟΟΗ2ΟΗ2ΟΗ2ΝΗ2) и 2'-фторо (2'-Р). Похожие модификации также могут быть введены в другие позиции в составе олигонуклеотида, в частности, в позиции 3' сахара 3'-концевого нуклеотида или соединенных 2'-5' олигонуклеотидов и в позиции 5' у 5'-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды также могут содержать миметики сахаров, такие как остатки циклобутила вместо пентофуранозила сахара. Примеры патентов США, которые описывают получение структур таких модифицированных сахаров, включают в качестве неограничивающих примеров патенты США № 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873;5670633 и 5700920.
В других миметиках олигонуклеотидов, как сахар, так и межнуклеозидные связи, т. е., остов, нуклеотидных единиц, заменены новыми группами, хотя основания сохраняются для гибридизации с соответствующим целевым соединением - нуклеиновой кислотой. Одно такое олигомерное соединение, миметик олигонуклеотида, для которого было показано, что он обладает превосходными гибридизационными свойствами, называют пептидо-нуклеиновой кислотой (РNΑ). В соединении РNΑ, сахарный остов олигонуклеотида заменен амидосодержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом, нуклеооснования сохранены и связаны непосредственно или опосредованно с атомами азота азогрупп амидной части остова. Примеры патентов США, которые описывают получение соединений РNΑ, включают в качестве неограничивающих примеров патенты США № 5539082, 5714331 и 5719262. Дополнительные идеи по поводу соединений РNΑ можно найти в №е1зеи е! а1. (8с1еисе, 1991, 254, 1497-1500).
Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения являются олигонуклеотидами с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеозидами с гетероатомными остовами, и, в частности, -ΟΗ2--ΝΗ--Ο-СИ2--, --ΟΗ2--Ν(ΟΗ3)--Ο--ΟΗ2-- (называемым метилен (метиламино) или ММ1-остовом) -СИ2--О-Ν(ΟΗ3)-^Η2--, --ίΉ2--Ν(ί.Ή3,)-Ν(ί.Ή3,)--ί.Ή2-- и --Ο--Ν(ί.Ή3)-ί.Ή2--ί.Ή2-- (где природный фосфодиэфирный остов представлен в виде --Ο-Γ-Ο-ΟΗ^-) по вышеуказанному патенту США № 5489677, и амидными остовами по вышеуказанному патенту США № 5602240. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, имеющие морфолиновую структуру остова по вышеуказанному патенту США № 5034506.
Остаток сахара также может содержать один или несколько атомов углерода, которые обладают стереохимической конфигурацией, противоположной таковой соответствующего атома углерода в составе рибозы. Таким образом, олигонуклеотид может включать нуклеотиды, содержащие, например, арабинозу, в качестве сахара. Мономер может иметь а-соединение в 1' позиции сахара, например, ануклеозиды. Олигонуклеотиды могут также включать "лишенные азотистого основания" сахара, у которых отсутствует азотистое основание у атома С-1'. Эти лишенные азотистого основания сахара могут дополнительно содержать модификации по одному или нескольким составляющим атомам сахара. Олигонуклеотиды могут также содержать один или несколько сахаров, находящихся в Ь-форме, например Ьнуклеозиды.
Химерные олигонуклеотиды
Не требуется, чтобы все позиции в данном соединении были однородно модифицированы, и фактически более одной из вышеупомянутых модификаций может быть вовлечено в одном соединении или даже в одном нуклеозиде в пределах олигонуклеотида. Некоторые предпочтительные олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются химерными олигонуклеотидами. "Химерные олигонуклеотиды" или "химеры" в контексте настоящего изобретения являются олигонуклеотидами, содержащими две или несколько химически различные области, каждая из которых состоит из по меньшей мере одного нуклеотида. Эти олигонуклеотиды, в типичном случае, содержат по меньшей мере одну область модифицированных нуклеотидов, которые придают одно или несколько полезных свойств (таких как, например, повышенная устойчивость к нуклеазам, повышенное поглощение клетками, повышенная аффинность связывания с РНК-мишенью), и область, которая является субстратом для расщепления РНКазой Н.
В одном из вариантов воплощения химерный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну область, модифицированную для повышения аффинности связывания с мишенью. Аффинность олигонуклеотида к его мишени стандартно определяют измерением показателя Тт пары олигонуклеотид/мишень, который равен температуре, при которой олигонуклеотид и мишень диссоциируют; диссоциацию определяют спектрофотометрически. Чем выше значение Тт, тем больше аффинность олигонуклеотида к мишени. В одном из вариантов воплощения область олигонуклеотида, которую модифицируют для повышения аффинности связывания с мРНК-мишенью, содержит по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный по 2' позиции сахара, наиболее предпочтительно 2'-Ο-алкил, 2'-Ο-алкил-Ο-алкил или 2'фторо-модифицированный нуклеотид. Такие модификации стандартно внедряют в олигонуклеотиды, и было показано, что эти олигонуклеотиды обладают более высокой Тт (т. е. более высокой аффинностью связывания с мишенью), чем 2'-дезоксиолигонуклеотиды, действующие против данной мишени. Эффект такой повышенной афинности заключается в значительном усилении ингибирования олигонуклеотидом экспрессии целевого гена.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения химерный олигонуклеотид содержит область, которая служит субстратом для РНКазы Н. Естественно, при этом понимается, что олигонуклеотиды могут включать любую комбинацию различных модификаций, описанных в этом документе.
- 32 028860
Еще одна модификация олигонуклеотидов согласно изобретению включает химическое присоединение к олигонуклеотиду одного или нескольких остатков или конъюгатов, которые усиливают активность, распределение в клетке и поглощение клетками олигонуклеотида. Такие конъюгаты и способы их получения известны специалистам в данной области.
Специалисту в данной области понятно, что для полезности ίη νίνΌ, такой как терапевтическая эффективность, целесообразным эмпирическим правилом является то, что если тиол-модифицированная версия последовательности работает в свободной форме, то инкапсулированные частицы той же последовательности, любой химической природы, также будут эффективны. Инкапсулированные частицы могут также иметь более широкий диапазон полезности ίη ν^νο, демонстрируя эффективность в условиях и модельных системах, для которых известно, что они не отвечают на другие способы терапии с применением антисмысловых олигонуклеотидов. Специалисту в данной области известно, что применяя настоящее изобретение, можно обнаружить, что старые модельные системы начнут давать ответ на терапию с применением антисмысловых олигонуклеотидов. Дополнительно, могут быть пересмотрены ранее отброшенные антисмысловые последовательности или химические соединения, и обнаружено, что они являются эффективными в случае применения настоящего изобретения.
Олигонуклеотиды, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть удобно и стандартно получены с помощью хорошо известного способа твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продают несколько поставщиков, в том числе компания АррНей ВюкукЮтк. Также может быть применен любой другой способ такого синтеза; фактический синтез олигонуклеотидов зависит от потенциальных возможностей выполняющего его специалиста. Также хорошо известно, что можно применять схожие способы для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоатные и алкилированные производные.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды
Нуклеиновые кислоты, ассоциированные с липидными частицами по настоящему изобретению, могут быть иммуностимулирующими, в том числе иммуностимулирующими олигонуклеотидами ^88; одно- или двуцепочечными), способными индуцировать иммунный ответ при введении субъекту, который может являться млекопитающим или другим пациентом. ^8 включают, например, некоторые палиндромные последовательности, приводящие к образованию шпилечных вторичных структур (см. Υатато1о 8., е1 а1. (1992), ί. Iттиηο1. 148: 4072-4076), или СрС-мотивы, а также другие известные характерные элементы ^8 (такие как мульти-С домены, см. АО 96/11266).
Иммунный ответ может быть врожденным или адаптивным иммунным ответом. Иммунная система подразделяется на в большей степени врожденную иммунную систему и приобретенную адаптивную иммунную систему позвоночных, последняя из которых дополнительно подразделяется на гуморальный и клеточный компоненты. В некоторых вариантах воплощения иммунный ответ может быть мукозным.
В некоторых вариантах воплощения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является иммуностимулирующей только при введении в сочетании с липидной частицей, и не является иммуностимулирующей при введении в ее "свободной форме". В соответствии с настоящим изобретением, такой олигонуклеотид считается иммуностимулирующим.
Полагают, что иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты являются не специфичными к последовательности, если для провоцирования иммунного ответа не требуется, чтобы они специфично связывались с целевым полинуклеотидом и снижали его экспрессию. Таким образом, некоторые иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут содержать последовательность, соответствующую области гена или мРНК природного происхождения, но тем не менее считаться не специфичными к последовательности иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами.
В одном из вариантов воплощения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота или олигонуклеотид содержит по меньшей мере один динуклеотид СрС. Олигонуклеотид или динуклеотид СрС могут быть неметилированными или метилированными. В другом варианте воплощения настоящего изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один динуклеотид СрС, имеющий метилированный цитозин. В одном из вариантов воплощения нуклеиновая кислота содержит один динуклеотид СрС, при этом цитозин в упомянутом динуклеотиде СрС метилирован. В конкретном примере воплощения нуклеиновая кислота содержит последовательность 5' ТААССТТСАСССССАТ 3'. В соответствии с другим вариантом воплощения нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере два динуклеотида СрС, при этом по меньшей мере один цитозин в динуклеотидах СрС метилирован. В дополнительном варианте воплощения каждый цитозин в динуклеотидах СрС, присутствующих в последовательности, метилирован. В другом варианте воплощения настоящего изобретения нуклеиновая кислота содержит множество динуклеотидов СрС, при этом по меньшей мере один из упомянутых динуклеотидов СрС содержит метилированный цитозин.
В конкретном примере воплощения нуклеиновая кислота содержит последовательность 5' ТТССАТСАССТТССТСАССТ 3'. В еще одном конкретном примере воплощения последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность 5' ТССАТСАССТТССТСАССТ 3', при этом два цитозина, выделенные жирным шрифтом, метилированы. В некоторых вариантах воплощения ОЭЛ выбран из группы ОЭУ состоящей из ОЭЛ № 1, ОЭЛ № 2, ОЭЛ № 3, ОЭЛ № 4, ОЭЛ № 5, ОЭЛ № 6, ОЭЛ № 7,
- 33 028860
ΟΌΝ № 8 и ΟΌΝ № 9, как показано ниже.
Таблица 4
Примеры иммуностимулирующих олигонуклеотидов (ΟΌΝ)
НАЗВАНИЕ ΟΩΝ ЕОГО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ΟϋΝ (5'-3').
ΟϋΝ 1 с-тус человека 5 '-ТААСОТТОАООООСАТ-3
* ΟϋΝ 1т 5 '-ΤΑΑΖΟΤΤΟΑΟΟΟΟΟΑΤ-3
ΟϋΝ 2 5'-ТССАТОАСОТТССТОАСОТТ-3
* ΟϋΝ 2т 5 '-ТСС ΑΤΟΑΖΟΤΤ€ΧΤΟΑΖΟΤΤ-3
ΟϋΝ 3 5 ’-ТААОС АТАСООООТОТ-3
ΟϋΝ 5 5'-ААСОТТ-3
ΟϋΝ 6 5 '-ОАТОСТОТОТСООООТСТССОООС-3'
ΟϋΝ 7 5 '-ТСОТСОТТТТОТСОТТТТОТСОТТ-3'
ΟϋΝ 7т 5 '-ΤΖΟΤΖΟΤΤΤΤΟΤΖΟΤΤΤΤΟΤΖΟΤΤ-3'
ΟϋΝ 8 5 '-ТСС АООАСТТСТСТСАООТТ-3'
ΟϋΝ 9 5 '-ТСТСССАОСОТОСОСС АТ-3'
ΟΩΝ 10 внутриклеточная молекула адгезии-1 мыши 5 '-ТОС АТСССССАООССАССАТ-3
ΟΩΝ 11 внутриклеточная молекула адгезии-1 человека 5'-ОСССААОСТООСАТССОТСА-3'
ΟΩΝ 12 внутриклеточная молекула адгезии-1 человека 5'-ОСССААОСТООСАТССОТСА-3'
ΟϋΝ 13 егЬ-В-2 человека 5'-ООТ ОСТСАСТОС ООС-3'
ΟΩΝ 14 с-тус человека 5'-ААСС ОТТ ОАО ООО САТ-3'
ΟΩΝ 15 с-тус человека 5'-ТАТ ОСТ ОТО ССО ООО ТСТ ТСО ООС3'
ΟϋΝ 16 5'-ОТОССО ОООТСТТСОООС-3'
ΟΩΝ 17 рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 человека 5'-ООАСССТССТССООАОСС-3'
ΟΩΝ 18 рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 человека 5'-ТСС ТСС ООА ОСС АОА СТТ-3'
ΟϋΝ 19 рецептор эпидермального фактора роста человека 5'-ААС ОТТ ОАО ООО САТ-3'
ΟϋΝ 20 рецептор эпидермального фактора роста 5'-ССОТООТСА ТОСТСС-3'
ΟΩΝ 21 фактор роста эндотелия сосудов человека 5'-САО ССТООСТСАССО ССТТОО-3'
ΟΟΝ 22 Фосфокиназа С - а мыши 5'-САО ССА ТОО ТТС ССС ССА АС-3'
ΟϋΝ 23 5'-ОТТ СТС ОСТ СОТ ОАО ТТТ СА-3'
ΟΩΝ 24 Вс1-2 человека 5'-ТСТ СССАОСОТОСОССАТ-3'
ΟΩΝ 25 С-КаГ-з человека 5'-ОТО СТС САТ ТОА ТОС-3'
ΟΩΝ №26 рецептор-1 фактора роста эндотелия сосудов человека 5 '-ОАоиисиоАиоАооссоАААОоссоАААоисио-з'
ΟϋΝ №27 б'-ККСОУУ-З'
ΟϋΝ №28 5 '-ААСОТТОАООООСАТ-3'
ΟϋΝ №29 5 ’-СААСОТТАТООООАОА-З'
ΟϋΝ №30 с-тус человека 5 '-ТААСОТТОАООООСАТ-3'
"Ζ" обозначает метилированный остаток цитозина. ΟΌΝ 14 является 15-мерным олигонуклеотидом, а ΟΌΝ 1 является тем же олигонуклеотидом, содержащим тимидин, добавленный на 5'конец, в результате чего ΟΌΝ1 становится 16-мером. Различий в
- 34 028860
биологической активности между ΟΌΝ 14 и ΟΌΝ 1 не обнаружено, и они оба проявляют схожую иммуностимулирующую активность (Мш ек а1., 2001).
Дополнительные последовательности олигонуклеотидов (ΟΌΝ) специфичных нуклеиновых кислот, пригодные для применения в композициях и способах согласно изобретению, описаны в Капеу ек а1., 1оигпа1 οί РДагтасо1оду апй Ехрептепка1 ТДегареикюз, 298:1185-1192 (2001). В некоторых воплощениях ΟΌΝ, применяемые в композициях и способах по настоящему изобретению, имеют фосфодиэфирный ("РО") остов или фосфоротиоатный ("Ρδ") остов, и/или по меньшей мере один метилированный остаток цитозина в составе мотива СрО.
Олигонуклеотиды-ловушки
Так как транскрипционные факторы распознают свои относительно короткие последовательности для связывания даже в отсутствие окружающей их геномной ДНК, то короткие олигонуклеотиды, несущие консенсусную последовательность связывания специфичного транскрипционного фактора, могут применяться в качестве инструмента для управления экспрессией гена в живых клетках. Эта стратегия включает внутриклеточную доставку таких "олигонуклеотидов-ловушек", которые после этого распознаются и связываются своими целевыми факторами. Занятие ДНК-связывающего сайта транскрипционного фактора ловушкой делает транскрипционный фактор неспособным к последующему связыванию с промоторными областями целевых генов. Ловушки могут применяться в качестве терапевтических агентов, либо для ингибирования экспрессии генов, активируемых транскрипционным фактором, либо для повышения экспрессии генов, которые подавляются связыванием транскрипционного фактора. Примеры применения олигонуклеотидов-ловушек можно найти в работе Мапп ек а1., ί. СПп. 1^езк., 2000, 106: 1071-1075, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки.
Супермир
Супермир обозначает одноцепочечный, двуцепочечный или частично двуцепочечный олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или обеих или их модификаций, который имеет нуклеотидную последовательность, в существенной мере идентичную т1РНК и являющуюся антисмысловой относительно ее мишени. Этот термин включает олигонуклеотиды, состоящие из природного происхождения нуклеооснований, сахаров и ковалентных межнуклеозидных (остовных) связей, и которые содержат по меньшей мере одну часть неприродного происхождения, которая выполняет схожие функции. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды имеют превосходство над нативными формами благодаря требуемым свойствам, таким как, например, более интенсивное поглощение клетками, повышенная аффинность к целевой нуклеиновой кислоте и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз. В предпочтительном воплощении супермир не содержит смысловой цепи, а в еще одном предпочтительном воплощении, супермир не обладает свойством самогибридизации в существенной степени. Супермир, являющийся особенностью настоящего изобретения, может иметь вторичную структуру, но он является в существенной мере одноцепочечным в физиологических условиях. Супермир, который является в существенной мере одноцепочечным, является одноцепочечным в такой степени, что менее чем примерно 50% (например, менее чем примерно 40, 30, 20, 10 или 5%) супермира образует дуплексы внутри молекулы. Супермир может содержать шпилечный сегмент, например, последовательность, предпочтительно на 3'-конце, может самогибридизоваться и образовывать дуплексную область, например, дуплексную область длиной по меньшей мере 1, 2, 3 или 4, и предпочтительно менее чем 8, 7, 6 или п нуклеотидов, например, 5 нуклеотидов. Дуплексная область может быть присоединена с помощью линкера, например, нуклеотидного линкера, например, 3, 4, 5 или 6 остатков йТ, например, модифицированных остатков йТ. В другом варианте воплощения настоящего изобретения супермир образует дуплекс с более коротким олиго, например, длиной 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, например, на одном или обоих 3'- и 5'-концах, или на одном конце и в не терминальной или срединной части супермира.
Миметики ш1РНК
Миметики т1РНК представляют класс молекул, которые могут применяться для имитации способности одной или нескольких т1РНК вызывать сайленсинг генов. Таким образом, термин "миметик микроРНК" представляет синтетические некодирующие РНК (т.е. т1РНК получены не с помощью очистки из источника эндогенных т1РНК), которые способны вступать в сигнальный путь РНК1 и регулировать экспрессию генов. Миметики т1РНК могут быть сконструированы в виде зрелых молекул (например, одноцепочечных) или предшественников миметиков (например, при- или пре-т1РНК). Миметики т1РНК могут состоять из нуклеиновой кислоты (модифицированных или немодифицированных нуклеиновых кислот), включая олигонуклеотиды, содержащие, но не ограничиваясь этим, РНК, модифицированную РНК, ДНК, модифицированную ДНК, запертые нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты с 2'О,4'-С-этиленовыми мостиками (ΕNΑ), или любую комбинацию вышеуказанного (в том числе ДНК-РНК гибриды). Кроме того, миметики т!РНК могут содержать конъюгаты, влияющие на доставку, внутриклеточную компартментализацию, стабильность, специфичность, функциональность, предпочтительное использование цепи, и/или активность. В одном из вариантов конструкции миметики т!РНК являются двуцепочечными молекулами (например, с дуплексной областью длиной от примерно 16 до примерно 31
- 35 028860
нуклеотида) и содержат одну или несколько последовательностей, обладающих идентичностью со зрелой цепью данной пиРНК. Модификации могут включать 2'-модификации (в том числе 2'-О-метил модификации и 2'-Р-модификации) на одной или обеих цепях молекулы и межнуклеотидные модификации (например, фосфоротиоатные модификации), которые усиливают стабильность и/или специфичность нуклеиновой кислоты. Кроме того, миметики тРНК могут содержать "липкие" концы. "Липкие" концы могут состоять из 1-6 нуклеотидов на любом из 3' или 5'-концов любой цепи и могут быть модифицированы для повышения стабильности или усиления функциональности. В одном из вариантов воплощения миметик Ш1РНК содержит дуплексную область длиной от 16 до 31 нуклеотида и одну или несколько из следующих схем химических модификаций: смысловая цепь содержит 2'-О-метильные модификации нуклеотидов 1 и 2 (считая от 5'-конца смыслового олигонуклеотида), и всех остатков С и И; модификации антисмысловой цепи могут содержать 2' Р-модификацию всех остатков С и и, фосфорилирование 5'конца олигонуклеотида и стабилизированные межнуклеотидные связи, ассоциированные с "липким" концом 3' из 2 нуклеотидов.
Антимиры или ингибиторы ш1РНК
Термины "антимир", "ингибитор тюгоРНК", "ингибитор ιηίΚ" или "ингибитор" являются синонимами и означают олигонуклеотиды или модифицированные олигонуклеотиды, которые препятствуют активности специфичных Ш1РНК. В общем случае, ингибиторы являются нуклеиновой кислотой или модифицированными нуклеиновыми кислотами по природе, включая олигонуклеотиды, содержащие РНК, модифицированную РНК, ДНК, модифицированную ДНК, запертые нуклеиновые кислоты (ΕΝΑ) или любую комбинацию вышеуказанного. Модификации включают 2'-модификации (в том числе 2'-О-алкил модификации и 2'-Р-модификаци) и межнуклеотидные модификации (например, фосфоротиоатные модификации), которые могут влиять на доставку, стабильность, специфичность, внутриклеточную компартментализацию, или активность. Кроме того, ингибиторы Ш1РНК могут содержать конъюгаты, влияющие на доставку, внутриклеточную компартментализацию, стабильность и/или активность. Ингибиторы могут принимать различные конфигурации, включая одноцепочечную, двуцепочечную (РНК/РНК или РНК/ДНК дуплексы) и шпилечную структуры, в общем случае, ингибиторы Ш1РНК содержат одну или несколько последовательностей или частей последовательностей, которые комплементарны или частично комплементарны зрелой цепи (или цепям) целевой Ш1РНК, кроме того, с 5' или, ингибитор Ш1РНК может также содержать дополнительные последовательности, расположенны 3' стороны от последовательности, являющейся обратно-комплементарной для зрелой Ш1РНК. Дополнительные последовательности могут быть обратно-комплементарными последовательностям, которые расположены рядом со зрелой Ш1РНК в рг1-Ш1РНК, из которой происходит зрелая Ш1РНК, или дополнительные последовательности могут быть случайными последовательностями (являющимися смесью остатков Α, О, С или и). В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения одна или обе дополнительные последовательности являются случайными последовательностями, способными образовывать шпильки. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения последовательность, являющаяся обратно-комплементарной к Ш1РНК, фланкирована с 5'-стороны и с 3'-стороны шпилечными структурами. Ингибиторы микроРНК, если они являются двуцепочечными, могут содержать пары с нарушением комплементарности между нуклеотидами в противонаправленных цепях. Дополнительно, ингибиторы микроРНК могут быть соединены с остатками конъюгатов для облегчения поглощения ингибитора клеткой. Например, ингибитор микроРНК может быть соединен с холестерил-5-(бис-(4метоксифенил)(фенил)метокси)-3-гидроксипентилкарбаматом, который делает возможным пассивное поглощение ингибитора микроРНК клеткой. Ингибиторы микроРНК, включая шпилечные ингибиторы Ш1РНК, подробно описаны в Vе^шеи1еη е1 а1., "ОоиЫе-81гапйей Кедюпк Аге Е88епйа1 Эе^ди С’оШропепЦ 0£ Ро1еп1 ^ЪПоге о£ М8С Рипсйоп", ΚΝΑ 13: 723-730 (2007) и в №02007/095387 и №0 2008/036825, содержание каждой из которых целиком включено сюда в качестве ссылок. Специалист в данной области может выбрать последовательность из базы данных для требуемой Ш1РНК и сконструировать ингибитор, полезный для способов, описанных в этом документе.
и1-адаптор
Ш-адаптеры ингибируют полиА-сайты и представляют собой бифункциональные олигонуклеотиды с целевым доменом, комплементарным сайту в составе терминального экзона целевого гена и "Шдомена", который связывается с И1 малой ядерной РНК, являющейся компонентом И1 мяРНП (Оогас/шак, е1 а1., 2008, ΝΟμ Вю1есЬпо1оду, 27(3), 257-263, содержание которой специально целиком включено сюда в качестве ссылки). И1 мяРНП является рибонуклеопротеиновым комплексом, который функционирует в основном при осуществлении ранних этапов образования сплайсосомы путем связывания с экзон-интронной границей пре-мРНК (Вго\уп апб 81Шр8оп, 1998, Аппи Кеу Р1ап1 Рйу8ю1 Р1ап1 Мо1 Вю1 49:77-95). Нуклеотиды 2-11 на 5'-конце И1 мяРНК связываются путем спаривания оснований с 5'одноцепочечным участком пре-мРНК. В одном из вариантов воплощения олигонуклеотиды согласно изобретению являются и1-адаптерами. В одном из вариантов воплощения Ш-адаптер может вводиться в сочетании по меньшей мере с одним другим агентом, представленным 1РНК.
- 36 028860
Модификации олигонуклеотидов
Немодифицированные олигонуклеотиды могут быть не оптимальными для некоторых применений, например, немодифицированные олигонуклеотиды могут быть склонны к деградации, например, клеточными нуклеазами. Нуклеазы способны гидролизовать фосфодиэфирные связи нуклеиновых кислот. Однако, химические модификации олигонуклеотидов могут придать улучшенные свойства и, например, могут сделать олигонуклеотиды более стабильными к нуклеазам.
Так как олигонуклеотиды являются полимерами, состоящими из субъединиц или мономеров, многие модификации, описанные ниже, происходят по позиции, которая повторяется в олигонуклеотиде, например, модификация основания, сахара, фосфатного остатка или не входящего в состав мостиков атома кислорода фосфатного остатка. Не требуется, чтобы все позиции в данном олигонуклеотиде были однородно модифицированы, и фактически более одной из вышеупомянутых модификаций может быть вовлечено в одном олигонуклеотиде или даже в одном нуклеозиде в пределах олигонуклеотида.
В некоторых случаях модификация будет происходить по всем рассматриваемым позициям в олигонуклеотиде, но во многих, фактически в большинстве, случаев этого происходить не будет. В качестве примера, модификация может происходить только по 3' или 5'-терминальной позиции, может происходить только во внутренней области, может происходить только в терминальных областях, например, в позиции терминального нуклеотида или в крайних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах олигонуклеотида. Модификация может происходить в двуцепочечной области, одноцепочечной области или в обеих.
Модификация может происходить только в области, охватывающей две цепи двуцепочечного олигонуклеотида, или может происходить только в области, охватывающей одну цепь двуцепочечного олигонуклеотида. Например, фосфоротиоатная модификация в позиции не входящего в состав мостиков атома кислорода может происходить только на одном или на обоих концах, может происходить только в терминальных областях, например, в позиции на терминальном нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи, или может происходить в областях, охватывающих две цепи или одну цепь, в частности, на концах. 5'-конец или концы могут быть фосфорилированы.
Модификация, описанная в этом документе, может являться единственной модификацией или единственным типом модификации, включенной во множество нуклеотидов, или модификация может сочетаться с одной или несколькими другими модификациями, описанными в этом документе. Модификации, описанные в этом документе, могут также сочетаться в олигонуклеотиде, например, различные нуклеотиды одного олигонуклеотида могут иметь различные модификации, описанные в этом документе.
В некоторых вариантах воплощения особенно предпочтительно, например, для повышения стабильности, включать некоторые нуклеооснования в "липкие" концы, или включать модифицированные нуклеотиды или заменители нуклеотидов в одноцепочечные "липкие" концы, например, в 5' или 3' "липкий" конец, или в оба. Например, может быть желательно включение пуриновых нуклеотидов в "липкие" концы. В некоторых вариантах воплощения все или некоторые основания в 3' или 5' "липком" конце будут модифицированы, например, с участием модификации, описанной в этом документе. Модификации могут включать, например, применение модификаций по 2' ОН-группе сахара рибозы, например, применение дезоксирибонуклеотидов, например, дезокситимидина, вместо рибонуклеотидов, и модификаций фосфатной группы, например, фосфоротиоатных модификаций. "Липкие" концы могут быть не гомологичны целевой последовательности.
Специфичные модификации обсуждаются более подробно ниже.
Фосфатная группа
Фосфатная группа несет отрицательный заряд. Заряд равномерно распределен между двумя не входящими в состав мостика атомами кислорода. Однако фосфатная группа может быть модифицирована путем замены одного из атомов кислорода другим заместителем. Одним из результатов такой модификации может быть повышенная устойчивость фосфатных остовов РНК олигорибонуклеотида к нуклеолитической деградации. Таким образом, не следуя какой-то определенной теории, в некоторых вариантах воплощения может быть желательным введение изменений, приводящих либо к незаряженным линкерам, либо к заряженным линкерам с несимметричным распределением заряда.
Примеры модифицированных фосфатных групп включают фосфоротиоат, фосфороселенаты, боранофосфаты, боранофосфатные эфиры, Н-фосфонаты, фосфорамидаты, алкил- или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. В некоторых воплощениях один из не входящих в состав мостика атомов кислорода фосфатной группы в остатке фосфатного остова может быть замещен любым из следующих остатков: §, 8е, ВК3 (К - атом водорода, алкил, арил), С (т.е. алкильной группой, арильной группой и т.д.), Н, ΝΡ2 (К атом водорода, алкил, арил), или ОК (К - алкил или арил). Атом фосфора в немодифицированной фосфатной группе не является хиральным. Однако, замена одного из не входящих в состав мостика атомов кислорода одним из перечисленных выше атомов или групп атомов превращает атом фосфора в хиральный; иначе говоря, атом фосфора в фосфатной группе, модифицированной таким способом, является стереогенным центром. Стереогенный атом фосфора может обладать либо "К"-конфигурацией (в этом документе - Кр), либо "δ''-конфигурацией (в этом документе - δρ).
В фосфородитиоатах оба не входящие в состав мостика атома кислорода заменены на серу. Цен- 37 028860
тральный атом фосфора в фосфородитиоатах не является хиральным, что предотвращает образование диастереомеров олигорибонуклеотидов. Таким образом, не следуя какой-то определенной теории, модификации обоих не входящих в состав мостика атомов кислорода, при которых не появляется хиральный центр, например, образование фосфородитиоатов, могут быть желательны благодаря тому, что при этом не будут получаться смеси диастереомеров. Таким образом, не входящие в состав мостика атомы кислорода могут быть независимо заменены на любой атом или группу из δ, δβ, В, С, Н, Ν или ΟΚ (К - алкил или арил).
Фосфатный линкер также может быть модифицирован путем замены входящего в состав мостика атома кислорода (т.е. атома кислорода, соединяющего фосфат с нуклеозидом) на атом азота (образующие мостик фосфорамидаты), атом серы (образующие мостик фосфоротиоаты) и атом углерода (образующие мостик метиленофосфонаты). Может происходить замена как любого из входящих в состав мостика атомов кислорода, так и обоих входящих в состав мостика атомов кислорода. Когда входящий в состав мостика атом кислорода является 3'-атомом кислорода нуклеозида, предпочтительной является замена на атом углерода. Когда входящий в состав мостика атом кислорода является 5'-атомом кислорода нуклеозида, предпочтительной является замена на атом азота.
Замена фосфатной группы
Фосфатная группа может быть заменена на соединяющие группы, не содержащие атом фосфора. Не следуя какой-то определенной теории, полагают, что так как заряженная фосфодиэфирная группа является реакционным центром при нуклеолитической деградации, то ее замена на нейтральный структурный миметик должна придать повышенную стабильность к нуклеазам. С другой стороны, не следуя какой-то определенной теории, может быть желательно в некоторых вариантах воплощения ввести изменения, при которых заряженную фосфатную группу заменяют на нейтральный остаток.
Примеры остатков, которые могут заменять фосфатную группу, включают метилфосфонат, гидроксиламино, силоксан, карбонат, карбоксиметил, карбамат, амид, тиоэфир, этиленоксидный линкер, сульфонат, сульфонамид, тиоформацеталь, формацеталь, оксим, метиленимино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилендиметилгидразо и метиленоксиметилимино. Предпочтительные замены включают метиленкарбониламино и метиленметилимино группы.
Модифицированные фосфатные межнуклеозидные связи, где по меньшей мере один из атомов кислорода, присоединенных к фосфату, был заменен или фосфатная группа была заменена на не содержащую фосфор группу, также называют "не фосфодиэфирные связи остова".
Замена рибофосфатного остова
Могут также быть сконструированы остовы, имитирующие структуру олигонуклеотида, где фосфатный линкер и сахар рибоза заменены на устойчивые к нуклеазам заменители нуклеозидов или нуклеотидов. Не следуя какой-то определенной теории, полагают, что отсутствие повторяющихся заряженных групп в остове снижает связывание с белками, которые распознают полианионы (например, с нуклеазами). С другой стороны, не следуя какой-то определенной теории, может быть желательно в некоторых вариантах воплощения ввести изменения, при которых основания соединены нейтральным остовом из заменителей. Примеры включают мофилино, циклобутил, пирролидин-заменители нуклеозидов и заменитель на основе пептидо-нуклеиновой кислоты (ΡΝΑ). Предпочтительным является заменитель на основе ΡΝΑ.
Модификации концов молекулы
3'- и 5'-концы олигонуклеотида могут быть модифицированы. Такие модификации могут происходить по 3'-концу, 5'-концу или по обоим концам молекулы. Они включают модификацию или замену концевого фосфата целиком или одного или нескольких атомов фосфатной группы. Например, 3'- и 5'концы олигонуклеотида могут быть конъюгированы с другими функциональными молекулами, такими как остатки для мечения, например, флуорофоры (например, пирен, ΤΑΜΚΑ, флуоресцеин, красители Су3 или Су5), или защитные группы (на основе например, серы, силикона, бора или сложного эфира). Функциональные молекулы могут быть присоединены к сахару через фосфатную группу и/или линкер. Концевой атом линкера может присоединяться к соединительному атому фосфатной группы или С-3' или С-5' О, Ν, δ или С групп сахара, или замещать их. В соответствии с другим вариантом, линкер может присоединяться к концевому атому заменителя нуклеотида (например, ΡΝΑ), или замещать его.
Если соединенные в ряд линкер/фосфат-функциональная молекула-линкер/фосфат расположены между двумя цепями двухцепочечнойРНК, этот ряд может заменить петлю РНК-шпильки в РНК-агенте со структурой типа "шпилька".
Модификации концов молекулы, полезные для модуляции активности, включают модификацию 5'конца фосфатом или аналогами фосфата. Например, в предпочтительных вариантах воплощения антисмысловые цепи двухцепочечнойРНК являются фосфорилированными по 5'-концу или содержат фосфорильный аналог на 5'-конце. 5'-фосфатные модификации включают модификации, которые совместимы с опосредованным ΡΙδί'.' сайленсингом генов. Пригодные модификации включают: 5'-монофосфат ((НО)2(О)Р-О-5'); 5'-дифосфат ((НО)2(О)Р-О-Р(НО)(О)-О-5'); 5'-трифосфат ((НО)2(О)Р-О-(НО)(О)Р-ОР(НО)(О)-О-5'); 5'-гуанозиновый кэп (7-метилированный или неметилированный) (7ιη-^Ο-5'-(ΗΟ)(Ο)ΡΟ-(НО)(О)Р-О-Р(НО)(О)-О-5'); 5'-аденозиновый кэп (Аррр), или любую структуру кэпа из модифициро- 38 028860
ванного или ^модифицированного нуклеотида (Ы-О-5'-(НО)(О)Р-О-(НО)(О)Р-О-Р(НО)(О)-О-5'); 5'монотиофосфат (фосфоротиоат; (НО)2(8)Р-О-5'); 5'-монодитиофосфат (фосфородитиоат; (НО)(Н8)(8)РО-5'), 5'-фосфоротиолат ((НО)2(О)Р-8-5'); любую дополнительную комбинацию замены атомов кислорода/серы в монофосфате, дифосфате или трифосфате (например, 5'-а-тиотрифосфат, 5'-у-тиотрифосфат и т.д.), 5'-фосфорамидаты ((НО)2(О)Р-ЫН-5', (НО)(ЫН2)(О)Р-О-5'), 5'-алкилфосфонаты (К=алкил=метил, этил, изопропил, пропил и т.д., например, РР(ОН)(О)-О-5'-, (ОН)2(О)Р-5'-СН2-), 5'-алкил-эфирные фосфонаты (К=алкилэфир=метоксиметил (МеОСН2-), этоксиметил и т.д., например КР(ОН)(О)-О-5'-).
Модификации концов молекулы также могут быть полезны для проведения мониторинга распределения, и в таких случаях предпочтительные для добавления группы включают флуорофоры, например флуоресцеин или краситель А1еха, например А1еха 488. Модификации концов молекулы также могут быть полезны для повышения поглощения, полезные для этого модификации включают холестерол. Модификации концов молекулы также могут быть полезны для поперечной сшивки РНК-агента с другим остатком; полезные для этого модификации включают митомицин С.
Нуклеооснования
Аденин, гуанин, цитозин и урацил являются самыми распространенными основаниями, обнаруженными в РНК. Эти основания могут быть модифицированы или заменены для придания РНК улучшенных свойств. Например, устойчивые к нуклеазам олигорибонуклеотиды можно приготовить с применением этих оснований или синтетических и природных нуклеооснований (например, инозина, тимина, ксантина, гипоксантина, нубуларина, изогуанизина или туберцидина) и любой из вышеуказанных модификаций. В соответствии с другим вариантом, может применяться замещенный или модифицированный аналог любого из вышеупомянутых оснований, например, "нестандартные основания", "модифицированные основания", "неприродные основания" и "универсальные основания", описанные в этом документе. Неограничивающие примеры включают 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 5-гало-урацил и цитозин, 5пропинил-урацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 5галоурацил, 5-(2-аминопропил)урацил, 5-аминоаллилурацил, 8-гало-, амино-, тиол-, тиоалкил-, гидроксил- и другие замещенные по 8 положению аденины и гуанины, 5-трифторометил- и другие замещенные по 5 положению урацилы и цитозины, 7-метилгуанин, замещенные по 5 положению пиримидины, 6азапиримидины и N-2, N-6 и О-6-замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5пропинилурацил и 5-пропинилцитозин, дигидроурацил, 3-деаза-5-азацитозин, 2-аминопурин, 5алкилурацил, 7-алкилгуанин, 5-алкил цитозин,7-деазааденин, N6, Ы6-диметиладенин, 2,6-диаминопурин, 5-аминоаллилурацил, Ы3-метилурацил, замещенные 1,2,4-триазолы, 2-пиридинон, 5-нитроиндол, 3нитропиррол, 5-метоксиурацил, урацил-5-оксиуксусная кислота, 5-метоксикарбонилметилурацил, 5метил-2-тиоурацил, 5-метоксикарбонилметил-2-тиоурацил, 5-метиламинометил-2-тиоурацил, 3-(3амино-3-карбоксипропил)урацил, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, Ы4-ацетилцитозин, 2-тиоцитозин, Ы6-метиладенин, Ы6-изопентиладенин, 2-метилтио-Ы6-изопентениладенин, Ν-метилгуанины или Оалкилированные основания. Дополнительные пурины и пиримидины включают таковые, описанные в патенте США № 3687808, таковые, описанные в Сопсйе Епсус1ореб1а ОГ Ро1утег 8с1епсе Апб Епдтееппд, р. 858-859, 1<го5с11\\й/. II., еб. 1о1т \УПеу & 8оп§, 1990, и таковые, описанные в работе ЕпдЙ8сЬ е1 а1., Апде\\цпб1е СИение, 1п!егпабопа1 ЕбШоп, 1991, 30, 613.
Катионные группы
Модификации олигонуклеотидов также могут включать присоединение одной или нескольких катионных групп к сахару, основанию и/или атому фосфора в составе фосфата или остатка модифицированного фосфатного остова. Катионная группа может быть присоединена к любому атому, способному к замещению, в составе природного, нестандартного или универсального основания. Предпочтительной позицией является позиция, которая не препятствует гибридизации, т.е. не препятствует образованию взаимодействий в виде водородных связей, необходимых для образования пар оснований. Катионная группа может быть присоединена, например, через С2'-позицию сахара или аналогичную позицию в циклическом или ациклическом заменителе сахара. Катионные группы могут включать, например, протонированные аминогруппы, производные, например, О-АМ1ЫЕ (АМ1ЫЕ = ЫН2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диарил амино, гетероарил амино или дигетероарил амино, этилендиамин, полиамино); аминоалкокси, например, О(СН2)пАМ1ЫЕ, (например, АМ1ЫЕ = ЫН2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диарил амино, гетероарил амино или дигетероарил амино, этилендиамин, полиамино); амино (например, ЫН2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диарил амино, гетероарил амино, дигетероарил амино или аминокислота); или ЫН(СН2СН2ЫН)пСН2СН2-АМ1ЫЕ (АМ1ЫЕ = ЫН2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероарил амино или дигетероарил амино).
Расположение в пределах олигонуклеотида
Некоторые модификации могут предпочтительно включаться в состав олигонуклеотида в определенных положениях, например, во внутренней части цепи или на 5' или 3'-конце олигонуклеотида. Предпочтительное положение модификации в составе олигонуклеотида может придавать предпочтительные свойства агенту. Например, предпочтительные места расположения некоторых модификаций могут при- 39 028860
давать оптимальные свойства в обеспечении сайленсинга генов, или повышенную устойчивость к эндонуклеазной или экзонуклеазной активности.
Один или несколько нуклеотидов в составе олигонуклеотида могут иметь соединение 2'-5'. Один или несколько нуклеотидов в составе олигонуклеотида могут иметь инвертированное соединение, например, соединение 3'-3', 5'-5', 2'-2' или 2'-3'.
Двуцепочечные олигонуклеотиды могут включать по меньшей мере один динуклеотид 5'-уридинаденин-3' (5'-ИА-3'), при этом уридин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или концевой динуклеотид 5'-уридин-гуанин-3' (5'-ИО-3'), при этом 5'-уридин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или концевой динуклеотид 5'-цитидин-аденин-3' (5'-СА-3'), при этом 5'-цитидин является 2'модифицированным нуклеотидом, или концевой динуклеотид 5'-уридин-уридин-3' (5'-ии-3'), при этом 5'-уридин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или концевой динуклеотид 5'-цитидин-цитидин3' (5'-СС-3'), при этом 5'-цитидин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или концевой динуклеотид 5'-цитидин-уридин-3' (5'-СИ-3'), при этом 5'-цитидин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или концевой динуклеотид 5'-уридин-цитидин-3' (5'-ИС-3'), при этом 5'-уридин является 2'модифицированным нуклеотидом. Двуцепочечные олигонуклеотиды, содержащие эти модификации, особенно стабильны к эндонуклеазной активности.
Общие ссылки
Олигорибонуклеотиды и олигорибонуклеозиды, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть синтезированы с применением твердофазного синтеза, см., например, "ОНдоиис1еоЬйе 8уи!Ье818, а ргасЬса1 арргоасЬ", Ей. М. ί. Оай, ШЬ Рге88, 1984; "О11доиис1еойДе8 аий Апа1одие8, А РгасЬса1 АрргоасЬ", Ей. Р. ЕскЧеш, ШЬ Рге88, 1991 (особенно Глава 1, Мойегп тасЫпе-нйей те!Ьой8 о£ оЬдойео\упЫопис1еоЬйе 8уп1Не818„ Глава 2, ОПдопЫопис1еоЬйе 8уп!Ье818, Глава 3, 2'-ОМе!Ьу1ойдог1Ыопис1еоййе- 8: 8уп!Ье818 апй аррЬсайопз, Глава 4, РЬо8рЬого!Ыоа!е о11допис1еоййе8, Глава 5, 8уп!Ье818 о£ оЬдопискоЬйе рЬо8рЬогоййЫоа!е8, Глава 6, 8уп1Ье818 о£ о1|до-2'-йео\уг|Ыопис1ео81йе те!Ьу1рЬо8рЬопа!е8, и Глава 7, О1|дойео\упис1ео11йе8 сойаштд тойШей Ыа8е8. Другие особенно полезные способы синтеза, реагенты, блокирующие группы и условия проведения реакций описаны в Майш, Р., Не1у. СЫт. Ас!а, 1995, 78, 486-504; Веаисаде, 8.Ь. апй Цег, К.Р., Те!гаЬейгоп, 1992, 48, 2223-2311 апй Веаисаде, 8.Ь. апй !уег, К.Р., Те1гаЬейгоп, 1993, 49, 6123-6194, или работах, на которые даны ссылки в этих публикациях. Модификации, описанные в \УО 00/44895, \УО 01/75164 или \УО 02/44321, могут применяться в этом документе. Раскрытие всех публикаций, патентов и опубликованных заявок на патент, перечисленных в этом документе, включены сюда в качестве ссылок.
Ссылки по фосфатным группам
Получение фосфинатных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5508270. Получение алкилфосфонатных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 4469863. Получение фосфорамидитных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5256775 или патенте США № 5366878. Получение фосфотриэфирных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5023243. Получение боранофосфатных олигорибонуклеотидов описано в патентах США № 5130302 и 5177198. Получение 3'дезокси-3'-амино фосфорамидатных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5476925. 3'дезокси-3'-метиленфосфонатные олигорибонуклеотиды описаны в Ап, Н., е! а1. ί. Огд. СЬет. 2001, 66, 2789-2801. Получение соединенных серосодержащими мостиками нуклеотидов описано в 8ргоа! е! а1. Ыис1ео81йе8 Мис1еоЬйе8 1988, 7,651 и Сго88Йск е! а1. Те!гаЬейгоп Ьей. 1989, 30, 4693.
Ссылки по группам сахара
Модификации, относящиеся к 2'-модификациям, можно найти в Vе^та. 8. е! а1. Аппи. Кеу. ВюсЬет. 1998, 67, 99-134 и ссылках, приведенных в этой работе. Специфичные модификации рибозы можно найти в следующих работах: 2'-фторо- (Ка\уа8аЫ е! а1., ί. Мей. СЬет., 1993, 36, 831-841), 2'-МОЕ (Майт, Р. Не1у. СЫт. Ас!а 1996, 79, 1930-1938), "1.\А" (№епде1, ί. Асс. СЬет. Ке8. 1999,32, 301-310).
Ссылки по замене фосфатной группы
Метиленметилимино-сшитые олигорибонуклеозиды, также называемые в этом документе ММЬ сшитыми олигорибонуклеозидами, метилендиметилгидразо-сшитые олигорибонуклеозиды, также называемые в этом документе МОН-сшитыми олигорибонуклеозидами, и метиленкарбониламино-сшитые олигонуклеозиды, также называемые в этом документе амидо-3-сшитыми олигорибонуклеозидами, и метиленаминокарбонил-сшитые олигонуклеозиды, также называемые в этом документе амидо-4сшитыми олигорибонуклеозидами, а также соединения со смешанным остовом, содержащие, например, чередующиеся ММ1 и РО или Р8 связи, могут быть получены как описано в патентах США № 5378825, 5386023, 5489677 и в опубликованных РСТ заявках на патент РСТ/И892/04294 и РСТ/И892/04305 (опубликованных как \УО 92/20822 \УО и 92/20823 соответственно). Формацеталь- и тиоформацеталь-сшитые олигорибонуклеозиды могут быть получены как описано в патентах США № 5264562 и 5264564. Этиленоксид-сшитые олигорибонуклеозиды могут быть получены как описано в патентах США № 5223618. Замены на силоксан описаны в Согш1ег, 1.Р. е! а1. Ыис1е1с Ас1й8 Ке8. 1988, 16, 4583. Замены на карбонат описаны в ТЫешог, 1.К. 1. СЬет. 8ос. С 1971, 1933. Замены на карбоксиметил описаны в Ейде, М.Э. е! а1. I. СЬет. 8ос. Регкт Тгап8. 1 1972, 1991. Замены на карбамат описаны в 8ЬгсЬак, Е.Р. Ыис1е1с Ас1й8 Ке8. 1989, 17, 6129.
- 40 028860
Ссылки по замене фосфато-рибозного остова
Соединения циклобутилового заменителя сахара могут быть получены как описано в патенте США № 5359044. Пирролидиновый заменитель сахара может быть получен как описано в патенте США № 5519134. Морфолиновый заменитель сахара может быть получен как описано в патентах США № 5142047 и 5235033, и в раскрытиях других родственных патентов. Пептидо-нуклеиновые кислоты (ΡΝΑ) известны как таковые и могут быть получены в соответствии с любым из множества способов, указанных в РерРбе Жс1е1с Ас1б§ (ΡΝΑ): 8упШе515, РгоретНо апб Ро1ееиЫ АррНсаРопз, Вюогдашс & Мебюта1 СИе'тШгу, 1996, 4, 5-23. Они также могут быть получены в соответствии с патентом США № 5539083.
Ссылки по модификациям концов молекул
Модификации концов молекул описаны в МапоЪагап, М. ей а1. Апйзепзе апб Жс1ею Ас1б Бгид Беνе1οртеηΐ 12, 103-128 (2002) и ссылках, приведенных в этой работе.
Ссылки по нуклеооснованиям
Ν-2-замещенные пуриновые нуклеозид амидиты могут быть получек пы как описано в патенте США № 5459255. 3-деазапуриновые нуклеозид амидиты могут быть получены как описано в патенте США № 5457191. 5,6-Замещенные пиримидиновые нуклеозид амидиты могут быть получены как описано в патенте США № 5614617. 5-Пропинил пиримидиновые нуклеозид амидиты могут быть получены как описано в патенте США № 5484908.
Линкеры
Термин "линкер" означает органический остаток, который соединяет две части соединения. В типичном случае, линкеры содержат прямую связь или атом, такой как атом кислорода или атом серы, структурную единицу, такую как ΝΚ1, С(О), С(О)\Н, δθ, 8О2, 8Ο2ΝΗ или цепочку атомов, такую как замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный акинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероарилалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкенилгетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкенилгетероарилалкинил, алкинилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, где один или несколько остатков метилена могут прерываться или заканчиваться атомом или группой О, 8, 8(О), 8О2, Ν(Κ?)2, С(О), расщепляемой линкерной группой, замещенным или незамещенным арилом, замещенным или незамещенным гетероарилом, замещенным или незамещенным гетероциклом; где К1 это атом водорода, ацил, алифатическая или замещенная алифатическая группа.
В одном из вариантов воплощения линкер является -[(Ρ-Ρ-Κ)ς-Χ-(Ρ'-Ρ'-Κ')ς']ς"-Т-, где Р, К, Т, Р', К' и Т каждый независимо для каждого случая отсутствует, является СО, ΝΗ, О, 8, ОС(О), ΝΗΟ^), СН2, (ΊΕΝΙI, СН2О, NΗСΗ(Ка)С(Ο), -С(О)-СН(Ка)-, ΝΗ-, С^^О,
или гетероциклил;
О и 9' каждый независимо для каждого случая отсутствует, является -(СН2)п-, -С(К1)(К2)(СН2)п-, -(СН2)пС(К1)(К2)-, -(СН2СН2О)тСН2СН2- или -(СНзСНзО^СНзСН^Н-;
X - отсутствует или является расщепляемой линкерной группой;
Ка является Н или боковой цепью аминокислоты;
К1 и К2 каждый независимо для каждого случая является Н, СН3, ОН, 8Н или Ν(Κν)2;
ΚΝ независимо для каждого случая является Н, метилом, этилом, пропилом, изопропилом, бутилом или бензилом;
с], (]' и с|" каждый независимо для каждого случая равняется 0-20, и при этом повторяющаяся единица может быть той же самой или иной;
п независимо для каждого случая равняется 1-20; т независимо для каждого случая равняется 0-50.
В одном из вариантов воплощения линкер содержит по меньшей мере одну расщепляемую линкерную группу.
В некоторых воплощениях линкер является разветвленным линкером. Точка ветвления разветвленного линкера может являться по меньшей мере трехвалентным, но может быть тетравалентным, пентавалентным или гексавалентным атомом, или группой, обеспечивающей такие множественные валентности. В некоторых воплощениях точка ветвления представлена -Ν, -Ν(Ρ)-% -О-С, -8-С, -88-С, -С^^^-С, -ОЦО^^-С, или -ЭД^С^О-С; где О независимо для каждого случая является Н или
- 41 028860
необязательно замещенным алкилом. В другом варианте воплощения точка ветвления является глицерином или производным глицерина.
Расщепляемые линкерные группы
Расщепляемая линкерная группа - это группа, которая в существенной мере стабильна вне клетки, но при попадании в целевую клетку расщепляется с высвобождением двух частей, которые линкер удерживает вместе. В предпочтительном воплощении расщепляемая линкерная группа расщепляется по меньшей мере в 10 раз или более, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз быстрее в целевой клетке или при первом стандартном условии (которое может, например, быть выбрано для моделирования или создания образца внутриклеточных условий), чем в крови субъекта, или при втором стандартном условии (которое может, например, быть выбрано для моделирования или создания образца условий, обнаруженных в крови или сыворотке).
Расщепляемые линкерные группы чувствительны к расщепляющим агентам, например, рН, окислительно-восстановительному потенциалу или присутствию способствующих деградации молекул. В общем случае, расщепляющие агенты или в большей степени преобладают или обнаруживаются с более высоким уровнем содержания или активностей внутри клетки, чем в сыворотке или крови. Примеры таких деградирующих агентов включают: окислительно-восстановительные агенты, которые выбраны для конкретных субстратов или которые не имеют субстратной специфичности, включая, например, окислительные или восстановительный ферменты или восстановительные агенты, такие как меркаптаны, присутствующие в клетке, которые могут деградировать чувствительную к окислительновосстановительному потенциалу расщепляемую линкерную группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или агенты, способные создавать кислые условия окружающей среды, например, таковые, приводящие к показателю рН 5 или ниже; ферменты, способные гидролизовать или деградировать расщепляемую в кислых условиях линкерную группу по механизму общего кислотного катализа, пептидазы (которые могут быть субстрат-специфичными) и фосфатазы.
Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может быть чувствительной к рН. Сыворотка человека имеет рН 7,4, в то время как среднее значение рН внутри клетки немного ниже, в диапазоне примерно 7,1-7,3. В эндосомах значение рН более кислое, в диапазоне 5,5-6,0, а лизосомы имеют еще более кислый рН со значением около 5,0. Некоторые линкеры содержат расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется при предпочтительном значении рН, посредством этого высвобождая катионный липид от лиганда внутри клетки или внутри требуемого компартмента клетки.
Линкер может включать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой линкерной группы, внедренной в линкер, может зависеть от целевой клетки. Например, лиганды, направленного действия на клетки печени, могут быть присоединены к катионным липидам через линкер, который содержит сложноэфирную группу. В клетках печени содержится много эстераз, по этой причине линкер будет расщепляться более эффективно в клетках печени, чем в типах клеток, не богатых содержанием эстераз. Другие типы клеток, богатых эстеразами, включают клетки легкого, коркового вещества почки и семенников.
Линкеры, содержащие пептидные связи, могут применяться, если направленное действие осуществляется на типы клеток, богатые пептидазами, такие как клетки печени и синовиоциты.
В общем случае, пригодность кандидатной расщепляемой линкерной группы можно оценить с помощью испытания способности деградирующего агента (или условия) расщеплять кандидатную линкерную группу. Также желательно дополнительно испытать кандидатную расщепляемую линкерную группу на способность быть устойчивой к расщеплению в крови или при контакте с другими не целевыми тканями. Таким образом, можно определить относительную чувствительность к расщеплению при первом и втором условии, при этом первое выбрано так, чтобы оно моделировало расщепление в целевой клетке, а второе выбрано таким образом, чтобы оно моделировало расщепление в других тканях или биологических жидкостях, например, в крови или сыворотке. Оценку можно проводить в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в органной или тканевой культуре, или на целом организме животного. Может оказаться полезным провести начальную оценку в условиях бесклеточной системы или культуры и подтвердить ее путем дополнительной оценки на целом организме животного. В предпочтительных воплощениях, полезные кандидатные соединения расщепляются по меньшей мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях ίη νίΐΐΌ, выбранных так, чтобы они моделировали внутриклеточные условия), по сравнению с кровью или сывороткой (или в условиях ίη νίίΐΌ, выбранных так, чтобы они моделировали условия внеклеточной среды).
Чувствительные к окислительно-восстановительному потенциалу расщепляемые линкерные группы
Один класс расщепляемых линкерных групп представлен чувствительными к окислительновосстановительному потенциалу расщепляемыми линкерными группами, которые расщепляются при восстановлении или окислении. Примером расщепляемой при восстановлении линкерной группы является дисульфидная линкерная группа (-8-8-). Чтобы определить, является ли кандидатная расщепляемая линкерная группа пригодной "расщепляемой при восстановлении линкерной группой", или, например, пригодной для применения с конкретным остатком интерферирующей РНК и конкретным агентом на- 42 028860
правленного действия, можно ориентироваться на способы, описанные в этом документе. Например, кандидатную группу можно оценить путем инкубирования с дитиотреитолом (ΌΤΤ) или с другим восстанавливающим агентом, применяя известные специалисту в данной области реагенты, что воспроизводит скорость расщепления, которая наблюдалась бы в клетке, например, в целевой клетке. Кандидатную группу также можно оценить в условиях, которые выбраны так, чтобы они моделировали условия в крови или сыворотке. В предпочтительном воплощении, кандидатные соединения расщепляются в крови не более чем на 10%. В предпочтительных воплощениях, полезные кандидатные соединения деградируют по меньшей мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или в условиях ш νίίΓο, выбранных так, чтобы они моделировали внутриклеточные условия), по сравнению с кровью (или в условиях ш νίίτο, выбранных так, чтобы они моделировали условия внеклеточной среды).
Скорость расщепления кандидатных соединений можно определить с применением стандартного анализа ферментативной кинетики в условиях, выбранных так, чтобы они моделировали внутриклеточную среду, и в сравнении с условиями, выбранными таким образом, чтобы они моделировали внеклеточную среду.
Расщепляемые линкерные группы на основе фосфата
Расщепляемые линкерные группы на основе фосфата расщепляются агентами, которые деградируют или гидролизуют фосфатную группу. Примером агента, расщепляющего фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как клеточные фосфатазы. Примерами линкерных групп на основе фосфата являются -О-Р(О)(ОКк)-О-, -О-Р(5)(ОКк)-О-, -О-Р(5)(5Кк)-О-, -5-Р(О)(ОКк)-О-, -О-Р(О)(ОКк)-5-, -5-Р(О)(ОКк)-5-, -О-Р(5)(ОКк)-5-, -5-Р(5)(ОКк)-О-, -О-Р(О)(Кк)-О-, -О-Р(5)(Кк)-О-, -5-Р(О)(Кк)-О-, -δΡ(δ)(ΚΚ)-Θ-, -8-Р(О)(Кк)-8-, -Θ-Ρ(δ)(ΚΧ)-δ-. Предпочтительными воплощениями являются -О-Р(О)(ОН)О-, -О-Р(5)(ОН)-О-, -О-Р(5)(5Н)-О-, -5-Р(О)(ОН)-О-, -О-Р(О)(ОН)-5-, -5-Р(О)(ОН)-5-, -О-Р(5)(ОН)-5-, -δР(5)(ОН)-О-, -О-Р(О)(Н)-О-, -О-Р(5)(Н)-О-, -5-Р(О)(Н)-О-, -5-Р(5)(Н)-О-, -5-Р(О)(Н)-5-, -О-Р(5)(Н)-5-. Предпочтительным воплощением является -О-Р(О)(ОН)-О-. Эти кандидатные соединения можно оценить с применением способов, аналогичных описанным выше.
Расщепляемые под действием кислоты линкерные группы
Расщепляемые под действием кислоты линкерные группы являются линкерными группами, которые расщепляются в кислых условиях. В предпочтительных воплощениях, расщепляемые под действием кислоты линкерные группы расщепляются в кислой среде со значением рН около 6,5 или ниже (например, около 6,0, 5,5, 5,0 или ниже), или под действием агентов, таких как ферменты, которые могут действовать по общему кислотному механизму. В клетке специфичные органеллы с низким рН, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечивать способствующее расщеплению окружение для расщепляемых под действием кислоты линкерных групп. Неограничивающие примеры расщепляемых под действием кислоты линкерных групп включают гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые под действием кислоты группы могут иметь общую формулу ^=ΝΝ-, -С(О)О или -ОС(О). В предпочтительном воплощении, атом углерода, присоединенный к атому кислорода сложного эфира (алкокси-группа) принадлежит арильной группе, замещенной алкильной группе или третичной алкильной группе, такой как диметил пентил или трет-бутил. Эти кандидатные соединения можно оценить с применением способов, аналогичных описанным выше.
Линкерные группы на основе сложного эфира
Линкерные группы на основе сложного эфира, которые подлежат расщеплению, расщепляются в клетках ферментами, такими как эстеразы и амидазы. Неограничивающие примеры расщепляемых линкерных групп на основе сложного эфира включают сложные эфиры алкиленовых, алкениленовых и алкиниленовых групп. Расщепляемые линкерные группы на основе сложного эфира имеют общую формулу -С(О)О- или -ОС(О)-. Эти кандидатные соединения можно оценить с применением способов, аналогичных описанным выше.
Расщепляемые группы на основе пептида
Расщепляемые линкерные группы на основе пептида расщепляются в клетках ферментами, такими как пептидазы и протеазы. Расщепляемые линкерные группы на основе пептида представляют собой пептидные связи, сформированные между аминокислотами с образованием олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Расщепляемые группы на основе пептида не включают амидогруппу (-С(О)МН-). Амидогруппа может образовываться между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь является особым типом амидной связи, сформированной между аминокислотами с образованием пептидов и белков. Расщепляемая группа на основе пептида в общем случае ограничена пептидной связью (т. е. амидной связью), сформированной между аминокислотами с образованием пептидов и белков, и не включает полностью функциональную амидогруппу. Расщепляемые линкерные группы на основе пептида имеют общую формулу МНСНКХ^МНСН^СЮ)-, где КА и Кв К-группы двух соседних аминокислот. Эти кандидатные соединения можно оценить с применением способов, аналогичных описанным выше.
- 43 028860
Лиганды
Широкое разнообразие молекул может быть присоединено к олигонуклеотидам и липидам по настоящему изобретению. Предпочтительными остатками являются лиганды, которые присоединяют, предпочтительно ковалентно, либо непосредственно, либо опосредованно через вставочный элемент.
В предпочтительных воплощениях, лиганд изменяет распределение, направление действия или время существования молекулы, в которую он внедрен. В предпочтительных воплощениях, лиганд обеспечивает повышенную аффинность к выбранной мишени, например, к молекуле, клетке или типу клеток, компартменту, например, клеточному или органному компартменту, к ткани, органу или области тела, при, например, сравнении с формой, лишенной такого лиганда. Лиганды, обеспечивающие повышенную аффинность к выбранной мишени также называют нацеливающими лигандами. Предпочтительными лигандами для конъюгации с липидами по настоящему изобретению являются лиганды направленного действия.
Некоторые лиганды могут обладать эндосомолитическими свойствами. Эндосомолитические лиганды способствуют лизису эндосомы и/или транспорту композиции согласно изобретению, или ее компонентов, из эндосомы в цитоплазму клетки. Эндосомолитический лиганд может являться полианионным пептидом или пептидомиметиком, демонстрирующим рН-зависимую мембранную активность и фузогенность. В некоторых воплощениях эндосомолитический лиганд приобретает свою активную конформацию при эндосомальном значении рН. "Активная" конформация - это конформация, при которой эндосомолитический лиганд обеспечивает лизис эндосомы и/или транспорт композиции согласно изобретению, или ее компонентов, из эндосомы в цитоплазму клетки. Примеры эндосомолитических лигандов включают ОЛЬА-пептид (ЗиЬЬагао е1 а1., ВюсйетШгу, 1987, 26: 2964-2972), ЕАЬА-пептид ^о§е1 е1 а1., I. Ат. Сйет. Зос, 1996, 118: 1581-1586), и их производные (Тигк е1 а1., Вюсйет. Вюрйук. Ас1а, 2002, 1559: 56-68). В некоторых воплощениях эндосомолитический компонент может содержать химическую группу (например, аминокислоту), которая будет претерпевать изменение заряда или протонирование в ответ на изменение рН. Эндосомолитический компонент может быть линейным или разветвленным. Примеры первичных последовательностей эндосомолитических лигандов на основе пептидов показаны в табл. 5.
Таблица 5
Список пептидов, обладающих эндосомолитической активностью
Название Последовательность (οτΝ- κ С-концу) Ссылка
САЙА ААЕЕАЕАЕАЕЕАЕАЕАЕЕАЕАЕААААООС 1
ЕАЬА ААЕАЕАЕАЕАЕАЕАЕАЕАЕАЕАЕААААООС 2
ΑΕΕΑΕΑΕΑΕΕΑΕΑΕΑ 3
ΙΝΓ-7 ΟΕΓΕΑΙΕΟΓΙΕΝΟ\νΕΟΜΙ\νϋΥΟ 4
Ιηί НА-2 ΟίΕΟΑΙΑΟΠΕΝΟ\\ΈΟΜΙΟΟ\\ΎΟ 5
άίΙΝΓ-7 ΘΕΕ ΕΑΙ ΕΟΓΙ ΕΝ 04' ΕΟΜΙ ϋΟλΥΥΟΟ ΘΕΕ ΕΑΙ ΕΟΓΙ ΕΝ 04' ΕΟΜΙ ϋΟν/ΥΟΟ 5
άίΙΝΓ3 ΟίΕ ΕΑΙ ΕΟΓΙ ΕΝ 04' ΕΟΜΙ ϋΟΟΟ ΟίΕ ΕΑΙ ΕΟΓΙ ΕΝ 04' ΕΟΜΙ ϋΟΟΟ 6
ΘΕΕ ΟίΡΟΑίΑΕΑίΑΕΑίΑΕΗίΑΕΑίΑΕΑίΕΑίΑΑΟΟδΟ 6
ΟΑΕΑ-ΙΝΕ3 ΟίΡίΑΙίΟΡΙίΝΟ4'ΈΟίΑίΑίΑίΑίΕΑίΑΑΟΟ8€’ 6
ΙΝΓ-5 ΟίΕ ΕΑΙ ΕΟΓΙ ΕΝ 04' ΕΟηΙ ϋθ К ΟίΕ ΕΑΙ ΕΟΓΙ ΕΝ 04' ΕΟηΙ ϋθ 4
п - норлейцин.
Ссылки
1. 5иЬЬагао είа1., Βίοείιεπύεΐτγ, 1987, 26: 2964-2972.
2. Уо§е1 εί а1„ I. Ат. С1ют. 5ос„ 1996, 118: 1581 -1586
3. Тигк, Μ. 1., Ρεάάν. 1. Α. εΐ а1. (2002). СкагайопгаЕоп οί а ηονεί ρΗ-εεηδίίίνε ρερίίάε Ига! опкапоез άηΐ£ геказо ίΐΌηιίοΡιίε-ίΒπ;είεά Нрозотоз а! εηάοδοηκιΐ рПз. ВюсЫт. ΒίορΗγζ. АсГа 1559, 56-68.
4. Р1апк, С. ОЪогЬаизог, В. ΜεεΙιίΙεΓ, К. КосН. С. \\’а§пег, Е. (1994). ΤΗε ίηΠιιεηεε οί εηάθ5οηιε-άί5πιρΐίνε ρερίίάεε оп §спс ИапзГсг пзте, зу πΐΐιείΐε νίηΐ5-1ίΚε βεηε ИапзГсг 5γ5ίεηΐ5, 1. Βϊοΐ. Скот. 269 12918-12924.
5. Маз1гоЬаШз1а, Ε., Κοηίη§. Ο. Α. εΐ а1. (2002). Гппс0опа1 сНагаОеп/аОоп οί ап εηάοεοιηε-άίεηιρίίνε ρερίίάε апб ίΐ8 аррПсаОоп ίη εγίοεοίίε άεΐίνείλ οί ίηιηηιηοΙίροδοηιε-εηίιηρρεά ριοίοϊ пз. 1. ΒϊοΙ. СНет. 277, 27135-43.
6. ОЪогЬаизог, В., Р1апк, С. εΐ а1. (1995). Епкапст§ опбозота1 εχίί οί ηιιείείε ηεϊάδ изт§ ρΗ-εεηδίίίνε упа1 ίύείοη ρερΐίάεε. ϋεΐίν. 54Ήίε£ίε5 АпОзопзс Οΐίβοηιιείεοίίάε ΤΙιει. 247-66.
Предпочтительные лиганды могут улучшать свойства, связанные с транспортом, гибридизацией и специфичностью, и также могут улучшать устойчивость к нуклеазам получившегося в результате при- 44 028860
родного или модифицированного олигорибонуклеотида или полимерной молекулы, содержащей любую комбинацию мономеров, описанных в этом документе, и/или природные или модифицированные рибонуклеотиды.
В целом лиганды могут содержать терапевтические модификаторы, например, для усиления поглощения; диагностические соединения или репортерные группы, например, для мониторинга распределения; агенты для поперечной сшивки; и остатки, придающие устойчивость к нуклеазам. Основные примеры включают липиды, стероиды, витамины, сахара, белки, пептиды, полиамины и миметики пептидов.
Лиганды могут включать субстанцию природного происхождения, такую как белок (например, сывороточный альбумин человека (И8А), липопротеин низкой плотности (ЛНП), липопротеин высокой плотности (ЛВП) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновая кислота); или липид. Лиганд также может являться рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота или олигонуклеотид (например, аптамер). Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту полилизин (РЬЬ), поли-Ь-аспарагиновую кислоту, поли-Ь-глутаминовую кислоту, сополимер стиреновой кислоты с малеиновым ангидридом, поли-(Ь-лактид-когликолевый) сополимер, сополимер дивинилового эфира с малеиновым ангидридом, ^(2-гидроксипропил)метакриламидный сополимер (НМРА), полиэтиленгликоль (РЕО), поливиниловый спирт (РУА), полиуретан, поли-(2-этилакриловую кислоту), Νизопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают: полиэтиленимин, полилизин (РЬЬ), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, пептидомиметический полиамин, дендримерный полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или а-спиральный пептид.
Лиганды также могут включать группы направленного действия, например, агенты, направленного действия на клетку или ткань, например, лектин, гликопротеин, липид или белок, например, антитело, связывающееся с определенным типом клеток, таким как клетки почки. Группа направленного действия может являться тиротропином, меланотропином, лектином, гликопротеином, сурфактантным белком А, углеводом муцина, мультивалентной лактозой, мультивалентной галактозой, Ν-ацетил-галактозамином, Ν-ацетил-глюкозамином, мультивалентной маннозой, мультивалентной фукозой, гликозилированными полиаминокислотами, мультивалентной галактозой, трансферрином, бисфосфонатом, полиглутаматом, полиаспартатом, липидом, холестеролом, стероидом, жёлчной кислотой, фолатом, витамином В12, биотином, ΡΟΌ-пептидом, миметиком ΡΟΌ-пептида или аптамером. В табл. 6 показаны некоторые примеры лигандов направленного действия и ассоциированных с ними рецепторов.
- 45 028860
Таблица 6
Лиганды направленного действия и ассоциированные с ними рецепторы
Клетки печени Лиганд Рецептор
1) Паренхимная клетка (РС) (гепатоциты) Галактоза ΑδΟΡ-Κ (рецептор асиологликопротеинов)
Оа1 N Ас (Ν-ацетил-галактозамин) ΑδΡΟ-Κ Рецептор Оа1 N Ас
Лактоза
Асиалофетуин ΑδΡΟ-τ
2) Синусоидальная эндотелиальная клетка (8ЕС) Гиалуроновая кислота Рецептор гиалуроновой кислоты
Про-коллаген Рецептор про-коллагена
Отрицательно заряженные молекулы Фагоцитарные рецепторы
Манноза Рецепторы маннозы
N -ацетил-г люкозамин Фагоцитарные рецепторы
Иммуноглобулины Рецептор Рс
Липополисахарид Рецептор СО 14
Инсулин Рецептор-опосредованный трансцитоз
Трансферрин Рецептор-опосредованный трансцитоз
Альбумины Неспецифичные
Конъюгаты сахаров с альбуминами
Маннозо-6-фосфат Рецептор маннозо-6фосфата
3) Клетка Купффера (КС) Манноза Рецепторы маннозы
Фукоза Рецепторы фукозы
Альбумины Неспецифичные
Конъюгаты маннозы с альбуминами
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие агенты (например, акридины), поперечные сшивки (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), не природные эндонуклеазы (например, ЭДТА), липофильные молекулы, например, холестерол, холевую кислоту, адамантан-уксусную кислоту, 1-пирен-масляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бисО(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, О3(олеоил)литохолевую кислоту, О3-(олеоил)холевую кислоту, конъюгаты диметокситритила или феноксазина с пептидом (например, пептидом ап!еппареЙ1а, Та!-пептидом), алкилирующие агенты, фосфат, амино-, меркапто-, ПЭГ (например, ПЭГ-40К), МПЭГ, [МПЭГ]2, полиамино-, алкил, замещенный алкил, радиоактивно меченные маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), соединения, способствующие транспорту/всасыванию (например, аспирин, витамин Е, фолевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, кластеры имидазола, конъюгаты акридина и имидазола, Еи3+ комплексы тетраазамакроциклов), динитрофенил, НКР или АР.
Лиганды могут быть белками, например, гликопротеинами, или пептидами, например, молекулами,
- 46 028860
имеющими специфичную аффинность к ко-лиганду, или антителами, например, антителом, связывающимся со специфичным типом клеток, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или клетка кости. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать непептидные молекулы, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, мультивалентная лактоза, мультивалентная галактоза, Ν-ацетил-галактозамин, Ν-ацетил-глюкозамин, мультивалентная манноза, мультивалентная фукоза или аптамеры. Лиганд может являться, например, липополисахаридом, активатором р38 МАР-киназы, или активатором ΝΡ-кВ.
Лиганд может быть субстанцией, например лекарственным веществом, которое может повышать поглощение агента, участвующего в РНК1, клеткой, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например, посредством разрушения клеточных микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов. Лекарственное вещество может быть, например, таксоном, винкристином, винбластином, цитохалазином, нокодазолом, ясплакинолидом, латрункулином А, фаллоидином, свинхолидом А, инданоцином или миосервином.
Лиганд может повышать поглощение агента, участвующего в РНК1, клеткой путем, например, активации воспалительного ответа. Примеры лигандов, которые могли бы оказывать такое действие, включают фактор некроза опухолей α (ΤΝΡ-α), интерлейкин-1 β или γ-интерферон.
В одном из вариантов настоящего изобретения, лиганд является липидом или молекулой на основе липида. Такой липид или молекула на основе липида предпочтительно связываются с белком сыворотки, например, сывороточным альбумином человека (ΗδΑ). ΗδΑ-связывающий лиганд делает возможным распределение конъюгата к целевой ткани, например, не входящей в состав почек целевой ткани организма. Например, целевая ткань может быть тканью печени, включая паренхимные клетки печени. Другие молекулы, связывающиеся с ΗδΑ, также могут применяться в качестве лигандов. Например, могут применяться непроксин или аспирин. Липид или лиганд на основе липида может (а) повышать устойчивость конъюгата к деградации, (б) усиливать направленное действие или транспорт в целевую клетку или к клеточной мембране и/или (в) может применяться для регулировки связывания с белком сыворотки, например, ΗδΑ.
Лиганд на основе липида может применяться для модуляции, например, для контроля связывания конъюгата с целевой тканью. Например, липид или лиганд на основе липида, который связывается с ΗδΑ более сильно, с меньшей вероятностью будет направлен на почки и следовательно, с меньшей вероятностью будет выводиться из организма. Липид или лиганд на основе липида, который связывается с ΗδΑ менее сильно, может применяться для направленного действия конъюгата на почки.
В предпочтительном воплощении, лиганд на основе липида связывается с ΗδΑ. Предпочтительно он связывается с ΗδΑ с существенной аффинностью, таким образом, что конъюгат будет предпочтительно распределяться к не входящим в состав почек тканям. Однако предпочтительно, чтобы аффинность не была настолько сильной, что связывание ΗδΑ с лигандом было бы необратимым.
В другом предпочтительном воплощении, лиганд на основе липида связывается с ΗδΑ слабо или не связывается вовсе, таким образом, что конъюгат будет предпочтительно распределяться к почкам. Другие остатки, направленные к клеткам почек, также могут применяться вместо или совместно с лигандом на основе липида.
Еще одной особенностью является то, что лиганд представлен остатком, например, витамином, который захватывается целевой клеткой, например, пролиферирующей клеткой. Это, в частности, полезно для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или не злокачественного типа, например, опухолевых клеток. Примеры витаминов включают витамины А, Е и К. Другие примеры витаминов включают витамины группы В, например, фолевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или питательные вещества, поглощаемые опухолевыми клетками. Сюда также относятся ΗΑδ, липопротеин низкой плотности (ЛНП) и липопротеин высокой плотности (ЛВП).
Еще одной особенностью является то, что лиганд представлен проникающим в клетку агентом, предпочтительно спиральным проникающим в клетку агентом. Предпочтительно агент является амфипатичным. Примером агента служит пептид, такой как 1а1 или αηΐοηηοροάία. Если агент является пептидом, он может быть модифицирован, в том числе, пептидилмиметиком, инвертомерами, непептидными или псевдопептидными линкерами или применением Ό-аминокислот. Спиральный агент предпочтительно является а-спиральным агентом, который предпочтительно имеет липофильную и липофобную фазу.
Лиганд может быть пептидом или пептидомиметиком. Пептидомиметик (также называемый в этом документе олигопептидомиметиком) - это молекула, способная сворачиваться в определенную трехмерную структуру, схожую со структурой природного пептида. Остаток пептида или пептидомиметика может иметь длину примерно 5-50 аминокислот, например, длину около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот (например, см. табл. 7).
- 47 028860
Таблица 7
Примеры проникающих в клетку пептидов
Проникающий в клетку пептид Аминокислотная последовательность Ссылка
Пенетратин κρικπνΡΟΝΚΚΜκννκκ ϋεΓΟδδί βί αί, I. ΒίοΙ. Сйет. 269:10444, 1994
Тайфрагмент (48-60) СРККРРрРРКРРрС νίνεδ βί αί., 1. ΒίοΙ. Сйет., 272:16010, 1997
Пептид на основе сигнальной последовательности САЙР шире Α ΑΟδ ТМО А и-δ рРКККР κν Сйа1от βί αί, Вюсйет. ΒίορΗγδ. Κεδ. Соттип., 243:601, 1998
РУЕС ΡΡΙΙΡΚΚΚΙΚΚΟ АН АН δ К Είπτςττίδΐ βί αί, Εχρ. Се11 Κεδ., 269:237, 2001
Транспортан ΟΑΤΡΝδΑΟΥΡΡΚΙΝΡΚΑΡΑΑΡΑΚΚΙΡ Роо§ае(о/., ΡΑδΕΒ 12:67, 1998
Амфифильный модельный пептид КРАРКРАРКАРКААРКРА ОеЫке βί αί, Мой Тйег., 2:339, 2000
АГ§9 ккккккккк МЛсйеП βί αί., 1. Ρερΐ. Κεδ., 56:318, 2000
Проникающий через бактериальную клеточную стенку КРРКРРКРРК
РР-37 ΡΡΟϋΡΡΚΚδ ΚΕΚΙΟΚΕΡΚΕίνΟΚΙΚΟΡΡ ΚΝΡνΡΚΤΕδ
Цекропин Р1 δλνΡδΚΤΑΚΚΡΕΝδΑΚΚΚΙδΕΟΙΑΙΑίρΟΟΡΚ
а-дефенсин Α€Ύ€ΡΙΡΑ€ΙΑΟΕΡΡΥΟΤ€ΙΥΡΟΡΡΥ'Α РСС
β-дефенсин ОНУНСУ88ООрСРУ8АСР1РТК1рОТС укокаксск
Бактенецин ККСК1УУ1КУСК
РК-39 ΚΚΚΡΚΡΡΥΡΡΚΡΚΡΡΡΡΡΡΡΚΡΡΡΚΙΡΡΟΡ ΡΡΚΡΡΡΚΡΡΟΚΚ-ΝΗ2
Индолицидин Ιρρ\νκ\νρ\ν\νρ\νκκ-ΝΗ2
Пептид или пептидомиметик может являться, например, проникающим в клетку пептидом, катионным пептидом, амфипатическим пептидом или гидрофобным пептидом (например, состоящим в основном из Туг, Тгр или РЬс). Пептидный остаток может быть дендримерным пептидом, пептидом с ограниченной конформационной свободой или пептидом с поперечной сшивкой. В соответствии с другим вариантом, пептидный остаток может включать гидрофобную последовательность для транслокации через мембрану (МТ8). Примером пептида, содержащего гидрофобную МТ8, является КРОР, имеющий аминокислотную последовательность ААУАР1.РАУ1.1.А1.1.АР. Аналог КРОР (например, аминокислотная последовательность ААРРРУРРААР), содержащий гидрофобную МТ8, может также быть остатком направленного действия. Пептидный остаток может являться пептидом "доставки", который переносит крупные полярные молекулы, в том числе пептиды, олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны. Например, было обнаружено, что последовательности из ТаРбелка ВИЧ (ОКККККЬКККРРЬ) и белка АФсппарсбт дрозофилы иКДЮАРО^ККМКАКК) способны функционировать в качестве пептидов доставки. Пептид или пептидомиметик может кодироваться случайной последовательностью ДНК, например, пептид, идентифицированный в составе библиотеки на основе фагового дисплея, или комбинаторной библиотеки "один-шарик-одно-соединение" (ОВОС) (Рат с! а1., ΝπΡιιό, 354:82-84, 1991). Предпочтительно пептид или пептидомиметик, присоединенный к агенту, участвующему в РНК£ через внедренную мономерную единицу, является пептидом направленного действия, таким как пептид аргининглицин-аспарагиновая кислота (КОБ) или миметик КОБ. Пептидный остаток может иметь длину в диапазоне от примерно 5 аминокислот до примерно 40 аминокислот. Пептидные остатки могут иметь структурную модификацию, такую, которая повышает стабильность или влияет на конформационные свойства. Могут применяться любые структурные модификации, описанные ниже.
Остаток КОБ-пептида может применяться для направленног действия на опухолевую клетку, такую
- 48 028860
как эндотелиальная опухолевая клетка или клетка раковой опухоли груди (ΖίΙ/шапп е1 а1., Сапсег Кек., 62:5139-43, 2002). КСБ-пептид может облегчать направление действия агента, участвующего в РНК1, на опухоли множества других тканей, включая легкие, почки, селезенку или печень (Аок е1 а1., Сапсег Сепе ТБегару 8:783-787, 2001). Предпочтительно КСБ-пептид будет облегчать направленеие действия агента, участвующего в РНЮ, на почку. КСБ-пептид может быть линейным или циклическим, и может быть модифицирован, например, гликозилирован или метилирован, для облегчения направления действия на специфичные ткани. Например, гликозилированный КСБ-пептид может доставлять агент, участвующий в РНК1, к опухолевой клетке, экспрессирующей οΐν(33 (НаиЬиег е1 а1., Миг. №с1. Мей., 42:326-336, 2001).
Могут применяться пептиды, которые направлены на маркеры, которыми обогащены пролиферирующие клетки. Например, КСБ-содержащие пептиды и пептидомиметики могут быть направлены на раковые клетки, в частности, клетки, экспонирующие интегрин ανβ3. Таким образом, можно применять КСБ-пептиды, циклические пептиды, содержащие КСБ, КСБ-пептиды, содержащие Б-аминокислоты, а также синтетические миметики КСБ. В дополнение к КСБ, можно применять другие остатки, которые направлены на лиганд интегрин ανβ3. В общем случае, такие лиганды могут применяться для контроля пролиферирующих клеток и ангиогенеза. Предпочтительные конъюгаты лигандов этого типа направлены на РЕСАМ-1, УЕСР или другие опухолевые гены, например, опухолевые гены, описанные в этом документе.
"Проникающий в клетку пептид" способен проникать в клетку, например микробную клетку, такую как бактериальная клетка или клетка гриба, или в клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Проникающий в бактериальную клетку пептид может являться, например, α-спиральным линейным пептидом (например, ЬЬ-37 или церопином ΡΙ), содержащим дисульфидную связь пептидом (например, адефенсином, β-дефенсином или бактенецином), или пептидом, содержащим только одну или две доминирующие аминокислоты (например, РК-39 или индолицидином). Проникающий в клетку пептид может также содержать сигнал ядерной локализации (ΝΡδ). Например, проникающий в клетку пептид может являться двухчастным амфипатическим пептидом, таким как МРС, который получен слиянием пептидного домена ВИЧ-1 др41 и ΝΣδ большого Т-антигена вируса 8У40 (§1теош е1 а1., №с1. АсМк Кек. 31:2717-2724, 2003).
В одном из вариантов воплощения пептид направленного действия, присоединенный к агенту, участвующему в РНК1, и/или олигомеру-носителю, может быть амфипатическим α-спиральным пептидом. Неограничивающие примеры амфипатических α-спиральных пептидов включают цекропины, ликотоксины, парадаксины, буфорин, СРР, бомбинин-подобный пептид (ВЬР), кателицидины, цератотоксины, пептиды 8. с1а\'а. кишечные антимикробные пептиды миксины (ΗΡΙΆΡ), магаинины, бревинины-2, дермасептины, мелиттины, плейроцидин, Н2А-пептиды, пептиды Хепорик, эскулентинис-1 и каерины. Ряд факторов должны предпочтительно учитываться для сохранения целостности стабильной спирали. Например, будет применяться максимальное количество стабилизирующих спираль остатков (например, Ьеи, А1а или Ьук) и минимальное количество дестабилизирующих спираль остатков (например, пролина или циклических мономерных единиц). Следует учитывать кэппирующий остаток (например, С1у является примером Ν-кэппирующего остатка) и/или может применяться С-концевое амидирование для обеспечения дополнительной водородной связи с целью стабилизации спирали. Образование солевых мостиков между остатками с противоположными зарядами, разделенными ί±3 или ί±4 позициями, может обеспечить стабильность. Например, катионные остатки, такие как лизин, аргинин, гомо-аргинин, орнитин или гистидин, могут образовывать солевые мостики с анионными остатками глутаматом и аспартатом.
Пептидные и пептидомиметические лиганды включают таковые с пептидами естественного происхождения или модифицированными, например, Б- или Ь-пептиды; α-, β- или γ-пептиды; Νметилпептиды; азапептиды; пептиды, имеющие один или несколько амидогрупп, т.е. пептиды, у которых связи между мономерами заменены одной или несколькими связями на основе мочевины, тиомочевины, карбамата, или сульфонилмочевины; или циклические пептиды.
Лиганд направленного действия может быть любым лигандом, способным оказывать действие на специфичный рецептор. Примерами являются фолат, СаВДАс, галактоза, манноза, маннозо-6-фосфат, кластеры сахаров, такие как кластер СаШАс, маннозный кластер, галактозный кластер, или аптамер. Кластер - это комбинация двух или нескольких единиц сахаров. Лиганды направленного действия также включают лиганды интегриновых рецепторов, лиганды хемокиновых рецепторов, трансферрин, биотин, лиганды серотониновых рецепторов, Р8МА, эндотелии, ССР11, соматостатин, лиганды ЛНП и ЛВП. Лиганды также могут быть на основе нуклеиновой кислоты, например, аптамер. Аптамер может быть немодифицированным или нести любую комбинацию модификаций, описанных в этом документе.
Агенты высвобождения из эндосом включают имидазолы, поли- или олигоимидазолы, РЕ1, пептиды, фузогенные пептиды, поликарбоксилаты, поликатионы, маскированные олиго- или поликатионы или анионы, ацетали, полиацетали, кетали/поликетали, ортоэфиры, полимеры с маскированными или не маскированными катионными или анионными зарядами, дендримеры с маскированными или не маскированными катионными или анионными зарядами.
ФК-модулятор обозначает фармакокинетический модулятор. ФК-модулятор включает липофиль- 49 028860
ные молекулы, желчные кислоты, стероиды, аналоги фосфолипидов, пептиды, агенты, связывающиеся с белками, ПЭГ, витамины и т. п. Неограничивающие примеры ФК-модуляторов включают холестерол, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицерид, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т.д. Известно, что олигонуклеотиды, которые содержат несколько фосфоротиоатных связей, также связываются с белком сыворотки, поэтому короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды длиной примерно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие множество фосфоротиоатных связей в остове, также пригодны для настоящего изобретения в качестве лигандов (например, ФК-модулирующих лигандов).
Кроме того, аптамеры, которые связываются с компонентами сыворотки (например, белками сыворотки) также пригодны для настоящего изобретения в качестве ФК-модулирующих лигандов.
Другие лиганды, пригодные для настоящего изобретения, описаны в находящихся в процессе одновременного рассмотрения заявках υ88Ν: 10/916185, поданной 10 августа 2004 г.; υ88Ν: 10/946873, поданной 21 сентября 2004 г.; υ88Ν: 10/833934, поданной 3 августа 2007 г.; υ88Ν: 11/115989, поданной 27 апреля 2005 г. и υ88Ν: 11/944227, поданной 21 ноября 2007 г., которые фактически включены сюда полностью в качестве ссылок.
Когда присутствуют два или несколько лигандов, то лиганды могут все иметь одинаковые свойства, все иметь разные свойства или некоторые лиганды могут иметь одинаковые свойства, в то время как другие - иметь разные свойства. Например, лиганд может иметь направленные свойства, иметь эндосомолитическую активность или иметь ФК-модулирующие свойства. В предпочтительном воплощении, все лиганды имеют разные свойства.
Лиганды могут быть присоединены к олигонуклеотидам в различных положениях, например, к 3'концу, 5'-концу и/или в позиции внутри последовательности. В предпочтительных воплощениях, лиганд присоединен к олигонуклеотидам через промежуточную структуру. Лиганд или присоединенный через промежуточную структуру лиганд может присутствовать на мономере, когда названный мономер вовлекается в растущую цепь. В некоторых вариантах воплощения лиганд может быть вовлечен путем соединения с мономером-"предшественником" после того, как названный мономер-"предшественник" был вовлечен в растущую цепь. В качестве примера, мономер, имеющий, например, промежуточную соединительную структуру с амино-концом (т.е. не содержащий ассоциированного лиганда), например, ТАР(СН2^ИН2, может быть вовлечен в растущую смысловую или антисмысловую цепь. На последующем этапе, т.е. после вовлечения мономера-предшественника в цепь, лиганд, имеющий электрофильную группу, например, пентафторофенил-эфирную или альдегидную группу, может быть впоследствии присоединен к мономеру-предшественнику путем взаимодействия электрофильной группы лиганда с концевой нуклеофильной группой соединительной структуры мономера-предшественника.
В случае двуцепочечных олигонуклеотидов, лиганды могут быть присоединены к одной или обеим цепям. В некоторых вариантах воплощения двуцепочечный агент, участвующий в РНК1, содержит лиганд, конъюгированный со смысловой цепью. В других вариантах воплощения двуцепочечный агент, участвующий в РНК1, содержит лиганд, конъюгированный с антисмысловой цепью.
В некоторых вариантах воплощения лиганд может быть конъюгирован с азотистыми основаниями, остатками сахара или межнуклеозидными связями молекулы нуклеиновой кислоты. Конъюгация с пуриновыми азотистыми основаниями или их производными может происходить по любой позиции, включая эндоциклические и экзоциклические атомы. В некоторых вариантах воплощения 2-, 6-, 7- или 8-позиции пуринового азотистого основания соединены с конъюгирующим остатком. Конъюгация с пиримидиновыми азотистыми основаниями или их производными также может происходить по любой позиции. В некоторых вариантах воплощения 2-, 5- и 6-позиции пиримидинового азотистого основания могут быть замещены конъюгирующим остатком. Конъюгация с остатками сахара в составе нуклеозида может происходить по любому атому углерода. Примеры атомов углерода в составе остатка сахара, к которым может быть присоединен конъюгирующий остаток, включают 2', 3' и 5' атомы углерода. Позиция 1' также может быть соединена с конъюгирующим остатком, например, в случае отсутствия азотистого основания. Межнуклеозидные связи также могут нести конъюгированные остатки. В случае фосфорсодержащих связей (например, фосфодиэфирной, фосфоротиоатной, фосфородитиоатной, фосфорамидатной и т.п.) конъюгирующий остаток может быть присоединен непосредственно к атому фосфора или к атому О, Ν или 8, связанному с атомом фосфора. В случае амино- или амидосодержащих межнуклеозидных связей (например, РNА) конъюгирующий остаток может быть присоединен к атому азота амино- или амидо-группы или к соседнему атому углерода.
Существует множество способов получения конъюгатов олигомерных соединений. В общем случае, олигомерное соединение присоединяют к конъюгирующему остатку посредством взаимодействия реакционно-способной группы (например, ОН, 8Н, амино-, карбоксильной, альдегидной и т.п.) на олигомерном соединении с реакционно-способной группой на конъюгирующем остатке. В некоторых вариантах воплощения одна реакционно-способная группа является электрофильной, а другая - нуклеофильной.
Например, электрофильная группа может быть карбонилсодержащей функциональной группой, а нуклеофильная группа может быть амино- или тиольной группой. Способы конъюгации нуклеиновых
- 50 028860
кислот и родственных олигомерных соединений с участием или без участия линкерных групп подробно описаны в литературных источниках, таких как, например, работа МапоБагап в АпБкепке КекеатсБ апб АррБсаБопк, Сгооке апб ЬеВ1еи, еб§., СКС Рге§8, Воса Ка!оп, Р1а., 1993, СБар!ег 17, содержание которой полностью включено сюда в качестве ссылки.
Примеры патентов США, которые описывают получение олигонуклеотидных конъюгатов, включают в качестве неограничивающих примеров патенты США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717; 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077;
5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263;
4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5149782; 5214136; 5245022;
5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241; 5391723; 5416203; 5451463; 5510475;
5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928;
5672662; 5688941; 5714166; 6153737; 6172208; 6300319; 6335434; 6335437; 6395437; 6444806; 6486308;
6525031; 6528631; 6559279; содержание каждого из которых включено сюда в качестве ссылок.
Определения
Для удобства ниже приведены значения некоторых терминов и фраз, использованных в описании изобретения, примерах и прилагаемой формуле изобретения. При возникновении очевидного противоречия между использованием термина в других частях настоящего описания изобретения и описанием, приведенным в данном разделе, определение из данного раздела имеет преимущественную силу.
Символы "О", "С", "А" и "И" каждый в общем случае обозначает нуклеотид, содержащий в качестве основания гуанин, цитозин, аденин и урацил соответственно. Однако понятно, что термин "рибонуклеотид" или "нуклеотид" также может относиться к модифицированному нуклеотиду, как подробно описано далее, или к заменяющему его суррогатному остатку. Специалисту в данной области понятно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими остатками без существенного изменения свойств спаривания оснований олигонуклеотида, включая и нуклеотид, несущий такой заменяющий остаток. Например, в частности, нуклеотид, включающий инозин в качестве основания, может образовывать пару оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены в нуклеотидной последовательности согласно изобретению на нуклеотид, содержащий, например, инозин. Последовательности, содержащие такие заменяющие остатки, являются воплощениями настоящего изобретения.
При использовании в этом документе, "фактор VII" означает мРНК, белок, пептид или полипептид фактора VII. В качестве синонимов термина "фактор VII" специалистам в данной области известны термины АI132620, С£7, предшественник фактора свертывания крови VII, фактор свертывания крови VII, РУН, акселератор конверсии сывороточного протромбина, коагуляционный белок РУН и эптаког а.
При использовании в этом документе, "целевая последовательность" означает непрерывную часть нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образующейся во время транскрипции гена, включая мРНК, являющуюся продуктом РНК-процессинга первичного продукта транскрипции.
При использовании в этом документе, термин "цепь, содержащая последовательность" означает олигонуклеотид, содержащий цепочку нуклеотидов, расположенных в соответствии с названной последовательностью, указанной с применением стандартной номенклатуры нуклеотидов.
При использовании в этом документе, и если не указано иначе, термин "комплементарный", используемый в контексте пары нуклеотидов, означает классическую Уотсон-Криковскую пару, т.е. ОС, АТ или Аи. Он также распространяется на классическое Уотсон-Криковское спаривание, при котором один или оба нуклеотида были модифицированы, как описано в этом документе, например, путем модификации рибозы или модификации фосфатного остова. Он также включает спаривание с инозином или другой молекулой, при котором свойства спаривания оснований существенно не изменяются.
При использовании в этом документе, и если не указано иначе, термин "комплементарный", при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности относительно второй нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать дуплексную структуру в определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как это понятно специалисту в данной области. Комплементарность может включать полную комплементарность, существенную степень комплементарности и достаточную степень комплементарности для гибридизации в физиологических условиях, например, в физиологически значимых условиях, которые могут иметь место внутри организма. Полная комплементарность означает комплементарность, как описано выше для отдельной пары, всех пар первой и второй последовательности. Когда последовательность "в существенной степени комплементарна" относительно второй последовательности, при использовании в этом документе, две последовательности могут быть полностью комплементарны, или они могут образовывать одну или несколько, но в общем случае не более 4, 3 или 2 пар с нарушением комплементарности оснований при гибридизации, при этом сохраняя способность гибридизоваться в условиях, более соответствующих их основному применению. Существенная степень комплементарности также может быть определена как гибридизация в жестких условиях, при этом жесткие условия могут включать 400 мМ ЦаС1, 40 мМ Р!РЕ5 рН 6,4, 1 мМ ЭДТА, 50 или 70°С в течение 12- 51 028860
16 ч с последующими отмывками. Специалист в данной области сможет определить набор условий, наиболее подходящих для испытания комплементарности двух последовательностей в соответствии с основным применением гибридизуемых нуклеотидов.
Однако, если два олигонуклеотида сконструированы таким образом, чтобы при гибридизации формировались один или несколько одноцепочечных "липких" концов, такие "липкие" концы не должны рассматриваться как пары с нарушением комплементарности при определении комплементарности. Например, двухцепочечнаяРНК, содержащая один олигонуклеотид длиной 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид длиной 23 нуклеотида, при этом более длинный олигонуклеотид содержит последовательность длиной 21 нуклеотид, которая полностью комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может тем не менее считаться "полностью комплементарной" для целей настоящего изобретения.
"Комплементарные" последовательности, при использовании в этом документе, могут также включать или полностью состоять из не-Уотсон-Криковских пар оснований и/или пар оснований, образованных не природными и модифицированными нуклеотидами, если соблюдаются указанные выше требования в отношении их способности гибридизоваться.
Термины "комплементарный", "полностью комплементарный", "в существенной степени комплементарный" и комплементарность, достаточная для гибридизации в физиологических условиях, например, в физиологически значимых условиях, которые могут иметь место внутри организма, могут использоваться в этом документе в отношении спаривания оснований между смысловой цепью и антисмысловой цепью двухцепочечной РНК, или между антисмысловой цепью двухцепочечной РНК и целевой последовательностью, как будет ясно из контекста их использования.
При использовании в этом документе, полинуклеотид, который "комплементарен", например, в существенной степени комплементарен, по меньшей мере части молекулы матричной РНК (мРНК), означает полинуклеотид, который комплементарен, например, в существенной степени комплементарен, непрерывной части рассматриваемой мРНК (например, кодирующей фактор VII). Например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части мРНК фактора VII, если последовательность в существенной степени комплементарна не прерываемой части мРНК, кодирующей фактор VII.
Термин "двуцепочечная РНК" или "дцРНК", при использовании в этом документе, означает молекулу рибонуклеиновой кислоты или комплекс молекул рибонуклеиновой кислоты, имеющий дуплексную структуру, включающий две антипараллельные и в существенной степени комплементарные, как описано выше, цепи нуклеиновой кислоты. Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут являться разными частями одной более крупной молекулы РНК, или они могут быть раздельными молекулами РНК. В случае, если две цепи являются частями одной более крупной молекулы, и по этой причине соединены непрерывной цепочкой нуклеотидов между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей второй цепи, образующих дуплексную структуру, соединительная цепочка РНК называется "петлей шпильки". В случае, если две цепи соединены ковалентно иным способом, чем непрерывная цепочка нуклеотидов между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей второй цепи, образующих дуплексную структуру, соединительная структура называется "линкером". Цепи РНК могут содержать одинаковое или разное количество нуклеотидов. Максимальное количество пар оснований равно количеству нуклеотидов в самой короткой цепи дцРНК. В дополнение к дуплексной структуре, дцРНК может содержать один или несколько нуклеотидных "липких" концов. ДцРНК, при использовании в этом документе, также называется "малой ингибиторной РНК", "31РНК", "з1РНК-агентом", "агентом, участвующим в РНК-интерференции" или "агентом, участвующим в РНК1".
При использовании в этом документе, "нуклеотидный "липкий" конец" означает неспаренный нуклеотид или нуклеотиды, которые выступают из дуплексной структуры дцРНК, когда 3'-конец одной цепи дцРНК простирается за пределы 5'-конца другой цепи, или наоборот. "Тупой" или "тупой конец" означает, что на конце дцРНК отсутствуют неспаренные нуклеотиды, т.е. отсутствует нуклеотидный "липкий" конец. ДцРНК "с тупыми концами" - это дцРНК, которая является двуцепочечной по всей ее длине, т.е. нуклеотидный "липкий" конец отсутствует на обоих концах молекулы.
Термин "антисмысловая цепь" означает цепь дцРНК, которая включает область, в существенной степени комплементарную целевой последовательности. При использовании в этом документе, термин "область комплементарности" означает область на антисмысловой цепи, которая в существенной степени комплементарна последовательности, например, целевой последовательности, как определено в этом документе. Если область комплементарности не полностью комплементарна целевой последовательности, пары с нарушением комплементарности в наибольшей степени допустимы в концевых областях и, если присутствуют, в общем случае в концевой области или областях, например, в пределах 6, 5, 4, 3 или 2 нуклеотидов 5'- и/или 3'-конца.
Термин "смысловая цепь", при использовании в этом документе, означает цепь дцРНК, которая включает область, в существенной степени комплементарную области антисмысловой цепи.
Термин "идентичность" означает отношение между двумя или несколькими полинуклеотидными последовательностями, определенное сравнением этих последовательностей. Идентичность также означает степень схожести последовательностей между полинуклеотидными последовательностями, определенную путем выравнивания цепочек таких последовательностей. Хотя существует несколько способов
- 52 028860
измерения идентичности между двумя полинуклеотидными последовательностями, термин хорошо известен специалистам в данной области (см., например, Зедиеисе Аиа1уз1з т Мо1еси1аг Вю1оду, νοη 11епще, О., Асайетю Ргезз (1987); и Зедиеисе Аиа1уз1з Рптег, ΟτΛδ^ν., М. аий Оех-стеих, б., ейз., М. §!оск!ои Ргезз, №\ν Υο^к (1991)). "В существенной степени идентичный", при использовании в этом документе, означает, что существует очень высокая степень гомологии (предпочтительно, 100% идентичность последовательностей) между смысловой цепью дцРНК и соответствующей частью целевого гена. Однако, в изобретении могут применяться дцРНК, имеющие идентичность последовательности более 90% или 95%, и, следовательно, допускаются вариации последовательности, появление которых можно ожидать из-за генетических мутаций, полиморфизма цепей или эволюционной дивергенции. Хотя предпочтительной является идентичность на 100%, дцРНК может содержать случайные одиночные или множественные пары с нарушением комплементарности между РНК и целевым геном.
"Внедрение в клетку", если относится к дцРНК, означает облегчение поглощения или абсорбции клеткой, как понятно специалисту в данной области. Абсорбция или поглощение дцРНК может происходить в ходе процессов пассивной диффузии или активного клеточного транспорта, или с помощью дополнительных агентов или приспособлений. Значение этого термина не ограничено клетками в системе т уйго; дцРНК также может быть "внедрена в клетку", если клетка является частью живого организма. В таком случае, внедрение в клетку будет включать доставку в организм. Например, для доставки т у1уо дцРНК может быть инъецирована в область ткани или введена системно. Внедрение в клетку т νίύΌ включает способы, известные специалистам в данной области, такие как электропорация и липофекция.
Термины "подавлять путем сайленсинга" и "ингибировать экспрессию", если они относятся к гену фактора У11, в этом документе означают, по меньшей мере, частичное подавление экспрессии гена фактора УП, что выражается в снижении количества мРНК, образующейся с гена фактора У11, которая может быть выделена из первой клетки или группы клеток, в которой транскрибируется ген фактора У11, и которая была обработана таким образом, чтобы экспрессия гена фактора У11 была ингибирована, в сравнении со второй клеткой или группой клеток, в существенной степени идентичной первой клетке или группе клеток, но которая не была обработана таким образом (контрольные клетки). Степень ингибирования обычно выражают следующим образом:
(мРНК в контрольных клетках) - (мРНК в обработанных клетках)
(мРНК в контрольных клетках) 1θθ %
В соответствии с другим вариантом степень ингибирования может быть представлена в исчислении снижения показателя, который функционально связан с транскрипцией гена фактора УП, например, количества белка, кодируемого геном фактора У11 и секретируемого клеткой, или количества клеток, демонстрирующих определенный фенотип, например, апоптоз. По существу, сайленсинг гена фактора У11 можно определить в любой клетке, экспрессирующей мишень, конститутивно или в результате манипуляций геномной инженерии, и любым соответствующим аналитическим способом. Однако, если необходима справочная информация для определения того, ингибирует ли данная дцРНК экспрессию гена фактора У11 в определенной степени, и, следовательно, является дцРНК по настоящему изобретению, в качестве такой справочной информации должен служить способ анализа, приведенный в примерах ниже.
Например, в некоторых случаях экспрессия гена фактора У11 подавляется по меньшей мере примерно на 20, 25, 35, 40 или 50% введением двуцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В одном из вариантов воплощения ген фактора У11 подавляется по меньшей мере примерно на 60, 70 или 80% введением двуцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В более предпочтительном варианте воплощения ген фактора У11 подавляется по меньшей мере примерно на 85, 90 или 95% введением двуцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению.
Термины "лечить", "лечение" и им подобные означают избавление от болезни или нарушения или смягчение их течения. В контексте настоящего изобретения, в той мере, пока это относится к любому из других состояний, перечисленных в этом документе ниже (например, опосредованных фактором У11 состояний, отличных от тромботического нарушения), термины "лечить", "лечение" и им подобные означают избавление от или смягчение по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, или замедление или обращение прогрессирования такого состояния.
"Терапевтически значимая" композиция может смягчать течение болезни или нарушения, или симптом болезни или нарушения при введении в соответствующей дозировке.
При использовании в этом документе термин "опосредованное фактором У11 состояние или заболевание" и родственные ему термины и фразы означает состояние или заболевание, характеризующееся отклоняющейся от нормальной, например, выше нормальной, активностью фактора У11. Отклоняющаяся от нормальной функциональная активность фактора У11 может быть результатом экспрессии фактора У11 в клетках, которые в норме не экспрессируют фактор У11, или повышенной экспрессии фактора У11 (ведущей, например, к симптому вирусной геморрагической лихорадки или к образованию тромба). Опосредованное фактором У11 состояние или заболевание может быть полностью или частично опосредовано отклоняющейся от нормальной функциональной активностью фактора УП. Однако опосредованное фактором У11 состояние или заболевание - это такое состояние или заболевание, при котором модуляция
- 53 028860
фактора У11 приводит к определенному эффекту на лежащее в основе состояние или заболевание (например, ингибитор фактора УН приводит к определенному улучшению благополучия пациента, по меньшей мере, у некоторых пациентов).
"Геморрагическая лихорадка" включает комбинацию заболеваний, вызванных вирусной инфекцией. Лихорадка и желудочно-кишечные симптомы обычно сопровождаются капиллярным кровотечением.
"Коагулопатия" - это любое нарушение механизма свертывания крови у субъекта.
При использовании в этом документе "тромботическое нарушение" - это любое нарушение, предпочтительно являющееся результатом нежелательной экспрессии РУН, включая любое нарушение, характеризующееся нежелательной свертываемостью крови.
При использовании в этом документе фразы "терапевтически эффективное количество" и "профилактически эффективное количество" означают количество, обеспечивающее терапевтическую пользу при лечении, профилактике или оказании помощи при вирусной геморрагической лихорадке, или выраженном симптоме такого нарушения, например кровотечении, лихорадке, слабости, мышечной боли, головной боли, воспалении или циркуляторном шоке. Специфичное количество, являющееся терапевтически эффективным, может легко определить обычный практикующий врач, и оно может варьировать в зависимости от факторов, известных специалистам в данной области, таких как, например, тип тромботического нарушения, история болезни и возраст пациента, стадия заболевания и введение других агентов.
При использовании в этом документе "фармацевтическая композиция" включает фармакологически эффективное количество дцРНК и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в этом документе, "фармакологически эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или просто "эффективное количество" означает количество РНК, эффективное для получения требуемого фармакологического, терапевтического или профилактического результата. Например, если данный клинический способ лечения считается эффективным, если имеет место по меньшей мере 25% снижение значения измеряемого параметра, ассоциированного с заболеванием или нарушением, терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения - это количество, необходимое для достижения по меньшей мере 25%-го снижения значения этого параметра.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель для введения терапевтического агента. Такие носители включают в качестве неограничивающих примеров раствор натрия хлорида, буферный раствор натрия хлорида, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Из термина специально исключена среда для культуры клеток. Для лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемлемые носители включают в качестве неограничивающих примеров фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как инертные разбавители, способствующие распадаемости агенты, связывающие агенты, смазывающие агенты, агенты-подсластители, вкусовые агенты, красящие агенты и консерванты. Пригодные инертные разбавители включают натрия и кальция карбонат, натрия и кальция фосфат и лактозу, в то время как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются пригодными агентами, способствующими распадаемости. Связывающие агенты могут включать крахмал и желатин, а смазывающие агенты, если присутствуют, в основном будут представлены магния стеаратом, стеариновой кислотой или тальком. Если необходимо, таблетки могут быть покрыты оболочкой из таких материалов как глицерил моностеарат или глицерил дистеарат, чтобы отсрочить всасывание в желудочно-кишечном тракте.
При использовании в этом документе "трансформированная клетка" - это клетка, в которую был внедрен вектор, с которого может экспрессироваться молекула дцРНК.
Характеристика липидонуклеиновых частиц
В некоторых воплощениях изобретение относится к способам и композициям для получения частиц, инкапсулированных в липиды нуклеиновых кислот, в которых нуклеиновые кислоты инкапсулированы внутри липидного слоя. Такие липидонуклеиновые частицы, содержащие олигонуклеотиды 31РНК, охарактеризовывают с применением различных биофизических параметров, включая (1) соотношение лекарственного средства и липида; (2) эффективность инкапсулирования и (3) размер частицы. Высокие значения соотношения лекарственного средства и липида, высокая эффективность инкапсулирования, хорошая устойчивость к нуклеазам и стабильность в сыворотке и контролируемый размер частицы, в общем случае менее 200 нм в диаметре, являются желательными характеристиками. Кроме того, важна природа полимера нуклеиновой кислоты, так как модификация нуклеиновых кислот с целью придать устойчивость к нуклеазам, увеличивает стоимость лечения, при этом во многих случаях обеспечивая лишь ограниченную устойчивость. Если не указано иначе, эти критерии вычисляются в настоящем описании изобретения следующим образом:
Соотношение нуклеиновой кислоты и липида равно количеству нуклеиновой кислоты в определенном объеме получения, деленному на количество липида в том же объеме. Показатель можно выражать как соотношение молей на моль, массы на массу или массы на моль. Для окончательной, готовой для введения композиции, соотношение нуклеиновая кислота:липид вычисляют после того как с применением диализа, хроматографии и/или переваривания ферментами (например, нуклеазами) было удалено максимально возможное количество не инкапсулированной нуклеиновой кислоты.
- 54 028860
Эффективность инкапсулирования равна соотношению лекарственного средства и липида в начальной смеси, деленному на соотношение лекарственного средства и липида в окончательной, пригодной для введения, композиции. Это является мерой относительной эффективности. Для измерения абсолютной эффективности необходимо вычислить суммарное количество от нуклеиновой кислоты, добавленной в начальную смесь, которое окажется в пригодной для введения композиции. Также может быть вычислено количество липида, потерянное во время процесса получения композиции. Эффективность является мерой потери и стоимости композиции; а размер указывает размер (диаметр) образующихся частиц. Распределение размеров можно определить с применением квазиупругого рассеивания света (ОЕЬ-δ) на субмикронном анализаторе размера частиц №сотр, модель 370. Частицы размером менее 200 нм являются предпочтительными для распределения в неоваскуляризированных (с повышенной проницаемостью) тканях, таких как неоплазмы и области воспаления.
Способы получения липидных частиц
В способах и композициях согласно изобретению применяют определенные катионные липиды, синтез, получение и характеристика которых описаны ниже и в сопутствующих примерах. Кроме того, настоящее изобретение направлено на создание способов получения липидных частиц, включая таковые, ассоциированные с терапевтическим агентом, например, с нуклеиновой кислотой. В способах, описанных в этом документе, смесь липидов объединяют с буферизированным водным раствором нуклеиновой кислоты для получения промежуточной смеси, содержащей нуклеиновую кислоту, инкапсулированную в липидных частицах, при этом инкапсулированные нуклеиновые кислоты присутствуют в соотношении нуклеиновая кислота/липид, равном примерно от 3 до примерно 25 мас.%, предпочтительно от 5 до 15 мас.%. Промежуточную смесь необязательно можно подвергнуть разделению по размерам частиц для получения частиц инкапсулированной в липиды нуклеиновой кислоты, где липидные части являются однослойными везикулами, предпочтительно имеющими диаметр от 30 до 150 нм, более предпочтительно примерно от 40 до 90 нм. После этого повышают значение рН, чтобы нейтрализовать по меньшей мере часть поверхностных зарядов на липидонуклеиновых частицах, обеспечив тем самым, чтобы композиция нуклеиновой кислоты, инкапсулированной в липиды, содержала, по меньшей мере, частично нейтральные поверхности.
Как описано выше, некоторые из этих катионных липидов являются аминолипидами, которые несут заряды при значениях рН ниже значения рКа аминогруппы, и в существенной степени нейтральны при значениях рН выше значения рКа. Такие катионные липиды называют титруемыми катионными липидами, и они могут применяться в композициях согласно изобретению с помощью двухэтапного способа. На первом этапе, липидные везикулы формируются при пониженных значениях рН из титруемых катионных липидов и других компонентов везикул в присутствии нуклеиновых кислот. Таким образом, везикулы инкапсулируют и удерживают нуклеиновые кислоты. На втором этапе, поверхностный заряд новообразованных везикул можно нейтрализовать повышением значения рН среды до уровня выше значения рКа присутствующих титруемых катионных липидов, т.е. до физиологического значения рН или выше. В частности, выгодные особенности этого способа включают как легкое удаление любой адсорбированной на поверхности нуклеиновой кислоты, так и получение в результате для доставки нуклеиновой кислоты везикулы, которая имеет нейтральную поверхность. Полагают, что липосомы или липидные частицы, имеющие нейтральную поверхность, избегут быстрого клиренса из кровеносной системы и не будут иметь определенных токсических свойств, которые ассоциированы с препаратами катионных липосом. Дополнительное подробное описание этих применений подобных титруемых катионных липидов в композиции липидонуклеиновых частиц приведены в патенте США 6287591 и патенте США 6858225, включенных в этот документ в качестве ссылки.
Дополнительно отмечается, что везикулы, образованные таким способом, обеспечивают композиции с везикулами однородного размера с высоким содержанием нуклеиновых кислот.
Дополнительно, везикулы имеют диапазон размеров от примерно 30 до примерно 150 нм, более предпочтительно от примерно 30 до примерно 90 нм.
Не следуя какой-то определенной теории, полагают, что очень высокая эффективность инкапсуляции нуклеиновой кислоты является результатом электростатического взаимодействия при низких значениях рН. При кислых значениях рН (например, рН 4,0) поверхность везикулы заряжена и связывает часть нуклеиновых кислот посредством электростатических взаимодействий. Когда внешний кислотный буферный раствор заменяют на более нейтральный буферный раствор (например, с рН 7,5), поверхность липидной частицы или липосомы нейтрализуется, позволяя удалять любую внешнюю нуклеиновую кислоту. Более подробная информация о способе получения рецептур представлена в различных публикациях (например, в патенте США 6287591 и патенте США 6858225).
С учетом вышесказанного, настоящее изобретение направлено на создание способов получения липидонуклеиновых композиций. В способах, описанных в этом документе, смесь липидов объединяют с буферизированным водным раствором нуклеиновой кислоты для получения промежуточной смеси, содержащей нуклеиновую кислоту, инкапсулированную в липидных частицах, например, где инкапсулированные нуклеиновые кислоты присутствуют в соотношении нуклеиновая кислота/липид, равном примерно от 10 до примерно 20 мас.%. Промежуточную смесь необязательно можно подвергнуть разделе- 55 028860
нию по размерам частиц для получения частиц инкапсулированной в липиды нуклеиновой кислоты, где липидные части являются однослойными везикулами, предпочтительно имеющими диаметр от 30 до 150 нм, более предпочтительно примерно от 40 до 90 нм. После этого повышают значение рН, чтобы нейтрализовать по меньшей мере часть поверхностных зарядов на липидонуклеиновых частицах, обеспечив тем самым, чтобы композиция нуклеиновой кислоты, инкапсулированной в липиды, содержала, по меньшей мере, частично нейтральные поверхности.
В некоторых воплощениях смесь липидов содержит по меньшей мере два липидных компонента: первый аминолипидный компонент по настоящему изобретению, который выбран из липидов, имеющих такую рКа, что липид является катионным при значениях рН ниже рКа и нейтральным при значениях рН выше рКа, и второй липидный компонент, который выбран из липидов, предотвращающих агрегацию частиц во время формирования липидонуклеиновых частиц. В некоторых вариантах воплощения аминолипид является новым катионным липидом по настоящему изобретению.
При получении липидонуклеиновых частиц согласно изобретению, смесь липидов в типичном случае является раствором липидов в органическом растворителе. Эта смесь липидов в последующем может быть высушена с образованием тонкой пленки или лиофилизирована с образованием порошка перед гидратацией водным буферным раствором для образования липосом. В соответствии с другим вариантом в предпочтительном способе липидная смесь может быть солюбилизирована в смешивающемся с водой спирте, таком как этанол, и этот раствор в этаноле добавляют к водному буферному раствору, что приводит к спонтанному образованию липосом. В большинстве вариантов воплощения спирт применяют в том виде, в котором он доступен для приобретения. Например, этанол может применяться в виде абсолютного этанола (100%), или в виде 95% этанола, при этом оставшаяся часть является водой. Этот способ описан более подробно в патенте США 5976567.
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения смесь липидов является смесью катионных липидов, нейтральных липидов (отличных от катионного липида), стерола (например, холестерола) и ПЭГ-модифицированного липида (например, ПЭГ -ДМГ или ПЭГ <ΌΜΑ) в спиртовом растворителе. В предпочтительных воплощениях, липидная смесь в существенной степени состоит из катионного липида, нейтрального липида, холестерола и ПЭГ-модифицированного липида в спирте, более предпочтительно в этаноле. В дополнительных предпочтительных воплощениях, первый раствор состоит из вышеуказанной липидной смеси с молярными соотношениями примерно 20-70% катионного липида:5-45% нейтрального липида:20-55% холестерола:0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида. В еще более предпочтительных вариантах воплощения первый раствор в существенной степени состоит из липида, выбранного из Таблицы 1, ДСФХ, холестерола и ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-с^ΜΑ, более предпочтительно в молярном соотношении примерно 20-60% катионного липида:5-25% ДСФХ:25-55% холестерола:0,5-15% ПЭГ -ДМГ или ПЭГ -ΌΜΑ. В некоторых вариантах воплощения молярное соотношение липидов составляет примерно 50/10/38,5/1,5 (мол.% катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ, ПЭГ-ДСГ или ПЭГ-ДПГ), 57,2/7,1/34,3/1,4 (мол.% катионного липида/ДПФХ/холестерола/ПЭГ-с^ΜΑ), 40/15/40/5 (мол.% катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ), 50/10/35/4,5/0,5 (мол.% катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДСГ или Са1NΑс3-ПЭГ-ДСГ), 50/10/35/5 (катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ), 40/10/40/10 (мол.% катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-с^ΜΑ), 35/15/40/10 (мол.% катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-с^ΜΑ) или 52/13/30/5 (мол.% катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-с^ΜΑ). В другой группе предпочтительных вариантов воплощения нейтральный липид в этих композициях заменен на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или СМ. В соответствии с изобретением, липидную смесь смешивают с буферизированным водным раствором, который может содержать нуклеиновые кислоты. Буферизированный водный раствор в типичном случае является раствором, в котором буфер имеет значение рН ниже значения рКа способного к протонированию липида в составе липидной смеси. Примеры пригодных буферных растворов включают цитратный, фосфатный, ацетатный и ΜΕδ-буферы. Особенно предпочтительным буферным раствором является цитратный буфер. Предпочтительные буферные растворы будут иметь концентрацию в диапазоне 1-1000 мМ по аниону, в зависимости от химических свойств нуклеиновой кислоты, которую инкапсулируют, и оптимизация концентрации буфера может являться существенным этапом для достижения высоких уровней нагрузки (см., например, патент США 6287591 и патент США 6858225). В соответствии с другим вариантом может быть полезна чистая вода, подкисленная до рН 5-6 хлоридом, сульфатом или им подобным соединением. В этом случае, может быть применимо добавление 5% глюкозы или другого неионного растворенного вещества, которое сбалансирует осмотический потенциал на мембране частиц при проведении диализа частиц для удаления этанола, повышения рН, или при смешивании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как изотонический раствор натрия хлорида. Количество нуклеиновой кислоты в буферном растворе может варьировать, но в типичном случае будет составлять от примерно 0,01 до примерно 200 мг/мл, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 50 мг/мл.
Смесь липидов и буферизированный водный раствор терапевтических нуклеиновых кислот объединяют для получения промежуточной смеси. Промежуточная смесь в типичном случае является смесью липидных частиц, несущих инкапсулированные нуклеиновые кислоты. Дополнительно, промежуточная
- 56 028860
смесь может также содержать некоторую часть нуклеиновых кислот, которые присоединены к поверхности липидных частиц (липосом или липидных везикул) благодаря ионному взаимодействию отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и положительно заряженных липидов на поверхности липидной частицы (аминолипиды или другие липиды, составляющие способный к протонированию первый липидный компонент, положительно заряжены в буферном растворе, имеющем значение рН ниже, чем значение рКа протонируемой группы липида). В одной группе предпочтительных вариантов воплощения смесь липидов является спиртовым раствором липидов, и объемы каждого из растворов скорректированы таким образом, чтобы при объединении конечное содержание спирта составляло от примерно 20% по объему до примерно 45% по объему. Способ объединения смесей может включать любое разнообразие способов, часто в зависимости от масштаба получения композиции. Например, если суммарный объем равен примерно 10-20 мл или менее, растворы можно объединить в пробирке и смешать с применением вихревой мешалки. Крупномасштабное смешивание можно проводить в пригодной стеклянной посуде для промышленного производства.
Необязательно, комплексы инкапсулированного липидами терапевтического агента (например, нуклеиновой кислоты), которые получены смешиванием липидной смеси и буферизированного водного раствора терапевтического агента (нуклеиновых кислот), могут быть отсортированы по размеру для достижения требуемого диапазона размеров и относительно узкого распределения размеров липидных частиц. Дополнительно, композиции, описанные в этом документе, будут отсортированы по размеру частиц со средним диаметром от примерно 70 до примерно 200 нм, более предпочтительно от примерно 90 до примерно 130 нм. Доступно несколько способов сортировки липосом по размеру для получения требуемого размера. Один способ сортировки по размеру описан в патенте США № 4737323, включенном в этот документ в качестве ссылки. Обработка липосомной суспензии ультразвуком, либо в бане, либо с помощью зонда, приводит к прогрессивному уменьшению размеров вплоть до маленьких однослойных везикул (8υν) размером менее чем примерно 0,05 мкм. Гомогенизация является еще одним способом, основанным на применении энергии сдвигового деформирования для фрагментации крупных липосом с образованием малых. При типичном способе гомогенизации, многослойные везикулы рециркулируют через стандартный гомогенизатор для эмульсий до достижения выбранных размеров липосом, в типичном случае от примерно 0,1 до 0,5 мкм. При обоих способах распределение размера частиц можно контролировать стандартным определением размера частиц с помощью лазерного луча. Для некоторых способов в этом документе применяется экструзия для получения однородных по размеру везикул.
Экструзия липосомных композиций через мелкопористую поликарбонатную мембрану или асимметрическую керамическую мембрану приводит к относительно четко определенному распределению по размерам. В типичном случае, суспензия циркулирует через мембрану один или несколько раз, до достижения требуемого распределения липосомных комплексов по размеру. Липосомы могут быть экструдированы через последовательные мембраны с уменьшающимся размером пор для достижения постепенного уменьшения размера липосом. В некоторых случаях формирующиеся липидонуклеиновые композиции могут быть применены без разделения по размерам.
В некоторых вариантах воплощения способы по настоящему изобретению дополнительно включают этап нейтрализации, по меньшей мере, некоторых поверхностных зарядов на липидной части липидонуклеиновых композиций. Нейтрализуя, по меньшей мере частично, поверхностные заряды, достигается высвобождение не инкапсулированной нуклеиновой кислоты с поверхности липидной частицы, и она может быть удалена из композиции с применением стандартных способов. Предпочтительно не инкапсулированные и абсорбированные на поверхности нуклеиновые кислоты удаляют из конечной композиции путем замены буферных растворов. Например, замена цитратного буфера (значение рН примерно 4,0, применяется при формировании композиции) на НЕРЕ8-буферизированный раствор натрия хлорида (НВ8, значение рН примерно 7,5) приводит к нейтрализации поверхности липосом и высвобождению нуклеиновой кислоты с поверхности. Высвобожденная нуклеиновая кислота после этого может быть удалена хроматографией с применением стандартных методов, с последующим переходом на буфер со значением рН выше значения рКа используемого липида.
Необязательно, липидные везикулы (т.е. липидные частицы) могут быть сформированы гидратацией в водном буферном растворе и отсортированы по размеру с применением способов, описанных выше, перед добавлением нуклеиновой кислоты. Как описано выше, водный буферный раствор должен иметь значение рН ниже значения рКа аминолипида. Раствор нуклеиновых кислот может добавляться к этим отсортированным по размеру, предварительно сформированным везикулам. Для того чтобы произошло инкапсулирование нуклеиновых кислот в эти "предварительно сформированные" везикулы, смесь должна содержать спирт, такой как этанол. В случае этанола, он должен присутствовать в концентрации от примерно 20% (мас./об.) до примерно 45% (мас./об.). Кроме того, может быть необходимо подогреть смесь предварительно сформированных везикул и нуклеиновой кислоты в смеси водного буферного раствора и этанола до температуры от примерно 25 до примерно 50°С, в зависимости от композиции липидных везикул и природы нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области будет понятно, что оптимизация способа инкапсулирования для достижения требуемого уровня содержания нуклеиновой кислоты в липидных везикулах потребует изменения таких переменных как концентрация этанола и темпера- 57 028860
тура. Примеры пригодных условий для инкапсуляции нуклеиновой кислоты представлены в разделе Примеров. После того как нуклеиновые кислоты инкапсулированы внутри предварительно сформированных везикул, значение внешнего рН можно повысить, чтобы нейтрализовать, по меньшей мере частично, поверхностный заряд. После этого не инкапсулированные и абсорбированные на поверхности нуклеиновые кислоты можно удалить как описано выше.
Способ применения
Липидные частицы согласно изобретению могут применяться для доставки терапевтического агента в клетку, ш νίΙΐΌ или ш у1уо. В некоторых вариантах воплощения терапевтический агент является нуклеиновой кислотой, которая доставляется в клетку с применением липидонуклеиновых частиц согласно изобретению. Хотя следующее описание различных способов применения липидных частиц и родственных фармацевтических композиций согласно изобретению использует в качестве примеров описание, относящееся к липидонуклеиновым частицам, при этом понимается, что эти способы и композиции могут быть легко адаптированы для доставки любого терапевтического агента для лечения любого заболевания или нарушения, при котором такое лечение будет полезно.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение направлено на создание способов внедрения нуклеиновой кислоты в клетку. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами для внедрения в клетки являются 81РНК, иммуностимулирующие олигонуклеотиды, плазмиды, антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы. Эти способы могут осуществляться путем контакта частиц или композиций согласно изобретению с клетками в течение периода времени, достаточного для прохождения внутриклеточной доставки.
Композиции согласно изобретению могут адсорбироваться практически любым типом клеток, например, линиями опухолевых клеток, включая в качестве неограничивающих примеров клеточные линии НеЬа, НСТ116, А375, МСР7, В16Р10, Нер3Ъ, НИН7, НерС2, 8коу3, И87 и РС3. После адсорбции липидонуклеиновые частицы могут либо поглощаться путем эндоцитоза частью клеток, либо обмениваться липидами с клеточными мембранами, либо сливаться с клетками. Перенос или внедрение части комплекса, представленной нуклеиновой кислотой, может происходить по любому их этих путей. Не ограничиваясь только объемом настоящего изобретения, полагают, что в случае попадания частиц в клетку путем эндоцитоза, частицы после этого взаимодействуют с эндосомальной мембраной, что приводит к дестабилизации зндосомальной мембраны, возможно, через формирование не-бислойных фаз, что в результате приводит к внедрению инкапсулированной нуклеиновой кислоты в цитоплазму клетки. Схожим образом, в случае прямого слияния частиц с плазматической мембраной клетки, если такое слияние имеет место, мембрана липосомы интегрируется в клеточную мембрану, и содержимое липосомы смешивается с внутриклеточной жидкостью. Контакт между клетками и липидонуклеиновыми композициями, если он происходит ш У11го, будет иметь место в биологически совместимой среде. Концентрация композиций может широко варьировать, в зависимости от конкретного применения, но в общем случае составляет от примерно 1 мкМ до примерно 10 мМ. В некоторых воплощениях обработка клеток липидонуклеиновыми композициями в общем случае будет проводиться при физиологических значениях температуры (примерно 37°С) в течение периода времени от примерно 1 до 24 ч, предпочтительно от примерно 2 до 8 ч. В случае применения ш νίΙΐΌ. доставка нуклеиновых кислот может осуществляться в любую клетку, выращиваемую в культуре, как растительного, так и животного происхождения, клетку позвоночного или беспозвоночного, из любой ткани и любого типа. В предпочтительных воплощениях, клетки будут являться клетками животного, более предпочтительно, клетками млекопитающего, и наиболее предпочтительно, клетками человека.
В одной группе вариантов воплощения суспензию липидонуклеиновых частиц добавляют к культивируемым на чашках клеткам с конфлюэнтностью 60-80%, имеющим плотность клеток от примерно 103 до примерно 105 клеток/мл, более предпочтительно примерно 2х104 клеток/мл. Концентрация суспензии, добавляемой к клеткам, предпочтительно составляет от примерно 0,01 до 20 мкг/мл, более предпочтительно примерно 1 мкг/мл.
Типичные примеры применения включают применение хорошо известных способов обеспечения внутриклеточной доставки 81РНК для нокаута или сайленсинга специфичных клеточных мишеней. В соответствии с другим вариантом, применения включают доставку последовательностей ДНК или мРНК, кодирующих терапевтически полезные полипептиды. В этом случае обеспечивается терапия генетических заболеваний путем поставки дефицитных или отсутствующих продуктов генов (т.е. для дистрофии Дюшенна, см. Кипке1, е! а1., Вгй. Мей. Ви11 45(3):630-643 (1989), и для муковисцидоза см. СоойТейоте, №1иге 341:102-103 (1989)). Другие применения композиций согласно изобретению включают внедрение антисмысловых олигонуклеотидов в клетки (см. Веппей, е! а1., Мо1. Рйагт. 41:1023-1033, 1992).
В соответствии с другим вариантом, композиции согласно изобретению могут также применяться для доставки нуклеиновых кислот в клетки ш У1уо, с применением способов, известных специалисту в данной области. Что касается применения настоящего изобретения для доставки последовательностей ДНК или мРНК, работа 2йи, е! а1., Заепсе 261:209-211 (1993), включенная в этот документ в качестве ссылки, описывает внутривенную доставку экспрессирующей плазмиды, несущей вставку цитомегаловирусный промотор (СМУ) - ген хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ), с применением комплексов
- 58 028860
ЭОТМА-ДОФЭ. В работе Нуйе, е1 а1., Уинге 362:250-256 (1993), включенной в этот документ в качестве ссылки, описывается доставка гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (СРТК) в эпителий дыхательных путей и в альвеолы в легких мыши с применением липосом. В работе ВпдНат, е1 а1., Ат. I. Мей. 8а. 298:278-281 (1989), включенной в этот документ в качестве ссылки, описывается трансфекция ίη νί\Ό клеток легких мыши функционально активным прокариотическим геном, кодирующим внутриклеточный фермент, хлорамфениколацетилтрансферазу (САТ). Таким образом, композиции согласно изобретению могут применяться для лечения инфекционных заболеваний.
Таким образом, другой особенностью композиций согласно изобретению является то, что они могут применяться для сайленсинга или модуляции целевого гена, неограничивающими примерами которого являются РУН, Ед5, РС8К9, ТРХ2, ароВ, 8АА, ТТК, К8У, ген РЭСР β, ген ЕгЬ-В, ген 8гс, ген СКК, ген СКВ2, ген КА8, ген МЕКК, ген ίΝΕ, ген КАР, ген Егк1/2, ген РСNА(р21), ген МΥВ, ген ΐυΝ, ген РО8, ген ВСЬ-2, ген циклина Ό, ген УЕСР, ген ЕСРК, ген циклина А, ген циклина Е, ген АЛТ-1, ген βкатенина, ген с-МЕТ, ген РКС, ген №КВ, ген 8ТАТ3, ген сурвивина, ген Нег2/№и, ген топоизомеразы I, ген топоизомеразы II а, ген р73, ген р21(ААР1/СIР1), ген р27(КЕР1), ген РРМЮ, ген КА8, ген кавеолина I, ген МШ I, ген МТАР ген М68, гены опухолевых супрессоров, ген опухолевого супрессора р53, член р53-семейства ПУр63, ген опухолевого супрессора рКЬ, ген опухолевого супрессора АРС1, ген опухолевого супрессора ВКСА1, ген опухолевого супрессора РТЕИ, химерный ген тЬЬ, химерный ген ВСК/АВЬ, химерный ген ТЕЬ/АМЫ, химерный ген ЕА8/РЫ1, химерный ген Τ^8/Рυ81, химерный ген РАХ3/РКНК, химерный ген АМЫ/ЕТО, ген αν-интегрина, ген рецептора РЙ-1, ген тубулина, ген папилломавируса человека, ген, необходимый для репликации папилломавируса человека, ген вируса иммунодефицита человека, ген, необходимый для репликации вируса иммунодефицита человека, ген вируса гепатита А, ген, необходимый для репликации вируса гепатита А, ген вируса гепатита В, ген, необходимый для репликации вируса гепатита В, ген вируса гепатита С, ген, необходимый для репликации вируса гепатита С, ген вируса гепатита Ό, ген, необходимый для репликации вируса гепатита Ό, ген вируса гепатита Е, ген, необходимый для репликации вируса гепатита Е, ген вируса гепатита Р, ген, необходимый для репликации вируса гепатита Р, ген вируса гепатита С, ген, необходимый для репликации вируса гепатита С, ген вируса гепатита Н, ген, необходимый для репликации вируса гепатита Н, ген респираторно-синцитиального вируса, ген, необходимый для репликации респираторно-синцитиального вируса, ген вируса простого герпеса, ген, необходимый для репликации вируса простого герпеса, ген цитомегаловируса герпеса, ген, необходимый для репликации цитомегаловируса герпеса, ген вируса герпеса Эпштейна-Барр, ген, необходимый для репликации вируса герпеса Эпштейна-Барр, ген вируса герпеса, ассоциированного к саркомой Капоши, ген, необходимый для репликации вируса герпеса, ассоциированного к саркомой Капоши, ген вируса 1С, ген человека, необходимый для репликации вируса 1С, ген миксовируса, ген, необходимый для репликации гена миксовируса, ген риновируса, ген, необходимый для репликации риновируса, ген коронавируса, ген, необходимый для репликации коронавируса, ген вируса Западного Нила, ген, необходимый для репликации вируса Западного Нила, ген вируса энцефалита Сент-Луис, ген, необходимый для репликации вируса энцефалита Сент-Луис, ген вируса клещевого энцефалита, ген, необходимый для репликации вируса клещевого энцефалита, ген вируса энцефалита долины Муррея, ген, необходимый для репликации вируса энцефалита долины Муррея, ген вируса денге, ген, необходимый для репликации гена вируса денге, ген вакуолизирующего обезьяньего вируса 40, ген, необходимый для репликации вакуолизирующего обезьяньего вируса 40, ген лимфотропного Т-клеточного вируса человека, ген, необходимый для репликации лимфотропного Т-клеточного вируса человека, ген вируса мышиного лейкоза Молони, ген, необходимый для репликации вируса мышиного лейкоза Молони, ген вируса энцефаломиокардита, ген, необходимый для репликации вируса энцефаломиокардита, ген вируса кори, ген, необходимый для репликации вируса кори, ген вируса ветряной оспы, ген, необходимый для репликации вируса ветряной оспы, ген аденовируса, ген, необходимый для репликации аденовируса, ген вируса желтой лихорадки, ген, необходимый для репликации вируса желтой лихорадки, ген полиовируса, ген, необходимый для репликации полиовируса, ген поксвируса, ген, необходимый для репликации поксвируса, ген Р1актойшт, ген, необходимый для репликации Р1актойшт, ген МусоЬааегшт ^сегата, ген, необходимый для репликации МусоЬааегшт Шсеш^, ген МусоЬааегшт ШЪегсШоык, ген, необходимый для репликации МусоЬааегшт ШЪегсШоык, ген МусоЬааегшт 1ергае, ген, необходимый для репликации МусоЬааегшт 1ергае, ген 81арНу1ососсик аигеик, ген, необходимый для репликации 81арНу1ососсик аигеик, ген 81герЮсоссик рηеитοη^ае, ген, необходимый для репликации 81герЮсоссик рηеитοη^ае, ген 81герЮсоссик ру-оденек, ген, необходимый для репликации 81герЮсоссик ру-оденек, ген СЫатуФа раентотае, ген, необходимый для репликации СЫатуФа рηеитοη^ае, ген Мусор1акта рηеитοη^ае, ген, необходимый для репликации Мусор1акта рηеитοη^ае, ген интегрина, ген селектина, ген системы комплемента, ген хемокина, ген хемокинового рецептора, ген СС8Р, ген Сго1, ген Сго2, ген Сго3, ген РР4, ген МЮ, ген про-тромбоцитарного основного белка, ген МГР-Н, ген М!Р-1.1, ген КАОТЕ8, ген МСР-1, ген МСР-2, ген МСР-3, ген СМВКК1, ген СМВКК2, ген СМВКК3, СМВКК5ν, ген АШ-1, ген 1-309, ген компонента ионного канала, ген рецептора нейротрансмиттера, ген нейротрансмиттерного лиганда, ген амилоидного семейства, ген пресенилина, ген ΗΌ, ген ПКРЬА, ген 8СА1, ген 8СА2, ген МГО1, ген САСЖ1А4, ген
- 59 028860
8СА7, ген 8СА8, аллельный ген, обнаруженный в клетках ЬОН или один аллельный ген из семейства полиморфных генов.
В случае ведения ш У1уо, фармацевтические композиции вводят парентерально, т.е. внутрисуставно, внутривенно, интраперитонеально, подкожно или внутримышечно. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции вводят внутривенно или интраперитонеально с помощью инъекции ударной дозы вещества. Один из примеров см. в 8!аб1ег, е! а1., патент США № 5286634, содержание которого включено сюда в качестве ссылки. Внутриклеточная доставка нуклеиновых кислот также обсуждалась в 8!гаиЬгтдег, е! а1., МЕТНОЭ8 ΙΝ ЕЖУМОЬОСУ, Асабетк Ргекк, №\ν Уогк. 101:512-527 (1983); Маппто, е! а1., ВкЮсИпкщек 6:682-690 (1988); №со1аи, е! а1., Сгй. Кеу. ТИег. Эгид Сатег 8ук!. 6:239-271 (1989), и ВеИг, Асс. Скет. Кек. 26:274-278 (1993). Дополнительные способы введения терапевтических средств на основе липидов описаны, например, в КаИтап е! а1., патент США № 3993754; 8еагк, патент США № 4145410; РараИаб)орои1о5 е! а1., патент США № 4235871; 8сИпе1бег, патент США № 4224179; Ьепк е! а1., патент СшА № 4522803; и Роийаш е! а1., патент США № 4588578.
При других способах фармацевтические препараты могут приходить в контакт с целевой тканью путем прямого приложения препарата к ткани. Приложение может производиться с применением местного, "открытого" или "закрытого" способа. Под "местным" подразумевается прямое приложение фармацевтического препарата к ткани, экспонированной в окружающую среду, такой как кожа, глотка, наружный слуховой проход и т.п. "Открытые" способы - это способы, которые включают рассечение кожи пациента и прямого зрительного наблюдения подлежащей ткани, к которой будут приложены фармацевтические препараты. Обычно это достигается хирургическими процедурами, такими как торакотомия для доступа к легким, абдоминальная лапаротомия для доступа к внутренним органам брюшной полости или другим прямым хирургическим способом доступа к целевой ткани. "Закрытые" способы - это инвазивные способы, при которых внутренние целевые ткани не наблюдаются непосредственно визуально, но доступ к ним достигается посредством проникновения инструментов через небольшие ранки в коже. Например, препараты можно вводить в брюшину путем лаважа с применением иглы. Схожим образом, фармацевтические препараты можно вводить в мягкие мозговые оболочки или в спинной мозг инфузией во время люмбальной пункции, после которой пациента располагают в соответствующей позе, как стандартно практикуется при проведении спинальной анестезии или обследовании спинного мозга с использованием метразамида. В соответствии с другим вариантом, препараты можно вводить через эндоскопические изделия.
Липидонуклеиновые композиции также можно вводить в составе аэрозоля, вдыхаемого в легкие (см. Впдкат, е! а1., Ат. 1. 8сг 298(4):278-281 (1989)) или прямой инъекцией в область развития заболевания (Си1уег, Нитап Сепе Ткегару, Магу Апп ЫеЬей, 1пс., РиЬкккегк, №ν Уогк, р. 70-71 (1994)).
Способы согласно изобретению могут осуществляться в отношении различных организмов-хозяев. Предпочтительные организмы-хозяева включают виды млекопитающих, такие как человек, все приматы, кроме человека, собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы и т. п.
Дозировки частиц согласно изобретению, содержащих липид и терапевтический агент, будут зависеть от соотношения терапевтического агента и липида и мнения производящего введение врача, основанного на возрасте, массе тела и состоянии пациента.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа модуляции экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. Эти способы в общем случае включают контакт клетки с липидной частицей согласно изобретению, которая ассоциирована с нуклеиновой кислотой, способной модулировать экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. При использовании в этом документе, термин "модуляция" означает изменение экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. В различных вариантах воплощения модуляция может означать повышение или увеличение, или может означать снижение или уменьшение. Способы измерения уровня экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида известны и доступны специалистам в данной области и включают, например, способы с применением обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и иммуногистохимические методики. В некоторых вариантах воплощения уровень экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида повышается или понижается по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50 или более чем 50%, по сравнению с соответствующим контрольным значением.
Например, если требуется повышенная экспрессия полипептида, нуклеиновая кислота может находиться в экспрессионном векторе, который содержит полинуклеотид, кодирующий требуемый полипептид. С другой стороны, если требуется пониженная экспрессия полинуклеотида или полипептида, то нуклеиновая кислота может являться, например, антисмысловым олигонуклеотидом, 51РНК или микроРНК, включающей полинуклеотидную последовательность, которая специфично гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим целевой полипептид, тем самым нарушая экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. В соответствии с другим вариантом, нуклеиновая кислота может являться плазмидой, экспрессирующей такой антисмысловой олигонуклеотид, 51РНК или микроРНК.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа модуляции экспрессии полипептида клеткой, включающего доставку в клетку липидной частицы, которая состоит или в существенной степени состоит из катионного липида формулы I, нейтрального липида, сте- 60 028860
рола, ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида, например, в молярном соотношении примерно 20-65% катионного липида формулы I, 3-25% нейтрального липида, 15-55% стерола и 0,5-15% ПЭГ или ПЭГмодифицированного липида, при этом липидная частица ассоциирована с нуклеиновой кислотой, способной модулировать экспрессию полипептида. В некоторых вариантах воплощения молярное соотношение липидов составляет примерно 60/7,5/31/1,5, 57,5/7,5/31,5/3,5, 57,2/7,1/34,3/1,4, 52/13/30/5, 50/10/38,5/1,5, 50/10/35/5, 40/10/40/10, 40/15/40/5 или 35/15/40/10 (мол.% катионного липида формулы ЕДСФХ или ДПФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-сЭМА). В некоторых вариантах воплощения липидная частица также включает остаток направленного действия, такой как нацеливающий липид, описанный в этом документе (например, липидная частица в существенной мере состоит из катионного липида формулы I, нейтрального липида, стерола, ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида и нацеливающего остатка). В другой группе вариантов воплощения нейтральный липид в этих композициях заменен на ДПФХ, ПОФХ, ДОФЭ или СМ. В другой группе вариантов воплощения ПЭГ или ПЭГмодифицированный липид заменен на ПЭГ-ДСГ, ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДПГ.
В некоторых вариантах воплощения терапевтический агент выбран из 31РНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида, плазмиды, способной экспрессировать 31РНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид, и при этом 31РНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид содержит полинуклеотид, который специфично связывается с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, или с комплементарным ему полинуклеотидом, таким образом, что экспрессия полипептида снижается.
В других вариантах воплощения настоящего изобретения нуклеиновая кислота является плазмидой, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или фрагмент, таким образом, что экспрессия полипептида или его функционального варианта или фрагмента повышена.
В родственных воплощениях настоящее изобретение направлено на создание реагентов, полезных для трансфекции клеток в культуре. Например, липидные композиции, описанные в этом документе, могут применяться для доставки нуклеиновых кислот в культивируемые клетки (например, адгезивные клетки, суспензионные клетки и т.д.).
В родственных вариантах воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения заболевания или нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией полипептида в организме субъекта, включающего введение субъекту фармацевтической композиции согласно изобретению, при этом терапевтический агент выбирают из з!РНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать з!РНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид, и при этом з!РНК, микроРНК или антисмысловая РНК содержит полинуклеотид, который специфично связывается с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, или с комплементарным ему полинуклеотидом.
В одном из вариантов воплощения фармацевтическая композиция содержит липидную частицу, которая состоит или в существенной степени состоит из катионного липида формулы I, ДСФХ, холестерола и ПЭГ-ДМГ, ПЭГ-С-ЭОМО или ПЭГ-сЭМА, например, в молярном соотношении примерно 20-65% катионного липида формулы I, 3-25% нейтрального липида, 15-55% стерола и 0,5-15% ПЭГ или ПЭГмодифицированного липида ПЭГ -ДМГ, ПЭГ-С-ЭОМО или ПЭГ-сЭМА, при этом липидная частица ассоциирована с терапевтической нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах воплощения молярное соотношение липидов составляет примерно 60/7,5/31/1,5, 57,5/7,5/31,5/3,5, 57,2/7,1/34,3/1,4, 52/13/30/5, 50/10/38,5/1,5, 50/10/35/5, 40/10/40/10, 35/15/40/10 или 40/15/40/5 (мол.% катионного липида формулы ЕДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-сЭМА). В некоторых вариантах воплощения липидная частица также включает нацеливающий липид, описанный в этом документе (например, липидная частица в существенной мере состоит из катионного липида формулы I, нейтрального липида, стерола, ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида и нацеливающего остатка (например, ОаШАс3-ПЭГ-ДСГ)). В некоторых вариантах воплощения, когда нацеливающий липид содержит остаток ПЭГ и добавлен к существующей липосомной композиции, количество ПЭГ-модифицированного липида снижено таким образом, что суммарное количество ПЭГ-модифицированного липида (т.е. ПЭГ-модифицированного липида, например, ПЭГ-ДМГ, и ПЭГ-содержащего нацеливающего липида), выраженное в мольных процентах, сохранялось постоянным (например, 0,3, 1,5 или 3,5 мол.%). В другой группе вариантов воплощения нейтральный липид в этих композициях заменен на ДПФХ, ПОФХ, ДОФЭ или СМ. В другой группе вариантов воплощения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид заменен на ПЭГ-ДСГ или ПЭГ-ДПГ. В другом родственном варианте воплощения настоящее изобретение включает способ лечения заболевания или нарушения, характеризующегося пониженной экспрессией полипептида в организме субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции согласно изобретению, при этом терапевтический агент является плазмидой, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или фрагмент.
Настоящее изобретение дополнительно направлено на создание способа индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающего введение субъекту фармацевтической композиции согласно изобретению, при этом терапевтический агент является иммуностимулирующим олигонуклеотидом. В некоторых воплощениях иммунный ответ является гуморальным или мукозным иммунным ответом, который состоит или в существенной степени состоит из катионного липида формулы I, ДСФХ, холестерола и ПЭГ ДМГ, ПЭГ-С-ЭОМО или ПЭГ-сЭМА, например, в молярном соотношении примерно 20-65% катионного
- 61 028860
липида формулы I, 3-25% нейтрального липида, 15-55% стерола и 0,5-15% ПЭГ или ПЭГмодифицированного липида ПЭГ - ДМГ, ПЭГ-С-ЭОМС или ПЭГ-сЭМА. при этом липидная частица ассоциирована с терапевтической нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах воплощения молярное соотношение липидов составляет примерно 60/7,5/31/1,5, 57,5/7,5/31,5/3,5, 57,2/7,1/34,3/1,4, 52/13/30/5, 50/10/38,5/1,5, 50/10/35/5, 40/10/40/10, 35/15/40/10 или 40/15/40/5 (мол.% катионного липида формулы 1/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-сЭМА). В некоторых вариантах воплощения липидная частица также включает нацеливающий липид, описанный в этом документе (например, липидная частица в существенной мере состоит из катионного липида формулы Ι, нейтрального липида, стерола, ПЭГ или ПЭГ-модифицированного липида и нацеливающего остатка). В некоторых вариантах воплощения когда нацеливающий липид содержит остаток ПЭГ и добавлен к существующей липосомной композиции, количество ПЭГ-модифицированного липида снижено таким образом, что суммарное количество ПЭГмодифицированного липида (т.е. ПЭГ-модифицированного липида, например, ПЭГ-ДМГ, и ПЭГсодержащего нацеливающего липида), выраженное в мольных процентах, сохранялось постоянным (например, 0,3, 1,5 или 3,5 мол.%). В другой группе вариантов воплощения нейтральный липид в этих композициях заменен на ДПФХ, ПОФХ, ДОФЭ или СМ. В другой группе вариантов воплощения ПЭГ или ПЭГ-модифицированный липид заменен на ПЭГ-ДСГ или ПЭГ-ДПГ. В дополнительных вариантах воплощения фармацевтическая композиция вводится субъекту в сочетании с вакциной или антигеном. Таким образом, само изобретение направлено на создание вакцин, содержащих липидную частицу согласно изобретению, которая включает иммуностимулирующий олигонуклеотид, а также ассоциирована с антигеном, к которому требуется вызвать иммунный ответ. В некоторых вариантах воплощения антиген является опухолевым антигеном или ассоциирован с инфекционным агентом, таким как, например, вирус, бактерия или паразитический организм.
Специалистам в данной области известно множество опухолевых антигенов, антигенов инфекционных агентов и антигенов, ассоциированных с другими заболеваниями, и их примеры описаны в ссылках, процитированных в этом документе. Антигены, пригодные для применения в изобретении, включают в качестве неограничивающих примеров полипептидные антигены и ДНК-антигены. Конкретными примерами антигенов являются антигены гепатита А, гепатита В, черной оспы, полиомиелита, сибирской язвы, гриппа, сыпного тифа, столбняка, кори, ротавируса, дифтерии, коклюша, туберкулеза и краснухи. В одном из вариантов воплощения антиген представлен рекомбинантным антигеном гепатита В. В другом варианте антиген представлен рекомбинантным антигеном гепатита А. В еще одном варианте, антиген является опухолевым антигеном. Примерами таких ассоциированных с опухолью антигенов являются МиС-1, антиген ЕВУ и антигены, ассоциированные с лимфомой Беркитта. Дополнительной особенностью является то, что антиген представлен рекомбинантным антигеном опухолевого антигена, родственного белку тирозиназе. Специалисту в данной области будет известно о других антигенах, пригодных для применения в изобретении.
Ассоциированные с опухолью антигены, пригодные для применения в настоящем изобретении, включают как мутированные, так и не мутированные молекулы, которые могут быть признаком одного типа опухоли, быть общими для нескольких типов опухоли и/или экспрессироваться или сверхэкспрессироваться исключительно в опухолевых клетках, по сравнению с нормальными клетками. Помимо белков и гликопротеинов, были задокументированы особенности опухоле-специфичной экспрессии углеводов, ганглиозидов, гликолипидов и муцинов. Примеры ассоциированных с опухолью антигенов для применения в рассматриваемых противораковых вакцинах, включают белковые продукты онкогенов, генов опухолевых супрессоров и других генов с мутациями или перестройками, характерными для опухолевых клеток, продукты реактивированных эмбриональных генов, онкофетальные антигены, тканеспецифичные (но не опухоле-специфичные) антигены дифференцировки, рецепторы факторов роста, остатки углеводов клеточной поверхности, чужеродные вирусные белки и ряд других собственных белков.
Конкретные примеры воплощения ассоциированных с опухолью антигенов включают, например, мутированные антигены, такие как белковые продукты протоонкогенов Каз р21, онкогенов опухолевых супрессоров р53 и ВСК-аЫ, а также СЭК4, МиМ1, каспаза 8, и β катенин; сверхэкспрессированные антигены, такие как галектин 4, галектин 9, карбоангидраза, альдолаза А, РКАМЕ, Нег2/пеи, ЕгЬВ-2 и К8А, онкофетальные антигены, такие как α-фетопротеин (АРР), хорионический гонадотропин человека (НСС); аутоантигены, такие как карциномоэмбриональный антиген (СЕА) и антигены дифференцировки меланоцитов, такие как Май 1/Ме1ап А, др100, др75, тирозиназа, ТКР1 и ТКР2; простатоспецифические антигены, такие как Р8А, РАР, Р8МА, Р8М-Р1 и Р8М-Р2; продукты реактивированных эмбриональных генов, такие как МАСЕ 1, МАСЕ 3, МАСЕ 4, САСЕ 1, САСЕ 2, ВАСЕ, КАСЕ, и другие антигены, специфичные для рака яичек, такие как НУ-Е8О1, 88X2 и 8СР1; муцины, такие как Мис-1 и Мис-2; ганглиозиды, такие как СМ2, СЭ2 и СЭ3, нейтральные гликолипиды и гликопротеины, такие как Бе\\зз (у) и глобо-Н; и гликопротеины, такие как Тп, антиген Томпсона-Фриденрайха (ТР) и зТп. В этот документ также включены в качестве ассоциированных с опухолью антигенов целая клетка и лизаты опухолевых клеток, а также их иммуногенные части, а также идиотипы иммуноглобулинов, экспрессируемые моноклональными пролиферирующими В-лимфоцитами для применения против В-клеточных лимфом.
- 62 028860
Патогены включают в качестве неограничивающих примеров инфекционные агенты, например вирусы, которые инфицируют млекопитающих, в частности человека. Примеры инфекционных вирусов включают в качестве неограничивающих примеров: Кейоушбае (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ-1 (также называемый НТЬУ-Ш, ЬАУ или НТЬУ-Ш/ЬАУ, или Н1У-Ш); и другие изоляты, такие как Н1У-ЬР; Рюогпаушбае (например, вирусы полиомиелита, вирус гепатита А; энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, ЕСНО-вирусы); СаЫутбае (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); Тодаутбае (например, вирусы энцефалита лошадей, вирусы краснухи); Р1аушбае (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Согопоушбае (например, короновирусы); КЬаЬбоутабае (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Согопаутбае (например, коронавирусы); КЬаЬбоутбае (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Рйоушбае (например, вирусы Эбола); Рагатухоутбае (например, вирусы парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); ОгШотухоутбае (например, вирусы гриппа); Випдаушбае (например, вирусы Хантаан, бунгавирус, флебовирусы и найровирусы); Агепаутбае (вирусы геморрагической лихорадки); Кеоушбае (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); В1гпаушбае; Нерабпаутбае (вирус гепатита В); Рагуоутба (парвовирусы); Рароуаутбае (вирусы папилломы, вирусы полиомы); Абепоушбае (большинство аденовирусов); Негрекушбае вирус простого герпеса (Н8У) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (СМУ), вирус герпеса; Рохутбае (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы); и Ыбоутбае (например, вирус африканской лихорадки свиней); и неклассифицированные вирусы (например, этиологические агенты губчатых энцефалопатии, агент дельта-гепатита (считается дефектным сателлитом вируса гепатита В), агенты не-А, не-В гепатитов (класс 1=с внутренней передачей; класс 2=с парентеральной передачей (т.е. гепатит С); вирус Норуолк и родственные ему вирусы и астровирусы).
Грамположительные и грамотрицательные бактерии также служат антигенами у позвоночных животных. Такие грамположительные бактерии включают в качестве неограничивающих примеров Рак1еиге11а креиек, 81арЬу1ососс1 креиек и 81герЮсоссик креиек. Грамотрицательные бактерии включают в качестве неограничивающих примеров ЕксЬейсЫа сой, Ркеиботопак креаек и 8а1топе11а креаек. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают в качестве неограничивающих примеров: НейсоЬас1егру1ойк, Вогейа ЬигдбогГей, Ьедюпейа рпеиторЫйа, МусоЬасГога крк (например, М. 1иЬегси1ок1к, М. ау1ит, М. шГгасейШаге, М. капкаи, М. догбопае), 8!арЬу1ососсик аигеик, №Ькепа допоггЬоеае, №Ькепа тетпдШбЬ, Ык1ег1а топосуЮдепек. 81герЮсосспк руодепек (стрептококк группы А), 81герЮсосспк ада1асйае (стрептококк группы В), 81герЮсосспк (группа вириданс), 8йерЮсоссик£аесайк, 81герЮсосспк Ьоу1к, 81герЮсосспк (апаегоЫс крк.), 81герЮсосспк рпеитотае, патогенные Сатру1оЬас1ег кр., Епегососсик кр., НаеторЬйик тГиеп/ае. ВасШик апйаак, согупеЬаЫегшт бгрЬШейае, согупеЬаЫегшт кр., Егук1ре1оШг1х гЬикюраГШае, ОокЫбтт регйгпдегк, ОокЫбтт 1е1ат. Еп1егоЬас1ег аегодепек, К1еЬые11а рпеитотае, РакЫгейа тийоаба, ВасЮгсабек кр., РикоЬасЮгтт ппс1еа1пт. 8ГгерЮЬаа11ик топШГоптк. Тгеропета ра1йбшт, Тгеропета рейепие, ЬерЮкрйа. Кюкейыа и Асйпотусек 1кгае1й.
Дополнительные примеры патогенов включают в качестве неограничивающих примеров инфекционные грибы, которые инфицируют млекопитающих, и в частности, человека. Примеры инфекционных грибов включают в качестве неограничивающих примеров: СгурЮсоссик пеоГогтапк, Н1кЮр1акта сарки1а1пт. СосабЮбек 1ттШк, В1акЮтусек бегтаййбй, СЬ1атуб1а ГгасЬотайк, Сапб1ба а1Ысапк. Примеры инфекционных паразитических организмов включают Р1актобшт, такие как Р1актобшт Га1арашт. Р1актобтт та1апае. Р1актобтт оуа1е и Р1актобтт У1уах. Другие инфекционные организмы (т.е. простейшие) включают Тохор1акта допби.
Фармацевтические композиции
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание фармацевтических композиций, содержащих агент в виде нуклеиновой кислоты, идентифицированный с помощью модельного скрининга клеток печени, описанного в этом документе. Композиция включает агент, например, дцРНК, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция полезна для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена. Композицию таких фармацевтических композиций разрабатывают исходя из способа доставки. Одним примером служат композиции, композиция которых разработана для системного введения путем парентеральной доставки. Фармацевтические композиции, содержащие идентифицированный агент, вводят в дозировках, достаточных для ингибирования экспрессии целевого гена, например, гена фактора У11. В общем случае, пригодная доза дцРНК-агента будет находиться в диапазоне от 0,01 до 5,0 мг на кг массы тела реципиента в день, обычно в диапазоне от 1 мкг до 1 мг на кг массы тела в день. Фармацевтическую композицию могут вводить один раз в день, или дцРНК могут вводить в виде двух, трех или нескольких суб-доз через приемлемые интервалы времени в течение дня, или даже с применением непрерывной инфузии или доставки с применением композиции с контролируемым высвобождением. В таком случае, содержание дцРНК в каждой суб-дозе должно быть соответствующим образом уменьшено, чтобы достичь суммарной ежедневной дозы. Единица дозирования может быть получена для доставки в течение нескольких дней, например, с применением традиционной композиции с замедленным высвобождением, которая обеспечивает замедленное высвобождение дцРНК в течение периода в несколько дней. Композиции с
- 63 028860
замедленным высвобождением хорошо известны специалистам в данной области, и, в частности, полезны для вагинальной доставки агентов, таких как могут применяться с агентами согласно изобретению. В этом варианте воплощения единица дозирования содержит соответствующее количество ежедневных доз.
Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые факторы могут влиять на дозировку и выбор временных периодов для эффективного лечения субъекта, включая в качестве неограничивающих примеров степень тяжести заболевания или нарушения, предшествующие способы лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта, а также наличие других заболеваний. Дополнительно, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать разовый курс лечения или серию курсов лечения. Расчеты эффективных дозировок и периодов полувыведения ίη νίνο для индивидуальных дцРНК согласно изобретению можно производить с применением стандартных методик или на основании испытаний ίη νίνο с применением соответствующей модели на животном, как описано в других местах в этом документе.
В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции, содержащие липидонуклеиновые частицы согласно изобретению, получены в соответствии со стандартными способами и дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. В общем случае, в качестве фармацевтически приемлемого носителя может использоваться изотонический раствор натрия хлорида. Другие пригодные носители включают, например, воду, буферизированную воду, 0,9% раствор натрия хлорида, 0,3% глицин и т.п., содержащие гликопротеины для повышения стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и т.д. В композициях, включающих раствор натрия хлорида или другой содержащий соль носитель, этот носитель предпочтительно добавляют после формирования липидных частиц. Таким образом, после того как композиции липидонуклеиновых частиц сформировались, эти композиции можно разбавить фармацевтически приемлемыми носителями, такими как изотонический раствор натрия хлорида.
Полученные в результате фармацевтические препараты можно простерилизовать с применением стандартных, хорошо известных, методик стерилизации. После этого водные растворы можно упаковать для применения или профильтровать в стерильных условиях и лиофилизовать, при этом лиофилизованный препарат перед введением должен смешиваться со стерильным водным раствором. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные субстанции, необходимые для создания условий, близких к физиологическим, такие как корректирующие значение рН и буферизирующие агенты, корректирующие тоничность агенты и т.п., например, натрия ацетат, натрия лактат, натрия хлорид, калия хлорид, кальция хлорид, и т. д. Дополнительно, липидная суспензия может включать защищающие липиды агенты, которые защищают липиды при хранении от повреждений, вызванных свободными радикалами и перекисным окислением. Пригодными являются липофильные гасители свободных радикалов, такие как α-токоферол и водорастворимые железо-специфичные хелаторы, такие как ферриоксамин.
Концентрация липидной частицы или липидонуклеиновой частицы в фармацевтических композициях может широко варьировать, т.е. от менее чем примерно 0,01%, обычно равной или по меньшей мере примерно равной 0,05-5%, до 10-30% по массе, и будет выбираться в основном с учетом объемов жидкости, вязкости и т.д., в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Например, концентрация может быть повышена для снижения связанной с лечением нагрузки вводимой жидкостью. Это может быть, в частности, необходимо для пациентов, имеющих ассоциированную с атеросклерозом застойную сердечную недостаточность или тяжелую форму гипертонии. В соответствии с другим вариантом, комплексы, состоящие из способных вызывать воспаление липидов, могут быть разбавлены для снижения концентраций с целью уменьшения воспаления в области введения. В одной группе вариантов воплощения нуклеиновая кислота будет нести присоединенную метку и будет применяться для диагностики (указывая на присутствие комплементарной нуклеиновой кислоты). В этом случае, количество введенных комплексов будет зависеть от конкретной использованной метки, диагностируемого болезненного состояния и суждения клинициста, но в общем случае будет составлять от примерно 0,01 до примерно 50 мг/кг массы тела (например, для агента в виде нуклеиновой кислоты), предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 5 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах воплощения вводимый комплекс содержит от примерно 0,004 до примерно 50 мг/кг массы тела агента, представленного нуклеиновой кислотой (например, от примерно 0,006 мг/кг до примерно 0,2 мг/кг).
Как указано выше, частицы липида с терапевтическим агентом (например, нуклеиновой кислотой) согласно изобретению могут содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ)-модифицированные фосфолипиды, ПЭГ-церамиды или ганглиозиды, ОМ1 -модифицированные липиды или другие липиды, эффективные для предотвращения или ограничения агрегации. Добавление таких компонентов не только предотвращает агрегацию комплексов. Скорее, оно может дополнительно обеспечивать способ увеличения времени существования в кровеносной системе и увеличения доставки композиции липида и нуклеиновой кислоты к целевым тканям.
Настоящее изобретение направлено на создание композиций липида и терапевтического агента в виде набора. В типичном случае, набор будет состоять из контейнера, имеющего отделения для хранения различных элементов набора. Набор будет содержать частицы или фармацевтические композиции со- 64 028860
гласно изобретению, предпочтительно в дегидратированной или концентрированной форме, с инструкциями по их регидратации или разбавлению и введению. В некоторых воплощениях частицы содержат активный агент, в то время как в других вариантах воплощения не содержат.
Фармацевтические композиции, содержащие агент, идентифицированный с помощью модельного скрининга клеток печени, могут вводиться с помощью ряда способов, в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение и от области, к которой применяется лечение. Введение может быть местным, легочным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе с применением небулайзера; внутритрахеальным, интраназальным, эпидермальным или трансдермальным, пероральном или парентеральным. Способ введения может быть разработан так, чтобы в результате достичь предпочтительной локализации в конкретных тканях с применением местной доставки, например, прямой внутрисуставной инъекцией в сустав, ректальным введением для прямой доставки в кишку и кишечник, интравагинальным введением для доставки в шейку матки и вагину, интравитриальным введением для доставки в глаз. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, внутрисуставную, подкожную, интраперитонеальную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или интракраниальное, например, интратекальное или интравентрикулярное введение.
Фармацевтические композиции и составы для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, примочки, кремы, гели, капли, суппозитории, аэрозоли, растворы и порошки. Стандартные фармацевтические носители, жидкие, порошкообразные или масляные основы, загустители и т. п. могут быть необходимы или желательны. Также могут быть полезны презервативы, перчатки и т.п. с покрытием. Предпочтительные местные композиции включают таковые, где дцРНК согласно изобретению находятся в смеси с компонентом для местной доставки, таким как липид, липосома, жирная кислота, сложный эфир жирной кислоты, стероид, хелатирующий агент или поверхностно-активное вещество. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин (ДОФЭ), димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ), дистеароилфосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидилглицерин, или ДМФГ) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил ЭОТАР и диолеоилфосфатидилэтаноламин ЭОТМА). ДцРНК согласно изобретению могут быть инкапсулированы внутри липосом или могут образовывать с ними комплексы, в частности, с катионными липосомами. В соответствии с другим вариантом, дцРНК могут находиться в комплексе с липидами, в частности, с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и сложные эфиры включают в качестве нелимитирующих примеров арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, арахиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, диэфир каприновой кислоты, триэфир каприновой кислоты, моноолеин, дилаурин, глицерил-1монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или сложный эфир С1-10-алкила (например, изопропилмиристат, ГРМ), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемые соли. Композиции для местного применения подробно описаны в заявке на патент США с № 09/315298, поданной 20 мая 1999 г., содержание которой целиком включено сюда в качестве ссылки.
Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрогранулы, наногранулы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, желатиновые капсулы, пакеты-саше, таблетки или минитаблетки. Могут требоваться загустители, вкусовые и ароматические агенты, разбавители, эмульгирующие агенты, диспергирующие агенты или связующие вещества. Предпочтительными композициями для перорального введения являются композиции, в которых дцРНК согласно изобретению вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, поверхностно-активными веществами и хелатирующими агентами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры и соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли включают хенодезоксихолевую кислоту (СОСА) и урсодезоксихолевую кислоту (ИОСА), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, натрия тауро-24,25-дигидрофузидат и натрия гликодигидрофузидат. Предпочтительные жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, диэфир каприновой кислоты, триэфир каприновой кислоты, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемые соли (например, натриевые). Также предпочтительными являются сочетания веществ, способствующих проникновению, например, комбинации жирных кислот/солей с желчными кислотами/солями. В частности, особо предпочтительным сочетанием является сочетание натриевой соли лауриновой кислоты, каприновой кислоты и ЫЭСА. Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают эфир полиоксиэтилен-9-лаурила, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Доставка дцРНК согласно изобретению может осуществляться перорально, в виде гранул, в том числе в виде аэрозоля сухих частиц, или в комплексе с образованием микро- и наногранул. Комплексообразующие агенты для дцРНК включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, поли- 65 028860
окситаны, полиалкилцианоакрилаты; катионированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; ДЭАЭ-производные полииминов, поллуланы, целлюлозы и крахмалы. В частности, предпочтительные комплексообразующие агенты включают хитозан, Ν-триметилхитозан, поли-Ь-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен ΡίΤΩΛΕ), полиаминостирен (например, р-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), ДЭАЭ-метакрилат, ДЭАЭ-гексилакрилат, ДЭАЭ-акриламид, ДЭАЭ-альбумин и ДЭАЭ-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, полиЩЬмолочная кислота), поли(сополимер Ό,Ε-молочной кислоты/гликолевой кислоты) (РЬОА), альгинат и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Композиции для перорального введения для дцРНК и их получение подробно описаны в заявках на патент США № 08/886829 (поданной 1 июля 1997 г.), № 09/108673 (поданной 1 июля 1998 г.), № 09/256515 (поданной 23 февраля 1999 г.), № 09/082624 (поданной 21 мая 1998 г.) и № 09/315298 (поданной 20 мая 1999 г.), содержание каждой из которых целиком включено сюда в качестве ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать стерильные водные растворы, которые дополнительно могут содержать буферы, разбавители и другие пригодные добавки, такие как, в качестве нелимитирующих примеров, вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.
Фармацевтические композиции включают в качестве неограничивающих примеров растворы, эмульсии и композиции, содержащие липосомы. Эти композиции могут быть получены из различных компонентов, включая в качестве неограничивающих примеров предварительно полученные жидкости, само-эмульгирующиеся сухие вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.
Фармацевтические композиции, которые еще в одном варианте могут быть представлены в форме единицы дозирования, могут быть получены в соответствии со стандартными способами, хорошо известными специалистам фармацевтической промышленности. Такие способы включают этап объединения активных веществ с фармацевтическим носителем (носителями) или вспомогательным веществом (веществами). В общем случае, композиции приготавливают путем смешивания до однородности и тесного взаимодействия активных веществ с жидкими носителями или тонкодисперсными твердыми носителями или с обоими, и после этого, в случае необходимости, формируют продукт.
Композициям может быть придана любая из многих возможных лекарственных форм, включая в качестве неограничивающих примеров таблетки, капсулы, желатиновые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции согласно изобретению могут также быть получены в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать субстанции, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбитол и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
В одном из вариантов воплощения изобретения, фармацевтические композиции могут быть получены для применения в форме пены. Фармацевтические пены включают в качестве неограничивающих примеров такие композиции как эмульсии, микроэмульсии, кремы, желе и липосомы. Хотя они и являются в целом схожими по своей природе, эти композиции различаются по компонентам и стабильности готового продукта. Способы получения таких композиций и композиций в общем случае известны специалистам в области фармацевтики и могут применяться для композиций и композиций согласно изобретению.
Настоящее изобретение не ограничено в своих применениях особенностями получения и сборки компонентов, изложенными в следующем описании. Изобретение пригодно для других применений и может применяться на практике и выполняться различными способами. Дополнительно, фразеология и терминология, использованные в этом документе, имеют целью дать описание и не должны рассматриваться как ограничивающие. Применение слов "включающий", "содержащий" или "имеющий", "вовлекающий" и их вариантов в этом документе означает включение всех позиций, перечисленных после этого, и их эквивалентов, а также дополнительных позиций.
Примеры
Последующие примеры приведены в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения.
При использовании в примерах, приведенных в этом документе, термин "АроЕ" означает АроЕ3, если не указано иначе.
Пример 1. Дуплексы 51РНК для направленного действия на Ьис и ΡνΐΙ.
В табл. 8 ниже приведены примеры последовательностей для направленного действия на Ьис и
Ρνΐΐ.
- 66 028860
Таблица 8
Дуплекс Смысловой/ антисмысловой Последовательность 5'-3' Мишень
1000/2434 сии асо сио лои леи исо латат и* со ААО ШАС иСА ОСО ШАА ΟάΤ*άΤ Ьис
2433/1001 с*иш асо сио аош леи исо лат*ат исо аао иле исл осо илл оатат Ьис
2433/2434 с*иш асо сио аош леи исо лат*ат и* со ААО ШАС иСА ОСО ШАА ΟάΤ*άΤ Ьис
1000/1001 сии асо сио лои леи исо латат исо аао иле исл осо илл оатат Ьис
Αϋ1596 оолисАисисААоисииАсатат оиААОАсииоАОАиолиссатат РУН
Αϋ1661 ООАШШАШШШШААОШШШШАГСаТзаТ ОШААОАШШШОАОАШОАШГСШаТ* ат РУН
Примечание: 1.8:
строчная буква: 2'-О-метил-модифицированный нуклеотид; *: фосфоротиоатная связь в остове; ίΝ: 2'-фторонуклеотид; 6Ν: 2'дезоксинуклеотид.
Пример 2. Оценка т νινί) РУН с применением липосом на основе катионного липида.
Эксперименты по сайленсингу щ νινί) фактора VII и АроВ у грызунов. Мышам линии С57ВИ/6 (С1аг1ез Ккег ЬаЪз, Массачусетс, США) и крысам линии Спрейг-Даули (С1аг1ез Ккег ЬаЪз, Массачусетс, США) вводили либо раствор натрия хлорида, либо 31РНК в составе требуемых композиций путем инъекции в хвостовую вену в объеме 0,01 мл/г. В разных временных точках после введения животных анестезировали ингаляцией фторированного простого эфира и собирали пробы крови в пробирки для отделения сыворотки путем забора крови из ретро-орбитального синуса. Содержание в сыворотке белкового фактора VII определяли в пробах с применением хромогенного анализа (Соазе! Рас1ог VII, ^^аΡ1а^та Огоир, Огайо, США или ВюрНеп РУН, Атага СогрогаРоп, Огайо, США) в соответствии с протоколами производителя. Стандартную кривую получали, используя сыворотку, собранную от животных, обработанных раствором натрия хлорида. В экспериментах, где проводилась оценка содержания мРНК в клетках печени в различных временных точках после введения, животных умерщвляли и печень извлекали и мгновенно замораживали в жидком азоте. Замороженную ткань печени растирали в порошок. Приготавливали лизаты ткани и определяли содержание мРНК фактора VII и ароВ с применением метода разветвленной ДНК оценки ^иапРОепе Аззау, Ρаηοт^сз, Калифорния, США).
Пример 3. Липосомные композиции для направленного действия на РVII.
Фактор VII (РVII), известный белок, участвующий в коагуляционном каскаде, синтезируется в печени (в гепатоцитах) и секретируется в плазму. Содержание РVII в плазме можно определить с помощью простого колориметрического анализа с использованием планшетов. По существу, РVII представляет собой удобную модель для определения опосредованного 31РНК подавления выработки гепатоцитами белков, а также мониторинга концентраций в плазме и распределения в тканях липидонуклеиновых частиц и 81РНК.
Нокдаун фактора VII у мышей.
Активность РVII оценивали у животных, обработанных РVII 31РНК, в точке 24 ч после внутривенной (с дозой насыщения) инъекции мышам линии С57ВИ/6. Содержание РVII измеряли с применением имеющегося в продаже набора для определения содержания белка в сыворотке или ткани, следуя инструкциям производителя, в масштабе микропланшета. Снижение содержания РVII определяли в сравнении с не обработанными контрольными мышами, и результаты выражали как % остаточного количества Р^Р В начальном скрининге каждой новой липосомной композиции использовали четыре уровня дозы (2, 5, 12,5, 25 мг/кг РVII 31РНК), и расширяли количество дозировок при последующих экспериментах, основанных на результатах, которые были получены при начальном скрининге.
Определение переносимости.
Переносимость каждой новой липосомной композиции с 31РНК оценивали, проводя мониторинг изменения массы, наблюдения за поведением в клетке, проводя клинический биохимический анализ и, в некоторых случаях, гематологический анализ. Массу животных регистрировали перед обработкой и через 24 ч после обработки. Данные регистрировали в виде % изменения массы тела. Помимо измерения
- 67 028860
массы тела, проводили полный клинический биохимический анализ, включая определение маркеров функции печени, для каждого уровня дозы (2, 5, 12,5 и 25 мг/кг 81РНК) в точке 24 ч после инъекции, используя аликвоты сыворотки, собранной для анализа ΡνΠ. Пробы отсылали для проведения анализа в Центральную лабораторию ветеринарии (Йапд1еу, ВС). В некоторых случаях, в лечебную группу включали дополнительных мышей для сбора цельной крови для проведения гематологического анализа.
Определение терапевтического индекса.
Терапевтический индекс (ΤΣ) - это условный параметр, получаемый сравнением показателей токсичности и активности. В ходе данных исследований, Ή определяли как:
ΤΊ = МТО (максимально переносимая доза) /ΕΏ50 (доза для 50%-го нокдауна ΡνΠ).
МТО для настоящих исследований установили как наименьшую дозу, вызывающую >7% снижение массы тела и повышение в >200 раз содержания аланинаминотрансферазы (АЛТ), клинического биохимического маркера с высокой специфичностью к повреждению печени у грызунов. ΕΌ50 определяли по кривым зависимости доза-активность ΡΆΓ
ΑΟ 1661 81РНК, которая представлена в примере 1, вводили в составе композиций, содержащих ПЕт-М-С3-ОМА:ДСФХ:холестерол:ПЭГ-ДМГ в следующих молярных соотношениях, которые приготавливали и испытывали способами, описанными в примере 2: 60:7,5:31:1,5; 50:10:38,5:1,5 и 40:20:38,5:1,5. Результаты этих экспериментов т у1уо представлены на фиг. 1, демонстрирующей способность испытанных композиций к сайленсингу.
Пример 4. Получение 1,2-ди-0-алкила-8п3-карбомоилглицерида (ПЭГ-ДМГ). колглон
Получение Аа:
1.2- ди-О-тетрадецил-8п-глицерид Ы (30 г, 61,80 ммоль) и Ν,Ν'-сукцинимидилкарбонат (О8С, 23,76 г, 1,5 экв.) поместили в дихлорметан (ОСМ, 500 мл) и перемешивали, держа в смеси льда с водой. Триэтиламин (ΤΕΑ, 25,30 мл, 3 экв.) добавили в перемешиваемый раствор и после этого оставили реакционную смесь перемешиваться в течение ночи при температуре окружающей среды. За развитием реакции следили с помощью ТСХ. Реакционную смесь разбавили ОСМ (400 мл) и промыли органический слой водой (2 раза по 500 мл), водным раствором №НС03 (500 мл), с последующим стандартным исследованием. Полученный осадок высушили при температуре окружающей среды при высоком вакууме в течение ночи. После высушивания полученный таким образом грубый карбонат Па растворили в дихлорметане (500 мл) и перемешивали в ледяной бане. К перемешиваемому раствору в атмосфере аргона добавили 1пПЭГ;Шш-\11; (III, 103,00 г, 47,20 ммоль, приобретенный у Ν0Ρ Согрогаиоп, Япония) и безводный пиридин (Ру, 80 мл, в избытке). После этого оставили реакционную смесь перемешиваться в течение ночи при температуре окружающей среды. Растворители и летучие соединения удалили под вакуумом и осадок растворили в ОСМ (200 мл) и нанесли на колонку силикагеля, упакованного в этилацетат. Колонку сначала элюировали этилацетатом и после этого - градиентом 5-10% метанола в дихлорметане для получения требуемого ПЭГ-липида Аа в виде белого сухого вещества (105,30 г, 83%).
1Н ЯМР (СОС13, 400 МГц) δ 5,20-5,12 (ш, 1Н), 4,18-4,01 (ш, 2Н), 3,80-3,70 (ш, 2Н), 3,70-3,20 (ш, -ОСН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 2,10-2,01 (ш, 2Н), 1,70-1,60 (ш, 2Н), 1,56-1,45 (ш, 4Н), 1,31-1,15 (ш, 48Н), 0,84 (ΐ, 1=6,5 Гц, 6Н).
Обнаруженный диапазон масс-спектра: 2660-2836.
Получение АЪ:
1.2- ди-О-гексадецил-8п-глицерид 1Ъ (1,00 г, 1,848 ммоль) и Э8С (0,710 г, 1,5 экв.) поместили вместе в дихлорметан (20 мл) и охладили до 0°С в смеси льда с водой. Триэтиламин (1,00 мл, 3 экв.) добавили и оставили реакционную смесь перемешиваться в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ, разбавили ОСМ, промыли водой (2 раза), раствором №НС03 и высушили над натрия сульфатом. Растворители удалили при пониженном давлении и полученный осадок ПЪ хранили под высоким вакуумом в течение ночи. Это соединение применяли непосредственно для проведения следующей реакции без дополнительной очистки. МПЭГ2000-ЫН2 III (1,50 г, 0,687 ммоль, приобретенный у Ν0Ρ Согрогаиоп,
- 68 028860
Япония) и 11Ъ (0,702 г, 1,5 экв.) растворили в дихлорметане (20 мл) в атмосфере аргона. Реакционную смесь охладили до 0°С. Добавили пиридин (1 мл, в избытке) и перемешивали реакционную смесь в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ. Растворители и летучие соединения удалили под вакуумом и осадок очистили хроматографией (элюировали сперва этилацетатом, потом градиентом 5-10% МеΟΗ/^СМ) для получения требуемого соединения 1УЪ в виде белого сухого вещества (1,46 г, 76%).
ΊI ЯМР (СПС13, 400 МГц) δ 5,17 (!, 1=5,5 Гц, 1Н), 4,13 (йй, 1=4,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 4,05 (йй, 1=5,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 3,82-3,75 (т, 2Η), 3,70-3,20 (т, -О-СН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 2,05-1,90 (т, 2Н), 1,80-1,70 (т, 2Н), 1,61-1,45 (т, 6Н), 1,35-1,17 (т, 56Н), 0,85 (!, 1=6,5 Гц, 6Н).
Обнаруженный диапазон масс-спектра: 2716-2892.
Получение 1Ус:
1,2-ди-О-октадецил-зи-глицерид 1с (4,00 г, 6,70 ммоль) и Э8С (2,58 г, 1,5 экв.) поместили вместе в дихлорметан (60 мл) и охладили до 0°С в смеси льда с водой. Триэтиламин (2,75 мл, 3 экв.) добавили и оставили реакционную смесь перемешиваться в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ, разбавили ЭСМ, промыли водой (2 раза), раствором ΝηΜί-Ο и высушили над натрия сульфатом. Растворители удалили при пониженном давлении и осадок хранили под высоким вакуумом в течение ночи. Это соединение применяли непосредственно для проведения следующей реакции без дополнительной очистки. МПЭГ^да-Х^Ш (1,50 г, 0,687 ммоль, приобретенный у ΝΟΡ Согрогайои, Япония) и 11с (0,760 г, 1,5 экв.) растворили в дихлорметане (20 мл) в атмосфере аргона. Реакционную смесь охладили до 0°С. Добавили пиридин (1 мл, в избытке) и перемешивали реакционную смесь в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ. Растворители и летучие соединения удалили под вакуумом и осадок очистили хроматографией (элюировали этилацетатом, потом градиентом 5-10% МеΟΗ/^СМ) для получения требуемого соединения 1Ус в виде белого сухого вещества (0,92 г, 48%).
'Н ЯМР (СБС13, 400 МГц) δ 5,22-5,15 (т, 1Η), 4,16 (йй, 1=4,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 4,06 (йй, 1=5,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 3,81-3,75 (т, 2Н), 3,70-3,20 (т, -О-СН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 1,80-1,70 (т, 2Н), 1,60-1,48 (т, 4Н), 1,31-1,15 (т, 64Н), 0,85 (!, 1=6,5 Гц, 6Н).
Обнаруженный диапазон масс-спектра: 2774-2948.
Пример 5. Получение ПЬт-М-С3-ОМА (т.е. (6Ζ,9Ζ,28Ζ,31Ζ)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19ил-4-(диметиламино)бутаноата).
Раствор (6Ζ,9Ζ,28Ζ,31Ζ)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ола (0,53 г), 4-Ν,Νдиметиламиномасляной кислоты гидрохлорида (0,51 г), 4-^^диметиламинопиридина (0,61 г) и 1-этил3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промыли разбавленной хлористо-водородной кислотой, и после этого - разбавленным водным раствором натрия бикарбоната. Органические фракции высушили над безводным магния сульфатом, профильтровали и удалили растворитель на роторном испарителе. Остаток пропустили через колонку силикагеля (20 г), используя элюцию градиентом 1-5% метанола/дихлорметана. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединили и удалили растворитель, получив бесцветную маслянистую жидкость (0,54 г).
Соединения по настоящему изобретению могут быть синтезированы способами, описанными в следующих статьях, которые полностью включены сюда.
1. 8сЬ1ие!ег, Игз; Ьи, 1ии; Ргазег-Ре1й, Вей. ЗуикЬейс АрргоасЬез То ЧелсИу Ь1р1йа!ей РЬозрЬод1усеготозШйез. Οι^ιπχ Ье!!егз (2003), 5(3), 255-257.
2. Кшд, 1.Р.; А11Ъи!!, АВ. Саи. 1. СЬет. 1970, 48, 1754-1769.
3. МасЬ, Ма1еиз/; §сЬ1ие!ег, Игз; МакЬете, РеЬх; Ргазег-РеМ, Вей; Иа/еи, Κονίιι С. Сотрапид иреи!еиу1 ойЬоез!егз аий и-реи!еиу1 д1усоз1йез аз аНет-ийе д1усозу1 йоиогз. ТейаЬейгои (2002), 58(36), 73457354.
Пример 6. Эффективность у крыс МС3-липосом, имеющих разные липосомные композиции.
Для проверки дозозависимого эффекта МС3-содержащих липосомных композиций у крыс, приготовили следующие липосомные композиции, в существенной степени как описано в примере 2. В приведенной ниже таблице включенные компоненты указаны следующим образом: МС3-ДСФХ-холестеролПЭГ-С14. В табл. 9 указаны примеры испытанных композиций.
- 69 028860
Таблица 9
Группа Размер группы Мишень 8ΪΡΗΚ Конц. (мг/мл) Ввод. об. (мкл/г) Доза (мг/кг) Носитель
1 3 5 ΡΒδ
2 3 РУН 1661 0,06 5 0,30 50-10-38,5-1,5
3 3 РУН 1661 0,02 5 0,10 50-10-38,5-1,5
4 3 РУН 1661 0,006 5 0,03 50-10-38,5-1,5
5 3 РУН 1661 0,002 5 0,01 50-10-38,5-1,5
6 3 РУН 1661 0,06 5 0,30 40-15-40-5
7 3 РУН 1661 0,02 5 0,10 40-15-40-5
8 3 РУН 1661 0,006 5 0,03 40-15-40-5
9 3 РУН 1661 0,002 5 0,01 40-15-40-5
Животные линия Спрейг-Даули δρΓαβΐΐϋ-Ι)α\γΙϋΥ.
Всего 27.
Ввод. об. (мкл) инъекция 5 мкл/г.
Как показано на фиг. 2, липосомные композиции, имеющие 50 мол.% МС3, демонстрировали дозозависимую кривую с эффективностью при немного более низких концентрациях 51РНК, чем таковые у липосомных композиций, имеющих 40 мол.% МС3.
Пример 7. Эффективность МС3-липосом демонстрирует зависимость от АроЕ у мышей.
Для дополнительной проверки роли АроЕ в эффективности различных липосомных композиций, мышам дикого типа и нокаутным по АроЕ вводили МС3-липосомы, содержащие композиции ΑΏ-1661 51РНК в дозе 0,1, 0,03 и 0,01 мг/кг, в существенной мере так, как описано в примере 2. Половина липосомных композиций были предварительно смешаны с рекомбинантным белком АроЕ для определения того, может ли экзогенное добавление АроЕ восполнить отсутствие белка у мышей. В табл. 10 указаны примеры испытанных композиций.
Таблица 10
Группа Размер группы Тип мыши Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Доза (мг/кг) Носитель
1 3 С57ВР/6 0,00 ΡΒδ
2 3 С57ВР/6 РУН 1661 0,0100 0,100 МСЗ 50-10-38,5-1,5 с АроЕ
3 3 С57ВР/6 РУН 1661 0,0030 0,030 МСЗ 50-10-38,5-1,5 с АроЕ
4 3 С57ВР/6 РУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 50-10-38,5-1,5 с АроЕ
5 3 С57ВР/6 РУН 1661 0,0100 0,100 МСЗ 50-10-38,5-1,5 без АроЕ
6 3 С57ВР/6 РУН 1661 0,0030 0,030 МСЗ 50-10-38,5-1,5 без АроЕ
7 3 С57ВР/6 РУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 50-10-38,5-1,5 без АроЕ
8 3 Нокаут по АроЕ 0,00 ΡΒδ
9 3 Нокаут по АроЕ РУН 1661 0,0100 0,100 МСЗ 50-10-38,5-1,5 с АроЕ
10 3 Нокаут по АроЕ РУН 1661 0,0030 0,030 МСЗ 50-10-38,5-1,5 с АроЕ
11 3 Нокаут по АроЕ РУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 50-10-38,5-1,5 с АроЕ
12 3 Нокаут по АроЕ РУН 1661 0,0100 0,100 МСЗ 50-10-38,5-1,5 без АроЕ
13 3 Нокаут по АроЕ РУН 1661 0,0030 0,030 МСЗ 50-10-38,5-1,5 без АроЕ
14 3 Нокаут по АроЕ РУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 50-10-38,5-1,5 без АроЕ
План эксперимента.
Животные С57ВЬ/6 и нокаутные по АроЕ.
Всего 42.
Ввод. об. (мкл) различный, в зависимости от массы.
- 70 028860
На фиг. 3 показано дозозависимое снижение содержания белка РУН у мышей дикого типа (правые столбцы), но не у нокаутных мышей с дефицитом АроЕ (левые столбцы), при введении МС3содержащих липосом, что свидетельствует о роли АроЕ в поглощении клетками и/или доставке в печень. МСЗ-липосомы, полученные как описано выше, содержащие 1661 δΐРНК, вводили в концентрациях 0,1, 0,03 и 0,01 мг/кг отдельно или в предварительно полученной смеси с липопротеином АроЕ. Однако обнаружено, что при намного более высоких дозах (например, около 1,0 мг/кг или выше) композиции, содержащие МС3, опосредуют сайленсинг РУ11 на уровне мРНК и белка (данные не приведены). Как показано на фиг. 3, испытанные липосомные композиции, содержащие МС3, не способны опосредовать сайленсинг РУ11 в нокаутных по АроЕ мышах, если не были предварительно смешаны с рекомбинантным АроЕ. Таким образом, активность может быть восстановлена в нокаутных по АроЕ мышах путем предварительного смешивания МС3 (МС3-содержащей липосомы) с АроЕ.
Пример 8. Эффективность МС3-содержащих липосомных композиций, изменяющаяся в зависимости от мольного процента и длины хвоста фосфохолинов.
Для проверки эффекта изменения мольного процента и длины хвоста фосфохолинов на эффективность различных липосомных композиций, различные композиции, содержащие ДСФХ, ДМФХ и ДЛФХ, испытывали на эффективность в сайленсинге РУ11 при 0,01 и 0,03 мг/кг. В табл. 11 ниже указаны примеры испытанных композиций.
Таблица 11
Группа Размер группы Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Доза (мг/кг) Носитель
1 3 0,00 ΡΒδ
2 3 ГУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 50-10-38,5-1,5 1661 ДСФХ
3 3 ГУН 1661 0,0003 0,003 МСЗ 50-10-38,5-1,5 1661 ДСФХ
4 3 ГУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 50-10-38,5-1,5 1661 ДМФХ
5 3 ГУН 1661 0,0003 0,003 МСЗ 50-10-38,5-1,5 1661 ДМФХ
6 3 ГУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 50-10-38,5-1,5 1661 ДЛФХ
7 3 ГУН 1661 0,0003 0,003 МСЗ 50-10-38,5-1,5 1661 ДЛФХ
8 3 ГУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 40-20-38,5-1,5 1661 ДСФХ
9 3 ГУН 1661 0,0003 0,003 МСЗ 40-20-38,5-1,5 1661 ДСФХ
1 о Ώ ТТЛ 7ТТ 1 /С/С 1 η ηηι η η λιλ Ά/ΓΛ'Ώ /1П 9Λ ΏΟ < 1 < 1/С/С1 ΤΤΑ/Γζϊ\ν
IV О 1 V 11 ιννι ν,ννιν ν,νιν ΐνΐν^ Ч-ν-Ζ,ν-^Ο,ιννι
11 3 ГУН 1661 0,0003 0,003 МСЗ 40-20-38,5-1,5 1661 ДМФХ
12 3 ГУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 40-20-38,5-1,5 1661 ДЛФХ
13 3 РУП 1661 0,0003 0,003 МСЗ 40-20-38,5-1,5 1661 ДЛФХ
14 3 ГУН 1661 0,0010 0,010 МСЗ 30-30-38,5-1,5 1661 ДМФХ
15 3 РУП 1661 0,0003 0,003 МСЗ 30-30-38,5-1,5 1661 ДМФХ
План эксперимента.
Животные С57ВЕ/6.
Всего 45.
Ввод. об. (мкл) различный, в зависимости от массы.
На фиг. 4 показаны эффекты изменений мольного процента МС3, например, при сравнении 50 и 40 мол.%, и, в случае ДМФХ-содержащей композиции, 50, 40 и 30 мол.%. На фиг. 4 также демонстрируется эффект замены нейтрального липида, и можно видеть различие результатов для МС3-липосомных композиций, содержащих ДСФХ, ДМФХ и ДЛФХ.
Пример 9. Включение СаШАс-липидов в липосомные композиции.
Для исследования возможности альтернативных способов доставки были проведены эксперименты ΐη νίνο с применением липосомных композиций, содержащих липиды, конъюгированные с Νацетилгалактозамином (СаШЛс). СаШАс был выбран в качестве возможного нацеливающего лиганда, поскольку известно, что рецептор СаА Ас, как полагают, имеет высокий уровень экспрессии в печени. По этой причине провели на мышах и крысах исследования по испытанию эффективности МС3содержащих липосомных композиций, дополнительно содержащих липид СаШАс3-ПЭГ-ДСГ формулы III, в существенной мере как описано в примере 2. Во всех экспериментах, суммарное количество ПЭГконъюгированных липидов сохраняли постоянным (например, там, где добавляли 0,5 мол.% СаШАс3ПЭГ, соответствующее количество ПЭГ-ДСГ снижали на 0,5 мол.%). В эксперименте использовали четырех животных в каждой из девяти групп на генотип.
В табл. 12 ниже представлены экспериментальные параметры способов, включавших применение МС3-содержащих липосом с 5% концентрацией ПЭГ-липидов, где композиции испытывали на мышах
- 71 028860
линии С57ВЙ6. Липосомы содержали следующие молярные соотношения: 50/10/35/5
МС3/ДСФХ/холестерол/ПЭГ-ДСГ. Там, где добавляли 0,5% СаШАс3-ПЭГ, соответствующее количество ПЭГ-ДСГ снижали до 4,5%.
Таблица 12
Группа Размер группы Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Ввод. об. (мкл/г) Доза (мг/кг) Носитель
1 4 10 ΡΒδ
2 4 РУП 1661 0,1 10 1,00 50/10/35/5
3 4 РУП 1661 0,05 10 0,50 50/10/35/5
4 4 РУП 1661 0,025 10 0,25 50/10/35/5
5 4 РУП 1661 0,0125 10 0,125 50/10/35/5
6 4 РУП 1661 ОД 10 1,00 50/10/35/4,5 с 0,5% ОаВДАслипидом
7 4 РУП 1661 0,05 10 0,50 50/10/35/4,5 с 0,5% ОаВДАслипидом
8 4 РУП 1661 0,025 10 0,25 50/10/35/4,5 с 0,5% ОаВДАслипидом
9 4 РУП 1661 0,0125 10 0,125 50/10/35/4,5 с 0,5% ОаРКАслипидом
План эксперимента.
Животные С57ВЙ6.
Всего 36.
Ввод. об. (мкл) различный, в зависимости от массы.
В табл. 13 ниже представлены экспериментальные параметры способов, включавших применение
МС3-содержащих липосом с концентрацией ПЭГ-ДСГ-липидов 10 мол.%, где композиции испытывали на мышах линии С57ВЙ6. Липосомы содержали следующие молярные соотношения: 50/10/30/10 МС3/ДСФХ/холестерол/ПЭГ-ДСГ. Там, где добавляли 0,5% СаШАс3-ПЭГ, соответствующее количество ПЭГ-ДСГ снижали до 9,5%.
Таблица 13
Группа Размер группы Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Ввод. об. (мкл/г) Доза (мг/кг) Носитель
1 4 10 ΡΒδ
2 4 РУП 1661 0,5 10 5,00 50/10/30/10
3 4 РУП 1661 0,25 10 2,50 50/10/30/10
4 4 РУП 1661 0,125 10 1,25 50/10/30/10
5 4 РУП 1661 0,0625 10 0,625 50/10/30/10
6 4 РУП 1661 0,5 10 5 50/10/30/9,5 с 0,5% СаА Ас-липидом
7 4 РУП 1661 0,25 10 2,50 50/10/30/9,5 с 0,5% ОаШАс
8 4 РУП 1661 0,125 10 1,25 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШАс
9 4 РУП 1661 0,0625 10 0,63 50/10/30/9,5 с 0,5% ОаШАс
План эксперимента.
Животные С57ВЙ6.
Всего 36.
Ввод. об. (мкл) различный, в зависимости от массы.
На фиг. 5 показаны эффекты, при которых усиление ПЭГ-экранирования подавляет не-СаШАсопосредованный сайленсинг у мышей линии С57ВЙ6. Это продемонстрировано у мышей линии С57ВЙ6 для концентраций ПЭГ как 5%, так и 10%. Включение С^-ПЭГ (т.е. ПЭГ-ДСГ) в концентрации 10 мол.%
- 72 028860
эффективно ингибирует сайленсинг, и этот эффект может быть преодолен при помощи замены 0,5 мол.% ПЭГ-липида на эквимолярное количество ОаШЛс-липида (т.е. ОаШЛсЭ-ПЭГ-ДСГ формулы III). Следовательно, усиление ПЭГ-экранирования (например, с 5 мол.% до 10 мол.%), по-видимому, подавляет неОаШЛс-опосредованный сайленсинг, а также общую эффективность.
Схожие эксперименты также были проведены на крысах, при этом ПЭГ-липид (тоже ПЭГ-ДСГ) включали в липосомы в двух концентрациях - 5 и 10 мол.%. В табл. 14 ниже представлены экспериментальные параметры способов, включавших применение МС3-содержащих липосом с 5% концентрацией ПЭГ-липидов, где композиции испытывали на крысах. Липосомы содержали следующие молярные соотношения: 50/10/35/5 МС3/ДСФХ/холестерол/ПЭГ-ДСГ. Там, где добавляли 0,5% ОаШЛс3-ПЭГ, соответствующее количество ПЭГ-ДСГ снижали до 4,5%.
Таблица 14
Группа Размер группы Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Ввод. об. (мкл/г) Доза (мг/кг) Носитель
1 4 5 ΡΒδ
2 4 РУН 1661 0,2 5 1,00 50/10/35/5
3 4 ρνπ 1661 0,1 5 0,50 50/10/35/5
4 4 ρνπ 1661 0,05 5 0,25 50/10/35/5
5 4 ρνπ 1661 0,025 5 0,125 50/10/35/5
6 4 ρνπ 1661 0,2 5 1,00 50/10/35/4,5 с 0,5% СаШ Ас-липидом
7 4 ρνπ 1661 ο,ι 5 0,50 50/10/35/4,5 с 0,5% ΟαΙΝ Ас-липидом
8 4 ρνπ 1661 0,05 5 0,25 50/10/35/4,5 с 0,5% ΟαΙΝ Ас-липидом
9 4 ρνπ 1661 0,025 5 0,125 50/10/35/4,5 с 0,5% ΟαΙΝ Ас-липидом
План эксперимента.
Животные Крысы линии Спрейг-Даули.
Всего 36.
Ввод. об. (мкл) инъекция ударной дозы вещества.
В табл. 15 ниже представлены экспериментальные параметры способов, включавших применение МС3-содержащих липосом с 10% концентрацией ПЭГ-липидов, где композиции испытывали на крысах. Липосомы содержали следующие молярные соотношения: 50/10/30/10 МС3/ДСФХ/холестерол/ПЭГДСГ. Там, где добавляли 0,5% ОаШЛс3-ПЭГ, соответствующее количество ПЭГ-ДСГ снижали до 9,5%.
Таблица 15
Группа Размер группы Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Ввод. об. (мкл/г) Доза (мг/кг) Носитель
1 4 5 ΡΒδ
2 4 ρνπ 1661 1 5 5,00 50/10/30/10
3 4 ρνπ 1661 0,5 5 2,50 50/10/30/10
4 4 ρνπ 1661 0,25 5 1,25 50/10/30/10
5 4 ρνπ 1661 0,125 5 0,625 50/10/30/10
6 4 ρνπ 1661 1 5 5,00 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШ Ас-липидом
7 4 ρνπ 1661 θ,5 5 2,50 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШ Ас-липидом
8 4 ρνπ 1661 0,25 5 1,25 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШ Ас-липидом
9 4 ρνπ 1661 0,125 5 0,625 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШ Ас-липидом
План эксперимента.
Животные Спрейг-Даули.
Всего 36.
Ввод. об. (мкл) инъекция ударной дозы вещества.
- 73 028860
На фиг. 6 показаны результаты для МС3-композиций, содержащих С18 ПЭГ в количестве 5 мол.% и 10 мол.%, вводимых крысам в указанных дозировках. Композиции, содержащие 10 мол.% ПЭГ-ДСГ, демонстрируют незначительный уровень сайленсинга в испытанных концентрациях (0,625 - 5 мг/кг) у крыс. Однако, включение 0,5 мол.% ОаШАс3-ПЭГ-ДСГ формулы III (т.е. замена 0,5 мол.% С18-ПЭГ), восстанавливает эффект нокдауна РУН. Следовательно, при сравнении с данными для мышей, у крыс композиции с более высоким экранированием в общем случае лучше сохраняют эффективность, что видно по разнице результатов для концентраций 5 мол.% и 10 мол.% ПЭГ.
Пример 10. Оценка вариаций мольного процента компонентов МС3-содержащих липосом пых композиций с включением или без включения 0,5 мол.% ОаШАс3-ПЭГ-ДСГ.
Для определения эффективности МС3-содержащих липосом, имеющих различный мольный процент компонентов, с добавлением или без добавления ОаШАс3-ПЭГ-ДСГ, приготовили и испытали на мышах линии С57В1.6, в существенной степени как описано в примере 2 выше, следующие липосомные композиции. Компоненты, указанные в таблице, представлены в следующем порядке: МС3/ДСФХ/холестерол/ПЭГ-ДСГ. Там, где добавляли 0,5%
ОаШАс3-ПЭГ, соответствующее количество ПЭГ-ДСГ снижали до 4,5%, как показано в табл. 16.
Таблица 16
Группа Размер группы Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Ввод. об. (мкл/г) Доза (мг/кг) Носитель
1 3 10 ΡΒδ
2 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 50/10/35/5
3 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 50/10/35/4,5 с 0,5% ОаШАс-липидом
4 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 40/15/40/5
5 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 40/15/40/4,5 с 0,5% ОаШАс-липидом
6 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 30/25/40/5
7 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 30/25/40/4,5 с 0,5% ОаШАс-липидом
8 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 20/35/40/5
9 3 ГУП 1661 0,1 10 1,00 20/35/40/4,5 с 0,5% ОаШАс-липидом
Животные С57ВЬ6.
Всего 33.
Ввод. об. (мкл) различный, в зависимости от массы.
Как показано на фиг. 7, добавление Ο1аNАс к липосомным композициям усиливает сайленсинг РУ11 каждой композиции, т.е. где МС3 присутствует в количестве 50, 40 и 30 мол.%.
Пример 11. Эффективность МС3- и ОаШАс-содержащих липосом в мышах дикого типа (^Т) и нокаутных по гену Л8СРК.
Для проверки роли А8ОРК в эффективности различных липосомных композиций, мышам дикого типа и нокаутным по гену А8ОРК вводили МС3-липосомы, содержащие композицию АО-1661 §1РНК в дозе 3, 1 и 0,3 мг/кг, как описано в примере 1. Компоненты, указанные в таблице, представлены в следующем порядке: МС3/ДСФХ/холестерол/ПЭГ-ДСГ. Там, где добавляли 0,5% ОаШАс3-ПЭГ, соответствующее количество ПЭГ-ДСГ снижали до 9,5%, как показано в Таблице 17 ниже.
- 74 028860
Таблица 17
Группа Размер группы Мишень δίΡΗΚ Конц. (мг/мл) Ввод. об. (мкл/г) Доза (мг/кг) Носитель
1 5 10 ΡΒδ
2 5 ГУП 1661 0,3 10 3,00 50/10/30/10
3 5 ГУП 1661 0,3 10 3,00 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШАс-липидом
4 5 ГУП 1661 0,1 10 1,00 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШАс-липидом
5 5 ГУП 1661 0,03 10 0,300 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШАс-липидом
6 5 10 ΡΒδ
7 5 ГУП 1661 0,3 10 3,00 50/10/30/10
8 5 ГУП 1661 0,3 10 3,00 50/10/30/9,5 с 0,5% СаШАс-липидом
План эксперимента.
Животные С57ВБ6 и нокаутные по гену АЗОРг.
Всего 25 + 15.
Ввод. об. (мкл) различный, в зависимости от массы.
На фиг. 8 приведены результаты данных экспериментов, демонстрирующие, что для композиций, содержащих С18 ПЭГ, восстановление нокдауна ΡΥΠ путем включения липида ОаШАс3-ПЭГ-ДСГ не происходит при введении линии мышей, дефицитных по рецептору асиалогликопротеинов (АЗОРК), который является предполагаемым рецептором для направленного действия остатка ОаВДАс.
Пример 12. Синтез олигонуклеотидов.
Синтез.
Олигонуклеотиды синтезируют на синтезаторе АКТАоНдорПо!. Для синтеза олигонуклеотидов использовали имеющиеся в продаже стеклянный носитель с контролируемым размером пор (бТ-СРО, 500А, Рпте Зуп!Бе818) и РНК-фосфорамидиты со стандартными защитными группами, 5'-Одиметокситритил Ц6-бензоил-2'-!-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-О-Ц,Ц'-диизопропил-2цианоэтилфосфорамидит, 5'-О-диметокситритил-Ц4-ацетил-2'-!-бутилдиметилсилил-цитидин-3'-О-Ц,Ц'диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-О-диметокситритил-Ц2-изобутирил-2'-!-бутилдиметилсилилгуанозин-3'-О-Ц,Ц-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, и 5'-О-диметокситритил-2'-!бутилдиметилсилил-уридин-3'-О-Ц,Ц'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Р1егсе Цис1ею АскЬ ТесБпо1од1ез). 2'-Р-фосфорамидиты, 5'-О-диметокситритил-Ц4-ацетил-2'-фторо-цитидин-3'-О-Ц,Ц'диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-фторо-уридин-3'-О-Ц,Ц'диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, приобретены у компании Рготеда. Все фосфорамидиты применяют в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (СН3СЦ), за исключением гуанозина, который применяют в концентрации 0,2 М в 10% ТГФ/АЦС (об.%). Используют время присоединения/рециклирования 16 мин. Активатором является 5-этилтиотетразол (0,75 М, Атепсап !п1егпа11опа1 СБетюаН); для окисления группы РО используют смесь йод/вода/пиридин и для окисления группы РЗ используют РАБЗ (2%) в 2,6-лутидин/ацетонитрил (1:1 по объему).
Конъюгированные по 3'-концу с лигандом цепи синтезируют с применением твердого носителя, содержащего соответствующий лиганд. Например, включение холестерольной единицы в последовательность производят из гидроксипролинол-холестерол-фосфорамидита. Холестерол соединяют с транс-4гидроксипролинолом через 6-аминогексаноатную связь с получением остатка гидроксипролинолхолестерола. Меченые по 5'-концу Су-3 и Су-5,5 (флуорофором) 81РНК синтезируют из соответствующего Риазаг-570 (Су-3)-фосфорамидита, приобретенного у компании ВюзеагсБ ТесБпо1од1ез. Конъюгацию лигандов с 5'-концом и во внутренней позиции проводят с помощью соответствующим образом защищенных стандартных блоков лиганд-фосфорамидит. Продолжительное, в течение 15 мин, присоединение 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном СН3СЦ в присутствии 5-(этилтио)-1Н-тетразольного активатора к олигонуклеотиду, связанному с твердым носителем. Окисление межнуклеотидного фосфита до фосфата проводят с применением стандартной смеси йода с водой, как указано (1) или обработкой смесью трет-бутила гидропероксид/ацетонитрил/вода (10: 87: 3) со временем ожидания для окисления конъюгированного олигонуклеотида 10 мин. Фосфоротиоат вводят окислением фосфита до фосфоротиоата с применением серо-переносящего реагента, такого как ИИТТ (приобретенный у компании АМ СБетюаН), РАОЗ и/или Бекаже реагента. Холестерол-фосфорамидит синтезируют самостоятельно и применяют в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время присоединения для холестерол-фосфорамидита составляет 16 мин.
- 75 028860
Удаление защитных групп Ι (удаление защитных групп с азотистых оснований).
После завершения синтеза носитель перемещают в стеклянную колбу емкостью 100 мл (УАК). Олигонуклеотид отщепляют от носителя с одновременным удалением защитных групп с оснований и фосфатных групп с 80 мл смеси этанола и аммония [аммоний: этанол (3:1)] в течение 6,5 ч при 55°С. Колбу непродолжительное время охлаждают на льду и после этого отфильтровывают смесь этанола с аммонием в новую колбу емкостью 250 мл. СРО промывают 2 раза 40 мл порциями смеси этанол/вода (1:1 по объему). После этого объем смеси уменьшают до примерно 30 мл в роторном испарителе. Далее смесь замораживают на сухом льду и высушивают под вакуумом в концентраторе типа δрееάVас.
Удаление защитных групп ΙΙ (удаление 2'-ΤΒΏΜδ группы).
Высушенный остаток ресуспендируют в 26 мл триэтиламина, триэтиламина тригидрофторида ^ЕАД^) или пиридина-НР и ДМСО (3:4:6) и нагревают при 60°С в течение 90 мин для удаления третбутилдиметилсилильных (ΤΒΏΜδ) групп в положении 2'. После этого реакцию гасят добавлением 50 мл 20 мМ натрия ацетата и доводят до рН 6,5. Олигонуклеотид хранят в морозильной камере до проведения очистки.
Анализ.
Олигонуклеотиды перед очисткой анализируют с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), и выбор буфера и колонки зависит от природы последовательности и/или конъюгированного лиганда.
Очистка ВЭЖХ.
Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды очищают с применением препаративной обратнофазовой ВЭЖХ. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищают с применением анионообменной ВЭЖХ на колонке ΤδΚαχΊ, упакованной самостоятельно. В качестве буферных растворов применяют 20 мМ натрия фосфат (рН 8,5) в 10% СНзСN (буфер А) и 20 мМ натрия фосфат (рН 8,5) в 10% С113С\, 1М ХаНг (буфер В). Фракции, содержащие полноразмерные олигонуклеотиды, объединяют, обессоливают, и лиофилизуют. Приблизительно 0,15 (Ю обессоленных олигонуклеотидов разводят в воде до 150 мкл и с помощью пипетки помещают в специальные пробирки для проведения анализа капиллярным гельэлектрофорезом и жидкостной хроматографией с последующей масс-спектрометрией (ЬС/Μδ). После этого соединения анализируют жидкостной хроматографией с последующей электро-спрей-массспектрометрией и капиллярным гель-электрофорезом.
Получение §1РНК.
Для получения §1РНК, эквимолярные количества смысловой и антисмысловой цепи нагревают в 1χΡΒδ при 95°С в течение 5 мин и медленно охлаждают до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждают анализом с помощью ВЭЖХ.
Таблица 18
Дуплексы §1РНК для направленного действия на Ьис и ΡνΐΙ
Дуплекс Поел. ГО Последовательность 5'-3' Мишень
1000/1001 1 сии асо сио лои леи исо латат Ьис
2 исо аао иле исл осо илл оатат
Αϋ-1955 3 сииАсОсиОАОиАсиисОАаТ ЗЙТ Ьис
4 11СО Α ΑΟι ι А СIШАОСОн А А ОНТзНТ
Αϋ-1596 5 оолислисисААоисиилсатат РУН
6 оиААОАсииоАОАиолиссатат
Αϋ-1661 7 ООАШГСАШГСШГСААОШГСШШАГСаТзаТ РУН
8 ОШААОАГСШШОАОАЩОАЩГСГСаТзаТ
Строчными буквами обозначена 2'ОМе-модификация и ΝΓ представляет 2Т-модифицированное азотистое основание, άΤ обозначает дезокситимидин, § обозначает фосфоротиоат.
Пример 13. Синтез тПЭГ2000-1,2-ди-О-алкил-§п3-карбомоилглицерида.
ПЭГ-липиды, такие как тПЭГ2000-1,2-ди-О-алкил-§п3-карбомоилглицерид, синтезировали с применением следующих способов:
- 76 028860
тПЭГ2000-1,2-ди-О-алкил-зп3-карбомоилглицерид.
Получение соединения 4а (ПЭГ-ДМГ): 1,2-ди-О-тетрадецил-зп-глицерид 1а (30 г, 61,80 ммоль) и Ν,Ν'-сукцинимидилкарбонат (О8С, 23,76 г, 1,5 экв.) поместили в дихлорметан (ЭСМ, 500 мл) и перемешивали, держа в смеси льда с водой. Триэтиламин (25,30 мл, 3 экв.) добавили в перемешиваемый раствор и после этого оставили реакционную смесь перемешиваться в течение ночи при температуре окружающей среды. За развитием реакции следили с помощью ТСХ. Реакционную смесь разбавили ЭСМ (400 мл) и промыли органический слой водой (2 раза по 500 мл), водным раствором ИаНСО3 (500 мл), с последующим стандартным исследованием. Полученный осадок высушили при температуре окружающей среды при высоком вакууме в течение ночи. После высушивания полученный таким образом грубый карбонат 2а растворили в дихлорметане (500 мл) и перемешивали в ледяной бане. К перемешиваемому раствору в атмосфере аргона добавили тПЭГ2000-ИН2 (3, 103,00 г, 47,20 ммоль, приобретенный у ИОР Согрогакюп, Япония) и безводный пиридин (80 мл, в избытке). В некоторых вариантах воплощения метокси-(ПЭГ)х-амин имел значение х от 45 до 49, предпочтительно 47-49, и более предпочтительно 49. После этого оставили реакционную смесь перемешиваться в течение ночи при температуре окружающей среды. Растворители и летучие соединения удалили под вакуумом и осадок растворили в ЭСМ (200 мл) и нанесли на колонку силикагеля, упакованного в этилацетат. Колонку сначала элюировали этилацетатом и после этого - градиентом 5-10% метанола в дихлорметане для получения требуемого ПЭГ-липида 4а в виде белого сухого вещества (105,30 г, 83%).
'Н ЯМР (СОС13, 400 МГц) δ 5,20-5,12 (т, 1Н), 4,18-4,01 (т, 2Н), 3,80-3,70 (т, 2Н), 3,70-3,20 (т, -О-СН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 2,10-2,01 (т, 2Н), 1,70-1,60 (т, 2Н), 1,56-1,45 (т, 4Н), 1,31-1,15 (т, 48Н), 0,84 (к, 1=6,5 Гц, 6Н).
Обнаруженный диапазон масс-спектра: 2660-2836.
Получение 4Ь: 1,2-ди-О-гексадецил-зп-глицерид 1Ь (1,00 г, 1,848 ммоль) и Б8С (0,710 г, 1,5 экв.) поместили вместе в дихлорметан (20 мл) и охладили до 0°С в смеси льда с водой. Добавили триэтиламин (1,00 мл, 3 экв.) и оставили перемешиваться в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ, разбавили ЭСМ, промыли водой (2 раза), раствором ИаНСО3 и высушили над натрия сульфатом. Растворители удалили при пониженном давлении и осадок 2Ь хранили под высоким вакуумом в течение ночи. Это соединение применяли непосредственно для проведения следующей реакции без дополнительной очистки. МПЭГ2000-ИН2 3 (1,50 г, 0,687 ммоль, приобретенный у ИОР Согрогакюп, Япония) и соединение 2Ь, полученное на предыдущем этапе (0,702 г, 1,5 экв.), растворили в дихлорметане (20 мл) в атмосфере аргона. Реакционную смесь охладили до 0°С. Добавили пиридин (1 мл, в избытке) и перемешивали в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ. Растворители и летучие соединения удалили под вакуумом и осадок очистили хроматографией (элюировали сперва этилацетатом, потом градиентом 5-10% МеОН/ОСМ) для получения требуемого соединения 4Ь в виде белого сухого вещества (1,46 г, 76%).
'Н ЯМР (СОС13, 400 МГц) δ 5,17 (к, 1=5,5 Гц, 1Н), 4,13 (άά, 1=4,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 4,05 (άά, 1=5,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 3,82-3,75 (т, 2Н), 3,70-3,20 (т, -О-СН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 2,05-1,90 (т, 2Н), 1,80-1,70 (т, 2Н), 1,61-1,45 (т, 6Н), 1,35-1,17 (т, 56Н), 0,85 (к, 1=6,5 Гц, 6Н).
Обнаруженный диапазон масс-спектра: 2716-2892.
Получение 4с: 1,2-ди-О-октадецил-зп-глицерид 1с (4,00 г, 6,70 ммоль) и Б8С (2,58 г, 1,5 экв.) поместили вместе в дихлорметан (60 мл) и охладили до 0°С в смеси льда с водой. Добавили триэтиламин (2,75 мл, 3 экв.) и оставили перемешиваться в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ, разбавили ЭСМ, промыли водой (2 раза), раствором ИаНСО3 и высушили над натрия сульфатом. Растворители удалили при пониженном давлении и осадок хранили под высоким вакуумом в течение ночи. Это соединение применяли непосредственно для проведения следующей реакции с дополнительной очисткой. МПЭГ2000-ИН2 3 (1,50 г, 0,687 ммоль, приобретенный у ИОР Согрогакюп, Япония) и соеди- 77 028860
нение 2с, полученное на предыдущем этапе (0,760 г, 1,5 экв.), растворили в дихлорметане (20 мл) в атмосфере аргона. Реакционную смесь охладили до 0°С. Добавили пиридин (1 мл, в избытке) и перемешивали в течение ночи. За развитием реакции следили с помощью ТСХ. Растворители и летучие соединения удалили под вакуумом и осадок очистили хроматографией (элюировали сперва этилацетатом, потом градиентом 5-10% МеОН/ОСМ) для получения требуемого соединения 4с в виде белого сухого вещества (0,92 г, 48%).
'Н ЯМР (СПС13, 400 МГц) δ 5,22-5,15 (т, 1Н), 4,16 (йй, .1=4,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 4,06 (йй, .1=5,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 3,81-3,75 (т, 2Н), 3,70-3,20 (т, -О-СН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 1,80-1,70 (т, 2Н), 1,60-1,48 (т, 4Н), 1,31-1,15 (т, 64Н), 0,85 (к, .1=6,5 Гц, 6Н).
Обнаруженный диапазон масс-спектра: 2774-2948.
Пример 14. Общий протокол для проведения экструзии.
Липиды (катионный липид формулы I, ДСФХ, холестерол, ДМГ-ПЭГ) растворяют и смешивают в этаноле в соответствии с требуемым молярным соотношением. Липосомы формируют с применением способа этанольной инъекции, при котором смешанные липиды добавляют в буферный раствор натрия ацетата при рН 5,2. Это приводит к спонтанному образованию липосом в 35% этаноле. Липосомы экструдируют через 0,08 мкм поликарбонатную мембрану по меньшей мере 2 раза. Исходный раствор 31РНК приготавливали в растворе натрия ацетата с 35% этанолом и добавили для нагрузки липосом. Раствор комплексов з!РНК-липосомы инкубировали при 37°С в течение 30 мин и после этого разбавили. Удалили этанол и заменили его буферным раствором ΡΒδ с помощью диализа или тангенциальной поточной фильтрации.
Пример 15. Общий протокол для проведения поточного смешивания.
Приготавливают два отдельных индивидуальных исходных раствора: один, содержащий липид, и другой - 31РНК. Исходный раствор липида, содержащий катионный липид формулы I, ДСФХ, холестерол и ПЭГ-липид, приготавливают растворением в 90% этаноле. Остальные 10% составляет цитратный буферный раствор с низким значением рН. Концентрация исходного раствора липида равна 4 мг/мл. Диапазон значения рН этого цитратного буферного раствора может составлять рН 3-5, в зависимости от типа применяемого фузогенного липида. з!РНК также растворяют в цитратном буферном растворе в концентрации 4 мг/мл. Для малых масштабов приготавливают по 5 мл каждого исходного раствора.
Исходные растворы полностью прозрачны, и липиды должны быть полностью растворены перед объединением с з!РНК. Поэтому исходные растворы можно нагревать для полного растворения липидов. Применяемые в этом способе з!РНК могут являться немодифицированными или модифицированными олигонуклеотидами и могут быть конъюгированы с липофильными остатками, такими как холестерол.
Индивидуальные исходные растворы объединяют, нагнетая насосом каждый раствор в Т-образный тройник. Для одновременного контроля начала и остановки двух потоков применяют насос с двумя каналами Уотсона-Марлоу. Полипропиленовую трубку диаметром 1,6 мм дополнительно меняют на меньшую по диаметру трубку 0,8 мм для увеличения линейной скорости потока. Полипропиленовые трубки (внутренний диаметр = 0,8 мм) присоединяют с каждой стороны Т-образного тройника. Полипропиленовая трубка имеет прямой конец диаметром 1,6 мм, с результирующим объемом 4,1 мм3. Каждый большой конец (1,6 мм) полипропиленовой трубки помещают в пробирки, содержащие либо исходный раствор солюбилизированного липида, либо солюбилизированную 31РНК. После Т-образного тройника помещают одну трубку, по которой будет вытекать объединенный поток. После этого трубку помещают в контейнер с 2х объемом ΡΒδ. Раствор ΡΒδ быстро перемешивается. Скорость потока для насоса устанавливают на уровне 300 об./мин или 110 мл/мин. Этанол удаляют и заменяют на ΡΒδ с помощью диализа. После этого липидные композиции концентрируют с применением центрифугирования или диафильтрации до соответствующей рабочей концентрации.
Пример 16. Синтез [62,92,287,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино) бутаноата] (катионного липида формулы I или МС3)
- 78 028860
ί) Щпйе/тетрагидрофуран; ίί) М8С1, Е13Ы, диметиламинопиридин/дихлорметан; ίίί) ЫВг/диметилформамид; ίν) Мд, НСООЕ!; ν) ЫаОН, тетрагидрофуран, вода; νί) I Τ)Ο, диметиламинопиридин, диизопропилэтиламин.
Получение спиртового соединения 2.
В чистый, сухой стеклянный реактор емкостью 200 л, оснащенный вводом аргона и термокарманом, загрузили 60 л тетрагидрофурана и 5,73 кг (20,4 моль) линолевой кислоты. Содержимое реактора охладили до температуры ниже 0°С с помощью бани со смесью ацетона и сухого льда. К этому охлажденному раствору медленно добавили 13,8 л νύπιΠ в толуоле (60% мас./об.), поддерживая внутреннюю температуру реакционной смеси на уровне ниже 0°С (Примечание: первоначальное добавление укпйе было экзотермическим процессом, и наблюдалось пенообразование. Пенообразование прекратилось через 15 мин после начала добавления). Добавление νύπιΠ заняло 3 ч 45 мин. По завершении добавления реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Отобрали аликвоту и остановили реакцию с применением насыщ. Ыа28О4, и полученный таким образом неочищенный продукт анализировали ТСХ на присутствие исходной кислоты. ТСХ показала завершение реакции, и реакционную смесь снова охладили до температуры ниже 0°С примерно за 45 мин. Насыщенный раствор натрия сульфата (полученный растворением 1,1 кг натрия сульфата в 1,5 л воды) медленно добавляли в реакционную смесь в течение 45 мин. По завершении этого добавления, добавляли 25 л этилацетата в течение 30 мин при перемешивании. Полученную реакционную смесь профильтровывали через слой целита в течение 45 мин и промыли слой целита дополнительным объемом 17 л этилацетата для полного удаления продукта из осадка. Объединенные органические фракции сконцентрировали при пониженном давлении. Осадок растворили в 15 л этилацетата и промыли органический слой водой (2 раза по 7 л) и высушили над натрия сульфатом (1,1 кг). После фильтрации органический слой сконцентрировали при пониженном давлении и высушили под высоким вакуумом для получения продукта, линолеилового спирта, в виде маслянистой жидкости. Примерный выход = 5,5 кг (теоретический выход = 5,43 кг). Данный продукт применяли без дополнительной очистки на следующем этапе.
Способ получения линолеилмезилата 3.
В чистый, сухой полностью стеклянный реактор емкостью 200 л, оснащенный вводом аргона и термокарманом, загрузили 45 л дихлорметана и 5,5 кг неочищенного продукта, полученного на этапе 1. К этому раствору медленно добавили 11,5 л триэтиламина, а после этого -0,252 кг (2,0 моль) диметиламинопиридина. Раствор охладили до -10°С с помощью смеси сухого льда и ацетона и к этой охлажденной реакционной массе добавляли по капле в течение 3 ч раствор мезилхлорида (3,2 л, 41,3 моль) в дихлорметане (10 л), при этом поддерживая температуру ниже 0°С. По завершении добавления, реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 1 ч, после чего ТСХ (5% Е!ОАс в дихлорметане; окраска фосфорномолибденовой кислотой) реакционной смеси показала полное исчезновение исходного спирта. К реакционной смеси добавили 17 л охлажденной во льду воды и провели разделение слоев. Верхний водный слой еще раз промыли 10 л дихлорметана и провели разделение слоев. Объединенные органические слои промыли 2 раза по 10 л разбавленной хлористо-водородной кислотой (полученной смешиванием 2 л конц. НС1 с 18 л воды, очищенной методом обратного осмоса) 2 раза по 7,5 л водой и 10 л соляного раствора (полученного растворением 11 кг ЫаС1 в 10 л воды, очищенной методом обратного осмоса). Органический слой отделили, высушили над Ыа28О4 (2,75 кг) и профильтровали. Органический слой выпаривали при пониженном давлении и сушили под вакуумом для получения неочищенного мезилата в виде
- 79 028860
светло-желтой маслянистой жидкости. Примерный выход = 7,1 кг (теоретический выход = 7,1 кг). Данный материал применяли без дополнительной очистки на следующем этапе.
Ίί ЯМР (СБС1з, 400 МГц) δ 5,42-5,21 (т, 4Н), 4,20 (!, 2Н), 3,06 (к, 3Н), 2,79 (!, 2Н), 2,19-2,00 (т, 4Н), 1,90-1,70 (т, 2Н), 1,06-1,18 (т, 18Н), 0,88 (!, 3Н).
13С ЯМР (СБС1з) δ 130,76, 130,54, 128,6, 128,4, 70,67, 37,9, 32,05, 30,12, 29,87, 29,85, 29,68, 29,65, 29,53, 27,72, 27,71, 26,15, 25,94, 23,09, 14,60.
Масс-спектрометрия. Расчетная молекулярная масса для С19Н36О38 344,53, экспериментально определенная 343,52 (М-Н).
Получение линолеилбромида 4.
В чистый, сухой полностью стеклянный реактор емкостью 200 л, оснащенный вводом аргона и термокарманом, загрузили 25 л диметилформамида и 7,1 кг неочищенного продукта, полученного на этапе 2. Эту смесь охладили до -10°С с помощью смеси ацетона и сухого льда. К этой перемешиваемой смеси добавляли в течение 1,5 ч раствор лития бромида (2,7 кг, 31,0 моль) в 25 л диметилформамида, при этом поддерживая температуру реакции ниже 0°С. По завершении добавления, реакционную смесь перемешивали при 45°С в течение 18-20 ч, пока ТСХ (10% Е!ОАс в гексане; окраска фосфорномолибденовой кислотой) аликвоты не показала полное исчезновение исходного мезилата. Реакционную смесь разбавили 70 л воды и экстрагировали 57 л гексана. Водный слой дополнительно экстрагировали 2 раза по 10 л гексана и объединенные органические слои (примерно 120 л) опять промыли 2 раза по 10 л воды и 1 раз 10 л соляного раствора (полученного растворением 14 кг натрия хлорида в 10 л воды). Полученный органический слой (120 л) высушили над натрия сульфатом (4 кг) и концентрировали при пониженном давлении для получения неочищенного продукта (6,5 кг). Неочищенный продукт очистили колоночной хроматографией с применением силикагеля 60-120 меш и гексана в качестве элюента. Концентрирование очищенного продукта дало 5,5 кг (81%, три этапа) бромида 4 в виде бесцветной жидкости.
ΊI ЯМР (СБС1з, 400 МГц) δ 5,41-5,29 (т, 4Н), 4,20 (б, 2Н), 3,40 (!, 1=7 Гц, 2Н), 2,77 (!,.7=6,6 Гц, 2Н), 2,09-2,02 (т, 4Н), 1,88-1,00 (т, 2Н), 1,46-1,27 (т, 18Н), 0,88 (!, 1=3,9 Гц, 3Н).
13С ЯМР (СБС1з) δ 130,41, 130,25, 128,26, 128,12, 34,17, 33,05, 31,75, 29,82, 29,57, 29,54, 29,39, 28,95, 28,38, 27,42, 27,40, 25,84, 22,79, 14,28.
Получение дилинолеилметанола 6.
Чистый, сухой полностью стеклянный реактор емкостью 20 л, оснащенный вводом аргона, обратным холодильником и термокарманом, дегазировали и провели продувку аргоном. В реактор загрузили 277 г (11,3 моль) активированного магния, а после этого - 1,5 л безводного эфира. Реактор снова дегазировали три раза и провели продувку аргоном. Бромид 4 (2,5 кг, 7,6 моль) растворили в 5 л безводного диэтилового эфира в атмосфере аргона и 1 л этого раствора добавили в реактор, после чего добавили 25 мл (0,35 моль) дибромометана. Содержимое реактора нагрели до 40°С с применением водяной бани (наблюдалось вскипание с последующим рефлюксом, что свидетельствовало о начале образования реактива Гриньяра). После начала реакции нагревательный элемент удалили из реактора и медленно добавляли оставшиеся 4 л бромида в течение 2 ч 30 мин, поддерживая слабый рефлюкс смеси. По завершении добавления реакционную смесь опять нагревали для достижения рефлюкса (температура бани 45°С) в течение 1 ч, после чего в аликвоте реакционной смеси остановили реакцию водой и проанализировали ТСХ (гексан, окраска фосфорномолибденовой кислотой), которая показала полное израсходование исходного бромида. Реакционную смесь охладили до температуры ниже 10°С с применением ледяной бани и добавляли раствор этилформиата (275 мл в 4 л диэтилового эфира) в диэтиловом эфире в течение 2 ч 30 мин, и по завершении добавления реакционную смесь нагрели до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. Реакционную смесь снова охладили до 10°С и медленно добавили к смеси ацетон (1,15 л), после этого добавили 7 л охлажденной на льду воды и раствор 10% серной кислоты (полученный разведением 3,4 л серной кислоты 34 л охлажденной на льду воды). Продукт экстрагировали 3 раза по 10 л диэтиловым эфиром, и объединенные органические слои промыли 10 л соляного раствора и высушивали над натрия сульфатом (2 кг). Концентрирование органического слоя при пониженном давлении дало неочищенный продукт (2 кг) в виде смеси требуемого дилинолеилового спирта со следовыми количествами О-формилированного продукта. Неочищенный продукт повторно растворили в тетрагидрофуране (4 л) и загрузили в стеклянный реактор емкостью 20 л. К этому раствору добавили раствор ЫаОН (0,934 кг, растворенный в 8 л охлажденной на льду воды) и содержимое нагревали при 65°С в течение 18 ч, после чего ТСХ (10% эфир в гексане) показала полное превращение О-формилированного продукта в требуемый дилинолеилметанол. Реакционную смесь охладили и экстрагировали диэтиловым эфиром (3 раза по 4 л), и объединенные органические слои промыли 5 л соляного раствора и высушивали над натрия сульфатом (4 кг). Фильтрация с последующим концентрированием органического слоя дали неочищенный продукт. Полученный таким образом неочищенный продукт очистили колоночной хроматографией с применением силикагеля 60-120 меш и 4% эфира в гексане. Концентрирование фракций очищенного продукта дало очищенное соединение 6 (1,45 кг, 80%) в виде бесцветной жидкости.
Ίΐ ЯМР (400 МГц, СЭСЕ) δ 5,47-5,24 (т, 8Н), 3,56 (бб, 1= 6,8, 4,2, 1Н), 2,85-2,66 (т, 4Н), 2,12-1,91 (т, 9Н), 1,50-1,17 (т, 46Н), 0,98-0,76 (т, 6Н).
- 80 028860
13С ЯМР (101 МГц, СГОСЬ) δ 130,41, 130,37, 128,18, 128,15, 77,54, 77,22, 76,91, 72,25, 37,73, 31,75, 29,94, 29,89, 29,83, 29,73, 29,58, 29,53, 27,46, 27,43, 25,89, 25,86, 22,80, 14,30.
Получение [6Ζ,9Ζ,28Ζ,3 Щ)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноата]
МС3 (8).
Дилинолеилметанол 6 (144 г, 272 ммоль) растворили в 1 л дихлорметана и добавили к этому раствору хлористо-водородную соль диметиламиномасляной кислоты 7 (55 г, 328 ммоль) и после этого диизопропилэтиламин (70 мл) и диметиламинопиридин (4 г). После перемешивания в течение 5 мин при температуре окружающей среды добавили ΕΌί'Ι (80 г, 417 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи, после чего анализ ТСХ (силикагель, 5% МеОН в СЩС12) показал полное исчезновение исходного спиртового соединения. Реакционную смесь разбавили СИ2С12 (500 мл) и промыли насыщенным раствором Ν;·ιΗί'Ο3, (400 мл), водой (400 мл) и соляным раствором (500 мл). Объединенные органические слои сушили над безводн. Ν;·ι2δΟ4 и удаляли растворители в условиях вакуума. Полученный таким образом неочищенный продукт (180 г) очистили колоночной флэшхроматографией [2,5 кг силикагеля, с применением следующих элюентов: ί) колонка, упакованная 6 л 0,1% ΝΕΐ3 в дихлорметане; после загрузки ίί) 4 л 0,1% ΝΕΐ3 в дихлорметане; ίίί) 16 л 2% МеОН - 98% 0,1% ΝΕΐ3 в дихлорметане; ίν) 4 л 2,5% МеОН - 97,5% 0,1% ΝΕΐ3 в дихлорметане; ν) 12 л 3% МеОН -97% 0,1% ΝΕΐ3 в дихлорметане] для получения очищенного продукта 8 (МС3, 159 г, 91%) в виде бесцветной маслянистой жидкости.
Ή ЯМР (400 МГц, СОСЬ) δ 5,46-5,23 (т, 8Η), 4,93-4,77 (т, 1Н), 2,83-2,66 (т, 4Η), 2,37-2,22 (т, 4Η), 2,20 (5, 6Η), 2,10-1,96 (т, 9Η), 1,85-1,69 (т, 2Η), 1,49 (Д, ί=5,4, 4Η), 1,39-1,15 (т, 39Η), 0,95-0,75 (т, 6Η).
13С ЯМР (101 МГц, СОСЬ) δ 173,56, 130,38, 130,33, 128,17, 128,14, 77,54, 77,22, 76,90, 74,44, 59,17, 45,64, 34,36, 32,69, 31,73, 29,87, 29,76, 29,74, 29,70, 29,56, 29,50, 27,44, 27,41, 25,84, 25,55, 23,38, 22,78, 14,27.
ΕΙ-масс-спектрометрия (+уе): Молекулярная масса расчетная для С43Η79NΟ2 (Μ+ Η)+: 642,6, определенная экспериментально: 642,6.
Пример 17. Получение композиции с 51РНК с применением предварительно сформированных везикул.
Содержащие катионный липид частицы приготовили с применением способа предварительно сформированных везикул. Катионный липид, ДСФХ, холестерол и ПЭГ-липид солюбилизировали в этаноле в молярном соотношении 40/10/40/10 соответственно. Липидную смесь добавили к водному буферному раствору (50 мМ цитрат, рН 4) при перемешивании, до конечной концентрации этанола и липидов 30 об.% и 6,1 мг/мл, соответственно, и дали уравновеситься при комнатной температуре в течение 2 мин перед экструзией. Гидратированные липиды экструдировали через два расположенные друг над другом фильтра с размером пор 80 нм Дискрете) при 22°С с помощью экструдера Ырех (Шпкет Ыркк, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) до достижения диаметра везикул 70-90 нм, согласно данным анализа с помощью М^тр. Обычно для этого требовалось 1-3 прогона. В случае некоторых смесей катионных липидов, которые не образовывали маленькие везикулы, удавалось сформировать стабильные везикулы размером 70-90 нм с помощью гидратации липидной смеси буферным раствором с пониженным рН (50 мМ цитрат, рН 3) для протонирования фосфатной группы головки ДСФХ.
51РНК для РУ11 (солюбилизированную в водном растворе 50 мМ цитрата, рН 4, содержащем 30% этанол) добавляли к везикулам, предварительно уравновешенным до 35°С, со скоростью примерно 5 мл/мин при перемешивании. По достижении конечного соотношения 51РНК/липид 0,06 (по массе) смесь инкубировали дополнительно в течение 30 мин при 35°С для - перестройки везикул и инкапсуляции 51РНК РУ11. После этого удалили этанол и заменили внешний буферный раствор на ΡΒδ (155 мМ ЫаС1, 3 мМ Να2ΗΡΟ4, 1 мМ ΚΗ2ΡΟ4, рН 7,5) с применением либо диализа, либо тангенциальной поточной диафильтрации. Конечное соотношение инкапсулированной 51РНК к липиду определяли после удаления неинкапсулированной 51РНК с применением центрифужных колонок для эксклюзионной хроматографии или центрифужных колонок для ионообменной хроматографии. Кривая зависимости доза-эффект, демонстрирующая % остаточного РУ11 в зависимости от дозы (мг/кг) приведена на фиг. 9.
Пример 18. Определение рКа катионного липида формулы I.
Значение рКа для катионного липида формулы Ι определяли в существенной мере как описано в работе (Έ;·ι$1ιπ;·ιη еΐ а1., 1992 Β^ΙκιπίδίΓν 31:4262-4268), с применением флуоресцентного зонда 2-(ртолуидино)-6-нафталенсульфоновой кислоты (ΤΝδ), которая не флуоресцирует в воде, но приобретает заметную флуоресценцию при связывании с мембранами. Везикулы, состоящие из катионного липида/ДСФХ/холестерола/ПЭГ-с-^ΟΜС (в молярном соотношении 40:10:40:10) разбавили до 0,1 мМ в буферных растворах (130 мМ ЫаС1, 10 мМ ίΉ,ί’ΟΟΝΗ.-μ 10 мМ ΜΕδ, 10 мМ ΗΕΡΕδ) с различными значениями рН в диапазоне от 2 до 11. Аликвоту водного раствора ΤΝδ (до конечной концентрации 1 мкМ) добавляли к разбавленным везикулам и после 30-секундного периода уравновешивания измеряли флуоресценцию ΤΝδ-содержащего раствора при длинах волн возбуждения и испускания 321 и 445 нм соответственно. Значение рКа для содержащих катионный липид везикул определяли, строя график зависимости измененной величины флуоресценции от значения рН растворов и выравнивая данные по сигмо- 81 028860
идной кривой с применением коммерческой программы для построения графиков 1догРго. Кривая титрования рКа для катионного липида формулы I представлена на фиг. 10.
- 82 028860
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ΤΕΚΜΙΚΑ РНАКМАСЕиТТСАЬЗ ΟΟΚΡΟΚΑΤΙΟΝ
<120> УЛУЧШЕННАЯ ЛИПИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
<130> Λ2038-7182ΜΟ
<140> РСТ/и310/38224
<141> 2010-06-10
<150> 61/244,834
<151> 2009-09-22
<150> 61/185,800
<151> 2009-06-10
<160> 79
<170> Патентная версия 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 1
сииасдсида диасиисдаЬ Ь 21
<210> 2
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 2
исдаадиаси садсдиаадЬ Ь 21
<210> 3
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
- 83 028860
<220>
<223> тид Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(3)
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (5)..(5)
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (7)..(8)
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (12)..(12)
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (14)..(17)
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 3
сииасдсида диасиисдаб ύ 21
<210> 4
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (7)..(7)
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (11)..(11)
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (16)..(16)
- 84 028860
<223> 2'-о-метиловый нуклеотид
<220>
<221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 4
исдаадиаси садсдиаадр ύ 21
<210> 5
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220> <223> тид Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
<400> 5
ддаисаисис аадисииасЁ ύ 21
<210> 6
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<220> <223> тид Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
<400> 6
диаадасиид адаидаиссР ύ 21
<210> 7
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<220> <223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (3)..(4)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (6)..(9)
- 85 028860
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (13)..(16)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (18)..(18)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 7
ддаисаисис аадисииасб ύ 21
<210> 8
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(1)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (6)..(8)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (13)..(13)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (16)..(18)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 8
диаадасиид адаидаиссб ύ 21
<210> 9
<211> 16
- 86 028860
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 9
ЕаасдЕЕдад дддсаЕ 16
<210> 10
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 10
ЕЕссаЕдасд ЕЕссЕдасдЕ 20
<210> 11
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (8)..(8)
<223> метилированный-цитозин
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (17)..(17)
<223> метилированный-цитозин
<400> 11
ЕссаЕдасдЕ ЕссЕдасдЕ 19
<210> 12
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (4)..(4)
<223> метилированный-цитозин
<400> 12
ЕаасдЕЕдад дддсаЕ 16
<210> 13 <211> 20
- 87 028860
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<400> 13
ЕссаЕдасдЕ ЕссЕдасдЕЕ
20
<210> 14
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (8)..(8)
<223> метилированный-цитозин
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (17)..(17)
<223> метилированный-цитозин
<400> 14
ЕссаЕдасдЕ ЕссЕдасдЕЕ
20
<210> 15
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 15
ЕаадсаЕасд дддЕдЕ 16
<210> 16
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 16
даЕдсЕдЕдЕ сддддЕсЕсс дддс 24
<210> 17
<211> 24
<212> ДНК
- 88 028860
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<400> 17
5сд5сд5555 д5сд5555д5 сд55
24
<210> 18
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (2)..(2)
<223> метилированный-цитозин
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (5)..(5)
<223> метилированный-цитозин
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (13)..(13)
<223> метилированный-цитозин
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (21)..(21)
<223> метилированный-цитозин
<400> 18
5сд5сд5555 д5сд5555д5 сд55
24
<210> 19
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 19
5ссаддас55 с5с5садд55
20
<210> 20
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
- 89 028860
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<400> 20
ЕсЕсссадсд ЕдсдссаЕ
18
<210> 21
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 21
ЕдсаЕссссс аддссассаЕ
20
<210> 22
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 22
дсссаадсЕд дсаЕссдЕса
20
<210> 23
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<400> 23
дсссаадсЕд дсаЕссдЕса
20
<210> 24
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 24
ддЕдсЕсасЕ дсддс
15
<210> 25
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 90 028860
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический тид
<400> 25
аассдДДдад дддсаВ
16
<210> 26
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический тид
<400> 26
5а5дс5д5дс сдддд5с55с дддс
24
<210> 27
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический тид
<400> 27
дрдссддддр сВВсдддс
18
<210> 28
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический тид
<400> 28
ддасссВссВ ссддадсс
18
<210> 29
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический тид
<400> 29
5сс5ссддад ссадасВВ
18
<210> 30
<211> 15
олигонуклеоолигонуклеоолигонуклеоолигонуклеоолигонуклео- 91 028860
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<400> 30
аасдббдадд ддсаб
15
<210> 31
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 31
ссдбддбсаб дсбсс
15
<210> 32
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 32
садссбддсб сассдссббд д
21
<210> 33
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<400> 33
садссабддб бссссссаас
20
<210> 34
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 34
дббсбсдсбд дбдадбббса 20
- 92 028860
<210> 35
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 35
ЕсЕсссадсд ЕдсдссаЕ
18
<210> 36
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 36
дЕдсЕссаЕЕ даЕдс 15
<210> 37
<211> 33
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 37
дадиисидаи даддссдааа ддссдааади сид
33
<210> 38
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 38
аасдЕЕдадд ддсаЕ
15
<210> 39
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<400> 39
- 93 028860
саасдЬЬаЬд дддада 16
<210> 40
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 40
О1и А1а Ьеи А1а
1
<210> 41
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 41 А1а А1а Ьеи 1 О1и А1а 5 Ьеи А1а О1и А1а Ьеи 10 О1и А1а Ьеи А1а О1и А1а 15
Ьеи О1и А1а Ьеи А1а О1и А1а А1а А1а А1а О1у О1у Суз
20 25
<210> 42 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 42 А1а А1а Ьеи А1а 1 О1и 5 А1а Ьеи А1а О1и А1а 10 Ьеи А1а О1и А1а Ьеи А1а 15
О1и А1а Ьеи А1а О1и А1а Ьеи А1а А1а А1а А1а О1у О1у Суз
20 25 30
<210> 43 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 43
А1а Ьеи О1и А1а Ьеи А1а О1и А1а Ьеи О1и А1а Ьеи А1а О1и А1а
1 5 10 15
<210> 44
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа типа А
<400> 44
- 94 028860
О1у Ьеи РНе О1и А1а 11е О1и О1у РНе 11е О1и Азп О1у Тгр О1и О1у
1 5 10 15
Меб 11е Тгр Азр Туг О1у
20
<210> 45
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа типа А
<400> 45
О1у Ьеи РНе О1у А1а 11е А1а О1у РНе 11е О1и Азп О1у Тгр О1и О1у
1 5 10 15
Меб 11е АЗР О1у Тгр Туг О1у 20
<210> 46
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа типа А
<400> 46
О1у Ьеи РНе О1и А1а 11е О1и О1у РНе 11е О1и Азп О1у Тгр О1и О1у
1 5 10 15
Меб 11е Азр О1у Тгр Туг О1у Суз 20
<210> 47
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа типа А
<400> 47
О1у Ьеи РНе О1и А1а 11е О1и О1у РНе 11е О1и Азп О1у Тгр О1и О1у
1 5 10 15
Меб 11е Азр О1у О1у Суз
20
<210> 48
<211> 35
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 48 О1у Ьеи РНе 1 О1у А1а 5 Ьеи А1а О1и А1а Ьеи 10 А1а О1и А1а Ьеи А1а 15 О1и
НФз Ьеи А1а О1и 20 А1а Ьеи А1а О1и А1а 25 Ьеи О1и А1а Ьеи А1а 30 А1а О1у
О1у Зег суз 35
<210> 49 <211> 34 <212> БЕЛОК
- 95 028860
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 49
О1у Ьеи РНе О1и А1а 11е О1и О1у РНе 11е О1и Азр О1у Тгр О1и О1у
1 5 10 15
Ьеи А1а О1и А1а Ьеи А1а О1и А1а Ьеи О1и А1а Ьеи А1а А1а О1у О1у
20 25 30
Бег Суз
<210> 50
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа типа А
<220>
<221> МОБ_КЕБ <222> (17)..(17) <223> Норлейцин
<400> 50
О1у Ьеи РНе О1и А1а 11е О1и О1у РНе 11е О1и Азп О1у Тгр О1и О1у
1 5 10 15
Хаа 11е Азр О1у Ьуз 20
<210> 51
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа типа А
<220>
<221> МОБ_КЕБ <222> (17)..(17) <223> Норлейцин
<400> 51
О1у Ьеи РНе О1и А1а 11е О1и О1у РНе 11е О1и Азп О1у Тгр О1и О1у
1 5 10 15
Хаа 11е Азр О1у
20
<210> 52 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Дрозофила ос.
<400> 52
Агд О1п 11е Ьуз 11е Тгр РНе О1п Азп Агд Агд МеЕ Ьуз Тгр Ьуз Ьуз
1 5 10 15
<210> 53
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Вирус иммунодефицита человека
<400> 53
- 96 028860
О1у Агд Ьуз 1 Ьуз Агд 5 Агд О1п Агд Агд Агд 10 Рго Рго О1п
<210> 54 <211> 27 <212> БЕЛОК
<213> Миз зр.
<400> 54 О1у А1а Ьеи 1 РЬе Ьеи 5 О1у Тгр Ьеи О1у А1а 10 А1а О1у Бег ТЬг МеЕ О1у 15
А1а Тгр Бег О1п 20 Рго Ьуз Ьуз Ьуз Агд 25 Ьуз Уа1
<210> 55
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 55
Ьеи Ьеи 11е 11е Ьеи Агд Агд Агд 11е Агд Ьуз О1п А1а Ηΐ3 А1а Ηΐ3 1 5 10 15
Бег Ьуз
<210> 56
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 56 О1у Тгр ТЪг 1 Ьеи Азп 5 Бег А1а О1у Туг Ьеи Ьеи Ьуз 10 11е Азп Ьеи Ьуз 15
А1а Ьеи А1а А1а Ьеи А1а Ьуз Ьуз 11е Ьеи
20 25
<210> 57
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 57
Ьуз Ьеи А1а Ьеи Ьуз Ьеи А1а Ьеи Ьуз А1а Ьеи Ьуз А1а А1а Ьеи Ьуз 1 5 10 15
Ьеи А1а
<210> 58
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
- 97 028860
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 58
Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд Агд
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 59
Ьуз РЬе РЬе Ьуз РЬе РЬе Ьуз РЬе РЬе Ьуз
1 5 10
<210> 60
<211> 37
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарчепз
<400> 60
Ьеи Ьеи О1у Азр 1 РЬе 5 РЬе Агд Ьуз Бег Ьуз 10 О1и Ьуз 11е О1у Ьуз 15 О1и
РЬе Ьуз Агд 11е Уа1 О1п Агд 11е Ьуз Азр РЬе Ьеи Агд Азп Ьеи Уа1
20 25 30
Рго Агд ТЬг О1и Бег
35
<210> 61
<211> 31
<212> БЕЛОК <213> Азсагчз зиит
<400> 61
Бег Тгр Ьеи 1 Бег Ьуз 5 ТЬг А1а Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азп Бег А1а Ьуз Ьуз
10 15
Агд 11е Бег О1и О1у 11е А1а 11е А1а 11е С1п О1у О1у Рго Агд
20 25 30
<210> 62 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Ното заруепз
<400> 62 А1а Суз Туг Суз Агд 11е Рго А1а Счз 11е А1а О1у О1и Агд Агд Туг
1 5 10 15
О1у ТЬг суз 11е Туг О1п О1у Агд Ьеи Тгр А1а РЬе Суз Суз
20 25 30
<210> 63
<211> 36
<212> БЕЛОК
<213> Ното зартепз
- 98 028860
<400> 63 Бег Бег С1у О1у 10 О1п Суз Ьеи Туг Бег 15 А1а
Азр 1 Н1з Туг Азп Суз 5 Уа1
Суз Рго 11е РЬе 20 ТЬг Ьуз 11е О1п О1у 25 ТЬг Суз Туг Агд О1у 30 Ьуз А1а
Ьуз Суз Суз 35 Ьуз
<210> 64
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного: неизвестный бактеницин пептид
<400> 64
Агд Ьуз Суз Агд 11е Уа1 Уа1 11е Агд Уа1 Суз Агд 10
1 5
<210> 65
<211> 42
<212> БЕЛОК
<213> Биз зсгоЬа
<220>
<223> С-терм амидированный
<400> 65
Агд 1 Агд Агд Рго Агд 5 Рго Рго Туг Ьеи Рго Агд 10 Рго Агд Рго Рго 15 Рго
РЬе РЬе Рго Рго Агд Ьеи Рго Рго Агд 11е Рго Рго О1у РЬе Рго Рго
20 25 30
Агд РЬе Рго Рго Агд РЬе Рго О1у Ьуз Агд
35 40
<210> 66
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного: неизвестный индолицидин пептид
<220>
<223> С-терм амидированный
<400> 66
11е Ьеи Рго Тгр Ьуз Тгр Рго Тгр Тгр Рго Тгр Агд Агд
1 5 10
<210> 67
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
- 99 028860
<400> 67
А1а А1а Уа1 А1а Ьеи
Ьеи Рго А1а Уа1 Ьеи Ьеи А1а
Ьеи Ьеи А1а Рго
10
15
<210> 68
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание исскуственной последовательности: синтетический пептид
<400> 68
А1а А1а Ьеи Ьеи Рго Уа1 Ьеи Ьеи А1а А1а Рго
1 5 10
<210> 69
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклеотид
<220>
<221> разное
<222> (1)..(2)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (7)..(7)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (16)..(16)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 69
исдаадиаси садсдиаадЕ Е
21
<210> 70
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<220>
- 100 028860
<223> тид Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
<220> <221> разное
<222> (1)..(2)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<220> <221> модифицированное_основание
<222> (3)..(3)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220> <221> модифицированное_основание
<222> (12)..(12)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220> <221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 70
сииасдсида диасиисдак к
21
<210> 71
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220> <223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 71
исдаадиаси садсдиаадк к 21
<210> 72
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклеотид
<220>
<222> разное
<222> (1)..(2)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<220>
- 101 028860
<221> модифицированное_основание <222> (3)..(3)
<223> 2Уд--ъеЛЬХЛб
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (12)..(12)
<223> 2Уд--ъеЛЬХЛб
<220>
<221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 72
сииасдсида диасиисдаЛ Л
21
<210> 73
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> разное
<222> (1)..(2)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (7)..(7)
<223> 2Уд--ъеЛЬХЛб
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (16)..(16)
<223> 2Уд--ъеЛЬХЛб
<220>
<221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 73
исдаадиаси садсдиаадЛ Л
21
<210> 74
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
- 102 028860
<220>
<223> тид Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
<4О0> 74 сииасдсида диасиисда5 5 21
<210> <211> <212> <213> 75 21 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<220> <223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<400> 75
исдаадиаси садсдиаад5 5
21
<210> 76
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<220> <223> тид Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
<400> 76 ддаисаисис аадисииас5 5 21
<210> <211> <212> <213> 77 21 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<223> ЧйеПДНК/РНК·ЦЧУцДГиКцЛееП1Й№СеЛЬХЛб
<400> 77
диаадасиид адаидаисс5 5
21
<210> 78
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 103 028860
<220>
<223> тид Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (4)..(5)
<223> 2'-·ъеЛЬХЛб
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (7)..(10)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (14)..(17)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (19)..(19)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 78
ддаисаисис аадисииасб ύ
21
<210> 79
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<223> Описание комбинированной ДНК/РНК Молекулы: Синтетический олигонуклео-
тид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (2)..(2)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (7)..(9)
<223> 2'-Фтор нуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
- 104 028860
<222> (14)..(14)
<223> 2'—ъеЛЬХЛб
<220>
<221> модифицированное_основание <222> (17)..(19)
<223> 2'—ъеЛЬХЛб
<220>
<221> разное
<222> (20)..(21)
<223> Фосфоротиотатное соединение
<400> 79
диаадасиид адаидаиссЕ Е
21

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Частица липид-нуклеиновая кислота, содержащая:
    (а) липидную частицу, включающую:
    (ΐ) соединение формулы
    или его соль,
    (ϊϊ) нейтральный липид;
    (ΐΐΐ) стерол;
    (ίν) ПЭГ-модифицированный липид; и
    (Ь) терапевтическую κί РНК, инкапсулированную в липидной частице.
  2. 2. Частица липид-нуклеиновая кислота по п.1, отличающаяся тем, что частица липид-нуклеиновая кислота имеет размер от примерно 70 до примерно 200 нм.
  3. 3. Частица липид-нуклеиновая кислота по п.2, отличающаяся тем, что частица липид-нуклеиновая кислота имеет размер от примерно 90 до примерно 130 нм.
  4. 4. Применение частицы липид-нуклеиновая кислота по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для модулирования экспрессии целевого гена в клетке.
  5. 5. Способ получения катионного липида формулы I или его фармацевтически приемлемой соли
    включающий взаимодействие дилинолеилметанола с диметиламиномасляной кислотой или ее солью в условиях получения катионного липида формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
  6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что дилинолеилметанол подвергают взаимодействию с гидрохлоридной солью диметиламиномасляной кислоты в условиях получения соединения I или его фармацевтически приемлемой соли.
  7. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что дилинолеилметанол подвергают взаимодействию с солью диметиламиномасляной кислоты в условиях, которые включают ΡΙΧΊ, ОМАР и ЫРРА.
  8. 8. Способ по п.5, дополнительно включающий очистку соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
  9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии.
  10. 10. Способ по п.5, дополнительно включающий обеспечение дилинолеилметанола путем превращения линолеилбромида в дилинолеилметанол.
  11. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что превращение проводят путем взаимодействия линолеилбромида с магнием с последующим взаимодействием с водой с обеспечением полученной смеси, содержащей дилинолеилметанол.
  12. 12. Способ по п.11, дополнительно включающий обработку полученной смеси основанием с получением дилинолеилметанола.
  13. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий очистку дилинолеилметанола.
  14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что дилинолеилметанол очищают с помощью колоночной хроматографии.
    - 105 028860
EA201690312A 2009-06-10 2010-06-10 Улучшенная липидная композиция EA028860B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18580009P 2009-06-10 2009-06-10
US24483409P 2009-09-22 2009-09-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201690312A1 EA201690312A1 (ru) 2016-08-31
EA028860B1 true EA028860B1 (ru) 2018-01-31

Family

ID=43309230

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201190306A EA024960B1 (ru) 2009-06-10 2010-06-10 Улучшенная липидная композиция
EA201791744A EA201791744A3 (ru) 2009-06-10 2010-06-10 Улучшенная липидная композиция
EA201690312A EA028860B1 (ru) 2009-06-10 2010-06-10 Улучшенная липидная композиция

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201190306A EA024960B1 (ru) 2009-06-10 2010-06-10 Улучшенная липидная композиция
EA201791744A EA201791744A3 (ru) 2009-06-10 2010-06-10 Улучшенная липидная композиция

Country Status (24)

Country Link
US (4) US8158601B2 (ru)
EP (2) EP3431076B1 (ru)
JP (4) JP5819291B2 (ru)
KR (7) KR102374518B1 (ru)
CN (2) CN104873464B (ru)
AU (4) AU2010259984B2 (ru)
CA (2) CA3014827A1 (ru)
CY (2) CY1120641T1 (ru)
DK (2) DK3431076T3 (ru)
EA (3) EA024960B1 (ru)
ES (2) ES2901627T3 (ru)
HK (1) HK1212620A1 (ru)
HR (2) HRP20211619T1 (ru)
HU (2) HUE038796T2 (ru)
IL (4) IL216876A (ru)
LT (2) LT2440183T (ru)
MX (4) MX342785B (ru)
NZ (3) NZ596958A (ru)
PL (2) PL3431076T3 (ru)
PT (2) PT3431076T (ru)
SG (3) SG10201912450XA (ru)
SI (2) SI3431076T1 (ru)
TR (1) TR201811076T4 (ru)
WO (1) WO2010144740A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2815001C2 (ru) * 2018-08-14 2024-03-11 Этрис Гмбх Составы на основе липидов для доставки рнк

Families Citing this family (652)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
EP2365077B1 (en) 2004-03-12 2013-05-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA agents targeting VEGF
NZ572666A (en) 2006-05-11 2010-11-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions comprising double stranded rna and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
US8598333B2 (en) * 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
WO2009134487A2 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
CA2716793A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
NZ588583A (en) 2008-04-15 2012-08-31 Protiva Biotherapeutics Inc Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
CA2739170A1 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of serum amyloid a gene
US8168775B2 (en) 2008-10-20 2012-05-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
CA2743139C (en) 2008-11-10 2019-04-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
CA2746514C (en) 2008-12-10 2018-11-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
CN104922699B (zh) * 2009-03-12 2020-07-24 阿尔尼拉姆医药品有限公司 脂质配制的组合物以及用于抑制Eg5和VEGF基因表达的方法
US20100285112A1 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Tatiana Novobrantseva Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
TR201811076T4 (tr) * 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
EA201270019A1 (ru) * 2009-06-15 2012-06-29 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Двуцепочечная рнк, включенная в липидный состав и мишенью которой является ген pcsk9
WO2010147992A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna
EP2449114B9 (en) 2009-07-01 2017-04-19 Protiva Biotherapeutics Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
EP2464336A4 (en) 2009-08-14 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS FORMULATED IN LIPIDS AND METHODS OF INHIBITING THE EXPRESSION OF EBOLA VIRUS GENE
US8859516B2 (en) 2009-09-15 2014-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes
HRP20220478T1 (hr) 2009-09-22 2022-05-27 Medicago Inc. Način pripreme proteina od biljaka
US9187746B2 (en) 2009-09-22 2015-11-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dual targeting siRNA agents
WO2011056883A1 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin (ttr)
ME03327B (me) 2009-12-01 2019-10-20 Translate Bio Inc Stereoidni derivati za isporuku irnk u humanim genetskim oboljenjima
EP2512449B1 (en) * 2009-12-18 2019-08-07 The University of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011088309A1 (en) 2010-01-14 2011-07-21 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compositions and methods
CA2799091A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use thereof
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012006369A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Immunisation of large mammals with low doses of rna
EP2590626B1 (en) 2010-07-06 2015-10-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Liposomes with lipids having an advantageous pka-value for rna delivery
HUE047796T2 (hu) 2010-07-06 2020-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNS bevitele több immunútvonal bekapcsolására
US20130202652A1 (en) * 2010-07-30 2013-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2606134B1 (en) 2010-08-17 2019-04-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
PL2611461T3 (pl) 2010-08-31 2022-07-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegylowane liposomy do dostarczania rna kodującego immunogen
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
MX349088B (es) 2010-09-20 2017-07-10 Merck Sharp & Dohme Lípidos catiónicos novedosos de bajo peso molecular para la entrega de oligonucleótidos.
PT3590949T (pt) 2010-10-01 2022-08-02 Modernatx Inc Ácidos ribonucleicos contendo n1-metilpseudouracilos e suas utilizações
KR102266691B1 (ko) 2010-10-11 2021-06-23 노파르티스 아게 항원 전달 플랫폼
CA2813024A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2632472B1 (en) 2010-10-29 2017-12-13 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (sina)
DK2635265T3 (en) 2010-11-05 2018-07-16 Sirna Therapeutics Inc New low molecular weight cyclic amine-containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
WO2012151575A2 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Duke University A method of controlling coagulation
EP2714971A4 (en) * 2011-05-23 2015-01-21 Phylogica Ltd METHOD FOR DETERMINING, IDENTIFYING AND INSULATING CELL-PENETRATING PEPTIDES
BR112013031553A2 (pt) 2011-06-08 2020-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. composições, mrna que codifica para uma hgla e seu uso, uso de pelo menos uma molécula de mrna e um veículo de transferência e uso de um mrna que codifica para proteína exógena
US9068184B2 (en) 2011-06-21 2015-06-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of expression of protein C (PROC) genes
AU2012272860A1 (en) * 2011-06-21 2013-12-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of expression of apolipoprotein C-III (APOC3) genes
MX360782B (es) 2011-06-21 2018-11-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni similares a angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para su uso.
US11896636B2 (en) 2011-07-06 2024-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combination compositions and uses thereof
WO2013033230A1 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SG11201401196WA (en) 2011-10-03 2014-05-29 Moderna Therapeutics Inc Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
ES2800065T3 (es) 2011-11-18 2020-12-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de iARN, composiciones y métodos de uso de los mismos para tratar enfermedades asociadas con transtiretina (TTR)
DK3988537T1 (da) 2011-12-07 2022-05-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc Bionedbrydelige lipider til afgivelse af aktive midler
CA2856737C (en) * 2011-12-07 2023-09-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
AU2012352180A1 (en) 2011-12-16 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
EP3473611B1 (en) 2012-02-24 2021-10-20 Arbutus Biopharma Corporation Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US10501513B2 (en) * 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP3505176A1 (en) 2012-04-02 2019-07-03 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
JP2015518705A (ja) 2012-04-02 2015-07-06 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
JP6232416B2 (ja) 2012-04-19 2017-11-15 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチド送達のための、新規なジエステルおよびトリエステルベースの低分子量、生分解性カチオン性脂質
US9127274B2 (en) 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
US9334498B2 (en) 2012-05-10 2016-05-10 Uab Research Foundation Methods and compositions for modulating MIR-204 activity
MX2014015041A (es) 2012-06-08 2015-06-17 Shire Human Genetic Therapies Administración pulmonar de arnm a células objetivo no pulmonares.
EP3536787A1 (en) 2012-06-08 2019-09-11 Translate Bio, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
US9415109B2 (en) 2012-07-06 2016-08-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Stable non-aggregating nucleic acid lipid particle formulations
US9512456B2 (en) 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
US20140120157A1 (en) * 2012-09-19 2014-05-01 Georgetown University Targeted liposomes
JP6144355B2 (ja) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
ES2657608T3 (es) 2012-12-05 2018-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Composiciones de arni de pcsk9 y métodos de uso de las mismas
AU2013355258A1 (en) * 2012-12-07 2015-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved nucleic acid lipid particle formulations
CA2897941A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
CA2888286C (en) * 2013-03-06 2020-03-24 Biomics Biotechnologies Co., Ltd. Liposome formulation, its preparation and application
US20160024181A1 (en) * 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
AU2014236305B2 (en) 2013-03-14 2019-01-17 Ethris Gmbh CFTR mRNA compositions and related methods and uses
HUE055044T2 (hu) 2013-03-14 2021-10-28 Translate Bio Inc MRNS-kódolt ellenanyagok bejuttatására szolgáló eljárások és készítmények
RS56663B1 (sr) 2013-03-14 2018-03-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Irnk sastavi komponente komplementa c5 i metode za njihovu upotrebu
KR20150128687A (ko) 2013-03-14 2015-11-18 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna의 정제 방법
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP2971161B1 (en) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US10272041B2 (en) * 2013-03-15 2019-04-30 The Penn State Research Foundation Acid stable liposomal compositions and methods for producing the same
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
ES2670529T3 (es) 2013-03-15 2018-05-30 Translate Bio, Inc. Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos a través de formulaciones mezcladas
JP6605446B2 (ja) * 2013-03-15 2019-11-13 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 形質移入用の脂質ナノ粒子および関連方法
CN105378085B (zh) 2013-05-01 2019-02-15 Ionis制药公司 用于调节hbv和ttr表达的组合物和方法
US10246708B2 (en) 2013-05-06 2019-04-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules
AU2014268529C1 (en) 2013-05-22 2020-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. TMPRSS6 iRNA compositions and methods of use thereof
SG10201804472YA (en) 2013-05-22 2018-07-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc SERPINA1 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
HUE056760T2 (hu) 2013-07-11 2022-03-28 Modernatx Inc A CRISPR-hez kapcsolódó fehérjéket és a szintetikus SGRNS-ket kódoló szintetikus polinukleotidokat tartalmazó készítmények és felhasználási módjaik
CN105555757A (zh) 2013-07-23 2016-05-04 普洛体维生物治疗公司 用于递送信使rna的组合物和方法
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015034928A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10195291B2 (en) * 2013-09-24 2019-02-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the manufacture of lipid nanoparticles
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051214A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EA201690576A1 (ru) 2013-10-22 2016-10-31 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Липидные композиции для доставки матричной рнк
EA034103B1 (ru) 2013-10-22 2019-12-27 Транслейт Био, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
WO2015061461A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
WO2015061500A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
KR102095085B1 (ko) 2013-11-18 2020-03-31 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. Rna 전달을 위한 이온화가능한 양이온성 지질
CA2930973A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Pal SAERTROM C/ebp alpha short activating rna compositions and methods of use
CA3107872A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component irna compositions and methods of use thereof
US9873669B2 (en) 2014-01-09 2018-01-23 Eisai R&D Management Co., Ltd. Cationic lipid
EP3960860A3 (en) 2014-02-11 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
EP3110401A4 (en) 2014-02-25 2017-10-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
SG10201912038TA (en) 2014-04-23 2020-02-27 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
CN117402871A (zh) 2014-04-25 2024-01-16 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
EP3137476B1 (en) 2014-04-28 2019-10-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
ES2849600T3 (es) 2014-05-01 2021-08-19 Ionis Pharmaceuticals Inc Conjugados de oligonucleótidos antisentido modificados y su uso para modular la expresión de PKK
PE20190626A1 (es) 2014-05-01 2019-04-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion del factor b del complemento
MX2016014102A (es) 2014-05-01 2017-05-03 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion de similar a la angiopoyetina tipo 3.
CN106459969B (zh) 2014-05-01 2019-11-15 Ionis制药公司 用于调节生长激素受体表达的组合物和方法
EP3137899A2 (en) 2014-05-02 2017-03-08 Cerenis Therapeutics Holding SA Hdl therapy markers
CN112852809A (zh) 2014-05-22 2021-05-28 阿尔尼拉姆医药品有限公司 血管紧张素原(AGT)iRNA组合物及其使用方法
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
JP6557722B2 (ja) 2014-05-30 2019-08-07 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 核酸の送達のための生分解性脂質
WO2015188194A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
AU2015279968B2 (en) 2014-06-24 2019-11-14 Translate Bio, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
ES2931832T3 (es) 2014-06-25 2023-01-03 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos y formulaciones de nanopartículas lipídicas novedosos para la entrega de ácidos nucleicos
BR112016030852A2 (pt) 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
EP3169693B1 (en) 2014-07-16 2022-03-09 ModernaTX, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
WO2016033326A2 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
EP3191591A1 (en) 2014-09-12 2017-07-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
JOP20200115A1 (ar) 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
WO2016061487A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting aminolevulinic acid synthase-1 (alas1) and uses thereof
WO2016065349A2 (en) 2014-10-24 2016-04-28 University Of Maryland, Baltimore Short non-coding protein regulatory rnas (sprrnas) and methods of use
EP3904519A1 (en) 2014-10-30 2021-11-03 Genzyme Corporation Polynucleotide agents targeting serpinc1 (at3) and methods of use thereof
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
CA2968114A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
JP6767976B2 (ja) 2014-12-05 2020-10-14 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 関節疾患の治療のためのメッセンジャーｒｎａ治療法
AU2015364508A1 (en) * 2014-12-18 2017-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ReversirTM compounds
JP6592458B2 (ja) 2014-12-26 2019-10-16 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 カチオン性脂質
EP3256587A2 (en) 2015-02-13 2017-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
WO2016149508A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for pompe disease
MX2017012610A (es) 2015-04-08 2018-03-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion del gen lect2.
WO2016168286A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
US10660973B2 (en) 2015-04-28 2020-05-26 Duke University Thrombus imaging aptamers and methods of using same
TWI727948B (zh) 2015-05-06 2021-05-21 美商阿尼拉製藥公司 第十二因子（哈格曼因子）（Ｆ１２）、激肽釋放素Ｂ、血漿（夫列契因子）１（ＫＬＫＢ１）及激肽原１（ＫＮＧ１）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP3307316A1 (en) 2015-06-12 2018-04-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
WO2016205323A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
US10221127B2 (en) 2015-06-29 2019-03-05 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
CN109477106B (zh) 2015-07-10 2022-10-04 Ionis制药公司 二酰基甘油酰基转移酶2(dgat2)的调节剂
WO2017011286A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (igfals) and insulin-like growth factor 1 (igf-1) irna compositions and methods of use thereof
CA2993350C (en) 2015-07-31 2022-04-05 Arcturus Therapeutics, Inc. Multiligand agent for drug delivery
EP3329002B1 (en) 2015-07-31 2020-10-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated diseases
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
EP3344769B1 (en) 2015-09-02 2024-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Programmed cell death 1 ligand 1 (pd-l1) irna compositions and methods of use thereof
EP3350328A1 (en) 2015-09-14 2018-07-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) and methods of use thereof
EP4286012A2 (en) 2015-09-17 2023-12-06 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
JP6877414B2 (ja) 2015-09-24 2021-05-26 アイオニス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｋｒａｓ発現のモジュレーター
CN108136041B (zh) 2015-10-02 2022-12-30 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合方法
US10849920B2 (en) 2015-10-05 2020-12-01 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017066573A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Modification of rna-related enzymes for enhanced production
ES2922760T3 (es) 2015-10-22 2022-09-20 Modernatx Inc Vacunas de virus respiratorios
HUE061564T2 (hu) 2015-10-28 2023-07-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske készítmények nukleinsavak bevitelére
WO2017079745A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
US10557137B2 (en) 2015-11-06 2020-02-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulating apolipoprotein (a) expression
EP3868890A1 (en) 2015-11-18 2021-08-25 Provivi, Inc. Microorganisms for the production of insect pheromones and related compounds
SG11201804729RA (en) 2015-12-07 2018-07-30 Genzyme Corp Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder
JP2018536689A (ja) 2015-12-10 2018-12-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
JP7080172B2 (ja) 2015-12-10 2022-06-03 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の送達のための組成物及び方法
EP4036079A3 (en) 2015-12-22 2022-09-28 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
EP4039699A1 (en) 2015-12-23 2022-08-10 ModernaTX, Inc. Methods of using ox40 ligand encoding polynucleotides
EP3400023A1 (en) 2016-01-10 2018-11-14 ModernaTX, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
HRP20211697T1 (hr) 2016-03-03 2022-02-04 University Of Massachusetts Zatvorena linearna dupleks dnk za nevirusni prijenos gena
CN113797348A (zh) 2016-03-07 2021-12-17 箭头药业股份有限公司 用于治疗性化合物的靶向配体
KR102369898B1 (ko) 2016-04-08 2022-03-03 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 다량체 코딩 핵산 및 그 용도
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
MA45295A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser
JP7066632B2 (ja) * 2016-05-09 2022-05-13 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 親油性抗炎症剤を含む脂質ナノ粒子およびその使用方法
AU2017266932B2 (en) 2016-05-18 2023-04-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding alpha-galactosidase A for the treatment of Fabry disease
CA3024500A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin
WO2017201332A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding acyl-coa dehydrogenase, very long-chain for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
MA45036A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour la citrine pour le traitement de la citrullinémie de type 2
EP3458083B1 (en) 2016-05-18 2022-11-02 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-12 (il12) and uses thereof
AR110606A1 (es) 2016-06-06 2019-04-17 Provivi Inc Producción semi-biosintética de alcoholes grasos y aldehídos grasos
EP3469083A1 (en) 2016-06-10 2019-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
CN109312313A (zh) 2016-06-13 2019-02-05 川斯勒佰尔公司 用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的信使rna疗法
BR112018075123A2 (pt) 2016-06-24 2019-06-18 Eisai R&D Man Co Ltd lipídio catiônico
AU2017286980B2 (en) 2016-06-30 2023-10-26 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for delivering messenger RNA
PT3484524T (pt) 2016-07-15 2023-02-15 Ionis Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para a modulação de smn2
GB201614120D0 (en) * 2016-08-18 2016-10-05 Univ Of Kwazulu-Natal pH-responsive lipids
SG11201811432WA (en) 2016-08-19 2019-03-28 Curevac Ag Rna for cancer therapy
WO2018041921A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Curevac Ag Mixing device for the production of a liquid nucleic acid composition
KR102493872B1 (ko) 2016-09-02 2023-01-30 다이서나 파마수이티컬, 인크. 4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드
KR102403408B1 (ko) 2016-09-02 2022-05-30 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 표적화 리간드
EP3432916B1 (en) 2016-09-13 2019-08-14 Allergan, Inc. Stabilized non-protein clostridial toxin compositions
WO2018053427A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Duke University Von willebrand factor (vwf)-targeting agents and methods of using the same
EP3519578B1 (en) 2016-10-03 2021-12-22 Precision Nanosystems Inc Compositions for transfecting resistant cell types
WO2018067900A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
MX2019004810A (es) 2016-10-26 2019-10-15 Modernatx Inc Ácidos ribonucleicos mensajeros para aumentar respuestas inmunes y métodos para usarlos.
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
TWI788312B (zh) 2016-11-23 2023-01-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
US11464836B2 (en) 2016-12-08 2022-10-11 Curevac Ag RNA for treatment or prophylaxis of a liver disease
WO2018112320A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing ttr-associated diseases using transthyretin (ttr) irna compositions
US10526284B2 (en) 2016-12-21 2020-01-07 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
US10383952B2 (en) 2016-12-21 2019-08-20 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
EP3558354A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Lassa virus vaccine
EP3558356A2 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Mers coronavirus vaccine
WO2018115507A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Henipavirus vaccine
JP2020514321A (ja) 2017-02-01 2020-05-21 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 活性化がん遺伝子変異ペプチドをコードする免疫調節治療ｍＲＮＡ組成物
WO2018146506A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Universitat Politècnica De València Therapeutic derivatives
WO2018157154A2 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized cftr mrna
PT3596041T (pt) 2017-03-15 2023-02-28 Modernatx Inc Compostos e composições para entrega intracelular de agentes terapêuticos
US11203569B2 (en) 2017-03-15 2021-12-21 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
US20200085944A1 (en) 2017-03-17 2020-03-19 Curevac Ag Rna vaccine and immune checkpoint inhibitors for combined anticancer therapy
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
EP3601576A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 CureVac AG Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
BR112019021852A2 (pt) 2017-04-18 2020-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Agente de rnai e uma vacina contra hbv, uso ou método e kit para tratamento
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
AU2018268859A1 (en) 2017-05-16 2019-12-12 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding CFTR
EP3635124A4 (en) 2017-05-17 2021-03-31 Provivi, Inc. MICRO-ORGANISMS INTENDED FOR THE PRODUCTION OF INSECT PHEROMONES AND ASSOCIATED COMPOUNDS
EP3625363A1 (en) 2017-05-17 2020-03-25 CureVac Real Estate GmbH Method for determining at least one quality parameter of an rna sample
US11485972B2 (en) 2017-05-18 2022-11-01 Modernatx, Inc. Modified messenger RNA comprising functional RNA elements
WO2018213731A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
WO2018222925A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Therapeutics for phenylketonuria
US11377643B2 (en) 2017-05-31 2022-07-05 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Therapeutics for glycogen storage disease type III
EP3630985A4 (en) 2017-05-31 2021-06-09 Arcturus Therapeutics, Inc. SYNTHESIS AND STRUCTURE OF HIGH POWER RNA-BASED THERAPEUTIC AGENTS
WO2018226841A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-13 Wayne State University Methods and compositions relating to carnitine- derived materials
CN109030429B (zh) * 2017-06-09 2022-06-21 南京大学 一种可对活细胞内microRNA21进行原位成像的纳米放大自参比探针
EP3638292A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
US20200131498A1 (en) 2017-06-14 2020-04-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
US10780183B2 (en) 2017-06-19 2020-09-22 Translate Bio, Inc. Messenger RNA therapy for the treatment of Friedreich's ataxia
CN111328287A (zh) 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子
CA3069868A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Lactate dehydrogenase a (ldha) irna compositions and methods of use thereof
EP3668833A1 (en) 2017-08-16 2020-06-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
MA50751A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Modernatx Inc Vaccins à base d'arnm efficaces
EP3673069A1 (en) 2017-08-22 2020-07-01 CureVac AG Bunyavirales vaccine
US11744801B2 (en) 2017-08-31 2023-09-05 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
WO2019048645A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Mina Therapeutics Limited STABILIZED COMPOSITIONS OF SMALL ACTIVATOR RNA (PARNA) FROM CEBPA AND METHODS OF USE
US11162099B2 (en) 2017-09-08 2021-11-02 Mina Therapeutics Limited HNF4A saRNA compositions and methods of use
KR20200089656A (ko) 2017-09-19 2020-07-27 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스타이레틴(ttr) 매개 아밀로이드증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
KR20200071081A (ko) 2017-10-19 2020-06-18 큐어백 아게 신규 인공 핵산 분자
WO2019089922A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
SG11202003247RA (en) 2017-11-08 2020-05-28 Curevac Ag Rna sequence adaptation
WO2019094702A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
EP3710587A1 (en) 2017-11-16 2020-09-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Kisspeptin 1 (kiss1) irna compositions and methods of use thereof
WO2019100039A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
JP7423522B2 (ja) 2017-11-22 2024-01-29 モダーナティエックス・インコーポレイテッド 尿素サイクル異常症の治療のためのオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド
EP3714252B1 (en) 2017-11-22 2023-05-31 Beckman Coulter, Inc. Diluent preparation module und method for supplying such diluent
CA3079543A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
MA50801A (fr) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour la phénylalanine hydroxylase pour le traitement de la phénylcétonurie
EP3723796A1 (en) 2017-12-13 2020-10-21 CureVac AG Flavivirus vaccine
CA3086343A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. High mobility group box-1 (hmgb1) irna compositions and methods of use thereof
CA3084061A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP3733647B1 (en) 2017-12-27 2022-06-15 Eisai R&D Management Co., Ltd. Cationic lipid
US11802146B2 (en) 2018-01-05 2023-10-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies
TW201934129A (zh) 2018-01-15 2019-09-01 美商Ionis製藥公司 Ｄｎｍ２表現之調節劑
CA3089117A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of agents to immune cells
AU2019218987A1 (en) 2018-02-12 2020-07-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
WO2019193183A2 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Curevac Ag Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination
US20210052506A1 (en) * 2018-04-09 2021-02-25 Orgenesis Inc. Bioxomes particles, redoxomes, method and composition
US20210163928A1 (en) 2018-04-11 2021-06-03 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
EP3775211B1 (en) 2018-04-12 2023-04-05 MiNA Therapeutics Limited Sirt1-sarna compositions and methods of use
SG11202008225PA (en) 2018-04-17 2020-11-27 Curevac Ag Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination
SG11202010012PA (en) 2018-05-09 2020-11-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for reducing fxi expression
US11904081B2 (en) 2018-05-11 2024-02-20 Lupagen, Inc. Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells
TW202016304A (zh) 2018-05-14 2020-05-01 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
US20210346306A1 (en) 2018-05-23 2021-11-11 Modernatx, Inc. Delivery of dna
CN112437767B (zh) 2018-05-24 2023-10-27 川斯勒佰尔公司 硫酯阳离子脂质
EP3802507A1 (en) 2018-05-30 2021-04-14 Translate Bio, Inc. Vitamin cationic lipids
MA52762A (fr) 2018-05-30 2021-04-14 Translate Bio Inc Lipides cationiques comprenant une fraction stéroïdienne
CA3101484A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Translate Bio, Inc. Phosphoester cationic lipids
AU2019277361A1 (en) 2018-05-30 2020-12-17 Translate Bio, Inc. Messenger RNA vaccines and uses thereof
JP7178409B2 (ja) 2018-06-08 2022-11-25 富士フイルム株式会社 化合物またはその塩および脂質粒子
US20210260178A1 (en) 2018-06-27 2021-08-26 Curevac Ag Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination
EP3813798A1 (en) 2018-06-28 2021-05-05 AstraZeneca AB Exosome extracellular vesicles and methods of use
US20210378977A1 (en) 2018-07-23 2021-12-09 Translate Bio, Inc. Dry Powder Formulations for Messenger RNA
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
US20210292768A1 (en) 2018-08-08 2021-09-23 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and agents against nonalcoholic steatohepatitis
JP2021534101A (ja) 2018-08-09 2021-12-09 ヴェルソー セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｃｒ２及びｃｓｆ１ｒを標的とするためのオリゴヌクレオチド組成物ならびにその使用
US20210170005A1 (en) 2018-08-15 2021-06-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of sensitizing tumors to treatment with immune checkpoint inhibitors
EP3841208A1 (en) 2018-08-24 2021-06-30 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
US11357726B2 (en) 2018-08-29 2022-06-14 Translate Bio, Inc. Process of preparing mRNA-loaded lipid nanoparticles
US20220110966A1 (en) 2018-09-02 2022-04-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
US20220054610A1 (en) 2018-09-12 2022-02-24 University Of Florida Research Foundation, Inc. Slow-cycling cell-rna based nanoparticle vaccine to treat cancer
MA53608A (fr) 2018-09-13 2021-07-21 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour les sous-unités e1-alpha, e1-beta et e2 du complexe alpha-cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée pour le traitement de la leucinose
MA53609A (fr) 2018-09-13 2021-07-21 Modernatx Inc Polynucléotides codant la glucose-6-phosphatase pour le traitement de la glycogénose
CA3112398A1 (en) 2018-09-14 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
EP3849617A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of methylmalonic acidemia
EP3849589A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 ModernaTX, Inc. Methods and compositions for treating cancer using mrna therapeutics
AU2019344776A1 (en) 2018-09-18 2021-01-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (KHK) iRNA compositions and methods of use thereof
TW202023573A (zh) 2018-09-19 2020-07-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
CN113271926A (zh) 2018-09-20 2021-08-17 摩登纳特斯有限公司 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
WO2020069169A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
CN113164379B (zh) * 2018-10-01 2024-04-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的可生物降解脂质
CN113166783A (zh) 2018-10-09 2021-07-23 不列颠哥伦比亚大学 包含无有机溶剂和去污剂的转染活性囊泡的组合物和系统以及与之相关的方法
KR20210090634A (ko) 2018-10-19 2021-07-20 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 무펌프 캡슐화
US10913951B2 (en) 2018-10-31 2021-02-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure
US20220001026A1 (en) 2018-11-08 2022-01-06 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
EP3877368A1 (en) 2018-11-09 2021-09-15 Translate Bio, Inc. 2,5-dioxopiperazine lipids with intercalated ester, thioester, disulfide and anhydride moieities
US20220071905A1 (en) 2018-11-09 2022-03-10 Translate Bio, Inc. Peg lipidoid compounds
WO2020097511A2 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for treatment of ocular diseases
AU2019377525A1 (en) 2018-11-09 2021-05-27 Translate Bio, Inc. Multi-PEG lipid compounds
CA3119449A1 (en) 2018-11-12 2020-05-22 Translate Bio, Inc. Methods for inducing immune tolerance
US20230050672A1 (en) 2018-11-21 2023-02-16 Translate Bio, Inc. Cationic lipid compounds
JP2022513657A (ja) 2018-11-28 2022-02-09 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ＬＮＰでの使用に最適化された、ＣＡＳ９をコードするｍＲＮＡ
ES2960692T3 (es) 2018-12-06 2024-03-06 Arcturus Therapeutics Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de la deficiencia de ornitina transcarbamilasa
TW202039534A (zh) 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
US20220056455A1 (en) 2018-12-20 2022-02-24 Praxis Precision Medicines, Inc. Compositions and methods for the treatment of kcnt1 related disorders
AU2019410737A1 (en) 2018-12-21 2021-06-10 CureVac SE RNA for malaria vaccines
US11559561B2 (en) 2019-01-07 2023-01-24 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
SG11202106987WA (en) 2019-01-11 2021-07-29 Acuitas Therapeutics Inc Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
SG11202108100PA (en) 2019-01-31 2021-08-30 Modernatx Inc Methods of preparing lipid nanoparticles
US20220126244A1 (en) 2019-01-31 2022-04-28 Modernatx, Inc. Vortex mixers and associated methods, systems, and apparatuses thereof
EP3920950A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 CureVac AG Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophtalmic diseases
CN113924365A (zh) 2019-03-29 2022-01-11 迪克纳制药公司 用于治疗kras相关疾病或病症的组合物和方法
EP3947646A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Precision BioSciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
US20220211740A1 (en) 2019-04-12 2022-07-07 Mina Therapeutics Limited Sirt1-sarna compositions and methods of use
EP3956303A1 (en) 2019-04-18 2022-02-23 Translate Bio, Inc. Cystine cationic lipids
US20220233444A1 (en) 2019-04-22 2022-07-28 Translate Bio, Inc. Thioester cationic lipids
US20220218808A1 (en) 2019-05-02 2022-07-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions for treatment of diffuse intrinsic pontine glioma
US20220177880A1 (en) 2019-05-03 2022-06-09 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules with shortened sense strands
WO2020227085A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Translate Bio, Inc. Di-thioester cationic lipids
WO2020227510A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Modernatx, Inc. Polynucleotides for disrupting immune cell activity and methods of use thereof
MA55887A (fr) 2019-05-07 2022-03-16 Modernatx Inc Microarn de cellules immunitaires exprimés de manière différentielle pour la régulation de l'expression de protéines
WO2020227615A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
EP3965797A1 (en) 2019-05-08 2022-03-16 AstraZeneca AB Compositions for skin and wounds and methods of use thereof
SG11202112922WA (en) 2019-05-22 2021-12-30 Massachusetts Inst Technology Circular rna compositions and methods
WO2020243540A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Translate Bio, Inc. Macrocyclic lipids
CA3142608A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Cocoon Biotech Inc. Silk-based products, formulations, and methods of use
JP7241869B2 (ja) * 2019-06-07 2023-03-17 富士フイルム株式会社 脂質組成物
EP3986452A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 CureVac AG Rotavirus mrna vaccine
WO2020257611A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Translate Bio, Inc. Cationic lipids comprising an hydroxy moiety
US20230092238A1 (en) 2019-06-21 2023-03-23 Translate Bio, Inc. Tricine and Citric Acid Lipids
MA56517A (fr) 2019-06-24 2022-04-27 Modernatx Inc Arn messager comprenant des éléments d'arn fonctionnels et leurs utilisations
WO2020263883A1 (en) 2019-06-24 2020-12-30 Modernatx, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
JP2022541740A (ja) 2019-07-08 2022-09-27 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 改善されたｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子、およびそれを作製するプロセス
EP3999097A1 (en) 2019-07-18 2022-05-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for inducing full ablation of hematopoiesis
EP3999642A1 (en) 2019-07-19 2022-05-25 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Recombinase compositions and methods of use
WO2021016430A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Translate Bio, Inc. Stable compositions of mrna-loaded lipid nanoparticles and processes of making
EP4003296A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 ModernaTX, Inc. Compositions and methods for delivery of rna interference agents to immune cells
EP4007812A1 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpin family f member 2 (serpinf2) irna compositions and methods of use thereof
EP4007811A2 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carboxypeptidase b2 (cpb2) irna compositions and methods of use thereof
JP2022543467A (ja) 2019-08-07 2022-10-12 モデルナティエックス インコーポレイテッド 強化された薬剤送達のための組成物及び方法
WO2021030522A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SMALL RIBOSOMAL PROTEIN SUBUNIT 25 (RPS25) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US20220296628A1 (en) 2019-08-14 2022-09-22 Curevac Ag Rna combinations and compositions with decreased immunostimulatory properties
CA3150458A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Improved lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
WO2021034639A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration anti-c5 formulations
CN114929205A (zh) 2019-09-06 2022-08-19 世代生物公司 包括末端封闭式dna和可切割脂质的脂质纳米颗粒组合物及其使用方法
WO2021055833A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CA3148158A1 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 Longcheng Li Nucleic acid molecule for treating thrombocytopenia and use thereof
WO2021055609A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
JP2022548399A (ja) 2019-09-23 2022-11-18 オメガ セラピューティクス， インコーポレイテッド 肝細胞核因子４－アルファ（ＨＮＦ４α）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法
JP2022548320A (ja) 2019-09-23 2022-11-17 オメガ セラピューティクス， インコーポレイテッド アポリポタンパク質ｂ（ａｐｏｂ）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法
JP2022552249A (ja) 2019-10-14 2022-12-15 アストラゼネカ・アクチエボラーグ Ｐｎｐｌａ３発現のモジュレーター
JP2022552378A (ja) 2019-10-15 2022-12-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド パーキンソン病を治療するための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードするｍＲＮＡ
WO2021076828A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Solute carrier family member irna compositions and methods of use thereof
CN115279418A (zh) 2019-10-21 2022-11-01 川斯勒佰尔公司 信使rna的组合物、方法和用途
EP4048793A1 (en) 2019-10-22 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
CN111205994B (zh) * 2019-10-23 2021-09-21 上海市第十人民医院 一株具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用
CN110903998B (zh) * 2019-10-23 2021-09-21 上海市第十人民医院 一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其应用
CN111004738B (zh) * 2019-10-23 2021-09-21 上海市第十人民医院 一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用
JP2022553377A (ja) 2019-10-25 2022-12-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ５関連疾患の治療または予防のための投与レジメン
CA3155921A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. HUNTINGTINE (HTT) TARGETING RNAI AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
KR20220115946A (ko) 2019-11-13 2022-08-19 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오텐시노겐 (agt) 관련 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
CN117417265A (zh) 2019-11-15 2024-01-19 富士胶片株式会社 脂质组合物
WO2021102373A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ataxin3 (atxn3) rnai agent compositions and methods of use thereof
JPWO2021117769A1 (ru) * 2019-12-10 2021-06-17
WO2021117770A1 (ja) * 2019-12-10 2021-06-17 富士フイルム株式会社 医薬組成物及び処置剤
CN115151641A (zh) 2019-12-13 2022-10-04 阿尔尼拉姆医药品有限公司 人类染色体9开放阅读框72(C9ORF72)iRNA剂组合物及其使用方法
WO2021126734A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
IL293890A (en) 2019-12-20 2022-08-01 Curevac Ag Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
JP2023508882A (ja) 2019-12-20 2023-03-06 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの直腸送達
CN115461042A (zh) 2019-12-20 2022-12-09 翻译生物公司 制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法
CN110974954B (zh) * 2019-12-24 2021-03-16 珠海丽凡达生物技术有限公司 一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法
WO2021142245A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Translate Bio, Inc. Compounds, pharmaceutical compositions and methods for modulating expression of muc5b in lung cells and tissues
US20230112857A1 (en) 2020-01-10 2023-04-13 Modernatx, Inc. Methods of making tolerogenic dendritic cells
WO2021146488A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. 4'-o-methylene phosphonate nucleic acids and analogues thereof
CN116133652A (zh) 2020-01-31 2023-05-16 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米粒子的方法
WO2021154941A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
MX2022009460A (es) 2020-02-04 2022-12-16 Curevac Ag Vacuna contra el coronavirus.
BR112022015770A2 (pt) 2020-02-10 2022-10-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para silenciar a expressão de vegf-a
IL295496A (en) 2020-02-18 2022-10-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Apolipoprotein c3 (apoc3) irna preparations and methods of using them
US20210275689A1 (en) 2020-02-25 2021-09-09 Translate Bio, Inc. Processes of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
US20220064638A1 (en) 2020-02-28 2022-03-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating smn2
CA3174708A1 (en) * 2020-03-04 2021-09-10 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted rna delivery
EP4114947A1 (en) 2020-03-05 2023-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
JP2023516095A (ja) 2020-03-06 2023-04-17 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
CA3171219A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
CA3172572A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics
WO2021195218A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing gaucher therapeutics
TW202204615A (zh) 2020-03-26 2022-02-01 美商阿尼拉製藥公司 冠狀病毒ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
US20230226169A1 (en) 2020-04-01 2023-07-20 University Of Florida Research Foundation Incorporated Multilamellar rna nanoparticle vaccine against sars-cov-2
TW202204618A (zh) 2020-04-06 2022-02-01 美商艾爾妮蘭製藥公司 用於靜默myoc表現之組合物及方法
CA3179678A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing scn9a expression
EP4133077A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
WO2021206917A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ANGIOTENSIN-CONVERTING ENZYME 2 (ACE2) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2021222065A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein e (apoe) irna agent compositions and methods of use thereof
JP2023523790A (ja) 2020-04-30 2023-06-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体因子Ｂ（ＣＦＢ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
US20230190954A1 (en) 2020-05-07 2023-06-22 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
CA3177940A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Anusha DIAS Optimized nucleotide sequences encoding sars-cov-2 antigens
US20230181619A1 (en) 2020-05-07 2023-06-15 Translate Bio, Inc. Improved compositions for cftr mrna therapy
US20230173104A1 (en) 2020-05-14 2023-06-08 Modernatx, Inc. Lnp compositions comprising an mrna therapeutic and an effector molecule
US20230226219A1 (en) 2020-05-14 2023-07-20 Translate Bio, Inc. Peg lipidoid compounds
EP4150086A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2)
EP4150076A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2021231698A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate lyase (asl)
EP4150088A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate synthetase (ass1)
WO2021231691A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of retinoschisin 1 (rsi)
WO2021231685A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of transmembrane channel-like protein 1 (tmc1)
WO2021231679A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of gap junction protein beta 2 (gjb2)
AU2021273502A1 (en) 2020-05-15 2023-02-02 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery
EP4150090A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of otoferlin (otof)
IL298282A (en) 2020-05-18 2023-01-01 Max Biology Co Ltd Polymer-lipid compounds and methods of use
CA3179420A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Avak Kahvejian Coronavirus antigen compositions and their uses
WO2021236930A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
WO2021243207A1 (en) 2020-05-28 2021-12-02 Modernatx, Inc. Use of mrnas encoding ox40l, il-23 and il-36gamma for treating cancer
CN116018405A (zh) 2020-05-29 2023-04-25 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 Trem组合物及其相关方法
IL298084A (en) 2020-05-29 2023-01-01 CureVac SE Nucleic acid-based combination vaccines
WO2021243301A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
US20230233475A1 (en) 2020-06-01 2023-07-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
AU2021285812A1 (en) 2020-06-01 2023-01-05 Modernatx, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
US11408000B2 (en) 2020-06-03 2022-08-09 Triplet Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders associated with MSH3 activity
EP4162050A1 (en) 2020-06-09 2023-04-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
JP2023530461A (ja) 2020-06-18 2023-07-18 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
JP2023531511A (ja) 2020-06-23 2023-07-24 モダーナティエックス・インコーポレイテッド 半減期が延長されたｍＲＮＡ治療薬を含むＬＮＰ組成物
WO2022006527A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Maritime Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reverse gene therapy
BR112022027038A2 (pt) 2020-07-08 2023-01-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Vacinas de replicon de rna contra hbv
WO2022011262A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating epilepsy
EP4182332A1 (en) 2020-07-17 2023-05-24 Greenlight Biosciences, Inc. Nucleic acid therapeutics for genetic disorders
EP4189098A1 (en) 2020-07-27 2023-06-07 Anjarium Biosciences AG Compositions of dna molecules, methods of making therefor, and methods of use thereof
WO2022023559A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Curevac Ag Nucleic acid encoded antibody mixtures
EP4192505A1 (en) 2020-08-04 2023-06-14 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Systemic delivery of oligonucleotides
BR112023002071A2 (pt) 2020-08-06 2023-05-02 Modernatx Inc Métodos para preparar nanopartículas lipídicas
WO2022043551A2 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Curevac Ag Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
JP2023542492A (ja) 2020-09-03 2023-10-10 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー 免疫原性組成物及びその使用
EP4212162A4 (en) 2020-09-14 2024-02-28 Fujifilm Corp LIPID COMPOSITION
BR112023005269A2 (pt) 2020-09-23 2023-04-25 Translate Bio Inc Lipídios catiônicos à base de tes
AU2021349262A1 (en) 2020-09-23 2023-06-08 Translate Bio, Inc. Piperazine-based cationic lipids
EP4217489A1 (en) 2020-09-24 2023-08-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) irna compositions and methods of use thereof
WO2022067091A1 (en) * 2020-09-25 2022-03-31 DNARx Systems and methods for expressing biomolecules in a subject
WO2022076291A1 (en) 2020-10-05 2022-04-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. G protein-coupled receptor 75 (gpr75) irna compositions and methods of use thereof
WO2022074541A1 (en) 2020-10-05 2022-04-14 Max Biology Co. Ltd. Cannabinoid-containing compositions and use for treating and preventing diseases
US20230372440A1 (en) 2020-10-06 2023-11-23 Translate Bio, Inc. Improved process and formulation of lipid nanoparticles
US20230365995A1 (en) 2020-10-07 2023-11-16 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
JP2023545128A (ja) 2020-10-12 2023-10-26 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を製造する改善された方法
US20220133631A1 (en) 2020-10-12 2022-05-05 Translate Bio, Inc. Process of preparing ice-based lipid nanoparticles
AU2021365822A1 (en) 2020-10-21 2023-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria
EP4232582A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin 5b (muc5b) irna compositions and methods of use thereof
JP2023548587A (ja) 2020-11-09 2023-11-17 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド コドン最適化したｍＲＮＡの送達のための改善された組成物
EP4243776A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
IL302709A (en) 2020-11-13 2023-07-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Coagulation factor iRNA compositions (F5) and methods of using them
US11447521B2 (en) 2020-11-18 2022-09-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
JP2023550644A (ja) 2020-11-25 2023-12-04 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 安定な液状脂質ナノ粒子製剤
WO2022112855A1 (en) 2020-11-27 2022-06-02 Guangzhou Ribobio Co., Ltd Lipid compound and the composition thereof
EP4025556A4 (en) 2020-11-27 2023-08-09 Guangzhou Ribobio Co., Ltd LIPID COMPOUND AND ITS COMPOSITION
US20230015616A1 (en) 2020-11-30 2023-01-19 Argorna Pharmaceuticals Ltd Coronavirus vaccines and uses thereof
WO2022119873A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
EP4259795A1 (en) 2020-12-08 2023-10-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coagulation factor x (f10) irna compositions and methods of use thereof
GB2603454A (en) 2020-12-09 2022-08-10 Ucl Business Ltd Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
CA3171051A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants
EP4267732A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions of modified trems and uses thereof
CA3203442A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Arcturus Therapeutics, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
WO2022150260A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT 9 (C9) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP4277929A1 (en) 2021-01-14 2023-11-22 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
WO2022162027A2 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Curevac Ag Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
EP4289814A1 (en) 2021-02-04 2023-12-13 Shionogi & Co., Ltd Cationic lipid
CN117157101A (zh) 2021-02-08 2023-12-01 德克萨斯大学系统董事会 不饱和的树枝状聚合物组合物、有关的制剂、及其使用方法
WO2022174079A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Modernatx, Inc. Lnp compositions comprising payloads for in vivo therapy
TW202305131A (zh) 2021-02-12 2023-02-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 用於治療或預防超氧歧化酶１－（ＳＯＤ１－）相關的神經退化疾病的超氧歧化酶１（ＳＯＤ１）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
JP2024509783A (ja) 2021-02-25 2024-03-05 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド プリオンタンパク質（ｐｒｎｐ）ｉｒｎａ組成物およびその使用方法
KR20230152014A (ko) 2021-02-26 2023-11-02 에트리스 게엠베하 에어로졸 형성을 위한 제형 및 핵산 전달을 위한 에어로졸
BR112023016645A2 (pt) 2021-02-26 2023-11-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de ceto-hexoquinase (khk) e métodos de uso das mesmas
TW202302849A (zh) 2021-03-04 2023-01-16 美商艾拉倫製藥股份有限公司 類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP4305169A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
EP4314260A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
WO2022204371A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
WO2022204380A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
WO2022204549A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Translate Bio, Inc. Optimized nucleotide sequences encoding the extracellular domain of human ace2 protein or a portion thereof
KR20230160872A (ko) 2021-03-26 2023-11-24 미나 테라퓨틱스 리미티드 Tmem173 sarna 조성물 및 사용 방법
CN117377491A (zh) 2021-03-26 2024-01-09 葛兰素史克生物有限公司 免疫原性组合物
AR125230A1 (es) 2021-03-29 2023-06-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSICIONES DE AGENTES DE ARNi CONTRA HUNTINGTINA (HTT) Y SUS MÉTODOS DE USO
CA3171429A1 (en) 2021-03-31 2022-09-30 Alexander SCHWENGER Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna
KR20230165276A (ko) 2021-03-31 2023-12-05 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션 폴리펩티드 및 암의 치료에서의 이의 용도
WO2022212711A2 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Modernatx, Inc. Methods for identification and ratio determination of rna species in multivalent rna compositions
EP4314293A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
TW202309002A (zh) 2021-04-15 2023-03-01 美商轉譯生技公司 基於「古德」緩衝液的陽離子脂質
WO2022225918A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Translate Bio, Inc. Improved compositions for delivery of mrna
WO2022223556A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding amylo-alpha-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase, methods of making thereof, and methods of use thereof
US20220370616A1 (en) 2021-04-23 2022-11-24 Modernatx, Inc. Stabilized formulations
TW202308658A (zh) 2021-04-23 2023-03-01 美商現代公司 異喹啉穩定之脂質奈米粒子調配物
TW202309280A (zh) 2021-04-26 2023-03-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 跨膜絲胺酸蛋白酶６（ＴＭＰＲＳＳ６）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
IL308404A (en) 2021-04-27 2024-01-01 Generation Bio Co Non-viral DNA vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
EP4329884A1 (en) 2021-04-27 2024-03-06 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
EP4329731A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 ModernaTX, Inc. Lyophilization methods for preparing lipid formulated therapeutics
EP4330396A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (stat6) irna compositions and methods of use thereof
WO2022233880A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Curevac Ag Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
WO2022240806A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Modernatx, Inc. Non-viral delivery of dna for prolonged polypeptide expression in vivo
EP4341401A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
WO2022246020A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
WO2022246023A1 (en) 2021-05-20 2022-11-24 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
CN113546180A (zh) * 2021-05-25 2021-10-26 重庆医科大学 一种具有心肌靶向性的基因递送载体及其制备方法
EP4347554A1 (en) * 2021-05-28 2024-04-10 Nanovation Therapeutics Inc. Mc3-type lipids and use thereof in the preparation of lipid nanoparticles
WO2022256283A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
WO2022256395A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
AU2022283796A1 (en) 2021-06-04 2023-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. HUMAN CHROMOSOME 9 OPEN READING FRAME 72 (C9ORF72) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
AR126070A1 (es) 2021-06-08 2023-09-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para tratar o prevenir la enfermedad de stargardt y/o trastornos asociados con la proteína transportadora de retinol 4 (rbp4)
WO2022260772A1 (en) * 2021-06-09 2022-12-15 Carnegie Mellon University Lipid nanoparticle formulations for gastrointestinal delivery
EP4355882A2 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
KR102516680B1 (ko) * 2021-06-24 2023-04-03 주식회사 테르나테라퓨틱스 지질 나노 입자 및 그 제조방법
WO2022270941A1 (ko) * 2021-06-24 2022-12-29 주식회사 테르나테라퓨틱스 지질 나노 입자 및 그 제조방법
WO2023278410A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
US20230194709A9 (en) 2021-06-29 2023-06-22 Seagate Technology Llc Range information detection using coherent pulse sets with selected waveform characteristics
KR20240026203A (ko) 2021-06-30 2024-02-27 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오텐시노겐(agt)-관련 장애를 치료하는 방법 및 조성물
WO2023278754A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Translate Bio, Inc. Compositions for delivery of mrna
AU2022301302A1 (en) 2021-07-01 2024-01-25 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023283403A2 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bis-rnai compounds for cns delivery
WO2023287751A1 (en) 2021-07-12 2023-01-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
IL309897A (en) 2021-07-21 2024-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Target gene IRNA compositions associated with a metabolic disorder and methods of using them
WO2023003995A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Beta-catenin (ctnnb1) irna compositions and methods of use thereof
WO2023009547A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and uses thereof
AU2022318949A1 (en) 2021-07-27 2024-02-29 Stand Therapeutics Co., Ltd. Peptide tag and nucleic acid encoding same
WO2023009499A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase for the treatment of glycogen storage disease type 1a (gsd1a)
WO2023009687A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa reductase (hmgcr) irna compositions and methods of use thereof
AU2022318664A1 (en) 2021-07-30 2024-02-29 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
CA3171750A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tim SONNTAG Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
WO2023014649A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Modernatx, Inc. Extraction-less reverse phase (rp) chromatography of mrna encapsulated in lipid nanoparticles for mrna purity assessment
TW202328445A (zh) 2021-08-03 2023-07-16 美商艾拉倫製藥股份有限公司 甲狀腺素運載蛋白（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
CA3228255A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing angiotensinogen (agt)
WO2023015261A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Modernatx, Inc. Mrnas encoding chimeric metabolic reprogramming polypeptides and uses thereof
WO2023014974A1 (en) 2021-08-06 2023-02-09 University Of Iowa Research Foundation Double stranded mrna vaccines
WO2023018773A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulations and methods of synthesis thereof
WO2023019181A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 lipid nanoparticle vaccine formulations
AU2022328347A1 (en) 2021-08-13 2024-02-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Factor xii (f12) irna compositions and methods of use thereof
IL309505A (en) 2021-09-03 2024-02-01 CureVac SE Lipid nanoparticles for nucleic acid delivery
AU2022336664A1 (en) 2021-09-03 2024-01-18 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine
WO2023031855A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
WO2023044370A2 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing complement component 3 (c3)
WO2023044006A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
AU2022345881A1 (en) 2021-09-20 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Inhibin subunit beta e (inhbe) modulator compositions and methods of use thereof
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
WO2023056401A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Rna formulations for high volume distribution, and methods of using the same for treating a disease or condition caused by or associated with human cytomegalovirus
WO2023064469A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Modernatx, Inc. Compositions of mrna-encoded il15 fusion proteins and methods of use thereof
AU2022364838A1 (en) 2021-10-15 2024-04-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extra-hepatic delivery irna compositions and methods of use thereof
WO2023069397A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2023069895A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Modernatx, Inc. Markerless dna production
CA3234835A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for disrupting nrf2-keap1 protein interaction by adar mediated rna editing
WO2023073534A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Astrazeneca Ab Novel lipids for delivery of nucleic acid segments
WO2023076450A2 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. HUNTINGTIN (HTT) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CA3234636A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b (cfb) irna compositions and methods of use thereof
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
WO2023077170A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding integrin beta-6 and methods of use thereof
WO2023081526A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Orna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions for delivering circular polynucleotides
KR20230068047A (ko) 2021-11-10 2023-05-17 주식회사 에스엠엘바이오팜 트레할로즈 유도체 및 신규 구조 유지 화합물을 포함하는 핵산 의약품 전달용 지질나노입자의 약학 조성물
WO2023086893A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
WO2023092060A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Cornell University Microrna-dependent mrna switches for tissue-specific mrna-based therapies
WO2023089522A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Astrazeneca Ab Novel lipids for delivery of nucleic acid segments
WO2023092151A1 (en) * 2021-11-22 2023-05-25 Ohio State Innovation Foundation Compositions and methods for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2023096963A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
WO2023096990A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovation Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
WO2023097003A2 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and their uses
WO2023099884A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Mina Therapeutics Limited Pax6 sarna compositions and methods of use
WO2023107999A2 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus mrna vaccines
GB202117758D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Ucl Business Ltd Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2023114307A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Modernatx, Inc. Determination of encapsulation efficiency of lipid nanoparticles
WO2023114889A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticles
WO2023122745A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2023122762A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Camp4 Therapeutics Corporation Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
WO2023122789A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
CN114044741B (zh) 2022-01-13 2022-04-15 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
WO2023135298A1 (en) 2022-01-17 2023-07-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing cell death of a population of solid tumor cells
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
WO2023147090A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023152365A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of the 15-lipoxygenase for the treatment of lymphedema
WO2023159197A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Modernatx, Inc. Mrnas encoding checkpoint cancer vaccines and uses thereof
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2023170435A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Mina Therapeutics Limited Il10 sarna compositions and methods of use
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
TW202345835A (zh) 2022-03-16 2023-12-01 美商轉譯生技公司 非對稱的基於哌嗪之陽離子脂質
WO2023177904A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Modernatx, Inc. Sterile filtration of lipid nanoparticles and filtration analysis thereof for biological applications
WO2023183909A2 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023193002A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Modernatx, Inc. Cross mixers for lipid nanoparticle production, and methods of operating the same
WO2023196399A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding argininosuccinate lyase for the treatment of argininosuccinic aciduria
WO2023196988A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Modernatx, Inc. Methods of use of mrnas encoding il-12
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023200893A1 (en) * 2022-04-13 2023-10-19 Oregon State University Small molecule enhancers of antisense oligo activity
WO2023198857A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Sanofi "good" buffer-based cationic lipids
WO2023201296A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Modernatx, Inc. Ribosomal engagement potency assay
WO2023212696A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Modernatx, Inc. Lyophilized human cytomegalovirus vaccines
WO2023215498A2 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Modernatx, Inc. Compositions and methods for cd28 antagonism
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
WO2023220734A2 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Bisphosphonate lipids, lipid nanoparticle compositions comprising the same, and methods of use thereof for targeted delivery
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2023230601A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Beam Therapeutics Inc. Identification of nanoparticles for preferential tissue or cell targeting
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2023240277A2 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Camp4 Therapeutics Corporation Methods of modulating progranulin expression using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
CN117263818A (zh) * 2022-06-14 2023-12-22 杭州高田生物医药有限公司 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
WO2024007020A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Indapta Therapeutics, Inc. Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024015890A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Modernatx, Inc. Norovirus mrna vaccines
WO2024023034A1 (en) 2022-07-25 2024-02-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of apelin for the treatment of lymphedema
WO2024026254A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
WO2024026482A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions comprising surface lipid derivatives and related uses
WO2024026475A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Compositions for delivery to hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) and related uses
WO2024026487A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions comprising phospholipid derivatives and related uses
WO2024030369A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Modernatx, Inc. Extraction-less reverse phase (rp) chromatography for mrna purity assessment
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024039776A2 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Universal non-targeting sirna compositions and methods of use thereof
WO2024040254A2 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024044147A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 Modernatx, Inc. Methods for purification of ionizable lipids
EP4327829A1 (en) 2022-08-26 2024-02-28 Ethris GmbH Stabilization of lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024042236A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Ethris Gmbh Stable lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024050483A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines and uses thereof
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2024059165A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (hsd17b13) irna compositions and methods of use thereof
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
WO2024064931A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of liver stage antigens and related methods
WO2024064934A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium csp antigens and related methods
WO2024063788A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024063789A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024068545A1 (en) 2022-09-26 2024-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030229037A1 (en) * 2000-02-07 2003-12-11 Ulrich Massing Novel cationic amphiphiles
US20040009216A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-15 Rodrigueza Wendi V. Compositions and methods for dosing liposomes of certain sizes to treat or prevent disease
US20050170508A1 (en) * 1999-04-23 2005-08-04 Shi-Kun Huang Gene delivery mediated by liposome-DNA complex with cleavable PEG surface modification
US20090023673A1 (en) * 2006-10-03 2009-01-22 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations

Family Cites Families (235)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5218A (en) 1847-08-07 Improvement in plows
US105A (en) 1836-12-15 knight
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3993754A (en) 1974-10-09 1976-11-23 The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy
US4086257A (en) 1976-10-12 1978-04-25 Sears Barry D Phosphatidyl quaternary ammonium compounds
CH624011A5 (ru) 1977-08-05 1981-07-15 Battelle Memorial Institute
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4522803A (en) 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4588578A (en) 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5008050A (en) 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
AU587989B2 (en) 1984-10-16 1989-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
DE3688418T2 (de) 1985-02-13 1993-08-26 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
JP3022967B2 (ja) 1985-03-15 2000-03-21 アンチバイラルズ インコーポレイテッド 立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマー
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
AU6522486A (en) 1985-10-04 1987-04-24 Biotechnology Research Partners Limited Recombinant apolipoproteins and methods
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
GB8712540D0 (en) 1987-05-28 1987-07-01 Ucb Sa Expression of human proapolipoprotein a-i
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5149782A (en) 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
GB8822492D0 (en) 1988-09-24 1988-10-26 Considine J Apparatus for removing tumours from hollow organs of body
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US4927637A (en) 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4957773A (en) 1989-02-13 1990-09-18 Syracuse University Deposition of boron-containing films from decaborane
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5182364A (en) 1990-02-26 1993-01-26 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of apolipoprotein E
US5177189A (en) 1989-08-18 1993-01-05 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of Apolipoprotein E
US5473039A (en) 1989-08-18 1995-12-05 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of apolipoprotein E, diagnostic systems and methods using the analogs
US5168045A (en) 1989-08-18 1992-12-01 The Scripps Research Institute Diagnostic systems and methods using polypeptide analogs of apolipoprotein e
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
JP3058686B2 (ja) 1989-08-31 2000-07-04 シティ・オブ・ホープ キメラｄｎａ―ｒｎａ触媒活性配列
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
EP0497875B1 (en) 1989-10-24 2000-03-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DK0455905T3 (da) 1990-05-11 1998-12-07 Microprobe Corp Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider
US6365730B1 (en) 1990-06-19 2002-04-02 Gene Shears Pty. Limited DNA-Armed ribozymes and minizymes
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5614617A (en) 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
MY107332A (en) 1990-08-03 1995-11-30 Sterling Drug Inc Compounds and methods for inhibiting gene expression.
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5789573A (en) 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
US5596086A (en) 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
ES2061416T3 (es) 1990-10-12 1997-03-01 Max Planck Gesellschaft Ribozimas modificadas.
EP0556301B1 (en) 1990-11-08 2001-01-10 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
WO1993000443A1 (en) 1991-06-26 1993-01-07 Bio-Technology General Corp. Purification of recombinant apolipoprotein e from bacteria
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
SE9103701D0 (sv) 1991-12-13 1991-12-13 Kabi Pharmacia Ab Apolipoprotein
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
EP0642589A4 (en) 1992-05-11 1997-05-21 Ribozyme Pharm Inc METHOD AND REAGENT TO INHIBIT VIRAL REPLICATION.
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US6372886B1 (en) 1992-06-23 2002-04-16 Arch Development Corp. Expression and purification of kringle domains of human apolipoprotein (a) in E. coli
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
SE9203753D0 (sv) 1992-12-11 1992-12-11 Kabi Pharmacia Ab Expression system for producing apolipoprotein ai-m
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
JPH08508491A (ja) 1993-03-31 1996-09-10 スターリング ウインスロップ インコーポレイティド ホスホジエステル結合をアミド結合に置き換えたオリゴヌクレオチド
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5532130A (en) 1993-07-20 1996-07-02 Dyad Pharmaceutical Corporation Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides
DE69433036T2 (de) 1993-09-03 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Aminoderivatisierte nukleoside und oligonukleoside
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5591317A (en) 1994-02-16 1997-01-07 Pitts, Jr.; M. Michael Electrostatic device for water treatment
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
KR100357839B1 (ko) 1994-03-07 2003-08-02 더 다우 케미칼 캄파니 생체활성및/또는표적화된덴드리머콘쥬게이트
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
JP3754072B2 (ja) 1994-03-22 2006-03-08 リサーチ・コーポレーション・テクノロジーズ・インコーポレーテッド 摂食抑制ペプチド
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5534499A (en) 1994-05-19 1996-07-09 The University Of British Columbia Lipophilic drug derivatives for use in liposomes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
WO1996010585A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Inex Pharmaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
AU3889595A (en) 1994-10-05 1996-05-02 Amgen, Inc. Method for inhibiting smooth muscle cell proliferation and oligonucleotides for use therein
US5783683A (en) 1995-01-10 1998-07-21 Genta Inc. Antisense oligonucleotides which reduce expression of the FGFRI gene
SE9500778D0 (sv) 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
US5747470A (en) 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to gp130 mRNA
EP1489184A1 (en) 1995-06-07 2004-12-22 Inex Pharmaceutical Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5672685A (en) 1995-10-04 1997-09-30 Duke University Source of apolipoprotein E and method of isolating apolipoprotein E
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
US6037323A (en) 1997-09-29 2000-03-14 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6046166A (en) 1997-09-29 2000-04-04 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6004925A (en) 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
AU756196B2 (en) 1998-11-13 2003-01-09 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
AU1830200A (en) * 1998-11-25 2000-06-13 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2001015726A2 (en) 1999-08-27 2001-03-08 Inex Pharmaceuticals Corp. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US6395437B1 (en) 1999-10-29 2002-05-28 Advanced Micro Devices, Inc. Junction profiling using a scanning voltage micrograph
NZ522045A (en) 2000-03-30 2007-05-31 Whitehead Biomedical Inst RNA sequence-specific mediators of RNA interference
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
ES2728168T3 (es) 2000-12-01 2019-10-22 Max Planck Gesellschaft Moléculas pequeñas de ARN que median en la interferencia de ARN
EP1985702A3 (en) 2000-12-08 2010-08-18 Coley Pharmaceutical GmbH CPG-like nucleic acids and methods of use thereof
US7887431B2 (en) 2008-05-16 2011-02-15 Taylor Made Golf Company, Inc. Golf club
EP1781593B1 (en) * 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
US9005654B2 (en) 2005-07-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
EP1986697B1 (en) 2006-02-17 2016-06-29 GE Healthcare Dharmacon, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene silencing by rna interference
WO2008036825A2 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
CA3044134A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
WO2009132131A1 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
WO2010042877A1 (en) 2008-10-09 2010-04-15 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
US8168775B2 (en) * 2008-10-20 2012-05-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
CA2743139C (en) * 2008-11-10 2019-04-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
US20120149875A1 (en) * 2009-01-12 2012-06-14 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Affinity chromatography matrix
US20100285112A1 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Tatiana Novobrantseva Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
TR201811076T4 (tr) * 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
DE102009039097B3 (de) 2009-08-27 2010-11-25 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zum Übertragen von Daten in einem Sensornetzwerk, Sensorknoten und Zentral-Rechner
WO2011141704A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
US8315599B2 (en) 2010-07-09 2012-11-20 Telecommunication Systems, Inc. Location privacy selector
US10867398B2 (en) 2017-11-21 2020-12-15 Reliance Core Consulting LLC Methods, systems, apparatuses and devices for facilitating motion analysis in an environment
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050170508A1 (en) * 1999-04-23 2005-08-04 Shi-Kun Huang Gene delivery mediated by liposome-DNA complex with cleavable PEG surface modification
US20030229037A1 (en) * 2000-02-07 2003-12-11 Ulrich Massing Novel cationic amphiphiles
US20040009216A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-15 Rodrigueza Wendi V. Compositions and methods for dosing liposomes of certain sizes to treat or prevent disease
US20090023673A1 (en) * 2006-10-03 2009-01-22 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hayes et al. Genospheres self-assembling nucleic acid-lipid nanoparticles suitable for targeted gene delivery Gene Therapy 2005, 13 646-651, pg. 648, right col., para 2 to pg. 649, left col., para 1 and pg. 648, fig. 1C *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2815001C2 (ru) * 2018-08-14 2024-03-11 Этрис Гмбх Составы на основе липидов для доставки рнк

Also Published As

Publication number Publication date
NZ622843A (en) 2015-10-30
KR20190065474A (ko) 2019-06-11
KR20170091798A (ko) 2017-08-09
PT3431076T (pt) 2021-10-26
JP6132321B2 (ja) 2017-05-24
LT2440183T (lt) 2018-08-10
NZ712719A (en) 2017-03-31
KR20220038506A (ko) 2022-03-28
CN102625696A (zh) 2012-08-01
KR102205886B1 (ko) 2021-01-21
CY1120641T1 (el) 2019-12-11
EA201791744A2 (ru) 2018-03-30
MX367665B (es) 2019-08-30
EA201791744A3 (ru) 2018-07-31
JP6592144B2 (ja) 2019-10-16
CN102625696B (zh) 2015-06-03
SG10201912450XA (en) 2020-03-30
AU2010259984B2 (en) 2017-03-09
US20170143631A1 (en) 2017-05-25
HUE056773T2 (hu) 2022-03-28
PL2440183T3 (pl) 2019-01-31
IL216876A0 (en) 2012-02-29
AU2010259984A1 (en) 2012-01-12
CN104873464A (zh) 2015-09-02
JP2017122126A (ja) 2017-07-13
KR20230098713A (ko) 2023-07-04
US8158601B2 (en) 2012-04-17
US9394234B2 (en) 2016-07-19
EP2440183A1 (en) 2012-04-18
KR20210008938A (ko) 2021-01-25
JP6359719B2 (ja) 2018-07-18
PL3431076T3 (pl) 2022-01-31
EP2440183A4 (en) 2013-02-27
ES2901627T3 (es) 2022-03-23
JP2018141019A (ja) 2018-09-13
JP2012530059A (ja) 2012-11-29
CA3014827A1 (en) 2010-12-16
WO2010144740A1 (en) 2010-12-16
US20120183602A1 (en) 2012-07-19
PT2440183T (pt) 2018-10-30
LT3431076T (lt) 2021-10-25
HRP20211619T1 (hr) 2022-02-04
EA201690312A1 (ru) 2016-08-31
SI3431076T1 (sl) 2022-04-29
SG176786A1 (en) 2012-01-30
AU2021201228A1 (en) 2021-03-11
JP5819291B2 (ja) 2015-11-24
CA2764609C (en) 2018-10-02
AU2017202702B2 (en) 2019-05-02
EA024960B1 (ru) 2016-11-30
KR101987962B1 (ko) 2019-06-11
CA2764609A1 (en) 2010-12-16
IL290077A (en) 2022-03-01
AU2019204984B2 (en) 2021-01-28
ES2689168T3 (es) 2018-11-08
MX2011013320A (es) 2012-02-28
AU2017202702A1 (en) 2017-05-18
EP2440183B1 (en) 2018-07-18
IL244945B (en) 2020-06-30
SI2440183T1 (sl) 2018-10-30
SG10201403054SA (en) 2014-10-30
NZ596958A (en) 2014-04-30
JP2015232048A (ja) 2015-12-24
US8802644B2 (en) 2014-08-12
EA201190306A1 (ru) 2013-01-30
KR20120081065A (ko) 2012-07-18
IL274826A (en) 2020-07-30
DK2440183T3 (en) 2018-10-01
EP3431076A1 (en) 2019-01-23
IL244945A0 (en) 2016-05-31
AU2019204984A1 (en) 2019-08-01
MX342785B (es) 2016-10-12
AU2021201228B2 (en) 2022-07-07
HUE038796T2 (hu) 2018-11-28
MX2019010340A (es) 2019-10-14
US20100324120A1 (en) 2010-12-23
KR20200006176A (ko) 2020-01-17
CN104873464B (zh) 2018-06-22
IL216876A (en) 2016-04-21
KR102374518B1 (ko) 2022-03-16
TR201811076T4 (tr) 2018-08-27
EP3431076B1 (en) 2021-10-06
US20150166465A1 (en) 2015-06-18
DK3431076T3 (da) 2021-12-20
HRP20181221T1 (hr) 2018-10-05
KR102066189B1 (ko) 2020-01-14
KR101766408B1 (ko) 2017-08-10
CY1124769T1 (el) 2022-11-25
HK1212620A1 (zh) 2016-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA028860B1 (ru) Улучшенная липидная композиция
JP2021020928A (ja) 標的化脂質
JP2020172500A (ja) 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物
JP2011517676A (ja) インビボでｒｎａ干渉を媒介するための組成物および方法
CHEN et al. Patent 2764609 Summary