CN116133652A - 制备脂质纳米粒子的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了产生脂质纳米粒子(LNP)配制物的方法及其所产生的LNP配制物。本公开还提供了与所产生的LNP配制物相关的治疗和诊断用途。

Description

制备脂质纳米粒子的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月31日提交的美国临时申请第62/968,337号的优先权和权益，所述临时申请的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本公开提供了产生核酸脂质纳米粒子(LNP)的新颖方法、其所产生的配制物以及相关治疗和/或诊断用途，诸如涉及核酸脂质纳米粒子以向哺乳动物细胞或器官递送一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)和/或在哺乳动物细胞或器官中产生多肽的方法。
背景技术
有效地靶向递送诸如小分子药物、蛋白质和核酸的生物活性物质代表了一项持续的医学挑战。特别是，由于此类物质的相对不稳定性和低细胞渗透性，使得核酸至细胞的递送变得困难。因此，需要开发促进将诸如核酸的治疗剂和预防剂递送至细胞的方法和组合物。
已证明含脂质的纳米粒子或脂质纳米粒子、脂质体和脂质体复合物有效地作为诸如小分子药物、蛋白质和核酸的生物活性物质转运至细胞和/或细胞内隔室中的媒介物。尽管多种此类含脂质的纳米粒子已得到证实，但仍缺乏安全性、功效和特异性的改进。
发明内容
在一些方面，本公开提供了一种制备空脂质纳米粒子(空LNP)的方法，所述方法包括：
i)混合步骤，所述混合步骤包括使可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成所述空LNP，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开提供了一种制备空脂质纳米粒子(空LNP)的方法，所述方法包括：
i)混合步骤，所述混合步骤包括使可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成所述空LNP。
在一些实施方案中，所述混合步骤包括使包含所述可离子化脂质的脂质溶液与包含所述第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)。
在一些方面，本公开提供了一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开提供了一种包含空LNP的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开提供了一种制备与核酸缔合的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：
ii)装载步骤，所述装载步骤包括使核酸与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种制备与核酸缔合的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：
i)混合步骤，所述混合步骤包括使可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成所述空LNP；以及
ii)装载步骤，所述装载步骤包括使核酸与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种制备包含核酸的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：
ii)装载步骤，所述装载步骤包括使核酸与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种制备包含核酸的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：
i)混合步骤，所述混合步骤包括使可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成所述空LNP；以及
ii)装载步骤，所述装载步骤包括使核酸与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种制备包含治疗剂的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：
ii)装载步骤，所述装载步骤包括使治疗剂与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种制备包含治疗剂的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：
i)混合步骤，所述混合步骤包括使可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成所述空LNP；以及
ii)装载步骤，所述装载步骤包括使治疗剂与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
在一些实施方案中，所述装载步骤包括使包含所述核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含负载LNP的负载脂质纳米粒子溶液(负载LNP溶液)。
在一些方面，本公开的方法还包括：
iii)处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液，由此形成脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)。
在一些方面，本公开提供了一种通过本公开的方法制备的空LNP。
在一些方面，本公开提供了一种通过本公开的方法制备的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种通过本公开的方法制备的负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种通过本公开的方法制备的负载LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种通过本公开的方法制备的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供了一种包含本公开的脂质纳米粒子(LNP)的制剂。
在一些方面，本公开提供了一种包含本公开的脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP基本上不含治疗剂或预防剂，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。在一些方面，本公开提供了一种包含本公开的脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP基本上不含核酸，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
在一些方面，本公开提供了一种包含本公开的脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP不含有治疗剂或预防剂，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。在一些实施方案中，本公开提供了一种包含本公开的脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP不含有核酸，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
在一些方面，本公开提供了一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中
(a)所述LNP包含：
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP基本上不含治疗剂或预防剂；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
在一些方面，本公开提供了一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中
(a)所述LNP包含：
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP基本上不含核酸；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
在一些方面，本公开提供了一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中
(a)所述LNP包含：
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP不含有治疗剂或预防剂；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
在一些方面，本公开提供了一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中
(a)所述LNP包含：
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP不含有核酸；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的负载LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的负载LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供了负载LNP在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供了负载LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物。例如，在一些实施方案中，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含空LNP或空LNP溶液。例如，在一些实施方案中，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物。在一些实施方案中，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含LNP配制物。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含含有负载LNP的药剂。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含药剂，所述药剂包含含有脂质纳米粒子(LNP)的制剂。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含空LNP和核酸溶液。在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含空LNP溶液和核酸溶液。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含：
(a)第一容器，所述第一容器包含前述实施方案中任一项所述的空LNP；和
(b)第二容器，所述第二容器包含含有治疗剂或预防剂的溶液。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包含：
(a)第一容器，所述第一容器包含前述实施方案中任一项所述的空LNP；
(b)第二容器，所述第二容器包含含有治疗剂或预防剂的溶液；和
(c)用于使所述第一容器和所述第二容器的内容物组合(例如，混合)的说明。
在一些实施方案中，所述第一容器为聚四氟乙烯(PTFE)袋。在一些实施方案中，所述第二容器为聚四氟乙烯(PTFE)袋。在一些实施方案中，所述第三容器为聚四氟乙烯(PTFE)袋。
在一些方面，本公开提供了一种包含本公开的空LNP的容器。在一些实施方案中，所述容器为聚四氟乙烯(PTFE)袋。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在本公开的实践或测试中可使用类似或等同于本文所述的那些方法和材料的方法和材料，但下面描述合适的方法和材料。本文所提及的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并非旨在进行限制。
本公开的其他特征和优势将从以下具体实施方案和权利要求显而易知。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在要求并且支付必要费用后由专利局提供。
图1是展示负载LNP的直径随PEG添加的mol％变化的图表。
图2是示出制备包含空LNP的空LNP溶液的一般过程的图。
图3是示出由包含空LNP的空LNP溶液制备LNP配制物的一般过程的图。
图4是示出制备LNP配制物的一般过程的图。
具体实施方式
本公开部分地基于以下发现：如本文所公开的产生脂质纳米粒子(LNP)或脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)的方法可影响和/或规定这些脂质纳米粒子内的某些组分的分布，并且此分布可影响和/或规定脂质纳米粒子的物理(例如稳定性)和/或生物(例如功效、细胞内递送、免疫原性)特性。
在一些实施方案中，本公开方法减轻所产生的脂质纳米粒子(LNP)或脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)的非所需特性变化。在一些实施方案中，如与通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP或LNP配制物相比，本公开方法减轻所产生的脂质纳米粒子(LNP)或脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)的非所需特性变化。
在一些实施方案中，非所需特性变化是由脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)或脂质纳米粒子(LNP)上的应力引起的。在一些实施方案中，所述应力是在产生、纯化、包装、储存、运输和/或使用脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)或脂质纳米粒子期间诱导的。在一些实施方案中，所述应力是热、剪切、过度搅拌、膜浓度极化(电荷状态变化)、脱水、冷冻应力、干燥应力、冷冻/解冻应力和/或喷雾应力。在一些实施方案中，所述应力是在储存脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)或脂质纳米粒子(LNP)期间诱导的。
在一些实施方案中，非所需特性变化是LNP配制物的物理稳定性的降低。在一些实施方案中，非所需特性变化是LNP配制物中的杂质和/或亚可见粒子的量的增加，或LNP的平均大小的增加。
在一些实施方案中，非所需特性变化是LNP配制物的化学稳定性的降低。在一些实施方案中，非所需特性变化是LNP配制物中的核酸(例如RNA(例如mRNA))的完整性的降低。
在一些实施方案中，非所需特性变化是LNP配制物的生物特性的降低。在一些实施方案中，非所需特性变化是LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性的降低。
在一些实施方案中，如与通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP配制物相比，通过本公开方法产生的LNP配制物更稳定(例如，LNP的平均大小不随时间增加)。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP的平均直径是通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP配制物的平均LNP直径的约99％或更低、约98％或更低、约97％或更低、约96％或更低、约95％或更低、约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、约50％或更低、约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低或约10％或更低。
在一些实施方案中，本公开的脂质纳米粒子(LNP)具有约15nm至约150nm、约20nm至约125nm、约25nm至约100nm、约30nm至约80nm、约35nm至约70nm、约40nm至约60nm或约45nm至约50nm的平均直径。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的空LNP的平均直径是通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的空LNP的平均直径的约99％或更低、约98％或更低、约97％或更低、约96％或更低、约95％或更低、约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、约50％或更低、约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低或约10％或更低。
在一些实施方案中，本公开的空LNP具有约15nm至约150nm、约20nm至约125nm、约25nm至约100nm、约30nm至约80nm、约35nm至约70nm、约40nm至约60nm或约45nm至约50nm的平均直径。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性高于通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性比通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性高约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高或约90％或更高。在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性比通过不同方法产生的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性高约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约10倍或更高、约20倍或更高、约30倍或更高、约40倍或更高、约50倍或更高、约100倍或更高、约200倍或更高、约300倍或更高、约400倍或更高、约500倍或更高、约1000倍或更高、约2000倍或更高、约3000倍或更高、约4000倍或更高、约5000倍或更高或约10000倍或更高。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物展现比通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)高的核酸表达(例如mRNA表达)。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物展现比通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)高约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高或约90％或更高的核酸表达(例如mRNA表达)。在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物展现比通过不同方法产生的LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)高约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约10倍或更高、约20倍或更高、约30倍或更高、约40倍或更高、约50倍或更高、约100倍或更高、约200倍或更高、约300倍或更高、约400倍或更高、约500倍或更高、约1000倍或更高、约2000倍或更高、约3000倍或更高、约4000倍或更高、约5000倍或更高或约10000倍或更高的核酸表达(例如mRNA表达)。
本发明提供了新颖“床边(bedside)”和/或“定点照护(point-of-care)”配制物，由此mRNA可囊封于早期制备的且在制备时不包含治疗剂的囊泡(例如，空LNP)内。此产生模式在临床供应的背景中具有优势，因为这些囊泡(例如，空LNP)可在临床环境中在与mRNA组合之前单独地产生和储存。具体而言，床边配制物可促进增加的稳定性，因为mRNA和空的原材料(例如，空LNP)可储存于针对每种组分独立优化的条件下。例如，mRNA可储存于与空LNP不同的条件下)。由于LNP制备独立于负荷(cargo)存在，过程复杂性和物品成本可降低，从而为多种mRNA或活性剂构建体提供一种平台方法。将治疗剂(例如mRNA)囊封到预形成的纳米粒子(“空LNP”)中以提供包含治疗剂的LNP(即“负载LNP”)的原理在本文中称为“事后装载”(PHL)、“事后添加”或“事后”。
本公开部分地基于以下努力：探索事后装载的基本原理，并且在空LNP产生之后的时间尺度上研究mRNA囊封(即，负载LNP的形成)的影响和条件。在脂质沉淀之后，mRNA添加的时间已向上变化了七个数量级(例如1ms至10,000,000ms)，而未不利地影响负载LNP的物理化学特性(例如粒度、囊封、形态和/或结构完整性)。经常描述寡核苷酸参与早期粒子组装步骤。经验实验的结果表明，mRNA囊封可能在脂质沉淀/粒子形成后显著长的时间段内发生，而未不利地影响负载LNP的物理化学特性。这些实验证明，脂质粒子形成和后续mRNA囊封可分为两个反应步骤。如本文所述的事后装载的概念可使得能够独立地控制和/或优化每个步骤。此外，事后装载可使得能够在允许定点照护形成负载LNP的时间尺度(例如，空LNP产生之后的数小时、数天、数月或数年)上进行mRNA添加。
长期以来，尚未开发出以适合临床供应的规模产生预形成的空脂质纳米粒子(空LNP)的工艺。本公开部分地基于以下努力：确定有利于规模化产生的多种过程参数，包括但不限于脂质浓度、PEG-脂质或聚合物脂质的量、温度、缓冲液组成(例如，离子强度、pH、抗衡离子)和乙醇含量。
本公开部分地基于以下发现：如本文所公开的产生脂质纳米粒子(LNP)或脂质纳米粒子(LNP)配制物的方法可影响和/或规定这些脂质纳米粒子内的某些组分的分布，并且此分布可影响和/或规定脂质纳米粒子的物理(例如稳定性)和/或生物(例如功效、细胞内递送、免疫原性)特性。
在一些实施方案中，本公开产生包含具有有利组分分布的脂质纳米粒子的组合物。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物展现比通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)高的核酸表达(例如mRNA表达)。
在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物展现比通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)制备的LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)高约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高或约90％或更高的核酸表达(例如mRNA表达)。在一些实施方案中，通过本公开方法产生的LNP配制物展现比通过不同方法制备的LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)高约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约10倍或更高、约20倍或更高、约30倍或更高、约40倍或更高、约50倍或更高、约100倍或更高、约200倍或更高、约300倍或更高、约400倍或更高、约500倍或更高、约1000倍或更高、约2000倍或更高、约3000倍或更高、约4000倍或更高、约5000倍或更高或约10000倍或更高的核酸表达(例如mRNA表达)。
本公开的方法
本公开提供了一种产生空脂质纳米粒子(空LNP)的方法，所述方法包括：i)混合步骤，所述混合步骤包括使可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成所述空LNP，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质或其他聚合物脂质。
在一些实施方案中，所述混合步骤包括使包含所述可离子化脂质的脂质溶液与包含所述第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)。
在一些方面，本公开提供了一种制备与核酸缔合的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：ii)装载步骤，所述装载步骤包括使核酸与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
在本公开方法的一些实施方案中，所述装载步骤包括使包含所述核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含负载LNP的负载脂质纳米粒子溶液(负载LNP溶液)。
在本公开方法的一些实施方案中，所述空LNP或所述空LNP溶液在未保存或储存的情况下经历装载步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，所述空LNP或所述空LNP溶液在保存一段时期之后经历装载步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，所述空LNP或所述空LNP溶液在保存约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时或约24小时之后经历装载步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，所述空LNP或所述空LNP溶液在储存约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年之后经历装载步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，在形成之后，所述空LNP或所述空LNP溶液在未储存或保存一段时期的情况下经历装载步骤。
在一些方面，本公开方法还包括：iii)处理所述负载LNP溶液，由此形成脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)。
与其他产生技术(例如薄膜再水合/挤压)形成对比，乙醇滴沉淀(ethanol-dropprecipitation)已成为用于产生核酸脂质纳米粒子的工业标准。沉淀反应因其连续性、可扩展性和易用性而受到青睐。此类工艺通常使用高能混合器(例如T型接头、受限冲击射流、微流体混合器、涡旋混合器)以可控制方式将脂质(在乙醇中)引入合适反溶剂(即，水)中，从而驱动液体过饱和以及自发沉淀成脂质粒子。在一些实施方案中，所用的涡旋混合器是描述于美国专利申请第62/799,636号和第62/886,592号中的那些，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，所用的微流体混合器是描述于PCT申请第WO/2014/172045号中的那些，所述PCT申请通过引用整体并入本文。
在本公开方法的一些实施方案中，用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述混合步骤。
在一些实施方案中，用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述装载步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约25℃、低于约24℃、低于约22℃或低于约20℃的温度下执行所述混合步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约25℃、低于约24℃、低于约22℃或低于约20℃的温度下执行所述装载步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，所述第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至空LNP溶液或负载LNP溶液中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述第一添加步骤包括将包含PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至空LNP溶液或负载LNP溶液中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，所述第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至空LNP溶液或负载LNP溶液中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述第二添加步骤包括将包含PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至空LNP溶液或负载LNP溶液中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.5mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质、约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质添加至空LNP中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.5mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质、约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质添加至负载LNP中。
在一些实施方案中，所述第一添加步骤包括将约1.75mol％PEG脂质添加至空LNP或负载LNP中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述第二添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.5mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质、约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质添加至空LNP中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述第二添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.5mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质、约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质添加至负载LNP中。
在本公开方法的一些实施方案中，所述第二添加步骤包括将约1.0mol％PEG脂质添加至空LNP或负载LNP中。
在本公开方法的一些实施方案中，在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约25℃、低于约24℃、低于约22℃或低于约20℃的温度下执行所述第一添加步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约25℃、低于约24℃、低于约22℃或低于约20℃的温度下执行所述第二添加步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括选自过滤、pH调节、缓冲液交换、稀释、透析、浓缩、冷冻、冻干、储存和包装的至少一个步骤。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括pH调节。
在本公开方法的一些实施方案中，所述pH调节包括添加第二缓冲剂，所述第二缓冲剂选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
在本公开方法的一些实施方案中，第一添加步骤在pH调节之前执行。
在本公开方法的一些实施方案中，第一添加步骤在pH调节之后执行。
在本公开方法的一些实施方案中，第二添加步骤在pH调节之前执行。
在本公开方法的一些实施方案中，第二添加步骤在pH调节之后执行。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括过滤。
在本公开方法的一些实施方案中，所述过滤为切向流过滤(TFF)。
在本公开方法的一些实施方案中，所述过滤从LNP溶液中去除有机溶剂(例如醇，诸如乙醇)。在一些实施方案中，在去除有机溶剂(例如醇，诸如乙醇)之后，所述LNP溶液转化为在中性pH，例如pH 6.5至7.8、pH 6.8至pH 7.5，优选地pH 7.0至pH 7.2下(例如，通过添加磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液)缓冲的溶液。在一些实施方案中，所述LNP溶液转化为在约7.0pH至约7.2pH下缓冲的溶液。在一些实施方案中，所得LNP溶液在储存或使用之前，例如通过过滤(例如，经由0.1-0.5μm过滤器)灭菌。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括缓冲液交换。
在本公开方法的一些实施方案中，所述缓冲液交换包括添加包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液。
在一些实施方案中，第一添加步骤在缓冲液交换之前执行。
在本公开方法的一些实施方案中，第一添加步骤在缓冲液交换之后执行。
在本公开方法的一些实施方案中，第二添加在缓冲液交换之前执行。
在本公开方法的一些实施方案中，第二添加步骤在缓冲液交换之后执行。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括稀释所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
在一些实施方案中，所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括透析所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括浓缩所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冷冻所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冻干所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
在本公开方法的一些实施方案中，所述冻干包括在约-100℃至约0℃、约-80℃至约-10℃、约-60℃至约-20℃、约-50℃至约-25℃或约-40℃至约-30℃的温度下冷冻负载LNP溶液。
在本公开方法的一些实施方案中，所述冻干还包括干燥冷冻的负载LNP溶液以形成冻干的空LNP或冻干的负载LNP。
在本公开方法的一些实施方案中，所述干燥在约50毫托至约150毫托范围内的真空下执行。
在一些实施方案中，所述干燥在约-35℃至约-15℃下执行。
在本公开方法的一些实施方案中，所述干燥在约25℃下执行。
在本公开方法的一些实施方案中，所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括储存所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括包装。
在本公开方法的一些实施方案中，所述包装空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤包括以下步骤中的一者或多者：
iib)向空LNP溶液或负载LNP溶液中添加冷冻保护剂；
iic)使空LNP溶液或负载LNP溶液冻干，由此形成冻干的LNP组合物；
iid)储存冻干的LNP组合物的空LNP溶液或负载LNP溶液；和/或
iie)向空LNP溶液、负载LNP溶液或冻干的LNP组合物中添加缓冲溶液，由此形成LNP配制物。
在本公开方法的一些实施方案中，在冻干之前将所述冷冻保护剂添加至空LNP溶液或负载LNP溶液中。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含一种或多种冷冻保护剂，并且所述一种或多种冷冻保护剂中的每一者独立地为多元醇(例如二醇或三元醇，诸如丙二醇(即，1,2-丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、乙二醇或二乙二醇)、非清洁剂磺基甜菜碱(例如NDSB-201(3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸酯)、渗压剂(例如L-脯氨酸或三甲胺N-氧化物二水合物)、聚合物(例如聚乙二醇200(PEG 200)、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000、聚乙二醇单甲醚550(mPEG 550)、mPEG 600、mPEG 2000、mPEG 3350、mPEG4000、mPEG 5000、聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮K15)、新戊四醇丙氧基化物或聚丙二醇P400)、有机溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)或乙醇)、糖(例如D-(+)-蔗糖、D-山梨糖醇、海藻糖、D-(+)-麦芽糖单水合物、间赤藻糖醇、木糖醇、肌醇、D-(+)-蜜三糖五水合物、D-(+)-海藻糖二水合物或D-(+)-葡萄糖单水合物)或盐(例如，乙酸锂、氯化锂、甲酸锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、氯化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠、硫酸钠或其任何水合物)或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含蔗糖。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂为蔗糖。
在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前空LNP溶液、负载LNP溶液或冻干的LNP组合物储存于约-40℃至约0℃、约-35℃至约-5℃、约-30℃至约-10℃、约-25℃至约-15℃、约-22℃至约-18℃或约-21℃至约-19℃的温度下。
脂质溶液
在一些实施方案中，本公开方法提供脂质溶液。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液还包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或它们的任何组合。
在一些实施方案中，所述脂质溶液还包含囊封剂。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为大于约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1.0mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为约0.01mg/mL至约1.0mg/mL、约0.01mg/mL至约0.9mg/mL、约0.01mg/mL至约0.8mg/mL、约0.01mg/mL至约0.7mg/mL、约0.01mg/mL至约0.6mg/mL、约0.01mg/mL至约0.5mg/mL、约0.01mg/mL至约0.4mg/mL、约0.01mg/mL至约0.3mg/mL、约0.01mg/mL至约0.2mg/mL、约0.01mg/mL至约0.1mg/mL、约0.05mg/mL至约1.0mg/mL、约0.05mg/mL至约0.9mg/mL、约0.05mg/mL至约0.8mg/mL、约0.05mg/mL至约0.7mg/mL、约0.05mg/mL至约0.6mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL、约0.05mg/mL至约0.4mg/mL、约0.05mg/mL至约0.3mg/mL、约0.05mg/mL至约0.2mg/mL、约0.05mg/mL至约0.1mg/mL、约0.1mg/mL至约1.0mg/mL、约0.2mg/mL至约0.9mg/mL、约0.3mg/mL至约0.8mg/mL、约0.4mg/mL至约0.7mg/mL或约0.5mg/mL至约0.6mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为至多约5.0mg/mL、至多约4.0mg/mL、至多约3.0mg/mL、至多约2.0mg/mL、至多约1.0mg/mL、至多约0.09mg/mL、至多约0.08mg/mL、至多约0.07mg/mL、至多约0.06mg/mL或至多约0.05mg/mL的可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为大于约0.1mg/mL、大于约0.5mg/mL、大于约0.6mg/mL、大于约0.7mg/mL、大于约0.8mg/mL、大于约0.9mg/mL、大于约1.0mg/mL、大于约1.5mg/mL、大于约2.0mg/mL、大于约3.0mg/mL、大于约4.0mg/mL、大于约5.0mg/mL、大于约6.0mg/mL、大于约7.0mg/mL、大于约8.0mg/mL、大于约9.0mg/mL、大于约10mg/mL、大于约11mg/mL、大于约12mg/mL、大于约13mg/mL、大于约14mg/mL、大于约15mg/mL、大于约20mg/mL、大于约25mg/mL或大于约30mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为约0.1mg/mL至约20.0mg/mL、约0.1mg/mL至约19mg/mL、约0.1mg/mL至约18mg/mL、约0.1mg/mL至约17mg/mL、约0.1mg/mL至约16mg/mL、约0.1mg/mL至约15mg/mL、约0.1mg/mL至约14mg/mL、约01mg/mL至约13mg/mL、约0.1mg/mL至约12mg/mL、约0.1mg/mL至约11mg/mL、约0.5mg/mL至约10.0mg/mL、约0.5mg/mL至约9mg/mL、约0.5mg/mL至约8mg/mL、约0.5mg/mL至约7mg/mL、约0.5mg/mL至约6mg/mL、约0.5mg/mL至约5.0mg/mL、约0.5mg/mL至约4mg/mL、约0.5mg/mL至约3mg/mL、约0.5mg/mL至约2mg/mL、约0.5mg/mL至约1mg/mL、约1mg/mL至约20mg/mL、约1mg/mL至约15mg/mL、约1mg/mL至约12mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL或约1mg/mL至约8mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为至多约30mg/mL、约25、约mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约15mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约8mg/mL、约6mg/mL、约5.0mg/mL、约4.0mg/mL、约3.0mg/mL、约2.0mg/mL、约1.0mg/mL、约0.09mg/mL、约0.08mg/mL、约0.07mg/mL、约0.06mg/mL或约0.05mg/mL的可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含在水性缓冲液和/或有机溶液中的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液还包含缓冲剂和/或盐。示例性合适缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为或大于约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约4mM、约6mM、约8mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM的缓冲剂。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述脂质溶液具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述脂质溶液具有约7.0至约8.0、约7.1至约7.8、约7.2至约7.6或约7.3至约7.5的pH。
在一些实施方案中，所述脂质溶液具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，相对于所述脂质溶液的总体积，所述脂质溶液包含约1体积％至约50体积％的第一有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米粒子配制物的总体积，所述脂质溶液包含约2体积％至约45体积％的所述有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米粒子配制物的总体积，所述脂质溶液包含约3体积％至约40体积％的所述有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米粒子配制物的总体积，所述脂质溶液包含约4体积％至约35体积％的所述有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米粒子配制物的总体积，所述脂质溶液包含约5体积％至约33体积％的所述有机溶剂。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂为醇。
在一些实施方案中，所述有机溶剂为乙醇。
缓冲剂
在一些实施方案中，本公开方法提供缓冲剂。在一些实施方案中，本公开方法提供第一缓冲剂、第二缓冲剂、第三缓冲剂或它们的组合。
在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液包含第一缓冲剂。在一些实施方案中，合适溶液可还包含一种或多种缓冲剂和/或盐。示例性缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液包含浓度为约0.1nM至约100mM、约0.5nM至约90mM、约1.0nM至约80mM、约2nM至约70mM、约3nM至约60mM、约4nM至约50mM、约5nM至约40mM、约6nM至约30mM、约7nM至约20mM、约8nM至约15mM、约9mM至约12mM的第一缓冲剂。在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液包含浓度为约0.1mM或大于约0.1mM、约0.5mM或大于约0.5mM、约1mM或大于约1mM、约2mM或大于约2mM、约4mM或大于约4mM、约6mM或大于约6mM、约8mM或大于约8mM、约10mM或大于约10mM、约15mM或大于约15mM、约20mM或大于约20mM、约25mM或大于约25mM、约30mM或大于约30mM、约35mM或大于约35mM、约40mM或大于约40mM、约45mM或大于约45mM或约50mM或大于约50mM的第一缓冲剂。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述第一缓冲剂包括第一水性缓冲液。在一些实施方案中，合适溶液可还包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。示例性合适水性缓冲液包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述第一水性缓冲液包含浓度为约0.1nM至约100mM、约0.5nM至约90mM、约1.0nM至约80mM、约2nM至约70mM、约3nM至约60mM、约4nM至约50mM、约5nM至约40mM、约6nM至约30mM、约7nM至约20mM、约8nM至约15mM、约9-12mM的水性缓冲液。在一些实施方案中，所述第一水性缓冲液包含浓度为约0.1mM或大于约0.1mM、约0.5mM或大于约0.5mM、约1mM或大于约1mM、约2mM或大于约2mM、约4mM或大于约4mM、约6mM或大于约6mM、约8mM或大于约8mM、约10mM或大于约10mM、约15mM或大于约15mM、约20mM或大于约20mM、约25mM或大于约25mM、约30mM或大于约30mM、约35mM或大于约35mM、约40mM或大于约40mM、约45mM或大于约45mM或约50mM或大于约50mM的水性缓冲液。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述第一缓冲剂具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述第一缓冲剂具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述第一水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
在一些实施方案中，所述缓冲剂选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液包含大于约1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约2mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约15mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约25mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或大于约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液包含约1mM至约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约2mM至约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约3mM至约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约4mM至约8mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或约5mM至约6mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述第一水性缓冲溶液包含约5mM乙酸盐，其中所述水性缓冲溶液具有约5.0的pH。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲溶液包含第二缓冲剂。在一些实施方案中，合适溶液可还包含一种或多种缓冲剂和/或盐。示例性合适缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述第二水性缓冲溶液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述第二水性缓冲溶液包含浓度为约0.1mM或大于约0.1mM、约0.5mM或大于约0.5mM、约1mM或大于约1mM、约2mM或大于约2mM、约4mM或大于约4mM、约6mM或大于约6mM、约8mM或大于约8mM、约10mM或大于约10mM、约15mM或大于约15mM、约20mM或大于约20mM、约25mM或大于约25mM、约30mM或大于约30mM、约35mM或大于约35mM、约40mM或大于约40mM、约45mM或大于约45mM或约50mM或大于约50mM的缓冲剂。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述第二缓冲剂包括第二水性缓冲液。在一些实施方案中，合适溶液可还包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。示例性合适水性缓冲液包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述第二水性缓冲液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的水性缓冲液。在一些实施方案中，所述第二水性缓冲液包含浓度为约0.1mM或大于约0.1mM、约0.5mM、约1mM或大于约1mM、约2mM或大于约2mM、约4mM或大于约4mM、约6mM或大于约6mM、约8mM或大于约8mM、约10mM或大于约10mM、约15mM或大于约15mM、约20mM或大于约20mM、约25mM或大于约25mM、约30mM或大于约30mM、约35mM或大于约35mM、约40mM或大于约40mM、约45mM或大于约45mM或约50mM或大于约50mM的水性缓冲液。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述第二缓冲剂具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述第二缓冲剂具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲溶液具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述第二水性缓冲溶液具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述第二缓冲剂选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲液为tris缓冲液。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲剂为tris缓冲液。
在一些实施方案中，所述第二缓冲剂具有约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6范围内的pH。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲液具有约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6范围内的pH。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲液具有约7.5的pH。
在一些实施方案中，所述第二水性缓冲剂具有约7.5的pH。
在一些实施方案中，所述第三水性缓冲溶液包含第三缓冲剂。在一些实施方案中，合适溶液可还包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。示例性合适缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述第三水性缓冲溶液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述第三水性缓冲溶液包含浓度为约0.1mM或大于约0.1mM、约0.5mM或大于约0.5mM、约1mM或大于约1mM、约2mM或大于约2mM、约4mM或大于约4mM、约6mM或大于约6mM、约8mM或大于约8mM、约10mM或大于约10mM、约15mM或大于约15mM、约20mM或大于约20mM、约25mM或大于约25mM、约30mM或大于约30mM、约35mM或大于约35mM、约40mM或大于约40mM、约45mM或大于约45mM或约50mM或大于约50mM的第三缓冲剂。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述第三缓冲剂包括第三水性缓冲液。在一些实施方案中，合适溶液可还包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。示例性合适水性缓冲液包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述第三水性缓冲液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的水性缓冲液。在一些实施方案中，所述第三水性缓冲液包含浓度为或大于约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约4mM、约6mM、约8mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM的水性缓冲液。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述第三水性缓冲液具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述第三缓冲剂具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述第三水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
在一些实施方案中，所述第三水性缓冲液具有约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6范围内的pH。
在一些实施方案中，所述第三水性缓冲液具有约7.5的pH。
核酸和活性剂溶液
在一些实施方案中，本公开方法提供包含治疗剂和/或预防剂的活性剂溶液。所述治疗剂和/或预防剂可呈溶液形式提供以混合或添加至脂质纳米粒子或脂质纳米粒子溶液中，使得所述治疗剂和/或预防剂可囊封于脂质纳米粒子中。
在一些实施方案中，所述治疗剂和/或预防剂是能够引起免疫反应的疫苗或化合物。在一些实施方案中，负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物为疫苗。
在一些实施方案中，所述治疗剂和/或预防剂为核酸。
在一些实施方案中，本公开方法提供包含核酸的核酸溶液。所述核酸可呈溶液形式提供以混合或添加至脂质纳米粒子或脂质纳米粒子溶液中，使得所述核酸可囊封于脂质纳米粒子中(由此形成“负载LNP”)。
在一些实施方案中，所述核酸溶液包含待以各种浓度囊封的核酸。在一些实施方案中，所述核酸溶液包含浓度为大于约0.01mg/mL、约0.05mg/mL或大于约0.05mg/mL、约0.06mg/mL或大于约0.06mg/mL、约0.07mg/mL或大于约0.07mg/mL、约0.08mg/mL或大于约0.08mg/mL、约0.09mg/mL或大于约0.09mg/mL、约0.1mg/mL或大于约0.1mg/mL、约0.15mg/mL或大于约0.15mg/mL、约0.2mg/mL或大于约0.2mg/mL、约0.3mg/mL或大于约0.3mg/mL、约0.4mg/mL或大于约0.4mg/mL、约0.5mg/mL或大于约0.5mg/mL、约0.6mg/mL或大于约0.6mg/mL、约0.7mg/mL或大于约0.7mg/mL、约0.8mg/mL或大于约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或大于约0.9mg/mL或约1.0mg/mL或大于约1.0mg/mL的核酸。在一些实施方案中，所述核酸溶液包含浓度为约0.01mg/mL至约1.0mg/mL、约0.01mg/mL至约0.9mg/mL、约0.01mg/mL至约0.8mg/mL、约0.01mg/mL至约0.7mg/mL、约0.01mg/mL至约0.6mg/mL、约0.01mg/mL至约0.5mg/mL、约0.01mg/mL至约0.4mg/mL、约0.01mg/mL至约0.3mg/mL、约0.01mg/mL至约0.2mg/mL、约0.01mg/mL至约0.1mg/mL、约0.05mg/mL至约1.0mg/mL、约0.05mg/mL至约0.9mg/mL、约0.05mg/mL至约0.8mg/mL、约0.05mg/mL至约0.7mg/mL、约0.05mg/mL至约0.6mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL、约0.05mg/mL至约0.4mg/mL、约0.05mg/mL至约0.3mg/mL、约0.05mg/mL至约0.2mg/mL、约0.05mg/mL至约0.1mg/mL、约0.1mg/mL至约1.0mg/mL、约0.2mg/mL至约0.9mg/mL、约0.3mg/mL至约0.8mg/mL、约0.4mg/mL至约0.7mg/mL或约0.5mg/mL至约0.6mg/mL的核酸。在一些实施方案中，所述核酸溶液可包含浓度为至多约5.0mg/mL、至多约4.0mg/mL、至多约3.0mg/mL、至多约2.0mg/mL、至多约1.0mg/mL、至多约0.09mg/mL、至多约0.08mg/mL、至多约0.07mg/mL、至多约0.06mg/mL或至多约0.05mg/mL的核酸。在一些实施方案中，所述核酸溶液包含约0.001至约1.0mg/mL的核酸、约0.0025至约0.5mg/mL的核酸或约0.005至约0.2mg/mL的核酸。在一些实施方案中，所述核酸溶液包含约0.005至约0.2mg/mL的核酸。
在一些实施方案中，所述核酸溶液包含在水性缓冲液中的核酸。在一些实施方案中，合适核酸溶液可还包含缓冲剂和/或盐。示例性合适缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、HEPES等。在一些实施方案中，所述核酸溶液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述核酸溶液包含浓度为约0.1mM或大于约0.1mM、大于约0.5mM、大于约1mM、大于约2mM、大于约4mM、大于约6mM、大于约8mM、大于约10mM、大于约15mM、大于约20mM、大于约25mM、大于约30mM、大于约35mM、大于约40mM、大于约45mM或大于约50mM的缓冲剂。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述核酸溶液具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，所述核酸溶液具有约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5的pH。在一些实施方案中，所述核酸溶液具有约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5的pH。在一些实施方案中，所述核酸溶液具有约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5的pH。在一些实施方案中，合适核酸溶液具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述核酸溶液包含乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述核酸溶液包含约1mM至约200mM乙酸盐缓冲液、约2mM至约180mM乙酸盐缓冲液、约3mM至约160mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约150mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约140mM乙酸盐缓冲液、约5mM至约130mM乙酸盐缓冲液、约6mM至约120mM乙酸盐缓冲液、约7mM至约110mM乙酸盐缓冲液、约8mM至约100mM乙酸盐缓冲液、约9mM至约90mM乙酸盐缓冲液、约10mM至约80mM乙酸盐缓冲液、约15mM至约70mM乙酸盐缓冲液、约20mM至约60mM乙酸盐缓冲液、约25mM至约50mM乙酸盐缓冲液或约30mM至约40mM乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述核酸溶液包含约8.8mM乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述核酸溶液包含约130mM乙酸盐缓冲液。
空脂质纳米粒子(空LNP)
在一些方面，本公开提供了通过本文所公开的方法制备的空脂质纳米粒子(空LNP)。
在一些方面，本公开提供了包含聚合物脂质的空LNP。
在一些方面，本公开提供了一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约2.5mol％、约0.2mol％至约2.25mol％、约0.25mol％至约2.0mol％、约0.5mol％至约1.75mol％、约0.75mol％至约1.5mol％或约1.0mol％至约1.25mol％的聚合物脂质。
在一些方面，本公开提供了一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的聚合物脂质。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质为PEG脂质。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质不为PEG脂质。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质为两亲性聚合物-脂质缀合物。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质为PEG-脂质缀合物。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质为表面活性剂。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质为Brij或OH-PEG-硬脂酸酯。
在一些方面，本公开提供了一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP还包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质、磷脂、结构脂质或它们的任何组合。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约3.0mol％PEG脂质或更少、约2.75mol％PEG脂质或更少、约2.5mol％PEG脂质或更少、约2.25mol％PEG脂质或更少、约2.0mol％PEG脂质或更少、约1.75mol％PEG脂质或更少、约1.5mol％PEG脂质或更少、约1.25mol％PEG脂质或更少、约1.0mol％PEG脂质或更少、约0.9mol％PEG脂质或更少、约0.8mol％PEG脂质或更少、约0.7mol％PEG脂质或更少、约0.6mol％PEG脂质或更少、约0.5mol％PEG脂质或更少、约0.4mol％PEG脂质或更少、约0.3mol％PEG脂质或更少、约0.2mol％PEG脂质或更少或约0.1mol％PEG脂质或更少。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0mol％至约3.0mol％PEG脂质、约0.1mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.25mol％PEG脂质、约0.25mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.5mol％至约1.75mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质或约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.050mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30mol％至约60mol％可离子化脂质；约0mol％至约30mol％磷脂；约15mol％至约50mol％结构脂质；和约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30mol％至约60mol％可离子化脂质；约0mol％至约30mol％磷脂；约15mol％至约50mol％结构脂质；和约0.1mol％至约10mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP具有约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述空LNP具有约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述空LNP具有约25至约45nm的平均脂质纳米粒子直径。
空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过本文所公开的方法制备的空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为大于约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1.0mg/mL的空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为约0.01mg/mL至约1.0mg/mL、约0.01mg/mL至约0.9mg/mL、约0.01mg/mL至约0.8mg/mL、约0.01mg/mL至约0.7mg/mL、约0.01mg/mL至约0.6mg/mL、约0.01mg/mL至约0.5mg/mL、约0.01mg/mL至约0.4mg/mL、约0.01mg/mL至约0.3mg/mL、约0.01mg/mL至约0.2mg/mL、约0.01mg/mL至约0.1mg/mL、约0.05mg/mL至约1.0mg/mL、约0.05mg/mL至约0.9mg/mL、约0.05mg/mL至约0.8mg/mL、约0.05mg/mL至约0.7mg/mL、约0.05mg/mL至约0.6mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL、约0.05mg/mL至约0.4mg/mL、约0.05mg/mL至约0.3mg/mL、约0.05mg/mL至约0.2mg/mL、约0.05mg/mL至约0.1mg/mL、约0.1mg/mL至约1.0mg/mL、约0.2mg/mL至约0.9mg/mL、约0.3mg/mL至约0.8mg/mL、约0.4mg/mL至约0.7mg/mL或约0.5mg/mL至约0.6mg/mL的空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为至多约5.0mg/mL、至多约4.0mg/mL、至多约3.0mg/mL、至多约2.0mg/mL、至多约1.0mg/mL、至多约0.09mg/mL、至多约0.08mg/mL、至多约0.07mg/mL、至多约0.06mg/mL或至多约0.05mg/mL的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含在水性缓冲液中的空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液可还包含缓冲剂和/或盐。示例性合适缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为或大于约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约4mM、约6mM、约8mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM的缓冲剂。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，合适空LNP溶液具有为4.5或不大于4.5、4.6或不大于4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有在约4.5至约6.25、约4.6至约6.0、约4.8至约5.8、约5.0至约5.75、约5.0至约5.5范围内的pH。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含约5mM乙酸盐缓冲液，其中所述乙酸盐缓冲液具有约5.0的pH。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，空LNP溶液还包含第一有机溶剂。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂为醇。
在一些实施方案中，所述醇为乙醇。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液还包含张力剂(例如糖，诸如蔗糖)。
负载脂质纳米粒子(负载LNP)
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过本文所公开的方法制备的负载脂质纳米粒子(负载LNP)。
在一些实施方案中，所述负载LNP还包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质、磷脂、结构脂质或它们的任何组合。
在一些实施方案中，所述负载LNP包含约3.0mol％PEG脂质或更少、约2.75mol％PEG脂质或更少、约2.5mol％PEG脂质或更少、约2.25mol％PEG脂质或更少、约2.0mol％PEG脂质或更少、约1.75mol％PEG脂质或更少、约1.5mol％PEG脂质或更少、约1.25mol％PEG脂质或更少、约1.0mol％PEG脂质或更少、约0.9mol％PEG脂质或更少、约0.8mol％PEG脂质或更少、约0.7mol％PEG脂质或更少、约0.6mol％PEG脂质或更少、约0.5mol％PEG脂质或更少、约0.4mol％PEG脂质或更少、约0.3mol％PEG脂质或更少、约0.2mol％PEG脂质或更少或约0.1mol％PEG脂质或更少。
在一些实施方案中，所述负载LNP包含约0mol％至约3.0mol％PEG脂质、0.1mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.25mol％PEG脂质、约0.25mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.5mol％至约1.75mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质或约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述负载LNP包含约0.050mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述负载LNP包含约30mol％至约60mol％可离子化脂质；约0mol％至约30mol％磷脂；约15mol％至约50mol％结构脂质；和约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述负载LNP包含约30mol％至约60mol％可离子化脂质；约0mol％至约30mol％磷脂；约15mol％至约50mol％结构脂质；和约0.1mol％至约10mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述负载LNP具有约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述负载LNP具有约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述负载LNP具有约25至约45nm的平均脂质纳米粒子直径。
负载脂质纳米粒子溶液(负载LNP溶液)
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过本文所公开的方法制备的负载LNP溶液。
在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含负载LNP。在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含浓度为大于约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1.0mg/mL的负载LNP。在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含浓度为约0.01mg/mL至约1.0mg/mL、0.01mg/mL至约0.9mg/mL、0.01mg/mL至约0.8mg/mL、0.01mg/mL至约0.7mg/mL、0.01mg/mL至约0.6mg/mL、0.01mg/mL至约0.5mg/mL、0.01mg/mL至约0.4mg/mL、0.01mg/mL至约0.3mg/mL、0.01mg/mL至约0.2mg/mL、0.01mg/mL至约0.1mg/mL、0.05mg/mL至约1.0mg/mL、0.05mg/mL至约0.9mg/mL、0.05mg/mL至约0.8mg/mL、0.05mg/mL至约0.7mg/mL、0.05mg/mL至约0.6mg/mL、0.05mg/mL至约0.5mg/mL、0.05mg/mL至约0.4mg/mL、0.05mg/mL至约0.3mg/mL、0.05mg/mL至约0.2mg/mL、0.05mg/mL至约0.1mg/mL、0.1mg/mL至约1.0mg/mL、0.2mg/mL至约0.9mg/mL、0.3mg/mL至约0.8mg/mL、0.4mg/mL至约0.7mg/mL或0.5mg/mL至约0.6mg/mL的负载LNP。在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含浓度为至多约5.0mg/mL、至多约4.0mg/mL、至多约3.0mg/mL、至多约2.0mg/mL、至多约1.0mg/mL、至多约0.09mg/mL、至多约0.08mg/mL、至多约0.07mg/mL、至多约0.06mg/mL或至多约0.05mg/mL的负载LNP。
在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含在水性缓冲液中的负载LNP。在一些实施方案中，所述负载LNP溶液可还包含缓冲剂和/或盐。示例性合适缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含浓度为约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1.0mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约20mM、约8mM至约15mM、约9mM至约12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述负载mM至约LNP溶液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的缓冲剂。示例性合适盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，所述负载LNP溶液具有约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6或约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，合适负载LNP溶液具有为4.5或不大于4.5、4.6、4.7或不大于4.7、4.8或不大于4.8、4.9或不大于4.9、5.0或不大于5.0、5.2或不大于5.2、5.4或不大于5.4、5.6或不大于5.6、5.8或不大于5.8、6.0或不大于6.0、6.1或不大于6.1、6.2或不大于6.2、6.3或不大于6.3、6.4或不大于6.4、6.5或不大于6.5、6.6或不大于6.6、6.7或不大于6.7、6.8或不大于6.8、6.9或不大于6.9或7.0或不大于7.0的pH。
在一些实施方案中，所述负载LNP溶液具有在约4.5至约6.25、约4.6至约6.0、约4.8至约5.8、约5.0至约5.75或约5.0至约5.5范围内的pH。
在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含约5mM乙酸盐缓冲液，其中所述乙酸盐缓冲液具有约5.0的pH。
在一些实施方案中，所述负载LNP溶液包含乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，负载LNP溶液还包含第一有机溶剂。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂为醇。
在一些实施方案中，所述醇为乙醇。
在一些实施方案中，所述负载LNP溶液还包含张力剂。
脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)
在一些实施方案中，本公开提供了通过本文所公开的方法制备的脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)。
在一些实施方案中，所述LNP配制物包含约30mol％-60mol％可离子化脂质；约0mol％至约30mol％磷脂；约15mol％至约50mol％结构脂质；和约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述LNP配制物包含约30mol％至约60mol％可离子化脂质；约0mol％至约30mol％磷脂；约15mol％至约50mol％结构脂质；和约0.1mol％至约10mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述LNP配制物具有约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述LNP配制物具有约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，LNP配制物具有约25至约45nm的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述LNP配制物的pH在约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5的范围内。
施用LNP配制物
在一些实施方案中，所述施用包括：(i)提供包含治疗剂和/或预防剂的具有在约4.5至约7.0范围内的pH的活性剂溶液，和包含空LNP的具有在约4.5至约6.5范围内的pH的空LNP溶液，所述空LNP包含可离子化脂质；(ii)通过混合所述空LNP溶液和所述活性剂溶液来形成包含囊封所述治疗剂和/或预防剂的负载LNP的LNP配制物，使得所述LNP配制物具有在约4.5至约小于7.0范围内的pH；以及(iii)在混合之后小于约72小时，将所述LNP配制物施用至患者。
在一些实施方案中，第一pH和第二pH在约7.0至约8.1，或约7.1至约7.8，或约7.2至约7.7，或约7.3至约7.6，或约7.4至约7.5范围内。
在一些实施方案中，第一pH和第二pH在约4.5至约6.5，或约4.6至约6.0，或约4.8至约5.5范围内。
在一些实施方案中，在混合之后小于约72小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约60小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约48小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约36小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约24小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约20小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约16小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约12小时执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约8小时执行所述施用。
在一些实施方案中，在混合之后小于约120分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约100分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约90分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约80分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约70分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约60分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约50分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约40分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约30分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约20分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约15分钟执行所述施用。在一些实施方案中，在混合之后小于约10分钟执行所述施用。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH和脂质纳米粒子配制物的pH大约相同。
在一些实施方案中，相对于脂质纳米粒子配制物的总体积，所述LNP配制物包含约1体积％至约50体积％的所述有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，所述LNP配制物包含约2体积％至约45体积％的所述有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，所述LNP配制物包含约3体积％至约40体积％的所述有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，所述LNP配制物包含约4体积％至约35体积％的所述有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，所述LNP配制物包含约5体积％至约33体积％的所述有机溶剂。
在一些实施方案中，所述有机溶剂为醇。
在一些实施方案中，所述有机溶剂为乙醇。
在一些实施方案中，所述有机溶剂包含第一有机溶剂和第二有机溶剂。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂为醇并且所述第二有机溶剂为醇。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂为乙醇并且所述第二有机溶剂为苄醇。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的wt/wt比率在约100:1至约1:1，或约50:1至约1:1，或约20:1至约1:1，或约10:1至约1:1范围内。
在一些实施方案中，所述有机溶液还包含润湿剂。如本文所用，润湿剂可指增加、降低或改善液体维持与诸如固体表面和/或液体表面的表面接触的能力的剂。
在一些实施方案中，所述润湿剂为有机溶剂。
在一些实施方案中，所述润湿剂为二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，所述润湿剂与所述有机溶剂的wt/wt比率在约1000:1至约1:1，或约500:1至约5:1，或约100:1至约10:1范围内。
在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液是选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组中的至少一者。在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液可为适于维持生理pH的任何缓冲液。在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液可为适于维持适于施用至患者的pH的任何缓冲液。在一些实施方案中，所述患者为哺乳动物患者。在一些实施方案中，所述患者为人类患者。
在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液还包含张力剂。如本文所用，张力剂可指增加、降低或改善有效渗透压梯度(如由两种溶液的水势所定义)或溶质溶解于溶液中的相对浓度的剂，所述相对浓度影响扩散的方向和程度。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含张力剂。
在一些实施方案中，所述张力剂为糖。
在一些实施方案中，所述糖为蔗糖。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.01g/mL至约1.0g/mL、约0.05g/mL至约0.5g/mL、约0.1g/mL至约0.4g/mL、约0.15g/mL至约0.3g/mL或约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液和LNP配制物的示例性实施方案
在一些实施方案中，本公开的空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物包含多种LNP，其中所述负载LNP或LNP配制物包含核酸和可离子化脂质。
本文进一步公开用于本公开方法的合适核酸。在一些实施方案中，所述核酸为RNA(例如mRNA)。
本文进一步公开用于本公开方法的合适可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物还包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或它们的任何组合。本文进一步公开用于本公开方法的合适磷脂、PEG脂质和结构脂质。
在一些实施方案中，本公开的空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物包括至少一种脂质纳米粒子组分。脂质纳米粒子可包括脂质组分和一种或多种额外组分，诸如治疗剂和/或预防剂，诸如核酸。LNP可经设计用于一种或多种特定应用或靶标。LNP的要素可基于特定应用或靶标，和/或基于一种或多种要素的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其他特征进行选择。同样，LNP的特定配制物可根据例如特定要素组合的功效和毒性被选择用于特定应用或靶标。LNP配制物的功效和耐受性可受所述配制物的稳定性影响。
所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的脂质组分可包括例如根据式(IL-I)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-VI)、(IL-VIIa)、(IL-VIIIa)、(IL-VIIIb)、(IL-VIIb-1)、(IL-VIIb-2)、(IL-VIIb-3)、(IL-VIIc)、(IL-VIId)、(IL-VIIIc)、(IL-VIIId)、(IL-VIVa)、(IL-VIVb)、(IL-III)、(IL-IIIa1)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)的脂质、磷脂(诸如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)、PEG脂质和结构脂质。所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的脂质组分可包括例如根据式(IL-I)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-VI)、(IL-VIIa)、(IL-VIIIa)、(IL-VIIIb)、(IL-VIIb-1)、(IL-VIIb-2)、(IL-VIIb-3)、(IL-VIIc)、(IL-VIId)、(IL-VIIIc)、(IL-VIIId)、(IL-VIVa)、(IL-VIVb)、(IL-III)、(IL-IIIa1)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)的脂质、磷脂(诸如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)和结构脂质。所述脂质组分的要素可以特定分率提供。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的脂质组分包括根据式(IL-I)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-VI)、(IL-VIIa)、(IL-VIIIa)、(IL-VIIIb)、(IL-VIIb-1)、(IL-VIIb-2)、(IL-VIIb-3)、(IL-VIIc)、(IL-VIId)、(IL-VIIIc)、(IL-VIIId)、(IL-VIVa)、(IL-VIVb)、(IL-III)、(IL-IIIa1)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)的脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的脂质组分包括约30mol％至约60mol％的式(IL-I)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-VI)、(IL-VIIa)、(IL-VIIIa)、(IL-VIIIb)、(IL-VIIb-1)、(IL-VIIb-2)、(IL-VIIb-3)、(IL-VIIc)、(IL-VIId)、(IL-VIIIc)、(IL-VIIId)、(IL-VIVa)、(IL-VIVb)、(IL-III)、(IL-IIIa1)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)化合物、约0mol％至约30mol％磷脂、约18.5mol％至约48.5mol％结构脂质和约0mol％至约10mol％PEG脂质，前提条件是总mol％不超过100％。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的脂质组分包括约35mol％至约55mol％的式(IL-I)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-VI)、(IL-VIIa)、(IL-VIIIa)、(IL-VIIIb)、(IL-VIIb-1)、(IL-VIIb-2)、(IL-VIIb-3)、(IL-VIIc)、(IL-VIId)、(IL-VIIIc)、(IL-VIIId)、(IL-VIVa)、(IL-VIVb)、(IL-III)、(IL-IIIa1)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)化合物、约5mol％至约25mol％磷脂、约30mol％至约40mol％结构脂质和约0mol％至约10mol％PEG脂质。在一个特定实施方案中，所述脂质组分包括约50mol％所述化合物、约10mol％磷脂、约38.5mol％结构脂质和约1.5mol％PEG脂质。在另一特定实施方案中，所述脂质组分包括约40mol％所述化合物、约20mol％磷脂、约38.5mol％结构脂质和约1.5mol％PEG脂质。在一些实施方案中，所述磷脂可为DOPE或DSPC。在一些实施方案中，所述PEG脂质可为PEG-DMG并且/或者所述结构脂质可为胆固醇。
脂质纳米粒子可经设计用于一种或多种特定应用或靶标。在一些实施方案中，LNP可经设计以将诸如RNA的治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或系统或其组。可改变脂质纳米粒子的生理化学特性以便增加针对特定身体靶标的选择性。例如，可基于不同器官的开窗大小调节粒度。包括于LNP中的治疗剂和/或预防剂还可基于一个或多个所需递送靶标进行选择。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂可针对特定适应症、疾患、疾病或病症和/或针对向特定细胞、组织、器官或系统或其组的递送(例如，局部或特异性递送)进行选择。在一些实施方案中，LNP可包括编码目标多肽的mRNA，所述mRNA能够在细胞内翻译以产生所述目标多肽。这种组合物可经设计以特异性地递送至特定器官。在一些实施方案中，组合物可经设计以特异性地递送至哺乳动物肝脏。
LNP中的治疗剂和/或预防剂的量可取决于所述脂质纳米粒子的大小、组成、所需靶标和/或应用或其他特性，以及取决于所述治疗剂和/或预防剂的特性。在一些实施方案中，可用于LNP中的RNA的量可取决于所述RNA的大小、序列和其他特征。LNP中的治疗剂和/或预防剂和其他要素(例如脂质)的相对量还可变化。在一些实施方案中，LNP中的脂质组分与治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的wt/wt比率可为约5:1至约60:1，诸如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。在一些实施方案中，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约10:1至约40:1。在一些实施方案中，所述wt/wt比率为约20:1。LNP中的治疗剂和/或预防剂的量可例如使用吸收光谱法(例如，紫外可见光谱)进行测量。
在一些实施方案中，LNP包括一种或多种RNA，并且所述一种或多种RNA、脂质及其量可经选择以提供特定N:P比率。组合物的N:P比率是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中的磷酸酯基团的数目的摩尔比率。一般来说，较低N:P比率为优选的。所述一种或多种RNA、脂质及其量可经选择以提供约2:1至约30:1的N:P比率，诸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1。在一些实施方案中，所述N:P比率可为约2:1至约8:1。在一些实施方案中，所述N:P比率为约5:1至约8:1。在一些实施方案中，所述N:P比率可为约5.0:1、约5.5:1、约5.67:1、约6.0:1、约6.5:1或约7.0:1。在一些实施方案中，所述N:P比率可为约5.67:1。
在一些实施方案中，包括LNP的配制物可还包括盐，诸如氯化物盐。
在一些实施方案中，包括LNP的配制物可还包括糖，诸如二醣。在一些实施方案中，所述配制物还包括糖，但不包括盐，诸如氯化物盐。
物理特性
本公开的LNP的物理特性可通过多种方法进行表征。在一些实施方案中，可使用显微术(例如，透射电子显微术或扫描电子显微术)来检查LNP的形态和大小分布。可使用动态光散射或电位测定法(例如电位滴定)来测量ζ电位。动态光散射还可用于测定粒度。还可使用诸如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)的仪器来测量LNP的多种特征，诸如粒度、多分散性指数和ζ电位。
所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可在数十nm与数百nm之间，例如通过动态光散射(DLS)所测量。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小的平均脂质纳米粒子直径。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的平均脂质纳米粒子直径。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约15nm至约55nm、约20nm至约50nm、约25nm至约45nm或约30nm至约40nm的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约25至约45nm的平均脂质纳米粒子直径。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可为约70nm至约100nm。在一个特定实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可为约80nm。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可为约100nm。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径在约1mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm或约38mm至约42mm范围内。
在一些实施方案中，如与通过不同方法(例如，不具有本公开方法的一个或多个步骤的方法，或与本公开方法至少有一个步骤不同的方法)产生的空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物相比，所述空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径为约99％或更低、约98％或更低、约97％或更低、约96％或更低、约95％或更低、约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、约50％或更低、约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低或约10％或更低。
LNP可为相对均质的。多分散性指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米粒子的粒度分布。小(例如小于0.3)多分散性指数一般指示狭窄粒度分布。LNP可具有约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的多分散性指数。在一些实施方案中，LNP的多分散性指数可为约0.10至约0.20。
治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的囊封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备之后经LNP囊封或以其他方式与LNP缔合的治疗剂和/或预防剂的量。高囊封效率是合乎需要的(例如，接近100％)。囊封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或清洁剂破碎脂质纳米粒子之前和之后含有脂质纳米粒子的溶液中的治疗剂和/或预防剂的量来测量。可使用阴离子交换树脂来测量溶液中的游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。可使用荧光来测量溶液中的游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。关于本文所述的脂质纳米粒子，治疗剂和/或预防剂的囊封效率可为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，囊封效率可为至少80％。在一些实施方案中，囊封效率可为至少90％。在一些实施方案中，囊封效率可为至少95％。
LNP可任选地包含一个或多个涂层。在一些实施方案中，LNP可配制在具有涂层的胶囊、膜或片剂中。包括本文所述的组合物的胶囊、膜或片剂可具有任何可用的大小、拉伸强度、硬度或密度。
定义
如本文所用，术语“烷基”或“烷基基团”意指包括一个或多个碳原子(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)的直链或支链饱和烃，其任选被取代。注记“C1-14烷基”意指任选被取代的包括1-14个碳原子的直链或支链饱和烃。除非另外指定，否则本文所述的烷基基团是指未被取代和被取代的烷基基团。
如本文所用，术语“烯基”或“烯基基团”意指包括两个或更多个碳原子(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)和至少一个双键的直链或支链烃，其任选被取代。注记“C2-14烯基”意指任选被取代的包括2-14个碳原子和至少一个碳碳双键的直链或支链烃。烯基基团可包括一个、两个、三个、四个或更多个碳碳双键。在一些实施方案中，C18烯基可包括一个或多个双键。包括两个双键的C18烯基基团可为亚油烯基。除非另外指定，否则本文所述的烯基基团是指未被取代和被取代的烯基基团。
如本文所用，术语“炔基”或“炔基基团”意指包括两个或更多个碳原子(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个碳原子)和至少一个碳碳三键的直链或支链烃，其任选被取代。注记“C2-14炔基”意指任选被取代的包括2-14个碳原子和至少一个碳碳三键的直链或支链烃。炔基基团可包括一个、两个、三个、四个或更多个碳碳三键。例如，C18炔基可包括一个或多个碳碳三键。除非另外指定，否则本文所述的炔基基团是指未被取代和被取代的炔基基团。
如本文所用，术语“碳环”或“碳环基团”意指任选被取代的包括一个或多个碳原子环的单环或多环体系。环可为三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、十一元、十二元、十三元、十四元、十五元、十六元、十七元、十八元、十九元或二十元环。注记“C3-6碳环”意指包括具有3-6个碳原子的单环的碳环。碳环可包括一个或多个碳碳双键或三键并且可为非芳族的或芳族的(例如，环烷基或芳基基团)。碳环的实例包括环丙基、环戊基、环己基、苯基、萘基和1,2-二氢萘基基团。如本文所用，术语“环烷基”意指非芳族碳环并且可包括或可不包括任何双键或三键。除非另外指定，否则本文所述的碳环是指未被取代和被取代的碳环基团，即任选被取代的碳环。在一些实施方案中，碳环是C3-8环烷基。在一些实施方案中，碳环是C3-6环烷基。在一些实施方案中，碳环是C6-10芳基。
“芳基”包括具有芳香性的基团，包括具有至少一个芳环并且在环结构中不含任何杂原子的“共轭”或多环体系。实例包括苯基、苄基、1,2,3,4-四氢萘基等。在一些实施方案中，“芳基”是具有芳香性的C6-10碳环(例如，“芳基”是C6-10芳基)。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环基团”意指任选被取代的包括一个或多个环的单环或多环体系，其中至少一个环包括至少一个杂原子。杂原子可为例如氮、氧或硫原子。环可为三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、十一元、十二元、十三元或十四元环。杂环可包括一个或多个双键或三键并且可为非芳族的或芳族的(例如，杂环烷基或杂芳基基团)。杂环的实例包括咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基基团。如本文所用，术语“杂环烷基”意指非芳族杂环并且可包括或可不包括任何双键或三键。除非另外指定，否则本文所述的杂环是指未被取代和被取代的杂环基团，即任选被取代的杂环。在一些实施方案中，杂环是4至12元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环是5元或6元杂芳基。
“杂芳基”基团是如上文所定义的芳基基团，除了在环结构中具有一个至四个杂原子，并且还可称为“芳基杂环”或“杂芳族化合物”。如本文所用，术语“杂芳基”旨在包括稳定的5元、6元或7元单环或者7元、8元、9元、10元、11元或12元双环芳族杂环，所述杂环由碳原子和独立地选自由氮、氧、硫和硼组成的组的一个或多个杂原子，例如1个或1-2个或1-3个或1-4个或1-5个或1-6个杂原子或例如1、2、3、4、5或6个杂原子组成。氮原子可被取代或未被取代(即N或NR，其中R是H或如所定义的其他取代基)。氮和硫杂原子可任选被氧化(即N→O和S(O)p，其中p＝1或2)。应注意，芳族杂环中的S和O原子的总数为不超过1。
杂芳基基团的实例包括吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。
此外，术语“芳基”和“杂芳基”包括多环芳基和杂芳基基团，例如三环、双环，例如萘、苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、喹啉、异喹啉、萘啶(naphthrydine)、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、脱氮嘌呤、吲嗪。
如本文所用，“生物可降解基团”是可促进哺乳动物实体中脂质的更快速代谢的基团。生物可降解基团可选自由但不限于-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR')O-、-S(O)2-、芳基基团和杂芳基基团组成的组。如本文所用，“芳基基团”是任选被取代的包括一个或多个芳环的碳环基团。芳基基团的实例包括苯基和萘基基团。如本文所用，“杂芳基基团”是任选被取代的包括一个或多个芳环的杂环基团。杂芳基基团的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基和噻唑基。芳基和杂芳基基团均可任选被取代。在一些实施方案中，M和M'可选自由任选被取代的苯基、噁唑和噻唑组成的非限制性组。在本文中的各式中，M和M'可独立地选自上文生物可降解基团的列表。除非另外指定，否则本文所述的芳基或杂芳基基团是指未被取代和被取代的基团，即任选被取代的芳基或杂芳基基团。
除非另外指定，否则烷基、烯基和环基(例如，碳环基和杂环基)基团可任选被取代。任选的取代基可选自由但不限于卤素原子(例如，氯离子、溴离子、氟离子或碘离子基团)、羧酸(例如-C(O)OH)、醇(例如羟基、-OH)、酯(例如-C(O)OR或-OC(O)R)、醛(例如-C(O)H)、羰基(例如-C(O)R，或者由C＝O表示)、酰基卤(例如-C(O)X，其中X是选自溴离子、氟离子、氯离子和碘离子的卤离子)、碳酸酯(例如-OC(O)OR)、烷氧基(例如-OR)、缩醛(例如-C(OR)2R””，其中每个OR是可相同或不同的烷氧基并且R””是烷基或烯基基团)、磷酸酯(例如P(O)4 3-)、硫醇(例如-SH)、亚砜(例如-S(O)R)、亚磺酸(例如-S(O)OH)、磺酸(例如-S(O)2OH)、硫醛(例如-C(S)H)、硫酸酯(例如S(O)4 2-)、磺酰基(例如-S(O)2-)、酰胺(例如-C(O)NR2或-N(R)C(O)R)、叠氮基(例如-N3)、硝基(例如-NO2)、氰基(例如-CN)、异氰基(例如-NC)、酰氧基(例如-OC(O)R)、氨基(例如-NR2、-NRH或-NH2)、氨甲酰基(例如-OC(O)NR2、-OC(O)NRH或-OC(O)NH2)、磺酰胺(例如-S(O)2NR2、-S(O)2NRH、-S(O)2NH2、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)S(O)2H或-N(H)S(O)2H)、烷基基团、烯基基团和环基(例如，碳环基或杂环基)基团组成的组。在前述任一者中，R是如本文所定义的烷基或烯基基团。在一些实施方案中，所述取代基基团自身可进一步被例如一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所定义的取代基取代。在一些实施方案中，C1-6烷基基团可进一步被一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所述的取代基取代。
含氮的本公开化合物可通过用氧化剂(例如3-氯过氧基苯甲酸(mCPBA)和/或过氧化氢)处理而转化为N-氧化物以提供其他本公开化合物。因此，当价态和结构允许时，所有所显示和要求保护的含氮化合物均被视为包括如所示的化合物和其N-氧化物衍生物(其可被指定为NO或N+-O-)。此外，在其他情况下，本公开化合物中的氮可转化为N-羟基或N-烷氧基化合物。例如，N-羟基化合物可通过利用诸如m-CPBA的氧化剂氧化母体胺来制备。当价态和结构允许时，所有所显示和要求保护的含氮化合物也被视为涵盖如所示的化合物和其N-羟基(即N-OH)和N-烷氧基(即N-OR，其中R是被取代或未被取代的C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、3-14元碳环或3-14元杂环)衍生物。
如本文所用，如应用于一个或多个目标值的术语“大约”和“约”是指类似于所陈述的参考值的值。在一些实施方案中，除非另外指定或在其他方面从本文显而易知(除了此数字将超过可能值的100％的情况)，否则术语“大约”或“约”是指值的范围，所述范围属于所陈述的参考值在任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低以内。在一些实施方案中，当在LNP的脂质组分中的给定化合物的量的背景中使用时，“约”可意指所陈述的值的+/-10％。例如，包括具有约40％的给定化合物的脂质组分的LNP可包括30-50％的所述化合物。
如本文所用，术语“化合物”意在包括所描绘的结构的所有异构体和同位素。“同位素”是指具有相同原子序数但由于原子核中不同数目的中子而具有不同质量数的原子。在一些实施方案中，氢的同位素包括氚和氘。此外，本公开的化合物、盐或复合物可通过常规方法与溶剂或水分子组合制备以形成溶剂化物和水合物。
如本文所用，术语“接触”意指在两个或更多个实体之间建立物理连接。在一些实施方案中，使哺乳动物细胞与LNP接触意指使所述哺乳动物细胞与纳米粒子共享物理连接。体内和离体使细胞与外部实体接触的方法是生物学领域中众所周知的。在一些实施方案中，使LNP和安置于哺乳动物内的哺乳动物细胞接触可通过变化的施用途径(例如，静脉内、肌肉内、皮内和皮下)进行并且可涉及变化量的脂质纳米粒子。此外，超过一种哺乳动物细胞可由LNP接触。
如本文所用，术语“可比较方法”是指关于所比较的方法，具有可比较参数或步骤(例如，产生本公开的LNP配制物)的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是具有所比较的方法的步骤i)、ia)、iaa)、ib)、ii)、iia)、iib)、iic)、iid)和iie)中的一者或多者的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是不具有所比较的方法的步骤i)、ia)、iaa)、ib)、ii)、iia)、iib)、iic)、iid)和iie)中的一者或多者的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是不具有所比较的方法的步骤ia)和ib)中的一者或多者的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是采用核酸的水溶性盐的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是采用不包含有机溶剂可溶性核酸的有机溶液的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是包括在施用脂质纳米粒子配制物之前处理脂质纳米粒子的方法。
如本文所用，术语“递送”意指向目的地提供实体。在一些实施方案中，向受试者递送治疗剂和/或预防剂可涉及向所述受试者施用包括所述治疗剂和/或预防剂的LNP(例如，通过静脉内、肌肉内、皮内或皮下途径)。向哺乳动物或哺乳动物细胞施用LNP可涉及使一种或多种细胞与所述脂质纳米粒子接触。
如本文所用，术语“增强的递送”意指与对照纳米粒子向目标靶组织递送治疗剂和/或预防剂的水平(例如MC3、KC2或DLinDMA)相比，由纳米粒子向目标靶组织(例如，哺乳动物肝脏)递送更多(例如，至少1.5倍多、至少2倍多、至少3倍多、至少4倍多、至少5倍多、至少6倍多、至少7倍多、至少8倍多、至少9倍多、至少10倍多)治疗剂和/或预防剂。纳米粒子向特定组织递送的水平可通过比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量，比较组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织的重量，比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织中总蛋白质的量，或比较组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织中总治疗剂和/或预防剂的量来测量。应理解，纳米粒子向靶组织的增强的递送无需在所治疗的受试者中测定，其可在诸如动物模型(例如大鼠模型)的替代物中测定。
如本文所用，术语“特异性递送(specific delivery)”、“特异性地递送(specifically deliver)”或“特异性地递送(specifically delivering)”意指与脱靶组织(例如，哺乳动物脾脏)相比，由纳米粒子向目标靶组织(例如，哺乳动物肝脏)递送更多(例如，至少1.5倍多、至少2倍多、至少3倍多、至少4倍多、至少5倍多、至少6倍多、至少7倍多、至少8倍多、至少9倍多、至少10倍多)治疗剂和/或预防剂。纳米粒子向特定组织递送的水平可通过比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织的重量，比较组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织的重量，比较组织中产生的蛋白质的量与所述组织中总蛋白质的量，或比较组织中治疗剂和/或预防剂的量与所述组织中总治疗剂和/或预防剂的量来测量。在一些实施方案中，关于肾血管靶向，如果在治疗剂和/或预防剂的全身性施用之后与递送至肝脏或脾脏的量相比，每1g组织1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍或20倍多的治疗剂和/或预防剂递送至肾脏，则如与肝脏和脾脏相比，治疗剂和/或预防剂特异性地提供至哺乳动物肾脏。应理解，纳米粒子特异性地递送至靶组织的能力无需在所治疗的受试者中测定，其可在诸如动物模型(例如大鼠模型)的替代物中测定。
如本文所用，“囊封效率”是指相对于用于制备LNP的治疗剂和/或预防剂的初始总量，变成LNP的一部分的治疗剂和/或预防剂的量。在一些实施方案中，如果在最初提供至LNP的总计100mg治疗剂和/或预防剂中有97mg治疗剂和/或预防剂被囊封于所述组合物中，则囊封效率可给出为97％。如本文所用，“囊封”可指完全、实质性或部分封闭、限制、围绕或包装。如本文所用，“囊封”、“囊封的”、“负载的”和“缔合的”可指完全、实质性或部分封闭、限制、围绕或包装。如本文所用，“囊封”或“缔合”可指限制纳米粒子内的个别核酸分子和/或在个别核酸分子与纳米粒子之间建立生理化学联系的过程。如本文所用，“空纳米粒子”可指基本上不含治疗剂或预防剂的纳米粒子。如本文所用，术语“基本上不含治疗剂或预防剂”意指纳米粒子不含显著量的治疗剂或预防剂。如本文所用，“空纳米粒子”可指包含少于少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％、少于1wt.％、少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的治疗剂或预防剂的脂质纳米粒子。如本文所用，“空纳米粒子”或“空脂质纳米粒子”可指基本上不含核酸的纳米粒子。如本文所用，术语“基本上不含核酸”意指纳米粒子不含显著量的核酸(例如mRNA)。如本文所用，“空纳米粒子”可指基本上仅由脂质组分组成的纳米粒子。如本文所用，“空纳米粒子”可指包含少于少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％、少于1wt.％、少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的核酸(例如mRNA)的脂质纳米粒子。如本文所用，“空纳米粒子”或“空脂质纳米粒子”可指基本上不含核苷酸或多肽的纳米粒子。如本文所用，“空纳米粒子”或“空脂质纳米粒子”可指基本上仅由脂质组分组成的纳米粒子。如本文所用，“负载LNP”、“负载纳米粒子”或“负载脂质纳米粒子”(也称为“完全纳米粒子”或“完全脂质纳米粒子”)可指包含空纳米粒子的组分和大量治疗剂或预防剂的纳米粒子。在一些实施方案中，负载LNP包含至少部分地位于LNP内部的治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，负载LNP包含大量与LNP表面缔合或与LNP外部缀合的治疗剂或预防剂。如本文所用，“负载LNP”如本文所用，“负载LNP”、“负载纳米粒子”或“负载脂质纳米粒子”(也称为“完全纳米粒子”或“完全脂质纳米粒子”)可指包含空纳米粒子的组分和大量核苷酸或多肽的纳米粒子。在一些实施方案中，负载LNP包含至少部分地位于LNP内部的核苷酸或多肽。在一些实施方案中，负载LNP包含与LNP表面缔合或与LNP外部缀合的核苷酸或多肽。如本文所用，“负载LNP”、“负载纳米粒子”或“负载脂质纳米粒子”(也称为“完全纳米粒子”或“完全脂质纳米粒子”)可指包含空纳米粒子的组分和大量核酸的纳米粒子。在一些实施方案中，负载LNP包含至少部分地位于LNP内部的核酸(例如mRNA)。在一些实施方案中，负载LNP包含与LNP表面缔合或与LNP外部缀合的核酸(例如mRNA)。
如本文所用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽或蛋白质和/或多肽或蛋白质的翻译后修饰。
如本文所用，术语“体外”是指事件发生于人工环境中，例如试管或反应容器中、细胞培养物中、陪替氏培养皿(Petri dish)中等，而非发生于生物体(例如动物、植物或微生物)内。
如本文所用，术语“体内”是指事件发生于生物体(例如动物、植物或微生物或其细胞或组织)内。
如本文所用，术语“离体”是指事件发生于生物体(例如动物、植物或微生物或其细胞或组织)外部。离体事件可发生于从天然(例如体内)环境最低程度地改变的环境中。
如本文所用，术语“异构体”意指化合物的任何几何异构体、互变异构体、两性离子、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。化合物可包括一个或多个手性中心和/或双键并且可因此作为立体异构体，诸如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如，对映异构体(即，(+)或(-))或顺式/反式异构体)存在。本公开涵盖本文所述的化合物的任何和所有异构体，包括立体异构体纯形式(例如，几何异构体纯、对映异构体纯或非对映异构体纯)以及对映异构体和立体异构体混合物(例如外消旋物)。化合物的对映异构体和立体异构体混合物以及将其拆分成其组分对映异构体或立体异构体的方式是众所周知的。
“互变异构体”是平衡存在并易于从一种异构体形式转化成另一种异构体形式的两种或更多种结构异构体之一。这种转化导致氢原子的形式迁移，伴随相邻的共轭双键的转换。互变异构体作为溶液中的互变异构体集合的混合物存在。在其中可能发生互变异构的溶液中，将达到互变异构体的化学平衡。互变异构体的精确比率取决于若干因素，包括温度、溶剂和pH。可通过互变异构相互转化的互变异构体的概念被称为互变异构现象。
在可能存在的若干类型的互变异构现象中，通常观察到两种。在酮-烯醇互变异构现象中，发生电子和氢原子的同时位移。由于糖链分子中的醛基(-CHO)与同一分子中的一个羟基(-OH)反应使其呈如由葡萄糖展现的环状(环形)形式，发生环链互变异构现象。
常见互变异构体对是：酮-烯醇、酰胺-腈、内酰胺-内酰亚胺、杂环中(例如，诸如鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的核碱基中)的酰胺-亚氨酸互变异构现象、亚胺-烯胺和烯胺-烯胺。二取代胍中的互变异构现象的实例示于下文。
Figure GDA0004174332580000641
应理解，本公开化合物可描绘为不同的互变异构体。还应理解，当化合物具有互变异构体形式时，所有互变异构体形式均旨在包括于本公开的范围内，并且所述化合物的命名不排除任何互变异构体形式。
如本文所用，“脂质组分”是包括一种或多种脂质的脂质纳米粒子的所述组分。在一些实施方案中，脂质组分可包括一种或多种阳离子/可离子化脂质、PEG化脂质、结构脂质或其他脂质，诸如磷脂。
如本文所用，“接头”是连接两个部分的部分，例如帽物质的两个核苷之间的连接。接头可包括一个或多个基团，包括但不限于磷酸酯基(例如，磷酸酯、硼代磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯和膦酸酯)、烷基基团、酰胺化物或甘油。在一些实施方案中，帽类似物的两个核苷可在其5'位置处由三磷酸酯基团或由包括两个磷酸酯部分和一个硼代磷酸酯部分的链连接。
如本文所用，“施用方法”可包括静脉内、肌肉内、皮内、皮下或向受试者递送组合物的其他方法。可选择一种施用方法以靶向递送(例如，特异性地递送)至身体的特定区域或系统。
如本文所用，“经修饰的”意指非天然的。在一些实施方案中，RNA可为经修饰的RNA。也就是说，RNA可包括一个或多个非天然存在的核碱基、核苷、核苷酸或接头。“经修饰的”物质也可在本文中称为“改变的”物质。物质可以在化学上、在结构上或在功能上被修饰或改变。在一些实施方案中，经修饰的核碱基物质可包括一种或多种非天然存在的取代。
如本文所用，“N:P比率”是例如在包括脂质组分和RNA的LNP中的脂质中的可离子化(在生理pH范围中)氮原子与RNA中的磷酸酯基的摩尔比率。
如本文所用，“脂质纳米粒子”是包含一种或多种脂质的组合物。脂质纳米粒子的大小通常在微米或更小数量级，并且可包括脂质双层。除非另外指定，否则如本文所用的脂质纳米粒子涵盖脂质纳米粒子(LNP)、脂质体(例如脂质囊泡)和脂质体复合物。在一些实施方案中，LNP可为含有具有500nm或更小的直径的脂质双层的脂质体。
如本文所用，“天然存在的”意指无人工辅助而存在于自然界中。
如本文所用，“患者”是指可寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或处于针对特定疾病或疾患受过训练的专业人员的护理下的受试者。
如本文所用，“PEG脂质”或“PEG化脂质”是指包含聚乙二醇组分的脂质。
如本文所用，“聚合物脂质”是指在化学结构中包含重复亚单位的脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质是包含聚合物组分的脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质为PEG脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质不为PEG脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质为Brij或OH-PEG-硬脂酸酯。
短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断的范围内适合与人类和动物组织接触使用而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物以外(例如，能够悬浮、复合或溶解所述活性化合物的媒介物)并且具有在患者中基本上无毒且非炎性的特性的任何成分。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(色料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱式)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧基甲基纤维素钠、柠檬酸钠、乙醇酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E(α-生育酚)、维生素C、木糖醇和本文所公开的其他物质。
在本说明书中，所述化合物的结构式在一些情况下为方便起见表示特定异构体，但本公开包括所有异构体，诸如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体等，应理解并非所有异构体均可具有相同活性水平。此外，关于由所述式表示的化合物，可存在晶体多态性。应注意，任何晶形、晶形混合物或其酸酐或水合物均包括于本公开的范围中。
术语“晶体多晶型物”、“多晶型物”或“晶形”意指晶体结构，其中化合物(或其盐或溶剂化物)可以不同的晶体堆积排列结晶，所有所述晶体堆积排列均具有相同元素组成。不同晶形通常具有不同的X射线衍射图案、红外光谱、熔点、密度硬度、晶体形状、光学和电学特性、稳定性和溶解度。重结晶溶剂、结晶速率、储存温度和其他因素可使一种晶形占优势。所述化合物的晶体多晶型物可通过在不同条件下结晶来制备。
组合物还可包括一种或多种化合物的盐。盐可为药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基与合适有机酸反应)而发生改变。药学上可接受的盐的实例包括但不限于诸如胺的碱性残基的无机或有机酸盐；诸如羧酸的酸性残基的碱金属或有机盐；等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等；以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般来说，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。在一些实施方案中，非水性介质是醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐的列表可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页，Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008，以及Berge等人,Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文。
如本文所用，“磷脂”是包括磷酸酯部分和一个或多个碳链(诸如不饱和脂肪酸链)的脂质。磷脂可包括一个或多个多重(例如，双或三)键(例如，一个或多个不饱和度)。磷脂或其类似物或衍生物可包括胆碱。磷脂或其类似物或衍生物可不包括胆碱。特定磷脂可促进与膜的融合。在一些实施方案中，阳离子磷脂可与膜(例如细胞或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质的组合物的一种或多种要素传递通过膜，从而允许例如将所述一种或多种要素递送至细胞。
如本文所用，“多分散性指数”是描述系统的粒度分布的均质性的比率。例如小于0.3的小值指示狭窄粒度分布。
如本文所用，两亲性“聚合物”是包含寡聚物或聚合物的两亲性化合物。在一些实施方案中，两亲性聚合物可包含寡聚物片段，诸如两个或更多个PEG单体单元。在一些实施方案中，本文所述的两亲性聚合物可为PS 20。
如本文所用，术语“多肽”或“目标多肽”是指典型地通过肽键接合的氨基酸残基的聚合物，其可天然地(例如，经分离或经纯化)或以合成方式产生。
如本文所用，“RNA”是指可天然或非天然存在的核糖核酸。在一些实施方案中，RNA可包括经修饰和/或非天然存在的组分，诸如一种或多种核碱基、核苷、核苷酸或接头。RNA可包括帽结构、链终止核苷、茎环、polyA序列和/或多聚腺苷酸化信号。RNA可具有编码目标多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，RNA可为信使RNA(mRNA)。编码特定多肽的mRNA的翻译(例如，哺乳动物细胞内部的mRNA的体内翻译)可产生编码多肽。RNA可选自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)以及它们混合物组成的非限制性组。
如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/同时/单一途径/单一接触点(即，单一施用事件)施用的任何治疗剂的剂量。
如本文所用，“分次剂量”是将单一单位剂量或总每日剂量分成两个或更多个剂量。
如本文所用，“总每日剂量”是以24小时时期给出或开具处方的量。其可作为单一单位剂量施用。
如本文所用，术语“受试者”是指可例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的施用根据本公开的组合物或配制物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类)和/或植物。
如本文所用，“Tx”是指LNP、LNP溶液、冻干LNP组合物或LNP配制物的核酸完整性(例如mRNA完整性)降级至用于制备所述LNP、LNP溶液、冻干LNP组合物或LNP配制物的核酸(例如mRNA)的初始完整性的约X所持续的时间量。例如，“T80％”是指LNP、LNP溶液、冻干LNP组合物或LNP配制物的核酸完整性(例如mRNA完整性)降级至用于制备所述LNP、LNP溶液、冻干LNP组合物或LNP配制物的核酸(例如mRNA)的初始完整性的约80％所持续的时间量。又如，“T1/2”是指LNP、LNP溶液、冻干LNP组合物或LNP配制物的核酸完整性(例如mRNA完整性)降级至用于制备所述LNP、LNP溶液、冻干LNP组合物或LNP配制物的核酸(例如mRNA)的初始完整性的约1/2所持续的时间量。
如本文所用，“靶向细胞”是指任何一种或多种目标细胞。所述细胞可发现于生物体的体外、体内、原位或者组织或器官中。所述生物体可为动物。在一些实施方案中，所述生物体为哺乳动物。在一些实施方案中，所述生物体为人类。在一些实施方案中，所述生物体为患者。
如本文所用，“靶组织”是指任何一种或多种目标组织类型，其中治疗剂和/或预防剂的递送将导致所需的生物和/或药理效应。目标靶组织的实例包括特定组织、器官和系统或其组。在特定应用中，靶组织可为肾脏、肺、脾脏、在血管中(例如，冠状动脉内或股动脉内)的血管内皮或肿瘤组织(例如，经由肿瘤内注射)。“脱靶组织”是指任何一种或多种组织类型，其中编码蛋白的表达不会导致所需的生物和/或药理效应。在特定应用中，脱靶组织可包括肝脏和脾脏。
术语“治疗剂”或“预防剂”是指当施用至受试者时具有治疗、诊断和/或预防效应和/或引起所需的生物和/或药理效应的任何剂。治疗剂也称为“活性剂(active)”或“活性剂(active agent)”。所述剂包括但不限于细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、小分子药物、蛋白质和核酸。
如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送的剂(例如，核酸、药物、组合物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，所述量当施用至患有或易经受感染、疾病、病症和/或疾患的受试者时足以治疗所述感染、疾病、病症和/或疾患，改进其症状，诊断、预防所述感染、疾病、病症和/或疾患，和/或延迟其发作。
如本文所用，“转染”是指将物质(例如RNA)引入细胞中。转染可例如体外、离体或体内发生。
如本文所用，术语“治疗”是指部分地或完全地缓解、改善、改进、减轻特定感染、疾病、病症和/或疾患，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重程度，和/或降低其一种或多种症状或特征的发生率。在一些实施方案中，“治疗”癌症可指抑制肿瘤的生存、生长和/或扩散。出于降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险的目的，治疗可施用至未展现疾病、病症和/或疾患的病征的受试者，和/或施用至仅展现疾病、病症和/或疾患的早期病征的受试者。
如本文所用，“ζ电位”是例如粒子组合物中的脂质的动电位。
可离子化脂质
本公开提供了可离子化脂质。在一些实施方案中，可离子化脂质包括中心胺部分和至少一个生物可降解基团。在一些实施方案中，可离子化脂质为氨基脂质。本文所述的脂质可有利地用于脂质纳米粒子和脂质纳米粒子配制物以将治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)递送至哺乳动物细胞或器官。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可为式(IL-1)化合物中的一者或多者：
Figure GDA0004174332580000711
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
R10选自由H、OH、C1-3烷基和C2-3烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基、(CH2)qOR*和H组成的组，
并且每个q独立地选自1、2和3；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不为5元、6元或7元杂环烷基。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可为式(IL-X)化合物中的一者或多者：
Figure GDA0004174332580000731
或其N-氧化物，
或其盐或异构体，其中
或其盐或异构体，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
Rx选自由C1-6烷基、C2-6烯基、-(CH2)vOH和-(CH2)vN(R)2组成的组，
其中v选自1、2、3、4、5和6；
每个R5独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
R10选自由H、OH、C1-3烷基和C2-3烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基、(CH2)qOR*和H组成的组，
并且每个q独立地选自1、2和3；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在一些实施方案中，式(IL-I)化合物的子集包括式(IL-IA)的那些：
Figure GDA0004174332580000751
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，m为5、7或9。例如，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。例如，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IL-IB)的那些：
Figure GDA0004174332580000761
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中所有变量均如本文所定义。在一些实施方案中，m选自5、6、7、8和9；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(IL-I)化合物的子集包括式(IL-II)的那些：
Figure GDA0004174332580000762
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可为式(IL-VI)化合物中的一者或多者：
Figure GDA0004174332580000771
或其N-氧化物，
或其盐或异构体，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
每个R5独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由H、C1-3烷基和C2-3烯基组成的组；
RN为H或C1-3烷基；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；
Xa和Xb各自独立地为O或S；
R10选自由H、卤基、-OH、R、-N(R)2、-CN、-N3、-C(O)OH、-C(O)OR、-OC(O)R、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)OR、-S(O)2OR、-NO2、-S(O)2N(R)2、-N(R)S(O)2R、-NH(CH2)t1N(R)2、-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2、-NH(CH2)s1OR、-N((CH2)s1OR)2、碳环、杂环、芳基和杂芳基组成的组；
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
r为0或1；
t1选自1、2、3、4和5；
p1选自1、2、3、4和5；
q1选自1、2、3、4和5；并且
s1选自1、2、3、4和5。
在一些实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VI-a)的那些：
Figure GDA0004174332580000791
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中
R1a和R1b独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；并且
R2和R3独立地选自由C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VII)的那些：
Figure GDA0004174332580000792
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1为键或M’；并且
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIII)的那些：
Figure GDA0004174332580000801
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1为键或M’；并且
Ra’和Rb’独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；并且
R2和R3独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
式(IL-I)、(IL-IA)、(IL-VI)、(IL-VI-a)、(IL-VII)或(IL-VIII)中任一者的化合物在适用时包括以下特征中的一者或多者。
在一些实施方案中，M1为M’。
在一些实施方案中，M和M’独立地为-C(O)O-或-OC(O)-。
在一些实施方案中，M和M’中的至少一者为-C(O)O-或-OC(O)-。
在某些实施方案中，M和M’中的至少一者为-OC(O)-。
在某些实施方案中，M为-OC(O)-并且M’为-C(O)O-。在一些实施方案中，M为-C(O)O-并且M’为-OC(O)-。在某些实施方案中，M和M’各自为-OC(O)-。在一些实施方案中，M和M’各自为-C(O)O-。
在某些实施方案中，M和M’中的至少一者为-OC(O)-M”-C(O)O-。
在一些实施方案中，M和M’独立地为-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的至少一者为-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的一者为-C(O)O-或-OC(O)-并且另一者为-S-S-。例如，M为-C(O)O-或-OC(O)-并且M’为-S-S-，或者M’为-C(O)O-或-OC(O)-并且M为-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的一者为-OC(O)-M”-C(O)O-，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基。在其他实施方案中，M”为C1-6烷基或C2-6烯基。在某些实施方案中，M”是C1-4烷基或C2-4烯基。例如，在一些实施方案中，M”为C1烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C2烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C3烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C4烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C2烯基。例如，在一些实施方案中，M”为C3烯基。例如，在一些实施方案中，M”是C4烯基。
在一些实施方案中，l为1、3或5。
在一些实施方案中，R4为氢。
在一些实施方案中，R4不为氢。
在一些实施方案中，R4为未取代的甲基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，Q为OH。
在一些实施方案中，Q为-NHC(S)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-NHC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R。
在一些实施方案中，Q为-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，Q为-O(CH2)nN(R)2。
在一些实施方案中，Q为-O(CH2)nOR。
在一些实施方案中，Q为-N(R)R8。
在一些实施方案中，Q为-NHC(＝NR9)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-NHC(＝CHR9)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-OC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)OR。
在一些实施方案中，n为2。
在一些实施方案中，n为3。
在一些实施方案中，n为4。
在一些实施方案中，M1不存在。
在一些实施方案中，至少一个R5为羟基。例如，一个R5为羟基。
在一些实施方案中，至少一个R6为羟基。例如，一个R6为羟基。
在一些实施方案中，R5和R6中的一者为羟基。例如，一个R5为羟基，并且每个R6为氢。例如，一个R6为羟基，并且每个R5为氢。
在一些实施方案中，Rx为C1-6烷基。在一些实施方案中，Rx为C1-3烷基。例如，Rx为甲基。例如，Rx为乙基。例如，Rx为丙基。
在一些实施方案中，Rx为-(CH2)vOH，并且v为1、2或3。例如，Rx为甲酰氧基。例如，Rx为乙酰氧基。例如，Rx为丙酰氧基。
在一些实施方案中，Rx为-(CH2)vN(R)2，v为1、2或3，并且每个R为H或甲基。例如，Rx为甲氨基、甲基甲氨基或二甲基甲氨基。例如，Rx为氨基甲基、甲基氨基甲基或二甲基氨基甲基。例如，Rx为氨基乙基、甲基氨基乙基或二甲基氨基乙基。例如，Rx为氨基丙基、甲基氨基丙基或二甲基氨基丙基。
在一些实施方案中，R'为C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”或-YR”。
在一些实施方案中，R2和R3独立地为C3-14烷基或C3-14烯基。
在一些实施方案中，R1b为C1-14烷基。在一些实施方案中，R1b为C2-14烷基。在一些实施方案中，R1b为C3-14烷基。在一些实施方案中，R1b为C1-8烷基。在一些实施方案中，R1b为C1-5烷基。在一些实施方案中，R1b为C1-3烷基。在一些实施方案中，R1b选自C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基和C5烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C1烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C2烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C3烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C4烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C5烷基。
在一些实施方案中，R1不同于-(CHR5R6)m-M-CR2R3R7。
在一些实施方案中，-CHR1aR1b-不同于-(CHR5R6)m-M-CR2R3R7。
在一些实施方案中，R7为H。在一些实施方案中，R7选自C1-3烷基。例如，在一些实施方案中，R7为C1烷基。例如，在一些实施方案中，R7为C2烷基。例如，在一些实施方案中，R7为C3烷基。在一些实施方案中，R7选自C4烷基、C4烯基、C5烷基、C5烯基、C6烷基、C6烯基、C7烷基、C7烯基、C9烷基、C9烯基、C11烷基、C11烯基、C17烷基、C17烯基、C18烷基和C18烯基。
在一些实施方案中，Rb’为C1-14烷基。在一些实施方案中，Rb’为C2-14烷基。在一些实施方案中，Rb’为C3-14烷基。在一些实施方案中，Rb’为C1-8烷基。在一些实施方案中，Rb’为C1-5烷基。在一些实施方案中，Rb’为C1-3烷基。在一些实施方案中，Rb’选自C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基和C5烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C1烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C2烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C3烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C4烷基。
在一个实施方案中，式(IL-I)化合物具有式(IL-IIa)：
Figure GDA0004174332580000841
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一个实施方案中，式(IL-I)化合物具有式(IL-IIb)：
Figure GDA0004174332580000842
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一个实施方案中，式(IL-I)化合物具有式(IL-IIc)或(IL-IIe)：
Figure GDA0004174332580000843
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一个实施方案中，式(IL-I)化合物具有式(IL-IIf)：
Figure GDA0004174332580000851
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中M为-C(O)O-或-OC(O)-，M”为C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
在又一个实施方案中，式(IL-I)化合物具有式(IL-IId)：
Figure GDA0004174332580000852
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R'、R”和R2至R6如本文所述。在一些实施方案中，R2和R3中的每一者可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在又一个实施方案中，式(IL-I)化合物具有式(IL-IIg)：
Figure GDA0004174332580000853
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，M”为C1-6烷基(例如C1-4烷基)或C2-6烯基(例如C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIa)的那些：
Figure GDA0004174332580000861
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(VI)化合物的子集包括式(IL-VIIIa)的那些：
Figure GDA0004174332580000862
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIIb)的那些：
Figure GDA0004174332580000863
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIb-1)的那些：
Figure GDA0004174332580000871
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIb-2)的那些：
Figure GDA0004174332580000872
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIb-3)的那些：
Figure GDA0004174332580000873
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIc)的那些：
Figure GDA0004174332580000874
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIId)的那些：
Figure GDA0004174332580000881
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIIc)的那些：
Figure GDA0004174332580000882
在另一个实施方案中，式(IL-VI)化合物的子集包括式(IL-VIIId)的那些：
Figure GDA0004174332580000883
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在一些实施方案中，可离子化脂质是描述于PCT申请第PCT/US 2020/051613号、第PCT/US2020/051613号和第PCT/US2020/051629号，和PCT公布第WO 2017/049245号、第WO2018/170306号、第WO 2018/170336号和第WO 2020/061367号中的一种或多种化合物。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自描述于美国申请第62/475,166号中的化合物1-280。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580000891
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580000892
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580000893
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580000894
或其盐。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可为式(IL-VIVa)化合物中的一者或多者：
Figure GDA0004174332580000901
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R’支链为
Figure GDA0004174332580000902
并且R’环状为：
Figure GDA0004174332580000903
并且
R'b为：
Figure GDA0004174332580000904
或
Figure GDA0004174332580000905
其中
Figure GDA0004174332580000906
表示连接点；
其中Raγ和Rbγ各自独立地为C2-12烷基或C2-12烯基；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为-(CH2)2OH；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
Ya为C3-6碳环；
R*”a选自由C1-15烷基和C2-15烯基组成的组；并且
s为2或3。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可为式(IL-VIVb)化合物中的一者或多者：
Figure GDA0004174332580000911
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R’支链为
Figure GDA0004174332580000912
并且R’环状为：
Figure GDA0004174332580000913
并且
R'b为：
Figure GDA0004174332580000914
或
Figure GDA0004174332580000915
其中
Figure GDA0004174332580000916
表示连接点；
其中Raγ和Rbγ各自独立地为C2-12烷基或C2-12烯基；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为
Figure GDA0004174332580000917
其中
Figure GDA0004174332580000918
表示连接点；
R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
Ya为C3-6碳环；
R*”a选自由C1-15烷基和C2-15烯基组成的组；并且
s为2或3。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自：
Figure GDA0004174332580000921
在一些方面，本公开的可离子化脂质可为式(IL-III)化合物中的一者或多者：
Figure GDA0004174332580000922
或其盐或异构体，其中，
W为
Figure GDA0004174332580000931
环A为
Figure GDA0004174332580000932
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)均不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；
RX1和RX2各自独立地为H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基和杂芳基组成的组；
M*为C1-C6烷基，
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
每个R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
每个R’独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’组成的组；并且
n为1-6的整数；
其中当环A为
Figure GDA0004174332580000941
时，则
i)X1、X2和X3中的至少一者不为-CH2-；并且/或者
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-R”MR'。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IL-IIIa1)-(IL-IIIa8)中的任一者：
Figure GDA0004174332580000942
Figure GDA0004174332580000951
在一些实施方案中，可离子化脂质是描述于PCT公布第WO 2017/112865号、第WO2018/232120号中的化合物中的一者或多者。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自描述于PCT公布第WO2018/232120号中的化合物1-156。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自描述于PCT公布第WO 2017/112865号中的化合物1-16、42-66、68-76和78-156。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580000961
或其盐。
根据式(IL-1)、(IL-IA)、(IL-IB)、(IL-II)、(IL-IIa)、(IL-IIb)、(IL-IIc)、(IL-IId)、(IL-IIe)、(IL-IIf)、(IL-IIg)、(IL-VI)、(IL-VIIa)、(IL-VIIIa)、(IL-VIIIb)、(IL-VIIb-1)、(IL-VIIb-2)、(IL-VIIb-3)、(IL-VIIc)、(IL-VIId)、(IL-VIIIc)、(IL-VIIId)、(IL-VIVa)、(IL-VIVb)、(IL-III)、(IL-IIIa1)、(IL-IIIa2)、(IL-IIIa3)、(IL-IIIa4)、(IL-IIIa5)、(IL-IIIa6)、(IL-IIIa7)或(IL-IIIa8)的脂质的中心胺部分可在生理pH下质子化。因此，脂质可在生理pH下具有正电荷或部分正电荷。此类脂质可称为阳离子或可离子化(氨基)脂质。脂质还可为两性离子的，即具有正电荷和负电荷两者的中性分子。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自由以下组成的组：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
聚乙二醇(PEG)脂质
如本文所用，术语“PEG脂质”是指经聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG脂质的非限制性实例包括经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、经PEG修饰的二烷基胺和经PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也称为PEG化脂质。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油烯基、PEG-二油烯基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一个实施方案中，PEG脂质选自由经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油、经PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物组成的组。
在一些实施方案中，PEG脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22的那些。在一些实施方案中，PEG脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)的大小为约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿。在一个实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子可包含PEG脂质，其为不可扩散PEG。不可扩散PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG脂质是本领域中已知的，诸如描述于美国专利第8158601号和国际公布第WO2015/130584 A2号中的那些，所述文献通过引用整体并入本文。
一般来说，本文所述的各式的一些其他脂质组分(例如PEG脂质)可如2016年12月10日提交的标题为“Compositions and Methods fo r Delivery of TherapeuticAgents”的国际专利申请第PCT/US2016/000129号中所述合成，所述专利申请通过引用整体并入。
脂质纳米粒子或脂质纳米粒子配制物的脂质组分可包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，诸如PEG或经PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称为PEG化脂质。PEG脂质是经聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油、经PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物的非限制性组。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是PEG DMG的经修饰形式。PEG-DMG具有以下结构：
Figure GDA0004174332580000981
在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可为描述于国际公布第WO2012099755号中的PEG化脂质，所述公布的内容通过引用整体并入本文。本文所述的这些示例性PEG脂质中的任一者均可经修饰以在PEG链上包含羟基。在一些实施方案中，PEG脂质为PEG-OH脂质。如本文一般所定义，“PEG-OH脂质”(本文中也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)基团的PEG化脂质。在一些实施方案中，PEG-OH脂质在PEG链上包括一个或多个羟基。在一些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端包含-OH基团。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质为式(PL-I)化合物。本文提供了式(PL-I)化合物：
Figure GDA0004174332580000991
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r为1与100之间的整数，包括1和100；
L1为任选取代的C1-10亚烷基，其中任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)代替；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
Figure GDA0004174332580000992
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)代替；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O代替；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2。
在一些实施方案中，式(PL-I)化合物为PEG-OH脂质(即，R3为-ORO，并且RO为氢)。在一些实施方案中，式(PL-I)化合物具有式(PL-I-OH)：
Figure GDA0004174332580001001
或其盐。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质为PEG化脂肪酸。在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质为式(PL-II)化合物。本文提供了式(PL-II)化合物：
Figure GDA0004174332580001011
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r为1与100之间的整数，包括1和100；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O代替；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，式(PL-II)化合物具有式(PL-II-OH)：
Figure GDA0004174332580001012
或其盐，其中：
其中r为1与100之间的整数；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O代替；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，r为10至80之间、20至70之间、30至60之间或40至50之间的整数。
在一些实施方案中，r为45。
在一些实施方案中，R5为C17烷基。
在又其他实施方案中，式(PL-II)化合物为：
Figure GDA0004174332580001021
或其盐。
在一个实施方案中，式(PL-II)化合物为
Figure GDA0004174332580001022
在一些方面，本文所述的药物组合物的脂质组成不包含PEG脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质可为描述于美国申请第62/520,530号中的一种或多种PEG脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质为式(PL-III)化合物：
Figure GDA0004174332580001031
或其盐或异构体，其中s为1与100之间的整数。
在一些实施方案中，PEG脂质为下式的化合物：
Figure GDA0004174332580001032
或其盐或异构体。
结构脂质
如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇并且还指含有固醇部分的脂质。
在脂质纳米粒子中并入结构脂质可帮助减轻粒子中的其他脂质的聚集。结构脂质可选自包括但不限于胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、西红柿碱、西红柿苷、熊果酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇、类固醇以及它们的混合物的组。在一些实施方案中，结构脂质为两种或更多种组分的混合物，各组分独立地选自胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、西红柿碱、西红柿苷、熊果酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇和类固醇。在一些实施方案中，结构脂质为固醇。在一些实施方案中，结构脂质为两种或更多种固醇的混合物。如本文所定义，“固醇”是由类固醇组成的类固醇子组。在一些实施方案中，结构脂质为类固醇。在一些实施方案中，结构脂质为胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质为胆固醇的类似物。在一些实施方案中，结构脂质为α-生育酚。
在一些实施方案中，结构脂质可为描述于美国申请第62/520,530号中的一种或多种结构脂质。
囊封剂
在本公开的一些实施方案中，所述囊封剂为式(EA-I)化合物：
Figure GDA0004174332580001041
或其盐或异构体，其中
R201和R202各自独立地选自由H、C1-C6烷基、C2-C6烯基和(C＝NH)N(R101)2组成的组，其中每个R101独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R203选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；
R204选自由H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C(O)(OC1-C20烷基)、C(O)(OC2-C20烯基)、C(O)(NHC1-C20烷基)和C(O)(NHC2-C20烯基)组成的组；
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些实施方案中，R201和R202各自独立地选自由H和CH3组成的组。
在一些实施方案中，R201和R202各自独立地选自由(C＝NH)NH2和(C＝NH)N(CH3)2组成的组。
在一些实施方案中，R203选自由C1-C20烷基、C8-C18烷基和C12-C16烷基组成的组。
在一些实施方案中，R204选自由H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C(O)(OC1-C20烷基)、C(O)(OC2-C20烯基)、C(O)(NHC1-C20烷基)和C(O)(NHC2-C20烯基)；C8-C18烷基、C8-C18烯基、C(O)(OC8-C18烷基)、C(O)(OC8-C18烯基)、C(O)(NHC8-C18烷基)和C(O)(NHC8-C18烯基)；以及C12-C16烷基、C12-C16烯基、C(O)(OC12-C16烷基)、C(O)(OC12-C16烯基)、C(O)(NHC12-C16烷基)和C(O)(NHC12-C16烯基)组成的组；
在一些实施方案中，n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；n1选自1、2、3、4、5和6；n1选自2、3和4。
在一些实施方案中，n1为3。
在本公开的一些实施方案中，所述囊封剂为式(EA-II)化合物：
Figure GDA0004174332580001051
或其盐或异构体，其中
X101为键、NH或O；
R101和R102各自独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R103和R104各自独立地选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；并且
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些实施方案中，X101为键。
在一些实施方案中，X101为NH。
在一些实施方案中，X101为O。
在一些实施方案中，R101和R102各自独立地选自由H和CH3组成的组。
在一些实施方案中，R103选自由C1-C20烷基、C8-C18烷基和C12-C16烷基组成的组。
在一些实施方案中，R104选自由C1-C20烷基、C8-C18烷基和C12-C16烷基组成的组。
在一些实施方案中，n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；n1选自1、2、3、4、5和6；n1选自2、3和4。
在一些实施方案中，n1为3。
示例性囊封剂包括但不限于月桂酰精氨酸乙酯、肉豆蔻酰精氨酸乙酯、棕榈酰精氨酸乙酯、胆固醇-精氨酸乙酯、油酸精氨酸乙酯、癸酸精氨酸乙酯和辛酸精氨酸乙酯。
在某些实施方案中，所述囊封剂为月桂酰精氨酸乙酯，
Figure GDA0004174332580001071
或其盐或异构体。
在某些实施方案中，所述囊封剂为选自由以下组成的组的至少一种化合物：
Figure GDA0004174332580001072
Figure GDA0004174332580001081
或其盐和异构体，诸如例如游离碱、TFA盐和/或HCl盐。
磷脂
磷脂可组装成一个或多个脂质双层。一般来说，磷脂包含一个磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可选自例如由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚麻油酸、α-次亚麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、花生油酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。
特定磷脂可促进与膜的融合。在一些实施方案中，阳离子磷脂可与膜(例如细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质的组合物(例如LNP)的一种或多种要素(例如治疗剂)传递通过膜，从而允许例如将所述一种或多种要素递送至靶组织。
还预期非天然磷脂物质，包括具有包括支链、氧化、环化和炔烃在内的修饰和取代的天然物质。在一些实施方案中，磷脂可被一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键代替的烯基基团)官能化或与所述一种或多种炔交联。在适当反应条件下，炔烃基团可在暴露于叠氮化物时经历铜催化的环加成。此类反应可用于官能化纳米粒子组合物的脂质双层以促进膜渗透或细胞识别，或者可用于使纳米粒子组合物缀合于可用组分，诸如靶向或成像部分(例如染料)。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括磷酸鞘脂，诸如鞘磷脂。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂为DSPC的类似物或变体。在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂为式(PL-I)化合物：
Figure GDA0004174332580001091
或其盐，其中：
每个R1独立地为任选取代的烷基；或者任选地两个R1与介入原子接合在一起以形成任选取代的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或者任选地三个R1与介入原子接合在一起以形成任选取代的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
Figure GDA0004174332580001101
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-或-NRNC(O)N(RN)-代替；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-代替；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2；
前提条件是所述式(I)化合物不具有下式：
Figure GDA0004174332580001111
其中R2的每个实例独立地为未取代的烷基、未取代的烯基或未取代的炔基。
在一些实施方案中，磷脂可为描述于美国申请第62/520,530号中的一种或多种磷脂。
在一些实施方案中，磷脂可选自由以下组成的非限制性组：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。在一些实施方案中，LNP包括DSPC。在一些实施方案中，LNP包括DOPE。在一些实施方案中，LNP包括DSPC和DOPE两者。
i)磷脂头修饰
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含经修饰的磷脂头(例如，经修饰的胆碱基团)。在一些实施方案中，具有经修饰的头的磷脂是具有经修饰的季胺的DSPC或其类似物。在一些实施方案中，在式(PL-I)的实施方案中，R1中的至少一者不为甲基。在一些实施方案中，R1中的至少一者不为氢或甲基。在一些实施方案中，式(PL-I)化合物是下式之一：
Figure GDA0004174332580001121
或其盐，其中：
每个t独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个u独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
每个v独立地为1、2或3。
在一些实施方案中，式(PL-I)化合物具有式(PL-I-a)：
Figure GDA0004174332580001122
或其盐。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含替代甘油酯部分的环状部分。在一些实施方案中，可用于本发明的磷脂为DSPC或其类似物，具有替代甘油酯部分的环状部分。在一些实施方案中，式(PL-I)化合物具有式(PL-I-b)：
Figure GDA0004174332580001131
或其盐。
ii)磷脂尾修饰
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含经修饰的尾。在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂为DSPC或其类似物，具有经修饰的尾。如本文所述，“经修饰的尾”可为具有较短或较长脂族链、引入支链的脂族链、引入取代基的脂族链、其中一个或多个亚甲基由环状或杂原子基团代替的脂族链或它们的任何组合的尾。在一些实施方案中，在一些实施方案中，(PL-I)化合物具有式(PL-I-a)，或其盐，其中R2的至少一个实例为R2的每个实例为任选地取代的C1-30烷基，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-代替。
在一些实施方案中，式(PL-I)化合物具有式(PL-I-c)：
Figure GDA0004174332580001132
或其盐，其中：
每个x独立地为0-30之间的整数，包括0和30；并且
G的每个实例独立地选自由以下组成的组：任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含经修饰的磷酸胆碱部分，其中将季胺连接至磷酰基的烷基链不是亚乙基(例如，n不为2)。因此，在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂为式(PL-I)化合物，其中n为1、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，式(PL-I)化合物具有下式之一：
Figure GDA0004174332580001141
或其盐。
替代脂质
在一些实施方案中，使用替代脂质代替本公开的磷脂。此类替代脂质的非限制性实例包括以下：
Figure GDA0004174332580001151
佐剂
在一些实施方案中，包括本文所述的一种或多种脂质的LNP还可包括一种或多种佐剂，例如吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡脱氧核苷酸(例如A或B类)、poly(I:C)、氢氧化铝和Pam3CSK4。
治疗剂
脂质纳米粒子(例如空LNP或负载LNP)可包括一种或多种治疗剂和/或预防剂。本公开提供了向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂、在哺乳动物细胞中产生目标多肽以及治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包括治疗剂和/或预防剂的脂质纳米粒子(例如空LNP或负载LNP)和/或使哺乳动物细胞与包括治疗剂和/或预防剂的脂质纳米粒子(例如空LNP或负载LNP)接触。
治疗剂和/或预防剂包括生物学活性物质并且替代地称为“活性剂”。治疗剂和/或预防剂可为一旦递送至细胞或器官就在所述细胞、器官或其他身体组织或系统中引起所需变化的物质。此类物质可用于治疗一种或多种疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或疾患的小分子药物。
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是疫苗、引起免疫反应的化合物(例如，编码蛋白质或多肽或肽的多核苷酸或核酸分子或者蛋白质或多肽或肽)和/或另一治疗剂和/或预防剂。疫苗包括能够提供针对与传染病相关的一种或多种疾患的免疫性的化合物和制剂并且可包括编码传染病源性抗原和/或表位的mRNA。疫苗还包括指导针对癌细胞的免疫反应的化合物和制剂并且可包括编码肿瘤细胞源性抗原、表位和/或新表位的mRNA。在一些实施方案中，疫苗和/或能够引起免疫反应的化合物经由本公开组合物经肌肉内施用。
在其他实施方案中，治疗剂和/或预防剂是蛋白质，例如增加或代替天然存在的目标蛋白质所需的蛋白质。此类蛋白质或多肽可为天然存在的，或者可使用本领域中已知的方法进行修饰，例如以延长半衰期。示例性蛋白质是细胞内、跨膜或分泌性的。
多核苷酸和核酸
在一些实施方案中，治疗剂是增强(即，增加、刺激、上调)蛋白质表达的剂。可用于增强蛋白质表达的治疗剂类型的非限制性实例包括RNA、mRNA、dsRNA、CRISPR/Cas9技术、ssDNA和DNA(例如表达载体)。上调蛋白质表达的剂可上调天然存在或非天然存在的蛋白质(例如已被修饰以改进半衰期的嵌合蛋白，或包含所需氨基酸变化的蛋白质)的表达。示例性蛋白质包括细胞内、跨膜或分泌性蛋白质、肽或多肽。
在一些实施方案中，治疗剂是DNA治疗剂。DNA分子可为双链DNA、单链DNA(ssDNA)或作为部分双链DNA的分子(即，具有双链部分和单链部分)。在一些情况下，DNA分子是三链的或是部分三链的(即，具有三链部分和双链部分)。DNA分子可为环状DNA分子或线性DNA分子。
DNA治疗剂可为能够将基因转移至细胞中，例如编码转录物并且可表达转录物的DNA分子。在其他实施方案中，DNA分子是合成分子，例如体外产生的合成DNA分子。在一些实施方案中，DNA分子是重组分子。非限制性示例性DNA治疗剂包括质粒表达载体和病毒表达载体。
本文所述的DNA治疗剂(例如DNA载体)可包括多种不同特征。本文所述的DNA治疗剂(例如DNA载体)可包括非编码DNA序列。例如，DNA序列可包括针对基因的至少一种调控元件，例如启动子、增强子、终止元件、多聚腺苷酸化信号元件、剪接信号元件等。在一些实施方案中，非编码DNA序列是内含子。在一些实施方案中，非编码DNA序列是转座子。在一些实施方案中，本文所述的DNA序列可具有可操作性连接至转录活性基因的非编码DNA序列。在其他实施方案中，本文所述的DNA序列可具有未连接至基因的非编码DNA序列，即所述非编码DNA不调控所述DNA序列上的基因。
在一些实施方案中，在本公开的负载LNP中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂是核酸。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂选自由核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)组成的组。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂是DNA时，所述DNA选自由双链DNA、单链DNA(ssDNA)、部分双链DNA、三链DNA和部分三链DNA组成的组。在一些实施方案中，所述DNA选自由环状DNA、线性DNA和它们的混合物组成的组。
在一些实施方案中，在本公开的负载LNP中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂选自由质粒表达载体、病毒表达载体和它们的混合物组成的组。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂是RNA时，所述RNA选自由单链RNA、双链RNA(dsRNA)、部分双链RNA和它们的混合物组成的组。在一些实施方案中，所述RNA选自由环状RNA、线性RNA和它们的混合物组成的组。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂是RNA时，所述RNA选自由短干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、RNA干扰(RNAi)分子、微小RNA(miRNA)、antagomir、反义RNA、核酶、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、锁核酸(LNA)和CRISPR/Cas9技术和它们的混合物组成的组。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂是RNA时，所述RNA选自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)和它们的混合物组成的组。
在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂是mRNA。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂是经修饰的mRNA(mmRNA)。
在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂是并入微小RNA结合位点(miR结合位点)的mRNA。此外，在一些实施方案中，mRNA包括茎环、链终止核苷、polyA序列、多聚腺苷酸化信号和/或5'帽结构中的一者或多者。
mRNA可为天然或非天然存在的mRNA。mRNA可包括一个或多个如下文所述的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸，在所述情况下其可被称为“经修饰的mRNA”或“mmRNA”。如本文所述，“核苷”被定义为含有与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称为“核碱基”)组合的糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。如本文所述，“核苷酸”被定义为包括磷酸酯基的核苷。
mRNA可包括5'非翻译区(5'-UTR)、3'非翻译区(3'-UTR)和/或编码区(例如开放阅读框)。mRNA可包括任何合适数目的碱基对，包括数十个(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个)、数百个(例如，200、300、400、500、600、700、800或900个)或数千个(例如，1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000个)碱基对。任何数目(例如，全部、一些或无)的核碱基、核苷或核苷酸均可为规范物质的类似物，被取代、被修饰或以其他方式非天然存在。在某些实施方案中，特定核碱基类型的全部可被修饰。在一些实施方案中，全部尿嘧啶或尿苷均被修饰。当全部核碱基、核苷或核苷酸被修饰(例如，全部尿嘧啶或尿苷)时，所述mRNA可被称为“完全被修饰”，例如针对尿嘧啶或尿苷。
在一些实施方案中，如本文所述的mRNA可包括5'帽结构、链终止核苷酸、任选地Kozak序列(也称为Kozak共有序列)、茎环、polyA序列和/或多聚腺苷酸化信号。
5'帽结构或帽物质是包括通过接头接合的两个核苷部分的化合物并且可选自天然存在的帽、非天然存在的帽或帽类似物或抗-反向帽类似物(ARCA)。帽物质可包括一个或多个经修饰的核苷和/或接头部分。例如，天然mRNA帽可包括鸟嘌呤核苷酸和在7位置处甲基化的鸟嘌呤(G)核苷酸，由所述核苷酸的5'位置处的三磷酸酯键接合，例如m7G(5')ppp(5')G，通常书写为m7GpppG。帽物质还可为抗-反向帽类似物。可能的帽物质的非限制性列表包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG、m27,O3'GpppG、m27,O3'GppppG、m27,O2'GppppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG、m27,O3'GpppG、m27,O3'GppppG和m27,O2'GppppG。
mRNA可替代地或另外包括链终止核苷。例如，链终止核苷可包括在其糖基的2'和/或3'位置处脱氧的那些核苷。此类物质可包括3'脱氧腺苷(蛹虫草菌素(cordycepin))、3'脱氧尿苷、3'脱氧胞嘧啶、3'脱氧鸟苷、3'脱氧胸腺嘧啶和2',3'二脱氧核苷(诸如2',3'二脱氧腺苷、2',3'二脱氧尿苷、2',3'二脱氧胞嘧啶、2',3'二脱氧鸟苷和2',3'二脱氧胸腺嘧啶)。在一些实施方案中，将链终止核苷酸并入mRNA中例如3'-末端处可实现mRNA的稳定化。
mRNA可替代地或另外包括茎环，诸如组蛋白茎环。茎环可包括2、3、4、5、6、7、8个或更多个核苷酸碱基对。例如，茎环可包括4、5、6、7或8个核苷酸碱基对。茎环可位于mRNA的任何区域中。例如，茎环可位于非翻译区(5'非翻译区或3'非翻译区)、编码区或polyA序列或尾端中、之前或之后。在一些实施方案中，茎环可影响mRNA的一种或多种功能，诸如翻译起始、翻译效率和/或转录终止。
mRNA可替代地或另外包括polyA序列和/或多聚腺苷酸化信号。polyA序列可完全地或主要包含腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物。polyA序列还可包含稳定化核苷酸或类似物。例如，polyA序列可包括脱氧胸苷作为稳定化核苷酸或类似物，例如反向(或反向键)脱氧胸苷(dT)。关于使用反向dT和其他稳定化poly A序列修饰的细节可见于例如WO2017/049275A2中，所述文件的内容通过引用并入本文。polyA序列可为与mRNA的3'非翻译区相邻定位的尾端。在一些实施方案中，polyA序列可影响mRNA的核输出、翻译和/或稳定性。
mRNA可替代地或另外包括微小RNA结合位点。微小RNA结合位点(或miR结合位点)可用于调控多种组织或细胞类型中的mRNA表达。在示例性实施方案中，miR结合位点被工程改造至mRNA的3'UTR序列中以调控(例如，增强)mRNA在表达同源miR的细胞或组织中的降解。此种调控可用于调控或控制mRNA的“脱靶”表达，即在体内非所需细胞或组织中的表达。关于使用mir结合位点的细节可见于例如WO 2017/062513 A2中，所述文件的内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，mRNA是包含第一编码区和第二编码区的双顺反子mRNA，所述编码区具有包含允许第一编码区与第二编码区之间的内部翻译起始的内部核糖体进入位点(IRES)序列的介入序列，或具有编码自裂解肽(诸如2A肽)的介入序列。IRES序列和2A肽典型地用于增强来自同一载体的多种蛋白质的表达。多种IRES序列是已知的并且在本领域中可获得并且可加以使用，包括例如脑心肌炎病毒IRES。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含一个或多个经修饰的核碱基、核苷或核苷酸(称为“经修饰的mRNA”或“mmRNA”)。在一些实施方案中，经修饰的mRNA可具有适用特性，包括如与参考未修饰mRNA相比，增强的稳定性、细胞内保留、增强的翻译和/或缺乏其中引入所述mRNA的细胞的先天免疫反应的实质诱导。因此，经修饰mRNA的使用可增强蛋白质产生效率、核酸的细胞内保留，以及具有降低的免疫原性。
在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3或4个)不同的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个)不同的经修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，相对于相应的未修饰mRNA，经修饰mRNA可在其中引入所述mRNA的细胞中具有降低的降解。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酰甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酰甲基-假尿苷、5-牛磺酰甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酰甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-阿拉伯糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、立西啶(lysidine，k2C)、α-硫代-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞苷、2'-F-阿拉伯糖-胞苷、2'-F-胞苷和2'-OH-阿拉伯糖-胞苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括a-硫代-腺苷、2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2'-F-阿拉伯糖-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿拉伯糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括a-硫代-鸟苷、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m22G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2'-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2'-F-阿拉伯糖-鸟苷和2'-F-鸟苷。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。在一些实施方案中，经修饰的核碱基是N1-甲基假尿苷(m1ψ)并且本公开的mRNA是完全地被N1-甲基假尿苷(m1ψ)修饰。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)表示mRNA中的75-100％尿嘧啶。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)表示mRNA中的100％尿嘧啶。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有经修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括7-脱氮-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-鸟苷、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，经修饰的核碱基是1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷或α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述经修饰的核碱基的组合(例如，2、3或4种前述经修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，mRNA包含2'-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在某些实施方案中，本公开的mRNA是针对特定修饰均一地被修饰(即，完全被修饰、通过整个序列修饰)。例如，mRNA可均一地被N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)修饰，意指mRNA序列中的所有尿苷或所有胞嘧啶核苷均被N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)代替。类似地，本公开的mRNA可通过用经修饰残基(诸如上文所陈述的那些)代替而针对存在于所述序列中的任何类型的核苷残基均一地被修饰。
在一些实施方案中，本公开的mRNA可在编码区(例如，编码多肽的开发阅读框)中被修饰。在其他实施方案中，mRNA可在除编码区之外的区中被修饰。例如，在一些实施方案中，提供5'-UTR和/或3'-UTR，其中任一者或两者可独立地含有一种或多种不同的核苷修饰。在此类实施方案中，核苷修饰还可存在于编码区中。
本公开的mmRNA可包括针对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰的组合。这些组合可包括本文所述的任何一种或多种修饰。
在列出单一修饰的情况下，所列出的核苷或核苷酸表示100％的所述A、U、G或C核苷酸或核苷已被修饰。在列出百分率的情况下，这些表示所存在的A、U、G或C三磷酸酯的总量中所述百分率的所述特定A、U、G或C核碱基三磷酸酯。例如，组合：25％5-氨基烯丙基-CTP+75％CTP/25％5-甲氧基-UTP+75％UTP是指多核苷酸，其中25％的胞嘧啶三磷酸酯是5-氨基烯丙基-CTP，而75％的胞嘧啶是CTP；而25％的尿嘧啶是5-甲氧基UTP，而75％的尿嘧啶是UTP。在未列出经修饰UTP的情况下，则天然存在的ATP、UTP、GTP和/或CTP用于所述多核苷酸中发现的那些核苷酸的100％位点中。在此实例中，所有GTP和ATP均保持未被修饰。
本公开的mRNA或其区域可经密码子优化。密码子优化方法是本领域中已知的并且可用于多种目的：匹配宿主生物体中的密码子频率以确保适当折叠，使GC含量产生偏好以增加mRNA稳定性或降低二级结构，使可削弱基因建构或表达的串联重复序列密码子或碱基连串降至最低，定制转录和翻译控制区，插入或去除蛋白质转运序列，去除/添加编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)，添加、去除或改组蛋白结构域，插入或删除限制位点，修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点，调节翻译速率以允许蛋白质的多个结构域适当地折叠，或降低或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的；非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park,CA)的服务和/或专属方法。在一些实施方案中，mRNA序列使用优化算法进行优化，例如以优化哺乳动物细胞中的表达或增强mRNA稳定性。
在某些实施方案中，本公开包括与任何本文所述的多核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的多核苷酸。
本公开的mRNA可通过本领域中可获得的方式，包括但不限于体外转录(IVT)和合成方法产生。可使用酶促(IVT)、固相、液相、组合合成方法、小区合成和接合方法。在一些实施方案中，mRNA使用IVT酶促合成方法制得。因此，本公开还包括可用于体外转录本文所述的mRNA的多核苷酸，例如DNA、构建体和载体。
非天然修饰的核碱基可在合成期间或合成后引入多核苷酸(例如，mRNA)中。在某些实施方案中，修饰可在核苷间键、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。在特定实施方案中，修饰可引入在多核苷酸链的末端处或所述多核苷酸链中的任何其他位置；使用化学合成或使用聚合酶。
酶促或化学接合方法可用于使多核苷酸或其区域与不同的功能部分(例如靶向或递送剂、荧光标记、液体、纳米粒子等)缀合。用于降低蛋白质表达的治疗剂
在一些实施方案中，治疗剂是降低(即，减少、抑制、下调)蛋白质表达的治疗剂。可用于降低蛋白质表达的治疗剂的类型的非限制性实例包括并入微小RNA结合位点(miR结合位点)的mRNA、微小RNA(miRNA)、antagomir、小(短)干扰RNA(siRNA)(包括短聚物(shortmer)和dicer-底物RNA)、RNA干扰(RNAi)分子、反义RNA、核酶、小发夹RNA(shRNA)、锁核酸(LNA)和CRISPR/Cas9技术。
感应序列和微小RNA(miRNA)结合位点
感应序列包括例如微小RNA(miRNA)结合位点、转录因子结合位点、结构化mRNA序列和/或基序、经工程改造以充当内源核酸结合分子的假受体的人工结合位点以及它们的组合。感应序列的非限制性实例描述于美国公布2014/0200261中，所述公布的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的包含编码多肽的开放阅读框(ORF)的多核糖核苷酸(例如核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))还包含感应序列。在一些实施方案中，感应序列为miRNA结合位点。
miRNA是19-25个核苷酸长的非编码RNA，其结合至多核糖核苷酸并且通过降低所述多核糖核苷酸的稳定性或通过抑制其翻译来下调基因表达。miRNA序列包含“种子”区，即成熟miRNA的位置2-8的区中的序列。miRNA种子可包含成熟miRNA的位置2-8或2-7。在一些实施方案中，miRNA种子可包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺苷(A)。在一些实施方案中，miRNA种子可包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺苷(A)。参见例如Grimson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett-Engele P,Lim LP,Bartel DP；Mol Cell.2007年7月6日；27(1):91-105。可对靶细胞或组织的miRNA进行谱分析，以确定miRNA存在或不存在于细胞或组织中。在一些实施方案中，本公开的多核糖核苷酸(例如核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))包含一个或多个微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA种子。此类序列可对应于任何已知的微小RNA，诸如美国公布US2005/0261218和美国公布US2005/0059005中教导的那些，这些公布中的每一者的内容均通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“微小RNA(miRNA或miR)结合位点”是指多核糖核苷酸内(例如DNA内或RNA转录物内，包括5'UTR和/或3'UTR中)的序列，其与整个miRNA或其区具有充足互补性以与miRNA相互作用、缔合或结合。在一些实施方案中，本公开的包含编码多肽的ORF的多核糖核苷酸还包含miRNA结合位点。在示例性实施方案中，多核糖核苷酸(例如核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))的5'UTR和/或3'UTR包含miRNA结合位点。
与miRNA具有充足互补性的miRNA结合位点是指互补程度足以促进miRNA介导的多核糖核苷酸调控，例如miRNA介导的多核糖核苷酸的翻译抑制或降解。在本公开的示例性方面，与miRNA具有充足互补性的miRNA结合位点是指互补程度足以促进miRNA介导的多核糖核苷酸降解，例如miRNA指导的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的mRNA裂解。miRNA结合位点可与例如19-25个核苷酸的miRNA序列、19-23个核苷酸的miRNA序列或22个核苷酸的miRNA序列具有互补性。miRNA结合位点可仅与miRNA的一部分互补，例如与天然存在的miRNA序列的全长的小于1、2、3或4个核苷酸的部分互补。在一些实施方案中，所需调控为mRNA降解。在一些实施方案中，miRNA结合位点具有充分或完全互补性(例如，在天然存在的miRNA的长度的全部或大部分上充分互补或完全互补)。在一些实施方案中，mRNA降解具有充分或完全互补性。
在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有互补性(例如，部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有完全互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有互补性(例如，部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有完全互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA序列具有完全互补性，但具有1、2或3个核苷酸取代、末端添加和/或截短。
在一些实施方案中，miRNA结合位点的长度与相应miRNA相同。在一些实施方案中，在5'末端、3'末端或两个末端处，miRNA结合位点比相应miRNA短一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个核苷酸。在其他实施方案中，在5'末端、3'末端或两个末端处，微小RNA结合位点比相应微小RNA短两个核苷酸。比相应miRNA短的miRNA结合位点仍能够使并入一个或多个miRNA结合位点的mRNA降解或防止mRNA翻译。
在一些实施方案中，miRNA结合位点结合至相应成熟miRNA，所述成熟miRNA是含有Dicer的活性RISC的一部分。在另一个实施方案中，miRNA结合位点与RISC中的相应miRNA的结合使含有miRNA结合位点的mRNA降解或防止mRNA被翻译。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA具有充足互补性，使得包含miRNA的RISC复合物裂解包含miRNA结合位点的多核糖核苷酸。在一些实施方案中，miRNA结合位点具有不完美互补性，使得包含miRNA的RISC复合物诱导包含miRNA结合位点的多核糖核苷酸中的不稳定性。在另一个实施方案中，miRNA结合位点具有不完美互补性，使得包含miRNA的RISC复合物抑制包含miRNA结合位点的多核糖核苷酸的转录。
在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应miRNA具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个错配。
在一些实施方案中，miRNA结合位点具有分别与相应miRNA的至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个连续核苷酸互补的至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个连续核苷酸。
通过将一个或多个miRNA结合位点工程改造至本公开的多核糖核苷酸中，所述多核糖核苷酸可经靶向用于降解或减少的翻译，只要可获得所讨论的miRNA。这可减少递送多核糖核苷酸时的脱靶效应。在一些实施方案中，如果本公开的多核糖核苷酸不欲递送至组织或细胞，而是终止于组织或细胞，则如果miRNA的一个或多个结合位点经工程改造至所述多核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中，则所述组织或细胞中的丰富miRNA可抑制目标基因的表达。
相反，miRNA结合位点可从其中天然存在这些结合位点的多核糖核苷酸序列中去除，以便增加特定组织中的蛋白质表达。在一些实施方案中，针对特定miRNA的结合位点可从多核糖核苷酸中去除以改善含有miRNA的组织或细胞中的蛋白质表达。
在一个实施方案中，本公开的多核糖核苷酸可在5'UTR和/或3'UTR中包括至少一个miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂引导至特定细胞，诸如但不限于正常细胞和/或癌细胞。在另一个实施方案中，本公开的多核糖核苷酸可在5'-UTR和/或3'-UTR中包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂引导至特定细胞，诸如但不限于正常细胞和/或癌细胞。
对多种组织中的表达的调控可通过引入或去除一个或多个miRNA结合位点来实现。可基于疾病中miRNA表达模式和/或其谱分析来决定去除或插入miRNA结合位点。已报告了对miRNA、miRNA结合位点及其表达模式和在生物学中的作用的鉴定(例如，Bonauer等人,Curr Drug Targets 201011:943-949；Anand和Cheresh Curr Opin Hematol 201118:171-176；Contreras和Rao Leukemia 201226:404-413(2011年12月20日.doi:10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell2009136:215-233；Landgraf等人,Cell,2007129:1401-1414；Gentner和Naldini,Tissue Antigens.201280:393-403以及其中所有参考文献；所述文献中的每一者通过引用整体并入本文)。
miRNA和miRNA结合位点可对应于任何已知序列，包括描述于美国公布第2014/0200261号、第2005/0261218号和第2005/0059005号中的非限制性实例，所述公布中的每一者通过引用整体并入本文。
其中已知miRNA调控mRNA并且由此调控蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
具体而言，已知miRNA在免疫细胞(也称为造血细胞)，诸如抗原呈递细胞(APC)(例如树突状细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等中差异性表达。免疫细胞特异性miRNA牵涉于免疫原性、自身免疫性、对感染的免疫反应、炎症以及在基因疗法和组织/器官移植之后的非所需免疫反应中。免疫细胞特异性miRNA还调控造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和细胞凋亡的多个方面。在一些实施方案中，miR-142和miR-146仅在免疫细胞中表达，尤其在骨髓树突状细胞中很丰富。已证明，对多核糖核苷酸的免疫反应可通过向所述多核糖核苷酸的3'-UTR中添加miR-142结合位点来关闭，使得能够在组织和细胞中进行更稳定的基因转移。miR-142有效地降解抗原呈递细胞中的外源性多核糖核苷酸并且抑制经转导细胞的细胞毒性消除(例如，Annoni A等人,blood,2009,114,5152-5161；Brown BD,等人,Nat med.2006,12(5),585-591；BrownBD,等人,blood,2007,110(13):4144-4152，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文)。
抗原介导的免疫反应可指由外来抗原触发的免疫反应，这些外来抗原在进入生物体时由抗原呈递细胞处理并且呈现于抗原呈递细胞的表面上。T细胞可识别呈递的抗原并且诱导表达所述抗原的细胞的细胞毒性消除。
将miR-142结合位点引入本公开的多核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中可通过miR-142介导的降解选择性地抑制抗原呈递细胞中的基因表达，从而限制抗原呈递细胞(例如树突状细胞)中的抗原呈递并且由此防止在递送所述多核糖核苷酸之后出现抗原介导的免疫反应。所述多核糖核苷酸接着稳定表达于靶组织或细胞中而不会触发细胞毒性消除。
在一个实施方案中，已知表达于免疫细胞、尤其抗原呈递细胞中的miRNA的结合位点可经工程改造至本公开的多核糖核苷酸中，以通过miRNA介导的RNA降解抑制所述多核糖核苷酸在抗原呈递细胞中的表达，从而抑制抗原介导的免疫反应。所述多核糖核苷酸在其中未表达免疫细胞特异性miRNA的非免疫细胞中维持表达。在一些实施方案中，在一些实施方案中，为了防止针对肝脏特异性蛋白的免疫原性反应，可去除任何miR-122结合位点并且miR-142(和/或mirR-146)结合位点可经工程改造至本公开的多核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中。
为了进一步驱动APC和巨噬细胞中的选择性降解和抑制，本公开的多核糖核苷酸可在5'UTR和/或3'UTR中包括另一负调控元件，单独或与miR-142和/或miR-146结合位点组合。作为非限制性实例，另一负调控元件为组成性衰减组件(CDE)。
免疫细胞特异性miRNA包括但不限于hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-7a-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7i-5p、miR-10a-3p、miR-10a-5p、miR-1184、hsa-let-7f-1--3p、hsa-let-7f-2--5p、hsa-let-7f-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1279、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-132-3p、miR-132-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-146a-3p、miR-146a-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147a、miR-147b、miR-148a-5p、miR-148a-3p、miR-150-3p、miR-150-5p、miR-151b、miR-155-3p、miR-155-5p、miR-15a-3p、miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-15b-3p、miR-16-1-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181a-2-3p、miR-182-3p、miR-182-5p、miR-197-3p、miR-197-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-223-3p、miR-223-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-23b-3p、miR-23b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-26a-1-3p、miR-26a-2-3p、miR-26a-5p、miR-26b-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-27b-3p、miR-27b-5p、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-2909、miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p、miR-29c-3p、miR-29c-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-331-5p、miR-339-3p、miR-339-5p、miR-345-3p、miR-345-5p、miR-346、miR-34a-3p、miR-34a-5p、miR-363-3p、miR-363-5p、miR-372、miR-377-3p、miR-377-5p、miR-493-3p、miR-493-5p、miR-542、miR-548b-5p、miR548c-5p、miR-548i、miR-548j、miR-548n、miR-574-3p、miR-598、miR-718、miR-935、miR-99a-3p、miR-99a-5p、miR-99b-3p和miR-99b-5p。此外，可通过微阵列杂交和切片机分析在免疫细胞中鉴定新颖miRNA(例如，JimaDD等人,Blood,2010,116:e118-e127；Vaz C等人,BMC Genomics,2010,11,288，所述文献中的每一者的内容通过引用整体并入本文)。
已知表达于肝脏中的miRNA包括但不限于miR-107、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1228-3p、miR-1228-5p、miR-1249、miR-129-5p、miR-1303、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-152、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p、miR-296-5p、miR-557、miR-581、miR-939-3p和miR-939-5p。针对任何肝脏特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在肝脏中的表达。肝脏特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的多核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知表达于肺中的miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-7a-3p、let-7a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-127-3p、miR-127-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-130b-3p、miR-130b-5p、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-18b-3p、miR-18b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-296-3p、miR-296-5p、miR-32-3p、miR-337-3p、miR-337-5p、miR-381-3p和miR-381-5p。任何肺特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在肺中的表达。肺特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的多核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知表达于心脏中的miRNA包括但不限于miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-186-3p、miR-186-5p、miR-208a、miR-208b、miR-210、miR-296-3p、miR-320、miR-451a、miR-451b、miR-499a-3p、miR-499a-5p、miR-499b-3p、miR-499b-5p、miR-744-3p、miR-744-5p、miR-92b-3p和miR-92b-5p。任何心脏特异性微小RNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在心脏中的表达。心脏特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的多核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知表达于神经系统中的miRNA包括但不限于miR-124-5p、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1271-3p、miR-1271-5p、miR-128、miR-132-5p、miR-135a-3p、miR-135a-5p、miR-135b-3p、miR-135b-5p、miR-137、miR-139-5p、miR-139-3p、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-153、miR-181c-3p、miR-181c-5p、miR-183-3p、miR-183-5p、miR-190a、miR-190b、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR-30c-5p、miR-30d-3p、miR-30d-5p、miR-329、miR-342-3p、miR-3665、miR-3666、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-383、miR-410、miR-425-3p、miR-425-5p、miR-454-3p、miR-454-5p、miR-483、miR-510、miR-516a-3p、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-571、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-7-5p、miR-802、miR-922、miR-9-3p和miR-9-5p。富集于神经系统中的miRNA还包括特异性地表达于神经元中的那些，包括但不限于miR-132-3p、miR-132-3p、miR-148b-3p、miR-148b-5p、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-320b、miR-320e、miR-323a-3p、miR-323a-5p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-922，和特异性地表达于神经胶质细胞中的那些，包括但不限于miR-1250、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-219-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-3065-3p、miR-3065-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-32-5p、miR-338-5p和miR-657。任何CNS特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在神经系统中的表达。神经系统特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的多核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知表达于胰腺中的miRNA包括但不限于miR-105-3p、miR-105-5p、miR-184、miR-195-3p、miR-195-5p、miR-196a-3p、miR-196a-5p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-30a-3p、miR-33a-3p、miR-33a-5p、miR-375、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-493-3p、miR-493-5p和miR-944。任何胰腺特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在胰腺中的表达。胰腺特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的多核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知表达于肾中的miRNA包括但不限于miR-122-3p、miR-145-5p、miR-17-5p、miR-192-3p、miR-192-5p、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-204-3p、miR-204-5p、miR-210、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-296-3p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR30c-5p、miR-324-3p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-363-3p、miR-363-5p和miR-562。任何肾特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在肾中的表达。肾特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的多核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知表达于肌肉中的miRNA包括但不限于let-7g-3p、let-7g-5p、miR-1、miR-1286、miR-133a、miR-133b、miR-140-3p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-188-3p、miR-188-5p、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-25-3p和miR-25-5p。任何肌肉特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在肌肉中的表达。肌肉特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的多核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
miRNA还差异性表达于不同类型的细胞，诸如但不限于内皮细胞、上皮细胞和脂肪细胞中。
已知表达于内皮细胞中的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-100-3p、miR-100-5p、miR-101-3p、miR-101-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1236-3p、miR-1236-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19a-5p、miR-19b-1-5p、miR-19b-2-5p、miR-19b-3p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-217、miR-210、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-296-5p、miR-361-3p、miR-361-5p、miR-421、miR-424-3p、miR-424-5p、miR-513a-5p、miR-92a-1-5p、miR-92a-2-5p、miR-92a-3p、miR-92b-3p和miR-92b-5p。通过深度测序分析在内皮细胞中发现了许多新颖miRNA(例如Voellenkle C等人,RNA,2012,18,472-484，其通过引用整体并入本文)。任何内皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在内皮细胞中的表达。
已知表达于上皮细胞中的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-1246、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-338-3p、miR-429、miR-451a、miR-451b、miR-494、miR-802和miR-34a、miR-34b-5p、miR-34c-5p、miR-449a、miR-449b-3p、miR-449b-5p(在呼吸道纤毛上皮细胞中具特异性)、let-7家族、miR-133a、miR-133b、miR-126(在肺上皮细胞中具特异性)、miR-382-3p、miR-382-5p(在肾上皮细胞中具特异性)和miR-762(在角膜上皮细胞中具特异性)。任何上皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的多核糖核苷酸中或从本公开的多核糖核苷酸去除以调控所述多核糖核苷酸在上皮细胞中的表达。
此外，一大组miRNA富集于胚胎干细胞中，从而控制干细胞自我更新以及多种细胞谱系(诸如神经细胞、心脏细胞、造血细胞、皮肤细胞、骨原细胞和肌肉细胞)的发育和/或分化(例如，KuppusamyKT等人,Curr.Mol Med,2013,13(5),757-764；Vidigal JA和VenturaA,Semin Cancer Biol.2012,22(5-6),428-436；GoffLA等人,PLoS One,2009,4:e7192；Morin RD等人,Genome Res,2008,18,610-621；Yoo JK等人,Stem Cells Dev.2012,21(11),2049-2057，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文)。胚胎干细胞中的丰富miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-a-3p、let-7a-5p、let7d-3p、let-7d-5p、miR-103a-2-3p、miR-103a-5p、miR-106b-3p、miR-106b-5p、miR-1246、miR-1275、miR-138-1-3p、miR-138-2-3p、miR-138-5p、miR-154-3p、miR-154-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-290、miR-301a-3p、miR-301a-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-302b-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-302c-5p、miR-302d-3p、miR-302d-5p、miR-302e、miR-367-3p、miR-367-5p、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-373、miR-380-5p、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-486-5p、miR-520c-3p、miR-548e、miR-548f、miR-548g-3p、miR-548g-5p、miR-548i、miR-548k、miR-548l、miR-548m、miR-548n、miR-548o-3p、miR-548o-5p、miR-548p、miR-664a-3p、miR-664a-5p、miR-664b-3p、miR-664b-5p、miR-766-3p、miR-766-5p、miR-885-3p、miR-885-5p、miR-93-3p、miR-93-5p、miR-941、miR-96-3p、miR-96-5p、miR-99b-3p和miR-99b-5p。通过深度测序在人类胚胎干细胞中发现了许多预测的新颖miRNA(例如Morin RD等人,Genome Res,2008,18,610-621；Goff LA等人,PLoS One,2009,4:e7192；Bar M等人,Stem cells,2008,26,2496-2505，所述文献中的每一者的内容通过引用整体并入本文)。
在一个实施方案中，胚胎干细胞特异性miRNA的结合位点可包括于本公开的多核糖核苷酸的3'UTR中或从本公开的多核糖核苷酸的3'UTR去除，以调节胚胎干细胞的发育和/或分化，以抑制退行性疾患(例如退行性疾病)下的干细胞的衰老，或刺激疾病状态下的干细胞(例如癌症干细胞)的衰老和细胞凋亡。
进行了许多miRNA表达研究，以分析miRNA在各种癌细胞/组织和其他疾病中的差异性表达。一些miRNA异常地过表达于某些癌细胞中，而另一些则表达不足。在一些实施方案中，miRNA差异性表达于癌细胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294)；癌症干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌和疾病(US 2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210)；哮喘和炎症(US8415096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538)；肺癌细胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO2013/011378)；结肠直肠癌细胞(WO2011/0281756、WO2011/076142)；癌症阳性淋巴结(WO2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP2112235)；慢性阻塞性肺病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO2011/095623)；乳腺癌细胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)、白血病和淋巴瘤(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO 2010/018563，所述文献中的每一者的内容通过引用整体并入本文)。
作为非限制性实例，在某些癌症和/或肿瘤细胞中过表达的miRNA的miRNA结合位点可从本公开的多核糖核苷酸的3'UTR去除，从而恢复受到癌细胞中过表达的miRNA抑制的表达，因此改善相应生物学功能，例如转录刺激和/或抑制、细胞周期停滞、细胞凋亡和细胞死亡。其中miRNA表达未上调的正常细胞和组织将保持不受影响。
MiRNA还可调控复杂生物学过程，诸如血管生成(例如miR-132)(Anand和ChereshCurr Opin Hematol 201118:171-176)。在本公开的多核糖核苷酸中，可去除或引入牵涉于此类过程中的miRNA结合位点，以便针对生物学相关细胞类型或相关生物学过程调适所述多核糖核苷酸的表达。在本文中，本公开的多核糖核苷酸定义为营养缺陷型多核糖核苷酸。
肽/多肽治疗剂
在一些实施方案中，治疗剂是肽治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是多肽治疗剂。
在一些实施方案中，所述肽或多肽是天然来源的，例如从天然来源分离。在其他实施方案中，所述肽或多肽是合成分子，例如体外产生的合成肽或多肽。在一些实施方案中，所述肽或多肽是重组分子。在一些实施方案中，所述肽或多肽是嵌合分子。在一些实施方案中，所述肽或多肽是融合分子。在一些实施方案中，所述组合物的肽或多肽治疗剂是天然存在的肽或多肽。在一些实施方案中，所述组合物的肽或多肽治疗剂是天然存在的肽或多肽的修饰形式(例如，与其野生型、天然存在的肽或多肽对应物相比，含有少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个或少于25个氨基酸取代、缺失或添加)。
在一些实施方案中，在本公开的负载LNP中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂是多核苷酸或多肽。
基因组编辑技术
在一些实施方案中，所述核酸适用于基因组编辑技术。
在一些实施方案中，所述基因组编辑技术是规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)或转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)。
在一些实施方案中，所述核酸是选自由CRISPR RNA(crRNA)、反式活化crRNA(tracrRNA)、单向导RNA(sgRNA)和DNA修复模板组成的组的适用于基因组编辑技术的至少一种核酸。
疫苗
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是可安全地引导身体的细胞机制产生几乎任何目标癌症蛋白或其片段的RNA(例如，信使RNA(mRNA))的核糖核酸(RNA)癌症疫苗。在一些实施方案中，所述RNA为经修饰的RNA。例如，本公开的RNA疫苗可用于诱导针对癌症的平衡免疫反应(包含细胞免疫和体液免疫两者)，而无插入性突变诱发的可能性风险。
所述RNA疫苗可用于各种环境中，这取决于癌症的流行率或未满足的医学需要的程度或水平。所述RNA疫苗可用于治疗和/或预防各种阶段或转移程度的癌症。所述RNA疫苗具有卓越特性，因为与包括癌症疫苗的替代抗癌疗法相比，这些疫苗产生大得多的抗体效价并且更早产生反应。虽然不希望受理论束缚，但相信呈mRNA多核苷酸形式的RNA疫苗被更好地设计以在翻译时产生适当蛋白质构象，因为这些RNA疫苗选用天然细胞机制。与离体制造并且可触发非所需细胞反应的传统疫苗不同，所述RNA疫苗以更天然方式呈递至细胞系统。
本公开的一些实施方案提供了包括至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸的癌症疫苗，所述开放阅读框编码至少一种癌症抗原多肽或其免疫原性片段{例如，能够诱导针对癌症的免疫反应的免疫原性片段)。其他实施方案包括至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，所述开放阅读框编码能够诱导针对癌症的免疫反应的两种或更多种抗原或表位。
在一些方面，本发明是具有编码癌症抗原的开放阅读框的mRNA和具有编码免疫检查点调节剂的开放阅读框的mRNA的疫苗。在一些实施方案中，所述免疫检查点调节剂为抑制性检查点多肽。在一些实施方案中，所述抑制性检查点多肽是特异性地结合至选自由PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR和LAG3组成的组的分子的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抑制性检查点多肽为抗CTLA4或抗PDl抗体。任选地，所述疫苗包括脂质纳米粒子。在一些实施方案中，将具有编码癌症抗原的开放阅读框的mRNA的疫苗施用至受试者。在其他实施方案中，检查点抑制剂在3-10周后施用。在一些实施方案中，检查点抑制剂在4周后施用。
在其他方面，本发明是具有编码至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA和脂质纳米粒子载体的个性化癌症疫苗，其中所述至少2种癌症抗原为患者特异性癌症抗原。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有50-200nm的平均直径。
在其他方面，本发明是具有编码至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA的个性化癌症疫苗，其中所述至少2种癌症抗原代表患者的抗原。在一些实施方案中，患者的抗原是外来体鉴定的患者抗原。在一些实施方案中，单一mRNA编码所述癌症抗原。在其他实施方案中，多种mRNA编码所述癌症抗原。
在其他实施方案中，各mRNA可编码5-10种癌症抗原或单一癌症抗原。在一些实施方案中，所述mRNA编码2-100种癌症抗原。在其他实施方案中，mRNA编码10-100、20-100、50-100、100-200、300-400、500-600、600-700、700-800、900-1,000或1,000-10,000种癌症抗原。
在一些实施方案中，
a)编码各癌症抗原的mRNA中散布有裂解敏感性位点；
b)编码各癌症抗原的mRNA在无接头的情况下直接彼此连接；
c)编码各癌症抗原的mRNA用单一核苷酸接头彼此连接；
d)各癌症抗原包含25-35个氨基酸并且包括位于中心的SNP突变；
e)至少30％的癌症抗原对来自受试者的I类MHC分子具有最高亲和力；
f)至少30％的癌症抗原对来自受试者的II类MHC分子具有最高亲和力；
g)至少50％的癌症抗原对HLA-A、HLA-B和/或DRB 1具有IC>500nM的预测结合亲和力；
h)mRNA编码20种癌抗原；
i)50％的癌症抗原对I类MHC具有结合亲和力并且50％的癌症抗原对II类MHC具有结合亲和力；并且/或者
j)编码癌症抗原的mRNA被安排，使得这些癌症抗原被排序以使假表位减至最少。
在一些实施方案中，各癌症抗原包含31个氨基酸并且包括位于中心的SNP突变，在所述SNP突变的每一侧上具有15个侧接氨基酸。
在一些实施方案中，所述疫苗为个性化癌症疫苗并且其中所述癌症抗原为受试者特异性癌症抗原。在一些实施方案中，受试者特异性癌症抗原可代表受试者的肿瘤样品的外显子组，或受试者的肿瘤样品的转录物组。在一些实施方案中，受试者特异性癌症抗原可代表受试者的外来体。
在一些实施方案中，开放阅读框进一步编码一种或多种传统癌症抗原。在一些实施方案中，传统癌症抗原为非突变型抗原。在一些实施方案中，传统癌症抗原为突变型抗原。
在一些实施方案中，所述mRNA疫苗还包含具有编码一种或多种传统癌症抗原的开放阅读框的mRNA。
在一些实施方案中，单一mRNA编码所述癌症抗原。在其他实施方案中，多种mRNA编码所述癌症抗原。在一些实施方案中，各癌抗原的长度为10-50个氨基酸。在其他实施方案中，各癌症抗原的长度为15-20个氨基酸。在其他实施方案中，癌症抗原的长度为20-50、25-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-1,000或1,000-10,000个氨基酸。
在一些实施方案中，所述疫苗还包含佐剂。
本公开的一些实施方案提供在脂质纳米粒子内配制的包括至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸的癌症疫苗，所述至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸具有编码至少一种癌症多肽的开放阅读框、至少一个5'末端帽和至少一种化学修饰。在一些实施方案中，5'末端帽为7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
在一些实施方案中，至少一种化学修饰选自假尿苷、Nl-甲基假尿苷、Nl-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，经化学修饰的核苷酸的并入程度已经优化以改善对疫苗配制物的免疫反应。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子(例如，本公开的空LNP或负载LNP)包含阳离子脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质为可离子化阳离子脂质，并且非阳离子脂质为中性脂质，并且固醇为胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油烯基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-l-基)酯(L319)。
在一些实施方案中，所述脂质纳米粒子配制物包括免疫增强剂(例如TLR激动剂)以增强疫苗(配制物)的免疫原性。
在一些实施方案中，开放阅读框中的100％尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰是在尿嘧啶的5位处。在一些实施方案中，化学修饰为Nl-甲基假尿苷。
在其他实施方案中，编码APC再编程分子的mRNA包括于所述疫苗中或与所述疫苗共同施用。所述APC再编程分子可为CIITA、伴侣蛋白(诸如CLIP、HLA-DO、HLA-DM)、共刺激分子(诸如CD40、CD80、CD86)、CIITA片段(诸如CIITA的氨基酸26-137)或与CIITA具有80％序列同一性的蛋白质。
在其他方面，提供了一种在受试者中引发免疫反应的方法，所述方法通过以下方式进行：从受试者的样品鉴定至少2种癌症抗原，其中所述至少2种癌症抗原包括选自由移码突变和重组组成的组的突变，并且向所述受试者施用具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA疫苗。
在一些实施方案中，从受试者的外来体鉴定所述癌症抗原。在一些实施方案中，从所述外来体鉴定2-100种抗原。在其他实施方案中，所述mRNA疫苗具有编码所述2-100种抗原的开放阅读框。单一mRNA或多种mRNA可编码所述抗原。
在一些实施方案中，所述抗原为癌症抗原。所述癌症抗原可具有选自点突变、移码突变和重组的突变。所述方法可进一步涉及通过外显子组分析确认这些癌症抗原为受试者特异性的。
在一些实施方案中，所述方法可进一步涉及通过转录物组分析确认这些癌症抗原为受试者特异性的。
在一些实施方案中，所述方法还涉及在施用所述mRNA疫苗之后至少一个月，从受试者的样品鉴定至少2种癌症抗原以产生第二癌症抗原集合，并且向所述受试者施用具有编码所述第二癌症抗原集合的开放阅读框的mRNA疫苗。
在其他实施方案中，受试者的样品为肿瘤样品。
在其他方面，本发明包含一种在受试者中引发免疫反应的方法，所述方法通过以下方式进行：从受试者的样品鉴定至少2种癌症抗原以产生第一癌症抗原集合，向所述受试者施用具有编码所述第一癌症抗原集合的开放阅读框的mRNA疫苗，在施用所述mRNA疫苗之后至少一个月，从受试者的样品鉴定至少2种癌症抗原以产生第二癌症抗原集合，并且向所述受试者施用具有编码所述第二癌症抗原集合的开放阅读框的mRNA疫苗。
在一些实施方案中，将具有编码所述第二抗原集合的开放阅读框的mRNA疫苗在具有编码所述第一癌症抗原集合的开放阅读框的mRNA疫苗之后6个月至1年施用至所述受试者。在其他实施方案中，将具有编码所述第二抗原集合的开放阅读框的mRNA疫苗在具有编码所述第一癌症抗原集合的开放阅读框的mRNA疫苗之后1-2年施用至所述受试者。
在一些实施方案中，单一mRNA具有编码所述癌症抗原的开放阅读框。在其他实施方案中，多种mRNA编码所述抗原。在一些实施方案中，第二癌症抗原集合包括2-100种抗原。在其他实施方案中，所述癌症抗原具有选自点突变、移码突变和重组的突变。
在其他方面，本发明包含一种在受试者中引发免疫反应的方法，所述方法通过以下方式进行：从受试者的样品鉴定至少2种癌症抗原，向所述受试者施用具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA，并且向所述受试者施用癌症治疗剂。在一些实施方案中，所述癌症治疗剂为靶向疗法。所述靶向疗法可为BRAF抑制剂，诸如维罗非尼(vemurafenib)(PLX4032)或达拉非尼(dabrafenib)。
在其他实施方案中，所述癌症治疗剂为T细胞治疗剂。所述T细胞治疗剂可为检查点抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体为BMS-936558(纳武单抗(nivolumab))。在其他实施方案中，所述抗CTLA-4抗体为伊匹单抗(ipilimumab)。在其他实施方案中，所述T细胞治疗剂为OX40L。在其他实施方案中，所述癌症治疗剂是包含基于群体的肿瘤特异性抗原的疫苗。
在其他实施方案中，所述癌症治疗剂是包含具有编码一种或多种传统癌症抗原的开放阅读框的mRNA的疫苗。
在一些实施方案中，具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA与所述癌症治疗剂同时施用至所述受试者。在一些实施方案中，具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA在施用所述癌症治疗剂之前施用至所述受试者。在一些实施方案中，具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA在施用所述癌症治疗剂之后施用至所述受试者。
在本发明的其他方面，提供了一种方法，所述方法包括使具有编码癌症抗原的开放阅读框的mRNA与脂质纳米粒子配制物混合以产生mRNA癌症疫苗，以及在混合的24小时内向受试者施用所述mRNA癌症疫苗。在一些实施方案中，所述mRNA癌症疫苗在混合的12小时内施用至所述受试者。在其他实施方案中，所述mRNA癌症疫苗在混合的1小时内施用至所述受试者。在一些实施方案中，所述mRNA癌症疫苗编码2-100种癌症抗原或10-100种癌症抗原。
在一些实施方案中，所述疫苗为个性化癌症疫苗并且其中所述癌症抗原为受试者特异性癌症抗原。
在一些实施方案中，单一mRNA编码所述癌症抗原。在其他实施方案中，多种mRNA编码所述癌症抗原。在其他实施方案中，各mRNA编码5-10种癌症抗原或单一癌症抗原。在其他实施方案中，各癌抗原的长度为10-50个氨基酸或15-20个氨基酸。
本文还提供了癌症疫苗在制造用于在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法中的药剂中的用途，所述方法包括以有效产生抗原特异性免疫反应的量向所述受试者施用所述癌症疫苗。
在其他方面，提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法通过以下方式进行：从分离自所述受试者的外来体鉴定至少2种癌症抗原；基于所鉴定的抗原，产生具有编码所述抗原的开放阅读框的mRNA疫苗；并且向所述受试者施用所述mRNA疫苗，其中所述mRNA疫苗在所述受试者中诱导肿瘤特异性免疫反应，由此治疗所述受试者的癌症。在其他方面，本发明是可根据如下方法制备的RNA疫苗，所述方法涉及从分离自受试者的外来体鉴定至少2种癌症抗原；基于所鉴定的抗原，产生具有编码所述抗原的开放阅读框的mRNA疫苗。
在本发明的方面，提供了一种在受试者中引发针对癌症抗原的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用包含至少一种具有编码至少一种抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸的RNA疫苗，由此在受试者中诱导对所述抗原多肽或其免疫原性片段具特异性的免疫反应，其中在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者中的抗抗原多肽抗体效价有所增加。“抗抗原多肽抗体”是特异性结合至抗原多肽的血清抗体。
预防有效剂量是在临床上可接受的水平下预防癌症进展的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量是疫苗的包装插页中列出的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本发明的mRNA疫苗以外的疫苗。例如，传统疫苗包括但不限于活微生物疫苗、灭活微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已获得监管批准和/或由国家药物监管机构(例如美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA.))登记的疫苗。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者中的抗抗原多肽抗体效价增加1log至10log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者中的抗抗原多肽抗体效价增加1log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者中的抗抗原多肽抗体效价增加2log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者中的抗抗原多肽抗体效价增加3log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者中的抗抗原多肽抗体效价增加5log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者中的抗抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者中的抗抗原多肽抗体效价增加10log。
在本发明的其他方面，提供了一种在受试者中引发针对癌症抗原的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用包含至少一种具有编码至少一种抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸的RNA疫苗，由此在受试者中诱导对所述抗原多肽或其免疫原性片段具特异性的免疫反应，其中受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗2倍至100倍剂量水平的针对癌症抗原的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗两倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗三倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗4倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗5倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗10倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗50倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗100倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗10倍至1000倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等于接种有相对于所述RNA疫苗100倍至1000倍剂量水平的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
在其他实施方案中，通过确定受试者中的抗体效价来评估免疫反应。
在其他方面，本发明包括一种在受试者中引发免疫反应的方法，所述方法通过以下方式进行：向受试者施用包含至少一种具有编码至少一种癌症抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸的RNA疫苗，由此在受试者中诱导对所述抗原多肽或其免疫原性片段具特异性的免疫反应，其中受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的针对癌症抗原的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早2天至10周诱导。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应在接种有相对于所述RNA疫苗2倍至100倍剂量水平的预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早2天诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早3天诱导。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早1周诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早2周诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早3周诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早5周诱导。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早10周诱导。
一种在受试者中引发针对癌症的免疫反应的方法，所述方法通过以下方式进行：向受试者施用具有编码第一抗原多肽的开放阅读框的癌症RNA疫苗，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定化元件，并且其中佐剂未与所述疫苗共同配制或共同施用。
在其他方面，本发明包括一种产生编码包含1000个与3000个之间核苷酸的多联体癌症抗原的mRNA的方法，所述方法通过以下方式进行：
(a)使包含编码所述多联体癌症抗原的开放阅读框的第一多核苷酸和包含5'-UTR的第二多核苷酸与缀合至固体支撑物的多核苷酸结合；
(b)在合适条件下使第二多核苷酸的3’末端接合至第一多核苷酸的5’末端，其中合适条件包含DNA连接酶，由此产生第一接合产物；
(c)在合适条件下使包含3'-UTR的第三多核苷酸的5'末端接合至第一接合产物的3'末端，其中合适条件包含RNA连接酶，由此产生第二接合产物；并且
(d)从所述固体支撑物释放第二接合产物，由此产生编码包含1000个与3000个之间核苷酸的多联癌症抗原的mRNA。在所提供的组合物或方法中的任一者的一些实施方案中，mRNA编码一种或多种复发性多态现象。在一些实施方案中，所述一种或多种复发性多态现象包括p53中的复发性体细胞癌突变。在一些此类实施方案中，p53中的一种或多种复发性体细胞癌突变选自由以下组成的组：
(1)在邻近密码子p.T125的规范5'剪接位点处的突变；
(2)在邻近密码子p.331的规范5'剪接位点处的突变；
(3)在邻近密码子p.126的规范3'剪接位点处的突变；
(4)在邻近密码子p.224的规范5'剪接位点处的突变，诱导一个隐含的替代内含子5'剪接位点。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含编码开放阅读框(ORF)的mRNA的癌症治疗疫苗，所述开放阅读框(ORF)编码新抗原肽(1)至(4)中的一者或多者。在一个实施方案中，本发明提供了基于含有任何上述突变的患者的肿瘤，选择性施用含有或编码肽(l)至(4)中的一者或多者的疫苗。在一个实施方案中，本发明提供了基于含有任何上述突变的受试者的肿瘤和含有经预测结合至所得新抗原的相应HLA等位基因的受试者的正常HLA类型的双重标准选择性施用疫苗。
在本发明的其他方面，提供了一种用个性化mRNA癌症疫苗治疗受试者的方法，所述方法通过以下方式进行：从受试者分离样品，通过分析来自样品的患者转录物组和/或患者外显子组来鉴定新表位集合以产生患者特异性突变组，基于MHC结合强度、MHC结合多样性、预测的免疫原性程度、低自身反应性和/或T细胞反应性选择用于来自所述突变组的疫苗的新表位集合，制备编码所述新表位集合的mRNA疫苗并且在从受试者分离样品的两个月内向受试者施用所述mRNA疫苗。在一些实施方案中，在从受试者分离样品的一个月内向受试者施用所述mRNA疫苗。
在其他方面，本发明包括一种鉴定用于个性化mRNA癌症疫苗的新表位集合的方法，所述个性化mRNA癌症疫苗具有一种或多种编码所述新表位集合的多核苷酸，所述方法通过以下方式进行：a.通过分析患者转录物组和患者外显子组来鉴定患者特异性突变组，b.基于以下至少三者使用针对所述新表位的加权值从所述突变组选择15-500种新表位的子集：在患者RNA-seq中评估基因或转录物层面的表达；变体调用置信度评分；RNA-seq等位基因特异性表达；保守对非保守氨基酸取代；点突变的位置(针对增加的TCR衔接的定中心评分)；点突变的位置(针对差异性HLA结合的锚定评分)；自主性：使用患者WES数据，<100％核心表位同源性；针对8聚体-l l聚体的HLA-A和-B IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DRB1IC50；混杂评分(即，经预测结合的患者HLA的数目)；针对8聚体-l l聚体的HLA-C IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DRB3-5 IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DQB 1/A1 IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DPB 1/A1 IC50；I类对II类比例；所涵盖的患者HLA-A、HLA-B和DRB 1同种异型的多样性；点突变对复杂表位(例如移码)的比例；和/或假表位HLA结合评分，和c.基于最高加权值从所述子集选择用于个性化mRNA癌症疫苗的新表位集合，其中新表位集合包含15-40种新表位。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗是经化学修饰的。在其他实施方案中，所述核酸疫苗是未经修饰的。
其他方面提供了用于对受试者接种疫苗的组合物和方法，所述方法包括向受试者施用核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定化元件，并且其中佐剂未与所述疫苗共同配制或共同施用。
在其他方面，本发明是用于对受试者接种疫苗的组合物或方法，所述方法包括向受试者施用核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中将10ug/kg与400ug/kg之间剂量的所述核酸疫苗施用至受试者。在一些实施方案中，RNA多核苷酸的剂量为每剂1-5ug、5-10ug、10-15ug、15-20ug、10-25ug、20-25ug、20-50ug、30-50ug、40-50ug、40-60ug、60-80ug、60-100ug、50-100ug、80-120ug、40-120ug、40-150ug、50-150ug、50-200ug、80-200ug、100-200ug、120-250ug、150-250ug、180-280ug、200-300ug、50-300ug、80-300ug、100-300ug、40-300ug、50-350ug、100-350ug、200-350ug、300-350ug、320-400ug、40-380ug、40-100ug、100-400ug、200-400ug或300-400ug。在一些实施方案中，将所述核酸疫苗通过皮内或肌肉内注射施用至受试者。在一些实施方案中，将所述核酸疫苗在第零天施用至受试者。在一些实施方案中，将第二剂量的所述核酸疫苗在第二十一天施用至受试者。
在一些实施方案中，将25微克剂量的RNA多核苷酸包括于施用至受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，将100微克剂量的RNA多核苷酸包括于施用至受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，将50微克剂量的RNA多核苷酸包括于施用至受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，将75微克剂量的RNA多核苷酸包括于施用至受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，将150微克剂量的RNA多核苷酸包括于施用至受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，将400微克剂量的RNA多核苷酸包括于施用至受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，将200微克剂量的RNA多核苷酸包括于施用至受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，与远侧淋巴结相比，所述RNA多核苷酸以高100倍水平积聚于局部淋巴结中。在其他实施方案中，所述核酸疫苗经化学修饰，并且在其他实施方案中，所述核酸疫苗未经化学修饰。
本发明的方面提供了一种核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸和药学上可接受的载剂或赋形剂，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定化元件，其中佐剂未包括于所述疫苗中。在一些实施方案中，所述稳定化元件为组蛋白茎环。在一些实施方案中，所述稳定化元件是相对于野生型序列具有增加的GC含量的核酸序列。
本发明的方面提供了核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸存在于用于体内施用至宿主的配制物中，所述配制物赋予的抗体效价优于针对用于可接受百分比的人类受试者的第一抗原的血清保护的标准。在一些实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的抗体效价为中和抗体效价。在一些实施方案中，所述中和抗体效价大于蛋白疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价大于佐剂蛋白疫苗。在其他实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价为1,000-10,000、1,200-10,000、1,400-10,000、1,500-10,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,800-10,000、2000-10,000、2,000-5,000、2,000-3,000、2,000-4,000、3,000-5,000、3,000-4,000或2,000-2,500。中和效价通常表示为实现斑块数目的50％减少所需的最高血清稀释度。
在某些方面，本发明疫苗(例如，LNP囊封的mRNA疫苗)在接种疫苗的受试者的血液或血清中产生预防和/或治疗有效水平、浓度和/或效价的抗原特异性抗体。如本文所定义，术语抗体效价是指在受试者(例如人类受试者)中产生的抗原特异性抗体的量。在示例性实施方案中，抗体效价表示为仍然给出阳性结果的最大稀释度(在连续稀释中)的倒数。在示例性实施方案中，通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)来测定或测量抗体效价。在示例性实施方案中，通过中和测定，例如通过微量中和测定来测定或测量抗体效价。在某些方面，抗体效价测量值表示为比率，诸如1:40、1:100等。
在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生大于1:40、大于1:100、大于1:400、大于1:1000、大于1:2000、大于1:3000、大于1:4000、大于1:500、大于1:6000、大于1:7500、大于1:10000的抗体效价。在示例性实施方案中，截至疫苗接种之后10天、截至疫苗接种之后20天、截至疫苗接种之后30天、截至疫苗接种之后40天或截至疫苗接种之后50天或更长时间产生或达到所述抗体效价。在示例性实施方案中，在向受试者施用单一剂量的疫苗之后产生或达到所述效价。在其他实施方案中，在多个剂量之后，例如在第一和第二剂量(例如，加强剂量)之后产生或达到所述效价。
在本发明的示例性方面，抗原特异性抗体以μg/ml为单位来度量，或以IU/L(国际单位/升)或mlU/ml(毫国际单位/ml)为单位来度量。在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生>0.5μg/ml、>0.1μg/ml、>0.2μg/ml、>0.35μg/ml、>0.5μg/ml、>1μg/ml、>2μg/ml、>5μg/ml或>10μg/ml。在本发明的示例性实施方案中，有效疫苗产生>10mlU/ml、>20mlU/ml、>50mlU/ml、>100mlU/ml、>200mlU/ml、>500mlU/ml或>1000mlU/ml。在示例性实施方案中，截至疫苗接种之后10天、截至疫苗接种之后20天、截至疫苗接种之后30天、截至疫苗接种之后40天或截至疫苗接种之后50天或更长时间产生或达到所述抗体水平或浓度。在示例性实施方案中，在向受试者施用单一剂量的疫苗之后产生或达到所述水平或浓度。在其他实施方案中，在多个剂量之后，例如在第一和第二剂量(例如，加强剂量)之后产生或达到所述水平或浓度。在示例性实施方案中，通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)来测定或测量抗体水平或浓度。在示例性实施方案中，通过中和分析，例如通过微量中和测定来测定或测量抗体水平或浓度。还提供了核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中所述RNA多核苷酸存在于用于体内施用至宿主的配制物中，从而引发比由具有稳定化元件或用佐剂配制并且编码第一抗原多肽的mRNA疫苗引发的抗体效价持续更长时间的高抗体效价。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸经配制以在单次施用的一周内产生中和抗体。在一些实施方案中，佐剂选自阳离子肽和免疫刺激核酸。在一些实施方案中，阳离子肽为鱼精蛋白。
多个方面提供了包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中所述RNA多核苷酸存在于用于体内施用至宿主的配制物中，使得宿主中的抗原表达水平显著超过由具有稳定化元件或用佐剂配制并且编码第一抗原多肽的mRNA疫苗产生的抗原表达水平。
其他方面提供了包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中所述疫苗具有与未经修饰的mRNA疫苗产生相等抗体效价所需相比少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
本发明的方面还提供了疫苗使用单位，所述疫苗使用单位包含lOug与400ug之间的一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸和药学上可接受的载剂或赋形剂，所述一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，所述疫苗使用单位经配制用于递送至人类受试者。在一些实施方案中，所述疫苗还包含阳离子脂质纳米粒子。
本发明的方面提供了在个体或个体群体中产生、维持或恢复针对肿瘤的抗原记忆的方法，所述方法包括向所述个体或群体施用抗原记忆加强核酸疫苗，所述核酸疫苗包含：(a)至少一种RNA多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰和两个或更多个密码子优化开放阅读框，所述开放阅读框编码参考抗原多肽的集合；和(b)任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，将所述疫苗经由选自由肌肉内施用、皮内施用和皮下施用组成的组的途径施用至个体。在一些实施方案中，所述施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适于注射所述组合物的器件接触。在一些实施方案中，所述施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适于注射所述组合物的器件接触，结合电穿孔。
本发明的方面提供了对受试者接种疫苗的方法，所述方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向受试者施用25ug/kg与400ug/kg之间的单一剂量的核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。
其他方面提供了包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中所述疫苗具有与未经修饰的mRNA疫苗产生相等抗体效价所需相比少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
其他方面提供了包含LNP配制的具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述RNA多核苷酸不包含核苷酸修饰(未经修饰)，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或
多联体多肽，其中所述疫苗具有与未在LNP中配制的未经修饰的mRNA疫苗产生相等抗体效价所需相比少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
在其他方面，本发明涵盖一种治疗60岁或以上的老年受试者的方法，所述方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向所述受试者施用包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框编码抗原多肽或多联体多肽。
在其他方面，本发明涵盖一种治疗17岁或以下的年轻受试者的方法，所述方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向所述受试者施用包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框编码抗原多肽或多联体多肽。
在其他方面，本发明涵盖一种治疗成年受试者的方法，所述方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向所述受试者施用包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框编码抗原多肽或多联体多肽。
在一些方面，本发明包括一种对受试者接种包括至少两种编码抗原的核酸序列的组合疫苗的方法，其中所述疫苗的剂量为组合治疗剂量，其中编码抗原的各个别核酸的剂量为亚治疗剂量。在一些
实施方案中，所述组合剂量是施用至受试者的核酸疫苗中的25微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用至受试者的核酸疫苗中的100微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用至受试者的核酸疫苗中的50微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用至受试者的核酸疫苗中的75微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用至受试者的核酸疫苗中的150微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用至受试者的核酸疫苗中的400微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗原的各个别核酸的亚治疗剂量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微克。在其他实施方案中，所述核酸疫苗经化学修饰，并且在其他实施方案中，所述核酸疫苗未经化学修饰。
其他组分
除了前述部分中所述的那些以外，LNP(例如，本公开的空LNP或负载LNP)还可包括一种或多种组分。在一些实施方案中，LNP(例如，本公开的空LNP或负载LNP)可包括一种或多种小疏水性分子，诸如维生素(例如，维生素A或维生素E)或固醇。
脂质纳米粒子(例如，本公开的空LNP或负载LNP)还可包括一种或多种渗透性增强剂分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其他组分。渗透性增强剂分子可为例如美国专利申请公布第2005/0222064号所述的分子。碳水化合物可包括单糖(例如葡萄糖)和多糖(例如糖原和其衍生物和类似物)。
聚合物可包括于LNP中和/或用于囊封或部分地囊封LNP。聚合物可为生物可降解的和/或生物相容性的。聚合物可选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯(polycarbamate)、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯(polyurethane)、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚丙烯酸酯。在一些实施方案中，聚合物可包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟基丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚亚烷基(诸如聚乙烯和聚丙烯)、聚亚烷基二醇(诸如聚(乙二醇)(PEG))、聚氧化烯(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯(诸如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(诸如聚(乙酸乙烯酯))、聚卤化乙烯(例如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨酯、衍生化纤维素(诸如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟基丙基纤维素、羧基甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)和其共聚物和混合物)、聚二噁烷酮和其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚富马酸丙二醇酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚氧胺、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯(trimethylenecarbonate)、聚(N-丙烯酰基吗啉)(PAcM)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)和聚甘油。
表面改变剂可包括但不限于阴离子蛋白(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子表面活性剂，诸如二甲基二(十八烷基)-溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如乙酰基半胱氨酸、艾蒿、菠罗蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青属(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、胺溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白、胸腺素β4、阿法链道酶(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))和DNase(例如rhDNase)。表面改变剂可安置于纳米粒子内和/或LNP的表面上(例如，通过涂布、吸附、共价连接或其他方法)。
LNP(例如，本公开的空LNP或负载LNP)还可包含一种或多种官能化脂质。在一些实施方案中，脂质可经炔烃基团官能化，所述炔烃基团当在适当反应条件下暴露于叠氮化物时可经历环加成反应。特别是，脂质双层可以这种方式经可用于促进膜渗透、细胞识别或成像的一种或多种基团官能化。LNP(例如，本公开的空LNP或负载LNP)的表面还可与一种或多种适用抗体缀合。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能团和缀合物是本领域中众所周知的。
除了这些组分以外，脂质纳米粒子(例如，本公开的空LNP或负载LNP)还可包括可用于药物组合物的任何物质。在一些实施方案中，脂质纳米粒子可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或附属成分，诸如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒介物、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂和其他物质。还可包括诸如蜡、黄油、着色剂、涂布剂、调味剂和芳香剂的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如Remington的The Science andPractice ofPharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。
稀释剂的实例可包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉和/或它们的组合。造粒剂和分散剂可选自由马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、乙醇酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯-吡咯烷酮)(交联聚维酮)、羧基甲基淀粉钠(乙醇酸淀粉钠)、羧基甲基纤维素、交联羧基甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧基甲基纤维素钙、硅酸镁铝
Figure GDA0004174332580001641
月桂基硫酸钠、季铵化合物和/或它们的组合组成的非限制性列表。
表面活性剂和/或乳化剂可包括但不限于天然乳化剂(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄蓍胶、chondrux、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶质粘土(例如，膨润土[硅酸铝]和
Figure GDA0004174332580001651
[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如，硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三乙酸甘油酯单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如，羧基聚甲烯、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如，羧基甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯[
Figure GDA0004174332580001652
20]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇[
Figure GDA0004174332580001653
60]、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[
Figure GDA0004174332580001654
80]、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯[
Figure GDA0004174332580001655
40]、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯[
Figure GDA0004174332580001656
60]、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯[
Figure GDA0004174332580001657
65]、甘油单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯[
Figure GDA0004174332580001658
80])、聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬脂酸酯[
Figure GDA0004174332580001659
45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯和
Figure GDA00041743325800016510
)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如
Figure GDA00041743325800016511
)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚[
Figure GDA00041743325800016512
30])、聚(乙烯-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、
Figure GDA00041743325800016513
F 68、
Figure GDA00041743325800016514
188、西曲溴铵、西吡氯铵、苯扎氯铵、多库酯钠和/或它们的组合。
粘合剂可为淀粉(例如，玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)；天然和合成胶(例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰苔提取物、潘瓦尔胶(panwar gum)、茄替胶、伊莎珀尔果壳的粘液、羧基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯-吡咯烷酮)、硅酸镁铝
Figure GDA00041743325800016515
和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚氧化乙烯；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；和它们的组合，或任何其他合适的粘合剂。
防腐剂的实例可包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。抗氧化剂的实例包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、一硫代甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸单水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。抗微生物防腐剂的实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、布罗波尔(bronopol)、溴棕三甲铵、西吡氯铵、洛赫西定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯基乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。抗真菌防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。醇防腐剂的实例包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苄醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯基乙醇。酸性防腐剂的实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、去氢抗坏血酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、乙酸生育酚、甲磺酸去铁胺、溴棕三甲铵、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、
Figure GDA0004174332580001661
对羟基苯甲酸甲酯、
Figure GDA0004174332580001662
115、
Figure GDA0004174332580001663
II、NEOLONETM、KATHONTM和/或
Figure GDA0004174332580001664
缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、乳糖酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氨基-磺酸盐缓冲液(例如HEPES)、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原质水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和/或它们的组合。润滑剂可选自由硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、甘油山嵛酸酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠和它们的组合组成的非限制性组。
油的实例包括但不限于扁桃仁、杏仁、鳄梨、巴西棕榈、佛手柑、黑加仑籽、琉璃苣、刺桧、甘菊、芥花、香菜、巴西棕榈、蓖麻、肉桂、可可脂、椰子、鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻仁、香草醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、熏衣草花、熏衣草、柠檬、山苍子、澳洲坚果、锦葵、芒果核、池花籽、貂、肉豆蔻、橄榄、橙、橙鲷、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、白檀、山茶花、欧洲薄荷、沙棘、芝麻、乳木果油、硅酮、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿花、香根草、胡桃和小麦胚芽油以及硬脂酸丁酯、辛酸三酸甘油酯、癸酸三酸甘油酯、环甲基硅酮、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、西甲硅油、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二醇、油醇、硅酮油和/或它们的组合。
药物组合物
包含脂质纳米粒子的配制物可完整地或部分地被配制为药物组合物。药物组合物可包括一种或多种脂质纳米粒子。在一些实施方案中，药物组合物可包括一种或多种脂质纳米粒子，其包括一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物还可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或附属成分，诸如本文所述的那些。关于药物组合物和药剂的配制和制造的一般准则可例如在Remington的The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006中获得。常规赋形剂和附属成分可用于任何药物组合物，除非任何常规赋形剂或附属成分可与本公开配制物中的LNP的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或附属成分与所述配制物的LNP的组分或LNP的组合可导致任何非所需生物效应或在其他方面导致有害效应，则所述赋形剂或附属成分可与所述组分不相容。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂或附属成分可构成包括LNP的药物组合物的总质量或体积的超过50％。在一些实施方案中，所述一种或多种赋形剂或附属成分可构成药物组合物的50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂获得批准用于人类和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂获得美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是药物级。在一些实施方案中，赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
根据本公开的药物组合物中的一种或多种脂质纳米粒子、一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、体型和/或状况并且进一步根据组合物的施用途径而变化。举例来说，药物组合物包含0.1％与100％(wt/wt)之间的一种或多种脂质纳米粒子。作为另一实例，药物组合物包含0.1％与15％(wt/vol)之间的一种或多种两亲性聚合物(例如0.5％、1％、2.5％、5％、10％或12.5％w/v)。
在一些实施方案中，本公开的脂质纳米粒子和/或药物组合物被冷藏或冷冻用于储存和/或装运(例如，储存在4℃或更低温度，诸如约-150℃与约0℃之间或约-80℃与约-20℃之间的温度(例如，约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)。例如，包含一种或多种脂质纳米粒子的药物组合物是在例如约-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下被冷藏用于储存和/或装运的溶液或固体(例如，经由冻干)。在某些实施方案中，本公开还涉及一种通过将脂质纳米粒子和/或其药物组合物储存在4℃或更低温度，诸如约-150℃与约0℃之间或约-80℃与约-20℃之间的温度，例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃下来增加脂质纳米粒子的稳定性的方法。
脂质纳米粒子和/或包括一种或多种脂质纳米粒子的药物组合物可施用至任何患者或受试者，包括可受益于通过向一种或多种特定细胞、组织、器官或系统或其组(诸如肾系统)递送治疗剂和/或预防剂而提供的治疗效应的那些患者或受试者。尽管本文所提供的对于脂质纳米粒子和包括脂质纳米粒子的药物组合物的描述原则上涉及适合施用至人类的组合物，熟练技术人员应理解此类组合物通常适合施用至任何其他哺乳动物。应充分了解，可对适于施用至人类的组合物进行修饰以使所述组合物适于施用至多种动物，并且普通熟练兽医药理学家仅需常规(如果存在)实验即可设计和/或执行此类修饰预期施用所述组合物的受试者包括但不限于人类、其他灵长类动物和其他哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
包括一种或多种脂质纳米粒子的药物组合物可通过药理学领域中已知或今后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后有需要或必要时，将产物分成、成形和/或包装成所需单一剂量或多剂量单元。
根据本公开的药物组合物可大批、作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量进行制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物(例如，脂质纳米粒子)的个别量。活性成分的量通常等于将施用至受试者的活性成分的剂量，和/或这种剂量的适宜分率，诸如例如这种剂量的一半或三分之一。
药物组合物可以适于多种施用途径和方法的多种形式制备。在一些实施方案中，药物组合物可以液体剂型(例如，乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如，胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒)、用于表面和/或透皮施用的剂型(例如，软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴剂)、悬浮液、散剂和其他形式制备。
用于口服和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除了活性成分以外，液体剂型还包含本领域中通常使用的惰性稀释剂，诸如例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和它们的混合物。除了惰性稀释剂以外，口服组合物还可包括额外的治疗剂和/或预防剂、额外剂(诸如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂)。在关于肠胃外施用的某些实施方案中，组合物与诸如
Figure GDA0004174332580001701
醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或它们的组合物的增溶剂混合。
可注射制剂(例如无菌可注射水性或油性悬浮液)可根据已知技术使用合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂进行配制。无菌可注射制剂可为无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液。无菌、不挥发性油惯常地用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。诸如油酸的脂肪酸可用于可注射剂的制备。
可注射配制物可例如通过经由细菌截留过滤器过滤，和/或通过并入呈可在使用之前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌。
为了延长活性成分的作用，通常可需要减慢从皮下或肌肉内注射吸收所述活性成分。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而其溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过使所述药物溶解或悬浮于油媒介物中来实现。可注射储槽形式是通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯的生物可降解聚合物中形成所述药物的微囊封基质而制得。取决于药物与聚合物的比率和所用的特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储槽可注射配制物是通过将所述药物截留于可与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
用于直肠或阴道施用的组合物典型地为栓剂，其可通过将组合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，其在环境温度下为固体，但在体温下为液体并且因此在直肠或阴道腔中熔融并释放活性成分。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、膜剂、散剂和颗粒。在此类固体剂型中，活性成分与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或填充剂或增量剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸)、粘合剂(例如，羧基甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、保湿剂(例如甘油)、崩解剂(例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、特定硅酸盐和碳酸钠)、溶液延迟剂(例如石蜡)、吸收促进剂(例如季铵化合物)、润湿剂(例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯)、吸收剂(例如高岭土和膨润土、硅酸盐)和润滑剂(例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)和它们的混合物混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物可在使用例如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中用作填充剂。片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可用包衣和壳，诸如肠溶包衣和药物配制领域中众所周知的其他包衣制备。其可任选地包含乳浊剂并且可具有使其仅释放活性成分的组成。在一些实施方案中，固体组合物可任选地包含乳浊剂并且可具有如下组成，所述组成使其任选地以延迟方式在肠道的特定部分中释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物可在使用例如乳糖以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中用作填充剂。
用于组合物的表面和/或透皮施用的剂型可包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和/或贴剂。一般来说，活性成分在无菌条件下与可需要的药学上可接受的赋形剂和/或任何所需防腐剂和/或缓冲液混合。另外，本公开预期透皮贴剂的使用，所述透皮贴剂通常具有向身体提供化合物的控制递送的附加优势。此类剂型可例如通过使所述化合物溶解和/或分散于适当介质中来制备。或者或另外，速率可通过提供速率控制膜和/或通过在聚合物基质和/或凝胶中分散所述化合物来控制。
用于递送本文所述的皮内药物组合物的合适器件包括短针器件，诸如美国专利4,886,499；5,190,521；5,328,483；5,527,288；4,270,537；5,015,235；5,141,496；和5,417,662中所述的那些。皮内组合物可通过限制针进入皮肤中的有效穿透长度的器件(诸如PCT公布WO 99/34850中所述的那些及其功能等效物)来施用。经由液体射流注射器和/或经由刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针向真皮递送液体组合物的射流注射器件是合适的。射流注射器件描述于例如美国专利5,480,381；5,599,302；5,334,144；5,993,412；5,649,912；5,569,189；5,704,911；5,383,851；5,893,397；5,466,220；5,339,163；5,312,335；5,503,627；5,064,413；5,520,639；4,596,556；4,790,824；4,941,880；4,940,460；PCT公布WO97/37705和WO 97/13537中。使用压缩气体来加速呈粉末形式的疫苗通过皮肤外层到达真皮的弹道粉末/粒子递送器件是合适的。或者或另外，常规注射器可用于皮内施用的经典曼托方法(mantoux method)中。
适于表面施用的配制物包括但不限于液体和/或半液体制剂，诸如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液(诸如乳膏、软膏和/或糊剂和/或溶液和/或悬浮液)。可表面施用的配制物可例如包含约1％至约10％(wt/wt)活性成分，不过活性成分的浓度可高达所述活性成分在溶剂中的溶解度极限。用于表面施用的配制物还可包含一种或多种本文所述的额外成分。
药物组合物可以适于经由口腔进行肺部施用的配制物形式进行制备、包装和/或销售。这种配制物可包括包含活性成分的干燥粒子。此类组合物便利地呈干粉形式以使用包含干粉储集器的器件(推进剂流可被引导至其中以分散粉末)和/或使用自推进溶剂/粉末分配容器(诸如包含溶解和/或悬浮于密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的器件)进行施用。干粉组合物可包括固体细粉稀释剂，诸如糖，并且便利地以单位剂型提供。
低沸点推进剂通常包括在大气压力下具有低于65℉的沸点的液体推进剂。通常，推进剂可构成组合物的50％至99.9％(wt/wt)，并且活性成分可构成组合物的0.1％至20％(wt/wt)。推进剂还可包含额外成分，诸如液体非离子和/或固体阴离子表面活性剂和/或固体稀释剂(其可具有与包含活性成分的粒子相同级别的粒度)。
被配制用于肺部递送的药物组合物可提供呈溶液和/或悬浮液的小液滴形式的活性成分。此类配制物可作为任选地无菌并包含活性成分的水性和/或稀醇溶液和/或悬浮液进行制备、包装和/或销售，并且可便利地使用任何喷雾和/或雾化器件进行施用。此类配制物还可包含一种或多种额外成分，包括但不限于调味剂(诸如糖精钠)、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(诸如羟基苯甲酸甲酯)。由这种施用途径提供的小液滴可具有在约1nm至约200nm范围内的平均直径。
本文中描述为可用于肺部递送的配制物可用于鼻内递送药物组合物。适于鼻内施用的另一种配制物是包含活性成分并具有约0.2μm至500μm的平均粒度的粗粉。这种配制物是以其中采取鼻吸的方式，即通过经由鼻道从保持紧密接近鼻子的粉末容器快速吸入来施用。
适于鼻施用的配制物可例如包含约低至0.1％(wt/wt)且高达100％(wt/wt)的活性成分，并且可包含一种或多种本文所述的额外成分。药物组合物可以适于经颊施用的配制物形式进行制备、包装和/或销售。此类配制物可例如呈使用常规方法制得的片剂和/或锭剂形式并且可包含例如0.1％至20％(wt/wt)活性成分，余量包含经口可溶解和/或可降解组合物并且任选地包含一种或多种本文所述的额外成分。或者，适于经颊施用的配制物可包括包含活性成分的粉末和/或气雾化和/或雾化溶液和/或悬浮液。当分散时，此类粉状、气雾化和/或气雾化配制物可具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均粒子和/或小液滴大小，并且还可包含一种或多种本文所述的任何额外成分。
药物组合物可以适于眼施用的配制物形式进行制备、包装和/或销售。此类配制物可例如呈包括例如活性成分于水性或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(wt/wt)溶液和/或悬浮液的滴眼剂形式。此类滴剂还可包含缓冲剂、盐和/或一种或多种其他本文所述的任何额外成分。可用的其他眼施用配制物包括包含呈微晶形式和/或呈脂质体制剂的活性成分的那些。滴耳剂和/或滴眼剂预期在本公开的范围内。
在细胞中产生多肽的方法
本公开提供了在哺乳动物细胞中产生目标多肽的方法。产生多肽的方法涉及使细胞与包含包括编码目标多肽的mRNA的LNP的本公开配制物接触。在细胞与脂质纳米粒子接触时，所述mRNA可在细胞中溶解并翻译以产生所述目标多肽。
一般来说，使哺乳动物细胞与包括编码目标多肽的mRNA的LNP接触的步骤可在体内、离体、培养物中或体外进行。与细胞接触的脂质纳米粒子的量和/或其中mRNA的量可取决于所接触的细胞或组织的类型、施用方式、脂质纳米粒子和其中mRNA的生理化学特征(例如，大小、电荷和化学组成)以及其他因素。一般来说，脂质纳米粒子的有效量将允许细胞中的有效多肽产生。关于效率的度量可包括多肽翻译(由多肽表达指示)、mRNA降解的水平和免疫反应指示剂。
使包括mRNA的LNP与细胞接触的步骤可涉及或引起转染。LNP的脂质组分中包括的磷脂可例如通过与细胞或细胞内膜相互作用和/或融合而促进转染和/或增加转染效率。转染可允许细胞内的mRNA翻译。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子可在治疗上使用。例如，LNP中包括的mRNA可编码治疗性多肽(例如，在可翻译区中)并且在接触和/或进入(例如，转染)至细胞中时产生所述治疗性多肽。在其他实施方案中，LNP中包括的mRNA可编码可改进或增加受试者的免疫性的多肽。在一些实施方案中，mRNA可编码粒细胞-集落刺激因子或曲妥珠单抗(trastuzumab)。
在一些实施方案中，LNP中包括的mRNA可编码重组多肽，所述重组多肽可补充可基本上不存在于与脂质纳米粒子接触的细胞中的一种或多种多肽。所述一种或多种基本上不存在的多肽可由于编码基因或其调控途径的基因突变而缺乏。或者，通过mRNA翻译产生的重组多肽可拮抗存在于细胞中、细胞的表面上或从细胞分泌的内源蛋白的活性。拮抗性重组多肽可需要抗击由所述内源蛋白的活性引起的有害效应，诸如改变的活性或通过突变引起的定位。在另一种替代方案中，通过mRNA翻译产生的重组多肽可间接地或直接地拮抗存在于细胞中、细胞的表面上或从细胞分泌的生物部分的活性。经拮抗的生物部分可包括但不限于脂质(例如胆固醇)、脂蛋白(例如低密度脂蛋白)、核酸、碳水化合物和小分子毒素。通过mRNA翻译产生的重组多肽可经工程改造以定位于细胞内，诸如特定隔室(诸如细胞核)内，或者可经工程改造以从细胞分泌或易位至细胞的质膜。
在一些实施方案中，使细胞与包括mRNA的LNP接触可降低细胞对外源核酸的先天免疫反应。细胞可与包括第一量的包括可翻译区的第一外源mRNA的第一脂质纳米粒子接触并且可测定所述细胞对所述第一外源mRNA的先天免疫反应的水平。随后，所述细胞可与包括第二量的所述第一外源mRNA的第二组合物接触，所述第二量是与所述第一量相比较少量的所述第一外源mRNA。或者，所述第二组合物可包括第一量的不同于所述第一外源mRNA的第二外源mRNA。使所述细胞与第一组合物和第二组合物接触的步骤可重复一次或多次。另外，可任选地测定细胞中的多肽产生(例如翻译)效率，并且所述细胞可重复地与第一组合物和/或第二组合物再接触，直至实现靶蛋白产生效率。
向细胞和器官递送治疗剂的方法
本公开提供了向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的方法。向细胞递送治疗剂和/或预防剂涉及向受试者施用包含包括所述治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的LNP的本公开配制物，其中所述组合物的施用涉及使所述细胞与所述组合物接触。在一些实施方案中，蛋白质、细胞毒性剂、放射性离子、化学治疗剂或核酸(诸如RNA，例如mRNA)可递送至细胞或器官。在治疗剂和/或预防剂是mRNA的情况下，在细胞与所述脂质纳米粒子接触时，可翻译mRNA可在细胞中翻译以产生目标多肽。然而，基本上不可翻译的mRNA也可递送至细胞。基本上不可翻译的mRNA可用作疫苗和/或可隔绝细胞的翻译组分以降低其他物质在细胞中的表达。
在一些实施方案中，LNP可靶向特定类型或类别的细胞(例如，特定器官或其系统的细胞)。在一些实施方案中，包括目标治疗剂和/或预防剂的LNP可特异性地递送至哺乳动物肝脏、肾脏、脾脏、股骨或肺。特异性递送至特定类别的细胞、器官或其系统或组暗示例如在将LNP施用至哺乳动物时，相对于其他目的地，较高比例的包括治疗剂和/或预防剂的脂质纳米粒子递送至目标目的地(例如组织)。在一些实施方案中，特异性递送可导致如与另一目的地(例如脾脏)相比，靶向目的地(例如目标组织，诸如肝脏)的每1g组织中治疗剂和/或预防剂的量的超过2倍、5倍、10倍、15倍或20倍增加。在一些实施方案中，目标组织选自由肝脏、肾脏、肺、脾脏、股骨、血管中(例如，冠状动脉内或股动脉内)或肾脏中的血管内皮，和肿瘤组织(例如，经由肿瘤内注射)组成的组。
作为靶向或特异性递送的另一个实例，编码细胞表面上的蛋白结合搭配物(例如，抗体或其功能片段、骨架蛋白或肽)或受体的mRNA可包括于LNP中。mRNA可另外或替代地用于指导脂质、碳水化合物或其他生物部分的合成和细胞外定位。或者，LNP的其他治疗剂和/或预防剂或要素(例如脂质或配体)可基于其对特定受体(例如低密度脂蛋白受体)的亲和力加以选择，以致LNP可更容易地与包括所述受体的靶细胞群体相互作用。在一些实施方案中，配体可包括但不限于特定结合对的成员、抗体、单克隆抗体、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单结构域抗体、骆驼化抗体和其片段、人源化抗体和其片段以及其多价形式；包括单特异性或双特异性抗体的多价结合试剂，诸如二硫化物稳定化Fv片段、scFv串联、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体；以及适体、受体和融合蛋白。
在一些实施方案中，配体可为表面结合抗体，其可允许细胞靶向特异性的调整。这是尤其有用的，因为高度特异性抗体可关于所需靶向位点针对目标表位产生。在一个实施方案中，多种抗体表达于细胞的表面上，并且每种抗体可对所需靶标具有不同特异性。此类方法可增加靶向相互作用的亲合力和特异性。
配体可例如由生物领域的技术人员基于细胞的所需定位或功能进行选择。
在一些实施方案中，LNP可靶向肝细胞。诸如阿朴脂蛋白E(apoE)的阿朴脂蛋白已显示与身体中的含中性或近中性脂质的脂质纳米粒子缔合，并且已知与发现于肝细胞表面上的受体(诸如低密度脂蛋白受体(LDLR))缔合。因此，施用至受试者的包括具有中性或近中性电荷的脂质组分的LNP可在受试者的身体中获得apoE并且可随后以靶向方式向包括LDLR的肝细胞递送治疗剂和/或预防剂(例如RNA)。
治疗疾病和病症的方法
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的空LNP。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的负载LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的空LNP。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的负载LNP。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的负载LNP溶液。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供了本文所公开的空LNP在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供了本文所公开的空LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供了本文所公开的负载LNP在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供了本文所公开的负载LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供了一种向受试者施用本文所公开的空LNP的方法。
在一些方面，本公开提供了一种向受试者施用本文所公开的空LNP溶液的方法。
在一些方面，本公开提供了一种向受试者施用本文所公开的负载LNP的方法。
在一些方面，本公开提供了一种向受试者施用本文所公开的负载LNP溶液的方法。
在一些方面，本公开提供了一种向受试者施用本文所公开的LNP配制物的方法。
脂质纳米粒子可用于治疗疾病、病症或疾患。特别是，此类组合物可用于治疗特征在于缺失或异常蛋白或多肽活性的疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，包含包括编码缺失或异常多肽的mRNA的LNP的本公开配制物可施用或递送至细胞。mRNA的后续翻译可产生所述多肽，由此降低或消除由于所述多肽不存在或由所述多肽引起的异常活性而引起的问题。因为翻译可快速地发生，所以所述方法和组合物可用于治疗急性疾病、病症或疾患，诸如败血症、中风和心肌梗塞。LNP中包括的治疗剂和/或预防剂还可能够改变给定物质的转录速率，由此影响基因表达。
本公开提供了涉及施用包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的脂质纳米粒子和包括所述脂质纳米粒子的药物组合物的方法。术语治疗剂和预防剂可在本文中关于本公开的特征和实施方案互换使用。其治疗组合物或成像、诊断或预防组合物可使用有效用于预防、治疗、诊断疾病、病症和/或疾患或使疾病、病症和/或疾患成像和/或任何其他目的的任何合理量和任何施用途径施用至受试者。施用至给定受试者的特定量可根据所述受试者的物种、年龄和一般状况；施用目的；特定组成；施用模式等而变化。为便于施用和剂量的均一性，根据本公开的组合物可以剂量单位形式配制。然而，应了解，本公开组合物的总每日用量将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。针对任何特定患者的特定治疗有效、预防有效或在其他方面适当的剂量水平(例如，用于成像)将取决于多种因素，包括所治疗的病症的严重程度和鉴定(如果存在)；所用的一种或多种治疗剂和/或预防剂；所用特定组成；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用的特定药物组合物的排泄速率；治疗持续时间；与所用的特定药物组合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。
包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的LNP可通过任何途径施用。在一些实施方案中，包括一种或多种本文所述的脂质纳米粒子的组合物(包括预防、诊断或成像组合物)通过多种途径中的一者或多者施用，包括口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、透皮或皮内、皮间、直肠、阴道内、腹膜内、表面(例如，通过散剂、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、肠、玻璃体内、肿瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口腔喷雾剂和/或散剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂，和/或经由门静脉导管。在一些实施方案中，组合物可经静脉内、肌肉内、皮内、动脉内、肿瘤内、皮下或通过吸入施用。然而，考虑到药物递送科学的可能进展，本公开涵盖通过任何适当途径递送或施用本文所述的组合物。一般来说，最适当施用途径将取决于多种因素，包括包含一种或多种治疗剂和/或预防剂的脂质纳米粒子的性质(例如，其在诸如血流和胃肠道的多种身体环境中的稳定性)、患者状况(例如，所述患者是否能够耐受特定施用途径)等。
在某些实施方案中，根据本公开的组合物可以给定剂量中足以递送约0.0001mg/kg至约10mg/kg、约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.005mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约0.0001mg/kg至约5mg/kg、约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.005mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.05mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约0.0001mg/kg至约2.5mg/kg、约0.001mg/kg至约2.5mg/kg、约0.005mg/kg至约2.5mg/kg、约0.01mg/kg至约2.5mg/kg、约0.05mg/kg至约2.5mg/kg、约0.1mg/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg至约2.5mg/kg、约2mg/kg至约2.5mg/kg、约0.0001mg/kg至约1mg/kg、约0.001mg/kg至约1mg/kg、约0.005mg/kg至约1mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.05mg/kg至约1mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.0001mg/kg至约0.25mg/kg、约0.001mg/kg至约0.25mg/kg、约0.005mg/kg至约0.25mg/kg、约0.01mg/kg至约0.25mg/kg、约0.05mg/kg至约0.25mg/kg或约0.1mg/kg至约0.25mg/kg的治疗剂和/或预防剂(例如mRNA)的剂量水平施用，其中1mg/kg(mpk)剂量提供1mg治疗剂和/或预防剂/1kg受试者体重。在一些实施方案中，可施用约0.001mg/kg至约10mg/kg的LNP的治疗剂和/或预防剂(例如mRNA)的剂量。在其他实施方案中，可施用约0.005mg/kg至约2.5mg/kg的治疗剂和/或预防剂的剂量。在某些实施方案中，可施用约0.1mg/kg至约1mg/kg的剂量。在其他实施方案中，可施用约0.05mg/kg至约0.25mg/kg的剂量。剂量可以相同或不同量每天施用一次或多次，以获得所需水平的mRNA表达和/或治疗、诊断、预防或成像效应。所需剂量可例如一天三次、一天二次、一天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送。在某些实施方案中，所需剂量可使用多次施用(例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)进行递送。在一些实施方案中，单一剂量可例如在手术程序之前或之后或在急性疾病、病症或疾患的情形中施用。
包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(诸如核酸)的脂质纳米粒子可与一种或多种其他治疗剂、预防剂、诊断剂或成像剂组合使用。“与......组合(in combination with)”不旨在暗示所述剂必须同时施用和/或被配制用于一起递送，尽管这些递送方法是在本公开的范围内。在一些实施方案中，可组合施用包括一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂的一种或多种脂质纳米粒子。组合物可与一种或多种其他所需治疗剂或医学程序并行地、在一种或多种其他所需治疗剂或医学程序之前或之后施用。一般来说，各剂将以针对该剂确定的剂量和/或时程施用。在一些实施方案中，本公开涵盖其组合物或成像、诊断或预防组合物与改进其生物可用性、降低和/或调节其代谢、抑制其排泄和/或修饰其在身体内的分布的剂组合递送。
应进一步理解，组合利用的治疗、预防、诊断或成像活性剂可在单一组合物中一起施用，或在不同组合物中分开地施用。一般来说，预期组合利用的剂将以不超过其个别地利用时的水平的水平利用。在一些实施方案中，组合利用的水平可低于个别地利用的水平。
用于组合方案中的疗法(治疗剂或程序)的特定组合将考虑到所需治疗剂和/或程序的可相容性以及待实现的所需治疗效应。还应理解，所用疗法可对同一病症实现所需效应(例如，可用于治疗癌症的组合物可与化学治疗剂并行地施用)，或者其可实现不同效应(例如，对诸如输注相关反应的任何不良效应的控制)。
LNP可与剂组合使用以增加组合物的有效性和/或治疗窗。这种剂可为例如抗炎化合物、类固醇(例如皮质类固醇)、他汀类、雌二醇、BTK抑制剂、S1P1激动剂、糖皮质激素受体调节剂(GRM)或抗组胺。在一些实施方案中，LNP可与地塞米松、氨甲蝶呤、对乙酰氨基酚、H1受体阻断剂或H2受体阻断剂组合使用。在一些实施方案中，一种治疗有需要的受试者或向受试者(例如哺乳动物)递送治疗剂和/或预防剂的方法可涉及在施用LNP之前用一种或多种剂预治疗所述受试者。在一些实施方案中，受试者可用适用量(例如，10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg或任何其他适用量)的地塞米松、氨甲蝶呤、对乙酰氨基酚、H1受体阻断剂或H2受体阻断剂预治疗。预治疗可在脂质纳米粒子的施用之前24小时或更短时间(例如，24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟)发生并且可以例如增加的剂量发生一次、两次或更多次。
本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定根据本文所述的公开内容的特定实施方案的许多等效方案。本公开的范围不旨在局限于以上具体实施方式，而是如所附权利要求中所陈述。
除非相反指示或在其他方面从本文显而易见，否则在权利要求中，诸如“一个”、“一种”和“所述”的冠词可意指一个(种)或超过一个(种)。除非相反指示或在其他方面从本文显而易见，否则在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述在所述组成员中的一者、超过一者或全部存在于、用于给定产物或过程中或以其他方式与给定产物或过程相关时被视为满足条件的。本公开包括如下实施方案，其中确切地所述组的一个成员存在于、用于给定产物或过程中或以其他方式与给定产物或过程相关。本公开包括如下实施方案，其中所述组成员中的超过一者或全部存在于、用于给定产物或过程中或以其他方式与给定产物或过程相关。
还应注意，术语“包含”旨在是开放性的并且允许但不需要包括额外要素或步骤。当术语“包含”在本文中使用时，因此还涵盖并公开术语“基本上由......组成”和“由......组成”。在通篇描述中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，预期组合物还基本上由所陈述的组分组成，或由所陈述的组分组成。类似地，在方法或工艺被描述为具有、包括或包含特定工艺步骤的情况下，所述工艺还基本上由所陈述的工艺步骤组成，或由所陈述的工艺步骤组成。此外，应理解步骤的次序或关于执行某些动作的次序并不重要，只要本发明保持可操作即可。此外，两个或更多个步骤或动作可同时进行。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，还应理解除非另外指示或在其他方面从本文和本领域普通技术人员的理解显而易知，否则以范围表述的值可在本公开的不同实施方案中假设所陈述的范围内的任何特定值或子范围，除非本文另外清楚地指示，否则达到所述范围的下限的单位的十分之一。
此外，应理解属于现有技术的本公开的任何特定实施方案均可明确地从权利要求的任何一项或多项排除。由于此类实施方案被认为是本领域普通技术人员所知的，所以可将这些实施方案排除在外，即使在本文中未明确陈述所述排除。
所有引用的来源(例如，参考文献、公布、专利申请、数据库、数据库条目和本文所引用的技术)通过引用并入本申请中，即使在引用中未明确陈述。在引用的来源与本申请的陈述有冲突的情况下，应以本申请中的陈述为准。
在已描述本公开的情况下，提供以下实施例以作说明而非限制。
等效方案
本发明的一个或多个实施方案的细节陈述于以上随附描述中。虽然在本公开的实践或测试中可使用类似或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本公开的其他特征、目标和优势将从所述描述和权利要求显而易知。除非上下文另外明确规定，否则在本说明书和所附权利要求书中，单数形式包括复数指示物。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本说明书中所引用的所有专利和公布均通过引用并入。
前述描述已仅出于说明目的呈现，并不旨在将本发明局限于所公开的精确形式，而是由所附权利要求来限定。
列举的实施方案
实施方案1.一种制备包含空脂质纳米粒子(空LNP)的空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
(i)混合步骤，所述混合步骤包括使包含可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的所述空LNP溶液，
其中所述空LNP溶液包含乙酸盐缓冲液并且具有在约4.6至约6.0范围内的pH。
实施方案2.一种制备包含空脂质纳米粒子(空LNP)的空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
(i)混合步骤，所述混合步骤包括使包含可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的所述空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的所述PEG脂质，
其中所述空LNP溶液包含乙酸盐缓冲液并且具有在约4.6至约6.0范围内的pH。
实施方案3.如实施方案1所述的方法，所述方法还包括处理所述空LNP溶液。
实施方案4.一种制备包含负载脂质纳米粒子(负载LNP)的负载脂质纳米粒子溶液(负载LNP溶液)的方法，所述方法包括：
(i)混合步骤，所述混合步骤包括使包含可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的所述空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含乙酸盐缓冲液并且具有在约4.6至约6.0范围内的pH；以及
(ii)装载步骤，所述装载步骤包括使包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含负载LNP的负载LNP溶液。
实施方案5.一种制备包含负载脂质纳米粒子(负载LNP)的负载脂质纳米粒子溶液(负载LNP溶液)的方法，所述方法包括：
(i)混合步骤，所述混合步骤包括使包含可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的所述空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的所述PEG脂质，其中所述空LNP溶液包含乙酸盐缓冲液并且具有在约4.6至约6.0范围内的pH；以及
(ii)装载步骤，所述装载步骤包括使包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含负载LNP的负载LNP溶液。
实施方案6.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法还包括处理所述负载LNP溶液，由此形成脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)。
实施方案7.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述负载LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，所述第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述负载LNP中。
实施方案8.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤包括将包含所述PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至所述负载LNP溶液中。
实施方案9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.5mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质或约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液的步骤还包括pH调节。
实施方案11.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述pH调节包括添加第二缓冲剂。
实施方案12.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲剂包括第二水性缓冲溶液。
实施方案13.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
实施方案14.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
实施方案15.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂为乙酸盐。
实施方案16.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液的步骤还包括过滤。
实施方案17.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中通过切向流过滤执行所述过滤。
实施方案18.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述负载LNP溶液的步骤还包括缓冲液交换。
实施方案19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述缓冲液交换包括添加包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液。
实施方案20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三缓冲剂包括第三水性缓冲溶液。
实施方案21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲溶液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
实施方案22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲溶液具有在约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6范围内的pH。
实施方案23.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲溶液具有约7.5的pH。
实施方案24.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之前执行所述第一添加步骤。
实施方案25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之后执行所述第一添加步骤。
实施方案26.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述负载LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，所述第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述负载LNP中。
实施方案27.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之前执行所述第二添加步骤。
实施方案28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之后执行所述第二添加步骤。
实施方案29.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液的步骤还包括稀释所述空LNP溶液。
实施方案30.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冷冻所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
实施方案31.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冻干所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
实施方案32.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括储存所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
实施方案33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述混合步骤。
实施方案34.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述装载步骤。
实施方案35.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液具有在约4.5至约6.5、约4.6至约6.0、约4.7至约5.75、约4.8至约5.5或约4.9至约5.25范围内的pH。
实施方案36.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液具有约5.0的pH。
实施方案37.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液具有在约4.8至约5.8、约5.0至约5.75或约5.0至约5.5范围内的pH。
实施方案38.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液具有在约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5范围内的pH。
实施方案39.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液、所述空LNP溶液和所述LNP配制物的pH在约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5范围内。
实施方案40.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述负载LNP溶液具有在约4.5至约6.0、约4.6至约5.8、约4.8至约5.6、约5.0至约5.5或约5.1至约5.4范围内的pH。
实施方案41.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液还包含第一有机溶剂。
实施方案42.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含第一有机溶剂。
实施方案43.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一有机溶剂为醇。
实施方案44.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一有机溶剂为乙醇。
实施方案45.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一缓冲剂包括第一水性缓冲溶液。
实施方案46.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
实施方案47.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含大于约1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约2mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约15mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约25mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或大于约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
实施方案48.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含约1mM至约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约2mM至约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约3mM至约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约4mM至约8mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或约5mM至约6mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
实施方案49.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
实施方案50.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含约5mM乙酸盐，其中所述水性缓冲溶液具有约5.0的pH。
实施方案51.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含张力剂。
实施方案52.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述张力剂为糖。
实施方案53.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述糖为蔗糖。
实施方案54.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液包含约0.01g/mL至约1.0g/mL、约0.05g/mL至约0.5g/mL、约0.1g/mL至约0.4g/mL、约0.15g/mL至约0.3g/mL或约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
实施方案55.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
实施方案56.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.2g/mL蔗糖。
实施方案57.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约0.01至约1.0mg/mL的所述核酸、约0.05至约0.5mg/mL的所述核酸或约0.1至约0.25mg/mL的所述核酸。
实施方案58.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组的缓冲液。
实施方案59.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含乙酸盐缓冲液。
实施方案60.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约1mM至约200mM乙酸盐缓冲液、约2mM至约180mM乙酸盐缓冲液、约3mM至约160mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约150mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约140mM乙酸盐缓冲液、约5mM至约130mM乙酸盐缓冲液、约6mM至约120mM乙酸盐缓冲液、约7mM至约110mM乙酸盐缓冲液、约8mM至约100mM乙酸盐缓冲液、约9mM至约90mM乙酸盐缓冲液、约10mM至约80mM乙酸盐缓冲液、约15mM至约70mM乙酸盐缓冲液、约20mM至约60mM乙酸盐缓冲液、约25mM至约50mM乙酸盐缓冲液或约30mM至约40mM乙酸盐缓冲液。
实施方案61.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述装载步骤期间将所述核酸溶液和所述空LNP溶液以约5:1至约7:1、约4:1至约6:1、约3:1至约5:1或约2:1至约4:1的体积流量比率混合。
实施方案62.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述负载LNP溶液包含乙酸盐缓冲液。
实施方案63.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液、所述空LNP、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物还包含囊封剂。
实施方案64.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物还包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或它们的任何组合。
实施方案65.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP包含
约30mol％-60mol％可离子化脂质；
约0mol％-30mol％磷脂；
约15mol％-50mol％结构脂质；和
约0.1mol％-0.5mol％PEG脂质。
实施方案66.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质选自由经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油和经PEG修饰的二烷基甘油组成的组。
实施方案67.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述结构脂质选自由胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、西红柿碱、熊果酸、α-生育酚和它们的衍生物组成的组。
实施方案68.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述磷脂选自由1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0DietherPC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂和它们的衍生物组成的组。
实施方案69.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质包含可离子化氨基脂质。
实施方案70.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸为核糖核酸。
实施方案71.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸为选自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)组成的组的至少一种核糖核酸。
实施方案72.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸为信使RNA(mRNA)。
实施方案73.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA包括选自由茎环、链终止核苷、polyA序列、多聚腺苷酸化信号和5’帽结构组成的组的至少一个基序。
实施方案74.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA的长度为至少30个核苷酸。
实施方案75.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA的长度为至少300个核苷酸。
实施方案76.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N:P比率为约1.1:1至约30.1。
实施方案77.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N:P比率为约2:1至约20:1。
实施方案78.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N:P比率为约2:1至约10:1或约2:1至约5:1。
实施方案79.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物包含约0.01至约500mg/mL的所述核酸、约0.1至约100mg/mL、约0.25至约50mg/mL、约0.5至约10mg/mL或约1.0至约10mg/mL的所述核酸。
实施方案80.一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
实施方案81.一种空LNP，所述空LNP通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案82.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案83.一种包含空LNP的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
实施方案84.一种负载LNP，所述负载LNP通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案85.一种负载LNP溶液，所述负载LNP溶液通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案86.一种LNP配制物，所述LNP配制物通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案87.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的负载LNP。
实施方案88.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的负载LNP溶液。
实施方案89.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的LNP配制物。
实施方案90.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中经肠胃外执行所述施用。
实施方案91.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中经肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行所述施用。
实施方案92.如前述实施方案中任一项所述的负载LNP，所述负载LNP用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案93.如前述实施方案中任一项所述的负载LNP溶液，所述负载LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案94.如前述实施方案中任一项所述的LNP配制物，所述LNP配制物用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案95.前述实施方案中任一项所述的负载LNP在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
实施方案96.前述实施方案中任一项所述的负载LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
实施方案97.前述实施方案中任一项所述的LNP配制物在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
实施方案98.一种药盒，所述药盒包含实施方案77-83中任一项所述的空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物。
实施方案99.一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约1.25mol％的PEG脂质。
实施方案100.一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
实施方案101.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，所述空LNP还包含可离子化脂质。
实施方案102.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，所述空LNP还包含磷脂和结构脂质。
实施方案103.一种空LNP，所述空LNP包含约30mol％-60mol％可离子化脂质；约0mol％-30mol％磷脂；约15mol％-50mol％结构脂质；和约0.1mol％-10mol％PEG脂质。
实施方案104.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含前述实施方案中任一项所述的空LNP。
实施方案105.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液还包含乙酸盐缓冲液。
实施方案106.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液还包含张力剂。
实施方案107.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述张力剂为蔗糖。
实施方案108.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质的空LNP；和
(ii)乙酸盐缓冲液。
实施方案109.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质的空LNP；
(ii)乙酸盐缓冲液；和
(iii)蔗糖。
实施方案110.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质的空LNP；和
(ii)乙酸盐缓冲液。
实施方案111.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质的空LNP；
(ii)乙酸盐缓冲液；和
(iii)蔗糖。
实施方案112.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液具有约4.5至约6.25、约4.6至约6.0、约4.8至约5.8、约5.0至约5.75或约5.0至约5.5的pH值。
实施方案113.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约5mM乙酸盐缓冲液，其中所述乙酸盐缓冲液具有约5.0的pH。
实施方案114.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约0.2g/mL蔗糖。
实施方案115.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约30mol％至约60mol％的所述可离子化脂质、约0mol％至约30mol％的所述磷脂、约15mol％至约50mol％的所述结构脂质和约0.1mol％至约0.5mol％的所述PEG脂质。
实施方案116.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约40mol％至约60mol％的所述可离子化脂质、约5mol％至约20mol％的所述磷脂、约30mol％至约50mol％的所述结构脂质和约0.1mol％至约1.25mol％的所述PEG脂质。
实施方案117.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述PEG脂质以约0.2mol％至约0.7mol％的浓度存在。
实施方案118.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述PEG脂质以约0.5mol％的浓度存在。
实施方案119.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案120.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约30mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案121.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约20mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案122.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约10mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案123.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约5mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案124.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述缓冲液具有比所述可离子化脂质的pKa小至少1个单位的pH。
实施方案125.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述缓冲液具有小于5.5的pH。
实施方案126.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述缓冲液具有约5.0的pH。
实施方案127.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液具有比所述可离子化脂质的pKa小至少1个单位的pH。
实施方案128.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液具有小于5.5的pH。
实施方案129.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液具有约5.0的pH。
实施方案130.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述LNP包含约45mol％至约50mol％可离子化脂质。
实施方案131.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002011
或其盐。
实施方案132.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002012
或其盐。
实施方案133.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述PEG脂质为PEG2k-DMG。
实施方案134.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述结构脂质为胆固醇。
实施方案135.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
实施方案136.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP基本上不含治疗剂或预防剂。
实施方案137.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP不包含治疗剂或预防剂。
实施方案138.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP包含少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％或少于1wt.％的治疗剂或预防剂。
实施方案139.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP包含少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的治疗剂或预防剂。
实施方案140.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP基本上不含核酸。
实施方案141.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP不包含核酸。
实施方案142.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP包含少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％或少于1wt.％的核酸。
实施方案143.如前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液，其中所述空LNP包含少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的核酸。
实施方案144.一种制剂，所述制剂包含前述实施方案中任一项所述的空LNP。
实施方案145.一种制剂，所述制剂包含前述实施方案中任一项所述的空LNP和具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案146.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂。
实施方案147.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP基本上不含治疗剂或预防剂，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案148.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP不包含治疗剂或预防剂，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案149.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP包含少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％或少于1wt.％的治疗剂或预防剂，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案150.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP包含少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的治疗剂或预防剂，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案151.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP基本上不含核酸，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案152.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP不包含核酸，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案153.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP包含少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％或少于1wt.％的核酸，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案154.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中所述LNP包含少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的核酸，并且其中所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案155.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP基本上不含治疗剂或预防剂；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案156.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP不包含治疗剂或预防剂；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案157.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP包含少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％、少于1wt.％的治疗剂或预防剂；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案158.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP包含少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的治疗剂或预防剂；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案159.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP基本上不含核酸；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案160.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP不包含核酸；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案161.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP包含少于5wt.％、少于4wt.％、少于3wt.％、少于2wt.％或少于1wt.％的核酸；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案162.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP包含少于0.9wt.％、少于0.8wt.％、少于0.7wt.％、少于0.6wt.％、少于0.5wt.％、少于0.4wt.％、少于0.3wt.％、少于0.2wt.％或少于0.1％的核酸；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案163.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述PEG脂质以约0.2mol％至约0.7mol％的浓度存在。
实施方案164.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述PEG脂质以约0.5mol％的浓度存在。
实施方案165.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约2mM至约30mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案166.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约2mM至约20mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案167.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约2mM至约10mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案168.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约5mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
实施方案169.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述缓冲液具有比所述可离子化脂质的pKa小至少1个单位的pH。
实施方案170.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述缓冲液具有小于5.5的pH。
实施方案171.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述缓冲液具有约5.0的pH。
实施方案172.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述LNP包含约45mol％至约50mol％可离子化脂质。
实施方案173.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002081
或其盐。
实施方案174.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002091
或其盐。
实施方案175.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述PEG脂质为PEG2k-DMG。
实施方案176.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述结构脂质为胆固醇。
实施方案177.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
实施方案178.一种前述实施方案中任一项所述的空LNP的群体。
实施方案179.一种制备空脂质纳米粒子(空LNP)的方法，所述方法包括：
i)混合步骤，所述混合步骤包括使可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成所述空LNP，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
实施方案180.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述混合步骤包括使包含所述可离子化脂质的脂质溶液与包含所述第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)。
实施方案181.一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
实施方案182.一种包含空LNP的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
实施方案183.一种制备与核酸缔合的负载脂质纳米粒子(负载LNP)的方法，所述方法包括：
ii)装载步骤，所述装载步骤包括使核酸与空LNP混合，由此形成所述负载LNP。
实施方案184.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述装载步骤包括使包含所述核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含负载LNP的负载脂质纳米粒子溶液(负载LNP溶液)。
实施方案185.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在形成之后，所述空LNP或所述空LNP溶液在未保存或储存的情况下经历所述装载步骤。
实施方案186.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述空LNP溶液在保存一段时期之后经历所述装载步骤。
实施方案187.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述空LNP溶液在储存一段时期之后经历所述装载步骤。
实施方案188.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在形成之后，所述空LNP或所述空LNP溶液在未储存或保存一段时期的情况下经历所述装载步骤。
实施方案189.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法还包括：
iii)处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液，由此形成脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)。
实施方案190.一种空LNP，所述空LNP通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案191.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案192.一种负载LNP，所述负载LNP通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案193.一种负载LNP溶液，所述负载LNP溶液通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案194.一种LNP配制物，所述LNP配制物通过前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案195.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP或所述负载LNP还包含约0.1mol％-0.5mol％PEG脂质、磷脂、结构脂质或它们的任何组合。
实施方案196.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，所述第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案197.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤包括将包含所述PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至所述空LNP溶液或负载LNP溶液中。
实施方案198.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，所述第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案199.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤包括将包含所述PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至所述空LNP溶液或负载LNP溶液中。
实施方案200.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG或约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案201.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG或约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案202.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤包括将约1.75mol％PEG脂质添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案203.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG或约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案204.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG或约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案205.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤包括将约1.0mol％PEG脂质添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
实施方案206.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP或所述负载LNP包含约3.0mol％PEG脂质或更少、约2.75mol％PEG脂质或更少、约2.5mol％PEG脂质或更少、约2.25mol％PEG脂质或更少、约2.0mol％PEG脂质或更少、约1.75mol％PEG脂质或更少、约1.5mol％PEG脂质或更少、约1.25mol％PEG脂质或更少、约1.0mol％PEG脂质或更少、约0.9mol％PEG脂质或更少、约0.8mol％PEG脂质或更少、约0.7mol％PEG脂质或更少、约0.6mol％PEG脂质或更少、约0.5mol％PEG脂质或更少、约0.4mol％PEG脂质或更少、约0.3mol％PEG脂质或更少、约0.2mol％PEG脂质或更少或约0.1mol％PEG脂质或更少。
实施方案207.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP或所述负载LNP包含约0mol％至约3.0mol％PEG脂质、0.1mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.25mol％PEG脂质、约0.25mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.5mol％至约1.75mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质或约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质。
实施方案208.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP或所述负载LNP包含约0mol％至约0.5mol％PEG脂质。
实施方案209.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括选自过滤、pH调节、缓冲液交换、稀释、透析、浓缩、冷冻、冻干、储存和包装的至少一个步骤。
实施方案210.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括pH调节。
实施方案211.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述pH调节包括添加第二缓冲剂。
实施方案212.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，所述第二缓冲剂包括第二水性缓冲液。
实施方案213.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，所述第二水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
实施方案214.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二水性缓冲液为tris缓冲液。
实施方案215.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二水性缓冲液具有在约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6范围内的pH。
实施方案216.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二水性缓冲液具有约7.5的pH。
实施方案217.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤在所述pH调节之前执行。
实施方案218.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤在所述pH调节之后执行。
实施方案219.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤在所述pH调节之前执行。
实施方案220.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤在所述pH调节之后执行。
实施方案221.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括过滤。
实施方案222.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述过滤为切向流过滤。
实施方案223.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括缓冲液交换。
实施方案224.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述缓冲液交换包括添加包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液。
实施方案225.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第三缓冲剂包括第三水性缓冲液。
实施方案226.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第三水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
实施方案227.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第三水性缓冲液具有在约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6范围内的pH。
实施方案228.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第三水性缓冲液具有约7.5的pH。
实施方案229.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤在所述缓冲液交换之前执行。
实施方案230.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤在所述缓冲液交换之后执行。
实施方案231.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加在所述缓冲液交换之前执行。
实施方案232.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤在所述缓冲液交换之后执行。
实施方案233.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括稀释。
实施方案234.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括透析。
实施方案235.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括浓缩。
实施方案236.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冷冻。
实施方案237.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冻干。
实施方案238.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述冻干包括在约-100℃至约0℃、约-80℃至约-10℃、约-60℃至约-20℃、约-50℃至约-25℃或约-40℃至约-30℃的温度下冷冻所述负载LNP溶液。
实施方案239.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述冻干还包括干燥冷冻的负载LNP溶液以形成冻干的空LNP或冻干的负载LNP。
实施方案240.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述干燥在约50毫托至约150毫托范围内的真空下执行。
实施方案241.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述干燥在约-35℃至约-15℃下执行。
实施方案242.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述干燥在约室温至约25℃下执行。
实施方案243.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括储存。
实施方案244.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述储存包括将所述空LNP或所述负载LNP在约-80℃、约-78℃、约-76℃、约-74℃、约-72℃、约-70℃、约-65℃、约-60℃、约-55℃、约-50℃、约-45℃、约-40℃、约-35℃或约-30℃的温度下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案245.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述储存包括将所述空LNP或所述负载LNP在约-40℃、约-35℃、约-30℃、约-25℃、约-20℃、约-15℃、约-10℃、约-5℃、约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃或约25℃的温度下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案246.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述储存包括将所述空LNP或所述负载LNP在-40℃至约0℃、约-35℃至约-5℃、约-30℃至约-10℃、约-25℃至约-15℃、约-22℃至约-18℃或约-21℃至约-19℃的温度下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案247.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述储存包括将所述空LNP或所述负载LNP在约-20℃的温度下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案248.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括包装。
实施方案249.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述混合步骤。
实施方案250.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述装载步骤。
实施方案251.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述混合步骤在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约24℃、低于约22℃、低于约20℃或低于约环境温度的温度下执行。
实施方案252.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述装载步骤在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约24℃、低于约22℃、低于约20℃或低于约环境温度的温度下执行。
实施方案253.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一添加步骤在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约24℃、低于约22℃、低于约20℃或低于约环境温度的温度下执行。
实施方案254.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第二添加步骤在低于约30℃、低于约28℃、低于约26℃、低于约24℃、低于约22℃、低于约20℃或低于约环境温度的温度下执行。
实施方案255.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述混合步骤与所述第一添加步骤之间的停留时间在约1.0毫秒至约60分钟、约2.0毫秒至约30分钟、约3.0毫秒至约15分钟、约4.0毫秒至约10分钟、约5.0毫秒至约5分钟、约10.0毫秒至约2分钟、约100.0毫秒至约1.0分钟、约1000毫秒至约1.0分钟范围内。
实施方案256.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述水性缓冲溶液具有在约4.5至约6.5、约4.6至约6.0、约4.7至约5.75、约4.8至约5.5或约4.9至约5.25范围内的pH。
实施方案257.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述水性缓冲溶液具有约5.0的pH。
实施方案258.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述脂质溶液具有在约7.0至约8.0、约7.1至约7.8、约7.2至约7.6或约7.3至约7.5范围内的pH。
实施方案259.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液具有在约4.5至约6.25、约4.6至约6.0、约4.8至约5.8、约5.0至约5.75、约5.0至约5.5范围内的pH。
实施方案260.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液具有在约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5范围内的pH。
实施方案261.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液、所述空LNP溶液和所述LNP配制物的pH在约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5范围内。
实施方案262.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述负载LNP溶液具有在约4.5至约6.0、约4.6至约5.8、约4.8至约5.6、约5.0至约5.5或约5.1至约5.4范围内的pH。
实施方案263.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述脂质溶液还包含第一有机溶剂。
实施方案264.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含第一有机溶剂。
实施方案265.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一有机溶剂为醇。
实施方案266.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一有机溶剂为乙醇。
实施方案267.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一缓冲剂包括第一水性缓冲液。
实施方案268.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
实施方案269.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一水性缓冲液包含大于约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约15mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约25mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或大于约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
实施方案270.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一水性缓冲液包含大于约1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约2mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约15mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约25mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或大于约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
实施方案271.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一水性缓冲液包含约1mM至约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约2mM至约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约3mM至约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约4mM至约8mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或约5mM至约6mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
实施方案272.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一水性缓冲液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
实施方案273.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述第一水性缓冲液包含约5mM乙酸盐，其中所述水性缓冲溶液具有约5.0的pH。
实施方案274.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含张力剂。
实施方案275.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中在所述装载步骤之前所述空LNP溶液或负载LNP溶液与张力剂一起储存。
实施方案276.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述张力剂为糖。
实施方案277.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述糖为蔗糖。
实施方案278.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.01g/mL至约1.0g/mL、约0.05g/mL至约0.5g/mL、约0.1g/mL至约0.4g/mL、约0.15g/mL至约0.3g/mL或约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
实施方案279.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
实施方案280.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.2g/mL蔗糖。
实施方案281.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含约0.01至约1.0mg/mL的所述核酸、约0.05至约0.5mg/mL的所述核酸或约0.1至约0.25mg/mL的所述核酸。
实施方案282.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含约0.001至约1.0mg/mL的所述核酸、约0.0025至约0.5mg/mL的所述核酸或约0.005至约0.2mg/mL的所述核酸。
实施方案283.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含约0.005至约0.2mg/mL的所述核酸。
实施方案284.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组的缓冲液。
实施方案285.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含乙酸盐缓冲液。
实施方案286.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含约1mM至约200mM乙酸盐缓冲液、约2mM至约180mM乙酸盐缓冲液、约3mM至约160mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约150mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约140mM乙酸盐缓冲液、约5mM至约130mM乙酸盐缓冲液、约6mM至约120mM乙酸盐缓冲液、约7mM至约110mM乙酸盐缓冲液、约8mM至约100mM乙酸盐缓冲液、约9mM至约90mM乙酸盐缓冲液、约10mM至约80mM乙酸盐缓冲液、约15mM至约70mM乙酸盐缓冲液、约20mM至约60mM乙酸盐缓冲液、约25mM至约50mM乙酸盐缓冲液或约30mM至约40mM乙酸盐缓冲液。
实施方案287.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含约8.8mM乙酸盐缓冲液。
实施方案288.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸溶液包含约130mM乙酸盐缓冲液。
实施方案289.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中在所述装载步骤期间将所述核酸溶液和所述空LNP溶液以约5:1至约7:1、约4:1至约6:1、约3:1至约5:1或约2:1至约4:1的体积流量比率混合。
实施方案290.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中在所述装载步骤期间将所述核酸溶液和所述空LNP溶液以约3:1的体积流量比率混合。
实施方案291.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液包含乙酸盐缓冲液。
实施方案292.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液包含约5mM乙酸盐缓冲液，其中所述乙酸盐缓冲液具有约5.0的pH。
实施方案293.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述脂质溶液、所述空LNP、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物还包含囊封剂。
实施方案294.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述囊封剂为式(EA-I)化合物：
Figure GDA0004174332580002271
或其盐或异构体，其中
R201和R202各自独立地选自由H、C1-C6烷基、C2-C6烯基和(C＝NH)N(R101)2组成的组，其中每个R101独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R203选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；
R204选自由H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C(O)(OC1-C20烷基)、C(O)(OC2-C20烯基)、C(O)(NHC1-C20烷基)和C(O)(NHC2-C20烯基)组成的组；并且
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施方案295.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述囊封剂为式(EA-II)化合物：
Figure GDA0004174332580002272
或其盐或异构体，其中
X101为键、NH或O；
R101和R102各自独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R103和R104各自独立地选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；并且
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施方案296.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述囊封剂为月桂酰精氨酸乙酯或其盐或异构体。
实施方案297.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物与所述核酸的wt/wt比率在约5:1至60:1范围内。
实施方案298.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物与所述核酸的wt/wt比率在约10:1至约50:1范围内。
实施方案299.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述脂质溶液、空LNP、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物还包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或它们的任何组合。
实施方案300.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述负载LNP和/或所述LNP配制物包含
约30mol％-60mol％可离子化脂质；
约0mol％-30mol％磷脂；
约15mol％-50mol％结构脂质；和
约0.1mol％-0.5mol％PEG脂质。
实施方案301.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述负载LNP和/或所述LNP配制物包含
约30mol％-60mol％可离子化脂质；
约0mol％-30mol％磷脂；
约15mol％-50mol％结构脂质；和
约0.01mol％-10mol％PEG脂质。
实施方案302.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质选自由经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油和经PEG修饰的二烷基甘油组成的组。
实施方案303.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为式(PL-I)化合物：
Figure GDA0004174332580002291
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r为1与100之间的整数，包括1和100；
L1为任选取代的C1-10亚烷基，其中任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)代替；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
Figure GDA0004174332580002301
L2的每个实例独立地为键或任选取代的C1-6亚烷基，其中任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)代替；
R2的每个实例独立地为任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O代替；
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基；
环B为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p为1或2。
实施方案304.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为式(PL-I-OH)化合物：
Figure GDA0004174332580002311
或其盐。
实施方案305.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为式(PL-II)化合物：
Figure GDA0004174332580002312
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选取代的烷基或氧保护基；
其中r为1与100之间的整数；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O代替；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
实施方案306.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为式(PL-II-OH)化合物：
Figure GDA0004174332580002321
或其盐，其中：
其中r为1与100之间的整数；
R5为任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地R5的一个或多个亚甲基被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O代替；并且
RN的每个实例独立地为氢、任选取代的烷基或氮保护基。
实施方案307.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中r为40与50之前的整数。
实施方案308.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中r为45。
实施方案309.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中R5为C17烷基。
实施方案310.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为式(PL-II)化合物：
Figure GDA0004174332580002331
或其盐。
实施方案311.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为式(PL-II)化合物：
Figure GDA0004174332580002332
实施方案312.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为式(PL-III)化合物：
Figure GDA0004174332580002333
或其盐或异构体，其中s为1与100之间的整数。
实施方案313.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述PEG脂质为具有下式的化合物：
Figure GDA0004174332580002341
实施方案314.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述结构脂质选自由胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和它们的衍生物组成的组。
实施方案315.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述磷脂选自由1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0DietherPC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂和它们的衍生物组成的组。
实施方案316.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
实施方案317.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质包含可离子化氨基脂质。
实施方案318.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-1)化合物：
Figure GDA0004174332580002351
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR 9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不为5元、6元或7元杂环烷基。
实施方案319.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IA)化合物：
Figure GDA0004174332580002371
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
实施方案320.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IB)化合物：
Figure GDA0004174332580002372
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中所有变量均如本文所定义。在一些实施方案中，m选自5、6、7、8和9；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
实施方案321.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-II)化合物：
Figure GDA0004174332580002381
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M’；R4为氢、未取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
实施方案322.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IIa)化合物：
Figure GDA0004174332580002391
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
实施方案323.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IIb)化合物：
Figure GDA0004174332580002392
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
实施方案324.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IIc)或(IL-IIe)化合物：
Figure GDA0004174332580002393
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
实施方案325.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IIf)化合物：
Figure GDA0004174332580002401
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中M为-C(O)O-或-OC(O)-，M”为C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
实施方案326.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IId)化合物：
Figure GDA0004174332580002402
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R’、R”和R2至R6如本文所述。在一些实施方案中，R2和R3中的每一者可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
实施方案327.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IIg)化合物：
Figure GDA0004174332580002403
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，M”为C1-6烷基(例如C1-4烷基)或C2-6烯基(例如C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
实施方案328.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002411
或其盐。
实施方案329.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002412
或其盐。
实施方案330.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002413
或其盐。
实施方案331.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002421
或其盐。
实施方案332.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-III)化合物：
Figure GDA0004174332580002422
或其盐或异构体，其中，
W为
Figure GDA0004174332580002423
环A为
Figure GDA0004174332580002424
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)均不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；
RX1和RX2各自独立地为H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基和杂芳基组成的组；
M*为C1-C6烷基，
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
每个R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-组成的组；
每个Y独立地为C3-6碳环；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
每个R’独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’组成的组；并且
n为1-6的整数；
其中当环A为
Figure GDA0004174332580002431
时，则
i)X1、X2和X3中的至少一者不为-CH2-；并且/或者
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-R”MR'。
实施方案333.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-IIIa1)-(IL-IIIa8)中任一者的化合物：
Figure GDA0004174332580002441
Figure GDA0004174332580002451
实施方案334.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为
Figure GDA0004174332580002452
或其盐。
实施方案335.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-VIVa)化合物：
Figure GDA0004174332580002453
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R’支链为
Figure GDA0004174332580002454
并且R’环状为：
Figure GDA0004174332580002455
并且
R'b为：
Figure GDA0004174332580002456
其中
Figure GDA0004174332580002461
表示连接点；
其中Raγ和Rbγ各自独立地为C2-12烷基或C2-12烯基；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为-(CH2)2OH；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
Ya为C3-6碳环；
R*”a选自由C1-15烷基和C2-15烯基组成的组；并且
s为2或3。
实施方案336.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质为式(IL-VIVb)化合物：
Figure GDA0004174332580002462
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中R'a为R'支链或R'环状；其中
R’支链为
Figure GDA0004174332580002463
并且R’环状为：
Figure GDA0004174332580002464
并且
R'b为：
Figure GDA0004174332580002465
其中
Figure GDA0004174332580002466
表示连接点；
其中Raγ和Rbγ各自独立地为C2-12烷基或C2-12烯基；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为
Figure GDA0004174332580002471
其中
Figure GDA0004174332580002472
表示连接点；
R10为N(R)2；每个R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
每个R'独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
Ya为C3-6碳环；
R*”a选自由C1-15烷基和C2-15烯基组成的组；并且
s为2或3。
实施方案337.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质选自：
Figure GDA0004174332580002473
Figure GDA0004174332580002481
实施方案338.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述可离子化脂质选自由以下组成的组：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
实施方案339.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸为核糖核酸。
实施方案340.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核糖核酸为选自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)组成的组的至少一种核糖核酸。
实施方案341.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述核酸为信使RNA(mRNA)。
实施方案342.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述mRNA包括选自由茎环、链终止核苷、polyA序列、多聚腺苷酸化信号和5’帽结构组成的组的至少一个基序。
实施方案343.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述mRNA的长度为至少30个核苷酸。
实施方案344.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述mRNA的长度为至少300个核苷酸。
实施方案345.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物的N:P比率为约1.1:1至约30.1。
实施方案346.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物的N:P比率为约2:1至约20:1。
实施方案347.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物的N:P比率为约2:1至约10:1或约2:1至约5:1。
实施方案348.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP包含约0.01至约500mg/mL的所述核酸、约0.1至约100mg/mL、约0.25至约50mg/mL、约0.5至约10mg/mL或约1.0至约10mg/mL的所述核酸。
实施方案349.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述负载LNP和/或所述LNP配制物具有约0.01至约0.25的多分散性指数(PDI)。
实施方案350.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的囊封效率。
实施方案351.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物具有至少约85％、至少约90％或至少约95％的囊封效率。
实施方案352.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物具有至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％的囊封效率。
实施方案353.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)为约20％或更高、约25％或更高、约30％或更高、约35％或更高、约40％或更高、约45％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高或约99％或更高。
实施方案354.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述负载LNP和/或所述LNP配制物具有约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小的平均脂质纳米粒子直径。
实施方案355.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述负载LNP和/或所述LNP配制物具有约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的平均脂质纳米粒子直径。
实施方案356.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述负载LNP和/或LNP配制物具有约15nm至约55nm、约20nm至约50nm、约25nm至约45nm或约30nm至约40nm的平均脂质纳米粒子直径。
实施方案357.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述负载LNP和/或LNP配制物具有约25至约45nm的平均脂质纳米粒子直径。
实施方案358.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物的多分散性指数(PDI)在所述LNP配制物于约-5℃-25℃、约0℃-10℃或约2℃-8℃下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年后增加少于约0.25、少于约0.20、少于约0.15、少于约0.10、少于约0.05、少于约0.04、少于约0.03、少于约0.02或少于约0.01。
实施方案359.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物的多分散性指数(PDI)在所述LNP配制物于约-100℃至约80℃、约-80℃至约60℃、约-40℃至约40℃、约-20℃至约30℃、约-5℃至约25℃、约0℃至约10℃或约2℃至约8℃下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年后增加少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％。
实施方案360.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述空LNP、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物的囊封效率在所述LNP配制物于约-100℃至约80℃、约-80℃至约60℃、约-40℃至约40℃、约-20℃至约30℃、约-5℃至约25℃、约0℃至约10℃或约2℃至约8℃下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年后囊封效率降低少于约25％、降低少于约20％、降低少于约15％、降低少于约10％、降低少于约5％、降低少于约4％、降低少于约3％、降低少于约2％或降低少于约1％。
实施方案361.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中与通过可比较方法产生的LNP配制物相比，所述空LNP、所述负载LNP和/或所述LNP配制物的平均脂质纳米粒子直径为约99％或更少、约98％或更少、约97％或更少、约96％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约40％或更少、约30％或更少、约20％或更少或约10％或更少。
实施方案362.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物的囊封效率比通过可比较方法产生的LNP配制物的囊封效率高约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约30倍或更多、约40倍或更多、约50倍或更多、约100倍或更多、约200倍或更多、约300倍或更多、约400倍或更多、约500倍或更多、约1000倍或更多、约2000倍或更多、约3000倍或更多、约4000倍或更多、约5000倍或更多或约10000倍或更多。
实施方案363.如前述实施方案中任一项所述的方法、空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物，其中所述LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)比通过可比较方法产生的LNP配制物的核酸表达(例如mRNA表达)高约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多、约30倍或更多、约40倍或更多、约50倍或更多、约100倍或更多、约200倍或更多、约300倍或更多、约400倍或更多、约500倍或更多、约1000倍或更多、约2000倍或更多、约3000倍或更多、约4000倍或更多、约5000倍或更多或约10000倍或更多。
实施方案364.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的空LNP。
实施方案365.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液。
实施方案366.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的负载LNP。
实施方案367.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的负载LNP溶液。
实施方案368.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述实施方案中任一项所述的LNP配制物。
实施方案369.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中经肠胃外执行所述施用。
实施方案370.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中经肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行所述施用。
实施方案371.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，所述空LNP用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案372.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案373.如前述实施方案中任一项所述的负载LNP，所述负载LNP用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案374.如前述实施方案中任一项所述的负载LNP溶液，所述负载LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案375.如前述实施方案中任一项所述的LNP配制物，所述LNP配制物用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案376.前述实施方案中任一项所述的空LNP在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
实施方案377.前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
实施方案378.前述实施方案中任一项所述的负载LNP在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
实施方案379.前述实施方案中任一项所述的负载LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
实施方案380.一种药盒，所述药盒包含前述实施方案中任一项所述的空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物。
实施方案381.一种药盒，所述药盒包含前述实施方案中任一项所述的空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物。
实施方案382.一种药盒，所述药盒包含前述实施方案中任一项所述的空LNP或空LNP溶液。
实施方案383.一种药盒，所述药盒包含前述实施方案中任一项所述的负载LNP或负载LNP溶液或LNP配制物。
实施方案384.一种药盒，所述药盒包含前述实施方案中任一项所述的LNP配制物。
实施方案385.一种药盒，所述药盒包含含有前述实施方案中任一项所述的负载LNP的药剂。
实施方案386.一种药盒，所述药盒包含药剂，所述药剂包含含有前述实施方案中任一项所述的脂质纳米粒子(LNP)的制剂。
实施方案387.一种药盒，所述药盒包含前述实施方案中任一项所述的空LNP的群体。
实施方案388.一种药盒，所述药盒包含前述实施方案中任一项所述的空LNP的群体和治疗剂或预防剂溶液。
实施方案389.一种药盒，所述药盒包括
(a)第一容器，所述第一容器包含前述实施方案中任一项所述的空LNP；和
(b)第二容器，所述第二容器包含含有治疗剂或预防剂的溶液。
实施方案390.一种药盒，所述药盒包括
(a)第一容器，所述第一容器包含前述实施方案中任一项所述的空LNP；
(b)第二容器，所述第二容器包含含有治疗剂或预防剂的溶液；和
(c)用于使所述第一容器和所述第二容器的内容物组合的说明。
实施方案391.如前述实施方案中任一项所述的药盒，其中所述第一容器为聚四氟乙烯(PTFE)袋。
实施方案392.如前述实施方案中任一项所述的药盒，其中所述第二容器为聚四氟乙烯(PTFE)袋。
实施方案393.一种容器，所述容器包含含有前述实施方案中任一项所述的负载LNP的药剂。
实施方案394.一种容器，所述容器包含药剂，所述药剂包含含有前述实施方案中任一项所述的脂质纳米粒子(LNP)的制剂。
实施方案395.一种容器，所述容器包含前述实施方案中任一项所述的空LNP。
实施方案396.一种容器，所述容器包含前述实施方案中任一项所述的空LNP的群体。
实施方案397.如前述实施方案中任一项所述的容器，其中所述容器为聚四氟乙烯(PTFE)袋。
实施方案398.如前述实施方案中任一项所述的药盒，其中所述治疗剂或预防剂为核酸。
实施方案399.如前述实施方案中任一项所述的药盒，其中所述核酸为核糖核酸。
实施方案400.如前述实施方案中任一项所述的药盒，其中所述核糖核酸为选自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)组成的组的至少一种核糖核酸。
实施方案401.如前述实施方案中任一项所述的药盒，其中所述核酸为信使RNA(mRNA)。

Claims (147)

1.一种制备包含空脂质纳米粒子(空LNP)的空脂质纳米粒子溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
(i)混合步骤，所述混合步骤包括使包含可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的所述空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的所述PEG脂质，
其中所述空LNP溶液包含乙酸盐缓冲液并且具有在约4.6至约6.0范围内的pH。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括处理所述空LNP溶液。
3.一种制备包含负载脂质纳米粒子(负载LNP)的负载脂质纳米粒子溶液(负载LNP溶液)的方法，所述方法包括：
(i)混合步骤，所述混合步骤包括使包含可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含所述空LNP的所述空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的所述PEG脂质，其中所述空LNP溶液包含乙酸盐缓冲液并且具有在约4.6至约6.0范围内的pH；以及
(ii)装载步骤，所述装载步骤包括使包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含负载LNP的负载LNP溶液。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括处理所述负载LNP溶液，由此形成脂质纳米粒子配制物(LNP配制物)。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述负载LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，所述第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述负载LNP中。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤包括将包含所述PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至所述负载LNP溶液中。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.5mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质或约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质添加至所述空LNP或所述负载LNP中。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液的步骤还包括pH调节。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pH调节包括添加第二缓冲剂。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲剂包括第二水性缓冲溶液。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液的步骤还包括过滤。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过切向流过滤执行所述过滤。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述负载LNP溶液的步骤还包括缓冲液交换。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述缓冲液交换包括添加包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三缓冲剂包括第三水性缓冲溶液。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲溶液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲溶液具有在约6.5至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6范围内的pH。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲溶液具有约7.5的pH。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之前执行所述第一添加步骤。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之后执行所述第一添加步骤。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述负载LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，所述第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述负载LNP中。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之前执行所述第二添加步骤。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述缓冲液交换之后执行所述第二添加步骤。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液的步骤还包括稀释所述空LNP溶液。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冷冻所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括冻干所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或负载LNP溶液的步骤还包括储存所述空LNP溶液或负载LNP溶液。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述混合步骤。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用T形接头、受限冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行所述装载步骤。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液具有在约4.5至约6.5、约4.6至约6.0、约4.7至约5.75、约4.8至约5.5或约4.9至约5.25范围内的pH。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液具有约5.0的pH。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液具有在约4.8至约5.8、约5.0至约5.75或约5.0至约5.5范围内的pH。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液具有在约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5范围内的pH。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液、所述空LNP溶液和所述LNP配制物的pH在约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5范围内。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述负载LNP溶液具有在约4.5至约6.0、约4.6至约5.8、约4.8至约5.6、约5.0至约5.5或约5.1至约5.4范围内的pH。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液还包含第一有机溶剂。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含第一有机溶剂。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一有机溶剂为醇。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一有机溶剂为乙醇。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一缓冲剂包括第一水性缓冲溶液。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含大于约1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约2mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约15mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，大于约25mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或大于约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含约1mM至约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约2mM至约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约3mM至约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，约4mM至约8mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris，或约5mM至约6mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲溶液包含约5mM乙酸盐，其中所述水性缓冲溶液具有约5.0的pH。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含张力剂。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述张力剂为糖。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖为蔗糖。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液包含约0.01g/mL至约1.0g/mL、约0.05g/mL至约0.5g/mL、约0.1g/mL至约0.4g/mL、约0.15g/mL至约0.3g/mL或约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.2g/mL至约0.25g/mL张力剂。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或负载LNP溶液还包含约0.2g/mL蔗糖。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约0.01至约1.0mg/mL的所述核酸、约0.05至约0.5mg/mL的所述核酸或约0.1至约0.25mg/mL的所述核酸。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含选自由乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液组成的组的缓冲液。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含乙酸盐缓冲液。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约1mM至约200mM乙酸盐缓冲液、约2mM至约180mM乙酸盐缓冲液、约3mM至约160mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约150mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约140mM乙酸盐缓冲液、约5mM至约130mM乙酸盐缓冲液、约6mM至约120mM乙酸盐缓冲液、约7mM至约110mM乙酸盐缓冲液、约8mM至约100mM乙酸盐缓冲液、约9mM至约90mM乙酸盐缓冲液、约10mM至约80mM乙酸盐缓冲液、约15mM至约70mM乙酸盐缓冲液、约20mM至约60mM乙酸盐缓冲液、约25mM至约50mM乙酸盐缓冲液或约30mM至约40mM乙酸盐缓冲液。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述装载步骤期间将所述核酸溶液和所述空LNP溶液以约5∶1至约7∶1、约4∶1至约6∶1、约3∶1至约5∶1或约2∶1至约4∶1的体积流量比率混合。
58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述负载LNP溶液包含乙酸盐缓冲液。
59.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液、所述空LNP、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物还包含囊封剂。
60.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液、所述空LNP溶液、所述负载LNP、所述负载LNP溶液和/或所述LNP配制物还包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或它们的任何组合。
61.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP包含
约30mol％-60mol％可离子化脂质；
约0mol％-30mol％磷脂；
约15mol％-50mol％结构脂质；和
约0.1mol％-0.5mol％PEG脂质。
62.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质选自由经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油和经PEG修饰的二烷基甘油组成的组。
63.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结构脂质选自由胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和它们的衍生物组成的组。
64.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磷脂选自由1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2--二-肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2--二-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂和它们的衍生物组成的组。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质包含可离子化氨基脂质。
66.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸为核糖核酸。
67.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸为选自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)组成的组的至少一种核糖核酸。
68.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸为信使RNA(mRNA)。
69.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA包括选自由茎环、链终止核苷、polyA序列、多聚腺苷酸化信号和5’帽结构组成的组的至少一个基序。
70.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA的长度为至少30个核苷酸。
71.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA的长度为至少300个核苷酸。
72.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N∶P比率为约1.1∶1至约30.1。
73.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N∶P比率为约2∶1至约20∶1。
74.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N∶P比率为约2∶1至约10∶1或约2∶1至约5∶1。
75.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物包含约0.01至约500mg/mL的所述核酸、约0.1至约100mg/mL、约0.25至约50mg/mL、约0.5至约10mg/mL或约1.0至约10mg/mL的所述核酸。
76.一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
77.一种空LNP，所述空LNP通过前述权利要求中任一项所述的方法制备。
78.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液通过前述权利要求中任一项所述的方法制备。
79.一种包含空LNP的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
80.一种负载LNP，所述负载LNP通过前述权利要求中任一项所述的方法制备。
81.一种负载LNP溶液，所述负载LNP溶液通过前述权利要求中任一项所述的方法制备。
82.一种LNP配制物，所述LNP配制物通过前述权利要求中任一项所述的方法制备。
83.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述权利要求中任一项所述的负载LNP。
84.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述权利要求中任一项所述的负载LNP溶液。
85.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述权利要求中任一项所述的LNP配制物。
86.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中经肠胃外执行所述施用。
87.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中经肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行所述施用。
88.如前述权利要求中任一项所述的负载LNP，所述负载LNP用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
89.如前述权利要求中任一项所述的负载LNP溶液，所述负载LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
90.如前述权利要求中任一项所述的LNP配制物，所述LNP配制物用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
91.前述权利要求中任一项所述的负载LNP在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
92.前述权利要求中任一项所述的负载LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
93.前述权利要求中任一项所述的LNP配制物在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
94.一种药盒，所述药盒包含权利要求77-83中任一项所述的空LNP、空LNP溶液、负载LNP、负载LNP溶液或LNP配制物。
95.一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约1.25mol％的PEG脂质。
96.一种空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG脂质。
97.如前述权利要求中任一项所述的空LNP，所述空LNP还包含可离子化脂质。
98.如前述权利要求中任一项所述的空LNP，所述空LNP还包含磷脂和结构脂质。
99.一种空LNP，所述空LNP包含约30mol％-60mol％可离子化脂质；约0mol％-30mol％磷脂；约15mol％-50mol％结构脂质；和约0.1mol％-10mol％PEG脂质。
100.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含前述权利要求中任一项所述的空LNP。
101.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液还包含乙酸盐缓冲液。
102.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液还包含张力剂。
103.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述张力剂为蔗糖。
104.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质的空LNP；和
(ii)乙酸盐缓冲液。
105.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质的空LNP；
(ii)乙酸盐缓冲液；和
(iii)蔗糖。
106.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质的空LNP；和
(ii)乙酸盐缓冲液。
107.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(i)包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质的空LNP；
(ii)乙酸盐缓冲液；和
(iii)蔗糖。
108.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液具有约4.5至约6.25、约4.6至约6.0、约4.8至约5.8、约5.0至约5.75或约5.0至约5.5的pH值。
109.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约5mM乙酸盐缓冲液，其中所述乙酸盐缓冲液具有约5.0的pH。
110.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约0.2g/mL蔗糖。
111.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约30mol％至约60mol％的所述可离子化脂质、约0mol％至约30mol％的所述磷脂、约15mol％至约50mol％的所述结构脂质和约0.1mol％至约0.5mol％的所述PEG脂质。
112.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约40mol％至约60mol％的所述可离子化脂质、约5mol％至约20mol％的所述磷脂、约30mol％至约50mol％的所述结构脂质和约0.1mol％至约1.25mol％的所述PEG脂质。
113.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述PEG脂质以约0.2mol％至约0.7mol％的浓度存在。
114.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述PEG脂质以约0.5mol％的浓度存在。
115.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
116.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约30mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
117.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约20mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
118.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约2mM至约10mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
119.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液包含具有约5mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
120.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述缓冲液具有比所述可离子化脂质的pKa小至少1个单位的pH。
121.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述缓冲液具有小于5.5的pH。
122.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述缓冲液具有约5.0的pH。
123.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液具有比所述可离子化脂质的pKa小至少1个单位的pH。
124.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液具有小于5.5的pH。
125.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP溶液具有约5.0的pH。
126.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述LNP包含约45mol％至约50mol％可离子化脂质。
127.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述可离子化脂质为
Figure FDA0003871696570000151
或其盐。
128.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述可离子化脂质为
Figure FDA0003871696570000152
或其盐。
129.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述PEG脂质为PEG2k-DMG。
130.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述结构脂质为胆固醇。
131.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液，其中所述磷脂为1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
132.一种包含脂质纳米粒子(LNP)的制剂，其中：
(a)所述LNP包含
约40mol％至约50mol％可离子化脂质，
约30mol％至约50mol％结构脂质，
约5mol％至约20mol％磷脂，和
约0.1mol％至约1.25mol％PEG脂质；
(b)所述LNP基本上不含治疗剂或预防剂；并且
(c)所述制剂包含具有约2mM至约40mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
133.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述PEG脂质以约0.2mol％至约0.7mol％的浓度存在。
134.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述PEG脂质以约0.5mol％的浓度存在。
135.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约2mM至约30mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
136.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约2mM至约20mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
137.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约2mM至约10mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
138.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含具有约5mM的浓度的乙酸盐缓冲液。
139.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲液具有比所述可离子化脂质的pKa小至少1个单位的pH。
140.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲液具有小于5.5的pH。
141.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述缓冲液具有约5.0的pH。
142.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述LNP包含约45mol％至约50mol％可离子化脂质。
143.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述可离子化脂质为
Figure FDA0003871696570000171
或其盐。
144.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述可离子化脂质为
Figure FDA0003871696570000172
或其盐。
145.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述PEG脂质为PEG2k-DMG。
146.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述结构脂质为胆固醇。
147.如前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述磷脂为1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
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