JP2016504050A - 細胞表現型の改変のためのシグナルセンサーポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年1月17日出願の米国仮特許出願第61,753,661号、表題「Signal−Sensor Polynucleotides for the Alternation of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年1月18日出願の米国仮特許出願第61/754,159号、表題「Signal−Sensor Polynucleotidesfor the Alternation of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、 2013年3月14日出願の米国仮特許出願第61/781,097号、表題「Signal−Sensor Polynucleotidesfor the Alternation of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、 2013年5月31日出願の米国仮特許出願第61/829,334号、表題「Signal−Sensor Polynucleotidesfor the Alternation of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年6月27日出願の米国仮特許出願第61/839,893号、 表題「Signal−Sensor Polynucleotidesfor the Alternation of Cellular Phenotypes and Microenvironments」、2013年7月3日出願の米国仮特許出願第61/842,733号、表題「Signal−Sensor Polynucleotidesfor the Alternation of Cellular
Phenotypes and Microenvironments」、および2013年7月23日出願の米国仮特許出願第61/857,304号、表題「Signal−Sensor Polynucleotidesfor the Alternation of Cellular Phenotypes and Microenvironments」に対する優先権を主張し、各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、配列表とともに電子書式で出願されている。M37PCT.txtと題される配列表ファイルは、2013年9月30日に作成され、9,748,473バイトの大きさである。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、細胞表現型および微小環境の改変のための、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびmRNA分子の設計、調製、製造、および/または製剤化のための組成物、方法、プロセス、キット、ならびにデバイスに関する。
の操作のための遺伝子療法は、疾患診断、治療および管理をさらに標的にしたアプローチを提供する。
of Antibodies」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Modified Polynucleotides for
the Production of Antibodies」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,134号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,135号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Protein
s」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of
Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucleotides for the Production
of Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,935号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日
出願の米国仮特許出願第61/681,687号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified
Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,720号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国特許仮出願第61/737,213号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願の米国特許仮出願第61/681,742号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030062号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」、2013年3月9日出願の米国特許出願第13/791,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030063号、表
題「Modified Polynucleotides」、 国際出願第PCT/US2013/030064号、表題「Modified Polynucleotides
for the Production of Secreted Proteins」、2013年3月9日出願の米国特許出願第13/791,921号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030059号、表題「Modified Polynucleo
tides for the Production of Membrane Proteins」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030066号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030067号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030060号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030061号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2013年3月9日出願の米国特許出願第13/791,910号、表題「Modified Polynucleotides for
the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US第2013/030068号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」、および、2013年3月9日出願の国際出願第PCT/US2013/030070号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」、2013年3月15日出願の国際特許出願第PCT/US2013/031821号、表題「In Vivo Production of Proteins」に開示されており、各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
クレオチドは、化学的に修飾されたmRNA(mmRNA)分子であり得る。
」「TGA」および「TAG」からなる群から選択される。別の態様では、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、3つの終止コドンを含む。
がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる二次発癌が挙げられるが、これらに限定されない。
および筋肉内であり得る。別の態様では、投与は、限定はしないが、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、スプレー、溶液などを用いて局所的であり得る。
と呼ばれ、ポリヌクレオチド治療薬(例えば、mRNA)の層別化、プロファイリングおよび/または個別化に特に役立し、特定の細胞型、疾患または細胞の微小環境または生物学的プロファイルに合わせて調節される、新しいクラスのポリヌクレオチド治療薬によってコードされる。
イリングといった、複数のクラスにわたって実施され得る。
リヌクレオチドの異なる領域に位置し得る。非制限的な例として第1のセンサー領域は第1の隣接領域に位置し、第2のセンサー領域は第2の隣接領域に位置する。センサー領域は、同一のセンサー配列または異なるセンサー配列を含み得る。
全体が本明細書に組み込まれる)。
al.,Science、2013、340、82−85、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。センサーシグナルポリヌクレオチドはさらに、マイクロRNA媒介性遺伝子制御を強化するためにこの構造化した5’UTRを含むように修飾され得る。
A部位は、完全なマイクロRNA部位、マイクロRNA種配列および/または種配列を有さないマイクロRNA結合部位であり得る。
本発明は、1個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする核酸分子、具体的には、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを提供する。具体的には、本発明はがんまたはがんに関連した疾患、障害に有用なシグナルセンサーポリヌクレオチドを企図する。本明細書で使用されるとき、「シグナルセンサーポリヌクレオチド」は、翻訳された時に細胞(がん細胞または非がん細胞)に「シグナル」を送り、がん細胞に有害または正常な細胞に有益であるか、がん細胞に有害かつ正常な細胞に有利であるかのいずれかである治療効果を生物体にもたらす、1つ以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする核酸転写物のことである。シグナルセンサーポリヌクレオチドはさらに、ポリヌクレオチドの微小環境を「感知」し、(a)翻訳されるペプチドまたはタンパクに関連する機能または表現型の結果、(b)シグナルセンサーポリヌクレオチドの発現量、および/または、双方を改変する配列(翻訳可能または不可能)を含んでいてもよい。
オチドには、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA、β−D−リボ配置を有するLNA、α−L−リボ配置を有するα−LNA(LNAのジアステレオマー)、2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−LNA、および2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−α−LNAを含む)、またはこれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および/または構造的設計特徴において野生型mRNAと区別される。
学関連ポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。目的とする腫瘍学関連ポリペプチドは、その5’末端に、シグナルペプチド配列領域103によってコードされた1つ以上のペプチドシグナル配列を含み得る。隣接領域104は、1つ以上の完全または不完全な5’UTR配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域104は、5’末端キャップ108も含み得る。第2の隣接領域106は、1つ以上の完全または不完全な3’UTRを含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域106は、3’尾部配列110および3’UTR120も含み得る。
,000を含む)まで、またはそれらを超える)。本明細書で使用するとき、「第1の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第1の領域」と称され得る。
開始コドンおよび/または終止コドンに加えて、1つ以上のシグナルおよび/または制限配列を含み得る。
本発明に従って、シグナルセンサー一次構築物またはmmRNAは、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリA結合タンパク質と5’末端結合タンパク質との間の相互作用を補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも3つの異なる経路、すなわち1)化学的経路、2)酵素的経路、および3)リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された5’/3’連結は、分子内または分子間であり得る。
本発明に従って、複数のはっきりと異なるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、3’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて3’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、HepG2細胞に1:1の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種に3’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種にC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ(New England Biolabs、Ipswich,MA)を用いて転写後に添加される。3’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら2個のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載の
クリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。
腫瘍学関連タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド一次構築物またはmmRNAは、他のポリヌクレオチド、腫瘍学関連ポリペプチド、染料、挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。
本発明の一実施形態は、二機能性シグナルセンサーポリヌクレオチド(例えば、二機能性一次構築物または二機能性mmRNA)である。その名称が示すように、二機能性シグナルセンサーポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有するか、または少なくとも2つの機能の能力があるシグナルセンサーポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有するシグナルセンサーポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。そのような非コード領域は、シグナルセンサー一次構築物の「第1の領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第1の領域以外の領域であり得る。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移RNA(tRNA)等の1つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの1つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における1つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。シグナルセンサーポリヌクレオチドおよび/または一次構築物は、1個以上の長い非コードRNA(lncRNAもしくはlincRNA)もしくはその部分、低分子核RNA(sno−RNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、またはPiwi干渉RNA(piRNA)を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、栄養要求性であり得る。本明細書で使用されるとき、「栄養要求性」という表現は、腫瘍学関連タンパク質発現が実質的に阻止されるまたは低下するように、空間的または時間的な合図に応答して自身の分解または不活性化を引き起こす、助長するまたは誘導する少なくとも1つの特長を含むシグナルセンサーポリヌクレオチドを指す。そのような空間的または時間的な合図としては、特定の組織もしくは器官または細胞環境といった、翻訳されるシグナルセンサーポリヌクレオチドの位置が挙げられる。温度、pH、イオン強度、含水量などに関わる合図もさらに企図される。
オチドの下方制御があるだろう(例えば実施例19に記載される実験を参照)。別の非制限的な例として、少なくとも1つのmiR−122結合部位、種配列を有さないmiR−122結合部位またはmiR−122結合部位をコードし、有するシグナルセンサーポリヌクレオチドを投与する前に、miR−122の量を、HeLa細胞、初代培養ヒト肝細胞および初代培養ラット肝細胞で測定し得る。投与後、シグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を測定して、シグナルセンサーポリヌクレオチドのmiR−122の弱化効果を決定し得る(例えば、実施例41、42、43、57、58および59で説明される実験を参照)。さらに別の非制限的な例として、異なる3’UTRのmiR−122結合部位、miR−122種または種を有さないmiR−122結合部位の効果を、限定はしないが、一番高い弱化効果といった所望する結果のための適切なUTRを決定するために評価し得る(例えば、実施例46に記載される研究を参照)。
本発明に従って、シグナルセンサー一次構築物は、1個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とする腫瘍学関連ポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、1個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とする腫瘍学関連ポリペプチド」という用語は、選択されて本発明のシグナルセンサー一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基(天然または非天然)のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約50個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体、三量体、も
しくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、1個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
得るか、または固体支持体に結合され得る。
は、それが由来するドメインとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分(ドメインのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、3個のアミノ酸または4個のアミノ酸(7/2=3.5+/−0.5で3または4になる)の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない(すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る)ことも理解される。
たは100を超えるアミノ酸長の参照腫瘍学関連タンパク質の任意のタンパク質断片(少なくとも1個のアミノ酸残基が参照腫瘍学関連ポリペプチド配列よりも短いが、他の点では同一である腫瘍学関連ポリペプチド配列を意味する)が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、または約100%同一の一続きの約20、約30、約40、約50、または約100個のアミノ酸を含む任意の腫瘍学関連タンパク質が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の変異を含む。
本発明のシグナルセンサー一次構築物またはmmRNAは、腫瘍学関連ペプチドおよびタンパク質といった、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードするように設計され得る。
Heinje,G.,Academic Press,1987、Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991、およびCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
0%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。そのようなアライメントのツールは、BLASTプログラム一式を含む(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Scha
ffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein databese search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
本明細書で開示されるシグナルセンサー一次構築物またはmmRNAは、1個以上の有効な、または「試験用の」腫瘍学関連タンパク質または腫瘍学関連ペプチドをコードし得る。
前がん細胞および/もしくは他の細胞における、細胞周期、DNA損傷応答(例えば、DNA損傷修復)、アポトーシス、血管新生、細胞運動性、上皮細胞の上皮間葉転換、ホスファチジルイノシトール3(PI3)キナーゼ/Akt細胞性シグナル伝達経路、テロメラーゼ活性および/もしくは発現、腫瘍転移、腫瘍形成、カテプシン、細胞老化、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達、代謝および薬物代謝、Gタンパク質シグナル伝達、成長因子および受容体、熱ショックタンパク質、ヒストンデアセチラーゼ、ホルモン受容体、低酸素、ポリADPリボースポリメラーゼ、プロテインキナーゼ、RASシグナル伝達、トピソメラーゼ、転写因子ならびに腫瘍抑制活性が挙げられるが、これらに限定されない。
遺伝子の非翻訳領域(UTR)は、転写されるが、翻訳されない。5’UTRが転写開始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、3’UTRは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてUTRが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。UTRの制御特徴は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方制御を確保することができる。非翻訳領域は、mRNAを生産し得、および/または、細胞、組織および/または生物体に送達されて、目的とするポリペプチドを生産し得るベクター系に組み込まれ得る。
Using RNA Constructs」、2013年7月3日出願の米国仮特許出願第61/842,709号、表題「Differential Targeting
Using RNA Constructs」、2013年7月23日出願の米国仮特許出願第61/857,436号、表題「Differential Targeting Using RNA Constructs」に記載されており、当該仮特許出願の
各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの末端修飾には、5’キャップ、末端領域におけるマイクロRNA結合部位、鎖終止ヌクレオシド、末端領域における翻訳エンハンサー要素ならびにポリAーGカルテットおよびステムループ配列を含む尾部配列が含まれるが、これらに限定されない。
天然5’UTRは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGGを有し、式中、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、この後に別の「G」が続く。5’UTRは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。例えば、二次5’−UTR構造の1つにeIF4A2伸長因子結合のための構造化したIRESがあり、これは、3’UTRにおけるマイクロRNA媒介性遺伝子抑制に必要である。
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および/またはmmRNAの5’UTRには、少なくとも1つの翻訳上エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサー要素、翻訳上エンハンサー要素(複数)(集合的に「TEE」(複数可)と呼ぶ)が含まれ得る。非制限的な例として、TEEは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。5’UTRに少なくとも1つのTEEを有するシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および/またはmmRNAは、5’UTRにキャップを含み得る。さらに、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳を行うシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および/またはmmRNA
の5’UTRに、少なくとも1つのTEEが位置し得る。
Acids Research、2013、1−10;参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)によって以前に示されている。
国特許第US6310197号、米国特許第US6849405号、米国特許第US7456273号、米国特許第US7183395号、米国特許第US20090226470号、米国特許第US20070048776号、米国特許第US20110124100号、米国特許第US20090093049号、米国特許第US20130177581号、国際公開第WO2009075886号、国際公開第WO2007025008号、国際公開第WO2012009644号、国際公開第WO2001055371号、国際公開第WO1999024595号、ならびに欧州特許第EP2610341A1号および欧州特許第2610340A1号を参照;各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる)で開示される特定のTEEまたはそれらの変異形、相似体まもしくは機能的誘導体を1つ以上含むポリヌクレオチドである。特定のTEEの1または複数の複写物がシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および/またはmmRNAに存在し得る。翻訳上エンハンサーポリヌクレオチドのTEEは、1つ以上の配列セグメントで組織化され得る。配列セグメントは、本明細書で例として挙げられる特定のTEEを1つ以上保有し得、各TEEは1つ以上の複写物で存在する。複数の配列セグメントが翻訳上エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、同種または異種であり得る。したがって、翻訳上エンハンサーポリヌクレオチドの複数の配列セグメントは、同一もしくは異なる種類の本明細書で例示される特定のTEE、特定のTEEそれぞれの同一もしくは異なる数の複写物、および/または、各配列セグメント内にTEEの同一もしくは異なる組織を保有し得る。
とも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも55個または60個超のTEE配列を含み得る。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、修飾核酸および/またはmmRNAの5’UTRにおけるTEE配列は、同一または異なるTEE配列であり得る。TEE配列は、ABABABもしくはAABBAABBAABBもしくはABCABCABCまたは1回、2回または4回以上繰り返したその変異形といったパターンであり得る。これらのパターンでは、各文字A、BまたはCは、ヌクレオチドレベルで異なるTEE配列を表す。
照により本明細書に組み込まれる米国特許第7456273号および米国特許第7183395号、米国特許第20090093049号ならびに国際公開第WO2001055371号に記載されるオリゴヌクレオチドまたはその部分である。
switch in p27−3’UTR controls miR−221 and miR−22 accessibility.Nature Cell Biology.2010を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
RNA結合タンパク質(RBP)は、同時転写および転写後遺伝子発現の数多くの側面を制御し得、例えば、RNAスプライシング、局在化、翻訳、ターンオーバー、ポリアデニル化、キャッピング、修飾、搬出および局在化が挙げられるが、これらに限定されない。限定はしないが、RNA認識モチーフ(RR)およびhnRNP K−相同(KH)ドメインといったRNA結合ドメイン(RBD)は通常、RBPとそのRNA標的との間の配列の関連性を制御する(Ray et al.,Nature 2013.499:172−177;参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。一実施形態において、標準のRBDは短いRNA配列と結合し得る。別の実施形態では、標準RBDは構造RNAを認識できる。
ス由来である必要すらない。
3’UTRは、それらに包理される一続きのアデノシン(Adenosine)およびウリジン(Uridine)を有することで知られている。これらのAU豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、AU豊富な要素(ARE)は、3つのクラスに分類され得る(Chen et al.,1995):クラスIのAREは、U豊富な領域内にAUUUAモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2個以上の重複したUUAUUUA(U/A)(U/A)九量体を有する。この種のAREを含有する分子は、GM−CSFおよびTNF
−aを含む。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのU豊富な領域は、AUUUAモチーフを含有しない。C−Junおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の2つである。AREに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ELAVファミリーのメンバー、中でも注目すべきHuRがmRNAの安定性を向上させることが実証されている。HuRは、これら3つのクラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を操作して核酸分子の3’UTRに入れることで、HuR結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。
一実施形態において、本発明のシグナル配列ポリヌクレオチドは、シグナル配列ポリヌクレオチドの3’末端上に三重鎖を含み得る。本発明の核酸の3’末端には、三重鎖が、単独またはポリA尾部と組み合わせて含まれ得る。
一実施形態において、本発明の核酸は、限定はしないが、ヒストンステムループといった、ステムループを含み得る。ステムループは、長さが約25個または約26個のヌクレオチドであるヌクレオチド配列であり得、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2013103659号に記載される配列番号7〜17が挙げられるが、これらに限定されない。ヒストンステムループは、コード領域に関して3’(例えば、コード領域の3’末端)に位置し得る。非制限的な例として、ステムループは本明細書に記載される核酸の3’末端に位置し得る。
mRNAの5’キャップ構造は、核外輸送に関与し、mRNAの安定性を向上させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合し、これは、CBPのポリ(A)結合タンパク質との会合を介して細胞におけるmRNA安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状mRNA種を形成する。このキャップはさらに、mRNAスプライシング中に5’近位のイントロンの除去を支援する。
5’エンドヌクレアーゼに対する感受性、および/または低下した5’デキャッピングを有するものがある。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え2’−O−メチルトランスフェラーゼ酵素は、mRNAの5’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に基準の5’−5’−トリホスフェート結合を生成し得、キャップグアニンは、N7メチル化を含有、mRNAの5’末端ヌクレオチドは、2’−O−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ1構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の5’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定性、ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(キャップ0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(キャップ1)、および7mG(5’)−ppp(5’)NlmpN2mp(キャップ2)が含まれる。
限定はしないが大麦縞萎縮ウイルス(BYDV−PAV)の翻訳エンハンサー配列といったウイルス配列は、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの3’UTRに操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。形質移入実験を関連細胞株において行うことができ、ELISAによってタンパク質産生を形質移入後12時間、24時間、48時間、72時間、および7日時点でアッセイすることができる。
さらに、内部リボソーム進入部位(IRES)を含有し得るシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスRNAと特定されたIRESは、5’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始するときに重要な役割を果たす。IRESは、mRNAの唯一のリボソーム結合部位として働き得るか、または複数のリボソーム結合部位のうちの1つの役割を果たし得る。2個以上の機能的リボソーム結合部位を含有するシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、リボソーム(「多シストロン性核酸分子」)によって独立して翻訳されるいくつかの腫瘍学関連ペプチドまたは腫瘍学関連ポリペプチドをコードし得る。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにIRESが提供されるとき、第2の翻訳可能な領域がさらに任意に提供される。本発明に従って用いられ得るIRES配列の例には、制限なく、ピコルナウイルス(例えば、FMDV)、ペストウイルス(CFFV)、ポリオウイルス(PV)、脳心筋炎ウイルス(ECMV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、豚コレラウイルス(CSFV)、マウス白血病ウイルス(MLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、またはコオロギ麻痺ウイルス(CrPV)由来のものが挙げられる。
RNA処理中、長いアデニンヌクレオチド鎖(ポリA尾部)が、安定性を向上させるためにmRNA分子といったのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後、転写物の3’末端が切断されて3’ヒドロキシルを遊離させ得る。その後、ポリAポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは100〜250残基長であり得るポリA尾部を付加する。
得る。
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の体液由来のエクソソームにおいて定量化され得る。本明細書で使用するとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、および臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
本発明に従って用いるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、化学合成、一般にインビトロ転写(IVT)と称される酵素合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含むが、これらに限定されない任意の利用可能な技法に従って調製され得る。RNAを合成する方法は、当技術分野において既知である(例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Gait,M.J.(ed.)Oligoヌクレオチドynthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,DC:IRL Press,1984、およびHerdewijn,P.(ed.)Oligoヌクレオチドynthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005を参照のこと)。
Aは、精製および浄化プロセスを経り得る。これらのステップは、以下でより詳細に提供される。
遺伝子構築ステップは、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化および浄化、ならびにcDNA鋳型合成および浄化を含み得るが、これらに限定されない。
目的とする腫瘍学関連ポリペプチドまたは標的が産生のために選択された時点で、シグナルセンサー一次構築物が設計される。一次構築物内で、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域は、選択された核酸(DNAまたはRNA)転写物のオープンリーディングフレーム(ORF)を用いて構築され得る。ORFは、野生型ORF、アイソフォーム、変異形、またはその断片を含み得る。本明細書で使用するとき、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードすることができる核酸配列(DNAまたはRNA)を指すよう意図される。ORFは、多くの場合、開始コドンATGで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わる。
表1.コドン選択肢
表2.5’非翻訳領域
表3.3’非翻訳領域
る。本明細書で使用するとき、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味において、少なくとも1つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する2個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの群を指すために用いられる。
一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物は、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、TGA、TAA、およびTAGから選択され得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサー一次構築物は、終止コドンTGAおよびもう1つの終止コドンを含む。さらなる実施形態において、もう1つの終止コドンは、TAAであり得る。
シグナルセンサー一次構築物を含有するベクターは、その後、増幅され、Invitrogen PURELINK(商標)HiPure Maxiprepキット(Carlsbad,CA)を用いたマキシプレップ等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いてプラスミドが単離および精製される。
プラスミドは、その後、制限酵素および緩衝液の使用等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて線形化され得る。線形化反応物は、例えば、InvitrogenのPURELINK(商標)PCR Microキット(Carlsbad,CA)、ならびに強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法、ならびにInvitrogenの標準PURELINK(商標)PCRキット(Carlsbad,CA)を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、もたらされた線形化反応物の大きさに応じて修正され得る。その後、線形化されたプラスミドを用いて、インビトロ転写(IVT)反応のためのcDNAを生成する。
cDNA鋳型は、線形化されたプラスミドにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を経させることによって合成され得る。表4は、本発明のPCR反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧である。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当技術分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合忠実性および塩基対合強度を高めるように化学的に修飾された塩基も含有し得る。そのような修飾には、5−メチル−シチジン、2、6−ジ−アミノ−プリン、2’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、またはロックド核酸が含まれ得る。
表4.プライマーおよびプローブ
シグナルセンサーポリヌクレオチド産生のプロセスは、インビトロ転写、cDNA鋳型除去およびRNA浄化、ならびにキャッピングおよび/またはテーリング反応を含み得るが、これらに限定されない。
先のステップで産生されたcDNAは、インビトロ転写(IVT)系を用いて転写され得る。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)、RNase阻害剤、およびポリメラーゼを含む。NTPは、自家で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。NTPは、天然および非天然(修飾された)NTPを含む本明細書に記載のNTPから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、および修飾された核酸に組み込まれることができるポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。
任意の数のRNAポリメラーゼまたは変異形が本発明のシグナルセンサー一次構築物の設計において用いられ得る。
は核酸配列を最適化し、かつ/または当技術分野で既知の他の方法を用いることによって得られ得る。非限定的な例として、T7 RNAポリメラーゼ変異形は、Esveltら(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Nature(2011)472(7344):499−503)によって立案された連続指向進化システムを用いて進化させられ得、T7 RNAポリメラーゼのクローンは、93位のリジンがトレオニンで置換された変異(K93T)、I4M、A7T、E63V、V64D、A65E、D66Y、T76N、C125R、S128R、A136T、N165S、G175R、H176L、Y178H、F182L、L196F、G198V、D208Y、E222K、S228A、Q239R、T243N、G259D、M267I、G280C、H300R、D351A、A354S、E356D、L360P、A383V、Y385C、D388Y、S397R、M401T、N410S、K450R、P451T、G452V、E484A、H523L、H524N、G542V、E565K、K577E、K577M、N601S、S684Y、L699I、K713E、N748D、Q754R、E775K、A827V、D851N、またはL864F等であるが、これらに限定されない少なくとも1つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、T7 RNAポリメラーゼ変異形は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20100120024号および同第20070117112号に記載の少なくとも1つの変異をコードし得る。RNAポリメラーゼの変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および/または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。
非限定的な例として、少なくとも1つの置換および/または挿入は、転写開始部位のすぐ下流(+1〜+6等であるが、これらに限定されない)の領域内の少なくとも1個の核酸を置換することによって転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域を変化させることにより、開始速度に影響を及ぼし、見かけ上のヌクレオチドトリホスフェート(NTP)反応一定値を増加させ、かつ初期転写物を硬化させることによる転写複合体からの短い転写物の解離を高め得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Brieba et al.,Biochemistry(2002)41:5144−5149)。少なくとも1個の核酸の修飾、置換、および/または挿入は、核酸配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
cDNA鋳型は、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)での処理等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて除去され得る。RNA浄化は、Beckman Coulter(Danvers,MA)のAGENCOURT(登録商標)CLEANSEQ(登録商標)システム;強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない精製方法も含み得る。
シグナルセンサー一次構築物またはmmRNAは、キャッピングおよび/またはテーリング反応も経り得る。キャッピング反応は、5’キャップをシグナルセンサー一次構築物の5’末端に付加する当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。キャッピングのための方法には、ワクシニアキャッピング酵素(New England Biolabs、Ipswich,MA)の使用が含まれるが、これに限定されない。
シグナルセンサー一次構築物またはmmRNA精製は、mRNAまたはmmRNA浄化、品質保証、および品質管理を含み得るが、これらに限定されない。mRNAまたはmmRNA浄化は、AGENCOURT(登録商標)ビーズ(Beckman Coulter Genomics、Danvers,MA);ポリTビーズ;LNA(商標)オリゴT捕捉プローブ(EXIQON(登録商標)Inc、Vedbaek,Denmark);または強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。「精製されたmRNAまたはシグナルセンサーmmRNA」等の「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、少なくとも1つの混入物質から分離されるものを指す。本明細書で使用するとき、「混入物質」とは、別の物質を不適切、不純、または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたシグナルセンサーポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)は、天然に見られる形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
得るかを決定し、シグナルセンサーmRNAまたはmmRNAの分解が生じていないことを確認するために分析され得る。シグナルセンサーmRNAおよび/またはmmRNAの分解は、アガロースゲル電気泳動;強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法;液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS);キャピラリー電気泳動(CE);ならびにキャピラリーゲル電気泳動(CGE)等であるが、これらに限定されない方法を用いて確認され得る。
シグナルセンサー一次構築物またはmmRNAは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような特徴の1つに、シグナルペプチド配列がある。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、それぞれ、コーディング領域またはコードされたポリペプチドの5’(またはN末端)に組み込まれる、それぞれ、約9〜200ヌクレオチド長(3〜60アミノ酸長)のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、1つ以上の分泌経路を通るコードされた腫瘍学関連ポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
表5.シグナルペプチド
本発明に従って、シグナルセンサー一次構築物は、少なくとも1つの目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの少なくとも1つの第1の領域を含む。本発明の、目的とする腫瘍学関連ポリペプチド、つまり「標的」または腫瘍学関連タンパク質および腫瘍学関連ペプチドが表6、表7および表41に列記される。腫瘍学関連ポリペプチドは、その機能およびがん介入の領域に基づいてクラスに分けられ得る。例えば、(1)アポトーシスまたは生存シグナルの不釣り合いに関連した標的(AS標的)が挙げられ得る。これらは、カスパーゼ依存またはカスパーゼ非依存性標的;(2)複製能力または抗老化(CC/S標的);(3)アシドーシスまたは低酸素症(O2が1%超)の併発を含む代謝性ストレス(M標的);(4)免疫応答(I標的);および(5)DNA損傷/保護(DDR標的)であり得る。
表6.腫瘍学関連標的
表7.家族性がん症候群標的
一実施形態において、本発明の腫瘍学関連ポリペプチドは、少なくとも1個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも1個のタンパク質切断シグナルを含み得る。タンパク質
切断部位は、N末端とC末端の真ん中、N末端と中間点との間、中間点とC末端との間、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないN末端とC末端との間の任意の空間で、N末端、C末端に位置し得る。
表8.タンパク質切断部位配列
マイクロRNA(またはmiRNA)は、核酸分子の3’UTRに結合し、かつ核酸分子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。本発明の修飾核酸(mRNA)、強化した修飾RNAまたはリボ核酸は、1つ以上のマイクロRNA標的配列、マイクロRNA配列またはマイクロRNA種を含み得る。そのような配列は、米国特許公開第US2005/0261218号および米国特許公開第US2005/0059005号に教示されるもの等の任意の既知のマイクロRNAに対応し得、これらの内容は、参照に
よりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。非制限的な実施形態として、ヒトゲノムの、公知のマイクロRNA、その配列および結合部位配列が下記表9に列記される。
6;27(1):91−105を参照されたく、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。マイクロRNA種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロRNA標的配列を操作して、本発明の核酸またはmRNAの3’UTRに入れることによって、分解または翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、問題のマイクロRNAが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。マイクロRNA、マイクロRNA標的領域、およびそれらの発現パターンの特定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bonauer et al.,Curr Drug Targets 2010 11:943−949、Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171−176、Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404−413(2011 Dec 20.doi:10.1038/leu.2011.356)、Bartel Cell 2009 136:215−233、Landgraf et al.,Cell,2007 129:1401−1414、Gentner and Naldini,Tissue Antigens.2012 80:393−403およびこれらの文献内の全引用文献)。
正常および/またはがん細胞(例えばHEP3BまたはSNU449)といった特定の細胞に指向するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは少なくとも1つのmiRNA結合部位を3’UTRに含み得る。非制限的な例として、強いアポトーシスシグナルおよび少なくとも1つのmiR−122a結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも1つのmiR−122a結合部位は3’UTRに位置する。別の非制限的な例として、アポトーシス誘導因子短アイソフォーム(AIFsh)および少なくとも1つのmiR−122a結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも1つのmiR−122a結合部位は3’UTRに位置する。さらに別の非制限的な例として、構成的活性型(C.A.)カスパーゼ6および少なくとも1つのmiR−122a結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも1つのmiR−122a結合部位は3’UTRに位置する。別の非制限的な例として、HSV1−tkおよび少なくとも1つのmiR−122a結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該少なくとも1つのmiR−122a結合部位が3’UTRに位置する。
マクロファージ、単球、Bリンパ球、Tリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などである。免疫細胞特異的マイクロRNAは、免疫原性、自己免疫、感染症に対する免疫応答、炎症、ならびに、遺伝子療法および組織/器官移植後の所望されない免疫応答にも関わる。免疫細胞特異的マイクロRNAはまた、造血細胞(免疫細胞)の発達、増殖、分化およびアポトーシスの多くの側面を制御する。例えば、miR−142およびmiR−146は免疫細胞で排他的に発現され、特に骨髄系樹状細胞で豊富である。miR−142結合部位を本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドの3’−UTRに導入することは、miR−142媒介性mRNA分解を通して、抗原提示細胞での遺伝子発現を選択的に抑制し得、プロフェッショナルなAPC(例えば、樹状細胞)での抗原提示を制限し、それによって、遺伝子送達後の抗原媒介性免疫応答を阻止する(Annoni A et al.,blood,2009,114,5152−5161を参照、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
、miR−26a−2−3p、miR−26a−5p、miR−26b−3p、miR−26b−5p、miR−27a−3p、miR−27a−5p、miR−27b−3p、miR−27b−5p、miR−28−3p、miR−28−5p、miR−2909、miR−29a−3p、miR−29a−5p、miR−29b−1−5p、miR−29b−2−5p、miR−29c−3p、miR−29c−5p、miR−30e−3p、miR−30e−5p、miR−331−5p、miR−339−3p、miR−339−5p、miR−345−3p、miR−345−5p、miR−346、miR−34a−3p、miR−34a−5p、miR−363−3p、miR−363−5p、miR−372、miR−377−3p、miR−377−5p、miR−493−3p、miR−493−5p、miR−542、miR−548b−5p、miR548c−5p、miR−548i、miR−548j、miR−548n、miR−574−3p、miR−598、miR−718、miR−935、miR−99a−3p、miR−99a−5p、miR−99b−3pおよびmiR−99b−5pが挙げられるが、これらに限定されない。下記表11に示されるのは、特定の種類の免疫細胞に濃縮されたマイクロRNAである。さらに、新規のマイクロRNAが、ミクロアレーハイブリダイゼーションおよびミクロトーム分析を通して当該技術分野の免疫細胞で発見された(Jima DD et al.,Blood,2010,116:e118−e127;Vaz C et al.,BMC Genomics,2010,11,288,各内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる).
miR−557, miR−581, miR−939−3p, miR−939−5pが挙げられるが、これらに限定されない。いずれの肝臓特異的マイクロRNA由来のマイクロRNA結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、肝臓におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。肝臓特異的マイクロRNA結合部位は、単独で操作され得、または、肝臓のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞(例えばAPC)マイクロRNA結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
a、miR−133b、miR−149−3p、miR−149−5p、miR−186−3p、miR−186−5p、miR−208a、miR−208b、miR−210、miR−296−3p、miR−320、miR−451a、miR−451b、miR−499a−3p、miR−499a−5p、miR−499b−3p、miR−499b−5p、miR−744−3p、miR−744−5p、miR−92b−3pおよびmiR−92b−5pが挙げられるが、これらに限定されない。いずれの心臓特異的マイクロRNA由来のマイクロRNA結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、心臓におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。心臓特異的マイクロRNA結合部位は、単独で操作され得、または、心臓のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞(例えばAPC)マイクロRNA結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
iR−196a−3p、miR−196a−5p、miR−214−3p、miR−214−5p、miR−216a−3p、miR−216a−5p、miR−30a−3p、miR−33a−3p、miR−33a−5p、miR−375、miR−7−1−3p、miR−7−2−3p、miR−493−3p、miR−493−5pおよびmiR−944が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの膵臓特異的マイクロRNA由来のマイクロRNA結合部位も、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、膵臓におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの制御を調節し得る。膵臓特異的マイクロRNA結合部位は、単独で操作され得、または、膵臓のタンパク質発現に対する免疫応答を阻止するために、免疫細胞(例えばAPC)マイクロRNA結合部位とさらに組み合わせて操作され得る。
6−5p、miR−361−3p、miR−361−5p、miR−421、miR−424−3p、miR−424−5p、miR−513a−5p、miR−92a−1−5p、miR−92a−2−5p、miR−92a−3p、miR−92b−3pおよびmiR−92b−5pが挙げられるが、これらに限定されない。多くの新規マイクロRNAが、ディープ配列決定分析から内皮細胞で発見された(Voellenkle C et
al.,RNA,2012,18,472−484,参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。)いずれかの内皮細胞特異的マイクロRNA由来のマイクロRNA結合部位は、シグナルセンサーポリヌクレオチドに導入、またはシグナルセンサーポリヌクレオチドから除去して、様々な状態で内皮細胞におけるシグナルセンサーポリヌクレオチドの発現を制御し得る。
−5p、miR−664b−3p、miR−664b−5p、miR−766−3p、miR−766−5p、miR−885−3p、miR−885−5p、miR−93−3p、miR−93−5p、miR−941、miR−96−3p、miR−96−5p、miR−99b−3pおよびmiR−99b−5pが挙げられるが、これらに限定されない。多くの予測された新規マイクロRNAがヒト胚性幹細胞でのディープ配列決定によって発見されている(Morin RD et al.,Genome Res,2008,18,610−621;Goff LA et al.,PLoS One,2009,4:e7192;Bar M et al.,Stem cells,2008,26,2496−2505,各内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
表9.Mirおよびmir結合部位
表10.mirs、組織/細胞発現および疾患
lood,2010,116:e118−e127;Vaz C et al.,BMC
Genomics,2010,11,288,各内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。表11では、「HCC」は肝細胞癌を意味し、「ALL」は急性リンパ性白血病を意味し、「CLL」は慢性(chrominc)リンパ性白血病を意味する。
表11.免疫細胞のマイクロRNA
本明細書におけるシグナルセンサーポリヌクレオチド(一次構築物またはmRNA分子等)において、「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、A、G、U、またはCリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する5’末端mRNAキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。ポリペプチドにおいて、「修飾」という用語は、基準の組の20個のアミノ酸と比較した修飾を指す。
mRNA分子)を含み得る。これらのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAについての詳細は、以下に続く。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域、第1の領域の5’末端に位置する第1の隣接領域、および第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域を含む。
本発明は、修飾シグナルセンサーmRNA(mmRNA)分子のビルディングブロック、例えば、修飾リボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチドも含む。例えば、これらのビルディングブロックは、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの調製に有用であり得る。そのようなビルディングブロックは、同時係属出願である、2012年10月3日(M9)に出願された国際出願第PCT/US12/058519号で教示され、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。本明細書に記載の「ヌクレオシド」は、有機塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)またはその誘導体(本明細書において「核酸塩基」とも称される)と組み合わせて糖分子(例えば、ペントースもしくはリボース)またはその誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドと定義される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるヌクレオシドおよびヌクレオチドは通常、主溝面上で化学的に修飾される。非制限的な例となる修飾には、アミノ基、チオール基、アルキル基、ハロ基または本明細書に記載されるいずれかのものが含まれる。修飾ヌクレオチドは、(1個以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるために、例えば、化学的、酵素的、または組換え的に)本明細書に記載の任意の有用な方法によって合成され得る。
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合(例えば、リン酸骨格)において修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」および「ホス
ホジエステル」という表現は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの1個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別の本明細書に記載のヌクレオシド間結合との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)、および炭素(架橋メチレンホスホネート)での置換によっても修飾され得る。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、糖、核酸塩基、および/またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書、または、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる2012年10月3日(M9)に出願された国際出願第PCT/US12/058519号に記載のいずれか1つ以上の修飾を含み得る。
本発明に従って用いるシグナルセンサーポリペプチド、一次構築物、およびmmRNA分子は、本明細書に記載の任意の有用な技法に従って調製され得る。本明細書に開示のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA分子の合成において用いられる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製され得る。典型的なプロセス条件または好ましいプロセス条件(例えば、反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力等)が提供される場合、当業者であれば、さらなるプロセス条件を最適化および開発することができるであろう。最適な反応条件は、用いる特定の反応物または溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、日常的な最適化手順を用いて当業者によって決定され得る。
%〜約100%の修飾ヌクレオチド(全ヌクレオチド含量または1種類以上のヌクレオチド、すなわち、A、G、U、もしくはCのうちのいずれか1つ以上のいずれかと関連したもの)または任意の中間の割合(例えば、1%〜20%、1%〜25%、1%〜50%、1%〜60%、1%〜70%、1%〜80%、1%〜90%、1%〜95%、10%〜20%、10%〜25%、10%〜50%、10%〜60%、10%〜70%、10%〜80%、10%〜90%、10%〜95%、10%〜100%、20%〜25%、20%〜50%、20%〜60%、20%〜70%、20%〜80%、20%〜90%、20%〜95%、20%〜100%、50%〜60%、50%〜70%、50%〜80%、50%〜90%、50%〜95%、50%〜100%、70%〜80%、70%〜90%、70%〜95%、70%〜100%、80%〜90%、80%〜95%、80%〜100%、90%〜95%、90%〜100%、および95%〜100%)を含有し得る。
修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が2012年10月3日(M9)に出願された国際出願第PCT/US12/058519号で提供され、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%)。
製剤化、投与、送達、および投薬
本発明は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの組成物および複合体を提供する。薬学的組成物は、任意に、1つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療上および/または予防上活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および/または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005において見出され得る。
複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ/または販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、薬学的組成物の個別的な量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および/または例えば、そのような投薬量の2分の1もしくは3分の1等の、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、:(1)安定性を増加させ、(2)細胞形質移入を増加させ、(3)(例えば、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのデポー製剤からの)持続放出もしくは遅延放出を可能にし、(4)生体分布を変化させ(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの標的を特定の組織または細胞型に定める)、(5)コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させ、かつ/または(6)コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、1つ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等の伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、制限なく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA(例えば、対象への移植のために)で形質移入された細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組み合わせを含むことができる。さらに、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを、自己組織化核酸ナノ粒子を用いて製剤化し得る。
任意のさらなる成分の相対的な量は、治療されている対象の素性、サイズ、および/または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するであろう。例えば、組成物は、0.1w/w%〜99%の活性成分を含み得る。
リピドイドの合成が詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの送達に特に適している(これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Mahon et al.,Bioconjug Chem.2010 21:1448−1454、Schroeder et al.,J Intern Med.2010 267:9−21、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869、Siegwart et al.,Proc
Natl Acad Sci USA.2011108:12996−3001を参照のこと)。
Biochemistry,401:61(2010)を参照のこと)、C12−200(誘導体および変異形を含む)、およびMD1を含むが、これらに限定されない、異なるリピドイドを有する製剤がインビボ活性について試験され得る。
Acad Sci USA.2010 107:1864−1869およびLiu and Huang,Molecular Therapy.2010 669−670によって開示されている。リピドイド製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに加えて、3つもしくは4つのいずれかまたはそれよりも多い構成成分を含む粒子を含むことができる。例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、98N12−5を含むが、これらに限定されず、42%リピドイド、48%コレステロール、および10%PEG(C14アルキル鎖長)を含有してもよい。別の例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、C12−200を含むが、これらに限定されず、50%リピドイド、10%ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%コレステロール、および1.5%PEG−DMGを含有してもよい。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの薬学的組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および薬学的製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、直径数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性の区画によって分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞(MLV)、直径50nmよりも小さい場合がある小さい単細胞小胞(SUV)、および直径50〜500nmであり得る大きい単層小胞(LUV)等であるが、これらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシス等であるが、これらに限定されない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むが、これらに限定されない。リポソームは、薬学的製剤の送達を改善するために低pHまたは高pHを含有してもよい。
の合成から形成されるもの等のリポソームを含んでもよい(これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Wheeler et al.Gene Therapy.1999 6:271−281、Zhang et al.Gene Therapy.1999 6:1438−1447、Jeffs et al.Pharm Res.2005 22:362−372、Morrissey et al.,Nat
Biotechnol.2005 2:1002−1007、Zimmermann et al.,Nature.2006 441:111−114、Heyes et al.,J Contr Rel.2005 107:276−287、Semple et al.,Nature Biotech.2010 28:172−176、Judge et al.,J Clin Invest.2009 119:661−673、deFougerollesHum Gene Ther.2008 19:125−132を参照のこと)。Wheelerらによる元の製造方法は、洗浄剤透析法(detergent dialysis method)であり、それは後にJeffsらによって改善され、自発的小胞形成法(spontaneous vesicle formation method)と称される。リポソーム製剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに加えて、3〜4つの脂質構成成分から構成される。例としてリポソームは、Jeffsらによって記載されるように、55%のコレステロール、20%のジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン(DSPC)、10%のPEG−S−DSG、および15%の1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DODMA)を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、Heyesらによって記載されるように、48%のコレステロール、20%のDSPC、2%のPEG−c−DMA、および30%のカチオン性脂質を含有してもよいが、これらに限定されず、このカチオン性脂質は、1,2−ジステアリルオキシ(distearloxy)−N,N−ジメチルアミノプロパン(DSDMA)、DODMA、DLin−DMA、または1,2−ジリノレニルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)であり得る。
Biotech,Bothell,WA)、中性DOPC(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)系リポソーム(例えば、卵巣癌に対するsiRNA送達(Landen et al.,Cancer Biology&Therapy 2
006 5(12)1708−1713))、およびヒアルロナンコーティングリポソーム(Quiet Therapeutics,Israel)等であるが、これらに限定されないリポソーム中に製剤化されてもよい。
に位置する粘膜組織等であるが、これらに限定されない。より高い薬物カプセル封入効率および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい10〜200nmよりも大きいナノ粒子、は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜(mucosla)組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール(PEG)で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子(直径200nm〜500nm)は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか4〜6倍低く、粘液を通って拡散した(参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Lai et al.,PNAS 2007 104(5):1482−487、Lai et al.,Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158−171)。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定(FRAP)および高解像度多数粒子追跡(MPT)を含むが、これらに限定されない、透過速度および/または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。
プロラクトン)、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー、および(ポリ(エチレングリコール)−(ポリ(プロピレンオキシド)−(ポリ(エチレングリコール)トリブロックコポリマー(参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120121718号および米国公開20100003337号を参照のこと)等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる(GRAS)ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が何ら作り出されないような方式であってもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過可能である、ポロキサマーコーティングPLGAナノ粒子を含んでもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Yang et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2011 50:2597−2600)。
継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜(mucosla)組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール(PEG)で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子(直径200nm〜500nm)は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか4〜6倍低く、粘液を通って拡散した(参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Lai et al.,PNAS 2007 104(5):1482−487、Lai et al.,Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158−171)。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定(FRAP)および高解像度多数粒子追跡(MPT)を含むが、これらに限定されない、透過速度および/または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。
によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120121718号および米国公開20100003337号を参照のこと)等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。
34;その内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)が説明するような二重様式治療のためであり得る。脂質ナノ粒子に製剤化される治療剤または治療剤(複数)は、抗血管新生および細胞傷害剤であり得る(例えば、Mieszawska et al.,Bioconjugate Chemistry,2013,24(9),pp 1429-1434が教示するポリマー−脂質ナノ粒子を参照;その内容は、参照により
その全体が本明細書に組み込まれる)。
、がん治療および/または画像処理のために使用され得る。
Biotechnol.2005 23:709−717、Judge et al.,J Clin Invest.2009 119:661−673、Kaufmann
et al.,Microvasc Res 2010 80:286−293、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222−1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360−1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334−344、Basha et al.,Mol.Ther.2011 19:2186−2200、Fenske and Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:25−44、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、DLin−DMA、DLin−KC2−DMA、およびMC3ベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Eに結合し、インビボでこれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Mol Ther.2010 18:1357−1364)。製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、および抗体で標的を定めるアプローチにより例として示されるが、これらによって限定されない、それらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kolhatkar et al.,Curr Drug D
iscov Technol.2011 8:197−206、Musacchio and Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388−1412、Yu et al.,Mol Membr Biol.2010 27:286−298、Patil et al.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1−61、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Zhao et
al.,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309−319、Akinc et al.,Mol Ther.2010 18:1357−1364、Srinivasan et al.,Methods Mol Biol.2012 820:105−116、Ben−Arie et al.,Methods Mol Biol.2012 757:497−507、Peer 2010 J Control Release.20:63−68、Peer et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:4095−4100、Kim et al.,Methods Mol Biol.2011 721:339−353、Subramanya et al.,Mol Ther.2010 18:2028−2037、Song et al.,Nat Biotechnol.2005 23:709−717、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、天然および/または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例としては、MIRUS(登録商標)Bio(Madison,WI)およびRoche Madison(Madison,WI)によるDynamic POLYCONJUGATE(商標)製剤、制限なく、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(Seattle,WA)等のPHASERX(商標)ポリマー製剤、DMRI/DOPE、ポロキサマー、Vical(San Diego,CA)によるVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(Pasadena,CA)によるシクロデキストリン、
デンドリマーおよびポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)ポリマー、RONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,CA)、ならびにPHASERX(商標)(Seattle,WA)等であるが、これらに限定されないpH応答性ブロックコポリマー(co−block polymers)が挙げられる。
zema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887、Sullivan et al.,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:1433−1446、Convertine et al.,Biomacromolecules.2010 Oct 1、Chu et al.,Acc Chem Res.2012 Jan 13、Manganiello et al.,Biomaterials.2012 33:2301−2309、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Singha et al.,Nucleic Acid Ther.2011 2:133−147、deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125−132、Schaffert and Wagner,Gene Ther.2008 16:1131−1138、Chaturvedi et al.,Expert Opin Drug Deliv.2011
8:1455−1468、Davis、Mol Pharm.2009 6:659−668、Davis,Nature 2010 464:1067−1070)。
d Sci USA.2007 104:12982−12887、Davis,Mol
Pharm.2009 6:659−668、Davis,Nature 2010 464:1067−1070)。
み込まれる米国特許第6,217,912号に記載の方法を用いて作製されてもよい。PAGAポリマーは、共重合して、ポリ−L−リジン、ポリアルギン(polyargine)、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド、およびポリ(ラクチド−co−グリコリド)等であるが、これらに限定されないポリマーとともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに/または参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,057,821もしくは米国公開第2012009145号に記載の方法によって作製されてもよい。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して明確に異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン(LPEI)ブロックを用いて合成されてもよい。さらに、組成物または薬学的組成物は、当技術分野で既知の方法、本明細書に記載の方法、または参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20100004315号もしくは米国特許第6,267,987号および同第6,217,912号に記載の方法によって作製されてもよい。
−コレステロールHCl)ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン(DOGS)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロパ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチル塩化アンモニウムDODAC)、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。
組み込まれる、Wang et al.,Nat Mater.2006 5:791−796、Fuller et al.,Biomaterials.2008 29:1526−1532、DeKoker et al.,Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748−761、Endres et al.,Biomaterials.2011 32:7721−7731、Su et al.,Mol Pharm.2011 Jun 6;8(3):774−87)。
Rel.2010 142:416−421、Li et al.,J Contr Rel.2012 158:108−114、Yang et al.,Mol Ther.2012 20:609−615)。この送達系は、siRNAの送達を改善するために、標的を定めたナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成成分リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによる細胞の形質移入を増加させるために、ペプチドおよび/またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチド等であるが、これらに限定されないペプチドを用いて、薬学的製剤を送達してもよい。本発明の薬学的製剤とともに使用され得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはhCT由来細胞透過性ペプチドである(例えば、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、Caron et al.,Mol.Ther.3(3):310−8(2001)、Langel,Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)、El−Andaloussi et al.,Curr.Pharm.Des.11(28):3597−611(2003)、およびDeshayes et al.,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839−49(2005)を参照のこと)。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、細胞内送達を可能にするために、Aileron Therapeutics(Cambridge,MA)およびPermeon Biologics(Cambridge,MA)によるペプチドおよび/またはタンパク質等であるが、これらに限定されない、ペプチドおよび/またはタンパク質に複合体形成されてもよい(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Cronican et al.,ACS Chem.Biol.2010 5:747−752、McNaughton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009 106:6111−6116、Sawyer,Chem Biol Drug Des.2009 73:3−6、Verdine and Hilinski,Methods Enzymol.2012;503:3−33)。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、エクスビボで細胞中に形質移入することができ、それがその後、対象に移植される。非限定的な例として、薬学的組成物は、修飾RNAを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾RNAをウイルス様粒子(VLP)中で送達するためのビロソーム、ならびにMAXCYTE(登録商標)(Gaithersburg,MD)による細胞、およびERYTECH(登録商標)(Lyon,France)による細胞等であるが、これらに限定
されない、修飾RNAを送達するためのエレクトロポレーション処理された細胞を含んでもよい。mmRNA以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、およびエレクトロポレーション処理された細胞の使用例が、文書化されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Godfrin et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:127−133、Fang et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:385−389、Hu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:10980−10985、Lund et al.,Pharm Res.2010 27:400−420、Huckriede et al.,J Liposome Res.2007;17:39−47、Cusi,Hum Vaccin.2006 2:1−7、de Jonge et al.,Gene Ther.2006 13:400−411)。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの筋肉内
または皮下局所注入は、ヒアルロナンの加水分解を触媒する、ヒアルロニダーゼを含むことができる。介在性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させて、それによって組織透過性を増加させる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427−440)。それらの分散および形質移入された細胞によって産生されるコードされたタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内にまたは皮下に投与された本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに曝露される細胞の数を増加させることができる。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入されかつ/またはそれに吸収され得る。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞等であるが、これらに限定されない、生物または粒子の送達機能を模倣することができる。非限定的な例として、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン(viron)粒子中にカプセル封入されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006376号を参照のこと)。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いたツイン塩基(twin bases)を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび/または単層カーボンナノチューブ等であるが、これらに限定されない、少なくとも1つのナノチューブに付着または結合され得る。シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、立体(steric)力、イオン力、共有結合力、および/または他の力等であるが、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
よって形成され得る。少なくとも1つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012094304号に記載のプロセスによって、少なくとも1つのロゼットナノチューブに付着および/または結合されてもよく、ここでロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールは、水性媒体中で、少なくとも1つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAがロゼットナノチューブに付着または結合するようになり得る条件下で、少なくとも1つのシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAと混合される。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、担体もしくは標的化基に共有結合された、または一緒に融合タンパク質を産生する2つのコード領域を含む(例えば、標的化基および治療的タンパク質またはペプチドを担持する)、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA等の複合体を含む。
、同第5,514,785号、同第5,565,552号、同第5,567,810号、同第5,574,142号、同第5,585,481号、同第5,587,371号、同第5,595,726号、同第5,597,696号、同第5,599,923号、同第5,599,928号および同第5,688,941号、同第6,294,664号、同第6,320,017号、同第6,576,752号、同第6,783,931号、同第6,900,297号、同第7,037,646号が含まれるが、これらに限定されない。
MAPキナーゼの活性化因子であり得る。
−−O−−CH2−−として表される]、および上に参照される米国特許第5,602,240号のアミド骨格を有する、オリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の特色をなすポリヌクレオチド(polynucletotides)は、上に参照される米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、および同第5,700,920号が含まれるが、これらに限定されない。
自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように精密に制御され得る、明確に定義されたサイズを有する。例えば、20nm超の直径が、向上した透過性および保持効果により腎クリアランスを回避し、ある特定の腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒径は、20〜100nmである。自己集合性核酸ナノ粒子を用いて、向上した送達のために癌標的化リガンドの精密に制御された空間定位および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、短いDNA断片および治療的siRNAのプログラミング可能な自己集合を用いて調製された。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンド箇所および密度を有して、分子的に同一である。DNA断片およびsiRNAは、1ステップ反応へと自己集合して、標的を定めたインビボ送達のためにDNA/siRNA四面体ナノ粒子を生成した。(Lee et al.,Nature Nanotechnology 2012 7:389−393)。
薬学的製剤は、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等を含む、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,2006は、薬学的組成物を製剤化するのに使用される種々の賦形剤およびこれらの調製のための既知の技法を開示する。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分(複数可)と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図される。
ation)によって認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬品等級である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方(United States Pharmacopoeia(USP))、欧州薬局方(European Pharmacopoeia(EP))、英国薬局方(British Pharmacopoeia)、および/または国際薬局方(International Pharmacopoeia)の基準を満たしている。
monostearate)、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール)、カルボマー(例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)20]、ポリオキシエチレンソルビタン[TWEENn(登録商標)60]、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)80]、モノパルミチン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)40]、モノステアリン酸ソルビタン[Span(登録商標)60]、トリステアリン酸ソルビタン[Span(登録商標)65]、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)80])、ポリオキシエチレンエステル(例えば、モノステアリン酸ポリオキシ
エチレン[MYRJ(登録商標)45]、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化(polyethoxylated)ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびSOLUTOL(登録商標))、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、CREMOPHOR(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル、(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30])、ポリ(ビニル−ピロリドン)、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、PLUORINC(登録商標)F 68、POLOXAMER(登録商標)188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等、ならびに/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム(deteroxime mesylate)、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(hydroxytoluened)(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、GLYDANT PLUS(登録商標)、PHENONIP(登録商標)、メチルパラベン、GERMALL(登録商標)115、GERMABEN(登録商標)II、NEOLONE(商標)、KATHON(商標)、および/またはEUXYL(登録商標)が含まれるが、これらに限定されない。
本開示は、薬物送達の科学進展の見込みを考慮した任意の適切な経路による、治療目的、薬学目的、診断目的、または撮像目的のうちのいずれのためのシグナルセンサーポリヌ
クレオチド、一次構築物、またはmmRNAの送達をも包含する。送達は、ネイキッドであっても製剤化されてもよい。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ネイキッドで細胞に送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」とは、形質移入を促進する薬剤を用いずにシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、修飾を全く含有しない場合がある。ネイキッドシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されているかつ/または修飾されていない場合があるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有してもよい。製剤は、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生崩壊性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、治療上有効成果をもたらす任意の経路によって投与されてもよい。これらには、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外(硬膜上)、脳内(大脳の中へ)、脳室内(脳室の中へ)、皮膚上(皮膚上への適用)、皮内、(皮膚自体の中へ)、皮下(皮膚の下)、経鼻投与(鼻を介して)、静脈内(静脈の中へ)、動脈内(動脈の中へ)、筋肉内(筋肉の中へ)、心臓内(心臓の中へ)、骨内輸注(骨髄の中へ)、髄腔内(脊柱管の中へ)、腹腔内(腹腔の中への輸注または注入)、膀胱内輸注、硝子体内(眼を介して)、空洞内注入(陰茎基部の中へ)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分布のための無傷の皮膚(intact skin)を介した拡散)、経粘膜(粘膜を介した拡散)、ガス注入(鼻からの吸引)、舌下、口唇下、浣腸、点眼(結膜上に)、または点耳におけるもの含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液−脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能にするような方式で投与されてもよい。本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのための非限定的な投与経路が以下に記載される。
経口および非経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチ
ルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および/または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス等の好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができるる。
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉剤、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の少なくとも1つの不活性な薬学的に許容される賦形剤、および/または充填剤もしくは増量剤(例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸)、結合剤(例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシア)、保水剤(例えば、グリセロー
ル)、崩壊剤(例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム)、溶解遅延剤(solution retarding agents)(例えば、パラフィン)、吸収促進剤(例えば、第四級アンモニウム化合物)、湿潤剤(例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール)、吸収剤(例えば、カオリンおよびベントナイト粘土)、ならびに滑沢剤(例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、ならびにこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。
本明細書に記載されるように、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する組成物は、局所的な投与のために製剤化されてもよい。皮膚は、それが容易に接触可能であるため、送達に理想的な標的であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対してのみ制限され、非特異的な毒性を回避する可能性があるだけでなく、皮内の特定の層および細胞型にも制限され得る。
特許第6,190,315号に記載されている。
一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびmmRNAは、様々な透過エンハンサーを用いて、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびmmRNAを、1つ以上の過剰増殖性疾患、障害または状態に関連する少なくとも1つの領域に送達し得る。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で溶液に存在する。しかし、通常は、脂質溶解性または脂溶性薬剤のみが容易に細胞膜を超える。超える膜を透過エンハンサーで処理した場合、非脂溶性薬剤でさえも、細胞膜を超え得ることが分かっている。細胞膜を超えて非脂溶性薬剤を拡散する手助けをするのに加え、透過エンハンサーは脂溶性薬剤の透過性も強化する。
本発明と関わりの中で、界面活性剤(または、「表面活性剤」)は、水性溶液に溶解した際に、溶液の表面張力、または、水性溶液と他の液体との間の界面張力を低下し、粘膜経由のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびmmRNAの吸収を高める結果を伴う、化学物質である。胆汁酸塩および脂肪酸の加え、これらの透過エンハンサーには、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−9−−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−20−セチルエーテル)(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems,1991,p.92);およびFC−43といった全フッ素置換エマルション(Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)が含まれる。
透過エンハンサーとして作用する様々な脂肪酸およびその誘導体には、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸(n−カプリン酸)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリかプレート、モノオレイン(1−モノオレオイル−ラック−グリセロール、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1−モノかプレート、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのC1−C10アルキルエステル(例えば−メチル、イソプロピルおよびt−ブチル)、およびそのモノ−、ジ−グリセリド(すなわち、オレアート、ラウレート、かプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど)が挙げられるが、これらに限定されない(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems,1991,p.92;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1−33;El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651−654)。
胆汁の生物学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の助長が挙げられる(Brunton,Chapter 38 in:Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therape
utics,9th Ed.,Hardman et al.,Eds.,McGraw−Hill,New York,1996,pp.934−935)。様々な天然の胆汁酸塩およびその合成誘導体が、透過エンハンサーとして作用する。このように、「胆汁酸塩」という語句には、胆汁に天然に存在するいずれかの成分およびその合成誘導体のいずれもが包含される。本発明の胆汁酸塩としては、コール酸(またはその薬剤的に許容できるナトリウム塩コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルコール(glucholic)酸グルコール酸(glucholate)ナトリウム)、グリコール(glycholic)酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ−24,25−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム(STDHF)、グリコジシドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン − 9 − ラウリルエーテル(POE)が挙げられるが、これらに限定されない(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92;Swinyard,Chapter 39 In:Remington’s
Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages782−783;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1−33;Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25;Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579−583)。
本発明との関わりで使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成して金属イオンを溶媒から取り除き、粘膜経由のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびmmRNAの吸収が強化される結果を伴う化合物として定義され得る。本発明における透過エンハンサーとしての使用に関して、キレート化剤はDNase阻害剤としても役立ち得る追加的な効果を有し、なぜなら、多くの特徴づけられたDNAヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、こうしてキレート化剤によって阻害されるからである(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315−339)。本発明のキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチレート(例えばサリチル酸ナトリウム、5−メトキシサリチレートおよびホモバニレート)、コラーゲンのN−アシル誘導体、ラウレス−9およびベータ−ジケトン(エナミン)のN−アミノアシル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1−33;Buur
et al.,J. Control Rel.,1990,14,43−51)。
本明細書で使用される非キレート化非界面活性剤透過強化性化合物は、キレート化剤または界面活性剤としては取るに足らない活性を示すが、それにも関わらず、消化の粘膜経由のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物およびmmRNAの吸収を強化する化合物として定義され得る(Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1−33)。このクラスの透過エンハンサーとしては、不飽和環状尿素、1−アル
キル−および1−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92);ならびに、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンといった非ステロイド性抗炎症剤が挙げられるが、これらに限定されない(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621−626)。
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、具体的な器官または組織(「標的組織」)が、投与のための標的とされる。
組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳類対象の組織内における目的とする腫瘍学関連タンパク質の産生を増加させる方法が提供される。標的組織の既定体積内に含有される細胞の実質的な割合(%)において目的とするポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることで特徴付けられる、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する組成物が提供される。
薬学的組成物は、口腔を介した肺投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、活性成分を含み、かつ約0.5nm〜約7nmまたは約1nm〜約6nmの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好適には、噴射剤の流れが粉末を分散するようにそこに向けられ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用い、かつ/または密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および/もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイス等の自己噴射溶媒/粉末分与容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態にある。そのような粉末は、粒子の少なくとも98重量%が0.5nm超の直径を有し、粒子の少なくとも95%(数量)が7nm未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも95重量%は、1nm超の直径を有し、粒子の少なくとも90%(数量)は、6nm未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖等の固体微粉末希釈剤を含んでもよく、それは単位用量形態で好都合に提供される。
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する、粗粉である。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち、鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって、投与される。
薬学的組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、0.1/1.0w/w%の活性成分の溶液および/または懸濁液を含む、点眼の形態にあってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、および/または本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちのもう1つ以上をさらに含んでもよい。有用である他の眼内投与可能な製剤には、微小結晶形態でおよび/またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳および/または点眼は、本発明の範囲内にあるものとして企図される。
本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、物質(「ペイロード」)の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される、いくつかの異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法には、インビトロ画像法およびインビボ画像法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光画像法(BLI)、磁気共鳴画像法(MRI)、ポジトロン放出断層撮影法(PET)、電子顕微鏡法、X線コンピュータ断層撮影法、ラマン画像法、光干渉断層撮影法、吸収画像法、熱画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィー画像法、核磁気共鳴画像法、X線画像法、超音波画像法、光音響画像法、研究室アッセイ、またはタギング/染色/画像法が必要とされる任意の状況における方法が含まれ得るが、これらに限定されない。
され得る。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞において標的タンパク質を修飾するADP−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ADP−リボシレートGタンパク質は、致命的な下痢をもたらす、小腸の内壁からの大量の体液分泌を引き起こすことによって、ヒト細胞を変性させる。
7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC、クマリン120)、および7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン(クマリン151);シアニン色素;シアノシン;4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI);5’5”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン(naphthalein)(ブロモピロガロールレッド);7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアン酸フェニル)−4−メチルクマリン;ジエチレントリアミン五酢酸塩;4,4’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;4,4’−ジイソチオシアン酸スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;5−[ジメチルアミノ]−ナフタレン−1−スルホニルクロリド(DNS、ダンシルクロリド);4−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−4’−イソチオシアネート(DABITC);エオシンおよび誘導体(例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート);エリスロシンおよび誘導体(例えば、エリスロシンBおよびエリスロシンイソチオシアネート);エチジウム;フルオロセインおよび誘導体(例えば、5−カルボキシフルオロセイン(FAM)、5−(4,6−ジクロロトリアジン−2−イル)アミノフルオロセイン(DTAF)、2’,7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、X−ローダミン−5−(および−6)−イソチオシアネート(QFITCまたはXRITC)、およびフルオレスカミン);2−[2−[3−[[1,3−ジヒドロ−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル)−2H−ベンズ[e]インドール−2−イリデン]エチリデン]−2−[4−(エトキシカルボニル)−1−ピペラジニル]−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル(sulforpropyl))−1H−ベンズ[e]インドリウム水酸化物、分子内塩、n,n−ジエチルエタンアミン(1:1)(IR144)との化合物;5−クロロ−2−[2−[3−[(5−クロロ−3−エチル−2(3H)−ベンゾチアゾール−イリデン)エチリデン]−2−(ジフェニルアミノ)−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−3−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩(IR140);マラカイトグリーンイソチオシアネート;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジアルデヒド;ピレンおよび誘導体(例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル1−ピレン);酪酸塩量子ドット;リアクティブレッド4(CIBACRON(商標)ブリリアントレッド3B−A);ローダミンおよび誘導体(例えば、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン(rhodarnine)(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;シアニン−3(Cy3);シアニン−5(Cy5);シアニン−5.5(Cy5.5)、シアニン−7(Cy7);IRD 700;IRD 800;Alexa 647;La Jolta Blue;フタロシアニン;ならびにナフタロシアニンが含まれる。
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または撮像剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されるかつ/または一緒に送達するために製剤化される必要があることを暗示するようには意図さないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、1つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と並行して、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でおよび/または時間スケジュールに基づいて投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的、予防的、診断的、または撮像組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減および/もしくは修飾し、それらの排泄を阻害し、かつ/またはそれらの体内分布を修飾し得る薬剤と組み合わせて、送達することを包含する。非限定的な例として、シグナルセンサー核酸またはmmRNAは、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬品と組み合わせて使用されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第7,964,571号において、リポポリマーとともにインターロイキン−12をコードするDNAプラスミドを含む薬学的組成物を使用し、また少なくとも1つの抗癌剤または化学療法剤を投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明のシグナルセンサー核酸およびmmRNAは、リポポリマーとともに薬学的組成物中にあってもよい(例えば、抗増殖性分子をコードするDNAプラスミドおよびリポポリマーを含む薬学的組成物を特許請求する、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20110218231号を参照のこと)、それは少なくとも1つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与され得る。
本発明は、本発明に従う修飾mRNAおよびそれらのコードされたタンパク質または複合体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその薬学的、画像化、診断的、もしくは予防的組成物は、疾患、障害、および/または状態(例えば、記憶障害の取り組みに関連した疾患、障害、および/または状態)の予防、治療、診断、または画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法等に応じて、対象によって異なる。本発明に従う組成物は、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総1日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されてもよいことが理解される。任意の特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重症度;用いられる特定の化合物の活性;用いられる特定の組成物;患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活;投与時間、投与経路、および用いられる特定の化合物の排泄速度;治療の持続期間;用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物;医学分野で周知の要素等を含む様々な要素に依存する。
に、週1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間に1回送達されてもよい。ある特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回以上の投与)によって送達されてもよい
本明細書に記載の薬学的組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注入用(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下)等の本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
非経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。非経口投与についてのある特定の実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせと混合されてもよい。
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って製剤化されてもよく、好適な分散化剤、湿潤剤、および/または懸濁化剤を含んでもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および/または溶媒、例えば、1,3−ブタンジオール溶液中の滅菌注入用溶液、懸濁液、および/またはエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、U.S.P.、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。無刺激固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達にも使用され得る。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する粗粉であってもよい。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって投与されてもよい。
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒の固体剤形を、コーティング剤およびシェル、例えば、腸溶性コーティング剤および医薬品製剤化分野で周知の他のコーティング剤で調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、それらが、腸管のある特定の部分において、任意に、遅延様式で、活性成分(複数可)のみを放出するか、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、その
ような賦形剤をラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。
本明細書に記載の薬学的組成物は、生物学的利用能、治療域、および/または分布量のうちの1つ以上によって特徴付けられ得る。
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、生物学的利用能の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「生物学的利用能」という用語は、哺乳動物に投与されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの所与の量の全身利用能を指す。生物学的利用能は、化合物を哺乳動物に投与した後に、変化していない形態の化合物の曲線下面積(AUC)または最大血清または血漿濃度(Cmax)を測定することによって評価され得る。AUCは、縦座標(Y軸)に沿った化合物の血清または血漿濃度を横座標(X軸)に沿った時間に対してプロットした曲線下面積の決定である。一般に、特定の化合物のAUCは、当業者に既知の方法、および参照により本明細書に組み込まれるG.S.Banker,Modern Pharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences,v.72,Marcel Dekker,New York,Inc.,1996に記載の方法を用いて算出され得る。
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた投与されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物の治療域と比較して、投与されたシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物の治療域の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「治療域」は、治療的効果を誘発する可能性の高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療上活性物質のレベルの範囲を指す。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの治療域は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、ま
たは約100%増加し得る。
シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、分布量(Vdist)の改善、例えば、低減または標的化を呈し得る。分布量(Vdist)は、体内の薬物の量を血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書で使用されるとき、「分布量」という用語は、血液または血漿中の濃度と同一の濃度で体内の薬物の総量を含有するよう要求される液量を指し、Vdistは、体内の薬物の量/血液または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、用量10mgおよび血漿濃度10mg/Lの場合、分布量は、1リットルである。分布量は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布量は、血漿タンパク質結合と比較して組織構成成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、Vdistを用いて負荷用量を決定し、定常状態濃度を達成することができる。いくつかの実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの分布量は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%減少し得る。
一実施形態において、動物に送達されるシグナルセンサー修飾mRNAの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することによって分類され得る。タンパク質発現は、本発明のシグナルセンサー修飾mRNAを投与した哺乳動物から収集された生体試料を分析することによって決定され得る。一実施形態において、哺乳動物に投与されるシグナルセンサー修飾mRNAによってコードされた少なくとも50pg/mLの発現タンパク質が好ましくあり得る。例えば、哺乳動物に送達されるシグナルセンサー修飾mRNAによってコードされるタンパク質の50〜200pg/mLの発現タンパク質が、哺乳動物における治療上有効量のタンパク質と見なされ得る。
質量分析(MS)は、分子のイオン変換後の分子の構造質量および分子量/濃度情報を提供することができる分析的技法である。分子は、最初に、イオン化されて正電荷または負電荷を得て、次いで、それらは、質量分析器を通って移動して、それらの質量/電荷(m/z)比に従って検出器の異なる領域に到達する。
イオンは、検出され得る(すなわち、選択的イオン監視モード(SIM)を用いて)か、またはあるいは、イオンは、走査モード、例えば、多重反応監視(MRM)もしくは選択反応監視(SRM)を用いて検出され得る。
Chem 2010 56:281−290)。バイオマーカー発見の研究で頻繁に用いられる標的化されていない質量分析とは異なり、標的化されたMS方法は、計器の完全な分析能力を複合体混合物中の何十〜何百もの選択されたペプチドに集中させるMSのペプチド配列に基づくモードである。検出および断片化を目的とするタンパク質に由来するペプチドのみに制限することによって、感受性および再現性は、発見モードのMS方法と比較して劇的に改善される。このタンパク質の質量分析に基づく多重反応監視(MRM)定量化方法は、臨床試料の迅速な標的化された多重化タンパク質発現プロファイリングを介してバイオマーカーの発見および定量化に劇的に影響を与えることができる。
)、前駆体スキャン(親スキャン)、中性損失、または多重反応監視を用いて分析され得る。
、および2,5−ジヒドロキシ安息香酸がある。分析物−マトリックス混合物のレーザー放射は、マトリックスおよび分析物の蒸発をもたらし得る。レーザー誘起脱離は、無傷の分析物の高イオン収率を提供し、高精度の化合物の測定を可能にする。試料は、当技術分野で既知の方法を用いて分析され得る(例えばLewis,Wei and Siuzdak,Encyclopedia of Analytical Chemistry 2000:5880−5894)。非限定的な例として、MALDI分析に用いられる質量分析器には、線形飛行時間(TOF)、TOFリフレクトロン、またはフーリエ変換質量分析器が含まれ得る。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、好ましい実施形態において、免疫応答および/もしくは分解経路等の有害な生体応答の回避(avoidance)もしくは回避(evasion)、発現の閾値の克服および/もしくはタンパク質産生能力の改善、改善された発現率もしくは翻訳効率、改善された薬物もしくはタンパク質半減期および/もしくはタンパク質濃度、最適化されたタンパク質局在化を提供して、組織内の安定性および/もしくはクリアランス、受容体による取り込みおよび/もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、分泌効率(該当する場合)、血液循環への到達可能性、ならびに/または細胞の状態、機能、および/もしくは活性の調節のうちの1つ以上を改善するように設計される。
治療剤
本明細書に記載される、修飾核酸および修飾RNA等の本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、ならびにそれらから翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。それらは、医薬において使用するために提供される。例えば、本明細書に記載のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、対象に投与することができ、このシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、インビボで翻訳されて、対象において治療的または予防的腫瘍学関連ポリペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の診断、治療、または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAを含有する細胞、またはシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAから翻訳されるポリペプチドを含む。
伝子調節活性の性質を有し得る。関連する実施形態において、投与されるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、組換え腫瘍学関連ポリペプチドが翻訳される細胞内に存在しているが、実質的に不全である機能的活性を増加させる(例えば、相乗的に)、1つ以上の組換え腫瘍学関連ポリペプチドの産生を指示する。
一実施形態において、シグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物および/またはmmRNAを、がん、がん関連および/またはがん治療関連障害、副作用および/または状態の治療、管理、特徴づけおよび/または診断に使用し得る。そのような疾患、障害および状態には、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロ
ブリン血症、ウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
672[H1672]、NCI−H1693[H1693]、NCI−H1694[H1694]、NCI−H1703[H1703]、NCI−H1734[H−1734、H1734]、NCI−H1755[H1755]、NCI−H1755[H1755]、NCI−H1770[H1770]、NCI−H1793[H1793]、NCI−H1836[H1836]、NCI−H1838[H1838]、NCI−H1869[H1869]、NCI−H1876[H1876]、NCI−H1882[H1882]、NCI−H1915[H1915]、NCI−H1930[H1930]、NCI−H1944[H1944]、NCI−H1975[H−1975、H1975]、NCI−H1993[H1993]、NCI−H2023[H2023]、NCI−H2029[H2029]、NCI−H2030[H2030]、NCI−H2066[H2066]、NCI−H2073[H2073]、NCI−H2081[H2081]、NCI−H2085[H2085]、NCI−H2087[H2087]、NCI−H2106[H2106]、NCI−H2110[H2110]、NCI−H2135[H2135]、NCI−H2141[H2141]、NCI−H2171[H2171]、NCI−H2172[H2172]、NCI−H2195[H2195]、NCI−H2196[H2196]、NCI−H2198[H2198]、NCI−H2227[H2227]、NCI−H2228[H2228]、NCI−H2286[H2286]、NCI−H2291[H2291]、NCI−H2330[H2330]、NCI−H2342[H2342]、NCI−H2347[H2347]、NCI−H2405[H2405]、NCI−H2444[H2444]、UMC−11、NCI−H64[H64]、NCI−H735[H735]、NCI−H735[H735]、NCI−H1963[H1963]、NCI−H2107[H2107]、NCI−H2108[H2108]、NCI−H2122[H2122]、Hs573.T、Hs573.Lu、PLC/PRF/5、BEAS−2B、HepG2、Tera−1、Tera−2、NCI−H69[H69]、NCI−H128[H128]、ChaGo−K−1、NCI−H446[H446]、NCI−H209[H209]、NCI−H146[H146]、NCI−H441[H441]、NCI−H82[H82]、NCI−H460[H460]、NCI−H596[H596]、NCI−H676B[H676B]、NCI−H345[H345]、NCI−H820[H820]、NCI−H520[H520]、NCI−H661[H661]、NCI−H510A[H510A、NCI−H510]、SK−HEP−1、A−427、Calu−1、Calu−3、Calu−6、SK−LU−1、SK−MES−1、SW900[SW−900、SW900]、Malme−3MおよびCapan−1を包含するATCC(Manassas,VA)由来のものが挙げられる。
ンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該3つのmiR−122a結合部位は3’UTRに位置する。別の非制限的な例として、HSV1−tkおよび3つのmiR−122a結合部位がシグナルセンサーポリヌクレオチドによってコードされ、ここで、当該3つのmiR−122a結合部位が3’UTRに位置する。
脳がん
脳がんは、通常悪性脳腫瘍の成長に関連する、脳の組織における異常な細胞の成長である。脳腫瘍は成長して脳の付近の領域を圧迫し、これによって、脳のその部分は本来働くべくように働くことを阻害され得る。脳がんが脳外部の他の組織に転移することはめったにない。顕微鏡下でがん細胞がどれだけ異常に見えるかに基づいた腫瘍の悪性度を用いて、成長の遅い腫瘍と成長の速い腫瘍との間の違いを区別し得る。悪性度Iの腫瘍は成長が遅く、付近の組織にはめったに転移せず、正常な細胞に似た細胞を有し、腫瘍全体を外科手術で取り除くことが可能である。悪性度IIの腫瘍も成長は遅いが、付近の組織に転移し得、再発し得る。悪性度IIIの腫瘍は成長が速く、付近の組織に転移する可能性が高く、腫瘍細胞は正常な細胞とはかなり異なって見える。高悪性度である悪性度IVは成長も転移も早く、腫瘍に死細胞の領域があり得る。脳がんの症状には、起床時の頭痛または嘔吐後になくなる頭痛、頻繁に起こる吐き気および嘔吐、視覚、聴覚および発話問題、平衡感覚障害および歩行困難、片方側の身体の脱力感、異常な眠気または活動レベルの変化、人格または行動の異常な変化、発作が包含されるが、これらに限定されない。
乳癌は、限定はしないが、管および小葉といった、男女双方の胸の組織で形成される。最も一般的な乳癌の種類は、乳管癌であり、これは、管の細胞で始まる。ローブまたは小葉で始まる小葉癌は、双方の胸でしばしば発見される。珍しい種類の乳癌である炎症性乳癌では、胸が温かくなり、赤くなって腫れる。遺伝性乳癌は、全乳癌のおよそ5〜10%を占め、改変された遺伝子がいくつかの民族でよく見られ、それによってその民族は乳癌に対してより高い感受性を有する。乳癌の症状として、胸部もしくは胸部付近またはわきの下領域での塊または肥厚部、胸のサイズまたは形状の変化、胸の皮膚のくぼみまたは歪み、内向きになった胸の乳首、乳首から出る母乳ではない流体、うろこ状、赤色または腫れている、胸、乳首または乳輪の皮膚、オレンジの皮膚(橙皮上皮膚(peau d’orange))のような胸のくぼみが挙げられるが、これらに限定されない。
オチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、乳癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、乳癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも1つの癌の症状を軽減および/または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および/または改善し得る。
子宮頚癌は、子宮頚部の組織で形成され、通常成長速度は遅い。子宮頚癌の原因は通常ヒトパピローマウイルス(HPV)感染と関係がある。子宮頚癌はいずれの徴候も示さないが、可能性のある症状としては、膣の出血、異常な膣分泌物、骨盤痛および性行の際の痛みが挙げられ得るが、これらに限定されない。
食道癌は、食道の内側を覆う組織に形成される癌である。2種類の一般的な食道癌が存在し、これらは悪性になる細胞の種類から名前が付けられる。扁平上皮癌は、食道の内側を覆う薄く平らな細胞に形成される癌である(類表皮癌とも呼ばれる)。粘液といった流体を生産および放出する腺(分泌)細胞で始まるがんは、腺癌と呼ばれる。食道癌に関連する一般的な症状としては、痛みを伴う嚥下または嚥下困難、体重の軽減、胸骨の奥の痛み、しわがれ声および咳、ならびに消化不良および胸やけが挙げられるが、これらに限定されない。
家族性がん症候群は、対象ががんを進行する遺伝的素因を表す。全てのがんの5〜10%は遺伝性であり、ある血縁者から別の血縁者に受け継がれる特定の遺伝子を通して継承される。これらの遺伝子変化の1つを遺伝した対象は、その生涯でがんを進行させる可能性がより高くあり得る。家族性がん症候群としては、毛細血管拡張性運動失調、基底細胞母斑症候群、母斑性基底細胞癌症候群、ゴーリン症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、バート・ホッジ・デューブ症候群、ブルーム症候群、遺伝性乳癌および/または卵巣癌、カーニー複合疾患、位I型およびII型タイプ、家族性脊索腫、大腸癌、遺伝性非ポリポーシスリンチ症候群、コステロ症候群、顔皮膚骨格症候群(Facio−Cutaneous−Skeletal Syndrome)、カウデン病、先天性角化異常症、食道癌との肥厚化、食道癌との手掌足底角化症、ハウエル・エバンス症候群、遺伝性多発性外骨症、ファンコーニ貧血、遺伝性びまん性胃癌、消化管間質腫瘍、多発性消化管間質腫瘍、家族性上皮小体機能亢進症、急性骨髄白血病、家族性白血病、慢性リンパ球性白血病、リー・フラウメニ症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、遺伝性多発性黒色腫、多彩異数性モザイク、多発性内分泌新生物I型、2A型および2B型、家族性甲状腺髄様癌、家族性多発性骨髄腫、遺伝性神経芽細胞腫、神経繊維腫症1型および2型、ナイミーヘン症候群、遺伝性膵癌、遺伝性傍神経節腫、ポイツ・ジェガース症候群、家族性大腸腺腫症、家族性若年性ポリポーシス、MYH関連ポリポーシス、遺伝性前立腺癌、多発性皮膚子宮筋腫を伴う遺伝性腎細胞癌、遺伝性腎細胞癌、遺伝性乳頭状腎細胞癌、ラブドイド素因症候群(Rhabdoid Predisposition Syndrome)、ロスムンド・トムソン症候群、シンプソン・ゴラビ・ベーメル症候群、家族性精巣胚細胞性腫瘍、家族性非甲状腺髄様癌、結節性硬化症、フォンヒッペル・リンダウ病、家族性ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウェルナー症候群、家族性ウィルムス腫瘍および色素性乾皮症といった障害が挙げられるが、これらに限定されない。
白血病は、多くの血液細胞が生産され、血流に入るようすることができる骨髄などの血液形成組織で始まるがんの一形態である。白血病は中枢神経系にも転移し得、脳および脊髄がんを引き起こし得る。白血病の種類には、成人急性リンパ球性、小児急性リンパ急性、成人急性骨髄性、慢性リンパ性、慢性骨髄性および毛様細胞が挙げられるが、これらに限定されない。白血病の非制限的な症状の例としては、脱力感または疲労感、熱、あざができやすい、出血しやすい、点状出血、息切れ、体重の軽減または食欲低下、骨または胃の痛み、肋骨下部の満腹感、および、首、わき、胃または鼠径部の痛みの伴わない塊が挙げられる。
ポリヌクレオチドを投与することで治療し得る。一実施形態において、本発明のシングルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、白血病と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、白血病と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも1つのがんの症状を軽減および/または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および/または改善し得る。
肝臓癌には、肝臓の組織で形成される原発性肝臓癌と、身体の別の部分から肝臓に転移した続発性肝臓癌、または転移性肝臓癌の2種類がある。肝臓癌の可能性のある症状としては、胸郭の真下の右部分上の硬い塊、右上腹部における不快感、右肩甲骨周囲の痛み、原因不明の体重軽減、黄疸、異常な疲労感、吐き気および食欲低下が挙げられるが、これらに限定されない。
c−mycタンパク質は、通常の細胞プロセスでの重要な役割を有する多機能性bHLHZip転写因子であり、ヒトのがんの大部分で異常に制御される。c−、N−およびL−Mycは、Max、MadおよびMiz−1といったパートナーと二量体化し得るファミリーメンバーである。このタンパク質は多数の示唆される転写標的のトランス活性化および抑制に関わり、近年の研究によって、Mycのために、進行するがんでトランス活性化される遺伝子の「転写増幅因子」としての役割が示された。これは、がん細胞増殖、成長、生合成代謝、リボ合成および翻訳ならびにおそらく発癌性シグナルが通らなくてはいけない非重複節において、良く確立された機能を有する。
スモデルで、それぞれ、成熟肺腫瘍の形成の確立を阻害し、成熟肺腫瘍の形成の退縮を誘導し(Soucek et al.,Nature 2008,455,679−683);トランスジェニックOmomycは、腫瘍形成を阻害し、制御可能な副作用を有する膵臓神経内分泌癌のRIP1−TAG2モデルにおいて、確立された腫瘍を退縮させ、さらに、がん細胞Mycに関して許容的な腫瘍微小環境の維持における役割を示し(Sodir et al.,Genes and Development 2011,25,907−916);ならびに、「OmomycはインビトロおよびインビボでKRAS突然変異性ヒト肺腺癌A549細胞の細胞死を誘導する」と報告された(Fukazawa
et al.,Anticancer Res,2010,30,4193−4200)。
肺癌は、肺の組織、通常は、気道に並ぶ細胞に形成され、小細胞肺癌または非小細胞肺癌のいずれかとして分類される。小細胞肺癌には2種類あり、小細胞癌と、複合型小細胞癌である。非小細胞肺がんの種類としては、扁平上皮癌(癌は扁平細胞で始まる)、大細胞癌(癌は複数の種類の細胞で始まり得る)および腺癌(癌は肺胞に並ぶ細胞および粘液を作る細胞で始まる)がある。肺癌の症状としては、胸の不快感または痛み、時間が経ってもなくならないまたは悪化する咳、呼吸困難、喘鳴、唾液の血液、しわがれ声、食欲低下、理由不明の体重軽減、疲労感、嚥下困難ならびに顔および/または首の静脈の腫れが挙げられるが、これらに限定されない。
をコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および/または改善し得る。
リンパ腫は、免疫系の細胞で始まるがんである。ホジキンリンパ腫を有する対象は、リード・シュテルンベルク細胞呼ばれる細胞を有し、非ホジキンリンパ腫には、大きな群の免疫系細胞のがんが包含される。リンパ腫の例としては、頚部、わきの下または鼠径部の痛みのない腫れたリンパ節、理由不明の熱、あふれ出る寝汗、理由不明の体重軽減、皮膚のかゆみおよび疲弊が挙げられるが、これらに限定されない。
卵巣癌は、卵巣上皮癌(卵巣の表面で始まる)または悪性生殖細胞腫瘍(がんは卵細胞で始まる)のいずれかである、卵巣組織に形成される癌である。卵巣癌の症状としては、腹部の痛みまたは腫れ、骨盤での痛み、おなら、腹部膨満または便秘といった胃腸管の問題および月経停止後の膣出血が挙げられるが、これらに限定されない。
前立腺の組織に形成される前立腺は、主に年配の男性が患う。前立腺癌の非制限的な例としては、弱いまたは断続的な尿の流れ、頻尿、排尿困難、排尿の際の痛みまたはひりひりした痛み、尿または精液の血液、なくならない背中、おしりまたは骨盤の痛みおよび痛みを伴う射精が挙げられるが、これらに限定されない。
ルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、前立腺癌と診断されたまたは診断され得る対象の腫瘍の成長を軽減、除去または阻害し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減、除去または阻害し得る。一実施形態において、本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、前立腺癌と診断されたまたは診断され得る対象の少なくとも1つの癌の症状を軽減および/または改善し得、前記対象に目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを投与することで軽減および/または改善し得る。
睾丸癌は1つまたは双方の睾丸の組織に形成され、若いまたは中年男性に最も見られる。多くの睾丸癌は、生殖細胞にあり、睾丸生殖細胞腫瘍と呼ばれる。睾丸細胞腫瘍には、精上皮種および非精上皮種と呼ばれる2種類がある。睾丸癌の一般的な症状としては、いずれかの睾丸における痛みのない塊または腫れ、睾丸の感じ方における変化、下腹部または鼠径部の鈍痛、陰嚢における流体の突然の形成、および、睾丸または陰嚢における痛みまたは不快感が挙げられるが、これらに限定されない。
咽頭癌は、咽頭の組織で形成され、鼻咽腔(鼻咽腔癌)、中咽頭(中咽頭癌)、下咽頭(咽頭下部癌)および喉頭(喉頭癌)の癌を包含する。咽頭癌の一般的な症状には、なくならないのどの痛み、耳の痛み、頚部の塊、痛みの伴う嚥下または嚥下困難、声の変化またはしわがれ声、呼吸困難または発話困難、鼻血、難聴、耳の痛みまたは耳鳴り、頭痛、胸骨奥の鈍痛、咳および理由不明の体重軽減が挙げられるが、これらに限定されない。
低酸素誘導因子(HIF)は、酸素欠乏への細胞順応を制御する。がん細胞は、HIFに結合して有害状況での成長を持続し、こうして代謝、増殖、存続および移動性を包含する細胞再プログラムを促進する。ヒトのがん生検でのHIF過剰発現は、高転移性および脂肪率と相互関連する。
Clin Invest.2010;120(6):2119-2130)。CITE
D4およびSHARP1双方の発現は低下したHIF1−アルファ発現および同時に付随するHIF1−アルファ制御遺伝子発現の低下につながることが知られている。シグナルセンサーポリヌクレオチドの有効性を決定するために、細胞死および/または増殖も評価し得る。
ヌクレオチドと比較して、シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与する。動物細胞、組織および/または器官を次いで、遺伝子発現プロファイルまたはトランスクリプトームレベルでの変化に関して評価する。
2つの補因子間の結合親和性を滴定するために、実験を実行し得る。本明細書で使用される「滴定」という語句は、1つ以上の因子を、目的とする特性を評価するために、その溶液、シナリオまたはシリーズに体系的に(例えば、増加量で、または、1つ以上の因子が体系的に修飾される)導入する方法を指す。本実施形態では、目的とする特性は2つの補因子間の親和性である。1つの実施形態では、2つの補因子をコードする構築物を得て、および/または合成して、変異体構築物のシリーズを準備および/または合成する。変異構築物には、切断変異体(NまたはC末端ドメインのいずれかで1つ以上のアミノ酸が欠如する変異体タンパク質)、領域的欠失[タンパク質の(1つ以上のアミノ酸を含む)内部領域が不在であるタンパク質]を有する変異体、単一のアミノ酸置換(正常に発現されるアミノ酸が代替アミノ酸で置換される)を有する変異体、1つ以上の追加アミノ酸が、内部に、または、いずれかの末端に追加された変異体、領域的置換[タンパク質の(1つ以上のアミノ酸を含む)内部領域が、(1つ以上のアミノ酸を含む)代替領域および/またはこれらのいずれかの組み合わせで置換されるタンパク質]を有する変異対が包含され得る。変異体構築物はランダムに突然変異され、または、調査されている2つの補因子間の結合に必要な分子相互作用の既存の知識に基づいて、標的とする突然変異に供する。
の阻害剤または活性剤であり得る。上記の通り、変異体のシリーズが第3の因子のために作製され得、そのようなシリーズを滴定実験で用い、2つの補因子間の結合に対する突然変異の効果を評価し得る。
キット
本発明は、好都合におよび/または効果的に本発明の方法を行うための多様なキットを
提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の(複数可)複数の治療を実施する、および/または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量および/または数の構成成分を含む。
本発明は、目的とするポリペプチドをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定した製剤中に、ヒト患者等のそれを必要とする対象に即時に送達されることができる製剤中にシグナルセンサーポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
は無制限の異なるシグナルセンサーポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのモバイル合成が可能である。ある特定の実施形態において、デバイスは、1または少数の個体によって輸送されることができる。他の実施形態において、デバイスは、卓上または机に合うように調整される。他の実施形態において、デバイスは、スーツケース、バックパック、または同様の大きさの対象に収まるように調整される。別の実施形態において、デバイスは、ポイントオブケアまたは手持ち式デバイスであってもよい。さらなる実施形態において、デバイスは、乗用車、運搬車、もしくは救急車等の自動車、または戦車もしくは兵員輸送車等の軍用車両に収まるように調整される。目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする修飾シグナルセンサーmRNA生成するために必要な情報は、デバイスに存在するコンピュータ可読媒体内に存在する。
0,381号、同第5,599,302号、同第5,334,144号、同第5,993,412号、同第5,649,912号、同第5,569,189号、同第5,704,911号、同第5,383,851号、同第5,893,397号、同第5,466,220号、同第5,339,163号、同第5,312,335号、同第5,503,627号、同第5,064,413号、同第5,520,639号、同第4,596,556号、同第4,790,824号、同第4,941,880号、同第4,940,460号、ならびにPCT出願第WO97/37705号および同第WO97/13537号に記載されている。圧縮ガスを用いて、粉末形態にあるワクチンを加速させ、皮膚の外層を通して真皮に到達させる弾道粉末/粒子送達デバイスが、好適である。あるいは、またはさらに、従来のシリンジを皮内投与の古典的なマントゥー法で用いることができる。
rancisco,CA)であってもよい。さらに、パッチポンプは、電池式および/または充電式であり得る。
、米国特許第7,364,568号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Angelによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、異なる方向から表面内に挿入されるその針を通して物質を体表内に輸送する。マイクロそのニードル経皮輸送デバイスは、中実型マイクロニードルシステムまたは中空型マイクロニードルシステムであってもよい。非限定的な例として、中実型マイクロニードルシステムは、薬物で被覆された約150〜700μmの高さの、cm2当たり300〜1500の中実マイクロニードルを伴う最大0.5mgの容量を有し得る。マイクロニードルは、角質層に透過し、短い持続期間(例えば、20秒間〜15分間)、皮膚に残存する。別の例において、中空型マイクロニードルシステムは、最大3mLの容量を有し、およそ950μmの高さであるcm2当たり15〜20マイクロニードルを用いて液体製剤を送達する。マイクロニードルは皮膚に透過し、液体製剤がデバイスから皮膚内に流れることを可能にする。中空型マイクロニードルシステムは、製剤体積および粘度に応じて、1〜30分間で消耗し得る。
えば、米国特許第6,468,247号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Zamoyskiによると、複数の皮下針が、皮下注射器が後退するときに皮下注射器の内容物を組織内に注入するデバイス内に組み込まれる。
カテーテルおよびルーメンを使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割された投薬スケジュールにおいて本発明のmmRNAを投与することができる。そのような方法およびデバイスを、以下に記載する。
まれる。McIntyreによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、これはチャネルを取り囲む組織の領域内に治療剤を分注し、特に経心筋血行再建手術によく適している。
管のそれぞれの上に設置され、血管壁内への輸注のためにマルチルーメンカテーテルを通してその可撓管の中へ、およびその注入器の外へ薬物流体を導入する。
本明細書に教示される単回、複数回、または分割された投薬レジメンに従って、電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本発明のmmRNAを送達することができる。そのような方法およびデバイスが、以下に記載される。
胞内へ通過することを可能にする。
本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことが具体的に意図される。例えば、「C1−6アルキル」という用語は、メチル、エチル、C3アルキル、C4アルキル、C5アルキル、およびC6アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
イトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
を循環し得る。
定義されるアルキレン基(例えば、1〜4、1〜6、1〜10、または1〜20個の炭素のアルキレン基)を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるシクロアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびシクロアルキルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
コキシ−C1−6アルコキシ、C1−10アルコキシ−C1−10アルコキシ、またはC1−20アルコキシ−C1−20アルコキシ等の、2〜12または2〜20個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
RN1は、アミノについて定義される通りである);(4)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(5)アジド;(6)ハロ;(7)(C2−9ヘテロシクリル)オキシ;(8)ヒドロキシ;(9)ニトロ;(10)オキソ(例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル);(11)C1−7スピロシクリル;(12)チオアルコキシ;(13)チオール;(14)−CO2RA’(式中、RA’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(15)−C(O)NRB’RC’(式中、RB’およびRC’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−
NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイル(aryloyl)置換基をもたらすことができる。
明記されない限り、C2−20アルキニル基(例えば、C2−6またはC2−10アルキニル)である。例示のアルキニルオキシ基には、エチニルオキシ、プロピニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基(例えば、ヒドロキシ基)でさらに置換され得る。
、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(15)−C(O)NRB’RC’(式中、RB’およびRC’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例
えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。
オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)C6−10アリール−C1
−6アルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)C2−20アルケニル;ならびに(27)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
等のC1−6アルコキシ);(4)C1−6アルキルスルフィニル;(5)C6−10アリール;(6)アミノ;(7)C1−6アルク−C6−10アリール;(8)アジド;(9)C3−8シクロアルキル;(10)C1−6アルク−C3−8シクロアルキル;(11)ハロ;(12)C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−12ヘテロアリール);(13) (C1−12ヘテロシクリル)オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ
;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C6−10アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)C2−20アルケニル;ならびに(28)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
H3が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
ドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル等が含まれ、1つ以上の二重結合が還元され、水素と置き換えられる、それらのジヒドロおよびテトラヒドロ形態を含む。さらに他の例示のヘテロシクリルには、2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−オキサゾリル;2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−イミダゾリル;2,3,4,5−テトラヒドロ−5−オキソ−1H−ピラゾリル(例えば、2,3,4,5−テトラヒドロ−2−フェニル−5−オキソ−1H−ピラゾリル);2,3,4,5−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−1H−イミダゾリル(例えば、2,3,4,5−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−5−メチル−5−フェニル−1H−イミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−1,3,4−オキサジアゾリル(例えば、2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−5−フェニル−1,3,4−オキサジアゾリル);4,5−ジヒドロ−5−オキソ−1H−トリアゾリル(例えば、4,5−ジヒドロ−3−メチル−4−アミノ5−オキソ−1H−トリアゾリル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3,3−ジエチルピリジニル);2,6−ジオキソ−ピペリジニル(例えば、2,6−ジオキソ−3−エチル−3−フェニルピペリジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソピリジミニル;1,6−ジヒドロ−4−オキソピリミジニル(例えば、2−(メチルチオ)−1,6−ジヒドロ−4−オキソ−5−メチルピリミジン−1−イル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリミジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3−エチルピリミジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−ピリダジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−6−オキソ−3−エチルピリダジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−5−イソプロピル−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリル(例えば、3,3−ジメチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリルおよび2,3−ジヒドロ−2−オキソ−3,3’−スピロプロパン−1H−インドール−1−イル);1,3−ジヒドロ−1−オキソ−2H−イソ−インドリル;1,3−ジヒドロ−1,3−ジオキソ−2H−イソ−インドリル;1H−ベンゾピラゾリル(例えば、1−(エトキシカルボニル)−1H−ベンゾピラゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル(例えば、3−エチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル(例えば、5−クロロ−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル;2−オキソ−2H−ベンゾピラニル;1,4−ベンゾジオキサニル;1,3−ベンゾジオキサニル;2,3−ジヒドロ−3−オキソ,4H−1,3−ベンゾチアジニル;3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル(例えば、2−メチル−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル(例えば、1−エチル−1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−7H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−1,3−ジメチル−2,6−ジオキソ−7H−プリニル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−1H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−3,7−ジメチル−2,6−ジオキソ−1H−プリニル);2−オキソベンズ[c,d]インドリル;1,1−ジオキソ−2H−ナフト[1,8−c,d]イソチアゾリル;および1,8−ナフチレンジカルボキサミドが含まれる。さらなる複素環には、3,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロ−ピロlo[3,4−b]ピロl−(2H)−イル、および2,5−ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン−2−イル、ホモピペラジニル(またはジアゼパニル)、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが含まれる。複素環基は、式:
シクリル)オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)アリールアルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)(C1−12ヘテロシクリル)イミノ;(28)C2−20アルケニル;ならびに(29)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
反応に対してアミノ基を保護するよう意図される基を表す。一般的に使用されるN保護基は、参照により本明細書に組み込まれる、Greene,“Protective Groups in Organic Synthesis,” 3rd Edition(John Wiley & Sons,New York,1999)に開示されている。N保護基には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、2−クロロアセチル、2−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、o−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、4−クロロベンゾイル、4−ブロモベンゾイル、4−ニトロベンゾイル等の、アシル、アリーロイル、またはカルバミル基、および保護されたまたは保護されいないD、L、またはD等のキラル助剤、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等のL−アミノ酸;ベンゼンスルホニル、p−トルエンスルホニル等のスルホニル含有基;ベンジルオキシカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルオキシカルボニル、2−ニトロベンジルオキシカルボニル、p−ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1−(p−ビフェニルyl)−1−メチルエトキシカルボニル、α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2,−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、4−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−9−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル等のアルカリール基、ならびにトリメチルシリル等のシリル基が含まれる。好ましいN保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、およびベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。
子を除いて、1〜7個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、シクロアルキル基および/またはヘテロシクリル基に対する任意の置換基として本明細書に提供される1、2、3、または4個の置換基で任意に置換されてもよい。
c tautomers)を含む。例示のプロトン互変異性体には、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、およびプロトンが複素環式系の2つ以上の位置を占有し得る環状型、例えば、1H−および3H−イミダゾール、1H−、2H−、および4H−1,2,4−トリアゾール、1H−および2H−イソインドール、ならびに1H−および2H−ピラゾールが含まれる。互変異性型は、平衡し得るか、または適切な置換によって1つの形態へと立体的に固定され得る。
を指す。
を有するように設計されるとき、「操作」される。
酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非同一配列を無視することができる)。ある特定の実施形態において、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが次いで比較される。第1の配列内の位置が、第2の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されるとき、その分子は、その位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れながら、配列によって共有される同一位置の数の関数である。2つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて遂行することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Computational
Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987、Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M
Stockton Press,New York,1991に記載の方法の等を用いて決定することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、MeyersおよびMiller(CABIOS,1989,4:11−17)のアルゴリズムを用いて決定することができ、それはPAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いてALIGNプログラム(第2.0版)に組み込まれている。2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、あるいは、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用するGCGソフトウェアパッケージにおけるGAPプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法には、参照により本明細書に組み込まれるCarillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)に開示の方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。2つの配列間の相同性を決定するための例示のコンピュータソフトウェアには、GCGプログラムパッケージ、Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA、Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.、215、403(1990))が含まれるが、これらに限定されない。
中、ペトリ皿中等の、人工的な環境で生じる事象を指す。
す。
酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩(ペクチンate)、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むが、これらに限定されない、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を、化学量論的量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中で、またはその2つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはブタノール)、またはアセトニトリル等の非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418、Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl and C.G.Wermuth(eds.),Wiley−VCH,2008、およびBerge et al.,Journal of Pharmaceutical Science,66,1−19(1977)において見出される。
は散布であり、(M)代謝(または生体内変換)は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的な変換であり、(E)排泄(または排除)は、身体からの物質の排除を指す。まれな場合において、いくつかの薬物は、身体組織内に不可逆的に蓄積する。
Association and Pergamon Press,1987で論じられている。
す。
ように本明細書で使用される。
当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明に従う具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、解明することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるように限定されることが意図される。
2008)、Anderson BRらNAR(2010)を参照のこと)。
する製品を用いて行う必要があり得る。浄化した後、線形化されたベクターを、NanoDropを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動を用いて分析して線形化を確認する。
表12.G−CSFの配列
cDNAの調製のためのPCR手順を、Kapa Biosystems(ウーバン、マサチューセッツ州)による2×KAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを用いて行う。このシステムには、2×KAPA ReadyMix12.5μl、順方向プライマー(10uM)0.75μl、逆方向プライマー(10uM)0.75μl、鋳型cDNA100ng、および25.0μlに希釈したdH20が含まれる。反応条件は、95℃で5分間、98℃で20秒間を25サイクル、その後58℃で15秒間、続いて72℃で45秒間、次いで72℃で5分間、次いで4℃で終了までである。
in vitro転写反応により、修飾ヌクレオチドまたは修飾RNAを含有するmRNAを生成する。投入するヌクレオチドトリホスフェート(NTP)混合物は、天然および非天然のNTPを用いて自家作製したものである。
mRNAのキャッピングを、次のように行い、混合物には、IVT RNAが60μg〜180μgおよびdH20が最大72μl含まれる。混合物を、65℃で5分間インキュベートしてRNAを変性させ、その後すぐに氷上に移す。
cDNAにポリTがない場合、最終産物を浄化する前に、ポリAテーリング反応を行う必要がある。これは、キャップされたIVT RNA(100μl)、RNase阻害剤(20U)、10倍テーリング緩衝液(0.5M Tris−HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)、20mM ATP(6.0μl)、ポリAポリメラーゼ(20U)、dH20最大123.5μlを混合し、37℃で30分間インキュベートすることによって行う。ポリA尾部が既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、直接AmbionのMEGACLEAR(商標)kit(オースチン、テキサス州)(最大500μg)での浄化に進んでもよい。ポリAポリメラーゼは、好ましくは、酵母に発現される組み換え酵素である。
修飾RNAの5’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、次の化学的RNAキャップ類似体を用いたin vitro転写反応の際に付随して完了し得、5’グアノシンキャップ構造が生成される:3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G[ARCAキャップ]、G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、m7G(5’)ppp(5’)G(New England
BioLabs,Ipswich 、マサチューセッツ州)。修飾RNAの5’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了し、「キャップ0」構造:m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich、マサチューセッツ州)を生成し得る。キャップ1構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および2’−Oメチルト−ランスフェラーゼの両方を用いて生成され得、m7G(5’)ppp(5’)G−2’−O−メチルが得られる。キャップ2構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から3番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ1構造から生成され得る。キャップ3構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から4番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ2構造から生成され得る。酵素は、好ましくは組み換え源に由来する。
A.タンパク質発現アッセイ
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造の粗製合成産物を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号6567に示され、各シトシンにおける5−メチルシチジンおよび各シチジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾されたmRNA配列は配列番号6570に示され、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)を、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動により単一の集約された帯域を有する合成mRNAは、複数の帯域または筋状の帯域を有する合成mRNAと比較して、より高い純度の産物に対応する。単一のHPLCピークを有する合成mRNAもより高い純度の産物に対応する。より高効率のキャッピング反応により、より純粋なmRNA集団が得られる。
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号6567に示され、各シチジンにおける5−メチルシチジンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたmRNA配列は配列番号6570に示され、約160ヌクレオチド長のポリA尾部は配列内に示されない)を、複数の濃度でヒト初代ケラチノサイトに形質移入することができる。形質移入の6、12、24、および36時間後に、培養培地に分泌されたTNF−αおよびIFN−β等の炎症促進性サイトカインの量を、ELISAによってアッセイすることができる。培地中により高レベルの炎症促進性サイトカインを分泌する合成mRNAは、免疫活性化キャップ構造を有する合成mRNAに対応する。
ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号6567に示される、各シチジンにおける5−メチルシチジンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたmRNA配列は各シトシンにおける配列番号6570に示され、約160ヌクレオチド長のポリA尾部は、配列内に示されない)を、キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理の後に、LC−MSによってキャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理により、LC−MSによって検出可能な遊離ヌクレオチドとキャップされた5’−5−トリホスフェートキャップ構造の混合物が得られる。LC−MSスペクトル上のキャップされた生成物の量は、反応からの全mRNAの割合として表すことができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、LC−MSにより、より高い量のキャップされた生成物を有するであろう。
個々の修飾RNA(20μl体積中200〜400ng)または逆転写されたPCR産物(200〜400ng)を、非変性1.2%アガロースE−ゲル(Invitrogen、カールスバッド、カルフォルニア州)のウェルに充填し、製造業者のプロトコルに従って12〜15分間泳動させる。
TE緩衝液(1μl)中の修飾RNAを、Nanodrop UV吸光読み取りに使用して、in vitro転写反応からの各RNAの収率を定量化する。
シグナルセンサーポリヌクレオチドを、in vitroおよびin vivo実験のために製剤化してもよく、2012年12月14日に提出された国際出願番号第PCT/US12/069610号に教示の方法に従い、内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
シグナルセンサーポリヌクレオチドを、同時係属出願の2013年3月9日に提出された国際出願番号第PCT/US2013/030070号および2012年8月10日に提出された米国特許第61/681,742号(MNC2)に記載の方法を使用して観察してもよく、内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
シグナルセンサーポリヌクレオチドを任意の数の癌または正常な細胞株で研究してもよい。本発明に有用な細胞株として、ATCC(マナサス、バージニア州)のものが挙げられ、表13に列挙する。
表13.細胞株
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドの試験のために様々な動物モデルを使用することができる。とりわけ肺癌および肝癌についてのモデルが挙げられる。
Sv/EvのMm ES細胞クローンから始まり、肝臓活性化タンパク質(LAP)プロモーター向けテトラサイクリントランス活性化因子(tTA)および肝臓特異的イメージングのためのtetO−ルシフェラーゼの導入、得られたLAP−tTAの凍結、tetO−ルシフェラーゼをクローン化し、c−Mycおよび他の肝臓関連のプログラム癌遺伝子に使用すること、tetO駆動癌遺伝子、例えばtetOcMycの追加、得られるLAP−tTA:tetO−ルシフェラーゼ:tetO−MYCクローンの凍結、得られたESクローンをC57Bl/6胚細胞に注射し、擬似妊娠中の母親に移植し、それによって得られたキメラ動物はドキシサイクリンの除去(すなわちTet−Off)の際に腫瘍モデルとなる。このモデルは、理想的には、正常な肝細胞に囲まれるc−Myc駆動、ルシフェラーゼを発現するHCCの誘導性小結節を明示する。
低酸素誘導因子(HIF)は、酸素欠乏に対する細胞の適応を制御する。癌細胞は、不利な条件での成長を維持するためにHIFと関わり、代謝、増殖、生存および移動を含む細胞再プログラムを促進する。ヒト癌生検のHIFの過剰発現は、高転移および死亡率と相関する。
FA等の増殖、TERT、NANOG、OCT4等の生存、ZEB1、ZEB2、SNAI2、MMP14、MMP9、AMF、MET、PTHrP等の細胞移動−侵入に関連する遺伝子を制御する(Keithら、Nat Rev Cancer 2012;12:9−22)。
2130)。CITED4とSHARP1の両方の発現によって、HIF1−αが減少し、HIF1−α制御遺伝子発現が同時に減少することが知られている。細胞死および/または増殖の評価も行う。
本発明のシグナルセンサーポリヌクレオチドに組み込むことができる2つの核輸出シグナル(NES)は、ミュラーらによって報告されたものを含み(Traffic、2009、10:514−527)、遺伝子COMMD1を介したシグナル伝達に関連している。これらはNES1、PVAIIELEL(配列番号6596)およびNES2、VNQILKTLSE(配列番号6597)である。
、COMMD1 mut1/mut2+NLS(例えば、攪乱されたNESシグナルと加えられたNLSの両方)をコードする。シグナル配列は、腫瘍関連ポリペプチドまたは翻訳可能ではないスクランブル配列をコードすることができる。コードされるシグナル配列はHIF1−αと相互作用し、癌細胞のトランスクリプトームを変更する。
実施例13で概説した動物モデルを用いて、動物を、MYC阻害剤についてのシグナルセンサーポリヌクレオチド対負対照(MYC阻害剤Dについて翻訳不可能なmRNA)対ビヒクルで処理する。また、KRasモデルについて、既存の形質導入されたOmoMycモデル追加を利用することができる。次に、動物の遺伝子発現、腫瘍状態、または癌表現型または遺伝子型に関連する特徴のいずれかを評価する。
癌治療薬(mRNAおよび非mRNAの両方)の設定の場合に、正常細胞に細胞保護の利点を付与するタンパク質(天然または非天然、細胞内または細胞外)を生じる複数のmRNAの治療薬を送達する。
特定の細胞(正常および/または癌)に、直接細胞毒性または細胞保護mRNA治療薬を指示するためのmRNA治療薬の3’UTRに、miRNAの結合部位を使用する。
まず、AIFshグナルセンサーポリヌクレオチドに感受性のある(すなわちアポトーシスをもたらす)癌細胞を選択する。
まず、C.A.カスパーゼ6シグナルセンサーポリヌクレオチド(すなわち、それがアポトーシスをもたらす)に感受性がある癌細胞を選択する。
まず、HSV1−tkシグナルセンサーポリヌクレオチドに感受性がある(すなわち、アポトーシスをもたらす)癌細胞を選択する。
にコードし、試験のアームは、2つの細胞株(正常肝細胞、SNU449またはHEP3B)×5治療群(ビヒクルのみ、翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、シグナルセンサーポリヌクレオチドHSV1−tk(3’UTRのmiR BSでない)、3’UTR[miR122a BS x3]−翻訳不可能なシグナルセンサーポリヌクレオチド、3’UTR[miR122a BS x3]−シグナルセンサーポリヌクレオチドHSV1−tk)を含む。
in vivo動物実験を、本明細書に開示されたモデルまたは市販の同所性HCCモデルのいずれかを使用して、AIFsh、C.A.カズパーゼ6、HSV1−tkについて行う。
ヒト胎児腎臓上皮細胞(HEK293A)および一次ヒト肝細胞(肝細胞)を、500μlの細胞培養培地(InVitro GRO medium 、セルシス、シカゴ、イリノイ州)にウェル当たり200,000の密度で播種した。α−グロビン3’UTR(G−CSFα)(mRNA配列は配列番号6599に示される、配列には示されていない約160ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾された)α−グロビン3’UTRおよびmiR−122結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSFのmiR−122)(mRNA配列は配列番号6600に示される、配列には示されていない約160ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5メチルシチジンとシュードウリジンで完全修飾された)、または種が削除された(G−CSF種のない)4つのmiR−122結合部位でαグロビン3’UTRを有するG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号6601に示される、配列には示されていない約160ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾された)を有するG−CSFmRNAを、24ウェルプレートにウェルあたり250ngの濃度で試験した。G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表14に示す。
表14.miR−122結合部位
本明細書に記載のように肝臓癌および肺癌の細胞株を、生理食塩水中でMYC阻害剤D修飾mRNAを形質移入する、または本明細書または国際出願第PCT/US2012/69610号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のように製剤化する。MYC阻害剤D修飾mRNAで選択性および/または治療効果を評価するために、正常な肝細胞もMYC阻害剤D修飾mRNAを形質移入する。
シグナルセンサーポリヌクレオチドを、本明細書に記載され、当技術分野で周知であり、および/または国際出願第PCT/US2012/69610号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のように、脂質ナノ粒子中に製剤化する。腫瘍送達のために、脂質ナノ粒子製剤を、in vitroまたはin vivo投与の前に、効率的に送達するために適合する。標的化送達、および/または毒性を低減するために、シグナルセンサーポリヌクレオチドは、少なくとも一つのmiR結合部位を含む。
シグナルセンサーポリヌクレオチドを肺および/または肝臓癌モデル(例えば、本明細書に記載のもの)をin vivo送達するために製剤化する。シグナルセンサーポリヌクレオチドを、本明細書に記載され、当技術分野で周知であり、および/または国際出願第PCT/US2012/69610号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のように、脂質ナノ粒子中に製剤化する。
。シグナルセンサーポリヌクレオチドのタンパク質発現を評価するためにアッセイを使用する。アポトーシス、毒性、腫瘍体積による有効性、肝酵素レベルおよび腫瘍組織を、当技術分野で周知の一般的な方法を用いて評価する。
98N12−5(NPA−005)およびDLin−KC2−DMA(NPA−003)のナノ粒子製剤を、様々な濃度で試験し、FL4またはmCherryのMFIを決定する(配列番号6602に示されるmRNA配列、配列には示されていない約160ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾)を、あらゆる用量範囲で決定する。試験した製剤を表15に概説する。98N12−5のナノ粒子製剤の最適濃度を決定するために、製剤化された修飾RNA(ウェル当たり100ng、10ng、1.0ng、0.1ngおよび0.01ng)の様々な濃度を、HEK293の24ウェルプレートで試験した。
に、0.025ng/ウェルの濃度とそれより低い濃度は、約386.125であるmCherryのバックグラウンドMFIレベルに類似している。
表15.製剤
表16.HEK293、NPA−005、24ウェル、n=4
表17.HEK293、NPA−003、24−ウェル、n=4
表18.HEK293、NPA−003、24ウェル、n=4
表19.濃度およびMFI
DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200およびDLin−MC3−DMAの製剤を、HEK293のプレートでは60ng/ウェルまたは62.5ng/ウェルのプレートの濃度で、HepG2細胞のプレートでは62.5ng/ウェルの濃度で24時間インキュベートし、mCherryのMFI(配列番号6602に示されるmRNA配列)、配列には示されていない約160ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全に修飾された)を各製剤について決定した。
表20.製剤
表21.HEK293、96ウェル、60ngの修飾RNA/ウェル
表22.HEK293、62.5ng/ウェル
表23.HEK293、62.5ng/ウェル
表24.HepG2細胞、62.5ng/ウェル
表25.HepG2細胞、62.5ng/ウェル
mCherry mRNA(配列番号6604、配列には示されていない約160ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾された)を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPを、最終の脂質モル比が50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)の20:1重量比の修飾mRNAに対する総脂質で製剤化した。mCherry製剤を、表26に列挙し、粒子サイズ、ゼータ電位、およびカプセル化によって特徴づけた。
表26.mCherry製剤
2つの補因子間の結合親和性を滴定するために、実験を実施した。本明細書に使用するとき、用語「滴定」は、目的の特性を評価するために、1つ以上の因子を系統的に導入する方法(例えば、増加しているレベル、または1つ以上の因子を系統的に改変する)、溶液、シナリオまたはその系列を意味する。本実施形態では、目的の特性は、2つの補因子間の結合親和性である。一実施形態では、2つの補因子をコードする構築物を得て、および/または合成し、一連の変異体構築物を調製および/または合成する。変異体構築物は、補因子変異体をコードし、補因子変異体として、切り詰め変異体(N末端またはC末端ドメインのいずれかから1つまたは複数のアミノ酸を欠いている変異タンパク質)、局地的に削除された変異体(タンパク質の内部領域(1つ以上のアミノ酸を含む)が不在である)、単一のアミノ酸置換を有する変異体(正常に発現したアミノ酸が代替アミノ酸で置換される)、内部またはいずれかの末端に加えられる1つ以上の追加のアミノ酸を有する変異体が挙げられ、タンパク質の局所的置換を有する変異体(一つ以上のアミノ酸を含む)は、代替領域(一つ以上のアミノ酸を含む)および/またはこれらの任意の組み合わせで置換される。変異体構築物は無作為に変異し、または観察されている2つの補助因子間の結合に必要な分子間相互作用の既存の知識に基づいて、標的変異に供される。
列の変異体がサイズの大きい切断を含むように設計される。別の例では、同様の方法で翻訳後修飾され得るアミノ酸(例えば、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、グリコシル化等)は、一連の変異体のポリペプチド配列に沿って変異させることができる。
活性を調節する。別の実施形態では、ARNTとの相互作用に必要な領域を進行性に変異させるHIF1−αおよび/またはHIF2−α変異体系列を生成し、それによってARNTと結合し、HIF依存性遺伝子発現を調節するために改変された能力を有する変異体を作成する。別の実施形態では、他のHIFサブユニットとの相互作用に必要な領域を進行性に変異させるARNT変異体系列を生成し、それによってHIF サブユニットと結合し、HIF依存性遺伝子発現を調節するために改変された能力を有する変異体を作成する。
表27.滴定実験のための追加の標的の転写産物配列
表28.滴定実験のための追加のターゲットのためのペプチド配列
表29は、実施例27〜33に記載の修飾mRNA配列を説明している。
表29
CD1マウス(Harlan Laboratories、サウスイーストン、マサチューセッツ州)に、lipolex化アポトーシス誘導因子ショート(AIFsh)修飾mRNA(表29に示されるmRNA配列、配列に示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)を静脈投与し、当該修飾mRNAは、5メチルシチジンおよびプソイドウリジン(5mC/pU)で完全修飾され、および5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジン(5mC/1mpU)で完全修飾され、2−チオウリジンで修飾された25%のウリジン、および5メチルシチジン(s2Uと5mC)で修飾された25%のシチジン、プソイドウリジン(pU)で完全修飾され、または1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾された。マウスに、100μlの滅菌基礎DMEM培地(添加剤なし、LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)中、2μlのリポフェクタミン2000(LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)と複合された2μgのmRNAの用量を投与した。
スあるいはピペットで再懸濁し、2000rpmで2分間遠心した。
Fisher、ロックフォード、イリノイ州)で展開した。
CD1マウス(Harlan Laboratories、サウスイーストン、マサチ
ューセッツ州)に、ipolexed siahE3ユビキチンタンパク質リガーゼ1(SIAH1)修飾mRNAを静脈内投与した(配列番号6618に示されるmRNA配列(表29)、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、当該修飾mRNAは、5−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾され(5mC/pU)、5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され(5mC/pU)、2−チオウリジンで修飾された25%のウリジンおよび5−メチルシチジンで修飾された25%のシチジン(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全修飾され(pU)、または1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された(1mpU)。マウスに、100μlの滅菌基礎DMEM培地(添加剤なし、LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)中、2μlのリポフェクタミン2000(LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)と複合された2μgのmRNAの用量を投与した。
CD1マウス(ハーランラボラトリーズ、サウスイーストン、マサチューセッツ州)に、lipolex化構成的活性型(C.A.)カスパーゼ3(リバースカスパーゼ3またはRev−カスパーゼ3としても知られる)修飾mRNA(配列番号6619に示されるmRNA)を静脈投与し、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は5−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾され(5mC/pU)、5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され(5mC/pU)、2−チオウリジンで修飾された25%のウリジンおよび5−メチルシチジンで修飾された25%のシチジン(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全修飾され(pU)、または1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された(1mpU)。マウスに、100μlの滅菌基礎DMEM培地(添加剤なし、LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)中、2μlのリポフェクタミン2000(LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)と複合された2μgのmRNAの用量を投与した。
合わせた。脾細胞を、2000rpmで5分間の短時間ボルテックスすることにより再懸濁した。PBSを捨て、1mlのBD Pharmlyseを細胞ペレットに添加した。脾細胞を短時間のボルテックスによって再懸濁した。細胞を、室温で3分間インキュベートし、次に5分間、200rpmで遠心した。細胞を500μlのPBSで2回洗浄し、上記のように遠心した。細胞を500μlのPBSで再懸濁し、上記のように遠心した。
CD1マウス(Harlan Laboratories、サウスイーストン、マサチューセッツ州)に、lipolex化グラニュライシンmRNA(配列番号6620(表29)に示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)を静脈内投与し、当該mRNA配列は、5−メチルシチジンとプソイドウリジンで完全修飾され(5mC/pU)、5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され(5mC/1mpU)、2−チオウリジンで修飾された25%のウリジンおよび5−メチルシチジンで修飾された25%のシチジン(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジンで完全修飾され(pU)、または1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された(1mpU)。マウスに、100μlの滅菌基礎DMEM培地(添加剤なし、LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)中、2μlのリポフェクタミン2000(LifeTechnologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)と複合された2μgのmRNAの用量を投与した。
ローディング緩衝液(両方ともLife Technologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)を含有した。試料を5分間95℃で加熱し、ゲルに充填した。メーカーによって、200V、120mAおよび最大25Wの標準設定を選択した。実行時間は60分であったが、色素が移動しゲルの下端に到達する時間を超えることはなかった。
ペプチドの識別を確認するために,定量的LC−多重反応モニタリング(MRM)を用いて質量分析(LC−MS/MS)と並行して、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いてタンパク質を評価することができる。本明細書に記載の任意のタンパク質標的の特定は、定量的LC−多重反応モニタリング(MRM)アッセイ(Biognosys AG、スイス)を用いて質量分析(LC−MS/MS)と並行して、液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて評価することができる。修飾されたmRNAから発現されたタンパク質を含有するHeLa細胞溶解物は、細胞溶解物中のペプチドの識別を確認するために定量的LC−MRMアッセイ(Biognosys、スイス)を有するLC−MS/MSを使用して評価される。特定されたペプチド断片は、当該技術分野で周知および/または記載された方法を用いてアイソフォームを含む、既知のタンパク質と比較される。
溶解緩衝液中の各試料のタンパク質は、5mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を用いて37℃で1時間インキュベートすることによって還元する。アルキル化は、室温で、暗所で30分間、10mMのヨードアセトアミドを用いて行われる。タンパク質は、プロテアーゼでトリプシン(シーケンスグレード、PromegaCorporation、マディソン、ウィスコンシン州)を用いてペプチドに消化され、タンパク質比は1:50である。消化は、37℃(合計消化時間は12時間である)で一晩行われる。ペプチドは、製造業者の指示に従ってC18スピンカラム(The Nes
t Group、サウスボロ、マサチューセッツ州)を使用して質量分析のためにクリーンアップされる。ペプチドを、完全に乾燥させ、LC溶媒A(1%アセトニトリル、0.1%ギ酸(FA))に再懸濁する。全ての溶媒は、SIGMA−ALDRICH(登録商標)(セントルイス、ミズーリ州)からのHPLCグレードであり、全ての化学物質は、特に明記しない限り、SIGMA−ALDRICH(登録商標)(セントルイス、ミズーリ州)から得られる。
ペプチドが、すべての質量分析について、Proxeon Easy nLCナノ液体クロマトグラフィーシステム上で、充填されたC18カラムに注射される(Magic AQ、3μmの粒子サイズ、200オングストロームの細孔サイズ、Michrom Bioresources,Inc(オーバーン、カリフォルニア州)、11cmのカラムの長さ、75μmの内径、New Objective(マサチューセッツ州))。LC溶媒は、A:0.1%のFAを含む水中の1%アセトニトリル、B:0.1%FAを有するアセトニトリル中の3%の水。ショットガン分析のためのLC勾配は、120分で5〜35%の溶媒B、次に2分で35〜100%の溶媒B、8分間で100%溶媒Bである(総勾配の長さは130分)。ペプチドの検出のために実行されるLC−MS/MSショットガンは、標準的なナノエレクトロスプレー源を装備したThermo Scientific(Thermo Fisher Scientific)(ビレリカ、マサチューセッツ州)Q Exactive質量分析計で実施される。LC−MRMのためのLC勾配は、30分で5〜35%の溶媒B、次に2分で35〜100%の溶媒B、8分間で100%溶媒B(総勾配の長さは40分)である。Thermo Scientific(Thermo Fisher Scientific)(ビレリカ、マサチューセッツ州)TSQ Vantageのトリプル四重極質量分析計は、標準的なナノエレクトロスプレー源を装備している。再校正のため予定外のMRMモードでは、遷移ごとに20ミリ秒の滞留時間で運転される。試料間のペプチドの相対的定量のためにTSQ Vantageを4分の取得ウィンドウ長で、スケジュールMRMモードで動作させる。LC溶離液は、1.9kVでエレクトロスプレーされ、MRM分析は、0.7DaのQ1ピーク幅を使用して実行される。衝突エネルギーは、ベンダーの仕様に従って線形回帰によってTSQ Vantageについて計算する。
LC−MRMアッセイの生成のために、LC−MS/MS分析からの12の最も強いフラグメントイオンを、スケジュールLC−MRMモードで測定し、データはMQUEST(登録商標)(Cluetec、カールスルーエ、ドイツ)、mProphetのスコアリング部分を使用して処理した(Reiterら、mProphet:Automated data processing and statistical validation for large−scale SRM experiments,Nature Methods,2011(8),430−435;内容は参照により本明細書に取り込まれる)。アッセイは手動で検証され、正確なフラグメント強度が決定され、iRT(indexed retention times)がBiognosysのiRTペプチドに対して割り当てられる(Escherら.Using iRT,a normalized retention time for more targeted
measurement of peptides,Proteomics,2012(12),1111−1121、内容は参照により本明細書に取り込まれる)。試料の系列に渡るペプチドの相対的定量化のために、各アッセイの8つの最も強い遷移を試料の系列に渡って測定する。データ分析はSpectroDive(商標)を用いて行う(Biognosys、Schlieren、スイス)。総ピーク面積を、選択されたペプチドについて比較し、0.05の偽発見率を適用する。0.05以下のQ値を有するペプチドを排除し、それぞれの試料中に検出されないと考えられている。
siah E3ユビキチンタンパク質リガーゼ1(SIAH1)修飾mRNAから製造されるタンパク質含む細胞溶解物(配列番号6618(表29)によって示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤D(ヒトc−mycを構成する固有のドミナントネガティブな90アミノ酸タンパク質)修飾mRNA(配列番号6621(表29)に示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、当該修飾mRNAは、5−メチルシチジンおよびプソイドウリジン(5mCおよびpU)で完全修飾され、5−メチルシチジンと1−メチルプソイドウリジン(5mCおよび1mpU)で完全修飾され、25%のウリジンの場合は2−チオウリジンで修飾され、25%のシチジンの場合は5−メチルシチジンで修飾され(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジン(pU)で完全修飾され、または1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾され、実施例31に記載されるように、手定量的LC−MRMのLC−MS/MSを使用して評価する。評価されたタンパク質について特定されたペプチド断片を、表30に示す。
表30.タンパク質およびペプチド断片配列
グラニュライシンmRNAから産生されたタンパク質を含有する細胞溶解物(表29に示すmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾され、実施例31に記載したように定量的LC−MRMのLC−MS/MSを用いて評価した。評価されたタンパク質について同定されたペプチド断片を、表31に示す。表31では、「Uniprot ID」は、ペプチド断片配列が、データベース内のすべてのレビュータンパク質に対してブラストしたときに、UniProtのデータベースからのタンパク質識別子を意味する。
表31.タンパク質およびペプチド断片配列
実施例13で概説した動物モデルを用いて、動物を、ドミナントネガティブSTAT3分子またはドミナントネガティブAkt分子をコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドで処置し、その発現によってPI−3キナーゼ誘導発癌性形質転換が妨げられることが示され、神経膠芽腫細胞(Vogt and Hart,Cancer Discov,2011 1:481−486;参照によりその全体が本明細書に含まれる)に含まれる。動物に、ドミナントネガティブSTAT3 mRNAをコードするmRNA対ドミナントネガティブ Akt mRNA対負の対照mRNA(複数の終止コドンを含む同mRNAの非翻訳版)対送達および製剤の適切な経路を使用したビヒクルを注射する。次に、動物の遺伝子発現、腫瘍状態、または癌表現型または遺伝子型に関連する特徴のいずれかを評価する。癌のためのドミナントネガティブアプローチの他の例は概説されており、同様に修飾mRNAと使用することができる(Moss and Lemoine Chapter 15 RNA Interference and Dominant Negative Approaches in Viral Therapy of Cancer Harrington et al., eds. Wiley & Sons、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
実施例13で概説した動物モデルを用いて、ドミナントネガティブhTERTをコードするシグナルセンサーポリヌクレオチドで動物を処理し、その発現が、テロメラーゼ活性を妨害し、癌細胞のアポトーシスを引き起こすことが示されている(Agrawalら2012 Recent Pat Anricancer Drug Discov 7:102−117,Samyら2012 Mol Cancer Ther 11:2384−2393,Nguyenら2009 Cell Cycle.8:3227−3233、参照によりその全体が本明細書に含まれる)。特殊なRNA指向性DNAポリメラーゼであるテロメラーゼは、真核生物の染色体の末端にテロメアを拡張し、安定化させる。テロメアの進行性の喪失は、限られた数の細胞分裂をもたらし、ヒト細胞の老化のメカニズムに関連づけられている。不定増殖によって特徴付けられる腫瘍細胞は、テロメラーゼによって維持される安定したテロメアの長さを有している。正常細胞と癌細胞のテロメラーゼ酵素の発現の差は、癌細胞を老化に導くテロメアを不安定にし、短くするために、テロメラーゼ酵素活性を阻害する腫瘍特異的抗テロメラーゼのアプローチの発展につながっている。そのような1つのアプローチは、ドミナントネガティブのhTERTを発現するように修飾mRNAを使用することである。したがって、動物にドミナントネガティブhTERTのmRNAをコードしているmRNA対負の対照mRNA(複数の終止コドンを含む同mRNAの非翻訳版)対送達および製剤の適切な経路を用いたビヒクルを注射する。次に、動物の遺伝子発現、腫瘍状態、または癌表現型または遺伝子型に関連する特徴のいずれかを評価する。癌のためのドミナントネガティブアプローチの他の例は概説されており、同様に修飾mRNAと使用することができる(Moss and Lemoine
Chapter 15 RNA Interference and Dominant Negative Approaches in Viral Therapy of Cancer Harringtonら、eds.Wiley&Sons、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
RNA Interference and Dominant Negative Approaches in Viral Therapy of Cancer Harringtonら, eds.Wiley&Sons、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ヒト胎児腎臓上皮細胞(HEK293A)、または単球由来樹状細胞(MDDC)またはPBMC等の高発現のmir−142/146を有する細胞または細胞株を示す抗体を、500μlの細胞培養培地(CelsisのInVitro GRO培地、シカゴ、イリノイ州)を、ウェル当たり200,000密度で播種する。G−CSF mRNA(配列番号6595に示されるmRNA、配列には示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)miR−142−5pの結合部位を有するG−CSFのmRNA(G−CSFのmiR−142−5p)(cDNA配列は配列番号6627に示され、mRNA配列は配列番号6628に示されている、配列中に示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、miR−142−5p結合部位から種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−5p−seed)(cDNA配列は、配列番号6629に示されている、mRNA配列は、配列番号6630に示されている、配列には示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)種配列なしのmiR−142−5p結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−5p−seedless)(cDNA配列は配列番号6631で示される、mRNA配列は配列番号6632で示される、配列中に示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)miR−142−3p結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−3p)(cDNA配列は、配列番号6633に示されている、mRNA配列は、配列番号6634に示されている、配列には示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、miR−142−3p結合部位から種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−3p−seed)(cDNA配列は配列番号6635で示される、mRNA配列は配列番号6636で示される、配列中に示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、種配列なしのmiR−142−3p結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142−3p−seedless)(cDNA配列は配列番号6637で示される、mRNA配列は配列番号6638で示される、配列中に示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)miR−146a結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−146a)(cDNA配列は、配列番号6639に示されている、
mRNA配列は配列番号6640に示されている、配列中に示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)miR−146a結合部位から種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−146a−seed)(cDNA配列は、配列番号6641に示されている、mRNA配列は配列番号6642に示されている、配列には示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)種配列なしのmiR−146a結合部位を有するG−CSF
mRNA(G−CSF miR−146a−seedless)(cDNA配列は配列番号6643で示される、mRNA配列は配列番号6644に示されている、配列には示されていない少なくとも140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)を、24ウェルプレート中、ウェルあたり250ngの濃度で試験する。mRNA配列を、本明細書に記載および/または当該技術分野で周知の様々な化学修飾で評価し、5−メチルシチジンおよびプソイドウリジンで完全修飾され、5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、プソイドウリジンで完全修飾され、1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、ウリジン残基の25%は2−チオウリジンで修飾され、シチジン残基の25%は5−メチルシチジンで修飾される。各試料中のG−CSFの発現をELISAによって測定する。
表32.miR結合部位を有するG−CSF構築物
マイクロRNAの結合部位をmRNA治療薬の3’UTR に使用し、選択的に免疫細胞のmRNA治療薬を分解し、mRNA治療薬の送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑える。
troで実施する。
ヒト胎児腎臓上皮細胞(HEK293A)、高発現のmir−146/142を有する提示細胞または細胞株、例えば、単球由来樹状細胞(MDDC)またはPBMCを、500μlの細胞培養培地中、ウェルあたり200,000密度で播種する(CelsisのInVitro GRO培地、シカゴ、イリノイ州)。実施例37に記載したように、培養細胞を、マイクロRNAシグネチャーのある場合とない場合とで、G−CSF mRNAを形質移入する。細胞は、5日間連続して形質移入される。形質移入複合体を、形質移入の各ラウンドから4時間後に除去する。
シグナルセンサータンパク質発現およびin vivo免疫反応を試験するために、雌のBALB/cマウス(n=5)を実施例37に記載したようにマイクロRNAシグネチャーのある場合とない場合で、G−CSF mRNAを筋肉内に注射する。血液を投与から8時間後に回収する。G−CSF、TNF−αおよびIFN−αのタンパク質レベルは、ELISAによって決定される。
ラットおよびヒト初代肝細胞の肝細胞特異的miR−122のレベルを測定した。Hela細胞および初代ラットおよびヒト肝細胞を培養し、RNAを細胞溶解物から抽出した。ラットおよびヒト初代肝細胞のmiR−122レベルを、Hela細胞のそれと比較した。miR−122レベルは、Hela細胞に比べて、それぞれ初代ヒト肝細胞では約6倍増加し、初代ラット肝細胞では約12倍増加した。
初代ラットおよびヒト肝細胞およびHela細胞を、500μlの細胞培養培地中でウェル当たり200,000密度(CelsisのInVitro GRO培地、シカゴ、イリノイ州)に播種した。3’UTRにmiR−122結合部位を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−122−1X)(配列番号6600に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は5メチルシチジンおよびプソイドウリジン(5mC/pU)で完全修飾され、ま
たはプソイドウリジン(pU)または削除された種子(G−CSF種なし)を有する4つのmiR−122結合部位を有するG−CSF mRNAで完全修飾され(配列番号6601に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は、5−メチルシチジンとプソイドウリジン(5MC/pU)で完全修飾され、またはプソイドウリジン(pU)で完全修飾され、24ウェルプレート中、ウェルあたり250ngの濃度で試験した。形質移入から24時間後に、G−CSFの発現をELISAによって測定し、結果を表33に示す。
表33.G−CSF mir122発現
翻訳の抑制および/または標的メッセンジャーRNAの分解によるマイクロRNA制御遺伝子の発現。G−CSF mRNAを含むMir−122結合部位を、肝細胞に翻訳による調節を行った。
mRNAで完全修飾され(配列番号6601に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は、5−メチルシチジンとプソイドウリジン(5mC/pU)で完全修飾され、またはプソイドウリジン(pU)で完全修飾され、24ウェルプレート中、ウェルあたり250ngの濃度で試験した。形質移入から24時間後に、G−CSFの発現をELISAによって測定した。G−CSF薬剤(mRNA)レベルおよびタンパク質レベルを、表34に示す。
表34.G−CSF薬剤およびタンパク質レベル
ポリヌクレオチド、一次構築物および/または本発明のmmRNAを、緩衝液、脂質ナノ粒子およびPLGA等の本明細書に記載される方法1つを使用して製剤化する。これらの製剤を、その後に投与するか、または国際公開番号WO2013086502号、WO2013086486号およびWO2013086505号(その各々の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる)に記載のように臓器チップから作成された微小生理系と接触させる。
シグナルセンサーポリヌクレオチドの5’および/または3’非翻訳領域(UTR)、一次構築物および/または本明細書に記載のmmRNAは、少なくとも1つの翻訳エンハンサー要素(TEE)を含むことができる。5’UTRおよび/または3’UTRに含むことができるそのようなTEEとして、限定されないが、表35に列挙したものが挙げられ、部分および/またはその断片を含む。TEE配列は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または99%以上の表35に開示されたTEE配列を含むことができ、および/またはTEE配列は、5〜30ヌクレオチド断片、5〜25ヌクレオチド断片、5〜20ヌクレオチド断片、5〜15ヌクレオチド断片、5〜10ヌクレオチド断片の表35に開示されたTEE配列を含みことができる。
表35.TEE配列
翻訳抑制および/または標的メッセンジャーRNAの分解によるマイクロRNA遺伝子発現。ヒトまたはマウスのα−グロビン3’翻訳不可能領域(UTR)でのG−CSF mRNAおよび第IX因子mRNAの発現を、3’UTRのmiR−122配列を使用し
てヒト初代肝細胞において下方制御した。
UTR中のmiR−122種配列(Factor IX Mm3’UTR miR−122種、配列番号7334に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)または3’UTRに種配列がないmiR−122配列(Factor IX Mm3’UTR miR−122種なし、配列番号7335に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
表36.G−CSFタンパク質発現
HeLaおよびRAW264細胞をそれぞれ、100μlの細胞培養培地(DMEM+10%FBS)ウェル当り17000および80000の密度で播種した。
miR−146a種なし、配列番号6644に示されるmRNA配列、配列には示され
ていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された。
表38.G−CSF発現
HeLa細胞を100μlの細胞培養培地(DMEM+10%FBS)にウェルあたり17000の密度で播種した。IRES配列およびコザック配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF IRES Kozak、配列番号7336に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、IRES配列を有するがコザック配列を有さないG−CSF mRNA(G−CSF IRES、配列番号7337に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、IRESもコザック配列も有さないG−CSF mRNA(GCSF no Kozak、配列番号7338に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、またはコザック配列を有するG−CSF配列(G−CSF Kozak、配列番号7339に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、24ウェルプレートにウェルあたり75ngの濃度で試験を行った。形質移入から24時間後に、G−CSFの発現をELISAで測定し、結果を表39に示す。
表39.G−CSF発現
ヒトまたはマウスMALAT1配列で、G−CSFまたはmCherryをコードしている修飾mRNAおよび対応するcDNA配列を以下の表40に示す。表40では、各配列の開始コドンに下線を引き、MALAT1配列を太字にしている。
表40.MALAT1構築物
する。
セプチン4は、対象の腫瘍関連ポリペプチドであり得る。目的の癌関連ポリペプチドをコードする遺伝子の名前と説明の他に、ENSEMBLトランスクリプトID(ENST)、ENSEMBLタンパク質ID(ENSP)を表41に示し、それぞれ適用可能な場合に存在し、最適化された配列番号(OPT.SEQ ID)が使用可能であるときに存在する。
表41.癌関連の標的
以下から産生されたタンパク質を含む細胞溶解物、以下、(a)アポトーシス誘導因子1、ミトコンドリアの短いアイソフォーム(AIFsh、遺伝子名AIFM1)修飾mR
NA(配列番号6617(表42)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、(b)1(COMMD1)修飾mRNAを含む銅代謝(Murr1)領域(配列番号7491(表42)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、および(d)diablo、IAP結合性ミトコンドリアタンパク質(DIABLO)修飾mRNA(配列番号7494(表42)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、5−メチルシチジンおよびプソイドウリジン(5mCおよびpU)で完全修飾され、5−メチルシチジンと1−メチルプソイドウリジン(5mCおよび1mpU)で完全修飾され、2−チオウリジンで修飾された25%のウリジンおよび5−メチルシチジンで修飾された25%の2−シチジン(s2Uおよび5mC)、プソイドウリジン(pU)で完全修飾され、または1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾され、実施例31に記載されるように、定量的LC−MRMのLC−MS/MSを使用して評価した。表42.標的配列
表43.タンパク質およびペプチド断片配列
ヒト肺癌A549細胞を6ウェルに播種し、リポフェクタミン2000(Life Technologies)および5μgの構成的活性型(C.A.)カスパーゼ3mRNAを形質移入した(配列番号6619(表44)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)または構成的活性型(C.A.)カスパーゼ6mRNA(配列番号7506(表44)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)を形質移入し、当該修飾mRNAは、5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジン(5MCおよび1mpU)で完全修飾され、1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾された。細胞を、形質移入から7〜10時間後に収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、インディアナポリス、インディアナ)を含むRIPA緩衝液に溶解した。レーンあたり20μgの細胞溶解物に、ウェスタンブロットを実行し、内因性および導入されたカスパーゼ3、内因性および導入されたカスパーゼ6、カスパーゼ3下流基質PARPおよびカスパーゼ6下流基板ラミンA/Cを検出した。対照の溶解物と比較して、C.A.カスパーゼ3およびC.A.カスパーゼ6修飾mRNAが形質移入された細胞に、それぞれ、高いレベルの切断されたカスパーゼ3および切断されたカスパーゼ6を検出した。図7に示すように、下流の基質のPARPおよびラミンA/Cの切断が、C.A.カスパーゼ3修飾mRNA(図7A)およびC.A.カスパーゼ6修飾mRNA(図7B)で処理した細胞で検出された。図7Aおよび7Bに示したウエスタンブロットの5つレーンは、1)形質移入されていないHeLa細胞、2)形質移入さ
れていないA5495MC、3)A549のリポフェクタミンのみの対照、4)5mC、1mpU修飾mRNAを形質移入されたA549からの溶解物を含む。
表44.C.A.カスパーゼ配列
培養ヒト肺腺癌A549細胞の活性を、WST−1基質(Roche、インディアナポリス、インディアナ州)のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって変換されたホルマザンを測定することによって評価した。96ウェルあたり7500の細胞を、様々な用量のリポフェクタミン2000リポプレックス化構成的活性型(C.A.)カスパーゼ3mRNA(配列番号6619(表44)に示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)または構成的活性型(C.A.)カスパーゼ6mRNA(配列番号7506(表44)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)は完全に1−メチルプソイドウリジン(5mCおよび1mpU)で完全修飾され、1−メチルプソイドウリジン(1mpU)もしくは対照タンパク質(eGFP(配列番号7507に示されるmRNA)で完全修飾され、配列には示されていない約140ヌクレオチドの
ポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジン(5MCおよび1mpU)で完全修飾され、または1−メチルプソイドウリジン(1mpU)およびルシフェラーゼで完全修飾され、(配列番号7508に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジン(5MCおよび1mpU)で完全修飾され、または1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾された))の単回投与で処理した。細胞活性は、WST−1製造業者のプロトコルに従ってmRNAの処置から1日後に培養した細胞で測定し、バックグラウンドシグナルについて補正された変換されたホルマザンの450nmの吸光度の読み取りとしてプロットされる。表45に示すように、形質移入されたC.A.カスパーゼmRNA(0ng、2ng、10ng、50ngおよび250ng)の量が増加し、対照と比較して(細胞活性の読み出しのときに)光学密度(OD)シグナルを著しく阻害した。同様の結果が、ヒト肺腺癌H441細胞およびヒト子宮頸癌HeLa細胞で得られた。
表45.細胞活性
ヒト肝細胞癌HEP3B細胞を3×106細胞/ウェルの播種密度で6ウェルプレートに播種し、mRNAを形質移入したリポフェクタミン−2000は、5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジン(5MCおよび1mpU)で完全修飾され、または1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾され、以下をコードするように設計され、以下、蛍光タンパク質mCherry(配列番号に示されるmRNA配列6602、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、非翻訳可能な第IX因子(配列番号7509に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、完全長の野生型C−MYC配列番号に示される(配列番号7510に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤A(配列番号7511(表46)に示されるmRNA配列、配列には示されて
いない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤B(配列番号7513(表46)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤C(配列番号7418(表46)に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤D(配列番号7515(表46)に示されるmRNA配列、列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)。細胞を、形質移入から8時間後に収集し、溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、インディアナポリス、インディアナ州)を含むRIPA溶解緩衝液を用いて作製した。BCAアッセイにより決定された等量の溶解物を、4〜12%のビス−トリス ゲルを介してSDS−PAGEにより溶解し、ニトロセルロースブロットに移動させ、適切な一次抗体および二次抗体でプローブした。ウエスタンブロットは、HEP3B細胞で、4つ修飾mRNA MYC阻害剤の陽性発現および全長C−MYCを明らかにした。
表46.MYC阻害剤配列
Hep3B細胞を、2500細胞/ウェルの播種密度で96ウェルプレートに播種し、0、0.2nM、0.7nM、2nMまたは6nMの修飾mRNAを形質移入したリポフェクタミン2000は、1−メチルプソイドウリジン(1mpU)で完全修飾され、以下をコードするように設計され、以下、mCherry(配列番号6602に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、非翻訳可能な第IX因子(配列番号7509に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、完全長の野生型C−MYC(配列番号7510に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤A(配列番号7511に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤B(配列番号7513に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)、MYC阻害剤C(配列番号7515に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)およびMYC阻害剤D(配列番号6621に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1)。細胞活性を、製造業者の指示(Roche、インディアナポリス、インディアナ州)に従ってWST−1を用いた形質移入から48時間後に測定した。吸光度の読み取りを、WST−1を添加してから4時間後に、450nm収集し、バックグラウンド補正された結果を表47に示す。阻害剤(MYC阻害剤A、MYC阻害剤B、MYC阻害剤C、およびMYC阻害剤D)のそれぞれの3つ最高濃度は、対照に比べ吸光度信号を減少させた。
表47.細胞の活動
A. BALB/C ヌードマウス
BALB/cヌードマウスに、miR−122結合部位のない0.1ミリグラム/kgのルシフェラーゼ修飾mRNAを静脈投与し(「非標的mRNA」、配列番号7518に示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、当該ルシフェラーゼ修飾mRNAは、表48に記載の脂質ナノ粒子、またはルシフェラーゼ修飾mRNAは、表49に記載の脂質ナノ粒子中に製剤化された3’UTRにmiR−122結合部位を有するルシフェラーゼ修飾mRNAで製剤化された(「miR−122標的mRNA」、配列番号7519に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)である。
表48.非標的mRNAの脂質ナノ粒子
表49.標的mRNAの脂質ナノ粒子
表50.操作されたmiR122結合部位によって調整された修飾mRNAのin vivo発現
BALB/cヌードマウスの肝臓内に、2×106の肝細胞癌HEP3B細胞を移植し、同所性腫瘍が24日間で増殖した。腫瘍を有するマウスに、miR−122結合部位のない0.1mg/kgのルシフェラーゼ修飾mRNAを静脈投与し、当該修飾mRNAは、(「非標的mRNA」、配列番号7518に示されるmRNA7518、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)または3’UTRにmiR−122結合部位を有するルシフェラーゼ修飾mRNA(「miR−122標的mRNA」配列番号7519に示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチ
ドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5メチルシチジンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)であり、当該ルシフェラーゼ修飾mRNAは、表45に記載の脂質ナノ粒子中に製剤化された。処理から24時間後の動物に麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基質D−ルシフェリンを注射し、20分後に、生きている動物からの生物発光イメージング(BLI)をIVISイメージャーで評価した。隣接する正常肝臓と比較して、同所性腫瘍からの信号を定量化、およびmiR−122標的mRNAは、正常肝臓と比較して腫瘍において2倍の濃縮にわたって達成された脂質ナノ粒子を介して、全身に送達された。
A. HeLa細胞
HeLa細胞を100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)中、ウェル当たり15,000の密度で播種した。3’UTRにmiR−122の配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR122、配列番号7325に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)または3’UTRに種配列のないmiR−122の配列を有するG−CSF mRNA配列(G−CSF種なし、配列番号7327に示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)を、96ウェルプレート中、75ngのmRNAの濃度でウェル当たり0.3μlのリポフェクタミン2000を形質移入した。上清は形質移入後、16〜18時間の間に収集し、G−CSFの発現をELISAにより測定し、結果を表51に示す。
表51.HeLaのG−CSF細胞発現
初代ヒトまたはラット肝細胞細胞を500μlの細胞培養培地中でウェルあたり350,000細胞の密度で播種した(in vitroGRO CPおよびInVitroGRO HI培地+2.2%のTorpedo Antibiotic Mix)。3’UTRにmiR−122の配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR122、配列番号7520に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)または3’UTRにG−CSFの種配列のないmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種なし、配列番号7521に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)を、一次ヒト肝細胞および初代ラット肝細胞について24ウェルプレート中、ウェルあたり500ngのmRNAの濃度で、ウェル当たり1μlのリポフェクタミン2000を形質移入した。上清は形質移入後、16〜18時間の間に収集し、G−CSFの発現をELISAにより測定し、結果を表52に示す。mRNAのmir−122結合部位配列は、初代肝細胞のG−CSFタンパク質の発現の勢いを弱める。
表52.肝細胞のG−CSF発現
A.HeLa細胞
HeLa細胞を100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)中、ウェル当たり17,000の密度で播種した。3’UTRにmiR−122配列を有さないG−CSF mRNA(G−CSF、配列番号7321に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1。5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7320に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR122、配列番号7325に示される3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7322に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種、配列番号7326に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1。5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7323に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、 5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRに種配列のないmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種なし、配列番号7327に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7324に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)、3’UTRにmiR−122配列のない第IX因子mRNA(FIX、配列番号7329に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7328に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIX miR122、配列番号7333に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7330に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾
された)、3’UTRにmiR−122の種配列を有する第IX因子mRNA(FIX種、配列番号7334に示されるマウス3‘UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7331に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)または3’UTRに種配列のないmiR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIX種なし、配列番号7335に示されるマウス3’ UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7332に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)を6ウェルプレートにウェル当たり75ngのmRNAの濃度でリポフェクタミン2000のウェルあたり0.3μlを形質移入した。上清を形質移入後16〜18時間の間に収集し、G−CSFまたは第IX因子の発現をELISAにより測定し、結果を表53に示す。
表53.HeLaの発現
初代ヒトまたはラット肝細胞細胞を、500μlの細胞培養培地中でウェルあたり350,000の細胞密度で播種した(in vitro GRO CPおよびInVitroGRO HI培地+2.2%のTorpedo Antibiotic)。3’UTRにmiR−122配列を有さないG−CSF mRNA(G−CSF、配列番号7321に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7320に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR122、配列番号7325に示される3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1− メチルプソイドウリジンで完全修飾され、 配列番号7322に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、
5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種、配列番号7326に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1。5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7323に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドの
ポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRに種配列のないmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種なし、配列番号7327に示されるマウス3’UTR
mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7324に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122配列のない第IX因子mRNA(FIX、配列番号7329に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7328に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIX miR122、配列番号7333に示されるマウス3’ UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7330に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)、第3’UTRにmiR−122の種配列を有するIX因子mRNA(FIX種、配列番号7334に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7331に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)または3’UTRに種配列のないmiR−122配列を有する第IX因子mRNA(FIX種なし、配列番号7335に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾され、配列番号7332に示されるヒト3’UTR mRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)を一次ヒト肝細胞および初代ラット肝細胞について24ウェルプレート中、ウェルあたり500ngの濃度でウェル当たり1μlのリポフェクタミン2000を形質移入した。上清を形質移入後、24時間、48時間、72時間で採取し、G−CSFおよび第IX因子の発現をELISAにより測定し、結果を表54に示す。mRNA中のmir−122結合部位の配列は、初代肝細胞の第IX因子タンパク質の発現を減衰させた。
表54.肝細胞のG−CSF発現
A. miR−122のベースレベル
ヒト肝細胞、ラット肝細胞、ヒト肝細胞癌細胞(HEP3B)およびHeLa細胞のmir−122の基準レベルは、製造業者のプロトコルを使用して、TAQMAN(登録商標)分析により決定した。レベルをU6に正規化し、その結果を表55に示す。
表55.様々な細胞型のmiR−122レベル
初代ヒト肝細胞を、100μlの細胞培養培地中にウェルあたり50,000細胞の密度で播種した(in vitro GRO CPおよびInVitroGRO HI培地+2.2%Torpedo Antibiotic Mix)およびHEP3B細胞を、100μlの細胞培養培地MEM+10%FBSでウェルあたり20,000細胞の密度で播種した。3’UTRにmiR−122配列を有さないG−CSF mRNA(G−CSF、配列番号7320に示されるマウス3’UTR mRNA配列、配列には示されて
いない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR122、配列番号7322に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−122の種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種、配列番号7323に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)または3’UTRに種配列のないmiR−122配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種なし、配列番号7324に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)を6ウェルプレートにウェル当たり75ngのmRNAの濃度で、ウェルあたり0.3μlのリポフェクタミン2000を形質移入した。上清を形質移入後、24時間、48時間、72時間で採取し、G−CSFの発現をELISAにより測定し、結果を表56に示す。mRNA中のmir−122結合部位の配列は、初代ヒト肝細胞ではG−CSFタンパク質の発現が減衰したが、HEP3B細胞では減衰しなかった。
表56.G−CSF発現
表57.種々の細胞型におけるmiR−142 3pのレベル
HeLa細胞を、100μlの細胞培養培地DMEM+10%FBSに、ウェル当たり17,000の密度で播種し、RAW264.7細胞を100μlの細胞培養培地DMEM+10%FBSに、ウェル当たり200,000密度で播種した。3’UTRにmiR−142 3p配列を有さないG−CSF mRNA(G−CSF、配列番号7522に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR−142 3p、配列番号7523に示すmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)、3’UTRにmiR−142 3pの種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種、配列番号7524に示すmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)または3’UTRに種配列のないmiR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種なし、配列番号7525に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)を、HeLaについては、96ウェルプレート中、ウェルあたり75ngのmRNA濃度で、ウェル当たり0.3μlのリポフェクタミン2000を播種し、または、RAW264.7については、24ウェルプレート中、ウェルあたり250ngのmRNA濃度で、ウェル当たり1μlのリポフェクタミン2000を播種した。上清は形質移入後、16〜18時間の間に収集し、G−CSFの発現をELISAにより測定し、結果を表58に示す。G−CSFのmiR−142 3p部位が、RAW264.7細胞ではG−CSFの発現を下方制御することが示された。
表58.発現
RAW264.7細胞を、100μlの細胞培地(DMEM+10%FBS)中、ウェルあたり60,000細胞の密度で播種した。3’UTRにmiR−142 3p配列を有さないG−CSF mRNA(G−CSF、配列番号7522に示されるmRNA配列
、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)、3’UTRにmiR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR142 3p、配列番号7523に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)、3’UTRにmiR−142 3pの種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種、配列番号7524に示すmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾された)または3’UTRも種配列のないmiR−142 3p配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種なし、配列番号7525に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)を96ウェルプレートに、ウェル当たり75ngのmRNAの濃度で、ウェルあたり0.3μlのリポフェクタミン2000を形質移入した。上清を形質移入後、24時間、48時間、72時間で採取し、G−CSFの発現をELISAにより測定し、結果を表59に示す。mRNA中のmiR−142 3p結合部位配列は、経時的に、RAW264.7細胞のG−CSFの強力な発現を抑制することを示した。表59.G−CSF発現
末梢血単核細胞(PBMC)を100μlの細胞培養培地中のウェルあたり150,000細胞の密度で播種した(Opti−MEMおよび形質移入後10%FBSを追加)。3’UTRにmiR−142 3pの配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF miR142 3p、配列番号7523に示されるmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)、3’UTRにmiR−142 3pの種配列を有するG−CSF mRNA(G−CSF種、配列番号7524に示すmRNA配列、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)または3’UTRに種配列がないmiR−142 3pを有するG−CSF mRNA(G−CSF種なし、配列番号7525に示されるmRNA、配列には示されていない約140ヌクレオチドのポリA尾部、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよび1−メチルプソイドウリジンで完全修飾)を、2つまたは3つのドナーのために、96ウェルプレート中のウェルあたり500ngのmRNAの濃度で、ウェルあたり0.4μlのリポフェクタミン2000を3つ組で形質移入した。上清を形質移入後24時間で回収し、G−C
SFの発現は、ELISAによって測定した。2つのドナーについての結果を、表60に示し、3つのドナーについての結果を表61に示す。mRNA中のmiR−142 3p結合部位配列は、ヒトPBMCでG−CSFの発現を下方制御することを示した。
表60.PBMC発現(2つのドナー)
表61.PBMC発現(3つのドナー)
使用されている言葉は、説明するためにあり、限定するものではなく、そのより広い態様で、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、変更が添付の特許請求の範囲内でなされ得ることを理解されたい。
Claims (53)
- 単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドであって、目的とする腫瘍学関連ポリペプチド、ならびに、配列番号3529〜4549、配列番号5571〜6591およびそれらの機能的変異形のいずれかからなる群から選択される1つ以上のセンサー配列をコードするmRNAを含む、前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記目的とする腫瘍学関連ポリペプチドが配列番号1321〜2487、6611〜6616、7355〜7361、7490、7492、7493、7512、7514、7516および7517からなる群から選択される、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、少なくとも、配列番号2488〜2496、6617〜6621、7348〜7354、7362〜7489、7491、7494、7506、7511および7513からなる群から選択される核酸配列のオープンリーディングフレームを含む、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記オープンリーディングフレームがコドン最適化された、請求項3に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが2つの終止コドンを含む、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが第1の終止コドン「TGA」、ならびに、「TAA」、「TGA」および「TAG」からなる群から選択される第2の終止コドンを含む、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサー単離ポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、少なくとも140個のヌクレオチドのポリA尾部、三重鎖およびAーGカルテットからなる群から選択される、結合ヌクレオシドの3’尾部配列を有する、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、キャップ0、キャップ1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジド−グアノシンからなる群から選択される5’末端キャップを少なくとも1つ含む、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが実質的に精製されている、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの化学修飾が1−メチルシュードウリジンである、請求項10に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 化学修飾5−メチルシチジンをさらに含む、請求項11に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも2つの化学修飾を含む、
請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。 - 前記修飾がヌクレオシドおよび/または前記ヌクレオチドの骨格のうちの1つ以上の上に位置する、請求項13に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記修飾がヌクレオシドおよび骨格結合の双方上に位置する、請求項13に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記修飾が前記骨格結合上に位置する、請求項13に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 単離シグナルセンサーポリヌクレオチドがコドン最適化された、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 単離シグナルセンサーポリヌクレオチドが製剤化される、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 目的とする前記ポリペプチドが、HIFサブユニット間の親和性および/またはHIF−依存性遺伝子発現を調節する因子である、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記HIFサブユニットが配列番号6611〜6616からなる群から選択される、請求項19に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも1つの翻訳エンハンサー要素を含む、請求項1に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドであって、
(a)結合ヌクレオシドの第1の領域であって、前記第1の領域が、配列番号1321〜2487、6611〜6616および7355〜7361、7490、7492、7493、7512、7514、7516および7517からなる群から選択される、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする、前記結合ヌクレオシドの第1の領域と、
(b)前記第1の領域に対して5’に位置する第1の隣接領域であって、
(i)配列番号1321〜2487、6611〜6616、7355〜7361、7490、7492、7493、7512、7514、7516、7517、配列番号1〜4、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然5’非翻訳領域(UTR)からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む前記第1の隣接領域と、
(c)前記第1の領域に対して3’に位置する第2の隣接領域であって、
(i’)配列番号1321〜2487、6611〜6616、7355〜7361、7490、7492、7493、7512、7514、7516、7517、配列番号5〜21、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然3’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、
(ii’)配列番号3529〜4549、配列番号5571〜6591およびそれらの機能的変異形のいずれかからなる群から選択されて位置する1つ以上のセンサー配列と、
(iii’)結合ヌクレオシドの3’尾部配列とを含む前記第2の隣接領域と、を含む、前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。 - 前記結合ヌクレオシドの第1の領域が核酸配列のオープンリーディングフレームを少な
くとも含み、前記核酸配列が配列番号2488〜2496、6617〜6621、7348〜7354、7362〜7489、7491、7494、7506、7511および7513からなる群から選択される、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。 - 前記オープンリーディングフレームがコドン最適化された、請求項23に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が2つの終止コドンを含む、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域が第1の終止コドン「TGA」、ならびに、「TAA」、「TGA」および「TAG」から成る群から選択される第2の終止コドンを含む、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサー単離ポリヌクレオチド。
- 前記結合ヌクレオシドの3’尾部配列が、少なくとも140個のヌクレオチドのポリA尾部、三重鎖、およびポリAーGカルテットからなる群から選択される、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記第1の隣接領域が少なくとも1つの5’末端キャップをさらに含む、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの5’末端キャップが、キャップ0、キャップ1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および、2−アジド−グアノシンからなる群から選択される、請求項28に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 単離シグナルセンサーポリヌクレオチドが実質的に精製されている、請求項28に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの化学修飾が1−メチルシュードウリジンである、請求項31に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 化学修飾5−メチルシチジンをさらに含む、請求項32に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記第1の領域に少なくとも2つの化学修飾を含む、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記修飾が、ヌクレオシドおよび/または前記ヌクレオチドの骨格のうちの1つ以上の上に位置する、請求項34に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記修飾が、ヌクレオシドおよび骨格結合の双方上に位置する、請求項34に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記修飾が骨格結合上に位置する、請求項34に記載の単離合成シグナルセンサーポリ
ヌクレオチド。 - 前記単離シグナルセンサーポリヌクレオチドがコドン最適化された、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 結合ヌクレオシドの前記第1の領域がコドン最適化された、請求項38に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 前記単離シグナルセンサーポリヌクレオチドが製剤化される、請求項22に記載の単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチド。
- 目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、必要な対象の疾患、障害および/または状態を治療する方法であって、前記対象に、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
- 目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、必要な対象の腫瘍成長を軽減、除去または阻止する方法であって、前記対象に、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
- 目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの量を増大することで、必要な対象のがんの症状の少なくとも1つを軽減および/または改善する方法であって、前記対象に、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患、障害および/または状態が、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、肝細胞癌(HCC)、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる二次発癌からなる群から選択される、請求項41〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腫瘍成長が、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳がん、乳癌、小児癌、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、肝細胞癌(HCC)、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟組織の肉腫、基底および扁平細胞皮膚癌、黒色腫
、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍ならびにがん治療によって引き起こされる二次発癌からなる群から選択される疾患、障害および/または状態の結果である、請求項44に記載の方法。 - 前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドの投与が、がん細胞の数を低下させる、がん細胞を除去する、がん細胞の増加を阻止する、および/または、対象のがんの症状を緩和する、請求項41〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんの症状の少なくとも1つが、脱力感、疼痛および痛み、熱、疲労、体重減少、血液凝固、血液のカルシウム量の上昇、白血球数の低下、息切れ、めまい、頭痛、色素沈着過剰、黄疸、紅斑症、そう痒症、多毛症、排便習慣の変化、膀胱機能の変化、永続的な潰瘍、口内の白い斑点、舌上の白点、異常な出血または排泄、身体部分の肥大またはこぶ、消化不良、呑み込みにくさ、いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚の変化ならびにしつこい咳およびしわがれ声から成る群から選択される、請求項43に記載の方法。
- 単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが製剤化される、請求項41〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドが0.001μg〜150μgの総1日用量で投与される、請求項48に記載の方法。
- 投与が注射、局所投与、眼内投与または鼻腔内投与である、請求項49に記載の方法。
- 投与が注射によってであり、前記注射が、皮内、皮下および筋肉内からなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
- 投与が局所投与であり、前記局所投与が、クリーム、ローション、軟膏、ジェル、スプレー、溶液などからなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
- 組織または器官のがん細胞に細胞死を優先的に誘導する方法であって、
(a)前記組織または器官を単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドに接触させることを含み、前記単離合成シグナルセンサーポリヌクレオチドは、
(i)発現がアポトーシスまたは細胞死を引き起こす腫瘍学関連ポリペプチドおよび
(ii)マイクロRNAの少なくとも1つのマイクロRNA結合部位であって、がん細胞での前記マイクロRNAの発現が、正常な非がん細胞での前記マイクロRNAの発現よりも低い、前記少なくとも1つのマイクロRNA結合部位をコードする、前記方法。
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