JP2021534778A - フィードバック使用可能合成遺伝子、標的シードマッチカセット、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法119(e)条の下、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、2018年8月30日出願の米国仮出願第62/725,126号および2019年6月13日出願の第62/861,044号の優先権を主張するものである。
名称が5470−844WO_ST25.txtであり、17,375バイトのサイズであり、2019年8月22日に作成され、EFS−Web経由で提出された、米国特許法施行規則1.821条の下で提出されたASCIIテキストフォーマットの配列表を、紙コピーの代わりに提供する。この配列表は、これにより、その開示のために本明細書内にこれ中に参考として組み込まれている。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号4T32HD040127−15号の下、政府支援によって行われた。政府が本発明の特定の権利を有する。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「a」、「an」、および「the」は、内容によりそうでないと明白に指示されない限りは、複数形も含むことを意図する。
本発明は、用量感受性知的能力障害などの障害を処置するために、内在性調節が可能な導入遺伝子の発現を標的組織において提供する目的の、フィードバック使用可能合成遺伝子、ポリヌクレオチド標的カセット、ベクター、および医薬組成物に関する。
配列番号1.「Reg2」標的シードマッチならびに5’および3’フランキング配列
5’CTGTTCTAGCCCCCAAAGAGTTTTCTGTGCTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAACCAAAGACATAGATGTGAAAATTTTAGGCAGTGTAAGCTGATAGCACAAGTTCTGGCGACTCACAATTATGCTGTGAATTTTACAAAAAGAAGCAGTAATCTACCTCAGCCGATAAC−3’
配列番号2.「Reg1」標的シードマッチならびに5’および3’フランキング配列
5’ATAAGGGCAGAAACGGTTCACATTCCATTCTGCCCCGGACCTACCTCCCTCCCTCTCCTTATCAAACCCTAGCCTTGCTTGTTAAAT−3’
本発明は、用量依存的阻害性フィードバックを示す合成遺伝子を作製する方法をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド標的カセットを合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップを含む、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と1つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子を調製する方法を提供する。
本発明の別の態様では、対象に本発明の合成遺伝子、ベクター、および/または医薬組成物を投与し、それによって合成遺伝子を対象に送達することを含む、合成遺伝子を送達する方法を提供する。
超生理的なMeCP2発現によって上方調節される内在性miRNAを同定するために、毒性用量のMECP2ベクターで処置したマウスからの小脳および髄質のRNAをスクリーニングした。Mecp2+/yおよびMecp2−/yマウスに、生理食塩水または1×1012ベクターゲノム(vg)のAAV9/MeP426−hMECP2−myc−RDH1pAのどちらかを大槽内注射した(出生後28日目[PND28]、10μLの注射体積、n=2匹のマウス/処置)。処置の2週間後、致死的用量のトリブロモエタノールでマウスを安楽死させた。小脳および脳幹を解剖し、ドライアイス上で凍結し、貯蔵のためにすぐに−80℃に移した。Qiagen miRNAeasy Mini Kitを使用して、全RNAを解凍した小脳および脳幹(合わせた)から精製した。精製したRNAを−80℃で保管し、後に、スクリーニングのためにドライアイス上でLC Sciencesへと発送した(マイクロアレイパート番号MRA−1002、miRBaseバージョン21)。
MeP426−hMECP2−myc−RDH1pAウイルスゲノム中の3つのmiRNA標的(すなわち、miR−22−3p、miR−19−3p、およびmiR−132−3p)をmiR−494−3pの標的配列で置き換えた(Sinnettら、2017年、Mol.Ther.Methods Clin.Dev.、(5):106〜115頁、Gadallaら、2017年、Mol.Ther.Methods Clin.Dev.、(5):180〜190頁)。その後、改変ウイルスゲノムをAAV9内にパッケージングし、モザイクMECP2−EGFP−融合/ヌル雌内に大槽内注射した。導入遺伝子の発現は、MeCP2−EGFP発現に応答して、隣接するヌル細胞において観察されるものと比較してわずかに減少していた(図8)。
上述のパイロット研究の制限に対処するために、大スケールスクリーニングを完了した。より詳細には、さらなる対照群を追加し、より多くのマウスを処置し、RNA精製前に脳領域を細かく解剖した(合わせない)。Mecp2+/yおよびMecp2−/yマウスに、生理食塩水、1×1012vgのAAV9/MeP426−hMECP2−myc−RDH1Pa、または1×1012vgのAAV9/CBH−EGFPのいずれかを大槽内注射した(PND P28〜P35、10μLの注射体積、n=3匹のマウス/処置)。処置の2〜3週間後、致死的用量のトリブロモエタノールでマウスを安楽死させた。頚髄、小脳、および脳幹を解剖し、ドライアイス上で凍結し、貯蔵のためにすぐに−80℃に移した。その後、Qiagen miRNAeasy Mini Kitを使用して、全RNAを解凍した組織から精製した。脳領域はRNA精製の前に合わせなかった。RNAを−80℃で保管し、後に、スクリーニングのためにドライアイス上でLC Sciencesへと発送した(マイクロアレイパート番号MRA−1002、miRBaseバージョン21)。
5’CTGTTCTAGCCCCCAAAGAGTTTTCTGTGCTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAACCAAAGACATAGATGTGAAAATTTTAGGCAGTGTAAGCTGATAGCACAAGTTCTGGCGACTCACAATTATGCTGTGAATTTTACAAAAAGAAGCAGTAATCTACCTCAGCCGATAAC−3’(配列番号1)
さらなる構築物をRTTに特異的となるように開発し、本明細書中で「reg1」と呼ぶ。この配列中の標的は、脳および脊髄RNAの高スループットスクリーニングにおいてMeCP2発現に相関して上方調節されていることが示されているmiRNAに対応する。
5’ATAAGGGCAGAAACGGTTCACATTCCATTCTGCCCCGGACCTACCTCCCTCCCTCTCCTTATCAAACCCTAGCCTTGCTTGTTAAAT−3’(配列番号2)
図12は、RTT特異的パネル「reg1」および幅広く適用可能なパネル(他の箇所では「reg2」または「UNIVT」と呼ぶ)を設計するための戦略を要約する。図12パネルAは、外因性MeCP2発現をin vivoで安全に調節するためのRTT特異的標的パネルを設計するために元々使用したマイクロRNA発現データを示す。図12のパネルBに示すように、同じ発現データが、reg2を設計する目的ためにUTRデータ組を処理するための選択基準を提供した。図12パネルC〜Gに例示したステップを通じて、2491個のヒト標的のリストを、reg2の中で現在特長となっている6個の保存的標的まで絞り込んだ。これらの標的のうちの5個は、MeCP2駆動のmiRNAと結合することが予測される(表1を参照)。let−7標的が多くのlet−7miRNAシードと塩基対合するため、reg2パネルは11個までのmiRNAと結合し得ることが可能である。Reg1および/またはReg2に含まれるmiRNAシードと結合し得る潜在的なmiRNAの非限定的なリストを表5に示す。
Claims (58)
- 目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と1つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子であって、
ポリヌクレオチドが、それぞれが内在性miRNAの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する5’フランキング配列および3’フランキング配列とを含む、1つまたは複数の核酸セグメントをさらに含み、
前記1つまたは複数の核酸セグメントが、前記合成遺伝子が内在性miRNAを発現する細胞に送達される際の前記目的のタンパク質または核酸の発現が、1つまたは複数の核酸セグメントを含まない合成遺伝子が内在性miRNAを発現する細胞に送達される際の目的のタンパク質または核酸の発現と比較して低下しているように、前記ポリヌクレオチドの調節領域内に挿入されている、
合成遺伝子。 - 目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が、TCF4、UBE3A、DYRK1A、MEF2C、NSD1、ZEB2、MBD5、RPS6KA3、ATRX、MECP2、SLC6A1、FOXG1、AKT3、またはその活性断片から選択される遺伝子のコード領域を含む、請求項1に記載の合成遺伝子。
- 目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が、遺伝子MECP2またはその活性断片のコード領域を含む、請求項1に記載の合成遺伝子。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miR−690、miR−124−3p、miR−451a、miR−9−5p、miR−26−5p、miR−23−3p、miR−218−5p、miR−27−3p、let−7−5p/98−5p、miR−29−3p、miR−338−3p、miR−98−5p、miR−7−5p、miR−494−3p、またはその任意の組合せから選択される1つまたは複数のmiRNAと結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miRNAであるmiR−9−5p、miR−26−5p、miR−23−3p、miR−218−5p、miR−27−3p、およびlet−7−5pと結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miRNAであるmiR−690、miR−451a、およびlet−7−5pと結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチが約5〜約10個のヌクレオチドの長さである、請求項1から6のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチが約6〜約8個のヌクレオチドの長さである、請求項1から6のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチに隣接する5’および3’フランキング配列がそれぞれ約9〜約13個のヌクレオチドの長さである、請求項1から6のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチに隣接する5’および3’フランキング配列がそれぞれ11個のヌクレオチドの長さである、請求項1から6のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- ポリヌクレオチドが少なくとも2つのシードマッチを含み、シードマッチが約7〜約40個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項1から6のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- 少なくとも2つのシードマッチが約20〜約25個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項11に記載の合成遺伝子。
- 少なくとも2つのシードマッチが22個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項11に記載の合成遺伝子。
- ポリヌクレオチドが3〜8個のシードマッチを含む、請求項11から13のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング3’および5’配列が、配列番号1と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング3’および5’配列が、配列番号2と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の合成遺伝子を含むベクター。
- プラスミド、ウイルスベクター、発現カセット、形質転換細胞、またはナノ粒子である、請求項17に記載のベクター。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載の合成遺伝子または請求項17もしくは18に記載のベクターと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 内在性miRNAの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する5’および3’フランキング配列とを含む1つまたは複数の核酸セグメントを含む、合成遺伝子に用量依存的阻害性フィードバックを提供するためのポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miR−690、miR−124−3p、miR−451a、miR−9−5p、miR−26−5p、miR−23−3p、miR−218−5p、miR−27−3p、let−7−5p/98−5p、miR−29−3p、miR−338−3p、miR−98−5p、miR−7−5p、miR−494−3p、またはその任意の組合せから選択される1つまたは複数のmiRNAと結合する、請求項20に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miRNAであるmiR−9−5p、miR−26−5p、miR−23−3p、miR−218−5p、miR−27−3p、およびlet−7−5pと結合する、請求項20に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miRNAであるmiR−690、miR−451a、およびlet−7−5pと結合する、請求項20に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチが約5〜約10個のヌクレオチドの長さである、請求項20から23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチが約6〜約8個のヌクレオチドの長さである、請求項20から23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチに隣接する5’および3’フランキング配列がそれぞれ約9〜約13個のヌクレオチドの長さである、請求項20から25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチに隣接する5’および3’フランキング配列がそれぞれ11個のヌクレオチドの長さである、請求項20から25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング3’および5’配列が、配列番号1と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項20から27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング3’および5’配列が、配列番号2と少なくとも70%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項20から27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
- 請求項20から29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセットを合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップを含む、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と1つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子を調製する方法。
- それぞれが内在性miRNAの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する5’および3’フランキング配列とを含む、1つまたは複数の核酸セグメントを、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と1つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドの調節領域内に挿入するステップを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の合成遺伝子を作製する方法。
- 目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が、TCF4、UBE3A、DYRK1A、MEF2C、NSD1、ZEB2、MBD5、RPS6KA3、ATRX、MECP2、SLC6A1、FOXG1、AKT3またはその活性断片から選択される遺伝子のコード領域を含む、請求項31に記載の方法。
- 目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が遺伝子MECP2またはその活性断片のコード領域を含む、請求項31に記載の方法。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miR−690、miR−124−3p、miR−451a、miR−9−5p、miR−26−5p、miR−23−3p、miR−218−5p、miR−27−3p、let−7−5p/98−5p、miR−29−3p、miR−338−3p、miR−98−5p、miR−7−5p、miR−494−3p、またはその任意の組合せから選択される1つまたは複数のmiRNAと結合する、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miRNAであるmiR−9−5p、miR−26−5p、miR−23−3p、miR−218−5p、miR−27−3p、およびlet−7−5pと結合する、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
- シードマッチならびに5’および3’フランキング配列が、miRNAであるmiR−690、miR−451a、およびlet−7−5pと結合する、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
- 目的のタンパク質または核酸が発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したmiRNAをスクリーニングするステップと、
発現が増加した1つまたは複数のmiRNAのシードマッチならびに5’および3’フランキング配列を同定するステップと、
前記ポリヌクレオチドの調節領域内に挿入することとなる前記シードマッチと5’および3’フランキング配列とを含む核酸セグメントを調製するステップと
をさらに含む、請求項31に記載の方法。 - 目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加した1つまたは複数のmiRNAのシードマッチならびに5’および3’フランキング配列を同定するステップと、
前記シードマッチと5’および3’フランキング配列とを、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と1つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップと
を含む、合成遺伝子中に挿入することとなる1つまたは複数のシードマッチならびに5’および3’フランキング配列を同定する方法。 - 妥当性確認されたまたは推定上のシードマッチならびに5’および3’フランキング配列について核酸データセットをスクリーニングするステップをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したmiRNAを同定するステップをさらに含む、請求項38または39に記載の方法。
- 目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したmiRNAについて核酸データセットをスクリーニングするステップをさらに含む、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
- 目的のタンパク質または核酸を細胞中で発現させるステップと、
miRNAを細胞から収集するステップと、
前記目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、前記目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、前記miRNAの発現レベルを計算し、それによって前記miRNAの核酸データセットを作成するステップと
をさらに含む、請求項38から41のいずれか一項に記載の方法。 - 核酸データセットが3’UTRデータセットである、請求項39、41、または42のいずれか一項に記載の方法。
- 目的のタンパク質または核酸が、TCF4、UBE3A、DYRK1A、MEF2C、NSD1、ZEB2、MBD5、RPS6KA3、ATRX、SLC6A1、FOXG1、AKT3、MECP2、またはその活性断片から選択される遺伝子の転写産物または翻訳産物である、請求項38から43のいずれか一項に記載の方法。
- 目的のタンパク質または核酸が遺伝子MECP2またはその活性断片の転写産物または翻訳産物である、請求項38から43のいずれか一項に記載の方法。
- 対象に請求項1から16のいずれか一項に記載の合成遺伝子、請求項17もしくは18に記載のベクター、または請求項19に記載の医薬組成物を投与し、それによって合成遺伝子を対象に送達するステップを含む、合成遺伝子を対象に送達する方法。
- 内在性遺伝子によってコードされている目的のタンパク質または核酸をコードしている請求項1から16のいずれか一項に記載の合成遺伝子、請求項17もしくは18に記載のベクター、または請求項19に記載の医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップを含む、内在性遺伝子の異常発現または内在性遺伝子によってコードされている突然変異タンパク質の発現に関連する疾患を処置する方法。
- 対象がヒトである、請求項46または47に記載の方法。
- 対象が知的能力遺伝子用量感受性障害の危険性を有するまたは危険性にある、請求項46から48のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、レット症候群、MeCP2重複症候群、アンジェルマン症候群、dup15Q、DYRK1Aハプロ不全、ダウン症候群、MEF2Cハプロ不全症候群、dup5Q14.3、ソトス症候群、逆ソトス症候群、アルファ地中海貧血症X連鎖知的障害症候群、Xq13.2q21.1重複、コフィン−ローリー症候群、Xp22.12重複、ピット・ホプキンス症候群、モワット−ウィルソン症候群、2q22.3三重複、2q23.1重複、2q23.1微小欠失、FOXG1症候群、ウエスト症候群、巨大脳症−多小脳回−多指症−水頭症症候群、AKT3重複、デューズ症候群、SLC6A1重複、および18トリソミーからなる群から選択される障害の危険性を有するまたは危険性にある、請求項46から48のいずれか一項に記載の方法。
- 対象がレット症候群またはMeCP2重複症候群の危険性を有するまたは危険性にある、請求項46から50のいずれか一項に記載の方法。
- 合成遺伝子、ベクター、または医薬組成物を、経腸、非経口、くも膜下腔内、大槽内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下、および経皮からなる群から選択された送達経路によって送達する、請求項46から51のいずれか一項に記載の方法。
- 合成遺伝子を静脈内で送達する、請求項46から51のいずれか一項に記載の方法。
- 合成遺伝子をCSF内で送達する、請求項46から51のいずれか一項に記載の方法。
- 対象において目的のタンパク質または核酸をコードしている内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンするステップをさらに含む、請求項46から54に記載の方法。
- 内在性遺伝子がMECP2である、請求項55に記載の方法。
- 対象の細胞中の内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンするステップと、内在性遺伝子によってコードされている目的のタンパク質または核酸をコードしている請求項1から14のいずれか一項に記載の合成遺伝子、請求項15もしくは16に記載のベクター、または請求項17に記載の医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップとを含む、対象において、内在性遺伝子の異常発現または内在性遺伝子によってコードされている突然変異タンパク質の発現に関連する疾患を処置する方法。
- 疾患が、レット症候群、MeCP2重複症候群、アンジェルマン症候群、dup15Q、DYRK1Aハプロ不全、ダウン症候群、MEF2Cハプロ不全症候群、dup5Q14.3、ソトス症候群、逆ソトス症候群、アルファ地中海貧血症X連鎖知的障害症候群、Xq13.2q21.1重複、コフィン−ローリー症候群、Xp22.12重複、ピット・ホプキンス症候群、モワット−ウィルソン症候群、2q22.3三重複、2q23.1重複、2q23.1微小欠失、FOXG1症候群、ウエスト症候群、巨大脳症−多小脳回−多指症−水頭症症候群、AKT3重複、デューズ症候群、SLC6A1重複、および/または18トリソミーである、請求項57に記載の方法。
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