KR20210039495A

KR20210039495A - 피드백이 가능한 합성 유전자, 표적 시드 매치 카세트, 및 그 용도

Info

Publication number: KR20210039495A
Application number: KR1020217008991A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 제임스 그레이; 사라 시네트
Original assignee: 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2021-04-09
Also published as: US20210170051A1; WO2020047234A9; BR112021003469A2; CA3110289A1; AU2019333140A1; JP2021534778A; IL280956A; MX2021002418A; SG11202102013XA; CN113056560A; EP3844277A4; WO2020047234A1; EP3844277A1

Abstract

본 발명은 용량 민감 지적 능력 장애와 같은 장애를 치료하기 위한 내인 조절이 가능한 표적 조직에 전이유전자 발현을 제공하는 목적을 위해 피드백이 가능한 합성 유전자, 폴리뉴클레오티드 표적 카세트, 벡터, 및 약학적 조성물뿐만 아니라 이를 제조하는 방법 및 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

피드백이 가능한 합성 유전자, 표적 시드 매치 카세트, 및 그 용도

우선권의 설명

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 근거하여 2018년 8월 30일에 제출된 미국 임시 출원 제62/725,126호 및 2019년 6월 13에 제출된 제62/861,044호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

서열목록의 전자 제출에 관한 설명

37 C.F.R. § 1.821에 따라 제출되고, 5470-844WO_ST25.txt라는 제목을 가지며, 크기가 17,375 바이트로, 2019년 8월 22일에 생성되어 EFS-Web을 통해 제출된 ASCII 텍스트 형식의 서열목록은 종이 사본 대신에 제공된다. 본 서열목록은 그 개시를 위한 명세서의 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

정부 지원의 설명

본 발명은 미국 국립보건연구원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인번호(grant number) 4T32HD040127-15에 따른 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.

본 발명의 분야

본 발명은 용량 민감 지적 능력 장애와 같은 장애를 치료하기 위해 내인 조절(endogenous regulation)이 가능한 표적 조직에 전이유전자 발현을 제공하기 위한 목적으로 피드백이 가능한 합성 유전자, 폴리뉴클레오티드 표적 카세트, 벡터 및 약학적 조성물뿐만 아니라 이를 제조하는 방법 및 이용하는 방법에 관한 것이다.

지적 장애로 특징되는 많은 신경발달장애는 엄격하게 규제되어야 하는 유전자의 돌연변이에 의해 매개된다 (표 1 참조). 내인성 유전자 산물의 발현은 알려진 및 아직 알려지지 않은 분자 기전(mechanism)을 통해 표적 및 비표적 조직 모두에서 신중하게 조절된다. 부적절한 또는 불완전한 조절을 가진 표적 조직의 유전자 치료 벡터에서 유전자 산물의 과다 및 과소발현에 대한 현재 유전자 치료법에는 부정적인 결과가 있다. 따라서, 당업계에서는 발현의 조절이 개선된 벡터에 대한 요구가 있다. 본 발명은 용량 민감 지적 능력 장애와 같은 장애 치료에 대해 내인 조절이 가능한 표적 조직에 전이유전자 발현을 제공하는 것을 목적으로 피드백이 가능한 합성 유전자, 폴리뉴클레오티드 표적 카세트, 벡터 및 약학적 조성물을 제공함으로써 당업계의 단점을 극복한다.

본 발명은 부분적으로 레트 증후군(Rett Syndrome, RTT)과 같은 용량 민감 지적 능력 장애와 같은 장애를 치료하기 위해 내인 조절이 가능한 표적 조직에 전이유전자 발현을 제공하기 위한 목적으로 피드백이 가능한 합성 유전자(feedback-enabled synthetic gene), 폴리뉴클레오티드 표적 카세트, 벡터 및 약학적 조성물의 개발에 기초한다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 관심 있는 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역(coding region)과 하나 이상의 조절 영역(regulatory region)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자(synthetic gene)에 관한 것으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 내인성 miRNA에 대한 결합 부위로 확인된 시드 매치(seed match) 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 인접 서열(flanking sequence) 및 3' 인접 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 핵산 분절(nucleic acid segment)을 더 포함하며, 상기 하나 이상의 핵산 분절은, 상기 합성 유전자가 내인성 miRNA를 발현하는 세포에 전달될 때의 상기 관심 단백질 또는 핵산의 발현이 상기 하나 이상의 핵산 분절을 포함하지 않는 합성 유전자가 내인성 miRNA를 발현하는 세포에 전달될 때의 관심 단백질 또는 핵산의 발현과 비교하여 감소되도록 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역에 삽입된다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명의 합성 유전자를 포함하는 벡터 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 합성 유전자에 용량 의존적 억제 피드백(dose dependent inhibitory feedback)을 제공하기 위한 폴리뉴클레오티드 표적 카세트에 관한 것이다.

추가 양태는 합성 유전자의 조절 영역 안에 폴리뉴클레오티드 표적 카세트를 삽입하는 단계를 포함하는 합성 유전자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 합성 유전자의 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 삽입하는 단계를 포함하는 합성 유전자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 시드 매치 및 인접 서열을 식별하는 단계, 및 합성 유전자의 조절 영역 안에 상기 시드 매치 및 인접 서열을 삽입하는 단계를 포함하는 합성 유전자에 삽입되는 하나 이상의 시드 매치 및 인접 서열을 식별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가 양태는 개체에게 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체에 합성 유전자를 전달하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 또는 약학적 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료하는 단계를 포함하는 내인성 유전자의 비정상 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 개체의 세포에 내인성 유전자를 유전학적으로(genetically) 녹다운하는 단계, 및 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 또는 약학적 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료하는 단계를 포함하는 개체에서 내인성 유전자의 비정상 발현 또는 내인성 유전자에 의해 암호화된 돌연변이 단백질의 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 및 다른 양태는 하기 본 발명의 설명에서 보다 자세하게 제시한다.

도 1은 MeCP2 유도(driven) miRNA가 외인성 MeCP2의 독성 과발현을 어떻게 약화할 수 있는지를 설명하는 피드백 루프를 보여준다.
도 2 (도 2a 및 도 2b)는 시료 마이크로어레이 데이터를 보여준다. 선택된 데이터는 야생형(wild-type, WT) 대(versus) MeCP2-결손(null) 조직의 miRNA 발현 수준을 정량화한다.
도 3은 (식염수 처리 KO 마우스와 비교하여) 식염수 처리 WT 마우스에서 평균 발현 수준이 증가된 miRNA를 보여준다. (3개의 조직 유형 중 최소 1개에서) 발현이 통계적으로 유의하게 증가한 miRNA는 (*)로 표시된다. (모든 조직에서) AAV9/EGFP에 반응하여 상향조절된 거짓 양성 적중도(false positive hit)는 (**)로 표시된다. 생물학적 시료당 선별 반복실험(screening replicate) n=2, 처리군당 마우스 n=3.
도 4는 내인성 MeCP2 발현과 관련된 경부 척수(cervical cord, CC) 또는 연수(medulla)에서 발현이 증가된 miRNA를 보여준다. 각 데이터 포인트(data point)는 단일 마우스에 대해 2회 선별 반복실험한 평균이다. 서로 다른 군에서 유의하게 차이가 있는 군은 빨간색 상자로 표시된다. 처리군당 마우스 n=3.
도 5는 (식염수 처리 KO 마우스와 비교하여) AAV/MECP2 처리 KO 마우스에서 평균 발현 수준이 증가된 miRNA를 보여준다. (3개의 조직 유형 중 최소 1개에서) 발현이 통계적으로 유의하게 증가한 miRNA는 (*)로 표시된다. (모든 조직에서) AAV9/EGFP에 반응하여 상향조절된 거짓 양성 적중도는 (**)로 표시된다. 생물학적 시료당 선별 반복실험 n=2, 처리군당 마우스 n=3.
도 6은 (식염수 처리 WT 마우스와 비교하여) AAV/MECP2 처리 WT 마우스에서 평균 발현 수준이 증가된 miRNA를 보여준다. (3개의 조직 유형 중 최소 1개에서) 발현이 통계적으로 유의하게 증가한 miRNA는 (*)로 표시된다. (모든 조직에서) AAV9/EGFP에 반응하여 상향조절된 거짓 양성 적중도는 (**)로 표시된다. 생물학적 시료당 선별 반복실험 n=2, 처리군당 마우스 n=3.
도 7은 WT 또는 KO 마우스에서 외인성 MeCP2 발현과 관련하여 발현이 증가된 miRNA를 보여준다.
도 8은 "V2" 바이러스 게놈 내 mir-494-3p 표적의 삽입이 (MeCP2-결손 세포 vs.) MeCP2-EGFP(+) 세포에서 외인성 MeCP2 발현을 (유의하지 않게) 감소시킨다는 것을 보여준다. 2016년 예비 연구(pilot study)에서 miR-494-3p가 양성 적중도로 확인된 후, 3개의 연쇄(tandem) 표적은 (miR-132, miR-19 및 miR-22에 대한 표적이 제거된) MeP426-hMECP2-myc-RDH1pA 바이러스 게놈의 3'UTR에 삽입되었다. 변형된 바이러스 게놈은 AAV9 (AAV9/V2-T1) 안에 패키지되어(packaged) 모자이크 MECP2EGFP-융합/결손(fusion/null) 마우스에 주입되었다. 전이유전자 발현은 이웃한 결손 세포에서 관찰된 것과 비교하여 MeCP2-EGFP(+) 세포에서 약간 감소되었다.
도 9는 응집된(aggregated) MECP2 발현과 관련하여 상향조절된 miRNA를 보여준다. MECP2(-) 군은 식염수 및 AAV9/EGFP 처리 KO 마우스에 대한 데이터 포인트를 보여준다. MECP2(+) 군은 식염수, AAV9/MECP2 및 AAV9/EGFP 처리 WT 마우스뿐만 아니라 AAV9/MECP2 처리 KO 마우스에 대한 데이터 포인트를 보여준다. 상자는 유의한 차이를 나타낸다.
도 10 (도 10a 및 도 10b) 패널 A-E는 RTT 특이 패널 reg1이 WT 푸르키네 세포(Purkinje cell)에서 총 MeCP2 발현을 어떻게 엄격하게 조절하는지를 보여준다. 푸르키네 세포는 수조내 주입 부위(intracisternal injection site)와 가까운 곳에 위치하며 초생리적인 전이유전자(supraphysiological transgene)를 발현하기 쉽다. 각 핵에 대해 수정된 총 세포 형광 (항-MeCP2 신호)은 myc(-) 푸르키네 핵에 대한 평균 MeCP2 신호로 정규화되었다(normalized). 패널 A의 각 마우스에 대해 나타낸 평균은 특정 숙주에 대해 정량화된 모든 myc(+) 핵에 대한 평균화된 정규화 MeCP2 신호를 나타낸다. Z 스택(Z-stack) 내 세포에 대해 반복적으로 평균화한 다음, 단일 마우스 내 Z 스택에 대해서도 반복적으로 평균화하여 총 MeCP2 발현에서 유의한 감소를 보였다. 패널 A 및 B는 공지된 대조구(control) (AAV9/MeP426-miniMECP2-myc-RDH1pA; Gadalla et al., 2017)를 처리한 후 형질도입된 푸르키네 세포의 평균 총 Mecp2 발현 (mini + 내인성 전체 길이)이 비도입된 푸르키네 세포의 5배임을 보여준다. (miR-124-3p에 대한 3개의 표적을 나타내는) 신경 녹다운에 대한 양성 대조구 패널은 과발현이 절반으로 감소하였다 (p = 0.06). reg1 카세트 또한 과발현이 절반으로 감소하였다 (p = 0.02). 패널 C는 총 MeCP2 강도의 히스토그램을 보여주며, reg1이 총 MeCP2 강도의 분포를 좁히고, 보다 강력한 조절을 나타냄을 보여준다. 패널 D는 국소 형질도입 효율 대 형질도입된 푸르키네 세포의 평균 총 MeCP2 강도를 보여주며, 각 데이터 포인트는 단일 Z 스택 내의 푸르키네 세포에 대한 평균 강도 및 형질도입 효율을 나타낸다. 추세선(trendline)은 단일 마우스의 Z 스택을 연결한다. reg1 카세트는 높은 형질도입 효율을 가진 소뇌(cerebellum) 영역에서도 총 MeCP2 발현을 제한한다. 대조적으로, 음성 대조구 패널은 높은 국소 형질도입 효율을 가진 영역에서 생리적인 수준을 크게 초과하는 총 MeCP2 발현을 허용한다. 패널 E는 reg1 카세트가 NeuN+ 세포에서 전이유전자 발현을 허용함을 보여준다. 대조적으로, 신경 녹다운에 대한 양성 대조구는 NeuN+ 세포의 백분율을 감소시킨다. 데이터는 평균 ± SEM이다.
도 11은 이형접합(heterozygous) 모자이크 암컷 마우스에 AAV9/mini-MECP2-reg1를 수조내 투여한 후 reg1이 간 전이유전자 발현을 감소시키는 것을 나타내는 예비 데이터를 보여준다. 나타낸 모든 이미지에서 동일한 이득 설정(gain setting)이 사용되었다. 스케일 바(scale bar)는 20 μm을 표시한다. 각 사분면은 ID 번호 (ID#)로 표시되는 하나의 마우스를 나타낸다.
도 12는 RTT 특이 패널 ("reg1"로 표시함) 및 광범위하게 적용 가능한 패널 ("reg2" 또는 "UNIVT"로 표시함)을 설계하기 위한 전략을 요약한다. 패널 A는 생체내 외인성 MeCP2 발현을 안전하게 조절하기 위해 RTT 특이 표적 패널을 설계하는데 사용된 발현 데이터를 보여준다. 동일한 발현 데이터는 패널 B에 나타낸 바와 같이, reg2를 설계하는 목적으로 UTR 데이터 세트를 가공하기 위한 선택 기준(selection criteria)을 제공하였다. 패널 C-G는 2491명의 인간 표적 목록을 reg2로 특징된 6개의 보존 표적(conserved target)으로 좁히는데 사용되는 단계를 보여준다. 이러한 표적들 중 5개는 MeCP2 유도 miRNA에 결합하는 것으로 예측된다 (표 1 참조). 많은 let-7 miRNA 시드를 가지는 let-7 표적 염기쌍 때문에 reg2 패널은 최대 11개의 miRNA와 결합할 수 있다.
도 13은 PHP.B 매개 miniMECP2 유전자를 전달한 후 reg2가 WT 뇌에서 전이유전자 발현 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도면에 표시된 머리글자(acronym)는 CA1-3, 해마 영역(regions of hippocampus); CTX, 피질(cortex); MID, 중간뇌(midbrain); SUB, 지지물(subiculum); TH, 시상(thalamus)을 포함한다. 실험 이미지에 대한 이득 설정은 대조구 이미지와 일치되었다. 각 사분면은 ID 번호 (ID#)로 표시되는 하나의 마우스를 나타낸다.
도 14는 대표적인 소뇌 타일 스캔에서 푸르키네 세포의 miniMeCP2 발현에 대한 reg2 의존적 억제를 보여준다. 왼쪽에서 (대조구: (-reg2)), 화살표는 대조구 벡터 처리 마우스의 여러 소뇌엽에서 myc(+) 푸르키네 신경을 나타낸다. reg2 처리 마우스에서, 대부분의 푸르키네 세포는 myc(-) 이었다. 오른쪽에서 (실험구: (+reg2)), 화살표는 전정소뇌 영역으로 제한된 miniMeCP2 발현을 나타낸다. reg2 처리 마우스는 (전정소뇌 영역으로 제한된) myc(+) 0% 또는 myc(+) 100%인 푸르키네 세포 층의 넓은 구획을 가지기 때문에 이웃한 myc(+) 및 myc(-) 푸르키네 세포의 총 MeCP2 발현에 대한 정량 분석은 권고되지 않았다. 각 2x2 타일 스캔은 하나의 마우스를 나타낸다.
도 15A-15C (도 15a 및 도 15b)는 reg2가 다중 뇌 영역에서 광범위하게 허용되지만, 발현이 엄격하게 제어된다는 것을 보여준다. 이미지는 도 13에 나타낸 것에 비해 더 높은 배율에서 보여준다. (A) reg2 처리 마우스에 대해 표시된 myc(+) 세포의 백분율은 실제 형질도입된 세포의 백분율을 과소평가한 가능성이 있으며, 많은 myc(+) 세포에 대한 항-myc 면역형광 신호가 검출 한계를 겨우 넘었다. 조사된 3개의 영역 중 해마는 (reg2 vs. 대조구 처리 마우스) myc (+) 세포 %에서 가장 급격한 감소를 보여주었다. 도 15A에서 나타낸 범례(legend)는 또한 도 15C 및 도 16에 적용된다. 도 15B는 시상, 해마 및 연수에 대한 대표적인 이미지를 보여준다. 항-myc 신호를 쉽게 볼 수 있도록 reg2 이미지에 대한 이득 설정을 조작하였다. 도 15C는 Reg2가 시상의 겉보기 신경 친화성을 강화한다는 것을 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 스케일 바는 20 μm를 표시한다. *p ≤0.05.
도 16은 reg2가 간에서 miniMeCP2 조절을 개선할 수 있음을 보여준다. 도면은 대표 이미지를 보여주기보다는, 마우스에 대한 myc(+) 간세포 %의 변동성(variability)을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM이다. p > 0.05. 왼쪽 막대 그래프 군은 도 15A에 설명된 바와 같은 도면 범례에 해당한다.
도 17은 식염수 및 바이러스 처리 KO 마우스에 대한 예비 생존 데이터를 보여준다. 마우스는 생후 4~5주에 수조내 주입되었다. reg2가 전이유전자 발현에 강한 억제 효과를 가졌지만, reg2는 PHP.B/miniMECP2 (1E11 vg/마우스)에 의해 매개된 중간 생존의 확장을 약화하는 것으로 나타나지 않았다. 또한, reg2 처리는 조기 사망이 더 적었다. 각 코호트(cohort)에서 여전히 살아있는 마우스의 수를 표시한다. 처리된 마우스의 정상 뒷다리의 해당 백분율은 표 6에 작성된다.

본 발명은 아래에서 더 자세히 설명된다. 본 설명은 본 발명이 구현될 수 있는 모든 다양한 방법, 또는 예시적인(instant) 발명에 추가될 수 있는 모든 특징에 대한 상세한 카탈로그(catalog)가 되도록 의도된 것이 아니다. 예를 들어, 일 구체예에 관하여 설명되는 특징들은 다른 구체예에 포함될 수 있으며, 특정 구체예에 관하여 설명되는 특징들은 그 구체예에서 삭제될 수 있다. 또한, 여기에 제시된 다양한 구체예에 대한 많은 변이와 추가는 예시적인 발명에서 벗어나지 않는 예시적인 개시에 비추어 볼 때 당업계 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 다음 명세서는 본 발명의 일부 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 그의 모든 치환(permutation), 조합 및 변이를 철저하게 명시하지 않는다.

문맥(context)을 달리 표시하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 다양한 특징이 모든 조합으로 사용될 수 있도록 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 구체예에서, 여기에 제시된 어떤 특징이나 특징들의 조합이 제외되거나 생략될 수 있다고 예상한다. 설명에서, 만약 명세서가 복합물(complex)이 구성요소 A, B 및 C를 포함한다고 명시하는 경우, A, B 또는 C, 또는 그의 조합 중 어느 하나가 생략될 수 있으며 하나 또는 모든 조합이 포기될 수 있도록 구체적으로 의도된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속한 기술분야에서 통상의 기술자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 여기 본 발명의 설명에서 사용된 전문용어는 특정 구체예만을 설명하기 위한 목적이며 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.

뉴클레오티드 서열은 구체적으로 달리 표시되지 않는 한, 왼쪽에서 오른쪽으로 5' - 3' 방향을 가지는 단일 가닥에 의해서만 본 명세서에 제시된다. 뉴클레오티드와 아미노산은 모두 37 C.F.R. §1.822 및 확립된 용법에 따라 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission), 또는 (아미노산의 경우) 1 문자 코드 또는 3 문자 코드에 의해 권장되는 방법으로 본 명세서에 표시된다.

달리 명시된 경우를 제외하고, 당업계 기술자에게 알려진 표준 방법은 재조합 및 합성 유전자, 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산, 핵산 서열의 조작, 형질절환된 세포의 생산, 벡터 구조체(vector construct)의 구축, 및 데이터세트의 생성 및 분석에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 당업계 기술자에게 알려져 있다. 예컨대, SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F. M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York) 참조.

본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 및 기타 참조는 전체 참조에 의해 포함된다.

정의

본 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥을 명확하게 달리 표시하지 않는 한, 복수형도 포함시키도록 의도된다.

본 명세서에서 사용된 "및/또는(and/or)"은 하나 이상의 관련 열거된 항목들의 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안적으로 해석할 때 조합의 결여 ("또는(or)")를 의미하고 포함한다.

“선택적인(optional)” 또는 “선택적으로(optionally)”는 후속적으로 기재된 사건(event)이나 상황(circumstance)이 발생할 수 있거나 발생할 수 없으며, 설명이 사건 또는 상황을 발생하는 경우와 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 또한 발명의 일부 구현에서, 여기에 제시된 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 생략될 수 있다고 생각한다.

또한, 본 발명의 화합물 또는 시약의 양, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에서 사용된 용어 “약(about)”은 특정 양의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 ± 0.1%의 변이를 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 전환구(transitional phrase) “필수적으로 이루어진(consisting essentially of)”은 기재된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 근본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 그러므로, 본 명세서에서 사용된 용어 “필수적으로 이루어진”은 “포함하는(comprising)”에 대응하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용된 용어 “필수적으로 이루어진(consists essentially of)” (및 문법적 변형)은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능이 물질적으로 변경되지 않도록 기재된 서열의 5' 및/또는 3' 또는 N-말단 및/또는 C-말단 또는 양 말단 (예컨대, 도메인들 사이) 사이에 기재된 서열 (예컨대, 서열번호) 및 총 10개 이하 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 추가 뉴클레오티드 또는 아미노산 모두로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 총 10개 이하의 추가 뉴클레오티드 또는 아미노산은 함께 추가된 추가 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 수를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 적용된 용어 “물질적으로 변경된(materially altered)”은 기재된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 발현 수준과 비교하여 약 50% 이상의 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 능력의 증가 또는 감소를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드에 적용된 용어 “물질적으로 변경된”은 기재된 서열로 이루어진 폴리펩티드의 활성과 비교하여 약 50% 이상의 생물학적 활성의 증가 또는 감소를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 당업계 표준 의미를 가진다. 당업계에 알려진 바와 같이, 많은 다양한 프로그램들이 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 알려진 서열과 서열 동일성 또는 유사성(similarity)을 가지는지를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 서열 동일성 또는 유사성은 국소 서열 동일성 알고리즘(local sequence identity algorithm) (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), 서열 동일성 정렬 알고리즘(sequence identity alignment algorithm) (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), 유사성 방법에 대한 연구(search for similarity method) (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), 알고리즘의 전산화 실행(computerized implementations of these algorithms) (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), 최적 맞춤 서열 프로그램(Best Fit sequence program) (Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387 (1984))을 포함하는 당업계에 알려진 표준 기술을 이용하여 결정될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게 기본 설정을 사용하거나, 또는 점검(inspection)된다.

유용한 알고리즘의 예로는 PILLEUP가 있다. PILLEUP는 진보적인 양방향 정렬(progressive, pairwise alignment)을 사용하여 관련 서열 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. PILLEUP는 또한 정렬을 생성하는데 사용되는 군집화 관계(clustering relationship)를 보여주는 트리(tree)를 구성할 수 있다. FILEUP는 진보적인 정렬 방법(progressive alignment method) (Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987))의 단순화를 사용하며, 상기 방법은 Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989)에 기재된 것과 유사하다.

유용한 알고리즘의 또 다른 예는 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)에 기재된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460 (1996); blast.wustl/edu/blast/README.html에서 입수한 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 여러 검색 매개변수(search parameter)를 사용하며, 이 매개변수는 기본값으로 설정하는 것이 바람직하다. 상기 매개변수는 동적 값이며 특정 관심 서열의 조성과 상기 관심 서열이 검색되는 특정 데이터베이스의 조성에 따라 프로그램 자체에 의해 설정되지만, 상기 값은 민감도를 높이기 위해 조정될 수 있다.

추가 유용한 알고리즘으로는 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)에 의해 보고된 gapped BLAST가 있다.

백분율 아미노산 서열 동일성 값(percentage amino acid sequence identity value)은 일치하는 동일한 잔기 수를 정렬된 영역 내 “더 긴(longer)” 서열의 총 잔기 수로 나눈 값에 의해 결정된다. 상기 "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 실제 가장 많은 잔기를 가지는 것이다 (정렬 점수(alignment score)를 최대화하기 위해 WU-BLAST-2에 의해 도입된 간격(gap)은 무시된다).

유사한 방법으로, 백분율 핵산 서열 동일성은 본 명세서에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다.

상기 정렬은 정렬될 서열 내에 간격 도입이 포함될 수 있다. 또한, 본 명세서에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드보다 뉴클레오티드를 더 많이 또는 더 적게 포함하는 서열의 경우, 일 구체예에서, 서열 동일성의 백분율은 총 뉴클레오티드 수와 관련하여 동일한 뉴클레오티드 수에 기초하여 결정될 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서에 구체적으로 개시된 서열보다 더 짧은 서열의 서열 동일성은 일 구체예에서, 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 수를 사용하여 결정될 것이다. 백분율 동일성 계산(percent identity calculation)에서, 상대 가중치(relative weight)는 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitution) 등과 같은 서열 변이의 다양한 표현에 할당되지 않는다.

일 구체예에서, 오직 동일성만이 양성적으로 (+1) 점수가 매겨지며 간격을 포함하는 서열 변이의 모든 형태는 “O” 값이 할당되며, 서열 유사성 계산(sequence similarity calculation)을 위해 아래에 설명한 바와 같은 가중된 규모(weighted scale) 또는 매개변수에 대한 요구를 제거한다. 백분율 서열 상동성(percent sequence identity)은 예를 들어, 일치하는 동일한 잔기 수를 정렬된 영역 내 “더 짧은(shorter)” 서열의 총 잔기 수로 나누고 100을 곱하여 계산될 수 있다. 상기 “더 긴” 서열은 정렬된 영역에서 실제 가장 많은 잔기를 가지는 것이다.

본 명세서 사용된 “분리된(isolated)” 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 (예컨대, “분리된 DNA” 또는 "분리된 RNA")은 최소 자연적으로 발생한 유기체 또는 바이러스의 다른 성분의 일부로부터 분리되거나 상당히 자유로운 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 예를 들어, 세포나 바이러스 구조적 성분 또는 다른 폴리펩티드나 핵산은 흔히 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 관련되어 발견되었다.

마찬가지로, "분리된(isolated)" 폴리펩티드는 최소 자연적으로 발생한 유기체 또는 바이러스의 다른 성분의 일부로부터 분리되거나 상당히 자유로운 폴리펩티드를 의미하며, 예를 들어, 세포나 바이러스 구조적 성분 또는 다른 폴리펩티드나 핵산은 흔히 폴리펩티드와 관련되어 발견되었다.

용어 “내인성(endogenous)”은 도입 성분, 즉 "외인성(exogenous)" 성분과 구별되어 환경에서 자연적으로 발견되는 성분, 즉 유전자, 핵산, miRNA, 단백질, 세포, 또는 기타 자연 성분을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “이종(heterologous)”은 외래 종으로부터 또는 동일한 종으로부터 유래한 뉴클레오티드/폴리펩티드를 의미하며, 의도적인 인간 간섭에 의해 조성물(composition) 및/또는 유전자 좌위(genomic locus) 내 그의 자연적인 형태로부터 상당히 변형된다.

본 명세서에서 사용된 용어 “핵산(nucleic acid)”은 5'에서 3' 말단까지 해독되는 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체(polymer)를 의미한다. 상기 "핵산"은 또한 선택적으로 비자연적으로 발생하거나 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 용어 “뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)” 또는 “핵산 서열(nucleotide sequence)”은 개별적인 단일 가닥이거나 이중 가닥인 핵산의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 가닥 모두를 의미한다. 용어 “리보뉴클레오티드(ribonucleic acid, RNA)”는 RNAi (억제성(inhibitory) RNA), dsRNA (이중 가닥(double stranded) RNA), siRNA (소간섭(small interfering) RNA), shRNA (짧은(short)/짧은 헤어핀(small hairpin) RNA), mRNA (메신저(messenger) RNA), miRNA (마이크로(micro)-RNA), tRNA (운반(transfer) RNA, 해당 아실화 아미노산이 충전되거나 방출되는지 여부), lncRNA (긴 비번역(long non-coding) RNA), rRNA (리보솜(ribosomal) RNA), snRNA (소핵(small nuclear) RNA), snoRNA (소핵소체(small nucleolar) RNA) 및 cRNA (상보성(complementary) RNA)를 포함하며, 용어 “데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA)”은 cDNA, 게놈(genomic) DNA 및 DNA-RNA 하이브리드(hybrid)를 포함한다.

MicroRNA는 miRNA 유전자에 의해 암호화된 1차 miRNA(primary miRNA, pri-miRNA) 전사체(transcript)에서 유래한 비번역 소형(noncoding small) RNA의 일종이다. 상기 pri-miRNA 전사체는 더 작은 19~24개의 뉴클레오티드 RNA로 가공되며, 예를 들어, 번역 억제(translational inhibition)나 분열(cleavage)에 의해 매개되는 침묵 반응(silencing reaction)을 통해 유전자 발현을 조절할 수 있다.

용어 “핵산 분절(nucleic acid segment)”, “핵산 서열(nucleotide sequence)”, 또는 더 일반적인 “분절(segment)” 은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 발현하거나 발현하기 위해 조정될 수 있는 게놈 서열, 리보솜 RNA 서열, 운반 RNA 서열, 메신저 RNA 서열, 작은 조절(small regulatory) RNA 서열, 오페론(operon) 서열 및 더 작게 조작된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기능 용어로 당업계 기술자에 의해 이해될 것이다. 본 개시의 핵산은 당업계에 알려진 방법에 의해 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 따라서, 본 개시의 핵산 전체 또는 일부는 선택된 숙주에 의해 선호되는 코돈(codon)을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 종 선호 코돈(species-preferred codon)은 특정 숙주 종(specie)에서 발현되는 단백질에 가장 흔히 사용되는 코돈으로부터 결정될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 다른 변형은 돌연변이가 활성을 약간 변화시키는 결과를 야기할 수 있다.

핵산에 관하여 본 명세서에서 사용된 용어 “단편(fragment)”은 참조 핵산에 비해 길이가 감소되고, 참조 핵산의 해당 부분과 동일하거나 거의 동일한 (예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어지거나 및/또는 이루어진 것을 포함하는 핵산을 의미한다. 이러한 핵산 단편은 적절한 위치에서(where appropriate), 그 구성성분인 더 긴 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 핵산 단편은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 필수적으로 이루어지거나 이루어진 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 핵산 단편은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개 미만의 연속적인 뉴클레오티드로 필수적으로 이루어지거나 이루어진 것을 포함한다.

폴리펩티드에 관하여 본 명세서 사용된 용어 “단편(fragment)”은 참조 폴리펩티드에 비해 길이가 감소되고, 참조 폴리펩티드의 해당 부분과 동일하거나 거의 동일한 (예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 연속 아미노산의 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지거나 및/또는 이루어진 것을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 폴리펩티드 단편은 적절한 위치에서, 그 구성성분인 더 긴 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 일부 구체예서, 상기 폴리펩티드 단편은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 이상의 더 연속적인 아미노산으로 필수적으로 이루어지거나 이루어진 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드 단편은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500개 미만의 연속적인 아미노산으로 필수적으로 이루어지거나 이루어진 것을 포함한다.

핵산에 관하여 본 명세서에서 사용된 “기능적인 단편(functional fragment)” 또는 “활성 단편(active fragment)”은 폴리펩티드의 기능적인 단편을 암호화하는 핵산을 의미한다.

폴리펩티드에 관하여 본 명세서에서 사용된 “기능적인 단편” 또는 “활성 단편”은 전체 길이 폴리펩티드(full-length polypeptide) 중 최소 하나의 생물학적 활성 (예컨대. 유전자 발현을 상향 또는 하향조절하는 능력)을 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상 유지하는 폴리펩티드 단편을 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 기능적인 단편은 실제로 전체 길이 폴리펩티드의 최소 하나의 생물학적 활성의 더 높은 수준을 가진다.

본 명세서에서 사용된, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용되는 용어 “변형된(modified)”은 하나 이상의 결실, 삽입, 치환, 또는 그의 조합으로 인해 야생형(wild-type) 서열과 다른 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 바이러스 벡터를 "분리(isolate)" 또는 "정제(purify)" (또는 문법적 등가물) 함으로써는 바이러스 벡터가 최소 출발 물질에 있는 다른 성분들 중 일부로부터 최소 부분적으로 분리된 것을 의미한다.

용어 “강화(enhance)” 및 ”증가(increase)”는 최소 약 1.25배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 8배, 10배, 20배, 또는 50배까지 특정 매개변수의 증가를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “억제(inhibit)” 및 “감소(reduce)” 또는 그의 문법적 변형체(grammatical variation)는 약 15%, 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% 이상의 특정 수준 또는 활성에서 감소 또는 축소를 의미한다. 특정 구체예에서, 억제(inhibition) 또는 감소(reduction)는 거의 또는 필수적으로 감지할 수 없는 활성 (기껏해야 사소한 양, 예컨대 약 10% 또는 5% 미만)을 야기한다.

본 명세서에서 사용된 “발현(expression)”은 폴리뉴클레오티드가 (mRNA 또는 다른 RNA 전사체와 같은) DNA 주형(template)으로부터 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 전사체는 "전사 산물(transcription product)”로 의미될 수 있으며, 암호화된 폴리펩티드는 “번역 산물(translation product)”로 의미될 수 있다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 공통적으로 “유전자 산물(gene product)”로 의미될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵세포에서 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 포함할 수 있다. 발현 산물 자체, 예컨대, 핵산 또는 단백질의 결과물은 "발현된다(expressed)"라고도 말할 수 있다. 발현 산물은 세포내(intracellular), 세포외(extracellular) 또는 분비된(secreted)으로 특징될 수 있다. 용어 "세포내"는 세포 안에 있는 것을 의미한다. 용어 "세포외"는 세포 밖에 있는 것을 의미한다. 물질이 세포 어딘가 또는 내부로부터 세포 외부에 상당한 크기로 나타날 경우, 물질은 세포에 의해 “분비된다(secreted)”.

본 명세서에서 사용된 용어 “합성 유전자(synthetic gene)”는 의도적인 인간 설계에 의해 비자연적으로 생성된 핵산 서열을 의미하며, 상기 합성 유전자는 다른 성분들 중 관심 단백질 또는 핵산에 대한 암호 영역, 및 상기 암호 영역의 발현을 위한 조절 영역을 포함한다. 상기 합성 유전자의 구조적 및 기능적 성분은 다른 및/또는 복수의 근원 물질(source material)로부터 포함될 수 있다. 상기 합성 유전자는 개체에게 외인적으로 전달될 수 있으며, 대응되는 내인성 유전자와 비교하여 외인성이 될 수 있다. 세포에서 발현될 때, 합성 유전자 산물은 합성 산물 (예컨대, "합성 RNA(synthetic RNA)" 또는 "합성 폴리펩티드(synthetic polypeptide)")로 의미될 수 있다. 특정 조건 하에서, 상기 합성 유전자는 또한 상호교환적으로 "전이유전자(transgene)"로 의미될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “트랜스제닉(transgenic)” 또는 “전이유전자(transgene)”는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 유전자에 대해 기능적인 암호 영역을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 외인성 핵산은 게놈 내에 안정적으로 통합되어, 폴리뉴클레오티드가 연속적인 세포 분열로 전달될 수 있다. 상기 외인성 핵산은 게놈에 단독으로 또는 재조합 발현 카세트의 일부로 통합될 수 있다. "트랜스제닉"은 외인성 핵산의 존재에 의해 변형된 유전자형(genotype)을 가진 모든 물질(substrate)을 지정하는데 사용될 수 있다.

용어 “피드백(feedback)”은 동일한 물질에 의해 수행된 일부 결과, 효과, 또는 기능의 결과로서 물질에 제공되는 분자 암호화된 정보를 의미한다. 상기 물질은 유전자 또는 RNA 및 단백질과 같은 유전자의 전사 또는 번역 산물을 포함하는 모든 유형의 미세(micro) 또는 거대(macro) 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용어 “피드백 루프(feedback loop)”는 기능, 효과, 및/또는 결과의 정보가 수신 출처(receiving source)로 반환되기 때문에 기능, 효과, 및/또는 결과를 수행하는 분자의 루프(loop)를 의미한다. 예를 들어, 유전자 (예컨대, MECP2) 발현의 기능, 효과, 및/또는 결과는 상기 유전자에서 유래된 mRNA에 miRNA의 결합을 통해 피드백을 얻을 수 있는데, 이때 상기 miRNA는 그 유전자 발현의 기능, 효과, 및/또는 결과로 인해 발현되었다. 피드백 루프는 억제성(inhibitory)/음성(negative) (즉, 추가 기능, 효과, 및/또는 결과의 지속을 억제함), 또는 양성(positive) (지속 강화)일 수 있다. 피드백을 받을 수 있는 물질은 "피드백이 가능하다(feedback-enabled)"라고 한다. 유전자의 핵산이거나 전사 또는 번역 산물의 발현 수준 및/또는 기능에 따라 억제 및/또는 강화의 강도에 가변적인 피드백은 "용량 의존(dose dependent)" 피드백 및/또는 "용량 의존 피드백 루프(dose dependent feedback loop)"라고 할 수 있다.

용어 “폴리펩티드(polypeptide)”, “펩티드(peptide)” 및 “단백질(protein)”은 모든 길이의 아미노산 중합체를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 “핵산(nucleic acid)”, “핵산 서열(nucleic acid sequence)”, 및 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 모든 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열", "핵산 분자" 및 "핵산 단편"은 단일 또는 이중 가닥인 RNA, DNA, 또는 RNA 및 DNA의 중합체를 의미하며, 선택적으로 합성, 비자연 및/또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “관심 유전자(gene of interest)”, "관심 핵산(nucleic acid of interest)" 및/또는 "관심 단백질(protein of interest)"은 특정 문맥 조건 하에서 원하는 유전자/핵산/단백질을 의미한다.

용어 “조절 요소(regulatory element)”는 핵산 서열의 발현에 대한 일부 양태를 조절하는 유전적인 요소를 의미한다. 예를 들어, 프로모터(promoter)는 작동 가능한 암호 영역의 전사 개시를 촉진하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소로는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화(polyadenylation) 신호, 종료(termination) 신호 등이 있다. 하나 이상의 조절 요소가 발견되는 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드의 상기 영역은 "조절 영역"으로 의미된다.

본 명세서에서 사용된 용어 암호 영역(coding region)은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예컨대 유전자를 의미한다.

핵산에 관하여 본 명세서에서 사용된 용어 “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 두 개 이상의 핵산 사이의 기능적 연결을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 서열은 상기 프로모터 서열이 이종 핵산 서열의 전사를 시작 및/또는 매개하기 때문에 이종 핵산 서열과 "작동 가능하게 연결된” 것으로 설명될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 작동 가능하게 연결된 핵산 서열은 연속적이며, 및/또는 동일한 해독 프레임(reading frame) 안에 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “결합 위치(binding site)”는 성분들을 결합하기 위한 위치 역할을 하는 일반적인 구조적 특징을 의미한다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 적용된 용어 “결합 위치”는 1차, 2차, 또는 3차 구조의 특정 모티브(motif)의 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 여기서 모티브는 다른 핵산이나 단백질을 포함할 수 있는 상호작용 분자(interacting molecule)의 결합 위치를 제공한다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질에 적용된 용어 “결합 위치”는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 구조의 특정 모티브의 아미노산 서열을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 여기서 모티브는 다른 핵산이나 단백질을 포함할 수 있는 상호작용 분자의 결합 위치를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “시드 매치(seed match)”는 경험적으로 상기 시드 매치를 포함하는 해당 mRNA에 대한 miRNA 종(specie)에 의해 인식하며 상보적 결합(complementary binding)을 하기 위해 적절한 표적 뉴클레오티드 서열이 될 것으로 확인되는, 검증되는, 또는 추정하여 예측되는 더 긴 내인성 mRNA 서열 내 뉴클레오티드의 하위집단(subset)을 구체적으로 의미한다. 용어 “시드(seed)” 또는 “시드 영역(seed region)”은 경험적으로 상기 miRNA 종에 의해 mRNA 종의 표적 시드 매치의 인식 및 이와 상보적 결합을 하기 위해 적절한 뉴클레오티드 서열이 될 것으로 확인되는, 검증되는, 또는 추정하여 예측되는 더 긴 내인성 mRNA 서열 내의 뉴클레오티드의 하위집단을 의미한다. 일반적으로, mRNA의 시드 매치는 각각의 3 프라임 비번역 영역(3 prime (3') untranslated region, 3' UTR) 내에서 암호화되지만, 다른 위치에 존재할 수 있다. "검증된(validated)" 또는 "경험적으로 확인된(empirically identified)" 시드 매치는 현재 당업계에 알려진 시드 매치로 정의되며, 미래에도 동일하다. "추정(putative)" 또는 "예측되는(predicted)" 시드 매치는 아직 경험적으로 알려지거나 정의되지 않은 시드 매치로 정의된다.

용어 “5 프라임 인접 서열(5 prime (5') flanking sequence)” 및/또는 “3' 인접 서열”은 근원 서열(source sequence) 내 관심 서열의 말단 (즉, 5' 인접 말단 및/또는 3' 인접 말단)에 특정 서열 (예컨대, 시드 매치)이 바로 인접하여 (즉, “이웃한(neighboring)”) 발견되는 서열 내 뉴클레오티드의 하위집단을 의미한다. 일부 경우에서, 5' 인접 서열은 일치하는 miRNA에 추가적인 왓슨-크릭(Watson-Crick, WC) 상보적 결합을 제공할 수 있다. 5' 및 3' 인접 서열은 함께, 이웃한 시드 매치에 두 개 이상의 miRNA가 결합함으로써 협동적인 억압(cooperative repression)을 촉진할 수 있는 내부 시드 매치 스플라이싱(inter-seed match spacing)에 기여한다 (Grimson et al., 2007). 5' 및 3' 인접 서열은 효과적인 시드 매치와 관련이 있는 높은 % 아데닐레이트-우리딜레이트(adenylate-uridylate, AU) 뉴클레오티드 컨텍스트(context)를 제공할 수 있다 (Grimson et al., 2007).

용어 "3' UTR”은 번역 종결 코돈이 바로 이어지는 mRNA의 부분을 의미한다. 일반적으로, mRNA 분자는 DNA 서열로부터 전사되어 나중에 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역된다. 상기 mRNA 분자의 여러 서열 영역은 단백질로 번역되지 않으며, 5' 캡(cap), 5' 비번역 영역(5' untranslated region, 5' UTR), 3' UTR, 및 polyA 꼬리(polyadenylation tail)를 포함한다. 일반적으로, 3' UTR은 유전자 발현 후 전사적으로(gene expression post-transcriptionally) 영향을 미칠 수 있는 조절 영역을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자 용량 민감(gene-dose sensitive)” 또는 "용량 민감(dose sensitive)” 장애는 시작, 발현(presentation), 진행, 증상, 표현형 또는 다른 관련 현상이 가변적이며, 질병 또는 장애의 시작, 발현, 진행, 증상, 표현형 또는 다른 관련 현상에 관련이 있는 유전자의 핵산 (예컨대, 유전자) 또는 전사 또는 번역 산물 (예컨대, RNA 종 또는 단백질)의 상대적인 기능적 발현 수준과 일치하는 질병 또는 장애를 의미한다. 예를 들어, 특정 유전자의 다른 발현 수준에 따라 그 표현형이 변화한다면, 장애는 용량 민감으로 설명될 수 있다. 또 다른 예를 들면, 장애는 유전자가 변이되어 장애의 시작, 발현, 진행, 증상, 표현형 또는 다른 관련 현상에 영향을 미치는 저기능성 또는 과기능성 단백질(hypo- or hyper-functioning protein)을 생성할 때 용량 민감이라고 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “지적 능력 장애(intellectual ability disorder)”는 개체의 신경발달 지적 기능, 정신 능력, 인지 능력, 및/또는 적응 기능에 영향을 미치는 질병, 장애, 또는 장애(disability)의 집단을 의미하며, 즉 개체의 “지적 능력”은 추론, 계획, 사고 및 의사 소통 능력을 포함한다. 용어 "지적 능력 장애"는 "지적 장애(intellectual disability)"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 지적 능력 장애와 함께 나타날 수 있는 다른 증상으로는 언어 이상, 발작, 소두증, 근긴장 저하, 이 갈기, 및/또는 상동증을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 시작, 발현, 진행, 증상, 표현형 또는 다른 관련 현상이 다른 지적 능력 장애는 “용량 민감 지적 능력 장애(dose sensitive intellectual ability disorder)”로 의미될 수 있으며, 그 원인 유전자는 “지적 능력을 매개하는 용량 민감 유전자(dose-sensitive genes that mediate intellectual ability)”로 의미될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “표적 조직(target tissue)” 및 “비표적 조직(off-target tissue)”은 관심 특정 핵산 또는 단백질이 발현되는 개체의 신체 영역, 장기, 조직, 구조물(structure) 및/또는 세포를 의미한다. "표적 조직"은 일반적인 건강한 및/또는 질병이 있는 상태 하에서 관심 내인성 핵산 또는 단백질이 발현되는 개체의 신체 영역, 장기, 조직, 구조물 및/또는 세포를 의미한다. “비표적 조직”은 일반적인 건강한 및/또는 질병이 있는 상태 하에서 관심 내인성 핵산 또는 단백질이 발현되지 않는 개체의 신체 영역, 장기, 조직, 구조물 및/또는 세포를 의미한다.

“벡터(vector)”는 복제 및/또는 발현될 수 있는 또 다른 세포 내로 외부 유전 물질을 운반하기 위한 수단(vehicle)으로 사용되는 혼합물(compound)을 의미한다. 외부 핵산을 포함하는 복제 벡터(cloning vector)는 재조합 벡터라고 불린다. 핵산 벡터의 예로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 발현 카세트, 및 인공 염색체가 있다. 재조합 벡터는 일반적으로 복제의 기원, 다중 복제 사이트, 및 선택 가능한 마커를 포함한다. 핵산 서열은 일반적으로 삽입물(insert) (재조합 핵산 또는 전이유전자)과 벡터의 “백본(backbone)”으로 제공하는 더 긴 서열로 구성된다. 유전 정보를 다른 세포로 전달하는 벡터의 목적은 일반적으로 표적 세포에서 삽입물을 분리, 증식, 또는 발현하기 위한 것이다. 발현 벡터 (발현 구조체 또는 발현 카세트)는 표적 세포에서 외인성 유전자를 발현하기 위한 것이며, 일반적으로 외인성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 서열을 가진다. 표적 세포 내 벡터의 삽입은 세균과 진핵 세포에 대해 형질전환(transformation) 또는 형질주입(transfection)이라고 하나, 바이러스 벡터의 삽입은 주로 형질도입(transduction)이라고 한다. 용어 "벡터(vector)"는 일반적으로 형질전환된 세포 또는 나노입자와 같은 다른 세포로 외부 유전 물질을 운반하는 역할을 하는 항목을 설명하는데 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

“약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)”에 의한 것은 독성이 없거나 달리 바람직하지 않은 물질, 즉 어떤 바람직하지 않은 생물학적 영향을 유발하지 않고 개체에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오티드 표적 카세트(polynucleotide target cassette)”는 하나 이상의 미리 결정된 시드 매치 및 각 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 뉴클레오티드 카세트를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 카세트가 표적 유전자에 삽입될 때, 흔한 표적 조직이 아닌 뚜렷한 유전적 원인을 가진 다중 장애에 의해 공유되는 과발현 표현형에 대해 보호하기 위한 적절한 시드 매치의 선택에 의해 설계될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 많은 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함할 수 있다.

용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", 및 "의 치료(treatment of)" (또는 문법적으로 동등한 용어)에 의한 것은 개체 상태의 중증도가 감소되거나 최소한 부분적으로 개선 또는 개선되는(ameliorated) 것 및/또는 최소 하나의 임상 증상에서 일부 경감, 완화 또는 감소가 달성되는 것 및/또는 상태의 진행이 지연 및/또는 질병 또는 장애의 시작(onset)을 예방 또는 지연하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방하다(prevent)", "예방하다(prevents)", 및 "예방(prevention)" (및 그의 문법적 등가물)은 질병이나 장애의 시작(onset) 지연 또는 질병이나 장애의 시작에서 증상의 약화를 의미한다. 상기 용어는 완전한 질병의 폐지(abolition)를 암시하며 상태의 발생을 감소하거나 상태의 시작 및/또는 진행을 지연시키는 예방 치료의 모든 유형을 포함하는 것을 의미하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 “치료 유효한(treatment effective)” 양(amount)은 개체에게 약간의 개선 또는 이익을 제공하기에 충분한 양이다. 대안적으로(alternatively), “치료 유효한” 양은 개체 중 최소 하나의 임상 증상에서 일부 경감, 완화, 감소 또는 안정화를 제공하는 양이다. 당업계 기술자는 개체에게 일부 이익이 제공되는 한, 치료 효과가 완전하거나 치유력(curative)이 있을 필요가 없다는 것을 인정할 것이다.

본 명세서에서 사용된 "예방 유효한(prevention effective)” 양(amount)은 본 발명의 방법이 부재할 때 발생하는 것과 비교하여 개체의 질병, 장애 및/또는 임상 증상의 시작을 예방 및/또는 지연시키며 및/또는 개체의 질병, 장애 및/또는 임상 증상의 시작의 중증도를 감소 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 당업계 기술자는 개체에게 일부 이익이 제공되는 한, 예방 수준이 완전할 필요가 없다는 것을 인정할 것이다.

개체에 대한 합성 유전자, 발현 카세트, 벡터, 플라스미드, 바이러스 벡터, 형질전환된 세포, 나노입자, 또는 약학적 조성물을 "투여하는(administering)” 및 "투여(administration)”라는 용어는 의도된 기능을 수행하기 위해 혼합물을 개체에게 도입하거나 전달하는 모든 경로를 포함한다. 투여는 경구로(orally), 비강내로(intranasally), 비경구로(parenterally) (정맥내로(intravenously), 근육내로(intramuscularly), 복강내로(intraperitoneally), 수조내로(intracisternally), 경막내로(intrathecally), 뇌실내로(intraventricularly), 또는 피하로(subcutaneously)), 또는 국소로(topically)를 포함하는 모든 적절한 경로에 의해 전달될 수 있다. 투여는 자가 투여 및 다른 사람에 의한 투여를 포함한다.

합성 유전자

본 발명은 용량 민감 지적 능력 장애와 같은 장애를 치료하기 위해 내인 조절이 가능한 표적 조직에 전이유전자 발현을 제공하기 위한 목적으로 피드백이 가능한 합성 유전자, 폴리뉴클레오티드 표적 카세트, 벡터, 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자에 관한 것으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 내인성 miRNA에 대한 결합 부위로 확인된 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 인접 서열 및 3' 인접 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 더 포함하며, 상기 하나 이상의 핵산 분절은, 상기 합성 유전자가 내인성 miRNA를 발현하는 세포에 전달될 때의 상기 관심 단백질 또는 핵산의 발현이 하나 이상의 핵산 분절을 포함하지 않는 합성 유전자가 내인성 miRNA를 발현하는 세포에 전달될 때의 관심 단백질 또는 핵산의 발현과 비교하여 감소되도록 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역에 삽입된다.

일부 구체예에서, 상기 관심 핵산 또는 단백질을 암호화하는 암호 영역은 유전자의 암호 영역 또는 유전자의 활성 단편을 포함하며, 상기 유전자는 예컨대, 지적 능력 유전자 용량 민감 장애(intellectual ability gene-dose sensitive disorder)와 관련된 유전자이다. 지적 능력 유전자 용량 민감 장애와 관련된 유전자는 TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX, MECP2, FOXG1, AKT3, SLC6A1, 또는 그의 활성 단편을 제한하지 않고 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단백질 또는 핵산을 암호화하는 영역은 유전자 MECP2 또는 그의 활성 단편의 암호 영역을 포함한다.

상기 시드 매치는 모든 뉴클레오티드 서열 길이일 수 있으며, 일반적으로 약 3 내지 약 10개, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 여기에 포함된 모든 범위의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 시드 매치는 길이가 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 시드 매치는 길이가 약 6 내지 약 8개의 뉴클레오티드이다.

본 발명의 합성 유전자는 하나 이상의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 최소 두 개, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상, 또는 여기에 포함된 모든 범위의 시드 매치를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 3개 이상의 시드 매치를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 3개 이상의 시드 매치를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 3 내지 8개의 시드 매치를 포함한다. 일부 구체예에서, 일부 또는 전체 시드 매치는 3' UTR에 존재한다.

상기 5' 및 3' 인접 뉴클레오티드 서열은 모든 길이일 수 있으며, 일반적으로 특정 서열 (예컨대, 시드 매치)의 각 5' 및/또는 3' 말단에서 약 1 내지 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 인접 뉴클레오티드 서열은 특정 서열 (예컨대, 시드 매치)의 각 5' 및/또는 3' 말단에서 약 9 내지 약 13개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 상기 인접 뉴클레오티드 서열은 특정 서열 (예컨대, 시드 매치)의 각 5' 및/또는 3' 말단에서 약 11개의 뉴클레오티드이다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 특정 서열 (예컨대, 시드 매치)의 5' 및 3' 인접 서열의 총 뉴클레오티드 수는 약 7 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 뉴클레오티드 또는 여기에 포함된 모든 범위이다. 일부 구체예에서, 특정 서열 (예컨대, 시드 매치)의 5' 및 3' 인접 서열의 총 뉴클레오티드 수는 약 20 내지 약 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 특정 서열 (예컨대, 시드 매치)의 5' 및 3' 인접 서열의 총 뉴클레오티드 수는 약 22개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 각 시드 매치는 그들 사이의 3' 및 5' 인접 서열에 의해 차선으로 가장 가까운(next most proximate) 시드 매치로부터 분리된다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 최소 2개의 시드 매치는 약 7 내지 약 40개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 일부 구체예에서, 상기 최소 2개의 시드 매치는 약 20 내지 약 25개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 일부 구체예에서, 상기 최소 2개의 시드 매치는 약 22개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다.

본 발명의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 하나 이상의 miRNA와 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, miR-7-5p, miR-494-3p, 또는 그의 모든 조합을 포함하는 하나 이상의 miRNA와 결합한다. 또한, 이론(theory)에 얽매이기를 바라지 않지만, 아직 확인되지 않은 miRNA가 MeCP2 피드백 루프에 기여할 수 있다는 것은 개념적으로 가능하다. 표적 패널에서 특정 miRNA 시드와 miRNA 시드 매치 사이에 왓슨-크릭(WC) 염기쌍을 허용하는 시드 서열을 포함하는 모든 miRNA는 관심 외인성 표적 핵산 또는 단백질, 즉 관심 핵산 또는 단백질을 암호화하는 암호 영역의 산물의 내인 조절을 매개하는데 도움을 줄 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 본 발명의 miRNA 시드 서열과 시드 매치 사이에 WC 염기쌍을 허용하는 시드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-451a, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-22, miR-19, miR-132, 및/또는 miR-124인 miRNA와 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 그와 최소 70% 동일한, 예컨대 그와 최소 약 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 것을 포함하며, 이는 miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, 및 let-7-5p에 대한 시드 매치를 포함한다. 매치는 밑줄이 그어진 것을 참조.

서열번호 1: "Reg2" 표적 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열

5'CTGTTCTAGCCCCCAAAGAGTTTTCTGTGCTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAACCAAAGACATAGATGTGAAAATTTTAGGCAGTGTAAGCTGATAGCACAAGTTCTGGCGACTCACAATTATGCTGTGAATTTTACAAAAAGAAGCAGTAATCTACCTCAGCCGATAAC-3'

일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 상기 시드 매치와 이웃한 인접 5' 및 3' 서열은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 그와 최소 70% 동일한, 예컨대 그와 최소 약 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 것을 포함하며, 이는 miR-451a, let-7-5p, 및 miR-690에 대한 시드 매치를 포함한다. 매치는 밑줄이 그어진 것을 참조.

서열번호 2: "Reg1" 표적 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열

5'ATAAGGGCAGAAACGGTTCACATTCCATTCTGCCCCGGACCTACCTCCCTCCCTCTCCTTATCAAACCCTAGCCTTGCTTGTTAAAT-3'

일부 구체예에서, 본 발명은 합성 유전자를 포함하는 벡터를 포함한다. 벡터는 세포에 폴리뉴클레오티드를 전달하는 모든 적절한 수단일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 발현 카세트, 형질전환된 세포, 또는 나노입자이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 운반체에 본 발명의 합성 유전자 또는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 운반체에 본 발명의 합성 유전자 또는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 선택적으로 다른 약물(medicinal agent), 제약제(pharmaceutical agent), 안정제, 완충제, 운반체, 보강제, 희석제 등을 제공한다. 주입(injection)의 경우, 상기 운반체는 일반적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 상기 운반체는 고체이거나 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 상기 운반체는 호흡 가능한 것이며, 바람직하게 고체 또는 액체 미립자 형태이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 합성 유전자에 대해 용량 의존적 억제 피드백을 제공하는 폴리뉴클레오티드 표적 카세트를 제공하며, 상기 카세트는 내인성 miRNA에 대한 결합 부위로 확인된 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 합성 유전자의 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 내 상기 카세트의 삽입을 통해 합성 유전자를 생성하는데 사용될 수 있으며, 따라서 합성 유전자의 발현을 조절할 수 있는 폴리뉴클레오티드 표적 카세트 내에서 제공된 시드 매치와 결합 가능한 miRNA가 합성 유전자에 대한 용량 의존적 억제 피드백의 가능성을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 모든 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열 수를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 최소 2개, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 또는 그에 포함된 모든 범위의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 3개 이상의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 3 내지 8개의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 관심 표적 핵산 또는 단백질, 즉 관심 핵산 또는 단백질을 암호화하는 암호 영역의 산물의 외인 조절을 매개하는데 도움을 줄 수 있는 하나 이상의 miRNA와 결합하는 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 miRNA는 miRNA 시드 서열과 시드 매치 사이에 WC 염기쌍을 허용하는 시드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 miR-690, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p, 또는 그의 모든 조합으로 선택된 하나 이상의 miRNA와 결합하는 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 miR-690, miR-451a, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 시드 매치를 포함하며, 상기 시드 매치는 길이가 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 시드 매치를 포함하며, 상기 시드 매치는 길이가 약 6 내지 약 8개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 길이가 각각 약 9 내지 약 13개의 뉴클레오티드인 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 길이가 각각 약 11개의 뉴클레오티드인 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 그와 최소 70% 동일한, 예컨대 그와 최소 약 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 것을 포함하는 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 표적 카세트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 그와 최소 70% 동일한, 예컨대 그와 최소 약 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 것을 포함하는 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 포함한다.

합성 유전자를 제조하는 방법

본 발명은 합성 유전자를 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 합성 유전자는 용량 의존적 억제 피드백을 보인다. 일 구체예에서, 본 발명은 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자의 제조 방법을 제공하며, 상기 합성 유전자의 조절 영역 안에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 표적 카세트를 삽입하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 합성 유전자의 조절 영역 안에 핵산 분절을 삽입하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 합성 유전자의 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에서 관심 miRNA와 결합하는 것으로 알려지거나 새로 확인된 시드 매치를 삽입하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 합성 유전자의 뉴클레오티드의 조절 영역 안에 폴리뉴클레오티드 표적 카세트를 삽입함으로써 합성 유전자를 제조하는 방법을 제공하며, 따라서 합성 유전자의 발현을 조절할 수 있는 폴리뉴클레오티드 표적 카세트 내에서 제공된 시드 매치와 결합 가능한 miRNA가 합성 유전자에 대한 용량 의존적 억제 피드백의 가능성을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 합성 유전자의 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 삽입하는 단계를 포함하는 합성 유전자의 제조 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 합성 유전자의 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에서 발견된 하나 이상의 내인성 시드 매치를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 합성 유전자에 삽입되는 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 표적 조직 및/또는 비표적 조직에 발현되는 miRNA와 결합할 수 있으며, 따라서 비표적 조직에서 합성 유전자의 발현을 억제하는 합성 유전자에 대한 피드백 가능성을 제공하며, 표적 조직에서 합성 유전자의 내인 조절을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 합성 유전자는 비표적 조직에서 발현된 miRNA로부터 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 제외한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 합성 유전자는 miR-22, miR-19, miR-132, 및/또는 miR124인 miRNA에 대한 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 제외한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 합성 유전자를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 관심 단백질 또는 핵산이 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 miRNA를 선별하는 단계; 발현이 증가된 하나 이상의 miRNA에 대한 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 식별하는 단계; 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에 삽입되는 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함하는 핵산 분절을 제조하는 단계를 포함하며, 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에 내인성 miRNA에 대한 결합 부위로 확인된 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 삽입하는 단계를 포함한다.

합성 유전자를 제조하는 방법의 일부 구체예에 있어서, 상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역은 TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX, MECP2, FOXG1, AKT3, SLC6A1, 또는 그의 활성 단편으로부터 선택된 유전자의 암호 영역을 포함한다. 활성 단편(active fragment)은 전체 길이 MeCP2의 각각 88%, 52% 및 32%를 차지하는 ΔN, ΔNC, 및/또는 ΔNIC 활성 MeCP2 단편과 같은 MeCP2의 활성 단편을 포함할 수 있으나, 이제 제한되지 않으며, 그러나 레티노산 및 갑상선 호르몬 수용체의 핵 수용체 보조 억제자/스플라이싱 매개자(nuclear receptor co-repressor/silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptors, NCoR/SMRT) 복합물과 DNA의 물리적 연결을 허용할 수 있는 메틸-CpG 결합 및 NCoR/SMRT 상호작용의 보존된 기능성을 유지한다. 이러한 활성 단편은 전체 길이 MeCP2 단백질의 절단(truncation)으로, ΔN는 전체 길이 MeCP2 아이소형(isoform) e2의 메틸-CpG 결합 도메인(methyl-CpG binding domain, MBD) (72~173 잔기)에 대한 N-말단 13~17 잔기의 결실을 포함하며, ΔNC는 상기 NCoR-SMRT 상호작용 도메인(interaction domain) (NID) (272~312 잔기)의 C-말단 313~484 잔기의 추가 결실을 포함하며, ΔNIC는 MBD와 NID 도메인 사이에 개입한 아미노산을 Tillotson et al. (Tillotson et al. 2017 Nature 550(7676):398-401)에 기재된 짧은 유연한 링커(short flexible linker)에 의해 연결된 SV40 바이러스의 핵 위치선정 신호(nuclear localization signal)로 추가로 대체하며, 본 개시는 참조에 의해 본 명세서에 완전히 포함된다. RTT의 치료를 위해 사용된 MeCP2의 활성 단편은 MeCP2의 아이소형 e1에서 유래된다. 본 명세서에 기재된 아미노산 번호는 관례적으로 MeCP2 e2 아이소형 아미노산 서열에 기초한다.

일부 구체예에서, 상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역은 유전자 MECP2 또는 그의 활성 단편의 암호 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 핵산 분절은 miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, 및 miR-494-3p로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA와 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, 및 let-7-5p와 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-451a, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 합성 유전자에 삽입되는 하나 이상의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 식별하는 방법을 제공하며, 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 하나 이상의 miRNA에 대한 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 식별하는 단계; 및 상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자의 조절 영역 안에 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 삽입하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 합성 유전자 안에 삽입되는 하나 이상의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 식별하는 방법은 세포에서 상기 관심 단백질 또는 핵산을 발현시키는 단계; 상기 세포로부터 miRNA를 수집하는 단계; 및 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때의 상기 miRNA의 발현 수준을 계산하는 단계를 추가적으로 포함함으로써 상기 miRNA의 핵산 데이터세트를 생성한다. 일부 구체예에서, 상기 식별하는 방법은 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 miRNA에 대한 핵산 데이터세트 (예컨대, 기존 데이터세트)를 선별하는 단계, 및/또는 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 miRNA를 식별하는 단계, 및/또는 검증되거나 또는 추정되는 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열에 대한 핵산 데이터세트를 선별하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "데이터세트(dataset)"는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 제한하지 않고 포함하는 모든 유형의 데이터를 포함하는 실험 또는 컴퓨터 분석에서 얻은 관련 정보, 즉 데이터의 세트(set)를 회수하는 것을 의미한다. 상기 데이터세트는 각 특정 데이터세트에 의해 정의된 가변 매개변수에 따라 선별하거나 및/또는 다른 방법으로 관심 있는 특정 데이터를 검색할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 데이터세트는 핵산 데이터세트, 즉 핵산 서열을 포함하는 데이터세트이다. 일부 구체예에서, 상기 데이터세트는 3' UTR 데이터세트이다.

일부 구체예에서, 상기 관심 단백질 또는 핵산은 TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX, SLC6A1, FOXG1, AKT3, MECP2, 또는 그의 활성 단편으로부터 선택된 유전자의 전사 또는 번역 산물이다. 일부 구체예에서, 상기 관심 단백질 또는 핵산은 유전자 MECP2 또는 그의 활성 단편의 전사 또는 번역 산물이다.

합성 유전자를 이용하는 방법

본 발명의 또 다른 양태에서, 합성 유전자를 전달하는 방법은 제공되며, 상기 방법은 개체에게 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함함으로써 개체에게 합성 유전자를 전달한다.

본 발명의 추가 양태에서, 표적 조직에서 내인성 유전자의 비정상 발현 또는 표적 조직에서 내인성 유전자에 의해 암호화된 돌연변이 단백질의 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법은 제공되며, 상기 방법은 내인성 유전자에 의해 암호화된 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함함으로써 상기 질병을 치료한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 표적 조직에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 표적 및 비표적 조직에 투여될 수 있어, 비표적 조직 내 합성 유전자의 발현을 억제하고 표적 조직 내 합성 유전자의 발현을 내재적으로 조절한다.

일부 구체예에서, 상기 질병을 치료하는 방법은 상기 개체에서 상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 내인성 유전자를 유전학적으로 녹다운하는(knocking down) 및/또는 녹아웃하는(knocking out) 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 내인성 유전자는 MECP2이다. 유전학적으로 내인성 유전자을 녹다운하거나 "의 녹다운(knock down of)", 또는 녹아웃하거나 "의 녹아웃(knock out of)"은 내인성 유전자를 발현하는 개체, 조직, 및/또는 세포에 일치하는 shRNA, TALE 또는 TALEN, 또는 CRISPR/cas9 발현 벡터를 도입하는 RNAi, TALE 및 TALEN(Transcription Activator-like Effectors and Nucleases), 또는 CRISPR-cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 방법을 사용하는 것을 제한하지 않고 포함하는 당업계에서 현재 또는 나중에 확인되어 알려진 모든 기술 또는 방법으로 수행됨으로써 RNAi, TALE, TALEN, 또는 CRISPR/cas9의 처리 없이 내인성 핵산 또는 단백질의 발현에 비해 상기 관심 내인성 핵산 또는 단백질의 발현을 제거하거나 줄일 수 있다. 이러한 기술 및 기타는 Boettcher and McManus 2015 Mol. Cell 58(4):575-585, 및 미국 특허 제7,195,916호 to Qin et al., 제8,440,431호 to Voytas et al., 제8,889,356호 to Zhang, 제8,871,445호 to Cong et al., and 제10,000,772호 to Doudna et al에서 검토되었으며, 각각은 전체 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 추가 구체예에서, 개체에서 내인성 유전자의 비정상 발현 또는 내인성 유전자에 의해 암호화된 돌연변이 단백질의 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법은 제공되며, 상기 방법은 상기 개체의 세포에 내인성 유전자를 유전학적으로 녹다운하는 단계, 및 내인성 유전자에 의해 암호화된 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함함으로써 상기 질병을 치료한다.

용어 "환자(patient)", "개체(subject)", "개인(individual)" 등은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 시험관내(in vitro) 또는 인 시투(in situ)에서의 모든 동물 또는 세포가 본 명세서에 기재된 방법에 따라 처리될 수 있는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 상기 환자, 개체, 또는 개인은 포유동물이다. 일부 구체예에서, 상기 포유동물은 마우스(mouse), 랫트(rat), 기니피그(guinea pig), 비인간 영장류, 개, 고양이, 또는 가축 (예컨대, 말, 소, 돼지, 염소, 양) 이다. 일부 구체예에서, 상기 환자, 개체, 또는 개인은 인간이다. 일부 구체예에서, 상기 환자, 개체, 또는 개인은 지적 능력 유전자 용량 민감 장애에 대한 위험이 있다. 일부 구체예에서, 상기 환자, 개체, 또는 개인은 레트 증후군에 대한 위험이 있다. 추가 선택적으로, 상기 개체는 실험 동물 및/또는 동물 질병 모델일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 그를 필요로 하는(in need thereof) 개체에게 관심 핵산 또는 단백질의 비정상적인 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양을 개체에게 전달하는 단계를 포함함으로써 개체에서 관심 핵산 또는 단백질의 비정상적인 발현과 관련된 장애를 치료한다.

일부 구체예에서, 상기 관심 핵산 또는 단백질은 지적 능력 유전자 용량 민감 장애와 관련된다. 지적 능력 유전자 용량 민감 장애와 관련된 관심 핵산 또는 단백질은 TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX, FOXG1, AKT3, SLC6A1, MECP2 또는 그의 활성 단편을 제한하지 않고 포함한다.

지적 능력 유전자 용량 민감 장애는 레트 증후군(Rett syndrome), MeCP2 중복 증후군(MeCP2 duplication syndrome), 안젤만 증후군(Angelman syndrome), dup15Q, DYRK1A 반가불충분성(haploinsufficiency), 다운 증후군(Down syndrome), MEF2C 반가불충분성 증후군(MEF2C haploinsufficiency syndrome), dup5Q14.3, 소토스 증후군(Sotos syndrome), 역소토스 증후군(Reverse Sotos syndrome), ATRX 증후군(Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability syndrome), Xq13.2q21.1 중복(duplication), 코핀-로우리 증후군(Coffin-Lowry syndrome), Xp22.12 중복, 피트 홉킨스 증후군(Pitt Hopkins syndrome), 모왓-윌슨 증후군(Mowat-Wilson Syndrome), 2q22.3 삼중복(triplication), 2q23.1 중복, 2q23.1 미세결실(microdeletion), FOXG1 증후군, 웨스트 증후군(West Syndrome), MPPH 증후군(megalencephaly-polymicrogyria-polydactyly-hydrocephalus syndrome), AKT3 중복, 두세 증후군(Doose syndrome), SLC6A1 중복, 및 트리소미 18(Trisomy 18)을 제한하지 않고 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 관심 핵산 또는 단백질은 MECP2 또는 그의 모든 활성 단편이며, MECP2와 관련된 상기 지적 능력 유전자-용량 민감 장애는 레트 증후군 및/또는 MeCP2 중복 증후군이다.

특정 구체예에서, 상기 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물은 상기 개체, 예컨대 개체의 전신적으로 (예컨대, 정맥내로) 또는 중추 신경계에 직접 (예컨대, 경막내, 수조내, 또는 뇌실내 주입에 의해 뇌척수액으로) 전달된다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물은 장관(enteral), 비경구(parenteral), 경막내(intrathecal), 수조내(intracisternal), 뇌내(intracerebral), 뇌실내(intraventricular), 비강내(intranasal), 이내(intra-aural), 안구내(intra-ocular), 안구주위(peri-ocular), 직장내(intrarectal), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 경구(oral), 설하(sublingual), 피하(subcutaneous) 및 경피(transdermal)로부터 선택된 전달 경로에 의해 전달된다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물은 정맥내로 전달된다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물은 정맥내로, 수조내로, 경막내로, 및/또는 뇌실내로 전달되어 척수액으로 ("CSF 내(intraCSF)”) 직접 전달된다.

본 발명의 일 양태는 시험관내(in vitro)에서 세포에 합성 유전자를 옮기는 방법이다. 본 발명의 합성 유전자 및/또는 벡터는 적절한 양으로 세포에 도입될 수 있다. 바이러스 벡터의 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 특정 표적 세포에 적합한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 감염다중도(multiplicity of infection)로 세포에 도입될 수 있다. 투약할 상기 바이러스 벡터 또는 캡시드(capsid)의 역가(titer)는 표적 세포 유형과 수, 및 특정 바이러스 벡터 또는 캡시드에 따라 달라질 수 있으며, 과도한 실험 없이 당업계 기술자에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 최소 약 10² 감염유발 단위(infectious unit), 더욱 바람직하게 최소 약 10², 10³, 10⁴, 10⁵,10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 또는 10¹³ 감염유발 단위는 세포에 도입된다.

본 발명의 합성 유전자 및/또는 벡터에서의 세포, 예컨대 바이러스 벡터는 (말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뉴런, 희소돌기신경교, 신경아교세포, 성상세포와 같은 뇌 세포를 포함하는) 신경 세포, 폐 세포, (망막 세포, 망막 색소 상피, 및 각막 세포를 포함하는) 눈 세포, 상피 세포 (예컨대, 창자 및 호흡기 상피 세포), (근원세포, 근관세포 및 근섬유를 포함하는) 골격근 세포, 횡격막 근육 세포, 수지상 세포, (섬 세포를 포함하는) 췌장 세포, 간 세포, (평활근 세포, 상피 세포를 포함하는) 위장관 세포, (심장근육세포를 포함하는) 심장 세포, 골 세포 (예컨대, 골수 줄기 세포), 조혈모 세포, 비장 세포, 각질형성세포, 섬유아세포, 내피 세포, 전립선 세포, (예컨대, 연골, 반달연골, 활막 및 골수를 포함하는) 관절 세포, 생식 세포 등을 제한하지 않고 포함하는 모든 유형으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 모든 간세포(progenitor cell)일 수 있다. 추가 대안으로, 상기 세포는 줄기 세포 (예컨대, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 또한, 상기 세포는 상술한 모든 기원의 종(any species of origin)에서 유래될 수 있다.

본 발명의 합성 유전자 또는 벡터, 예컨대 바이러스 벡터는 개체에게 변형된 세포를 투여할 목적으로 시험관내 세포에 도입될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 세포는 개체로부터 제거되었고, 본 발명의 합성 유전자 및/또는 벡터, 예컨대 바이러스 벡터는 여기에 도입되어, 상기 세포는 개체에서 다시 대체된다. 생체외(ex vivo) 치료를 위해 개체로부터 세포를 제거하고 그 다음에 상기 개체에 다시 도입하는 방법은 당업계에서 알려져 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,399,346호 참조). 대안적으로, 본 발명의 합성 유전자 및/또는 벡터, 예컨대 바이러스 벡터는 또 다른 개체의 세포, 배양된 세포, 또는 모든 다른 적절한 출처의 세포 내로 도입되며, 상기 세포는 그를 필요로 하는 개체에게 투여된다.

생체외 유전자 치료에 대한 적절한 세포는 상술한 바와 같다. 개체에게 투여될 세포의 용량은 개체의 나이, 상태 및 종, 세포의 유형, 세포에 의해 발현될 핵산, 투여 방식(mode) 등에 따라 다를 것이다. 일반적으로, 최소 약 10² 내지 약 10⁸개 또는 약 10³ 내지 약 10⁶개의 세포는 약학적으로 허용 가능한 운반체에 용량당 투여될 것이다. 특정 구체예에서, 상기 벡터가 형질도입되는 세포는 약학적 운반체와 조합하여 유효한 양으로 개체에게 투여된다.

인간 개체는 신생아, 유아, 청소년, 및 성인을 포함한다. 선택적으로, 상기 개체는 예컨대, 상기 개체가 본 명세서 기재된 것을 포함하는 장애의 위험을 가지거나 있고 또는 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 합성 유전자의 전달로부터 이익을 얻을 수 있기 때문에 본 발명의 방법을 "필요로 하는(in need of)" 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 합성 유전자는 예컨대, 개체가 관심 핵산 또는 단백질의 비정상 발현이나 활성으로 진단되는 즉시, 개체의 삶에서 가능한 일찍 그를 필요로 하는 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 예컨대, 신생아 선별검사에서 관심 핵산 또는 단백질의 비정상 발현이나 활성이 확인된 후 신상아 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 예컨대, 태아 선별검사에서 비정상 발현 또는 활성이 확인된 후 자궁내(in utero) 태아에게 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 개체가 관심 핵산 또는 단백질의 비정상 발현 또는 활성과 관련된 증상이 생기자마자, 또는 관심 핵산 또는 단백질의 비정상 발현 또는 활성을 가지는 것으로 의심되거나 진단되는 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 합성 유전자는 개체가 관심 핵산 또는 단백질의 비정상 발현 또는 활성과 관련된 증상이 생기기 전에 개체, 예컨대 증상이 나타나기 시작하지 않았지만 비정상 발현 또는 활성을 가지는 것으로 의심되거나 진단된 개체에게 투여된다.

본 발명의 추가 양태는 본 발명의 합성 유전자, 벡터, 및/또는 약학적 조성물, 예컨대 본 발명의 합성 유전자를 개체에게 전달하는 방법이다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 동물 개체에게 합성 유전자를 전달하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 동물 개체에게 본 발명에 따른 합성 유전자의 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다. 그를 필요로 하는 인간 개체 또는 동물에 대한 본 발명의 합성 유전자의 투여는 당업계에 알려진 모든 수단에 의한 것일 수 있다. 선택적으로, 상기 합성 유전자 및/또는 벡터는 약학적으로 허용 가능한 운반체에 유효한 양이 전달된다.

개체에게 투여되는 벡터의 용량은 투여 방식, 치료되는 질병 또는 상태, 개별 개체의 상태, 전달되는 특정 바이러스 벡터, 및 핵산에 의존할 것이며, 일상적인 방법(routine manner)으로 결정될 수 있다. 바이러스 벡터의 구체예에서, 치료 효과를 얻기 위한 전형적인 용량(exemplary dose)은 약 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶이상 형질도입 단위(transducing unit)에서의 바이러스 역가이다. 용량 및 바이러스 역가 형질도입 단위는 벡터 또는 바이러스 게놈(viral genomes, vg)으로 계산될 수 있다.

특정 구체예에서, 1회 이상의 투여 (예컨대, 2회, 3회, 4회 이상의 투여)는 다양한 간격의 기간, 예컨대 일일, 주간, 월간, 연간 등에 걸쳐 유전자 발현의 원하는 수준을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

투여의 전형적인 방식(exemplary mode)은 경구, 직장, 점막관통(transmucosal), 국소, 비강내, 흡입 (예컨대, 에어로졸을 통한), 볼 (예컨대, 설하), 질, 경막내, 안구내, 경피, 자궁내 (또는 난소내(in ovo)), 비경구 (예컨대, 정맥내, 피하, 진피내, [골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 대한 투여를 포함하는] 근육내, 진피내, 흉강내, 뇌내, 및 관절내), 국소 (예컨대, 기도 표면을 포함하는 피부와 점막 표면 사이에 대해, 및/또는 경피 투여), 림프관 내(intro-lymphatic) 등 뿐만 아니라 직접적인 조직 또는 장기 주입 (예컨대, 간, 골격근, 심장근, 횡격막근 또는 뇌에 대한)을 포함한다. 투여는 또한 종양 (예컨대, 종양 또는 림프절 내부 또는 가까이)에 대한 것일 수 있다. 모든 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료 중인 상태의 특성과 중증도 및 사용되는 특정 벡터의 특성에 의존할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 벡터는 CNS, 말초 신경계, 또는 둘 다에 투여된다.

일부 구체예에서, 상기 벡터는 CNS, 예컨대 뇌 또는 척수(spinal cord)에 직접 투여된다. 직접 투여는 CNS 세포의 형질도입 특이도가 높을 수 있으며, 예컨대 형질도입된 세포의 80%, 85%, 90%, 95% 이상이 CNS 세포이다. CNS에 직접적으로 벡터를 투여하기 위해 당업계에 알려진 모든 방법이 사용될 수 있다. 상기 벡터는 척수, 뇌간 (연수, 뇌교), 중뇌 (시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑질, 송과선), 소뇌, 종뇌 (선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체를 포함하는 대뇌), 번연계, 신피질, 선조체, 대뇌, 및 하구 내로 도입될 수 있다. 상기 벡터는 또한 망막, 각막 또는 시신경과 같은 눈의 다양한 영역에 투여될 수 있다. 상기 벡터는 상기 벡터의 보다 확산되는 투여를 위해 척수액 내로 (예컨대, 요추 천자에 의해) 전달될 수 있다.

상기 전달 벡터는 당업계에 알려진 모든 경로에 의해 CNS의 원하는 영역에 투여될 수 있으며, 경막내, 뇌내, 뇌실내, 비강내, 이내, 안구내 (예컨대, 유리체내, 각막하, 전방) 및 안구주위 (예컨대, 서브-테논 영역(sub-Tenon's region)) 전달 또는 그의 모든 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 전달 벡터는 CNS, 말초 신경계, 및/또는 기타 조직을 포함하는 조직의 보다 광범위하고 확산된 형질도입을 생성하는 방법으로 투여될 수 있다.

일반적으로, 상기 벡터는 CNS 및/또는 기타 조직의 원하는 영역 또는 구획(compartment)에 직접 주입 (예컨대, 정위주사(stereotactic injection))하여 액체 제형으로 투여될 것이다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 저장소(reservoir) 및/또는 펌프(pump)를 통해 전달될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 벡터는 원하는 영역에 국소적으로 적용되거나 에어로졸 제형의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈 또는 귀 안에 대한 투여는 액체 방울의 국소 적용(topical application)에 의한 것일 수 있다. 추가 대안으로, 상기 벡터는 고체, 서방 제형(slow-release formulation)으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 파보바이러스(parvovirus) 및 AAV 벡터의 제어된 방출은 국제 특허 출원 WO 01/91803에 의해 설명된다.

주사제(injectable)는 액체 용액 또는 현탁액(suspension), 주입 전 액체의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 또는 유탁액(emulsion)으로 전통적인 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 전신 방법, 예를 들어, 축적(depot) 또는 지속적인 방출 제형 보다는 국소로 벡터를 투여할 수 있다. 또한, 상기 바이러스 벡터는 골 이식 대체제(bone graft substitute), 봉합제(suture), 스텐트(stent) 등과 같은 (예컨대, 미국 특허 제7,201,898호에 기재된 바와 같은) 외과적으로 이식 가능한 매트릭스(matrix)에 전달될 수 있다.

경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 캡슐, 카세제(cachet), 로젠지(lozenge), 또는 알약(tablet)과 같은 개별 단위(discrete unit)로 제시될 수 있으며, 각각은 분말 또는 과립; 수용액 또는 비수용액의 용액 또는 현탁액; 또는 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 유탁액으로 본 발명의 조성물의 미리 결정된 양을 포함할 수 있다. 경구 전달은 동물의 창자에서 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 운반체에 본 발명의 바이러스 벡터를 복합화(complexing)함으로써 수행될 수 있다. 이러한 운반체의 예로는 당업계에 알려진 바와 같은 플라스틱 캡슐이나 알약을 포함한다. 이러한 제형은 구성요소와 적합한 운반체를 연관시키는 단계를 포함하는 모든 적합한 약학 방법에 의해 제조된다 (위에서 언급된 하나 이상의 보조 성분을 포함할 수 있음). 일반적으로, 본 발명의 구체예에 따른 약학적 조성물은 액체 또는 미세하게 분할된 고체 운반체, 또는 둘 다를 가지는 조성물을 균일하고 밀접하게 혼합한 다음, 필요한 경우, 결과 혼합물을 정형(shaping)함으로써 제조된다. 예를 들어, 알약은 하나 이상의 보조 성분을 선택적으로 가지는 조성물을 포함하는 분말 또는 과립을 압축하거나 성형함으로써 제조될 수 있다. 압축된 알약은 적합한 기계에서 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 및/또는 표면 활성/분산제와 선택적으로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 흐름 형태(free-flowing form)로 조성물을 압축함으로써 제조된다. 성형된 알약은 적합한 기계에서 불활성 액체 결합제에 적신 분말 화합물을 성형함으로써 제조된다.

볼 (설하) 투여에 적합한 약학적 조성물은 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트(tragacanth)인 향미제(flavored base)에 본 발명의 조성물을 포함한 로젠지; 및 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성화제(inert base)에 상기 조성물을 포함한 파스틸(pastille)을 포함한다.

비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 본 발명의 조성물의 멸균 수용성 및 비수용성 주사 용액을 포함하며, 조제용 물질(preparation)은 선택적으로 지정된 수혜자의 혈액과 등장성을 가진다. 이러한 조제용 물질은 항산화제, 완충제, 세균 발육 억제제(bacteriostat) 및 용질을 포함할 수 있으며, 지정된 수혜자의 혈액과 등장성을 가지는 상기 조성물을 형성한다. 수용성 및 비수용성 멸균 현탁액, 용액 및 유탁액은 현탁제 및 비후제(thickening agent)를 포함할 수 있다. 비수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주입 가능한 유기 에스테르가 있다. 수용성 운반체는 식염수 및 완충 배지(buffered media)를 포함하는 물, 알코올성/수용성 용액, 유탁액 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 부형제(vehicle)는 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 젖산화된 링거(lactated Ringer's), 또는 고정 오일(fixed oil)을 포함한다. 정맥주사 부형제는 체액(fluid) 및 영양 보충물, (링거 덱스트로스에 기초한 것과 같은) 전해질 보충물 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제는 또한 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 등과 같이 존재될 수 있다.

상기 조성물은 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단위/용량 또는 다중 용량 용기에 제시될 수 있으며, 사용하기 직전에 멸균 액체 운반체, 예를 들어, 식염수 또는 주사용 물(water-for-injection)만 첨가하여 동결건조 (lyophilized) 상태로 보관될 수 있다.

임시 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 알약으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 용기에 든 단위 용량 형태(unit dosage form)로 본 발명의 주입 가능하고 안정적인 멸균 조성물이 제공될 수 있다. 상기 조성물은 동결건조물(lyophilizate)의 형태로 제공될 수 있으며, 동결건조물은 개체에게 주입하기 적합한 액체 조성물을 형성하기 위해 적합한 약학적으로 허용 가능한 운반체와 재구성될 수 있다. 단위 용량 형태는 본 발명의 조성물 중 약 1 μg 내지 약 10 g일 수 있다. 상기 조성물이 실질적으로 불용성일 때, 생리적으로 허용 가능한 유화제의 충분한 양은 수용성 운반체에 상기 조성물을 유화하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 이러한 유용한 유화제 중 하나는 포스파티딜 콜린이다.

직장내 투여에 적합한 약학적 조성물은 단위용량좌약(suppositorie)으로 제시될 수 있다. 이는 하나 이상의 전통적인 고체 운반체, 예를 들어, 코코아 버터와 상기 조성물을 혼합한 다음, 그 결과 혼합물을 정형함으로써 제조될 수 있다.

피부에 대한 국소 적용에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 연고, 크림, 로션, 페이스트, 젤, 스프레이, 에어로졸, 또는 오일의 형태를 취할 수 있다. 사용될 수 있는 운반체는 페트로리움 젤리(petroleum jelly), 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 경피 증강인자(transdermal enhancer), 및 그의 두 개 이상의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 국소 전달은 피부 내로 투과할 수 있는 친유제(lipophilic reagent) (예컨대, DMSO)와 본 발명의 약학적 조성물을 혼합함으로써 수행될 수 있다.

경피 투여에 적합한 약학적 조성물은 연장된 시간의 기간을 위해 개체의 표피와 밀접한 접촉을 유지하기 위한 조정된 개별 패치의 형태일 수 있다. 경피 투여에 적합한 조성물은 또한 이온이동법(iontophoresis)에 의해 전달될 수 있으며 (예컨대, Pharm. Res. 3:318 (1986) 참조) 일반적으로 본 발명의 조성물에 대해 선택적으로 완충된 수용액의 형태를 취한다. 적합한 제형은 시트레이트 또는 비스/트리스 완충액(bis/tris buffer) (pH 6) 또는 에탄올/물일 수 있다.

본 명세서에 기재된 벡터는 모든 적합한 수단, 예를 들어, 상기 개체가 흡입하는 벡터를 포함하는 바람직한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로써 개체의 폐에 투여될 수 있다. 흡입 가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 바이러스 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업계 기술자에게 알려진 압력 구동 에어로졸 분무기(nebulizer) 또는 초음파 분무기와 같은 모든 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제4,501,729호 참조. 상기 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 또한 제약 업계에서 알려진 기술에 의해 모든 고체 미립자 의약품 에어로졸 생성기로 생성될 수 있다.

본 발명을 설명하였으며, 본 발명은 다음의 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이며, 실시예는 본 명세서에서 설명 목적으로만 포함되며, 본 발명을 제한하는데 의도된 것이 아니다.

실시예

실시예 1: MECP2 발현에 의해 상향조절된 miRNA의 확인

초생리적인(supraphysiological) MeCP2 발현에 의해 상향조절된 내인성 miRNA를 확인하기 위하여, MECP2 벡터의 독성 용량(toxic dose)으로 처리된 마우스의 소뇌(cerebellar) 및 속질(medullar) RNA를 선별하였다. Mecp2+/y 및 Mecp2-/y 마우스는 식염수 또는 AAV9/MeP426-hMECP2-myc-RDH1pA의 1 x 10¹² 벡터 게놈(vector genome, vg)을 수조내로 주입하였다 (출생후 28일 [PND28]; 주사량 10 μL; 처리당 마우스 n = 2). 처리한지 2주 후, 마우스를 치사량의 트리브롬에탄올(tribromoethanol)로 안락사시켰다. 소뇌와 뇌간을 해부하여 드라이아이스로 얼리고 보관을 위해 즉시 -80℃로 옮겼다. Qiagen miRNeasy Mini Kit는 해동된 (결합된) 소뇌와 뇌간으로부터 총 RNA를 정제하는데 사용되었다. 정제된 RNA는 -80℃에서 저장되었으며, 나중에 선별 (마이크로어레이 파트 번호(microarray part number) MRA-1002; miRBase version 21)을 위해 드라이아이스로 LC 사이언스(LC Sciences)에 배송되었다.

원본 데이터는 LC 사이언스에 의해 기술 회보(technical bulletin) (Sciences, L. microRNA Microarray Data Analysis)에 따라 처리되었다. 예비 연구에 사용된 작은 시료 크기는 처리군 간의 통계적으로 유의한 차이만을 바탕으로 한 양성 적중도(positive hit)를 확인하는 것을 배제하였다. 따라서, 검정력(statistical power)을 개선하기 위하여, 통계적 의의를 계산하기 전에 3개의 모든 MECP2(+) 군 (즉, 식염수 및 바이러스 처리 Mecp2+/y 마우스와 바이러스 처리 Mecp2-/y 마우스)에 대한 데이터를 응집하였다(aggregated). MECP2(+) 마우스 중 상승된 수준으로 높게 발현되는 miRNA의 중등(moderately) 10개에서, 1개의 miRNA (miR-494-3p)가 내인성 MECP2 3'UTR (targetscan.org; Agarwal et al. 2015 Elife (4); mouse and human) 내에 표적을 가지고 있으며, 이는 MeCP2와 miR-494-3p에 의해 매개되는 음성 피드백 루프(negative feedback loop)가 생체내 존재할 수 있음을 시사한다. 또한, 정규화 신호 강도(normalized signal intensity)는 Mecp2+/y 및 Mecp2-/y 마우스 모두에서 증가된 miR-494-3p 발현과 내인성 MeCP2 발현 사이에 강렬한 경향(trend)을 보여주었다.

실시예 2: MECP2 발현에 의해 상향조절된 추가 miRNA의 확인

MeP426-hMECP2-myc-RDH1pA 바이러스 게놈의 3개의 miRNA 표적 (즉, miR-22-3p, miR-19-3p, 및 miR-132-3p)은 miR-494-3p에 대한 표적 서열로 대체되었다 (Sinnett et al. 2017 Mol. Ther. Methods Clin. Dev. (5):106-115; Gadalla et al. 2017 Mol. Ther. Methods Clin. Dev. (5):180-190). 변형된 바이러스 게놈을 AAV9 안에 포장하여 모자이크 MECP2-EGFP-융합/결손(fusion/null) 암컷에 수조내로 주입하였다. 전이유전자 발현은 MeCP2-EGFP 발현에 대한 반응이 이웃한 결손 세포에서 관찰된 것과 비교하여 약간 감소되었다 (도 8).

실시예 3: 상향조절된 miRNA의 대규모 선별

대규모 선별은 전술한 예비 연구의 한계를 설명하기 위해 완성되었다. 보다 구체적으로, 추가 대조군을 추가하여 더 많은 마우스를 처리하였고, RNA 정제 전에 뇌 영역을 (결합하지 않고) 잘게 해부하였다. Mecp2+/y 및 Mecp2-/y 마우스는 식염수, 1 x 10¹² vg AAV9/MeP426-hMECP2-myc-RDH1Pa, 또는 1 x 10¹² vg AAV9/CBH-EGFP를 수조내로 주입하였다 (PND P28-P35; 주사량 10 μL; 처리당 마우스 n = 3). 처리한지 2~3주 후, 마우스를 치사량의 트리브롬에탄올로 안락사시켰다. 경부 척수(cervical spinal cord), 소뇌 및 뇌간을 해부하여 드라이아이스로 얼린 뒤 보관을 위해 즉시 -80℃로 옮겼다. 그런 다음 Qiagen miRNeasy Mini Kit는 해동된 조직으로부터 총 RNA를 정제하는데 사용되었다. 뇌 영역은 RNA 정제 전에 결합되지 않았다. RNA는 -80℃에서 저장되었으며, 나중에 선별 (마이크로어레이 파트 번호 MRA-1002; miRBase version 21)을 위해 드라이아이스로 LC 사이언스에 배송되었다.

원본 데이터는 LC 사이언스에 의해 기술 회보에 따라 처리되었다. 내인성 MeCP2, AAV9/MECP2, 또는 AAV9/EGFP 처리와 관련하여 유의하게 상향조절된 miRNA를 확인하였다. (도 2~7). mmu-let-7e-5p, mmu-miR-451a, 및 mmu-miR-690의 평균 발현 수준은 외인성 및 내인성 MeCP2와 관련하여 가장 흔하게 증가하였으며, Mecp2+/y 및 Mecp2-/y 마우스에서 조직 유형에 대해 AAV9/EGFP와 관련하여 가장 적게 증가하였다.

응집된 처리군 (MECP2(-) vs. MECP2(+))의 분석을 통해 최소 1개의 조직 유형에서 MeCP2 발현에 의해 유의하게 상향조절된 추가 miRNA가 드러났다 (도 9). miR-690에 대하여, 경부 척수에서 MECP2(-)와 MECP2(+) 군 간에 유의한 차이가 있었고, 연수에서 식염수 처리 KO와 WT 마우스 간에 유의한 차이가 있었다. miR-451a에 대하여, 연수에서 MECP2(-)와 MECP2(+) 군 간에 유의한 차이가 있었고, 경부 척수에서 식염수 처리 KO와 WT 마우스 간에 유의한 차이가 있었다. let-7e5p에 대하여, 경부 척수에서 MECP2(-)와 MECP2(+) 군 간에 유의한 차이가 있었고, 경부 척수에서 식염수 처리 KO와 WT 마우스 간에도 유의한 차이가 있었다. 유의성을 감출 수 있는 상대적 발현 수준과 잠재적 이상치 데이터 포인트(outlier data point)를 고려하여, Let-7e-5p는 소뇌에 대한 합리적인 표적이 될 수 있다. 3개의 표적 (miR-690, miR-451a 및 Let-7e-5p)은 MeP426-ΔNIC-RDH1pA에 추가되었다. miR-124-3p에 대하여, 경부 척수에서 응집된 MECP2(+) 군이 더 낮았으며, 식염수 처리 KO와 WT 마우스의 경부 척수에서의 이전 분석과 일치하였다. 이러한 역전관계(inverse relationship)에도 불구하고, 뇌 전체의 상대적으로 높은 발현은 이 표적이 주입 경로에 관계없이 발현하는데 합리적일 수 있다는 것을 의미한다. miR-132-3p에 대하여, 응집 분석에서만 연수에서 상향조절된 것이 확인되었다. miR-124-3p 및 miR-132-3p는 RDH1pA의 표적으로 발표되었다. miR-9-5p, miR-26b-5p, miR-23a-3p, miR-218-5p, 및 miR-27a-3p는 (let-7e-5p뿐만 아니라) 범용 패널(universal panel)의 부분이다. miR-9-5p 및 miR-27a-3p에 대하여, 응집 분석에서만 경부 척수에서 상향조절되었다. miR-26b-5p에 대하여, 경부 척수에서 MECP2(-)와 MECP2(+) 군 간에 유의한 차이가 있었고, 경부 척수에서 식염수 처리 KO와 WT 마우스 간에도 유의한 차이가 있었다. 도 9의 대부분의 miRNA는 일반적으로 miR-494-3p에 비해 더 높은 수준으로 발현되며, 이는 새로운 패널 설계가 전이유전자 발현을 더욱 강력하게 억제할 수 있음을 시사한다.

선별에서 얻은 데이터는 두 가지 유형의 miRNA 표적 패널을 설계하는데 사용되었다. 첫 번째 패널은 실시예 4에 자세히 설명한 바와 같이, 발현 수준이 생체내 MeCP2 발현과 관련하여 증가한 miRNA에 결합한다. 두 번째 패널 설계는 아래에서 설명된다.

식염수 및 바이러스 처리 마우스의 RNA 시료는 중추 신경계(central nervous system, CNS)에서 발현된 MeCP2 유도 miRNA를 확인하기 위하여 선별되었다. MECP2 바이러스 게놈의 3'UTR 내 이러한 miRNA에 대한 표적의 삽입은 생체내 외인성 MeCP2의 독성 과발현을 약화시키기 위해 내인성 RNA 간섭 기전의 사용을 허용한다 (도 1). 최근 선별에서 얻은 데이터는 두 가지 유형의 miRNA 표적 패널을 설계하는데 사용되었다. 첫 번째 패널은 발현 수준이 생체내 MeCP2 발현과 관련하여 증가한 miRNA에 결합한다. 두 번째 패널 설계는 문헌과 실험 데이터 모두에 의해 정당화된 표적을 포함한다. 중요한 것은, 이 두 번째 패널의 표적은 지적 능력을 매개하는 많은 용량 민감 유전자의 3' UTR에 보존된다는 것이다. 따라서, 이 패널은 다른 신경발달장애뿐만 아니라 레트 증후군(RTT)의 마우스 모델에서 시험하는데 이상적일 수 있으며, 치료 설정(therapeutic setting)에서 전이유전자의 개선된 피드백 조절을 중재할 수 있다.

완전한 패널 서열은 아래에 열거된다. 시드 매치는 밑줄을 긋고, 모든 다른 시드 매치 및 인접 서열 부분은 이탤릭체로 한다. 결합 위치 핵심(Binding site key) (5'-3' 순서로): miR-9-5p; miR-26-5p; miR-23-3p; miR-218-5p; miR-27-3p; let-7-5p:

5'CTGTTCTAGCCC CCAAAGA GTTTTCTGTGCTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAACCAAAGACATAG ATGTGAA AATTTTAGGCAGTGTAAGCTGATAGCACAAGTTCTGGCGACTCACAATTATG CTGTGAA TTTTACAAAAAGAAGCAGTAATCTACCTCAGCCGATAAC-3' (서열번호 1)

지적 장애로 특징된 많은 신경발달장애는 엄격하게 조절되는 유전자들의 돌연변이에 의해 매개된다 (표 1 참조). 이러한 유전자의 3' UTR 중 유사성은 유전적 원인과 관계없는 과발현 유도 지적 장애로부터 뇌를 보호하기 위한 생체내 억제 기전일 수 있음을 시사한다 (표 2 참조).

지적 장애로 특징된 장애를 매개하는 선택된 용량 민감 유전자

기능 손실 증후군	유전자	과발현 증후군 (열거된 유전자에 의해 전체 또는 부분적으로 매개됨)
레트 증후군	MECP2	MeCP2 중복 증후군
안젤만 증후군	UBE3A	dup15Q
DYRK1A 반가불충분성	DYRK1A	다운 증후군
MEF2C 반가불충분성 증후군	MEF2C	dup5Q14.3
소토스 증후군	NSD1	"역" 소토스 증후군
ATRX 증후군	ATRX	Xq13.2q21.1 중복
코핀-로우리 증후군	RPS6KA3	Xp22.12 중북
피트 홉킨스 증후군	TCF4	트리소미 18
2q23.1 미세결실 증후군	MBD5	2q23.1 중복
모왓-윌슨 증후군	ZEB2	2q22.3 삼중복

유사 표현형 (예컨대, 지적 장애, 언어 이상, 발작, 소두증, 및/또는 상동증)을 매개하는 결실 및 상호 중복 장애는 표 1에 열거된 것을 제한하지 않고 포함한다. 이러한 중복 장애의 중증 표현형은 유전자 치료 후 전이유전자 발현을 조절하기 위한 광범위하게 적용 가능한 miRNA 표적 패널에 대한 필요성을 정당화한다.

표 1의 결실 또는 돌연변이 장애에 대한 인간 및 동물 모델을 설명하는 참조는 다음과 같다: TCF4 (Agarwal 2015; Dean L. 2012 Medical Genetics Summaries, Bethesda MD; Sweetser et al. 1993 GeneReviews((R)), Seattle WA; de Winter et al. 2016 Orphanet J. Rare Dis. 11:37); MECP2 (Leonard et al. 2017 Nat. Rev. Neurol. 13(1):37-51; Chahil and Bollu 2018 StatPearls: Treasure Island FL; Seltzer and Paciorkowski 2014 Am. J. Med. Genet. C. Semin. Med. Genet. 166C(2):140-155; Fuertes-Gonzales et al. 2011 Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 16(1):e37-41); UBE3A (Dagli et al. 1993 GeneReviews((R)): Seattle WA; Pelc et al. 2008 Neuropsychiatr. Dis. Treat. 4(3):577-584; Pelc et al. 2008 Sleep Med. 9(4):434-441); DYRK1A (Luco et al. 2016 BMC Med. Genet. 17:15); MEF2C (Vrecar et al. 2017 J. Pediatr. Genet. 6(3):129-141); NSD1 (Tatton-Brown et al. 1993 GeneReviews((R)): Seattle WA); ATRX (Stevenson R. E. 1993 GeneReviews((R)): Seattle WA; Bouazzi et al. 2016 Indian J. Med. Res. 143(1):43-48); RPS6KA3 (Miyata et al. 2018 Brain Dev. 40(7):566-569; Morino et al. 2016 Medicine (Baltimore) 95(31):e4468; Touraine et al. 2002 Eur. J. Pediatr. 161(4):179-187; Tos et al. 2015 Genet. Couns. 26(1):47-52); MBD5 (Talkowski et al. 2011 Am. J. Hum. Genet. 89(4):551-563); ZEB2 (Hegarty et al. 2015 Prog. Neurobiol. 132:81-95).

표 1의 (단일유전자 또는 다중유전자) 과발현에 대한 인간 및 동물 모델을 설명하는 참조는 다음과 같다: 트리소미 18 (Roberts et al. 2016 Clin. Anat. 29(5):628-632; de Queiroz et al. 2007 J. Dent. Child (Chic) 74(1):67-72); MeCP2 중복 증후군 (Miguet et al. 2018 J. Med. Genet. 55(6):359-371); Dup15Q (Finucane et al. 1993 GeneReviews((R)): Seattle WA; Copping et al. 2017 Hum. Mol. Genet. 26(20):3995-4010; Wegiel et al. 2012 J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71(5):382-397); 다운 증후군 (Duchon and Herault 2016 Front. Behav. Neurosci. 10:104; Kent and Vorperian 2013 J. Speech Lang. Hear. Res. 56(1):178-210; Araujo et al. 2015 Epilepsy Behav. 53:120-125; Guedj et al. 2012 Neurobiol. Dis. 46(1):190-203; Carter et al. 2008 Neuroreport 19(6):653-656); dup5Q14.3 (Cesaretti et al. 2016 Am. J. Med. Genet. A 170A(5):1352-1357); 역소토스 증후군 (Rosenfeld et al. 2013 Mol. Syndromol. 3(6):247-254); Xq13.2q21.1 (Lugtenberg et al. 2009 Am. J. Med. Genet. A 149A(4):760-766; Berube et al. 2002 Hum. Mol. Genet. 11(3):253-261); Xp22.12 (Matsumoto et al. 2013 J. Hum. Genet. 58(11):755-757; Tejada et al. 2011 Pediatrics 128(4):e1029-1033); 2q23.1 중복 (Mullegama et al. 2014 Eur. J. Hum. Genet. 22(1):57-63); 2q22.3 삼중복 (Yuan et al. 2015 Mol. Cytogenet. 8:99).

내인성 3'UTR의 완전한 표적 목록은 targetscan.org에서 확인될 수 있다. 표 2의 각 칸(cell)에서, 컨텍스트(context) ++ 백분위수 점수(percentile score)는 2개의 종 (인간/마우스)에 대해 열거된다. 높은 점수는 유리한 게놈 컨텍스트(favorable genomic context)를 가진 표적을 나타낸다. 합성 패널은 위에 열거된 많은 내인성 3' UTR에 결합할 것으로 예상되는 miRNA의 표적을 포함한다. 6개의 선택된 표적 중, 4개의 표적은 MeCP2 발현과 관련하여 증가된 발현이 입증된 miRNA (miR-9-5p, miR-26b-5p, miR-27-3p 및 let-7-5p)에 결합해야 한다 (도 9의 HTS 데이터 참조). 또한, MeCP2 발현과 let-7 간에 상관관계 (Urdinguio et al. 2010 Epigenetics 5(7):656-663; Wu et al. 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(42):18161-18166); TCF4 발현과 miR-218 간에 상관관계 (Hassan et al. 2012 J. Biol. Chem. 287(50):42084-42092); 및 miR-23a-3와 MEF2C 발현 간에 상관관계 (Kalsotra et al. 2014 Cell Rep. 6(2):336-345)가 발표되었다. 발표되지 않은 HTS 데이터는 경부 척수의 miR-23a-3p 발현과 MeCP2 발현의 증가 추세를 보여주었다. 다른 표적은 다음과 같은 이유로 제외되었다: (1) 표적은 전이유전자 발현에 약간의 영향을 미친다 (즉, miR-494-3p; 도 8 참조); (2) 표적은 위에서 검사된 UTR에 나타나지 않는다 (즉, miR-451a); (3) 해당 miRNA는 AAV9/EGFP 와 관련하여 상향조절된다 (즉, miR-30c-5p); 또는 (4) 표적은 공지된 MECP2 바이러스 게놈의 합성 원위(distal) MECP2 pA의 성분으로 이미 제시된다 (즉, miR-124-3p) (Sinnett et al. 2017; Gadalla et al. 2017). X는 인간 또는 마우스 3' UTR에 표적이 없음을 나타낸다. --/--를 포함하는 상자(box)는 표적이 인간(/--) 또는 마우스(--/) 3'UTR만 있음을 나타낸다. 나머지 표적은 두 종에서 나타난다. 종에 대해 유사하거나 동일한 5' 인접 서열을 가진 표적은 # 기호로 표시된다. 보존된 5' 인접 서열이 없는 표적은 β 기호로 표시된다. 굵게 윤곽이 표시된 표적 (및 그의 인접 서열)은 합성 패널로 선택되었다. 마지막으로, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, 및 miR-7-5p에 대한 표적은 이러한 miRNA에 대한 결합 부위가 위에 열거된 많은 유전자 (targetscan.org 참조)에 존재하기 때문에 범용 표적 패널에 삽입될 후보가 될 수 있으며, 이러한 miRNA의 증가된 발현은 MeCP2 발현과 관련하여 관찰되었다.

miRNA 표적의 평가 및 그 인간 게놈 컨텍스트

*유전자*	5' 인접 서열	miR-9-5p 표적	3' 인접 서열
MECP2	CUCCUGGCACU- (SEQ ID NO:3) (36% AU)	ACCAAAG-	GACACUUAUCCA (SEQ ID NO:4) (58% AU)
UBE3A	CUGUUCUAGCCC (SEQ ID NO:5) (42% AU; WC M12-M15)	-CCAAAGA	-GUUUUCUGUGC (SEQ ID NO:6) (55% AU)
DYRK1A	UAAUUUAUUGU- (SEQ ID NO:7) (91% AU)	ACCAAAG-	CUGUUUUUAUAG (SEQ ID NO:8) (75% AU)
MEF2C	AAUAUGUUUUA- (SEQ ID NO:9) (91% AU)	ACCAAAGA	-UGUGGAGCAAU (SEQ ID NO:10) (55% AU)
MBD5	CAUUUGCAUUAG (SEQ ID NO:11) (67% AU)	-CCAAAGA	-GAUAAGAACAU (SEQ ID NO:12) (73% AU)
ZEB2	GGGGAAAAAAC- (SEQ ID NO:13) (55% AU)	ACCAAAGA	-AUUCACAUGGG (SEQ ID NO:14) (55% AU)
TCF4	UUUAUGAAAUUU (SEQ ID NO:15) (92% AU)	-CCAAAGA	-UUUUGGUUGAU (SEQ ID NO:16) (73% AU)
Vg	CTGTTCTAGCCC (SEQ ID NO:17) (42% AT; WC M12-M15)	-CCAAAGA	-GTTTTCTGTGC (SEQ ID NO:18) (55% AT)
*유전자*	5' 인접 서열	miR-26-5p 표적	3' 인접 서열
MECP2	-AGGCUUGCAGA (SEQ ID NO:19) (45% AU)	-ACUUGAA	GCCUGCUCCUU (SEQ ID NO:20) (36% AU)
UBE3A	-UUGCUUUUGAA (SEQ ID NO:21) (73% AU)	-ACUUGAA	GUCUUGAAAAC (SEQ ID NO:22) (64% AU)
DYRK1A	-UUUUUUUUUUA (SEQ ID NO:23) (100% AU)	-ACUUGAA	AAGAUUGCAAA (SEQ ID NO:24) (73% AU)
MEF2C	-AAGAAGAAGCC (SEQ ID NO:25) (55% AU)	-ACUUGAA	CCCUCAAUAAA (SEQ ID NO:26) (64% AU)
NSD1	-GAGGUUGAGAC (SEQ ID NO:27) (45% AU)	-ACUUGAA	CUCAGGCAGAG (SEQ ID NO:28) (36% AU)
ATRX	ACAAUUUUGGU- (SEQ ID NO:29) (73% AU)	UACUUGAA	UUGUUAAAGAA (SEQ ID NO:30) (82% AU)
MBD5	-AAAAGAAAACA (SEQ ID NO:31) (82% AU)	-ACUUGAA	CAUUUUCAAUA (SEQ ID NO:32) (82% AU)
ZEB2	-UCUGUGAAGGA (SEQ ID NO:33) (55% AU)	-ACUUGAA	GUGAUGCAUGU (SEQ ID NO:34) (55% AU)
TCF4	-UUUCUCAUGGG (SEQ ID NO:35) (55% AU)	-ACUUGAA	GUGGACUCAUC (SEQ ID NO:36) (45% AU)
vg	-TTGCTTTTGAA (SEQ ID NO:37) (73% AT)	-ACTTGAA	GTCTTGAAAAC (SEQ ID NO:38) (64% AT)
*유전자*	5' 인접 서열	miR-23-3p 표적	3' 인접 서열
MECP2	-UUUUUUAAUAC (SEQ ID NO:39) (91% AU)	-AUGUGAA	-AGCAAAGAAUA (SEQ ID NO:40) (73% AU)
UBE3A	-AAACAAAAAGC (SEQ ID NO:41) (73% AU)	-AUGUGAA	-AGUGCACUUAA (SEQ ID NO:42) (64% AU)
DYRK1A	AACACUAUGUA- (SEQ ID NO:43) (73% AU)	AAUGUGAA	-UGGAAACUUGG (SEQ ID NO:44) (55% AU)
MEF2C	CCUUCUCUUGG- (SEQ ID NO:45) (45% AU)	AAUGUGAA	-GAUCUGUCGAU (SEQ ID NO:46) (55% AU)
NSD1	-UUUCCAAAGGG (SEQ ID NO:47) (55% AU; WC M14-M16)	-AUGUGAA	-UUGGAGUGAAA (SEQ ID NO:48) (64% AU)
ATRX	-CAAAGACAUAG (SEQ ID NO:49) (64% AU)	-AUGUGAA	-AAUUUUAGGCA (SEQ ID NO:50) (73% AU)
RPS6KA3	CAGCUGGUUCC- (SEQ ID NO:51) (36% AU)	AAUGUGA-	CUGAGUGUUCUC (SEQ ID NO:52) (50% AU)
MBD5	AAGUAAGAAAA- (SEQ ID NO:53) (82% AU)	AAUGUGAA	-ACAAAUGUAGA (SEQ ID NO:54) (73% AU)
ZEB2	-UUAUGACAUAU (SEQ ID NO:55) (82% AU)	-AUGUGAA	-CACAUCACAAA (SEQ ID NO:56) (64% AU)
TCF4	-AUUUGGUUCAC (SEQ ID NO:57) (64% AU)	-AUGUGAA	-GUGCCCUCCAU (SEQ ID NO:58) (36% AU)
vg	-CAAAGACATAG (SEQ ID NO:59) (64% AT)	-ATGTGAA	-AATTTTAGGCA (SEQ ID NO:60) (73% AT)
*유전자*	5' 인접 서열	miR-218-5p 표적	3' 인접 서열
MECP2	UUCUUACCGAC- (SEQ ID NO:61) (55% AU; WC M12-M14)	AAGCACA-	GUCAGGUUGAAG (SEQ ID NO:62) (50% AU)
UBE3A	AACUUUAGUAAC (SEQ ID NO:63) (75% AU; WC M12-M15)	-AGCACAA	-CAAAUUAAAAA (SEQ ID NO:64) (91% AU)
MEF2C	UUAAUGAGAAG- (SEQ ID NO:65) (73% AU)	AAGCACAA	-UUUUGAUUUUG (SEQ ID NO:66) (82% AU)
ATRX	GCACGAAUAUA- (SEQ ID NO:67) (64% AU)	AAGCACA-	UCUCUUAACUGC (SEQ ID NO:68) (58% AU)
RPS6KA3	GUGUAAGCUGAU (SEQ ID NO:69) (58% AU; WC M15-M19)	-AGCACAA	-GUUCUGGCGAC (SEQ ID NO:70) (36% AU)
MBD5	AAUAAGAAAUGU (SEQ ID NO:71) (83% AU)	-AGCACAA	-CAUAAUUUUCC (SEQ ID NO:72) (73% AU)
ZEB2	AUUUAUACUUU- (SEQ ID NO:73) (91% AU; WC M15-M17)	AAGCACAA	-CUAGAAAAUUG (SEQ ID NO:74) (73% AU)
TCF4	UCAGCAUAAAC- (SEQ ID NO:75) (64% AU)	AAGCACAA	-AAAUUUAGUCU (SEQ ID NO:76) (82% AU)
vg	GTGTAAGCTGAT (SEQ ID NO:77) (58% AT; WC M15-M19)	-AGCACAA	-GTTCTGGCGAC (SEQ ID NO:78) (36% AT)
*유전자*	5' 인접 서열	miR-27a-3p 표적	3' 인접 서열
MECP2	-GAUAAAUCUCU (SEQ ID NO:79) (73% AU)	-CUGUGAA	-AGUGA (60% AU)
DYRK1A	-UCACAAUUAUG (SEQ ID NO:80) (73% AU)	-CUGUGAA	-UUUUACAAAAA (SEQ ID NO:81) (91% AU)
MEF2C	-UUUAAAAAAAU (SEQ ID NO:82) (100% AU)	-CUGUGAA	-AUUAACAUGCU (SEQ ID NO:83) (73% AU)
NSD1	UCAUGAAAUAA- (SEQ ID NO:84) (82% AU)	ACUGUGAA	-UUUGGGGGGGG (SEQ ID NO:85) (27% AU)
ATRX	-AAAUCAUACAG (SEQ ID NO:86) (73% AU)	-CUGUGAA	-GACUUGCCUUU (SEQ ID NO:87) (55% AU)
MBD5	ACAAACCUAAA- (SEQ ID NO:88) (73% AU)	ACUGUGA-	GCCAUUGUAAA- (SEQ ID NO:89) (64% AU)
ZEB2	-UUUUUUUUUUU (SEQ ID NO:90) (100% AU)	-CUGUGAA	-GGAACUUGAAG (SEQ ID NO:91) (55% AU)
TCF4	-UUGGGGCUUUC (SEQ ID NO:92) (45% AU)	-CUGUGAA	-AUGUAUGAACA (SEQ ID NO:93) (73% AU)
vg	-TCACAATTATG (SEQ ID NO:94) (73% AT)	-CTGTGAA	-TTTTACAAAAA (SEQ ID NO:95) (91% AT)
*유전자*	5' 인접 서열	let-7e/98-5p 표적	3' 인접 서열
MECP2	GUUGUUAGUUA- (SEQ ID NO:96) (73% AU)	CUACCUC-	CUCUCCUGACA- (SEQ ID NO:97) (45% AU)
DYRK1A	GAAGCAGUAAU- (SEQ ID NO:98) (64% AU)	CUACCUC-	UGCCGAUAACC- (SEQ ID NO:99) (45% AU)
MEF2C	CAAAUUGAUUCA (SEQ ID NO:100) (75% AU)	-UACCUCA	-GUUUAAUUCAG (SEQ ID NO:101) (73% AU)
NSD1	UCUGCCCCUCU- (SEQ ID NO:102) (36% AU)	CUACCUC-	UUCCACUCAUG- (SEQ ID NO:103) (55% AU)
MBD5	CACUGUGUGUG- (SEQ ID NO:104) (45% AU)	-UACCUCA	-GUGACCUUUUA (SEQ ID NO:105) (64% AU)
RPS6KA3	GAGCCUACUUC- (SEQ ID NO:106) (45% AU)	CUACCUC-	UUAAGGCACUU- (SEQ ID NO:107) (64% AU)
vg	GAAGCAGTAAT- (SEQ ID NO:108) (64% AT)	CTACCTC-	AGCCGATAACC- (SEQ ID NO:109) (45% AT)

인간 3' UTR에서 나타난 표적 및 그 인접 서열은 표 3의 각 유전자 옆에 표시된다. 합성 패널을 위해 선택된 서열은 "vg" (바이러스 게놈) 옆에 열거된다. 주어진 miRNA에 대해 2개 이상의 표적이 인간 3' UTR에 존재한 경우, 종에 대해 보존된 표적 서열을 선택하고 상기 표에 열거하였다. 합성 패널을 위한 5' 인접 서열을 선택할 때 다음의 매개변수가 고려되었다: (1) 메신저 RNA(mRNA) 13~16 뉴클레오티드 (M13-M16)에 선호되는 쌍을 가진 (Targetscan에 의해 예측된) 중대한(consequential) 왓슨-크릭(WC) 염기쌍 (Grimson et al. 2007 Mol. Cell 27(1):91-105); (2) 종에 대한 5' 인접 서열의 보존 (표 2 참조); (3) Targetscan에 열거된 컨텍스트 ++ 백분위수 점수; 및 (4) 서열 복잡성 (상업적인 유전자 합성은 전체 합성 패널에 대해 35% 미만의 %GC 함량을 요구한다). 선택된 각 5' 인접 서열에 대하여, 동일한 UTR의 3' 인접 서열은 표적 패널에 삽입하기 위해 선택되었다. (3) (하이라이트 및 굵게 표시된) 하나의 돌연변이는 mRNA-Argonaute 상호작용을 촉진하기 위한 T1A 앵커(anchor)를 생성하기 위해 도입되었다 (Schirle et al. 2015 Elife (4); Schirle et al. 2014 Science 346(6209):608-613). miRNA 서열의 유사성으로 인해, let-7e-5p의 표적은 다른 let-7 miRNA에 결합할 수 있다. Let-7a-5p, let-7b-5p, 및 let-7g-5는 응집 데이터 분석에서 MECP2(+) 경부 척수 조직의 증가된 발현을 보였으며; let-7c-5p, let-7d-5p, 및 let-7g-5p는 MECP2 바이러스를 처리한 후 Mecp2 ^-/y 마우스에서 증가된 발현을 보였다. 또한, let-7e-5p 표적은 경부 척수 조직에 대한 응집 데이터 분석에서 발현 수준이 증가한 miR-98-5p에 결합할 수 있다. T1A 앵커는 표적 열(column)에 밑줄을 그었다. Argonaute 상호작용의 입체구조(conformation)를 최적화하는 것으로 여겨지는 T9A/Us는 5' 인접 서열 열에 밑줄을 그었다 (Lewis et al. 2005 Cell 120(1):15-20).

표 2 와 비교한다. 세포유지 유전자(housekeeping gene)의 3' UTR는 표 4에 나타낸 바와 같이, 조사된 표적 중 거의 없다. 표 4의 라벨링(labeling)은 표 2에 대한 설명한 바와 같이 다음과 같다. 따라서, 지적 능력을 매개하는 유전자들에 대한 표적의 보존은 생리적으로 중요할 수 있다. 내인성 3' UTR의 완전한 표적 목록은 targetscan.org에서 확인될 수 있다. 표 4의 각 칸에서, 컨텍스트 ++ 백분위수 점수는 2개의 종 (인간/마우스)에 대해 열거된다. 높은 점수는 유리한 게놈 컨텍스트를 가진 표적을 나타낸다. ACTB, beta-actin; ATF1, activating transcription factor 1; DAD1, defender against cell death 1; DARS, aspartyl-tRNA synthetase; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; HSPA4, heat shock protein family A (Hsp70) member 4; MRPL9, mitochondrial ribosomal protein L9; POLR1C, RNA polymerase I and III subunit C; PRKAG1, protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 1; RPL5, ribosomal protein L5.

실시예 4: RTT-특이 구조체의 개발

추가 구조체는 본 명세서에서 "reg1"이라고 하는 RTT에 대해 특정하도록 개발되었다. 이 서열의 표적은 뇌와 척수 RNA의 높은 처리량 선별(high-throughput screen)에서 MeCP2 발현과 관련하여 상향조절된 것으로 보여지는 miRNA에 해당한다.

reg1의 서열은 다음과 같다. 시드 매치는 밑줄을 긋고, 모든 다른 시드 매치 및 인접 서열 부분은 이탤릭체로 한다. 결합 위치 핵심 (5'-3' 순서로): miR-451a; let-7-5p; miR-690.

5'ATAAGGGCAGA AACGGTT CACATTCCATTCTGCCCCGGACCTACCTCCCTCCCTCTCCTTATCAAACCC TAGCCTT GCTTGTTAAAT-3' (서열번호 2)

Reg1은 WT 마우스에서 시험되었으며, 도 10 (도 10a 및 도 10b)에 나타낸 바와 같이, WT 푸르키네 세포에서 엄격하게 조절되는 총 MeCP2 발현을 보여주었다. 푸르키네 세포는 수조내 주입 부위와 가까운 곳에 위치하며 초생리적인 전이유전자를 발현하기 쉽다. 각 핵에 대해 수정된 총 세포 형광 (항-MeCP2 신호)은 myc(-) 푸르키네 핵에 대한 평균 MeCP2 신호로 정규화되었다. 도 10 패널 A의 각 마우스에 대해 제시된 평균은 특정 숙주에 대해 정량화된 모든 myc(+) 핵에 대해 평균화된 정규화 MeCP2 신호를 나타낸다. Z 스택 내 세포에 대해 반복적으로 평균화한 다음, 단일 마우스 내 Z 스택에 대해서도 반복적으로 평균화하여 총 MeCP2 발현에서 유의한 감소를 보였다 (vs. 공지된 대조구 AAV9/MeP426-miniMECP2-myc-RDH1pA에서 관찰된 것; Gadalla et al. 2017). 형질도입된 푸르키네 세포의 평균 총 MeCP2 발현 (mini + 내인성 전체 길이)은 도 10 패널 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 형질도입되지 않은 푸르키네 세포의 5배였다. (miR-124-3p에 대한 3개의 표적을 나타내는) 신경 녹다운에 대한 양성 대조구 패널은 과발현이 절반으로 감소하였다 (p = 0.06). reg1 카세트는 또한 과발현이 절반으로 감소하였다 (p = 0.02). 도 10 패널 C는 총 MeCP2 강도의 히스토그램을 보여주며, reg1이 총 MeCP2 강도의 분포를 좁히고, 보다 강력한 조절을 나타냄을 설명한다. 국소 형질도입 효율은 소뇌 전체에서 다르기 때문에, 형질도입된 푸르키네 세포의 평균 총 MeCP2 강도 vs. 국소 형질도입 효율은 도 10 패널 D에 표시되었으며, 각 데이터 포인트는 단일 Z 스택 내의 푸르키네 세포에 대한 평균 강도 및 형질도입 효율을 나타낸다. 추세선은 단일 마우스의 Z 스택을 연결한다. reg1 카세트는 높은 형질도입 효율을 가진 소뇌 영역에서도 총 MeCP2 발현을 제한하였다. 대조적으로, 음성 대조구 패널은 높은 국소 형질도입 효율을 가진 영역에서 생리적인 수준을 크게 초과하는 총 MeCP2 발현을 허용하였다. 도 10 패널 E는 NeuN+ 세포에서 전이유전자 발현이 허용된 reg1 카세트를 보여준다. 대조적으로, 신경 녹다운에 대한 양성 대조구는 NeuN+ 세포의 백분율이 감소하였다. 유사하게, 도 11은 이형접합 모자이크(heterozygous mosaic) 암컷 마우스에 AVVV9/mini-MECP2-reg1을 수조내 투여한 후 reg1이 간 전이유전자 발현을 감소시킨 예비 데이터를 보여준다.

실험예 5: 일반화된 패널 설계 전략 및 실험 연구

도 12는 RTT 특이 패널 "reg1"과 광범위하게 적용 가능한 패널 ("reg2" 또는 "UNIVT"로 표시함)을 설계하기 위한 전략을 요약한다. 도 12 패널 A는 원래 생체내 외인성 MeCP2 발현을 안전하게 조절하기 위해 RTT 특이 표적 패널을 설계하는데 사용된 microRNA 발현 데이터를 보여준다. 동일한 발현 데이터는 도 12 패널 B에 나타낸 바와 같이, reg2 설계를 목적으로 UTR 데이터 세트를 가공하기 위한 선택 기준을 제공하였다. 2491명의 인간 표적 목록은 도 12 패널 C-G에 설명된 단계를 통해 현재 reg2로 특징된 6개의 보존 표적으로 좁혀졌다. 이러한 표적 중 5개는 MeCP2 유도 miRNA에 결합하는 것으로 예측된다 (표 1 참조). let-7 표적 염기쌍이 많은 let-7 miRNA 시드를 가지기 때문에 reg2 패널은 최대 11개의 miRNA와 결합할 수 있다. Reg1 및/또는 Reg2에 포함된 miRNA 시드에 결합할 수 있는 잠재적 miRNA의 비제한 목록은 표 5에 나타낸다.

Reg1 및 Reg2의 MECP2 유도 miRNA 및 그 해당 표적

miRNA	내인성 MeCP2	외인성 MeCP2	응집된 MECP2(+) 처리군	해당 표적	패널 설계
miR-690	연수	--	경부 척수	miR-690	Reg1
miR-451a	경부 척수	--	연수	miR-451a	Reg1
let-7e-5p	경부 척수	--	경부 척수	let-7-5p	Reg1 및 Reg2
let-7a-5p	--	--	경부 척수
let-7b-5p	--	--	경부 척수
let-7c-5p	--	경부 척수	--
let-7d-5p	--	경부 척수	--
let-7g-5p	--	경부 척수	경부 척수
miR-98-5p	경부 척수	--	경부 척수
miR-9-5p	--	--	경부 척수	miR-9-5p	Reg2
miR-218-5p	--	--	--	miR-218-5p
miR-26b-5p	경부 척수	--	경부 척수	miR-26-5p
miR-23a-3p	--	경부 척수	--	miR-23-3p
miR-27a-3p	--	--	경부 척수	miR-27-3p

miRNA 발현 vs. 내인성 MeCP2 발현, 외인성 MeCP2 발현, 및/또는 응집된 (내인성 및 외인성) MeCP2 발현 간의 상관관계를 확인하였다. 또한, 개념적으로 MeCP2 피드백 루프에 기여할 수 있는 miRNA가 아직 확인되지 않았을 가능성이 있다. miRNA 시드와 miRNA 표적 패널 사이에 왓슨-크릭(WC) 염기쌍을 허용하는 시드 서열을 포함하는 모든 miRNA는 외인성 MeCP2 조절를 매개하는데 도움이 될 수 있다.

추가 실험은 reg1 RTT 특이 구조체와 reg2 광범위하게 적용 가능한 구조체 모두로 계속되었다. 도 13은 PHP.B 매개 miniMECP2 유전자를 전달한 후 reg2가 생체내 WT 뇌의 전이유전자 발현 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 14는 대표적인 소뇌 타일 스캔(tile scan)에서 푸르키네 세포의 miniMeCP2 발현에 대한 reg2 의존적 억제를 보여준다. 도 13의 왼쪽에서, 화살표는 대조구 벡터 처리 마우스의 여러 소뇌엽에서 myc(+) 푸르키네 신경을 나타낸다. reg2 처리 마우스에서, 대부분의 푸르키네 세포는 myc(-)이었다. 도 13의 오른쪽에서, 화살표는 전정소뇌(vestibulocerebellar) 영역으로 제한된 miniMeCP2 발현을 나타낸다. reg2 처리 마우스는 0% myc(+) 또는 100% myc(+)인 푸르키네 세포 층의 넓은 구획(swathe)을 가지고 있었기 때문에, 이웃한 myc(+)와 myc(-) 푸르키네 세포의 총 MeCP2 발현에 대한 정량 분석은 권고되지 않았다.

도 15A-15C (도 15a 및 도 15b)는 reg2가 다중 뇌 영역에서 광범위하게 허용되지만, 발현이 엄격하게 제어된다는 것을 나타낸다. 많은 myc(+) 세포에 대한 항-myc 면역형광 신호가 검출 한계를 겨우 넘었기 때문에, 도 15A의 reg2 처리 마우스에 대해 표시된 myc(+) 세포의 백분율은 실제 형질도입된 세포의 백분율에 대해 과소평가했을 가능성이 가장 높았다. 조사된 3개의 영역 중 해마는 (reg2 vs. 대조구 처리 마우스) myc(+) 세포 %에서 가장 급격한 감소를 보였다. 도 15B는 시상, 해마 및 연수에 대한 대표 이미지를 보여준다. 도 15C는 Reg2가 시상의 겉보기 신경 친화성(apparent neuronal tropism)을 강화했음을 보여준다. 도 16은 reg2가 간(liver)에서 miniMeCP2 조절을 개선할 수 있다는 것도 보여준다.

예비 생존 연구는 도 17에 나타낸 바와 같이 식염수 및 바이러스 처리 KO 마우스에서 수행되었다. 마우스는 생후 4~5주에 수조내로 주입되었다. 비록 reg2가 전이유전자 발현에 강한 억제 효과를 가졌지만, reg2는 PHP.B/miniMECP2 (1E11 vg/마우스)에 의해 매개된 중간 생존(median survival)의 확장을 약화시키는 것으로 나타나지 않았다. 또한, reg2 처리는 조기 사망이 더 적었다. 각 코호트(cohort)에 여전히 살아있는 마우스의 수를 표시한다. 표 6은 처리된 KO 마우스의 전체 수명에서 정상적인 뒷다리 기능을 유지한 백분율을 보여준다. (비조절된 벡터 vs.) 조절된 벡터가 처리된 KO 마우스는 전체 수명에서 정상적인 뒷다리 표현형을 유지할 가능성이 더 높았다.

생존 연구 동안 정상적인 뒷다리를 유지하는 처리된 KO 마우스

처리	% (n)
식염수 ICM	38% (5/13)
PHP.B/mini, 1E10-1E11 vg ICM	18% (4/22)
PHP.B/mini-reg2, 1E10-1E11 vg ICM	43% (10/23)
AAV9/full-length MECP2 (공지된 표준), 1E10-1E11 vg ICM	12% (3/24) (Sinnett et al., 2017, MTMCD에 의해 발표된 연구에서 사용된 마우스에 대한 미발표 데이터)

상술한 실시예들은 본 발명을 분명히 보여주며, 이를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 비록 본 발명이 바람직한 구체예와 관련하여 상세하게 기재되어 있으나, 변이와 변형은 다음의 청구범위에 기재되고 정의되는 본 발명의 범위와 원리 내에 존재한다.

<110> The University of North Carolina at Chapel Hill <120> Feedback Enabled Synthetic Genes, Target Seed Match Cassettes, and Their Uses <130> PI210006 <150> PCT/US 2019/048776 <151> 2019-08-29 <150> US 62/861044 <151> 2019-06-13 <150> US 62/725126 <151> 2018-08-30 <160> 109 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 175 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reg2 <400> 1 ctgttctagc ccccaaagag ttttctgtgc ttgcttttga aacttgaagt cttgaaaacc 60 aaagacatag atgtgaaaat tttaggcagt gtaagctgat agcacaagtt ctggcgactc 120 acaattatgc tgtgaatttt acaaaaagaa gcagtaatct acctcagccg ataac 175 <210> 2 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reg1 <400> 2 ataagggcag aaacggttca cattccattc tgccccggac ctacctccct ccctctcctt 60 atcaaaccct agccttgctt gttaaat 87 <210> 3 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 cuccuggcac u 11 <210> 4 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gacacuuauc ca 12 <210> 5 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 cuguucuagc cc 12 <210> 6 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 guuuucugug c 11 <210> 7 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 uaauuuauug u 11 <210> 8 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 cuguuuuuau ag 12 <210> 9 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 aauauguuuu a 11 <210> 10 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 uguggagcaa u 11 <210> 11 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 cauuugcauu ag 12 <210> 12 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 gauaagaaca u 11 <210> 13 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggggaaaaaa c 11 <210> 14 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 auucacaugg g 11 <210> 15 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 uuuaugaaau uu 12 <210> 16 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 uuuugguuga u 11 <210> 17 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-9-5p target 5' flanking <400> 17 ctgttctagc cc 12 <210> 18 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-9-5p target 3' flanking <400> 18 gttttctgtg c 11 <210> 19 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 aggcuugcag a 11 <210> 20 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 gccugcuccu u 11 <210> 21 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 uugcuuuuga a 11 <210> 22 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 gucuugaaaa c 11 <210> 23 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 uuuuuuuuuu a 11 <210> 24 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 aagauugcaa a 11 <210> 25 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 aagaagaagc c 11 <210> 26 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 cccucaauaa a 11 <210> 27 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 gagguugaga c 11 <210> 28 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 cucaggcaga g 11 <210> 29 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 acaauuuugg u 11 <210> 30 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 uuguuaaaga a 11 <210> 31 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 aaaagaaaac a 11 <210> 32 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 cauuuucaau a 11 <210> 33 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 ucugugaagg a 11 <210> 34 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 gugaugcaug u 11 <210> 35 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 uuucucaugg g 11 <210> 36 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 guggacucau c 11 <210> 37 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-26-5p target 5' flanking <400> 37 ttgcttttga a 11 <210> 38 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-26-5p target 3' flanking <400> 38 gtcttgaaaa c 11 <210> 39 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 uuuuuuaaua c 11 <210> 40 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 agcaaagaau a 11 <210> 41 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 aaacaaaaag c 11 <210> 42 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 agugcacuua a 11 <210> 43 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 aacacuaugu a 11 <210> 44 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 uggaaacuug g 11 <210> 45 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 ccuucucuug g 11 <210> 46 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 gaucugucga u 11 <210> 47 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 uuuccaaagg g 11 <210> 48 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 uuggagugaa a 11 <210> 49 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 caaagacaua g 11 <210> 50 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 aauuuuaggc a 11 <210> 51 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 cagcugguuc c 11 <210> 52 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 cugaguguuc uc 12 <210> 53 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 aaguaagaaa a 11 <210> 54 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 acaaauguag a 11 <210> 55 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 uuaugacaua u 11 <210> 56 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 cacaucacaa a 11 <210> 57 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 auuugguuca c 11 <210> 58 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 gugcccucca u 11 <210> 59 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-23-3p target 5' flanking <400> 59 caaagacata g 11 <210> 60 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-23-3p target 3' flanking <400> 60 aattttaggc a 11 <210> 61 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 uucuuaccga c 11 <210> 62 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 gucagguuga ag 12 <210> 63 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 aacuuuagua ac 12 <210> 64 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 caaauuaaaa a 11 <210> 65 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 uuaaugagaa g 11 <210> 66 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 uuuugauuuu g 11 <210> 67 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 gcacgaauau a 11 <210> 68 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 ucucuuaacu gc 12 <210> 69 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 guguaagcug au 12 <210> 70 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 guucuggcga c 11 <210> 71 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 71 aauaagaaau gu 12 <210> 72 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 72 cauaauuuuc c 11 <210> 73 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 73 auuuauacuu u 11 <210> 74 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 74 cuagaaaauu g 11 <210> 75 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 75 ucagcauaaa c 11 <210> 76 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 76 aaauuuaguc u 11 <210> 77 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-218-5p target 5' flanking <400> 77 gtgtaagctg at 12 <210> 78 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-218-5p target 3' flanking <400> 78 gttctggcga c 11 <210> 79 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 79 gauaaaucuc u 11 <210> 80 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 80 ucacaauuau g 11 <210> 81 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 81 uuuuacaaaa a 11 <210> 82 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 82 uuuaaaaaaa u 11 <210> 83 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 auuaacaugc u 11 <210> 84 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 ucaugaaaua a 11 <210> 85 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 uuuggggggg g 11 <210> 86 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 aaaucauaca g 11 <210> 87 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 87 gacuugccuu u 11 <210> 88 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 acaaaccuaa a 11 <210> 89 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 gccauuguaa a 11 <210> 90 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 uuuuuuuuuu u 11 <210> 91 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 ggaacuugaa g 11 <210> 92 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 uuggggcuuu c 11 <210> 93 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 auguaugaac a 11 <210> 94 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-27a-3p target 5' flanking <400> 94 tcacaattat g 11 <210> 95 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg miR-27a-3p target 3' flanking <400> 95 ttttacaaaa a 11 <210> 96 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 guuguuaguu a 11 <210> 97 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 cucuccugac a 11 <210> 98 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 gaagcaguaa u 11 <210> 99 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 99 ugccgauaac c 11 <210> 100 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 100 caaauugauu ca 12 <210> 101 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 101 guuuaauuca g 11 <210> 102 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 102 ucugccccuc u 11 <210> 103 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 103 uuccacucau g 11 <210> 104 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 104 cacugugugu g 11 <210> 105 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 105 gugaccuuuu a 11 <210> 106 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 106 gagccuacuu c 11 <210> 107 <211> 11 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 107 uuaaggcacu u 11 <210> 108 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg let-7e/98-5p target 5' flanking <400> 108 gaagcagtaa t 11 <210> 109 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vg let-7e/98-5p target 3' flanking <400> 109 agccgataac c 11

Claims

관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자로서,
상기 폴리뉴클레오티드는 내인성 miRNA에 대한 결합 부위로 확인된 시드 매치(seed match) 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 인접 서열 및 3' 인접 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 핵산 분절(nucleic acid segment)을 더 포함하며,
상기 하나 이상의 핵산 분절은, 상기 합성 유전자가 내인성 miRNA를 발현하는 세포에 전달될 때의 상기 관심 단백질 또는 핵산의 발현이 상기 하나 이상의 핵산 분절을 포함하지 않는 합성 유전자가 내인성 miRNA를 발현하는 세포에 전달될 때의 관심 단백질 또는 핵산의 발현과 비교하여 감소되도록 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역에 삽입되는 것인 합성 유전자.
청구항 1에 있어서,
상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역은 TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX, MECP2, SLC6A1, FOXG1, AKT3, 또는 그의 활성 단편으로부터 선택된 유전자의 암호 영역을 포함하는 것인 합성 유전자.
청구항 1에 있어서,
상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역은 유전자 MECP2 또는 그의 활성 단편의 암호 영역을 포함하는 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, miR-7-5p, miR-494-3p, 또는 그의 모든 조합으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA와 결합하는 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-451a, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치는 길이가 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오티드인 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치는 길이가 약 6 내지 약 8개의 뉴클레오티드인 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열은 각각 길이가 약 9 내지 약 13개의 뉴클레오티드인 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열은 각각 길이가 11개의 뉴클레오티드인 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 최소 2개의 시드 매치를 포함하며,
상기 시드 매치는 약 7 내지 약 40개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것인 합성 유전자.
청구항 11에 있어서,
상기 최소 2개의 시드 매치는 약 20 내지 약 25개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것인 합성 유전자.
청구항 11에 있어서,
상기 최소 2개의 시드 매치는 약 22개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것인 합성 유전자.
청구항 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 3 내지 8개의 시드 매치를 포함하는 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 인접 3' 및 5' 서열은 서열번호 1과 최소 70% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 인접 3' 및 5' 서열은 서열번호 2와 최소 70% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 유전자.
청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 합성 유전자를 포함하는 벡터.
청구항 17에 있어서,
상기 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 발현 카세트, 형질전환된 세포 또는 나노입자인 것인 벡터.
청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 합성 유전자 또는 청구항 17 또는 18의 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물.
합성 유전자에 대해 용량 의존적 억제 피드백을 제공하는 폴리뉴클레오티드 표적 카세트로서,
상기 카세트는 내인성 miRNA에 대한 결합 부위로 확인된 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, miR-7-5p, miR-494-3p, 또는 그의 모든 조합으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA와 결합하는 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-451a, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치는 길이가 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치는 길이가 약 6 내지 약 8개의 뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열은 각각 길이가 약 9 내지 약 13개의 뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열은 각각 길이가 11개의 뉴클레오티드인 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열은 서열번호 1과 최소 70% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
청구항 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열은 서열번호 2와 최소 70% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 표적 카세트.
관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자를 제조하는 방법으로서,
상기 방법은 합성 유전자의 조절 영역 안에 청구항 20 내지 29 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 표적 카세트를 삽입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 합성 유전자를 제조하는 방법으로서,
상기 방법은 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에 내인성 miRNA에 대한 결합 부위로 확인된 시드 매치 및 상기 시드 매치에 이웃한 5' 및 3' 인접 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 핵산 분절을 삽입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 31에 있어서,
상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역은 TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX, MECP2, SLC6A1, FOXG1, AKT3 또는 그의 활성 단편으로부터 선택된 유전자의 암호 영역을 포함하는 것인 방법.
청구항 31에 있어서,
상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역은 유전자 MECP2 또는 그의 활성 단편의 암호 영역을 포함하는 것인 방법.
청구항 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, miR-7-5p, miR-494-3p, 또는 그의 모든 조합으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA와 결합하는 것인 방법.
청구항 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 것인 방법.
청구항 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서,
상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열은 miR-690, miR-451a, 및 let-7-5p인 miRNA와 결합하는 것인 방법.
청구항 31에 있어서,
상기 방법은
관심 단백질 또는 핵산이 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 miRNA를 선별하는 단계;
발현이 증가된 하나 이상의 miRNA에 대한 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 식별하는 단계; 및
상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역 안에 삽입되는 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 포함하는 핵산 분절을 제조하는 단계
를 더 포함하는 것인 방법.
합성 유전자에 삽입되는 하나 이상의 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 식별하는 방법으로서,
상기 방법은
관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 하나 이상의 miRNA에 대한 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 식별하는 단계; 및
상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 암호 영역 및 하나 이상의 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자의 조절 영역 안에 상기 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열을 삽입하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
청구항 38에 있어서,
상기 방법은 검증되거나 또는 추정되는 시드 매치 및 5' 및 3' 인접 서열에 대한 핵산 데이터세트를 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 38 또는 39에 있어서,
상기 방법은 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 miRNA를 식별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서,
상기 방법은 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때 발현이 증가된 miRNA에 대한 핵산 데이터세트를 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서,
상기 방법은
세포에서 상기 관심 단백질 또는 핵산을 발현시키는 단계;
상기 세포로부터 miRNA를 수집하는 단계; 및
상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현되지 않을 때와 비교하여 상기 관심 단백질 또는 핵산이 세포에서 발현될 때의 상기 miRNA의 발현 수준을 계산함으로써 상기 miRNA의 핵산 데이터세트를 생성하는 단계
를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 39, 41 또는 42 중 어느 하나에 있어서,
상기 핵산 데이터세트는 3' UTR 데이터세트인 것인 방법.
청구항 38 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
상기 관심 단백질 또는 핵산은 TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX, SLC6A1, FOXG1, AKT3, MECP2, 또는 그의 활성 단편으로부터 선택된 유전자의 전사 또는 번역 산물인 것인 방법.
청구항 38 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
상기 관심 단백질 또는 핵산은 유전자 MECP2 또는 그의 활성 단편의 전사 또는 번역 산물인 것인 방법.
개체에 합성 유전자를 전달하는 방법으로서,
상기 방법은 개체에게 청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 합성 유전자, 청구항 17 또는 18의 벡터, 또는 청구항 19의 약학적 조성물을 투여함으로써 상기 개체에게 상기 합성 유전자를 전달하는 단계를 포함하는 것인 방법.
내인성 유전자의 비정상 발현 또는 내인성 유전자에 의해 암호화된 돌연변이 단백질의 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 내인성 유전자에 의해 암호화된 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 합성 유전자, 청구항 17 또는 18의 벡터, 청구항 19의 약학적 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 46 또는 47에 있어서,
상기 개체는 인간인 것인 방법.
청구항 46 내지 48 중 어느 하나에 있어서,
상기 개체는 지적 능력 유전자 용량 민감 장애(intellectual ability gene-dose sensitive disorder)에 대한 위험을 가지거나 있는 것인 방법.
청구항 46 내지 48 중 어느 하나에 있어서,
상기 개체는 레트 증후군(Rett syndrome), MeCP2 중복 증후군(MeCP2 duplication syndrome), 안젤만 증후군(Angelman syndrome), dup15Q, DYRK1A 반가불충분성(haploinsufficiency), 다운 증후군, MEF2C 반가불충분성 증후군, dup5Q14.3, 소토스 증후군(Sotos syndrome), 역소토스 증후군(Reverse Sotos syndrome), ATRX 증후군(Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability syndrome), Xq13.2q21.1 중복, 코핀-로우리 증후군(Coffin-Lowry syndrome), Xp22.12 중복, 피트 홉킨스 증후군(Pitt Hopkins syndrome), 모왓-윌슨 증후군(Mowat-Wilson Syndrome), 2q22.3 삼중복(triplication), 2q23.1 중복, 2q23.1 미세결실(microdeletion), FOXG1 증후군, 웨스트 증후군(West Syndrome), MPPH 증후군(megalencephaly-polymicrogyria-polydactyly-hydrocephalus syndrome), AKT3 중복, 두세 증후군(Doose syndrome), SLC6A1 중복 및 트리소미 18(Trisomy 18)로 이루어진 군에서 선택된 장애에 대한 위험을 가지거나 있는 것인 방법.
청구항 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서,
상기 개체는 레트 증후군 또는 MeCP2 중복 증후군에 대한 위험을 가지거나 있는 것인 방법.
청구항 46 내지 51 중 어느 하나에 있어서,
상기 합성 유전자, 벡터, 또는 약학적 조성물은 장관, 비경구, 경막내, 수조내, 뇌내, 뇌실내, 비강내, 이내, 안구내, 안구주위, 직장내, 근육내, 복강내, 정맥내, 경구, 설하, 피하 및 경피로 이루어진 군에서 선택된 전달 경로에 의해 전달되는 것인 방법.
청구항 46 내지 51 중 어느 하나에 있어서,
상기 합성 유전자는 정맥내로 전달되는 것인 방법.
청구항 46 내지 51 중 어느 하나에 있어서,
상기 합성 유전자는 CSF 내(intraCSF) 전달되는 것인 방법.
청구항 46 내지 54 중 어느 하나에 있어서,
상기 방법은 상기 개체에서 상기 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 내인성 유전자를 유전학적으로 녹다운하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 55에 있어서,
상기 내인성 유전자는 MECP2인 것인 방법.
개체에서 내인성 유전자의 비정상 발현 또는 내인성 유전자에 의해 암호화된 돌연변이 단백질의 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법으로서,
상기 방법은
개체의 세포에 내인성 유전자를 유전학적으로 녹다운하는 단계; 및
상기 내인성 유전자에 의해 암호화된 관심 단백질 또는 핵산을 암호화하는 청구항 1 내지 14 중 어느 하나의 합성 유전자, 청구항 15 또는 16의 벡터, 또는 청구항 17의 약학적 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
청구항 57에 있어서,
상기 질병은 레트 증후군, MeCP2 중복 증후군, 안젤만 증후군, dup15Q, DYRK1A 반가불충분성, 다운 증후군, MEF2C 반가불충분성 증후군, dup5Q14.3, 소토스 증후군, 역소토스 증후군, ATRX 증후군, Xq13.2q21.1 중복, 코핀-로우리 증후군, Xp22.12 중복, 피트 홉킨스 증후군, 모왓-윌슨 증후군, 2q22.3 삼중복, 2q23.1 중복, 2q23.1 미세결실, FOXG1 증후군, 웨스트 증후군, MPPH 증후군, AKT3 중복, 두세 증후군, SLC6A1 중복 및/또는 트리소미 18인 것인 방법.