JP7170656B2 - Mecp2ベースの治療 - Google Patents
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Description
A-B-C-D-E
を有し得、
式中、合成ポリペプチドの部分Bは、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すMBDアミノ酸配列であり、合成ポリペプチドの部分Dは、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を示すNIDアミノ酸配列であり、次の3つのうち少なくとも1つが真である:合成ポリペプチドの部分Aが30未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6で示されるアミノ酸配列と90%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Cが20未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号7に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号7に示されるアミノ酸配列と90%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Eは存在しないか、ポリペプチドタグであるか、及び/又は配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8に示されるアミノ酸配列と90%未満の同一性を有する。当業者は、この一般構造が、一般に認められる、合成ポリペプチドのN末端からC末端の方向に左から右に開示されることを理解するであろう。
本発明は、MBDアミノ酸配列及びNIDアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドを提供する。
・ギャップペナルティ:8
・ギャップ長ペナルティ:2
・末端ギャップにペナルティはない。
A-B-C-D-E
を有し、式中、合成ポリペプチドの部分Bは、上述のようなMBDアミノ酸配列であり、合成ポリペプチドの部分Dは、上述のような前記NIDアミノ酸配列である。しかしながら、上記で説明したように、MBD及びNIDドメイン以外の合成ポリペプチドの部分、すなわち部分A、C、及びDは、野生型MeCP2配列と比較して変化を有し得る。したがって、合成ポリペプチドは以下の1つ以上に従う変化を含み得る:合成ポリペプチドの部分Aが40未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号5及び6に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号5及び6で示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Cが20未満のアミノ酸長であり、及び/又は配列番号7に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号7に示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有する;合成ポリペプチドの部分Eは存在しないか、タンパク質タグであるか、及び/又は配列番号8に示されるアミノ酸配列の全長にわたって計算して、配列番号8に示されるアミノ酸配列と95%未満の同一性を有する。
本発明は、本発明の合成ポリペプチドをコードする核酸構築物、及び本発明の合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターはウイルスベクターであってもよく、したがって、本発明はまた、本発明による発現ベクターを含むビリオンを提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように適合された合成遺伝子構築物を含む細胞、本発明のベクターを含む細胞、及び本発明のビリオンを産生するための細胞を提供する。
本発明の合成ポリペプチドは、レット症候群又は関連障害の影響を受ける細胞の欠陥MeCP2を置換するのに有用である。したがって、本発明は、本発明の合成ポリペプチドを投与する工程を含む、動物の疾患を治療又は予防する方法を提供する。好ましくは、疾患は、MECP2の不活性化変異に関連する神経障害、例えばレット症候群である。好ましくは動物はヒト患者である。
以下は、本発明に従って使用されるポリヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
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1. 物質及び方法
命名法
慣例に従って、以下に示す全てのアミノ酸番号は、e2アイソフォームを指す。番号は、ヒトタンパク質に2つのアミノ酸挿入がある残基385までの、ヒト(NCBI受託P51608)及びマウス(NCBI受託Q9Z2D6)の相同アミノ酸を指す。
上述のように、変異データ4が収集された。原因となるRTTを引き起こすミスセンス変異は、RettBASEデータセットから抽出された13。健康なヘミ接合体オスで同定された多型は、Exome Aggregation Consortium(ExAC)データベースから抽出された14。
MBD及びNIDは、それぞれ残基72~173及び272~312として定義された。3つ全てのコンストラクトは、エクソン1と2によってコードされた最端のN末端配列を保持し、それぞれアイソフォームe1とe2に存在する。それらにはまた、スプライス受容部位を保持するために、エクソン3の最初の3つのアミノ酸(EEK)も含まれている。介在領域(I)はΔNICで、柔軟なリンカーが前に付いたSV40のNLSに置き換えられた。NLSの配列は、PKKKRKV(配列番号32)(DNA配列:CCCAAGAAAAAGCGGAAGGTG(配列番号33))であり、リンカーのものはGSSGSSG(配列番号34)(DNA配列:GGATCCAGTGGCAGCTCTGGG (配列番号35))である。3つのタンパク質は全て、リンカーで接続されたEGFPでC末端にタグ付けされている。全長MeCP216をタグ付けする以前の研究と一致するように、リンカー配列CKDPPVAT(配列番号36)(DNA配列:TGTAAGGATCCACCGGTCGCCACC(配列番号37))を使用して、ΔNのC末端をEGFPに接続した。ΔNC及びΔNICにおいてNIDをEGFPタグに接続するために、柔軟なGSSGSSG(配列番号38)リンカーを、代わりに使用した(DNA配列:GGGAGCTCCGGCAGTTCTGGA(配列番号39))。WT-EGFP、ΔN-EGFP、ΔNC-EGFP、及びΔNIC-EGFPポリペプチドのe1及びe2アイソフォームのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号40~47として本明細書で提示される。WT-EGFP、ΔN-EGFP、ΔNC-EGFP、及びΔNIC-EGFPポリペプチドのe1及びe2アイソフォームのcDNA配列は、それぞれ配列番号48~55として本明細書で提示される。
HeLa及びNIH-3T3細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS;Gibco社)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco社)を添加したDMEM(Gibco社)で増殖させた。ES細胞は、ウシ胎児血清(FBS、Gibco社によりバッチテスト)、1%非必須アミノ酸(Gibco社)、1%ピルビン酸ナトリウム(Gibco社)、0.1%β-メルカプトエタノール(Gibco社)、及びLIF(ESGRO社)を添加したグラスゴーMEM(Gibco社)で増殖させた。
HeLa細胞にJetPEI(PolyPlus Transfection社)を使用してpEGFPN1-MeCP2プラスミドをトランスフェクトし、24~48時間後に回収した。核抽出物はBenzonase(Sigma社E1014-25KU)と150mM NaClを使用して調製し、MeCP2-EGFP複合体はこれまでに記載されたようにGFP-Trap_Aビーズ(Chromotek社)を使用して捕捉した4。タンパク質は、GFP(NEB社#2956)、NCoR(Bethyl社A301-146A)、HDAC3(Sigma社3E11)、及びTBL1XR1(Bethyl社A300-408A)に対する抗体を全て1:1000の希釈率で使用し、1:10,000希釈でのLI-COR社の二次抗体:IRDye(登録商標)800CWロバ抗マウス(926-32212)及びIRDye(登録商標)800CWロバ抗ウサギ(926-32213)又はIRDye(登録商標)680LTロバ抗ウサギ(926-68023)が後に続くウエスタンブロッティングで分析した。
NIH-3T3細胞を6ウェルプレートのカバースリップに播種し(ウェルあたり25,000細胞)、JetPEI(PolyPlus Transfection社)を使用して2μgのプラスミドDNA(pEGFPN1-MeCP2及びpmCherry-TBL1X)をトランスフェクトした。48時間後、細胞を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI(Sigma社)で染色し、次いでProLong Diamond(Life Technologies社)を使用してマウントした。固定細胞は、共焦点顕微鏡(Leica社SP5)を使用して撮影した。
エレクトロポレーションによりターゲティングベクターを129/Ola E14 TG2a ES細胞に導入し、Mecp2遺伝子座に正しくターゲティングしたG418耐性クローンをPCR及びサザンブロットスクリーニングにより同定した。CRISPR-Cas9テクノロジーは、ΔN及びΔNIC系統のターゲティング効率を高めるために使用された。ガイドRNA配列(GGTTGTGACCCGCCATGGAT)(配列番号64)がpX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Feng Zhangからの贈り物;Addgene社プラスミド#4223025)にクローニングされ、ターゲティングベクターとともにES細胞に導入された。これにより、野生型遺伝子のイントロン2(ターゲティングベクターのNeoSTOPカセットの部位)に二本鎖切断が導入された。マウスは、これまでに記載されたようにES細胞から生成された26。「floxed」NeoSTOPカセットは、C57BL/6JバックグラウンドでトランスジェニックCMV-Cre削除者系統(JAX Stock#006054)のホモ接合メスとキメラを交配させることにより、in vivoで除去された。CMV-Cre導入遺伝子はその後育種された。この研究で使用された全てのマウスは、標準条件下でエジンバラ大学の動物施設で飼育及び維持され、手順は1986年英国内務省によって認可されたスタッフによって、動物及び科学的手順法に従って行われた。
生化学分析のために、特に明記しない限り、6~13週齢において、液体窒素で急速凍結することにより脳を採取した。特に明記しない限り、全ての分析にヘミ接合体オスマウスの脳を使用した。サザンブロット分析のために、半脳を50mM Tris Cl pH7.5、100mM NaCl、5mM EDTA中でホモジナイズし、1%SDS中の0.4mg/mlプロテイナーゼKで、55℃で一晩処理した。ゲノムDNAのフェノール:クロロホルム抽出前に、試料を0.1mg/ml RNAseAで、37℃で1~2時間処理した。ゲノムDNAは、Puregene Core Kit A(Qiagen社)を使用して、培養細胞に関する製造者の取扱説明書に従ってES細胞から精製した。ゲノムDNAを制限酵素(NEB社)で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、ZetaProbeメンブレン(BioRad社)に転写した。エクソン4又は3'相同性アームの末端のいずれかに相同なDNAプローブを、Prime-a-Gene Labeling System(Promega社)を使用して[α32]dCTP(Perkin Elmer社)で放射性標識した。Typhoon FLA 7000でスキャンする前に、ブロットを一晩プローブし、洗浄し、Phosphorimagerカセットで露光した。ImageQuantソフトウェアを用いてバンドを定量化した。
これまでの研究16と一致して、マウスは表現型の特性評価を受ける前に、約94%のC57BL/6Jに達するように4世代戻し交配された。それぞれが10の変異動物と10の野生型同腹仔で構成される2つの別個のコホートが、各新規ノックイン系統について作成された。1つのコホートが記録され、これまでに記載されたように生後4~52週で定期的に体重を測定した24、27。生存率を、カプラン・マイヤープロットを使用してグラフ化した。(7匹のΔNCマウスと9匹の野生型同腹仔の予備的非近交系[75%C57BL/6J]コホートも記録された。)2番目の戻し交配コホートは、20~21週齢で行動分析を受けた(詳細なプロトコールについては27及び16を参照されたい)。試験は2週間にわたって実施された。1日目の高架式十字迷路、2日目のオープンフィールドテスト、6~9日目の加速ロータロッドテスト(1日の訓練と続く3日間の試行)。全ての分析は遺伝子型を隠して実施された。
反復測定ANOVAを使用して成長曲線を比較した。行動分析では、全てのデータが正規分布(オープンフィールドにおける中心での時間と移動距離)に適合するとき、t検定を使用して遺伝子型を比較した。そうでない場合(高架式十字迷路のアーム内の時間及び加速ロータロッドの落下までの滞在時間)、コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して遺伝子型を比較した。加速ロータロッドテストにおける経時的なパフォーマンスの変化は、フリードマン検定を使用して決定された。
転写が抑制された最小MeCP2(ΔNIC)は、27で使用した手順に従って症候性null様「STOP」マウスで再活性化された。手短に、ΔNICMecp2対立遺伝子は、削除者マウスの代わりに野生型メスとキメラを交配させることにより、イントロン2にNeoSTOPカセットを保持することにより不活性化された。得られたSTOP/+メスは、ヘテロ接合Cre-ERトランスジェニックオス(JAX Stock#004682)と交配され、4つの遺伝子型のオス(87.5% C57BL/6J)を生成した。WT(n=4)、WT CreER(n=4)、STOP(n=9)、STOP CreER(n=9)の4つの遺伝子型全てからなるコホートをスコア付けし、4週齢から毎週計量した。6週間(STOP及びSTOP CreERマウスがRTT様症状を示したとき)から、全ての個体に一連のタモキシフェン注射を投与した:毎週2回、続いて毎日5回、それぞれ100μg/g体重の用量であった。タモキシフェンで処理したSTOP CreER(n=8)、WT(n=1)及びWT CreER(n=1)動物の脳組織を生化学分析のために28週齢で(STOP CreERマウスでの症状反転が成功した後)採取した。タモキシフェンで処理した1匹のSTOPマウスの脳組織も生化学分析に含めた(上述の方法)。
最小MeCP2(ΔNIC)AAVベクターは、C57BL/6バックグラウンドで維持されたMecp2-null及びWTマウスで試験された。組換えAAVベクター粒子は、UNC遺伝子治療センターベクターコア施設で生成された。自己相補型AAV(scAAV)粒子(AAV9キャプシドにパッケージ化されたAAV2 ITR隣接ゲノム)は、ヘルパープラスミド(pXX6~80、pGSK2/9)及びITRに隣接するΔNIC導入遺伝子構築物を含むプラスミドを含むポリエチレンイミン(Polysciences社、Warrington、PA)を使用してトランスフェクトされた懸濁HEK293細胞から生成された。使用した構築物を図17Bに示し、ITRに隣接するΔNIC導入遺伝子構築物の注釈付き配列(配列番号65)を図17Cに示す。翻訳に関連して、ΔNIC発現構築物は、同等のヒトMECP2_e1コード配列を利用し、他の実験で使用されたEGFPタグを置き換える小さなC末端Mycエピトープタグを使用した。導入遺伝子は、追加のプロモーター調節エレメントと推定サイレンサーエレメントを組み込んだ拡張内因性Mecp2プロモーター断片(MeP426)の制御下にあった(図17B、図17C)。構築物は、Mecp239~41の調節に関与することが知られているmiRNAの結合部位の選択パネルとともに、内因性MECP2 3'UTRの断片からなる新規3'UTRも組み込んだ(図17B、図17C)。これまでに記載されたようにウイルス産生を行い28、5%ソルビトールを補充した高塩濃度PBS(350mM総NaClを含む)の最終製剤でベクターを調製した。マウスへの脳注射では、これまでに記載されたように、ウイルスの直接両側注射(部位あたり3μl;用量=マウスあたり1×1011ウイルスゲノム)を、麻酔していないP1/2オスの神経網に送達した29。対照注射は、ベクターを欠く同一の希釈剤を使用して行われた(「ビヒクル対照」)。注射された胎仔をホームケージに戻し、上記のように毎週評価した。
MeCP2のアミノ酸配列は脊椎動物種全体で高度に保存されており(図1A)、タンパク質のほとんどが精製選択の対象であることを示唆している。これは、複数の結合パートナーとの相互作用が機能的に重要であるという広く支持されている見解を裏付けている。MeCP2は、適切な神経機能に必要ないくつかの細胞経路への関与が示唆されている11、3。RTTの原因となるミスセンス変異の分布を分析すると、重要なものとしてMBDとNID(タンパク質のごく少数)のみが強調表示される代替的な画像が表れる(図1A)。更に、健康な個人から収集されたエクソーム配列決定データは、タンパク質の他の領域に多数の多型を示し(図1A)、これらの配列が不要であることを示唆している。MBD及びNIDがMeCP2機能に十分であるかどうかを試験するために、内因性遺伝子の段階的な一連の欠失を設計して、N末端からMBD(ΔN)、C末端からNID(ΔC)、及びこれらのドメイン間の介在するアミノ酸(ΔI)の領域を削除した(図1B)。介在領域は、短いリンカーで接続されたSV40ウイルスに由来する核局在化シグナル(NLS)配列に置き換えられた。Mecp2遺伝子には4つのエクソンがあり、転写産物が選択的にスプライシングされて、最端のN末端でのみ異なる2つのアイソフォームが生成される30。ノックインマウスのMecp2遺伝子構造を維持するために、構築物はエクソン1と2、及びエクソン3の最初の10bp(スプライスアクセプター部位)を保持し、結果として、アイソフォームe1及びe2のそれぞれについて、29及び12のN末端アミノ酸が含まれる(図2A~図2B、図3、図4)。タグ付はマウスのMeCP2機能に影響しないため16、検出と回収を容易にするためにC末端EGFPタグが付加された(図1B)。マップされた結合部位、構造情報、及び進化的保存を考慮して、残基72~173としてMBDを、残基272~312としてNIDを包含した(図S1C~図S1D)。ΔN、ΔNC、及びΔNICに保持される天然MeCP2タンパク質配列の割合は、それぞれ野生型の88%、52%、及び32%である。
全体として、MeCP2は多機能ハブとして機能するという見解に反し、代わりにその主要な機能がクロマチンのメチル化部位にNCoR/SMRTコリプレッサー複合体を動員するという単純なモデルを裏付ける結果が得られた。最小のMeCP2タンパク質(ΔNIC)には、ATフック23、いくつかの活性依存性リン酸化部位17、18、RNA結合モチーフ6、及びマイクロRNAプロセシング9、スプライシング10、クロマチンリモデリング8への関与が示唆されているタンパク質の相互作用部位等、潜在的に重要であると強調されているいくつかのドメインの全て又は一部が欠落していることは注目に値する。重要なことに、これら2つのドメインがMeCP2欠損マウスの神経機能を回復するのに十分であるという発見により、最小タンパク質の治療可能性を示すことができた。
完全長のMecp2/MECP2がマウスに送達されるとき、運動機能障害、運動失調、及び固有受容性感覚の明らかな消失という形での毒性の出現がこれまでに報告されている49、50。独立した報告書は、最近、より大きな哺乳類種でのAAV9バリアント(AAVhu68)の送達に応答する同一のステレオタイプ運動失調と固有受容性感覚の喪失を示しており、末梢神経後根神経節はAAV9変異体の投与に特に感受性がある可能性があることを示している51。
AAV9-MeP229/MECP2は、内因性Mecp2プロモーターの強い229bp断片と完全長MECP2を持つAAV2/9ベクターを指す。AAV9-MeP426/MECP2は、内因性Mecp2プロモーターの426bp断片と完全長MECP2を持つAAV2/9ベクターを指す。AAV9-MeP426/ΔNIC MECP2は、内因性Mecp2プロモーターの426bp断片とΔNIC MECP2ミニ遺伝子挿入物を有するAAV2/9ベクターを指す。
Claims (20)
- 構造:
A-B-C-D
を有する合成ポリペプチドであって、式中、
合成ポリペプチドの部分Aが、配列番号11に示される配列を含むN-末端ドメインであり、
合成ポリペプチドの部分Bが、配列番号1と少なくとも95%同一である配列を含むメチル結合ドメイン(MBD)であり、
合成ポリペプチドの部分Cが、リンカー及び核局在シグナル(NLS)を含み、リンカーが配列番号34に示される配列を含み、NLSが配列番号32に示される配列を含み、
合成ポリペプチドの部分Dが、配列番号2に示される配列と少なくとも95%同一である配列を含むNCoR/SMRT相互作用ドメイン(NID)である、合成ポリペプチド。 - ポリペプチドが、配列番号3及び配列番号4に示されるMeCP2のアミノ酸配列の全長にわたって90%未満の同一性を有する、請求項1に記載の合成ポリペプチド。
- 前記合成ポリペプチドが、NCoR/SMRTコリプレッサー複合体の構成要素を、メチル化DNAに動員することができ、NCoR/SMRTコリプレッサー複合体の構成要素がNCoR/SMRT、HDAC3、GPS2、TBL1X、又はTBLR1である、請求項1又は2に記載の合成ポリペプチド。
- 前記合成ポリペプチドが、430個未満のアミノ酸からなる、請求項1から3のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド。
- MBDとNIDのアミノ酸配列の間のアミノ酸配列が、50個未満のアミノ酸長である、請求項1から4のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド。
- NIDアミノ酸配列のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列がない、請求項1から5のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド。
- MBDアミノ酸配列のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列が、50個未満のアミノ酸長である、請求項1から6のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド。
- ポリペプチドが、配列番号3及び配列番号4に示されるMeCP2のアミノ酸配列の全長にわたって80%未満の同一性を有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸構築物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 神経細胞におけるヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター、例えば、Mecp2又はMECP2プロモーター、MECP2又はMecp2の3'UTR由来の1つ以上の下流miR結合部位、及びAUリッチエレメントから選択される、1つ以上の制御エレメントを更に含む、請求項10に記載の発現ベクター。
- アデノウイルスベクターである、請求項10又は請求項11に記載の発現ベクター。
- ベクターがAAV9ベクターである、請求項12に記載の発現ベクター。
- 請求項12又は13に記載の発現ベクターを含むビリオン。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド、請求項9に記載の核酸構築物、請求項10から13のいずれか一項に記載の発現ベクター、及び/又は請求項14に記載のビリオンを含む医薬組成物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現するよう適合された合成遺伝的構築物を含む細胞。
- 請求項10から13のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、請求項16に記載の細胞。
- 請求項14に記載のビリオンを産生するための請求項16又は17に記載の細胞。
- レット症候群の治療又は予防のための、請求項1から8のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド、請求項9に記載の核酸構築物、請求項10から13のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項14に記載のビリオン、及び/又は請求項15に記載の医薬組成物。
- レット症候群の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1から8のいずれか一項に記載の合成ポリペプチド、請求項9に記載の核酸構築物、請求項10から13のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項14に記載のビリオン、及び/又は請求項15に記載の医薬組成物の使用。
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