CN114195866A - 植物中直接降低蛋白水平方法的建立 - Google Patents

植物中直接降低蛋白水平方法的建立 Download PDF

Info

Publication number
CN114195866A
CN114195866A CN202010975279.0A CN202010975279A CN114195866A CN 114195866 A CN114195866 A CN 114195866A CN 202010975279 A CN202010975279 A CN 202010975279A CN 114195866 A CN114195866 A CN 114195866A
Authority
CN
China
Prior art keywords
smash
protein
plant
asv
plants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010975279.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114195866B (zh
Inventor
邱金龙
李盟鸥
张倩伟
尹康权
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN202010975279.0A priority Critical patent/CN114195866B/zh
Publication of CN114195866A publication Critical patent/CN114195866A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114195866B publication Critical patent/CN114195866B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供对植物的直接调控蛋白水平的方法。通过该方法可使植物中的靶蛋白的水平快速，准确，可逆地降低。本发明的方法可以实现植物中的靶蛋白水平的剂量依赖性降低，并能够与其他生物表达调节方法例如利用了CRISPR/Cas9系统的方法组合使用，从而实现更精细的调节。

Description

植物中直接降低蛋白水平方法的建立
技术领域
本发明涉及一种植物中的蛋白水平的调节方法，能够在植物中直接降低蛋白水平。具体地，本发明涉及一种利用适用于植物的小分子辅助关闭系统SMASh(Smallmolecule-associated shutoff)的方法。本发明还提供所述方法与利用CRISPR系统的方法的组合使用，以及通过这些方法构建的表达载体。
背景技术
基因表达及蛋白质稳定性的调控是生物学中研究基因功能的重要手段，一般在DNA，RNA及蛋白水平三个层面进行，对于植物而言主要有以下方法。
在DNA水平上能够通过T-DNA插入、基因编辑技术等，在获得相应表型的植株后进一步研究蛋白的功能，但缺点在于周期长，且重要基因的敲除可能会出现致死表型。
在RNA水平上，主要有：1)利用组成型或特异性启动子的表达系统，但部分外源基因的组成型表达可能会造成致死表型，或者对植物的生长发育产生影响；2)各类化学诱导表达系统，已在植物中有较长时间的应用，体系较为完善，缺点在于采用如乙醇、四环素、地塞米松、铜离子等作为诱导物，这些诱导物的高剂量可能会对植物内源基因的表达，蛋白活性和植物的生长表型产生影响，严重时还会引起防御反应，对实验结果产生干扰；3)RNA干扰技术，其序列依赖或非序列依赖性的脱靶情况严重。
在以上这些方法中，翻译前水平的调控是间接调控，因此需要相对长的时间去影响靶蛋白的功能。同时，另一个问题在于靶蛋白的“滞留”，由于靶蛋白的降解速度取决于蛋白本身或融合蛋白在细胞中的半衰期，这种“滞留”在研究细胞周期，细胞分化，神经活动等高速的动态过程时造成很大的阻碍。
因此，需要一种在植物中直接对蛋白水平进行调控的方法，期待这样的方法能够避免产生致死表型的植株，不易脱靶，调节迅速，在靶蛋白实现功能后能够迅速使其降解。
已知真核细胞内蛋白质的降解主要通过自噬和泛素-蛋白酶体系统(UPS，ubiquitin-proteasome system)两种途径发生。其中，蛋白降解子(Degrons)是蛋白上的一段特定的氨基酸序列，其通过被蛋白酶识别而介导所述蛋白的降解和清除，通常位于蛋白的氨基端或羧基端。目前的研究认为，位于氨基端的序列与降解的相关性更为密切，有时氨基端一个氨基酸的改变甚至可以使蛋白质对蛋白酶变得敏感，称为N端法则。
目前，作为直接对蛋白水平进行调控的方法，已开发了温度诱导类、光诱导类以及小分子诱导类这三大类利用蛋白降解子原理的蛋白降解系统。其原理为将靶蛋白和降解子融合表达，通过不同条件的诱导而人工控制蛋白质水平。鉴于温度诱导和光诱导条件可能对生物的正常生理活动产生不可预测的影响，因此更优选小分子诱导类。
小分子诱导类指利用一些生物激素或化学小分子物质来控制蛋白降解子的活化，目前已有生长素诱导的降解子系统(Auxin-Inducible Degron,AID)，小分子靶向诱导蛋白降解技术(Proteolysis-targeting chimera,PROTAC)和F-box融合方法等。然而，这些技术可能会影响靶蛋白的功能，或者需要为每个靶蛋白设计新的小分子配基，而不能应用于一般的靶蛋白。
小分子辅助关闭系统(以下简称SMASh系统)是在酵母、哺乳动物中应用的反向调控的蛋白降解系统。其主要原理为将靶蛋白与由丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)蛋白酶结构域+NS4A蛋白+顺式切割位点组成的重组SMASh标签相连。
当带有SMASh标签的融合蛋白被转录表达后，在不进行人工诱导(不施用HCV蛋白抑制剂ASV，asunaprevir)的情况下，标签中的蛋白酶会立即切除蛋白降解子部分，使靶蛋白以带有极少修饰的形式释放，而剩余的SMASh标签部分会在降解子的引导下降解。另一方面，当存在HCV蛋白抑制剂ASV的情况下，标签中的蛋白酶受到了抑制，则融合蛋白中的降解子不会被切下，最后，带有降解子的融合蛋白通过降解子的介导而整个地被降解，使得靶蛋白在细胞内的存在水平降低。
SMASh系统对靶蛋白修饰最少，能够最大限度地不影响靶蛋白的功能，并同时实现对靶蛋白快速，准确，可逆地降解。但其目前主要应用于哺乳动物细胞和酵母细胞中，尚无成功报道的适用于植物的SMASh系统。
发明内容
本发明人通过将来自于病毒的SMASh标签的序列进行了拟南芥密码子优化并连接到靶蛋白，从而成功建立了使用植物性SMASh标签的SMASh系统，及利用其的在植物中的蛋白水平调节方法。
具体而言，为了更好地应用到植物中，本发明将来自于病毒的SMASh标签序列进行了拟南芥密码子优化，得到SEQ ID NO:28所示的序列，以下也称为本发明的SMASh标签或植物性SMASh标签。
首先在拟南芥中，分别通过外源性基因绿色荧光蛋白(GFP)和内源性基因MYB75蛋白(花青素表达相关)验证了本发明的方法。
先以GFP为靶蛋白，建立了将植物性SMASh标签分别连接到靶蛋白的羧基端或氨基端的载体。结果发现，在转化拟南芥植物后，在植物性SMASh标签连接到靶蛋白的氨基端的植株中检测不到融合蛋白，而在植物性SMASh标签连接到靶蛋白的羧基端的植株中检测到了融合蛋白的高转录和靶蛋白积累水平，且在ASV诱导后该靶蛋白被降解。确认植物性SMASh标签连接到靶蛋白的羧基端的方法能够建立有效的SMASh系统。
为了检测SMASh系统对内源基因的调节能力，以MYB75蛋白作为靶蛋白在羧基端融合植物性SMASh标签而进行了试验。植物中的花青素能对过量光照起到屏障作用，其积累后植物组织会变为深红色或紫色，能够极大减少强光下叶绿体受到的照射。MYB75是调控花青素合成的主要转录因子，参与激活花青素晚期合成基因DFR、LDOX和UF3GT，从而调节花青素水平。
在一个实施方式中，分别使用了MYB75-OE过表达植株(阳性对照)，myb75-c(阴性对照)，拟南芥Col-0(野生型)作为对照，使用本发明的SMASh标签的SMASh系统对MYB75蛋白进行了降解，研究其对花青素含量及晚期合成基因的影响。
MYB75-OE过表达植株以及利用CRISPR-Cas技术获得的myb75-c纯合突变体为本实验室前期工作中得到的表型。在myb75-c突变体中，MYB75基因的起始密码子处发生了一个碱基的插入，导致提前终止，造成该基因无法正常翻译。而前期实验室研究证明，拟南芥Col-0在强光照(High light，175μmol m-2s-1)条件下能观察到很强的花青素积累现象。结果证实了本发明的SMASh系统对内源基因MYB75蛋白能够实现ASV诱导的降解，并能降低花青素的积累，降低其下游基因的表达。
其后，在水稻原生质体中，通过将带有植物性SMASh标签的水稻密码子优化AcrIIA4融合蛋白与CRISPR/Cas9系统共转化，大幅降低了Cas9的脱靶效应。
AcrIIA4属于type II-A型Anti-CRISPR，文献报道，在加入Cas9 RNP6h后递送AcrIIA4，会降低50％的编辑效率，且适时的加入AcrIIA4能够大幅降低脱靶效应。在一个实施方式中，通过植物性SMASh标签在特定时长和阶段对AcrIIA4的蛋白水平进行调控，有效地降低了CRISPR/Cas9系统的脱靶效应。证实了本发明的方法在与其他生物表达调节方法联用时同样有效，并能够实现对其他生物表达调节方法的精细调节。
农药增效剂是农药中的一种重要助剂，其本身无活性，但在与农药混用时能够改善农药的利用率，其中有机硅助剂为一种应用广泛的增效助剂。发明人发现，对拟南芥叶片喷洒ASV时表面蜡质层会阻碍外界化学物质进入叶片内部，而通过在喷洒ASV之前对要施用的叶片喷施有机硅助剂，能够大大提高ASV的进入效率。在本发明的一个实施方式中，为了使ASV更好地浸润植物叶片而使用了有机硅助剂S233对植物进行处理，取得了良好的效果。在对四周苗龄的植株进行喷施处理时，叶片在0.05％S233的帮助下，能够将叶片表面完全浸润。
本发明的优点：根据本发明的植物的直接调控蛋白水平的方法能够建立植物中适用的SMASh系统，与植物中的其他的调控蛋白方法相比，本发明的方法对靶蛋白修饰最少，能够最大限度地不影响靶蛋白的功能，并同时实现对靶蛋白快速，特异性，可逆地降解。仅以小分子蛋白抑制剂对植株的直接施用，就能够在极短的时间内在蛋白水平降低植物中靶蛋白的浓度。这样的过程不影响靶蛋白的转录水平，并且是可逆的，从而能够解决靶蛋白在细胞中滞留对植物造成的后续影响。不需要进行重要基因的敲除，从而避免了致死表型的出现。同时，本发明的方法能够与其他生物表达调节方法联用，而在蛋白浓度控制，作用时间上实现对其他生物表达调节方法的精细调节。
本发明主要包括以下内容。
1.含有蛋白降解子的SMASh标签序列，所述标签序列为如SEQ ID NO:28所示的序列，优选所述标签序列用于植物蛋白水平的调节。
2.植物中的蛋白水平调节方法，包括
将SMASh标签序列直接或通过接头连接于靶蛋白的羧基端来构建靶蛋白-SMASh融合蛋白，从而在植物中表达靶蛋白-SMASh融合蛋白，
所述SMASh标签序列为SEQ ID NO:28所示的序列。
3.根据项2所述的蛋白水平调节方法，包括
构建表达靶蛋白-SMASh融合蛋白的载体，优选所述载体为35S:GFP-SMASh，35S:MYB75-SMASh或Ubi:AcrIIA4-SMASh，以及将载体转化至植物中。
4.根据项3所述的植物中的蛋白水平调节方法，包括向所述植物施用阿那匹韦(asunaprevir,ASV)。
5.根据项4所述的植物中的蛋白水平调节方法，其中，当所述植物为整株植物状态时，向叶片施用不低于3μM，优选为不低于9μM的ASV；
当所述植物为原生质体状态时，向原生质体施用1-9μM，优选为1μM的ASV。
6.根据项2～5中任一项所述的植物中的蛋白水平调节方法，其中，所述靶蛋白选自以下各项组成的组：
(1)GFP，编码靶蛋白的序列为如SEQ ID NO:25所示的序列；
(2)MYB75，编码靶蛋白的序列为如SEQ ID NO:26所示的序列；和
(3)AcrⅡA4，编码靶蛋白的序列为如SEQ ID NO:27所示的序列。
7.根据项2～5中任一项所述的植物中的蛋白水平调节方法，其包括进一步使用CRISPR系统的方法，且所述靶蛋白优选为与Cas9竞争性结合同一位点的蛋白，更优选为AcrIIA4。
8.根据项7所述的植物中的蛋白水平调节方法，其中，所述靶蛋白-SMASh融合蛋白的载体为Ubi:AcrIIA4-SMASh(优选为将pJIT163-Ubi-hGFP载体单BamHI酶切后，与AcrIIA4-SMASh片段同源重组构建获得)，其与CRISPR系统使用的Ubi:Cas9-gRNA载体(优选为将pJIT163-Cas9单SpeI酶切后，与gRNA片段同源重组构建获得)以1:1～1:2，优选为1:2的浓度比例进行共转染。
9.根据项4～8中任一项所述的方法，其包括在施用ASV前使用有机硅助剂，优选为S233处理植株，优选的处理位置为叶片，S233的使用浓度优选为0.05％。
10.在项2～8中任一项所述的植物中的方法中构建的载体。
附图说明
图1：不同浓度ASV处理后GFP-SMASh融合蛋白的降解情况。图1A显示用不同浓度ASV进行喷施叶片后24h，用荧光共聚焦显微镜观察。bar＝10μM。图1B是A中的荧光强度的定量统计。图1C是蛋白免疫印迹方法检测不同处理下GFP蛋白水平变化。图1D为实时定量PCR检测的GFP-SMASh的转录水平。
图2：ASV诱导后MYB75-SMASh转基因植株的花青素积累。图2A是在ASV或DMSO存在下培养的各组植株在体视镜下的表型。图2B为2A中植株的花青素含量测定，(n＝3；“**”表示P<0.01，“ns”表示无意义)。FW(Fresh weight)，鲜重。
图3：MYB75-SMASh蛋白水平及转录水平的检测。图3A为图2中相同处理植株的总蛋白用蛋白免疫印迹方法检测MYB75蛋白水平。Actin蛋白作为上样量对照。图3B为实时定量PCR检测GFP-SMASh的转录水平。图3C展示实时荧光定量PCR检测的MYB75-SMASh转基因植株中DFR、LDOX以及UF3GT的表达水平。(n＝3；“**”表示P<0.01)
图4：ASV调控AcrIIA4-SAMSh降低Cas9:脱靶效应。图4A是AcrIIA4-SMASh系统原理示意图。图4B是靶位点及潜在脱靶位点核酸序列。图4C为不同Cas9:AcrIIA4比例对编辑效率的影响。图4D展示了ASV通过调控AcrIIA4-SMASh对编辑效率的影响，通过二代测序分析靶位点及脱靶位点编辑效率。n＝3。
图5：使用的载体图谱。图5A是pJIT163-Ubi-hGFP载体的图谱。图5B是pJIT163-Cas9载体的图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本文所用的百分比浓度为质量体积百分比浓度。
本文中所用的术语具有本领域所通常理解的含义。
特别地，本文所用的术语“可操作地连接”是指例如载体(例如质粒)中所连接的序列以实现其功能的方式连接。
本发明的实施方式中所进行的密码子“优化”，指以避免出现终止密码子及对载体构建会产生影响的酶切位点的方式进行的优化。
试验方法
植物的培养
植物的土壤培养：将拟南芥种子按常规密度播于土壤(营养土:蛭石:珍珠岩＝10:4:1，按重量计)表面，4℃暗处理三天，之后移入短日照温室(光照8h，黑暗16h，下同)。一周后进行移苗，施加营养液(Chembase公司的MS培养基[含琼脂蔗糖]4.47g至1L水配置，每棵苗施加10ml即可)正常生长。用于收取种子的植物在短日照下生长三周，而后转入长日照温室(光照1.6h，黑暗8h，下同)，抽苔前施加营养液，收取种子。短日照温室及长日照温室的温度均设为22℃，相对湿度为75％。
植物的无菌培养：将拟南芥种子经75％酒精消毒，用无菌水洗3次，再用2.5％次氯酸钠表面消毒15min，用无菌水清洗5-7次。按常规密度均匀铺在1/2MS平板上，避光处理，置于4℃三天后，将平板置于温室中正常生长。温室温度均设为22℃，相对湿度为75％。
密码子优化及序列合成
本文涉及的密码子优化及优化后的序列合成均委托北京全式金公司进行。引物合成委托华大基因公司进行。
荧光共聚焦显微镜的样品制备及观察
(1)制片：用剪刀剪取合适长度且平整的拟南芥叶片，置于放有水的载玻片上，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余的水，用羊毛脂、石蜡、凡士林按1:1:1配成的试剂70℃水浴熔化后封片；
(2)荧光观察：将制好的片子置于荧光共聚焦显微镜下，在63倍水镜下进行观察，GFP激发光设置为488nm，收集光谱设置为500-550nm。
DNA提取，靶位点和预测脱靶位点的测序
以CTAB法(Murray和Thompson，1980)提取原生质体和幼苗基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。在第一轮PCR中，使用各自的位点特异性引物扩增靶区域。在第二轮中，将正向和反向barcode添加到PCR产物的末端以用于文库构建。使用Illumina NextSeq 500平台，将等量的PCR产物汇集在一起，并通过成对端读取测序对样品进行商业测序(GENEWIZ，中国苏州)。对测序读物中的sgRNA靶位点进行INDELs检查。
关于重复性，从3个独立的原生质体样品中提取基因组DNA，对每个目的位点进行3次扩增序列测定。
实施例1.拟南芥中利用植物性SMASh标签调控GFP的水平
1.载体的构建
对病毒SMASh标签序列进行拟南芥密码子优化(委托北京全式金公司)，得到SEQID NO:28所示的序列，将其作为植物性SMASh标签编码序列进行合成(委托北京全式金公司)。
通过融合PCR方法，将植物性SMASh标签编码序列分别与GFP的C端(使用引物5’-AAGAGACAGGATCCACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(正向引物,SEQ ID NO:1)，和(5’-GCGGTGGCGGCCGCTCTAGACTAGTACAAAACCTCTCTATC-3’(反向引物,SEQ ID NO:2))或N端序列(使用引物5’-AAGAGACAGGATCCACTAGTATGGATTATAAAGATGATGATGATAAG-3’(正向引物,SEQ ID NO:29)，和(5’-GCGGTGGCGGCCGCTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(反向引物,SEQ ID NO:30))融合，通过同源重组的方法，使用pJL12双元载体(获自中国科学院微生物研究所，由中国科学院微生物研究所邱金龙课题组保存)，采用启动子35S驱动融合基因表达而构建了载体。将构建的载体分别命名为35S:GFP-SMASh和35S:SMASh-GFP。
2.农杆菌介导的转化
将35S:GFP-SMASh和35S:SMASh-GFP载体分别利用电转化法转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101(获自中国科学院微生物研究所，由中国科学院微生物研究所邱金龙课题组保存)中，利用浸花法转化到拟南芥Col-0中，具体方法如下：
(1)取农杆菌GV3101感受态细胞，冰上融化，将35S:SMASh-GFP载体、、载体质粒稀释至1ng/μl，取1μl质粒加入至感受态中；
(2)把质粒和感受态细胞轻轻吹吸混匀，加入电极杯中，避免产生气泡；
(3)把电极杯放入电转化仪中，选择“AGR”模式，进行操作，响起提示音，显示“PL5”表明操作成功；
(4)向电极杯中加入1ml预冷的LB液体培养基，吹打混匀，将菌液吸出至1.5ml离心管中，28℃，120rpm孵育2h；
(5)取100μl菌液涂布在含有Rif、Gen和质粒抗性的LB培养基中，28℃倒置培养2-3天；
(6)对培养得到的农杆菌提取质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进而再提质粒送测序，验证转入农杆菌的质粒序列是否正确；
(7)待转化拟南芥需在浸染前一天浇足水；
(8)挑取验证正确的农杆菌单菌落至5ml含有庆大霉素(Gen)，利福平(Rif)及质粒抗性的LB液体培养基中，28℃，220rpm过夜培养；
(9)把5ml菌液转接250ml相应的LB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养12h左右；
(10)配置拟南芥转化液(配制1L需先加入1/2MS 2.2g，再加入蔗糖5g；之后加入1mg/ml 6-BA的溶液10μl搅拌至溶化，用KOH调节PH至5.8后加入100μl表面活性剂Silwet-L77，搅拌4-5h后立即使用)，将250ml农杆菌菌液4000rpm离心10min，弃上清，用转化液将沉淀悬浮起来；
(11)将待转化的拟南芥花序浸入菌液中5min，将浸染结束的拟南芥花盆平放至托盘中，向托盘中加入少量水，盖上盖子并在外面套上黑色塑料袋，塑料袋上开两个小孔透气，暗培养24h；
(12)揭去黑色塑料袋及托盘的盖子，将拟南芥花盆摆正，正常培养。对得到的植株进行Basta筛选和PCR验证。
Basta筛选：购自拜耳公司的Basta原液用水稀释1000倍后混匀，在拟南芥二叶期进行喷施，隔一天喷施一次，三次后可观察到部分植株变黄，而其他植株依旧为绿色即为已转入Basta抗性基因的阳性植株，继而完成筛选。
PCR验证使用了引物：5’-GCGATCACATGGTCCTGCTG-3’(正向引物,SEQ ID NO:3)和5’-CAGCACCTGGAAGATGTTGAG-3’(反向引物,SEQ ID NO:4)，分别得到了SMASh-GFP转基因株系和GFP-SMASh转基因株系，通过实时荧光定量PCR分析了SMASh-GFP或GFP-SMASh的转录水平(引物：5’-GCGATCACATGGTCCTGCTG-3’(正向引物,SEQ ID NO:3)和5’-CAGCACCTGGAAGATGTTGAG-3’(反向引物,SEQ ID NO:4))。其中，检测到转录水平较高的有SMASh-GFP转基因株系51、55、69，GFP-SMASh转基因株系7、9、11，对这些植株按照“荧光共聚 焦显微镜的样品制备及观察”在镜下观察了荧光。
结果发现：SMASh-GFP转基因株系中的植株51、55、69，虽然有较高的转录水平，但是在共聚焦显微镜下均观察不到荧光。而GFP-SMASh转基因株系7、9、11中有较高水平的GFP-SMASh转录，且在共聚焦显微镜下均能观察到较强的荧光，提示融合蛋白表达正常。
即，在拟南芥中，将植物性SMASh标签融合至靶蛋白N端时，细胞中转录了高水平的SMASh-GFP融合蛋白序列，但该融合蛋白没有存留在细胞中，相反，将植物性SMASh标签融合至靶蛋白C端时，GFP-SMASh融合蛋白存留在细胞中没有被降解。
讨论：这样的结果与在哺乳动物细胞中观察到的结果不同，在哺乳动物细胞中，SMASh标签在黄色荧光蛋白(YFP)的羧基端和氨基端两端都能够起作用。推测植物中出现的这种差异是由于位于靶蛋白氨基端时，SMASh标签中的蛋白酶结构域不能有效识别或切割拟南芥中的顺式切割位点，导致在蛋白切割子介导下，SMASh-GFP融合蛋白被快速降解。
3.ASV诱导融合蛋白进行降解
选取上述拟南芥株系7，对四周苗龄的植株先喷洒0.05％S233润湿叶片，再喷洒9μM ASV进行处理。
在9μM ASV处理24h后，按照“荧光共聚焦显微镜的样品制备及观察”在镜下观察了荧光，发现几乎观察不到荧光，提示植株积累的GFP-SMASh蛋白完全降解。
以上结果表明：ASV可快速高效的诱导GFP-SMASh融合蛋白的降解。
4.ASV诱导的降解的剂量依赖试验
除了使用了1μM，3μM，9μM的三个浓度的ASV以外，与上述方法相同地实施了ASV处理，以DMSO作为对照组(0μM)。处理24h后，通过荧光共聚焦显微镜在63倍水镜下进行观察荧光，并对荧光强度用Image J进行定量统计(图1A，1B)。同时，提取总蛋白，用抗GFP抗体(购自Abmart公司，货号：M20004)进行免疫印迹分析，Actin蛋白作为上样量对照(图1C)，并通过实时荧光定量PCR分析了GFP-SMASh的转录水平(引物同上)，数据以DMSO处理组为目标进行转录水平表达量的归一化处理，n＝3(图1D)。
根据结果可知，以1μM ASV浓度处理的转基因植株，其GFP荧光强度并无明显变化，但随着ASV用量的增加，荧光强度逐渐减弱直至消失。免疫印迹分析进一步证实了GFP-SMASh融合蛋白的降解为ASV剂量依赖性。并且在ASV处理前后，GFP-SMASh的转录水平并无明显变化。
这些数据提示，ASV诱导的拟南芥中GFP-SMASh融合蛋白的降解作用在蛋白水平进行，能够通过调整诱导剂ASV的浓度控制其降解率，具有可调性且起效快速。
实施例2.在拟南芥中利用植物性SMASh标签调控内源基因蛋白水平1.载体的构建及农杆菌介导的转化
以拟南芥基因组为模板，用高保真DNA聚合酶FastPfu，(使用引物5’-AAGAGACAGGATCCACTAGTATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTG-3’(正向引物,SEQ ID NO:31)，和(5’-CCAGATCCACCTCCACTAGTATCAAATTTCACAGTCTCTCCATCGAAAAGACTC-3’(反向引物,SEQ ID NO:32))扩增包含MYB75(At1g56650)编码序列在内的约1.5kb基因组DNA片段，其中，在片段的3’端不包含终止密码子并通过融合PCR方法添加3×HA标签。通过融合PCR方法，在上述添加了3×HA标签的基因组DNA片段的对应于羧基端的一侧融合SMASh序列(引物5’-AAGAGACAGGATCCACTAGTATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCG-3’(正向引物,SEQ ID NO:5)和5’-CCACTAGTATCAAATTTCACAGTCTCTCCATCGAAAAGACTC-3’(反向引物,SEQ ID NO:6))，并克隆到pJL12双元表达载体中而构建了由35S启动子驱动的载体。将构建的载体命名为35S:MYB75-SMASh载体。
经测序无误后，将35S:MYB75-SMASh载体以与实施例1中相同的方法经农杆菌介导，采用浸花法转化拟南芥myb75-c突变体植株(该突变体植株信息参考Plant Cell,2016,28:2866-2883，见参考文献)。由此，在拟南芥myb75-c突变体背景下，获得了MYB75融合在SMASh羧基端的35S:MYB75-SMASh/myb75-c拟南芥转基因植株(以下简写为MYB75-SMASh)。
2.MYB75-SMASh融合蛋白的高表达植株筛选
在MYB75-SMASh植株中随机抽取部分株系，用引物5’-AGATAAGAAGAAAGACCAACTAGTG-3’(正向引物,SEQ ID NO:7)和5’-CCAAGGTGTCCCCCTTTTC-3’(反向引物,SEQ ID NO:8)进行MYB75-SMASh的转录水平的检测，发现株系3、50、101等等有较高水平的MYB75-SMASh表达量，且融合蛋白表达正常。进一步筛选，获得了2个纯合转基因株系(株系50和101)。
3.ASV处理引起的花青素积累消失
使用株系50进行进一步的研究。首先将该50品系的种子平铺在含有9μM ASV及相应浓度DMSO的1/2MS培养基上，各种子在强光照(175μmol m-2s-1)下诱导培养一周后，在体视镜下观察其表型，同时将过表达MYB75的MYB75-OE品系(该过表达植株信息参考PlantCell,2016,28:2866-2883，见参考文献)(阳性对照)、MYB75无法正常翻译的myb75-c品系(阴性对照)及Col-0品系(野生型，WT，获自中国科学院微生物研究所)作为对照进行同样的操作(图2A)。为了对实验结果进行验证而重复了上述实验，并获得了类似的结果。之后，对不同平板上的植株分别进行了花青素含量测定(图2B)。
花青素含量测定
测定方法在已有报道(Lange et al.,1971)上略有改动，简述如下：
(1)取1/2MS平板上生长的拟南芥幼苗至2ml离心管中，快速称量并记录为鲜重，加入350μl抽提溶液；
(2)将上述离心管置于100℃金属浴中加热3min，置于暗处放置过夜；
(3)14000rpm离心1min，取250μl上清至新的离心管中，加入750μl抽提溶液；
(4)测定其在535nm和650nm波长处的光吸收值；
(5)按如下公式计算花青素含量：A535-2.2A650/g·FW。
结果显示：目测可见在含9μM ASV的1/2MS平板中生长一周的植株中，myb75-c突变体植株呈绿色，WT植株呈墨绿色，MYB75-OE叶片组织、下胚轴有明显变紫现象，且与对照组相比无显著差别。MYB75-SMASh转基因植株50与DMSO处理相比，植株的紫色消失(图2A)。
花青素含量测定结果显示，与DMSO处理相比，在含9μM ASV的1/2MS平板中生长一周的植株中，myb75-c品系中基本检测不到花青素；MYB75-OE及WT(野生型)品系中，花青素含量有较低程度的升高；而MYB75-SMASh植株中，花青素含量下降至对照处理的1/6(图2B)。
综上，证实MYB75-SMASh融合蛋白的高表达植株在经ASV诱导后导致了花青素积累的降低。
4.ASV处理后的MYB75-SMASh蛋白降解
为验证MYB75-SMASh植株的上述表型变化是因为MYB75-SMASh融合蛋白降解所致，对上述处理的植株也分别进行了MYB75-SMASh融合蛋白的蛋白水平(图3A)和转录水平的检测(图3B)，方法同实施例1，其中，以anti-HA(购自柏奥易杰(北京)科技有限公司，货号：BE2007)为抗体，数据以DMSO处理组为目标进行转录水平表达量的归一化处理，n＝3。
结果显示：经ASV处理后，MYB75-SMASh融合蛋白水平明显降低，而MYB75-SMASh转录水平(使用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)没有发生明显变化。与以GFP为靶蛋白时的结果一致，表明ASV诱导能够在利用本发明的SMASh标签的植物中直接降低内源基因的蛋白水平，且靶蛋白的降解作用是在蛋白水平而非转录水平进行的。
为进一步验证MYB75-SMASh植株经ASV处理后是特异地降解MYB75-SMASh融合蛋白。对于上述植株，通过荧光定量PCR，分别用引物5’-TGGTGTCGGTCCATTCAT-3’(正向引物,SEQ ID NO:9)和5’-GAGAGAGCGCGGTGATAAGG-3’(反向引物,SEQ ID NO:10)；5’-TCCGGGTTTGCAGCTTTTC-3’(正向引物,SEQ ID NO:11)和5’-ATCAGGAACACATTTTGCAGTGA-3’(反向引物,SEQ ID NO:12)；5’-TGGAGGTGGCGGTTGAA-3’(正向引物,SEQ ID NO:13)和5’-CTTTGCCGCGAGAACCA-3’(反向引物,SEQ ID NO:14)对花青素晚期合成基因：二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、白花色素双氧酶(leucoanthocyandindioxygenase,LDOX)以及类黄酮3-葡糖基转移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase,3GT/UF3GT)的转录表达水平进行了检测，数据以ACTIN8为内参进行均一化处理，n＝3；“**”表示P<0.01。(图3C)。
结果显示：经ASV处理后，花青素晚期合成基因DFR、LDOX、UF3GT的表达水平降低，这表明，作为影响花青素合成的主要转录激活子，MYB75蛋白水平降低后，相应的下游基因DFR、LDOX、UF3GT的转录表达量也降低。
这些数据证实，利用本发明的SMASh标签的SMASh系统能够通过ASV诱导而调节拟南芥中内源基因的蛋白水平。
实施例3.植物性SMASh标签与CRISPR/Cas9系统的组合使用
1.载体的构建
将AcrIIA4序列进行水稻密码子优化，得到编码靶蛋白AcrⅡA4的序列(该核苷酸序列见SEQ ID NO:27)并合成该序列(北京全式金公司)，将其通过融合PCR方法，使用引物(5’-CAAAGCTTGTCGACGGATCCATGAACATCAATGACCTCATCAG-3’(正向引物,SEQ ID NO:15)和5’-GATTTCAGCGTACCGAATTCCTAGTACAAAACCTCTCTATCAG-3’(反向引物,SEQ ID NO:16))与SMASh蛋白的羧基端融合后，利用同源同组的方法克隆至pJIT163-Ubi-hGFP载体(获自中国科学院遗传与发育研究所高彩霞课题组，载体图谱见图5)中，构建了由Ubi启动子驱动的载体，得到的载体命名为Ubi:AcrIIA4-SMASh。
通过查阅文献，在水稻基因组中选取了1个已知具有潜在脱靶效应的位点，位于OsMKK4基因中，用引物5’-GGCAGACGTCGGCGAGGAAGGCCT-3’(正向引物,SEQ ID NO:17)和5’-AAACAGGCCTTCCTCGCCGACGTC-3’(反向引物,SEQ ID NO:18)退火得到靶位点gRNA(参见“DNA提取，靶位点和预测脱靶位点的测序”)。同时将pJIT163-Cas9载体(获自中国科学院遗传与发育研究所高彩霞课题组，载体图谱见图5)单SpeI酶切后，用引物5’-CTTTCAAGATCAAAACTAGTTGCCAAGCTTGCATGCCTGC-3’(正向引物,SEQ ID NO:33)和5’-CTCCGGTGTGAGGGAACTAGTACCCGGGGATCCTCTAGAG-3’(反向引物,SEQ ID NO:34)扩增gRNA片段，将线性化的载体和片段通过同源重组构建出同时表达Cas9和gRNA的载体。将得到的载体命名为Ubi:Cas9-gRNA。
2.共转化原生质体
将Ubi:AcrIIA4-SMASh载体(以下有时简称AcrIIA4-SMASh)和Ubi:Cas9-gRNA载体(以下有时简称Cas9-gRNA)以Cas9:AcrIIA4＝1:1、1:2两种比例共转化水稻原生质体。实验组分别为Cas9:AcrIIA4(Cas9-gRNA:AcrIIA4-SMASh)为1:1(10μg:10μg)，1:2(10μg:20μg)；对照组：Cas9(Cas9-gRNA 10μg)，所示比例为质粒比，原生质体在孵育48h后，提取植物基因组，同时引物5’-GGCTCATGTAGGCGATGGTC-3’(正向引物,SEQ ID NO:19)和5’-CGCGCTCAAGGTGCTCTA-3’(反向引物,SEQ ID NO:20)扩增Site1靶位点序列，用引物5’-GGGAGCGGGTTCACCGGCATCTC-3’(正向引物,SEQ ID NO:21)和5’-TGTCGTGTCAGGTCGGTAAGACC-3’(反向引物,SEQ ID NO:22)扩增脱靶位点(OT1-1)序列，引物5’-ACCAAACCAAAACCCACACACCC-3’(正向引物,SEQ ID NO:23)和5’-TCAGCATCCCCGCCCAACATCTC-3’(反向引物,SEQ ID NO:24)脱靶位点(OT1-2)序列，酶切后通过ImageJ对胶图进行分析(图4C)。共转化水稻原生质体的具体步骤如下。
原生质体转化
将水稻日本晴(本实验室所有，该品种为常用的试验品系，获自例如北京科学院大学生物互作卓越创新中心或其他商业种子公司购得)植株在1/2MS培养基上培养2周左右，用于实验。
(1)水浴锅温度设置为55℃；
(2)按照如下配方配置酶解液，用0.45μM滤膜过滤；
Figure BDA0002685541800000161
(3)将酶解液用0.45μM滤膜过滤至150ml三角瓶中；
(4)配置40ml 0.6M Mannitol溶液；
选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的细丝；将细丝放入0.6M Mannitol溶液中，锡箔纸包裹避光处理10分钟；用75μM尼龙布过滤，将细丝放入50ml酶液中避光，真空泵抽真空30min，压强约50kPa，取出后放在室温摇床上消化5-6小时，转速10-20rpm；
(5)加相同体积W5稀释酶解产物，用尼龙布过滤至50ml离心管中，收集原生质体，23℃，250×g离心，升速3，降速3，离心3min，弃上清；
(6)加适量MMG溶液重悬，血球计数器计数,稀释原生质体浓度至2×1.06/ml，；
(7)加20μg质粒于2ml离心管，用去尖的枪头吸取20.0μl原生质体沿管壁缓慢加入离心管中，轻轻吸打混匀，再加220μl PEG 4000，轻轻颠倒混匀，避光转化10-20min；
(8)加800μl W5颠倒混匀，23℃，250×g水平离心，升速3，降速3，离心3min，弃上清；
(9)加1ml WI，颠倒混匀，轻轻转至2ml离心管中，28℃或室温暗处培养。
(10)为观察载体转化效率和原生质体状态，转化12h后，在荧光显微镜下观察转化pJIT163-GFP质粒的原生质体GFP表达情况，统计转化效率，一般转化效率能够达到70-80％，如果转化效率太低或者基本看不到荧光则无需进行下步操作；
(11)在转化42后加入1μM ASV或对应浓度的DMSO，待48h时收集原生质体，12000rpm，1min离心，弃上清。
结果显示：Cas9:AcrIIA4＝1:1、1:2时均表现出AcrIIA4对Cas9的抑制作用，比例为1:2时对Cas9的抑制效果比1:1更强(图4C)。并发现加入1μM ASV后抑制作用消失。
4.ASV诱导下AcrIIA4-SMASh对编辑效率的影响
以与实施例3的项3同样的方法进行了水稻原生质体共转化，并孵育48h。其中，对照组：Cas9(Cas9-gRNA，10μg)，无ASV处理组：Cas9:AcrIIA4＝1:2(Cas9-gRNA 10μg:AcrIIA4-SMASh 20μg)；ASV处理组：Cas9:AcrIIA4＝1:2(Cas9-gRNA 10μg:AcrIIA4-SMASh20μg)，其中，ASV处理组在42h时加入1μM ASV，处理6h，在48h时与其他组一起收样(图4D)。提取水稻原生质体中的基因组，用相应引物对on-target位点(Site1：5’-GACGTCGGCGAGGAAGGCCTCGG-3’(SEQ ID NO:35))；off-target位点(OT1-1：5’-GACGCCGGCGAGGAAGGCCTCGG-3’(SEQ ID NO:36)，OT1-2：5’-GGGGTCGGCGAGGAAGGCCTCGG-3’(SEQ ID NO:37))进行PCR扩增。而后，通过二代测序分析靶位点及脱靶位点编辑效率，具体步骤参见“DNA提取，靶位点和预测脱靶位点的测序”。
其中，on-target位点Site1和其off-target位点OT1-1与OT1-2是发明人通过查阅文献所选择的。如图所示，与Site1相比，off-target位点OT1-1与OT1-2分别有1个和2个碱基的错配(图4A，浅色域，PAM处标注了下划线)。
结果表明，与对照组相比，在ASV处理组和无ASV处理组中，Site1、OT1-1与OT1-2的编辑效率均出现了降低，其中，在ASV处理组中维持了高于6％的Site1编辑效率，而在无ASV处理组中，三个位点的效率均过低，从而无法评价脱靶效应。对于脱靶效应而言，在对照组中，Site1与OT1-1、OT1-2的编辑效率相比不存在优势，脱靶效应明显；而在ASV处理组中，通过6h的ASV处理，靶位点Site1的编辑效率与OT1-1、OT1-2的编辑效率相比存在优势，对Site1的编辑效率为OT1-1、OT1-2的两倍以上，脱靶效应得到显著降低。
综上所述，通过特定时间的ASV处理，使得在维持一定的靶位点编辑效率的同时，提高了靶位点相对于脱靶位点的优势，降低了脱靶效应。换言之，通过将两个方法组合而对Cas9维持活性的时间进行间接调节，实现了在保留一定靶位点编辑效率的同时，使Cas9的脱靶效应降低(图4B，图4D)。
以上结果证实了与CRISPR/Cas9系统的方法组合使用时，通过加入ASV诱导降解AcrIIA4-SMASh融合蛋白，能够使Cas9活性恢复从而实现更精细的调节。
推测其机理为：当没有小分子ASV存在时，AcrIIA4融合蛋白正常表达后切去蛋白降解子，释放AcrIIA4蛋白并与Cas9竞争性结合至PAM区，从而抑制Cas9活性，导致靶位点不能被编辑；当加入ASV时，AcrIIA4-SMASh融合蛋白中的降解子无法被切去，使得融合蛋白被降解，导致Cas9恢复活性，能够对靶位点进行编辑(图4A)。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
参考文献
Li Shengnan,Wang Wenyi,Gao Jinlan et al.MYB75 Phosphorylation by MPK4Is Required for Light-Induced Anthocyanin Accumulation in Arabidopsis.[J].Plant Cell,2016,28:2866-2883.
Figure IDA0002685541870000011
Figure IDA0002685541870000021
Figure IDA0002685541870000031
Figure IDA0002685541870000041
Figure IDA0002685541870000051
Figure IDA0002685541870000061
Figure IDA0002685541870000071
Figure IDA0002685541870000081
Figure IDA0002685541870000091
Figure IDA0002685541870000101
Figure IDA0002685541870000111
Figure IDA0002685541870000121

Claims (10)

1.含有蛋白降解子的SMASh标签序列，所述标签序列为如SEQ ID NO:28所示的序列，优选所述标签序列用于植物蛋白水平的调节。
2.植物中的蛋白水平调节方法，包括
将SMASh标签序列直接或通过接头连接于靶蛋白的羧基端来构建靶蛋白-SMASh融合蛋白，从而在植物中表达靶蛋白-SMASh融合蛋白，
所述SMASh标签序列为SEQ ID NO:28所示的序列。
3.根据权利要求2所述的蛋白水平调节方法，包括
构建表达靶蛋白-SMASh融合蛋白的载体，优选所述载体为35S:GFP-SMASh，35S:MYB75-SMASh或Ubi:AcrIIA4-SMASh，以及将载体转化至植物中。
4.根据权利要求3所述的植物中的蛋白水平调节方法，包括向所述植物施用阿那匹韦(asunaprevir,ASV)。
5.根据权利要求4所述的植物中的蛋白水平调节方法，其中，当所述植物为整株植物状态时，向叶片施用不低于3μM，优选为不低于9μM的ASV；当所述植物为原生质体状态时，向原生质体施用1-9μM，优选为1μM的ASV。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的植物中的蛋白水平调节方法，其中，所述靶蛋白选自以下各项组成的组：
(1)GFP，编码靶蛋白的序列为如SEQ ID NO:25所示的序列；
(2)MYB75，编码靶蛋白的序列为如SEQ ID NO:26所示的序列；和
(3)AcrⅡA4，编码靶蛋白的序列为如SEQ ID NO:27所示的序列。
7.根据权利要求2～5中任一项所述的植物中的蛋白水平调节方法，其包括进一步使用CRISPR系统的方法，且所述靶蛋白优选为与Cas9竞争性结合同一位点的蛋白，更优选为AcrIIA4。
8.根据权利要求7所述的植物中的蛋白水平调节方法，其中，所述靶蛋白-SMASh融合蛋白的载体为Ubi:AcrIIA4-SMASh(优选为将pJIT163-Ubi-hGFP载体单BamHI酶切后，与AcrIIA4-SMASh片段同源重组构建获得)，其与CRISPR系统使用的Ubi:Cas9-gRNA载体(优选为将pJIT163-Cas9单SpeI酶切后，与gRNA片段同源重组构建获得)以1:1～1:2，优选为1:2的浓度比例进行共转染。
9.根据权利要求4～8中任一项所述的方法，其包括在施用ASV前使用有机硅助剂，优选为S233处理植株，优选的处理位置为叶片，S233的使用浓度优选为0.05％。
10.在权利要求2～8中任一项所述的植物中的方法中构建的载体。
CN202010975279.0A 2020-09-16 2020-09-16 植物中直接降低蛋白水平方法的建立 Active CN114195866B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010975279.0A CN114195866B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 植物中直接降低蛋白水平方法的建立

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010975279.0A CN114195866B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 植物中直接降低蛋白水平方法的建立

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114195866A true CN114195866A (zh) 2022-03-18
CN114195866B CN114195866B (zh) 2024-05-28

Family

ID=80644557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010975279.0A Active CN114195866B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 植物中直接降低蛋白水平方法的建立

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114195866B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102762729A (zh) * 2009-08-31 2012-10-31 螺线有限公司 提高翻译效率的dna片段和包含该dna片段的重组载体
CN110945015A (zh) * 2017-03-24 2020-03-31 爱丁堡大学董事会 基于mecp2的疗法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102762729A (zh) * 2009-08-31 2012-10-31 螺线有限公司 提高翻译效率的dna片段和包含该dna片段的重组载体
CN110945015A (zh) * 2017-03-24 2020-03-31 爱丁堡大学董事会 基于mecp2的疗法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114195866B (zh) 2024-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101227432B1 (ko) 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법
CN101688214A (zh) 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
US7253000B2 (en) Transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance
CN101883783A (zh) 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
CN109161550A (zh) 一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法
CN112226455B (zh) 一种水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因与应用
CN111826386B (zh) 一种调控棉花纤维呈色的融合基因及其表达载体和应用
Escobar et al. Using GFP as a scorable marker in walnut somatic embryo transformation
CN104703998B (zh) 植物中雄性育性的遗传减少
Chen et al. An efficient transient transformation system for gene function studies in pumpkin (Cucurbita moschata D.)
CN107475264B (zh) Dgm1蛋白在提高植物根毛生成能力中的应用
US7317141B2 (en) Transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance
CN111826364B (zh) 一种抗病虫害相关基因及其应用
JPWO2006098225A1 (ja) 窒素固定活性の高い根粒を着生する植物の作出法
CN107936099B (zh) Lhap1蛋白及其编码基因在调控植物光合作用中的应用
CN101874116A (zh) 具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法
CN104099368A (zh) 具有改良特征的植物及其制备方法
CN114085854B (zh) 一种水稻抗旱、耐盐基因OsSKL2及其应用
CA2372323C (en) Methods for increasing plant cell proliferation by functionally inhibiting a plant cyclin inhibitor gene
CN114195866B (zh) 植物中直接降低蛋白水平方法的建立
CN116103262A (zh) 棉花丝/苏氨酸蛋白磷酸酶GhTOPP4及其编码基因和应用
CN106831966B (zh) 增强植物耐盐碱胁迫能力的基因及其应用
CN111996204B (zh) 烟草GSNOR1a/1b在植物抗逆中的应用
CN111172176A (zh) 一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用
WO2013185028A1 (en) Compositions and methods for enhancing plant photosynthetic activity

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant