CN111996204B - 烟草GSNOR1a/1b在植物抗逆中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及烟草亚硝基谷胱甘肽还原酶氨基酸编码基因NtGSNOR1a/1b及其用途。本发明公开了一种烟草亚硝基谷胱甘肽还原酶氨基酸编码基因NtGSNOR1a/1b以及NtGSNOR1a/1b基因编码的蛋白质。敲除NtGSNOR1a/1b基因，所得烟草对除草剂百草枯(PQ)、烟草花叶病毒(TMV)均有抗性效应。

Description

烟草GSNOR1a/1b在植物抗逆中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及烟草亚硝基谷胱甘肽还原酶氨基酸编码基因NtGSNOR1a/1b及其用途。
背景技术
一氧化氮(Nitric oxide,NO)是参与动物和植物各种发育过程和应激反应的关键信号分子(Besson-Bard,Pugin et al.2008)。NO在植物体内的主要功能是通过调控蛋白质S-亚硝基化这一过程来实现的(Tada,Spoel et al.2008,Kneeshaw,Gelineau etal.2014)。近年来，植物中大量蛋白质被鉴定为S-亚硝基化的靶标，特别是在细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)期间，亚硝基化可以直接或间接的影响植物PCD(Huang,Huo et al.2019)。GSNO是植物体内NO主要的运输形式，尽管NO和GSNO并不总是与相同的靶蛋白相互作用(Frungillo,Skelly et al.2014)，但作为一氧化氮的缓冲剂，GSNO可以维持蛋白质的S-亚硝基化稳态平衡(Liu,Hausladen et al.2001)。GSNOR1作为GSNO的特异性还原酶在RNS的代谢中起着关键作用，它可以维持细胞内NO的稳态变化和控制S-亚硝基化蛋白与GSNO之间的反式亚硝化平衡(Feechan,Kwon et al.2005,Frungillo,Skelly etal.2014)。GSNOR1是NO介导的植物免疫信号分子中的重要调控者，这已经在拟南芥GSNOR1功能丧失的突变体(atgsnor1-3)中得到了证实，该突变体体内S-NOs水平增加，SA积累减少，并伴随着基础和非宿主抗性受损(Feechan,Kwon et al.2005)。拟南芥GSNOR1等位基因突变体hot5也显示出相似的表型特征，说明S-NOs稳态在调节生物、非生物胁迫反应中具有重要作用(Lee,Wie et al.2008)。除上述作用外，由GSNOR1/HOT5调节的细胞内NO水平变化是否参与其他细胞活动很大一部分仍然是未知的。
系统获得性抗性(SAR)在GSNOR1反义沉默植株中增强，在超表达植株中降低，与系统获得性抗性一致，植株中的S-NOs的水平也发生了相应的变化(Rustérucci,Espunya etal.2007)。另有报道指出GSNO和SA可以在SAR中起到协同作用(Feechan,Kwon etal.2005)。但是报道中也有与此相反的结果，即GSNOR1在病原菌侵染植物早期具有正向调控植物免疫的作用。当敲除AtGSNOR1之后，植物的基础抗性减弱，并且伴随着SA依赖的抗病基因表达量的减少(Feechan,Kwon et al.2005)，之后在向日葵(Chaki,
Figure BDA0002645631730000011
etal.2009)，以及黄瓜中也发现了类似的结果(Kubienova,Ticha et al.2014)。抛去以上矛盾之处，这些证据也进一步证实了GSNOR1在植物免疫防御中的重要作用。
植物免疫反应过程中，GSNOR1在NO/GSNO介导的化学修饰中也具有重要的作用。GSH可以促进烟草BY-2细胞GSNOR1及水杨酸依赖基因NPR1显著上调(Kovacs,Durner etal.2015)。GSNO还可以诱导拟南芥NPR1的表达和SA的积累从而增强拟南芥对Pst DC3000的抗性(Tada,Spoel et al.2008)。研究表明NO可以诱导GSH的产生，而GSH是SA积累和NPRI诱导所必需的，但是在拟南芥NO过表达突变体(nox1)中SA的生物合成以及依赖SA表达的基因都有所降低(Yun,Skelly et al.2016)。之后通过不同的双突变体nox1/atgsnor1-1(植物过表达GSNOR1)或nox1/atgsnor1-3(GSNOR1敲除的植物)发现NO或GSNO可以通过调控独立的或者重叠的靶标来对细胞进行调控。这就说明了GSNOR1调控的GSNO/NO信号通路在植物免疫过程中具有高度的复杂性(Jahnová,Luhováet al.2019)
GSNOR1还可以参与植物免疫反应过程中的PCD。当用Pst DC3000侵染atgsnor1-3时，突变体叶片较野生型中出现了更严重的细胞死亡；但是在atgsnor1-3/sid2(水杨酸缺乏突变体)，atgsnor1-3/atrbohD或atgsnor1-3/rbohF(缺乏活性氧中间体)双突变体植株中却没有观察到死亡减轻的现象，说明在没有SA和活性氧中间体合成的情况下植物体内升高的S-NOs就可以促进超敏反应(HR,Hypersensitive Response)的发生(Yun,Feechan etal.2011)。NO可以和ROS协同调控植物死亡，但需要注意的是，当S-NOs浓度升高时，一氧化氮介导的AtRBOHD的S-亚硝基化形成一个反馈回路抑制了超敏反应的发生(Yun,Feechanet al.2011)。
拟南芥GSNOR1突变体atgsnor1-3对百草枯表现出增强的抗性。
本发明中涉及的参考文献如下：
1)、Babbs,C.F.,J.A.Pham and R.C.Coolbaugh(1989)."Lethal HydroxylRadicalProduction in Paraquat-Treated Plants."Plant Physiology 90(4):1267(Babbs,C.F.,J.A.Pham and R.C.Coolbaugh(1989)."百草枯处理植物导致致死因子羟基自由基的产生".植物生理学90(4):1267)；
2)、Besson-Bard,A.,A.Pugin and D.Wendehenne(2008)."New insights intonitric oxide signaling in plants."Annual Review of Plant Biology 59:21-39.(Besson-Bard,A.,A.Pugin and D.Wendehenne(2008)."对植物中一氧化氮信号转导的新见解"植物生理学年鉴59:21-39)；
3)、Chaki,M.,A.M.
Figure BDA0002645631730000021
R.Valderrama,A.Carreras,F.J.Esteban,F.Luque,M.V.Gómez-Rodríguez,J.C.Begara-Morales,F.J.Corpas and J.B.Barroso(2009)."Involvement of Reactive Nitrogen and Oxygen Species(RNS and ROS)inSunflower–Mildew Interaction."Plant and Cell Physiology 50(3):665-679.(Chaki,M.,A.M.
Figure BDA0002645631730000022
R.Valderrama,A.Carreras,F.J.Esteban,F.Luque,M.V.Gómez-Rodríguez,J.C.Begara-Morales,F.J.Corpas and J.B.Barroso(2009)."活性氮与活性氧参与向日葵对疫霉菌的防御反应"植物与细胞生理学50(3):665-679)；
4)、Chen,R.Q.,S.L.Sun,C.Wang,Y.S.Li,Y.Liang,F.Y.An,C.Li,H.L.Dong,X.H.Yang,J.Zhang and J.R.Zuo(2009)."The Arabidopsis PARAQUAT RESISTANT2 geneencodes an S-nitrosoglutathione reductase that is a key regulator of celldeath."Cell Research 19(12):1377-1387.(Chen,R.Q.,S.L.Sun,C.Wang,Y.S.Li,Y.Liang,F.Y.An,C.Li,H.L.Dong,X.H.Yang,J.Zhang and J.R.Zuo(2009)."编码拟南芥亚硝基谷胱甘肽还原酶的PAR2基因是细胞死亡的调控因子."细胞研究19(12):1377-1387)；
5)、Dodge,A.D.(1971)."The mode of action of the bipyridyliumherbicides,paraquat and diquat."Endeavour 30(111):130-135.(Dodge,A.D.(1971)."百草枯的作用原理"奋进杂志30(111):130-135)；
6)、Feechan,A.,E.Kwon,B.W.Yun,Y.Wang,J.A.Pallas and G.J.Loake(2005)."Acentral role for S-nitrosothiols in plant disease resistance."Proc Natl AcadSci U S A 102(22):8054-8059.(Feechan,A.,E.Kwon,B.W.Yun,Y.Wang,J.A.Pallas andG.J.Loake(2005)."S-亚硝基硫醇在植物抗病中的重要作用."美国科学院学报102(22):8054-8059)；
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8)、Huang,D.,J.Huo,J.Zhang,C.Wang,B.Wang,H.Fang and W.Liao(2019)."ProteinS-nitrosylation in programmed cell death in plants."Cell Mol Life Sci76(10):1877-1887.(Huang,D.,J.Huo,J.Zhang,C.Wang,B.Wang,H.Fang and W.Liao(2019)."蛋白质S-亚硝基化在植物细胞程序性死亡中的作用."细胞与分子生命科学.76(10):1877-1887)；
9)、Jahnová,J.,L.Luhováand M.
Figure BDA0002645631730000031
(2019)."S-NitrosoglutathioneReductase-The Master Regulator of Protein S-Nitrosation in Plant NOSignaling."Plants(Basel,Switzerland)8(2):48.(Jahnová,J.,L.Luhováand M.
Figure BDA0002645631730000032
(2019)."S-亚硝基谷胱甘肽还原酶是植物NO信号转导中蛋白质s-亚硝化的主要调控因子."植物(瑞士巴塞尔).8(2):48)；
10)、Kneeshaw,S.,S.Gelineau,Y.Tada,G.J.Loake and S.H.Spoel(2014)."Selective Protein Denitrosylation Activity of Thioredoxin-h5 Modulates PlantImmunity."Molecular Cell56(1):153-162.(Kneeshaw,S.,S.Gelineau,Y.Tada,G.J.Loake and S.H.Spoel(2014)."硫氧还蛋白h5的选择性脱氮活性参与调节植物免疫."细胞分子.56(1):153-162)；
11)、Kovacs,I.,J.Durner and C.Lindermayr(2015)."Crosstalk betweennitric oxide and glutathione is required for NONEXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 1(NPR1)-dependent defense signaling in Arabidopsis thaliana."The New phytologist 208.(Kovacs,I.,J.Durner and C.Lindermayr(2015)."一氧化氮和谷胱甘肽之间的串扰是拟南芥NPR1防御信号所必需的。"新植物学家.208)；
12)、Kubienova,L.,T.Ticha,J.Jahnova,L.Luhova,B.Mieslerova andM.Petrivalsky(2014)."Effect of abiotic stress stimuli on S-nitrosoglutathionereductase in plants."Planta 239(1):139-146.(Kubienova,L.,T.Ticha,J.Jahnova,L.Luhova,B.Mieslerova and M.Petrivalsky(2014)."非生物胁迫刺激对植物S-亚硝基谷胱甘肽还原酶的影响."植物学239(1):139-146)；
13)、Lee,U.,C.Wie,B.O.Fernandez,M.Feelisch and E.Vierling(2008)."Modulation of nitrosative stress by S-nitrosoglutathione reductase iscritical for thermotolerance and plant growth in Arabidopsis."Plant Cell 20(3):786-802.(Lee,U.,C.Wie,B.O.Fernandez,M.Feelisch and E.Vierling(2008)."S-亚硝基谷胱甘肽还原酶调控亚硝化胁迫对拟南芥的耐热性和植物生长至关重要."植物细胞.20(3):786-802)；
14)、Liu,L.,A.Hausladen,M.Zeng,L.Que,J.Heitman and J.S.Stamler(2001)."A metabolic enzyme for S-nitrosothiol conserved from bacteria to humans."Nature 410(6827):490-494.(Liu,L.,A.Hausladen,M.Zeng,L.Que,J.Heitman andJ.S.Stamler(2001)."一种从细菌到人类都非常保守的s-亚硝基硫醇的代谢酶."自然410(6827):490-494)；
15)、Rustérucci,C.,M.C.Espunya,M.Díaz,M.Chabannes and M.C.Martínez(2007)."S-nitrosoglutathione reductase affords protection against pathogensin Arabidopsis,both locallyand systemically."Plant physiology 143(3):1282-1292.(Rustérucci,C.,M.C.Espunya,M.Díaz,M.Chabannes and M.C.Martínez(2007)."亚硝基谷胱甘肽还原酶在拟南芥抵御病原菌过程中具有重要作用."植物生理学143(3):1282-1292)；
16)、Tada,Y.,S.H.Spoel,K.Pajerowska-Mukhtar,Z.Mou,J.Song,C.Wang,J.Zuoand X.Dong(2008)."Plant immunity requires conformational changes[corrected]ofNPR1 via S-nitrosylation and thioredoxins."Science 321(5891):952-956.(Tada,Y.,S.H.Spoel,K.Pajerowska-Mukhtar,Z.Mou,J.Song,C.Wang,J.Zuo and X.Dong(2008)."s-亚硝基化和硫氧还蛋白改变NPR1的构象过程参与植物免疫."科学321(5891):952-956)；
17)、Yan,L.,S.Wei,Y.Wu,R.Hu,H.Li,W.Yang and Q.Xie(2015)."High-Efficiency Genome Editing in Arabidopsis Using YAO Promoter-Driven CRISPR/Cas9 System."Molecular Plant 8(12):1820-1823.(Yan,L.,S.Wei,Y.Wu,R.Hu,H.Li,W.Yang and Q.Xie(2015)."利用YAO启动子驱动的CRISPR/Cas9系统对拟南芥进行高效基因组编辑."植物分子8(12):1820-1823)；
18)、Yun,B.-W.,M.Skelly,M.Yin,M.Yu,B.-G.Mun,S.-U.Lee,A.Hussain,S.Spoeland G.Loake(2016)."Nitric oxide and S-nitrosoglutathione function additivelyduring plant immunity."The New phytologist 211.(Yun,B.-W.,M.Skelly,M.Yin,M.Yu,B.-G.Mun,S.-U.Lee,A.Hussain,S.Spoel and G.Loake(2016)."一氧化氮和S-亚硝基谷胱甘肽在植物免疫过程中的叠加效应."新植物学家211)；
19)、Yun,B.W.,A.Feechan,M.Yin,N.B.Saidi,T.Le Bihan,M.Yu,J.W.Moore,J.G.Kang,E.Kwon,S.H.Spoel,J.A.Pallas and G.J.Loake(2011)."S-nitrosylation ofNADPH oxidase regulates cell death in plant immunity."Nature 478(7368):264-268.(Yun,B.W.,A.Feechan,M.Yin,N.B.Saidi,T.Le Bihan,M.Yu,J.W.Moore,J.G.Kang,E.Kwon,S.H.Spoel,J.A.Pallas and G.J.Loake(2011)."NADPH氧化酶的S-亚硝基化可以调节植物免疫过程中的细胞死亡."自然478(7368):264-268)。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种烟草GSNOR1a/1b在植物抗逆中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种烟草亚硝基谷胱甘肽还原酶氨基酸编码基因NtGSNOR1a/1b，基因NtGSNOR1a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，基因NtGSNOR1b的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。
本发明还提供了上述NtGSNOR1a/1b基因编码的蛋白质：基因NtGSNOR1a编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述，基因NtGSNOR1b编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:4所述。
本发明还同时提供了上述NtGSNOR1a/1b基因在植物抗逆中的应用：敲除NtGSNOR1a/1b基因，所得烟草对除草剂百草枯(PQ)、烟草花叶病毒(TMV)均有抗性效应。
本发明还同时提供了制备NtGSNOR1a/1b转基因敲除植株的方法：同时敲除NtGSNOR1a基因及NtGSNOR1b基因，从而使得植物表达的NtGSNOR1a及NtGSNOR1b的mRNA提前出现终止密码子。
既，利用基因编辑技术创制突变体使得植物不能表达正常的NtGSNOR1a/1b氨基酸序列。
本发明提供了NtGSNOR1a/1b基因的核苷酸序列或氨基酸序列在研究植物对百草枯抗性及烟草花叶病毒(TMV)抗性效应中的应用。
烟草属于异源二倍体，本发明利用CRISPR/CAS9技术(Yan,Wei et al.2015)创制了不同的转基因株系，本发明中所使用的野生型烟草为(Nicotiana.tabacum cv samsun,NN)携带抗烟草花叶病毒的N基因，所有转基因实验所使用的烟草均是此背景。本发明对不同的T2代转基因株系中NtGSNOR1a/1b的敲除情况进行了遗传测序分析(图1)。
鉴定出NtGSNOR1a/1b两个基因同时被敲除的CRISPR/CAS9纯合株系2个。
株系line1中NtGSNOR1a位点为5bp纯合缺失(-5bp/-5bp)，NtGSNOR1b位点为1bp纯合插入(+1bp/+1bp)；
株系line3中NtGSNOR1a位点为2bp纯合缺失(-2bp/-2bp)，NtGSNOR1b位点为40bp纯合缺失(-40bp/-40bp)；
所有株系中的不同形式的突变均导致NtGSNOR1a和NtGSNOR1b编码基因不能合成正常的蛋白，达到基因敲除的目的。
具体而言：
株系line1在NtGSNOR1a中的第58-62bp处缺失5个碱基，在NtGSNOR1b中的第61bp之后插入一个碱基T；
株系line3在NtGSNOR1a中的第60-61bp处缺失2个碱基，在NtGSNOR1b中的第62-101bp处缺失40个碱基；
1-1-二甲基-4-4-联吡啶俗称百草枯(Paraquat,PQ)，是一种快速触杀型除草剂，它可以快速诱导绿色植物产生大量活性氧，从而使植物遭受氧化胁迫损伤，达到除草目的(Dodge 1971)。无论是在植物中还是在动物中百草枯都能迅速的诱导细胞死亡(Babbs,Pham et al.1989)。为了探究NtGSNOR1a/1b双敲除突变对百草枯的抗性效应，本发明用0.25％的百草枯对野生型(Nicotiana.tabacum cv samsun,NN)及两个不同的NtGSNOR1a/1b双敲除突变体株系(line1、line3)进行了喷洒实验。在喷洒后三天左右，野生型植株叶片上出现大面积的细胞死亡，双敲除株系叶片上也有一定程度的细胞死亡，但死亡程度远低于对照株；喷施六天后，野生型叶片基本全部干枯死亡，而NtGSNOR1a/1b双敲除植株仍然存活、叶片仍呈绿色(图2A)，说明在烟草中敲除NtGSNOR1a/1b具有增强抗除草剂百草枯的效应。
百草枯可以诱导植物产生大量活性氧，百草枯处理后的par2突变体中ROS的积累量和野生型之间并无显著性的差异(Chen,Sun et al.2009)。为了探究百草枯喷洒前后NtGSNOR1a/1b双敲除突变体中ROS的变化，本发明用0.25％的百草枯喷施野生型(Nicotiana.tabacum cv samsun,NN)和其中一个转基因烟草株系(line1)，并对喷施2天的烟草叶片进行DAB染色。结果表明，喷施2天后，野生型烟草叶片上出现大面积细胞死亡，并且伴随着大量的活性氧的积累，而NtGSNOR1a/1b双敲除突变体植株叶片上ROS的积累水平远低于野生型(图2 B)，说明NtGSNOR1a/1b具有促进百草枯诱导的ROS积累的效应；NtGSNOR1a/1b双敲除突变体植株叶片上不能积累过量的H2O2是其在喷施百草枯后仍能存活的主要原因。
研究报道指出GSNOR1在植物免疫过程中具有重要的作用(Kovacs,Durner etal.2015)。为了探究双敲除NtGSNOR1a/1b株系的抗病性效应，采用烟草花叶病毒(TMV)侵染WT及NtGSNOR1a/1b双敲除突变体株系(line1和line3)。由于所用的野生型及转基因烟草携带N基因，当TMV侵染时会在接种的当地叶片产生HR。HR的大小反映了病毒在侵染部位复制和运动的情况，通过比较HR的大小，便可判断抗性的强弱。
如(图3 A，B)所示，TMV侵染后在NtGSNOR1a/1b双敲除突变体植株叶片上形成的HR远小于在WT叶片上的HR，说明同时敲除NtGSNOR1a/1b可增强烟草N基因介导的对TMV的抗性。
综上所述，本发明涉及一种烟草亚硝基谷胱甘肽还原酶氨基酸编码基因(NtGSNOR1a/1b)敲除株系在植物抗除草剂百草枯(PQ)及烟草花叶病毒(TMV)中的应用。NtGSNOR1a/1b的敲除株系表现出对百草枯增强的抗性，并且敲除NtGSNOR1a/1b后，降低了百草枯诱导植物对活性氧(ROS,Reactive oxygen species)的积累效应，增强了NtGSNOR1a/1b敲除株系对百草枯的抗性；本发明还发现敲除NtGSNOR1a/1b增强了N基因介导的对烟草花叶病毒(TMV)抗性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为不同的CRISPR/CAS9株系的突变形式序列比对；
即，图1为2个已鉴定的CRISPR/CAS9株系的序列比对；横线下划(_____)线标注的序列表示CRISPR/CAS9-NtGSNOR1a/1b，序列短横线(-)表示删除；
Figure BDA0002645631730000071
代表PAM序列；波浪线下划线
Figure BDA0002645631730000072
标注的碱基表示插入；…//…表示省略了一些碱基；//表示为方便序列比对使连续序列断开。
图2为NtGSNOR1a/1b敲除株系降低了百草枯(PQ)诱导的H2O2积累，表现出对百草枯诱导死亡增强的抗性。
图2中，A.0.25％百草枯(PQ)喷施40天左右的WT和CRISPR/CAS9敲除株系(line 1和line 3)。在喷施后的第0、3和6天进行拍摄。B.通过DAB染色观察喷施百草枯两天后野生型和敲除株系叶片中H2O2的积累。
图3为敲除NtGSNOR1a/1b导致N基因介导的对TMV的抗性增强
图3中，A.在接种TMV之后，NtGSNOR1a/1b敲除株系(line1和line3)叶片上形成的HR直径较野生型(NN)植株明显减小。B.在体式显微镜下测量A中显示的HR病斑直径的大小。每个独立株系测量三个叶片，每个叶片测量30个病斑。***表示T检验P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
1、获取NtGSNOR1a/1b的cDNA序列及氨基酸序列
基因NtGSNOR1a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述。
基因NtGSNOR1b的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所述。
2、烟草总DNA提取
(1)用剪刀剪取适量转基因及野生型叶片于1.5mL离心管中，用研磨棒充分研磨至匀浆状。
(2)加入300或400μL CTAB，上下颠倒混匀，然后放到65℃水浴锅中水浴20min，每隔5min上下颠倒混匀一次，水浴结束后离心机12000rpm离心10min。
(3)小心吸取上清到一个新的1.5mL的离心管中，之后加入等体积的氯仿，用震荡仪混匀，然后12000rpm离心10min。
(4)吸取(3)中的上清到新的离心管中(注意不要吸到中间相和水相)，并加入与相同体积的异丙醇，用震荡仪轻轻混匀，12000rpm离心10min。
(5)弃掉上清，向离心管中加入800μL 75％的乙醇，用震荡仪轻轻震荡悬浮，然后8000rpm离心5min。
(6)离心完成后用移液枪将上清吸净，然后置于55℃干燥箱中干燥10min左右，然后加入10-50μL的去离子水，轻弹混匀，置于-20℃冰箱中保存。
3、PCR扩增体系及鉴定引物设计
(1)反应体系的配制
表1、突变体鉴定PCR反应体系
PCR reaction systems for mutant identification
Figure BDA0002645631730000081
Figure BDA0002645631730000091
(2)PCR反应程序
Figure BDA0002645631730000092
(3)引物设计
CAS9-NtGSNOR1a/1b靶点-F:5’-ATTGCTGGGAACCCAACAAGCCTC-3’
CAS9-NtGSNOR1a/1b靶点-R:5’-AAACGAGGCTTGTTGGGTTCCCAG-3’
CAS9-NtGSNOR1a/1b-验证-F:5’-CACTACTAGTATACCACTTA-3’
CAS9-NtGSNOR1a-验证-R1:5’-GTGGTTAACTTTATGAATAATTTGC-3’
CAS9-NtGSNOR1b-验证-R2:5’-TTAGAAACTCACATAGCCGG-3’
4.转基敲除突变体的创制及鉴定
首先利用(Yan,Wei et al.2015)的方法构建CRISPR/CAS9载体，并利用农杆菌介导的转基因技术创制一系列转基因株系，具体如下：
(1)分别从NtGSNOR1a和NtGSNOR1b基因组DNA的第二个外显子同源区段中选择20个核苷酸的寡核苷酸(既SEQ ID NO:1、2中所述第45-64bp 20个碱基)。所选寡核苷酸的正义链和反义链均用与Bsa I粘性末端ATTG和AAAC融合(CAS9-NtGSNOR1a/1b靶点-F、CAS9-NtGSNOR1a/1b靶点-R)，之后将引物序列送基因公司合成。
(2)将合成的寡核苷酸的正义链和反义链在TE缓冲液中混合，98℃加热5分钟，然后冷却至室温，退火。随后将退火的双链寡核苷酸连接到预先用Bsa I消化的中间载体AtU6-26-sgRNA-SK上(Yan,Wei et al.2015)。
(3)将中间载体质粒用Nhe I和Spe I(Nhe I和Spe I是同尾酶)双酶切，将包含向导序列的642bp片段连接到预先用Spe I酶切并用碱性磷酸酶处理的最终载体pCAMBIA-1300-pYAO：CAS9中(Yan,Wei et al.2015)。
(4)通过测序证实最终构建体的真实性。
(5)将上述构建成功的最终载体转入到农杆菌GV3101中，并利用农杆菌介导的转基因技术进行转基因创制。
(6)对创制的不同的转基因株系的不同T2代进行靶点测序：首先在基因DNA靶点侧翼两端的非同源区段分别设计NtGSNOR1a/1b的特异性引物(CAS9-NtGSNOR1a/1b-验证-F、CAS9-NtGSNOR1a-验证-R1、CAS9-NtGSNOR1b-验证-R2)，之后用PCR扩增的方法用提取的总DNA作为模板(扩增体系和程序如上述3(1)和3(2)所述)，将靶点序列扩增出来进行直接测序或者连接到过渡载体(PMD-19T)上挑取单克隆去测序，从而达到鉴定不同株系突变情况的目的。
通过上述方法共鉴定到如图1所述的株系。
将上述株系放到温室中(光照条件：23℃，16h；黑暗条件：20℃，8h；湿度50％)，通过自交从而获得相应的纯合的转基因突变体种子进行下述步骤5、6、7的相关实验。
5.百草枯喷洒实验
将消过毒的烟草(Nicotiana.tabacum cv samsun,NN)野生型及转基因突变体种子(line1和line3)平铺在MS固体培养基上，分别标记好各材料的名称和日期，用封口膜将平板封口，垂直放置于烟草人工光照培养箱(光照条件：23℃，16h；黑暗条件：20℃，8h；湿度50％)培养皿架上，待其培养15天左右后，将幼苗移植到土壤中。待植株培养到40天左右的时候用0.25％的百草枯喷施野生型及转基因植株，进行抗性分析。
注意：百草枯是一种剧毒类药物，在配药和喷药时一定要有防护措施，比如戴橡胶手套、穿工作服、戴口罩，护目镜等，如果药液不小心溅入眼睛或皮肤上，必须马上进行冲洗，如果比较严重的话要及时就医。配制百草枯的容器须存放到专区，并做好剧毒标记。
(1)配制好0.25％的百草枯放到喷壶中。
(2)选取40d左右的长势良好的转基因及野生型有苗做好标记，用喷壶在同一高度将百草枯均匀喷洒到烟草叶片上，在保持高度和喷壶出液量一致的情况下，每株烟草按动喷壶开关两下，之后将烟草放置到正常培养条件下进行培养观察。
(3)每隔一天对喷洒过百草枯的烟草表型进行拍照观察。
所得结果为：在喷洒后三天左右，野生型植株叶片上出现大面积的细胞死亡，双敲除株系叶片上也有一定程度的细胞死亡，但死亡程度远低于对照株；喷施六天后，野生型叶片基本全部干枯死亡，而NtGSNOR1a/1b双敲除植株仍然存活、叶片仍呈绿色(图2A)。根据该结果可得知：在烟草中敲除NtGSNOR1a/1b具有增强抗除草剂百草枯的效应。
6.DAB染色实验
DAB配制：准备一个洗净的小烧杯，并用锡箔纸包好进行避光处理，首先称取50mgDAB粉末置于小烧杯中，并加入45mL的无菌水，将上述DAB染液置于磁力搅拌器上搅拌使其充分的溶解，从而配制成1mg/mL的DAB染液；之后用0.2M的HCl调节PH到3.0；随后向该溶液中加入25μL的吐温20和2.5mL的200mM Na2HPO4，并继续调节PH，直到PH稳定在3.0(DAB见光易分解，注意全程避光操作)。
依次进行以下步骤：
(1)将配置好的DAB染料盛放到500mL的玻璃烧杯中，用锡箔纸封好，注意避光。
(2)用剪刀剪取转基因和野生型叶片分别放到盛有DAB染料的烧杯中，注意不要弄伤叶片。将烧杯放到真空泵中抽真空5min。
(3)将烧杯置于水平小摇床上80rpm轻轻摇晃染色4-5h。
(4)将染色液倒入废液桶中，然后加入新配制的漂白液(按照无水乙醇：乙酸：甘油为3:1:1的比例配制)，置于沸水中水浴加热15-30min，期间更换漂白液，直到将叶绿素去除干净(即，叶绿素完全去除，未染色部分为白色，叶脉清洗可见)。
(5)漂白完成后用清水清洗一下，用镊子轻轻夹出放到白板上拍照记录，或者放到体式显微镜下拍照。
所得结果为：喷施百草枯2天后，野生型烟草叶片上有大量的活性氧的积累，而NtGSNOR1a/1b双敲除突变体植株叶片上ROS的积累水平远低于野生型(图2B)，说明NtGSNOR1a/1b具有促进百草枯诱导的ROS积累的效应。
根据该结果可得知：双敲除NtGSNOR1a/1b可降低植株对于百草枯诱导的活性氧的积累效应，从而增强其对百草枯诱导死亡的抗性。
7.烟草花叶病毒(TMV)侵染实验
(1)TMV病毒的接种与活化
本实验采用摩擦接种法，为确保接种病毒的活性，在接种前需要接种到野生型植株(不含有抗TMV的N基因；Nicotiana.tabacum cv samsun,nn)收集新鲜病毒汁液进行接种。
将保存的TMV病毒汁液取出置于冰上融化，用PBS缓冲液将病毒汁液稀释10倍，将石英砂均匀的洒在野生型烟草叶片生上，吸取50μL滴加在叶片上，戴手套用手轻轻摩擦接种叶片，使形成微小创伤，接种完成后用喷壶喷洒适量水到接种叶片上，保持叶片湿润。接种约30min后用喷壶洗净叶片上的石英砂，并用保鲜罩子罩住，24h左右打开罩子。到约10天左右根据病毒叶片表型(既上部系统叶片出现皱缩、畸形、扭曲)收集叶片保存病毒汁液。
(2)将研磨棒和研钵用酒精灼烧，自然冷却到室温后将要收集病毒的叶片剪下放到研钵中，加入适量的PBS缓冲液，用研磨棒捣碎成匀浆。
(3)吸取新鲜的病毒汁液用PBS稀释100倍，采用步骤(1)的方法将病毒均匀接种到需要实验的烟草叶片上，注意接种过程一定要轻。
(4)由于本实验的烟草材料(Nicotiana.tabacum cv samsun,NN及在此背景下创制的转基因株系)携带有抗TMV的N基因，当接种TMV后会出现致死斑点，所以在接种后需要每天观察致死斑的变化情况，约接种5天左右致死斑直径不再扩大，这时候摘取叶片用体式显微镜对烟草的叶片上的致死斑进行拍照。
(5)用Image J软件对病斑的直径进行测量，并对病斑数据进行统计学分析。
镜下拍照。
所得结果为：如(图3A，B)所示，TMV侵染后在NtGSNOR1a/1b双敲除突变体植株叶片上形成的HR远小于在WT叶片上的HR。
根据该结果可获得以下总结性结论：同时敲除NtGSNOR1a/1b可增强烟草N基因介导的对TMV的抗性。
验证实验一、按照上述方法制备所得的转基因敲除植株，经检测，
基因序列同株系line1的4个平行株系，上述5～7的实验结果均同上述株系line1。
基因序列同株系line3的4个平行株系，上述5～7的实验结果均同上述株系line3。
验证实验二、
(1)对于转基因植株突变位点的确定：所有转基因株系突变位点均经过测序及比对最终验证其突变位点的正确性。
(2)对于双敲除NtGSNOR1a/1b植株对百草枯的抗性实验：使用百草枯稀释液(浓度0.25％)喷施野生型及转基因株系，并且至少重复该实验3次以上均可得到一致的实验结果，既双敲除NtGSNOR1a/1b植株较野生型植株对百草枯诱导死亡具有增强的抗性，且这种抗性效应是由于双敲除NtGSNOR1a/1b之后降低了百草枯对绿色植物活性氧的诱导效应。
(3)对于双敲除NtGSNOR1a/1b植株对烟草花叶病毒(TMV)的抗性：使用摩擦接种病毒的方式并进行病毒接种，之后对接种后的病斑进行观察及统计，并且至少重复该实验3次以上均可得到一致的实验结果，既双敲除NtGSNOR1a/1b植株较野生型植株对烟草花叶病毒的抗性显著增强。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 烟草GSNOR1a/1b在植物抗逆中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctacac aaggtcaagt catcacctgc aaagctgcgg tggcctggga acccaacaag 60
cctctggtga tcgaggatgt gcaggtggct ccgccgcaag ccggtgaagt ccgtgttaaa 120
gttctctata ctgctctctg ccacactgat gcttatacct ggagtggcaa ggatcctgaa 180
ggtctcttcc catgtgttct tggtcatgag gctgcaggga tagtagaaag tgtcggtgaa 240
ggagttactg aggttcagcc aggagaccat gttatacctt gttaccaggc agaatgcaga 300
gaatgcaagt tctgcaaatc aggaaagacc aacctttgtg gtaaagtaag ggcagctact 360
ggagtaggag ttatgatgaa cgaccgcaag agtcgatttt ctatcaacgg aaagccaatc 420
tatcatttca tgggaacttc aaccttcagt cagtacactg ttgtccatga tgttagtgtt 480
gcaaagattg acccagtagc tcctctggag aaagtctgcc ttcttggatg tggtgttcca 540
actggtcttg gagctgtttg gaacactgca aaagttgaac caggttccat tgttgctgtc 600
tttggcctgg gcacagttgg tcttgctgtg gcagagggtg caaaagctgc tggtgcttcg 660
cgaattattg ggattgatat tgacagcaaa aagttcgata gagccaaaaa atttggtgtg 720
actgaattca tcaaccccaa agagcatgag aaaccaatac agcaagtcat tgtggatctt 780
acagatggtg gtgttgatta cagttttgag tgcattggaa acgtctcggt tatgagggct 840
gctttagagt gctgtcacaa gggatgggga acctcggtga ttgtgggtgt tgctgcatct 900
ggtcaggaga tatccactcg tccatttcag ctggtgactg gccgtgtttg gaagggaacc 960
gcatttggtg gtttcaaaag ccgatcccaa gttccttggc tcgtggacaa gtatttgaag 1020
aaggaaatca aggtggatga atacatcact cataatatga cgcttgcgga cataaacaaa 1080
gcttttgacc tgatgcatga cggaagctgc ctccgtgttg tcctggatat gttcgtatga 1140
<210> 2
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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acagatggtg gtgttgatta cagttttgag tgcattggaa acgtctcggt tatgagggct 840
gctttagagt gctgtcacaa ggggtgggga acctcagtga ttgtgggtgt tgctgcatct 900
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aaggaaatca aggtggatga atacataact cataatatga cgcttacgga cataaacaaa 1080
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<210> 3
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Thr Gln Gly Gln Val Ile Thr Cys Lys Ala Ala Val Ala Trp
1               5                   10                  15
Glu Pro Asn Lys Pro Leu Val Ile Glu Asp Val Gln Val Ala Pro Pro
            20                  25                  30
Gln Ala Gly Glu Val Arg Val Lys Val Leu Tyr Thr Ala Leu Cys His
        35                  40                  45
Thr Asp Ala Tyr Thr Trp Ser Gly Lys Asp Pro Glu Gly Leu Phe Pro
    50                  55                  60
Cys Val Leu Gly His Glu Ala Ala Gly Ile Val Glu Ser Val Gly Glu
65                  70                  75                  80
Gly Val Thr Glu Val Gln Pro Gly Asp His Val Ile Pro Cys Tyr Gln
                85                  90                  95
Ala Glu Cys Arg Glu Cys Lys Phe Cys Lys Ser Gly Lys Thr Asn Leu
            100                 105                 110
Cys Gly Lys Val Arg Ala Ala Thr Gly Val Gly Val Met Met Asn Asp
        115                 120                 125
Arg Lys Ser Arg Phe Ser Ile Asn Gly Lys Pro Ile Tyr His Phe Met
    130                 135                 140
Gly Thr Ser Thr Phe Ser Gln Tyr Thr Val Val His Asp Val Ser Val
145                 150                 155                 160
Ala Lys Ile Asp Pro Val Ala Pro Leu Glu Lys Val Cys Leu Leu Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Val Pro Thr Gly Leu Gly Ala Val Trp Asn Thr Ala Lys Val
            180                 185                 190
Glu Pro Gly Ser Ile Val Ala Val Phe Gly Leu Gly Thr Val Gly Leu
        195                 200                 205
Ala Val Ala Glu Gly Ala Lys Ala Ala Gly Ala Ser Arg Ile Ile Gly
    210                 215                 220
Ile Asp Ile Asp Ser Lys Lys Phe Asp Arg Ala Lys Lys Phe Gly Val
225                 230                 235                 240
Thr Glu Phe Ile Asn Pro Lys Glu His Glu Lys Pro Ile Gln Gln Val
                245                 250                 255
Ile Val Asp Leu Thr Asp Gly Gly Val Asp Tyr Ser Phe Glu Cys Ile
            260                 265                 270
Gly Asn Val Ser Val Met Arg Ala Ala Leu Glu Cys Cys His Lys Gly
        275                 280                 285
Trp Gly Thr Ser Val Ile Val Gly Val Ala Ala Ser Gly Gln Glu Ile
    290                 295                 300
Ser Thr Arg Pro Phe Gln Leu Val Thr Gly Arg Val Trp Lys Gly Thr
305                 310                 315                 320
Ala Phe Gly Gly Phe Lys Ser Arg Ser Gln Val Pro Trp Leu Val Asp
                325                 330                 335
Lys Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Lys Val Asp Glu Tyr Ile Thr His Asn
            340                 345                 350
Met Thr Leu Ala Asp Ile Asn Lys Ala Phe Asp Leu Met His Asp Gly
        355                 360                 365
Ser Cys Leu Arg Val Val Leu Asp Met Phe Val
    370                 375
<210> 4
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Thr Gln Gly Gln Val Ile Thr Cys Lys Ala Ala Val Ala Trp
1               5                   10                  15
Glu Pro Asn Lys Pro Leu Val Ile Glu Asp Val Gln Val Ala Pro Pro
            20                  25                  30
Gln Ala Gly Glu Val Arg Val Lys Val Leu Tyr Thr Ala Leu Cys His
        35                  40                  45
Thr Asp Ala Tyr Thr Trp Ser Gly Lys Asp Pro Glu Gly Leu Phe Pro
    50                  55                  60
Cys Val Leu Gly His Glu Ala Ala Gly Ile Val Glu Ser Val Gly Glu
65                  70                  75                  80
Gly Val Thr Glu Val Gln Pro Gly Asp His Val Ile Pro Cys Tyr Gln
                85                  90                  95
Ala Glu Cys Arg Glu Cys Lys Phe Cys Lys Ser Gly Lys Thr Asn Leu
            100                 105                 110
Cys Gly Lys Val Arg Ala Ala Thr Gly Val Gly Val Met Met Asn Asp
        115                 120                 125
Arg Gln Ser Arg Phe Ser Ile Asn Gly Lys Pro Ile Tyr His Phe Met
    130                 135                 140
Gly Thr Ser Thr Phe Ser Gln Tyr Thr Val Val His Asp Val Ser Val
145                 150                 155                 160
Ala Lys Ile Asp Pro Val Ala Pro Leu Glu Lys Val Cys Leu Leu Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Val Pro Thr Gly Leu Gly Ala Val Trp Asn Thr Ala Lys Val
            180                 185                 190
Glu Pro Gly Ser Ile Val Ala Val Phe Gly Leu Gly Thr Val Gly Leu
        195                 200                 205
Ala Val Ala Glu Gly Ala Lys Ala Ala Gly Ala Ser Arg Ile Ile Gly
    210                 215                 220
Ile Asp Ile Asp Ser Lys Lys Phe Asp Arg Ala Lys Asn Phe Gly Val
225                 230                 235                 240
Thr Glu Phe Ile Asn Pro Lys Glu His Glu Lys Pro Ile Gln Gln Val
                245                 250                 255
Ile Val Asp Leu Thr Asp Gly Gly Val Asp Tyr Ser Phe Glu Cys Ile
            260                 265                 270
Gly Asn Val Ser Val Met Arg Ala Ala Leu Glu Cys Cys His Lys Gly
        275                 280                 285
Trp Gly Thr Ser Val Ile Val Gly Val Ala Ala Ser Gly Gln Glu Ile
    290                 295                 300
Ser Thr Arg Pro Phe Gln Leu Val Thr Gly Arg Val Trp Lys Gly Thr
305                 310                 315                 320
Ala Phe Gly Gly Phe Lys Ser Arg Ser Gln Val Pro Trp Leu Val Asp
                325                 330                 335
Lys Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Lys Val Asp Glu Tyr Ile Thr His Asn
            340                 345                 350
Met Thr Leu Thr Asp Ile Asn Lys Ala Phe Asp Leu Met His Asp Gly
        355                 360                 365
Ser Cys Leu Arg Val Val Leu Asp Met Phe Val
    370                 375

Claims (2)

1.烟草亚硝基谷胱甘肽还原酶氨基酸编码基因NtGSNOR1a/1b在烟草抗除草剂百草枯及烟草花叶病毒中的应用，其特征是：同时敲除野生型烟草（Nicotiana. tabacum cv  samsun，NN）中的NtGSNOR1a基因和NtGSNOR1b基因，所得烟草对除草剂百草枯、烟草花叶病毒均有抗性效应；基因NtGSNOR1a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，基因NtGSNOR1b的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述；所述野生型烟草为携带抗烟草花叶病毒的N基因的烟草。
2.制备对除草剂百草枯、烟草花叶病毒均有抗性效应的NtGSNOR1a/1b转基因敲除烟草的方法，其特征在于：同时敲除野生型烟草（Nicotiana. tabacum cv samsun，NN）中的NtGSNOR1a基因及NtGSNOR1b基因，从而使得烟草表达的NtGSNOR1a及NtGSNOR1b的mRNA提前出现终止密码子；基因NtGSNOR1a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，基因NtGSNOR1b的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述；所述野生型烟草为携带抗烟草花叶病毒的N基因的烟草。
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