CN104561023B - 大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因及其调控开花及衰老的作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因及其调控开花及衰老的用途。具体地，本发明涉及具有SEQ ID NO：1或3所示的序列大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因、包含该基因的DNA分子、载体、该基因编码的蛋白质及相关的转化细胞和转基因植物，还涉及所述基因在调控植物叶子衰老和开花中的应用和培育相关转基因植物的方法。

Description

大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因及其调控开花及衰老的作用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因及其应用。

背景技术

自然界中，植物衰老研究已成为植物生命科学研究的重要问题之一。Thimann等人1978年提出，植物衰老是生长发育过程中一系列的衰退过程(Thimann,1978)。十几年后Roach提出衰老是随着植物年龄的增长，生存和生殖能力逐渐降低的生理过程(Roach等，1993)。1997年，Nooden对这一概念进行了完善，提出衰老是植物体细胞程序性死亡的有序降解过程(Nooden等，1997)。与植物其他衰老事件一样，叶片衰老是发育的最后阶段，最终叶片死亡，因此限制了叶片的生命周期和寿命。

叶片衰老调控进程的阐明有助于我们了解衰老现象和植物生命周期的生物学原理。植物叶片衰老的分子机制的探索在生物工程应用中影响重大，例如提高植物产量，收后贮藏，逆境耐受性。

迄今为止，通过芯片分析在不同物种中发现大量的SAGs。很多基因可能编码调控因子，这些调控因子可能是信号感应器和传导器的组成部分，例如转录因子和类受体激酶。这些调控基因的进一步研究可是一些重要的衰老调控基因被发现同时也为叶片衰老调控机制研究提供依据。WRKY家族中，WRKY53和WRKY6与叶片衰老相关的功能被深入研究。WRKY53在衰老早期表达上调但在后期表达量下降，表明WRKY53在衰老早期起调控作用(Hinderhofer K，2001)。WRKY53包括其他SAGs的靶基因是胁迫相关基因以及转录因子包括其他WRKY因子。WRKY53敲除突变体的衰老被延迟，而诱导WRKY53过表达则产生早衰，这表明WRKY53是衰老的正调控子(Miao Y，2004)。通过对WRKY53介导的衰老调控通路的研究来探索WRKY53的直接下游作用靶基因。另一个WRKY家族转录因子WRKY6，在叶片衰老和病原菌侵染中其表达量大幅上调(Robatzek S，2002)。WRKY6通过与启动区的W-box结合来调控基因。很多WRKY6相关基因包括衰老诱导的类受体激酶基因SIRK与衰老和病原体响应有关。虽然WRKY6在病原菌防卫和衰老中都起作用，但SIRK仅在衰老阶段表达。WRKY6敲除突变会改变SAGs的表达但对衰老的影响不明显。这是因为敲除突变体中SAGs表达的改变可能不足以对叶片衰老变化起到明显作用。也可能是由于WRKY家族成员而产生的功能冗余。

NAC蛋白是植物特有的最大转录因子家族之一，拟南芥中该家族就有100多个成员。NAC家族基因在胚芽和幼芽的分生组织发育，侧根的形成，生长素信号转导和防御响应中起作用。20个NAC转录因子的表达水平在自然衰老和黑暗诱导的衰老中显著增加(Guo Y，2006)。NAP编码一个NAC家族转录因子，T-DNA敲除突变体AtNAP表现出衰老延迟表型。可见AtNAP是叶片衰老的正调控子。水稻中AtNAP的同源基因在衰老叶片中也上调表达。NAC家族成员间同源二聚化和异源二聚化是该转录因子调控发育过程的重要分子机制，而这些机制也参与了NAC转录因子介导的叶片衰老调控。这些基因的功能特点包括它们参与的信号通路以及调控基因的研究对于叶片衰老复杂分子通路的诠释十分有价值。

另一个典型的SAGs是自噬基因，其功能在体内已被研究。拟南芥自噬基因T-DNA插入突变体，AtAPG7、AtAPG8、AtAPG18a表现出早衰现象(Doelling J H，2002；Hanaoka H，2002；Xiong Y，2005)。这些突变体中衰老过程中营养的利用率比较低或者衰老所需的组分没有被有效的提供，从而导致衰老提前。

植物开花调控途径研究已有一百余年的历史，目前至少有四条开花调控的信号途径被确定，即光周期途径、春化途径、自主途径和赤霉素途径(Amasino，1996；Bernier，2005)。

植物生长过程中受很多外界环境影响，光是重要的环境因素之一。植物中主要有两种光受体分别感受红光/远红光和蓝光的信号。拟南芥中的光受体研究进展较为突出，目前拟南芥中已发现的光受体：(1)吸收红光/远红光(波长为600～750nm)的光受体即光敏色素(DhyA，phyB，phyC，phyD，phyE)；(2)吸收蓝光/UV-A(波长为320～500nm)的隐花色素(CRY1，CRY2)、向光素(PHOT1，PHOT2)以及LOV/F-box/Kelch domain蛋白(ZTL，FKF，LKP2)；(3)UV-B(波长为282～320nm)受体UVR8。这些光受体、共同感受光信号，并与光合色素协同调控植物发育和能量产生。

植物响应蓝光早在两个世纪前就有报道，1993年Ahmad和ashmore在拟南芥中利用T-DNA插入得到一类蓝光不敏感突变体hy4。后来筛选cDNA文库最先分离到第一个蓝光受体-隐花色素1(CRY1)。1996年，拟南芥隐花色素2(CRY2)也被分离得到。在拟南芥中还发现了无光形态建成功能的CRY3(Kleine等，2003；Huang等，2006)。

随后隐花色素在其他植物和其他物种如细菌、动物甚至人体内被鉴定到。不同物种间隐花色素的同源性虽然有差别，但其功能与拟南芥很相似。即其N端序列与DNA光解酶高度同源，大都行使光受体的功能。隐花色素可分为：CPD光裂解酶，6-4光裂解酶，植物隐花色素，动物隐花色素和CRY-DASH五个亚家族。CPD光裂解酶、6-4光裂解酶分别修复环丁烷嘧啶二聚体、嘧啶-嘧啶酮光产物(Sancar A,2003)。目前研究认为植物与动物隐花色素均没有光裂解酶活性。CRY-DASH蛋白能够直接绑定DNA或RNA，但是没有光裂解酶的活性，可通过调控基因转录来调控发育过程(Hitomi K，2000；Brudler R，2003；Worthington E N，2003)。但也有报道说体外的CRY-DASH蛋白，包括拟南芥CRY3，能够修复单链DNA中的嘧啶二聚体(Huang Y，2006；Selby C P，2006；Klar T，2007)。

蛋白质的结构决定其功能。隐花色素有两个主要的结构域，N端的类似于光解酶的PHR区和C端不同氨基酸长度的延伸区CCT。PHR结构域与光解酶相似性很高，能绑定隐花色素中的生色团且参与同源二聚化反应中(Cashmore等，1999；Lin和Shalitin，2003；Lin和Todo，2005)，CCT结构域可通过与蛋白质的相互作用来传递光信号，是隐花色素的效应区。

隐花色素被认为是由光解酶进化而来(Sancar A，2003)。光裂解酶是一类大的黄素蛋白家族能够修复嘧啶二聚体(Todo等，1996)。由于其作用底物的不同又可分为：修复环丁烷嘧啶二聚体的CPD光解酶(即光解酶)和修复6-4嘧啶-嘧啶光产物的6-4光解酶。

目前发现的光解酶均含两个发色基团即催化基团-核黄素(FAD)和捕光基团-四氢叶酸MTHF或8-HDF。光裂解酶能结合到DNA嘧啶二聚体上，这种结合不依赖于光。吸收一个光子后，光解酶启动光修复反应。

虽然隐花色素的PHR域序列与光解酶在一级结构上非常相似，均由两部分结构域构成：N端α/β结构域和C端α螺旋域，这两个结构域通过Loop环相连。但两者的高级结构差异很大，因此在功能存在很大差别(Brautigam等，2004；Huang等，2006)，光解酶具有光修复功能，隐花色素不能与DNA结合也没有修复嘧啶二聚体的功能。

隐花色素与光解酶结构间的差别主要体现在以下几个方面：(1)ATP结合能力。光解酶的FAD结合区能结合DNA，而隐花色素却结合ATP，前者主要行使修复嘧啶二聚体的功能，而后者ATP渗入到FAD通道的巢穴中，而磷酸基团靠近PHR表面，这样的构象有利于隐花色素蓝光依赖的磷酸化反应。(2)表面所带电荷不同。隐花色素表面多带负电荷，而光解酶多带正电荷，因而后者能结合带负电荷的DNA(Huang等，2006)，表面电势的差异恰好解释了隐花色素为何不具备光裂解酶修复DNA的活性。隐花色素负电荷的表面进一步支持了这样一个假说，光照后磷酸化的隐花色素CCT域会与PHR域分开，导致构象的改变，特异位点的暴露，使得依赖蓝光的蛋白-蛋白相互作用产生，从而传递光信号。此外，PHR区除了能捕捉光信号(能量)外还能形成同源二聚体，这对隐花色素正常行使功能至关重要(Sang等，2005；Yu等，2007a)。

隐花色素在C端有一个延伸区即CCT结构域。不同物种隐花色素CCT序列上差别较大，但它们含有一个共同的基序-DAS基序(DQXVP-Adidic-STAESSS)，此基序也是一个识别隐花色素的重要标识(Lin和Shalitin，2003)。CCT结构域是植物和动物隐花色素的功能效应区，它们可为信号蛋白提供了结构的可塑性，变化的结构可提供更多的蛋白作用位点，或作用的特异性或亲和性，能识别不同的信号成员或被不同调节蛋白识别，因此在细胞定位和蛋白相互作用中起到非常重要的作用(Ahmad等，1998b；Yang等，2000；Wang等，2001；Lin和Todo，2005)。

植物隐花色素蓝光依赖的磷酸化和降解途径具体描述如下：

(1)拟南芥隐花色素蓝光依赖的磷酸化过程

拟南芥隐花色素CRY1和CRY2都会被磷酸化，其主要有以下几个特点：

1)蓝光特异的磷酸化过程。将拟南芥黄化苗从黑暗转移到蓝光(>15μmol m-2s-1)下在短时间内可检测到隐花色素的磷酸化，而磷酸化活性在黄化苗中检测不到。隐花色素蓝光特异的磷酸化，随着蓝光强度和光照时间的增加磷酸化程度而随之增加。转移到红光或远红光下的黄化苗中检测不到磷酸化活性，黄化苗蓝光处理后再转到红光或远红光下也会很快去磷酸化(Shalitin等，2002，2003；Yu等，2007b)。

2)磷酸化过程发生在隐花色素C端。体外实验显示，从大肠杆菌中表达的拟南芥CRY1N端和C端蛋白经纯化后进行体外磷酸化检测，结果显示C端有明显的磷酸化信号，而N端没有；全长CRY1的C端突变后磷酸化也会减少(Ahmad等，1998b)。体内试验显示，转基因表达GUS-CCT融合蛋白引起拟南芥持续性光响应，而GUS-CCT也是被持续磷酸化的转基因表达GUS-CCT融合蛋白引起拟南芥持续性光响应，而GUS-CCT也是被持续磷酸化的(Ahmad等，1998a；Yu等，2007b)。转基因过表达GFP-CRY2融合蛋白在拟南芥体内具有依赖蓝光的磷酸化现象，与内源CRY2一致。过表达CRY2-GFP的拟南芥则具有持续性光响应，同时该蛋白也拥有持续性的磷酸化过程。转基因CRY2-GR蛋白在没有地塞米松的情况下定位于胞质中，CRY2-GR不被磷酸化，过表达的CRY2不能恢复突变体的表型，加了地塞米松处理后，在GR的带领下CRY2定位到细胞核内，能够被磷酸化，且具有生理活性，恢复了突变体的正常表型(Tessadori F，2007)。

学者们推测磷酸化的隐花色素CCT表面负电荷打破了与PHR的相互作用，从而影响了隐花色素与信号成员的互作(Yu等，2007b；Yang等，2000；Liu等，2008；Yu等，2009b)。

3)自主磷酸化。拟南芥隐花色素CRY1与蛋白激酶没有序列同源性，但是在体外显示出自磷酸化活性。目前对于拟南芥隐花色素CRY1体外自磷酸化的研究存在相反的结果，有研究报道它是蓝光依赖的、蓝光加强的，也有研究报道它是不依赖于蓝光的(ShalitinD，2003；Bouly JP，2003；Ozgur S，2006)。撇开是否依赖蓝光，至少这些实验结果都证明了拟南芥CRY1在体外具有自磷酸化活性。拟南芥CRY1的自磷酸化是否足够影响CRY1的磷酸化，或CRY1依赖蓝光的磷酸化还需要其他激酶的辅助还不是很清楚。目前没有关于拟南芥CRY2自磷酸化的报道。

(2)拟南芥CRY2蛋白依赖蓝光的降解活性信号蛋白的一个重要特征就是蛋白的快速代谢从而使生物体恢复到信号刺激前的状态。与光敏素phyA经历依赖红光的快速降解类似，隐花色素CRY2也经历依赖蓝光的快速降解，且是通过泛素化/26S蛋白酶体途径(Shalitin等，2002；Yu等，2007b)，而隐花色素CRY1不具备依赖蓝光的降解活性(Lin,1998；Ahmad M，1998)。有研究显示，在大豆中隐花色素CRY1的降解依赖于蓝光，而隐花色素CRY2在蓝光下不降解(Zhang等，2008)。拟南芥CRY2的降解依赖于FAD，当CRY2突变(CRY2D387A)丧失结合FAD 的能力后，该突变的蛋白不再经历蓝光诱导的降解过程(Liu等，2008)。CRY2的降解需要持续的高光强的蓝光照射，CRY2依赖蓝光的降解活性同时需要PHR域和CCT域(Ahmad M，1998)。与此结论一致，持续磷酸化的GUS-CCT2在蓝光下不降解(Yu，2007)。CRY2的降解与E3连接酶COP1有关(Wang，2001)，但是COP1不是CRY2唯一的E3连接酶，因为CRY2的降解在COP1功能降低的突变体cop1-4和cop1-6中被部分削弱，而在COP1无效等位基因突变体cop1-5中并没有完全消失(Shalitin D，2002)。这些结果暗示CRY2的降解有可能还牵涉到其他E3连接酶。

拟南芥隐花色素CRY2的磷酸化和降解都是在核内发生，CRY2的磷酸化是CRY2降解所必须的，CRY2介导蓝光对下胚轴生长的调控和光周期控制的开花也是在核内，说明光受体CRY2在核内完成了它的整个翻译后生活周期，从蛋白修饰到行使功能再到蛋白降解(Yu，2009)。

从隐花色素CRY1被发现起，CRY1、它在拟南芥中的同源基因CRY2、其他物种的同源基因CRY广泛的功能被陆续发现。拟南芥隐花色素的功能鉴定主要是通过遗传学方法，分析CRY1或CRY2基因缺失型突变体cry1、cry2，以及过表达转基因植株CRY1、CRY2的表型。这些研究证明拟南芥隐花色素CRY1、CRY2分别主要介导了蓝光促进光形态的建成以及光周期控制的开花。当然，它们还介导了其他蓝光响应，究竟隐花色素是如何协调体内扮演的不同角色，其调控机理都需要进一步研究与阐明。隐花色素CRY3T-DNA插入突变体cry3没有明显的表型改变，其具体的生理功能还不是很清楚。目前的研究主要知道CRY3具有修复单链DNA的生化活性，有可能参与了细胞器基因组的保护。除了拟南芥，大部分物种(从细菌到人类)都发现了隐花色素的存在。隐花色素与生物钟密切相关，最近的研究还表明，隐花色素与生物钟不仅仅与农作物产量有关，还影响了人类健康，包括癌症、睡眠紊乱以及许多生理上的失调。了解隐花色素和蓝光反应的分子机制，不仅对初步了解生命的基本过程具有重大的意义，而且在农业和医药方面也具有一定的实用价值。

基因的功能往往与其亚细胞定位密切相关。拟南芥隐花色素CRY1和CRY2基因在被检测过的所有细胞类型和所有细胞器中都有表达(Ahmad M，1993；Lin，1996；Toth R，2001)。隐花色素全方位的表达与其调控多种信号途径相关。用隐花色素内源启动子启动荧光素酶报告基因的表达，结果显示隐花色素mRNA的表达几乎不受蓝光影响，但受生物钟的调控，表达量在光下达到最高值，在暗中降到最低值(Toth R，2001)。隐花色素CRY1的蛋白水平不受光影响,CRY2的蛋白水平则在蓝光下降低(Lin，1996)。蛋白水平的变化也与隐花色素依赖光强的活性相关。在细胞质与细胞核中均能检测到CRY1的表达，其细胞中的表达量不受光的影响(Wu G，2007)。有报道称核内的CRY1介导蓝光促进膜的去极化、抑制下胚轴的生长，胞质中的CRY1介导蓝光促进子叶的张开和根的生长(Wu G，2007)。与CRY1不一样，隐花色素CRY2主要在核内完成它的整个转录后过程，包括依赖蓝光的磷酸化与降解(Yu,2007)。核定位的CRY2主要介导了对开花的诱导和对下胚轴生长的抑制(Yu,2007)。也有报道称核定位的CRY2参与了基因的转录和细胞分裂间期染色质的浓缩(Tessadori F，2007；Charron J B，2009)。由此可见，基因的定位为其功能提供了线索。

植物的光形态建成(又叫去黄化)包括几个形态学改变：下胚轴生长抑制、子叶扩张和叶绿体发育。光抑制下胚轴的生长，刺激子叶的扩张，促进质体到叶绿体的转变(Nemhauser J，2002)。拟南芥光受体隐花色素和光敏素介导了去黄化过程，主要是依赖于对基因转录水平和转录后水平的调控来促进光形态建成(Jiao Y，2007)。对削弱了去黄化响应的基因突变体进行遗传学分析，发现很多基因(如COP1，SPA1，HY5/HYH，HFR1，PP7，HRB1，SUB1，OBP3，SHB1，BIT1，ATAB2等)参与了隐花色素调控的去黄化响应。除了COP1，SPA1，HY5/HYH，对于这些基因是如何参与隐花色素的功能还不是很清楚。

光抑制下胚轴生长是研究去黄化的表征之一。隐花色素CRY1的发现正是源于对蓝光下下胚轴生长去抑制的突变体hy4的分析(Koornneef M，1980)。CRY1过表达植株呈现对蓝光的高度敏感性，与野生型相比，在持续蓝光下出现短的下胚轴(Lin，1995)。CRY2也参与了蓝光对下胚轴生长的调节，但是其作用相对于CRY1较弱，且主要是介导低强度蓝光(<10μMm-2s-1)对下胚轴生长的抑制，有可能与CRY2在高强度蓝光下快速降解有关。双缺失突变体cry1cry2在持续蓝光下呈现出比隐花色素单缺失突变体cry1、cry2更长的下胚轴，说明这两个隐花色素在介导蓝光抑制下胚轴生长中存在功能冗余(Mockler T C，1999)。通过对野生型、双缺失突变体cry1cry2、CRY1过表达植株的分析，发现CRY1主要介导390-480nmUV-A和蓝光范围内的光响应(Ahmad M，2002)。

对于隐花色素介导蓝光抑制下胚轴生长的细胞机制，Spalding与他的同事做了大量研究，提出隐花色素激活了离子通道，导致质膜去极化，从而抑制细胞伸长(Spalding E，1988；Cho M H，1996)。他们进一步提出核定位的CRY1介导了下胚轴生长和膜去极化的过程。依赖核CRY1的质膜去极化在光照后的数秒内便发生，暗示其反应机制要远远快于转录调控或者蛋白降解调控。另外，缺失突变体cry1、cry2、phyA和phot1都呈现出减弱的蓝光诱导的质膜去极化响应(Parks B M，1999；Folta K M，2001)。但是phot1在蓝光下并没有出现伸长的下胚轴。有可能Phot1在介导蓝光对细胞伸长的影响中处于光响应的起始阶段，而CRY1的功能在于保持蓝光对下胚轴生长的抑制(Parks B M，2001；Folta K M，2003)。

光对下胚轴生长的调控主要还是通过基因调控的方式。大量研究表明，隐花色素CRY1能抑制COP1介导的转录因子的降解，如HY5/HYH、HFR1(Osterlund M T，2000；Duek PD，2004)。这一类转录因子在黑暗中被降解，见光后，光受体(隐花色素或光敏素)抑制COP1的活性，导致转录因子的累积，从而改变代谢酶类或信号蛋白的表达水平，如生长素、油菜素类固醇、赤霉素、催化合成和降解细胞壁的代谢酶等等，能在一定程度上解释光对下胚轴生长的影响。

与光抑制下胚轴生长相反，光能促进子叶的阔张，促进子叶细胞的伸长。隐花色素CRY1和CRY2共同介导了蓝光对子叶生长的影响，不同的是，胞质定位的CRY1介导这一应答，而核内的CRY2参与了这一光响应(Wu G，2007)，不同位置的CRY介导同一响应让人费解。隐花色素CRY1介导了高低强度的蓝光对子叶阔张的影响，而CRY2则主要介导低强度蓝光的响应，与抑制下胚轴生长情况类似(Lin，1998)。过表达CRY1或CRY2的转基因幼苗在持续蓝光下呈现出比野生型更大的子叶，说明细胞内隐花色素的浓度影响了子叶阔张程度。隐花色素介导蓝光抑制下胚轴生长，却又介导蓝光促进子叶阔张，说明隐花色素不同的功能间存在不同的调控机制，或不同器官或组织的隐花色素具有不同的功能。

除了对下胚轴和子叶的影响，隐花色素还能介导蓝光调节质体的发育、叶绿体的生成，主要依赖对基因表达水平的调控，包括对编码质体蛋白的核基因及质体转录组的诱导(Jiao Y，2007；Fuglevand G，1996；Thum K E，2001)，如PSII反应中心的蛋白D1，D2编码基因psbA、psbD受核基因SIG5的调控，而SIG5的表达受CRY1的介导在蓝光下增加。因此，隐花色素通过调控质体转录需要的核基因的表达，从而调节叶绿体的发育。

隐花色素除了促进拟南芥幼苗光形态建成，在植物的生长过程中还调控了光周期控制的开花。cry2突变体在长日照条件下开花时间远远晚于野生型，但是在短日照下开花时间不受影响，说明隐花色素CRY2参与了对光周期控制的开花途径的调控(Guo H，1998)。另外，有研究发现cry2正是早先筛选到的晚花突变体fha的等位基因，结合这些研究结果：cry与co、ft、gi一样，通过光周期途径调控开花(Guo H，1998；Koornneef M，1998)。通过转基因拟南芥和大豆瞬时表达研究证明：大豆中的隐花色素GmCRY1a和GmCRY2a均参与光形态成过程，GmCRY1a的作用更明显；暗示了GmCRY1a对大豆光周期调控的开花途径起到重要的作用(Zhang，2008)。

隐花色素CRY2蛋白水平在短日照下呈现出依赖蓝光的昼夜节律，而在长日照下没有该现象，说明CRY2蛋白水平的变化有可能解释它参与光周期信号的机理(Mockler T，2003)。对CRY2等位基因EDI的分析，更支持了这一说法。EDI是在赤道附近热带群岛内拟南芥Cvi生态型中筛选到的光周期不敏感早花数量性状基因座(Alonso-Blanco C，1998)。QTL图谱定位将EDI定位到了CRY2基因，从而发现V367M的点突变是造成EDI不依赖光周期早花的原因，细胞内CRY2V367M蛋白比CRY2更为稳定。CRY2V367M蛋白的稳定性与不受光周期的调节有可能解释了它不依赖于光周期的早花表型。

隐花色素CRY1有可能也影响拟南芥开花时间。一些实验条件下，cry1突变体呈现出晚花的表型，但是也有一些实验条件下，cry1突变体开花时间与野生型没有差异(Bruggemann E，1996；Blazquez M A，2003)。有可能是实验条件的略微差异造成的这种不一致。因为蓝光下cry1cry2双缺失突变体开花晚于单突变体和野生型，说明CRY1与CRY2功能冗余，均能促进开花(Liu，2008)。另外，cry2突变体抑制了phyB突变体早花的表型，暗示CRY2与phyB在介导红光抑制开花中起相反的作用(Mockler T C，2002)。

生物钟是生物体生命活动的内在节律性，它使生物体能够适应地球环境的变化，保持大约24小时的昼夜循环以及一年的光周期循环(Harmer S L，2009)。生物钟调控了植物的生长发育，促进了植物的适应性。生物钟同时受到环境的影响，光是其中之一，光信号能够促进生物体的生物钟、生理活性与周围环境昼夜循环同步(Sancar A，2000)。科学家们在拟南芥、果蝇和老鼠中陆续发现隐花色素在生物钟中扮演重要角色，隐花色素被认为是一个主要的光受体或生物钟的内部成员促进光信号的传递(Emery P，1998；Somers D E，1998)。拟南芥隐花色素突变体削弱了生物钟对其下游基因的调控(Somers D E，1998)。拟南芥cry1突变体在蓝光下呈现加长的生物钟周期，cry2突变体仅在低强度蓝光下呈现略微缩短的生物周期，cry1cry2双突变体在蓝光下呈现出加长的生物周期。除了生物周期的改变，cry1cry2并不影响节律，暗示拟南芥隐花色素并不是生物钟振荡器的内在成员(DevlinP F，2000)。

对于拟南芥隐花色素如何介导光对生物钟的影响还不是很清楚。有报道称隐花色素有可能通过抑制COP1的活性从而影响ELF3和GI，进而调节光对钟的影响(Yu J W，2008)。另外，已报道的光受体间的相互作用CRY1-phyA，CRY2-phyB，CRY1-ZTL和phyB-ZTL有利于整合光信号共同影响生物钟(Jarillo J A，2001)。光受体介导光对生物钟的调控机理还需要进一步研究。

光影响保卫细胞的发育和气孔的开放。光对保卫细胞发育的影响是一个比较复杂的过程，包括不对称细胞分裂的起始，前体细胞的增值，气孔保卫细胞的分化，气孔的形成。研究表明蓝光、红光和远红光都能刺激保卫细胞的发育(Kang C Y，2009)。遗传学分析表明隐花色素介导了蓝光刺激气孔的发育，且其调控途径不同于已知的LRR受体激酶、MAPK和纵多转录因子相关的调控网络(Kang C Y，2009)。

除了对气孔发育的影响，隐花色素还能介导光调节气孔的开放。我们知道光能够促进气孔的开放，允许气体交换进行光合作用或蒸腾作用(Zeiger E，1977)。而向光素是调控气孔开放的主要光受体，介导蓝光调节保卫细胞膜电位的去极化，导致水的流动和气孔的开放(Schroeder J I，2001)。最近的一些研究结果报道cry1cry2双缺失突变体增加了植物的干旱耐受力，是归于蓝光促使气孔的开放(Mao J，2005)。隐花色素的缺失降低了蓝光下气孔的开放，而过表达CRY1增加了气孔的开放。在向光素双缺失突变体中残留的气孔开放现象，在隐花色素和向光素四缺突变体中被消除了，并且，过表达CRY1于向光素双缺失突变体中能够恢复气孔开放对蓝光的响应，暗示隐花色素确实参与了蓝光诱导气孔开放的信号途径(Mao J，2005)。与去黄化响应一样，隐花色素对气孔的发育和开放的影响也依赖于COP1，但是隐花色素/COP1、向光素调控途径间的相互关系、隐花色素/COP1与MAPK途径的相互关系目前还不是很清楚。

早在1998年，Ahmad研究组发现隐花色素cry1cry2双缺失突变体缺乏依赖蓝光的向光性，而CRY1过表达则加强向光性响应(Ahmad M，1998)。但随后有研究发现向光素而非隐花色素主要介导了植物向光性(Christie J M，1998)。隐花色素cry1cry2双缺失突变体、光敏素phyAphyB双缺失突变体降低了向光性，但是向光性的重要参数并没有很明显的变化(Tsuchida-Mayama T，2010)。由此研究者们认为向光素介导了蓝光对向光性的影响，促进气孔的开放、叶绿体的运动。隐花色素和光敏素有可能参与或协助了向光素的某些调控(Whippo C W，2003)。最近有报道称隐花色素CRY1、CRY2和光敏素phyA正向调节RPT2蛋白的积累、向光素依赖的生长素梯度的形成，促进向光性生长，同时也负调控依赖GA的向光性抑制途径(Tsuchida-Mayama T，2010)。

除了向光性，光还影响植物的向地性(Hangarter R P，1997)。红光会影响拟南芥下胚轴向地性生长，主要是通过光敏素介导(Robson P R，1996)。然而，蓝光对向地性的影响往往会被向光性掩盖，因此这类实验分析需要在向光素突变的背景下进行。将隐花色素CRY1或CRY2过表达到cry1cry2phot1phot2四缺突变体中，在蓝光下会出现随机的下胚轴弯曲，而在黑暗下没有。这项实验证明，类似于光敏素介导红光抑制向地性，隐花色素介导了蓝光对向地性的抑制(Ohgishi M，2004)。光受体介导的向地性有可能主要是通过光受体调节荷尔蒙代谢、转运、信号传导基因的表达实现。例如，隐花色素介导蓝光抑制PGP19/ABSB9基因的表达。PGP19/ABSB9基因编码了一个ABC型的生长素转运子，该转运子参与了生长素的运输和向地性生长。遗传学分析表明PGP19在隐花色素上位(Nagashima A，2008)。由此，隐花色素介导蓝光对PGP19基因表达的抑制解释了蓝光对向地性的影响。隐花色素对向地性的响应也牵涉到COP1信号途径，cop1突变体呈现出持续性光形态建成和背地性表型(CaoD，2000；Yang，2000)。

光能够调节根的发育，包括根的延伸、侧根的产生、质体发育和向性生长(FeldmanL J，1984)。据报道蓝光刺激根的延伸，而隐花色素CRY1介导了这一响应(Canamero R C，2006)。CRY2在对根的生长调节中与CRY1的功能相反。另外，有研究表明胞质和核CRY1有可能分别促进或抑制根的延伸(Wu G，2007)。除了对根细胞延伸的影响，蓝光还会影响根叶绿体的发育，主要是通过CRY1介导(Usami T，2004)。

迁徙动物如鸟类和昆虫类被认为能够感受地球磁场，由此能够辨别迁徙的方向。动物的磁场感应依赖于光，目前研究认为光诱导光受体产生磁场响应的质子对，转移到神经系统，使动物感受磁场的方向(Ritz T，2000)。在果蝇中该光受体被认为是隐花色素，且隐花色素介导磁场感应的光化学机制不依赖于蛋白内色氨酸三联体电子传递和FAD光还原反应(Gegear R J，2010)。科学家们也研究了植物对磁场的响应，发现磁场能够促进拟南芥隐花色素CRY1介导蓝光抑制下胚轴的生长、促进花青素的累积和依赖蓝光的CRY2的降解，并且该反应依赖于FAD光还原光激活机制(Solov′yov I A，2007)。也有研究报道下胚轴的生长、花青素的积累、相关基因的表达并不受到磁场强度的影响(Harris S R，2009)。磁场对隐花色素介导蓝光响应的影响还需要进一步核实。

研究发现在flu突变体背景下，拟南芥cry1突变体抑制依赖蓝光、ROS的细胞程序性死亡(PCD)(Danon A，2006)。flu突变体是在光合成色素和光敏素生色团叶绿素和蓝藻胆素生物合成途径的研究中发现的(Meskauskiene R，2001)。当flu缺失后，光下生长的突变体转移到黑暗下会积累更多的原叶绿素酸脂，当将此突变体重新放回到光下时，原叶绿素酸脂分子会将光能转移到基态的氧促使氧到激发态。作为ROS的重要来源，氧促进了PCD，引起了经历光到黑暗再到光下的突变体flu的死亡(Op den Camp R G，2003)。flu突变体PCD表型仅依赖于蓝光而非红光，由此科学家们想到了隐花色素有可能参与了PCD的调控。CRY1突变能够拯救flu突变体的PCD表型，暗示CRY1介导了依赖蓝光的PCD过程，有可能是通过诱导胁迫响应基因的表达从而放大PCD过程(Danon A，2006)。

除了以上依赖蓝光的功能，隐花色素还拥有蓝光非依赖的活性，例如介导红光和远红光响应。cry2突变体幼苗在红光下呈现加长的生物钟周期，在远红光下出现下胚轴延伸缺陷(Mas P，2000)。cry1cry2双缺失突变体在其他光照条件下也呈现降低的子叶张开度，CRY2Cvi生态型等位基因CRY2V367M在远红光下呈现加强的子叶张开(Botto J F，2003)。一般认为隐花色素不吸收长波长的光，但是隐花色素包含的生色团FAD拥有不同的氧化还原态，它有可能吸收大于600nm的光(Henbest K B，2008；Ozturk N等，2008)。因此，不能排除其他光波长对隐花色素结构和功能的影响。另外，光受体之间的相互作用也解释了光受体在不同光下的响应。

拟南芥隐花色素CRY经历了一系列生理生化反应，包括电子传递、磷酸化、泛素化，改变蛋白构象传递蓝光信号。对于隐花色素光信号的传导途径，目前的研究主要提出了两种方式：一种方式是隐花色素通过与转录因子CIB相互作用调控基因表达；另一种是隐花色素通过与SPA1/COP1复合体相互作用调节蛋白稳定性。以上两种信号传导途径都依赖于蓝光依赖的蛋白相互作用调控基因表达，从而影响植物生长发育。

拟南芥隐花色素传导途径中的信号蛋白包括：

(1)转录因子CIB

2008年通过蓝光下的酵母双杂交筛选到第一个蓝光特异的隐花色素互作蛋白，定义为CIB1(CRY-interacting bHLH1)。在酵母中，CIB1与CRY2的互作是蓝光波长特异的，相互作用的强度依赖于蓝光强度，且依赖于生色团FAD。在暴露于蓝光下的拟南芥幼苗细胞中可以检测到CIB1-CRY2复合体，而在红光下检测不到。在瞬时转录因子试验中CIB1行使转录因子的功能依赖于隐花色素和蓝光。拟南芥CIB1在体外能够结合G-box(CACGTG)，在体内能够影响G-box和E-box(CANNTG)的转录，说明CIB1体外结合DNA的活性以及体内转录调节活性存在差异。一种可能的解释就是在体内CIB1与其他同家族基因(CIB3，4，5等)形成异源二聚体，从而改变了它对不同DNA的亲和性。事实证明，至少有四个CIB1相关基因能够与CIB1或CRY2相互作用，包括CIB1、CIB3、CIB4、CIB5，而其中一些能与CIB1形成异源二聚体，共同影响CRY2调控基因的表达。与此论点一致的是，单缺失突变体cib1在实验条件下没有任何表型，而双缺失突变体cbilcib5开花要稍晚于野生型，说明CIB蛋白间存在功能冗余。将CIB1过表达到野生型背景能够引起早花，而在cry1cry2突变体背景下没有表型，说明CIB1对开花的促进依赖于隐花色素。对CIB1启动子的检测，发现它在所有细胞器和细胞类型中均有活性，说明CIB1除了在维管束细胞中与CRY2相互作用调节开花以外，CIB1蛋白还有可能在其他细胞中与CRY相互作用调控其他光响应基因的表达。当然，目前已有的检测暗示CIB1有可能不参与CRY对去黄化的调节，因为CIB蛋白单缺失或多缺失都没有去黄化响应的异常表现(Liu和1in，未发表结果)。

(2)泛素化E3连接酶COP1

泛素化连接酶COP1在植物光形态响应和光受体功能中扮演着重要角色(Deng XW，1992)。功能缺失突变体cop1呈现出持续性光形态建成表型，在黑暗下出现短的下胚轴、张开的子叶、增加的花青素表达以及光诱导基因的错误表达。过表达GUS-CCT1和GUS-CCT2呈现出cop1表型，DNA芯片分析，在cop1中表达改变的基因有80％在GUS-CCT1和GUS-CCT2中的表达也受到影响，相似的表型暗示了功能上的关系，使科学家们开始了对隐花色素和COP1关系的探讨。在酵母双杂交系统中发现CCT1和CCT2能够与COP1相互作用，在拟南芥细胞中通过免疫共沉淀鉴定了CRY2与COP1相互作用，GFP-CCT1与COP1共定位于细胞核核体中(Wang H，2001)。对蛋白稳定性的调节是光形态建成调控的一个关键点，有研究表明COP1介导了众多光信号蛋白光依赖的降解，包括HY5/HYH、LAF1、HFR1、CRY2、phyA、CO、GI(Duek PD，2004；Liu，2008；Shalitin D，2002；Hardtke C S，2000；Jang S，2008)。由此假设光激活的隐花色素有可能直接或间接与COP1相互作用，抑制它的E3连接酶活性，改变COP1底物蛋白的稳定性，最终调节植物的发育(Yang，2000；Wang H，2001)。另外，隐花色素与COP1的相互作用是不依赖于蓝光的(Liu，2008；Yang，2000；Wang H，2001)，这就提出一个疑问，CRY2是如何介导光对COP1活性的影响呢？一种可能就是光照后CRY改变自身生化活性或COP1的核质分配，另一种可能就是CRY通过光依赖的方式与COP1互作的蛋白相互作用，来共同影响COP1的活性。

(3)coiled-coil/WD repeat蛋白SPAs

SPA1是光敏素phyA特异的信号介导蛋白，在拟南芥中抑制光形态的建成。它包含WD重复域，序列上高度类似于COP1的WID重复域。SPA1能够与COP1互作，其coiled-coil域是与COP1互作必须的。SPA1与COP1的互作促进了COP1对HY5、HFR1的泛素化，介导了phyA信号传导(Duek P D，2004；Saijo Y，2003)。SPA1与COP1的互作是光敏感的，光能够抑制他们的相互作用，抑制COP1的E3泛素化酶活性(SaijoY，2003，2008)。但是，究竟光是如何抑制SPA1与COP1的互作，又如何抑制COP1的活性目前还不清楚。

最近的研究显示SPA1能够与CRY1和CRY2相互作用，且是依赖于蓝光和生色团FAD的，作用强度随蓝光光强的增加而增加。除了SPA1，拟南芥还有三个SPA1相关基因SPA2、SPA3、SPA4。SPA4在蓝光下与CRY1和CRY2互作。SPAs基因间有可能存在功能冗余，共同参与隐花色素调控的蓝光信号途径。研究者们从遗传学角度进一步证实了SPAs基因在隐花色素调控蓝光信号途径中的角色。在持续蓝光下，突变体cry1呈现出长的下胚轴，而spa1spa4下胚轴短于野生型，spa1spa4cry1的下胚轴略长于野生型但是远短于cry1，说明SPAs参与了隐花色素调控的下胚轴生长抑制，且位于CRY1的上位。SPA1也参与了CRY2依赖的光周期控制的开花途径。长日照下cry2开花晚于野生型，而spa1无明显开花表型，双缺失突变体cry2spa1开花时间与spa1一致，说明SPA1在CRY2调控光周期控制的开花途径中位于CRY2的下游。CRYs还介导了蓝光调节SPAs基因转录水平的表达(Sellaro R，2009)。

蓝光响应途径具体描述如下

(1)CRY2-CIB1途径

拟南芥隐花色素CRY2与bHLH转录因子CIB1经历了依赖蓝光的互作。CIB1能够结合FT基因启动子中的E-box，CRY2通过与CIB1的互作，在转录水平调节FT的表达，促进光周期控制的开花。FT编码一个可移动的转录因子，从叶子移动到顶端分生组织促进开花基因的表达。CRY2还与CIB1的同源基因互作，体外实验证明CIB1与其他同源基因(CIB3，CIB4，CIB5)形成异源二聚体，结合到FT启动子的E-box。CIB蛋白共同参与了CRY2的信号转导途径，促进依赖光周期的花蕾的形成。

对于CRY2-CIBs调控途径还有一些问题需要进一步探讨。例如：CRY2是否影响CIB1结合DNA的亲和力？隐花色素是如何介导蓝光影响CIB1的转录活性的？另外，CIB蛋白在没有蓝光的条件下经历泛素化-26S蛋白酶体降解途径，蓝光是如何促进CIB蛋白的稳定性的呢？如何解释CIB蛋白在蓝光下的特异积累与隐花色素CRY2蓝光下的降解现象？除了促进光周期控制的开花，隐花色素还调控了许多其他响应，CIB是否介入了这些响应途径？是否也存在与CRY1互作的转录因子，使得隐花色素CRY1从转录水平直接调控基因的表达来传递光信号？

(2)CRY-SPA1/COP1途径除了通过与转录因子的互作从转录水平调节基因的表达，隐花色素还通过转录后机制间接调控基因的表达。隐花色素介导了蓝光对E3连接酶COP1活性的抑制，例如CRY1介导蓝光抑制了COP1依赖的转录因子HY5(Long Hypocoty15)、HYH(HY5Homologue)、HFR1(Long Hypocotyl in Far-Red1)蛋白的降解，这些转录因子在去黄化响应中调节基因的表达，如生长素、油菜素类固醇、赤霉素，以及合成和降解细胞壁的代谢酶类。CRY2介导了蓝光抑制COP1依赖的转录因子CO(Constans)蛋白的降解，CO是长日照下促进开花的一个重要成员，它能够在转录水平上促进FT的表达。最近的研究表明，隐花色素通过与蛋白复合体SPA1/COP1的互作传递光信号，CRY与COP1的互作不依赖于光，但是CRY能与COP1互作的蛋白SPA1经历光依赖的相互作用。CRY与SPA1的相互作用是蓝光特异的，SPA1在遗传上位于CRY的下游。CRY与SPA1依赖蓝光的互作一定程度上解释了CRY是如何介导光对COP1功能抑制的。出人意料的是结构相似的CRY1和CRY2与SPA1/COP1的互作存在一些差异。在酵母和拟南芥中CRY1-SPA1的互作抑制了SPA1-COP1的互作(Sellaro R，2009；Lian H L，2011；Liu B，2011)，CRY1以竞争对手的方式介导了蓝光对COP1活性的抑制，恰好解释了先前的发现：SPA1-COP1互作受到了光的抑制(Saijo Y，2003)。与CRY1相反，依赖于蓝光的CRY2-SPA1的相互作用并不影响SPA1-COP1的相互作用，CRY2-SPA1的相互作用在酵母中加强了CRY2-COP1的相互作用，在植物体内促进了CRY2-COP1复合体的形成(Zuo Z，2011)。CRY2-SPA1的相互作用促进CRY2-COP1的相互作用是通过酵母三杂交检测到的，CRY2-SPA1促进CRY2-COP1复合体的形成仅在SPA1过表达的转基因植株中观察到。隐花色素CRY1和CRY2与SPA1/COP1相互作用的差异有可能与其相互作用位点相关。CRY1的C端CCT域与SPA1的C端CC-WD域相互作用，而CRY2的N端PHR域与SPA1的N端激酶域相互作用。SPA4也与CRY1和CRY2存在依赖蓝光的相互作用。

大豆作为一种理想的光周期研究材料已有很长历史，但对其光周期反应的分子生物学机制至今仍知之甚少。从隐花色素着手研究其光周期反应的分子生物学问题，可以从信号转导的上游开始理解大豆光周期反应的特点，这样既有利于尽快开拓大豆光周期研究的新领域，也会为更深入的进行研究提供宝贵经验、打下坚实基础，具有非常重要的理论意义。之前的研究表明大豆隐花色素GmCRY1在大豆光周期反应中作用明显，且与拟南芥隐花色素CRY2特点相似，而GmCRY2更类似CRY1。GmCRY1与CRY2的相似之处主要表现为：①均呈现明显的昼夜节律；②均能促进植物开花。所不同的是GmCRY1在CRY1缺失突变体中过表达，短日下促进开花，而CRY2在长日下促进开花。GmCRY2与CRY1相似之处是，既没有明显昼夜节律也不能明显促进开花，但GmCRY2蓝光下能降解而CRY1不能(Zhang等，2008)。

在大豆中过表达或RNAi敲除GmCRY基因是否能够改变大豆开花对光周期的敏感性，在本研究之前还没有报道。此外，大豆中的GmCRY是否通过与GmCIB相互作用来进行蓝光信号传递也不清楚。目前我们在大豆中发现并克隆了9个与拟南芥CIB1同源的GmCIBs基因，通过酵母双杂交实验初步验证了GmCIB1与GmCRY2在蓝光下特异的相互作用。本研究将通过酵母双杂交、BiFC以及Co-IP等手段研究GmCRYs与GmCIBs蛋白间的相互作用；进一步获得GmCRY与GmCIB1基因过表达或RNAi敲除的遗传转化大豆株系，结合转基因后代的表型分析和染色体免疫共沉淀试验(ChIP)结果寻找GmCIB1的下游作用靶基因，分析大豆中GmCRY传递蓝光信号的GmCIB信号通路，以及GmCRY与GmCIB1基因在大豆衰老调控中的作用，为大豆光周期的进一步深入研究和种质创新打下基础。

发明简述

在一个方面中，本发明涉及一种分离的基因，其具有如下的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO：1或3所示的序列或其互补序列；

(2)在严格杂交条件下与SEQ ID NO：1或3杂交的序列；

(3)与SEQ ID NO：1或3具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列，其调控叶子衰老和开花；或

(4)由SEQ ID NO：1或3所示的序列通过其中一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入或添加而衍生所得到的序列。

在另一个方面中，本发明涉及一种分离的DNA分子，其包含上述的基因及其变体，该DNA分子具有GmCIB1基因或GmCRY2基因的生物学功能。

在另一个方面中，本发明涉及一种重组载体，其包含上述的基因或如DNA分子。

在另一个方面中，本发明涉及一种分离的蛋白质，其具有如下的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列；

(2)由上述的基因编码的序列；或

(3)包含一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加的SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列，该蛋白质具有调控植物叶子衰老和开花的功能。

在另一个方面中，本发明涉及一种宿主细胞，其包含上述的基因、DNA分子、重组载体或蛋白质。

在另一个方面中，本发明涉及一种转基因植物，其包含上述的基因、DNA分子、重组载体或蛋白质。

在一个实施方式中，所述的转基因植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

在另一个方面中，本发明涉及所述的基因、DNA分子、重组载体或蛋白质在调控植物叶子衰老和开花中的应用。

在一个实施方式中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

在另一个方面中，本发明涉及一种培育转基因植物的方法，包括将上述的基因导入目的植物中以获得转基因植物，从而调控所述转基因植物的叶子衰老和开花。

在一个实施方式中，培育转基因植物的方法进一步包括获得所述转基因植物的种子。

在一个实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

在另一个方面中，本发明涉及一种调控植物叶子衰老的方法，包括将上述的基因或载体引入所述植物中以使其在植物中表达，从而调控植物的叶子衰老。

在一个实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

在另一个方面中，本发明涉及一种调控植物开花的方法，包括将上述的基因或载体引入所述植物中以使其在植物中表达，从而调控植物的开花。

在一个实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或大豆。

在另一个方面中，本发明涉及一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含引入的上述基因、DNA分子或重组载体，或者其重组表达上述的蛋白质，该方法包括获得所述转基因植物的种子，并通过种植所述种子以获得新的转基因植物。

附图简要说明

图1显示了大豆CIB基因的染色体定位。

图2显示了大豆CIB基因家族成员之间的同源性。

图3显示了拟南芥和大豆CIB保守位点分析，箭头(顶部)表示各结构域中保守的氨基酸。

图4显示了大豆CIB基因的基因结构模式。

图5显示了大豆CIB在拟南芥原生质体中的亚细胞定位。

图6显示了大豆CIB基因家族在不同组织器官的表达模式。

图7显示了大豆CIB基因家族在不同发育时期的表达模式。

图8a-8i分别显示了大豆CIB1-9基因的光周期表达模式，其中图8a为CIB3基因的光周期表达模式，图8b为CIB2基因的光周期表达模式，图8c为大豆CIB1基因的光周期表达模式，图8d为大豆CIB4基因的光周期表达模式，图8e为大豆CIB5基因的光周期表达模式，图8f为大豆CIB6基因的光周期表达模式，图8g为大豆CIB7基因的光周期表达模式，图8h为大豆CIB8基因的光周期表达模式，和图8i为大豆CIB9基因的光周期表达模式，其中短日照(SD；8小时光照/16小时黑暗，a和b)或长日照(LD；16小时光照/8小时黑暗，c和d)处理48小时，分别转到连续光照(LL；a和c)或连续黑暗(DD；b和d)处理48小时。标准误差如图所示(n＝3)。

图9a-e分别显示了不同纬度来源大豆品种中GmCIB1-9的表达模式，其中图9a为不同纬度来源大豆品种中GmCIB2&3的表达模式，图9b为不同纬度来源大豆品种中GmCIB1&4的表达模式，图9c为不同纬度来源大豆品种中GmCIB5&6的表达模式，图9d为不同纬度来源大豆品种中GmCIB7&8的表达模式，和图9e为不同纬度来源大豆品种中GmCIB9的表达模式。

图10显示了大豆GmCIB1过表达拟南芥转化植株的表型。

图11显示了大豆GmCIB4/5/6/8过表达拟南芥转化植株的表型。

图12显示了GmCRY1过表达植株在连续照下衰老相关的表型，其中(A-C)：野生型和GmCRY1-OX转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类(绿色，没有衰老；黄色，轻度衰老；干枯，完全衰老)，每类所占的比例即该类的数目与植株总数的比值(n≥10)。(D-H)：不同衰老阶段植株单叶或子叶的图片。(I)：野生型和两个GmCRY1-OX转基因植株中GFP-GmCRY1和GmCRY1表达水平的免疫印迹分析。总蛋白提取物用于10％SDS-PAGE分析，GmCRY1抗体用于免疫杂交。WT，野生型KN18；GmCRY1-OX，GFP-GmCRY1过表达在野生型KN18中。

图13显示了GmCRY2过表达植株在连续照下衰老相关的表型，其中(A-C)：野生型和GmCRY2-OX转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类(如图12所示)，每类所占的比例即该类的数目与植株总数的比值(n≥10)。(D-F,H)：不同衰老阶段植株单叶或子叶的表型。(G)：野生型和两个GmCRY2-OX转基因植株中GFP-GmCRY2表达水平的免疫印迹分析。总蛋白提取物用于10％SDS-PAGE分析，GmCRY2抗体用于免疫杂交。NS，GmCRY2抗体非特异条带用于标示上样量对照；GmCRY2-OX，GFP-GmCRY2过表达在野生型KN18中。

图14显示了GmCRy2-RNAi在连续照下衰老相关的表型，其中(A-C)：野生型和GmCRY2-RNAi转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类(如图12所示)，每类所占的比例即该类的数目与植株总数的比值(n≥10)。(D-H)：不同衰老阶段植株单叶或子叶的表型。(I)：野生型和两个GmCRy2-RNAi转基因植株中GmCRY2表达水平的免疫印迹分析。总蛋白提取物用于10％SDS-PAGE分析，GmCRY2抗体用于免疫杂交。NS，GmCRY2抗体非特异条带用于标示上样量对照；GmCRY2-RNAi，GmCRY2RNA干扰植株。

图15显示了GmCIB1过表达植株在连续照下衰老相关的表型，其中(A-C)：野生型和GmCIB1-OX转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类(如图12所示)，每类所占的比例即该类的数目与植株总数的比值(n≥10)。(D-H)：不同衰老阶段植株单叶或子叶的表型。(I)：野生型和两个GmCIB1-OX转基因植株中YFP-GmCIB1表达水平的免疫印迹分析。总蛋白提取物用于10％SDS-PAGE分析，GFP抗体用于免疫杂交。NS，GFP抗体非特异条带用于标示上样量对照；GmCIB1-OX，GFP-GmCIB1过表达在野生型KN18中。

图16显示了野生型和转基因植株中叶绿素含量、光合速率以及衰老相关基因的表达情况，其中(A)：野生型和各转基因株系中四周大的单叶中总叶绿素含量(白色柱)和叶绿素a∶b比率的测定(黑色柱)。FW：鲜重。标准误差如图所示(n＝10)。(B)：叶片生长进程中光合成变化趋势。选择种植于连续光照下的第二复叶作为测定对象，用LI-6400仪器对播种后31天到43天的植株进行测定，每两天测定一次。PSR：光合速率。(C)：野生型和各转基因株系中四个衰老相关基因(GmAPGL5,GmWRKY53,GmSAGL12和GmAGL12)的RNA表达情况，所选材料为连续光照下即将变黄的单叶。标准误差如图所示(n＝10)。(D)：野生型和各转基因株系中叶绿素降解相关基因的GmPaO蓝光处理下的RNA表达情况。材料处理为：黑暗下生长12天的幼苗，转入蓝光下(～22μmol m-2s-1)处理6小时，分别在黑暗下，蓝光光照1小时、3小时和6小时取材(B1，B3和B6)。标准误差如图所示(n＝3)。

图17显示了GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株中的开花表型，其中(A)：开花时间测定；(B)：开花时的叶片数。植株种植在连续光照下(LL)，当野生型第七复叶出现时，将所有的植株包括个各转基因植株转入到短日照(SD)条件下(8小时光照/16小时黑暗)。标准误差如图所示(n≥15)。

图18显示了GmFTs和GmTFLs在不同基因型中mRNA表达水平，其中(A)：WT和GmCRY1-OX转基因植株中GmFTs和GmTFLs mRNA表达水平；(B)：WT和GmCRY2-OX转基因植株中GmFTs和GmTFLsmRNA表达水平；(C)：WT和GmCRy2-RNAi转基因植株中GmFTs和GmTFLs mRNA表达水平；(D)：WT和GmCIB11-OX转基因植株中GmFTs和GmTFLs mRNA表达水平；测定的材料为图17中描述的植株从连续光照转到短日照生长3天后，取第1七复叶。标准误差如图所示(n＝3)。

图19显示了酵母双杂交试验GmCRY1,GmCRY2及AtCRY1与GmCIBs间的相互作用，其中(A)：组氨酸营养缺陷分析显示GmCRY1和GmCIBs间没有互相作用。(B)：组氨酸营养缺陷分析显示GmCRY2和GmCIB1间有蓝光依赖的互相作用。(C)：组氨酸营养缺陷分析显示AtGmCRY1和GmCIB1、GmCIB4、GmCIB8间分别有蓝光依赖的互相作用。含有编码所示蛋白的酵母细胞在黑暗或蓝光下(～22tmol m-2s-1)生长三天分别用于(A-C)中组氨酸营养缺陷分析。(+)：酵母细胞生长在缺少色氨酸和亮氨酸，但含有组氨酸的培养基中。(-)：酵母细胞生长在缺少色氨酸、亮氨酸，和组氨酸的培养基中。(D)：β-半乳糖苷酶活性检测来分析蓝光(～30μmolm-2s-1)或黑暗下GmCRY2和GmCIBs间的相互作用。过夜培养表达所示蛋白的酵母细胞并按1/5x稀释，稀释液黑暗培养至OD600＝0.3-0.4后转移至蓝光下培养。标准误差如图所示(n＝3)。

图20显示了GmCRY2与GmCIB1蓝光依赖的相互作用，其中(A)：β-半乳糖苷酶活性显示红光(R30，～30μmol m-2s-1)、蓝光(B30，～30μmol m-2s-1)或黑暗处理2小时GmCRY2和GmCIB1间的相互作用。(B)：表达所示蛋白的酵母细胞红光(R30，～30μmol m-2s-1)、蓝光(B30，～30μmol m-2s-1)或黑暗不同处理时间时的β-半乳糖苷酶活性。(C)：不同蓝光强度(30～70μmol m-2s-1)和光照时间处理下，GmCRY2和GmCIB1相互作用时的β-半乳糖苷酶活性。(A-C)酵母细胞所表达的蛋白如图所示。标准误差如图所示(n＝3)。(D)：BiFC试验表明GmCRY2和GmCIB1体内的相互作用。长日照下生长四周的拟南芥幼苗的叶肉细胞的原生质体被分离用于共转化表达图中所示蛋白的质粒。共转化后黑暗培养12-14小时后蓝光(～22μmol m-2s-1)处理30分钟或仍放置于黑暗中用作对照。a列：YFP荧光；b列：自发荧光；c列：明场；d列：a、b、c叠加；标尺为20μm.(E)：在蓝光(～22μmol m-2s-1)和黑暗处理下，显微镜视野中共转化表达nYFP-GmCIB1和cCFP-GmCRY2质粒的一百个细胞中含有YFP荧光的细胞的比值。(F)：CoIP试验表明在烟草体内能够形成蓝光依赖的GmCRY2-GmCIB1的复合体。利用含有编码所示蛋白质粒的农杆菌注射烟草叶片。WT和已注射植物黑暗中放置三天后，转移到蓝光(～22μmol m-2s-1)下或留在黑暗中。MYC抗体用于总蛋白和MYC-凝胶产物的免疫杂交，将该蛋白膜剥去抗体后用Flag抗体再免疫杂交。

图21显示了GmCRY2N端结构域与GmCIB1蓝光依赖的相互作用，其中(A)：GmCYR2和GmCIB1蛋白结构示意图。GmCYR2和GmCIB1相互作用的结构域被标示出来(粉色阴影)。(B)：营养缺陷试验表明了GmCRY2N和GmCIB1间蓝光依赖的相互作用。结构域的命名采用(A)图所示。表达所示蛋白的酵母细胞在图19A中所述培养基上生长，分别置于黑暗或蓝光(～25μmol m-2s-1)下。(C)：GmCRY2N或GmCRY2C结构域与GmCIB1作用时的β-半乳糖苷酶活性。表达所示蛋白的酵母细胞置于黑暗或蓝光(25μmol m-2s-1)下(左)，或者进行不同蓝光强度(B30到B70,30～70μmol m-2s-1)和光照时间的处理(右)。

图22显示了GmCRY1PHR结构域与GmCIB1蓝光依赖的相互作用，其中(A)：GmCYR1和GmCIB1蛋白结构示意图。GmCYR1的PHR结构域(GmCRY1N485)和GmCIB1相互作用的结构域用粉色阴影标示出来。(B)：营养缺陷试验显示GmCRY1各个结构域和GmCIB1间相互作用情况。结构域的命名采用(A)图所示。表达所示蛋白的酵母细胞在图3.8A中所述培养基上生长，分别置于黑暗或蓝光(～25μmol m-2s-1)下。(C)：GmCRY1N或GmCRY1C结构域与GmCIB1作用时的β-半乳糖苷酶活性。表达所示蛋白的酵母细胞置于黑暗或蓝光(25μmol m-2s-1)下(左)，或者进行不同蓝光强度(B30到B70，30～70μmol m-2s-1)和光照时间的处理(右)。(D)：BiFC试验显示GmCRY1或GmCRY2的不同结构域与GmCIB1在原生质体中的相互作用情况。表达所示蛋白的质粒通过图3.9(D)所述方法共转化原生质体。蓝光(22μmol m-2s-1)处理30分钟后在荧光显微镜下观察。标尺为10μm。

图23显示了GmCIB1N端结构域与GmCRY2蓝光依赖的相互作用，其中(A)：营养缺陷试验显示GmCIB1N(GmCIB1N217)或GmCIB1C(GmCIB1C218-420)与GmCRY1或GmCRY2间相互作用情况。表达所示蛋白的酵母细胞在图19A中所述培养基上生长，分别置于黑暗或蓝光(～25μmol m-2s-1)。(B)：BiFC试验显示GmCIB1N与GmCRY2相互作用情况。(C-D)：GmCIB1不同结构域与GmCRY1或GmCRY2作用时的β-半乳糖苷酶活性。表达所示蛋白的酵母细胞置于黑暗或蓝光(25μmol m-2s-1)下(C)，或者进行不同蓝光强度(B30到B70,30～70μmol m-2s-1)和光照时间的处理(D)。

图24显示了GmCIB1与GmCRY1/GmCRY2在大豆体内的相互作用，其中(A，B)：Co-IP试验显示大豆体内蓝光特异的GmCRY2-GmCIB1或GmCRY1-GmCIB1复合体的形成WT(KN18)和35S：：YFPGmCIB1转基因植株分别种植于短日照条件下生长三周。幼苗转入黑暗下处理18小时后进行蓝光(B，22μmol m-2s-1)处理，处理时间为(D，0分钟；B30，30分钟；B60，60分钟B120，120分钟)。YFP抗体用于总蛋白(Input)和GFP-凝胶产物(FP-IP)的免疫杂交，将该蛋白膜剥去抗体后用GmCRY2(A)或GmCRYI(B)抗体再免疫杂交。

图25显示了GmCIB1与GmCRY1/GmCRY2体外蓝光依赖的相互作用，其中(A)：体外pull-down实验表明GmCRY2和GmCIB1蓝光特异的相互作用。含有Flag抗体的凝胶与分别表达GmCIB1-flag和GmCRY2蛋白的昆虫细胞裂解物的混合在一起。混合物在蓝光(B，22μmolm-2s-1)和黑暗下处理，处理时间如图所示。结合的蛋白漂洗后洗脱下来用Flag(GmCIB1-Flag)抗体进行免疫杂交，剥去该抗体后用GmCRY2再免疫杂交。(B)：体外pull-down实验表明GmCRY1和GmCIB1蓝光特异的相互作用。试验方法如图(A)所述，结合的蛋白漂洗后洗脱下来用F1ag(GmCIB3-F1ag)抗体进行免疫杂交，剥去该抗体后用GmCRY1再免疫杂交。

图26显示了GmCIB1-DNA体外的相互作用。RBSS试验结果显示GmCIB1蛋白结合的DNA序列以及列在底部的保守序列。底部序列为GmCIB1蛋白结合的DNA序列，底部为比对后的CANNTG。

图27a-e显示了GmCIB1与GmFT3、GmFT4、GmTFL1、GmTFL3和GmWRKY53染色体的相互作用，其中上图显示了所选基因(图27a-GmFT3、图27b-GmFT4、图27c-GmTFL1、图27d-GmTFL3、图27e-GmWRKY53)的启动区(箭头)，5′UTR(黑线)，外显子(灰色方框)，内含子(黑色方框)，3′UTR(黑线)。黑色圆圈表示E-box(CANNTG)所在的位置。黑线所示的DNA区域是所设引物能够扩增到或扩增不到的区域。下图显示ChIP-qPCR结果。选择野生型(WT)或YFP-GmCIB1过表达植株(GmCIB1-OX)的幼苗作为分离染色体片段(～500bp)的材料，植株生长21天后黑暗下放置18小时，转入蓝光(Blue，22μmol m-2s-1)下处理(左)或继续放置在黑暗(Dark)(右)下，用GFP抗体进行免疫沉淀，得到的DNA沉淀用于qPCR的引物。％Input：1％起始染色体片段的量用于Input。标准误差如图所示(n＝3)。

图28显示了酵母细胞中响应于蓝光的GmCRY2a与GmCIB1的相互作用。(A)β-半乳糖苷酶(β-gal)分析表明在蓝光(30μmol m^-2s^-1)或暗处理的酵母细胞中GmCRY2a与GmCIB1和GmCIB1同源物的相互作用。(B)β-gal分析表明在红光(R30，30μmol m-2s-1)、蓝光(B30，30μmol m^-2s^-1)或暗(D)处理2小时的酵母细胞中GmCRY2a与GmCIB1的相互作用。示出了表达各种诱饵和猎物的酵母细胞。显示三个独立重复的平均值和标准差(A，B)。(C)β-gal分析表明在所示时间段内响应于不同能流率的蓝光(D，暗；B30，30μmol m^-2s^-1；B50，50μmol m^-2s^-1；B70，70μmol m^-2s^-1)的GmCRY2a与GmCIB1的相互作用。各处理的β-gal活性在照射时随时间线性提高，且代表β-gal活性的点与线性回归曲线拟合。(D)不同能流率的线性回归曲线的斜率如(C)中所示。图中显示了三个独立重复的平均(±SD)(通过SPSS程序进行的Jonckheere-Terpstra趋势分析，P＝0.003，n＝3)，表明结合动力学的量度取决于光强度。(E)显示GmCRY2a-GmCIB1相互作用所需的GmCRY2a和GmCIB1的结构域(土黄色阴影)的示意图。

图29显示了体外和植物细胞中响应于蓝光的GmCRY2a与GmCIB1的相互作用。(A)pull-down分析表明了蓝光依赖性的GmCRY2a-GmCIB1体外相互作用。偶联抗Flag抗体(α-Flag)的琼脂糖珠与表达6His-GmCIB1-Flag(GmCIB1)和6His-GmCRY2a(GmCRY2a)的昆虫细胞的裂解物混合。混合物进行蓝光(B，22μmol m^-2s^-1)或暗处理所示的时间。结合的蛋白质在洗涤后洗脱，并通过抗Flag抗体(α-Flag)的免疫印迹进行分析、分条和用抗-GmCRY2a抗体(α-GmCRY2a)再次检测。(B)BiFC分析表明了用编码nYFP-GmCIB1和cCFP-GmCRY2a的质粒共转染的拟南芥原生质体中蓝光依赖性的GmCRY2a-GmCIB1相互作用。长日(LD，16h光/8h暗)条件下生长的4周龄植物的叶肉原生质体用编码所示蛋白质的质粒共转化，黑暗中温育12小时并随后转移到蓝光(22μmol m^-2s^-1)中30分钟，之后进行共焦显微分析。A栏，YFP荧光；b栏，自发荧光；c栏，明视场；d栏，a、b和c栏的合并.棒，10μm。(C)对显示BiFC荧光信号的原生质体的数目进行计数。各样品包含至少50个原生质体。显示了平均值和标准差(n＝3)。P＝0.00026(Student’s t检验)。(D)活体外Co-IP分析表明了烟草(Nicotianabenthamiana)中GmCRY2a-GmCIB1复合体的蓝光依赖性的形成。如所示的，嫩叶以携带编码GmCIB1-Flag(GmCIB1)或GmCRY2a-Myc(GmCRY2a)的质粒的农杆菌渗透，在黑暗中保持3天，并随后暴露于蓝光(B，22μmol m^-2s^-1)1小时或保持在黑暗(D)中。蛋白质提取物与偶联有抗-Myc抗体的琼脂糖一起在4℃下温育60分钟。收集珠并洗涤3次，随后洗脱IP产物。总蛋白质提取物(Input)和IP产物的免疫印迹使用抗-Myc抗体(α-Myc)和抗-Flag抗体(α-Flag)顺序地进行。(E)Co-IP分析表明大豆中GmCRY2a-GmCIB1复合体的蓝光依赖性的形成。野生型(WT)大豆KN18和过表达35S：：YFP-GmCIB1转基因的大豆转基因系(系2)(GmCIB1-OX-2)在SD下生长2周。植物转移到中18小时并暴露于蓝光(B，22μmol m^-2s^-1)所示的时间(D，0min；B30，30min；B60，60min；B120，120min)。使用偶联有抗-YFP抗体(α-YFP)的琼脂糖进行的蛋白质提取物(Input)和IP产物的免疫印迹通过抗-YFP抗体(α-YFP)进行检测、分条并通过抗-GmCRY2a抗体(α-GmCRY2a)再次检测。

图30.GmCIB1是与E box(CANNTG)相互作用的DNA-结合蛋白。(A)经由随机结合位点选择(RBSS)分析通过GmCIB1蛋白质选择的DNA序列的比对。通过GmCIB1选择的90％以上的序列包含E box元件(CANNTG)，如通过在线程序计算的(http：//weblogo.berkeley.edu/).(B)竞争EMSA分析表明GmCIB1与DIG-标记的E-box DNA的相互作用。GmCIB1-DNA相互作用与未标记的野生型E box(Ewt)或突变体E box(Em4)竞争，如(C)中所示。黑色楔形代表竞争者的都加量(12.5X，25X，50X，摩尔过量)。(C)野生型E-box DNA(Ewt)和突变体E-box序列(Em)竞争者的DNA序列。(D)使用Ewt或其它竞争者的竞争EMSA的定量分析。在未标记的寡核苷酸竞争者存在(+UOC)下GmCIB1-结合探针的信号除以不存在未标记的寡核苷酸竞争者(-UOC)GmCIB1-结合探针的信号，并表示为RBU(相对结合单位)。

图31.GmCIB1通过GmCRY2响应于蓝光而调节的转录激活因子。(A)E-box驱动双-Luc报告基因的结构和重组E-box的DNA序列。(B)显示了萤光素酶活性的图像。(C)相对报告基因活性的双-luc分析。(D)GmCRY2a对于GmCIB1与E-box DNA响应于蓝光的DNA-结合活性的抑制性效应的GmCIB1-DNA结合分析。

图32.GmCRY2a和GmCIB1调节叶衰老。(A-C)免疫印迹表明GmCRY2a-ox植物、GmCIB1-RNAi植物或野生型植物(WT)中GFP-GmCRY2a融合蛋白或内源GmCRY2a蛋白的表达，或者GmCIB1-ox植物中YFP-GmCIB1融合蛋白的表达。检验了各基因型的两个独立的品系。总蛋白质提取物在10％SDS-PAGE中分析用于通过α-GmCRY2a(A，B)或α-GFP抗体(C)检测的免疫印迹。通过抗体识别的非特异性带(NS)分别用作加载对照。(D-F)典型子叶的图像表明在所示的生长阶段所示品系的不同程度的衰老。WAS，播种后周数。(G-I)子叶和单小叶按照其在所示发育阶段的衰老程度分成三组(绿色，无衰老；黄色，轻度衰老；干燥，完全衰老)。叶衰老指数计算为相对于单个植株的总叶数(n≥10)的各组的百分比。(J-O)相应基因型(J-L)的叶绿素含量(叶绿素a+b)和GmCRY2a-OX-1(M)、GmCRY2a-RNAi-1(N)、GmCIB1-OX-2(O)的叶的叶绿素a∶b比率(M-O)与WT的比较。收集所示发育阶段中在连续白光中生长的植物的两个单小叶和前两个三小叶的混合样品用于这两个测量。显示了平均值和标准差(n＝3)。

图33.转基因大豆表现叶衰老表型。(A)过表达GmCRY2a的转基因大豆(CRY2ox)显示出延迟的叶衰老表型。植物在连续光照中生长8.5周。(B)表达GmCRY2a-RNAi的转基因大豆(CRY2RNAi)显示出加速的叶衰老表型。植物在连续光照中生长7.5周。(C)过表达GmCIB1的转基因大豆(CIB1ox)显示出加速的叶衰老表型。植物在连续光照中生长7.5周。

图34.GmCIB1结合GmWRKY53b染色质以促进其mRNA表达。(A)定量RT-PCR表明在连续光中生长的具有所示表型的叶中GmWRKY53b的RNA水平。相对表达单位(REU)通过GmWRKY53b信号相对于ACTIN11内部对照的信号的标准化进行测量，并显示了标准差(n=3)。2T2、2T4、2T6或2T8：从2WAS、4WAS、6WAS或8WAS(播种后周)的植物收集的第二个三小叶。WT和转基因系之间GmWRKY53b的表达差异通过Student t检验进行分析：对于2WAS或6WAS的GmCRY2a-ox及6WAS的GmCRY2a-RNAi或GmCIB1-ox，分别地p＝0.007，0.046，0.006或0.005。(B)该图表描述了GmWRKY53b基因的预测的启动子(箭头)和5′UTR(白色框)。黑色圆圈表示Ebox(CANNTG)的位置。2880bp WRKY53b基因组DNA的不同区域通过PCR扩增。短下划线表示单个重叠PCR产物的中心，星号表示推定的转录起始位点(TSS)，数字显示了TSS上游(+)或下游(-)的位置(bp)。(C)采用所示引物组对从不同发育阶段的GmCIB1-OX-2和WT植物收集的样品进行的ChIP-qPCR分析。植物在连续兴中生长。U2、U3或U4代表2WAS、3WAS或4WAS阶段的单小叶。ChIP样品通过抗-YFP抗体制备并进行qPCR分析。ChIP-qPCR的结果通过相对于具有相应输入信号的IP信号标准化而定量，显示了标准差(n＝3)。

图35.GmCIB1结合位于GmWRKY53b染色质中的E-box DNA序列。EMSA表明GmCIB1蛋白与分别对应于GmWRKY53b染色质的c、f、k、o或q区域的各DNA探针的亲和性，如图34B所示。各探针的DNA序列在底部。

图36.蓝光抑制GmCIB1与GmWRKY53b染色质的结合。(A)GmCIB1响应于蓝光与GmWRKY53b染色质的各区域(a-r，图34B)的亲和性的比较。在短日光周期(8hL/16hD)中生长的3周龄植物转移到黑暗中18小时，然后保持在黑暗中或暴露于蓝光(22μmol m^-2s^-1)。收集第一个三小叶用于ChIp分析。DBU(不同结合单位)通过下式计算：[(GmCIB1/NT)的IP/暗处理样品的(GmCIB1/WT)的输入]/[(GmCIB1/WT)的IP/蓝光处理样品的(GmCIB1/WT)的输入]，显示了标准差(n＝3)。GmCIB1与GmWRKY53b染色质的单个区域的不同亲和性通过Studentt检验进行分析，对于“a”、“f”或“k”区域，分别地p＝0.8，0.002或0.007。(B)工作模型描绘了对于叶衰老的GmCIB1-依赖性激活的GmCRY2a-介导的蓝光抑制。PHR和CCE：光解酶同源区域和CRY的C-末端延伸。

详细说明

下列定义和方法被提供来更好地定义本发明和在本发明的实施中指导本领域技术人员。除非另外指出，否则将根据相关领域技术人员常规使用的含义来理解术语。

如本文中所用，术语“重组”是指通常未在自然界中发现的并且因而通过人干预产生的DNA和/或蛋白质和/或生物体形式。这样的人干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。如本文中所用，“重组DNA分子”为包含不能一起天然存在的DNA分子的组合并且为人干预的结果的DNA分子，例如由至少两个彼此异源的DNA分子的组合组成的DNA分子，和/或为人工合成的并且包含从通常存在于自然界中的多核苷酸序列衍生的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工地整合入宿主细胞的基因组DNA的转基因和相连的宿主细胞的基因组的侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例为本文中描述的因转基因至拟南芥、玉米或水稻基因组内的插入而产生的DNA分子，其可最终导致重组DNA和/或蛋白质分子在该生物体中表达。

如本文中所用，术语“转基因”是指人工地整合入宿主细胞的基因组的多核苷酸分子。这样的转基因对于宿主细胞可以是异源的。术语“转基因植物”是指包含这样的转基因的植物。

如本文中所用，术语“DNA”、“DNA分子”、“核酸分子”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或核苷酸分子，从5’端(上游)至3’端(下游)阅读。

如本文中所用，术语“DNA序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常从5’(上游)末端至3’(下游)末端显示的DNA分子的核苷酸的序列。

如本文中所用，术语“分离的”是指至少部分地将分子与通常在其自体或天然状态中与其联接的其它分子分离。在一个实施方案中，术语“分离的基因”或“分离的DNA分子”是指这样的DNA分子，其至少部分地与在自体或天然状态中通常侧翼连接所述DNA分子的核酸分离。因此，例如作为重组技术的结果融合于它们通常不与其联接的调控或编码序列的DNA分子在本文中被认为是分离的。此类分子即使当整合入宿主细胞的染色体或与其它DNA分子一起存在于核酸溶液中时亦被认为是分离的。

如本文所述，术语“严格条件”，通常是指由Sambrook等人，1989和由Haymes等人在：Nucleic acid hybridization，A practical approach，IRO Press，Washington，DC(1985)中所描述的条件。DNA杂交的合适的严格条件(例如大约45℃的6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着50℃的2.0x SSC洗涤)是本领域的技术人员已知的，或可以在CurrentProtocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50℃的大约2.0x SSC的低严格条件到50℃的大约0.2x SSC的高严格条件。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温(大约22℃)的低严格条件增加到大约65℃的高严格条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度中的一种可以保持恒定，而另一个变量发生变化。例如，中等严格条件可以为大约2.0x SSC的盐浓度和大约65℃的温度，高严格条件可以为大约0.2x SSC的盐浓度和大约65℃的温度。在本发明的一个方面，本发明的基因具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核酸序列。在本发明的另一个方面，本发明的基因与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核酸序列共有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在本发明的进一步的方面中，本发明的基因与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3所示的核酸序列共有95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列同一性。

本发明的基因还包括GmCIB1基因通过其中的一个或多个核苷酸发生缺失、置换、插入或添加的突变而衍生得到的变体序列。基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的产生可以是自发的也可以是诱发的，人工诱变的方式包括物理诱变(如γ射线、x射线、紫外线和中子流等)、化学诱变(如烷化剂、碱基类似物和抗生素等)及生物诱变(如某些病毒和细菌等)。而且，可以利用重组DNA技术使DNA分子在指定位置上发生特定的变化，从而实现定向诱变。本领域技术人员可以使用这些公知的诱变方法中的任一种来获得包括一个或多个核苷酸发生缺失、置换、插入或添加的突变的GmCIB1基因的变体序列。

拟南芥(A.thaliana)，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。这种小小的有花植物是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。其在植物学中所扮演的角色正仿佛小白鼠在医学中和果蝇在遗传学中的一样。拟南芥的优点是植株小(1个茶杯可种植好几棵)、每代时间短(从发芽到开花不超过6周)、结子多(每棵植物可产很多粒种子)、生活力强(用普通培养基就可作人工培养)。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。每个单倍染色体组(n＝5)的总长只有7000万个碱基对，即只有小麦染色体组长的1/80，这就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。其整个基因组已于2000年由国际拟南芥菜基因组合作联盟联合完成，也是第一个测序分析的植物基因组。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。由于有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料。

除了在植物形态建成研究中经典的花发育ABC模型外，近十年来，植物科学家们利用拟南芥模式系统，对植物不同组织和器官的发育开展了类似的研究。通过大量拟南芥突变体的分析，科学家们对植物根、茎、叶、花、胚胎和种子的发育，对植物抗病性和抗逆性机理，以及对各种生命活动有关的激素、光和环境因子引起的信号传导过程等进行了深入的研究，极大丰富了人类对于植物生命活动内在机理的认识。

本发明中的植物包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，包括作物植物(如玉米)、芸苔属(例如，甘蓝、白菜、芥菜)，特别是可用作种子油来源的芸苔物种、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(0ryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghum vulgare)、粟(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(Panicummiliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪粟(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(CocoS nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、马卡达姆坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦)、蔬菜(如西红柿(Lycopersiconesculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、菜豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(Lathyms spp.)和黄瓜属的成员如黄瓜(C.sativus)、甜瓜(C.cantalupensis)和香瓜(C.melo))、观赏植物(如杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、猩猩木(Euphorbia pulcherrima)和菊花)。在特定的实施方式中，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在一些实施方式中，优选是拟南芥或大豆。

本发明从大豆(Glycine max)中克隆到9个CIB1同源基因，分析了其基因结构特点、不同组织器官和发育时期mRNA的时空表达模式、在不同光周期条件下和不同纬度来源大豆品种中的mRNA表达模式，并将基因过表达在拟南芥中对其功能进行初步研究，以期研究GmCIB基因在大豆生长发育过程、光周期调控中发挥的作用，为GmCIB基因的功能研究提供一定的理论参考。

基因组结构分析显示，GmCIB家族基因成员都含有不同数目和长度的外显子和内含子，以及不同长度的UTR。复杂的基因组结构可能也会产生不同的基因转录后修饰，同时伴随着不同的基因功能。

亚细胞定位分析看出，虽然GmCIB为转录因子但亚细胞定位并不仅仅是位于细胞核内，GmCIB6和GmCIB7蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，暗示了它们可能在细胞质内也能行使功能。

GmCIBs不同组织器官的时空表达分析显示各成员在不同组织器官的表达各异，表达模式也比较复杂。整体上看大部分基因在开花时期的器官中表达量较高，推测可能这一家族基因在大豆开花调控中起到一定的作用。目前研究显示拟南芥CIB1主要功能是调控植物开花，可为以上推测提供理论依据。GmCIBs中有些基因在单叶期的组织器官中也有较高的表达，如GmCIB1/2/3/9在刚刚张开的单叶中表达量很高，可能这些基因除有开花调控的作用，可能还参与到其他调控途径中。

大豆CIB基因不同发育时期表达模式综合分析看，除GmCIB2外，其他基因地上部分的表达量都较低，大部分基因表达量较高时期主要集中在营养生长后期，生殖生长初期阶段即开花期，这表明这些基因可能参与到大豆的开花调控。但是也有些基因在生殖生长初期阶段如单叶时期也有很高的表达量，GmCIB1在单叶期和开花初期的表达量都很高，而在发育中间阶段表达量却很低。可能该基因在营养生长和生殖生长的初级阶段均起到重要的调控作用，对发育调控起到双重作用。而GmCIB6的整体表达水平都很低，可能该基因对发育调控中的作用很小，或者是受某种信号诱导表达的基因。

光周期和生物钟分析显示，GmCIB家族成员中这两种表达模式较为复杂。总体上看大部分基因受光周期和生物钟共同调控，只是两种调控机制所占主导地位不同。纵观所有成员，GmCIB4在长日照条件的表达有明显的生物钟节律，而在短日照下，生物钟节律明显受到光周期调控拮抗，当转入连续光照是基因整体表达水平调高而在连续黑暗条件下基因一直维持在很低的表达水平。暗示了该基因在LD和SD条件下的调控机制有差异，这也可能由于大豆是严格的短日照植物，在两种光照条件迥异的条件下可能有不同的调控机制。虽然光周期和生物钟共同调控着基因的表达，对各成员的进一步分析发现，大部分基因(除GmCIB1和GmCIB9外)在SD和LD条件下，都有明显或不很明显生物钟节律，在一天的表达中都有峰值和谷值出现，转入LL和DD后生物钟节律被消减，而光周期调控占主导地位，LL条件下基因的整体表达水平提高，基因在DD条件下一直维持这较低的表达水平。GmCIB2例外，在LL条件下该基因表达明显受到抑制，而在DD条件下表达量相对较高，说明GmCIB2的表达受光照的抑制。

不同纬度来源大豆品种中GmCIBs表达模式显示，基因的表达模式与纬度间未发现明确的相关性。整体分析表明，不同纬度来源的品种中，无论在SD或LD环境下基因的表达都有随光照时间的增加逐渐增加的趋势，在增加过程中，有些基因在某些品种基因的表达在正午时刻(N)达到峰值后而逐渐降低，而有些会持续增加一直到黑暗来临(E)前达到峰值。很少一部分基因的表达呈现逐渐降低的模式。

将克隆到的GmCIBs构建过表达植物表达载体转化拟南芥，对得到的转基因植株进行表型分析。在长日和短日条件下，过表达GmCIB1/4/5/6/8的转基因拟南芥表现出早开花表型，与拟南芥CIB1的功能类似。在过表达GmCIB1的转基因植株中对下游靶基因AtFT表达水平检测显示，AtFT的表达水平明显高于野生型，说明外源GmCIB1的表达可提高AtFT的转录水平从而促进植物早开花。虽然GmCIB1在拟南芥中的功能与CIB1相似，但是大豆是典型的短日照植物，而拟南芥是长日照植物，两者的调控机理有可能不同，所以需进行大豆遗传转化进一步研究GmCIB基因在大豆中的功能。

此外，发明人通过酵母双杂交实验初步验证了GmCIB1与GmCRY2在蓝光下特异的相互作用。本研究将通过酵母双杂、BiFC以及Co-IP等手段研究GmCRYs与GmCIB1蛋白间的相互作用；进一步获得GmCRY与GmCIB1基因过表达或RNAi敲除的大豆遗传转化株系，结合转基因后代的表型分析和ChIP实验来寻找GmCIB1的下游作用靶基因，从而分析大豆中GmCRY传递蓝光信号的GmCIB信号通路，为大豆光周期和叶片衰老调控的深入研究和种质创新打下基础。

利用农杆菌介导的子叶节转化方法获得GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因大豆，分别对转基因植株进行表型分析；利用酵母双杂交、BiFC以及免疫共沉淀等手段研究了GmCRYs和GmCIB1将的相互作用；分析了GmCIB1与DNA体外相互作用的位点，并通过ChIP试验初步筛选鉴定GmCIB1的下游作用靶基因。主要得到以下结论：

GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因大豆表型分析结果表明，在连续光照下，过表达GmCRY2导致植株叶片衰老延迟，而在GmCRY1-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因大豆出现叶片提前衰老的表型，初步推测GmCRY1和GmCIB1在叶片衰老调控过程中起到正调控的作用，而GmCRY2可能抑制叶片的衰老。

过表达GmCRY1和GmCRY2敲除转基因大豆表现出提前开花，而过表达GmCRY2、GmCIB1则导致大豆晚开花，暗示了GmCRY1促进开花，而GmCRY2和GmCIB1负调控大豆开花。酵母双杂交和BiFC试验表明，GmCRY2和GmCIB1有蓝光特异的相互作用，且这种相互作用随着光强的增强和光照时间的增加而增强。GmCRY1和GmCRY2的PHR结构域参与和GmCIB1蓝光依赖的相互作用。体内(GmCIB1-OX转基因大豆)和体外(昆虫蛋白表达系统)Pull-down试验进一步验证了GmCRY1/GmCRY2与GmCIB1间蓝光依赖的相互作用。

GmCIB1与DNA体外的相互作用结果显示GmCIB1与E-box结合，ChIP试验显示，GmCIB1与拟南芥FT的同源基因GmFT3和GmFT4染色体区的E-box结合，也能与衰老相关基因WRYK53的同源基因GmWRYK53启动子区核基因组内的E-box结合，并且这种结合没有严格的蓝光特异性，推测GmCIB1在大豆体内可能通过负调控GmFT的表达抑制开花，促进衰老相关基因如GmWRYK53的转录进而促进叶片衰老。

实施例1、大豆CIB家族基因的克隆与表达模式分析

2008年在拟南芥中通过酵母双杂交筛选到第一个与隐花色素CRY2有蓝光特异相互作用的蛋白，命名为CIB1(CRY-interacting bHLH1)。CIB1是bHLH家族中的一个成员。在酵母细胞中，CIB1与CRY2的相互作用是蓝光波长特异的，且相互作用的强度随着蓝光强度的增强和光照时间的增加而增强。CIB1的结构功能研究显示，其N端结构域能够执行与蛋白相互作用的功能；而含有bHLH基序的C端结构域参与到与DNA的相互作用，从而通过顺式作用元件调控目的靶基因。拟南芥中CIB1通过与FT启动子区的E-box(CANNTG)的结合来提高FT的转录水平，从而启动植物开花。

本研究从大豆(Glycine max)中克隆到9个CIB1同源基因，分析了其基因结构特点、不同组织器官和发育时期mRNA的时空表达模式、在不同光周期条件下和不同纬度来源大豆品种中的mRNA表达模式，并将基因过表达在拟南芥中对其功能进行初步研究，以期研究GmCIB基因在大豆生长发育过程、光周期调控中发挥的作用，为GmCIB基因的功能研究提供一定的理论参考。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

(1)大豆材料：

大豆垦农18(KN18)以及10个其它栽培大豆品种，种植于温室，培养条件为：长日照(16h光照/8h黑暗)或短日照(8h光照/16h黑暗)，培养温度为25-28℃。发育时期和组织器官样品：将大豆垦农18(KN18)种植于短日条件下，培养温度为25-28℃。

当单叶张开前取地上部幼苗；单叶张开期取根、下胚轴、上胚轴、子叶、单叶和茎尖；在开花期(第四复叶期)取根、茎、单叶、第一复叶、第二复叶、第三复叶和花；在花后7d，14d和21d取不同发育时期的果荚和种子；分别在单叶期、第一复叶期、第二复叶期、第三复叶期、第四复叶期(开花期)取地上部分。光照开始后30min取样。

光周期样品：大豆垦农18(KN18)分别种植于长日和短日条件下，当单叶刚展开时每间隔2h取样，各取24个时间点(48h)，随后将幼苗分别转移至连续光照(LL)和连续黑暗(DD)条件下，每间隔2h取样，各取24个时间点(48h)。

不同维度来源大豆品种样品：选用11个栽培大豆品种，即黑河27(HH27)、绥农14(SN14)、垦农18(KN18)、长农13(CN13)、铁丰31(TF31)、冀豆12(JD12)、中黄13(ZH13)、中豆31(ZD31)、浙春3(ZC3)、福豆1(FD1)和桂早2(GZ2)，在长日和短日条件下种植，单叶完全张开时取样，分别在光照开始30min(M)、光照时间中间点(N)、光照结束前30min(E)取样。

所有样品取样后立即用液氮冷冻后贮于-80℃备用。

(2)拟南芥材料：

拟南芥野生型Col-0，生长温度为21～22℃，光照时间为长日(16h光照/8h黑暗)和短日照(8h光照/16h黑暗)。

1.1.2菌株及质粒

根癌农杆菌菌株GV3101：：pMP90RK由本实验室保存，大肠杆菌菌株DH5α购自全式金公司。Gateway T载体pGWc来自中国农业大学陈其军副教授实验室。植物表达载体pLeela、pENSG-YFP-GW本实验室提供。

1.1.3酶与试剂盒

PrimerSTAR扩增酶、SYBR Green I Kjt购自TaKaRa公司，Gateway LR ClonaseEnzyme Mix均购自Invitrogen公司，胶回收及质粒小提试剂盒购自Axygen公司，质粒小提中量试剂盒购自天根公司。

1.2实验方法

1.2.1生物信息学分析

(1)候选基因的确定

根据拟南芥CIB1基因的CDS(code sequence)和氨基酸序列，在http：//www.phytozome.net网站中进行Local Blast，筛选出大豆中的同源基因。

(2)引物设计与PCR扩增

根据基因的CDS序列，基因克隆引物利用Primer Premier5.0进行设计。Real-time引物采用Beacon Designer7.0软件进行设计。引物合成由上海生工生物公司完成。

(3)基因的染色体定位

根据大豆基因组网站Phytozome(http：//www.phytozome.net)提供的信息确定基因在染色体上的位置，按照基因和染色体的长度比例用Adode IIIustrator CS3进行绘制。

(4)基因结构分析

将预测所得的大豆基因组DNA序列与相应的cDNA基因序列在GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)网站中进行比对，确定基因UTR区、内含子和外显子的位置以及长度。采用Adode Illustrator CS3序列长度比例进行绘制基因结构模式图。

(5)同源片段的分析

采用生物学软件Clustalx2.1软件，DNAStar软件包，GeneDoc2.7软件，MEGA4软件包，以及http：//weblogo.berkeley.edu网站对预测基因的同源片段进行分析。

表1克隆基因的引物及序列

表2用于qRT-PCR的引物序列

(1)RNA的提取

1)在研钵中加入液氮，迅速将样品充分磨碎，用RNase-Free离心管盛约30mg样品(到1o0μl刻度处)。

2)加入350μl RAlBuffer和3.5μlβ-ME，充分涡旋振荡，使其完全混匀。

3)室温下8000g离心1min，将上清转移到粉色的过滤柱中，室温11000g离心1min，液体转移至新的1.5ml离心管，弃去过滤柱。

4)加入350μl70％乙醇，涡旋振荡25s，充分混匀。

5)将液体转移至蓝色的吸附柱中，8000g离心30s，RNA被吸附到柱子上。

6)除盐，加入350μl MDB Buffer，11000g离心1min，弃去废液。

7)除DNA，向吸附柱加入95μl DNase Reaction MiXture，室温静置15min。

8)清洗，加入200μl RA2Buffer，11000g离心2min，更换新的收集管。加入600μlRA3Buffer，11000g离心1min，弃去废液，加入250μlBuffer，11000g离心2min，弃废液。

9)更换新的RNase-Free离心管，向吸附膜中央加入60μlRNase-Free H20，11000g离心1min，重复一次，以增加洗脱率。此步骤在冰上操作。得到的RNA放于-80℃冰箱保存。

表3用于ChIP-PCR的引物序列

表4用于ChIP-PCR的引物序列

(2)cDNA第一链的反转录合成

2)在冰上向nuclease-feee PCR管中依次加入下列试剂：

Total RNA 6μl(0.1ng-5μg)

Oligo(dT)18primer 1μl

nuclease-free 5μl

置于PCR仪中65℃反应5min。

2)然后再加入以下试剂：

轻轻混匀，在PCR仪中45℃反应60min。

2)PCR仪中，70℃5min，终止反应。

(3)实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR采用ABI StepOne进行，利用SYBR Green I检测荧光信号。

1)反应体系为15μl：

2)反应程序为：

两步法：

Stage1：热启动95℃10s；

Stage2：PCR反应95℃5s，60℃1min，40Cycles；

Stage3：融解曲线分析95℃15s，60℃1min，95℃15s。

三步法：

Stage1：热启动95℃10s；

Stage2：PCR反应95℃5s，58℃30s，60℃1min，40Cycles；

Stage3：融解曲线分析95℃15s，60℃1min，95℃15s。

若两步法不理想时，利用三步法对退火温度进行调整优化。

3)基因相对表达量的计算计算公式为：相对表达量(RQ)＝2-ΔΔCT1.2.3基因的克隆及载体构建

(1)目的片段的扩增：该实验的模板为大豆垦农18(KN18)各组织部位cDNA的混合物。

PCR反应体系如下：

反应程序：98℃变性10s，57℃退火5s，72℃延伸2min30s，35个循环，25℃保温。

(2)PCR产物回收和产物连接

琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司)回收PCR产物，回收片段与线性化的pGWC载体进行连接。在使用前，该载体经过Eam1105I酶切而产生两端有5’T的线性化载体。回收的PCR产物与酶切后的pGWC载体连接，检测正向克隆并送测序。

pGWC载体的酶切反应体系如下：

反应混和液于37℃温育4-6h。琼脂糖凝胶电泳检测1μl酶切反应液的酶切效果，大体估计载体片段浓度，无需纯化酶切反应液直接用作连接。

DNA回收片段与pGWC-T的连接：

反应液16℃过夜连接(约12～16h)后用于转化实验。

(3)大肠杆菌DH5α的转化

a)在超净台中取50μl冰上冻融的感受态细胞，加入5μl连接产物，轻轻混匀，冰浴置30min。

b)42℃水浴锅热激45s，快速转移到冰上放置2min。

c)加入500μl无抗的LB培养基于离心管中，37℃，200rpm培养1h。

d)将菌液加均匀涂布与含有相应抗生素(氯霉素chl)的LB平板上，待液体完全吹干后，倒置平板，37℃培养过夜。

(4)阳性克隆的鉴定

用牙签挑取平板上的单克隆，在含有氯霉素抗生素的LB平板划线，然后将牙签在含有PCR反应混合物的管中轻轻搅动几下，进行菌落PCR来鉴定。可以挑取多个单克隆，并在平板上做好标记，以增加获得阳性克隆的概率。之后将平板置于37℃过夜培养。

PCR体系：

PCR程序：反应程序：98℃6min，94℃30s，57℃30s，72℃2min，35个循环，

PCR产物经电泳检测，有目的片段的克隆，把对应平板上的划线，送菌液测序，得到连有正向基因的阳性克隆。

(5)质粒提取对于测序正确的单克隆，扩摇菌液，用试剂盒提取质粒，步骤如下：

a)取2ml培养过夜的菌液，12000g离心1min，弃尽上清。

b)加250μl Buffer S1(含有RNase)用移液器吹打悬浮细菌沉淀，一定要保证均匀。

c)加入250μl Buffer S2，温和地上下翻转数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min，以防质粒DNA被裂解。

d)加入350μl Buffer S3，温和并充分地混合数次，12000g离心10min。

e)吸取上清转移到制备管(置于2ml离心管中)，12000g离心1min，弃滤液。

f)将制备管放回2ml离心管中，加500μl Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液。

g)将制备管放回离心管，加700μl Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液；重复一次。

h)将制备管放回2ml离心管中，12000g离心1min。

i)将制备管移入干净的1.5ml离心管中，在吸附管膜中央加40μl

ddH2O，室温静置1min。12000g离心1min，洗脱质粒DNA。

(6)基因表达载体的构建

本实验中用到的表达载体均含有Gateway重组系统，pGWC带有目的基因的质粒作为入门载体(Entery vector)，通过LR反应可完成目的基因表达载体的构建。

LR反应体系：

25℃反应过夜。反应液转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

(7)农杆菌感受态的制备与转化

1)农杆菌感受态的制备

挑取农杆菌GV3101：：pMP90RK和EHA105单菌落分别置于5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，GV3101：：pMP90RK抗性为：100μg/ml利福平(Rif)，50μg/ml卡那霉素(Kan)、50μg/ml庆大霉素(Gen)；EHA105抗性为：100μg/ml利福平(Rif)。28℃培养过夜；取过夜培养菌液

500μl接种于50ml LB含相应抗生素的液体培养基中，28℃培养到OD600约为0.5；冰上放置30min；4℃，5，000rpm离心10min，用15ml预冷的10mM CaCl2重悬农杆菌细胞，4℃，5,000rpm离心10min；用2ml预冷的10mM CaCl2重悬沉淀，冰上100μl/管分装，液氮速冻，-80℃保存。

2)农杆菌转化

取100μl感受态细胞冰上解冻，加入1μg质粒DNA混匀后，冰上放置30min，液氮速冻3-5min后立即放于37℃水浴5min，加入1ml无抗LB液体培养基，28℃，160rpm复苏3-5h后菌液均匀涂于含相应抗生素的固体培养基上。28℃倒置培养2～3d，挑单菌用PCR鉴定阳性克隆。

1.2.4原生质体转化及瞬时表达观察亚细胞定位

(1)小提中量试剂盒提取质粒DNA(提取方法参考天根小提中量试剂盒质粒提取方法)

(2)拟南芥原生质体制备

a)取未抽苔的幼嫩拟南芥叶片，将叶片切为0.5mm-1mm大小，弃去叶尖和叶柄。

b)将碎叶浸10ml酶解液中，暗培养3-4h，直至原生质体完全解离。

c)镜检检验酶解效果。

d)200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中，让液体沿着管壁慢慢滑下，移液器使用的枪头应剪切尖头，避免吸取过程中原生质体破裂。

e)低速100g离心1min，弃上清，收集原生质体；

f)用等体积预冷的W5液体培养基重悬原生质体，100g离心1min，弃去上清(重复一次)。

g)等体积预冷的W5液体重悬原生质体，冰上放置30min。

h)100g离心1min，收集原生质体，1/10体积MMg液体重悬原生质体。

(3)PEG转化原生质体

a)2ml离心管中依次加入10μl质粒DNA(10-20μg)，100μl上述原生质体，轻轻弹动管壁，充分混匀后加入110μl PEG-4000溶液。混合物室温静置30min。

b)加入440μl W5液体培养基，充分混匀。

c)低速100g离心1min，弃去上清，，收集原生质体。

d)加入500μl W5液体，100g离心1min，收集原生质体，重复一次。

e)1ml W5液体培养基重悬原生质体后加入到细胞培养板中，25℃避光培养18-20h。

f)100g离心1min，然后仅留下100μl液体悬浮原生质体，其余上清液体弃去，使用激光共聚焦显微镜成像保存。

1.2.5拟南芥遗传转化及表型观察

(1)农杆菌的准备

1)将含有目的载体的农杆菌(GV3101：：pMP90RK)接种于LB(含有相应抗生素)液体培养基；28℃，180-210rpm过夜培养；

2)吸取500μl菌液涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上，28℃培养过夜。

3)30ml YEB液体培养基刮起并重悬菌斑，重悬液用含有5％蔗糖和0.01％Silwet-L77的水溶液稀释到120ml，用于拟南芥转化。

(2)拟南芥的转化

1)长日照下生长的拟南芥种，剪掉抽苔后第一个花序；一周左右待更多花蕾露出时可用于转化；

2)农杆菌转化液浸泡花蕾10-20s。将已转化植株用黑色塑料袋罩住避光、保湿，16-24h后掀开塑料袋；

3)视植株生长情况，待下一批花蕾出现(两周后)，可进行第二次转化。精心照看转化后的植株，收种子用于转化阳性植株的筛选。

(3)筛选与初步鉴定拟南芥转化后代

转化后收到的种子为T1代，均匀播种于土中，7-10d后子叶完全张开，此时即可喷洒1∶1000的BASTA，5-7d后喷第二次。一周左右非转化植株全部萎蔫死亡，此时的植株即为转基因T2代植株，同时可通过提取DNA、PCR检测，来对T1代转基因植株进行初步鉴定。单株收获T2代种子。

(4)拟南芥开花时间与叶片的统计

种子置于含浸湿滤纸的培养皿中，4℃黑暗处理3-4d，然后播于土上，三周左右留下生长一致且长势较好的苗。将对照和待检测的苗种置于同样的条件下生长，每个株系确保有10-40个单株。统计从种植到开花时的开花时间和莲座叶片数的平均值和标准差。

2.结果与分析

2.1大豆CIB基因的克隆

根据拟南芥CIB1序列，在大豆基因组网站进行Blast分析，发现大豆CIB基因家族中共有12个成员(表5)，其中GmCIB1、GmCIB2、GmCIB3、GmCIB11与拟南芥CIB1的同源性较高，推测它们可能与CIB1有类似的功能。而其他成员在拟南芥中的同源基因均属于bHLH家族。目前共克隆到了9个GmCIB基因。

2.2大豆CIB基因的染色体定位

根据网站http：//www.phytozome.net提供的大豆基因组相关信息绘制12个GmCIB基因在染色体上定位模式图(图1)。12个基因分布在大豆的11条染色体上，除GmCIB2和GmCIB8共同分布在4号染色体上，且物理距离很近。其他10个基因均分布在不同的染色体上。从每个基因在染色体上的分布位置看，这12个基因大都分布在染色体的长臂上，只有GmCIB5、GmCIB9、GmCIB10位于染色体短臂上。

2.3大豆CIB基因同源性及保守位点分析

2.3.1同源性分析

在拟南芥中CIB1和CIB5调控开花。基因的同源性分析发现(图2)，大豆CIB基因与拟南芥CIB1、CIB5的同源性大都在30％以上。GmCIB1、GmCIB2、GmCIB3、GmCIB11与拟南芥CIB1的同源性较高，分别为41.6％、42.1％、39.2％和39.4％，而它们与CIB5的同源性稍低于与CIB1的同源性，同源性在30％左右。GmCIB9和GmCIB10与CIB1的同源性在30％左右，而与CIB5的同源性较高，分别为51.2％和50.5％。

大豆CIB基因间同源性的高低参差不齐，如GmCIB1和GmCIB2同源性高达91％，而这两个基因与其他基因的同源性明显低于这一数值。GmCIB1除与GmCIB11的同源性较高外，与其他基因的同源性相对较低。进一步分析发现12个大豆CIB基因中分成两两基因间同源性很高6对组合，而此两基因与其他基因间的同源性比较低。这可能是因为大豆为古四倍体，长期进化选择过程中，不同来源的两个基因被保留下来形成了2个拷贝，以至于很多基因以多拷贝方式存在。

表5大豆12个CIB基因家族成员

注：a序列信息来自

Phytozome(http：//www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/soybean)b本地Blastp比对拟南芥蛋白质数据库。

2.3.2保守位点分析

拟南芥CIB1是典型的bHLH家族基因，含有保守的bHLH结构域，对大豆CIB家族的保守结构域分析发现(图3)，所有基因都含有bHLH结构域，且含有与拟南芥相同的氨基酸保守位点，Basic碱性区典型的色氨酸Try(R)[除GmCIB8为丝氨酸Ser(S)]，Helix螺旋区的亮氨酸Leu(L)，Loop噜噗环中的脯氨酸Pro(P)。从功能上看，拟南芥bHLH结构域参与到与DNA的相互作用，通过与启动区的顺式作用元件结合来调控下游目标靶基因的表达。大豆的CIB家族含有如此保守的bHLH结构域，是否也参与到与DNA顺式作用元件的结合，目前还不清楚。

进一步对保守序列的同源性进行分析发现，GmCIB1和GmCIB8在进化的最外分支，GmCIB1/2/3/11，GmCIB4/6/12以及GmCIB9/10分别聚为一类。虽然基因的保守结构域的保守位点几乎一致，但是其他氨基酸的同源性很低可能是在长期进化过程中，不同的选择压力而造成的功能分化。

2.4大豆CIB基因的基因结构

拟南芥CIB1编码区结构的显示，从功能上可将基因分为N端和C端，N端含有一段核定位信号(NLS)参与到基因的入核定位以及蛋白间的相互作用，C端的bHLH结构域可以与DNA结合(作用元件)，调控下游靶基因的表达。大豆CIB基因编码区结构与CIB1类似，bHLH结构域也位于基因的C端。

基因组结构分析显示，大豆CIB基因组的保守性比较低，这是因为各个基因组结构组成复杂。图4显示每个基因都含有不同数目的外显子和内含子，且都含有不同长度的5’UTR。除GmCIB1/2/3/11含有3’UTR外其他基因没有，这刚好与此四个基因在进化上比较近相吻合。从外显子和内含子的数目上看，GmCIB1/4/5/6均含有7个外显子和6个内含子，其中GmCIB4/5/6每个相对应的外显子和内含子的长度差别不是很大。GmCI1/8/11均含有6个外显子和5个内含子，而GmCIB8的第五个内含子长度是所有基因中最长的。GmCIB12所含外显子数目最多有12个，而GmCIB9所含内含子数目最多有9个。

2.5大豆CIB基因的亚细胞定位

为了初步确定大豆CIB基因在细胞内的定位，构建了大豆CIB基因与黄色荧光蛋白(YFP)融合的表达载体，利用拟南芥叶肉细胞进行原生质体转化，对已克隆的GmCIB蛋白的亚细胞定位进行分析。结果显示(图5)除GmCIB6和GmCIB7蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，其他GmCIB蛋白均定位于细胞核内。

2.6大豆CIB基因的表达模式分析

2.6.1大豆CIB基因在不同组织器官的表达模式表达

利用大豆在单叶期、开花期和结荚期的20个不同组织器官对大豆CIB基因家族中的9个基因的表达情况进行分析。结果显示(图6)大豆CIB基因在不同组织器官的表达各异。GmCIB1、GmCIB2、GmCIB3的表达模式相似，在单叶期后期和开花期早期的组织器官中表达量较高，而在单叶期早期和开花期后期组织器官中的表达量较低。这三个基因在单叶期和开花期的单叶中表达量都很高，此外GmCIB1和GmCIB2在开花期的第二复叶，GmCIB1开花期的第一复叶中的表达量也很高。其他6个基因的mRNA表达分析显示，它们在开花后期和结荚时期的组织器官中的表达量较高。GmCIB5/6/7/8/9在花器官中的表达量都相对较高，GmCIB7在开花期的第二复叶高表达，GmCIB4和GmCIB5结荚后期表达量很高，而在成熟种子中表达量剧减，可能该基因不参与种子的后成熟。与此相反，GmCIB6/7/8/9在结荚后期表达量很低，而在成熟种子中表达量剧增，可能这些基因种子的后成熟有关。该推论的科学论证还需进一步探索。

表6大豆不同组织器官的样品

2.6.2大豆CIB基因在不同发育时期的表达模式

表7大豆不同发育时期的样品

大豆CIB基因在不同发育时期的表达模式各异(图7)，从所有基因的整体表达模式看，大豆CIB基因中除GmCIB2外，其他基因地上部分的表达量都较低，表达量较高时期主要集中在复叶时期，个别基因(GmCIB1)在单叶期也有很高的表达量。单个基因的表达水平显示，GmCIB6的整体表达较低，而GmCIB8的整体表达水平较高。GmCIB1/3/4/7在第三复叶刚张开时的表达量很高，GmCIB1在各个发育时期的单叶中都有表达。进一步分析发现GmCIB4和GmCIB7发育时期表达模式类似，除在第三复叶开始张开到第四复叶开始张开期间表达很高外，其他时期的表达都很低。GmCIB5和GmCIB9在果荚发育阶段的表达模式相反，GmCIB5的表达量随着果荚发育而不断增加但在种子成熟期表达剧减，而GmCIB9在果荚刚开始发育时表达量达到较高水平，随着果荚的发育其表达量不断减低，但在成熟种子该基因的表达量剧增。这样的表达模式可能与基因在发育时期所行使的功能有关。

2.6.3大豆CIB基因的光周期表达模式

大豆CIB光周期表达模式所涉及到的样品取材如下：垦农18(KN18)幼苗分别种植于长日(LD)和短日条件下(SD)，样品为刚展开的单叶，刚开灯时刻开始取样，每间隔2h取样，各取24个时间点(48h)。随后将幼苗分别转移至连续光照(SD-LL/LD-LL)和连续黑暗(SD-DD/LD-DD)条件下，每间隔2h取样，各取24个时间点(48h)。各组样品用于GmCIBs光周期表达分析，结果显示(图8)GmCIBs的光周期表达差异很大。GmCIB1(图8a)SD和LD条件下的表达模式不同，SD条件下，基因表达呈现周期节律变化，开灯后基因表达呈现下降趋势，进入黑暗时基因的表达还处于低水平表达，在亮灯前4小时基因表达峰值出现。转入连续光照后，基因的表达周期节律改变，出现多个表达峰值。而转入连续黑暗时，其周期节律整体模式变化不大，但基因的表达峰值向后推迟了两小时。LD条件下，GmCIB1的表达没有明显的光周期节律。

图8b显示了GmCIB2在SD和LD条件下的光周期表达情况，LD条件下GmCIB2表达没有明显的周期节律现象。而在SD条件下GmCIB2在开灯后表达量逐渐降低，在进入黑暗时其表达量达到最低，随后基因的表达逐渐增加，在开灯前4小时基因的表达达到最高。当从SD转入LL时基因表达整体水平有所下降，虽然表达峰值出现的时刻没有变化，但其幅度明显下降。而从SD转入DD时基因整体表达水平大幅提高，基因表达的峰值也被覆盖。可进一步推测，GmCIB2的表达在SD条件下受光周期的调控，同时还受到光的抑制作用。

GmCIB1的光周期表达模式在SD和LD条件下相类似，开灯后基因表达有稍短时间的降低，6小时后(即正午时刻)基因表达逐渐增加，熄灯后6小时基因表达达到最高，随后表达量剧减。

分别转入LL时，基因表达的峰值消失了，基因表达维持在中高等水平。而当转入DD时，基因的表达量明显降低。以上现象说明，GmCIB1的mRNA表达受光的正调控。

GmCIB4的光周期表达模式分析显示(图8d)，该基因在LD有明显的昼夜周期节律，关灯后6小时该基因的表达量最高，而其它时间其表达量相对较低。当转入LL后表达模式几乎没有改变，转/入DD后表达峰值推迟2h出现。SD条件下基因表达在亮灯6小时后达到最高，随后呈降低趋势。但转入LL时基因的表达明显增加，而在DD条件下基因一直处于较低的表达水平。可能SD下，光周期调控强度大于植物体内的生物钟调控，并且光照促进该基因的转录水平。而在LD条件下，该基因的生物钟调控起主导作用。

图8e显示在SD条件下，GmCIB5的表达量在光照4h后出现表达的峰值。转入LL条件下该基因量有不同程度的增加，但表达峰值消失。而在DD条件下，基因的表达水平明显降低。LD条件下，GmCIB5的表达量在亮灯后有个短时间(2h)的降低，随后随着光照时间的增加其表达量不断增加，光照6h后其表达量达到最高。推测该基因的表达主要受光周期的调控，且受光的正调控。

GmCIB6的表达模式(图8f)与GmCIB5相似，光周期调控占主导地位。在SD和LD下，该基因均呈现明显的昼夜节律。而在LL和DD下这种节律被打破，呈现出LL条件下基因表达水平整体大幅度提高，而在DD条件下基因表达显著降低。

GmCIB7的表达分析显示(图8g)，该基因在SD和LD均没有明显的生物钟或光周期节律。当转入LL后，随着光照时间的增加其表达量不断升到，虽然有个表达剧减时刻，但随后其表达又快速增加。而在DD条件下，该基因的表达明显减低且一直维持在很低的表达水平。以上结果表明该基因不受生物钟的调控，光照可能调控其转录水平。

由图8h可以看出，在SD和LD条件下GmCIB8有明显生物钟节律。SD下随着光照的到来表达量不断升高，在关灯后2h，表达峰值出现，随后表达量剧减，在开灯前4h，表达量降到低谷。LD条件下，光照后6h基因表达量达到最高，随后表达逐渐降低，开灯前6h表达量最低。LL和DD条件下这种节律现象消失，并且在LL条件下基因的整体表达水平有较大幅度的提高，而在DD条件下则维持在较低水平。

GmCIB9的表达结果显示(图8i)，该基因的生物钟节律和光周期均没有明显的规律，可能在基因表达过程中这两调控作用复杂的交织在一起共同起作用，或者该基因的表达受到更复杂的调控机制的控制。

2.6.4不同纬度来源大豆品种中GmCIB基因家族的表达模式

选取纬度不同的11个栽培大豆品种，分别种植在SD和LD的温室中，分别取M、N、E三个时刻的样品，用于GmCIBs基因的在不同品种中的表达分析。结果显示(图9)，GmCIBs基因在不同品种中的表达模式随着纬度的变化各不相同。在高纬度分布的品种(40°-50°)，无论在SD还是LD下GmCIB1表达有先增加再降低的趋势(图9a)，即在中午时刻(N)表达量最高。在低纬度品种(25°-30°)，SD条件下基因的表达呈下降趋势，而LD下表达量逐渐增加。

SD条件下，不同品种中GmCIB2表达模式大体相同，除CN13、TF31、ZD31外，其他品种中该基因一天中的表达呈现先增加后降低的趋势，在正午时刻达到峰值。而在LD条件下，几乎呈现相反的表达模式，在高纬品种(HH27、SN14)中，基因的表达在中午时刻达到谷值，在傍晚时刻表达量最高。随着纬度的降低，基因的表达自接受光照后持续增加，在傍晚时刻也达到最高。可见LD条件下，GmCIB2在KN18，CN13，TF31中自开灯后表达持续降低，而在其他品种几乎都呈现持续增加的趋势。

GmCIB1基因在不同品种的表达模式分析显示(图9b)，随着纬度的增加，其表达量的峰值不断前移，纬度38°-50°分布的栽培品种中，SD和LD条件下在傍晚时刻GmCIB1的转录水平最高。在ZD31和ZC3中，SD和LD下基因的表达模式刚好相反，短日照下基因表达呈现先增长，在正午时刻达到峰值，随后表达量逐渐降低，而在长日照呈现先降低在增加的趋势。在两个较低纬度品种FD1、GZ2中，基因表达不受光周期影响，表达模式几乎相同，随着光照时间的增加其表达量不断上升，在正午时刻表达量最高。

从图9b可以看出，GmCIB4基因在高纬度分布的栽培品种的表达，不受光周期的影响，在HH27、SN14、KN18中其表达呈现光照后持续增长趋势，在关灯前半小时到达表达峰值。随着纬度的降低，基因表达峰值不断前移，在正午时刻(N)到达，随后表达量逐渐降低。而在靠近赤道的品种(FD1和GZ2)，LD条件下其表达先有个下降趋势，在正午时刻(N)达到低谷，随后表达逐渐增加。而SD条件下，低纬度(ZC3、FD1和GZ2)品种表达模式类似于高纬度品种，其表达量持续增加。

图9c显示，LD条件下，GmCIB5基因在低纬度(25°-31°)栽培品种中(GZ2外)的表达，在光照期间持续增加，在即将进入黑暗时达到最高。这一趋势与其在SD条件下的表达模式类似。其他品种中GmCIB5基因(分布于中高纬度)在LD环境下的表达呈现先增加后降低的模式。SD和LD条件下，各个品种中GmCIB6基因的表达峰值大都在熄灯前，但增长的趋势有所不同，高纬度品种自开灯后GmCIB6基因的表达持续增长，随着纬度的降低，该基因的转录水平随着光照时间的增加而逐渐降低，达到低谷后又逐渐增加。

GmCIB7和GmCIB8基因在各品种的表达模式分析表明(图9d)，LD条件下两基因的表达模式大致相同，随着光照时间的增加表达量逐渐增加，在正午时刻(N)达到峰值。SD条件下GmCIB7基因在高纬度和低纬度分布的品种中也表现出上述表达模式，GmCIB8基因则表现出表达持续增加的趋势，在进入黑暗前(E)表达量最高。

GmCIB9基因表达分析显示该基因表达峰值随着纬度的降低而不断前移，并且SD条件下的移动速度快于LD条件。SD条件下，GmCIB9基因在高纬度分布的品种经过先降低再增加的表达模式，在进入黑暗前达到峰值。随着纬度的递减其表达呈先增长后降低的趋势，在正午时刻(N)达到最高值。而在较低纬度分布的品种中(FD1和GZ2)其表达持续降低。LD条件下，在低纬度品种(FD1和GZ2)中GmCIB9基因在正午时刻达到峰值，随着品种纬度分布的增加其表达不断增加，在熄灯前表达量达到最高。

2.7大豆CIB基因过表达在拟南芥中的表型分析

将大豆GmCIBs分别构建到35S植物过表达载体(pLeela)上，分别转化拟南芥并对其功能进行分析。经Basta筛选得到了GmCIB1/4/5/6/85个基因拟南芥过表达转基因植株。将筛选到的转基因植株分别种植在SD和LD条件下，进一步观察分析表型。GmCIB1过表达拟南芥在SD和LD均表现出早花表型(图10)。开花时间和叶片数统计显示，在SD和LD条件下，转基因植株开花时间明显早于野生型，叶片数也少于野生型。对过表达植株中(LD)的GmCIB1和AtFT的mRNA表达水平检测结果显示，转基因植株中GmCIB1基因过表达，AtFT的表达量明显高于野生型。暗示了GmCIB1基因的过表达促进了AtFT的表达，从而使植物提前开花。GmCIB3在拟南芥中的功能也与拟南芥CIB1功能相同。但其在大豆是否也有类似的功能呢，将在下面具体讨论。同样，GmCIB4/5/6/8四个基因分别过表达在拟南芥中，在SD和LD条件下均能促进拟南芥提前开花(图10)，开花时间早于野生型，莲座叶数目也明显减少，说明这四个基因在拟南芥也起到开花调控的作用。但它们在大豆中的功能，目前还不清楚。

3.讨论

3.1大豆CIB基因家族的克隆

本实验通过生物信息学同源比对在大豆中确定了CIB基因家族中的12个成员，最先预测到了前9个GmCIBs基因，随着大豆基因组序列的不断公布，随后又预测到了GmCIB10/11/12三个基因。本实验基于时间与转化材料的原因最先克隆了前9个GmCIBs基因。克隆所用模板是大豆垦农18(KN18)主要组织器官cDNA的混合物，这就避免了基因在不同组织中的表达差异造成的基因克隆困难。克隆的9个GmCIBs基因的编码区与预测的序列吻合，分别将基因构建到植物过表达载体、YFP融合的亚细胞定位表达载体，以及酵母双杂交等载体上，以期对这些基因的体内外功能进行研究。

3.2大豆CIB基因家族的基因结构

通过生物信息学工具和一些生物学软件对大豆CIB基因家族成员进行较详尽的生物信息学分析。染色体定位显示除GmCIB2和GmCIB8共同分布在同一染色体(chr.4)上，其他10个基因分布在不同的染色体上。虽然GmCIB2和GmCIB8在同一染色体上的物理距离很近，但两者的同源性并不高，仅达到27.3%，推测可能是长期进化中，选择压力造成的同源基因的功能分化。

12个GmCIB成员间，形成两基因间同源性很高的6对基因组合，同源性最高的达到93.0％(GmCIB9和GmCIB10)，最低的也到达了80.1％(GmCIB7和GmCIB8)。从染色体分布上看，同源性较高的两基因均位于不同染色体上，这可能因为大豆为古四倍体，不同来源的两个基因经过长期进化分化过程被保留下来，从而形成了2个拷贝，这些位于不同染色体上且同源较高的成对基因恰恰支持了这一论断。

GmCIB同源基因在功能上是否存在冗余，目前还未有报道。从进化角度考虑，重复基因受长期的进化选择压的影响可能向不同的方向演化，比如：功能的丧失(假基因)、功能弱化(表达降低，功能减弱)、功能获得(分化出新的功能)和功能细化(不同基因拷贝功能细化并调控同一过程)。对大豆CIB基因家族成员的时空表达模式进行分析将有助于了解在它们在大豆中行使的功能。

拟南芥CIB1是典型的bHLH蛋白，含有典型的bHLH保守结构域。大豆CIB基因家族保守性结构域分析表明，每个成员均含有保守性较高的bHLH结构域。拟南芥CIB1的研究显示，bHLH基序可以通过与FT基因启动区的E-box(CANNTG)结合，促进FT的mRNA表达水平，从而启动植物的开花(Liu等，2008)。GmCIB家族拥有如此保守的结构域，其功能是否和CIB1相似，这也是我们感兴趣的问题。拟南芥CIB1基因的N端和C端在的功能不同，N端含有一段核定位信号，与基因的入核以及蛋白-蛋白的相互作用有关。基因的C端含有bHLH结构域参与与DNA的结合。GmCIB家族基因的编码区结构预测与拟南芥CIB1类似，bHLH保守结构域也位于基因的C端。对GmCIB家族成员的保守结构域同源性分析发现，各基因间的结构域同源性与基因编码氨基酸全长同源性间稍有差异，这可能是除保守氨基酸外其他氨基酸不同所致。这可能也是长期进化过程中，植物体为适应不同的选择压而形成的同源基因的功能分化。

基因组结构分析显示，GmCIB家族基因成员都含有不同数目和长度的外显子和内含子，以及不同长度的UTR。复杂的基因组结构可能也会产生不同的基因转录后修饰，同时伴随着不同的基因功能。

3.3大豆CIB基因家族的表达模式

亚细胞定位分析看出，虽然GmCIB为转录因子但亚细胞定位并不仅仅是位于细胞核内，GmCIB6和GmCIB7蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，暗示了它们可能在细胞质内也能行使功能。

GmCIBs不同组织器官的时空表达分析显示各成员在不同组织器官的表达各异，表达模式也比较复杂。整体上看大部分基因在开花时期的器官中表达量较高，推测可能这一家族基因在大豆开花调控中起到一定的作用。目前研究显示拟南芥CIB1主要功能是调控植物开花，可为以上推测提供理论依据。GmCIBs中有些基因在单叶期的组织器官中也有较高的表达，如GmCIB1/2/3/9在刚刚张开的单叶中表达量很高，可能这些基因除有开花调控的作用，可能还参与到其他调控途径中。

大豆CIB基因不同发育时期表达模式综合分析看，除GmCIB2外，其他基因地上部分的表达量都较低，大部分基因表达量较高时期主要集中在营养生长后期，生殖生长初期阶段即开花期，这表明这些基因可能参与到大豆的开花调控。但是也有些基因在生殖生长初期阶段如单叶时期也有很高的表达量，GmCIB1在单叶期和开花初期的表达量都很高，而在发育中间阶段表达量却很低。可能该基因在营养生长和生殖生长的初级阶段均起到重要的调控作用，对发育调控起到双重作用。而GmCIB6的整体表达水平都很低，可能该基因对发育调控中的作用很小，或者是受某种信号诱导表达的基因。

光周期和生物钟分析显示，GmCIB家族成员中这两种表达模式较为复杂。总体上看大部分基因受光周期和生物钟共同调控，只是两种调控机制所占主导地位不同。纵观所有成员，GmCIB4在长日照条件的表达有明显的生物钟节律，而在短日照下，生物钟节律明显受到光周期调控拮抗，当转入连续光照是基因整体表达水平调高而在连续黑暗条件下基因一直维持在很低的表达水平。暗示了该基因在LD和SD条件下的调控机制有差异，这也可能由于大豆是严格的短日照植物，在两种光照条件迥异的条件下可能有不同的调控机制。虽然光周期和生物钟共同调控着基因的表达，对各成员的进一步分析发现，大部分基因(除GmCIB1和GmCIB9外)在SD和LD条件下，都有明显或不很明显生物钟节律，在一天的表达中都有峰值和谷值出现，转入LL和DD后生物钟节律被消减，而光周期调控占主导地位，LL条件下基因的整体表达水平提高，基因在DD条件下一直维持这较低的表达水平。GmCIB2例外，在LL条件下该基因表达明显受到抑制，而在DD条件下表达量相对较高，说明GmCIB2的表达受光照的抑制。

不同纬度来源大豆品种中GmCIBs表达模式显示，基因的表达模式与纬度间未发现明确的相关性。整体分析表明，不同纬度来源的品种中，无论在SD或LD环境下基因的表达都有随光照时间的增加逐渐增加的趋势，在增加过程中，有些基因在某些品种基因的表达在正午时刻(N)达到峰值后而逐渐降低，而有些会持续增加一直到黑暗来临(E)前达到峰值。很少一部分基因的表达呈现逐渐降低的模式。

3.4大豆CIB基因家族在拟南芥中的表型

将克隆到的GmCIBs构建过表达植物表达载体转化拟南芥，对得到的转基因植株进行表型分析。在长日和短日条件下，过表达GmCIB1/4/5/6/8的转基因拟南芥表现出早开花表型，与拟南芥CIB1的功能类似。在过表达GmCIB1的转基因植株中对下游靶基因AtFT表达水平检测显示，AtFT的表达水平明显高于野生型，说明外源GmCIB1的表达可提高AtFT的转录水平从而促进植物早开花。虽然GmCIB1在拟南芥中的功能与CIB1相似，但是大豆是典型的短日照植物，而拟南芥是长日照植物，两者的调控机理有可能不同，所以需进行大豆遗传转化进一步研究GmCIB基因在大豆中的功能。

4.小结

大豆中预测了12个拟南芥CIB1的同源基因，共克隆到了9个GmCIBs，通过对所预测基因的生物信息学分析，对克隆到的基因在不同组织器官和发育时期的mRNA的时空表达模式，生物钟和/或光周期以及在不同维度来源大豆品种中的mRNA表达模式进行分析，亚细胞定位，并将基因过表达拟南芥对基因功能进行初步分析。得到的主要结论如下：

大豆CIB基因家族成员共有12个，分别位于11条不同的染色体上(GmCIB2和GmCIB8分布在同一染色体)。同源性分析显示，家族成员共分成6对，每对基因间的同源性很高，但与其他成员间的同源性较低，且成对的基因均位于不同染色体上，可能与大豆是古四倍体以及长期的进化选择有关。

大豆CIB基因都有保守的bHLH结构域。各成员的基因组结构比较复杂，都含有不同数目和长度的外显子和内含子，以及不长度的UTR。

大豆CIB与YFP融合蛋白经原生质体转化瞬时表达对其亚细胞定位研究表明，所有基因都定位在细胞核内，而有个别基因(GmCIB6和GmCIB7)在细胞质中也有表达，说明这些基因的功能行使不仅仅局限于细胞核，可能也参与到细胞质中的部分功能调控。

大豆CIB基因不同组织器官的表达显示，大部分成员在开花期的组织表达较高。不同发育时期表达模式表明，大部分基因在营养生长过渡到生殖生长(即开花期)时表达量逐渐升高，推测该家族成员可能与开花调控相关。而个别基因如GmCIB1在单叶期和开花初期的表达量都很高，推测该基因可能在营养生长和生殖生长的初级阶段均起到重要的调控作用，对发育调控起到双重作用。光周期和生物钟表达模式分析显示，GmCIB基因受这两种机制的双重调控。整体上看，大部分基因(除GmCIB4外)受光周期的正调控。不同纬度来源大豆品种中GmCIBs表达模式显示，GmCIBs与纬度变化没有明显的相关性。

将克隆到的GmCIBs过表达到拟南芥中，得到的过表达GmCIB1/4/5/6/8转基因拟南芥在长日和短日条件下，均表现出早开花表型，表明这些在拟南芥中的功能与拟南芥CIB1的功能类似。

实施例2、GmCRYI&2及GmCIB1调控开花和衰老的功能研究

本研究将通过酵母双杂、BiFC以及Co-IP等手段研究GmCRYs与GmCIB1蛋白间的相互作用；进一步获得GmCRY与GmCIB1基因过表达或RNAi敲除的大豆遗传转化株系，结合转基因后代的表型分析和ChIP实验来寻找GmCIB1的下游作用靶基因，从而分析大豆中GmCRY传递蓝光信号的GmCIB信号通路，为大豆光周期和叶片衰老调控的深入研究和种质创新打下基础。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

大豆品种为垦农18，烟草品种为Nicotiana Benthamiana。

1.1.2菌株与质粒

农杆菌及大肠杆菌菌株同实施例1，酵母菌株Mav203为本实验室保存。昆虫细胞昆虫细胞sf9来自清华大学施一公实验室。

酵母双杂交载体pDEST22、pDEST32；植物表达载体pGWB11、pGWB17；BiFC载体pCCFP-X、pNYFP-X；昆虫表达载体pFASTBacHTA均由本实验室保存。

1.2方法

1.2.1大豆遗传转化与表型观察

(1)大豆遗传转化：将构建的含有目的基因的过表达载体和RNAi载体利用优化的农杆菌介导的子叶节法，转入大豆品种垦农18(KN18)中，得到纯合且可稳定遗传的转基因植株，初步研究基因的功能。

(2)转基因植株的鉴定和纯合系的获得：对于稳定遗传的转基因植株主要采取三个方法来鉴定：一是抗性分析，以上表达载体都带有除草剂筛选标记，可以用一定浓度的除草剂喷洒初步筛选到可能的转基因植株；第二，利用分子生物学方法鉴定，利用RT-PCR和Western-blot证明整合到基因组中的目的基因确实表达；第三，利用遗传学方法分析，除草剂抗性标记基因与目的基因是否共分离，目的基因在后代遗传中是否符合孟德尔规律，并筛选稳定遗传的纯合转基因植株。

(3)转基因植株的表型分析：分析稳定遗传的过表达和RNA干涉转基因植株与对照植株之间的表型差异。

1)开花时间和叶片数统计：将不同转基因植株和野生型分别种植于长日照和短日照温室内，统计开花时间以及开花时的叶片数。

2)叶片衰老差异的统计：基于在连续光照下一些转基因植株早衰现象比较明显，将不同转基因植株和野生型种植于连续光照条件下，统计子叶和单叶开始变黄、变黄以及脱落的时间。

3)总叶绿素以及叶绿素a、b含量的测定：种植于连续光照的植株，当早衰植株单叶开始变黄时，每株系分别取5片不同单叶，液氮冷冻后充分研磨样品。每样品加入500μl提取液[50mM磷酸锂pH7.2；1mM；120mM；5％(v/v)甘油；1mM PMSF；0.2％]混匀，分别取100μl加入80％丙酮，充分混匀后，置于-20℃避光放置1h，12800g离心3min。分光光度计测定663nm和646nm波长的光吸收值。利用以下公式计算叶绿素浓度：

总叶绿素含量(mg/L)＝20.2A646+8.02A663；

叶绿素a含量(mg/L)＝13.19A663-2.57A646；

叶绿素b含量(mg/L)＝22.1A646-5.269A663.

4)光合速率的测定：利用光合仪LI-6400在不同时间段测定连续光照种植的不同植株的光合速率，选择被测植株的单叶，第二复叶和第四复叶作为测定对象。

5)衰老相关基因以及开花调控相关基因表达情况分析选择连续光照下，早衰植株单叶刚刚变化时作为取材时间点，对不同转基因植株和野生型进行取材，作为衰老相关基因(GmAPGL5、GmWRKY53、GmSAGL12、GmAGL12)表达测定的模板。连续光照转为短日照三天后取第七复叶作为开花调控相关基因(GmFTs和GmTFLs)表达情况测定的模板。(RNA提取、Real-time PCR同实施例2)

1.2.2酵母双杂交

酵母双杂交实验依照Clontech手册进行。将GmCRYs与GmCIBs分别构建到酵母双杂交载体pDEST32(Bait)和pDEST22(Prey)，共转酵母菌株Mav203。用组氨酸营养缺陷实验分析GmCRYs与GmCIBs间蛋白的互作，将酵母克隆滴在三缺板上生长(-His-Trp-Leu)，一组放置在黑暗下，一组用25μmolem-2s-1蓝光照射，于28℃培养箱中生长2到3天。对蛋白互作的定量分析是采用定量β-半乳糖苷酶实验，以CPRG为显色底物。挑取酵母单克隆于二缺SD培养基(-Trp-Leu)中避光过夜培养，待OD600至1.8，用SD稀释至OD600约为0.2，再避光培养1-2h，然后分成两组，一组置于22μmolem-2s-1蓝光下，一组用锡箔纸包裹置于相同培养环境下，在0-150min内不同时间点收集酵母检测β-半乳糖苷酶活性。整个过程保持酵母生长浓度OD600在0.4-0.8之间。

1.2.3BiFC试验

将GmCRY1/GmCRY2和GmCIB1分别构建到表达载体pCCFP-X、pNYFP-X上，通过原生质体转化(方法同实施例1)，Confoal显微镜下观察GmCRY1/GmCRY2和GmCIB1相互作用情况。

1.2.4免疫印迹(western blot)

(1)免疫印迹操作流程

1)蛋白提取：收集拟南芥幼苗于1.5ml离心管中，加入20-30μL的4样品缓冲液，研磨充分后，95℃煮样5min，置冰上冷却，于最高转速离心15min。

2)SDS-PAGE分离蛋白。

3)将蛋白转移到NC膜上，用5％脱脂奶粉(溶于PBST溶液中)封闭1h。

4)加一抗常温孵育1h。

5)用PBST溶液洗膜三次，每次6min。

6)加入二抗孵育1h

7)用PBST溶液洗膜三次，每次6min。

8)加显色底物进行显影。

9)膜再杂交：用洗膜液洗膜三次，每次15min，重新用牛奶封闭，加入第二种抗体。

(2)溶液配制

1)凝胶储液：Acrylamide29.2g，Bisacrylamide0.8g，加ddH2O定容至100mL，滤纸过滤后于4℃保存。

2)1.5M Tris-HCl缓冲液，pH8.8

称量36.3g Tris-base于70mL ddH2O中，用HCl调pH值至8.8，加ddH2O定容至100mL，高压灭菌，室温保存。

3)0.5M Tris-HCl缓冲液，pH6.8

称量6g Tris-base于70mL ddH2O中，用HCl调pH值至6.8，加ddH2O定容至100mL，高压灭菌，室温保存。

4)10％SDS

称量10g SDS，用ddH2O定容至100ml，高压灭菌，室温保存。

5)10％AP

称量0.1g Ammonium Persulfate，用ddH2O定容至1mL，于-20℃保存。

6)10％的分离胶(5mL)

7)4％的浓缩胶(2mL)

8)10x蛋白电泳液(1000mL)

30g Tris，144g Glycine，10g SDS，加ddH2O定容至1000mL。

9)10x转膜液(1000mL)

30g Tris，144g Glycine，加ddH2O定容至1000mL。

10)1x转膜液(1000mL)

100ml10转膜液，700ml ddH2O，200mL甲醇。

11)10x PBS(1000mL)

80g NaCl，2g KH2PO4，2g KCl，21.4g Na2HPO.7H O。

12)1x PBST

100mL10PBS，1mL Tween20，加ddH2O定容至1000mL。

13)洗膜液(1000mL)

15g Glycine，用HCl调pH值为2.5，加ddH2O定容至1000mL。

14)样品缓冲液

25.2g Glycerol，0.02g Bromophenol Blue，4g SDS，20ml1MTris-HCl pH6.8，3.1g DTT，加ddH2O定容至50mL，分装后于-20℃保存。1.2.5GmCRY1&2和GmCIB1蛋白的体外表达和纯化

重组的His-GmCRY1，His-GmCRY2，His-GmCIB1-Flag蛋白是通过昆虫细胞sf9细胞系表达。GmCRY1，GmCRY2和GmCIB1-Flag编码区序列通过EcoRI和XhoI酶切分别连接到pFASTBacHTA载体，通过重组Bacmid DNA介导转化昆虫细胞sf9。构建与转化过程参照Invitrogen Bacto B ac Baculovirus Expression System。

蛋白纯化：离心收集病毒侵染细胞(3000g，10min)，重悬于xB溶液(500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.8，0.5％Triton X100，4.8mMβ-ME，1mM PMSF add fresh)，冰浴30min，超声破碎(SONICS&MATERIALS.INC，Model VC505)直至细胞溶液不再粘稠，随后超速离心(45000g，60min，4℃)，收集上清并用0.22μm的过滤膜过滤。用Ni-NTA(Invitrogen)镍柱吸附目的蛋白，透析并浓缩(Amicon Concentrator30KD cut off)。

1.2.6体外蛋白与蛋白的相互作用

体外GmCRY1&GmCRY2与GmCIB1的相互作用：

1)将昆虫细胞表达的GmCRY1、GmCRY2和GmCIB1-Flag的细胞裂解。将GmCRY1和GmCRY2的细胞裂解液分别与GmCIB1-Flag的细胞裂解液混合。

2)裂解后的细胞高速离心去沉淀，并用0.22μm的过滤器过滤上清。

3)用BCA Protein Assay System(Pierce)测定裂解液浓度。

4)用XB缓冲液将细胞裂解液稀释到1μg蛋白/μL。

5)分别取1mL GmCRY1、GmCIB1-Flag裂解液混合液和GmCRY2、GmCIB1-Flag裂解液混合液与20μLprotein-A/G agarose孵育1h，去除裂解液中与protein-A/G agarose非特异性结合的蛋白。

6)将连接了Flag抗体的protein-A/G agarose溶液分别加入到GmCRY1-GmCIB1和GmCRY2-GmCIB1混合裂解液中，置于冰上，在黑暗或蓝光(22μmolem-2s-1)下处理不同时间(10min，30min，60min，120min)。

7)1000g，3min，4℃，收集Agarose，用冰浴的WB2缓冲液(500mMNaCl，50mM Tris-HCl pH7.8，0.1％Triton X100，1mM PMSF)洗4次。

8)将Agarose beads重悬于30μL2样品缓冲液中，95℃煮10min。取10μl用SDS-PAGE分离，并用Western Blot检测目标蛋白。取0.2％的Input作为对照。用GmCRY1和GmCRY2的抗体分别检测GmCRY1和GmCRY2，用Flag的抗体检测GmCIB1。

1.2.7体内蛋白与蛋白的相互作用

(1)大豆体内蛋白相互作用的检测

大豆垦农18和35S：：YFPGmCIB1过表达转基因植株分别种植在短日照下三周左右。植株转移到黑暗条件下18h后蓝光(B，22μmol m-2s-1)处理，处理时间为D，0min；B30，30min；B60，60min；B120，120min。不同的处理时间分别取材，样品剪成细条用MG132避光处理3-4h，液氮冷冻用于免疫共沉淀试验。总蛋白提取物(Input)和偶联anti-GFP抗体凝胶柱拖下的产物(GFP-IP)利用anti-YFP抗体进行免疫杂交，随后该ECL膜用stripping buffer将anti-YFP抗体洗掉，用anti-GmCRY2或anti-GmCRY1抗体重新免疫结合。

(2)烟草瞬时表达检测蛋白-蛋白相互作用

1)挑取含有目的表达载体(pGWB11-GmCIB1、pGWB17-GmCRY2)的农杆菌于3-5mL LB培养基(+50mg/L Kana+50mg/L Rif)，250rpm，28℃振荡培养过夜(16h)。OD600＝1-2

2)以1；500-1∶1000转接至新鲜LB培养基(+10mM MES+20uM AS+50mg/L Kana+50mg/L Rif)，250rpm，28℃振荡培养过夜(16h)。OD600＝1

3)4000rpm离心10mmin，去上清

4)周infiltration buffer(10mM MES，150uM AS，10mM MgCl2)重悬菌体(可先用菌液一半体积的infiltration buffer重悬)。测量重悬液OD600的数值。

5)infiltration buffer调整pGWB11-GmCIB1与pGWB17-GmCRY2重悬液至OD600＝1.5，P19重悬液至OD600＝1。

6)等体积混合各菌液(也可先分开静置，注射前再混合)，在室温静置重悬液3小时以上(但不要太长时间，建议不要超过6小时)。

7)烟草准备：在注射前一天可以把烟草从培养室拿出来，放在楼上实验室，因为在培养室的烟草叶片含水量高，菌液很难渗透注射进去。所选择注射的叶片要完全伸展，靠近顶端的叶片最好，太嫩不好注射，太老活力不强。

8)在叶片背面用针头扎一个小孔，用去了针头的注射器对准小口，另一只手用手指隔着叶片轻轻堵住针筒和小孔(力度需要自己体会，太重了菌液推不出来，太轻了菌液推不进去，经验是用食指侧面比较好用)，推动活塞，把菌液注射进叶片，直至水渍满了整个叶片(如果叶片较大，扎2-4个小孔)。在叶柄上贴上标签。

9)注射完的烟草要注意保湿，温室放置一天后移至黑暗放置两天后，部分材料蓝光(B，22μmol m-2s-1)处理2h，黑暗和蓝光处理的材料分别取材，迅速用液氮冷冻，用于免疫共沉淀。

1.2.8DNA-binding试验

(1)材料的准备：

1)64bp dsDNA：合成序列中间含有16bp随机核酸序列的64bpssDNA。

Random5’-TGGAGAAGAGGAGAGTGGGCNNNNNNNNNN

Binding-F NNNNNNCTCTTTTGCATTCTTCTTCGATTCCGGG-3’

Random5’-CCCGGAATCGAAGAAGAATGCAAAAGAGNNN

Binding-R NNNNNNNNNNNNNGCCCACTCTCCTCTTCTCCA-3’

RBingF5’-TGGAGAAGAGGAGAGTGGGC-3’

RBingR5’-CCCGGAATCGAAGAAGAATGCAAAAGAG-3’

2)Protein：昆虫细胞表达His-GmCIB1

3)5x DNA结合缓冲液：

(2)试验程序：

1)dsDNA的合成：50μl PCR反应体系中等量混合RBSS-F和RBSS-R(200pmole)。PCR仪中进行以下反应：100℃2min；慢慢降温到45℃，保持10min；72℃10min。

2)昆虫细胞表达His-GmCIB1，利用Ni-NTA(Invitrogen)镍柱吸附目的蛋白，得到偶联His-GmCIB1beads，SDS PAGE检测蛋白量。

3)DNA结合：0.5ml离心管中加入

5μl DNA随机片段(步骤1或6)

5μl His-GmCIB1beads(10μg蛋白)

2.5μl 5x DNA结合缓冲液

室温反应10min。(注：不含有目的蛋白的beads作为阴性对照)

4)500μl1x DNA结合缓冲液漂洗beads，2000rpm，4℃离心，弃上清。重复洗5遍。

5)洗脱beads结合的DNA：加入10μl含有10mM还原型谷胱甘肽的50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液洗脱beads，轻轻混匀10min，2000rpm，4℃离心，将上清液转移到一新管中。

6)以洗脱得到的DNA片段为模板，以F/R为引物进行PCR扩增。

反应程序为：94℃30s，40℃1min，72℃20s；94℃30s，60℃10s，72℃10s，30个循环。

7)2.5％琼脂糖凝胶检测PCR产物。

8)重复步骤3到7，五次，直至PCR产物的量足够多，即20个循环就能检测到PCR产物。

(第三轮PCR产物出现拖尾现象，此时应减少循环数和缩短延伸时间)。第三轮PCR程序：94℃30s，40℃1min，72℃20s；94℃30s，60℃10s，72℃6s，22个循环；第四轮PCR程序：94℃30s，40℃1min，72℃20s；94℃30s，60℃10s，72℃5s，20个循环；第五到七轮PCR程序：94℃30s，40℃1min，72℃20s；94℃30s，60℃10s，72℃3s，18个循环。

9)最后一轮PCR产物连接到克隆载体上(TA cloning kit)，连接产物转化大肠杆菌DH5α。

10)经蓝白斑筛选，挑取白斑进行测序分析。

1.2.9ChIP试验

(1)交联：

1)大豆野生型和种植于35S：：YFPGmCIB1过表达转基因植株分别种植在短日照下三周左右。暗处放置18h后，蓝光(B，22μmol m-2s-1)处理2h，分别取4g蓝光和黑暗条件下的幼叶。

2)将所取的幼叶剪成细条放于50ml三角瓶中，分别加入37ml交联液，室温真空泵内交联10-15min。(交联后的叶片呈透明状)

3)交联的三角瓶中加入2.5ml2M的甘氨酸(终浓度为100mM)，室温抽真空泵5min来终止交联反应。

(2)染色体的分离与超声处理：

4)交联后的样品用无菌水洗三次，尽量吸干叶片表面后迅速用液氮冷冻。

5)充分研磨样品，确保样品在研磨过程中处于冷冻状态。

6)研磨后的样品装入50ml离心管中，25ml预冷的细胞核提取液重悬。

7)快速振荡样品，直至充分混匀，期间样品保持冰上放置。

8)四层纱布过滤后的重悬液，11000g，4℃离心20min。这是将会看到管底部有紧密的灰白色的颗粒。

9)弃上清，2ml预冷的核裂解液重悬灰白色颗粒(即细胞核)。(每个样品取出5μl用于与超声后的片段作对照)。

10)将得到的样品分成四份，每离心管中500μl。超声处理将DNA剪切成500bp左右的片段。超声处理的程序为：超声强度为25%，每超声15s停30s，共超声5次，样品保持冰上放置。

11)超声后样品，13800g，4℃离心10min。

12)将同一样品的上清液(共四管)集合至一起。分别取出5μl与步骤9中对应的样品进行电泳，1％琼脂糖凝胶，100-120V,电泳30min。紫外下观察，若超声后的样品在200-1000bp出现模糊拖尾样的条带，且在500bp左右较集中，说明DNA样品超声效果比较好。反之，超声效果不佳，要进一步优化超声条件。

(3)免疫沉淀：

13)取100μl超声处理的染色体样品用裂解液稀释十倍成1ml。

14)稀释后的样品中分别加入50μl预平衡的salmon sperm DNA/protein Aagarose beads，4℃轻轻翻转孵育1h，去样品中与salmon sperm DNA/protein A agarosebeads非特异性结合的DNA片段。

15)3，800g，4℃离心2min，弃去agarose beads。

16)上清液中加入5μl适当的抗体(anti-GFP)，4℃轻轻翻转孵育过夜。

17)向(16)中的反应液中加入80μl预平衡的salmon sperm DNA/protein Aagarose beads，4℃继续孵育2h。

18)3，800g，4℃离心2rmn，弃去上清，收集结合染色体的agarose beads。

19)Agarose beads的清洗，分别加入1ml以下缓冲液，4℃轻轻翻转混匀5min，3，800g，4℃离心2min，弃上清。清洗所用缓冲液的顺序为：低盐漂洗液漂洗一次，高盐漂洗液漂洗一次，LiCl漂洗液漂洗一次，TE缓冲液漂洗两次。

20)250μl新配制的洗脱缓冲液加入到含有agarose beads的离心管中，室温轻轻翻转15min，将免疫结合复合体从agarose beads洗脱下来。

21)3，800g，4℃离心2min，将上清液转移到一新的离心管中。

22)再加入250μl新配制的洗脱缓冲液到(21)步中含有agarose beads的离心管中，室温轻轻翻转30min，再次洗脱免疫结合复合体，3，800g，4℃离心2min。

23)将21)和22)步骤中两次洗脱液混合共500μl。与此同时，50μl超声后的染色体片段(来自于步骤12)加入450μl洗脱缓冲液作为input(阳性对照)。

(4)去交联和蛋白质消化：

24)去交联反应：向步骤23中的每个样品中加入20μl5M NaCl，65℃孵育过夜。

25)蛋白质的消化：各样品中依次加入：10μl0.5M EDTA，20μl1M Tris-HCl(pH6.5)，1μl proteinaseK(20mg ml-1)，45℃孵育1.5h。

(5)DNA沉淀：

26)加入等体积(550μl)的酚/氯仿/异戊醇，轻轻翻转混匀。

27)13,800g，4℃离心15min，将上清液转入到一新的2ml离心管中。

28)依次加入：2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，4μl糖原(20mg ml-1)，-80℃沉淀DNA过夜。

29)13,800g，4℃离心15min。

30)弃上清，500μl70％乙醇漂洗沉淀。13，800g，4℃离心10min。

31)弃上清，室温干燥沉淀。

32)50μl TE缓冲液溶解DNA，-80℃保存备用。

(6)Real-time PCR：

33)实时荧光定量PCR采用Roch480进行，利用LightCycler480SYBR Green IMaster检测荧光信号

34)利用基因特异引物进行PCR检测，本实验所涉及的基因为：GmFT3、CmFT4、GmTFL1、GmTFL3、GmWRKY53。

35)反应体系为15μl：

反应程序为：

Stage1：热启动95℃5min(20℃/s)。

Stage2：PCR反应95℃5s(20℃/s)，55℃10s(20℃/s)，72℃30s(20℃/s)，45Cycles。基因相对表达量的计算采用％Input方法计算

(7)溶液配制：

1)交联缓冲液：0.4M蔗糖，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM PMSF，1mM EDTA，1％formaldehyde，现用现配

2)细胞核解离缓冲液：0.25M蔗糖，15mM PIPES(pH6.8)，5mMMgCl2，60mM KCl，15mMNaCl，1mM CaCl2，0.9％TritonX-100，2mgml-1pepstain A，2mgml-1aprotinin，4℃保存。

3)细胞核裂解缓冲液：50mM HEPES(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF，1％SDS，0.1％Na deoxycholate，1％Triton X-100，1mg ml-1pepstain A，1mg ml-1aprotinin

4)洗脱缓冲液：0.5％SDS，0.1M NaHCO3

5)低盐漂洗缓冲液：150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH8，0.2％SDS，0.5％Triton X-100，2mM EDTA，4℃保存。

6)高盐漂洗缓冲液：500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH8，0.2％SDS，0.5％Triton X-100，2mM EDTA.4℃保存。

7)LiCl漂洗缓冲液：0.25M LiCl，1％sodiumdeoxycholate(脱氧胆酸钠)，10mMTris-HCl pH8，1％NP-40，1mM EDTA.4℃保存。

8)TE缓冲液：1mM EDTA，10mMTris-HCl pH8，4℃保存。

9)PMSF：用甲醇配制成200mM，-20℃保存。

10)Pepstatin A：用甲醇配制成1mg ml-1，-20℃保存。

11)Aprotinin：用水配制成1mg ml-1，-20℃保存。

12)预平衡的salmon sperm DNA/protein A agarose beads：

用裂解缓冲液来平衡protein A agarose beads的方法如下：视样品的个数，分别取50μl salmon sperm DNA/protein A agarose beads于1.5ml离心管中，3，800g，4℃离心2min，弃上清。加入50μl裂解缓冲液，4℃轻轻翻转混匀2min,3,800g，4℃离心2min，弃上清，重复此步一次。50μl裂解缓冲液重悬protein agarose A。

13)EDTA：50mM

2.结果与分析

2.1GmCRYs和GmCIB1过表达或RNAi大豆转基因植株的表型

通过大豆遗传转化得到了的GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株，将野生型(WT)和各转基因植株种植在连续光照下，分别用相应的抗体对转基因植株进行western检测，结果显示过表达植株GmCRY1-OX,GmCRY2-OX和GmCIB1-OX中GmCRY1、GmCRY2和GmCIB1分别都得到表达(图12I，13G，15G)，而GmCRY2-RNAi转化植株中内源GmCRY2的明显减少(图14I)。叶片衰老表型分析显示，GmCRY1-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株，种植两周左右，子叶脱落明显早于野生型，随着植株的生长单叶逐渐变黄，且变黄的时间也早与野生型，这三个转基因株系表现出早衰的表型。而GmCRY2-OX转基因植株无论是子叶脱落还是单叶变黄都晚于野生型，说明该转基因植株的衰老被延迟。以上表型暗示了GmCRY1和GmCIB1可能促进植物衰老，而GmCRY2抑制叶片衰老的进程。

进一步分析表征叶片衰老的相关参数显示，总叶绿素含量和叶绿素a∶b测定结果显示(图16A)，GmCRY1-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株中叶绿素含量明显低于野生型WT，而叶绿素a∶b比率高于WT，因为在叶绿素降解过程中叶绿素b先转变成叶绿素a然后再进入降解途径，因此在降解过程中叶绿素a∶b比率会升高。该结果也暗示了以上三个转基因株系中叶绿素的降解速度高于野生型对照。而GmCRY2-OX转基因植株中则相反，叶绿素含量高于WT，而叶绿素a∶b比率低于WT，推测该转基因植株中叶绿素的降解被延迟。对连续光照下生长31天的植株进行光合速率的测定，分别选择第二复叶和第四复叶作为测定对象，每两天测定一次，连续测定两周，结果表明(图16B)，每个被测定株系的光合速率随着叶片生长时间的增加其光合速率逐渐降低，从光合速率降低的趋势看GmCRY1-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株中光合速率降低速度高于野生型，而GmCRY2-OX转基因植株中光合速率降低幅度小于WT。

对衰老相关基因的mRNA水平测定分析表明，在早衰表型出现的转基因植株，这些衰老相关基因的表达水平明显上升，而在GmCRY2-OX转基因植株的表达水平很低(图16C)。如拟南芥典型的衰老相关基因WRKY53、SAG12、APGL5在大豆中的同源基因GmWRYK53、GmSAGL12、GmAGL12、GmAPGL5在GmCRY2-OX转基因植株中的表达量远低于WT，而在GmCRY1-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株中的表达量远高于WT，尤其是GmWRYK53、GmSAGL12、GmAGL12三个基因的表达量高于野生型10倍左右。暗示了GmCRY1、GmCRY2和GmCIB1可能参与到植株衰老的调控。PaO基因编码叶绿素降解过程中起限速作用的一个酶(脱镁叶绿酸a加氧酶)，对大豆中的该基因的同源基因GmPaO的表达水平分析显示(图16D)，黑暗下生长12天的黄化苗分别转移到蓝光下，蓝光处理6小时，在GmCRY1-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株中该基因在黑暗中的表达量很低，随着蓝光光照时间的增加其表达量逐渐增加且远高于野生型，尤其是GmCRY2-RNAi转基因植株中在蓝光光照6小时时该基因的表达量比野生型高30倍左右。而在GmCRY2-OX转基因植株，该基因一直维持在很低的表达水平。推测蓝光可能诱导GmCRY1-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植株中GmPaO的表达，从而加速了叶片衰老的进程。而GmCRY2-OX转基因植株中GmPaO的表达被抑制，所以其叶片衰老被延迟。

在实施例1中将GmCIB1基因过表达到拟南芥中得到了提前开花的转基因拟南芥，推测GmCIB1对开花调控起重要的作用。而在GmCIB1-OX转基因大豆中却表现出晚花的表型(图17)，暗示了GmCIB1也起到了开花调控的作用，但与拟南芥CIB1的作用相反，在大豆中GmCIB1抑制开花。对其他转基因植株开花表型分析显示GmCRY1-OX和GmCRY2-RNAi转基因植株表现出早花的表型，而GmCRY2-OX转基因植株则表现出晚花。推测GmCRY1和GmCRY2在开花调控中起相反的作用，前者促进开花而后者抑制开花。对WT和转基因植株中的GmFTs和GmTFLs的mRNA的表达水平进行分析，结果显示(图18)在GmCRY1-OX和GmCRY2-RNAi转基因植株中GmFTs的表达有不同程度的提高，GmTFLs的表达水平很低。而在GmCIB1-OX和GmCRY2-OX转基因株系中GmTFLs的mRNA水平明显上升，而GmFTs的表达量明显低于WT。进一步论证了GmCRY1可促进大豆开花，而GmCRY2和GmCIB1对开花起到负调控作用。

GmCRY1过表达叶片早衰表型结果参见图12。

GmCRY2过表达叶片晚衰表型结果参见图13。

GmCRY2-RNAi过表达叶片早衰表型结果参见图14。

GmCIB1过表达叶片早衰表型结果参见图15。

叶片衰老相关参数分析结果参见图16。

GmCRYs和GmCIB1对大豆开花时间的调控的结果参见图17。

GmFTs和GmTFLs在不同基因型中mRNA表达水平参见图18。

2.2GmCRYs和GmCIB1间蛋白-蛋白相互作用的分析

2.2.1酵母双杂交试验分析GmCRYs和GmCIB1间蛋白-蛋白相互作用

拟南芥中的研究表明CRY2与CIB1有蓝光依赖的相互作用，大豆中的CRYs与CIBs是否也有类似的相互作用呢？我们首先通过酵母双杂交实验来检测GmCRYs和GmCIBs间的相互作用。将AtCRY2、GmCRY1和GmCRY2分别构建到载体pDEST32(Bait)上，GmCIBs分别构建到pDEST22(Prey)上，分别共转化酵母细胞，在(-His，-Trp，-Leu)缺陷型培养基，黑暗和蓝光(22μmol m-2s-1)条件下进行筛选。从图19A-C看出GmCRY2和GmCIB1在蓝光下有相互作用，AtCRY2与GmCIB1/4/8均有蓝光特异的相互作用。β-半乳糖苷酶活性检测显示(图19D)含有GmCRY2和GmCIB1的酵母细胞在蓝光下有很高的β-半乳糖苷酶活性，进一步表明GmCRY2与GmCIB1有蓝光特异的相互作用。

GmCRYs-GmCIBs间蛋白的相互作用参见图19。

GmCRY2-GmCIB1间蛋白的相互作用参见图20。

GmCRY1&2不同的结构域(PHR结构域和CCT结构域)与GmCIB1间的相互作用参见图21和22。

GmCIB1不同的结构域与GmCRY1&2间的相互作用参见图23。

通过酵母双杂交、BiFC对GmCRY1/2与GmCIB1间的蛋白相互作用进行了分析，体内试验进行一步验证显示(图24)，烟草瞬时表达(图20F)显示，GmCRY2与GmCIB1在烟草体内有蓝光依赖的相互作用。利用GmCIB1-OX过表达植株进行Pull down试验，结果显示GmCRY1和GmCRY2在大豆体内均能和GmCIB1有蓝光特异的相互作用，且这种相互作用随着光照时间的增加，作用强度不断增强，光照两小时时相互作用强度最强。酵母细胞内GmCRY1仅有N端的PHR区能够与GmCIB1互作，而在体内GmCRY1全长能够与GmCIB1在蓝光下互作，推测GmCRY1在酵母和植物体可能形成不同的结构，因此产生不同的作用方式。

2.2.3体外昆虫细胞表达系统Pull down试验分析GmCRYs与GmCIB1的蛋白相互作用

利用昆虫表达系统，分别表达了GmCRYs与GmCIB1-Flag蛋白，体外Pull down试验结果显示(图25)，GmCRY1、GmCRY2与GmCIB1均有蓝光依赖的蛋白相互作用，作用强度随着光照时间的增加不断增强。与GmCRY2相比，GmCRY1与GmCIB1间作用强度较低。本实验所用的蛋白为GmCRY1全长蛋白，在酵母体内GmCRY1全长不能与GmCIB1互作，而在大豆体内两者能够相互作用，推测在不同的物种GmCRY1的蛋白结构可能有差异，从而导致了起作用方式的改变。

2.3GmCIB1蛋白DNA结合位点检测

GmCIB1蛋白与DNA的体外相互作用结果显示，GmCIB1能够与E-box结合(图26)。但拟南芥中CIB1体外与G-box(CACGTG)结合，体内与E-box结合来调控下游靶基因的表达。推测GmCIB1在体内也可能通过与E-box结合调控靶基因的表达，但GmCIB1调控的靶基因目前还不清楚。

2.4ChIP-qPCR检测GmCIB1与衰老或开花调控相关基因的染色体间相互作用

GmCIB1过表达转基因大豆表现出早衰和晚花的表型，为了寻找GmCIB1作用的下游靶基因，来初步阐明其作用机制。首先通过ChIP-qPCR来研究GmCIB1与一些候选基因染色体区的相互作用。候选基因是选择上述所检测的基因中，mRNA表达水平变化较大的一些基因。如开花调控中的GmFT3、GmFT4、GmTFL1、GmTFL3，衰老相关的基因GmWRKY53。对实验材料进行了黑暗和蓝光处理，看是否蓝光会影响其间的相互作用。实验结果显示，无论在蓝光或黑暗下GmCIB1蛋白均能与GmFT3、GmFT4和GmWRKY53染色体区的E-box结合(图27a，27b，27e)，进一步分析发现蓝光和黑暗下结合E-box有相同的也有不同的。如GmFT3染色体区与GmCIB1结合的E-box在蓝光和黑暗下是相同的，而GmFT4中的a区是暗黑下特异结合的，而j区是蓝光下特异结合。GmWRKY53中含有两个E-box的k区与GmCIB1在蓝光下的结合能力远远高于黑暗下。而且GmCIB1所结合的这些区域不仅分布在基因启动区，在基因组中也有分布，暗示了下游靶基因的染色体结构决定了转录因子的结合位点，同时也推测GmCIB1对靶基因的调控作用不是严格的蓝光依赖性的。在GmTFL1和GmTFL3中没有检测到GmCIB1蛋白结合的区域(图27c，27d)，说明GmCIB1可能对二者没有调控作用。

3.讨论

3.1GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因植

株的表型分析

通过大豆遗传转化获得GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIBI-OX转基因大豆，对表型进行观察过程中发现，连续光照下(LL)，不同转基因植株中出现有衰老相关的表型。

在LL条件下GmCRY1-OX,GmCRY2-OX和GmCIB1-OX转基因植株表现出早衰现象，如与野生型(WT)相比子叶和单叶变黄和脱落明显提前，叶片衰老表征的参数测定显示WT还处于较高光合作用时期时，这些转基因株系中叶绿素含量剧减，光合速率也大幅度降低，同时衰老相关基因(GmWRYK53、GmSAGL12、GmAGL12、GmAPGL5)的mRNA水平也明显上升。而GmCRY2-OX转基因植株中却出现相反的表型，子叶和单叶变黄和脱落相对于WT来说明显被推迟，叶绿素含量没有明显降低，光合速率降低速度远低于WT，衰老相关基因的表达受到抑制。暗示了在叶片衰老调控过程中GmCRY1和GmCIB1起到正调控的作用，而GmCRY2可能抑制叶片的衰老。基因的表达模式从某种程度上决定了基因的功能。实施例1中对GmCIB1的mRNA的时空表达模式进行了详尽的分析，结果显示GmCIB1在单叶时期的整体表达水平相对较高，过表达GmCIB1的转基因大豆植株中，在单叶时期叶片衰老提前的表型就已显现，推测GmCIB1在单叶时期的集中表达促进了其功能的发挥。而GmCIB1的光周期表达模式分析显示，该基因的mRNA水平受光照的正调控，当在连续光照条件下(图8c的a和c)，GmCIB1的整体表达水平呈现增长趋势，这一表达模式可能与GmCIB1过表达植株在连续光照下表现出明显的早衰表型相关，基因表达模式与其功能间相关性的具体机理目前还不清楚，还需做进一步研究。

开花表型分析发现，GmCRY1-OX和GmCRY2-RNAi转基因植株表现出早花表型，而GmCRY2-OX和GmCIB1-OX转基因大豆表现出晚开花。拟南芥中FT和TFL是开花调控中两个功能相反的基因，FT是一个开花途径中的整合因子整合来自不同开花途径的信号，促进开花。而TFL1与FT的功能完全相反，是一种开花抑制因子。TFL1主要通过延迟开花途径整合基因LFY的表达，并抑制花分生组织基因AP1和CAL的表达，延长营养生长阶段，抑制成花转变，并维持花序的无限生长状态。大豆中FT的9个同源基因GmFTs在GmCRY1-OX和GmCRY2-RNAi转基因植株的表达量有不同程度的提高，而在GmCRY2-OX和GmCIB1-OX转基因大豆中的表达量都维持很低的水平。拟南芥开花抑制因子TFL1的4个同源基因GmFTs在GmCRY2-OX和GmCIB1-OX转基因植株的表达量有不同程度的提高，而在GmCRY1-OX和GmCRY2-RNAi转基因大豆中的表达量很低。以上结果显示，在开花调控中GmCRY2和GmCIB1可能起到相同的调控作用，抑制开花。而GmCRY1起到开花促进作用。在实施例1中通过将GmCIB1基因过表达在拟南芥中对其功能进行了分析，在拟南芥中该基因能够促进AtFT的mRNA表达水平从而提前开花，其表型与上述GmCIB1基因在大豆中抑制开花的结果相反，推测可能是由于物种的不同而导致了基因调控机制的不同。大豆是严格的短日照植物，而拟南芥是长日照植物，而且本研究中还得出GmCIB1的表达水平受光调控，这些因素可是导致了GmCIB1基因在拟南芥和大豆中表现出不同功能，至于具体的机制还需通过对GmCIB1基因乃至整个GmCIB基因家族的深入研究来揭示。综上所述，我们可以得出在叶片衰老调控中，GmCRY1和GmCIB1均起到促进作用，而GmCRY2起负调控。在开花调控中GmCRY1促进开花，而GmCRY2和GmCIB1抑制开花。GmCRY1和GmCRY2在这两种调控中起到完全相反的作用，二者可能在每种调控过程中起到拮抗作用。

3.2GmCRYs和GmCIB1间蛋白-蛋白的相互作用

为了更好地诠释GmCRYs和GmCIB1在大豆中的功能，对它们之间的相互作用进行了深入的研究。首先通过酵母双杂交实验筛选到GmCRY2和GmCIB1蓝光特异的相互作用，且作用强度随着蓝光光强的增强和光照时间的增加而增加，但GmCRY1全长与GmCIB1却没有相互作用。GmCRY1/2的PHR区与GmCIB1有蓝光特异的相互作用，暗示了GmCRY的PHR域是蛋白-蛋白相互作用必需的，而GmCRY1的CCT结构域可能会影响其与GmCIB1间的相互作用。对GmCIB1的结构分析显示其N端结构域也是蛋白互作必需的结构域。

体内试验，烟草瞬时表达和GmCIB1-OX转基因植株体内的Pull-down试验进一步论证了GmCRY2和GmCIB1蓝光依赖的相互作用。利用昆虫蛋白表达系统分别表达的GmCRY1、GmCRY2和GmCIB1蛋白而进行的Pull-down试验也得出相同的结果。而GmCRY1和GmCIB1间的相互作用较有意思，虽然全长GmCRY1在酵母和烟草中不能与GmCIB1蛋白互作，但在大豆体内二者有蓝光依赖的相互作用。昆虫表达的GmCRY1与GmCIB1蛋白在蓝光下也有较弱的互作。推测GmCRY1在酵母、昆虫和植物体可能形成不同的结构，影响蛋白间的相互作用。

3.3GmCIB1与衰老或开花调控相关基因的染色体间相互作用

拟南芥CIB1在体外与E-box(CANNTG)中的G-box(CACGTG)结合，体内与FT启动子区的E-box结合来调控开花。GmCIB1与DNA相互作用的体外试验结果显示GmCIB1可与E-box结合，ChIP试验表明GmCIB1与拟南芥FT的同源基因GmFT3和GmFT4染色体区的E-box结合，也能与衰老相关基因WRYK53的同源基因GmWRYK53启动子区核基因组内的E-box结合，并且这种结合没有严格的蓝光特异性。而开花抑制基因TFL的同源基因GmTFL1和GmTFL3没有检测出结合区域。推测GmCIB1在大豆体内可能通过负调控GmFT的表达抑制开花，促进衰老相关基因如GmWRYK53的转录进而促进叶片衰老。

4.小结

利用农杆菌介导的子叶节转化方法获得GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因大豆，分别对转基因植株进行表型分析；利用酵母双杂交、BiFC以及免疫共沉淀等手段研究了GmCRYs和GmCIB1将的相互作用；分析了GmCIB1与DNA体外相互作用的位点，并通过ChIP试验初步筛选鉴定GmCIB1的下游作用靶基因。主要得到以下结论：

GmCRY1-OX,GmCRY2-OX,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因大豆表型分析结果表明，在连续光照下，过表达GmCRY2导致植株叶片衰老延迟，而在GmCRY1-OX，,GmCRY2-RNAi和GmCIB1-OX转基因大豆出现叶片提前衰老的表型，初步推测GmCRY1和GmCIB1在叶片衰老调控过程中起到正调控的作用，而GmCRY2可能抑制叶片的衰老。

过表达GmCRY1和GmCRY2敲除转基因大豆表现出提前开花，而过表达GmCRY2、GmCIB1则导致大豆晚开花，暗示了GmCRY1促进开花，而GmCRY2和GmCIB1负调控大豆开花。酵母双杂交和BiFC试验表明，GmCRY2和GmCIB1有蓝光特异的相互作用，且这种相互作用随着光强的增强和光照时间的增加而增强。GmCRY1和GmCRY2的PHR结构域参与和GmCIB1蓝光依赖的相互作用。体内(GmCIB1-OX转基因大豆)和体外(昆虫蛋白表达系统)Pull-down试验进一步验证了GmCRY1/GmCRY2与GmCIB1间蓝光依赖的相互作用。

GmCIB1与DNA体外的相互作用结果显示GmCIB1与E-box结合，ChIP试验显示，GmCIB1与拟南芥FT的同源基因GmFT3和GmFT4染色体区的E-box结合，也能与衰老相关基因WRYK53的同源基因GmWRYK53启动子区核基因组内的E-box结合，并且这种结合没有严格的蓝光特异性，推测GmCIB1在大豆体内可能通过负调控GmFT的表达抑制开花，促进衰老相关基因如GmWRYK53的转录进而促进叶片衰老。

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Claims (11)

1.一种分离的基因在调控植物叶片衰老和/或开花中的用途，其中所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的序列或其互补序列，其中所述植物是拟南芥或大豆。

2.权利要求1所述的用途，其中所述基因包含于DNA分子，该DNA分子具有GmCIB1基因的生物学功能。

3.权利要求1所述的用途，其中所述基因包含于重组载体。

4.权利要求2所述的用途，其中所述DNA分子包含于重组载体。

5.一种分离的蛋白质在调控植物叶片衰老和/或开花中的用途，其中所述蛋白质的氨基酸序列是：

(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(2)由权利要求1所述的基因编码的序列；其中所述植物是拟南芥或大豆。

6.一种培育转基因植物的方法，包括将一种分离的基因引入目的植物以获得转基因植物，从而调控所述转基因植物的叶片衰老和/或开花，其中所述基因的核苷酸序列是SEQ IDNO：1所示的序列或其互补序列；其中所述转基因植物是拟南芥或大豆。

7.如权利要求6所述的方法，进一步包括获得所述转基因植物的种子。

8.一种调控植物叶片衰老的方法，包括将一种分离的基因引入所述植物中以使其在植物中表达，其中所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的序列或其互补序列；其中所述植物是拟南芥或大豆。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述基因包含于重组载体。

10.一种调控植物开花的方法，包括将一种分离的基因引入所述植物中以使其在植物中表达，其中所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的序列或其互补序列；其中所述植物是拟南芥或大豆。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述基因包含于重组载体。