CN104328127B - 茎瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茎瘤芥来源的抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用。本发明抗逆基因BjEFh1，其碱基序列如SEQ ID NO.1；本发明所构建的重组植物表达载体pCAMBIA1302‑BjEFh1是由SEQ ID NO.1序列连入植物表达载体pCAMBIA1302构成；所述植物表达载体用于植物遗传转化，BjEFh1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成BjEFh1蛋白，从而提高植物耐逆境能力。

Description

茎瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及茎瘤芥来源的抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用。

背景技术

高盐、干旱和低温等非生物胁迫对作物的产量及生长发育有很大影响，因此，有关植物抗逆性的研究一直是植物学研究领域的热点之一。

茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)，又称青菜头，是十字花科芸薹属植物，为榨菜的主要原料，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。多年来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才陆续有生物学方面研究的报道，包括基因的克隆、功能研究以及茎瘤芥瘤状茎膨大相关研究，企图通过基因工程方法提高茎瘤芥的产量、质量以及抗病性、抗逆性等。

钙离子信号在许多细胞活动，如细胞代谢、基因表达、细胞骨架动态变化、细胞周期、细胞死亡、信号传导等过程中有重要作用。

在植物细胞中，钙离子的作用之一是作为第二信使，很多外界环境信号，如光、生物胁迫、非生物胁迫、植物激素等都会刺激胞液中Ca²⁺浓度的增加，从而引发钙离子信号传导。钙离子信号传导途径中首先响应的即是能结合Ca²⁺的钙结合蛋白，其结合Ca²⁺以后会发生构想变化，使疏水面外露，从而激活或抑制其它蛋白的活性，从而引发信号传导。具报道，钙结合蛋白包括钙调素、类钙调蛋白、钙依赖蛋白激酶等，其中对钙调素功能研究的报道最多；但对类钙调蛋白、钙依赖蛋白激酶的功能研究较少，其分子机理研究更少报道。

本发明克隆了一个茎瘤芥基因BjEFh1，由于其含有1对EF-hand(简称EFh)结构域，而EFh结构域通常是可能结合钙离子的结构基序，目前报道的钙结合蛋白中，通常具有1-3对EFh结构域，因此推测本发明克隆的茎瘤芥抗逆基因BjEFh1为钙结合蛋白家族基因。

发明内容

鉴于此，本发明的目的之一是提供茎瘤芥抗逆基因BjEFh1，该基因全长821bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；通过NCBI的ORF工具检测知其最大开放阅读框570bp，如SEQ ID NO.1所示；因此，其5’端非编码区有88bp，3’端非编码区有163bp。

本发明的目的之二是提供茎瘤芥抗逆基因蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，有189个氨基酸，且序列通过NCBI的保守结构域(conserved domains)检测知具有1对EF-hand结构域。

本发明的目的之三是提供茎瘤芥抗逆基因BjEFh1的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1，其由SEQ ID NO.1序列连入植物表达载体pCAMBIA1302构成。

本发明的目的之四是提供茎瘤芥抗逆基因BjEFh1在提高植物耐逆境特性中的应用，尤其是提高植物在高盐条件的耐受力。

本发明通过茎瘤芥转录组测序获得序列片段SEQ ID NO.4，然后根据片段SEQ IDNO.4设计巢式引物并通过RACE方法扩增获得茎瘤芥抗逆基因BjEFh1，基因编码189个氨基酸，NCBI比对预测具有1对EF-hand结构域，推测属于钙结合蛋白家族成员；通过构建BjEFh1基因植物表达载体，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制耐逆境新种质，提高植物的逆境耐受力特性，尤其是耐盐特性，可进行植物品种改良。

附图说明

图1为本发明BjEFh1基因编码区序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1的构建流程图；

图3为本发明T1代转BjEFh1基因拟南芥在含潮霉素(25mg/L)的MS培养基上的筛选摄影图；

图4为本发明转基因型拟南芥和野生型中的BjEFh1基因表达水平检测图；

图5为本发明正常条件下野生型与转基因型拟南芥发芽率的统计图；

图6为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥发芽率的统计图；

图7为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥根的长度统计图；

图8为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥根的生长对比摄影图；

图9为本发明NaCl条件下转BjEFh1基因拟南芥和野生型拟南芥耐盐能力对比摄影图；

图10为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥的存活率统计图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

实验例1：茎瘤芥抗逆基因BjEFh1的克隆

1主要试剂：柱式小量植物总RNA抽提试剂盒(W7021)购自上海华舜生物技术有限公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；5’-Full RACE Kit试剂盒、M-MLV反转录酶、Premix Ex Taq、DL2000DNA Marker、pMD19-T载体均购自大连宝生物工程有限公司。

2实验方法与步骤

BjEFh1基因序列片段SEQ ID NO.4的获取：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA，总RNA取小部分通过紫外分光光度计检测OD260/OD280的比值为1.93，通过琼脂糖凝胶电泳28S的亮度约是18S的2倍，说明RNA的纯度高且无降解，达到实验要求。将总RNA样品送北京华大基因研究中心进行转录组测序(RNA-seq)，方法为用带有Oligo(dT)的磁珠富集茎瘤芥总RNA中的mRNA，加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒(Qiagen公司)纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库(200bp)用IlluminaHiSeq^TM2000进行测序。通过对测序结果进行注释，选取可能的钙结合蛋白片段序列SEQ IDNO.4，然后根据该片段序列进行基因全长的克隆以及功能分析。

2.1BjEFh1基因5’端未知序列扩增

2.1.1总RNA提取和反转录：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA，然后取约1μg总RNA通过5’-Full RACE Kit试剂盒方法去磷酸化、去帽子、加接头，最后反转录获得cDNA第一链。

2.1.2引物设计：根据转录组测序得到的已知序列SEQ ID NO.4设计两个反向巢式引物：

BjEFh1-AOUT：5'-TGGTGCTGGAGAAGAGGC-3'

BjEFh1-AIN：5'-GAAACCCATCTGCCAAAC-3'

2.1.3巢式PCR扩增

首先为OUT扩增：以步骤2.1.1中cDNA第一链为模板，采用引物BjEFh1-AOUT和5’RACE Outer Primer(此引物为5’-Full RACE Kit试剂盒中的引物)做PCR扩增，反应体系为：ddH₂O 7.4μL，Premix Ex Taq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、53℃30s、72℃40s，30个循环；72℃延伸10min。

再做IN扩增：以OUT扩增的PCR产物为模板，采用引物BjEFh1-AIN和5’RACE InnerPrimer(此引物也为5’-Full RACE Kit试剂盒中的引物)做PCR扩增。20μL反应体系为：ddH₂O 7.4μL，Premix Ex Taq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、52℃30s、72℃30s，32个循环；72℃延伸10min。

2.1.4电泳：将IN扩增的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳在200bp左右有一特异条带。

2.1.5TA克隆：将IN扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.1.6测序结果：测序获得的序列的3’端序列与SEQ ID NO.4的5’端序列完全吻合，两者成功拼接，说明成功获得BjEFh1基因的5’端序列。

2.2BjEFh1基因3’端未知序列扩增

2.2.1总RNA提取和反转录：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA，然后取约1μg总RNA为模板，采用接头引物5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30MN-3'(N＝A,G,C或T；M＝A,G或C)(此接头引物来自Clontech公司的SMART RACE cDNA Synthesis Kit试剂盒)以及M-MLV反转录酶反转获得cDNA第一链。

2.2.2引物设计：根据转录组测序得到的已知序列SEQ ID NO.4设计两个正向巢式引物：

BjEFh1-SOUT：5'-CTCACTTTCTTGGCTCTGTTCA-3'

BjEFh1-SIN：5'-TCGGGTTTGGCAGATGGGTT-3'

2.2.3巢式PCR扩增：

首先为OUT扩增：以步骤2.2.1中cDNA第一链为模板，采用引物BjEFh1-SOUT和3’RACE Primer(此引物为步骤2.2.1中接头引物的前部分，即5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3')做PCR扩增，20μL反应体系为：ddH₂O 7.4μL，Premix ExTaq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、54℃30s、72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

再做IN扩增：以OUT扩增的PCR产物为模板，采用引物BjEFh1-SIN和3’RACE Primer做PCR扩增。20μL反应体系为：ddH₂O 7.4μL，Premix Ex Taq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、60℃30s、72℃60s，32个循环；72℃延伸10min。

2.2.4电泳：将IN扩增的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳在700bp左右有一特异条带。

2.2.5TA克隆：将IN扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.2.6测序结果：测序获得的序列的5’端序列与SEQ ID NO.4的3’端序列完全吻合，两者成功拼接，说明成功获得BjEFh1基因的3’端序列。

2.3BjEFh1基因编码区序列扩增

2.3.1序列拼接：将2.1.6获得的5’端序列、2.2.6获得的3’端序列和已知序列SEQID NO.4进行拼接，得到BjEFh1基因全长序列SEQ ID NO.2，其全长821bp，编码区即SEQ IDNO.1序列有570bp，5’端非编码区有88bp，3’端非编码区有163bp。为进一步验证拼接的全长是否为真实的全长序列，于是从5’端和3’端的非编码区设计引物进行PCR验证。

2.3.2引物设计：根据2.3.1的序列SEQ ID NO.2，从两端的非编码区设计一对上下游引物：

上游引物BjEFh1-F：5'-CCTCTACAACGCATTACTTAGTT-3'

下游引物BjEFh1-R：5'-TAAACATAAACAATGTCATTCCA-3'

2.3.3全长序列的PCR扩增：以步骤2.2.1中cDNA第一链为模板，采用引物BjEFh1-F和BjEFh1-R做PCR扩增。20μL反应体系为：ddH₂O 7.4μL，Premix Ex Taq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、58℃30s、72℃1min，32个循环；72℃延伸10min。

2.3.4电泳：将2.3.3扩增的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳发现特异条带如图1所示，M为DL2000，1为扩增条带，可见在700bp左右有一特异条带，与预期结果相符。

2.3.5TA克隆：将2.3.3中的扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将重组阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.3.6测序结果：测序获得的序列与拼接序列的相应片段完全一致，说明成功获得BjEFh1基因。BjEFh1基因编码的蛋白含有189个氨基酸，如SEQ ID NO.3序列所示，在NCBI上进行保守结构域预测其含有1对EF-hand基序，EF-hand基序可能具有结合钙离子的能力，因此预测BjEFh1基因为钙结合蛋白家族基因。

实验例2：茎瘤芥抗逆基因BjEFh1的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1的构建

1主要试剂：普通质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶Bgl II和BstE II购自大连宝生物工程有限公司；含质粒pCAMBIA1302的菌种由本实验室保存。

2重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1的构建

2.1引物设计：根据BjEFh1基因的编码区序列SEQ ID NO.1设计上下游引物，并分别引入酶切位点Bgl II(AGATCT)和BstE II(GGTAACC)序列，引物为：

上游引物BjEFh1-Bgl：5’-AGATCTATGGAGAAGAGCTTATTG-3’

下游引物BjEFh1-Bst：5’-GGTTACCTTAGCAGAAGCTACTC-3’

2.2PCR扩增：以实验例1中步骤2.2.1中cDNA第一链为模板，引物BjEFh1-Bgl和BjEFh1-Bst做PCR扩增：体系为ddH₂O 7.4μL，Premix Ex Taq 10μL，模板1μL，上下游引物各0.8μL。PCR程序为：94℃3min，94℃30s、58℃30s、72℃40s，32个循环；72℃延伸10min。

2.3电泳：将2.2扩增的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳在600bp左右有一特异条带，与预期结果相符。

2.4TA克隆获得重组载体pMD19-T-BjEFh1：将2.2中的扩增做3个20μL反应体系，电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至pMD19-T载体得重组载体pMD19-T-BjEFh1，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选，将含重组载体pMD19-T-BjEFh1的阳性DH5α菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2.5测序结果：与预期结果完全一致。

2.6重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1的构建：构建方法如图2所示，将2.4含重组载体pMD19-T-BjEFh1的阳性DH5α菌液扩大培养，并采用普通质粒提取试剂盒的方法提取菌液中的重组质粒pMD19-T-BjEFh1；将实验室保存的含有植物表达质粒pCAMBIA1302的DH5α菌种扩大培养，并用同样的方法提取质粒pCAMBIA1302。用Bgl II和BstE II双酶切质粒pMD19-T-BjEFh1和质粒pCAMBIA1302，参照酶的说明书两种质粒各做2个50μL酶切体系。酶切后电泳，并切下pMD19-T-BjEFh1质粒的小片段和pCAMBIA1302质粒的大片段，利用胶回收试剂盒回收。用T4DNA连接酶连接小片段和大片段(连接体系为：小片段7μL，大片段1μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA Ligase Buffer 1μL)至少24小时，然后利用热击法转化大肠杆菌感受态DH5α；PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1及含该重组表达载体的大肠杆菌。

2.7pCAMBIA1302-BjEFh1重组质粒转化农杆菌：从2.6中含pCAMBIA1302-BjEFh1载体的菌株中提取重组质粒，用液氮冷激法转化根瘤农杆菌GV3101，方法为：①200μL根瘤农杆菌GV3101感受态细胞中加入2μg(5-10μL)重组质粒DNA，冰浴5min，然后转至液氮中冷冻8min；②迅速与37℃水浴中温浴5min后，加入800μLLB液体培养基③28℃﹑250rpm预培养4-5h，然后涂布于含有Kan(50mg/L)﹑Gent(50mg/L)的LB平板，28℃培育24-28小时后可出现菌落；④挑取菌体做菌体PCR鉴定，确定正确后保存于-70℃，即为植物遗传转化的工程菌株。

实验例3：拟南芥的遗传转化

1主要试剂：荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM Kit购自大连宝生物工程有限公司；柱式小量植物总RNA抽提试剂盒W7021，购自上海华舜生物技术有限公司；DNA酶购自Promega公司。

2拟南芥的培养及农杆菌侵染实验

①取野生型拟南芥种子，用75％乙醇消毒1min后无菌水清洗；再用5％NaClO灭菌10min，无菌水清洗5次，去尽NaClO残留液。加一定量无菌水，于4℃条件下春化3-4天；

②将春化3-4天的拟南芥种子在MS空白培养基上光照培养7天，待长出幼苗，移栽至蛭石培养基(蛭石：营养土：珍珠岩＝3：1：1)，1/2MS液体培养基浇灌；

③待植物培养至初生花序10-15cm，次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序；培养至可进行侵染实验；

④将实验例2步骤2.7中制备好的已转化pCAMBIA1302-BjEFh1质粒的农杆菌菌液扩大培养，即在转化前1天晚上转入大瓶过夜培养；至菌液浓度为OD600＝2.0；离心，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于约3倍体积的渗透培养液中，使OD600在0.8左右；

⑤将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染5分钟；用保鲜膜将侵染过的植物(T0代植物)罩起来以保持湿度，置培养箱中黑暗培养12小时后正常条件培养；2-3天揭去保鲜膜，7天后可浇水；并定期侵染几次；

⑥继续培养至植物成熟，收种子(T1代种子)。

MS培养基由大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素等按一定比例组成。MS培养基作为目前使用最广的离体细胞培养基，由于其中无机盐浓度较高，为外植体的生长提供了足够的矿质营养并能使愈伤组织加速生长。为便于溶液配制及减小误差，先按大量元素、微量元素、铁盐、有机物质配制一定体积的母液。待用时再按一定比例稀释混合。

3拟南芥转基因纯合体的筛选

T1代种子经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培养基上，至人工气候培养箱中培养，观察幼苗(T1代植物)的生长状况。10-12天后明显可以观察到非转基因拟南芥只能长出2片子叶、没有真叶、根非常短，而转基因拟南芥长出2-4片真叶、根长，于是将转基因苗移栽至蛭石培养基中，成熟后分别收取各个转基因苗种子(T2代种子)。如图3所示，为T1代种子在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培养基上播种20天后，可以观察到非转基因拟南芥植株最多只能长出2片子叶且白化死亡；T1代转基因拟南芥植株则生长正常。将收获的T2代种子经消毒、灭菌和春化处理后又均匀地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培养基上，抗性苗(转基因苗)与非抗性苗(非转基因苗)的数量比约为3:1的，再将抗性苗(T2代植物)移栽至蛭石培养基中，成熟后分别收取各个转基因苗种子(T3代种子)。取各个T2代植物的小部分T3代种子，经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培养基上，若全为抗性苗(转基因苗)的即为纯合体，则相应的T3代种子可以用于后续实验，相应的T2代植物为纯合体。

随机选取纯合体T2代植物5株，分别命名为TL1、TL2、TL3、TL4和TL5，采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取各株植物叶片的总RNA，经DNA酶去除DNA，根据定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM Kit说明书操作检测各个转基因拟南芥中的BjEFh1基因的表达量，BjEFh1基因的引物为：

上游引物：5’-CCTCTTCTCCAGCACCATCAAC-3’

下游引物：5’-ATAACCATCGCTGCGTCTTCTC-3’，

内参基因为拟南芥18S基因，其引物为：

上游引物：5’-CGT CCC TGC CCT TTG TAC AC-3’

下游引物：5’-CGA ACA CTT CAC CGG ATC ATT-3’，

定量PCR结果如图4所示，横坐标TL1至TL5表示随机选取的5株转基因拟南芥植株，WT表示野生型拟南芥，纵坐标表示BjEFh1基因的相对表达量，知TL2和TL4表达量相对较高，于是选取TL2和TL4的T3代种子用于后续实验，TL2和TL4的T3代种子及其发芽后生长的植株均简称为转基因TL2和转基因TL4。

实验例4：转BjEFh1基因拟南芥的逆境反应实验

将转基因TL2、TL4种子和野生型种子各50颗，经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在正常的MS培养基上，至人工气候培养箱中培养，观察发芽率情况，重复3次该实验后统计，如图5所示，转基因型和野生型没有明显差异，播种后第一天发芽率均在50％左右，第二天则全部发芽。同样，将转基因TL2、TL4种子和野生型种子经消毒、灭菌和春化处理后分别均匀地涂布在含100mM NaCl的MS培养基上，观察发芽率情况，统计结果如图6所示，在含100mM NaCl的MS培养基上，野生型则不如转基因型种子发芽率高，播种后1天，野生型种子无发芽，转基因型均有小部分发芽，播种后第2-5天野生型发芽率均不如转基因型。由此说明BjEFh1基因有助于提高植物在盐胁迫下的发芽率，即提高了植物的抗逆性。

另外，当转基因TL2、TL4种子和野生型种子在正常的MS培养基和含100mM NaCl的MS培养基上生长15天后观察并统计野生型和转基因型拟南芥根的生长状态。经观察、对比和统计，如图7和图8所示，在正常的MS培养基上，野生型和转基因型拟南芥的根的生长无明显差别；但在含NaCl的MS培养基上，根的生长均受到抑制，但野生型比转基因型受抑制更严重。根短直接影响植物的营养吸收，从而影响植物的生长状况，由此说明BjEFh1基因的超表达有助于植物在高盐下根的生长，即提高了植物的抗逆性。

实施例5：转BjEFh1基因拟南芥苗耐盐性检测

将野生型WT种子和转基因型种子TL2、TL4经消毒、灭菌和春化处理后播种到正常的MS固体培养基上生长，于23℃培养至长出3-4片真叶后移栽至蛭石中继续生长，1/2液体培养基浇灌。当生长至3周大小时，用150mmol/L NaCl溶液喷洒野生型和转基因型拟南芥苗各个部位各20株，5天后观察、比较生长状况。如图9所示，野生型植株明显较转基因型植株萎蔫，说明BjEFh1基因可以提高拟南芥的耐盐能力。

实施例6：盐胁迫下BjEFh1基因对拟南芥的存活率的影响

将野生型WT种子和转基因型TL2、TL4种子各100颗经消毒、灭菌和春化处理后均匀地涂布在含300mM的NaCl的MS培养基上生长2周后移栽至无盐胁迫的蛭石中继续培养使恢复生长，12天后观察仍然存活的植株数量(植株全部白化被认为死亡)，重复3次该实验后进行统计，结果如图10所示，高盐胁迫生长2周后于正常状态下培养12天后，野生型植株死亡率高，存活率不到10％，而转基因型的存活率达到40％以上，具有显著性差异。说明BjEFh1基因有助于植物在高盐下的生长，即提高了植物的抗逆性。

综上所述，BjEFh1基因具有提高植物抗逆性的作用，促进植物在高盐逆境下的适应能力和生长能力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.茎瘤芥抗逆基因BjEFh1，其特征在于：其基因序列为SEQ ID NO.1。

2.茎瘤芥抗逆基因编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

3.茎瘤芥抗逆基因BjEFh1的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1，其特征在于：由权利要求1所述抗逆基因BjEFh1连入植物表达载体pCAMBIA1302构成。

4.茎瘤芥抗逆基因BjEFh1在提高植物耐逆境特性的应用，其特征在于：所述抗逆基因BjEFh的序列为SEQ ID NO.1，所述耐逆境特性为耐盐特性。