CN108624595A - 罗汉果性别基因SgACS2及其扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗汉果性别基因SgACS2，雄株系该基因序列如SEQ ID No.1所示，雌株系该基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明为罗汉果苗期性别PCR扩增检测提供了方法，同时也为罗汉果基因工程育种和利用特异多态性位点开发苗期性别鉴定新方法提供了重要的基因序列信息基础，从而实现加速罗汉果品种遗传改良进程，节约大量土地、人力和财力的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及一种罗汉果性别基因SgACS2及其扩增方法。
背景技术
罗汉果(Siraitia grosvenorii)为我国特有的葫芦科药用植物，具有润肺镇咳、润肠通便(中国药典，2010)、抗氧化(戚向阳等，2006)、降血糖(戚向阳等，2003)、抗癌(Takasaki et al，2003)等作用，是卫生部第一批列入既是药品又是食品名录的中药品种，也是广西最著名的道地药材。罗汉果活性成分甜苷V(刘婷等，2007)为世界上最强的非糖甜味物质之一，甜度为蔗糖的300-400倍(Matsumoto et al，1990)，且低热量、无毒(Jin etal，2007；Qin et al，2006)，是适宜糖尿病和肥胖症者食用的天然甜味剂。自成功打入美国市场(Rahul et al，2013)，市场需求量迅速增长。虽然组培苗成功推广应用使产业种植规模迅速扩大，但是苗期性别无法鉴定问题一直严重影响着罗汉果品种遗传改良。罗汉果通常为雌雄异花异株，由于后代群体中雌性株很少(雌、雄性别比为3︰7)，且种植时单株占地面积广、成本高，以致罗汉果杂交育种时，每种植一亩后代群体，雄性株浪费的土地和资金严重。苗期性别鉴定及早剔除无用的雄性株，从而富集雌性株，可大大提高育种效率，加速罗汉果品种遗传改良进程，节约大量土地、人力和财力。
罗汉果性别分化遗传机制未知情况下开发的现有随机多态性DNA标记(陶莉等，2005；秦新民等，2007；韦素玲等，2008；张会新等，2013)和同工酶标记(李惠敏等，2007)为非性别决定基因标记，存在与性别连锁不紧密而标记丢失问题(黄姿梅，2007)，这严重影响其苗期性别鉴定。Solexa等新一代高通量基因测序技术，具有全面、高效(1小时工作量相当于传统测序技术1个月的工作量)、廉价特点，可分析特定时空组织或器官基因的整个转录表达情况，非常便于罗汉果性别分化等基因遗传控制机制分析研究。因此，本发明以芽变两性突变体F56回交后代雄性和雌性近似等位基因系为材料，采用Solexa高通量测序技术(RNA-Seq-DEG)筛选出性别决定基因，通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和聚合酶链式反应技术(PCR)，克隆测序罗汉果性别基因SgACS2，以为罗汉果苗期性别PCR扩增检测提供了方法，同时也为罗汉果基因工程育种和利用特异多态性位点开发苗期性别鉴定新方法提供重要的基因序列信息基础，从而实现加速罗汉果品种遗传改良进程，达到节约大量土地、人力和财力的目的。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种罗汉果性别基因SgACS2及其扩增方法，其雄株系该基因序列如SEQ ID No.1所示，雌株系该基因序列如SEQ ID No.2所示，提取罗汉果基因进行扩增实验得出罗汉果雌雄株的性别基因SgACS2的不同碱基序列，有利于寻找差异多态性位点位置，为罗汉果苗期性别PCR扩增检测提供了方法，同时也为罗汉果基因工程育种和利用特异多态性位点开发苗期性别鉴定新方法提供重要的基因序列信息基础，从而实现加速罗汉果品种遗传改良进程，达到节约大量土地、人力和财力目的。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种罗汉果性别基因SgACS2，雄株系该基因序列如SEQ ID No.1所示，雌株系该基因序列如SEQ ID No.2所示。
优选的是，包括以下步骤：
步骤一、采集罗汉果现蕾茎段，利用核酸纯化提取类试剂盒提取罗汉果的总RNA；
步骤二、利用反转录酶反转录步骤一所述的总RNA，反转录过程中加入接头引物，构建3'-RACE和5'-RACE cDNA模板库，利用DNA聚合酶进行PCR扩增，5'-RACE用接头引物和特异引物GST-F配对，得到5'-RACE-Ready cDNA，3'-RACE用接头引物和引物特异GST-R配对，得到3'-RACE-Ready cDNA，将PCR所得所有清晰片段进行回收纯化，与克隆载体连接处理并进行测序，经过生物信息分析软件拼接后得出罗汉果性别基因SgACS2全长cDNA序列如SEQ ID No.3所示；
步骤三、在罗汉果性别基因SgACS2全长cDNA序列的非编码序列(UTR)上设计引物，利用核酸纯化提取类试剂盒提取罗汉果的总DNA，利用二引物法对提取的DNA进行PCR扩增，将PCR所得所有清晰片段进行回收纯化，与克隆载体连接处理并进行测序，经过生物信息分析软件拼接后得出罗汉果性别基因SgACS2全长DNA序列。
优选的是，所述步骤二中，反转录过程中接头引物为5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'，特异引物GST-F为ACAGCGTTTCTGAACTCTGGTAATC，特异引物GST-R为TGCTTCGCGAATATGGACGACAAGACG。
优选的是，所述步骤二中，PCR扩增分为两次完成，第一次PCR扩增反应具体参数如下：25个循环，94度变性30秒、68度退火30秒、72度延伸3分钟，得到第一次RACE结果；第二次降落PCR扩增反应具体参数如下：5个循环，94度变性30秒、72度退火与延伸3分钟；5个循环，94度变性30秒、70度退火30秒、72度延伸3分钟；25个循环，94度变性30秒、68度退火30秒、72度延伸3分钟，得到第二次RACE结果。
优选的是，所述步骤三中，二引物法中，特异引物序列如下所示：
SgACS2-F2:CACTGGAAAATATGGTGCTGGAATCG
SgACS2-R1:CGTTAAAACTTGGTCAGAATCGAACCC。
优选的是，步骤三中PCR扩增反应具体参数如下：94度预变性5分钟；34个循环，94度变性30秒、59度退火30秒、72度延伸3分钟；72度延伸7分钟。
本发明至少包括以下有益效果：随着越来越多功能基因及其等位基因的克隆分离和注解，目前扩增基因等位序列DNA多态性的功能性标记已广泛用于植物的性别鉴别研究。通过高通量RNA-Seq测序和RACE、PCR克隆检测出罗汉果雌雄株的一种性别基因SgACS2，为罗汉果苗期性别PCR扩增检测提供了方法，同时也为罗汉果基因工程育种和利用特异多态性位点(G/C)开发苗期性别鉴定新方法提供重要的基因序列信息基础，通过苗期性别鉴定及早剔除实生后代群体中无用的雄性株，从而富集雌性株，最终实现提高育种效率，加速罗汉果品种遗传改良进程，节约大量土地、人力和财力的有益效果。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明罗汉果SgACS2性别基因5'-端RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳结果图；
图2为本发明罗汉果SgACS2性别基因3'-端RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳结果图；
图3为本发明罗汉果SgACS2性别基因DNA全长片段扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
一种罗汉果性别基因SgACS2的扩增方法，包括以下步骤：
步骤一、采集罗汉果现蕾茎段，利用天根的植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取罗汉果的总RNA；
步骤二、利用Clontech的 RACE 5'/3'Kit User Manual提供的MMLV反转录酶反转录步骤一所得的总RNA，反转录过程中加入接头引物，构建3'-RACE和5'-RACEcDNA模板库；利用高扩增效率的Clontech的SeqAmp DNAPolymerase(Cat.No.638504)进行PCR扩增，5'-RACE用接头引物和特异引物GST-F配对，得到5'-RACE-Ready cDNA，3'-RACE用接头引物和特异引物GST-R配对，得到3'-RACE-Ready cDNA，RACE结果与全式金的Trans2KPlus II Marker进行对比；采用TaKaRa胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0将PCR扩增所得所有清晰片段进行回收纯化，将回收的PCR产物与全式金的克隆载体Peasy Blunt zero连接，连接产物转化到大肠杆菌中，挑取单克隆进行测序，测序获得的5'-端序列和3'-端序列与已测序获得的EST序列经过生物信息分析软件进行拼接，用ORF Finder和NCBI的BLAST工具预测得出全长编码序列以及两端非编码cDNA序列，全长cDNA序列如SEQ ID No.3所示；
其中，3'-RACE cDNA模板库和5'-RACE cDNA模板库的构建方法如下所示：
预混液1的配制(总体积5.5微升)
4.0微升 5X First-Strand Buffer
0.5微升 DTT(100毫摩尔)
1.0微升 dNTPs(20毫摩尔)
将上述三种试剂在PCR管里混匀并瞬离，置于室温待用；
预混液2的配制(总体积11微升，制备5'-RACE-Ready cDNA)
3.0微升 RNA
1.0微升 5'-CDS Primer A
7.0微升 Sterile H2O
将上述三种试剂在PCR管里混匀并瞬离，置于室温待用；
预混液3的配制(总体积12微升，制备3'-RACE-Ready cDNA)
3.0微升 RNA
1.0微升 3'-CDS Primer A
8.0微升 Sterile H2O
将上述三种试剂在PCR管里混匀并瞬离，置于室温待用；
用PCR仪将预混液2和预混液3在72度孵育3分钟，42度冷却2分钟，相对离心力14,000离心10秒，将管壁液体离心到管底；
预混液4的配制
向预混液2中加入1微升的SMARTer II A Oligonucleotide进行反应得到预混液4；
预混液5的配制(总体积8微升)配制两份，每一份的配制如下：
5.5微升 第一步的预混液1
0.5微升 RNase Inhibitor(40U/微升)
2.0微升 SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)
将两份预混液5分别加入到预混液3和预混液4中并轻轻混匀，瞬离5秒；
在PCR仪中按照如下程序反应：42℃反应90分钟，70℃反应10分钟，即得到3’-RACEcDNA模板库和5’-RACE cDNA模板库。
PCR扩增反应体系如下所示：
反应液a的配制(总体积41.5微升)
15.5微升 PCR-Grade H2O
25.0微升 2X SeqAmp Buffer
1.0微升 SeqAmp DNA Polymerase
将上述试剂混匀；
按照以下配制PCR反应液(总体积50.0微升)
2.5微升 5'-或3'-RACE cDNA模板
5.0微升 10X UPM通用接头引物
1.0微升 5'或3'序列特异性引物
41.5微升 反应液a
步骤三、在基因编码区外的非编码序列UTR上根据所述罗汉果性别基因SgACS2全长cDNA序列设计引物，采用天根的植物基因组提取试剂盒(DP305)提取罗汉果的总DNA，利用杭州擎科梓熙生物(TSING KE)的金牌mix采用二引物法进行PCR扩增，将PCR所得所有清晰片段进行回收纯化，将回收的PCR产物与全式金克隆载体Peasy Blunt zero连接，连接产物转化到大肠杆菌中，挑取单克隆进行测序，经过生物信息分析软件进行拼接得出罗汉果性别基因SgACS2全长DNA序列，雄株系该基因序列如SEQ ID No.1所示，雌株系该基因序列如SEQ ID No.2所示。
步骤二中，反转录过程中接头引物5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'，特异引物GST-F为ACAGCGTTTCTGAACTCTGGTAATC，特异引物GST-R为TGCTTCGCGAATATGGACGACAAGACG。
步骤二中，PCR扩增分为两次完成，第一次PCR扩增反应具体参数如下：25个循环，94度变性30秒、68度退火30秒、72度延伸3分钟，得出第一次RACE结果；第二次降落PCR扩增反应具体参数如下：5个循环，94度变性30秒、72度退火与延伸3分钟；5个循环，94度30变性秒、70度退火30秒、72度延伸3分钟；25个循环，94度变性30秒、68度退火30秒、72度延伸3分钟，得出第二次RACE结果。
步骤三中，二引物法中，引物序列如下所示：
SgACS2-F2:CACTGGAAAATATGGTGCTGGAATCG
SgACS2-R1:CGTTAAAACTTGGTCAGAATCGAACCC
步骤三中PCR扩增反应具体参数如下：94度预变性5分钟；34个循环，94度变性30秒、59度退火30秒、72度延伸3分钟；72度延伸7分钟。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室
<120> 罗汉果性别基因SgACS2及其扩增方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1940
<212> DNA
<213> 罗汉果性别基因SgACS2雄株系基因序列
<400> 1
atggtgctgg aatcgagcaa tgcaaagaaa ctgctgtcga agttggccag aggcaatgga 60
catggagaag attctccata ttttgatggc tggaaagctt acgacagcga tccatttcac 120
cccacaatga accctcgagg agtgattcaa atgggtttgg ctgaaaatca ggtacccaga 180
ttatgatctc tttttcttgc taattcctct cgagtttctt taatttctcc aatttcggtt 240
tctgatcctt aaaaattgca gctttctttt gagttcgtcg agaagtggat aagaaacaac 300
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ggaaaccgag tcaaattcga cccagaccga gttgtgatga gtggtggagc aacaggagct 600
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gattttgact ctcaattgac ccctccactc caccttgttt cattctgtcc ctatacactt 780
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aatggtgtga aacttttaga tagtgggttt ggtttacttg ttaataataa tactagtagt 900
aacatccagc aatggagttt ttgctgacaa atttgattaa aaatgggtgc agtttcgaca 960
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<210> 2
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<213> 罗汉果性别基因SgACS2雌株系基因序列
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<213> 罗汉果性别基因SgACS2全长cDNA序列
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gtattagcat gcatttgcag ttgttttcct tcttcttttt tcctcatttt tcactc 2096
Claims (6)
1.一种罗汉果性别基因SgACS2，其特征在于，雄株系该基因序列如SEQ ID No.1所示，雌株系该基因序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的罗汉果性别基因SgACS2的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采集罗汉果现蕾茎段，利用核酸纯化提取类试剂盒提取罗汉果的总RNA；
步骤二、利用反转录酶反转录步骤一所述的总RNA，反转录过程中加入接头引物，构建3'-RACE和5'-RACE cDNA模板库，利用DNA聚合酶进行PCR扩增，5'-RACE用接头引物和特异引物GST-F配对，得到5'-RACE-Ready cDNA，3'-RACE用接头引物和特异引物GST-R配对，得到3'-RACE-Ready cDNA，将PCR所得所有清晰片段进行回收纯化，与克隆载体连接处理并进行测序，经过生物信息分析软件拼接后得出罗汉果性别基因SgACS2全长cDNA序列如SEQ IDNo.3所示；
步骤三、在罗汉果性别基因SgACS2全长cDNA序列的非编码序列(UTR)上设计引物，利用核酸纯化提取类试剂盒提取罗汉果的总DNA，采用二引物法对提取的DNA进行PCR扩增，将PCR所得所有清晰片段进行回收纯化，与克隆载体连接处理并进行测序，经过生物信息分析软件拼接后得出罗汉果性别基因SgACS2全长DNA序列。
3.如权利要求2所述的罗汉果性别基因SgACS2的扩增方法，其特征在于，所述步骤二中，反转录过程中接头引物为5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'，特异引物GST-F为ACAGCGTTTCTGAACTCTGGTAATC，特异引物GST-R为TGCTTCGCGAATATGGACGACAAGACG。
4.如权利要求2所述的罗汉果性别基因SgACS2的扩增方法，其特征在于，所述步骤二中，PCR扩增分为两次完成，第一次PCR扩增反应具体参数如下：25个循环，94度变性30秒、68度退火30秒、72度延伸3分钟，得到第一次RACE结果；第二次降落PCR扩增反应具体参数如下：5个循环，94度变性30秒、72度退火与延伸3分钟；5个循环，94度变性30秒、70度退火30秒、72度延伸3分钟；25个循环，94度变性30秒、68度退火30秒、72度延伸3分钟，得到第二次RACE结果。
5.如权利要求2所述的罗汉果性别基因SgACS2的扩增方法，其特征在于，所述步骤三中，二引物法中，特异引物序列如下所示：
SgACS2-F2:CACTGGAAAATATGGTGCTGGAATCG
SgACS2-R1:CGTTAAAACTTGGTCAGAATCGAACCC。
6.如权利要求2所述的罗汉果性别基因SgACS2的扩增方法，其特征在于，步骤三中PCR扩增反应具体参数如下：94度预变性5分钟；34个循环，94度变性30秒、59度退火30秒、72度延伸3分钟；72度延伸7分钟。
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