CN109182581B - 一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法 - Google Patents

一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法。所述方法包括利用鉴定罗汉果雌雄株的SCAR分子标记进行鉴定,所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。本发明方法具有高度的特异性,能很好的应用于罗汉果早期性别的鉴定研究。

Description

一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法。
背景技术
罗汉果是多年生葫芦科藤本植物。关于罗汉果的功效,中国药典里面是这样描述的:清热润肺,利咽开音,滑肠通便,用于肺热燥咳,咽痛失音,肠燥便秘。中医学认为:罗汉果甘、酸、性凉、有清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、嫩肤益颜、润肺化痰等功效,而现代医学临床实验表明罗汉果对支气管炎、高血压等疾病有显著疗效,还可治咽喉炎、支气管哮喘、百日咳、胃热、便秘、急性扁桃体炎等病症。罗汉果除了具有多种药用功效外,还是良好的食用材料,是典型的药食同源药物,罗汉果含一种比蔗糖甜300倍的甜苷,然而它几乎不产生热量,是糖尿病、肥胖患等的理想糖代物。罗汉果中富含各种维生素,具有抗衰老、抗癌,抗心血管疾病等作用。
罗汉果是多年生藤本植物,雌雄异株,异花授粉,而雌株与雄株在形态上无典型的差异,肉眼无法分辨,需等到开花方可辨识。目前,罗汉果的种植均是以已知雌雄的植株作为母本,嵌插培育或者组织培养来保证罗汉果植株的性别。尽管这样的培育方法能保证罗汉果性别,操作也简单,但这样的培育方法会使得罗汉果品种趋于单一化,种苗品质下降,易受虫害、病毒感染等。造成生长势弱、植株成活率下降,不仅影响农户种植,更不利于品种保护与开发。
对于品种的开发,种子苗的种植是必不可少的,然而,罗汉果果实中,70%的种子是雄性,如果每次筛选优良品种的种子时,都将种子播种,待开花时再将多余的雄株拔去,这样不仅浪费大量的人力物力,更消耗大量的土地,时间,不利于优良品种的开发。因此,如果能在苗期就能鉴定出植株性别,能极大程度的节约人力物力,时间空间,有利于对优良品种的筛选和推广种植。
目前,对于罗汉果植株性别鉴定的方法主要有三种:1,基于形态学差异的组织观察法,主要是利用成熟植株的形态学,如花的差异,叶片的差异,该方法需等到植株生长完全,开花才能鉴定,耗时长,也占用大量的土地资源;2,基于植株生长代谢的理化性质的差异的化学鉴定法,雌雄株在生长过程中,体内的酶代谢,次生代谢的差异会导致植株内理化成分的差异,如同工酶差异,激素水平差异等,该方法检测的各种理化成分在植株体内含量少,离体存在时间短,检测需要高昂的设备和耗材;3,基于基因组差异的分子标记法,雌雄株的DNA组成是存在差异的,设计分子标记,如随机扩增多态性DNA(Random amplifiedpolymorphic DNA,RAPD)标记,简单序列重复区间扩增多态性(Inter-simple sequencerepeat,ISSR)等,通过PCR扩增出雌雄株差异条带,即可鉴定出雌雄株。其中分子标记法是通过遗传物质的差异进行鉴定的,与植株大小无关,操作简单,仅需一台PCR仪,无需高昂设备,结果准确,是目前应用最广泛的方法。
目前RAPD标记已广泛用于雌雄异株植物的性别鉴别研究中。韦弟和秦新民等[1-2]设计多组RAPD,并对罗汉果基因组进行扩展,结果表明部分引物PCR扩增得到雌雄株间差异条带,说明RAPD引物与罗汉果性别之间存在连锁。然而,由于RAPD标记不够稳定,重复性差,因此,张会新等利用将RAPD标记转化为序列特异性扩增区(Sequence-characterizedAmplified Region,SCAR)标记,使得分子标记稳定。尽管张会新等[3]发明的SCAR标记用于罗汉果雌雄株鉴定稳定,但是,整个PCR鉴定程序耗时较长,需150min,不利于样品的快速检测。
参考文献:
[1].韦弟,杨美纯,陈廷速,等.罗汉果性别的RAPD标记研究[J].中药材,2006,29(4):311-313.
[2].秦新民,黄夕洋,蒋水元.罗汉果性别相关的RAPD标记[J].广西师范大学学报(自然科学版),2007,25(3):109-112.
[3].张会新,张继贤.一种鉴别罗汉果性别的SCAR分子标记:,CN104073550A[P].2014.
发明内容
本发明的目的在于提供一种能鉴定罗汉果雌雄株的SCAR分子标记,以及基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种鉴定罗汉果雌雄株的SCAR分子标记,所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQID NO:24所示。
一种罗汉果雄株特异片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
一种扩增罗汉果雄株特异片段的引物对,所述引物对为DM3F和DM3R,DM3F的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示,DM3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法,所述方法包括利用如上所述的SCAR分子标记进行鉴定。
一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的PCR方法,所述PCR方法所获得的罗汉果雄株的扩增产物包含部分或全部的如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
本发明所提供的鉴定罗汉果雌雄株的SCAR分子标记,具有高度的特异性,利用该SCAR分子标记可以鉴定罗汉果雌雄株,可应用于罗汉果生产中,对于罗汉果的种植加工产业化具有重大意义。
本发明以罗汉果雌雄株叶片为材料,设计20条RAPD引物进行筛选,两条引物随机组合,20条引物分别为RP1,RP2,……RP19,RP20,20条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,……SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20所示。
PCR反应体系为
Figure BDA0001824781270000031
反应程序为
Figure BDA0001824781270000032
其中,引物RP2和RP8扩增各得到一条雄株特异性片段(图2),命名为RM28。将这条特异性片段回收、再经过一次扩增提高丰度和纯度(图3),送华大基因测序,获得一条测序长度为1000bp左右的序列RM28,其核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示,提取罗汉果雌株和雄株叶片的全基因组DNA,根据测得的RM28的核苷酸序列,设计一对30bp引物DM3F和DM3R,序列分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23所示,设计目标产物大小为463bp,进一步通过PCR验证SCAR标记的特异性。
PCR的体系和程序如下:
PCR反应体系为
Figure BDA0001824781270000041
反应程序为
Figure BDA0001824781270000042
结果发现,用这对SCAR标记引物进行扩增,得到的扩增结果,在罗汉果雌株和雄株间有差异。从琼脂糖凝胶电泳分析结果可以看到:SCAR标记引物DM3F和DM3R,扩增罗汉果基因组DNA时,所有雄株可以扩增得到一条在450bp附近的目的条带,与设计的产物大小一致(图4),回收目的条带,胶回收纯化,送样测序,得到的目的条带序列DM3。为了验证引物DM3F和DM3R作为SCAR分子标记的特异性,又提取实验室组培苗雌雄株各8株,再利用SCAR标记进行鉴定,同样在雄株得到463bp左右的目的片段(图5)。比对DM3与RM28,发现DM3与RM28的456-885bp之间的序列有90%是一样的(图6),因此,可以认为DM3F和DM3R扩增得到的目的条带DM3来源于RM28。利用DM3F和DM3R作为一种SCAR标记,鉴定的田间8株罗汉果的性别同植株田间性别性状一致,说明该SCAR标记不仅可以用于鉴定组培苗,也可以用于鉴定种子苗的性别。
本发明采用以上技术方案,首先设计多条RAPD标记,筛选得到差异条带,并完成差异条带测序,基于测序结果,设计特异性更好的分子标记,将RAPD标记转化为SCAR标记,优化PCR程序,使得鉴定的时长由150min缩短到50min,且具有高度的特异性,能很好的应用于罗汉果早期性别的鉴定研究。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
图1是本发明技术路线图。
图2是用随机引物RP2和RP8分别对罗汉果雌雄株基因组进行扩增的结果,图中从左向右依次为:lane1为Maker(条带自大到小依次为:2000bp;1000bp;750bp;500bp;250bp;100bp),lane2-3和lane6-7为雌性二倍体罗汉果,而lane4-5和lane8-9为雄性二倍体罗汉果,图中箭头所指,即为特异条带扩增目的片段,大小约为1400bp。
图3是PR2-PR8引物以特异条带为模板扩增的DNA结果电泳图,扩增目的片段大小为1400bp,图中从左向右依次为:lane1为Maker;lane2为扩增的目的条带,回收用于测序。
图4是DM3F引物与DM3R引物,扩增罗汉果基因组DNA结果琼脂糖凝胶电泳图,扩增目的片段大小为463bp,图中从左向右依次为:lane1为Maker,lane2-5泳道为雌性植株;6-9泳道为雄性植株。
图5为SCAR标记引物DM3F和DM3R对实验室多株组培苗的雌雄验证结果,图中从左向右依次为lane1为Maker,lane2-9为雄株,lane10-17为雌株。
图6为RM28与DM3序列比对的结果,DM3的序列与RM28的456-885bp(443bp)有90%的序列是相同的。
图7为田间样品的雌雄株鉴定,图中从左向右依次为:lane1为Maker,lane2、4、6为雌株,而lane3、5、7、8、9为雄株。
具体实施方式
本发明的具体技术路线如图1所示。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见《分子克隆》。所用引物及DNA序列均由深圳华大基因合成,测序由北京华大基因研究中心完成,植物基因组DNA提取使用OMEGA BIO-TEK公司的HP Plant DNA Kit(D2485-01),胶回收使用OMEGA BIO-TEK公司的Gel Extraction Kit(D2500-01),克隆使用Takara公司的
Figure BDA0001824781270000061
Fast PCRMaster Mix,方法均参照试剂盒提供的方法进行。
实施例1 20条随机引物组合对罗汉果不同雌雄株的RAPD标记
本发明先以罗汉果雌雄株叶片为材料,提取基因组DNA,并用20条随机引物进行扩增多态性筛选,扩增反应体系及反应程序参照《分子克隆实验指南》的方法,20条随机引物分别为RP1,RP2,……RP19,RP20,20条随机引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2,……SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20所示。实验结果发现,其中一对随机引物RP2和RP8扩增得到了1条罗汉果雄株特异性片段。将这条特异性片段回收、克隆及进行测序分析,获得一条长度为994bp的核苷酸序列,将其命名为RM28,其核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
用随机引物RP2和RP8对4个雌株、4个雄株的基因组DNA进行扩增,并将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像检测分析的结果如图2所示,lane2-3和lane6-7为雌性二倍体罗汉果,而lane4-5和lane8-9为雄性二倍体罗汉果,从图中可以清楚的观察到罗汉果雄株在大小约1400bp左右的地方出现一条特异性片段,即多态性片段。图中箭头所指,即为特异条带扩增目的片段,大小约为1400bp。而雌株中并未发现。
本实施例中罗汉果基因组DNA提取使用OMEGA BIO-TEK公司的HP Plant DNA Kit(D2485-01),具体方法及步骤如下:
1)取>100mg的幼嫩叶片,置于预冷的研钵中加入液氮,快速研磨成粉末;
2)将粉末转移到EP管中,加入500μL的Buffer CPL,涡旋充分混匀,65℃,15min(水浴过程混匀两三次);
3)加入500μL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋混匀20s;
4)>10000g,离心10min;
5)取300μL上清至另一洁净的EP管中,加入RNase A,室温10min,除去RNA;
6)加入150μL Buffer CXD和300μL无水乙醇,充分混匀;
7)转移全部的样品至HiBind DNA柱上,套上收集管,10000g,离心1min;
8)弃液体和管子,将层析柱转移到另一收集管,加650μL SPW Wash Buffer,10000g,离心1min;
9)弃液体,加650μL SPW Wash Buffer,10000g,离心1min;
10)弃液体,空管>13000g,离心2min;
11)弃液体和管,转移层析柱至新的EP管中,室温静置10min,加入50-100μL的55℃预热的去离子水,静置2min;
12)>13000g,离心2min,做好标记,-20℃保存备用。
以上述提取的基因组DNA作为模板,用随机引物RP2和RP8按以下PCR扩增体系进行扩增,所述RP2和RP8引物的核苷酸序列分别是5’CTGGACCCGT 3’(SEQ ID NO:2)、5’CGAAACGTAT 3’(SEQ ID NO:8),PCR扩增体系和扩增程序如下:
PCR反应体系为
Figure BDA0001824781270000071
扩增程序为
Figure BDA0001824781270000072
扩增后,经琼脂糖凝胶电泳分离,凝胶成像鉴定(图2),图中从左向右依次为:lane1为Make,lane2-3和lane6-7为雌性罗汉果,而lane4-5和lane8-9为雄性罗汉果,图中箭头所指,即为特异性条带扩增目的片段,大小约为1400bp。因此,筛选得到的随机引物RP2和RP8可作为RAPD标记,用于鉴定罗汉果雌雄株。
实施例2罗汉果雌雄株特异性SCAR标记的确定
由于RAPD标记的重复性差,不稳定,因此需将RAPD标记转化为更加精确的SCAR标记。根据RAPD标记鉴别出来的雄性多态性片段(即特异性片段)的序列,设计特异性引物,以此引物,对雌雄株基因组进行扩增,若能得到稳定的雄株多态性,则该引物即可作为一种SCAR标记。因此,首先得获得由RP2和RP8扩增的特异带。
使用OMEGA BIO-TEK公司的Gel Extraction Kit(D2500-01)试剂盒对特异条带进行切胶回收,具体操作步骤如下:
1)将含目的条带的琼脂糖胶小心切下,置于一洁净EP管;
2)加入等体积的Binding Buffer,55-65℃,7min,每2min混匀一下;
3)将胶溶液转移到吸附柱上,套上收集管,10000g,离心1min;
4)弃液体,加入500μL的Binding Buffer,10000g,离心1min;
5)弃液体,加入650μL的SPW Wash Buffer,10000g,离心1min;
6)弃液体,加入650μL的SPW Wash Buffer,10000g,离心1min;
7)弃液体,空管>13000g,离心2min;
8)弃液体和管,转移层析柱至新的EP管中,室温静置10min,加入30μL的55℃预热的去离子水,静置2min;
9)>13000g,离心2min,做好标记,-20℃保存备用。
由于回收的DNA量不够测序,因此,再以回收的DNA作为模板,用引物RP2和RP8扩增一次(图3),再一次切胶回收,得到的回收片段送华大基因测序,得到的测序序列命名为RM28。
根据上述罗汉果雄株特异片段RM28(核苷酸序列如SEQ ID NO:21)的序列,设计新的引物对DM3F和DM3R,以特异扩增此片段。所述引物DM3F和DM3R的序列如下:
DM3F:5'GCTTTCACTCTATGTATTTAGATTTGTATGT 3'(SEQ ID NO:22);
DM3R:5'GTGGAATCTGTTATCTGAATTATGCAAAC 3'(SEQ ID NO:23)。
分别以4个罗汉果雌株和雄株的基因组DNA为模板,用DM3F和DM3R进行PCR扩增,扩增体系和程序如下。
PCR反应体系为
Figure BDA0001824781270000081
Figure BDA0001824781270000091
反应程序为
Figure BDA0001824781270000092
扩增后,经琼脂糖凝胶电泳分离,凝胶成像鉴定(图4),图中从左向右依次为:lane1为Maker,lane2-5为雌性植株;6-9为雄性植株。雄株扩增得到目的片段大小为450bp左右,与设计的一致。为了验证DM3F和DM3R作为SCAR的稳定性与重复性,又另外提取实验室组培苗雌雄株各8株的基因组DNA,用DM3F和DM3R去扩增,所有的雄株都能扩增出450bp左右的片段,命名为DM3,而雌株没有(图5)。因此,DM3F和DM3R扩增的片段具有多态性,可作为一种鉴定罗汉果雌雄株的SCAR标记。
为了验证DM3条带是来源于RM28,本发明回收DM3片段,送华大基因测序,得到DM3的序列(SEQ ID NO:24)。利用NCBI(Nation Center for Biotechnology Information)的BLAST功能进行RM28与DM3的比对(图6),结果发现,DM3的测序序列439bp和RM28的456-885bp(443bp)有90%的序列是相同的,另外的10%的差异是源自于测序的误差和PCR过程的点突变,所以,DM3条带是来源于RM28,DM3是一种雄性多态性片段,引物DM3F和DM3R可以作为一种SCAR标记,用于区分罗汉果雌雄株。
实施例3田间种子苗的雌雄鉴定
随机选取田间8株种子苗作为鉴定的样品,其中样品编号为1-8。按照试剂盒的方法提取罗汉果基因组DNA,使用SCAR标记DM3F和DM3R进行PCR鉴定,具体的体系与程序同实施例2,PCR完成后,进行琼脂糖凝胶电泳,成像结果如图7所示:可以看出样品3、5、7、8和9能扩增出463bp的条带,为雄株,而样品2、4和6没有扩增目的条带,是雌株,与田间开花的结果一致,PCR结果与实际雌雄状况相符,所有雄株都可以扩增的到目的条带,而雌株则没有扩增产物,进一步确定本发明方法可以用来鉴定罗汉果幼苗的雌雄鉴定。
序列表
<110> 大闽食品(漳州)有限公司
<120> 一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法
<130> 2018
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 10
<212> DNA
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccagctcata 10
<210> 14
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgagtgatcg 10
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcgagtcgc 10
<210> 16
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atccgactcg 10
<210> 17
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggcacgctg 10
<210> 18
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tacgagctgg 10
<210> 19
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgcctgatc 10
<210> 20
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgcatcgtaa 10
<210> 21
<211> 994
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgcgacggta cgagtggctt gccgtcatgc gcatgcacat ccccccgccc atcctgttct 60
aacccgaaag ctttttgact cgatctagac aacaatggtc ggactgaggt ggcgagaccg 120
cctgcttcct gaagaatcca acctgtattc tccttgagga gatcctacct gaaagaacac 180
accgcttggc cgggacaacg agacgtagaa aaattccttt agaactataa agggcttcca 240
aaggacgaaa tcgctcggga gcacgtcgca tacctggatt cagctgcagc tcagatcgag 300
cagtacgagc aacaacggtt gacagggacg tcaacccttt aagtggggga gaatttcatg 360
gtcttcctcc tctagggcct gttgcctgtg gccacatgtc cttaacttcc tcaaccctca 420
tgctttcact ctatgtattt agatttgtat gttcatttca tttccttata cttttgacct 480
gaaacatttg ggatgcattc tagcggaaag gtaccaccat gtcaagttga ggatgatgtt 540
ccgagcgaag catgtcaagt cctctactgg gtggagcgtg ggtagcatgc taggtttttg 600
ggtagtcaga caatgtagct tggagatcgt aatttttgaa acttgtgaac tacaaaaatt 660
ggggaactaa aagtgtaatt cattttttag ctaggaatat gttttaatcc ataatgtgtg 720
ggtatattgt caatttactt ccatttaaaa agttacaatt tagtctctta taattcaaga 780
tttttctttc taccctcaat ttttttaata ttaagtttaa caaatgataa tctcacgtga 840
catgatactt aatgagtttg cataattcag ataacagatt ccacccccgt gaatactatt 900
tttgtactgc ttgtatcctt tctaagacac tgcaagaaat ttcgtttctc tcattcaatc 960
ccttagtttt ggtctaaatt tcaggcaatt cact 994
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctttcactc tatgtattta gatttgtatg t 31
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtggaatctg ttatctgaat tatgcaaac 29
<210> 24
<211> 439
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aattttttca tttccttata cttttgacct ttagcatttg ggatgcattc tagcggaaag 60
gtaccaccat gtcgagttga ggatgaggtt ccgagccgag catgtcaagt agtctacttt 120
gtctagcgtg ggtagcatgc taggtttttg ggtagtcaga caatgtagct caggagatcg 180
taatttttga aacttgtgaa ctaaaaaaat ttgggaacta aaagtgtaat ttatttttta 240
gctaaagata tgttttaatc cataatgttt gggtattttt tcaatttagt tccatttaaa 300
aagtttcaat ttagtccctt ataattcaag atttttcaat tctaccctcc aagtcagtta 360
atattaaaat tagctaatga taagcttaca tgacatgata cttaatgagt ttgcataatt 420
cagataaaag attccacca 439

Claims (2)

1.一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法,其特征在于:所述方法包括利用鉴定罗汉果雌雄株的SCAR分子标记进行鉴定,所述SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示,扩增产物包含全部的如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的品种为罗汉果雄株。
2.如权利要求1所述的方法在罗汉果生产中的应用,其特征在于:将权利要求1所述的方法应用于罗汉果的性别判断。
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