CN110747286A - 一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性scar标记 - Google Patents

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Abstract

一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，该SCAR标记为SC343‑1.4K‑12，在Genbank的序列号为MK584624，其制备步骤包括：S1、实验材料的采集和鉴定；S2、罗汉果DNA的提取；S3、构建DNA雌雄池；S4、RAPD引物筛选；S5、特异性片段的回收、克隆和测定；S6、SCAR引物的设计及特异性验证。本发明开发的罗汉果性别特异的SCAR标记(SC343‑1.4K‑12)，序列总长为22bp，在64℃退火条件下可稳定扩增出1373bp的雄性特异带，其特异性和稳定性要显著优于相应的RAPD引物S343(序列长10bp)，为罗汉果的性别早期鉴定和分子辅助育种提供了有效的途径。

Description

一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记
技术领域
本发明涉及罗汉果性别鉴定领域，尤其涉及一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记。
背景技术
罗汉果是广西的著名特产，也是一种传统中药和保健食品，果实中的主要甜味成分罗汉果苷Ⅴ的甜度约为甜菊苷和甘草甜素的2倍和6倍，约为蔗糖的300倍左右，是迄今为止所知最甜的非糖类物质之一，且低热、无毒，是糖尿病和肥胖病人极为理想的食糖代用品，具有极高的应用价值和市场开发前景。
罗汉果为雌雄异株的植物，但性别在苗期难以鉴定，因而性别的早期鉴定是罗汉果育种中亟待解决的问题，而分子标记技术是解决该问题的一条行之有效的途径，但早期开发的罗汉果性别鉴定的分子标记主要为RAPD标记，虽然成本较低，使用方便，但由于该类型标记的序列过短(仅10bp)，因而特异性和稳定性相对较差，实用性不高，而在RAPD标记的基础上开发序列较长的SCAR标记(18-24bp)则可以有效地解决这些问题。
目前，尚未见有关罗汉果性别鉴定的SCAR标记的开发与使用的报道，为解决上述问题，本申请中提出一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记。
发明内容
(一)发明目的
为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，本发明在RAPD标记的基础上开发出一个稳定性和特异性更高的SCAR标记，为罗汉果的性别早期鉴定和辅助育种研究提供了分子依据。
(二)技术方案
为解决上述问题，本发明提供了一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，该SCAR标记为SC343-1.4K-12，其在Genbank的序列号为MK584624。
优选的，上述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记制备步骤包括：
S1、实验材料的采集和鉴定；采集罗汉果雌雄单株各30株，其性别均在开花后根据花器官的结构予以确定；
S2、罗汉果DNA的提取；称取罗汉果幼叶0.1g，在液氮中磨碎后提取其总DNA，接着采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和完整性，最后进行DNA的定量检测。
S3、构建DNA雌雄池；将DNA稀释至统一浓度，-20℃保存备用；随机选择雌雄单株各10份，取等量DNA混匀构建DNA雌雄池；
S4、RAPD引物筛选；首先用雌雄池对所有的RAPD引物进行第一轮初筛，选择条带有差异的引物；接着利用雌雄单株各10份对其进行第二轮筛选，从中选择对应关系较好的引物；再对所有的雌雄单株进行第三轮筛选验证，最终得到一条雄性特异带；
其中RPAD-PCR反应体系为DNA模板1μl(100ng/μl)，RAPD引物1μl(10μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix(天根)10μl，加ddH2O补足至20μl；
RAPD-PCR扩增程序为94℃预变性4min，94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸10min；
PCR产物取5μl经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶自动成像仪上观察和拍照；最后通过对330条RAPD引物的筛选，发现RAPD引物S343(序列为5’-TCTCCGCTTG-3’)能够在罗汉果雌雄池和雌雄单株间显现出多态性，在1400bp左右可扩增出一条雄性特异带(图1)；
S5、特异性片段的回收、克隆和测定；从琼脂糖凝胶中挑取该雄性特异条带，利用DNA纯化回收试剂盒进行目的片段的回收和纯化；将目的片段克隆至T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选挑取白斑菌落，应用菌落PCR确定阳性克隆，摇菌后用质粒小提试剂盒提取质粒进行测序；完整序列见图2
S6、SCAR引物的设计及特异性验证；根据DNA测序的结果，在RAPD引物的基础上，向内延伸12bp，设计出相应的SCAR引物SC343-1.4K-12，其序列为(正向引物：TCTCCGCTTGCATAGTTATGTA，反向引物：TCTCCGCTTGGTACTGGCAATG)，序列总长22bp；将引物序列合成；利用该SCAR引物对罗汉果雌雄单株进行特异性的验证；
其中SCAR-PCR扩增体系为DNA模板1μl(100ng/μl)，SCAR上下游引物各0.5μl(10μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix(天根)10μl，加ddH2O补足至20μl；
SCAR-PCR扩增程序为94℃预变性4min，94℃变性30s，64℃退火40s，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸10min；
PCR产物取5μl经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶自动成像仪上观察和拍照；最后经PCR检测，SCAR引物SC343-1.4K-12在64℃可扩增出一条1373bp的雄性特异带(图3)，而雌株无此条带，表明RAPD引物S343已成功转化成SCAR标记，可用于罗汉果的性别鉴定研究。
优选的，在S1中，罗汉果雌雄株材料采集地为广西桂林市永福县和临桂区等地。
优选的，在S2中，采用改良CTAB法提取罗汉果的DNA。
优选的，在S3中，根据混合分离群体分析法原理，构建DNA雌雄池。
优选的，在S4中，根据上海生工生物工程有限公司随机引物目录，随机选择10bp的碱基RAPD引物进行RAPD引物筛选。
优选的，在S5中，经克隆测序后，雄性特异条带的实际长度为1373bp。
本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
本发明开发的罗汉果性别特异的SCAR标记(SC343-1.4K-12)，序列总长为22bp，在64℃退火条件下可稳定扩增出1373bp的雄性特异带，其特异性和稳定性要显著优于相应的RAPD引物S343(序列长10bp)，为罗汉果的性别早期鉴定和分子辅助育种提供了有效的途径。
附图说明
图1为本发明提出的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记的RAPD引物S343在罗汉果雌雄池和雌雄单株间的扩增结果示意图。
图2为本发明提出的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记的测序结果示意图。
图3为本发明提出的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记在罗汉果雌雄池和雌雄单株间的扩增结果结构示意图。
附图标记：
M、D2000marker；1、雌性DNA池；2、雄性DNA池；3-12、雌性单株；13-22、雄性单柱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明提出的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，该SCAR标记为SC343-1.4K-12，其在Genbank的序列号为MK584624。
在一种可选的实施例中，上述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记制备步骤包括：
S1、实验材料的采集和鉴定；采集罗汉果雌雄单株各30株，其性别均在开花后根据花器官的结构予以确定；
S2、罗汉果DNA的提取；称取罗汉果幼叶0.1g，在液氮中磨碎后提取其总DNA，接着采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和完整性，最后进行DNA的定量检测。
S3、构建DNA雌雄池；将DNA稀释至统一浓度，-20℃保存备用；随机选择雌雄单株各10份，取等量DNA混匀构建DNA雌雄池；
S4、RAPD引物筛选；首先用雌雄池对所有的RAPD引物进行第一轮初筛，选择条带有差异的引物；接着利用雌雄单株各10份对其进行第二轮筛选，从中选择对应关系较好的引物；再对所有的雌雄单株进行第三轮筛选验证，最终得到一条雄性特异带；
其中RPAD-PCR反应体系为DNA模板1μl(100ng/μl)，RAPD引物1μl(10μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix(天根)10μl，加ddH2O补足至20μl；
RAPD-PCR扩增程序为94℃预变性4min，94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸10min；
PCR产物取5μl经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶自动成像仪上观察和拍照；最后通过对330条RAPD引物的筛选，发现RAPD引物S343(序列为5’-TCTCCGCTTG-3’)能够在罗汉果雌雄池和雌雄单株间显现出多态性，在1400bp左右可扩增出一条雄性特异带(图1)；
S5、特异性片段的回收、克隆和测定；从琼脂糖凝胶中挑取该雄性特异条带，利用DNA纯化回收试剂盒进行目的片段的回收和纯化；将目的片段克隆至T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选挑取白斑菌落，应用菌落PCR确定阳性克隆，摇菌后用质粒小提试剂盒提取质粒进行测序；完整序列见图2
S6、SCAR引物的设计及特异性验证；根据DNA测序的结果，在RAPD引物的基础上，向内延伸12bp，设计出相应的SCAR引物SC343-1.4K-12，其序列为(正向引物：TCTCCGCTTGCATAGTTATGTA，反向引物：TCTCCGCTTGGTACTGGCAATG)，序列总长22bp；将引物序列合成；利用该SCAR引物对罗汉果雌雄单株进行特异性的验证；
其中SCAR-PCR扩增体系为DNA模板1μl(100ng/μl)，SCAR上下游引物各0.5μl(10μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix(天根)10μl，加ddH2O补足至20μl；
SCAR-PCR扩增程序为94℃预变性4min，94℃变性30s，64℃退火40s，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸10min；
PCR产物取5μl经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶自动成像仪上观察和拍照；最后经PCR检测，SCAR引物SC343-1.4K-12在64℃可扩增出一条1373bp的雄性特异带(图3)，而雌株无此条带，表明RAPD引物S343已成功转化成SCAR标记，可用于罗汉果的性别鉴定研究。
在一种可选的实施例中，在S1中，罗汉果雌雄株材料采集地为广西桂林市永福县和临桂区等地。
在一种可选的实施例中，在S2中，采用改良CTAB法提取罗汉果的DNA。
在一种可选的实施例中，在S3中，根据混合分离群体分析法原理，构建DNA雌雄池。
在一种可选的实施例中，在S4中，根据上海生工生物工程有限公司随机引物目录，随机选择10bp的碱基RAPD引物进行RAPD引物筛选。
在一种可选的实施例中，在S5中，经克隆测序后，雄性特异条带的实际长度为1373bp。
本发明开发的罗汉果性别特异的SCAR标记(SC343-1.4K-12)，序列总长为22bp，在64℃退火条件下可稳定扩增出1373bp的雄性特异带，其特异性和稳定性要显著优于相应的RAPD引物S343(序列长10bp)，为罗汉果的性别早期鉴定和分子辅助育种提供了有效的途径。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (7)

1.一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，该SCAR标记为SC343-1.4K-12，其在Genbank的序列号为MK584624。
2.根据权利要求1所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，其制备步骤包括：
S1、实验材料的采集和鉴定；采集罗汉果雌雄单株各30株，其性别均在开花后根据花器官的结构予以确定；
S2、罗汉果DNA的提取；称取罗汉果幼叶0.1g，在液氮中磨碎后提取其总DNA，接着采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和完整性，最后进行DNA的定量检测。
S3、构建DNA雌雄池；将DNA稀释至统一浓度，-20℃保存备用；随机选择雌雄单株各10份，取等量DNA混匀构建DNA雌雄池；
S4、RAPD引物筛选；首先用雌雄池对所有的RAPD引物进行第一轮初筛，选择条带有差异的引物；接着利用雌雄单株各10份对其进行第二轮筛选，从中选择对应关系较好的引物；再对所有的雌雄单株进行第三轮筛选验证，最终得到一条雄性特异带；
S5、特异性片段的回收、克隆和测定；从琼脂糖凝胶中挑取该雄性特异条带，利用DNA纯化回收试剂盒进行目的片段的回收和纯化；将目的片段克隆至T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选挑取白斑菌落，应用菌落PCR确定阳性克隆，摇菌后用质粒小提试剂盒提取质粒进行测序；
S6、SCAR引物的设计及特异性验证；根据DNA测序的结果，在RAPD引物的基础上，向内延伸12bp，设计出相应的SCAR引物SC343-1.4K-12；将引物序列合成；利用该SCAR引物对罗汉果雌雄单株进行特异性的验证。
3.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S1中，罗汉果雌雄株材料采集地为广西桂林市永福县和临桂区等地。
4.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S2中，采用改良CTAB法提取罗汉果的DNA。
5.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S3中，根据混合分离群体分析法原理，构建DNA雌雄池。
6.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S4中，根据上海生工生物工程有限公司随机引物目录，随机选择10bp的碱基RAPD引物进行RAPD引物筛选。
7.根据权利要求2所述的一种用于罗汉果性别早期鉴定的特异性SCAR标记，其特征在于，在S5中，经克隆测序后，雄性特异条带的实际长度为1373bp。
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韦素玲等: "罗汉果性别相关RAPD标记的克隆与序列分析", 《湖北农业科学》 *

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