CN102212611B - 黑麦草腥黑粉菌检测标准分子及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑麦草腥黑粉菌检测的标准分子，为能够进行复制的质粒，且所述质粒中含有序列A(Seq ID No.1)和序列B(Seq ID No.2)中的至少一种。序列A与黑麦草腥黑粉菌线粒体DNA一段2.3kb的核酸序列同源性为99.65％，B与黑麦草腥黑粉菌核糖体内转录间隔区的DNA序列同源性为100％。本发明还公开了上述标准分子的制备方法和检测方法。本发明中构建的标准分子可以代替黑麦草腥黑粉菌DNA作为黑麦草腥黑粉菌分子检测的阳性对照，该标准分子适用于对黑麦草腥黑粉菌的定性PCR和定量PCR检测。该标准分子适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

Description

黑麦草腥黑粉菌检测标准分子及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种口岸检验检疫、农业生产、植物保护领域检测用的标准分子，特别是涉及一种黑麦草腥黑粉菌检测用标准分子及其制备方法。

背景技术

黑麦草腥黑粉菌(Tilletia walkeri Castebury&Carris)是一种与小麦印度腥黑穗病菌在形态特征上极为相似的真菌，主要为害黑麦草。该菌分布于美国、澳大利亚、新西兰、加拿大、丹麦、荷兰、日本、西班牙等地，我国尚未有报道。黑麦草腥黑粉菌于1996年在美国农业部展开的对小麦印度腥黑穗病菌的大普查中于美国俄勒冈州和东南部诸州的小麦种子洗涤液中首次发现，1999年Castlebury等根据其在形态特征上及生物学上与小麦印度腥黑穗病菌的微弱差别进行鉴定，并将其命名。该菌与小麦印度腥黑穗病菌形态学特征和分子学特征都十分相似，并且在实验室人工接种条件下可侵染小麦(Mathre et al，2000)。

黑麦草腥黑粉菌与小麦印度腥黑穗病菌冬孢子在大小和颜色上较为接近，只是前者的孢子外壁纹饰比较粗，孢壁具有脑纹结构(Castlebury etal.，1997)。章桂明等对小麦印度腥黑穗病菌及其近似种的冬孢子的形态特征在扫描电镜下进行了比较，认为两者形态学特征非常接近，只获得少量孢子的情况下难以从形态学方面将两菌进行区别，需要较多的孢子综合分析才能得出结论(章桂明，1999)。

在分子生物学方面，Larocthe等应用AFLP方法来区别小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌，建立了区别小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌的AFLP方法(Larocthe et al.，1997)。Pimentel等利用RAPD和PCR-RFLP的分析方法研究了黑麦草腥黑粉菌及其近似种，结果表明黑麦草腥黑粉菌的特有酶切位点是Sca I，它与小麦印度腥黑穗病菌之间的相似性达到85％；而RAPD方法的研究结果则显示当软件的支持率为100％时，这两种菌之间仅有25％的相似性(Pimentel et al.，1998)。McDonald等利用rep-PCR基因指纹技术对黑麦草腥黑粉菌及其近似种的基因组DNA进行了分析，得到其基因组指纹图谱，通过GeCompar(4.0)软件分析成功的将黑麦草腥黑粉菌和小麦印度腥黑穗病菌及其它近似种和相关种区分开(McDonald et al.，2000)。上述检测方法由于对实验操作要求比较高，而且重复性差，在实际操作中难以推广应用。因此Frederick等在Ferreira研究的基础上进一步分析了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌2.3kb的线粒体DNA，并设计了扩增扩增黑麦草腥黑粉病菌的3对特异性引物，建立了黑麦草腥黑粉病菌常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法(Frederick et al.，2000)。程颖慧等对2.3kb的线粒体序列分析，分别设计了扩增小麦印度腥黑穗病菌的4对特异性引物和扩增黑麦草腥黑粉菌的2对特异性引物，对ITS序列进行分析设计了扩增所有供试材料的通用引物，建立了两种菌的常规PCR检测方法、双重PCR的检测技术、单孢PCR的检测方法、实时单色荧光PCR检测方法以及小麦印度腥黑穗病菌的实时双色荧光PCR检测方法(程颖慧等，2002)；易建平等对ITS序列进行分析设计了扩增所有供试材料的通用引物，利用套式PCR检测方法对冬孢子进行检测，建立了黑麦草腥黑粉菌的套式PCR检测方法(易建平等，2003)。章桂明等(2005)对黑麦草腥黑粉菌和小麦印度腥黑穗病菌分子检测方法进行研究，并在上述基础上制定了黑麦草腥黑粉菌实时荧光PCR检测方法国家标准。

分子生物学检测方法在实际检测过程中需要阳性参考物质作为对照，用以实验结果的分析和判定，确保实验结果的可靠性。现阶段黑麦草腥黑粉菌分子检测所用的阳性参考物质通常是其基因组DNA。但基因组DNA获取过程较复杂，制备非常不方便，其稳定性也尚不能满足长期及经常性使用的需要，并且由于不同检测实验室间使用的基因组DNA来源不同，提取质量存在差异，使得不同实验室的检测结果缺乏可比性和重复性，从而制约了黑麦草腥黑粉菌检测标准及其它分子检测方法的推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种制备简便、特异性强、具有良好均匀性和稳定性的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子。

本发明的另一目的在于提供上述标准分子的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述标准分子的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种黑麦草腥黑粉菌检测标准分子，所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B中的至少一种，

所述序列A与Genebank中编号为AF218061的序列99.65％同源；

所述序列B与Genebank中编号为AF399887的序列100％同源。

在本发明具体的实施方式中，所述序列A为Seq ID No.1所示的序列，所述序列B为Seq ID No.2所示的序列。

所述质粒优选为T载体，更优选为pMD19-T。

本发明还公开了上述黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括：以黑麦草腥黑粉菌DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增的引物包括下述引物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，

引物对a：

Seq ID No.3：5′-TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3′

Seq ID No.4：5′-AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3′

引物对b：

Seq ID No.5：5′-TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

Seq ID No.6：5′-GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

在本发明具体的实施方式中，是采用所述引物对a和引物对b分别进行PCR扩增，将引物对a扩增得到的片段与pMD19-T载体进行连接，将连接后得到的重组子以及引物对b扩增得到的片段分别用限制性内切酶XbaI和KpnI进行双酶切，分别回收酶切产物的大片段，将回收的片段进行连接。

本发明还公开了上述黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的检测方法，所述方法包括，利用特异性检测引物和探针，以所述标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，并且所述探针5′端和3′端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

所述特异性检测引物分别含有Seq ID No.7和Seq ID No.8所示的序列，探针含有Seq ID No.9所示的序列：

Seq ID No.7：5′-CTCGAGCCACTCCGTTGG-3′

Seq ID No.8：5′-GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3′

Seq ID No.9：5′-TACTCTTCATTGCCCTCA-3′

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

利用本发明的方法制备得到的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子，具有可以长期稳定保存、高拷贝数、易获得、纯度高和制备方便等特点，并且制备简便、特异性强、具有良好的均匀性和稳定性，可以替代黑麦草腥黑粉菌的基因组DNA用于黑麦草腥黑粉菌的定性PCR、定量PCR检测及分析，解决了黑麦草腥黑粉菌检测中标准分子缺乏的难题。该标准分子适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

附图说明

图1为本发明所述标准分子示意图。

图2为以引物MP3-1、MP3-2和探针MPb3对本发明所述标准分子以及黑麦草腥黑粉菌基因组DNA的实时荧光PCR特异性检测结果图。

图3为以引物MP3-1、MP3-2和探针MPb3对本发明所述标准分子的实时荧光PCR灵敏度检测结果图。

图4为以引物MP3-1、MP3-2和探针MPb3对本发明所述标准分子的实时荧光PCR扩增标准曲线。

图5为本发明所述标准分子测序结果与网上公布的黑麦草腥黑粉菌及其近似种线粒体2.3kb序列比对结果。

图6为本发明所述标准分子测序结果与网上公布的黑麦草腥黑粉菌ITS序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例1黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的构建

一、实验试剂

1、供试菌株

小麦印度腥黑穗病菌截获来自巴西、印度和墨西哥小麦，黑麦草腥黑粉菌截获自美国小麦，上述供试菌株均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术研究中心保存(表1)。

表1供试菌株

注：标“*”为本研究用于克隆的菌株。

2、供试材料

限制性内切酶XbaI，KpnI以及限制性内切酶缓冲液，pMD19-T载体，T4DNA连接酶及其缓冲液，dNTPs，Taq DNA聚合酶及其缓冲液、DL2000Marker，Agarose Gel DNA Purification Kit和MiniBEST Plasmid PurificationKit购自大连宝生物工程有限公司。DH5α感受态细胞购自北京天根生物公司。TaqMan探针及引物由上海超世生物科技有限公司合成。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

二、实验仪器

DY-8型核酸电泳仪(北京六一仪器有限公司)，Biometra Grident PCR仪，Syngene凝胶成像系统，其他仪器包括：离心机，恒温水浴锅，培养箱，天平等。

三、制备方法

1、序列获得

在GenBank中搜索黑麦草腥黑粉菌及其近似种线粒体2.3kb片段序列和核糖体内转录间隔区序列。

2、引物设计

根据获得的线粒体2.3kb片段序列和核糖体内转录间隔区序列，利用软件Primer premier 5.0设计PCR扩增引物(表2)。其中，Ti-1和Ti-4引物及PCR反应体系参考Frederick R D(2002)等。

表2供试引物

3、黑麦草腥黑粉菌线粒体2.3kb片段克隆

根据表2中的引物Ti-1和Ti-4对黑麦草腥黑粉菌DNA进行线粒体2.3kb片段扩增。扩增得到的序列如Seq ID No.1所示，扩增反应体系25μL(表3)，扩增条件为94℃预变性7min；然后进入30个循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s；循环结束后72℃延伸7min(Frederick R D，2000)。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化。将PCR纯化产物与pMD19-T Vector进行连接，连接体系体积为10μL，各成分为：Ligation Mix 5μL，PCR纯化产物3.5μL，pMD19-T Vector 1μL，补充灭菌去离子水至10μL。连接条件为16℃过夜。转化及筛选重组克隆过程见《分子克隆实验指南》。

表3PCR反应体系

4、黑麦草腥黑粉菌核糖体内转录间隔区片段扩增

根据表2中的引物ITS4-KpnI和ITS5-XbaI引物进行黑麦草腥黑粉菌核糖体内转录间隔区扩增。扩增得到的序列如Seq ID No.2所示，扩增反应体系25μL(表4)，扩增条件为95℃预变性7min；然后进入35个循环：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；循环结束后72℃延伸7min。

表4PCR反应体系

5、标准分子pMD19-T-TW的构建

将核糖体内转录间隔区PCR扩增产物和包含2.3kb的重组质粒分别进行Xba I和Kpn I双酶切处理，反应体系总体积20μL，各成分为：10×M buffer2μL，酶切模板10μL，Xba I和Kpn I各1μL，补充灭菌去离子水至20μL。37℃温浴3h。酶切完成后，分别切胶回收核糖体内转录间隔区扩增片段和包含2.3kb的重组质粒的大片段，并将两个片段进行16℃过夜(12h)连接。连接反应体系10μL，各成分为：Ligation Mix 5μL，核糖体转录间隔区切胶回收产物2.5μL，包含2.3kb的重组质粒切胶回收产物2.5μL。转化及筛选重组克隆过程见《分子克隆实验指南》。筛选得到的重组克隆通过M13F/R引物的常规PCR验证及XbaI和KpnI的酶切验证及测序验证，最终获得的重组子命名为pMD19-T-TW，即本发明所述标准分子。

实施例2标准分子性能评价

一、实验试剂

Universal Real-time Master Mix购自ABI公司。

引物及探针由上海超世生物科技有限公司合成。

二、实验仪器

ABI 7700实时荧光PCR仪。

三、验证方法及结果

1、特异性验证

以黑麦草腥黑粉菌DNA及其标准分子为阳性对照，小麦印度腥黑穗病菌DNA及其克隆质粒为阴性对照，采用表5的引物和探针进行黑麦草腥黑粉菌标准分子特异性实时荧光PCR检测，以验证其特异性。实时荧光PCR检测反应参考章桂明、章正等(2005)建立的黑麦草腥黑粉菌实时荧光PCR检测方法进行。反应体系10μL(表6)，反应条件为50℃预热2min；95℃预变性10min；然后进入40个循环：95℃变性15s，60℃退火及延伸1min。

表5供试引物及探针

表6实时荧光PCR反应体系

特异性测试结果

检测结果显示，黑麦草腥黑粉菌标准分子和黑麦草腥黑粉菌基因组DNA均有明显的检测信号，而小麦印度腥黑穗病菌DNA及其克隆质粒均未有检测信号，所构建的标准分子具有很好特异性，能够替代黑麦草腥黑粉菌DNA作为检测反应的阳性参考物质。

2、均匀性验证

对标准分子进行十倍梯度稀释(10^-2至10^-7)，采用表5中提供的引物和探针以稀释液为模板进行实时荧光PCR检测，反应体系及条件同特异性检测。绘制标准曲线，根据检测样品扩增效率及其相关系数分析标准分子的均匀性。

测试结果(图3和图4)

结果表明最低检测值均为达到10^-7稀释度，扩增效率为0.95。根据Ct值计算得出的标准曲线公式为y＝-3.523x+36.081，相关系数为1，所构建的标准分子具有较好的均匀性。

3、稳定性验证

将构建的标准分子置于室温条件下(平均室温25℃)，分别在放置24h、48h、72h、1周、2周、1月、2月，进行实时荧光PCR检测，检测反应体系及条件同特异性检测。对获得的Ct值进行统计分析标准分子的稳定性。

稳定性测试结果

对每次实时荧光测试每个反应2个重复的Ct值平均值进行相对标准偏差分析(RSD)结果见表7，结果表明7个放置不同时间的RSD均小于5％(标准偏差小于35％可以接受)。可见本试验研究的标准分子在室温下放置2个月仍然具有很好的稳定性。

表7标准分子实时荧光PCR检测Ct统计表

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

深圳市检验检疫科学研究院

<120>黑麦草腥黑粉菌检测标准分子及其构建方法

<130>DHC1010010

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2300

<212>DNA

<213>Tilletia walkeri Castebury & Carris

<400>1

tgggctgagt ctgagatgca gagcctgcac tcccgaaaac gtcgacgagt tttgccgaac  60

gaagcgtgtg cgacacccga atccgtggaa gaacaacgct gagtgatcct agctgagcta  120

acgccgtcct ggattgtgca ctcttcgtca ccgccgttgc gcgcttagcg tgaatgctcc  180

tggaagccac agactatcag caaatgactc gaacagcagt ttttgtttca tcacacaaga  240

ttcacttgag cggctcgcct tcttcttctg cagtagtacc tgtgggctct cccagggaag  300

gactgccagg ctctccttgg ctcgcaccag agtacagctt tcgtccttcc tgcctcgttt  360

tcaccagaga catgactttc atgatggcct ctataccgac gttggtctcg gccagttcca  420

cgccaacatg gaccgcttcg cgttgcctga tctgcatcga cggtcccaat acgaagttga  480

cccgaaaggc gctgagccct ggcagggaca tgggccgtgc cgagtcagga atcgttttcc  540

tcaaggtcct gctagccgag ccggcctcgc cgtaatagcc ctgtgcagag gttgcccaac  600

cagaatcaga agagaatgtg gagtcggcaa taggctcgag cgcccaatcc gcccaccgat    660

ccgtgaatcc gctcaaagtg agcgtgttca tggtgtttag cttactcgtg ctgcttgacc    720

tcttcagtgt ccgcccaccc agatgcgcat ttgacgagct cgcgacactc gcatcccgag    780

acattgtggt cggagagaga aaagtgtccg cgaatccaac tttcttcgct gatgatggcc    840

cactagcccg ttccaccgca gataatggaa agtcggattc agcccgaacg atccgtctga    900

ccggggacat gctttgaagt aatgttggcg tggcggcatt gaaagatctg acttgagcgc    960

taggatcatg cggcaagtct gaggcatcgc tgtccataga ctgcagtgac gccgaagccg    1020

ggaatgagcc ggtcaaaggc ggagaggcta gaagctcggc cagaggaact tgaggcggag    1080

ctctgctgtt tttcgcttcg aaccaccgag ccgtggtggt ctggtatgga gaataaatac    1140

taccgtcggc agaacccgaa gtcggcagcg gactgagagt gaaagagccg ctgcccattg    1200

cagcatcgct cgagccactc cgttggtggc cacgcgatcg gtggcgaccc ggtgccgaaa    1260

ataggggttg cttcgccgct tcgtgagtgc catactcttc attgccctca ctatcggagc    1320

catcactgga gttgtcatgg ttgacacgag gatcggtcgc ctgacgtcga ggccgaccat    1380

accggtcttg tcctcttacc ggtctcaaag gtgaccttgc tggggactgc gtgttttcat    1440

ggccgtccct cgaagaatgg aggccgggcg aaggtatttg gaagaagctg tccctcttgt    1500

ttgcactgcg tgaaggttgc cggaatgcgt gcggttcgga aaaggggtcc ggttcgcctg    1560

tcacgaaaag cgcttcgaag acctgtattg actcaaaagt cagctttaag cttccattcg    1620

cggcggggac gccagccatt acgaaggcgg tggcacctct cgccccagaa ccgattcgat    1680

ttggcattgc agcgagcatt tcagtaatgc tattttgaac gcctggtatt ctcgaggctc    1740

gagtggtagt ccgcccgtga agtgtttgag ccacgctatg accattcgct gcggttctgt  1800

tgttggagga ccagccttcg gactgtatgg gcatgtcctt tatagctgga tcggaaggga  1860

gattttgtcc aagtccattt gctgaagacg gcggtgtgac ctgtgctcgt ccacgatgct  1920

ctacatgtct ggcagagacg actttcatcg aataacgagc tcccatacgc ccgacacgga  1980

agacagtctc agcttcttgt acatagactt cgagccgatg aatctccact tcgaaaagag  2040

agcttacgac cgggatcgcc gatgctagaa ggaaaagacc gaccctcgtc cccctcaaga  2100

gccaagactg gatcgtgggt atgacagcgt cgcgaacgta tgcgtagatg agccatccga  2160

catagagtgg gacggtgcga aacgacgagg cggaagtttt tggaatcaga gcggagaatg  2220

gtcgccttgg aagttgcggc cgcgctggag gtgcactagc cactgtcccg ctgcccaggc  2280

tatgagacgc aggtat tact                                             2300

<210>2

<211>710

<212>DNA

<213>Tilletia walkeri Castebury & Carris

<400>2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttctgta ggtgaacctg cagaaggatc attagtgaat  60

tacggagctc ttcttcggaa gagtctcctt ctcttttatc ccaacaccaa actacggaag  120

gaacaaggcc ttgcgctgag tacctgtccg gatggaacag agttgctagt acttcggtat  180

tggcagcgct gctccaaccc ttttaaacac ttaagaatta aagaatgtta aaactattgt  240

cttcggacat aaactaatat acaacttttg acaacggatc tcttggttct cccatcgatg  300

aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc  360

tttgaacgca ccttgcgccc ttgggtattc tcaagggcat gcctgtttga gtgtcataat  420

actctcaact ctcaatcttt ttgtaagaga agattgcttg gagttggtga tgggcgcttg  480

ccagatgtaa cagtcttgct cgccttaaat taatcagtgg atctcttcga gtccggtctg  540

actatgtgtg ataatttgat cacatagaat gtgcttgtca caaccggatt ctgtatagag  600

gctctgcttc caacacggaa tgattcttcg gaatcatcga tagctttgta gcttgacctc  660

aaatcaggta ggactacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga             710

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgggctgagt ctgagatgc                                               19

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

agtaatacct gcgtctcata gc                                           22

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

taggtacctc ctccgcttat tgatatgc      28

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gttctagagg aagtaaaagt cgtaacaagg    30

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctcgagccac tccgttgg                 18

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gacaactcca gtgatggctc c             21

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tactcttcat tgccctca                 18

Claims (7)

1.一种黑麦草腥黑粉菌检测的标准分子，其特征在于：所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B，

所述序列A为Seq ID No.1所示序列；

所述序列B为Seq ID No.2所示序列。

2.根据权利要求1所述的标准分子，其特征在于：所述序列A为Seq ID No.1所示序列与GenBank中编号为AF218061的黑麦草腥黑粉菌2.3kb序列99.65%同源；所述序列B为Seq ID No.2所示序列与编号为AF399887的黑麦草腥黑粉菌ITS序列100%同源。

3.根据权利要求1～2任意一项所述的标准分子，其特征在于：所述质粒为T载体。

4.根据权利要求3所述的标准分子，其特征在于：所述T载体为pMD19-T。

5.权利要求1～4任意一项所述的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括：以黑麦草腥黑粉菌DNA为模板进行常规PCR扩增，所述PCR扩增的引物包括下述引物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，

引物对a：

Seq ID No.3：5′-TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3′

Seq ID No.4：5′-AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3′

引物对b：

Seq ID No.5：5′-TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

Seq ID No.6：5′-GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：采用所述引物对a和引物对b分别进行PCR扩增，将引物对a扩增得到的片段与pMD19-T载体进行连接，将连接后得到的重组子以及引物对b扩增得到的片段分别用限制性内切酶XbaI和KpnI进行双酶切，分别回收酶切产物的大片段，将回收的片段进行连接。

7.权利要求1～4任意一项所述的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的检测方法，所述方法包括，利用特异性检测引物和探针，以所述标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，并且所述探针5′端和3′端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

所述特异性检测引物分别含有Seq ID No.7和Seq ID No.8所示的序列，探针含有Seq ID No.9所示的序列：

Seq ID No.7：5′-CTCGAGCCACTCCGTTGG-3′ 

Seq ID No.8：5′-GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3′

Seq ID No.9：5′-TACTCTTCATTGCCCTCA-3′。 

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