CN106636369B - 小酸浆的分子特异性标记引物和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及小酸浆的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对小酸浆进行快速检测的方法。所述引物序列为：上游引物XSJF:5’‑TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG‑3’；下游引物XSJR:5’‑CCACCAGAATGTACTTGTTACG‑3’。运用本发明设计的特异性引物XSJF/XSJR，通过PCR方法，可以实现小酸浆的快速准确鉴别。XSJF/XSJR是小酸浆专一性扩增引物，若为其他酸浆属植物样品，则为阴性反应；本发明方法简便，灵敏度高，结果准确，且耗时短。

Description

小酸浆的分子特异性标记引物和检测方法
技术领域
本发明涉及一种小酸浆Physalis minima L.的分子特异性标记引物，以及利用该特异性标记引物对小酸浆进行快速检测的方法。
背景技术
小酸浆Physalis minima L.为茄科酸浆属Physalis一年生草本植物，在我国多地都有分布，其中云南、广东、广西及四川分布较多。主要以野生为主，多生长在海拔1000-1300米的山坡上。在我国，小酸浆是一种民间传统中药材，在《全国中草药汇编》中有记载。其味苦、凉，具有清热、利尿、抗炎、抗氧化、降血糖及细胞毒性等功效，主要用于咽喉肿痛、支气管炎、感冒发热、胆囊炎、血尿、湿疹及疖肿等的治疗。小酸浆叶片卵形或卵状披针形，边缘波状或有少数粗齿，两面脉上有柔毛。花生短柔毛，花萼钟状，果萼近球状或卵球状，果实球状，直径约6毫米。其形态学特征与酸浆属植物毛酸浆、苦蘵及酸浆非常相似。利用传统鉴别方法很难将它们区分开，这也阻碍了小酸浆药材的安全利用和保护。
DNA分子标记技术弥补和克服了传统形态学分类方法的一些缺陷和难题，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。常规的分子标记技术譬如RAPD、ISSR及SRAP等采用通用随机引物进行PCR扩增，其PCR产物指纹图谱比较复杂、重复性较差、且在物种鉴定中的应用性不强。特异性分子标记技术的引物具有较强的专一性，能够进行特异性扩增，且稳定性较好。该方法技术具有快速、简便、成本低、准确度高的特点，在植物种类鉴定中具有较好的应用前景。目前尚未有特异性分子标记技术应用于小酸浆物种检测的研究报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供小酸浆Physalis minima L.的分子特异性标记引物，该特异性标记引物序列如下：
上游引物XSJF:5’-TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG-3’,如SEQ ID NO.1所示；
下游引物XSJR:5’-CCACCAGAATGTACTTGTTACG-3’,如SEQ ID NO.2所示。
该引物组合是采用PCR技术，经过大量筛选实验，获得小酸浆特异性DNA片段，通过切胶回收、TA克隆、测序，获得该DNA序列，在此基础上设计小酸浆特异性标记引物，以该引物对小酸浆及其他酸浆属相近物种进行PCR扩增，只与小酸浆样本DNA发生反应，获得444bp大小的特异性片段，而不与其他酸浆属植物样品反应。
本发明的第二个目的是提供上述分子特异性标记引物对小酸浆进行检测的方法。所述方法为：采用上述引物组合(XSJF/XSJR)作为特异性扩增引物，以待测酸浆属植物样品基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现分子量为444bp大小的特异性片段，则待测酸浆属植物样品为小酸浆，反之则不是。
具体的，所述方法如下：
(1)基因组DNA的提取：取待测酸浆属植物样品新鲜叶片，加液氮研磨至粉末，然后利用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取待测酸浆属植物样品的基因组DNA。
(2)PCR扩增：以步骤(1)提取的待测酸浆属植物样品基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(XSJF/XSJR)作为扩增引物，进行PCR扩增。
PCR反应体系(总体积20μl)：10×Buffer(含Mg2+)2μl，dNTPs(10mM)0.8μl，引物XSJF(10μM)1μl，引物XSJR(10μM)1μl，Taq酶(2U/μl)0.5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，ddH2O13.7μl。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1.5min,共35个循环；72℃延伸10min。
(3)电泳检测：取步骤(2)PCR产物7μl,在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后利用凝胶成像系统拍照检测。若电泳结果出现分子量为444bp大小的DNA条带，则待测样品为小酸浆，反之则不是。
本发明主要有益效果表现为：引物组合XSJF/XSJR为小酸浆特异性扩增引物，若为其他酸浆属植物样品，则为阴性反应，进而实现小酸浆的快速鉴别，结果准确，方法简便，耗时短。
附图说明
图1为利用本发明设计的特异性标记引物XSJF/XSJR对酸浆属植物样品进行PCR扩增的电泳图，其中M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～4：小酸浆P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸浆P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸浆P.pubescens。电泳图显示只有小酸浆样品扩增出分子量为444bp大小的特异性DNA条带。
具体实施方式
本发明可以从分子水平上较为快速准确的鉴别小酸浆样品，下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：小酸浆分子特异性标记引物开发设计
1.基因组DNA的提取
剪取酸浆属植物样品(包括4个小酸浆样品、9个苦蘵样品、4个酸浆样品及3个毛酸浆样品)新鲜叶片100mg放入研钵，立即加入液氮彻底磨碎，然后使用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取基因组DNA，所得DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl，用于后续PCR扩增。
2.分子特异性标记引物设计
通过大量PCR扩增筛选试验，获得小酸浆特异性核苷酸序列，经过切胶回收、克隆及测序，获得该DNA序列，在此基础上设计获得小酸浆特异性标记引物XSJF/XSJR(XSJF:5’-TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG-3；XSJR:5’-CCACCAGAATGTACTTGTTACG-3’)。在上海生工生物工程有限公司进行引物序列合成。
实施例2：特异性引物XSJF/XSJR的PCR扩增及电泳检测
采用本发明设计的特异性标记引物XSJF/XSJR对不同酸浆属植物样品(具体见附图说明)进行PCR检测。
PCR反应体系(总体积20μl)：10×Buffer(含Mg2+)2μl，dNTPs(10mM)0.8μl，引物XSJF(10μM)1μl，引物XSJR(10μM)1μl，Taq酶(2U/μl)0.5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，ddH2O13.7μl。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1.5min,共35个循环；72℃延伸10min。
在1.5％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳检测，利用凝胶成像系统进行拍照检测。电泳图如图1所示(图中，通道M为DNA分子量标准marker DL2000；通道1～20为4种不同酸浆属植物的样品，具体见附图说明)，从图1可以看出只有小酸浆样品(通道1～4)能扩增出特异性DNA片段，将该小酸浆的特异性DNA片段送去测序，其序列长度为444bp。而其他酸浆属植物样品没有扩增出任何条带，这表明本发明的特异性标记引物专一性好，灵敏度高，可以用于小酸浆样品的快速检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 小酸浆的分子特异性标记引物和检测方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttgcaaacta tcttgtgagt cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccaccagaat gtacttgtta cg 22

Claims (4)

1.小酸浆的分子特异性标记引物，其特征在于该特异性标记引物序列如下：
上游引物XSJF: 5’- TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG-3’；
下游引物XSJR: 5’- CCACCAGAATGTACTTGTTACG-3’。
2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对小酸浆进行快速检测的方法，其特征在于所述方法为：以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，以待测酸浆属植物样品基因组DNA为模板，进行PCR扩增，电泳检测，若电泳结果出现444 bp大小的特异性片段，则待测样品为小酸浆，反之则不是；
所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物XSJF: 5’- TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG-3’；
下游引物XSJR: 5’- CCACCAGAATGTACTTGTTACG-3’。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增体系包括含Mg2+ 10×Buffer 2μL，10mM dNTPs 0.8μL，10μM引物XSJF 1μL，10μM引物XSJR 1μL，2U/μL Taq酶 0.5μL，50ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 13.7μL，共计20μL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR反应程序设置为： 94℃预变性5min；94℃变性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸1.5 min, 共35个循环；72℃延伸10 min。
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