CN109082424A - 一种标记Marker及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种标记Marker及制备方法，将标准分子量marker条带分别标记，所有条带都可以最终阶段显影，辅助确定基因分子量大小。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种标记Marker及其制备方法。
背景技术
Southern印迹杂交(Southern blot)是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Northern blot(诺瑟杂交)是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northern blot首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。"Northernblot"这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。Northern blot在1977年由斯坦福大学James Alwine，David Kemp和George Stark发明。Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot(依据生物学家EdwinSouthern名字来命名)来命名，Southern blot主要用来对DNA进行分析，用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。如northern blot被大量用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降，器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因表达量的上升，Northern blot还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。它的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。
southern和Northern blot实验是基于标准分子量marker来判定受检测基因或转录本分子量大小的，所以标准分子量marker的分子范围、种类至关重要。但是southern和Northern blot实验的显影是基于受检基因的特异性探针的，当该探针与marker条带存在一定同源性的情况下，该条带才最终被显影，否则不显影。所以，往往southern和Northernblot实验最终显影阶段，marker仅仅显示很少几条带，这对判定基因或转录本的大小带来很大困难。单纯对照凝胶电泳条带又存在很多方面的不便利及问题，例如，需要尼龙膜和凝胶大小完全一致、凝胶与显影结果拍照聚焦及图片大小完全一致，即使如此，依然需要从诸多位置相近的条带中选出显影条带，存在很大的误差。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种标记Marker及制备方法，可以将标准分子量marker条带分别标记，所有条带都可以最终阶段显影，辅助确定基因分子量大小。
本发明的目的是提供一种标记Marker。
本发明的另一目的是提供一种制备所述标记Marker的方法。
根据本发明的标记Marker，所述标记Make包括标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段，所述6135bp片段的序列如SEQ ID NO:1所示，所述3225bp片段的序列如SEQ ID NO:2所示，所述1976bp片段的序列如SEQ ID NO:3所示，所述1016bp片段的序列如SEQ ID NO:4所示，所述456bp片段的序列如SEQ ID NO:5所示。
根据本发明的标记Marker的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)分别对6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp采用PCR方法进行标记，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段；
(2)将步骤(1)得到的所述标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段分别连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-6135bp、pMD-18T-3225bp、pMD-18T-1976bp、pMD-18T-1016bp和pMD-18T-456bp，保存，备用。使用时，用带有生物素标记或地高辛标记的引物PR7和PR8将其扩增出来即可。
根据本发明的标记Marker的制备方法，其中，所述6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp均以PR7为上游引物和以PR8为下游引物进行PCR扩增，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段；
所述PR7的序列为5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'，所述序列如SEQ ID NO:6所示；所述PR8的序列为5'-AACGACGGCCAGTGCCAAGC-3'，所述序列如SEQ ID NO:7所示。所述PR7为上游引物，所述PR8为下游引物。
根据本发明的标记Marker的制备方法，其中，所述上游引物的5'末端和/或3'末端采用地高辛标记或生物素标记；所述下游引物的5'末端和/或3'末端采用地高辛标记或生物素标记。本发明采用地高辛标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段作为marker主要应用于southern blot、northernblot实验，本发明中采用生物素标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段作为marker主要应用于RNA酶及DNA酶印迹实验。
根据本发明的标记Marker的制备方法，其中，所述上游引物和所述下游引物的添加量均为0.1μm/L。
根据本发明的标记Marker的制备方法，其中，所述pMD-18T-6135bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸6min10s，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述pMD-18T-3225bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min10s，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述pMD-18T-1976bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述pMD-18T-1016bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述pMD-18T-456bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸27s，25-45个循环，72℃总延伸10min。
根据本发明的标记Marker的制备方法，其中，所述PCR扩增所用酶的扩增效率为1kb/min。
根据本发明的标记Marker的制备方法，其中，PCR扩增所用酶为：Genstar的2×HiFiTaq PCR StarMix。
根据本发明的标记Marker的制备方法，其中，PCR扩增所用酶的添加量为1μl。
本发明的再一目的是提供一种所述标记Marker的使用方法。
根据本发明的标记Marker的使用方法，包括将所述标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段以摩尔比1:1:1:1:1进行混合，组成标准分子量marker，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种标记Marker，将标准分子量marker条带分别标记，所有条带都可以最终阶段显影，辅助确定基因分子量大小。
2、转膜到显影后标准分子量marker每一条带都可见，解决了传统marker显影阶段只有部分或没有条带的问题。
3、本发明的标准分子量marker相对于现有技术中部分可见的marker，在定性基因分子量大小方面更加精准。
4、本发明提供的Marker条带做了生物素或地高辛的标记，所以在显影阶段每条带显影更加清晰明亮，避免了传统基于杂交的方式显影较弱的弊端。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的pMD18T表达载体模式图；
图2是本发明实施例提供的6135bp的PCR扩增结果图，M是10000bp DNA分子量标准，电泳泳道1为6135bp的PCR扩增结果；
图3是本发明实施例提供的pMD-18T-6135bp部分测序结果图；
图4是本发明实施例提供的3225bp的PCR扩增结果图，M是10000bp DNA分子量标准，电泳泳道1为3225bp的PCR扩增结果；
图5是本发明实施例提供的pMD-18T-3225bp部分测序结果图；
图6是本发明实施例提供的1976bp的PCR扩增结果图，M是2000bp DNA分子量标准，电泳泳道1为1976bp的PCR扩增结果；
图7是本发明实施例提供的pMD-18T-1976bp部分测序结果图；
图8是本发明实施例提供的1016bp和456bp的PCR扩增结果图，M是2000bp DNA分子量标准，电泳泳道1为456bp的PCR扩增结果；电泳泳道2为1016bp的PCR扩增结果；
图9是本发明实施例提供的pMD-18T-1016bp部分测序结果图；
图10是本发明实施例提供的pMD-18T-456bp部分测序结果图；
图11是本发明实施例提供的整体标记marker的PCR扩增结果图，M是10000bp DNA分子量标准，电泳泳道1为整体标记marker的PCR扩增结果；
图12是本发明实施例提供的整体标记marker经转膜及显影后的检测效果图；
图13是对比例提供的整体标记marker的PCR扩增结果图，M是10000bp DNA分子量标准，电泳泳道1为整体标记marker的PCR扩增结果；
图14是对比例提供的整体标记marker经转膜及显影后的检测效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本发明提供了一种标记Marker，所述标记Make包括标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段，所述6135bp片段的序列如SEQ ID NO:1所示，所述3225bp片段的序列如SEQ ID NO:2所示，所述1976bp片段的序列如SEQ ID NO:3所示，所述1016bp片段的序列如SEQ ID NO:4所示，所述456bp片段的序列如SEQ ID NO:5所示。
其制备方法为：分别对6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp采用PCR方法进行标记，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段。
实施例2
本发明提供了一种标记Marker，所述标记Make包括标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段，6135bp片段的序列如SEQ ID NO:1所示，3225bp片段的序列如SEQ ID NO:2所示，1976bp片段的序列如SEQID NO:3所示，1016bp片段的序列如SEQ ID NO:4所示，456bp片段的序列如SEQ ID NO:5所示。
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别对6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp均以5'末端生物素标记的PR7和PR8为引物，进行PCR扩增，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段；
(2)将步骤(1)得到标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段分别连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-6135bp、pMD-18T-3225bp、pMD-18T-1976bp、pMD-18T-1016bp和pMD-18T-456bp，保存，备用。
实施例3
本发明提供了一种标记Marker，所述标记Make包括标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段，6135bp片段的序列如SEQ ID NO:1所示，3225bp片段的序列如SEQ ID NO:2所示，1976bp片段的序列如SEQID NO:3所示，1016bp片段的序列如SEQ ID NO:4所示，456bp片段的序列如SEQ ID NO:5所示。
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别对6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp均以5'末端地高辛标记的PR7和PR8为引物进行PCR扩增，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段；PR7的序列为5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；所述PR8的序列为5'-AACGACGGCCAGTGCCAAGC-3'；PR7和PR8的添加量均为0.1μm/L；
(2)将步骤(1)得到标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段分别连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-6135bp、pMD-18T-3225bp、pMD-18T-1976bp、pMD-18T-1016bp和pMD-18T-456bp，保存，备用。
实施例4
本发明提供了一种标记Marker，所述标记Make包括标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段，6135bp片段的序列如SEQ ID NO:1所示，3225bp片段的序列如SEQ ID NO:2所示，1976bp片段的序列如SEQID NO:3所示，1016bp片段的序列如SEQ ID NO:4所示，456bp片段的序列如SEQ ID NO:5所示。
其制备方法包括以下步骤：
(1)分别对6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp均以5'末端地高辛标记的PR7和3'末端地高辛标记的PR8为引物，进行PCR扩增，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段；PR7的序列为5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；所述PR8的序列为5'-AACGACGGCCAGTGCCAAGC-3'；PR7和PR8的添加量均为0.1μm/L；PCR扩增所用酶为：Genstar的2×HiFiTaq PCR StarMix，添加量为1μl，扩增效率为1kb/min；
6135bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸6min10s，35个循环，72℃总延伸10min；12℃保存；
3225bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min10s，35个循环，72℃总延伸10min；12℃保存；
1976bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃总延伸10min；12℃保存；
1016bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃总延伸10min；12℃保存；
456bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸27s，35个循环，72℃总延伸10min；12℃保存；
(2)将步骤(1)得到标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段分别连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-6135bp、pMD-18T-3225bp、pMD-18T-1976bp、pMD-18T-1016bp和pMD-18T-456bp，保存，备用。连入pMD18T克隆载体可以制备成甘油菌保存在-80℃中。
在本发明的标记Marker的制备方法中，因为单片段无法长期保存，为了保存目的片段，将标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段分别连入pMD18T克隆载体。
本发明在制备标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段前，首先，以未标记的PR7和PR8为引物分别对6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp进行PCR扩增，然后分别连入pMD18T克隆载体中，最后分别进行测序检测，确保扩增出来的片段为目的片段；其中，pMD18T表达载体模式图如图1所示；
6135bp经PCR扩增后形成6135bp片段，PCR扩增结果如图2所示；连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-6135bp，部分测序结果如图3所示；
3225bp经PCR扩增后形成3225bp片段，扩增结果如图4所示；连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-3225bp，部分测序结果如图5所示；
1976bp经PCR扩增后形成1976bp片段，扩增结果如图6所示；连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-1976bp，部分测序结果如图7所示；
1016bp经PCR扩增后形成1016bp片段，扩增结果如图8所示，其中，第一泳道为；连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-1016bp，部分测序结果如图9所示；
456bp经PCR扩增后形成456bp片段，扩增结果如图8所示；连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-456bp，部分测序结果如图10所示。
本发明还提供了一种标记Marker的使用方法，将标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段以摩尔比1:1:1:1:1进行混合，组成整体标记marker，经琼脂糖凝胶电泳检测效果如图11所示，再经转膜及显影后检测效果如图12所示。
实施例5
本实施例与实施例4不同的是：本实施例中，6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp均以5'末端生物素标记的PR7和3'末端生物素标记的PR8为引物。将标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段以摩尔比1:1:1:1:1进行混合，组成整体标记marker，经琼脂糖凝胶电泳检测如图13所示，再经转膜及显影后检测效果如图14所示。
本发明采用地高辛标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段作为marker主要应用于southern blot、northernblot实验，本发明中采用生物素标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段作为marker主要应用于RNA酶及DNA酶印迹实验。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种标记Marker，所述标记Make包括标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段，所述6135bp片段的如SEQ ID NO:1所示，所述3225bp片段的序列如SEQ ID NO:2所示，所述1976bp片段的序列如SEQ ID NO:3所示，所述1016bp片段的序列如SEQ ID NO:4所示，所述456bp片段的序列如SEQ ID NO:5所示序列。
2.一种制备权利要求1所述的标记Marker的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分别对6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp采用PCR方法进行标记，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段；
(2)将步骤(1)得到所述标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段分别连入pMD18T克隆载体，构建质粒pMD-18T-6135bp、pMD-18T-3225bp、pMD-18T-1976bp、pMD-18T-1016bp和pMD-18T-456bp，保存，备用。
3.根据权利要求2所述的标记Marker的制备方法，其特征在于，所述6135bp、3225bp、1976bp、1016bp和456bp均以PR7为上游引物和以PR8为下游引物进行PCR扩增，形成标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段；
所述PR7的序列为5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'，所述序列为SEQ ID NO:6所示；所述PR8的序列为5'-AACGACGGCCAGTGCCAAGC-3'，所述序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求2所述的标记Marker的制备方法，其特征在于，所述上游引物的5'末端和/或3'末端采用地高辛标记或生物素标记；所述下游引物的5'末端和/或3'末端采用地高辛标记或生物素标记。
5.根据权利要求2所述的标记Marker的制备方法，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的添加量均为0.1μm/L。
6.根据权利要求2至5任一所述的标记Marker的制备方法，其特征在于，所述6135bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸6min10s，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述3225bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min10s，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述1976bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述1016bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，25-45个循环，72℃总延伸10min；
所述456bp进行PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸27s，25-45个循环，72℃总延伸10min。
7.根据权利要求2至5任一所述的标记Marker的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增所用酶的扩增效率为1kb/min。
8.根据权利要求7所述的标记Marker的制备方法，其特征在于，PCR扩增所用酶为：Genstar的2×HiFiTaq PCR StarMix。
9.根据权利要求8所述的标记Marker的制备方法，其特征在于，PCR扩增所用酶的添加量为1μl。
10.一种权利要求1所述标记Marker的使用方法，包括将所述标记的6135bp片段、标记的3225bp片段、标记的1976bp片段、标记的1016bp片段和标记的456bp片段以摩尔比1:1:1:1:1进行混合，组成标准分子量marker，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
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