CN103740702B - 一种与海湾扇贝热耐受性相关的snp标记及其鉴定方法和潜在应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用,所述与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记位于海湾扇贝转录本Ai-53308序列的第760个碱基处,此碱基存在U和C两个形式;相应的,该SNP在基因组DNA中存在T和C两个等位基因形式(以下基因型均指该SNP在基因组DNA中的基因型);所述海湾扇贝Ai-53308转录本,其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明的有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定,通过弃选CC基因型的亲贝,提高后代群体的热耐受性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程与遗传育种领域,涉及一个与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用。
背景技术
海湾扇贝原产美国大西洋沿岸及墨西哥湾,有四个地理亚种,其中北方亚种和南方亚种先后引进中国。海湾扇贝北方亚种主要养殖在河北、辽宁和山东沿海(渤海海域),南方亚种主要养殖在广东广西沿海(北部湾海域),是我国重要的养殖贝类。高温年份,海湾扇贝北方亚种主养区经常发生规模死亡,给养殖户造成巨大损失。高温被认为是引起扇贝夏季规模死亡的主要环境诱因,因此提高海湾扇贝热耐受性具有重要的现实意义。
生物通常有三种途径应对环境胁迫:1)分子伴侣蛋白表达上调,帮助细胞内蛋白维持正确的空间结构或错误折叠蛋白的重新折叠;2)细胞抗氧化系统有效平衡胁迫条件下产生的自由基,防止胞内结构被破坏;3)启动泛素蛋白酶体系以降解结构被破坏了的蛋白,防止其聚集产生毒性。宋林生等对海湾扇贝热休克蛋白HSP70启动子区进行重测序鉴定出8个与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记,这些标记可能通过影响HSP70表达水平影响海湾扇贝热耐受性,然而这种可能性尚未被证明。
本发明在利用转录组测序预测海量SNP标记的基础上,利用候选基因关联分析的方法,筛选出1个与海湾扇贝热耐受性极显著相关的SNP标记,发现该SNP的T等位基因比C等位基因更有利于海湾扇贝在高温胁迫条件下存活。荧光定量PCR结果显示,热激情况下海湾扇贝转录本53308转录水平显著上调,据此推测与上述SNP紧密连锁的一种变异通过影响基因的表达影响海湾扇贝的热耐受性。从而,上述SNP可以作为海湾扇贝热耐受性的功能标记,用于海湾扇贝高热耐受性品系的选育。本发明不但提供与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记,还提供简便且具有可移植性的鉴定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用。
本发明通过以下技术方案得以实现:
一种与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记:所述与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记位于海湾扇贝转录本Ai-53308序列的第760个碱基处,此碱基存在T和C两个形式;
所述海湾扇贝Ai-53308转录本,其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的鉴定方法,包括步骤如下:
1)提取海湾扇贝的基因组DNA,使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL;
2)取步骤1)中所述海湾扇贝的基因组DNA为模板,利用引物F和R配制反应体系:基因组DNA1uL,通用PCRmix5uL,引物F和R各0.2uL,灭菌双蒸水3.6uL(若基因组DNA浓度≤5ng/uL,可加4.6uL基因组DNA而不加灭菌双蒸水。另反应体系可同比放大);
3)PCR扩增的反应程序为:
4)步骤3)所述的PCR反应结束后,加入饱和荧光染料Lcgreen及内标(等量混合的高温内标和低温内标,即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸,高、低温内标终浓度分别为2.5uM)各1uL,经过95℃退火5-10min;
5)待步骤4)所述的退火后自然降温至室温,进行高分辨率熔解曲线分析,鉴定待测样本中所述海湾扇贝SNP标记的基因型,具体方法为:
a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正;
b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群,若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC,若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT,若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC;
c)判断每个待测样本所述海湾扇贝SNP标记基因型。
所述步骤2)中,用于鉴定所述与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记的正向引物为F:5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’;
反向引物为R:5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。
SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列,其中,
高温内标序列为:
5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-5’
低温内标序列为:
5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-5’。
获得内标的具体方法为:
1)委托公司合成四条寡核苷酸单链:
GWNB+:5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’
GWNB-:5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’
DWNB+:5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’
DWNB-:5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’
2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM;
3)等体积混合四条单链核苷酸,得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。
与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的潜在应用:在苗种繁育前,通过非致死性取样提取亲贝基因组DNA,利用如上述所述的SNP标记及其鉴定方法判断亲贝基因型,通过弃选CC基因型亲贝有效提高后代群体的热耐受性。本发明提供根据PCR产物熔解曲线判定SNP基因型的方法,如图1所示,当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC,当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT,当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。
本发明提供根据上述SNP基因型判定海湾扇贝热耐受性的方法,即当上述SNP基因型为TT或者TC时鉴定上述SNP基因型的海湾扇贝具有较高热耐受性,当上述SNP基因型为CC时鉴定上述SNP的海湾扇贝具有较差的热耐受性。
本发明提供了一个与海湾扇贝热耐受性显著相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用,其有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定(使用非致死性取样方法doi:10.1371/journal.pone.0068096),通过弃选CC基因型的亲贝,提高后代群体的热耐受性。
附图说明
图1是上述包含SNP53308-760的PCR产物熔解曲线求导图;
图2是海湾扇贝转录本Ai-53308在热胁迫及对照条件下转录水平的实时定量PCR结果。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步阐释本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例
本例中使用的关联分析材料为ZZ和ZN,其构建过程为:海湾扇贝北方亚种 。ZZ和ZN在海上养至100日龄,取300只到实验室进行暂养(2天,25±0.5℃),后对其中活力良好的230只进行逐步升温的热胁迫处理,期间每天上午9点、下午3点和晚上10点检查扇贝死亡情况,并立即对死亡样本进行酒精固定。设定ZZ和ZN中最先死亡的48只为热敏感群体,最后死亡的48只为热抗性群体,组成本例的ZZ96和ZN96关联群体。
按照说明书中的SNP鉴定方法,即:
1)提取ZZ96和ZN96共192个样本的基因组DNA并使用紫外吸光光度法测定浓度,根据测定浓度使用灭菌水将基因组DNA稀释至10-20ng/uL;
2)取步骤1)中稀释的基因组DNA作为模板,使用引物F和R进行PCR扩增,反应体系如下:基因组DNA1uL,引物F和R各0.2uL,PCRmix5uL,灭菌双蒸水3.6uL;
正向引物为F:5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’;
反向引物为R:5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’;
3)加入权利要求书中的内标和饱和荧光染料LCgreen,95℃退火5min后进行高分辨率熔解曲线分析,判定SNP53308-760在ZZ96和ZN96共192个体中的基因型。
具体方法如下:
a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正;
b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群,若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC,若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT,若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC;
c)判定每个待测样本SNP53308-760的基因型。
使用plink软件进行耐热能力与SNP53308-760基因型间的关联分析,分析结果如表1:
表1耐热能力与SNP53308-760基因型间的关联分析结果
关联分析结果显示,热敏感群体中SNP53308-760C等位基因频率显著高于抗性群,表明SNP53308-760与海湾扇贝热耐受性极显著相关,可做为海湾扇贝热耐受性状标记辅助选择的功能标记,且等位基因T使海湾扇贝具有更高的热耐受性。
为研究本申请中SNP53308-760造成海湾扇贝热耐受性差异的作用机制,对高温(30℃)及正常水温(20℃)处理2小时的海湾扇贝鳃组织的53308转录本转录水平进行了实时定量PCR分析。如图2所示,分别随机选择海湾扇贝北方亚种进行高温胁迫处理和正常水温处理,设置3个生物重复,处理2小时后立即解剖海湾扇贝取鳃组织于液氮中研磨并用TRIZOL提取总RNA。本试验中以18SrRNA作为内参基因,利用ΔΔCT法计算53308的表达量,发现热胁迫条件下53308表达量达到正常水温下的2.8倍,呈显著上调趋势,这表明53308参与了海湾扇贝热胁迫下的应激反应。由图2可知,热胁迫条件下海湾扇贝53308转录本转录水平显著上调。
序列表(1)SEQIDNO.1的信息序列特征长度:1565nt
类型:核酸
链型:单链
拓扑结构:线形
分子类型:RNA
特性名称:mRNA
来源:海湾扇贝
序列描述:
CAGCAUUUAAAUAAUAACAAUAAAUCACUCUAUCAUUUUAAUAACAAAAAUCACACUAAACAUUCAUGAGAUGUCAAACAUGAUUAAUUACUAAAACAUGAUUUCUGUAUUGCAUUAACAUGAAACAAAAAGAGUUACCUCCCUUUACUCGUGAGUUUACUAGCACUCUUCAAUACAAAUUUGUGAUAAUUUCGUCGUGCUAUAGUUUUUUAAUACUAGAAAUUGCUGUUGUAAUAUUACUCAUUUGAUAAUAUAAUAUGUCUUUAUACAUAUAUGAACAACAUACAUCAAUUGAGUAUAACAUGAUAUAUAUUCCAGUUCGCAUUAUUUUCUCUGACACGUAAUACUUACACAAAUAUAUCUUAUUAUACAUGCAUAUUUUUGGCACAAAAGAACAUUUCUGUUCGAUUAUAUAGGAUUGUACGUUUCAAUUUUAUUAGAAUUUAAAAAUUAGAAUUUGUUCUCAAUUUCGCAGGACAUCACUGAGCUCGCGAAAAUGUCUUCCAGGAAAAAUUAAACUGAUAAUAAAAUACGCUCUUGUAGCAAAAUCGCUUUUUUUCGCAUUCGUAAAAAUAAUUUUAUUCGUUGAAAUUUAAGCGCGAUUUUUCAGAUUAAAAAUAACCGGUUAUACGGUAUUUCGAAUUCUUAUGUAAAGAUUACUGUUAAAUCGUAUAUCAAUUUCUGUAAUUACGUCGUUAAUCUGAAUUUAUAUAAUUUACAAAACUAAUACAUAAAUGGAUCUCAGAAGUGAACGUCUGAUACAUUUUUACACUACAUACAAGGAACAUCCACGUGUGUAAUGGUACAGGCUAGAAUCAUUCAUGUGUACUCGAACUACAUACAAAUAUUACUUAUGAGUGAGCUACAUGUGCACUAGCUACAUAGAAAGCCAAAUCACAUGUACACUACCAUCAAACACAUUAGCCCGAGAUACUCUGGCCCUAAAACCAGACUUAGACAUUAAGGCAGAUAGAUAUUUGUCAUAAUGUUUAAGUCUGGUUUUUGGGCUUGAGUAUCUCGGGCUACAAACACUUGCGUACCCUCUCGUCAUAUCAGCACUUUCAUCCACGGGUCUCCCGCUACACACAUAUAUACAGAAAUCCCUAAUACAUUCCUUUGCUACAUACAAAAAUCACUCAAUCGUUCAUAUUAAUAGUCGUUACAUAAAAUAAUCACUUUUCGCACAUACUUAAGAUAAAUAAAAACAUUGCUGCGGGUCAAUGACGUCUCACUUUUUCAAUUUUAACACAAUUAUAUUUUAAUAUACAACAUUCAAACGUUUUGACAUGAGGUAGAAAUUAUACAAGUAUUGCAAAAUCUGUAACUUGUGAUGGUAUACUGUAUAUCAUGAAAUAUUCGUCGUGAAUACUGUUUUGAUAUUAUUUCGUGGAAACAAAUACUCGUGGUAGGCCGAAUGAGCAAUAUUAAGAAAUAUAUACAAAGACAAAGUUCGCUGAUCGUGGUCUUACAGUUAUCAUGCAAACAACGUAAGUUGCUACAGAACGAACAUCCCAUGUUAUACAGUAUAGAUGAUUGAUAAAUCAUAAUUUUUUAUAAUAUAUUUG
Claims (7)
1.一种用于扩增与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的引物对,其特征在于:正向引物为F:
5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’;
反向引物为R:5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。
2.一种如权利要求1所述的引物对用于鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法,其特征在于:
包括步骤如下:
1)提取海湾扇贝的基因组DNA,使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/μL;
2)取步骤1)中所述海湾扇贝的基因组DNA为模板,利用引物F和R配制反应体系:基因组DNA1μL,通用PCRmix5μL,引物F和R各0.2μL,灭菌双蒸水3.6μL;所述反应体系可同比放大;
3)PCR扩增的反应程序为:
4)步骤3)所述的PCR反应结束后,加入饱和荧光染料Lcgreen及内标各1μL,经过95℃退火5-10min;
5)待步骤4)所述的退火后自然降温至室温,进行高分辨率熔解曲线分析,鉴定待测样本中所述海湾扇贝的热耐受性相关基因型,具体如下:
a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正;
b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群,若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC,若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT,若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC;
c)判断每个待测样本所述海湾扇贝SNP标记基因型。
3.根据权利要求2所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法,其特征在于:
当所述基因组DNA浓度≤5ng/μL时,需加入4.6μL基因组DNA而不加灭菌双蒸水。
4.根据权利要求2所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法,其特征在于:
所述步骤4)中,内标为等量混合的高温内标和低温内标,即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸,高、低温内标终浓度分别为2.5μM。
5.根据权利要求4所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法,其特征在于:
所述步骤4)中,SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列,其中,
高温内标序列为:
低温内标序列为:
6.根据权利要求5所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法,其特征在于:
获得内标的具体方法为:
1)委托公司合成四条寡核苷酸单链:
GWNB+:
5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’
GWNB-:
5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’
DWNB+:
5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’
DWNB-:
5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’
2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10μM;
3)等体积混合四条单链核苷酸,得到高、低温内标终浓度分别为2.5μM的内标。
7.一种如权利要求1中所述的用于扩增与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的引物对的潜在应用,其特征在于:在苗种繁育前,通过非致死性取样提取亲贝基因组DNA,利用权利要求2所述的方法判断亲贝基因型,通过弃选CC基因型亲贝有效提高后代群体的热耐受性。
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