CN103740702B - 一种与海湾扇贝热耐受性相关的snp标记及其鉴定方法和潜在应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用，所述与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记位于海湾扇贝转录本Ai-53308序列的第760个碱基处，此碱基存在U和C两个形式;相应的，该SNP在基因组DNA中存在Ｔ和Ｃ两个等位基因形式（以下基因型均指该SNP在基因组DNA中的基因型）;所述海湾扇贝Ai-53308转录本，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。本发明的有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，通过弃选CC基因型的亲贝，提高后代群体的热耐受性。

Description

一种与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用

技术领域

本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及一个与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用。

背景技术

海湾扇贝原产美国大西洋沿岸及墨西哥湾，有四个地理亚种，其中北方亚种和南方亚种先后引进中国。海湾扇贝北方亚种主要养殖在河北、辽宁和山东沿海（渤海海域），南方亚种主要养殖在广东广西沿海（北部湾海域），是我国重要的养殖贝类。高温年份，海湾扇贝北方亚种主养区经常发生规模死亡，给养殖户造成巨大损失。高温被认为是引起扇贝夏季规模死亡的主要环境诱因，因此提高海湾扇贝热耐受性具有重要的现实意义。

生物通常有三种途径应对环境胁迫：1）分子伴侣蛋白表达上调，帮助细胞内蛋白维持正确的空间结构或错误折叠蛋白的重新折叠；2）细胞抗氧化系统有效平衡胁迫条件下产生的自由基，防止胞内结构被破坏；3）启动泛素蛋白酶体系以降解结构被破坏了的蛋白，防止其聚集产生毒性。宋林生等对海湾扇贝热休克蛋白HSP70启动子区进行重测序鉴定出8个与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记，这些标记可能通过影响HSP70表达水平影响海湾扇贝热耐受性，然而这种可能性尚未被证明。

本发明在利用转录组测序预测海量SNP标记的基础上，利用候选基因关联分析的方法，筛选出1个与海湾扇贝热耐受性极显著相关的SNP标记，发现该SNP的T等位基因比C等位基因更有利于海湾扇贝在高温胁迫条件下存活。荧光定量PCR结果显示，热激情况下海湾扇贝转录本53308转录水平显著上调，据此推测与上述SNP紧密连锁的一种变异通过影响基因的表达影响海湾扇贝的热耐受性。从而，上述SNP可以作为海湾扇贝热耐受性的功能标记，用于海湾扇贝高热耐受性品系的选育。本发明不但提供与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记，还提供简便且具有可移植性的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用。

本发明通过以下技术方案得以实现：

一种与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记：所述与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记位于海湾扇贝转录本Ai-53308序列的第760个碱基处，此碱基存在T和C两个形式；

所述海湾扇贝Ai-53308转录本，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的鉴定方法，包括步骤如下：

1）提取海湾扇贝的基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL；

2）取步骤1）中所述海湾扇贝的基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA1uL，通用PCRmix5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL（若基因组DNA浓度≤5ng/uL，可加4.6uL基因组DNA而不加灭菌双蒸水。另反应体系可同比放大）；

3）PCR扩增的反应程序为：

4）步骤3）所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标（等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5uM）各1uL，经过95℃退火5-10min；

5）待步骤4）所述的退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样本中所述海湾扇贝SNP标记的基因型，具体方法为：

a）利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；

b）对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC，若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT，若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC；

c）判断每个待测样本所述海湾扇贝SNP标记基因型。

所述步骤2）中，用于鉴定所述与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记的正向引物为F：5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’；

反向引物为R：5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。

SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，

高温内标序列为：

5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

3’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-5’

低温内标序列为：

5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

3’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-5’。

获得内标的具体方法为：

1）委托公司合成四条寡核苷酸单链：

GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’

DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’

2）用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM；

3）等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。

与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的潜在应用：在苗种繁育前，通过非致死性取样提取亲贝基因组DNA，利用如上述所述的SNP标记及其鉴定方法判断亲贝基因型，通过弃选CC基因型亲贝有效提高后代群体的热耐受性。本发明提供根据PCR产物熔解曲线判定SNP基因型的方法，如图1所示，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT，当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。

本发明提供根据上述SNP基因型判定海湾扇贝热耐受性的方法，即当上述SNP基因型为TT或者TC时鉴定上述SNP基因型的海湾扇贝具有较高热耐受性，当上述SNP基因型为CC时鉴定上述SNP的海湾扇贝具有较差的热耐受性。

本发明提供了一个与海湾扇贝热耐受性显著相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用，其有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定（使用非致死性取样方法doi:10.1371/journal.pone.0068096），通过弃选CC基因型的亲贝，提高后代群体的热耐受性。

附图说明

图1是上述包含SNP53308-760的PCR产物熔解曲线求导图；

图2是海湾扇贝转录本Ai-53308在热胁迫及对照条件下转录水平的实时定量PCR结果。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例

本例中使用的关联分析材料为ZZ和ZN，其构建过程为：海湾扇贝北方亚种 。ZZ和ZN在海上养至100日龄，取300只到实验室进行暂养（2天，25±0.5℃），后对其中活力良好的230只进行逐步升温的热胁迫处理，期间每天上午9点、下午3点和晚上10点检查扇贝死亡情况，并立即对死亡样本进行酒精固定。设定ZZ和ZN中最先死亡的48只为热敏感群体，最后死亡的48只为热抗性群体，组成本例的ZZ96和ZN96关联群体。

按照说明书中的SNP鉴定方法，即：

1）提取ZZ96和ZN96共192个样本的基因组DNA并使用紫外吸光光度法测定浓度，根据测定浓度使用灭菌水将基因组DNA稀释至10-20ng/uL；

2）取步骤1）中稀释的基因组DNA作为模板，使用引物F和R进行PCR扩增，反应体系如下：基因组DNA1uL，引物F和R各0.2uL，PCRmix5uL，灭菌双蒸水3.6uL；

正向引物为F：5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’；

反向引物为R：5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’；

3）加入权利要求书中的内标和饱和荧光染料LCgreen，95℃退火5min后进行高分辨率熔解曲线分析，判定SNP53308-760在ZZ96和ZN96共192个体中的基因型。

具体方法如下：

a）利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；

b）对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC，若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT，若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC；

c）判定每个待测样本SNP53308-760的基因型。

使用plink软件进行耐热能力与SNP53308-760基因型间的关联分析，分析结果如表1：

表1耐热能力与SNP53308-760基因型间的关联分析结果

关联分析结果显示，热敏感群体中SNP53308-760C等位基因频率显著高于抗性群，表明SNP53308-760与海湾扇贝热耐受性极显著相关，可做为海湾扇贝热耐受性状标记辅助选择的功能标记，且等位基因T使海湾扇贝具有更高的热耐受性。

为研究本申请中SNP53308-760造成海湾扇贝热耐受性差异的作用机制，对高温（30℃）及正常水温（20℃）处理2小时的海湾扇贝鳃组织的53308转录本转录水平进行了实时定量PCR分析。如图2所示，分别随机选择海湾扇贝北方亚种进行高温胁迫处理和正常水温处理，设置3个生物重复，处理2小时后立即解剖海湾扇贝取鳃组织于液氮中研磨并用TRIZOL提取总RNA。本试验中以18SrRNA作为内参基因，利用ΔΔCT法计算53308的表达量，发现热胁迫条件下53308表达量达到正常水温下的2.8倍，呈显著上调趋势，这表明53308参与了海湾扇贝热胁迫下的应激反应。由图2可知，热胁迫条件下海湾扇贝53308转录本转录水平显著上调。

序列表（1）SEQIDNO.1的信息序列特征长度：1565nt

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线形

分子类型：RNA

特性名称：mRNA

来源：海湾扇贝

序列描述：

CAGCAUUUAAAUAAUAACAAUAAAUCACUCUAUCAUUUUAAUAACAAAAAUCACACUAAACAUUCAUGAGAUGUCAAACAUGAUUAAUUACUAAAACAUGAUUUCUGUAUUGCAUUAACAUGAAACAAAAAGAGUUACCUCCCUUUACUCGUGAGUUUACUAGCACUCUUCAAUACAAAUUUGUGAUAAUUUCGUCGUGCUAUAGUUUUUUAAUACUAGAAAUUGCUGUUGUAAUAUUACUCAUUUGAUAAUAUAAUAUGUCUUUAUACAUAUAUGAACAACAUACAUCAAUUGAGUAUAACAUGAUAUAUAUUCCAGUUCGCAUUAUUUUCUCUGACACGUAAUACUUACACAAAUAUAUCUUAUUAUACAUGCAUAUUUUUGGCACAAAAGAACAUUUCUGUUCGAUUAUAUAGGAUUGUACGUUUCAAUUUUAUUAGAAUUUAAAAAUUAGAAUUUGUUCUCAAUUUCGCAGGACAUCACUGAGCUCGCGAAAAUGUCUUCCAGGAAAAAUUAAACUGAUAAUAAAAUACGCUCUUGUAGCAAAAUCGCUUUUUUUCGCAUUCGUAAAAAUAAUUUUAUUCGUUGAAAUUUAAGCGCGAUUUUUCAGAUUAAAAAUAACCGGUUAUACGGUAUUUCGAAUUCUUAUGUAAAGAUUACUGUUAAAUCGUAUAUCAAUUUCUGUAAUUACGUCGUUAAUCUGAAUUUAUAUAAUUUACAAAACUAAUACAUAAAUGGAUCUCAGAAGUGAACGUCUGAUACAUUUUUACACUACAUACAAGGAACAUCCACGUGUGUAAUGGUACAGGCUAGAAUCAUUCAUGUGUACUCGAACUACAUACAAAUAUUACUUAUGAGUGAGCUACAUGUGCACUAGCUACAUAGAAAGCCAAAUCACAUGUACACUACCAUCAAACACAUUAGCCCGAGAUACUCUGGCCCUAAAACCAGACUUAGACAUUAAGGCAGAUAGAUAUUUGUCAUAAUGUUUAAGUCUGGUUUUUGGGCUUGAGUAUCUCGGGCUACAAACACUUGCGUACCCUCUCGUCAUAUCAGCACUUUCAUCCACGGGUCUCCCGCUACACACAUAUAUACAGAAAUCCCUAAUACAUUCCUUUGCUACAUACAAAAAUCACUCAAUCGUUCAUAUUAAUAGUCGUUACAUAAAAUAAUCACUUUUCGCACAUACUUAAGAUAAAUAAAAACAUUGCUGCGGGUCAAUGACGUCUCACUUUUUCAAUUUUAACACAAUUAUAUUUUAAUAUACAACAUUCAAACGUUUUGACAUGAGGUAGAAAUUAUACAAGUAUUGCAAAAUCUGUAACUUGUGAUGGUAUACUGUAUAUCAUGAAAUAUUCGUCGUGAAUACUGUUUUGAUAUUAUUUCGUGGAAACAAAUACUCGUGGUAGGCCGAAUGAGCAAUAUUAAGAAAUAUAUACAAAGACAAAGUUCGCUGAUCGUGGUCUUACAGUUAUCAUGCAAACAACGUAAGUUGCUACAGAACGAACAUCCCAUGUUAUACAGUAUAGAUGAUUGAUAAAUCAUAAUUUUUUAUAAUAUAUUUG

Claims (7)

1.一种用于扩增与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的引物对，其特征在于：正向引物为F：

5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’；

反向引物为R：5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。

2.一种如权利要求1所述的引物对用于鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法，其特征在于：

包括步骤如下：

1)提取海湾扇贝的基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/μL；

2)取步骤1)中所述海湾扇贝的基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA1μL，通用PCRmix5μL，引物F和R各0.2μL，灭菌双蒸水3.6μL；所述反应体系可同比放大；

3)PCR扩增的反应程序为：

4)步骤3)所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标各1μL，经过95℃退火5-10min；

5)待步骤4)所述的退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样本中所述海湾扇贝的热耐受性相关基因型，具体如下：

a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；

b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC，若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT，若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC；

c)判断每个待测样本所述海湾扇贝SNP标记基因型。

3.根据权利要求2所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法，其特征在于：

当所述基因组DNA浓度≤5ng/μL时，需加入4.6μL基因组DNA而不加灭菌双蒸水。

4.根据权利要求2所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法，其特征在于：

所述步骤4)中，内标为等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5μM。

5.根据权利要求4所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法，其特征在于：

所述步骤4)中，SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，

高温内标序列为：

低温内标序列为：

6.根据权利要求5所述的鉴定与海湾扇贝热耐受性相关基因型的方法，其特征在于：

获得内标的具体方法为：

1)委托公司合成四条寡核苷酸单链：

GWNB+：

5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

GWNB-：

5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’

DWNB+：

5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

DWNB-：

5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’

2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10μM；

3)等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5μM的内标。

7.一种如权利要求1中所述的用于扩增与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的引物对的潜在应用，其特征在于：在苗种繁育前，通过非致死性取样提取亲贝基因组DNA，利用权利要求2所述的方法判断亲贝基因型，通过弃选CC基因型亲贝有效提高后代群体的热耐受性。